LT3997B - Process for preparing protoporphyrins and use thereof - Google Patents
Process for preparing protoporphyrins and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- LT3997B LT3997B LTIP1583A LTIP1583A LT3997B LT 3997 B LT3997 B LT 3997B LT IP1583 A LTIP1583 A LT IP1583A LT IP1583 A LTIP1583 A LT IP1583A LT 3997 B LT3997 B LT 3997B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- cells
- mammary gland
- protoporphyrin
- compound
- porphyrin
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 42
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 29
- KSFOVUSSGSKXFI-GAQDCDSVSA-N CC1=C/2NC(\C=C3/N=C(/C=C4\N\C(=C/C5=N/C(=C\2)/C(C=C)=C5C)C(C=C)=C4C)C(C)=C3CCC(O)=O)=C1CCC(O)=O Chemical compound CC1=C/2NC(\C=C3/N=C(/C=C4\N\C(=C/C5=N/C(=C\2)/C(C=C)=C5C)C(C=C)=C4C)C(C)=C3CCC(O)=O)=C1CCC(O)=O KSFOVUSSGSKXFI-GAQDCDSVSA-N 0.000 claims description 20
- 229950003776 protoporphyrin Drugs 0.000 claims description 20
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- UHSGPDMIQQYNAX-UHFFFAOYSA-N protoporphyrinogen Chemical compound C1C(=C(C=2C=C)C)NC=2CC(=C(C=2CCC(O)=O)C)NC=2CC(N2)=C(CCC(O)=O)C(C)=C2CC2=C(C)C(C=C)=C1N2 UHSGPDMIQQYNAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- -1 4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyphenyl Chemical group 0.000 claims description 7
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims description 6
- 108020001991 Protoporphyrinogen Oxidase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000005135 Protoporphyrinogen oxidase Human genes 0.000 claims description 6
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical compound C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 229910052717 sulfur Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 125000002373 5 membered heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004070 6 membered heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 2
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 72
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 9
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 9
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 229940109328 photofrin Drugs 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- CONWAEURSVPLRM-UHFFFAOYSA-N lactofen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)OC(C)C(=O)OCC)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 CONWAEURSVPLRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UJKPHYRXOLRVJJ-MLSVHJFASA-N CC(O)C1=C(C)/C2=C/C3=N/C(=C\C4=C(CCC(O)=O)C(C)=C(N4)/C=C4\N=C(\C=C\1/N\2)C(C)=C4C(C)O)/C(CCC(O)=O)=C3C Chemical class CC(O)C1=C(C)/C2=C/C3=N/C(=C\C4=C(CCC(O)=O)C(C)=C(N4)/C=C4\N=C(\C=C\1/N\2)C(C)=C4C(C)O)/C(CCC(O)=O)=C3C UJKPHYRXOLRVJJ-MLSVHJFASA-N 0.000 description 3
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 3
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 3
- MQJKPEGWNLWLTK-UHFFFAOYSA-N Dapsone Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MQJKPEGWNLWLTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- VGNCBRNRHXEODV-XXVHXNRLSA-N (6r,7r)-1-[(4s,5r)-4-acetyloxy-5-methyl-3-methylidene-6-phenylhexyl]-6-dodecoxy-4,7-dihydroxy-2,8-dioxabicyclo[3.2.1]octane-3,4,5-tricarboxylic acid Chemical compound C([C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)C(=C)CCC12[C@H](O)[C@H](C(O2)(C(O)=O)C(O)(C(O1)C(O)=O)C(O)=O)OCCCCCCCCCCCC)C1=CC=CC=C1 VGNCBRNRHXEODV-XXVHXNRLSA-N 0.000 description 2
- SYFDXJNNXBFQQL-UHFFFAOYSA-N 5-[2-chloro-4-(trifluoromethyl)phenoxy]-3-(1-ethoxy-1-oxopropan-2-yl)-2-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C(C(C)C(=O)OCC)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 SYFDXJNNXBFQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 2
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQMBBFQZGJFLBU-UHFFFAOYSA-N Oxyfluorfen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(OCC)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 OQMBBFQZGJFLBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 2
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N fomesafen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)NS(=O)(=O)C)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- XITQUSLLOSKDTB-UHFFFAOYSA-N nitrofen Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl XITQUSLLOSKDTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 208000017983 photosensitivity disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000434 photosensitization Toxicity 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 2
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 2
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- AICIYIDUYNFPRY-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydro-2H-imidazol-2-one Chemical compound O=C1NC=CN1 AICIYIDUYNFPRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXKAPDFYKAWQRM-UHFFFAOYSA-N 3-chloro-2-(4-chloro-2-fluoro-5-propan-2-yloxyphenyl)-4,5,6,7-tetrahydroindazole Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(C)C)=CC(N2C(=C3CCCCC3=N2)Cl)=C1F CXKAPDFYKAWQRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YDWGKHZZALLQFR-UHFFFAOYSA-N 5-[2-chloro-4-(trifluoromethyl)phenoxy]-4-ethoxycarbonyl-3-methyl-2-nitrobenzoic acid Chemical compound C(C)OC(=O)C1=C(C(=C(C(=O)O)C=C1OC1=C(C=C(C=C1)C(F)(F)F)Cl)[N+](=O)[O-])C YDWGKHZZALLQFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000497 Amalgam Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005484 Bifenox Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000206762 Bumilleriopsis filiformis Species 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- DXXVCXKMSWHGTF-UHFFFAOYSA-N Chlomethoxyfen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(OC)=CC(OC=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=C1 DXXVCXKMSWHGTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HHMCAJWVGYGUEF-UHFFFAOYSA-N Fluorodifen Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O HHMCAJWVGYGUEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHAHEVIQIYRFRG-UHFFFAOYSA-N Fluoroglycofen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)OCC(=O)O)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 DHAHEVIQIYRFRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- SUSRORUBZHMPCO-UHFFFAOYSA-N MC-4379 Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)OC)=CC(OC=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=C1 SUSRORUBZHMPCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000005590 Oxyfluorfen Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 description 1
- 241000195663 Scenedesmus Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960002749 aminolevulinic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- XQNAUQUKWRBODG-UHFFFAOYSA-N chlornitrofen Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl XQNAUQUKWRBODG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000007891 compressed tablet Substances 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 1
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- JUHMHPOXZAYYJP-UHFFFAOYSA-N ethyl 5-amino-1-(4-methylphenyl)sulfonylpyrazole-4-carboxylate Chemical class NC1=C(C(=O)OCC)C=NN1S(=O)(=O)C1=CC=C(C)C=C1 JUHMHPOXZAYYJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960003569 hematoporphyrin Drugs 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- LCPSIJJDZWNVRJ-UHFFFAOYSA-L in-protoporphyrin ix Chemical compound C1=C(N2[In]N34)C(C=C)=C(C)C2=CC(=N2)C(C)=C(CCC(O)=O)C2=CC3=C(CCC(O)=O)C(C)=C4C=C2C(C=C)=C(C)C1=N2 LCPSIJJDZWNVRJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000886 photobiology Effects 0.000 description 1
- 230000036211 photosensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000003969 polarography Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 description 1
- VCRBUDCZLSQJPZ-UHFFFAOYSA-N porphyrinogen Chemical compound C1C(N2)=CC=C2CC(N2)=CC=C2CC(N2)=CC=C2CC2=CC=C1N2 VCRBUDCZLSQJPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004034 porphyrinogens Chemical class 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- OVARTBFNCCXQKS-UHFFFAOYSA-N propan-2-one;hydrate Chemical compound O.CC(C)=O OVARTBFNCCXQKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- QSYAEOJYDZZOHF-UHFFFAOYSA-M sodium;2,4-dichloro-6-nitrophenolate Chemical compound [Na+].[O-]C1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1[N+]([O-])=O QSYAEOJYDZZOHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RVULBHWZFCBODE-UHFFFAOYSA-M sodium;5-[2-chloro-4-(trifluoromethyl)phenoxy]-2-nitrobenzoate Chemical compound [Na+].C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)[O-])=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 RVULBHWZFCBODE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N sulfamide Chemical compound NS(N)(=O)=O NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 150000004072 triols Chemical group 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Šis išradimas yra susijęs su specifiniu fermentinio protoporfirinogeno virsmo protoporfirinu IX, veikiant ląstelėse esančiai protoporfirinogenoksidazei, inhibitoriumi ir jo panaudojimu farmacinėse kompozicijose, skirtose pieno liaukos naviko ląstelių suardymui, diagnozavimui ir lokalizavimui, bei protoporfirino IX gavimo būdu.
Gerai žinomas būdas, kai, norint iššaukti ląstelių irimą, į pieno liaukos naviką Įvedamas hematoporfirino darinys arba mišinys porfirinų, kurie taip pat yra hematoporfirino dariniai, pavyzdžiui, preparatas Photofrin II, po to veikiant tam tikro bangos ilgio šviesos spinduliais. Tokiam fotodinaminės terapijos metodui skiriama serija straipsnių, sudarančių specialų žurnalo Photochemistry and Photobiology, 1987, 46 t., Nr.5 (toliau sutr. P&P 46-5) leidinį. Straipsniuose nurodoma, kad fotodinaminė terapija plačiai taikoma, gydant įvairius vėžinius susirgimus (tame skaičiuje bronchų, šlapimo pūslės, stemplės, plaučių, odos, galvos organų, kaklo, smegenų, storosios žarnos, o t.p. akies vidaus ir ginekologinius vėžinius susirgimus). Tvirtinama, kad minėta porfirininė fotosensibilizacij a yra lydima biocheminių efektų, kaip skersinių proteino ryšių membranose susidarymas, lipidų peroksidinimas, lizosomų ir mitochondrijų apvalkalų skaidymPs, eilės fermentų aktyvumo sumažėjimas ir porfirino įsisavinimo ląstelėmis padidėjimas (P&P 46-5, 695 psl.). Porfirininį preparatą, kaip įprasta, įveda injekcijų keliu (pvz., į veną ar pilvo ertmę); tipinė dozė - 2 mg preparato Photofrin vienam kūno masės kilogramui.
Be to, porfirininį preparatą galima įjungti į liposomą ir įvesti injekcijos būdu (pvz., į pilvo ertmę), kaip tai nurodyta straipsnyje Spikes ir kt. Fotodinaminis porfirinų elgesys modelinėse audinių ląstelių ir navikinėse sistemose (Photodynamic behavior of Porphyrins in Moda Cell, Tissue and Tumour Systems) rinkinyje Navikų ir kitų susirgimų fotodinaminė terapija (Photodynamic Therapy of Tumour and others Diseases), redaguotame Jori ir Perria: Paduja, leid. Libreria Pogretto, 1985, psl. 45-53, o t.p. ir aukščiau paminėtame specialiame leidinyje.
Specialioje literatūroje kalbama apie tai, kad įvedus protoporfiriną į tokias ląsteles, kaip, pvz., žmogaus kraujo eritrocitai arba leukemija sergančių pelių ląstelės, pastebimas ryškus fotosensibilizacijos efektas; žiūr.: Dabbleman ir kt. Biochimica et Biophysica Actą, 1978, 511 t., 141-151 psl.; Kessel, Cancer Research, 1982, 42 t., Nr.5, 1703-1706 psl. Kęselio straipsnyje tvirtinama, kad iš visų išbandytų fotosensibilizuojančių reagentų protoporfirinas - pats aktyviausias. Tačiau kai Kesselis ir kiti tyrinėtojai, pvz., Berenbaumas su bendradarbiais (žiūr.: Br.C. Cancer, 1982, 45 t., 571-581 psl.) leido porfiriną gyvuliams, pastebimo protoporfirino kiekio navikuose neaptiko, o tai liudija, kad vykstant kraujotakai, įvestas panašiu būdu į organizmą protoporfirinas gali būti greitai išneštas .
Aktyvusis junginys, skirtas naudoti fotodinaminėje terapijoje arba žinomuose navikų diagnozavimo ir lokalizavimo metoduose, pagal vieną iš šio išradimo aspektų yra ne porfirinas arba ne tik porfirinas.
Skirtingai nuo paprasto porfirino, duotasis junginys minėtose ląstelėse duoda impulsą fermentinei protoporfirinogeno hematogenezei, tuo pačiu sužadindamas endogeninio protoporfirino IX susidarymą ląstelėse. Autoriai nustatė, kad tokie reagentai, kaip kai kurie herbicidiniai junginiai, stabdantys fermentinį porfirinogenų perėjimą į chlorofilą augalų ląstelėse, taip pat stabdo ir fermentinį porfirinogeno pasikeitimą pieno liaukos ląstelių struktūroje. Autoriai mano: minėtas šių reagentų slopinantis poveikis, tikriausiai, turi įtakos ir protoporfirinogeno virsmui į protoporfiriną IX, veikiant fermentui (protoporfirinogenoksidazė, EC 1.2.3.4.) tokiu būdu, kai protoporfirinogenas nebevirsta protoporfirinu IX normaliu keliu, o vietoj to oksidinasi ląstelių viduje, (pvz., plazmoje) neįprastu fermentiniu procesu (pvz., organelos apvalkalėlyje), ko pasėkoje protoporfirinas IX kaupiasi tose srityse, kur jis neprieinamas normaliam virsmui į hemą; veikiant ląsteles šviesa, susikaupęs tokiu būdu protoporfirinas IX sukelia ląstelių irimo efektą, panašų į tą, kuris buvo stebimas aukščiau aprašytos fotodinaminės terapijos atveju.
Atitinkantys šiam išradimui aktyvūs junginiai, slopinantys fermentus, yra specifiniai protoporfirinogenoksidazės inhibitoriai ta prasme, kad jie funkcionuoja ne kaip paprasti fermentų nuodai, panašiai kaip reagentai, iššaukiantys denatūraciją arba tarpgrandininių jungčių susidarymą (pvz., kaip reagentai sulfihidrilo pagrindu); jie nėra visų pirma tokiais veikiančiais į oksidinimo sąlygas preparatais, kaip elektronų akceptoriai ir, vadinasi, aktyvūs junginiai, atitinkantys šiam išradimui, turi neigiamesnį redoks-potencialą, negu -500 mV ir dar neigiamesnį, būtent, lygų -800 mV, išmatuotą, pvz., tinkamame duotam junginiui tirpiklyje įprastu metodu: ciklinės voltametrijos metodu arba poliarografijos metodu). Vertinga tai, kad aktyvus junginys nėra tetrapirolas, ir kad jo rodiklis protoporfirinogen-oksidazei yra mažiau, nei 1 μΜ, pvz., mažiau, nei 0,3 μΜ; būtent, I50 apytikriai lygus 0,1, 0,03 ar 0,01 μΜ ar dar mažiau.
Yra tinkamas toks fermentą slopinantis aktyvus junginys, kuris pasižymi padidintu pajėgumu suardyti augalinių preparatų plazmalemą (plasmalemma). Vienas iš tokio pajėgumo tyrimo metodų aprašytas Holingo ir Piterso straipsnyje Išplovimo eksperimentas Plant Physiology, 1987, 84 t., 1114-5 psi. Pagal ši tyrimą (smulkiau jis aprašytas A priede) tinkamiausi reagentai rodo bent 50% bendrą išplovimą, esant apdirbimo lygiui 100 μΜ, geriau esant apdirbimo lygiui 1 μΜ ir mažiau, pvz., 100 nM.
Labai aktyvių preparatų, kaip 1-(4-chlor-2-fluor-5-pro2 pargiloksifenil)-3-metil-4-difluormetil-Δ -1,2,4-triazolinas-5 arba laktofenas (žiūr. žemiau), bendras išplovimo laipsnis viršyja 90%, koncentracij a - 100 nM.
Kita metodika, nustatanti preparato pajėgumą suskaldyti augalinės medžiagos plazmolemą, yra vadinama Pažaliavimo, sukelto apšvietimu, slopinimo tyrimai , smulkiai aprašyta žemiau Priede B. Pagal tą metodiką nustato preparato pajėgumą nuslopinti pažaliavimą išblyškusių tamsoje mikroorganizmo kultūrų Clamydomonas rein hardi, y-J (mikroorganizmų algae tipas, kuris auga tamsoje, nesudarydamas chlorofilo). Turima omenyje, kad masė algae išbąla, nes joje yra šviežios, nepažaliavę ląstelės, bet šviesoje vėl suformuoja chlorofilą. Daugelis tinkamų aktyvių junginių, naudojamų pagal šį išradimą, pajėgūs nuslopinti apšvitinimo sukeltą pažaliavimą bent jau 50%, esant naudojamo junginio koncentracijai 10 5 M, dar geriau 10 6 M ir mažiau, pvz., 10 7 M. Be to, tas junginys gali būti toks, kuris nurodyto tyrimo eigoje sudaro iškylanti, į paviršių produktą, kurio absorbcijos maksimumas yra ties 405 nm, o tai viršyja maksimumą chlorofilui, kuris duotoje sistemoje yra 669 nm, pvz., iškylantis produktas rodo prie 405 nm maksimumą, kuris 2, 3 ar 4 kartus viršyja maksimumą prie 668 nm.
Tarp fermentus slopinančių aktyvių junginių, kuriuos galima panaudoti šio išradimo įgyvendinimui, yra kelių tipų (A-D) herbicidai.
A. Aril-heterocikliniai herbicidai, kurių bendra formulė:
Ph - NHet, kur Ph - pakeistas fenilas, geriau 2,4-dipakeistas fenilas, dar geriau 2,4,5-tripakeistas fenilas, o NHet 5 ar 6-naris heterociklinis žiedas (su 1-4 azoto atomais žiede), kurio formulė:
- N - C = O arba - N - C - OH arba - N - C - Cl
I / I II I II
Q Q - C - R Q - C - R kur Q reiškia heterociklinio žiedo uždarančią grupę, o
R - vandenilis arba jį pakeičianti grupė.
Ši junginių klasė apima ir tokius preparatus, kurie Vakabajasi (Wakabayashi) ir kt. straipsnyje (žiūr. J. Pesticide Sci., 1986, 11 t., 635-460 psl.) apibrėžti kaip herbicidų klasė ciklinių imidų pagrindu, ir šio straipsnio 1 psl. pateikti tokie junginiai:
I II III
I junginys - tai herbicidas ariloksidiazolo pagrindu, būtent 2-tret.-būti1-4-(2,4-dichlor-5-izopropoksifenil)- Δ2-!, 3, 4-oksidiazolin-5-onas. Kiti 2-alkil-4(2, 4,5-tripakeistas fenil)- Δ -1, 3,4-oksidiazolin-5LT 3997 B onai, kuriuos galima panaudoti pagal šį išradimą, charakterizuoti, pvz., JAV patentuose Nr.Nr. 3 385 862,
836 539, 3 876 413.
II junginys - tai herbicidas aril-tetrahidroindazolo pagrindu, būtent 3-chlor-2-(4-chlor-2-fluor-5-izopropoksifenil)-4,5,6,7-tetrahidro-2H-indazolas.
III, IV ir V junginiai - tai herbicidai aril-tetrahidroftalimido pagrindu. Kiti aril-tetrahidroftalimidai, kuriuos galima panaudoti pagal šį išradimą, charakterizuojami, pvz., JAV patente Nr. 4 439 229 (nuo 4 psl. 25 eilutės iki 5 psl. 20 eilutės).
Kiti tinkami Ph - NHet tipo herbicidai yra:
aril-trialinonai, kurie aprašyti JAV patentuose Nr.Nr.
318 731, 4 398 943, 4 404 019, 4 702 945, 4 705 557, 4 702 763, 4 761 174, o taip pat tarptautinėse paraiškose Nr.Nr. WO 85/01637, WO 85/04307, W0 87/00730, WO 87/03782, WO 86/04481 ir WO 88/01133;
aril-tetrazolinonai, kurie aprašyti JAV patente Nr. 4 734 124, o t.p. tarptautinėse paraiškose Nr.Nr. WO 85/01939 ir WO 87/03873;
aril-triazindionai, kurie aprašyti JAV patentuose Nr.Nr. 4 755 217 ir 4 766 233, o t.p. tarptautinėje paraiškoje WO 86/00072;
aril-hidantoinai, kurie aprašyti JAV patente Nr. 4 427 438;
aril-urazolai, kurie aprašyti JAV patente Nr. 4 452 981;
aril-heksahidropiridazinai, kurie aprašyti JAV patente
Nr. 4 619 687.
B. Ari1-heterocikliniai uretanai, kurie aprašyti JAV patente Nr. 4 521 242.
C. Herbicidai paprasto fenilo eterio pagrindu iš tų, kurie turi para-halogen- arba para-nitro-fenoksifenilinę struktūrą, būtent, tokie kaip šie prekyboje esantys preparatai:
5-(2-chloro-4-(trifluorometil) fenoksi)-2-nitro-Nmetanesulfonilbenzamidas (fomesafen) natrio 5-(2-chloro-4-(trifluorometil )fenoksi)-2nitrobenzoatas (acifluorfen) metil 5-(2,4-dichlorofenoksi)-2-nitrobenzoatas (bifenox)
2-chlor-l-(3-etoxy-4-nitrofenoksi)-4-trifluorometil-benzenas (oxyfluorfen)
Kiti tinkami ir prekyboje esantys herbicidai paprastų difenilinių eterių pagrindu yra šie junginiai:
Laktofen: 1-(karboetoksi)-etil-5-(2-chlor-4-trifluormetil-fenoksi)-2-nitrobenzoatas;
Fliuorogliukofen: (karboetoksi)-metil-5-(2-chlor-4trifluormetilfenoksi)-2-nitrobenzoatas;
Fromesofen : 5-[ 2-chlor-4- (trif luormetil) -fenoksi] -Nmetilsulfonil-2-nitrobenzamidas;
Chloronitrofen : 2,4,6-trichlor-(4-nitrofenoksi) -benzenas ;
Chlorodifen: 2-nitro-l-(4-nitrofenoksi)-4-trifluormetil-benzolas;
Nitrofen: 2,4-dichlor-l-(4-nitrofenoksi)-benzenas;
Chlometoksifen : 4-(2,4-dichlorfenoksi)-2-metoksi-lnitrobenzenas.
Be to, dar vienu tinkamu paprastu difenilo eteriu yra oksim-O-acetatas 5- (2-chlor-4-trifluormetilfenoksi)-2nitroacetofenonas.
D. Herbicidai aril-pirazolų pagrindu, kurie aprašyti JAV patentuose Nr.Nr. 4 563 210, 4 496 390 ir 4 459 150, o taip pat Vokietijos paraiškoje Nr. 3 530 327 AI.
E. Junginys, kurio formulė:
Ii „ b
Pin v
II o i | ii o
kur x - deguonis arba siera, o Ph reikšmė tokia, kokia buvo nurodyta aukščiau; šie junginiai aprašyti Europos patento paraiškoje Nr. 273417, o t.p. kataloge Dervent Abstracts (žiūr. Nr. 87-040449).
Aktyvų junginį galima vartoti kaip sterilią kompoziciją, kuri yra reagentas, ištirpintas arba disperLT 3997 B guotas farmacijoje naudojamoje terpėje, pvz., vandeniniame izotoniniame tirpale, tokiame kaip sūrus vanduo (0,9% NaCl) arba pasūdytas Dulbecco buferinis tirpalas, kurio koncentracija yra 2,5 mg/ml eilės. Arba aktyvus junginys gali būti įjungtas į tokią liposominę sistemą, kurią galima gauti fosfolipidinėje terpėje, kaip tai aprašyta 1659-1660 psl. žinyne Remington's Pharmacentical Science, 17-me firmos Mack Publishing Co leidinyje. Pavyzdžiui, analogiškai receptūrai, kurią aprašė Jori su bendr. (žiūr.: Br.J. Cancer, 1983, 48 t., 307 psl.), galima ištirpinti 51,6 mg dipalmitoildifosfatidilcholino 10-je ml 1 mM reagento tirpalo mišinyje chloroformo su metilo spiritu (tūriniu santykiu 9:1) su tolimesniu tirpiklio pašalinimu (prieš tai kruopščiai sumaišius) 30°C temperatūroje, vakuume. Rezultate gaunama kieta medžiaga, kurią vėl galima pervesti į suspenduotą būklę 10-je ml 0,01 M fosfatinio buferinio tirpalo, turinčio 150 mM NaCl, kurio pH=7,4 su tolimesniu drumsto tirpalo apdorojimu ultragarsu 50°C temperatūroje 30 min.
Fermentus slopinančius reagentus, galima sujungti ar surišti su tinkamais monokloniniais antikūnais, specifiškai veikiančiais auglį (MABs), panaudojant surišimo techniką, gerai žinomą šios srities specialistams, ir reagentas, slopinantis fermentus, pristatomas į konkretų auglio pažeistą plotelį.
Pageidautina naudoti tokius fermentus slopinančius reagentus, kaip tirpias vandeny druskas arba rūgštinius junginius, sudarančius tirpias vandeny natrio ar kalio druskas, t.y. tokius, kaip sulfamidas, aprašytas Tarptautinėse paraiškose WO 87/037873 (pvz., reagentas 6c žemiau pateiktame 6 pavyzdyje) o t.p. WO 85/001939, WO 87/037873, arba jo vandeny tirpi druska, arba atitinkama karboksi rūgštis arba jos vandeny tirpi druska, pvz., natrio druska, žinoma Acifluorfeno pavadinimu.
Fermentus slopinančius aktyvius junginius, pagal šį išradimą, galima įjungti į įprastus farmacijos preparatus, tokius kaip tabletės (pvz., presuotos tabletės, ant kurių užtepta cukraus pasta ir/arba sirupas), žvakutės, kapsulės (pvz., kietos želatinines kapsulės), suspensijos, tirpalai, milteliai ar ampulės. Tokiuose preparatuose aktyvusis komponentas gali būti mišinyje su farmacijoje vartojamais kietais ar skystais nešikliais, kurie esant pageidavimui, gali būti maisto produktai. Pavyzdžiui, tai gali būti kietas produktas, kaip kukurūzų krakmolas arba skystas, kaip vanduo, arba maistinis ar mineralinis aliejus, arba tirpiklis: dimetilsulfoksidas ir pan. Galima vartoti fermentus slopinančių aktyvių komponentų mišinius, pvz., aktyvaus komponento 6c, nurodyto 6 pavyzdyje, mišinį su Acifluorfenu apytikriai vienodais kiekiais. Skiriamą dozę galima nustatyti įprastu eksperimentiniu keliu, gerai žinomu duotos srities specialistams, pagal eksperimento, aprašyto preparatui Fotofrin (Photophrin), metodiką Daferti straipsnyje Piktybinių auglių fotodinaminė terapija (FDT), žiūr.: CRC Critical Reviews leidinyje Geneology Hematology, 1984, 2 t., 2 leid.,
83-116 psl.
Išradimą iliustruoja šie pavyzdžiai:
pavyzdys
HeLa ląstelės (linija žmogaus navikinių ląstelių, paprastai naudojamų navikų tyrimams, išvesta iš kultūrų banko American Type Culture Collection), esančios logaritminio augimo fazėje (išaugintos 37°C temperatūroje per 5 paras 1 1 talpos falkoninėse kolbose audinių kultūroms), buvo išplautos buferiniame fosfatiniame druskos tirpale (BFDT). Vėliau prie jų pridėjo 0,25% tripsino tirpalo 2 ml BFDT. Po kelių minučių preparatą atsargiai ištraukė iš kolbos ir patalpino į stiklinę su
100 ml 25 mM HEPES tirpalo minimalioje pagrindinėje terpėje (MEM), pridėjus prie MEM 10% (svorio, dalys) neaktyvuotos veršelių plazmos, 1,1 ml 200 mM glutamino tirpalo 0,85% druskos tirpale, o t.p. 11.000 vienetų penicilino/11.000 kg streptomicino.
Gautą ląstelinę kultūrą, vėl pervestą į suspenduotą būklę, porcijomis po 5 ml patalpino į 50 ml talpos falkonines kolbas audinių kultūroms ir (išskyrus kontrolinį bandinį), sumaišė su aktyviu junginiu. Nurodytas porcijas 3 paras išlaikė tamsoje, 37°C temperatūroje. Po to audinių kultūras ištraukė ir ekstrahavo žalioje šviesoje tokiu būdu:
Nuo kolbos dugno ląsteles pakėlė, pridėdami 0,8 ml 0,25% tripsino tirpalo BFDT. Po 1 vai. trukusio inkubacinio auginimo tamsoje, ląsteles ir terpę išėmė iš kolbos, patalpino į apvaliadugnį centrifugavimo mėgintuvėlį ir, norėdami suardyti ląsteles ir suteikti galimybę ekstrahuoti, atliko du užšaldymo - atšildymo ciklus. Ląstelių suspensijos tyrimai po šios ardančios operacijos nerodė nesuardytų ląstelių.
Po to į kiekvieną mėgintuvėlį įpylė po 10 ml šarminio acetono tirpalo (90% acetono: 10% 0,1 N NH4OH) ir centrifugavo, norėdami pašalinti proteiną ir ląstelių gabalėlius. Į iškilusią paviršiuje medžiagą pridėjo po 50 ml vandens, o po to - po 0,5 ml sotaus vandeninio NaCI tirpalo. pH reguliavo iki 6,8, įlašindami lašais 2 M KH2PO4 tirpalo. Po to užpildė C8 Baker Prop. tipo kolonėlę acetono - vandeniniu ekstraktu. Kolonėlę išdžiovino ir kiekvieną plovė 2 ml vandens. Tetrapirolus išplovė CH4OH:H2O mišiniu santykiu 90:10; mišinio tūris 2x1,5 ml. Po to buvo atlikta ekstraktų kiekybinė analizė spektrofluorimetru.
Nagrinėjamame eksperimente buvo panaudoti šie aktyvus j unginiai:
A. 5 - aminolevulino rūgštis, žinoma kaip tarpinis produktas tetrapirolų sintezėje.
Aktyvus junginys A buvo naudotas kaip sterilizuotas filtravimu 250 mM vandeninis tirpalas (pH=6,5). Aktyvūs junginiai B, C, D ir E (žiūr. formules žemiau) buvo naudoti kaip 50 mM tirpalai acetone. Į kontrolinį bandinį taip pat buvo pridėta 0,2% (tūrio dalys) acetono. Į audinių kultūras įvedinėjo tokius
B. Herbicidas, kurio formulė:
F α
o
C. Herbicidas, kurio formulė:
Cl
CHg
D. Herbicidas,
E. Herbicidas, kurio formulė:
kiekius nurodytų aktyvių komponentų, kad būtų gautos koncentracijos, nurodytos žemiau 1 lentelėje. Tokioje pat lentelėje pateikti ir gauto protoporfirino IX tetrapirolo (Proto IX) kiekiai.
lentelė
Tetrapirolo susikaupimas apdorotose HeLa ląstelėse
| Aktyvus | Aktyvaus agento | Fluorescentinė | Proto IX |
| komponentas | koncentracija, | emisija | kiekis, |
| μΜ | 400/630 s | pikomoliai |
| A | 5 000 | 41 | 842 | 4.2 |
| B | 100 | 12 | 921 | 1.3 |
| C | 100 | 33 | 477 | 3.5 |
| D | 100 | 10 | 551 | 1.1 |
| E | 100 | 8 | 967 | 0.9 |
| Kontrolinis bandinys | 2 | 795 | 0.3 |
pavyzdys
HeLa ląsteles logaritminėje augimo fazėje augino 6 paras šešiose 1 1 talpos falkoninėse kolbose audinių kultūroms 37°C temperatūroje, po to išplovė buferiniu fosfatiniu druskos tirpalu (BFDT). Vėliau prie jų pridėjo 0,25%-nio tripsino tirpalo buferyje (BFDT) ir po keletos minučių ląsteles atsargiai ištraukė ir patalpino į stiklinę su 110 ml 25 mM HEPES tirpalo minimalioje pagrindinėje terpėje (MEM), pridėjus 10% (tūrio dalys) neaktyvuotos veršelių plazmos, 1,1 ml 200 mM gliutamino tirpalo 0,85%-niame druskos tirpale, o t.p. 11.000 vienetų penicilino/11.000 ųg streptomicino.
Gautą ląstelinę kultūrą, vėl pervestą į suspenduotą būklę, porcijomis po 5 ml patalpino į 50 ml talpos falkonines kolbas audinių kultūroms su herbicidu arba be jo; inkubacinis apdorojimas tamsoje 37°C temperatūroje vyko 4 paras, be to, analogiškai 1 pavyzdžiui, herbicidą pridėjo praskiestame acetono tirpale. Acetoną taip pat pylė ir į kontrolinius bandinius, kad acetono koncentracija juose būtų 0,2% (tūrio dalys). Herbicido kiekis buvo toks, kad būtų gaunamos koncentracijos, nurodytos žemiau 2 lentelėje.
Apdorojimui naudojo tokius aktyvius komponentus:
B. Kaip 1 pavyzdyje.
C. Kaip 1 pavyzdyje.
F. Herbicidas, kurio formulė:
Ekstrahavimą vykdė tokiu būdu. Terpę iš kiekvienos kolbos patalpino į stiklinius apvaliadugnius mėgintuvėlius, be to, ląsteles, prilipusias prie falkoninių kolbų dugnų, išlaisvino, pridedant 0,5 ml 0,25% tripsino tirpalo BFDT; išlaikius keletą minučių 37°C temperatūroje, nurodytą ląstelių kultūrą iš kolbos nupildavo ir sujungdavo su ląstelių terpe.
Vėliau iš kiekvienos ląstelių suspensijos atskyrė lygias porcijas po 100 μΐ, norėdami nustatyti ląstelių kultūros tankį. Likę 5,4 ml ląstelių kultūros suspensijos 30 min. buvo apdorojama ultragarsu, norint suardyti ląsteles.
Po to į kiekvieną mėgintuvėlį įpylė po 10 ml šarminio acetono tirpalo (90% acetono:10% NH4OH) ir centrifugavo, norėdami pašalinti proteiną ir ląstelių gabalėlius. Į iškilusią paviršiuje medžiagą pridėjo po 50 ml vandens, o po to - po 0,5 ml sotaus vandeninio NaCI tirpalo. pH reguliavo iki 6,8, įlašindami lašais 2 M KH2PO4 tirpalo.
Produktą ekstrahavo iš terpės vanduo/acetonas, pakraudami į C8 Baker Prop. kolonėlę. Kolonėlę pradžioj džiovino, o po to plovė 3 ml metilo alkoholio ir vandens (90:10) mišiniu. Analogiškai 1 pavyzdžiui, visos ekstrahavimo operacijos buvo atliekamos tokiose sąlygose, kad protoporfirinas pilnai būtų apsaugotas nuo jį sužadinančio šviesos poveikio, t.y. žalioje šviesoje arba tamsoje, pvz., induose su balta danga. Po to nustatinėjo ekstraktų fluorescencijos parametrus spektrofluorimetru CPEX.
Susikaupusio protoporfirino (Proto IX) kiekybinius rodiklius nustatinėjo, pasitelkdami iš anksto rastus gęsimo koeficientus. Rezultatai pateikti 2 lentelėje.
lentelė
Augimo sulėtėjimo vidutiniai rodikliai ir Proto IX susikaupimas
| Aktyvusis junginys | Aktyvaus komponento koncentracija | Augimo sulėtėj imas 0 | Proto IX kiekis pikomoliais | Proto IX santykinis kiekis |
| B | 100 | 99 | 5.20 | 2 364 |
| F | 100 | 106 | 2.71 | 1 232 |
| C | 100 | 52 | 4.41 | 2.005 |
| C | 10 | -15 + | 0.57 | 259 |
| C | 1 | -26+ | 0.19 | 86 |
Pastabos:
+ Neigiama rodiklio augimo sulėtėjimas reikšmė sako, kad augimas vistik vyksta ++ Vidutinė reikšmė 10-čiai ląstelių +++ %, lyginant su kontroliniu bandiniu
Kitas šio išradimo aspektas - protoporfirino gavimo būdas. Pagal ji, tamsoje (arba šviesoje, nesužadinančioje Proto IX), augino eukariotų klasei priklausančius algae mikroorganizmus, parinkdami terpę, turinčią aukščiau aprašytus aktyvius junginius, slopinančius fermentinį protoporfirinogeno perėjimą į Proto IX. Terpę ir algae mikroorganizmus, arba ir tuos, ir kitus toliau apdorojo, norėdami ekstrahuoti Proto IX ir atskirti ji nuo chlorofilo, karotenoidų, suardydami ląstelinius audinius ir pan. Atskyrimą galima atlikti bet kuriuo Įprastu būdu, pvz., panaudojant skystos fazės chromatografiją, tame tarpe ir skysčių chromatografiją su atvirkščia faze, arba ištirpinant tirpiklyje, o taip pat nusodinant Proto IX, pervedus jį į chelatinį junginį su metalu, pvz., geležim, cinku ar magniu, po to (esant reikalui), regeneruojant Proto IX, kaip tai daroma pagal žinomą chelato veikimo praskiesta rūgštimi metodiką.
Operacijas visose atskyrimo stadijose atlieka esant apšvietimui, neiššaukiančiam Proto IX sužadinimo, pvz., žalioje šviesoje, kaip tai aprašyta A Priede, pavadintame Apdirbimas tamsoje, arba pilnoje tamsoje. Geležies chelatas nejautrus šviesai, taigi, naudojant šį junginį, galima dirbti šviesoje.
Algae mikroorganizmus geriau auginti ląstelių kultūros suspensijos pavidalu 15-30°C temperatūroje. Aktyvaus junginio - inhibitoriaus koncentracija gali, pvz., būti nuo 10 5 iki 10 7 M. Tinkamų algae mikroorganizmų pavyzdžiai: Scenedesmus sp., Chlamydomonas reinhardi, Englena sp., Bumilleriopsis filiformis.
pavyzdys
Mikroorganizmo Clamydomonas reinhardi (laukinė atmaina) kultūras augino nerūdyjančio plieno rezervuare, pvz., 300 1 talpos, naudodami žemiau aprašytą kultivacinę terpę. Į kultūrą pridėjo l-(karboetoksi)-etil-5-(2chlor-4-trifluormetilfenoksi)-2-nitrobenzoato (taip vadin. Laktofen, techninis fenileterinis herbicidas) tirpalo acetone, užtikrindami aktyvaus komponento koncentraciją 10 5 M ir galutinę acetono koncentraciją, lygią 0,1%. Mikroorganizmų išauginimui mišinį palikdavo ramybėje 4-7 paroms 25°C temperatūroje, atsargiai mechaniškai ir/arba aerodinamiškai pamaišydami. Kaip ir kitas operacijas, rezervuaro turinio filtravimą atlikdavo tamsoje: filtratą analizuodavo, nustatydami jame protoporfiriną IX.
Vienas iš protoporfirino IX nustatymo analizės metodų susideda iš reakcijos rezervuaro turinio (visą laiką esančio tamsoje) filtravimo ir acetono pridėjimo į filtratą. Vėliau šį mišinį ekstrahavo petrolio eteriu.
Po to vandens-acetono terpę ekstrahavo dietilo eteriu, kurį iš nuosėdų pašalindavo garinimu. Tas nuosėdas tirpino metilo alkoholyje, ir protoporfirino IX nustatymui panaudojo atvirkštinės fazės chromatografiją. Be to, galima panaudoti ir duoto junginio nustatymo metodiką, aprašytą 1 ir 2 pavyzdžiuose.
Terpės sąstatas
| Druskos | Molinė koncentracija Kon x 10 M | centratas 0. o | Koncentrato ml/1 |
| (Na citratas)6H2O | 1,7 | 10 | 5 |
| Metalų pėdsakai | kaip nurodyta žemiau | 10 | |
| FeCl2.6H2O | 0, 37 | 1 | 1 |
| CaCl2.2H2O | 0,36 | 5,3 | 1 |
| MgSO4.7H2O | 1,2 | 10 | 3 |
| NH4NO3 | 3,7 | 10 | 3 |
| kh2po4 | 2,2 | 10 | 3 |
| k2hpo4 | 1,7 | 10 | 3 |
| CH3CO2Na | 7,5 | 10 | 10 |
Mišinio koncentratas, turintis metalų pėdsakus:
| H3BO3 | mg/1 100 |
| ZnSO4.7H2O | 100 |
| MnSO4*4H2O | 40 |
| CoCl2.6H20 | 20 |
| NaMo04-2H20 | 20 |
| CuSO4 | 4 |
Kaip alternatyva mikroorganizmų Clamydomonas reinhardi pritaikymui yra pritaikymas kultūros Sendesmus sp. , išaugintos aukščiau nurodytoje terpėje, kur natrio acetatas pakeistas gliukoze.
pavyzdys
Šis pavyzdys analogiškas 3 pavyzdžiui, išskyrus tai, kad vietoje Laktofeno naudojamas 1-(4-chlor-2-fluor55-propargiloksifenil)-3-metil-4-difluormetil-A2-l, 1, 4triazolin-5-nas.
pavyzdys
Rodiklio I50 nustatymas
Protoporfirinogenas IX (Protogenas IX)
Preparato Proto IX tiekėjas buvo firma Porphyrin Products iš Logeno miesto, Jutos štato, JAV. Šį preparatą išskyrė gryname pavidale ir aprašė Fuesleris su bendradarbiais (T.P. Fuesler et all.: Plant Physiol., 1981, 67 t., 246-249 psi.). Šviežią Protogeną IX gaudavo, redukuodami Proto IX, panaudojant Na/H amalgamas, kaip tai aprašė Jacobs ir Jacobs (N.J. Jacobs and J.M. Jacobs: Enzyme, 1982, 28 t., 206-219 psi.), dirbę su 300 μΜ koncentracijos išgrynintu Proto IX.
Augalinė medžiaga
Agurkų daigus (Cacumis sativus L., Wiskonsin SMR 18) augino užtemdytoje daiginimo kameroje vermikulite, sudrėkintame skystomis firminėmis trąšomis (9-45-15). Daigus augino 25°C temperatūroje, esant santykiniam oro drėgnumui 80-90%. Daigus apšviesdavo dozuoto intensyvumo 25 μΕ/m trūkčiojančia šviesa su (PAR), naudodami firmos General Electric šviesos šaltinį Bright Stiek, valdomą elektroniniu taimeriu, per 60 min. ciklą apšviečiant daigus 1 min. Tokiu būdu buvo gautas augalinis audinys, sugebantis pagreitintai sintetinti chlorofilą, suvedant iki minimumo rezervinio krakmolo kiekį ir pradinio chlorofilo lygį.
Chloroplastų izoliavimas
Išsiskiriantys chloroplastai buvo izoliuojami pagal metodą, kurį aprašė T.P. Fuesleris su bendradarbiais (žiūr.: Plant Physiol., 1984, 75 t., 662-664 psl.) išskyrus tai, kad galutinėje valymo stadijoje plasticidus centrifugavo per 40% (tūr. dalys), o ne per 45% įdėklą iš Perco II medžiagos. Po to chloroplastai vėl buvo pervedami į koloidinę būklę buferiniame tirpale, turinčiame 0,5 M manitolo, 20 μΜ TĘS', 10 μΜ HEPES, 1 μΜ etilendiamintetraacto rūgšties, 1 μΜ MgCl, 1% (masės/tūrio) jaučio serumo albumino ir 1 μΜ ditioeritritolo, esant pH=7,7 ir galutiniam proteino kiekiui 2 mg/1.
Protoporfirinogen-oksidazės bandiniai
Bandiniai buvo paruošti taip, kaip tai aprašė Jacobs ir Jacobs (J.M. Jacobs and N.J. Jacobs: Arch. Biochem. Biophys. 1984, 229 t., 312-319 psl.). Chloroplastų suspensijos pavyzdžiai (po 0,2 mi) buvo preliminariai 15 min. apdoroti tamsoje, esant skirtingoms acifluorfen-metilo (AFM) koncentracijoms arba, kontrolinio bandinio atveju, esant acetono koncentracijai 0,2% (tūrio dalys) . Po to 50 μϊ šviežiai paruošto apie 15 nM kone. preparato Protogen įpylė į suspensiją, kad prasidėtų reakcija. Bandinių paruošimas baigėsi tuo, kad buvo įvesta 2,75 ml fluorometrinės medžiagos, kurią pasiūlė Jacobs ir Jacobs (J.M. Jacobs and N.J. Jacobs: Enzyme 1982, 28 t., 206-219 psl., susidedančios iš 1% (tūrio dalys) tvin-20 (polioksietilensorbitano monolauratas), mM tris-HCl ir 1 mM etilendiamintetraacto rūgšties pH=8,5, be to, 1 mM ditioeri tri tolo buvo pakeista 5 mM gliutationo. Po to suspensiją analizavo tiesioginio skaitymo metodu spektrofluorimetru SPEX Fluorog-2, aprūpintu fluorescencijos indikatoriumi drumstiems biologiniams pavyzdžiams. Susidariusio Proto IX kiekį nustatinėjo pagal priklausomybės tarp kiekybinės Proto IX emisijos prie 630 nm ir sužadinimo prie 400 nm grafiko standartinę kreivę, beje, ši kreivė buvo gauta grynam Proto IX fluorometrinėje terpėje.
Norėdami kiekybiškai nustatyti nefermentinio oksidinimo iki Proto IX laipsnį aukščiau aprašytame bandinyje, paruošė tokį pat bandinį, išskyrus tai, kad vietoj aktyvių chloroplastų suspensijos panaudojo suspensiją, kurioje chloroplastai buvo pervesti į neaktyvią būklę, 15 min. šildant 85°C temperatūroje. Atskaičius Proto IX kiekį, gautą tokiu būdu, iš jo kiekio, gauto dalyvaujant aktyviems chloroplastams kaip tik ir gauname Proto IX kiekį, susidariusį fermentiniu keliu. Rezultatai grafiškai pavaizduoti Fig. 1, kur LSD - mažiausia skirtumo reikšmė (bendrai priimtas žymėjimas).
Fig. 1 matome, kad rodiklis I50 (koncentracija, užtikrinanti 50%-nį slopinimą) sudaro mažiau nei 0,1 μΜ, pvz., apie 0,03 M.
Bandymas, kaip veikia 10 μΜ AFM į fermentinį Proto IX virsmą magneziniu Proto IX chloroplasto suspensijoje (dalyvaujant ATP), neparodė jokio slopinančio AFM poveikio į šį virsmą.
pavyzdys
Pagal šį pavyzdį fermentus slopinantys aktyvūs komponentai buvo pridėti į maistą pelių, kurios yra navikų nešiotojos, tuo tarpu į kelių kontrolinių pelių maistą jokių preparatų nepridėjo. Po to peles numarindavo, išimdavo inkstus, žarnyną, antinksčius, kepenis, navikus ir analizuodavo juos, nustatydami Proto IX kiekį. Buvo panaudoti šie fermentus slopinantys aktyvūs junginiai:
žiūr. 23 psl.
Bandymams buvo panaudojamos DBA/2 Ha linijos pelės, kurioms nuline dieną į dešinį petį suleisdavo poodinį navikinį preparatą SMT-F. Pirmą dieną po to pelės gaudavo specialų maistą graužikams: Purina Rodent Chow 5001 Mash be priedų. Toliau 2-10 parų pelės gaudavo tą patį maistą su tiriamo fermentus slopinančio aktyvaus junginio 2 promilių priedu (kontrolinės pelės gaudavo tą patį maistą, bet be priedų). Priedą įvesdavo į maistą, įmaišydami nedidelį kiekį tiriamo aktyvaus junginio tirpalo acetone. Dešimtą parą peles numarindavo, išskyrus pele, paveiktą aktyviu junginiu, pažymėtu 6j : šią pelę numarindavo jau septintą parą. Gyvulėlių audinius palikdavo nakčiai 4°C temperatūroje, kad atšaltų, po to drėgmę pašalindavo sugeriamuoju popieriumi ir nustatydavo kiekvieno audinio pavyzdžio masę. Vėliau iš audinių ruošė homogeninę suspensiją 5-se ml (žarnyno ir kepenų audiniams - 10 ml) acetono ir 0,1 N NH4OH mišinyje, kur tūrinis jų santykis 9:1. Po to homogeniniai preparatai buvo centrifuguojami, esant 1500 g, ir išplautos į paviršių medžiagos buvo analizuojamos SPEX FA112 spektrofluorometru. Proto IX optimalūs yra sužadinimas prie 400 nm ir emisija esant bangos ilgiui 630 nm. Proto IX susikaupimą nustatinėjo pagal fluorescentini blykstelėjimų skaičių 1 g audinio per sekundę. Rezultatai pateikiami žemiau 3 lentelėje (kiekvienam preparatui reikšmės yra vidutinės pelių porai, išskyrus bandymus su aktyviais junginiais 6f, 6h, 6i ir 6j, kai bandymams ėmė tik vieną pelę.
lentelė
Fluorescentinių blykstelėjimų skaičius (xlO3 s 3) 1 gramui audinio preparatui Proto IX
| Aktyvus junginys | Navi- kas | Kepe- nys | Inks- tai | Antinks- čiai | Žarny- nas | Naviko masė sureagavusi į poveikį, mg |
| 6a | 1203 | 4291 | 10817 | 6572 | 5870* * ** | 143 |
| 6b | 1520 | 1261 | 2441 | 2529 | 5577** | 90 |
| 6c | 14336 | 2739 | 16186 | 13790 | 9937** | 157 |
| 6d | 2006 | 1581 | 12865 | 443 | 5565** | 294 |
| 6e | 836 | 876 | 915 | 1331 | 2069** | 165 |
| 6f | 449 | 1170 | 661 | 5611 | 1157 | 69 |
| 6g | 166 | 803 | 606 | 1984 | 466 | 250 |
| 6h | 298 | 914 | 585 | 2259 | 584 | 192 |
| 6i | 932 | 1510 | 4014 | 36940 | 3454 | 20 |
| 6j | 1251 | 538 | 315 | 491 | 572 | 11 |
| Kontrol. | 239 | 536 | 494 | 1504 | 233 | 200 |
2 4* *
Pastabos:
* Lentelės duomenis reikia skaityti su koeficientu x 10.
** Matavimai atlikti pavyzdžiams, praskiestiems šarminiu acetonu (3 dalys acetono 1 daliai pavyzdžio).
Nurodyti 4 lentelėje duomenys atitinka Proto IX kon15 centracijoms atitinkamuose audiniuose. Matavimo vienetas: Proto IX mikro gramai (ųg) vienam g audinio.
lentelė
| Aktyvus j unginys | Navikas | Kepenys | Inkstai | Antinksčiai | Žarnynas |
| 6a | 11 | 39 | 99 | 60 | 54 |
| 6b | 14 | 12 | 22 | 23 | 51 |
| 6c | 131 | 25 | 148 | 126 | 91 |
| 6d | 18 | 14 | 117 | 4 | 51 |
| 6e | 8 | 8 | 8 | 12 | 19 |
| 6f | 4 | 11 | 6 | 51 | 11 |
| 6g | 2 | 7 | 6 | 18 | 4 |
| 6h | 3 | 8 | 5 | 21 | 5 |
| 6i | 9 | 14 | 37 | 337 | 32 |
| 6j | 11 | 5 | 3 | 4 | 5 |
| Kontrol. | 2 | 5 | 5 | 14 | 2 4 |
Aukščiau cituojamame Dougherty straipsnyje nurodoma, 5 kad porfirino koncentracija to paties tipo (SMT-F) navike po 10 mg/kg hematoporfirino injekcijos tos pačios linijos DBA/2 pelėms yra 3,6 pg/g. Kitoje mokslinėje publikacijoje (Moan et ai: P P 46-5, 713721 psl., žiūr. pavyzdį 2 pieš., 716 psl.) nurodoma, 10 kad CH/Tif tipo navikams 12 pg/g eilės porfirino koncentraciją, kurią DBA/H2 linijos pelėms užtikrina mg/kg fotofrino II (Photofrin II) injekcija į pilvo sritį, plačiai naudoja, norėdami suteikti jautrumą šviesai, fotodinamiškai gydant ir diagnozuojant vėži15 nius susirgimus.
Pelės suėsdavo tokius maisto su aktyviu junginiu kiekius: 6a) 22 ir 35 g; 6b) 37 ir 35 g; 6c) 25 ir 22 g;
6d) 41 ir 32 g; 6e) 40 ir 44 g; 6f) 27 g; 6g) 33 ir 40 g; 6h) 36 g; 6i) lOg; 6j) 20 g.
Vykdant eksperimentus, aprašytus 6 pavyzdyje, su gyvūnėliais, nesančiais navikų nešiotojais, buvo naudojamas aktyvus junginys (jeigu nenurodyta kitaip), kuris šiame pavyzdyje pažymėtas 6c, ir operacijų seka buvo tokia:
a) nustatant aktyvaus junginio rodiklį LD50 jis pasirodė besąs virš 2600 mg/kg (t.y., mg aktyvaus junginio 1 kg kūno masės) žiurkėms, kai tą rodiklį nustatinėjo po 14 dienų, vieną kartą gyvūnams suėdus porciją kukurūzų aliejaus su 15% aktyvaus junginio ir virš 700 mg/kg pelėms, kai tą rodiklį nustatinėjo po 14 dienų, vieną kartą gyvūnams suėdus to paties aliejaus su 5% aktyvaus junginio.
b) Tiriant sąstatus be aktyvaus junginio, skirtus injekcijoms į pilvo ertmę, buvo aptikta, kad pelės gali atlaikyti 0,5 ml dozės injekcijas mišinio iš lygių dalių dimetilsulfoksido ir vandens.
c) Bandant aktyvų junginį, įvedama injekcija į pilvo ertmę mišinyje iš 60% kukurūzų aliejaus ir 40% dimetilsulfoksido buvo nustatyta, kad pelės gali atlaikyti dozę 100 mg/kg.
d) Su pelėmis buvo atlikti tokie eksperimentai:
1) per 8 dienas kasdien sumaitinama dozė 50 mg/kg (naudojant 1% aktyvaus junginio acetone tirpalą),
2) per 8 dienas kasdien suleidžiama į pilvo ertmę 50 mg/kg dozė 1%-nės aktyvaus junginio mineraliniame aliejuje dispersijos, paruoštos tirpinant aktyvų junginį dimetilsulfoksido laše ir sumaišant gautą tirpalą su mineraliniu aliejumi,
3) per 8 dienas kasdien užtepama ant odos 50 mg/kg 1% dimetilsulfoksido tirpalo dozė,
4) per 8 dienas maitinama standartiniu maistu, pridėjus 2 promiles nuo maisto masės aktyvaus junginio,
5) per 4 dienas kasdien suleidžiama į veną 50 mg/kg 2%nio dimetilsulfoksido dozė.
Po to peles, su kuriomis atlikti eksperimentai, numarindavo ir nustatydavo Proto IX susikaupimą jų audiniuose .
Kitame eksperimente Fisher 344 linijos žiurkės patinėlį per 24 dienas šėrė maistu su 5 promilėm aktyvaus junginio 6c, po to gyvūną numarindavo. Tos žiurkės audiniuose buvo pastebėti padidinti Proto IX kiekio lygiai, palyginus su kontroliniu gyviu, beje, žymesnis lygių padidėjimas buvo inkstų, žarnyno, skrandžio ir galvos smegenų audiniuose, tuo tarpu raumenų audiniuose 'pastebėtas tik nežymus lygio pakilimas.
Visuose aukščiau aprašytuose eksperimentuose žiurkės ir pelės buvo laikomos standartiniame apšvietimo režime: 12 vai. šviesoje ir 12 vai. tamsoje.
pavyzdys
Atliekant seriją eksperimentų pagal 1 ir 2 pavyzdžius, HeLa kultūros ląsteles inkubavo, dalyvaujant žemiau išvardintiems 100 μΜ koncentracijos įvairiems vaistiniams aktyviems junginiams. Rodikliai %-tais, kurie pateikiami po kiekvieno vaistinio aktyvaus junginio žymėjimo, rodo, kad dalyvaujant duotam vaistiniam aktyviam junginiui, susidariusio Proto IX kiekis padidėja, lyginant su tuo kiekiu, kuris susidaro to paties eksperimento kontroliniame pavyzdyje.
6-me pavyzdyje panaudoti aktyvūs junginiai turi tokias reikšmes: 6a) 337%; 6b) 336%; 6c) 297%; 6d) 1200%; 6e) 1210%; 6f) 280%; 6g) 326%; 6h) 431%; 6i) 544%; 6j) 469%; kitų aktyvių junginių formulės ir atitinkamos procentinės reikšmės tiems junginiams pateiktos žemiau, (žiūr. 29 psl.) pavyzdys
Šiame pavyzdyje fermentus slopinantį aktyvų junginį 6c iš 6 pavyzdžio sumaitino žiurkėms su įskiepytu naviku, po to navikinę zoną apšvitino šviesa, tuo būdu iššaukdami naviko rezorbciją.
Būtent, trims Sprague Dawley linijos žiurkėms, kurių masė vidutiniškai po 120 g, 6 dienų periodui buvo paskirtas maisto racionas su 2 promilių aktyvaus junginio priedu. Trečią parą ant kiekvienos žiurkės dešinės užpakalinės kojos implantavo chondrosarkomą, įleisdami 0,3 ml navikinių ląstelių suspensijos (1 milijonas navikinių ląstelių). Šeštą parą nuskuto kiekvienos žiurkės dešinės užpakalinės kojos plaukų dangą ir matavo kiekvieno naviko dydį. Toliau naviko pažeistą sritį ir aplinkinę odą švitino nešiluminėmis dozėmis šviesos, kurios bangos ilgis 630 nm, energijos srovės tankis 270 Dž/cm. Kitą dieną pasirodė, kad 2 žiurkės žymiu laipsniu išsigelbėjo nuo savo navikų (t.y., naviko masė daugiau neapčiuopiama), o trečios žiurkės navikas beveik rezorbavosi. Visoms žiurkėms oda apie navikus ir raumenų ląstelės truputį pabąlo ir atrodė lyg patinę, bet žymiai mažiau, negu tai būna naudojant preparatą Photofrin II fotodinaminėje terapijoje.
A priedas
Bandymas nustatyti išplovimo procentinį rodiklį
Bandymo eigoje, nustatant išplovimo procentinį rodiklį, naudojo sėklaskiltes, surinktas iš tamsoje sudaigintų agurkų daigų. Pirmoje stadijoje sėklaskilčių masę apdorojo tamsoje vandeniniu tirpalu (dalyvaujant buferiniam junginiui), turinčiu cukrų su radioaktyviais žymėtaisiais atomais. Po to matavo cukraus, kurį įsisavino sėklaskiltes, kiekį pagal žemiau aprašytą skaičiavimo metodiką. Visą sėklaskilčių masę dalino į dvi porcijas. Vieną iš tų porcijų apdorojo tamsoje vandeniniu tirpalu (dalyvaujant buferiniam junginiui) , kuriame yra tiriamas junginys, o kitą lygiai taip pat apdorojo tamsoje tuo pačiu tirpalu, tik be tiriamojo junginio (kontrolinis bandinys). Pamerktos į nurodytus vandeninius tirpalus sėklaskiltes 16 vai. buvo švitinamos šviesa, po to jas atskyrė nuo vandeninių tirpalų, kuriuose matavimo ir skaičiavimo metodu nustatinėjo medžiagos su radioaktyviais žymėtaisiais atomais kiekius. Gauti rezultatai buvo po to pateikti kaip išplovimo procentinis rodiklis (IPR), paskaičiuojamas pagal formulę:
IPR= (ST-SC) /S, kur S, ST ir Sc - atitinkamai medžiagos su radioaktyviais žymėtaisiais atomais skilimų skaičiai (vienai sėklaskiltei):
a) toje medžiagoje, kurią įsisavino sėklaskiltes jų pradinio apdirbimo metu,
b) vandeniniame tiriamojo junginio tirpale po švitinimo ir
c) kontroliniame vandeniniame tirpale po švitinimo.
Panaudotos medžiagos, o t.p. bandymo sąlygos, nustatant IPR, detaliau charakterizuojamos toliau.
Augalinės medžiagos
Vermikulite, sudrėkintame prekyboje turimomis trąšomis 9-45-15, buvo sudaigintos agurkų sėklos Cocumis Salivus L., rūšis Wisconsin SMR, iš kurių inkubacinėje kameroje 25°C temperatūroje, esant santykiniam oro drėgnumui 8090% tamsoje išaugino daigus. Po 5 parų nuo pasėjimo momento iš po blyškių, tamsoje išaugusių daigų ūglių surinko sėklaskiltes ir išplovė jas 1,0 mM CaCl2 tirpale. Visas tas operacijas atliko žalioje šviesoje.
Buferinis tirpalas
Tirpale yra 1 mM KC1, 1 mM CaCl2, 2,0 mM kalio fosfato; jo pH sureguliuotas iki 6,5 (kaip ir naudojant NaOH).
Cukrus su radioaktyviais žymėtaisiais atomais
Ta cukraus rūšis yra 3-O-metil-3[ 11-14C] -gliukozė su specifiniu aktyvumu 10,9 GBk/mM; tiekėjas: firma Amersham Corp. Arlingtono miestas, Ilinoiso valstija, JAV.
Pradinis apdorojimas
180-230 vienetų išplautų sėklaskilčių supylė į plačiagurklę 250 ml talpos Erlenmėjerio kolbą su putų poliuretano kamščiu, į kurią įpilta 50 ml buferinio tirpalo ir įdėta cukraus su radioaktyviais žymėtaisiais atomais toks kiekis, kad jo koncentracija tirpale būtų 600 nM. Tamsoje ant besisukančio įrenginio 24 vai. bėgyje kolbą kratė 125 min.'1 dažniu. Po to sėklaskiltes iškrovė ant neiloninio tinklo ir 3 kartus plovė 1 mM CaCl2, tirpalo porcijomis, kurių kiekviena - 20 ml. Cukraus su radioaktyviais žymėtaisiais atomais įsisaLT 3997 B vinimą nustatinėjo, ištirpindami 3 pavyzdžius, kurių kiekviename buvo po 5 sėklaskiltes, audinių tirpiklyje (markė NCS, firmos Amersham Corp. gamyba) ir sumarinį suvartojimą paskaičiuodavo skysčio scintiliacijos spektrometre .
Buvo nustatyta, kad suvartojimo nustatymo eksperimentas ekvivalentiškas analogiškiems nustatymams, sudeginant atrinktus sėklaskilčių bandinius savireduktoriuj e.
Apdirbimas panaudojant tiriamą junginį, o taip pat kontrolinis apdirbimas
Penkias sėklaskiltes paliko plaukioti 3 ml buferinio tirpalo, įpilto į 35 mm diametro plastmasinę Petri lėkštelę su dangteliu, paviršiuje. Po to ten įpylė tokį tiriamo junginio (jo tirpalo acetone) kiekį, kad būtų užtikrinta reikiama (apie kurią buvo pasakyta aukščiau) tiriamo junginio koncentracija buferiniame tirpale. Acetono kiekis buferiniame tirpale sudarė 0,1% (tūrio dalys) kaip kontroliniame bandinyje, taip ir tirpale su tiriamu junginiu. Plaukiančios sėklaskiltes 16 vai. sukosi ratu verpete, kuris susidarė kratant lėkšteles 90 min.-1 dažniu besisukančio kratančio įrenginio paviršiuje .
Švitinimas šviesa
Petri lėkšteles su sėklaskiltėmis, plaukiančiomis tirpalų paviršiuje, 16 vai. švitino keturių fluorescentinių lempų GE F20T12-CW šviesa, esant duotam intensyvumui 150 μΕ/m spektrinėje fotosintezės srityje (SFSS), be to, minėtą intensyvumą matavo sėklaskilčių paviršiuje, kai lėkštelės tuo metu buvo nenutrūkstamai kratomos.
Skystyje esančios medžiagos su radioaktyviaisiais žymėtaisiais atomais kiekio matavimas
Visą skystį atskyrė nuo sėklaskilčių; skysčių scintiliacijos spektrometru nustatinėjo skilimų skaičių.
Tamsa
Iki švitinimo šviesa stadijos, visas kitas apdorojimas buvo atliekamas žalioje šviesoje, kurią skleidė fluorescentinis šaltinis, t.y. šviesoje, praėjusioje per žalią atskiriantį plastmasinį šviesos filtrą, praleidžiantį 450-600 nm bangos ilgio šviesą.
B priedas lentelė
Terpė kultūroms
M terpė
| Druskos | Moliaringumas | Koncentratas | ml koncentrato 1-nam litrui |
| MgSO4.7H2O | 1.2xlO~3M | 10% | 3 |
| NH4NO3 | 3.7xlO'3M | 10% | 3 |
| kh2po4 | 2.2xlO”3M | 10% | 3 |
| k2hpo4 | 1.7x10’3M | 10% | 3 |
Mišinio, turinčio metalų pėdsakus, koncentratas
| H3BO3 | 100 | mg/1 |
| ZnSO4.7H2O | 100 | mg/1 |
| MnSO4«4H2O | 40 | mg/1 |
| COC12.6H2O | 20 | mg/1 |
| NaMo04»2H20 | 20 | mg/1 |
| CuSO4 | 4 | mg/1 |
A terpę kultūroms ruošė, pridėdami į M terpę 10 ml/1 10% vandeninio natrio acetato tirpalo (koncentracija 7,5x10' M) .
Visus komponentus pylė į distiliuotą vandenį aukščiau nurodyta tvarka, po to juos 15 min. apdorojo autoklave 1,05 kg/cm slėgyje.
Konservuoto preparato kultūrų auginimui šviesos poveikyje atsarga
Užkonservuotas y-I kultūras akseniškai pervesdavo į skystas kultūras A arba M terpėje, geriau A terpėje, Erlenmejerio kolbose, uždarytose poliuretano kamščiais, 25°C temperatūroje tokio ciklo sąlygomis: 14 vai. apšvietimo ir 10 vai. tamsos. Konservuotas kultūras inkubuodavo (be papildomo aeravimo) ant besisukančio kratančio įrenginio, dirbančio 125 min 1 dažniu. Apšvietimo intensyvumas kultūros sluoksnio lygyje sudaro 120 μΕ/kv.m.s (SOFS). Tokiose sąlygose kultūros yra pusiausinchroninio augimo režime iki tol, kol jos nepereina į stacionarinę fazę, turinčią (2-4)xl0 ląstelių viename ml.
Kultūrų auginimas be šviesos (kultūros, auginamos tamsoje)
7,5 ml šviesoje išaugintų ląstelių, esančių stacionarinėje kultivavimo fazėje iš konservuotos kultūros, pernešė į Erlenmejerio kolbą su 750 ml A terpės.
3-4 paras ląsteles inkubavo tamsoje, aeruodami per įgilintą aeracinį vamzdį 25°C temperatūroje. Per tą laiką turėjo įvykti 7-8 ląstelių y-I kultūros skilimai, netenkant viso matomo chlorofilo ir esant ląstelių koncentracijai (2-3)xl0 vnt./ml.
Ląstelių paruošimas bandinių tyrimams
Ląsteles išskirdavo iš 750 ml šviežiai paruoštos, tamsoje išaugintos kultūros, centrifuguodami apie 5 min. 20°C temperatūroje prie mažų apsisukimų (apie 2000 min x) . Tas ląsteles atsargiai vėl pervesdavo į suspenduotą būklę 50 ml A terpės. To suspensijos bandinyje (0,25 ml) nustatinėjo ląstelių judrumą, o užfiksavę 1%-niu vandeniniu gliceraldehido tirpalu - skaičiavo ląstelių kiekį 1-me ml. Dažniausiai ląstelių skaičius būna 5xl07 vnt./ml. Ląstelių kultūrų porcijas po 1 ml, turinčias po 10 vnt. ląstelių, patalpina į indus bandymams, pvz., į falkonines lėkšteles, skirtas audinių kultūroms, su 24 duobutėmis. Šioje stadijoje ląstelės yra nusidažiusios geltona spalva ir yra labai judrios.
Tiriamą junginį tirpino tinkamame tirpiklyje, pvz., acetone, etilo spirite, dimetilsulfokside ar vandenyje (geriausia - acetone), kad gaunama koncentracija 1000 kartų viršytų galutinę. Penkių ar dešimties μΐ mikrošvirkšto pagalba į kiekvieną duobučių porą įleisdavo po 1 μΐ minėto tiriamo tirpalo. Ant kiekvienos lėkštelės analogiškai ruošė 4 kontrolines duobutes be tiriamo junginio. Lėkšteles audinių kultūroms uždengdavo permatomais plastmasiniais dangteliais ir 13-16 vai. augino kameroje 25°C temperatūroje, esant apšvietimui 7090 μΕ/kv.m.s. Jei duobučių turinys geltonavo, tai jį išimdavo taip, kaip tai aprašyta žemiau punkte Rezultatų įvertinimas. Jeigu gi bandomųjų duobučių turinys pasirodė permatomas ar blyškiai-žalsvas, tai prieš jį išimant talpino ant besisukančio kratančio įrenginio, dirbančio 125 min'1 dažniu ir 2 vai. švitino šviesa, kurios intensyvumas apie 600 μΕ/kv.m.s.
Rezultatų įvertinimas
Į kiekvieną bandomąją duobutę pildavo 250 μΐ 10% vandeninio natrio dodecilsulfato tirpalo ir 1 ml metilo spirito, po to duobutės turinį rūpestingai permaišydavo. Gautus mišinius laikė tamsoje 3-4 vai. Lėkšteles su augalinėm kultūrom 5 min kambario temperatūroje apdorojo centrifūgoje su mažais apsisukimais (apie 2000 min x) . Išplaukiančią i paviršių medžiagą nuimdavo ir analizuodavo 35 modelio Bekmano (Beckman) spektrofotometru bangos ilgio intervale 350-800 nm (nustatant protoporfiriną IX, kuriam sistemoje su minėtu tirpalu charakteringas chlorofilo sugėrimo pikas ties 668 nm) , o t.p. ties 720 nm, panaudojant drumstumo foninį rodiklį.
Duomenų analizė
Pažaliavimo rodiklį kiekvienai duobutei gaudavo, išskaičiuodami iš reikšmės, gautos ties 668 nm reikšmę, gautą ties 720 nm. Atitinkami dydžiai yra vidutiniai kiekvienai tiriamojo junginio koncentracijai, o t.p. kontroliniam bandymui. Procentinį slopinimo rodiklį nustato pagal formulę:
Q=100x(l-k), kur k - vidutinės pažaliavimo rodiklio reikšmės kiekvienai konkrečiai koncentracijai santykis su kontrolinio bandinio vidutine pažaliavimo rodiklio reikšme.
Claims (10)
- IŠRADIMO APIBRĖŽTIS1. Specifinis fermentinio protoporfirinogeno virsmo protoporfirinu IX, veikiant protoporfirinogenoksidazei pieno liaukos naviko ląstelėse, inhibitorius, tuo pačiu iššaukiantis protoporfirino IX susidarymą tose ląstelėse, besiskiriantis tuo, kad jis nėra tetrapirolo darinys, o yra aril-heterociklinis junginys, kurio formulėPh-NHet, kurioje Ph - pakeistas fenilas, o N-Het - 5- ar 6-naris heterociklinis žiedas, kurio formulė:- N - C = O, - N - C - OH arba - N - C - Cl ! / I II I IIQ Q - C - R Q - C - R kurioje Q yra heterociklinio žiedo uždaranti grupė, o R yra vandenilis arba ji pakeičianti grupė; aril-heterociklinis uretanas; fenileteris; arilpirazolas arba junginys, kurio formulė:arba kurioje X - deguonis arba siera, o Ph reikšmė yra tokia, kaip nurodyta aukščiau.
- 2. Inhibitorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėto junginio I50 protoporfirinogenoksidazei yra mažiau už 1 μΜ.
- 3. Inhibitorius pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo redoks-potencialas yra neigiamesnis už -500 mV.
- 4. Inhibitorius pagal bet kurį iš 1-3 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra l-(4-chlor-2fluor-5-propargiloksifenil)-3-met il-4-dif luormet ϋ-Δ21,2,4-triazolin-5-as.
- 5. Inhibitorius pagal 1-4 punktus, skirtas pieno liaukos naviko ląstelėms suardyti, veikiant ląsteles šviesa ir dalyvaujant tetrapirolui.
- 6. Inhibitorius pagal 1-4 punktus, skirtas pieno liaukos navikinėms ląstelėms diagnozuoti ir lokalizuoti, padidinus porfirino kiekį tokiose ląstelėse ir tiriant pieno liaukos ląsteles po apšvitinimo šviesa, aktyvuojančia porfiriną, bei matuojant fluorescenciją, kurios šaltiniu yra navikas.
- 7. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad jos sudėtyje yra junginys pagal bet kurį iš 1-4 punktų, kuris yra specifinis fermentinio protoporfirinogeno virsmo protoporfirinu IX inhibitorius, iššaukiantis tuo pačiu protoporfirino IX susidarymą pieno liaukos naviko ląstelėse, ir farmaciškai priimtina terpė-nešiklis.
- 8. Farmacinė kompozicija pagal 7 punktą, skirta pieno liaukos naviko ląstelėms suardyti, .veikiant ląsteles šviesa ir dalyvaujant tetrapirolui.
- 9. Farmacinė kompozicija pagal 7 punktą, skirta pieno liaukos naviko ląstelėms diagnozuoti arba lokalizuoti, didinant porfirino kiekį šiose ląstele ir tiriant pieno liaukos ląsteles po apšvitinimo šviesa, aktyvuojančia porfiriną, be matuojant fluorescenciją, kurios šaltinis yra navikas.
- 10. Protoporfirino IX gavimo būdas, besiskirian5 t i s tuo, kad jį išskiria iš eukariotų klasei priklausančių algae mikroorganizmų, išaugintų terpėje, kurioje yra inhibitoriaus pagal 1-4 punktus.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28515188A | 1988-12-12 | 1988-12-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LTIP1583A LTIP1583A (en) | 1995-06-26 |
| LT3997B true LT3997B (en) | 1996-06-25 |
Family
ID=23092959
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LTIP1583A LT3997B (en) | 1988-12-12 | 1993-12-10 | Process for preparing protoporphyrins and use thereof |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD298882A5 (lt) |
| LT (1) | LT3997B (lt) |
| MW (1) | MW1191A1 (lt) |
| ZA (1) | ZA899447B (lt) |
-
1989
- 1989-12-11 DD DD89335506A patent/DD298882A5/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-11 ZA ZA899447A patent/ZA899447B/xx unknown
-
1991
- 1991-05-17 MW MW1191A patent/MW1191A1/xx unknown
-
1993
- 1993-12-10 LT LTIP1583A patent/LT3997B/lt not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JORI G ET AL.: "Preferential delivery of liposome-incorporated porphyrins to neoplastic cells in tumour-bearing rats", BR J CANCER., 1983, pages 307 - 309 |
| JORRI AND PERRIA: "Photodynamic Therapy of Tumour and others Deseases", pages: 45 - 53 |
| KESSEL D.: "Components of hematoporphyrin derivatives and their tumor-localizing capacity", CANCER RES., 1982, pages 1703 - 1706 |
| P. FUESLER ET AL.: "Properties of Magnesium Chelatase in Greening Etioplasts", PLANT PHYSIOLOGY, 1981, pages 246 - 249 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LTIP1583A (en) | 1995-06-26 |
| ZA899447B (en) | 1990-10-31 |
| MW1191A1 (en) | 1994-05-07 |
| DD298882A5 (de) | 1992-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Türk et al. | Effects of pomegranate juice consumption on sperm quality, spermatogenic cell density, antioxidant activity and testosterone level in male rats | |
| KR930003116B1 (ko) | 종양의 광역학적 치료용 조성물 | |
| US5994410A (en) | Therapeutic use of water-soluble fullerene derivatives | |
| Iacovitti et al. | Melatonin rescues dopamine neurons from cell death in tissue culture models of oxidative stress | |
| Haley | Review of the toxicology of paraquat (1, 1′-dimethyl-4, 4′-bipyridinium chloride) | |
| Lipetz et al. | Indole acetic acid oxidase and peroxidase activities in normal and crown gall tissue cultures of Parthenocissus tricuspidata | |
| Kessel | Determinants of hematoporphyrin‐catalyzed photosensitization | |
| Rathbun et al. | Glutathione synthesis and glutathione redox pathways in naphthalene cataract of the rat | |
| Bajaj et al. | Effect of dimethyl sulfoxide on zinc65 uptake, respiration, and RNA and protein metabolism in bean (Phaseolus vulgaris) tissues | |
| RU2074719C1 (ru) | Способ разрушения опухолевых клеток млекопитающих и фармацевтическая композиция для разрушения опухолевых клеток млекопитающих | |
| LT3997B (en) | Process for preparing protoporphyrins and use thereof | |
| Munday et al. | Effect of inducers of DT-diaphorase on the toxicity of 2-methyl-and 2-hydroxy-1, 4-naphthoquinone to rats | |
| CS176291A3 (en) | Pharmaceutical | |
| Butterworth Jr et al. | Abnormal folate metabolism in feed-related anemia of cultured channel catfish | |
| Savarie | Toxic characteristics of fluorocitrate, the toxic metabolite of compound 1080 | |
| Soliman | Aspects of ascorbic acid (vitamin C) nutrition in Oreochromis niloticus and O. mossambicus | |
| Bermudez et al. | Effects of feeding Fusarium fujikuroi culture material containing known levels of moniliformin in turkey poults | |
| BALAN et al. | THE INFLUENCE OF POLYPHENOLS OF NETTLE EXTRACT (Urtica dioica) ON THE ANTIOXIDANT ACTIVITY IN THE BLOOD SERUM OF ROOSTERS. | |
| BEKUZAROVA et al. | Biological Methods Increasing the Productivity of the Winter False Flax | |
| Mészáros et al. | Myoglobin and cytochrome oxidase in the myocardium of the developing chick | |
| HRP930762A2 (en) | Preparation and use of porphyrin | |
| Rip et al. | Liver enlargement induced by the herbicide 2, 4, 5-trichlorophenoxyacetic acid (2, 4, 5-T) | |
| Dunn et al. | Ultrastructural and cytochemical studies on the ventral pouch of Gastrothylax crumenifer (Digenea: Paramphistomidae) | |
| ABRUNHOSA | Society for Electron Microscopy | |
| Swanson | THE TRANSLOCATION OF C14-LABELED COMPOUNDS IN THE PHLOEM OF GRAPE |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 19981210 |