KR980008223A - 유기인산제제 중독에 의한 경련, 치사 및 뇌손상 해독제 - Google Patents

유기인산제제 중독에 의한 경련, 치사 및 뇌손상 해독제 Download PDF

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Abstract

니트릭 옥사이드(NO) 생성 억제제로 이루어진 유기인산제제 중독에 의한 경련, 치사 및 뇌손상의 방어용 해독제가 제공된다. 본 발명에 따른 해독제는 중추신경계에 작용하는 항콜린성 약물과 복합사용될 수 있다. 본 발명의 해독제에 의해 유기인산 제제 중독에 의한 중독증상 및 후유증이 효과적으로 방지될 수 있다.

Description

유기인산제제 중독에 의한 경련, 치사 및 뇌손상 해독제
도1은 유기인산제제 중독의 독성병리학적 기전을 도시한 도면.
도2는 유기인산제제 중독에 대한 여러 가지 후보물질의 특성에 따른 진경효과를 도시한 그래프.
도3A 및 3B는 각각 유기인산제제 DFP에 의한 급성 세포사망 소견 및 프로그램된 세포사망 소견을 나타내는 사진.
도4A 및 도4B는 DEP에 의한 뇌손상에 대한 PC 및 L-NAME의 방어효과를 보여주는 사진으로 도4A는 PC30mg/kg 투여시, 도4B는 L-NAME 100mg/kg 투여시의 추체세포의 정상적인 모습과 시상핵에서의 감소된 면역염색 소견을 나타낸다.
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 유기인산제제에 대한 해독제를 제공하는 것이다. 더욱 구체적으로는, 유기인산제제 중독에 의한 경련, 치사 및 뇌손상을 효과적으로 해독할 수 있는 해독제를 제공하는 데 있다.
[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]
유기인산제제 등의 항콜린에스테라제(anticholinesterase)는 그 강력한 독성으로 인해 살충제로 널리 이용되고 있으며, 그 중 일부의 맹독성 유기인산제제는 화학작용제로 개발되어 사용되고 있다. (참조, Soma ni, S.M., ed.(1992), Chemical Warfare Agents, Academic Press, San Diego). 유기인산제제 중독시의 독성 형태는 크게 콜린에스테라제 (cholinesterases,ChEs)억제에 따른 급성 콜린성 신경증상(acute choliner gic signs), 흥분성 아미노산(excitatory amino acids, EAAs) 수용체 활성화 및 억제성 아미노산 γ-아미노부탄산(γ-aminobutyric acid,GABA) 수용체의 불활성화에 따른 뇌신경 손상, 그리고 신경염 표적 에스테라제(neuropathy target esterase,NTE) 억제에 따른 지발성 다발성 신경염(organophsphate-induced deayedpolyneuropathy,OPIDPN)등 3가지 독성병리학적 증상으로 특징지어진다(도1참조).
유기인산제제 중독시의 급성독성 발현은 콜린에스테라제 억제에 따른 콜린성 신경연접(cholinergid nerve synapses)과 신경종말기 결합부(neuroeffector junctions)에의 과도한 아세틸콜린(acetylcholine,ACh)의 축적에 기인한 것으로, 무스카린성 증상(muscarinic signs), 니코틴성 증상(nicotinic signs), 중추성 증상(central effects) 등으로 구분되며, 결과적으로 주된 사망원인은 호흡중추의 억압에 따른 기관지 수축(broncho-constirction) 및 강직(broncho-spasm), 과분비 및 호흡근 마비 등에 의한 호흡곤란(respiratory failure)인 것으로 알려져 있다(참조,Dretchen, K.L.외, (1986), Toxicol.Appl.Pharmacol.83, 584;Rickett, D.J.외, (1987), Milmed.152, 35;Dunn, M.A＆Sidell, F.R.(1989), JAMA262,649), 이러한 유기인산제제 급성 중독증상의 해독은 증상치료제로서 무스카린성 수용체 차단제(antimuscarinic agent)인 황산 아트로핀(atropine sulfate,AtSO4)과 원인치료제로서 억제된 효소의 재활성화제인 옥심(oximes)의 복합투여로 이루어져 왔다. 그러나, 이 두 약물의 복합투여만으로는 성질이 다른 여러 가지 유기인산제제에 모두 만족할만한 해독 효과를 얻을 수 없다. 즉, 디오소프로필플루오포스페이트(diisopropylfluorophosphate,DEP)나 쏘만(soman)과 같이 효소 억제과정에서 빠르게 화학적 노화(aging)가 일어나는 유기인산제제의 경우 옥심의 재활성화 효력을 기대할 수 없다(참조,Berry,W.K＆Davies,D.R.(1970),Biochem.Pharmacol.19,927; Berm an,H.A.＆M.M.(1986),J.Biol.Chem.261,10646;Dunn,M.A.＆Sidell,F.R(1989),JAMA262 649)). 이러한 관점에서 생존율을 높일 수 있는 예방 전처치제로 피리도스티그민(pyridostigmine,PS)등의 카바메이트(carbamates) 약물이 개발되어 이들의 중독에 있어서도 상당한 생존율 상승효과를 얻게 되었다(참조,Koester,R.(1946), J.Pharmacol.Exp.Ther.88,39:Berry,W.K＆Davies,D.R(1970),Biochem.Pharmacol.19,927;Gordon,J.J.외(1978),Toxicol.Appl.Pharmacol.43,207). 그러나 이러한 복합처방에 의해 생존할 경우라도 뇌손상 등에 의한 행동이상 등의 후유증으로 정신집중 장애, 정신분열 증세, 우울증, 불면증, 기억상실, 신경과민, 심부전증, 시력이상 등이 남을 수 있어(참조, Metcalf,D.R.＆Holmes,J.H.(1969),Ann,NY Acad.Sci.160,357) 최근 해독 및 예방적 측면에서 뇌손상의 해결을 위한 노력에 관심이 집중되고 있다(참조, McLeod,C.G.,Jr.외,(1985),Fund. Appl.Toxcicol.5,sio; McDonough,J.H.,외(1989),Fund.Appl.Toxicol.13,256; Tryphonas,L.＆Clement,J.G.(1995),
Toxicol.Pathol.23,393). 다리 (후지)마비의 원인이 되는 유기인산제제 중독에 의한 지발성 다발성 신경염의 유발기전은 아직 밝혀져 있지 않으나 신경증상의 발현 전에 신경염 표적 에스테라제의 심한 억제가 선행되며(참조,Lotti,M.(1992),Toxicology21,465;Richardson,R.J.외,(1993),Fund.Appl.Toxico20,273)특히 효소 억제과정에서 화학적 노화 현상을 일으키는 유기인산제제에서 특이하게 지발성 다발성 신경염이 유발되므로 이 효소의 억제 및 화학적 노화와 관련되는 것으로 추정된다. 또 카바메이트나 페닐 메탄설포닐 플루오라이드(PMSF:phenylmethanesulfonylfluoride) 등에 의한 신경염 표적 에스테라제의 사전 억제는 유기인산제제에 의한 지발성 다발성 신경염의 유발을 효과적으로 예방하는 것으로 보고되었다.(참조, Veronsi,B.＆Padilla,S.(1985),Toxicol.Appl.Pharmacol.81,258;Carrington,C.D.(1989),Arch.Toxicol.63,165).그러나 신경염 표적 에스테라제 억제 후의 독성병리학적 기전은 밝혀지지 않았으며, 아드레노코르티코이드 등 (참조,Ehrlich,M.외(1988),Toxicol.Appl.Pharmacol.92,214;Lotti,M외(1993),Toxicol.Appl.Pharmacol.122,165)의 약한 치료효과 외에 효과적인 치료약물이 제시되고 있지 못한 실정이다. 한편 이러한 지발성 다발성 신경염 증상은 사람이나 조류에서 특징적으로 발현되나, 화학작용제 중에서는 쏘만(soman)에 심하게 중독되었을 때 나타나는 것으로 알려졌다.(참조,Somani,S.M.외(1992),Chemical Warfare Agents,Academic Press, San Diego;Lotti,M(1992),Toxicology,21,465).
본 발명의 목적은 유기인산 제제에 의한 중독증상 중 가장 심각한 문제인 경련 및 뇌손상의 방지를 위한 것으로, 유사 신경질환에도 적용가능한 효과적인 후보물질을 제시하고자 하는 것이다. 최근 여러 가지 원인에 의한 간질성 발작(epileptiform seizures)으로 인한 뇌손상의 예방에 많은 관심이 집중되면서 흥분성 아미노산이나 그 수용체의 효능제(agonist)가 뇌손상을 유발하는 것으로 알려졌으며(참조, Garthwaite,G.＆Garthwaite,J.(1989),J.Neurosci.Meth.29,33), 이러한 요인들은 뇌졸중 (strokes), 간질발작(epilepsy) 및 퇴행성 신경질환(neurodegenerative diseases)등과 같은 신경성 질환(neurological disorders)에서 중요한 역할을 할 것으로 여겨지고 있다(참조, Meldrum,B.＆Garthwaite,J.(1990),TiPS 11,379;Upton, N.(1994),TiPS 15,456;
Gerlach,M.외(1995),Biochem.Pharmacol.50,1).또한 유기인산제제 중독에 의한 경련 유발시에도 흥분성 아미노산이 증가하는 것으로 밝혀졌는 바(Lallemant,G.외(1992),Neurosci.Lett.139,104), 이때 흥분성 아미노산이 증가하는 것으로 밝혀졌는 바(Lallement,G.외,(1991)BrainRes.563,234;Lallemant,G.외(1992), Neurosci.Lett.139,104), 이때 흥분성 아미노산 수용체 길항제(antagonists)나 억제성 아미노산 GABA 수용체 효능제의 투여로 경련 및 뇌손상이 효과적으로 방지되는 것으로 보고된 바 있다(참조,McDonough,J.H.,Jr.외(1989),Fund.Appl.Toxicol.20,273;Shih,T.-M.외(1991),Neurosci.Biobehav.Rev.15,349;McDonough,J.H.,Jr.＆shih,T.-M.(1993),Neurosci.Biobehav.Rev.17,203).
흥분성 아미노산(글루타메이트,아스프테이트 등) 수용체는 3가지 이온통로 결합성(ionotropic)아형(sub types)과 1가지 대사 신호전달형(metabotropica) 수용체로 분류되는데, 이러한 분류는 각각의 수용체에 대한 효능제의 선택성에 따른 것으로 N-메틸-D-아스파테이트(N-methyl-D-aspartate,NMDA) 수용체,퀴스??레이트(quisqualate)/암파(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propinic acid, AMPA) 수용체, 퀴스??레이트(quisqualate)암파(α-amino-30hydroxy-5-methylisoxazole-4-propinic acid, AMPA) 수용체, 카이네이트(kainate) 수용체, 퀴스??레이트/이보테네이트를 감지하는 대사 신호전달형 수용체 등이다(참조,Choi,D.W.(1988),Neuron1,623;Makowiec,R.L.외(1991),Neuroscience 42,671;Albin,R.외(1992),Neuroscience46,35). 이들 수용체 중 주요 경련 발작은 NMDA 수용체의 활성화에 의해 일어나는 것으로 알려지고 있다.
유기인산제제로 인한 경련의 완화제로는 GABA 수용체 효능제류, NMDA 수용체 길항제류, 바비튜레이트(barbiturate)류, 칼슘이온(Ca2+)유입 차단제류 및 콜린성 신경 차단제류 등을 들 수 있다. (참조,Coudray -Lucas,C.외(1984),ActaPharmacol.Toxicol.5,153;Monino,E.F.(1987),Neurotoxicology8,113;McDugh,J.H.,Jr.외(1989),Fund.Appl.Toxicol.13,256;Shih,T.-M.외(1991),Neurosci.Biobehav.Rev.15,349;McDonough,J.H.,Jr.＆Shih,T.-M.(1993),Neurosci.Biobehav.Rev.17,203). 미국과 영국에서는 유기인산제제에 의한 경련을 완화할 목적으로 GABA 수용체 효능제를 사용하고 있으나 높은 용량이 요구되며, 심한 수면효과 등의 문제점이 대두되고 있다. 또 바비튜레이트류는 마취효과가 강하며, 칼슘이온 유입 차단제류 및 콜린성 신경 차단제류는 효과가 미미하다.
하지만 경련발작과 뇌손상과의 관련성은 인정되나 아직까지 뇌손상을 유발하는 매개물질은 잘 알려져 있지 않다. 현재까지는 흥분성 아미노산 수용체 중 NMDA 수용체의 자극에 따른 칼슘이온 농도의 증가가 뇌세포 사망의 주요원인이 될 것으로 제안되었다(참조,Choi,D.W.(1988),TINS 11,465). 이러한 칼슘이온 농도의 증가는 Ca2+-포스포리파제 A2,Ca2+-키나아제, Ca2+-엔도뉴클리아제, 칼파인, NO합성요소(NOS:NO synthase) 등등 칼슘이온 관련 효소들을 활성화시켜 세포구성성분의 분해나 세포기능의 저해로 사망에 이르게 한다(참조,kemp,J.A.(1994),TiPS,별지). 더 나아가 NMDA 수용체 자극에 의해 활성화된 NOS로부터 생성된 NO는 다시 흥분성 아미노산의 분비를 촉진시키는 것으로 알려져(참조, Montague,P.R.외,(1994),Science263,973) NO가 경련유도 혹은 촉진제로 제안되었다. 그러나 흥분상태에서 NO는 보상성으로 GABA 분비를 촉진시켜 피이드백 조절작용(feedback control)도 하는 것으로 알려졌다.(참조, Upton,N.(1994),TiPS 15,456). 이러한 이유로 해서 여러 가지 다양한 경련에 대해 NO생성 억제제들이 서로 상반된 결과를 보여주는 원인이 된다. 즉, NOS억제제인 L-N-니트로알기닌 메틸에스테르(L- N-nitroarginine methyl ester; L-NAME)나 L-N-모노메틸알기닌(L-N-monomethylarginine; L-NMMA)이 코카인(cocaine
)(참조, Itzhak, Y.(1994), Neurotoxicol.Teratol.16,363),메탐페타민(methamphetamine) (참조, Ohno.M.＆Watanabe,S.(1995),Eur.J.Pharmacol.275,39), 펜틸렌테트라졸(penthylenetetrazol)(참조, Osono, K.외,(1994),Brian.Res.663,338) 및 카이네이트(참조,Przegalinski,E.외,(1994),Neurosci.Lett.170,74)에 의한 경련을 완화시킨 반면 L-NAME나 L-N-니트로알기닌(L-N-nitroarginine;L-NA)은 NMDA(참조, Buisson,A.외(1993),NeuroReport4,444), 퀴놀리네이트(quinolinate)(참조,Haberny,K.A.외(1992),Neurosci.Lett146,187),카이네이트(참조,Rondouin,G.외(1993),NeuroReport4,1187) 및 비큐큘린(bicuculine)(참조,Wang,Q.외(1994),Brain Res.658,192)에 의한 경련을 증가시킨 것으로 보고되었다. 더욱이 필로칼핀(pilocarpine)이나 타크린(tacrine) 등의 콜린성 신경 자극제에 의한 경련발작유도모델에서도 서로 반대의 결과가 유도되기도 하였다(참조,Bagetta,G.외(1992),Eur.J.Pharmacol.213,301;Starr,M.S.＆Starr,B.S.(1993),Pharmacol .Bioche m.Behav.45,321;van Leeuven,R.외(1995), Eur. J. Pharmacol.287,211).
NO는 면역계, 심맥관계 및 신경계에서 NOS에 의해 생성되어 각기 외부로부터의 침입물질 제거, 혈관확장 및 신경전달 등의 작용을 하는 생리활성물질이지만 과도한 NO의 생성은 세포독성을 나타내는 바(참조,Dawson,V.L.(1991),Proc.Natl.Acad.Sci.88,6368;Lancaster,J.R.,Jr.(1992),Am.Scientists 80,248), 고농도의 NO에 노출된 세포는 프로그램된 세포사망(programmed cell death 또는 apoptosis)과정에 따라 죽게된다(참조,Albina,J.E.외(1993),J.Immunol.150,5080;Sarih,M.외(1993),Biochem.Biophys.Res.Comm.191,503;Blanco,F.J.(1995),Am.J.Pathol.146,75;Fehsel,K.외(1995),J.Immunol.155,2858).
[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]
본 발명자들은 유기인산제제에 의한 경련 및 뇌손상에 대해 NO생성 조절물질들의 영향을 조사하던 중 DFP에 의한 뇌손상 과정이 프로그램된 세포사망 및 급성세포사망 또는 괴사(acute cell death 또는 necrosis)의 형태로 나타남을 발견하였으며,이러한 경련 및 뇌손상에 NO가 깊이 관련됨을 확인하였다. 따라서 본 발명의 목적은 DFP를 비롯한 유기인산제제에 의한 경련,치사 및 뇌손상을 효과적으로 방지할 수 있는 약제를 제공하는 데 있다.
[발명의 구성 및 작용]
상기와 같은 목적 달성을 위해 본 발명에서는 유기인산제제에 의한 중독을 해독하기 위한 NO 생성 억제로서 NOS활성을 직접적으로 저해하는 기질유도체(substrate derivatives)로 L-NAME,L-NA 및 L-NMMA를, 기질 및 보조인자의 결합 저해제로 7-니트로인다졸(7-nitroindazole;7-NI)을, 칼모듈린(calmo dulin)의 작용을 차단하여 NOS활성을 억제하는 칼모듈린 길항제로 트리플루오페라진(trifluoperazine; TFP)을 (참조,Ogden,J.E.＆Moore,P.K. (1995) TIBTECH13,70),NO생성을 간접적으로 억제하는 NMDA수용체 길항제로 프로사이클리딘(procyclidine;PC)을(참조,Shih,T-M.외,(1991),Neurosci.Biobehav.Rev.15,349),그리고 칼모듈린 및 NMDA수용체의 동시적 길항제로 펜타미딘(pentamidine;PA)을 (참조,Reynolds,I.J.외,(1992),J.Newrosci.12,970;Kitamura,Y.외(1995),Eur.J.Pharmacol.289,299;Kitamura,Y.외(1995),Biol,Pharm.Bull.18,234) 선정하였다(표1).
표 1
후보물질의 약리작용 기전
▲, 촉진함, ▼, 억제함; (▼), 고농도에서 억제함
L-NAME는 10-200mg/kg,L-NA는 5-100mg/kg,L-NMMA는 5-200mg/kg,7-NI는 10-200mg/kg, TFP는 5-5-㎎/㎏, PC는 5-100mg/kg, 그리고 PA는 5-100mg/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다. 이와 같이 각 해독제의 용량을 정하는 것은 최소한의 해독효과를 내는 용량으로부터 약물자체의 부작용이 나타나지 않고 충분한 해독효과를 얻을 수 있는 용량까지를 제시하는 것이다.
한편, L-알기닌 메틸 에스테르(L-arginine methyl ester,L-AME)는 NOS의 기질로서 NO의 생성을 증가시키므로 NO의 경련촉진효과를 확인하기 위하여 사용하였다(참조,De,Sarro,G.외(1993),Eur.J.Pharmacol.230,151). 황산 아트로핀(AtSO4)은 고용량에서 진경효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며(참조,Shih,T.-M.외(1991),Neurosci.Biobehav.Rev.15,349), 유기인산제제 중독시의 주요 해독제이므로 본 발명의 후보약물과 복합투여시 사용하였다. 반면 메틸질산 아트로핀(atropine methylnitrate,AtMN)은 중추신경계에 대한 약리작용이 없어 말초성 중독증상을 제거하고 중추성 경련발작만을 보여주기 위한 실험모델 물질로 사용하였다.
참고로 본 발명에서 사용된 여러 후보물질들의 독성자료를 살펴보면, L-NAME, L-NA, L-NMMA 및 L-AME 등의 NOS 억제제들을 필수 아미노산인 L-아르기닌의 유도체로서 매우 안전한 화합물들이고, 그 밖의 TFP의 래트에 대한 경구투여시에 LD50값은 542.6mg/kg, 마우스에 대한 경구 투여시의 LD50값은 424.0mg/kg, PC의 마우스에 대한 정맥주사시의 LD50값은 60.mg/kg, 마우스에 대한 피하주사시의 LD50값은 300mg/kg, AtSO4의 랫트에 대한 경구투여시의 LD50값은 622.0mg/kg, AtMN의 마우스에 대한 복강주사시의 LD50값은 250.0mg/kg, PA의 마우스에 대한 경구투여시의 LD50값은 31.5mg/kg이다.
1) 유기인산제제의 선정
맹독성 유기인산제제 중 효소 억제과정에서 화학적 노화가 빠르게 일어나 뇌손상 유도물질로 널리 이용되는 DFP를 선정하였다.
2) NO생성 억제제의 선정
NO생성을 저해하는 물질들로는 NOS를 직접적으로 억제하는 기질유도체류 및 칼모듈린 길항제류, 칼슘이온의 증가를 막는 칼슘이온 통로 차단제류, NMDA수용제를 억제하여 간접적으로 칼슘이온의 증가를 막는 NMDA수용체 길항제류, 생성된 NO에 결합하여 NO의 작용을 막는 제거제(scavengers)등등 여러 가지가 있으나(참조,Marcocci,L.외(1991), Biochem.Biophys.Res.Comm.201,748;Shih,T.-M.외,(1991), Neurosci.Biobehav.Rev.15,349;Ogden,J.E.＆Moore,P.K.(1995),TIBETCH13,70;vanAcker,S.A.B.E.외(1995),Biochem.Biophys.Res.Comm.214,955), 위에서 언급한 부류의 후보물질을 선정하였는바, 이는 L-NAME,L-NA,L-NMMA 및 7-NI은 대표적인 NOS억제제이고, TFP는 잘 알려져 있는 강력한 칼모듈린 길항제로서 임상에서 쓰이고 있는 정신 안정제이며, PC는 임상에서 쓰이고 있는 파킨슨씨병(Parkinsonism)치료제이고, PA는 후천성 면엽결핍증(AIDS)에 의한 2차감염 및 치매(dementia)의 치료제이기 때문이다. 특히, L-NAME와 PC는 그 자체가 항무스카린성 효과, 즉 아트로핀 유사 효과도 가지고 있는 것으로 알려져 있다(참조,Buxton,I.L.O.외,(1993),Circ.Res.72,387;McDonough,J.H.Jr.＆Shih,T.-M.(1995),Pharmacol.Biochem.Behav.51,249).
3) 경련에 대한 진경효능 평가
후보약물의 진경효능은 유기인산제제 중독 후 경련 발현까지의 기간(time-to-onset) 및 경련의 강도( intensity)에 대한 지연 및 완화능으로 평가하였다. 경련발현 기간은 유기인산제제 주사 직후부터 최초로 경련증상이 나타날 때까지를 측정하였으며, 경련의 강도는 경련증상이 최고로 나타났을때의 강도를 다음의 5단계 기준으로 점수를 주었다.(참조,De Sarro,G.외(1993),Eur.J.Pharmacol.230,151).
1. 양측전지의 간대성 근육 연축(myoclonic jerks)
2. 입 및 안면운동(특히, 안면근육 연축, 턱 및 감각모의 간대성 경련) 및 두부의 끄덕임(head nodding)
3. 심한 전지의 간대성 경련
4. 일어서기(rearing) 및 심한 전지의 간대성 경련
5. 일어서기 및 넘어지기(falling)
4) 치사에 의한 해독효능 평가
유기인산제제 중독에 의한 치사에 대한 후보약물의 해독효능은 중독 후 24시간까지의 치사율(mortality,%)로 평가하였다.
5) 뇌손상에 대한 방어효능 평가
후보 약물의 뇌손상 방어효능은 유기인산제제 중독후의 뇌세포 사망 및 뇌조직의 변성을 지표로 평가하였다. 즉, 유기인산제제 중독 후의 대뇌해마(hippocampus), 피질(cortex), 편도(amygdala), 시상핵(thalamic nuclei) 및 뇌실(ventricles) 주위에서의 신경세포(neurons)의 급성 세포사망, 프로그램된 세포사망 또는 주위 뇌조직의 병리학적 변화를 관찰하였다. 이하 본 발명에 대하여 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하나 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
후모물질 단독투여에 의한 진경 및 해독효능 평가
실험동물로는 SD래트(체중200-300g,6-7주령)를 적정 사육조건에서 번식 사육하여 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 표2에 제시된 용량으로 L-NAME, PC, PA, TFP 또는 L-AME를 생리식염수에 녹여 각각 10마리의 실험동물에 5ml/kg의 양으로 복강내 주사하였다. 30분 후에 유기인산 제제 DFP(6mg/kg, 중간치사량의 약1.2배)를 증류수에 희석하여 1ml/kg의 양으로 복강내 투여하였다. DFP투여 직후부터 최초로 경련이 일어날 때까지의 기간, 최대 증상 발현시의 경련 강도 및 24시간까지의 치사율을 기록하였다. 각 그룹의 결과를 Student's t-test로 통제처리하여 해독제를 투여하지 않았을 때와 비교하였다. 유의성 검정은 P＜0.05에서 실시하였다.
표 2
유기인산제제 중독에 대한 후보물질 단독투여에 의한 진경 및 해독효과
DFP단독과 비교할 때 유의성 있음(P＜0.05)+PA (50)
표 2에서 후보약물을 투여하지 않은 대조군에서의 경련은 DFP중독 후 약 6분에 나타났으며, 경련의 강도는 약 4.1이었고, 모든 동물이 24시간 이내에 사망하였다. 반면 후보약물 투여에 의해 경련 및 치사율이 전반적으로 완화되었는 바, L-NAME외 PC가 탁월한 효과를 나타낸 반면, L-NMMA, PA 및 TFP의 효과는 상대적으로 미약하였다.
[실시예 2]
황산 아트로핀과 후보물질의 복합투여에 의한 진경 및 해독효능 평가
실시예 1에서와 같은 조건에서 표 3에 제시된 용량으로 후보물질을 투여하였으며, 황산 아트로핀(15mg/kg)은 생리식염수에 녹여 DFP투여 15분 전에 1ml/kg의 양으로 근육내 주사하였다. 표 3에서 황산 아트로핀만을 투여한 대조군에서는 경련발현 시간 및 경련의 강도가 약간 지연 및 완화되었으며, 치사율 역시 40%로 감소되었다. 여기에 더하여 후보물질 투여시에는 탁월한 경련 억제 및 치사율 감소를 나타내었는 바, 후보물질의 단독투여시보다 훨씬 우수하였다. 특히 단독투여로는 효과가 미약한 L-NMMA, PA 및 TFP의 경우 뚜렷한 상승효과(synergistic effect)를 나타내었는데, 이는 콜린성 신경계의 자극이 경련의 유도에 중요한 역할을 하기 때문인 것으로 여겨진다(참조,Jones,L.S.외(1990),Mol.Chem.Neuropathol. 13,1). 반면 L-AME는 NO생성 촉진제임에도 불구하고 그 자체의 항콜린성 효과로(참조,Buxton,I.L.O.외(1993),Circ.Res.72,387) 경련에는 영향을 주지 않고 동물의 치사율을 감소시켰다.
표 3
유기인산제제 중독에 대한 황산 아트로핀(AtSO4)과 후보물질의 복합투여에 의한 진경 및 해독효과
*DFP 단독과 비교할 때 유의성 있음(P＜0.005)
+AtSO4와 비교할 때 유의성 있음(P＜0.05)
@ND, 측정하지 않음 (not determined).
[실시예 3]
후보물질의 특성에 따른 진경 및 해독효능 평가
말초성 중독증상을 제거하고 중추유래의 간질성 발작만을 유도하기 위하여 새로운 모델을 설계하였다. 즉, 고용량(10mg/kg,중간치사량의 약 2.0배)의 DFP를 투여하여 간질발직을 유발하되 동물의 생존율을 높이기 위하여 중추신경계 작용이 없는 피리도스티그민과 메틸질산 아트로핀을 전투여하였다. 이들 약물은 생리식염수에 녹여 피리도스티그림은 DFP중독 30분 전에, 메틸질산 아트로핀은 10분 전에 1ml/kg의 양으로 근육내 주사하였다. 이렇게 고안된 실험모델에 각 후보물질을 단독 또는 황산 아트로핀과 복합적으로 도2에 제시된 용량으로 실시예 2에서와 동일한 조건으로 투여하였다.
도2에서 피리도스티그민과 메틸질산 아트로핀만을 투여한 용매 대조군(vehicle)에서 간질성 발작은 약 3.2로 발현되었다. L-NAME 및 PC는 단독으로 탁월한 억제효과를 나타내었다. 반면 L-NA 및 7-NI는 황산 아트로핀 존재하에서만 효과적이었다. 흥미롭게도 NO생성 촉진제인 L-AME는 경련을 유의성있게 심화시겼다. 이러한 결과는 NO가 유기인산제제 중독시 경련유발 또는 촉진물질로 작용함을 나타내며, 특히 유기인산제제 중독에 의한 간질성 발작의 효과적인 완화를 위해서는 NO생성 및 콜린성 신경계의 차단이 동시에 요구됨을 보여준다.
[실시예 4]
유기인산제제 중독에 의한 뇌손상에 대한 후보물질의 방어효능 평가
실시예 3에서 유기인산제제 DFP 투여후 24시간에 동물을 마취시킨 후 심장을 통하여 2 I.U. 헤파린(heparin)/ml이 함유된 생리식염수와 4% 파라포름알데히드로 뇌를 관류고정하였다. 뇌를 적출하여 10% 중성 포르말린으로 24시간동안 후 고정하였다. 고정된 조직을 파라핀 포매 후 6μm두께로 절편하여 헤마톡실린 ＆ 이오신(hematoxylin＆eosin,H＆E) 일반염색법 및 프로그램된 세포사망 검출키트(ApopTag In Situ Apoptosis Detection Kit)를 이용한 면역염색법(참조,Oncor manual(1994),ApopTag#S7100-KIT)으로 염색하였다. 염색된 조직 표본을 광학현미경 하에서 관찰하여 후보물질 유무에 따른 뇌세포의 급성세포사망, 프로그램된 세포사망 및 뇌조직의 변성정도를 지표로 방어효능을 평가하였다.
도3은 유기인산제제 DFP에 의한 뇌손상을 나타내는 사진으로, 도3A에서는 대뇌 해마부위 추체세포(pyramidal cells)의 농축(necrosis)현상과 세포주위 뇌조직의 공포변성을 보여준다. 도3B에서는 프로그램된 세포사망을 검출하는 Apoptosis Detection Kit를 이용한 면역염색으로 시상핵 부위의 뇌세포가 갈색으로 염색된 모습을 보여준다. 도4는 DFP에 의한 뇌손상에 대한 L-NAME 및 PC의 방어효과를 보여주는 것으로, 도4A는 PC 30mg/kg 투여시, 도4B는 L-MANE 100mg/kg투여시의 추체세포의 정상적인 모습과 시상핵에서의 감소된 면역염색 소견을 나타낸다.
모든 실시예의 결과를 종합해 볼 때, 유기인산제제 중독에 의한 경련, 치사 및 뇌손상에 대해 NO생성 억제제가 탁월한 방어효과를 나타내며, 이러한 효과는 아 트로핀과 같은 중추 콜린성 신경계의 차단제와 복합투여시 더욱 효과적이었다.

Claims (5)

  1. 니트릭 옥사이드(NO)생성 억제제를 유효성분으로 하는 유기인산제제 중독에 의한 경련, 치사 및 뇌손상의 해독제.
  2. 제1항에 있어서, NO생성 억제제가 NO합성효소(NOS)를 직접적으로 억제하는 L-N-니트로알기닌 메틸에스테르(L-NAME), L-N-모노메틸 알기닌(L-NMMA), L-N-니트로알기닌(L-NA),7-니트로인다졸(7- NI) 또는 트리플루오페라진(TFP) 중에서 선택되는 것이 특징인 해독제.
  3. 제1항에 있어서, NO생성 억제제가 흥분성 아미노산 수용체를 차단함으로써 NO생성을 간접적으로 억제하는 프로사이클리딘(PC) 또는 펜타미딘(PA) 중에서 선택되는 것이 특징인 해독제.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 항콜린성 약물과 복합사용되는 해독제.
  5. 제4항에 있어서, 항콜린성 약물이 황산 아트로핀인 것이 특징인 해독제.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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