KR930001119B1

KR930001119B1 - 아스코르브산-2-포스페이트의 제조방법

Info

Publication number: KR930001119B1
Application number: KR1019870014483A
Authority: KR
Inventors: 다쯔로우 후지오; 아끼히꼬 마루야마
Original assignee: 교우와 학고우 고오교 가부시끼가이샤; 카토오 미끼오
Priority date: 1986-12-18
Filing date: 1987-12-18
Publication date: 1993-02-18
Also published as: CA1334393C; EP0272064A3; KR880007741A; US5578471A; EP0272064B1; EP0272064A2; DE3784655D1; DE3784655T2

Abstract

내용 없음.

Description

아스코르브산-2-포스페이트의 제조방법

도면 1a와 b는 각각 참조용 AsA2P와 실시예 1의 공정에 의하여 제조된 AsA2P(RCI)의 자외선 흡수 스팩트럼의 결과.

도면 2a, b와 c는 각각 참조용 AsA2P, 실시예 1의 공정에 의하여 제조된 AsA2P(RCI)와 참조용 AsA2P와 RCI의 혼합물의 양성자-NMR의 결과.

도면 3a와 b는 참조용 AsA2P와 RCI의¹³C-NMR의 결과.

본 발명은 아스코르브산-2-포스페이트(이하 AsA2P라고함)의 제조방법에 관한 것이다. 아스코르브산은 예를들면 의약, 식품과 화장품 분야에 널리 사용되지만, 예를들면 열, 대기, 빛 등에 대한 노출에 의하여 쉽게 분해되는 단점을 가지고 있다. AsA2P는 몸체의 탈인산 반응에 의하여 쉽게 아스코르브산으로 전환되어 비타민 C활성을 보이는 안전성 유도체이다. 따라서 AsA2P는 널리 예를들면 화장품, 의약 특히 화장품 제조의 원료로서 또는 식품의 첨가물로서 사용된다.

화학합성에 의한 AsA2P의 제조공정은 알려져 있다 「예를들면 JP-A-30328 /70, 15605/73과 18191/77과, J.Org.Chem.47, 3453(1982) 등」. 그러나 미생물 공정에 의한 AsA2P의 제조공정은 아직 보고되지 않았다.

화학합성은 이미 공업적인 규모로 AsA2P를 제조하는데 이미 사용되고 있다. 그러나 화학합성은 본질적으로 불리한점이 있는데 2-위치의 목적하는 인산화외에도, 예컨대 3-과 5-위치에 인산회된 여러가지 이성질체가 나올 수 있으므로 AsA2P를 고수율로 얻는 것이 어렵다. 따라서 AsA2P의 수득률을 개선하기 위하여, 예를들면 보호기를 도입하거나 반응조건을 선택하는 등의 많은 시도가 이루어져 왔다. 그렇지만 공지의 방법을 사용하여서는 그 제조방법이 아직 복잡하고 비용이 많이들며 게다가 높은 순도의 AsA2P를 생산하는 것이 어렵다.

본 발명자는, 어떤 미생물이 아스코르브산과 아라보아스코르브산의 2-위치에 특이하게 인산화 할 수 있다는 사실과 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 아데노신 삼인산(ATP)으로부터 AsA2P를 제조할 수 있는 미생물을 발견했다. 그러므로 본 발명은 공업적 규모로 AsA2P를 제조할 수 있는 다른 방법을 제공한다.

본 발명은 다음에서 상세히 설명될 것이다.

본 발명에 따라서 아스코르브산-2-포스페이트를 생산하기 위하여 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 ATP의 효소반응을 촉매할 수 있는 미생물에서 얻어진 효소의 유효량의 존재하, 수용액배지중에서 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 ATP를 반응시켜 아스코르브산-2-포스페이트를 생성시키고, 반응용액에서 생성물인 아스코르브산-2-포스페이트를 회수하는 것으로 이루어진 아스코르브산-2-포스페이트의 제조방법을 제공한다.

아스코르브산이란 용어는 아스코르브산의 D-와 L-이성체를 포함한다.

본 발명의 목적에 사용할 수 있는 미생물은 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 ATP로부터 AsA2P를 생성할 수 있는 미생물이며 에어로모나스속, 클레브시엘라속, 플라보박테리아속, 슈도모나스속, 바실러스 또는 베네키아속에 속하는 미생물을 포함한다. 바람직한 예는

에어로모나스 카비아에 ATCC 13137

바실러스 수브털리스 ATCC 19221

베네키아 하이페롭티카 ATCC 15803

폴라보박테리아 더 보란스 ATCC 10829

클레브시엘라 옥시토카 ATCC 8724

슈도모나스 아조토콜리간스 ATCC 12417

슈도모나스 클로로라피스 ATCC 9446

과 이들의 변이종이다.

통상의 배지 예를들면 폴리펨톤(10g/ℓ), 육즙(7g/ℓ), 효모즙(5g/ℓ)과 염화나트륨(3g/ℓ)를 함유한 KM 102배지를 사용하고 pH를 7.2로 조절하여 미생물을 배양하는 것이 가능한데, 다만, AsA2P를 생산하는 능력을 억제함이 없이 사용 미생물이 잘 자랄 수 있어야 한다. 탄소원, 질소원 또는 기타 유, 무기물질을 함유하는 여러 유기적, 반합성적 및 합성배지를 사용할 수 있다.

바람직한 탄소원은 예를들면 포도당, 과당, 설탕 또는 젖당과 같은 탄수화물류 ; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당 알콜올류 ; 피루브산, 락트산 또는 시트르산과 같은 유기산류 ; 글루탐산, 메타오닌 또는 리신과 같은 아미노산을 포함한다. 필요하다면 전분 가스분해물, 당밀, 폐당밀, 백등겨, 카사바, 사탕수수찌끼 또는 콘 스팁 리쿼와 같은 자연 유기 영양분을 사용할 수 있다.

질소원의 예로는 요소, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄 또는 초산암모늄과 같은 유, 무기암모늄염 ; 글루탐산, 글루타민 또는 메티오닌과 같은 아미노산; 및 펩톤, NZ 아민, 콘 스팁 리쿼, 육즙, 효모즙, 카제인 가스분해물, 어육 및 이들의 분해제품 또는 번데기 가스분해물과 같은 질소함유 유기물이 있다.

무기물질의 예는 2염기 인산칼륨, 1염기 인산나트륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산동, 염화망간, 몰리브덴산암모늄 및 황산아연을 포함할 수 있으며 이들의 적당한 양을 배지에 부가할 수 있다.

비타민, 아미노산, 헥산과 미생물의 성장에 요구되는 다른 물질이 필요에 따라 배지에 첨가될 수 있다.

호기적 조건 예를들면 흔들거나 에어레이숀과 교반하면서 배양을 수행하는 것이 바람직하다. 통상 배양은 20-40℃ 바람직하게는 25-35℃온도에서 pH 5-10 바람직하게는 6.5-7.5pH로 10-100시간동안 실행한다.

AsA2P는 다음 두가지 방법중 어느 하나에 의하여 수행되는 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 ATP와의 반응에 의하여 생성된다 :

(방법 1) 미생물의 배양육즙에서 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 ATP를 혼합시키는 방법 ; 또는

(방법 2) 농축배양육즙, 건조배양육즙, 배양육즙 상층액, 미생물 균체와 이들의 처리에 의해 수득된 생성물 즉 동경-해동세포, 동결-건조세포, 고정효소와 미생물 균체에서 추출된 효소(자연미생물 균주 또는 적합한 유전공학적 미생물 균주종의 하나로부터 얻은 효소)로부터 선택된 적어도 한 배지를 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 ATP를 함유하는 용액과 혼합하는 방법.

필요하다면 계면활성제 또는 유기용매와 같은 첨가제를 AsA2P의 생성물을 증가시키기 위하여 반응용액에 부가할 수 있다.

적당한 계면활성제로는 폴리옥시에틸렌 스테아릴아민(예를들면, 니민 S-215 ; 일본 니혼 유시 K.K.의 제품) 또는 세틸트리메틸암모늄 브로마이드와 같은 양이온 계면활성제 ; 소듐 올레일아미드 술페이트와 같은 음이온 계면활성제 ; 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄모노스테아레이트와 같은 양쪽성 계면활성제(예를들면 일본 니혼 유시 K.K의 제품인 비이온 ST 221)가 있는데 이러한 계면활제는 아스코르브산 또는 아라보 아스코르브산과 ATP로부터 AsA2P를 생성하는 반응을 촉진시킬 수 있다.

적당한 유기용매의 예는 톨루엔, 크실렌, 아세톤, 지방족 알코올, 벤젠 및 초산에틸을 포함하는데, 이러한 것들은 통상 0.1-0.5㎕/m1, 바람직하게는 1-20 ㎕ /ml의 양으로 사용된다. 또한 마그네슘 이온은 1-100mM의 농도로 사용될 수 있다.

이러한 것들을 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 ATP를 함유하여야 하며 AA2P의 생성에 해롭지 않는 한 화학적으로 순수 또는 조아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 ATP가 본 발명의 목적으로 위하여 사용될 수 있다.

아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 ATP의 사용 농도는 각각 1-500mM과 1-1000mM인 것이 바람직하다.

방법 2에서는 예컨대 암모니아, NaOH 또는 KOH를 첨가하여 pH를 3-11로 유지하면서 20-70℃의 온도에서 1-48시간 동안 반응을 수행하는 것이 바람직하다.

배양육즙의 처리에 의하여 얻어지는 생성물의 예로는 농축 또는 건조배양육즙, 배양육즙에 계면활성제 및/또는 유기용매를 첨가하여 얻어지는 생성물, 균체를 용균성 효소로 처리하여 얻어지는 생성물, 고정미생물 균체와 미생물 균체에서 추 출된 효소 생성물이 있다.

배양육즙으로부터 분리된 균체는 바람직하게는 1-400mg/ml(습균체 중량)양을 사용될 수 있다.

AsA2P는 참조용으로 화학합성에 의하여 제조된 AsA2P 순품을 사용하여 뉴클레오실 10C₁₈칼럼(아세레이-나겔사제품, 독일)을 사용하는 고속액체 크로마토그래피한 후 254nm의 흡수에 의하여 정량할 수 있다.

배양육즙 또는 반응용액으로부터 AsA2P의 분리는 배양육즙으로부터 균체를 제거하고, 상층액에서 단백질을 분리하여, 상기 상층액을 중화하고, 예를들면 이온교환수지, 세파덱스등을 이용한 컬럼 크로마토그래피나 고속액체 크로마토그래피에 의하여 정제함으로써 실행할 수 있다.

다음의 비한정적인 실시예는 본 발명을 예시한다.

[실시예 1]

플라보박테리아 데보란스 ATCC 10829는 균체를 얻기 위하여 엘렌마이어 플라스크(용량 300ml)내에서 30℃의 온도로 20시간 동안 KM 102배지(30ml)에서 배앙한다. 그 다음, 12ml를 엘렌마이어 플라스크(용량 2ℓ)내의 KM 102배지(300ml)로 옮겨 다시 30℃의 온도에서 20시간동안 배양한다. 수득된 배양 육즙을 원심분리 ( 1 0,000×g/10min)하여 습균체(5.4g)를 얻는다. 습균체는 냉동시켜 -20℃의 온도에서 보존한다. 아스코르브산(30mM), ATP(40mM), MgSO₄(10mM)와 KH₂PO₄(40mM)로 구성되고 상기 보존된 균체(50mg/ml 습균체 중량)를 함유하는 반응용액은 용량 200ml의 비이커에서 24시간동안 30℃의 온도로 반응이 완결될때까지 자기 교반기로 교반 하는데(100r.p.m.), 이때 pH는 가성소다를 사용하여 약 6.5로 조절한다.

이 반응에 따른 배양육즙의 상충액은 1.16mg/ml의 AsA2P를 함유하였고 아스코르브산-5-포스페이트와 아스코르브산-3-포스페이트와 같은 부산물은 본질적으로 없었다.

반응용액을 염산을 사용하여 pH 3으로 조절한 후에, 용액(50ml)은 원심분리하여 단백질을 제거한다. 상층액은 가성소다로 중화시키고 300ml의 Dowex 1×8레진 (Cl-형)으로 패킹된 컬럼을 통해 통과시 0.2-0.6M의 NaHCO₃농도 구배 용출법으로 용리한다. 용출된 AsA2P 함유 분획을 모으고, 합한후, 염산으로 중화하고 농축한다. 수득된 분획(163ml)은 42mg의 AsA2P를 함유하였다. 농축물은 세파덱스 G-10(500ml)으로 채워진 컬럼을 통과시켜 고분해능 액상 크로마토그래피에서 단일 피크를 보이는 30mg의 AsA2P를 함유하는 분획(63ml)을 얻었다. 얻어진 샘플은 RCI라 명명되고 하기와 같은 화학구조 분석용으로 사용된다.

(1) 자외선 흡수 스펙트럼

제1도(a) 및 (b)는 각각 참조용 AsA2P와 샘플 RCI의 자외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다. RCI는 240nm에서 최대흡수를 보이며 그 패턴은 참조용 AsA2P 패턴과 완전히 일치한다.

(2) 알칼리 포스파타아제에 의해 분해

15μl의 RCI(25mg/ml)를 0.5M 글리신-완충액(pH 10.5 ; 20μl), 0.1M ZnSO₄(1μl), 0.1M MnSO₄(1μl), 2μl 알칼리 포스파타아제(200mg/ml의 효소를 함유함 ; 시그마사 제품)와 탈수이온수(36μl)로 구성된 용액에 첨가한다. 용액은 RCI의 효소 분해 정도를 관찰하기 위하여 30분 동안 37℃의 온도에서 유지시킨다.

다음 표 1은 고분해능 액상 크로마토그래피에 의하여 상층액을 분석한 결과를 나타낸다.

[표 1]

이표는 RCI가 인산화된 아스코르브산을 나타냄을 표시한다.

(3) 양성자-NMR분석

제2도 (a), (b)와 (c)는 각각 참조용 AsA2P, RCI 및 참조용 AsA2P와 RCI의 혼합물의 양성자-NMR 스펙트럼 패턴을 보이는데, 여기서 RCI는 참조용 AsA2P와 동일함을 알 수 있다.

(4)¹³C-NMR에 의한 분석

제3도의 (a)와 (b)는 각각 RCI와 참조용 AsA2P의¹³C-NMR의 패턴을 나타내는데, 둘다, 샘플의 2-위치의 탄소원자에 인산화되었음을 표시한다. 따라서 RCI는 참조용 AsA2P와 동일함이 명확하다.

[실시예 2]

표 2의 각 균주는 엘렌마이어 플라스크(용량 300ml)내에서 30℃의 온도로 20시간동안 KM 102배지(30ml)에서 배양시킨다. 생성균체 12ml는 30℃의 온도에서 20시간동안 배양하기 위하여 엘렌마이어 플라스크(용량 2ℓ)내의 KM 102배지(300ml)으로 옮긴다. 수득된 배양육즙을 원심분리(10,000×g/10min)하고 균체는 냉동시켜 -20℃의 온도에서 보존한다. 아스코르브산(30mM), ATP(40mM), MgSO₄(10mM)와 KH₂PO₄(40mM)로 구성되고 상기 유지된 균체(50mg/ml 냉동균체)를 함유하는 반응용액은 용량 200ml의 비이커에서 24시간동안 30℃의 온도로 자기 교반기로 교반 (100rpm)하는데, 이때 pH는 가성소다를 사용하여 약 6.5로 유지시킨다. 반응을 완결한후 반응용액중 상충액의 AsA2P 생성농도는 고분해능 액상 크로마토그래피에 의하여 결정된다. 결과는 표 2와 같다.

[표 2]

[실시예 3]

슈도모나스 아조토클리간스 ATCC 12417은 엘렌마이어 플라스크(용량 300ml)내 KM 102배지 (30ml)에서 30℃온도로 20시간 배양한다. 생성균체(12ml)는 엘렌마이어 플라스크(용량 2ℓ)내 KM 102배지(300ml)에서 30℃의 온도로 20시간동안 배양한다. 배양육즙은 원심분리(10,000×g/10min)하여 균체를 분리한다. 균체는 다음과 같은 별개의 다른 처리를 받는 분획으로 나누어진다 :

(a) 처리하지 않음 ; (b) 공기 건조 ; (c) -20℃에서 냉동하고 뒤이어 해동 ; (d) 계면활성제를 함유하는 용액속에 현탁 ; (e) 유기용매를 함유하는 용액에서 현탁 ; (f) 계면활성제와 유기용매의 혼합물을 함유하는 용액에 현탁 ; 또는 (g) 초음파로 처리.

각 샘플의 AsA2P-생성활성은 다음과 같은 방법으로 결정된다.

상기와 같이 처리된 균체(50mg/ml), 아스코르브산(30mM), ATP(40mM), MgSO₄(10mM)과 KH₂PO₄(40mM)로 이루어진 반응용액(50ml)는, 200ml용량의 비이커에서 가성소다를 사용하여 용액을 pH 6.5로 유지하면서 30℃에서 24시간동안 자기 교반기로 교반한다. 고속액체 크로마토그래피는 배양육즙 상층액에 존재하는 AsA2P농도를 결정하기 위하여 사용되며 그 결과는 다음표 3과 같다.

[표 3]

실시예 4에서 사용되는 초음파 파쇄기는 미지의 주파수에서 초음파를 6번 적용하도록 출력번호 5를 사용하였다(각 30초 간격을 두고 30초동안).

[실시예 4]

플라보박테리아 데보란스 ATCC 10829는 실시예 1에 기재된 바와 유사한 방법으로 배양한다. 생성미생물 균체는 원심분리하고 200mg/ml의 농도에서 pH 7.0의 인산-완충용액중에 재현탁시킨다. 균체 현탁액은 균체를 분쇄시키기 위하여 초음파 파쇄기(1)R-200P ; 일본 토미 세이코 K.K.사 제품)로 10분간 간헐적으로 처리한다. 균체는 여러 분획으로 나누고 각 분획을 다음중 한 방법으로 처리한다.

(1) 후처리가 전혀 없는 배양육즙

(2) 파쇄된 균체 용액 또는

(3) 파쇄된 균체를 원심분리(12,000×g/15분)하여 수득된 상층액.

각각의 경우에 생성물질은 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방법으로 반응시킨다. 샘플(1),(2)와 (3)을 각각 사용하여 0.102mg/ml, 0.175mg/ml와 0.168mg/ml의 AsA2P가 형성되고 모여졌다.

[실시예 5]

플라보박테리아 데보란스 ATCC 10829는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방법으로 배양한다. 생성 배양육즙에 L-아스코르브산(30mM), ATP(40mM), MgSO₄(10mM) 및 KH₂PO₄(40mM)을 가해 반응용액을 제조하고, pH가 6.5가 되도록 가성소다로 조절하면서 자기 교반기를 사용하여 30℃에서 20시간 교반한다(100r.p.m). 반응완결시에 반응혼합물의 상층액에 0.131mg/ml의 AsA2P가 형성되고 모여졌다.

[실시예 6]

플라보박테리아 데보란스 ATCC 10829는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방법으로 배양한다.

1. 배양육즙은 원심분리하여(10,100×g/10분) 습균체(5.4g)를 수득하고, -20℃에서 동결시켜 보존한다. 아라보아스코르브산(30mM), ATP(40mM), MgSO₄(10mM)과 KH₂PO₄(40mM)로 구성하고 50mg/ml의 상기 보존된 균체(습균체 중량)을 함유하는 반응용액을 200ml 비이커에 넣고 자기 교반기로 교반(100r.p.m/24시간)한다. pH는 반응동안 가성소다 용액을 간헐적으로 부가하여 6.5로 조절한다. 0.87mg/ml의 AsA2P가 반응혼합물에 모아졌다. 본질적으로, 아스코르브산-5-포스페이트, 아스코르브산 -3-포스페이트 및 아스코르브산의 피로인산 화합물과 같은 부산물이 검출되지 않았다.

본 발명은 효소원으로서 미생물 균체, 미생물 배양육즙, 배양육즙의 상층액과 미생물 균체로부터의 생성물에서 선택되는 적어도 한 종류를 사용하여 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 ATP로부터 AsA2P를 제조하는 방법을 제공한다.

Claims

효소 반응을 수행하기 위하여, 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 ATP의 효소반응을 촉매할 수 있으며, 에어로모나스속, 바실러스속, 베네키아속, 플라보박테리아속, 클레브시엘라속 및 슈도모나스속중에서 선택된 미생물로부터 얻어지는 효소의 유효량을 함유하는 수용액중에서, 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산을 ATP와 반응시켜 아스코르브산-2-포스페이트를 생성하고, 반응용액으로부터 생성물인 아스코르브산-2-포스페이트를 회수하는 것으로 이루어진 아스코르브산-2-포스페이트의 제조방법.
제1항에 있어서, 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산에 대한 보호기 없이 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 미생물이 에어로모나스 카비아에 ATCC 13137, 바실러스 수브틸리스 ATCC 19221, 베네키아 하이페롭티카 ATCC 15803, 폴라보박테리아 데보란스 ATCC 10829, 클레브시엘라 옥시토카 ATCC 8724, 슈도모나스 아조토클리간스 ATCC 12417, 슈도모나스 클로로라피스 ATCC 9466에서 선택되는 방법.
제1 또는 2항에 있어서, 효소반응이 상기 미생물의 배양육즙에서 일어나는 방법.
제4항에 있어서, 배양이 아스코르브산 또는 아라보아스코르브산과 유효량의 ATP 존재하에 20-40℃의 온도에서 5-10pH하에 10-100시간동안 이루어지는 방법.
제1 또는 2항에 있어서, 수용액은, 배양육즙, 농축 배양육즙, 건조배양육즙, 배양육즙 상층액, 용균성 효소로 처리한 미생물 균체, 고정효소 및 미생물균체로부터 추출된 효소에서 선택된 적어도 한 종류의 배지를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 반응이 2-70℃에서 3-11의 pH하에 1-48시간동안 이루어지는 방법.