KR920006398B1 - 비브리오 프로테오리티커스로부터 아미노펩티다제의 생산방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

비브리오 프로테오리티커스로부터 아미노펩티다제의 생산방법

제1도는 아미노펩티다제의 표준곡선이고,

제2도는 비브리오 프로테오리티커스를 글리세롤 저장방법으로 보관하는데 있어서 글리세롤 농도의 영향을 나타낸 그래프이며,

제3도는 비브리오 프로테오리티커스로부터 아미노펩티다제를 생산하는데 있어서 온도의 영향을 나타낸 그래프이고,

제4도는 비브리오 프로테오리티커스로부터 아미노펩티다제를 생산하는데 있어서 pH의 영향을 나타낸 그래프이며,

제5도는 비브리오 프로테오리티커스로부터 아미노펩티다제를 생산하는데 있어서 발효조 임펠러 회전속도(RPM)의 영향을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 비브리오 프로테오리티카스(Vibrio Proteolyticus, ATCC 15338)균주를 발효시킴으로써 아미노펩티다제를 생산하는 방법에 관한 것이다.

프로테아제는 단백질과 펩티드에 작용하여 그들의 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소단백질로서, 조미료의 제조나 식육연화 및 맥주, 청주의 혼탁방지 등의 식품공업, 소화제, 소염진통제 등의 제약공업, 피혁공업이나 세제공업 등 각 분야에 걸쳐 광범위하게 이용되고 있다.

이러한 프로테아제는 동물이나 식물로부터 추출하여 얻기도 하나 그 수와 양이 한정되여 있으므로, 근래에는 발효공업의 발전에 힘입어 경제적언 면이나 공업적 규모로의 활용면에 있어서 유리한 미생물을 발효시킴으로써 생산하는 방법의 연구가 활발해지고 있다.

공업적으로 프로테아제를 생산하는데 이용되는 대표적인 균주로는 곰팡이류의 아스페르질러스(Aspergil-lus sp.)와 세균류의 바실러스(Bacillus sp.)등이 있으며, 방선균이나 효모 등도 프로테아제를 생산하는데 이용된다.

한편, 최근에는 고전적인 변이방법을 이용하거나 값싼 원료를 사용하여 프로테아제의 생산을 증대시키고자 하는 시도들이 진행되고 있다.

세균류의 프로테아제 생산균주로는 바실리스 이외에 해양성 세균인 비브리오 프로테오리티커스가 있는데, 이 균주에 의해 체외로 분비되는 여러 프로테아제는 그 활성에 있어서 바실러스를 능가하며, 최근 유전공학기법에 의해 생산되는 여리 단백질의 가공에 이용되는 프로테아제의 일종인 아미노펩티다제를 생산한다.

비브리오 아미노펩티다제는 단백질의 아미노말단의 아미노산으로부터 펩티드 결합을 가수분해하는 효소로서 그 이용성이 주목되고 있다.

그러나 종래에는 이 효소를 상기와 같은 목적으로 이용하고자 했던 예가 없었던 관계로 이 효소의 생산방법은 1963년에 John. M. Prescott 등이 Method in Enzymology에서 발표한 방법에 머물러 있는 실정이다. 마찬가지로, 1971년에 Journal of Biological Chemistry(Vol.246, No.6;1956-1764)에 발표한 J.M. Prescott 등의 논문도 이 효소의 정제과정의 개선일 뿐 효소의 생산방법의 개선에는 더 나은 진전이 없었다.

이에 본 발명자들은 비브리오 프로테오리티커스에 의해 아미도펩티다제를 생산하는데 있어서 아미노펩티다제의 활성을 증대시키고 경제성을 개선함으로써 공업적 규모로 적용하기에 적합한 방법을 개발하고자 다각적으로 연구한 결과, 최적의 배양조건을 찾아내게 되었고 배양배지 조성의 대체 질소원을 개발하였을 뿐만 아니라 균주의 보관조건에 따라서도 아미노펩티다제의 활성이 크게 달라진다는 사실을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 비브리오 프로테오리티커스 균주로부터 아미노펩티다제를 생산하도록 하는데 최적인 배양배지의 조성과 배양조건 및 보관조건을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 비브리오 프로테오리티커스 균주로부터 아미노펩티다제를 생산하는데 있어서, 비브리오 프로테오리티커스 균주의 배양조건 및 배지조성을 변화시킴을 특징으로 하는 아미노펩티다제의 생산방법을 제공하는 것이다.

이와 같은 본 발명을 실험을 통해 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 다음의 실험에서는 비브리오 프로테오리티커스로부터 아미노펩티다제를 생산하는데 있어 최적의 보관조건과 배양조건 및 배지조성을 결정하였다.

본 실험에 앞서 참조를 위한 일반적인 배양방법과 아미노펩티다제의 활성 측정방법은 다음과 같다.

[비브리오 프로테오리티커스의 배양]

아미노펩티다제 생산을 위한 비브리오 프로테오리티커스를 다음의 표 1에 나타낸 바와 같은 조성의 초기배지 500ml에 -100℃ 보관중인 글리세롤 저장균주 1 바이알(1ml)울 접종한 후 30% 진탕기에서 16시간 동안 배양하였다.

그런다음, 생산배양을 위하여 51발효조에서 2%의 카시톤을 함유하는 생산배지 31에 상기 플라스크 배양액 100ml을 접종한 후 35℃에서 배양하였다.

[표 1] 비브리오 프로테오리티커스의 발효배지 조성

[아미노펩티다제 활성의 측정]

비브리오 프로테오리티커스로부터 생산된 아미노펩티다제의 활성을 측정하기 의하여 먼저 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 후 배양액을 10μl취하고, 기질로는 루이신 파라니트로아미드를 15μl 취하여 900μl 트리스완충용액(Tris. HCl, pH 8.0)중에서 37℃로 10분간 반응시킨 다음, 반응이 완료된 용액을 희석하여 405nm 파장에서 스팩트로포토미터로 흡광도를 측정하여 활성을 결정하였다. 활성의 단위는 균체를 제거한 배양액 1ml을 37℃에서 1분간 반응시켰을 때 변화시킬수 있는 기질의 μM을 효소양으로 나타낸 것을 1유니트로 하였다.

아미노펩티다제의 표준곡선은 제1도에 나타낸 바와 같았으며 이를 기준으로 하여 배양액의 활성을 계산하였다.

I. 균주 보관 조건

균주의 일반적인 장기보관 방법인 글리세롤 저장방법(Glycerol Stock)에 있어서 최적의 보관조건을 찾기위하여, 비브리오 프로테오리티커스 균주에 멸균된 글리세롤을 각각 30%,50%,75%의 농도로 혼합하여 -100℃에서 6시간동안 보관한 다음 아미노펩티다제의 활성을 측정하고, 이를 평판배지의 콜로니 균주를 대조구로 하여 비교하였다.

그 결과를 제2도에 나타내었다.

글리세롤 저장방법에 있어서 종래에는 글리세롤 농도를 30% 정도로 하였으나, 제2도에 나타나있는 바와같이 글리세롤 농도가 30%인 경우에 비하여 글리세롤 농도가 50%일때는 약 1.5배, 75%일때는 약 2배의 아미노펩티다제 활성을 나타내고 있는 바, 글리세롤을 50 내지 75% 농도로 함유시킬 때 최적의 보관조건을 제공함을 알 수 있다. 이는 대조구인 평판배지의 클로니에서와 비슷한 수준의 매우 우수한 활성이다.

II. 배양온도 조건

비브리오 프로테오리티커스로부터 아미노펩티다제 생산을 위한 발효조건 중에서 온도조건은 매우 중요한바, 본 실험은 최적의 온도조건을 갖기 위한 것이다. 비브리오 프로테오리티커스를 30℃, 35℃ 및 40℃에서 배양한 후에 각각의 아미노펩티다제 활성을 측정하고, 그 결과롤 제3도에 나타내었다(40℃에 대한 실험데이타는 도시되지 않았음).

실험결과에 따르면 아미노펩티다제의 활성이 30∼35℃의 범위에서는 온도가 상승할수록 증가하여 35℃일때는 26℃로 배양한 경우에 비하여 무려 2.5배 정도의 아미노펩티다제의 활성을 나타내고 배양시간은 거의 절반정도 밖에 소요되지 않다가 40℃에서는 다시 활성이 떨어지고 배양시간도 길어졌다. 이로부터 비브리오 프로테오리티커스의 아미노펩티다제 생산에 있어서 배양온도를 30 내지 35℃, 특히 35℃로 유지하는 것이 최적임을 알 수 있다. 이는 비브리오 프로테오리티커스의 서식지가 바닷가로서 통상 저온(26℃)에서 배양하고 있던 종래의 방법에서는 예상치 못했던 결과이다.

III. 배양 pH 조건

비브리오 프로테오리티커스로부터 아미노펩티다제를 생산하기 위해 발효조에서 배양하는 경우 초기에 pH가 다소 떨어지다가 3-4시간이 지나면서 pH가 상승되게 되는데 pH 9 정도에서는 세균 증식에 지장을 주게 되고 아미노펩티다제 활성도 떨어지게 된다.

100mM 인산으로 pH를 7.5와 8.0으로 고정시켜 조절하였을 경우 그렇지 못한 경우에 비하여 제4도에서보는 바와 같이 아미노펩티다제 활성이 각각 1.5,1.2배씩 증가함을 보여주었다.

비브리오 프로테오리티커스의 아미노펩티다제 생산에서 발효조의 pH를 7.0 내지 8.0, 특허 pH 7.5로 고정조절하는 것이 최적 조건임을 알 수 있다.

IV. 발효조의 임펠러 회전속도(RPM)조건

아미노펩티다제 생산울 위해 비브리오 프로테오리티커스 발효에서 배양액의 용존산소량은 세균의 증식과 아미노펩티다제 생성에 영향을 준다. 배양액 21를 발효시킬 때 발효조의 통기량을 1vvm으로 할 경우 임펠터의 회전수를 300,500,700RPM으로 고정하여 발효한 결과, 제5도에서 보는 바와 같이 RPM이 500과 700일 경우에는 별 차이가 없지만 RPM을 300으로 낮춘 경우에는 세균의 증식과 아미노펩티다제 활성이 떨어짐을 보여 주었다. 이 결과로 비브리오 프로테오리티커스의 발효에서 임펠러의 회전속도는 500 내지 700RPM 정도가 최적임을 알 수 있다.

V. 배지 조성의 개선

비브리오 프로테오리티커스로부터 아미노펩티다제 생산을 위해서 사용하는 배지성분증 질소원으로 이용되는 카세인하이드롤라이세이트의 일종인 Difco사의 카시톤(Casitone)은 고가이기 때문에 아미노펩티다제의 대량생산에 이용하기에는 문제점이 있다.

따라서, 이 실험은 대체 질소원으로 참치엑기스를 이용할 경우 생산비가 100배 이상 절감된다는 사실에 착안하여 아미노펩티다제의 대량생산에 있어서 참치엑기스의 이용 가능성을 시험하기 위한 것이다.

500ml 플라스크에서 카시톤 및 참치엑기스의 농도를 변화시켜 주면서 실험을 실시하였으며, 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 조성의 초기배지에서 16시간 배양한 것을 다음의 표 2에 나타내봐 같은 조성의 생산배지에서 8시간 배양한 다음, 샘플을 채취하여 균체량과 아미노펩티다제 활성을 측정하였다. 다음의 표 2에서보는 바와 같이 참치엑기스를 단독으로 사용한 경우 농도가 증가함에 따라 아미노펩티다제의 활성도 같이 증가하다가 4% 농도에서 최대치를 기록한 후 급격히 감소하였다.

이로부터 참치엑기스 4%를 사용하게 되면 아미노펩티다제의 활성에 있어서 카시톤 2%를 사용한 경우와 거의 비슷한 결과를 얻게 되는 반면 생산비는 거의 100배 정도 절감시킬 수 있음을 알 수 있다.

또한, 참치엑기스와 카시톤울 혼합사용하는 경우 각각 1%씩의 비율로 혼합하였을 때 가장 양호한 활성을 나타내며, 이는 카시톤만을 2 사용하였을 때 보다도 우수함을 알 수 있다.

[표 2] 질소원에 따른 아미노펩티다제 활성(단위 : 1유니트=μm/분.ml)

Claims (8)

1. 비브리오 프로테오리티커스 균주로부터 아미노펩티다제를 생산하는데 있어서, 비브리오 프로테오리티커스 균주의 배양조건 및 배지조성을 변화시키는 것을 특징으로 하는 비브리오 프로테오리티커스로부터 아미노펩티다제의 생산방법.
2. 제1항에 있어서, 비브리오 프로테오리티커스 균주를 글리세롤 보관할 경우 글리세롤 농도를 50 내지 75%로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 배양온도를 30 내지 35℃로 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 배양액의 pH를 7.0 내지 8.0로 고정시켜 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 발효조의 임펠러 회전수를 500 내지 700RPM으로 하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 배지조성의 질소원으로서 참치엑기스를 단독으로 사용하거나 또는 참치엑기스와 카시톤을 1 : 1의 비율로 혼합 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 참치엑기스를 단독으로 사용하는 경우 참치엑기스의 농도를 4%로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제6항에 있어서, 참치엑기스와 카시톤을 혼합 사용 경우 참치엑기스와 카시톤의 농도를 각각 1%로 하는 것을 특징으로 하는 방법.

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