KR890004018B1 - 전세포 효소를 세포 성장과 동시에 고정화하는 방법 - Google Patents

전세포 효소를 세포 성장과 동시에 고정화하는 방법

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Abstract

내용 없음.

Description

전세포 효소를 세포 성장과 동시에 고정화하는 방법
제1(a)도는 세포 배양시 이중 실관 한개의 반응기 조업도.
제1(b)도는 고농도 세포 배양후 효소 반응시 이중 실관 한개의 반응기 조업도.
제2도는 이중 실관 반응기 구조의 횡단면도.
본 발명은 전세포 효소(whole cell enzyme)를 고정화하는 새로운 방법에 관한 것이다. 정제된 효소(purified enzyme) 대신 전세포 효소를 효소반응에 이용하면 효소의 정제 비용을 절약할 수 있고, 일반적으로 단백질 상태로 정제된 효소에 비해 안정성이 우수하므로 산업적으로 매우 유리한 장점이 있다. 효소의 산업적 응용을 위해서 효소의 고정화는 매우 중요한 공정중의 하나이다. 지금까지 전세포 효소를 고정화하는 방법들로는 캄슘알지네이트(calcium alginate), 폴리아크릴 아마이드(polyacrylamide), 아가로스(agarose), 콜라젠(collagen)등의 담체를 이용한 방법이 가장 보편적으로 이용되어 왔다(k.Mosbach, Methods in Enzymology, vol. XLIV, Academic Press, N.Y., 1976). 기존의 이러한 방법들은 일단 발효조에서 세포를 배양한 후 세포를 회수하는 공정과 회수된 전세포 효소들을 담체에 고정화해야 하는 2가지 공정이 요구된다.
그러나, 본 방법은 이중 실관막 생물 반응기(dual hollow-fiber membrane bioreactor)를 이용하여 이 2공정을 1공정으로 간단히 하고 또한 반응기 내에 고농도로 전세포 효소를 충진시킬 수 있으므로 반응기 단위 체적당 높은 생산성을 얻을 수 있는 새롭고 진보된 방법에 관한 것이다.
이중 실관막 생물 반응기는 호기성 균체 배양을 위해 기존의 실관 반응기의 구조를 변형하여 제작된 것으로써 Robertson 과 Kim은 폴리프로필렌(polypropylene) 실관막 내부에 3개의 실리콘 튜브(siliconetube)를 삽입하여 폴리프로필렌 실관막 외부로는 액체 영양분을, 실리콘 튜브 내부로는 산소를 공급해 주고 그 사이에 호기성 박테리아인 스트렙토마이세스 오레오훼이션스(Streptomyces aureofaciens)균을 배양하여 테트라 사이클린(tetracycline) 연속 생산에 대한 연구를 수행하였다(Robertson과 Kim, Biotechnol. Bioeng., 27, 1012,1985). 그 후 본 발명자들은 Robertson과 Kim의 반응기와는 달리 바깥쪽에는 산소 공급을 위한 실리콘 튜브를, 그리고 안쪽에는 액체 영양분 위한 3개의 폴리프로필렌을 삽입하고 그 사이에 노카르디아 메디테라네이(Nocardia mediterranei)를 배양하여 처음으로 리파마이신 B의 장기적인 연속 생산에 성공하였다.(Chang 등. ACS Symp.Ser., 314, 31, 1986).
본 발명은 상기 본 발명자들이 발명한 반응기를 전세포 효소 반응에 이용하는 방법으로 그 상세한 방법을 도면에 의하여 설명하면 다음과 같다. 제1(a)도는 세포 배양시 이중 실관 한개의 반응기 조업도로써 이중 실관의 구조는 바깥쪽의 실리콘 튜브(1) 내부에 3개의 폴리프로필렌실관(2)이 내장된 구성으로 되어 있어 세포 배양시 공기(5a)는 실리콘 튜브(1)를 통하여, 그리고 액체영양분(3a)은 폴리프로필렌실관(2)을 통하여 그 사이에 있는 세포(6a)에 전달된 후 소모된 영양분(4a)을 배출한다.
제1(b)도는 고농도로 세포배양후 효소 반응시 이중 실관 한개의 반응기 조업도로서, 제1(a)도에서의 세포 배양에 의하여 효소 활성을 지닌 세포는 고농도로 반응기내에 고정화가 된다. 효소 반응시 기질용액 (3b)은 고농도로 충전된 전세포 효소(6b)에 전달되고 반응후 생산물(4b)을 배출한다. 이때 온도조절 수(5b)는 실리콘 외벽으로 흐르게 된다.
제2도는 이중실관 반응기의 횡단면도로서 반응기의 구조는 상기의 이중실관들이 유리관 내부에 병렬로 배열된 구성으로 되어 있으며, 이와같은 이중 실관 반응기는 실리콘튜브(1)들을 유리관(7) 내부에 넣은 후 양끝을 실리콘튜브(8)로 굳히고, 실리콘러버 단부에는 공기 및 온도 조절수 주입구(5)와 그 배출구(5')를 설치한다. 그다음 각각의 실리콘튜브(1) 내부에는 3개의 폴리프로필렌실관(2)을 넣고 그 양끝을 실리콘러버(8)로 굳히고 실리콘러버 단부에 세포접종 포트(6)를 설치하고, 유리관(7)들은 실리콘이나 타이콘튜브(9)로 연결하고 유리관의 양단에는각각 영양분 및 기질 용액의 주입구(3)와 그 배출구(3)를 설치하여 제작한다. 본 발명에서 반응기 제작에 사용된 폴리 프로필렌실관은 독일의 Enka사 제품으로 내경 0.033cm, 외경 0.063cm, 공극의 크기 0.4-0.6㎛의 것을 사용하였고, 실리콘튜브는 미국의 Dow Corning사 제품으로 내경 0.147cm, 외경 0.196cm의 것을 사용하였다.
내경 0.8cm의 유리관에 10개의 이중 실관을 삽입하였으며 산소와의 접촉할 수 있는 길이는 16cm이였다.
즉, 실리콘, 폴리프로필렌 이외의 재료들도 반응기 제작에 사용될 수 있으며, 반응기 구조도 다양하게 제작될 수 있다. 사용되는 실관의 규격에 따라 내부에 삽입되는 실관의 갯수도 다양하게 조절할 수 있다.
다음은 본 발명의 실시예이나 본 발명의 범위를 본 실시예에만 국한하는 것은 아니다.
[실시예 1]
포도당 이성화 효소(Glucose Isomerase)의 활성을 지닌 Streptomyces griseus(KCTC 1072)를 세포 접종포트(6)을 통하여 실리콘튜브(1)와 폴리프로필렌실관(2) 사이에 접종한 다음 배양한다.
사용된 배지는 D-Xylose(1%), yeast extract(1%), MgSO4(0.1%), CoCl2(0.01%), KH2PO4(0.3%)였으며, pH는 NaOH로 7로 조절하였다. 액체 배지는 영양분 주입구(3)를 통하여 주입하고 소모된 영양분은 영양분배출구(3')를 통하여 배출하는데 이때 액체 배지의 유속은 2ml/h로 하였으며, 공기와 온수를 공기 및 온도 조절수 주입구(5)를 통하여 주입하면서 그 배출구(5')로 배출하는데 공기는 100ml/min 속도로 흘려 보내주고 온도는 30℃로 유지하면서 10일간 배양하여 세포를 반응기에 고정화하였다. 상기와같이세포를 고정화한 반응기에 0.5M의 포도당 기질 용액을 주입구(3)를 통하여 2ml/h의 유속으로 공급한 바 과당이 연속 생산되었는데 그 생산성은 22.5g/1.h였다. 이것은 회분식 조업보다 12배 높은 것이다.
[실시예 2]
흙으로 부터 분리된 브레비박테리움으로 아크릴로 니트릴로부터 아크릴 아마이드 효소 변환 실험을 실시예 1에서와 같이 수행하였다. 배지 조성 ; 포도당 15g/l,yeast extract 3g/l, malt extract 3g/l, K2HPO413.4g/l, KH2PO46.5g/l,NaCl 1g/l, MgSO40.2g/l의 액체 배지로 3일 동안 이중실관 반응기에서 배양후 효소 반응을 수행하였다. 반응은 5% 아크릴로 니트릴을 4.5ml/h로 공급해 주고 반응 온도는 4℃를 유지하였다. 이때 아크릴아마이드 생산성은 106g/l.h 였다.

Claims (1)

  1. 이중실관 반응기의 실리콘튜브(1)와 폴리프로필렌실관(2) 사이에 세포를 접종한 다음 실리콘 튜브 외부로는 산소를 폴리프로필렌실관 내부로는 액체 영양분을 주입 통과시켜 특정 효소 활성을 지닌 세포를 고농도로 배양함과 동시에 반응기내에 고정화하여 실리콘튜브 외부로는 온도 조절수를 그리고 폴리프로필렌 실관 내부로는 기질 용액을 통과시켜 연속적인 효소반응을 수행하는 전세포 효소를 세포 성장과 동시에 고정화하는 방법.
KR1019840011375A 1987-10-14 1987-10-14 전세포 효소를 세포 성장과 동시에 고정화하는 방법 KR890004018B1 (ko)

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