KR850000411B1 - Lh-rh 또는 lh-rh 동족체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

LH-RH 또는 LH-RH 동족체의 제조방법
본 발명은
Figure kpo00001
유리아미노그룹 및 보호된 카복시그룹 함유하는 상응하는 펩타이드를 , 용매중에서 3-하이드록시-4-옥소-3,4-디하이드로-1,2,3-벤조트리아진(Hoobt) 및 카보디이미드를 가하여 반응시킨후, Dnp-(2,4-디니트로페닐)그룹을 제거함을 특징으로 하여 LH-RH 또는 LH-RH동족체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
LH-RH는 뇌하수체에서 분비되는 생식선자극 호르몬인 LH 및 FSH를 유리시키는 다음 구조식(I)의 시상하부에서 나오는 호르몬으로 알려져 있다.
Figure kpo00002
LH-RH 동족체는 LH-RH의 한 개의 아미노산 또는 여러개의 아미노산이 치환되고/되거나 펩타이드 쇄가 단축, 연장 및/또는 유도체화에 의해 변형된 펩타이드이다. 6위치의 글리신을 D-아미노산으로 치환하고 10 위치의 글리신은 알킬아민으로 치환하는 것이 특히 중요하다.
그러므로, 본 발명의 공정에서 적절한 두번째 성분은 주로 다음 일반식(Ⅱ) 및 (Ⅲ)의 옥타-및 헵타-펩타이드이다.
H-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(Ⅱ)
H-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5(Ⅲ)
상기식에서, X는 Gly 또는 D-아미노산 또는 그의 유도체, 예를들면 D-Ser(But), D-Leu, D-Ala, D-Phe, D-Trp, D-Gln-(사이클로헥실), D-Glu (OBu) 및 D-Lys(Boc)이다.
출발물질로 사용된 신규 디펩타이드 유도체
Figure kpo00003
통상적 방법에 의해 , 예를들면
Figure kpo00004
를 NaHCO3로 완충된 수용액중에서 2,4-디니트로 플루오로벤젠과 반응시켜 제조한다.
본 발명의 공정에서 사용하는 용매로는 용해도를 고려할때 디메틸 아세트아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 인산 트리스(디메틸 아미드) 또는 N-메틸-피롤리돈과 같은 극성 용매가 적합하다.
합성 공정은 -10℃ 내지 실온에서 수행할 수 있다. 반응은 약 0℃에서 시작하는 것이 바람직하며, 그후에 온도를 실온으로 상승시킨다.
축합제로는 쉽게 사용할 수 있는 디사이클로헥실 카보디이미드(DCC)가 바람직하지만, 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노-에틸)-카보디이미드, 톨루엔 설포네이트 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 염산염과 같은 다른 카보디이미드를 사용할 수도 있다.
중간체로는, 히스티딘의 이미다졸 환에서 디니트로 페닐기에 의해 보호된 펩타이드가 일차적으로 수득된다. 이러한 디니트로페닐기는 펩타이드 화학에서의 공지방법, 예를들면 가티올 분해 [Biochem-Biophys.Res. Commun. 29, 178(1967) ; Biochemistry9, 5122(1970)] 또는 가하이드라진 분해 [Tetrahydron Letters 44, 4121(1971)]에 의해 제거할 수 있다.
일반적으로, Dnp-함유 중간체는 분리할 필요가 없다. 펩타이드를 커플링시킨 후에, 머캅토에탄올 또는 에틸머캅탄과 같은 티올, 또는 하이드라진을 반응혼합물에 가하고 Dnp기를 제거(박충 크로마토그라피에 의해 쉽게 확인할 수 있다)한 후에 혼합물을 처리하여 반응을 완결시킨다. 하이드라진이 탈차단제로 사용되는 경우에, 디메틸 포름아미드는 하이드라진에 대해 불안정하기 때문에 용매로 적합하지 않다.
LH-RH 및 그의 동족체는 특히 N-하이드록시석신미드(HONSu), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt), 3-하이드록시-4-옥소-3,4-디하이드로-1,2,3-벤조트리아진(HOObt) 또는 N-하이드록시-5-노르보르넨-엔도-2,3-디카복스이미드(HNOB)와 같이 라세미화를 감소시키는 N-하이드록시 화합물을 가하고 DCC를 사용하여
Figure kpo00005
적절한 펩타이드를 결합시킴으로써 제조할 수 있다[참조. Biochem-Biophys, Res. Commun 45, 767-773(1971)].
그러나, 고압액체 크로마토그라피(HPLC)에 따르면 이 공정에서 히스티딘의 부분적인 라세미화는 피할 수 없음을 나타낸다(참조 표 1 및 2). 히스티딘 펩타이드 합성에 있어서 히스티딘의 라세미화를 감소시키기 위해, 이미다졸 환을 토실그룹(Tos그룹 )으로 보호하는 것이 문헌에 제안되어 있다. 2,4-디니트로페닐 그룹(Dnp-그룹)에 의한 상응하는 보호는 히스티딘이 라세미화될 뿐 아니라 더 오염되는 경향이 크기 때문에 적합하지 않다[참조. Rec. Trav. Chim. Pay-Bas 93, 256(1974)].
그러므로, 출발화합물
Figure kpo00006
히스티딘이 Nim-2,4-디니트로페닐그룹(Dnp)으로 보호되고 반응이 본 발명의 조건하에서 수행되는 경우에, 히스티딘의 라세미화를 D-히스티딘의 2%미만으로 줄일 수 있다는 것은 놀라운 사실이다. 동일 조건하에서 Nim보호 대신에 토실그룹을 사용하면 라세미화를 D-히스티딘의 5%이하로 감소시킬 수 없었다.
다른 카복시 화합물과 여러가지 축합방법을 사용한 LH-LH합성의 비교시험은 표1에 나타내었다. 이 시험에서, [D-His2]-LH-RH의 함량은 고압액체 크로마토그라피(HPLC)로 측정한다. 다음 표에서는 DCC-Hoobt의 사용 및 Nim-Dnp-보호만이 라세미화를 D-히스티딘의 2%이하로 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
표 2에서 볼 수 있는 바와 같이 LH-RH동족체의 합성에서도 동일한 결과를 얻는다.
[표 1]
LH-RH합성에 있어서의 라세미화에 대한 시험
반응조건은 실시예 3 내지 5에 설명하였다.
HPLC : 리크로소르브(Lichrosorb
Figure kpo00007
) SI60(평균 공극 크기 60Å의 실리카겔 ; 독일연방공화국의 머크사제품)으로 충진된 칼럼(0.4×25cm) ; 용출제는 클로로포름 310 용량부, 메탄올 190용량부, 물 14용량부, 트리에틸아민 3.1 용량부 및 포름산 1용량부 ; 용출속도 1ml/분.
RT(LH-RH)=약 14.0 내지 14.5분
RT([D-His2] LH-RH)=약 17.5 내지 18분
Figure kpo00008
[표 2]
[D-Ser(But)6]LH-RH-(1-9) 노나펩타이드 에틸아미드 합성시의 라세미화에 대한 시험
반응조건은 실시예 6및 7에 설명하였다,
HPLC : 리크로소르브
Figure kpo00009
SI 60(머크사 제품)으로 충진된 칼럼(0.4×25cm) ; 용출제는 아세토니트릴 410 용량부, 메탄올 29용량부, 물 29용량부, 클로로포름 20용량부, 트리에틸아민 3.7용량부 및 포름산 1 용량부 ; 용출속도 2ml/분
RT([D-Ser(But)6-LH-RH-(1-9)-노나 펩타이드 에틸아미드)=40분
RT([D-His2, D-Ser(But)6]-LH-RH-(1-9)-노나 펩타이드 에틸아미드)=40분
Figure kpo00010
다음 실시예는 본 발명을 설명하는 것이다.
[실시예 1]
Figure kpo00011
Figure kpo00012
30g(100밀리몰) 및 NaHCO320g(238밀리몰)을 물 200ml에 용해시키고, 교반하면서 디옥산 100ml 중의 2,4-디니트로플루오로벤젠 22.3g(120밀리몰)의 용액을 1시간에 걸쳐 적가한다. 혼합물은 실온에서 3시간동안 교반을 계속한다. 형성된 침전을 흡인 여과하고, 여액을 에틸 아시테이트 200ml씩으로 2회 추출한다. 수층을 농축하여, 잔사는 200ml에 용해시키고 1N HCl 120ml를 가한다. 상층을 경사시켜 침전된 적색 오일로부터 분리하고 여과한다. 수용액에 n-부탄을 300ml 가하고, 혼합물을 충분히 진탕하여 상혼합물을 4℃에서 밤새 방치한다. 다음날, 황색 침전을 흡인 여과하여 소량의 n-부탄올로 세척한다. 존재하는
Figure kpo00013
정량적으로 제거하기 위해 침전을 실온에서 물 300ml씩과 함께 각 1시간동안 2회 교반하고 혼합물을 흡인 여과하여 , 잔사를 감압하에서 P2O5로 건조시킨다.
수율 : 20g
융점 : 235 내지 241℃(분해)
Figure kpo00014
=-12.2℃(c=1, 아세트산)
Figure kpo00015
=+18.9℃(c=1, 디메틸포름아미드)
[실시예 2]
표 1의 대조 물질인
Figure kpo00016
제조
Figure kpo00017
3g(10밀리몰) 및 NaHCO32.3g을 물 20ml에 용해시키고, 실온에서 교반하면서, 디옥산 약 10ml중의 p-톨루엔 설포클로라이드 2.1g(10%과량)의 용액을 서서히 적가한다. 첨가가 완결되면, 혼합물을 추가로 1시간동안 계속 교반하여 에테르로 2회 추출한다. 수층을 2N HCl을 가해 pH 2로 산성화하고 침전을 흡입여과하여 물로 세척하고 여과잔사를 감압하에서 P2O5로 건조시킨다.
수율 : 2.2g
[실시예 3]
표 1에서 제시된 다른 커플링 방법을 사용한
Figure kpo00018
LH-RH합성
H-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHz 디토실레이트 640mg 및
Figure kpo00019
디메틸아세트아미드 3ml에 용해시킨다.
이 용액에 N-에틸모르폴린 0.065ml 및 HOBt 68mg (또는 HOObt 81mg 또는 HONB 90mg 또는 HONSu 57mg)을 가한다.
혼합물을 0℃로 냉각시키고, DCC 110mg을 가해 전체를 0℃에서 1시간 교반한 다음 실온에서 밤새 교반한다. 다음날, 하이드라진 하이드 레이트 0.1ml를 가하고 혼합물을 실온에서 2시간 교반한 다음 흡인 여과한다. 여액을 n-부탄올 30ml와 NaHCO3용액 30ml 사이에 분배한다. n-부탄올 상을 고진공중에서 농축하고 잔사를 에테르로 연마한다. 침전을 흡인여과하여 건조시킨다. 다음에 , 생성물을 묽은 아세트산에 용해시키고 용액을 약 10ml의 도엑스(Dowex) 1×2(아세테이트형태) 상에서 크로마토그라피한다. 칼럼을 물로 용출시키고 용출액을 동결 건조시킨다.
수율 500 내지 600mg
더 정제하기 위해 , 조 LH-RH를 독일연방공화국 특허공보 제2,438,350호에 기술된 바와같이 교차 결합된 하이드록시 프로필화 덱스트란 겔상에서 분배 크로마토그라피한다.
순수 LH-RH의 수율 : 약 250 내지 300mg
[실시예 4]
표 1에 제시된 다른 커플링 방법을 사용한
Figure kpo00020
LH-RH합성
H-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2디토실레이트 640mg 및
Figure kpo00021
210mg을 디메틸아세트아미드 3ml에 용해시킨다. N-에틸모르폴린 0.065ml 및 HOObt 81mg(또는 HONSu 57mg)을 가하여 혼합물을 0℃로 냉각시킨다. 다음에 DCC 110mg을 가하고 혼합물을 0℃에서 1시간 교반한 후, 실온에서 밤새 교반한다. 혼합물을 실시예 3에 기술한 방법으로 더 처리하여 완결시키고 정제한다.
수율 : 275mg(또는 250mg)
[실시예 5]
표 1에 따르는 다른 커플링 방법을 사용한
Figure kpo00022
LH-RH합성
Figure kpo00023
0.5H2O 11g(25밀리몰) 및 H-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2·2 TosOH 32g(25밀리몰)을 디메틸 아세트아미드 150ml에 용해시키다. HOObt(3-하이드록시-4-옥소-3,4-디하이드로-1,2,3-벤조트리아진) 4.07g(또는 HOBt 3.4g 또는 HONB 4.5g 또는 HONSu 2.9g)을 가하고 혼합물을 0℃로 냉각한 후, N-에틸모르폴린 3.25ml 및 DCC 5.5g을 가한다. 혼합물을 0℃에서 1시간동안 교반한 다음 실온에서 밤새 교반한다. 형성된 침전을 흡인여과하여 소량의 디메틸 아세트아미드로 세척한다. 여액에 100% 하이드라진 하이드레이트 2.5ml를 가하고 전체를 실온에서 4시간동안 교반한다. 흑색용액이 형성된다. 펩타이드를 에틸 아세테이트 1,250ml로 침전시킨다. 침전을 흡인 여과하여 에틸아세테이트로 세척한 후에 , 메탄올 430ml에 용해시키고, 에틸아세테이트 1,400ml 펩타이드를 재침전시킨다.
침전을 흡인여과하여 n-부탄올 1,000ml에 용해시키고, 포화 NaHCO3용액 1,000ml와 함께 1회 진탕한 다음에 포화 NaHCO3용액 750ml와 함께 진탕한다. n-부탄올 상을 고진공중에서 농축한다. 잔사를 에틸아세테이트로 연마하여 건조시킨다.
조수율 : 약 25g. 생성물은 실시예 3에 기술한 것과 같이 더 정제한다.
순수생성물의 수율 : 12 내지 14g
[실시예 6]
표 2에 제시된 다른 커플링 방법을 사용한
Figure kpo00024
부터의 [D-Ser(But)6-LH-RH-(1-9)-노나펩타이드 에틸아미드 합성
Figure kpo00025
11g(25밀리몰) 및 H-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5·2HCl 26.6g(25밀리몰)을 디메틸아세트아미드 150ml에 용해시킨다. 3-하이드록시-4-옥소-3, 4-디하이드로-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt) 4.07g(또는 HOBt 3.4g 또는 HONB 4.5g 또는 HONSu 2.9g)을 가하고 혼합물을 0℃로 냉각시킨다. 다음에, N-에틸모르폴린 3.25ml 및 DCC 5.5g을 가하고 혼합물을 0℃에서 1시간 교반한 다음 실온에서 밤새 교반한다.
형성된 침전을 흡입여과하여 디메틸 아세트아미드 50ml로 세척한다. 여액에 100% 하이드 라진 하이드 레이트 2.5ml를 가하고 혼합물을 실온에서 4시간동안 교반한 다음 에틸 아세테이트 1,250ml로 펩타이드를 침전시킨다. 침전을 흡입여과하여 에틸아세테이트로 완전히 세척한다. 다음에, 생성물을 메탄올 430ml에 용해시킨다. 에틸아세테이트 1,400ml를 가해 펩타이드를 다시 침전시킨다. 침전을 n-부탄올 1,000ml에 용해시키고, 용액을 포화 NaHCO3용액 1,000ml로 1회 추출한 다음 포화 NaHCO3용액 750ml로 추출한다.
n-부탄올 상을 농축하여 잔사를 에틸아세테이트로 연마한다. 침전을 흡인여과하여 에틸아세테이트로 세척하고 건조시킨다.
수율 : 18.7g
아세테이트로 전환시키기 위해, 상기생성물을 물 50ml 및 아세트산 5ml에 용해시키고, 도엑스 1×2(아세테이트 형태) 230ml상에서 크로마토그라피하여 칼럼을 물로 용출시킨다.
생성물 함유분획을 모아 동결 건조시킨다.
수율 : 약 15.0g
Figure kpo00026
=-40℃(C=1, 메탄올)
생성물은 실시예 3에 기술한 바와같이 더 정제한다. 수율 : 약 9.5 내지 11g
[실시예 7]
표 2에 제시된 다른 커플링 방법을 사용한
Figure kpo00027
부터의 [D-Ser(But)6]-LH-RH-(1-9)-노나펩타이드 에틸아미드 합성
H-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-(But)-Leu-Arg-Pro-NHC2H5·2HCl 532mg 및
Figure kpo00028
150mg을 디메틸아세트아미드 3ml에 용해시킨다. N-에틸모르폴린 0.065ml 및 HOBt 68mg(또는 HOOBt 81mg 또는 HONB 90mg 또는 HONSu 57mg)을 가한다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 DCC 110mg을 가하여 전체를 우선 0℃에서 1시간동안 교반한 다음 실온에서 밤새 교반한다.
생성물은 실시예 3에 기술한 방법으로 더 처리하여 완결시키고 정제한다.
수율 : 104 내지 207mg

Claims (1)

  1. Figure kpo00029
    유리아미노그룹 및 보호된 카복시그룹을 함유하는 일반식(Ⅱ)의 옥타-펩타이드 또는 (Ⅲ)의 헵타-펩타이드를 용매중에서 3-하이드록시-4-옥소-3,4-디하디드로-1,2,3-벤조트리아진(HOObt) 및 카보디아미드를 가하여 반응시킨 다음 디니트로페닐그룹을 제거하여, LH-RH 또는 LH-RH동족체를 제조하는 방법.
    H-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(Ⅱ)
    H-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5(Ⅲ)
    상기식에서, X는 Gly 또는 D-아미노산 또는 그의 유도체이다.
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