KR850000099B1

KR850000099B1 - Sen-143화합물의 제조방법

Info

Publication number: KR850000099B1
Application number: KR1019810003461A
Authority: KR
Inventors: 싱고 마쯔무라; 아오야나기; 요오지 에즈레; 토시 오지마노부; 교타가 곤노; 히로시 야마시따; 오사무 타나베
Original assignee: 다까라 슈조오 가부시기가이샤; 오오미야 다까시; 닛뽄신야꾸 가부시기가이샤; 모리시따 히로시
Priority date: 1981-02-24
Filing date: 1981-09-16
Publication date: 1985-02-22

Abstract

내용 없음.

Description

SEN-143화합물의 제조방법

제1도는 SEN-143의 취화 칼륨 정중에서의 적외흡수 스펙트럼.

제2도는 그의 중 클로로포름 중에서의¹H-NMR흡수 스펙트럼.

제3도는 그의 중 클로로포름 중에서의¹³C-NMR흡수 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명은 신규의 항생물질 SEN-143화합물과 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 SEN-143화합물은 다음과 같은 이화학적 성질을 가진다.

(a) 외관 : 백색분말

(b) 융점 : 214-217℃

(c) 원소분석 : C 57.54% H 8.84% N 0%

(d) 선광도 :

=-4.2°(C=1.0%, 메탄올)

(e) 자외선 흡수 스펙트럼 : 말단흡수

(f) 적외선 흡수 스펙트럼 : 제1도에 표시함.

(g)¹H-NMR : 제2도에 표시함

(h) 용해성 : 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 메탄올에가용, 에탄올에소량용해, 물에난용, 벤젠, 에틸에테르, 석유에테르, 헥산에불용.

(i) 안정성 : 안정(중성수용액중, 60℃ 30분에서 활성의 감소없음)

(j) 정색반응 : 양성, 요오드, 과망간산칼륨, 음성, 닌히드린, 염화제2철

(k) Rf값 : 서독 메르크사제 실리카겔(Art. 5554)를 사용한 박층 크로마토 그라피에 있어, 다음의 Rf값을 나타낸다.

(ㅣ)¹³C-NMR : 제3도에 표시함

(m) 분자식 : C_30-32H_54-58O_13-14(¹³C-NMR에서 탄수소는 30-32개이고, 원자분석의 결과를 합하여 산출)

(n) 분자량 : 622-666(분자식에서 산출) SEN-143화합물의 생물학적 성질은 다음과 같다.

(1) 살균작용, 항 캔디다 활성 : Sabouraud한천 평판배지를 사용하여, 접종 균농도 10⁵개/ml로 피검균을접종하고, 37℃로 48시간 배양후, 최소 발움 저해 농도를 측정했다.

살균활성 : HI(hard infusion) 평판 한천배지를 사용하여, 트리프트쇼오야 액체배지중에서 24시간, 37℃에서 배양한 피검균을 접종하고, 37℃로 24시간 배양후 균의 생육을 관찰하였는바, 최대농도 500㎍/ml에서 이하의 실험균에 살균황성을 나타내지 않았다.

Staphylococcus aureus (황색 포도성 구균) FDA 209p Staphylococcus aureus No. 41

Escherichia coli (대장균)NIHJ Escheridhia (대장균) No. 16

Klebsiella pneumoniae (폐염간균), Proteus vulgaris (심상변형균) HX-19, Saricinalutea (루테아팔련구균속) PCI 1001, 항사상균활성 : Sabouraud의 한천 평판배지를 사용하여, Sabouraud의 사면배지상에서 25℃로 2주간 배양하고, 충분히 성숙한 실험균을 접종하고, 25℃로 배양하여, 균의 생육을 관찰하였는바, 최대농도 1000 ㎍/ml에서 다음의 실험균에 황성을 나타내지 않았다.

흑색구균(Aspergillus niger), Fasarinm Oxysporum

성망상 백선균 (Trichophyton asteroides)

모창 백선균 (Trichophyton mentagrophytes)

성홍색 백선균 (Trichophyton rubrum)

(2) 급성독성, SEN-143화합물을 시험쥐에 복강내 투여(200mg/kg)한 결과, 이상은 볼 수 없었다. 이상의 이화학적 성질 및 생화학적성질에서 SEN-143화합물은 신규물질임이 확인되었다.

SEN-143화합물은 항세균 작용을 갖지않고, 항사상균 작용도 가지지 않고 항 캔디다 활성을 가진다는 특이한 생물학적 활성을 가지고, 예를들면 염기성 캔디다증, 호기성 캔디다증, 질캔디다증의 치료에 유용한 물질이다.

본 발명의 SEN-143물질은, 예를들면 스트렙토마이세스 속에 속하는 SEN-143화합물 생산균을 배지에 배양하는 것에 의하여 제조할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 스트렙토마이세스 속에 속하는 SEN-143화합물 생산균 가운데, 본 발명자등이 고오또후 후나이균 소노베쪼오의 토양에서 새로이 분리한 균주 (이하 SEN-143주라 칭한다)는 다음과 같은 균학적 성질을 가진다. 또한, 실험의 순서는 ISP의 실험법 (E. B. Shirling et al ; Ihtern. J. Systematic Bacteriol. Vol. 16(3) p. 313-340(1966)에 의거하였다. 또 배지는 상기 문헌이외에 산업별 심사기준 "응용미생물 공업" 및, S. A. Waksman 저(THE Actinomycetes Vol. 2(1961)에 예시되어 있는 것을 사용하였다. 또 색조의 기재는 Container Corporation of America의 Color Harmony Manual을 참조하여 필요가 있을 경우는 부기했다.

(I) ISP의 방법에 의한 기재, (a) 형태학적 특징

현미경하에서 잘분지된 기중균사에서 기균사가 생기고, 10개이상의 포자의 연쇄를 볼 수 있다.포자 형성쇄는 나선상을 나타내는데, 이스트 맥아 한천 배지, 글리세롤. 아스파라긴 한천 배지상에서는 흑상, 고리상의 불완전 나선사가 섞여있음을 볼 수 있다. 논생지(論生枝)의 형성은 볼 수 없다. ISP의 기준에 의하면, Spiral속에 속한다. 포자는 통상 난형에서 타원형으로(0.5-0.7)×(0.6-0.8)μ의 크기를 가지고, 전자현미경에 의한 포자 표면구조는 유자형(有刺型)이나, 이스트. 맥아 한천배지, 오오트미일 한천배지에서는 평활형(平滑型)이 섞여 있음을 볼 수 있다. 이상의 형태학적 특징은, 이스트. 맥아 한천배지 그리세로올, 아스파라긴 한천배지, 오오트미일 한천배지, 전분 무기염 한천배지, 기타의 기균사를 양호하게 형성하는 배지에 있어서 관찰된다.

(b) 콜로니의 색, 포자를 충분히 착생한 기균사의 색조는, 이스트. 맥아 한천배지, 글리세롤, 아스파라긴 한천배지, 오트밀 한천배지, 전분 무기염한천배지, 기타의 기균사를 양호하게 형성하는 배지에 있어서 회색계(Tresner Backus Color Wheels)이다. 즉, 대표적색조는 명회갈색(3ge)-회갈색(3ig)이다. 다만 전분 무기염 배지상에서는 회색(2fe)이다.

(c) 영양균사(콜로니)의 색, 이스트. 맥아한천배지, 글리세롤, 아스파라긴 한천배지에서 엷은황색 엷은갈색-엷은갈색이고, 특징적이 아니다. 전분 무기염 한천배지, 오트밀 한천배지이고 무색이다.

(α) 배지의 색(가용성 색소)

·멜라노이드 색소의 생산 : 양성

·펩토. 이스트. 철한천 흑갈색, 티토신 한천배지에서 흑색을 나타낸다.

·기타의 색소의 생산

글리세롤, 아스파라긴 한천배지, 글루코스 질산염 한천배지, 글리세롤 질산염 한천배지에서 담황색(pH지시물이 아니다)의 가용성 색소를 생상하는 이외에는 특히 저명한 색소생산은 인정되지 않는다.

(e) 탄소원의 이용성

·ISP 기재당의 이용성

·D-글루코스, L-아라비노오스, D-자일로스, D-프락토즈, i-이소시톨, D-만니톨, 라피노오즈(raffinofe)를 잘 이용한다. 수크로즈, 람노오즈를 이용하지 아니한다.

·기타의 당의 이용성, 갈락토오즈, 만노오즈, 말토오즈, 락토오즈, 전분을 잘 이용한다. 살리신을 약하게 이용하고, 이눌린은 이용하지 아니한다. (Ⅱ) 기타의 성상

(a) 배양기상의 성상(27℃, 14일 배양)

·기타의 배양기상의 성상

·글루코즈. 펩톤, 젤라턴 배지, 중간정도의 생육으로 기균사는 착생하지 않고 가용성 색소는 갈색, 젤라틴을 액화한다.

·셀롤로오스, 쯔아펙(czapex)의 질산염용액, 쯔아펙의 염화암모늄액의 어느것이든지 생육불량

·트립톤. 이스트 배양액, 생육은 양호이고, 가용성 색소는 흑갈색을 나타낸다.

(b) 생리적 성상

(9) 생육온도범위

5℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 28℃, 30℃, 35℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃로 실험.

10℃이하, 40℃이상에서는 생육하지 않음 28℃-30℃가 최적.

(10) 생육 pH 범위

pH 4.5-pH7.5에서 생육, pH6.0-pH7.5가 최적

(11) 셀룰라아재 : 음성

이상의 균학적 성상에서, 본 발명에 사용하는 균주(SEN-143주)는 스트렙토마이세스 속에 속한다. 본 균주는 회색계의 기균사를 가지고, 나선형의 형태적 특징을 가지고, 포자표면은 유자형(有刺型)이고, 영양균사, 가용성 색소는 특징적인색소생산이 없고, 멜라닌 색소의 생산성은 양성인 점 등에 주된 특징이다. 이러한 점을 고려해서 문헌 [Shirling, E. B., and Gottlieb, D. Intern. J. Systematic, Bacteriol., 18 (2) 69-189(1968) ; 18(4) 276-392(1968) ; 19(4) 391-512(1969) ; 22(4) 265-394(1972). S. A. Waksmann ; The Actinomycetes Vol.2(1961)]을 검색한 결과, 스트렙토마이세스 그리제오크로모게네스(Streptomyces griseochromogenes)의 범주에 속한다고 동정분리되었다. 또한, SEN-143은 신규항생물질을 생산한다는 유용한 특징을 가지므로, 스트렙토마이세스. 그리제오크로모게네스 SEN-143(Streptomyces griseochromogenes SEN-143)라고 명명하여, 다른 균주와 구별하였다. 본균은 일본 공업기술미생물 공업기술연구소에 미공연균기제5234호로하여 기탁되어 있으며 1982년 5월 13일자로 한국과학기술원(KAIST)에 수탁번호 제820513-02415호로 기탁되었다. 본 발명에 있어서 사용균으로서는, 상기한 스트렙토마이세스. 그리제오크로모게네스 SEN-143주와 본균주를 변이처리한 변이주 뿐만 아니라, 스트립토마이세스 속에 속하고, SEN-143물질을 생산하는 균이면 모두 사용할 수가 있다. 본 발명의 실시에서는, 스트립토마이세스, 그리제오크로모게네스 SEN-143주를 통상의 미생물의 배양방법으로 배양할 수가 있다. 배지의 영양원으로서는, 일반적으로 미생물의 배양에 이용되는 것이 사용된다. 즉, 탄소원으로서는, 글루코오스, 전분등이, 질소원으로서는, 대두분, 펩톤, 육즙, 옥수수추출액 등이 사용된다. 기타, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 탄산칼슘의 적량을 가하면 양호한 결과를 얻고, 또한 미량의 철, 마그네슘의 황산염등을 가해도 좋다. 배양방법으로서는, 정치배양, 진탕배양, 심부교반통기배양의 어느것이든지 좋으나 심부교반통기배양이 보다바람직하다. 배양온도는 22-30℃, 바람직하기로는 25-27℃, pH6-8로 배양하면 통상 48-72시간에 SEN-143물질이 균체중 및 배양액중에서 생산되지만, 특히 균체중에 많이 축적한다.

SEN-143물질의 추출, 단리에는 통상 사용되고 있는 방법이 널리 이용 가능하다. 즉, 균체중 보다 물과 혼화하는 유기용매, 예를들면 메탄올, 아세톤등에 의한 추출법, 물과 혼화하지 않는 유기용매, 예를 들면 초산 에스테르류, 알코홀류, 케톤류등에 의한 추출법, 실리카겔, 알루미나, 이온교환수지, 활성탄등에 의한 흡착법등을 단독 또는 적당히 조합시켜서 행하는 방법을 이용할 수가 있다. 이하에 실시예를 들어본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[실시예]

가용성전분 1%, 대두분 1%, 염화나트륨 0.5%, 염화암모늄 0.15%, 탄산칼슘 0.3%, pH7의 조성의 배지 200ml을 500ml 3각 플라스크에 넣어, 통상법대로 멸균후 여기에 스트렙토마이세스. 그리제오크로모게네스 SEN-143주의 사면배양에서 수 고리의 포자를 접종하고, 28℃ 3일간 200회전으로 진탕배양한다. 얻어진 균액 600ml을 같은 조성의 배지 10ℓ을 포함하는 14ℓ용 쟈아. 파아멘터에 접종하고, 교반 rpm통기량 6-7ℓ/1분, 온도 28℃로 48-72시간 배양한다. 여기서 얻어진 배양액 40ℓ을 원심분리하여 습한균체 약 1.3kg을 얻는다. 메탄올로 추출후 감압하에 농축하여 유상물질을 얻는다. 여기에 물 약 1ℓ를 가하여, 진한염산으로 pH2로 조정하여 초산에틸로 분배추출한다. 초산에틸층을 버리고, 수용층을 n-부탄올로 추출한다. 감압하에 n-부탄올을 제거하여 고형물 5.4g을 얻는다. 약 200g의 실리카겔을 사용하여, 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 칼럼크로마토그라피를 행한다. 메탄올 함량을 0%, 10%, 20%, 40%로 바꾸고, 최후에 메탄올로 전개한다. 활성물질은 40%-100%의 구분으로 얻어지고, 이것을 감압하에 농축견고하여 고형물 1g을 얻는다. 다시 여기에 에탄올을 가하여, 에탄올 가용물 약 250mg을 얻어, 이것을 물에 현탁하여 염산으로 pH를 2로 조정하여 n-부탄올로 추출한다. n-부탄올을 감압하에 제거하여 백색분말을 얻어, 이것을 메탄올과 에탄올의 혼합용매를 사용해서 재결정하여, SEN-143화합물의 백색분말 150m을 얻는다.

Claims

스트렙토마이세스 속에 속하는, 아래의 이화학적 성질을 가지는 SEN-143화합물의 생산균을 배지에 배양하여, 얻어지는 배양물에서 분리, 채취하는 것을 특징으로 하는 SEN-143물질의 제조방법.

(a) 외관 : 백색분말

(b) 융점 : 214-217℃

(c) 원소분석 : C : 57.54%, H : 8.84%, N : 0%

(d) 선광도 : t6 =-4.2°(C=1.0%, 메탄올)

(e) 자외선 흡수 스펙트럼 : 말단흡수

(f) 적외선 흡수 스펙트럼 : 제1도에 표시함

(g)¹H-NMR : 제2도에 표시함

(h) 용해성 : 디메틸 포름아미드, 디메틸설폭사이드, 메탄올에 가용, 에탄올에소량용해, 물에난용, 벤젠, 에틸에테르, 석유에테르, 헥산에불용

(i) 정색반응 : 양성 ; 요오드, 과망간산칼륨, 음성 ; 난히드린, 염화제2철

(j) 안정성 : 안정(중성수용액중, 60℃ 30분에서 활성의 감소없음)

(k) Rf치 ; 서독 메르크 사제 실리카겔(Art. 5554)를 사용한 박층 크로마토그라피에 있어, 다음의 Rf치를 나타낸다.