KR20240132357A - 친화도 크로마토그래피를 사용하여 불순물로부터 이종이량체 단백질의 분해를 개선하는 방법 - Google Patents
친화도 크로마토그래피를 사용하여 불순물로부터 이종이량체 단백질의 분해를 개선하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
일련의 크로마토그래피 사이클을 통해 불순물로부터 이종이량체 단백질(예: 이중특이적 항체)을 정제하는 방법이 개시된다. 다양한 구현예에서, 용리 완충액의 pH는, 결합하는 불순물로 인한 오염을 최소로 유지하기 위해 이종이량체 단백질의 유의한 회수 손실 없이, 일련의 사이클 내에서 사이클이 증가함에 증가된다
Description
본 발명은 단백질 생성물의 정제, 예를 들어 단백질의 복합 혼합물로부터 이종이량체 단백질을 정제하기 위한 친화도 크로마토그래피 컬럼의 분해 수명을 개선하는 것에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 방법은 이종이량체 단백질(예를 들어 이중특이적 항체)의 회수 손실을 최소화하면서 불순물에 의한 오염을 최소화하기 위해 증가하는 사이클에서 증가된 용리 pH를 사용하여 일련의 크로마토그래피 사이클을 수행하는 단계를 포함한다.
단백질 생성물의 정제는 다양한 크로마토그래피 단계를 활용하여 숙주 세포 단백질, DNA, 및 단백질 생성물의 원하지 않는 종과 같은 불순물을 제거하는 것을 필요로 할 때가 있다.
다중특이적 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 이종이량체 단백질은 친화도 크로마토그래피를 사용하는 정제에 맞게 포맷팅될 수 있다. 하나의 이러한 포맷은 개선된 약동학적 프로파일 및 최소 면역원성을 갖는 표준 완전 인간 IgG 항체를 기준으로 한다(그 전체가 본원에 통합되는 미국 특허 제8,586,713호 참조). 단일 공통 경쇄 및 2개의 구별되는 중쇄가 합쳐져 이중특이적 항체를 형성한다. 중쇄 중 하나는 치환된 Fc 서열(이하 "Fc*")을 함유하는데, 이는 단백질 A에 대한 Fc*의 결합을 감소시키거나 제거한다. 예를 들어, 하나의 이러한 Fc* 서열은 CH3 도메인에서 H435R/Y436F(EU 넘버링 시스템에 의함; IMGT 엑손 넘버링 시스템에 의하면 H95R/Y96F) 치환을 함유한다. 2개의 중쇄 및 공통 경쇄의 공동 발현은 3개의 산물을 생성하는데, 이들 중 2개는 중쇄에 대해 동종이량체이고, 이들 중 1개는 원하는 이종이량체 이중특이적 산물이다. Fc* 서열은, 고 결합력 FcFc 중쇄 동종이량체 또는 약하게 결합하는 Fc*Fc* 동종이량체와 비교하여 단백질 A에 대한 중간 결합 친화도로 인해, 상업적으로 이용 가능한 친화도 컬럼을 이용한 FcFc* 이중특이적 산물의 선택적 정제를 가능하게 한다.
이종이량체 단백질(예를 들어 이중특이적 항체)의 상업적 규모의 정제를 달성하기 위해서는, FcFc 동종이량체, Fc*Fc 이종이량체, 및 Fc*Fc* 동종이량체 간의 양호한 분해가 요구된다. 그러나, 다수의 사이클에 걸쳐 친화도 컬럼을 반복적으로 사용하면 결합하는 불순물에 의한 오염이 일반적으로 증가하며, 이는 회분 실패로 이어질 수 있다. 이러한 문제점은 컬럼의 수지(기판에 부착된 단백질 결합 리간드)의 교체에 의해 해결될 수 있지만, 컬럼 교체는 비용이 많이 들고(수지 1리터 당 약 $15K), 컬럼을 비우고 다시 채우는 데 필요한 시간과 연관된 지연을 초래한다. 친화도 크로마토그래피를 통한 정제의 경우, 정제된 이종이량체 단백질을 생산하는 비용은 허용 가능한 순도 및 회수율을 유지하면서 친화도 수지로 수행될 수 있는 사이클 수의 함수이다. 따라서, 더 많은 수의 사이클에 걸쳐 컬럼 기능을 개선하기 위한 방법이 바람직하다.
본 개시의 일 양태에서, 본 발명은 이종이량체 단백질을 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 일련의 크로마토그래피 사이클을 수행하는 단계로서, 각각의 사이클은 다음을 포함하는, 단계: (i) 이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화도 매트릭스에 도입하는 단계로서, 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화도를 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는, 단계; (ii) 5 내지 9의 제1 pH인 제1 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않은 불순물을 제거하는 단계; (iii) 제2 pH인 제1 용리 완충액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 용리하는 단계; 및 (iv) 4 미만의 제3 pH인 제2 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합 불순물을 제거하는 단계로서, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 일련의 예비 사이클 동안의 예비 pH이고, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 후속하는 일련의 사이클 동안 예비 pH보다 높은 후속 pH로 상승되고, 예비 pH 및 후속하는 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있는, 단계; 및 (b) 용리액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 수집하는 단계.
일부 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 20 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 30 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 40 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 50 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 적어도 50 사이클, 적어도 60 사이클, 적어도 70 사이클, 또는 적어도 80 사이클 또는 그 이상으로 구성된다.
일부 구현예에서, 일련의 후속 사이클은 적어도 20 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 후속 사이클은 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 또는 적어도 80 사이클로 구성된다.
일부 구현예에서, 일련의 후속 사이클은 적어도 20 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 후속 사이클은 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 또는 적어도 80 사이클로 구성된다.
일부 구현예에서, 예비 pH는 4.0 내지 4.2이다. 일부 경우에, 예비 pH는 4.1 ± 0.05이다. 일부 구현예에서, 후속 pH는 4.3 내지 4.7이다. 일부 경우에, 후속 pH는 4.5 ± 0.05이다.
본 개시의 일 양태에서, 본 발명은 이종이량체 단백질을 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 일련의 크로마토그래피 사이클을 수행하는 단계로서, 각각의 사이클은 다음을 포함하는, 단계: (i) 이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화도 매트릭스에 도입하는 단계로서, 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화도를 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는, 단계; (ii) 5 내지 9의 제1 pH인 제1 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않은 불순물을 제거하는 단계; (iii) 제2 pH인 제1 용리 완충액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 용리하는 단계; 및 (iv) 4 미만의 제3 pH인 제2 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하는 불순물을 제거하는 단계; (b) 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 사이클 중 임의의 하나 또는 그 이상을 수행한 후에 이종이량체 단백질을 함유하는 용리액에서 결합하는 불순물의 수준을 측정하고, 결합하는 불순물의 측정된 수준을 결합하는 불순물의 기준 수준과 비교하는 단계로서, 결합하는 불순물의 측정된 수준이 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 후속 사이클에서 제2 pH를 증가시키고, 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 또는 후속 사이클 동안의 제2 pH가 4.0 내지 5.2 범위 이내에 있는, 단계; 및 (c) 용리액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 수집하는 단계.
일부 구현예에서, 결합하는 불순물의 기준 수준은 2% 내지 10%이다. 일부 경우에, 결합하는 불순물의 기준 수준은 3% 내지 7%이다. 일부 경우에, 결합하는 불순물의 기준 수준은 5% ± 0.5%이다.
일부 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 후에 측정된다. 일부 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 매 5번 째 사이클 후에 측정된다. 일부 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 매 10번 째 사이클 후에 측정된다. 일부 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 매 20번 째 사이클 후에 측정된다. 일부 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 40번 째 사이클 또는 50번 째 사이클 후에 측정된다. 일부 경우에, 용리액은 일련의 사이클에 걸쳐(예를 들어 5 사이클 또는 10 사이클에 걸쳐) 수집되고, 결합하는 불순물의 수준은 합쳐진 용리액 풀에서 측정된다.
일부 구현예에서, 결합하는 불순물의 측정된 수준이 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 제2 pH는 4.0 내지 4.2의 범위에서 4.3 내지 4.7의 범위로 증가된다. 일부 경우에, 결합하는 불순물의 측정된 수준이 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 제2 pH는 4.1 ± 0.05에서 4.5 ± 0.05로 증가된다.
본 개시의 일 양태에서, 본 발명은 이종이량체 단백질을 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 일련의 크로마토그래피 사이클을 수행하는 단계로서, 각각의 사이클은 다음을 포함하는, 단계: (i) 이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화도 매트릭스에 도입하는 단계로서, 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화도를 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는, 단계; (ii) 5 내지 9의 제1 pH인 제1 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않은 불순물을 제거하는 단계; (iii) 제2 pH인 제1 용리 완충액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 용리하는 단계; 및 (iv) 4 미만의 제3 pH인 제2 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하는 불순물을 제거하는 단계로서, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 1차 일련의 사이클 동안의 1차 pH이고; 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 1차 일련의 사이클에 이어지는 2차 일련의 사이클 동안 1차 pH보다 높은 2차 pH로 상승하고; 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 2차 일련의 사이클에 이어지는 3차 일련의 사이클 동안 2차 pH보다 높은 3차 pH로 상승하며, 1차 pH, 2차 pH, 및 3차 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있는, 단계; 및 (b) 용리액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 수집하는 단계.
일부 구현예에서, 1차 일련의 사이클은 5 내지 50 사이클을 포함한다. 일부 경우에, 1차 일련의 사이클은 최대 20 사이클을 포함한다. 일부 경우에, 1차 일련의 사이클은 최대 40 사이클을 포함한다.
일부 구현예에서, 2차 일련의 사이클은 5 내지 50 사이클을 포함한다. 일부 경우에, 2차 일련의 사이클은 10 내지 25 사이클을 포함한다.
일부 구현예에서, 3차 일련의 사이클은 5 내지 50 사이클을 포함한다. 일부 경우에, 3차 일련의 사이클은 10 내지 25 사이클을 포함한다.
일부 구현예에서, 1차 pH는 4.0 내지 4.2의 범위 이내이다. 일부 경우에, 1차 pH는 4.1 ± 0.05이다. 일부 구현예에서, 2차 pH는 4.2 내지 4.4의 범위 이내이다. 일부 경우에, 2차 pH는 4.3 ± 0.05이다. 일부 구현예에서, 3차 pH는 4.4 내지 4.6의 범위 이내이다. 일부 경우에, 3차 pH는 4.5 ± 0.05이다.
일부 구현예에서, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 3차 일련의 사이클에 이어지는 제4 일련의 사이클 동안 3차 pH보다 높은 제4 pH로 상승되고, 여기서 제4 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 제4 일련의 사이클에 이어지는 제5 일련의 사이클 동안 제4 pH보다 높은 제5 pH로 상승되고, 여기서 제5 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 제5 일련의 사이클에 이어지는 제6 일련의 사이클 동안 제5 pH보다 높은 제6 pH로 상승되고, 여기서 제6 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있다.
일부 경우에, 2차 pH는 1차 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고, 3차 pH는 2차 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고, 제4 pH는 3차 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고, 제5 pH는 제4 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고/이거나, 제6 pH는 제5 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이며, 여기서 1차 pH는 4.0 내지 4.2의 범위 이내이다. 일부 구현예에서, 1차 pH는 4.1 ± 0.05이다.
일부 구현예에서, 1차 일련의 사이클, 2차 일련의 사이클, 3차 일련의 사이클, 제4 일련의 사이클, 제5 일련의 사이클, 및/또는 제6 일련의 사이클 각각은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 5 내지 50 사이클을 포함한다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 불순물은 제1 및 제2 폴리펩티드의 동종이량체 종을 포함한다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 단백질 결합 리간드는 단백질 A이고, 친화도 매트릭스는 기질에 첨부된 단백질 A 리간드를 포함한다.
일부 경우에, 단백질 A 리간드는 Z-도메인 4량체를 포함하는 조작된 단백질 A, Y-도메인 4량체를 포함하는 조작된 단백질 A, 또는 D 및 E 도메인이 결여된 조작된 단백질 A이다.
일부 경우에, 기질은 입자이고, 친화도 매트릭스는 25 μm 내지 100 μm의 평균 직경을 포함하는 다수의 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 입자는 40 μm 내지 60 um의 평균 직경을 포함한다. 일부 구현예에서, 입자는 45 μm 내지 55 um의 평균 직경을 포함한다. 일부 구현예에서, 입자는 약 50 μm의 평균 직경을 포함한다.
일부 경우에, 기질은 아가로오스, 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 폴리메타크릴레이트, 셀룰로오스, 조절된 기공 유리, 및 구형 실리카 중 어느 하나 또는 그 이상을 포함한다.
일부 경우에, 입자는 약 1100Å의 평균 직경을 갖는 기공을 포함한다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 용리 완충액은 적어도 250 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우에, 염 농도는 300 mM 초과 또는 400 mM 초과이다. 일부 경우에, 염 농도는 약 500 mM이다.
일부 구현예에서, 염은 다음을 함유하는 염으로부터 선택된다: (i) Cl-, Br-, I-, NO3 -, N(CH3)4 +, NH4 +, Cs+, Rb+, K+, Na+, H+, Ca2+, Mg2+, Al3+; (ii) Na+, H+, Ca2+, Mg2+, 또는 Al3+와 Cl-, Br-, I-, NO3 -, 또는 ClO4 -의 조합; 또는 (iii) CaCl2, MgCl2, 또는 NaCl의 조합.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 단백질 결합 리간드에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 단백질 결합 리간드에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함한다.
단백질 결합 리간드가 단백질 A인, 위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 단백질 A에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 단백질 A에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 제2 폴리펩티드는 H435R 변형 및 Y436F 변형(EU 넘버링)을 CH3 도메인에 포함한다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 제1 pH는 6 내지 8이다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 제3 pH는 2.8 내지 3.5이다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 이종이량체 단백질은 항체이다. 상기 방법의 다양한 구현예에서, 이종이량체 단백질은 이중 특이적 항원 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 단백질은 이중특이적 항체이다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 이종이량체 단백질의 적어도 85%는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수된다. 일부 경우에, 이종이량체 단백질의 적어도 87%는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수된다. 일부 경우에, 이종이량체 단백질의 적어도 89%는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수된다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 일련의 크로마토그래피 사이클은 100 이상의 사이클을 포함한다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 친화도 매트릭스는 매 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉될 수 있다. 일부 경우에, 친화도 매트릭스는 매 3 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉된다. 일부 경우에, 친화도 매트릭스는 매 5 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉된다. 일부 경우에, 친화도 매트릭스는 매 7 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉된다. 일부 구현예에서, 염기성 용액의 pH는 적어도 12이다. 일부 구현예에서, 염기성 용액은 0.1 N 내지 0.5 N의 농도로 염기를 포함한다. 일부 경우에, 염기 농도는 0.1 N 내지 0.3 N이다. 일부 구현예에서, 염기성 용액은 NaOH를 포함한다.
위에서 또는 본원에서 논의된 방법 중 어느 하나의 다양한 구현예에서, 각각의 사이클은 (v) 친화도 매트릭스를 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉시킴으로써 친화도 매트릭스를 세정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 염기성 용액의 pH는 적어도 12이다. 일부 구현예에서, 염기성 용액은 0.1 N 내지 0.5 N의 농도로 염기를 포함한다. 일부 경우에, 농도는 0.1 N 내지 0.3 N이다. 일부 구현예에서, 염기성 용액은 NaOH를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종이량체 단백질의 적어도 75%는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수되고, 결합하는 불순물은 6.5%를 초과하지 않는다. 일부 경우에, 이종이량체 단백질의 적어도 78%는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수된다. 일부 경우에, 이종이량체 단백질의 적어도 80%는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수된다.
다양한 구현예에서, 상기 또는 본원에서 논의된 구현예의 특징 또는 구성 요소 중 임의의 것이 조합될 수 있고, 이러한 조합은 본 개시의 범주 내에 포함된다. 상기에서 또는 여기에서 논의된 임의의 특정 값은 상기에서 또는 여기에서 논의된 다른 관련 값과 조합되어 범위의 상단과 하단을 나타내는 값을 갖는 범위를 열거할 수 있으며, 이러한 범위는 본 개시의 범주 내에 포함된다.
도 1은 본 개시의 일 구현예에 따른 예시적인 이종이량체 단백질(예를 들어 이중특이적 Fc*Fc) 및 결합된 불순물(동종이량체 종)을 도시한 것이다. 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 결합하는 하나의 폴리펩티드 및 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는 하나의 폴리펩티드를 포함한다(ø). 도시된 2개의 불순물은 동종이량체이며, 결합하지 않는 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는 (ø) 2개의 폴리펩티드로 구성되고, 결합하는 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하는 2개의 폴리펩티드로 구성된다.
도 2는 본 개시의 일 구현예에 따른 예시적인 크로마토그래피 사이클을 도시한다. 도시된 바와 같이, 사이클은 이종이량체 단백질 및 불순물의 혼합물을 친화도 매트릭스 상에 로딩하는 단계, 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않는 불순물을 제거하는 단계, 이종이량체 단백질을 용리하는 단계, 및 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하는 불순물을 제거하는 단계를 포함한다. 친화도 매트릭스에서 결합하는 불순물 및 이종이량체 단백질이 단백질 결합 리간드에 결합하는 것은 처음 2개의 패널에 도시되어 있다.
도 3은 용리 pH와 용리액 중 결합 불순물의 존재 및 미노출 크로마토그래피 컬럼에서 이종이량체 단백질(예: 이중특이적 항체)에 대한 상응하는 회수율 사이의 관계를 도시한다.
도 4a 및 4b는 미노출 컬럼(7 사이클) 및 사이클링된 컬럼(84 사이클)에서 용리 pH를 증가시키는 것이 용리액 중 결합하는 불순물의 존재에 미치는 영향(도 4a) 및 이종이량체 단백질(예를 들어 이중특이적 항체)에 대한 상응하는 회수율에 미치는 영향(도 4b)을 도시한다. 결합하는 불순물 수준에 관해 도 4a에 도시된 "목표 <5%"는 예시적인 것이며, 정제되는 이종이량체 단백질에 따라 달라질 수 있다.
도 5a 및 5b는 검정력 분석(도 5a) 및 설계 공간의 분획 도표(도 5b)를 포함하여, 설계 진단 파라미터를 도시한다. 검정력 분석은 제안된 설계가 특정 크기의 파라미터 효과를 구별할 수 있게 될 확률을 결정한다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 주요 효과 용어의 검정력은 >0.7이다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 상대 예측 분산은 설계 공간의 50%에 걸쳐 0.32 미만이다.
도 6은 실시예 3에서 평가된 상관관계의 그레이스케일 맵을 도시한다. 도시된 바와 같이, 모든 상관관계는 0.6 미만이며, 이는 충분히 직교하는 설계를 나타낸다. 맵에 상응하는 데이터의 표도 도 6에 포함되어 있다.
도 7a 및 7b는 이중특이적 수율(%)(도 7a) 및 결합하는 불순물 백분율(%)(도 7b)의 모델 예측 프로파일러를 도시한다. 분해 용리 완충액 pH가 감소하고 수산화물 접촉 시간이 증가할 때, 이중특이적 수율 및 결합하는 불순물 수준 둘 다 증가한다. 또한, 컬럼 로딩이 증가할 때, 이중특이적 수율이 증가한다.
도 2는 본 개시의 일 구현예에 따른 예시적인 크로마토그래피 사이클을 도시한다. 도시된 바와 같이, 사이클은 이종이량체 단백질 및 불순물의 혼합물을 친화도 매트릭스 상에 로딩하는 단계, 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않는 불순물을 제거하는 단계, 이종이량체 단백질을 용리하는 단계, 및 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하는 불순물을 제거하는 단계를 포함한다. 친화도 매트릭스에서 결합하는 불순물 및 이종이량체 단백질이 단백질 결합 리간드에 결합하는 것은 처음 2개의 패널에 도시되어 있다.
도 3은 용리 pH와 용리액 중 결합 불순물의 존재 및 미노출 크로마토그래피 컬럼에서 이종이량체 단백질(예: 이중특이적 항체)에 대한 상응하는 회수율 사이의 관계를 도시한다.
도 4a 및 4b는 미노출 컬럼(7 사이클) 및 사이클링된 컬럼(84 사이클)에서 용리 pH를 증가시키는 것이 용리액 중 결합하는 불순물의 존재에 미치는 영향(도 4a) 및 이종이량체 단백질(예를 들어 이중특이적 항체)에 대한 상응하는 회수율에 미치는 영향(도 4b)을 도시한다. 결합하는 불순물 수준에 관해 도 4a에 도시된 "목표 <5%"는 예시적인 것이며, 정제되는 이종이량체 단백질에 따라 달라질 수 있다.
도 5a 및 5b는 검정력 분석(도 5a) 및 설계 공간의 분획 도표(도 5b)를 포함하여, 설계 진단 파라미터를 도시한다. 검정력 분석은 제안된 설계가 특정 크기의 파라미터 효과를 구별할 수 있게 될 확률을 결정한다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 주요 효과 용어의 검정력은 >0.7이다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 상대 예측 분산은 설계 공간의 50%에 걸쳐 0.32 미만이다.
도 6은 실시예 3에서 평가된 상관관계의 그레이스케일 맵을 도시한다. 도시된 바와 같이, 모든 상관관계는 0.6 미만이며, 이는 충분히 직교하는 설계를 나타낸다. 맵에 상응하는 데이터의 표도 도 6에 포함되어 있다.
도 7a 및 7b는 이중특이적 수율(%)(도 7a) 및 결합하는 불순물 백분율(%)(도 7b)의 모델 예측 프로파일러를 도시한다. 분해 용리 완충액 pH가 감소하고 수산화물 접촉 시간이 증가할 때, 이중특이적 수율 및 결합하는 불순물 수준 둘 다 증가한다. 또한, 컬럼 로딩이 증가할 때, 이중특이적 수율이 증가한다.
본 발명을 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 하는데, 이는 이러한 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문이다. 또한 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 한정되므로 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 인용된 특정 수치와 관련하여 사용될 때, 이러한 값이 인용된 값과 1% 이내에서 다를 수 있음을 의미한다. 예를 들어 본 설명에 사용된 바와 같이, "약 100"이라는 표현은 99와 101을 포함하고 그 사이의 모든 값(예: 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 재료와 유사 또는 동등한 어떠한 방법 및 재료도 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료는 지금부터 설명한다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원, 및 비 특허 공개 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일반 사항:
친화도 크로마토그래피를 통한 이중특이적 항체의 정제는 이전에 기술되었다. 간략하게, 단백질 결합 리간드에 결합하는 하나의 폴리펩티드 및 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 관심 이종이량체 단백질은 동종이량체 불순물과 함께 친화도 매트릭스(단백질 결합 리간드를 함유함) 상에 도입된다. 알 수 있듯이, 2개의 동종이량체 종은 친화도 매트릭스의 단백질 결합 리간드에 결합하는 한 쌍의 폴리펩티드, 또는 친화도 매트릭스의 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는 한 쌍의 폴리펩티드를 포함한다(예를 들어 도 1 참조).
다수의 사이클에 걸쳐 친화도 크로마토그래피 컬럼을 반복적으로 사용하면 기능적 단백질-리간드 밀도가 상실되어 불순물 수준이 증가한다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 기능적 단백질-리간드 밀도의 상실은 불순물의 축적, 구조적 리간드 변화, 및/또는 리간드의 물리적 상실로부터 기인하는 것으로 여겨진다. 일부 경우에, 기능적 단백질-리간드 밀도의 상실은, 크로마토그래피 컬럼을 주기적으로 세정하는 데 사용되는 (예를 들어 NaOH로부터의) 수산화물 이온에 대한 노출과 적어도 부분적으로 관련된 것으로 여겨진다. 원인에 관계없이, 기능적 단백질-리간드 밀도의 상실은 결합하는 불순물 및 관심 이종이량체 단백질 모두의 경우에 친화도 매트릭스에 대한 결합력 저하로 이어진다. 재결합 이벤트의 경우, 감소된 확률과 결합된 저하된 결합력은 결합하지 않는 불순물과 함께 관심 이종이량체 단백질의 조기 제거로 이어지거나, 용리 동안 관심 이종이량체 단백질과 함께 결합하는 불순물의 조기 제거로 이어질 수 있다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 사이클링된 친화도 크로마토그래피 컬럼에서 용리 pH를 증가시키는 것이 이종이량체 단백질의 높은 회수율을 유지하면서 결합하는 불순물로부터 이종이량체 단백질(예를 들어 이중특이적 항체)의 분해를 개선할 수 있다는 예상치 못한 발견을 적어도 부분적으로 예측한다. 치료 단백질(예: 이중특이적 항체)의 대규모 상업적 제조 및 정제를 위한 원재료비는 상당한 관심사인데, 여기서 100 L 컬럼을 교체하는 비용은 150만 달러를 쉽게 초과할 수 있고, 정제 프로세스를 지연시킬 수 있다. 따라서, 친화도 크로마토그래피 컬럼의 가용 수명을 더 많은 수의 사이클에 걸쳐 연장시키면 상당한 비용적 이점을 달성할 수 있다.
이하에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 친화도 컬럼의 분해능을 연장시키고 이종이량체 단백질 회수율을 유지하는 방법은 다음을 포함한다: (i) 일련의 예비 사이클을 예비 용리 pH에서 수행하고 일련의 후속 사이클을 후속 (및 더 높은) pH에서 수행하는 단계; (ii) 용리액 중 불순물 수준을 각각의 사이클 후에 또는 주기적으로 측정하는 일련의 사이클을 수행하고, 일련의 사이클 전체에 걸쳐 최소 불순물 수준을 유지하도록 후속 사이클(들)에서 용리 pH를 상승시키는 단계; 및 (iii) 다수의 사이클 세트에 걸쳐 용리 pH를 단계적 방식으로 상승시키는 일련의 사이클을 수행하는 단계(예를 들어, 용리 pH는 매 5, 10, 15, 20, 또는 25 사이클 후에 0.1 내지 1 포인트 상승됨). 또한, 일부 구현예에서, (예를 들어 컬럼을 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉시킴으로써) 크로마토그래피 컬럼의 세정 빈도를 감소시키거나, 크로마토그래피 컬럼을 세정하는 데 사용되는 용액의 염기 농도를 감소시키는 것도 친화도 컬럼 해상도를 연장시킬 수 있다.
정의
용어 "항체"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 면역 글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH와 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 보다 보존적인 영역이 중간에 끼어 있는 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된 초가변 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단의 방향으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로 약칭될 수도 있고; 경쇄 CDR는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 약칭될 수도 있다. 용어 "고 친화도" 항체는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어, BIACORE™ 또는 용액-친화도 ELISA에 의해 측정했을 때, 이들의 표적에 대해 적어도 10-9 M, 적어도 10-1 M; 적어도 10-11 M; 또는 적어도 10-12 M의 결합 친화도를 갖는 항체를 지칭한다.
문구 "이중특이적 항체"는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 상이한 2개의 중쇄를 포함하며, 각각의 중쇄는 2개의 상이한 분자(예: 항원) 상에서, 또는 (예를 들어 동일한 항원 상의) 동일한 분자 상에서 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중특이적 항체가 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도보다 일반적으로 적어도 수 배 내지 수십 배 또는 수백 배 또는 수천 배 더 낮거나 그 반대일 것이다. 이중특이적 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상에(예를 들어 동일하거나 상이한 단백질 상에) 있을 수 있다. 이중특이적 항체는, 예를 들어 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄들을 조합함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 암호화하는 핵산 서열은 상이한 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열들은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 일반적인 이중특이적 항체는 2개의 중쇄 및 하나의 면역글로불린 경쇄를 갖는데, 중쇄 각각은 3개의 중쇄 CDR에 이어서, (N-말단에서 C-말단 방향으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖고; 면역글로불린 경쇄는 항원 결합 특이성을 부여하지는 않지만 각각의 중쇄와 결합할 수 있거나, 각각의 중쇄와 결합할 수 있고, 중쇄 항원 결합 영역에 의해 결합된 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있거나, 각각의 중쇄와 결합할 수 있고 중쇄 중 하나 또는 둘 다를 하나 또는 두 에피토프 모두에 결합시킬 수 있다.
본원에서 논의된 방법의 다양한 구현예에서, 이종이량체 단백질, 이중특이적 항체, Fc 함유 단백질 등은 이소형 IgG일 수 있다. 일부 경우에, 이종이량체 단백질, 이중특이적 항체, Fc 함유 단백질 등은 이소형 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 일부 경우에, 이종이량체 단백질, 이중특이적 항체, Fc 함유 단백질 등은 이소형 IgG1이다. 일부 경우에, 이종이량체 단백질, 이중특이적 항체, Fc 함유 단백질 등은 이소형 IgG4이다. 다양한 구현예에서, 이종이량체 단백질, 이중특이적 항체, Fc 함유 단백질 등은 완전한 인간이다.
"중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"라는 문구는 임의의 유기체의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하며, 달리 명시되지 않는 한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 달리 명시되지 않는 한, 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편에는 CDR, CDR 및 FR 및 이들의 조합이 포함된다. 일반적인 중쇄는, 가변 도메인에 이어서 (N-말단에서 C-말단 방향으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 기능성 단편은 항원을 특이적으로 인식할 수 있고 (예, 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD로 항원을 인식함), 세포로부터 발현 및 분비가 가능하고, 적어도 하나의 CDR을 포함하는, 단편을 포함한다.
"경쇄"라는 문구는 임의의 유기체의 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열을 포함하며, 달리 명시되지 않는 한 인간 카파(kappa) 및 람다(lambda) 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 (VL) 도메인은 달리 명시되지 않는 한, 일반적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 아미노 말단에서 카르복시 말단까지, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 VL 도메인, 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 경쇄는 예를 들어, 항원-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제1 항원 또는 제2 항원에 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 적절한 경쇄는 기존의 항체 라이브러리(웨트 라이브러리(wet library) 또는 가상 환경)에서 가장 일반적으로 사용되는 경쇄를 스크리닝하여 확인할 수 있는 것들을 포함하며, 이때 경쇄가 항원-결합 단백질의 항원-결합 도메인의 친화성 및/또는 선택성을 실질적으로 간섭하지 않는다. 적절한 경쇄는 항원-결합 단백질의 항원-결합 영역에 의해 결합되는 하나 또는 둘 모두의 에피토프에 결합할 수 있는 것들을 포함한다.
"가변 도메인"이라는 문구는 (달리 명시되지 않는 한) N-말단에서 C-말단까지 순서로, 다음과 같은 아미노산 영역들을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 (원하는 경우 변형됨)의 아미노산 서열을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. "가변 도메인"은 이중 베타 시트 구조를 갖는 정식 도메인 (VH 또는 VL)으로 접힐 수 있는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 베타 시트들이 제1 베타 시트와 제2 베타 시트의 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 연결된다.
"상보성 결정 영역"이라는 문구, 또는 "CDR"이란 용어는 보통 (즉, 야생형 동물에서) 면역글로불린 분자 (예: 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역의 2개의 프레임워크 영역 사이에 나타나는, 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예를 들어, 생식계열 서열 또는 재배열되거나 재배열되지 않은 서열에 의해 암호화될 수 있으며, 예를 들어, 미치료 B 세포 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. 일부 경우에(예: CDR3의 경우), CDR은, 예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서는 인접하지 않지만, 예를 들어 서열의 접합 또는 연결(예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합)의 결과로서 B 세포 핵산 서열 내에서는 인접하는 2개 이상의 서열(예: 생식세포 서열)에 의해 암호화될 수 있다.
"Fc-함유 단백질"이란 문구는 항체, 이중특이적 항체, 이종이량체 단백질, 및 면역접합체(immunoadhesin); 및 면역글로불린 CH2 및 CH3 영역의 적어도 기능성 부분을 포함하는 다른 결합 단백질을 포함한다. "기능적 부분"이란 Fc 수용체 (예: FcγR; 또는 FcRn, 즉, 신생아 Fc 수용체)에 결합할 수 있고/있거나, 보체 활성화에 참여할 수 있는, CH2 및 CH3 영역을 지칭한다. CH2 및 CH3 영역이 결실, 치환 및/또는 삽입 또는 임의의 Fc 수용체에 결합할 수 없고 상보체를 활성화시키지 못하게 하는 다른 변형을 포함하면, CH2 및 CH3 영역은 기능성이 아니다.
Fc-함유 단백질은 변형이 결합 단백질의 하나 이상의 이펙터 기능에 영향을 미치는 경우를 포함하여, 면역글로불린 도메인의 변형(예: FcγR 결합, FcRn 결합, 그에 따른 반감기 및/또는 CDC 활성에 영향을 미치는 변형)을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 면역 글로불린 불변 영역의 EU 넘버링을 참조하여, 다음의 변형 및 이들의 조합을 포함하되, 이들로 한정되지는 않는다: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, 및 439.
제한이 아니라 예를 들어, 결합 단백질은 Fc-함유 단백질로서, (언급된 변형(들)이 없는 동일한 Fc-함유 단백질과 비교하여) 개선된 혈청 반감기를 나타내며 위치 250(예: E 또는 Q); 250 및 428(예: L 또는 F); 252(예: L/Y/F/W 또는 T), 254(예: S 또는 T), 및 256(예: S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 428 및/또는 433(예: L/R/SI/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예: H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 250 및/또는 428에서의 변형; 307 또는 308(예: 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 갖는다. 또 다른 예에서, 변형은 428L(예: M428L) 및 434S(예: N434S) 변형; 428L, 259I(예: V259I), 및 308F(예: V308F) 변형; 433K(예: H433K) 및 434(예: 434Y) 변형; 252, 254, 및 256(예: 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (예: T250Q 및 M428L); 307 및/또는 308 변형(예: 308F 또는 308P)을 포함할 수 있다.
용어 "별 치환", "Fc*", 및 "HC*"는 단백질 A에 대한 결합을 제거하는 서열을 CH3 도메인 내에 함유하는 임의의 분자, 면역글로불린 중쇄, Fc 단편, Fc 함유 분자, 이종이량체 단백질 등을 포함한다. CH3 도메인에서 단백질 A 결합을 감소시키거나 제거할 수 있는 H95R 및 Y96F와 같은 특정 변형은 미국 특허 제8,586,713호에서 논의되었다. 이러한 디펩티드 돌연변이는 "별 치환"으로서 명명된다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현시키기에 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포(단 세포 또는 다세포), 박테리아 세포(예를 들어, 대장균, 간균종, 스트렙토마이세스종 등의 균주 등), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예: S. 세레비지애(S. cerevisiae), S. 폼베(S. pombe), P. 파스토리스(P. pastoris), P. 메타놀리카(P. methanolica) 등), 식물 세포, 곤충 세포(예: SF-9, SF-21, 배큘로바이러스에 감염된 곤충 세포, 양배추금무늬나방(Trichoplusia ni) 등), 비인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마와 같은 세포 융합물을 포함한다. 일부 실시예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 랫트, 또는 마우스 세포이다. 일부 실시예에서, 세포는 진핵세포이고, 다음의 세포로부터 선택된다: CHO(예: CHOK1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예: COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예: HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60(예: BHK21), Jurkat, Daudi, A431(상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 전술한 세포로부터 유래한 세포주.
"이동상 개질제"라는 문구는 단백질 간의 비특이적(즉, 비친화도) 이온성 상호작용 및 다른 비공유 상호작용의 효과를 감소시키거나 이를 파괴하는 모이어티를 포함한다. "이동상 개질제"는, 예를 들어 염; 아세트산염, 중탄산염, 탄산염, 할로겐(예: 염화물 또는 불화물), 질산염, 인산염, 또는 황산염과 I족 및 II족 금속의 이온성 조합을 포함한다. "이동상 개질제"의 비제한적인 예시적인 목록은 아세트산염의 베릴륨, 리튬, 나트륨, 및 칼륨 염; 중탄산나트륨 및 중탄산칼륨; 탄산리튬, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 및 탄산세슘; 염화리튬, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화세슘, 및 염화마그네슘; 불화나트륨 및 불화칼륨; 질산나트륨, 질산칼륨, 및 질산칼슘; 인산나트륨 및 인산칼륨; 및 황산칼슘 및 황산마그네슘을 포함한다.
"이동상 개질제"는 또한 비공유력을 약화시키거나 이를 달리 방해하고 생체분자계 내에서 엔트로피를 증가시키는 무질서유발제(chaotropic agents)를 포함한다. 무질서유발제의 비제한적인 예는 부탄올, 염화칼슘, 에탄올, 염화 구아니디늄, 과염소산리튬, 아세트산리튬, 염화마그네슘, 페놀, 프로판올, 도데실황산나트륨, 티오우레아, 및 우레아를 포함한다. 무질서유발제는 단백질의 용해도에 영향을 미치는 염을 포함한다. 더 무질서를 유발하는 음이온은, 예를 들어 염화물, 질산염, 브롬화물, 염소산염, 요오드화물, 과염소산염, 및 티오시아네이트를 포함한다. 더 무질서를 유발하는 양이온은, 예를 들어 리튬, 마그네슘, 칼슘, 및 구아니디늄을 포함한다.
"이동상 개질제"는 pH 구배 또는 단계에 추가 한 후, 또는 "이동상 개질제"에서 단백질 A 지지체를 평형화하고 pH 단계 또는 구배를 적용한 후, 이온성 상호작용 또는 다른 비공유 상호작용에 영향을 미쳐, 동종이량체 IgG와 이종이량체 IgG(예를 들어, 야생형 인간 IgG 및 이와 동일하지만 본원에 기술된 것과 같이 이의 CH3 도메인의 하나 이상의 변형을 보유하는 IgG)의 용리 사이의 pH 단위 거리를 넓히는 모이어티들을 포함한다. "이동상 개질제"의 적절한 농도는 동일한 컬럼, pH 단계 또는 구배를 사용하는 이의 농도에 의해 결정될 수 있으며, "이동상 개질제"의 농도는 주어진 pH 단계 또는 pH 구배에서 최대 pH 거리에 도달할 때까지 증가할 수 있다. "이동상 개질제"는 예를 들어 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 등을 포함하는 비극성 개질제를 포함할 수도 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "친화도 크로마토그래피"는 크로마토그래피 분리를 수행하기 위해 등전점, 소수성, 또는 크기와 같은 생체분자의 일반적인 특성보다는 생체분자 간의 특이적이고 가역적인 상호작용을 사용하는 크로마토그래피 방법이다. "단백질 A 친화도 크로마토그래피" 또는 "단백질 A 크로마토그래피"는 면역글로불린 분자의 Fc 부분에 대한 단백질 A의 IgG 결합 도메인의 친화도를 사용하는 특이적 친화도 크로마토그래피 방법을 지칭한다. 이러한 Fc 부분은 인간 또는 동물 면역글로불린 불변 도메인 CH2 및 CH3 또는 이들과 실질적으로 유사한 면역글로불린 도메인을 포함한다. 단백질 A는 포도상구균의 세포 벽 유래의 고유 단백질, 재조합 또는 합성 방법에 의해 생산된 단백질 A, 및 Fc 영역에 결합하는 능력을 보유하는 변이체를 포함한다. 실제로, 단백질 A 크로마토그래피는 고형 지지체에 고정된 단백질 A를 사용하는 것을 포함한다. Gagnon의 문헌[Protein A Affinity Chromotography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, pp. 155-198, Validated Biosystems, 1996] 참조. 단백질 G 및 단백질 L도 친화도 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 고형 지지체는 단백질 A가 부착되는 비수성 매트릭스이다. 이러한 지지체는 아가로오스, 세파로오스, 유리, 실리카, 폴리스티렌, 니트로셀룰로오스, 숯, 모래, 셀룰로오스, 및 임의의 다른 적합한 물질을 포함한다. 이러한 물질은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 적절한 방법을 사용하여 제2 단백질을 고형 지지체에 부착할 수 있다. 적절한 고형 지지체에 단백질을 부착하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 Ostrove의 문헌[in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, 182: 357-371, 1990] 참조. 고정된 단백질 A의 유무와 관계없이, 이러한 고형 지지체는 예컨대 Vector Laboratory (Burlingame, Calif.), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Calif.), BioRad (Hercules, Calif.), Cytiva (Marlborough, Massachusetts), Pall (Port Washington, NY), 및 EMD-Millipore(Billerica, Mass.)를 포함하는 많은 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용할 수 있다. 기공 유리 매트릭스에 고정된 단백질 A는 PROSEP®-A(Millipore)로서 상업적으로 이용 가능하다. 고상은 아가로오스계 매트릭스일 수도 있다. 아가로오스 매트릭스 상에 고정된 단백질 A는 MabSelect™(Cytiva)로서 상업적으로 이용 가능하다.
친화도 크로마토그래피는 또한, 면역글로불린 도메인 및/또는 서열을 함유하는 항체, 항체의 단편, 또는 키메라 융합 단백질에 선택적으로 결합시켜 이를 정제하는 데 사용될 수 있는 매질을 포함한다. 항체는 IgG, IgA, IgM, IgY, IgD, 및 IgE 유형을 포함한다. 항체는 또한, 카멜리드 항체, 조작된 카멜리드 항체, 단쇄 항체, 단일 도메인 항체, 나노바디 등과 같은 단쇄 항체를 포함한다. 항체 단편은 VH, VL, CL, CH 서열을 포함한다. 항체 서열을 함유하는 융합 단백질 및 항체 단편은 예를 들어 F(ab')3, F(ab')2, Fab, Fc, Fv, dsFv, (scFv)2, scFv, scAb, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fc-융합 단백질, 트랩 분자 등을 포함한다(Ayyyar 등의 문헌[Methods 56 (2012): 116-129] 참조). 이러한 친화도 크로마토그래피 매질은 항체, 이의 단편, 및 이들 단편을 함유하는 융합 단백질에 선택적으로 결합하는 리간드를 함유할 수 있다. 이러한 리간드는 항체 결합 단백질, 박테리아 유래 수용체, 항원, 렉틴, 또는 표적 분자(즉, 정제해야 할 분자)에 대해 유도된 항체를 포함한다. 예를 들어, IgG-CH1, IgG-Fc, IgG-CH3, IgG1, LC-kappa, LC-lambda, IgG3/4, IgA, IgM 등 중 하나 이상에 대해 유도된 카멜리드 유래 친화도 리간드가 친화도 리간드로서 사용될 수 있다(CAPTURESELECT 크로마토그래피 레진으로서 사용업으로 이용 가능함, Life Technologies, Inc., Carlsbad, Calif.).
이종이량체 단백질의 정제 방법
본 개시에 따라 (친화도 컬럼의 분해능을 연장시키고 이종이량체 단백질 회수율을 유지함으로써) 이종이량체 단백질을 정제하는 방법의 구현예는 다음을 포함한다: (i) 일련의 예비 사이클을 예비 용리 pH에서 수행하고 일련의 후속 사이클을 후속 (및 더 높은) pH에서 수행하는 단계; (ii) 용리액 중 불순물 수준을 각각의 사이클 후에 또는 주기적으로 측정하는 일련의 사이클을 수행하고, 일련의 사이클 전체에 걸쳐 최소 불순물 수준을 유지하도록 후속 사이클(들)에서 용리 pH를 상승시키는 단계; 및 (iii) 다수의 사이클 세트에 걸쳐 용리 pH를 단계적 방식으로 상승시키는 일련의 사이클을 수행하는 단계(예를 들어, 용리 pH는 매 10, 15, 20, 또는 25 사이클 후에 0.5, 0.75, 또는 1 포인트 상승됨).
이종이량체 단백질을 정제하는 방법의 각각은 다음을 포함한다: (a) 일련의 크로마토그래피 사이클을 수행하는 단계로서, 각각의 사이클은 다음을 포함하는, 단계: (i) 이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화도 매트릭스에 도입하는 단계로서, 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화도를 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는, 단계; (ii) 5 내지 9의 제1 pH인 제1 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않은 불순물을 제거하는 단계; (iii) 제2 pH인 제1 용리 완충액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 용리하는 단계; 및 (iv) 4 미만의 제3 pH인 제2 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합 불순물을 제거하는 단계로서, 제2 pH는 4.0 내지 5.2인, 단계.
다양한 구현예에서, 이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 친화도 매트릭스 상에 로딩하는 단계는 이종이량체 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 세포를 함유하는 정화된 세포 배양물을 하나 이상의 생물반응기로부터 로딩하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 세포는 이중특이적 항체를 형성하는 중쇄 및 경쇄 각각을 암호화하는 뉴클레오티드를 발현할 수 있다. 일부 경우에, 이중특이적 항체의 항원 결합 아암 각각은 공통 경쇄를 포함한다. 정화된 세포 배양물은 동종이량체 종, 숙주 세포 단백질, 및 DNA와 같은 불순물과 함께 이종이량체 단백질(예: 이중특이적 항체)을 포함할 것이다. 일부 경우에, 이종이량체 단백질은 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 진핵 세포에서 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 친화도 매트릭스 상에 로딩된 혼합물은 다음을 함유하는 단백질의 혼합물을 포함한다: (i) 제1 폴리펩티드의 2개의 카피를 포함하는 제1 동종이량체, (ii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체, 및 (iii) 제2 폴리펩티드의 2개의 카피를 포함하는 제2 동종이량체. 제1 및 제2 폴리펩티드는 친화도 매트릭스에 대해 상이한 친화도를 가지므로, 제1 동종이량체, 이종이량체, 및 제2 동종이량체는 친화도 매트릭스에 대한 차등 결합에 기초하여 분리될 수 있다. 친화도 매트릭스에 대한 차등 결합은, 특히 친화도 매트릭스 위를 통과하는 용액의 pH 및/또는 이온 강도를 변화시킴으로써 조작될 수 있다.
정화된 세포 배양물을 로딩한 후, 친화도 매트릭스를 5 내지 9의 pH를 갖는 세척 완충액(제1 세척 완충액)으로 세척한다. 일부 경우에, 세척 완충액의 pH는 6 내지 8이다. 일부 경우에, 세척 완충액의 pH는 약 7 내지 약 7.5이다. 다양한 구현예에서, 세척 완충액의 pH는 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0이거나 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0이다. 일부 구현예에서, 세척 완충액의 pH는 7.2이거나 약 7.2이다. 다양한 구현예에서, 완충액은 원하는 지점에서 또는 원하는 범위 내에서 pH를 유지할 수 있는 임의의 완충액일 수 있다. 다양한 구현예에서, 완충액 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM일 수 있다. 일부 경우에, 완충액 농도는 약 5 mM 내지 약 15 mM이다. 일부 경우에, 완충액 농도는 약 5 mM 내지 약 50 mM이다. 일부 경우에, 완충액 농도는 약 10 mM 내지 약 25 mM이다. 일부 경우에, 완충액 농도는 약 20 mM 내지 약 40 mM이다. 일부 경우에, 완충액 농도는 약 30 mM 내지 약 50 mM이다. 다양한 구현예에서, 완충액 농도는 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 또는 50 mM이거나 약 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 또는 50 mM이다. 일부 구현예에서, 세척 완충액 농도는 10 mM이거나 약 10 mM이다. 일부 구현예에서, 세척 완충액 농도는 40 mM이거나 약 40 mM이다. 일부 구현예에서, 세척 완충액은 인산나트륨이다. 세척 완충액(제1 세척 완충액)은 후술하는 것과 같은 염을 함유할 수도 있다.
일부 경우에, 세척 완충액은 약 200 mM 내지 약 800 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에, 세척 완충액은 약 250 mM 내지 약 750 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에, 세척 완충액은 약 300 mM 내지 약 700 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에, 세척 완충액은 약 350 mM 내지 약 650 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에, 세척 완충액은 약 400 mM 내지 약 600 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에, 세척 완충액은 약 450 mM 내지 약 550 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에는 세척 완충액은 200 mM, 210, mM, 220 mM, 225 mM, 230 mM, 240 mM, 250 mM, 260 mM, 270 mM, 275 mM, 280 mM, 290 mM, 300 mM, 310 mM, 320 mM, 325 mM, 330 mM, 340 mM, 350 mM, 360 mM, 370 mM, 375 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM, 420 mM, 425 mM, 430 mM, 440 mM, 450 mM, 460 mM, 470 mM, 475 mM, 480 mM, 490 mM, 500 mM, 510 mM, 520 mM, 525 mM, 530 mM, 540 mM, 550 mM, 560 mM, 570 mM, 575 mM, 580 mM, 590 mM, 600 mM, 610 mM, 620 mM, 625 mM, 630 mM, 640 mM, 650 mM, 660 mM, 670 mM, 675 mM, 680 mM, 690 mM, 700 mM, 710 mM, 720 mM, 725 mM, 730 mM, 740 mM, 750 mM, 760 mM, 770 mM, 780 mM, 790 mM, 또는 800 mM, 또는 약 200 mM, 210, mM, 220 mM, 225 mM, 230 mM, 240 mM, 250 mM, 260 mM, 270 mM, 275 mM, 280 mM, 290 mM, 300 mM, 310 mM, 320 mM, 325 mM, 330 mM, 340 mM, 350 mM, 360 mM, 370 mM, 375 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM, 420 mM, 425 mM, 430 mM, 440 mM, 450 mM, 460 mM, 470 mM, 475 mM, 480 mM, 490 mM, 500 mM, 510 mM, 520 mM, 525 mM, 530 mM, 540 mM, 550 mM, 560 mM, 570 mM, 575 mM, 580 mM, 590 mM, 600 mM, 610 mM, 620 mM, 625 mM, 630 mM, 640 mM, 650 mM, 660 mM, 670 mM, 675 mM, 680 mM, 690 mM, 700 mM, 710 mM, 720 mM, 725 mM, 730 mM, 740 mM, 750 mM, 760 mM, 770 mM, 780 mM, 790 mM, 또는 800 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 완충액의 염 농도는 500 mM이거나 약 500 mM이다. 일부 구현예에서, 세척 완충액은 약 500 mM NaCl을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 친화도 매트릭스의 세척은 결합되지 않은 불순물, 예컨대 친화도 매트릭스 물질(예: 단백질 A)에 대한 친화도가 없거나 거의 없는 숙주 세포 단백질, DNA, 및 동종이량체 종을 제거한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 이종이량체 단백질을 용리하기 전에, pH가 5 내지 9인 염을 포함하지 않거나 거의 포함하지 않는(< 25 mM) 세척 완충액을 이용한 제2 세척 단계를 임의로 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 세척 완충액은 약 10 mM 내지 약 50 mM 트리스[트리스(하이드록시메틸)아미노메탄]], 인산나트륨, 또는 아세테이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다양한 구현예에서, 이러한 세척 완충액은 전술한 제1 세척 완충액의 pH와 동일한 pH를 갖는다.
전술한 세척 단계(들) 후, 이종이량체 단백질은 용리 완충액에서 친화도 매트릭스로부터 용리되고, 용리액에서 수집된다. 용리 완충액은 약 4 내지 약 5.2(또는 4.0 내지 4.9)의 pH를 가지며, 농도가 200 mM를 초과하는 염을 포함한다. 다양한 방법과 관련하여 이하에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 용리 완충액의 pH는 약 4.0 내지 약 4.2이다. 일부 구현예에서, 용리 완충액의 pH는 약 4.4 내지 약 4.6이다. 다양한 구현예에서, 용리 완충액의 pH는 4.0, 4.05, 4.1, 4.15, 4.2, 4.25, 4.3, 4.35, 4.4, 4.45, 4.5, 4.55, 4.6, 4.65, 4.7, 4.75, 4.8, 4.85, 4.9, 4.95, 또는 5.0이거나, 약 4.0, 4.05, 4.1, 4.15, 4.2, 4.25, 4.3, 4.35, 4.4, 4.45, 4.5, 4.55, 4.6, 4.65, 4.7, 4.75, 4.8, 4.85, 4.9, 4.95, 또는 5.0이다. 일부 구현예에서, 용리 완충액의 pH는 4.1 ± 0.05이다. 일부 구현예에서, 용리 완충액의 pH는 4.5 ± 0.05이다. 다양한 구현예에서, 완충액은 원하는 지점에서 또는 원하는 범위 내에서 pH를 유지할 수 있는 임의의 완충액일 수 있다. 다양한 구현예에서, 완충액 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM일 수 있다. 일부 경우에, 완충액 농도는 약 25 mM 내지 약 55 mM이다. 일부 경우에, 완충액 농도는 약 30 mM 내지 약 50 mM이다. 다양한 구현예에서, 완충액 농도는 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 또는 50 mM이거나, 약 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 또는 50 mM이다. 일부 구현예에서, 용리 완충액 농도는 40 mM이거나 약 40 mM이다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 아세트산염이다.
일부 경우에, 용리 완충액은 약 200 mM 내지 약 800 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에, 용리 완충액은 약 250 mM 내지 약 750 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에, 용리 완충액은 약 300 mM 내지 약 700 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에, 용리 완충액은 약 350 mM 내지 약 650 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에, 용리 완충액은 약 400 mM 내지 약 600 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에, 용리 완충액은 약 450 mM 내지 약 550 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 경우에는 용리 완충액은 200 mM, 210, mM, 220 mM, 225 mM, 230 mM, 240 mM, 250 mM, 260 mM, 270 mM, 275 mM, 280 mM, 290 mM, 300 mM, 310 mM, 320 mM, 325 mM, 330 mM, 340 mM, 350 mM, 360 mM, 370 mM, 375 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM, 420 mM, 425 mM, 430 mM, 440 mM, 450 mM, 460 mM, 470 mM, 475 mM, 480 mM, 490 mM, 500 mM, 510 mM, 520 mM, 525 mM, 530 mM, 540 mM, 550 mM, 560 mM, 570 mM, 575 mM, 580 mM, 590 mM, 600 mM, 610 mM, 620 mM, 625 mM, 630 mM, 640 mM, 650 mM, 660 mM, 670 mM, 675 mM, 680 mM, 690 mM, 700 mM, 710 mM, 720 mM, 725 mM, 730 mM, 740 mM, 750 mM, 760 mM, 770 mM, 780 mM, 790 mM, 또는 800 mM, 또는 약 200 mM, 210, mM, 220 mM, 225 mM, 230 mM, 240 mM, 250 mM, 260 mM, 270 mM, 275 mM, 280 mM, 290 mM, 300 mM, 310 mM, 320 mM, 325 mM, 330 mM, 340 mM, 350 mM, 360 mM, 370 mM, 375 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM, 420 mM, 425 mM, 430 mM, 440 mM, 450 mM, 460 mM, 470 mM, 475 mM, 480 mM, 490 mM, 500 mM, 510 mM, 520 mM, 525 mM, 530 mM, 540 mM, 550 mM, 560 mM, 570 mM, 575 mM, 580 mM, 590 mM, 600 mM, 610 mM, 620 mM, 625 mM, 630 mM, 640 mM, 650 mM, 660 mM, 670 mM, 675 mM, 680 mM, 690 mM, 700 mM, 710 mM, 720 mM, 725 mM, 730 mM, 740 mM, 750 mM, 760 mM, 770 mM, 780 mM, 790 mM, 또는 800 mM의 농도로 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액의 염 농도는 500 mM이거나 약 500 mM이다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 500 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 500 mM CaCl2를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 500 mM MgCl2를 포함한다.
이종이량체 단백질을 용리하고 이를 친화도 매트릭스로부터 수집한 후, pH가 약 4 미만인 세척 완충액(제2 세척 완충액)으로 친화도 매트릭스를 세척한다. 일부 구현예에서, 세척 완충액의 pH는 약 2.5 내지 약 3.5이다. 일부 구현예에서, 세척 완충액의 pH는 3.0 ± 0.2이다. 다양한 구현예에서, 세척 완충액의 pH는 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 또는 3.9이거나, 약 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 또는 3.9이다. 세척 완충액은 전술한 pH 또는 pH의 범위를 제공하는 임의의 적절한 물질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세척 완충액은 약 20 mM 내지 약 60 mM의 농도로 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 완충액은 약 30 mM 내지 약 50 mM의 농도로 아세트산을 포함한다. 일부 경우에, 세척 완충액은 약 40 mM 아세트산을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 친화도 매트릭스의 세척은 이전에 결합된 불순물, 예컨대 친화도 매트릭스 물질(예: 단백질 A)에 대한 친화도가 이종이량체 단백질보다 더 큰 동종이량체 종을 제거한다. 일부 경우에, 본 발명의 방법은 바로 위에서 논의된 세척 완충액보다 더 낮은 pH(예를 들어 2.45 ± 0.2) 및 더 높은 농도의 완충액 물질(예를 들어 500 mM 아세트산)을 포함하는 완충액으로 친화도 매트릭스를 추가로 세척하는 단계를 포함할 수도 있다.
전술한 세척 단계(또는 세척 단계들)로 추가 불순물을 제거한 후, 친화도 매트릭스는 다음 사이클을 시작하기 전에 5의 pH에서 9의 pH로 재평형화될 수 있다. 다양한 구현예에서, 친화도 매트릭스는 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0의 pH 또는 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0의 pH로 평형화된다. 일부 구현예에서, 친화도 매트릭스는 약 7.2의 pH로 평형화된다. 평형화는 원하는 pH를 갖는 평형화 완충액으로 수행될 수 있다. 다양한 구현예에서, 완충액은 원하는 지점에서 또는 원하는 범위 내에서 pH를 유지할 수 있는 임의의 완충액일 수 있다. 다양한 구현예에서, 완충액 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM일 수 있다. 일부 경우에, 완충액 농도는 약 10 mM 내지 약 30 mM이다. 일부 경우에, 완충액 농도는 약 30 mM 내지 약 50 mM이다. 일부 경우에, 완충액 농도는 약 40 mM 내지 약 60 mM이다. 다양한 구현예에서, 완충액 농도는 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 50 mM, 51 mM, 52 mM, 53 mM, 54 mM, 55 mM, 56 mM, 57 mM, 58 mM, 59 mM, 또는 60 mM이거나 약 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 50 mM, 51 mM, 52 mM, 53 mM, 54 mM, 55 mM, 56 mM, 57 mM, 58 mM, 59 mM, 또는 60 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액 농도는 20 mM이거나 약 20 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액 농도는 40 mM이거나 약 40 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액 농도는 50 mM이거나 약 50 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액은 인산나트륨이다. 일부 구현예에서, 이러한 완충액은 약 10 mM 내지 약 50 mM 트리스, 인산나트륨, 또는 아세테이트, 또는 이들의 조합을 포함한다.
친화도 매트릭스의 평형화 후, 이종이량체 단백질을 함유하는 중화된 용리액(이제는 동종이량체 오염물 및 다른 불순물로부터 정제됨)을 전술한 정제 프로세스 단계에 사용된 것과 동일한 5 내지 9의 pH의 친화도 매트릭스에 재도포한다. 다양한 구현예에서, 중화된 용리액은 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0의 pH 또는 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0의 pH의 친화도 매트릭스에 재도포된다. 일부 구현예에서, pH는 약 7.2이다.
일부 구현예에서, 이종이량체 단백질을 정제하는 방법은 다음을 포함한다: (a) 일련의 크로마토그래피 사이클을 수행하는 단계로서, 각각의 사이클은 다음을 포함하는, 단계: (i) 이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화도 매트릭스에 도입하는 단계로서, 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화도를 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는, 단계; (ii) 5 내지 9의 제1 pH인 제1 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않은 불순물을 제거하는 단계; (iii) 제2 pH인 제1 용리 완충액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 용리하는 단계; 및 (iv) 4 미만의 제3 pH인 제2 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합 불순물을 제거하는 단계로서, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 일련의 예비 사이클 동안의 예비 pH이고, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 후속하는 일련의 사이클 동안 예비 pH보다 높은 후속 pH로 상승되고, 예비 pH 및 후속하는 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있는, 단계; 및 (b) 용리액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 수집하는 단계.
다양한 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 20 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 30 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 40 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 50 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 60 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 70 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 예비 사이클은 80 사이클로 구성된다. 일부 경우에, 일련의 예비 사이클은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 사이클 또는 그 이상을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 일련의 후속 사이클은 적어도 20 사이클로 구성된다. 일부 구현예에서, 일련의 후속 사이클은 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 또는 적어도 80 사이클로 구성된다. 일부 경우에, 일련의 후속 사이클은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 95, 또는 100 사이클 또는 그 이상을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 예비 pH는 4.0 내지 4.2이다. 일부 경우에, 예비 pH는 4.1 ± 0.05이다. 일부 경우에, 예비 pH는 4.0, 4.025, 4.05, 4.075, 4.1, 4.125, 4.15, 4.175, 또는 4.2이다. 일부 구현예에서, 후속 pH는 4.3 내지 4.7이다. 일부 경우에, 후속 pH는 4.5 ± 0.05이다. 일부 경우에, 후속 pH는 4.4, 4.425, 4.45, 4.475, 4.5, 4.525, 4.55, 4.575, 또는 4.6이다.
일부 구현예에서, 이종이량체 단백질을 정제하는 방법은 다음을 포함한다: (a) 일련의 크로마토그래피 사이클을 수행하는 단계로서, 각각의 사이클은 다음을 포함하는, 단계: (i) 이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화도 매트릭스에 도입하는 단계로서, 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화도를 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는, 단계; (ii) 5 내지 9의 제1 pH인 제1 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않은 불순물을 제거하는 단계; (iii) 제2 pH인 제1 용리 완충액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 용리하는 단계; 및 (iv) 4 미만의 제3 pH인 제2 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하는 불순물을 제거하는 단계; (b) 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 사이클 중 임의의 하나 또는 그 이상을 수행한 후에 이종이량체 단백질을 함유하는 용리액에서 결합하는 불순물의 수준을 측정하고, 결합하는 불순물의 측정된 수준을 결합하는 불순물의 기준 수준과 비교하는 단계로서, 결합하는 불순물의 측정된 수준이 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 후속 사이클에서 제2 pH를 증가시키고, 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 또는 후속 사이클 동안의 제2 pH가 4.0 내지 5.2 범위 이내에 있는, 단계; 및 (c) 용리액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 수집하는 단계.
일부 구현예에서, 결합하는 불순물의 기준 수준은 2% 내지 10%이다. 일부 경우에, 결합하는 불순물의 기준 수준은 3% 내지 7%이다. 일부 경우에, 결합하는 불순물의 기준 수준은 5% ± 0.5%이다. 다양한 구현예에서, 결합하는 불순물의 기준 수준은 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10%이거나, 약 1%, 1.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10%이다.
일부 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 후에 측정된다. 일부 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 매 5번 째 사이클 후에 측정된다. 일부 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 매 10번 째 사이클 후에 측정된다. 일부 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 매 20번 째 사이클 후에 측정된다. 일부 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 40번 째 사이클 또는 50번 째 사이클 후에 측정된다. 다양한 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 사이클 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 및/또는 사이클 100 후에 측정된다. 다양한 구현예에서, 용리액 중 결합하는 불순물의 수준은 매 2 사이클, 3 사이클, 4 사이클, 5 사이클, 6 사이클, 7 사이클, 8 사이클, 9 사이클, 10 사이클, 15 사이클, 20 사이클, 25 사이클, 30 사이클, 35 사이클, 40 사이클, 45 사이클, 또는 50 사이클 후에 측정된다. 일부 경우에, 용리액은 일련의 사이클에 걸쳐(예를 들어 5 사이클 또는 10 사이클에 걸쳐) 수집되고, 결합하는 불순물의 수준은 합쳐진 용리액 풀에서 측정된다. 다양한 구현예에서, 합쳐진 용리액 풀은 일련의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 사이클 또는 그 이상에 걸쳐 수집된다.
일부 구현예에서, 결합하는 불순물의 측정된 수준이 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 제2 pH는 4.0 내지 4.2의 범위에서 4.2 내지 5.2의 범위로 (또는 4.3 내지 4.7의 범위로) 증가된다. 일부 경우에, 결합하는 불순물의 측정된 수준이 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 제2 pH는 4.1 ± 0.05에서 4.5 ± 0.05로 증가된다. 일부 경우에, 제2 pH는 4.0, 4.025, 4.05, 4.075, 4.1, 4.125, 4.15, 4.175, 또는 4.2이고, 결합하는 불순물의 측정된 수준이 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 4.4, 4.425, 4.45, 4.475, 4.5, 4.525, 4.55, 4.575, 또는 4.6으로 증가된다.
일부 구현예에서, 제2 pH는 4.0 내지 4.2이고, 결합하는 불순물의 측정된 수준이 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 후속 사이클에서 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3, 3.25, 3.5, 3.75, 4, 4.25, 4.5, 4.75, 또는 5 포인트만큼 증가된다. 따라서, 일부 경우에, 결합하는 불순물의 측정된 수준이 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 제2 pH는 후속 사이클에서 점진적으로 증가될 수 있고, 이어서, 측정이 이루어지는 다음 사이클에서, 결합하는 불순물의 측정된 수준이 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 점진적으로 다시 (그리고 필요에 따라 몇 번이고) 증가될 수 있다. 이러한 방식으로, 용리 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클에 걸쳐 이종이량체 단백질의 회수를 최대화하면서 용리액 중 결합하는 불순물을 최소화하는 수준으로 유지될 수 있다.
일부 구현예에서, 이종이량체 단백질을 정제하는 방법은 다음을 포함한다: (a) 일련의 크로마토그래피 사이클을 수행하는 단계로서, 각각의 사이클은 다음을 포함하는, 단계: (i) 이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화도 매트릭스에 도입하는 단계로서, 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화도를 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하고, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는, 단계; (ii) 5 내지 9의 제1 pH인 제1 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않은 불순물을 제거하는 단계; (iii) 제2 pH인 제1 용리 완충액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 용리하는 단계; 및 (iv) 4 미만의 제3 pH인 제2 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하는 불순물을 제거하는 단계로서, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 1차 일련의 사이클 동안의 1차 pH이고; 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 1차 일련의 사이클에 이어지는 2차 일련의 사이클 동안 1차 pH보다 높은 2차 pH로 상승하고; 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 2차 일련의 사이클에 이어지는 3차 일련의 사이클 동안 2차 pH보다 높은 3차 pH로 상승하며, 1차 pH, 2차 pH, 및 3차 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있는, 단계; 및 (b) 용리액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 수집하는 단계.
일부 구현예에서, 1차 일련의 사이클은 5 내지 50 사이클을 포함한다. 일부 경우에, 1차 일련의 사이클은 최대 20 사이클을 포함한다. 일부 경우에, 1차 일련의 사이클은 최대 40 사이클을 포함한다. 일부 경우에, 일차 일련의 사이클은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75 사이클 또는 그이상을 포함하거나 최대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75 사이클 또는 그이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 2차 일련의 사이클은 5 내지 50 사이클을 포함한다. 일부 경우에, 2차 일련의 사이클은 10 내지 25 사이클을 포함한다. 일부 경우에, 이차 일련의 사이클은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75 사이클 또는 그이상을 포함하거나 최대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75 사이클 또는 그이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 3차 일련의 사이클은 5 내지 50 사이클을 포함한다. 일부 경우에, 3차 일련의 사이클은 10 내지 25 사이클을 포함한다. 일부 경우에, 삼차 일련의 사이클은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75 사이클 또는 그이상을 포함하거나 최대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75 사이클 또는 그이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 1차 pH는 4.0 내지 4.2의 범위 이내이다. 일부 경우에, 1차 pH는 4.1 ± 0.05이다. 일부 경우에, 1차 pH는 4.0, 4.025, 4.05, 4.075, 4.1, 4.125, 4.15, 4.175, 또는 4.2이다. 일부 구현예에서, 2차 pH는 4.2 내지 4.4의 범위 이내이다. 일부 경우에, 2차 pH는 4.3 ± 0.05이다. 일부 경우에, 2차 pH는 4.2, 4.225, 4.25, 4.275, 4.3, 4.325, 4.35, 4.375, 또는 4.4이다. 일부 구현예에서, 3차 pH는 4.4 내지 4.6의 범위 이내이다. 일부 경우에, 3차 pH는 4.5 ± 0.05이다. 일부 경우에, 3차 pH는 4.4, 4.425, 4.45, 4.475, 4.5, 4.525, 4.55, 4.575, 또는 4.6이다.
일부 구현예에서, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 3차 일련의 사이클에 이어지는 제4 일련의 사이클 동안 3차 pH보다 높은 제4 pH로 상승되고, 여기서 제4 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 제4 일련의 사이클에 이어지는 제5 일련의 사이클 동안 제4 pH보다 높은 제5 pH로 상승되고, 여기서 제5 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 제2 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 제5 일련의 사이클에 이어지는 제6 일련의 사이클 동안 제5 pH보다 높은 제6 pH로 상승되고, 여기서 제6 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있다.
일부 경우에, 2차 pH는 1차 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고, 3차 pH는 2차 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고, 제4 pH는 3차 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고, 제5 pH는 제4 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고/이거나, 제6 pH는 제5 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이며, 여기서 1차 pH는 4.0 내지 4.2의 범위 이내이다. 일부 구현예에서, 1차 pH는 4.1 ± 0.05이다.
일부 구현예에서, 2차, 3차, 4차, 5차, 또는 6차 pH(또는 7차, 8차, 9차 pH 등)는 다음 일련의 사이클에서 직전 pH에 비해 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, or 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3, 3.25, 3.5, 3.75, 4, 4.25, 4.5, 4.75, 또는 5 포인트만큼 증가된다(예를 들어, 2차 pH는 1차 pH에 비해 증가되고, 3차 pH는 2차 pH에 비해 증가되는 방식). 따라서, 일부 경우에, 용리 pH는 각각의 후속하는 일련의 사이클에서 점진적으로 증가될 수 있다. 이러한 방식으로, 용리 pH는 일련의 크로마토그래피 사이클에 걸쳐 이종이량체 단백질의 회수를 최대화하면서 용리액 중 결합하는 불순물을 최소화하는 수준으로 유지될 수 있다.
일부 구현예에서, 1차 일련의 사이클, 2차 일련의 사이클, 3차 일련의 사이클, 제4 일련의 사이클, 제5 일련의 사이클, 및/또는 제6 일련의 사이클 (또는 원하는 경우, 추가 사이클) 각각은 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 5 내지 50 사이클을 포함한다. 다양한 구현예에서, 각각의 일련의 사이클은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75 사이클 또는 그이상을 포함하거나 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75 사이클 또는 그이상을 포함한다.
다양한 구현예에서, 정화된 세포 배양물 또는 이종이량체 단백질을 함유하는 중화 용리액으로부터의 친화도 매트릭스를 로딩하는 것은 최대 약 75 g/L의 친화도 매트릭스 수지의 물질을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 친화도 매트릭스에는 65 g/L, 60 g/L, 55 g/L, 또는 50 g/L 이하의 물질이 로딩된다.
일부 구현예에서, 친화도 매트릭스는 기질에 부착된 리간드(예: 단백질 A)를 포함한다. 일부 경우에, 기질은 비드 또는 입자이므로, 친화도 매트릭스는 리간드가 부착된 복수의 입자이다. 다양한 구현예에서, 리간드는 단백질 A 또는 단백질 G이다. 리간드가 단백질 A인 경우, 단백질 A는 자연 발생 단백질 A 또는 변형된 포도상구균 단백질 A이거나, 조작된 단백질 A일 수 있다. 조작된 단백질 A는 예를 들어 Z-도메인 사량체, Y-도메인 사량체, 또는 D 및 E 도메인이 결여된 조작된 조작된 단백질 A일 수 있다. 예시된 이들 조작된 단백질 A는 면역글로불린의 VH3 도메인에 결합할 수 없지만(또는 결합하더라도 매우 낮은 친화도로 결합할 수 있지만), IgG1, IgG2, 및 IgG4의 CH3 도메인에는 여전히 결합할 수 있다.
일부 경우에, 친화도 매트릭스 기질은 아가로오스, 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 폴리메타크릴레이트, 조절된 기공 유리, 구형 실리카, 셀룰로오스 등을 함유하거나 이로 이루어진다. 기질이 비드 또는 입자로서 성형되는 구현예에서, 입자의 평균 직경은 25 μm 내지 100 μm이다. 일부 구현예에서, 입자의 평균 직경은 약 40 μm 내지 약 60 um이다. 일부 구현예에서, 입자의 평균 직경은 약 45 μm 내지 약 55 um이다. 일부 구현예에서, 입자의 평균 직경은 약 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 또는 55 μm이다. 일부 경우에, 입자의 평균 직경은 약 45 μm이다. 일부 경우에, 입자의 평균 직경은 약 50 μm이다. 일부 구현예에서, 입자는 35 μm, 45 μm, 60 μm, 75 μm, 또는 85 μm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자는 약 1000 Å, 1050 Å, 1100 Å, 1150 Å, 또는 1200 Å의 평균 직경을 갖는 기공을 함유한다. 일부 구현예에서, 입자는 약 1100 Å의 평균 직경을 갖는 기공을 함유한다.
다양한 구현예에서, 용리 완충액 또는 세척 완충액은 염을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 염은 Cl-, Br-, I-, NO3 -, N(CH3)4 +, NH4 +, Cs+, Rb+, K+, Na+, H+, Ca2+, Mg2+, 또는 Al3+를 포함한다. 일부 구현예에서, 염은 Na+, H+, Ca2+, Mg2+, 또는 Al3+를 포함한다. 일부 구현예에서, 염은 Cl-, Br-, I-, NO3 -, 또는 ClO4 -를 포함한다. 일부 구현예에서, 염은 Na+, H+, Ca2+, Mg2+, 또는 Al3+와 Cl-, Br-, I-, NO3 -, 또는 ClO4 -의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 염은 CaCl2, MgCl2, 또는 NaCl로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 일부 구현예에서, 염은 CaCl2이다. 일부 구현예에서, 염은 MgCl2이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 이종이량체 단백질은 단백질 A에 결합할 수 있는 CH3 도메인("Fc")을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 단백질 A에 결합할 수 없는 CH3 도메인("Fc*")을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 경우에, 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 H435R/Y436F(EU 넘버링 시스템에 의함; IMGT 엑손 넘버링 시스템에 의하면 H95R/Y96F) 치환(일명 "Fc*" 또는 "별 치환")을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 제1 동종이량체는 2개의 치환되지 않은 CH3 도메인(즉, FcFc)을 갖는 단일특이적 항체이고; 제2 동종이량체는 2개의 H435R /Y436F 치환된 CH3 도메인(즉, Fc*Fc*)을 갖는 단일특이적 항체이며; 이종이량체 단백질은 하나의 치환되지 않은 CH3 도메인 및 하나의 H435R /Y436F 치환된 CH3 도메인(즉, Fc*Fc)을 갖는 이중특이적 항체이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼을 (예를 들어, 컬럼을 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉시킴으로써) 세정하는 빈도는 단백질-리간드 기능에 미치는 영향을 최소화하기 위해 감소될 수 있다. 유사하게, 방법의 일부 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼을 세정하는 데 사용되는 용액 중 염기의 농도는 더 많은 수의 사이클에 걸쳐 컬럼 용해도를 최대화하기 위해 0.1 N 내지 0.5 N의 범위로 감소될 수 있다.
다양한 구현예에서, 친화도 매트릭스는 매 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉될 수 있다. 일부 경우에, 친화도 매트릭스는 매 3 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉된다. 일부 경우에, 친화도 매트릭스는 매 5 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉된다. 일부 경우에, 친화도 매트릭스는 매 7 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉된다. 다양한 구현예에서, 친화도 매트릭스는 매 2 사이클, 3 사이클, 4 사이클, 5 사이클, 6 사이클, 7 사이클, 8 사이클, 9 사이클, 또는 10 사이클 후에만 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉된다.
일부 구현예에서, 염기성 용액의 pH는 적어도 12이다. 일부 구현예에서, 염기성 용액의 pH는 적어도 11, 적어도 11.1, 적어도 11.2, 적어도 11.3, 적어도 11.4, 적어도 11.5, 적어도 11.6, 적어도 11.7, 적어도 11.8, 적어도 11.9, 적어도 12, 적어도 12.1, 적어도 12.2, 적어도 12.3, 적어도 12.4, 적어도 12.5, 적어도 12.6, 적어도 12.7, 적어도 12.8, 적어도 12.9, 또는 적어도 13이다.
일부 구현예에서, 염기성 용액은 0.1 N 내지 0.5 N의 농도로 염기를 포함한다. 일부 경우에, 염기 농도는 0.1 N 내지 0.3 N이다. 일부 경우에, 염기 농도는 0.1 N, 0.15 N, 0.2 N, 0.25 N, 0.3 N, 0.35 N, 0.4 N, 0.45 N, 또는 0.5 N이다. 일부 구현예에서, 염기성 용액은 알칼리 금속 수산화물을 포함한다. 일부 경우에, 염기는 NaOH이다. 일부 경우에, 염기는 KOH이다.
실시예
실시예 1: 친화도 크로마토그래피에서 이종이량체 단백질의 결합 불순물의 존재 및 회수율에 대한 용리 pH의 평가
이 실험을 위해, 16.2 mL MabSelect SuRe™ pcc 컬럼(1.0 cm i.d., 20.6 cm 상 높이)을 미처리 수지로 충진하고, AKTA Avant 25 벤치 상단 액체 크로마토그래피 제어기 상에 통합하였다. 친화도 분해 프로세스는 아래 표 1에 개략된 바와 같이 수행하였지만, 용리 pH는 3.90 내지 4.30으로 다양하였다.
| MabSelect SuRe™ pcc를 이용한 bsAb1 친화도 분해 크로마토그래피에 대한 용리 완충액 결정을 위한 프로세스 | ||||
| 단계 | 설명 | 용액 | 부피 | 머무름 시간 (분) |
| 1 | 보관 에탄올 제거 | RODI | 2 CV | 10 |
| 2 | 스트립-전 | 500 mM 아세트산, pH 2.45 ± 0.20 | 2 CV | 6 |
| 3 | 평형화 | 40 mM 인산나트륨, 500 mM NaCl, pH 7.20 ± 0.10 | 2 CV | 6 |
| 4 | 로딩 | 정화된 세포 배양물 | 55.0 g 결합 종/L(수지)a | 6 |
| 5 | 세척 1 | 40 mM 인산나트륨, 500 mM NaCl, pH 7.20 ± 0.10 | 3 CV | 6 |
| 6 | 세척 2 | 40mM 트리스, 10mM 아세테이트, pH 7.20 ± 0.10 |
2 CV | 6 |
| 7 | 용출 | 40 mM 아세테이트, 500 mM NaCl pH 4.10 ± 0.05 |
6 CVb | 6 |
| 8 | 스트립 1 | 40 mM 아세트산, pH 3.00 ± 0.10 |
2 CV | 6 |
| 9 | 스트립 2 | 500 mM 아세트산,pH 2.45 ± 0.20 | 2 CV | 6 |
| 10 | 재-평형화 | 20 mM 인산나트륨, pH 7.20 ± 0.10 |
2 CV | 6 |
| 11 | 보관 | 20%(v/v) 에탄올 | 2 CV | 10 |
a
결합 종은 이중특이적 종 및 결합 불순물 종을 지칭함. 결합 역가를 사용하여 컬럼 로딩을 결정함.
b
용리액은 0.5 CV에서 용리 블록으로 수집되기 시작함.
CV, 컬럼 부피; RODI, 역삼투 탈이온수
친화도 분해 용리액을 분획화하여 5, 6, 및 7 CV의 용리 길이에서 용리액 조성을 나타내는 모의 풀을 제조할 수 있게 하였다. 용리액은 0.5 CV에서 용리 블록으로 수집되기 시작함. CV 0.5~5를 벌크로 수집한 다음, CV 5~6 및 CV 6~7은 개별적으로 수집하였다. 분획화 후, 각 분획으로부터 적절한 부피를 합쳐 6 CV 및 7 CV 모의 풀을 생성한 다음; 5, 6, 및 7 CV 풀을 이산된 런으로서 통계적으로 평가하였다.
각 모의 풀의 농도는 Solo VPE 기기를 사용해 UV(280 nm)에 의해 결정하였다. 혼합 모드 크로마토그래피 검정을 사용하여 측정된 이중특이적 순도에 대해 각각의 모의 풀을 분석하였다. 각 모의 풀의 용리액 부피, 용리액 단백질 농도, 결합하는 불순물, 및 결합하지 않는 불순물 데이터를 사용하여 각 런별로 친화도 분해 이중특이적 수율을 계산하였다. 0.25의 진입 확률, 0.05의 이탈 확률, 및 95%로 설정된 p-값 임계 중단 규칙을 갖는 역방향 단계적 회귀 도구로부터 선택된 인자를 사용하여 모델을 생성하고, 이를 사용해 결합하는 불순물 수준 및 이종이량체 단백질 회수율을 계산하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 용리액 중 결합하는 불순물의 백분율 및 이종이량체 단백질 회수율 모두는 미노출 컬럼(0회의 이전 사이클)에서 pH가 증가함에 따라 감소하였다. 도시된 바와 같이, 4.1의 pH는 유의한 수준의 이종이량체 단백질 회수율(예: 92.5%)을 유지하면서 용리액에서 결합하는 불순물의 최소 수준(예: 2.0%)을 제공한다. 특히, 용리 완충액의 pH를 심지어 4.2로 상승시킨 경우에도 이종이량체 단백질의 회수율을 극적으로 감소시킨다(예: 약 80%).
실시예 2: 미노출 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피에서 이종이량체 단백질의 결합 불순물의 존재 및 회수율에 대한 용리 pH의 평가
Akta Avant 25(Cytiva) 액체 크로마토그래피 시스템에 통합된 MabSelect SuRe™ pcc 컬럼(1.0 cm 내경, 20 cm 상 높이)을 사용하여 이 실험을 수행하였다. 친화도 분해 프로세스는 아래 표 2에 개략된 바와 같이 수행하였지만, 아래 표 3에 나타낸 바와 같이 다양한 용리 pH 및 사이클 수로 수행하였다.
| 미처리 컬럼 및 사이클링된 컬럼에서 MabSelect SuRe™ pcc를 이용한 bsAb1 친화도 분해 크로마토그래피를 위한 용리 완충액 결정을 위한 프로세스 | ||||
| 단계 | 설명 | 용액 | 부피 | 머무름 시간 (분) |
| 1 | 보관 에탄올 제거 | 역삼투 탈이온수 | 2 CV | 10 |
| 2 | 스트립-전 | 500 mM 아세트산, pH 2.45 ± 0.20 | 2 CV | 6 |
| 3 | 평형화 | 20 mM 인산나트륨, pH 7.20 ± 0.10 |
2 CV | 6 |
| 4 | 로딩 | 정화된 세포 배양물 | 수지 1 리터 당 52~63 g의 결합하는 종(결합하는 불순물 + 이중특이적) | 6 |
| 5 | 세척 1 | 10 mM 인산나트륨, 525 mM NaCl,pH 7.10 ± 0.10 | 3 CV | 6 |
| 6 | 세척 2 | 20 mM 인산나트륨, pH 7.20 ± 0.10 |
2 CV | 6 |
| 7 | 용출 | 40 mM 아세테이트, 500 mM NaCl, pH 4.10 ± 0.05 또는 40 mM 아세테이트, 500 mM NaCl, pH 4.50 ± 0.05 |
≤7.25 CV | 8 |
| 8 | 스트립 1 | 40 mM 아세트산, 9 mM NaCl, pH 3.10 ± 0.10 |
2 CV | 6 |
| 9 | 스트립 2 | 500 mM 아세트산,pH 2.45 ± 0.20 | 2 CV | 6 |
| 10 | 재-평형화 | 20 mM 인산나트륨, pH 7.20 ± 0.10 |
2 CV | 6 |
| 11 | 스트립 3 | 0.5 M NaOH | 2 CV | 7.5 |
| 12 | 재-평형화 | 20 mM 인산나트륨, pH 7.20 ± 0.10 |
2 CV | 6 |
| 13 | 보관 | 20%(v/v) 에탄올 | 2 CV | 10 |
| pH 및 수지의 사이클 수 | |
| 런 | 수지 상의 사이클 수 |
| 4.1 미노리 | 1 |
| 4.1 사이클링됨 | 78 |
| 4.5 미노리 | 6 |
| 4.5 사이클링됨 | 83 |
도 4a에 도시된 바와 같이, 미노출 컬럼(≤6 사이클)에서 용리 pH를 (4.1에서 4.5로) 증가시키는 것은 용리액 중 결합하는 불순물의 백분율을 (2.7%에서 1.2%로)을 약간 감소시키는 반면, 사이클링된 컬럼(78~83 사이클)에서 용리 pH를 (4.1에서 4.5로) 증가시키는 것은 용리액 중 결합하는 불순물의 백분율을 (17.4%에서 2.0%로) 극적으로 및 예기치 않게 감소시킨다. 도 4b는, 용리 pH를 (4.1에서 4.5로) 증가시키는 것은 이종이량체 단백질(예: 이중특이적 항체)의 회수율에도 부정적인 영향을 미치지만, 사이클링된 컬럼에서의 회수율 감소가 예상 외로 훨씬 덜 유의함을 보여준다(미노출 컬럼에 비해 약 10x 더 적음). 도 4b에 도시된 바와 같이, 용리 pH를 4.1에서 4.5로 상승시켰을 때, 미노출 컬럼에서 이종이량체 단백질 회수율이 약 40%만큼 감소한 반면, 동일한 pH 증가에 대해 사이클링된 컬럼에서의 감소는 약 4%에 불과하였다.
실시예 3: pH 용리 연구에서 측정된 결과에 대한 입력 파라미터의 평가
AKTA pure 150(Cytiva) 액체 크로마토그래피 시스템에 개별적으로 통합된 3개의 MabSelect SuRe™ pcc 컬럼(1.0 cm 내경, 21 cm 상 높이; 16.5 mL 컬럼 부피)을 사용하여 이 실험을 수행하였다. 친화도 분해 프로세스는 아래 표 4에 개략된 바와 같이 수행하였지만, 아래 표 5에 나타낸 바와 같이 다양한 컬럼 로딩(수지 1 리터 당 33~55 g의 결합 종(이중특이적 + 결합하는 불순물)), 용리 pH(4.0~4.5), 및 수산화물 사이클 또는 수산화물 노출 시간(1~109 사이클 또는 0.28~30.56시간)으로 수행하였다. 수율(이중특이적 + 결합하는 불순물의 백분율(%)), 결합하는 불순물(%), 및 응집(SE-UPLC 고분자량 (%))을 컬럼 로딩, 용리 pH, 및 수산화물 사이클(또는 노출 시간)과 관련하여 측정하였다.
| bsAb1의 pH 용리 연구를 위한 프로세스 | ||||
| 단계 | 설명 | 용액 | 부피 | 머무름 시간 (분) |
| 1 | 물 세척 | 정제수 | 3 CV | 31.5 |
| 2 | 스트립-전 | 500 mM 아세트산, pH 2.45 ± 0.2 | 2 CV | 12.6 |
| 3 | 평형화 | 20 mM 인산나트륨, pH 7.20 ± 0.1 | 2 CV | 12.6 |
| 4 | 로딩 | 정화된 세포 배양물 | 표 x 참조 | 51.4~85.7 |
| 5 | 세척 1 | 10 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 7.20 ± 0.1 | 3 CV | 18.9 |
| 6 | 세척 2 | 20 mM 인산나트륨, pH 7.20 ± 0.1 | 2 CV | 12.6 |
| 7 | 용출 | 40 mM 아세테이트, 500 mM 염화나트륨용액 pH: 표 x 참조 | 6 CV | 37.8 |
| 8 | 스트립 1 | 40 mM 아세트산, pH 3.00 ± 0.2 | 2 CV | 12.6 |
| 9 | 스트립 2 | 500 mM 아세트산, pH 2.45 ± 0.2 | 2 CV | 12.6 |
| 10 | 재-평형화 | 20 mM 인산나트륨, pH 7.20 ± 0.1 | 2 CV | 12.6 |
| 실험 런에서 파라미터의 변동 | ||||
| 런 | 용해 pH | 로딩 (g/L) | 수산화물 사이클 | 수산화물 접촉 시간 (시간) |
| 1 | 4.00 | 55 | 105 | 29.44 |
| 2 | 4.50 | 33 | 1 | 0.28 |
| 3 | 4.00 | 33 | 2 | 0.56 |
| 4 | 4.25 | 44 | 106 | 29.72 |
| 5 | 4.25 | 44 | 50 | 14.02 |
| 6 | 4.50 | 55 | 3 | 0.84 |
| 7 | 4.00 | 55 | 4 | 1.12 |
| 8 | 4.25 | 33 | 51 | 14.30 |
| 9 | 4.25 | 55 | 52 | 14.58 |
| 10 | 4.25 | 44 | 53 | 14.86 |
| 11 | 4.50 | 44 | 54 | 15.14 |
| 12 | 4.25 | 44 | 55 | 15.42 |
| 13 | 4.50 | 55 | 107 | 30.00 |
| 14 | 4.00 | 33 | 108 | 30.28 |
| 15 | 4.00 | 44 | 56 | 15.70 |
| 16 | 4.25 | 44 | 5 | 1.40 |
| 17 | 4.50 | 33 | 109 | 30.56 |
실험 런은 상기 표 5에 열거된 순서로 실행하였다. 설계 진단은 도 5a, 5b, 및 6에 제시되어 있다. 실험은 전술한 바와 같이, 수산화물 사이클의 수가 낮거나(1~5), 중간이거나(50~56), 높은(105~109) 3개의 컬럼에 걸쳐 수행하였다. 분석을 용이하게 하기 위해, 수산화물 사이클을 수산화물 사이클 시간으로 변환하였다. 수산화물 접촉 시간은 사이클 당 16.82분(0.28시간)이었다. 분해 용리 완충액을 ±0.05의 pH 허용오차 내에서 제조하였다. 0.5 컬럼 부피(CV)에서 용리 블록 내로 용리액 수집을 시작하였다.
각 풀의 농도는 Solo VPE 기기를 사용해 UV(280 nm)에 의해 결정하였다. 풀이 이중특이적 단백질만을 함유하였다는 가정 하에, 용리액 부피 및 단백질 농도를 사용하여 각 런에 대한 친화도 분해 이중특이적 수율을 계산하였다.(즉, 불순물(결합하는 불순물)로 인해, 최종 수율은 >100%에서 측정할 수 있었음). 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 검정을 사용하여 이중특이적 순도를 측정하였다. 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피 검정(SE-UPLC)을 사용하여 응집을 측정하였다.
전체 모델, 결합 규칙, 및 0.05의 이탈 확률에 대한 p-값 임계값으로 시작하는 역방향 단계적 회귀 도구로부터 선택된 인자를 사용하여 모델을 생성하였다. 프로세스 지식 및/또는 추가 통계 분석을 또한 사용하여 적절한 경우 모델 용어를 추가하거나 제거하였다. 이중특이적 단계 수율(%), 결합하는 불순물(%), 및 응집(% HMW)에 대해 회귀 분석을 수행하였다.
모델 예측 프로파일러는 도 7a 및 7b에 도시되어 있다. 이중특이적 수율 및 결합하는 불순물에 대해 유의한 용어를 갖는 모델을 생성하였다. 응집에 대한 유의한 용어는 발견되지 않았다. pH가 낮고 컬럼 로딩과 수산화물 접촉 시간이 길수록 이중특이적 수율이 더 높았다. 이러한 더 높은 수율의 주된 요인은, 도 7b에 도시된 바와 같이, 증가된 결합하는 불순물의 존재로 인한 것이며, 이는 pH 및 수산화물 접촉 시간의 경우와 동일한 경향을 따랐다.
새로운 데이터를 예측하는 이들 모델의 능력을 평가하기 위해 3회의 확인 런을 수행하였다. 정화된 세포 배양물을 44 g/L(수지)의 평균 컬럼 로딩을 사용하여 3개의 컬럼 각각을 이용해 정제하였다. 상기 모델을 사용하여, 컬럼 수지 수명의
상이한 단계에 컬럼 상에서 고정된 수준(약 6%)의 결합하는 불순물을 표적화하기 위해 어떤 pH를 사용해야 하는지를 예측하였다. 결과는 아래 표 6에 제시되어 있다.
| 모델 확인 런 | ||||||||
| 런 | 분해 용리 완충액 pH | 로딩 (g/L(수지)) | 수산화물 사이클 | 수산화물 접촉 시간(시간) | 분해 이중특이적 단계 수율 (%, 예측) |
분해 이중특이적 단계 수율 (%, 실제) |
결합하는 불순물 (%, 예측) |
결합하는 불순물 (%, 실제) |
| 1 | 4.10 | 44 | 6 | 1.68 | 76.3 | 80.4 | 6.41 | 6.20 |
| 2 | 4.25 | 44 | 57 | 15.98 | 71.7 | 78.7 | 6.43 | 5.97 |
| 3 | 4.35 | 44 | 110 | 30.84 | 80.4 | 83.2 | 6.24 | 6.22 |
이중특이적 수율 모델은 평가 범위에 걸쳐 일관되게 낮게 예측되었지만 실제의 7% 이내였다. 컬럼 로딩은 결합하는 불순물을 예측하는 데 있어서 유의한 인자가 아니었다. 결합하는 불순물 모델 예측은 실제보다 높았지만, 0.5% 이내였다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형은 전술된 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 이내에 포함되는 것으로 의도된다.
Claims (83)
- 이종이량체 단백질을 정제하는 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
일련의 크로마토그래피 사이클을 수행하는 단계로서, 각각의 사이클은:
이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화도 매트릭스에 도입하는 단계로서, 상기 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화도를 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 불순물은 상기 단백질 결합 리간드에 결합하고, 적어도 하나의 불순물은 상기 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는, 단계;
5 내지 9의 제1 pH에서 제1 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않는 불순물을 제거하는 단계;
제2 pH에서 제1 용리 완충액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 용리하는 단계; 및
4 미만의 제3 pH에서 제2 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하는 불순물을 제거하는 단계를 포함하되;
일련의 크로마토그래피 사이클 내의 일련의 예비 사이클 동안 제2 pH는 예비 pH에 유지되고, 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 일련의 후속 사이클 동안에 제2 pH는 예비 pH보다 높은 후속 pH로 상승되고, 예비 pH 및 후속 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내인, 단계; 및
용리액에서 상기 친화도 매트릭스로부터 상기 이종이량체 단백질을 수집하는 단계. - 제1항에 있어서, 상기 일련의 예비 사이클은 20 사이클로 이루어지는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 일련의 예비 사이클은 30 사이클 또는 40 사이클로 이루어지는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 일련의 예비 사이클은 50 사이클 또는 60 사이클로 이루어지는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 일련의 예비 사이클은 70 사이클 또는 80 사이클로 이루어지는, 방법.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일련의 후속 사이클은 적어도 20 사이클로 이루어지는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 일련의 후속 사이클은 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 또는 적어도 80 사이클로 이루어지는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예비 pH는 4.0 내지 4.2인, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 예비 pH는 4.1 ± 0.05인, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후속 pH는 4.3 내지 4.7인, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 후속 pH는 4.5 ± 0.05인, 방법.
- 이종이량체 단백질을 정제하는 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
일련의 크로마토그래피 사이클을 수행하는 단계로서, 각각의 사이클은:
이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화도 매트릭스에 도입하는 단계로서, 상기 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화도를 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 불순물은 상기 단백질 결합 리간드에 결합하고, 적어도 하나의 불순물은 상기 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는, 단계;
5 내지 9의 제1 pH에서 제1 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않는 불순물을 제거하는 단계;
제2 pH에서 제1 용리 완충액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 용리하는 단계; 및
4 미만의 제3 pH에서 제2 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하는 불순물을 제거하는 단계를 포함하되;
연속 크로마토그래피 사이클 내의 사이클 중 임의의 하나 또는 그 이상에 이후에, 이종이량체 단백질을 함유하는 용리액에서 결합하는 불순물의 수준을 측정하고, 결합하는 불순물의 측정된 수준을 결합하는 불순물의 기준 수준과 비교하는 단계로서, 상기 결합하는 불순물 측정된 수준이 상기 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 후속 사이클에서 상기 제2 pH를 증가시키고, 상기 제2 pH는 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 동안 또는 후속 사이클 동안 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있는, 단계; 및
상기 용리액에서 상기 친화도 매트릭스로부터 상기 이종이량체 단백질을 수집하는 단계. - 제12항에 있어서, 상기 결합하는 불순물의 기준 수준은 2% 내지 10%인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 결합하는 불순물의 기준 수준은 3% 내지 7%인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 결합하는 불순물의 기준 수준은 5% ± 0.5%, 방법.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리액 중 상기 결합하는 불순물의 수준은 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 후에 측정되는, 방법.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리액 중 상기 결합하는 불순물의 수준은 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 중 매 5번 째 사이클 후에 측정되는, 방법.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리액 중 상기 결합하는 불순물의 수준은 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 중 매 10번 째 사이클 또는 매 12번 째 사이클 후에 측정되는, 방법.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리액 중 상기 결합하는 불순물의 수준은 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 중 40번 째 사이클 또는 50번 째 사이클 후에 측정되는, 방법.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리액 중 상기 결합하는 불순물의 수준은 상기 일련의 사이클로부터 수집된 합쳐진 용리액 풀에서 측정되는, 방법.
- 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합하는 불순물의 측정된 수준이 상기 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 상기 제2 pH는 4.0 내지 4.2의 범위에서 4.3 내지 4.7의 범위로 증가되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 결합하는 불순물의 측정된 수준이 상기 결합하는 불순물의 기준 수준을 초과하는 경우, 상기 제2 pH는 4.1 ± 0.05에서 4.5 ± 0.05로 증가되는, 방법.
- 이종이량체 단백질을 정제하는 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
일련의 크로마토그래피 사이클을 수행하는 단계로서, 각각의 사이클은:
이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화도 매트릭스에 도입하는 단계로서, 상기 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화도를 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 불순물은 상기 단백질 결합 리간드에 결합하고, 적어도 하나의 불순물은 상기 단백질 결합 리간드에 결합하지 않는, 단계;
5 내지 9의 제1 pH에서 제1 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하지 않는 불순물을 제거하는 단계;
제2 pH에서 제1 용리 완충액에서 친화도 매트릭스로부터 이종이량체 단백질을 용리하는 단계; 및
4 미만의 제3 pH에서 제2 세척 완충액으로 친화도 매트릭스를 세척하여 결합하는 불순물을 제거하는 단계를 포함하되;
상기 제2 pH는 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 1차 일련의 사이클 동안 1차 pH에 유지되고, 상기 제2 pH는 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 상기 일차 일련의 사이클에 이어지는 이차 일련의 사이클 동안 상기 1차 pH보다 높은 2차 pH로 상승되고, 상기 제2 pH는 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 2차 일련의 사이클에 이어지는 3차 일련의 사이클 동안 2차 pH보다 더 높은 3차 pH로 상승되고, 상기 1차 pH, 상기 2차 pH, 상기 3차 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있는, 단계; 및
용리액에서 상기 친화도 매트릭스로부터 상기 이종이량체 단백질을 수집하는 단계. - 제23항에 있어서, 상기 1차 일련의 사이클은 5 내지 50 사이클을 포함하는, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 1차 일련의 사이클은 최대 20 사이클을 포함하는, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 1차 일련의 사이클은 최대 40 사이클을 포함하는, 방법.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 일련의 사이클은 5 내지 50 사이클을 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 2차 일련의 사이클은 10 내지 25 사이클을 포함하는, 방법.
- 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3차 일련의 사이클은 5 내지 50 사이클을 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 3차 일련의 사이클은 10 내지 25 사이클을 포함하는, 방법.
- 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 pH는 4.0 내지 4.2의 범위인, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 1차 pH는 4.1 ± 0.05인, 방법.
- 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 pH는 4.2 내지 4.4의 범위인, 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 2차 pH는 4.3 ± 0.05인, 방법.
- 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3차 pH는 4.4 내지 4.6의 범위인, 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 3차 pH는 4.5 ± 0.05인, 방법.
- 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 pH는 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 상기 3차 일련의 사이클에 이어지는 제4 일련의 사이클 동안 상기 3차 pH보다 높은 제4 pH로 상승되고, 여기서 상기 제4 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있는, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 제2 pH는 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 상기 제4 일련의 사이클에 이어지는 제5 일련의 사이클 동안 상기 제4 pH보다 높은 제5 pH로 상승되고, 여기서 상기 제5 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 제2 pH는 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 상기 제5 일련의 사이클에 이어지는 제6 일련의 사이클 동안 상기 제5 pH보다 높은 제6 pH로 상승되고, 여기서 상기 제6 pH는 4.0 내지 5.2의 범위 내에 있는, 방법.
- 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 pH는 상기 1차 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고, 상기 3차 pH는 상기 2차 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고, 상기 제4 pH는 상기 3차 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고, 상기 제5 pH는 상기 제4 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이고/이거나, 상기 제6 pH는 상기 제5 pH보다 0.1 내지 0.9 높은 pH이며, 상기 1차 pH는 4.0 내지 4.2의 범위인, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 1차 pH는 4.1 ± 0.05인, 방법.
- 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 일련의 사이클, 상기 2차 일련의 사이클, 상기 3차 일련의 사이클, 상기 제4 일련의 사이클, 상기 제5 일련의 사이클, 및/또는 상기 제6 일련의 사이클 각각은 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 5 내지 50 사이클을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불순물은 상기 제1 및 제2 폴리펩티드의 동종이량체 종을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 결합 리간드는 단백질 A이고, 상기 친화도 매트릭스는 기질에 부착된 상기 단백질 A 리간드를 포함하는, 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 단백질 A 리간드는 Z-도메인 4량체를 포함하는 조작된 단백질 A, Y-도메인 4량체를 포함하는 조작된 단백질 A, 또는 D 및 E 도메인이 결여된 조작된 단백질 A인, 방법.
- 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 기질은 입자이고, 상기 친화도 매트릭스는 25 μm 내지 100 μm의 평균 직경을 포함하는 다수의 입자를 포함하는, 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 입자는 40 μm 내지 60 um의 평균 직경을 포함하는, 방법.
- 제47항에 있어서, 상기 입자는 45 μm 내지 55 um의 평균 직경을 포함하는, 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 입자는 약 50 um의 평균 직경을 포함하는, 방법.
- 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 아가로오스, 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 폴리메타크릴레이트, 셀룰로오스, 조절된 기공 유리, 및 구형 실리카 중 어느 하나 또는 그 이상을 포함하는, 방법.
- 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 약 1100 Å의 평균 직경을 갖는 기공을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리 완충액은 적어도 250 mM의 농도로 염을 포함하는, 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 염 농도는 300 mM 초과 또는 400 mM 초과인, 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 염 농도는 약 500 mM인, 방법.
- 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 염은 다음을 함유하는 염으로부터 선택되는, 방법: (i) Cl-, Br-, I-, NO3 -, N(CH3)4 +, NH4 +, Cs+, Rb+, K+, Na+, H+, Ca2+, Mg2+, Al3+; (ii) Na+, H+, Ca2+, Mg2+, 또는 Al3+와 Cl-, Br-, I-, NO3 -, 또는 ClO4 -의 조합; 또는 (iii) CaCl2, MgCl2, 또는 NaCl.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 단백질 결합 리간드에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 단백질 결합 리간드에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함하는, 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 단백질 A에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 단백질 A에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함하는, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 H435R 변형 및 Y436F 변형(EU 넘버링)을 포함하는, 방법.
- 제10항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 pH는 6 내지 8인, 방법.
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 pH는 2.8 내지 3.5인, 방법.
- 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이량체 단백질은 항체인, 방법.
- 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이량체 단백질은 이중특이적 항원 결합 단백질인, 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 이중특이적 항원 결합 단백질은 이중특이적 항체인, 방법.
- 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이량체 단백질의 적어도 85%가 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수되는, 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 이종이량체 단백질의 적어도 87%가 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수되는, 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 이종이량체 단백질의 적어도 89%가 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수되는, 방법.
- 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일련의 크로마토그래피 사이클은 100 또는 그 이상의 사이클을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화도 매트릭스는 매 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉되는, 방법.
- 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화도 매트릭스는 매 3 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉되는, 방법.
- 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화도 매트릭스는 매 5 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉되는, 방법.
- 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화도 매트릭스는 매 7 사이클 후에 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉되는, 방법.
- 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성 용액의 pH는 적어도 12인, 방법.
- 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성 용액은 0.1 N 내지 0.5 N의 농도로 염기를 포함하는, 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 농도는 0.1 N 내지 0.3 N인, 방법.
- 제68항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성 용액은 NaOH를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 사이클은 (v) 상기 친화도 매트릭스를 적어도 11의 pH를 갖는 염기성 용액과 접촉시킴으로써 상기 친화도 매트릭스를 세정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제76항에 있어서, 상기 염기성 용액의 pH는 적어도 12인, 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 염기성 용액은 0.1 N 내지 0.5 N의 농도로 염기를 포함하는, 방법.
- 제78항에 있어서, 상기 농도는 0.1 N 내지 0.3 N인, 방법.
- 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성 용액은 NaOH를 포함하는, 방법.
- 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이량체 단백질의 적어도 75%가 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수되고, 상기 결합하는 불순물은 6.5%를 초과하지 않는, 방법.
- 제81항에 있어서, 상기 이종이량체 단백질의 적어도 78%가 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수되는, 방법.
- 제82항에 있어서, 상기 이종이량체 단백질의 적어도 80%가 상기 일련의 크로마토그래피 사이클 내의 각 사이클 중 용리액에서 회수되는, 방법.
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