KR20240125190A - 대장암 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents
대장암 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240125190A KR20240125190A KR1020230017914A KR20230017914A KR20240125190A KR 20240125190 A KR20240125190 A KR 20240125190A KR 1020230017914 A KR1020230017914 A KR 1020230017914A KR 20230017914 A KR20230017914 A KR 20230017914A KR 20240125190 A KR20240125190 A KR 20240125190A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- protein
- colon cancer
- expression level
- matrix
- cms4
- Prior art date
Links
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 121
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 42
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 232
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 76
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 143
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 116
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 101
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 52
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 50
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 46
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- 102100027442 Collagen alpha-1(XII) chain Human genes 0.000 claims description 28
- 101000861874 Homo sapiens Collagen alpha-1(XII) chain Proteins 0.000 claims description 28
- 102100028084 Hyaluronan and proteoglycan link protein 1 Human genes 0.000 claims description 28
- 101710191341 Hyaluronan and proteoglycan link protein 1 Proteins 0.000 claims description 28
- 102000004237 Decorin Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000738 Decorin Proteins 0.000 claims description 21
- 102100030216 Matrix metalloproteinase-14 Human genes 0.000 claims description 21
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 20
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 20
- 101001011906 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-14 Proteins 0.000 claims description 20
- 101710114875 Procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2 Proteins 0.000 claims description 20
- 102100035198 Procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2 Human genes 0.000 claims description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 20
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 20
- 102100026007 ADAM DEC1 Human genes 0.000 claims description 18
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 claims description 18
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 claims description 18
- 101000719904 Homo sapiens ADAM DEC1 Proteins 0.000 claims description 18
- 101001043352 Homo sapiens Lysyl oxidase homolog 2 Proteins 0.000 claims description 18
- 101000990915 Homo sapiens Stromelysin-1 Proteins 0.000 claims description 18
- 101000577877 Homo sapiens Stromelysin-3 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100021948 Lysyl oxidase homolog 2 Human genes 0.000 claims description 18
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 claims description 18
- 102100023087 Protein S100-A4 Human genes 0.000 claims description 18
- 108010085149 S100 Calcium-Binding Protein A4 Proteins 0.000 claims description 18
- 102000000625 Secreted frizzled-related protein 4 Human genes 0.000 claims description 18
- 108050008088 Secreted frizzled-related protein 4 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 claims description 18
- 102100028847 Stromelysin-3 Human genes 0.000 claims description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- 102100021633 Cathepsin B Human genes 0.000 claims description 15
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 claims description 15
- 101001013150 Homo sapiens Interstitial collagenase Proteins 0.000 claims description 13
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 claims description 13
- 108091013859 Mimecan Proteins 0.000 claims description 13
- 102100026632 Mimecan Human genes 0.000 claims description 13
- 102100031581 SPARC-like protein 1 Human genes 0.000 claims description 13
- 102000043253 matrix Gla protein Human genes 0.000 claims description 13
- 108010057546 matrix Gla protein Proteins 0.000 claims description 13
- 102000003902 Cathepsin C Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000267 Cathepsin C Proteins 0.000 claims description 12
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 claims description 11
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 11
- 102100033825 Collagen alpha-1(XI) chain Human genes 0.000 claims description 10
- 101000710623 Homo sapiens Collagen alpha-1(XI) chain Proteins 0.000 claims description 10
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 claims description 9
- 102100024203 Collagen alpha-1(XIV) chain Human genes 0.000 claims description 9
- 102000015833 Cystatin Human genes 0.000 claims description 9
- 102100026897 Cystatin-C Human genes 0.000 claims description 9
- 101000898449 Homo sapiens Cathepsin B Proteins 0.000 claims description 9
- 101000909626 Homo sapiens Collagen alpha-1(XIV) chain Proteins 0.000 claims description 9
- 101000912205 Homo sapiens Cystatin-C Proteins 0.000 claims description 9
- 229940122344 Peptidase inhibitor Drugs 0.000 claims description 9
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 claims description 9
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 claims description 9
- 108050004038 cystatin Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 claims description 9
- 101000947699 Homo sapiens Microfibril-associated glycoprotein 4 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000626163 Homo sapiens Tenascin-X Proteins 0.000 claims description 7
- 102100036103 Microfibril-associated glycoprotein 4 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100024549 Tenascin-X Human genes 0.000 claims description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 5
- 101000588007 Homo sapiens SPARC-like protein 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100032449 EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 Human genes 0.000 claims description 4
- 101001016381 Homo sapiens EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100023757 Latent-transforming growth factor beta-binding protein 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710178977 Latent-transforming growth factor beta-binding protein 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 claims 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims 3
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 claims 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 abstract description 11
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 abstract description 11
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 abstract description 9
- 230000036541 health Effects 0.000 abstract description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 5
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 abstract description 5
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 126
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 33
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 102100029529 Thrombospondin-2 Human genes 0.000 description 19
- 101000669513 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 13
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 101000633605 Homo sapiens Thrombospondin-2 Proteins 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 8
- 101710190365 SPARC-like protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 108010060887 thrombospondin 2 Proteins 0.000 description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 7
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 7
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 7
- 238000012174 single-cell RNA sequencing Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100029921 Dipeptidyl peptidase 1 Human genes 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000793922 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 1 Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 5
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 102100039551 Collagen triple helix repeat-containing protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 4
- 101000746121 Homo sapiens Collagen triple helix repeat-containing protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 4
- 101710200520 Laminin subunit alpha-3 Proteins 0.000 description 4
- 102100022744 Laminin subunit alpha-3 Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 4
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 3
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 3
- 101000881168 Homo sapiens SPARC Proteins 0.000 description 3
- 102100032114 Lumican Human genes 0.000 description 3
- 108010076371 Lumican Proteins 0.000 description 3
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 3
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 3
- 102100030776 Matrix-remodeling-associated protein 5 Human genes 0.000 description 3
- 101710195820 Matrix-remodeling-associated protein 5 Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102100029143 RNA 3'-terminal phosphate cyclase Human genes 0.000 description 3
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 3
- 206010038019 Rectal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102100037599 SPARC Human genes 0.000 description 3
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 3
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 201000001281 rectum adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 108091022885 ADAM Proteins 0.000 description 2
- 102100021253 Antileukoproteinase Human genes 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 2
- 102100033601 Collagen alpha-1(I) chain Human genes 0.000 description 2
- 102100031519 Collagen alpha-1(VI) chain Human genes 0.000 description 2
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 2
- 102100031387 Fibrillin-3 Human genes 0.000 description 2
- 101710175017 Fibrillin-3 Proteins 0.000 description 2
- 101000941581 Homo sapiens Collagen alpha-1(VI) chain Proteins 0.000 description 2
- 101001067170 Homo sapiens Plexin-B2 Proteins 0.000 description 2
- 101000835541 Homo sapiens Target of Nesh-SH3 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024629 Laminin subunit beta-3 Human genes 0.000 description 2
- 101710186340 Laminin subunit beta-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100035159 Laminin subunit gamma-2 Human genes 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 102000005879 Mucin-5B Human genes 0.000 description 2
- 108010030201 Mucin-5B Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 102100037371 Nidogen-2 Human genes 0.000 description 2
- 101710091705 Nidogen-2 Proteins 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102100034383 Plexin-B2 Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010082545 Secretory Leukocyte Peptidase Inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 102100027979 Semaphorin-3B Human genes 0.000 description 2
- 101710199438 Semaphorin-3B Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100026544 Target of Nesh-SH3 Human genes 0.000 description 2
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000001790 Welch's t-test Methods 0.000 description 2
- 108010029483 alpha 1 Chain Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000010209 gene set analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N sulfluramid Chemical group CCNS(=O)(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- XOOUIPVCVHRTMJ-UHFFFAOYSA-L zinc stearate Chemical compound [Zn+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O XOOUIPVCVHRTMJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007504 ADAM10 Proteins 0.000 description 1
- 108091022879 ADAMTS Proteins 0.000 description 1
- 102000029750 ADAMTS Human genes 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021979 Asporin Human genes 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100036213 Collagen alpha-2(I) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100031518 Collagen alpha-2(VI) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100024338 Collagen alpha-3(VI) chain Human genes 0.000 description 1
- 206010055114 Colon cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100039673 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10 Human genes 0.000 description 1
- 102100024361 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9 Human genes 0.000 description 1
- 101100221522 Drosophila melanogaster kn gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102100031509 Fibrillin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000752724 Homo sapiens Asporin Proteins 0.000 description 1
- 101000875067 Homo sapiens Collagen alpha-2(I) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000941585 Homo sapiens Collagen alpha-2(VI) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000909506 Homo sapiens Collagen alpha-3(VI) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000832769 Homo sapiens Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000846893 Homo sapiens Fibrillin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001023271 Homo sapiens Laminin subunit gamma-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000990902 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000143252 Idaea infirmaria Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710095660 Laminin subunit gamma-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010006444 Leucine-Rich Repeat Proteins Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076557 Matrix Metalloproteinase 14 Proteins 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710101493 Viral myc transforming protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 101150112388 cms1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150034064 col gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002052 colonoscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000027978 fibril organization Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010199 gene set enrichment analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000007417 hierarchical cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010120 metabolic dysregulation Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 108010009956 metallopeptidase-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 201000002120 neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000004963 pathophysiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- RHDXSLLGPJSSGW-VEGRVEBRSA-N phosphoric acid;(2r,3r,4r)-2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical compound OP(O)(O)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O RHDXSLLGPJSSGW-VEGRVEBRSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004725 rapid separation liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O triethylammonium ion Chemical compound CC[NH+](CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
대장암의 CMS(consensus molecular subtype) 아형 중에서도 CMS4 아형은 EMT 관련 유전자, TGF-β 신호 전달, 혈관 신생합성, 보체매개성 염증 시스템의 활성, 및 기질 침윤과 관련된 유전자 발현에 현저한 변화를 보이는 그룹으로 가장 난치성이며 예후가 좋지 않은 특징을 나타내다.
본 발명은 가장 치료가 어렵고 예후가 나쁜 유형의 대장암을 높은 정확도로 진단하는데 현저한 효과가 있으므로, 의료 및 보건 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
대장암의 CMS(consensus molecular subtype) 아형 중에서도 CMS4 아형은 EMT 관련 유전자, TGF-β 신호 전달, 혈관 신생합성, 보체매개성 염증 시스템의 활성, 및 기질 침윤과 관련된 유전자 발현에 현저한 변화를 보이는 그룹으로 가장 난치성이며 예후가 좋지 않은 특징을 나타내다.
본 발명은 가장 치료가 어렵고 예후가 나쁜 유형의 대장암을 높은 정확도로 진단하는데 현저한 효과가 있으므로, 의료 및 보건 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 대장암 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 대장암 진단 방법에 관한 것이다.
대장암은 대장에 생기는 악성종양으로, 세계보건기구(WHO) 산하 국제암연구소(IARC) 보고서에 따르면, 한국의 대장암 발병률은 10만 명당 45명으로 세계 1위이다. 중앙암등록본부에서 발표한 암 등록 통계를 보면 2014년에 우리나라에서는 217,057건의 암이 발생했는데, 그 중 대장암은 26,978건으로 전체의 12.4%로 3위를 차지할 정도로 발병률이 높다. 대장암으로 인한 사망률 또한 암종별 사망자수의 4위를 차지할 정도로 높다. 이러한 대장암은 기대수명 증가와 서구화된 식습관에 의해 발병률의 증가가 더욱 가속화되고 있다. 따라서 환자의 생존율 및 삶의 질 향상을 위해 대장암 발병을 조기에 발견하기 위한 정확도 높은 기술이 시급이 요구되는 실정이다.
한편, 암 분류는 정확한 진단뿐만 아니라 개개의 암에 대한 생물학적 특성을 일부 예측할 수 있다는 점에서 매우 중요하다. 대장암은 다른 종류의 암에 비해 임상적으로나 형태학적으로 비교적 균일한 특성을 보이기는 하지만 생물학적 특성과 진행 과정이 매우 다양하므로 이를 예측할 수 있는 정확한 분류가 필수적이다. 최근 세계보건기구(World Health Organization, WHO)에서는 산발적으로 보고되었던 대장암의 분자 분류에 관한 기존의 데이터를 통합하여 대장암을 4개의 아형으로 분류하였는데(consensus molecular subtype; CMS), 그 중 4형 아형(CMS4)은 EMT 관련 유전자, TGF-β 신호 전달, 혈관 신생합성, 보체매개성 염증 시스템의 활성, 및 기질 침윤과 관련된 유전자 발현에 현저한 변화를 보이는 그룹으로 가장 난치성이며 예후가 좋지 않은 특징을 나타내다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 문제의 해결을 위하여 고안된 것으로, 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 효과적 진단을 위한 바이오마커와 이를 이용한 진단 방법을 제공한다. 본 발명은 가장 치료가 어렵고 예후가 나쁜 유형의 대장암을 높은 정확도로 진단하는데 현저한 효과가 있으므로, 의료 및 보건 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
본 발명의 일 목적은 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 조성물, 또는 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암을 진단하기 위한 정보를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 치료용 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에서 이하 “암”이란, 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 하는 것을 말한다. 학문적으로는 신생물이라고 명명되기도 한다. 암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환으로, 암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으나, 내적 요인과 외적 요인으로 구분한다. 정상세포가 어떠한 기전을 거처 암세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지 않았으나, 상당수의 암이 환경요인 등 외적인자에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다. 암의 발생에 관련되는 유전자에는 종양형성유전자 (oncogenes)와 종양억제유전자 (tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 위에서 설명한 내적 혹은 외적 용인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다.
본 명세서에서 이하 “대장암”은 대장과 직장의 점막에서 발생하는 악성 종양을 포괄하는 의미이다. 돌출형, 궤양형, 또는 침윤형의 특징을 보일 수 있다. 조직학적으로는 대장암의 90% 이상이 대장 점막 상피세포 기원의 선암종이며, 드물게 신경 내분비 암종, 편평 세포 암종 등이 발생한다. 선암종은 선 구조를 형성하는 정도에 따라 조직학적인 종양의 등급이 결정되는데 고분화형 선암종의 경우 95% 이상의 종양이 선을 형성하고, 중분화형 종양의 경우 50-95%가 선 구조를 보이며, 저분화형 종양의 경우 50% 이하의 종양이 선 구조를 형성하는 것으로 구분하고 있다. 대부분의 대장 선암종이 중분화형을 보이며, 고분화형이 약 10%, 저분화형이 약 20% 정도를 차지하는 것으로 알려져 있다. 최근 세계보건기구(World Health Organization, WHO)에서는 산발적으로 보고되었던 대장암의 분자 분류에 관한 기존의 데이터를 통합하여 대장암을 4개의 아형으로 분류하였는데(consensus molecular subtype; CMS), 그 구체적인 정보를 하기 표 1에 나타내었다.
| Subtype | CMS1 | CMS2 | CMS3 | CMS4 |
| Dominant feature | MSI immune | Canonical | Metabolic | Mesenchymal |
| Prevalence | 14% | 37% | 13% | 23% |
| Genome instability | MSI highCIMP high Hypermutation |
SCNA high | Mixed MSI CIMP low SCNA low |
SCNA high |
| Mutation | BRAF | KRAS | ||
| Pathway and microenvironment | Immune activation | WNT and MYC activation | Metabolic dysregulation | Stromal invasionTGF-β activation angiogenesis |
| Prognostic | Worse SAR | Worse RFS and OS | ||
| MSI, microsatellite instable; CIMP, CpG island methylator phenotype; SAR, survival after relapse; SCNA, somatic copy number alteration; WNT, wingless-type MMTV integration site; MYC, v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene; TGF-β, transforming growth factor β; RFS, relapse-free survival; OS, overall survival. |
||||
본 명세서에서 이하 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 발병 여부 혹은 그 발병 가능성을 확인하는 것으로서, 이를 통해 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 발병 여부를 조기에 예측할 수 있다.
본 명세서에서 이하 바이오마커로 기재된 유전자는 인간(Homo sapiens) 유래 유전자로서, 유전자에 관한 정보는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 등 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 자명한 공공의 데이터베이스에서 용이하게 검색할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 바이오마커에 관한 것이다.
상기 바이오마커는 COL14A1(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain), DPT(Dermatopontin), MFAP5(Microfibril Associated Protein 5), MATN2(Matrilin-2), SRPX(Sushi Repeat Containing Protein X-Linked), MFAP4(Microfibril Associated Protein 4), MGP(Matrix Gla Protein), TNXB(tenascin XB protein), EDIL3(EGF Like Repeats And Discoidin Domains 3), LTBP4(latent transforming growth factor beta binding protein 4), SPARCL1(SPARC Like 1), OGN(Osteoglycin), HAPLN1(Hyaluronan And Proteoglycan Link Protein 1), DCN(Decorin), ADAMDEC1(ADAM like decysin 1), A2M(Alpha-2-Macroglobulin), CTSC(Cathepsin C), CST3(cystatin c), CXCL12(C-X-C motif chemokine 12), 및 S100A4(S100 Calcium Binding Protein A4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자; 또는 이에 의해 코딩되는 단백질일 수 있다. 상기에서 선택된 1종 이상의 유전자; 또는 이에 의해 코딩되는 단백질은 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암에서 정상 대조군 대비 그 발현 수준이 감소된 것일 수 있다.
또는 상기 바이오마커는 COL12A1(Collagen type XII α1 chain), COL11A1(Collagen Type XI Alpha 1 Chain), CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), FN1(Fibronectin 1), TNC(Tenascin C), SPARC(Secreted Protein Acidic And Cysteine Rich), THBS2(Thrombospondin 2), TIMP1(TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1), MMP14(Matrix Metallopeptidase 14), PLOD2(Procollagen-Lysine,2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2), SERPINH1(Serpin peptidase inhibitor clade H, member 1), LOXL2(Lysyl Oxidase Like 2), MMP11(Matrix Metallopeptidase 11), MMP1(Matrix Metallopeptidase 1), CTSB(Cathepsin B), MMP3(Matrix Metallopeptidase 3), LGALS1(Galectin 1), 및 SFRP4(Secreted Frizzled Related Protein 4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자; 또는 이에 의해 코딩되는 단백질일 수 있다. 상기에서 선택된 1종 이상의 유전자; 또는 이에 의해 코딩되는 단백질은 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암에서 정상 대조군 대비 그 발현 수준이 증가된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 바이오마커는 COL14A1(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain), DPT(Dermatopontin), MFAP5(Microfibril Associated Protein 5), MATN2(Matrilin-2), SRPX(Sushi Repeat Containing Protein X-Linked), MFAP4(Microfibril Associated Protein 4), MGP(Matrix Gla Protein), TNXB(tenascin XB protein), EDIL3(EGF Like Repeats And Discoidin Domains 3), LTBP4(latent transforming growth factor beta binding protein 4), SPARCL1(SPARC Like 1), OGN(Osteoglycin), HAPLN1(Hyaluronan And Proteoglycan Link Protein 1), DCN(Decorin), ADAMDEC1(ADAM like decysin 1), A2M(Alpha-2-Macroglobulin), CTSC(Cathepsin C), CST3(cystatin c), CXCL12(C-X-C motif chemokine 12), 및 S100A4(S100 Calcium Binding Protein A4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자에 COL12A1(Collagen type XII α1 chain), COL11A1(Collagen Type XI Alpha 1 Chain), CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), FN1(Fibronectin 1), TNC(Tenascin C), SPARC(Secreted Protein Acidic And Cysteine Rich), THBS2(Thrombospondin 2), TIMP1(TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1), MMP14(Matrix Metallopeptidase 14), PLOD2(Procollagen-Lysine,2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2), SERPINH1(Serpin peptidase inhibitor clade H, member 1), LOXL2(Lysyl Oxidase Like 2), MMP11(Matrix Metallopeptidase 11), MMP1(Matrix Metallopeptidase 1), CTSB(Cathepsin B), MMP3(Matrix Metallopeptidase 3), LGALS1(Galectin 1), 및 SFRP4(Secreted Frizzled Related Protein 4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 이러한 경우, 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단 정확도가 향상될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 진단용 조성물은 COL14A1(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain), DPT(Dermatopontin), MFAP5(Microfibril Associated Protein 5), MATN2(Matrilin-2), SRPX(Sushi Repeat Containing Protein X-Linked), MFAP4(Microfibril Associated Protein 4), MGP(Matrix Gla Protein), TNXB(tenascin XB protein), EDIL3(EGF Like Repeats And Discoidin Domains 3), LTBP4(latent transforming growth factor beta binding protein 4), SPARCL1(SPARC Like 1), OGN(Osteoglycin), HAPLN1(Hyaluronan And Proteoglycan Link Protein 1), DCN(Decorin), ADAMDEC1(ADAM like decysin 1), A2M(Alpha-2-Macroglobulin), CTSC(Cathepsin C), CST3(cystatin c), CXCL12(C-X-C motif chemokine 12), 및 S100A4(S100 Calcium Binding Protein A4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.
또는 상기 진단용 조성물은 COL12A1(Collagen type XII α1 chain), COL11A1(Collagen Type XI Alpha 1 Chain), CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), FN1(Fibronectin 1), TNC(Tenascin C), SPARC(Secreted Protein Acidic And Cysteine Rich), THBS2(Thrombospondin 2), TIMP1(TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1), MMP14(Matrix Metallopeptidase 14), PLOD2(Procollagen-Lysine,2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2), SERPINH1(Serpin peptidase inhibitor clade H, member 1), LOXL2(Lysyl Oxidase Like 2), MMP11(Matrix Metallopeptidase 11), MMP1(Matrix Metallopeptidase 1), CTSB(Cathepsin B), MMP3(Matrix Metallopeptidase 3), LGALS1(Galectin 1), 및 SFRP4(Secreted Frizzled Related Protein 4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 바이오마커 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 포괄한다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다.
본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머은 본 발명의 속하는 분야에서 통상의 기술자들에게 자명한 다양한 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 바이오마커 단백질이나, 이를 코딩하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명의 진단용 조성물에서 상기 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 단백질 또는 유전자의 발현 수준은 탈세포된 조직에서 측정되는 것일 수 있고, 구체적으로는 탈세포된 세포외기질(extracellular matrix)에서 측정되는 것일 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물에서 상기 COL14A1(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain), DPT(Dermatopontin), MFAP5(Microfibril Associated Protein 5), MATN2(Matrilin-2), SRPX(Sushi Repeat Containing Protein X-Linked), MFAP4(Microfibril Associated Protein 4), MGP(Matrix Gla Protein), TNXB(tenascin XB protein), EDIL3(EGF Like Repeats And Discoidin Domains 3), LTBP4(latent transforming growth factor beta binding protein 4), SPARCL1(SPARC Like 1), OGN(Osteoglycin), HAPLN1(Hyaluronan And Proteoglycan Link Protein 1), DCN(Decorin), ADAMDEC1(ADAM like decysin 1), A2M(Alpha-2-Macroglobulin), CTSC(Cathepsin C), CST3(cystatin c), CXCL12(C-X-C motif chemokine 12), 및 S100A4(S100 Calcium Binding Protein A4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 대비 감소한 경우, 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암 발병 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물에서 상기 COL12A1(Collagen type XII α1 chain), COL11A1(Collagen Type XI Alpha 1 Chain), CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), FN1(Fibronectin 1), TNC(Tenascin C), SPARC(Secreted Protein Acidic And Cysteine Rich), THBS2(Thrombospondin 2), TIMP1(TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1), MMP14(Matrix Metallopeptidase 14), PLOD2(Procollagen-Lysine,2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2), SERPINH1(Serpin peptidase inhibitor clade H, member 1), LOXL2(Lysyl Oxidase Like 2), MMP11(Matrix Metallopeptidase 11), MMP1(Matrix Metallopeptidase 1), CTSB(Cathepsin B), MMP3(Matrix Metallopeptidase 3), LGALS1(Galectin 1), 및 SFRP4(Secreted Frizzled Related Protein 4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 대비 증가한 경우, 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암 발병 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다.
상기 본 발명의 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 조성물은 COL14A1(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain), DPT(Dermatopontin), MFAP5(Microfibril Associated Protein 5), MATN2(Matrilin-2), SRPX(Sushi Repeat Containing Protein X-Linked), MFAP4(Microfibril Associated Protein 4), MGP(Matrix Gla Protein), TNXB(tenascin XB protein), EDIL3(EGF Like Repeats And Discoidin Domains 3), LTBP4(latent transforming growth factor beta binding protein 4), SPARCL1(SPARC Like 1), OGN(Osteoglycin), HAPLN1(Hyaluronan And Proteoglycan Link Protein 1), DCN(Decorin), ADAMDEC1(ADAM like decysin 1), A2M(Alpha-2-Macroglobulin), CTSC(Cathepsin C), CST3(cystatin c), CXCL12(C-X-C motif chemokine 12), 및 S100A4(S100 Calcium Binding Protein A4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제에 COL12A1(Collagen type XII α1 chain), COL11A1(Collagen Type XI Alpha 1 Chain), CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), FN1(Fibronectin 1), TNC(Tenascin C), SPARC(Secreted Protein Acidic And Cysteine Rich), THBS2(Thrombospondin 2), TIMP1(TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1), MMP14(Matrix Metallopeptidase 14), PLOD2(Procollagen-Lysine,2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2), SERPINH1(Serpin peptidase inhibitor clade H, member 1), LOXL2(Lysyl Oxidase Like 2), MMP11(Matrix Metallopeptidase 11), MMP1(Matrix Metallopeptidase 1), CTSB(Cathepsin B), MMP3(Matrix Metallopeptidase 3), LGALS1(Galectin 1), 및 SFRP4(Secreted Frizzled Related Protein 4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 이러한 경우, 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단 정확도가 향상될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트에 관한 것이다.
상기 본 발명의 키트는 상기 기술한 본 발명의 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 조성물을 포함하며, 본 발명의 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 조성물을 구성하는 각 부분의 제한사항은 상기 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 조성물에서 기재한 바와 중복되어, 이하 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 상기 기재된 본 발명의 바이오마커로부터 선택된 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암을 진단하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란 대장암의 발명 여부가 불확실하거나, 또는 대장암 발명이 진단되었을지라도 대장암의 CMS 아형이 불분명한 개체를 의미한다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 바람직하게는 대장 조직인 것이 대장암을 진단하는데 정확도를 높일 수 있어 바람직하다.
본 발명에서는 상기와 같이 분리된 생물학적 시료에서 상기 열거된 바이오마커 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 이하 선택된 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 또는 선택된 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 진단용 조성물에서 기재한 바와 중복되어, 이하 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 대장암, 특히 CMS4 아형 대장암의 치료용 후보물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
이는 구체적으로 (a) 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 대장암 치료용 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 처리된 생물학적 시료에서 COL14A1(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain), DPT(Dermatopontin), MFAP5(Microfibril Associated Protein 5), MATN2(Matrilin-2), SRPX(Sushi Repeat Containing Protein X-Linked), MFAP4(Microfibril Associated Protein 4), MGP(Matrix Gla Protein), TNXB(tenascin XB protein), EDIL3(EGF Like Repeats And Discoidin Domains 3), LTBP4(latent transforming growth factor beta binding protein 4), SPARCL1(SPARC Like 1), OGN(Osteoglycin), HAPLN1(Hyaluronan And Proteoglycan Link Protein 1), DCN(Decorin), ADAMDEC1(ADAM like decysin 1), A2M(Alpha-2-Macroglobulin), CTSC(Cathepsin C), CST3(cystatin c), CXCL12(C-X-C motif chemokine 12), 및 S100A4(S100 Calcium Binding Protein A4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 (b) 단계에서 선택되어 측정된 단백질 또는 유전자의 발현 수준이 상기 후보물질의 처리 전에 비하여 증가된 경우 상기 후보물질을 대장암 치료제로 판별하는 것일 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 (c) COL12A1(Collagen type XII α1 chain), COL11A1(Collagen Type XI Alpha 1 Chain), CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), FN1(Fibronectin 1), TNC(Tenascin C), SPARC(Secreted Protein Acidic And Cysteine Rich), THBS2(Thrombospondin 2), TIMP1(TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1), MMP14(Matrix Metallopeptidase 14), PLOD2(Procollagen-Lysine,2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2), SERPINH1(Serpin peptidase inhibitor clade H, member 1), LOXL2(Lysyl Oxidase Like 2), MMP11(Matrix Metallopeptidase 11), MMP1(Matrix Metallopeptidase 1), CTSB(Cathepsin B), MMP3(Matrix Metallopeptidase 3), LGALS1(Galectin 1), 및 SFRP4(Secreted Frizzled Related Protein 4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있고, 상기 (c) 단계에서 선택되어 측정된 단백질 또는 유전자의 발현 수준이 상기 후보물질의 처리 전에 비하여 감소된 경우 상기 후보물질을 대장암 치료제로 판별하는 것일 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 발현 수준을 측정하는 제제 및 발현 수준의 측정 방법에 관한 기재는 본 발명의 진단을 위한 정보 제공 방법에 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 방지하기 위해 이하 그 기재를 생략한다.
이하, 본 발명을 실시예에 입각하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은 가장 치료가 어렵고 예후가 나쁜 유형의 대장암을 높은 정확도로 진단하는데 현저한 효과가 있으므로, 의료 및 보건 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 환자 유래 ECM(pdECM)의 특성화 연구 개요의 모식도이다. 환자 유래 시료는 세포외 기질(ECM) 농축을 위해 탈세포되었고, pdECM의 프로테오믹 프로파일은 TMT(tandem mass tag) 질량 분광법으로 정량적으로 분석되었다. 단일 세포 및 벌크 RNA 시퀀싱 데이터를 통합하여 조직 유래 섬유아세포의 매트리솜과 이질성을 분석하였다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 벌크 조직 시료의 공통 분자 아형(CMS), 시료 유형, 종양 단계 및 해부학적 영역을 포함한 임상 데이터를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 비탈세포, 또는 탈세포된 환자 유래 ECM의 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과를 나타낸다. 도 3에서 사이즈바는 1cm(흰색) 또는 100μm(검은색)이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 비탈세포, 또는 탈세포된 환자 유래 ECM의 DNA 정량화 결과를 나타낸다. 도 4에서 ***: p < 0.001 이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 종래 연구와 본 연구에서 검출된 매트리솜 단백질의 정성적 비교를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 매트리솜의 범주별 주석이 있는 참조 샘플에서 검출된 단백질의 상대적 백분율 조성(RPC)을 나타낸다. 각 범주의 단백질 수는 괄호 안에 표시되었다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 범주별 RPC에서 강도가 가장 높은 상위 단백질 100개를 유전자 온톨로지 분석하여 세포 성분을 평가한 결과를 나타낸다. 도 7에서 막대 그래프는 단백질의 수를 나타내고, 점은 각 범주의 통계적 유의성이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 환자 유래 정상 및 종양 ECM의 매트리솜 집중된 프로테오믹 프로파일의 계층적 클러스터링 히트맵 및 막대 그래프 분석으로 표시되는 샘플 간의 모체 단백질 구성을 나타낸다. 계층적 클러스터링은 정상 그룹과 종양 그룹 사이의 명확한 구분과 종양 그룹 내 이질성을 보여주고, 각 시료 사이 및 정상/종양 상태의 평균 사이에 범주별 주석이 있는 모든 단백질의 RPC가 막대 그래프에 표시된다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 모든 시료의 PCA 플롯을 나타낸다. 종양 샘플의 복제본은 오리지날 샘플에 가깝게 플로팅되고, 더 밝은 색상으로 표시된다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 정상 및 종양 그룹의 단백질 분포를 나타낸다. 검출된 단백질은 RPC에 따라 순위가 매겨졌고, 막대 그래프는 각 그룹에서 가장 풍부한 20개의 매트리솜 단백질을 나타낸다. 각 샘플의 각 단백질의 RPC는 막대 그래프에서 점으로 표시되었다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 환자 유래 정상 ECM과 종양 ECM 매트리솜 간에 차별적으로 발현된 단백질(DEP)을 화산 플롯으로 나타낸 것이다. 도 11에서 붉은색 선은 log2(폴드 변경) > 0.5이고 조정된 p < 0.01인 DEP의 임계값을 나타내고, 28개의 종양 농축 DEP가 우측에 표시되며 110개의 정상 농축 DEP가 좌측에 표시된다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, DEP의 기능적 유전자 집합 분석을 나타낸다. 도 12에서 막대 그래프는 정상 강화 및 종양 강화 DEP의 통계적 유의성과 함께 가장 주석이 달린 함수를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 핵심 매트릭스 범주에 포함된 선택된 DEP의 히트맵을 나타낸다. 종양 그룹이 이질적인 매트리솜 구성을 가지고 있기 때문에, 종양에서 풍부한 DEP의 발현 패턴은 정상에서 풍부한 DEP와 비교하여 시료 간에 일관되지 않은 프로필을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, DEP의 세포 기원 분석을 나타낸다. 단일 세포 시퀀싱 데이터를 사용하여 세포 유형별 발현 패턴과 세포 유형 중 가장 높은 평균 발현 수준을 기반으로 DEP의 세포 기원을 결정하였다. 도 14에서 막대 그래프는 세포 유형별 숫자 및 비율과 함께 DEP의 세포 기원을 보여준다. 대부분의 DEP는 섬유아세포에서 유래하였다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른, 정상 및 종양 결장직장 조직에 대한 단일 세포 시퀀싱 결과의 tSNE 플롯을 나타낸다. 세포는 전사적(transcriptomic) 프로파일에 따라 클러스터링 되었고, 종양 관련 및 정상 관련 클러스터는 각 그룹의 메타 클러스터로 클러스터링 되었다. 차등적으로 발현된 매트리솜 유전자는 종양관련(TAM) 및 정상 대조군 관련 (NAM) 마커 유전자로 정의되었다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른, TAM 및 NAM의 단백질 및 전사체 발현을 나타낸다. TAM과 NAM은 프로테오믹(proteomic) 및 전사적(transcriptomic) 발현 데이터에 따라 정의되었다. 도 16에서 히트맵은 TAM과 NAM의 단백질 프로파일을 나타내고, 도트 플롯은 주요 발현 세포 유형을 가진 TAM 및 NAM의 전사 프로파일을 나타낸다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른, COL12A1-, THBS2- 및 HAPLN1-염색된 정상 및 종양 조직의 면역조직화학적 이미지를 나타낸다. 도 17에서 사이즈바는 50μm이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른, 각 조직에 대한 컨센서스 분자 아형(CMS)과 함께 TAM 및 NAM의 정규화된 발현 점수를 나타낸다. 도 18에서 좌측은 TAM 점수, 우측은 NAM 점수이고, 각 상자 내부의 검은 선은 각 그룹의 중간 점수이다. 통계적으로 유의미한 차이는 소문자로 표시하였다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른, 38개의 매트리솜 마커의 GSEA 플롯을 나타낸다. 농축 점수를 사용하여 29개의 CMS4 농축 마커를 식별하였다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른, 29개의 CMS4-풍부 마커 점수와 EMT 점수 또는 TGF-β 반응 점수 사이의 양의 상관관계를 산점도로 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른, 상위 선택된 10개 CMS4-특이적 매트리솜 마커의 발현 패턴, CMS4 확률, 및 10-마커 점수에 따라 TCGA 샘플로부터의 PFS를 나타낸다. 고발현 25% 그룹과 저발현 25% 그룹 사이의 p-값이 < 0.05인 10개의 임상적으로 유의한 마커가 선택되었다. CMS4 확률 및 10-마커 점수는 CMS4 분류자 R 패키지 및 ssGSEA를 사용하여 계산되었다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른, 상위 10개 마커의 발현 수준과 TCGA 샘플의 CMS4 확률 사이에 양의 상관관계를 히트맵으로 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른, 상위 10개 마커의 발현 수준과 TCGA 샘플의 CMS4 확률 사이에 양의 상관관계를 산점도로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 벌크 조직 시료의 공통 분자 아형(CMS), 시료 유형, 종양 단계 및 해부학적 영역을 포함한 임상 데이터를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 비탈세포, 또는 탈세포된 환자 유래 ECM의 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과를 나타낸다. 도 3에서 사이즈바는 1cm(흰색) 또는 100μm(검은색)이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 비탈세포, 또는 탈세포된 환자 유래 ECM의 DNA 정량화 결과를 나타낸다. 도 4에서 ***: p < 0.001 이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 종래 연구와 본 연구에서 검출된 매트리솜 단백질의 정성적 비교를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 매트리솜의 범주별 주석이 있는 참조 샘플에서 검출된 단백질의 상대적 백분율 조성(RPC)을 나타낸다. 각 범주의 단백질 수는 괄호 안에 표시되었다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 범주별 RPC에서 강도가 가장 높은 상위 단백질 100개를 유전자 온톨로지 분석하여 세포 성분을 평가한 결과를 나타낸다. 도 7에서 막대 그래프는 단백질의 수를 나타내고, 점은 각 범주의 통계적 유의성이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 환자 유래 정상 및 종양 ECM의 매트리솜 집중된 프로테오믹 프로파일의 계층적 클러스터링 히트맵 및 막대 그래프 분석으로 표시되는 샘플 간의 모체 단백질 구성을 나타낸다. 계층적 클러스터링은 정상 그룹과 종양 그룹 사이의 명확한 구분과 종양 그룹 내 이질성을 보여주고, 각 시료 사이 및 정상/종양 상태의 평균 사이에 범주별 주석이 있는 모든 단백질의 RPC가 막대 그래프에 표시된다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 모든 시료의 PCA 플롯을 나타낸다. 종양 샘플의 복제본은 오리지날 샘플에 가깝게 플로팅되고, 더 밝은 색상으로 표시된다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 정상 및 종양 그룹의 단백질 분포를 나타낸다. 검출된 단백질은 RPC에 따라 순위가 매겨졌고, 막대 그래프는 각 그룹에서 가장 풍부한 20개의 매트리솜 단백질을 나타낸다. 각 샘플의 각 단백질의 RPC는 막대 그래프에서 점으로 표시되었다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 환자 유래 정상 ECM과 종양 ECM 매트리솜 간에 차별적으로 발현된 단백질(DEP)을 화산 플롯으로 나타낸 것이다. 도 11에서 붉은색 선은 log2(폴드 변경) > 0.5이고 조정된 p < 0.01인 DEP의 임계값을 나타내고, 28개의 종양 농축 DEP가 우측에 표시되며 110개의 정상 농축 DEP가 좌측에 표시된다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, DEP의 기능적 유전자 집합 분석을 나타낸다. 도 12에서 막대 그래프는 정상 강화 및 종양 강화 DEP의 통계적 유의성과 함께 가장 주석이 달린 함수를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 핵심 매트릭스 범주에 포함된 선택된 DEP의 히트맵을 나타낸다. 종양 그룹이 이질적인 매트리솜 구성을 가지고 있기 때문에, 종양에서 풍부한 DEP의 발현 패턴은 정상에서 풍부한 DEP와 비교하여 시료 간에 일관되지 않은 프로필을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, DEP의 세포 기원 분석을 나타낸다. 단일 세포 시퀀싱 데이터를 사용하여 세포 유형별 발현 패턴과 세포 유형 중 가장 높은 평균 발현 수준을 기반으로 DEP의 세포 기원을 결정하였다. 도 14에서 막대 그래프는 세포 유형별 숫자 및 비율과 함께 DEP의 세포 기원을 보여준다. 대부분의 DEP는 섬유아세포에서 유래하였다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른, 정상 및 종양 결장직장 조직에 대한 단일 세포 시퀀싱 결과의 tSNE 플롯을 나타낸다. 세포는 전사적(transcriptomic) 프로파일에 따라 클러스터링 되었고, 종양 관련 및 정상 관련 클러스터는 각 그룹의 메타 클러스터로 클러스터링 되었다. 차등적으로 발현된 매트리솜 유전자는 종양관련(TAM) 및 정상 대조군 관련 (NAM) 마커 유전자로 정의되었다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른, TAM 및 NAM의 단백질 및 전사체 발현을 나타낸다. TAM과 NAM은 프로테오믹(proteomic) 및 전사적(transcriptomic) 발현 데이터에 따라 정의되었다. 도 16에서 히트맵은 TAM과 NAM의 단백질 프로파일을 나타내고, 도트 플롯은 주요 발현 세포 유형을 가진 TAM 및 NAM의 전사 프로파일을 나타낸다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른, COL12A1-, THBS2- 및 HAPLN1-염색된 정상 및 종양 조직의 면역조직화학적 이미지를 나타낸다. 도 17에서 사이즈바는 50μm이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른, 각 조직에 대한 컨센서스 분자 아형(CMS)과 함께 TAM 및 NAM의 정규화된 발현 점수를 나타낸다. 도 18에서 좌측은 TAM 점수, 우측은 NAM 점수이고, 각 상자 내부의 검은 선은 각 그룹의 중간 점수이다. 통계적으로 유의미한 차이는 소문자로 표시하였다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른, 38개의 매트리솜 마커의 GSEA 플롯을 나타낸다. 농축 점수를 사용하여 29개의 CMS4 농축 마커를 식별하였다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른, 29개의 CMS4-풍부 마커 점수와 EMT 점수 또는 TGF-β 반응 점수 사이의 양의 상관관계를 산점도로 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른, 상위 선택된 10개 CMS4-특이적 매트리솜 마커의 발현 패턴, CMS4 확률, 및 10-마커 점수에 따라 TCGA 샘플로부터의 PFS를 나타낸다. 고발현 25% 그룹과 저발현 25% 그룹 사이의 p-값이 < 0.05인 10개의 임상적으로 유의한 마커가 선택되었다. CMS4 확률 및 10-마커 점수는 CMS4 분류자 R 패키지 및 ssGSEA를 사용하여 계산되었다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른, 상위 10개 마커의 발현 수준과 TCGA 샘플의 CMS4 확률 사이에 양의 상관관계를 히트맵으로 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른, 상위 10개 마커의 발현 수준과 TCGA 샘플의 CMS4 확률 사이에 양의 상관관계를 산점도로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실험방법]
환자 및 조직 시료 수집
대장내시경 소견에 근거하여 대장암을 진단받은 환자로부터 조직을 수득하였다. 일부의 환자로부터는 대장암 조직과 매칭하여 정상 조직을 함께 수득하였다. 수술 직후 채취한 조직들은 즉시 전처리 후 냉동 보관되었다. 모든 환자 및 조직의 임상적 특성은 의료 기록과 인터뷰를 기반으로 기록되었다.
조직 탈세포화 과정
수집된 조직들은 1% (v/v) Triton X-100 (T8787; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 0.1% (v/v) ammonium hydroxide (221228; Sigma-Aldrich)가 포함된 증류수에서 탈세포화되었다. 구체적으로, 조직들은 작은 절편(3 x 3 x 3mm)으로 컷팅되었고, 탈세포와 용액에서 2시간 이상 처리되었다. 용액은 30분 간격으로 또는 불투명해질 때마다 교체하였다. 조직이 무색이 되면 Dulbecco's phosphate buffered-saline(Welgene, Gyeongsan, Korea)으로 2일 동안 세척하되, 용액을 1시간 간격으로 교체하였다. 그 후 조직을 증류수로 10분씩 4회 세척하여 잔류 용액을 제거하였다. 탈세포화는 70rpm 속도의 오비탈 쉐이커를 사용하여 실온에서 수행하였고, 탈세포화가 완료된 조직을 1일 동안 동결건조 후, -20°C에서 보관하였다. 이하, 탈세포화된 환자 유래의 조직을 pdECM(patient-derived ECM)으로 명명한다.
탈세포화 조직의 특성 확인
헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 천연 조직 및 탈세포화된 조직을 4% paraformaldehyde (Biosesang, 성남, 한국)에서 1일 동안 고정하고, Paraplast(Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)를 통해 파라핀 블록을 만든 후, 10μm 두께로 섹션하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. pdECM 시료의 DNA 함량은 DNA 추출 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 제조업체의 권장 사항에 따라 정량하였고, DNA 농도는 DS-11 Spectrophotometer(DeNovix, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 측정하였다.
S-Trap 단백질 분해
S-Trap™ mini(ProtiFi, Huntington, NY, USA) 키트를 사용하여 단백질 분해를 수행하였다. 구체적으로, 약 5mg의 탈세포화된 결장 조직을 5% sodium dodecyl sulfate 완충액과 혼합한 후 VCX 130(Sonics)으로 초음파 처리하였고, 이후 13,000g에서 10분 동안 원심분리하였다. 각 상층액을 1.5mL 튜브에 수집하여 20 mM dithiothreitol(최종 농도)과 함께 95°C에서 10분 동안 끓이고, 용액을 실온으로 냉각시킨 후 암실에서 30분 동안 40 mM iodoacetamide로 알킬화시켰다. 이어서, sodium dodecyl sulfate 용해물에 12% aqueous phosphoric acid (1:10 희석, 최종 산출 농도 1.2% 인산) 및 7배 부피의 결합 완충액(최종 농도 100mM 트리에틸암모늄을 갖는 90% 수성 메탄올, TEAB: pH 7.1)을 첨가하였다. 이를 부드럽게 혼합한 후, 단백질 용액을 S-Trap 필터에 넣고 3,000g에서 1분 동안 회전시킨 다음 통과액을 재필터하였다. 이 과정을 2회 반복하고 필터를 결합 완충액 400μL로 3회 세척한 후, 10μg의 trypsin(Promega) 및 125μL의 digestion buffer(50mM TEAB)를 필터에 1:25 w/w로 첨가하여 37°C에서 16시간 동안 분해하였다. 분해된 펩타이드를 용출하기 위해 각 펩타이드에 80μL의 완충액을 적용하였다. 이들 완충액은 50mM TEAB, 증류수에 용해된 0.2% formic acid, 및 증류수에 용해된 50% acetonitrile/0.2% formic acid를 포함한다. 마지막으로, Pierce™ Peptide Desalting Spin Column(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)의 프로토콜에 따라 펩타이드 용액을 풀링, 동결건조 및 탈염하였다.
TMT 11플렉스 라벨링
시료 간의 데이터를 비교하기 위해 8개의 정상 조직과 16개의 종양 조직에 대해 4개의 TMT11-플렉스 세트와 함께 다중화하였다. 여러 세트의 TMT11-플렉스에 대한 데이터 조합을 용이하게 하기 위해 풀링된 공통 컨트롤을 참조로 구성하였다. 대조군은 실험에 사용된 각 시료와 동일한 중량의 총 펩타이드로 구성하였고, 각 TMT11-plex는 8개의 각 개별 시료와 함께 0.5:1:2의 비율의 3개 분취량으로 구성하여, 제조업체의 지침(Thermo Fisher Scientific)에 따라 Pierce™ Quantitative Fluorometric Peptide Assay 키트를 사용하여 총 100μg의 탈염 펩타이드를 측정하였다. 구체적으로, 탈염 및 건조된 펩타이드를 TMT 11-plex 시약을 사용하여 100mM TEAB(100μL)로 재용해하고, 0.8 mg의 TMT reagent(41 μL)를 각 시료에 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 8 μL의 5% hydroxylamine(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 반응을 켄칭하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 라벨링된 시료(25-100μg)을 결합하고 건조하여 Pierce™ Peptide Desalting Spin Columns(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 탈염하였다. 이후 용출액을 건조하고 -80°C에서 보관하였다.
High pH 역상 분획
TMT-표지된 펩타이드는 바이너리 펌프, 오토샘플러, 탈기 장치, 가변파 검출기 및 분획 수집기로 구성된 Shimadzu HPLC 시스템을 사용하여 분획화하였다. High pH 역상 분획은 4.6 × 150mm Waters XBridge® BEH C18 컬럼(직경, 2.5μm)을 사용하여 수행하였다. 이동상 A는 100% 물에 5mM ammonium formate로 구성하였고, 이동상 B는 95% acetonitrile에 5mM ammonium formate로 구성하였다. 시료 분리는 하기의 선형 구배를 사용하였다: 15분 동안 5% B, 5분 동안 5%에서 15% B, 30분 동안 15%에서 40% B, 5분 동안 40% B, 4분 동안 95% B, 4분 동안 95% B, 1분 동안 95%에서 5% B, 추가 9분 동안 5% B. 시간 의존적 분획은 총 40개의 분획에 대해 21분에서 61분까지 수집하여, 최종 수율 약 1mL/분획을 산출하였다. 가변 파장 검출기는 214 nm에서 모니터링하였고, 수집된 40개의 분획을 혼합 분획법(예: 1과 21; 2와 22; 3과 23)으로 20개의 분획으로 제조하였다. 각 분획은 LC-MS/MS 분석을 위해 200 μL water/formic acid (99.9:0.1, v:v)로 용해하였다.
나노 LC-전기분무 이온화-MS/MS 분석
Orbitrap Eclipse™ Tribrid™ 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)와 결합된 나노 흐름 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC) 시스템(UltiMate 3000 RSLCnano System, Thermo Fisher Scientific)을 프로테옴 분석에 사용하였다. 45°C에서 작동되는 EASY-Spray PepMap™ RSLC C18 컬럼 ES803A(2μm, 100A, 75μm × 50cm; Thermo Fisher Scientific)에서 이동상 A 및 이동상 B로 분획화된 펩타이드를 주입하고 분리하였다. 전기 분무 이온화 전압은 1800-1900V, 이온 전달 튜브 온도는 275°C로 설정하였다.
UHPLC-MS/MS 데이터는 MS2 스캔 수를 최대화하기 위해 3초의 주기로 전체 시간 동안 데이터 종속 최고 속도 모드를 사용하여 수집하였다. 전체 스캔(MS1)은 400-2000m/z의 질량 범위에서 120K의 해상도로 Orbitrap 분석기를 사용하여 감지하였고, 자동 이득 제어 대상 모드는 "표준", 최대 주입 시간 모드는 "자동", 충전 상태는 2-6으로 설정하였으며, 동적 제외 창은 30초로 설정하였다. 두 번째 스캔(MS2)은 고에너지 C-트랩 해리(HCD) 모드로 분석하였다. HCD 스펙트럼은 등압 표지된 펩타이드에 대해 37% 고정 충돌 에너지로 30K의 분해능에서 Orbitrap 분석기를 사용하여 검출하였고, 최대 사출 시간 모드는 "자동", 격리 창은 0.7, 자동 이득 제어 대상 모드는 "표준", 첫 번째 질량은 110으로 고정, 모드는 Turbo TMT로 설정하였다.
데이터 처리
프로테오믹스 분석을 위해 raw 파일은 RawConverter(The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 MS(.ms1) 및 MS2(.ms2) 파일로 변환하였고, 프로테옴 검색 및 데이터베이스 생성은 IP2(질량 분석 데이터 분석을 위한 통합 플랫폼, Bruker)를 사용하였다. 프로테옴 결과는 ProLuCID, DTASelect2 및 Census를 사용하여 분석하되, 분석을 위한 데이터베이스는 UniProt 인간 프로테옴 데이터베이스(20,645개 항목, 2020년 1월 1일 업데이트됨)를 사용하였다. 여기에는 하기의 IP2 매개변수를 사용하였다: 전구체 및 조각 질량 허용 오차, 50ppm; 효소, 트립신; 잘못된 분열, ≤ 2; 정적 변형, 시스테인에 추가된 57.0215 Da, 라이신 및 N-말단에 추가된 229.1629 Da; 차등 변형, 메티오닌에 15.9949 Da 첨가; 및 단백질당 최소 펩타이드 수 2. 20개 분획 모두의 풀링된 스펙트럼 파일을 동일한 매개변수를 사용하여 정상 데이터베이스와 역 데이터베이스로 비교하였다. 펩타이드 검증의 경우 위양성률은 스펙트럼 수준의 0.01이었다. TMT 리포터 이온 분석은 질량 허용 오차가 20ppm인 CPTAC 데이터 포털의 Census 소프트웨어를 사용하였다(https://cptac-data-portal.georgetown.edu/study-summary/S037).
풀링된 내부 표준을 사용하여 스펙트럼 정량 정확도 향상
3개의 TMT 채널을 모든 시료에서 동일한 양의 풀링된 펩타이드를 나타내는 풀링된 공통 컨트롤과 함께 내부 참조로 사용하였다. 이러한 방법을 통해 정량적 정확도를 향상시키면서 배치 내 및 배치 간 분산을 평가할 수 있었다. 풀링된 일반 대조군은 0.5:1:2의 비율로 TMT 130N, 131C 및 131N 시약으로 표지하였고, 참조 채널로 사용하였다. 프로테오믹 분석에서 측정된 모든 펩타이드에 대한 3개의 참조 채널(log2 TMT 채널 131N/131C, 131C/130N 및 131N/130N)의 log2 비율은 중심 극한 정리를 사용하여 약 1의 값(131N/131C), 약 1의 값(131C/130N), 및 약 2의 값(131N/130N)을 갖는 표준 가우시안(standard Gaussian) 분포에 매칭될 것으로 예상되었다. 이 방법은 기술 복제의 변형을 평가하는 데 사용될 수 있고, Perseus가 제공하는 다차원적 의미를 기반으로 필터링 기준을 구현할 수 있다. 벤자민-호흐버그(Benjamini-Hochberg) 거짓 발견율은 임계값 0.05 설정의 기준이 되었다. 상기 열거한 기준으로 이상값 스펙트럼을 필터링하여 정량적 정확도를 향상시켰다.
단백질 풍부도의 정상화
시료 처리 및 실험실 환경의 차이로 인해 단백질 풍부도의 정량화에 시료별 편향이 있을 수있으므로, 이러한 위험을 제거하기 위해 log2-변환된 펩타이드 풍부도의 중앙값을 계산하고, 중앙값에서 열 값을 빼 공통 중앙값을 0으로 설정하였다. 이후 중앙값의 평균을 계산하여 0 중심 열에 다시 추가하고, y = 2 ^ (x)를 사용하여 다시 중심 값을 변환시켰다. 또한 시료 간 강도 정규화를 위해, 각 시료에 포함된 단백질의 강도 값을 R2 컬럼의 원래 강도 값으로 나누어 각 단백질의 상대적 강도 값을 계산하였고, 이를 다른 시료의 기준으로 사용하였다. 이후 R2 컬럼의 평균 정규화 강도 값에 각 단백질의 상대 강도 값을 곱하여 최종 정규화 강도 값을 계산하였다. 정규화된 값은 y = 2 ^ (x) 함수를 사용하여 변환하였고, 변환된 풍부화 값을 추가 프로테옴 분석에 사용하였다.
TMT 프로테오믹스에 대한 통계 분석
TMT 기반 프로테오믹스 데이터는 계층적 클러스터링, PCA 및 DEP 분석을 수행하는 데 사용되었다. 계층적 클러스터링을 위해 정규화된 강도 값을 Perseus 소프트웨어의 유클리드 거리를 기반으로 매트리솜 단백질 데이터로 스케일링, 및 클러스터링하였다. PCA의 경우에는 매트리솜 단백질의 정규화된 강도 값만 사용하였고, 종양과 정상 조직 사이의 차별적으로 발현된 단백질(DEP; differentially expressed protein)은 Benjamini-Hochberg 보정과 함께 Welch의 t-테스트를 사용하여 결정하였다. 궁극적으로 DEP는 foldchange > √2 및 조정된 p < 0.01가 선택되었다. DEP의 GSEA는 Metascape에서 제공한 유전자 세트를 사용하여 수행하였고, p-값은 풍부한 유전자를 식별하는 데 사용하였다.
scRNA-Seq 및 데이터 분석
대장암 조직의 scRNA-Seq 분석을 위해, 삼성 메디컬 센터 코호트의 단세포 대장암 분리물을 수집하고 제조업체의 지침에 따라 바코드 시퀀싱 라이브러리를 생성하였다. 6개의 전체 세포 유형(상피, 간질, B, T, 골수 및 비만)과 25개의 세부 유형을 추가 분석에 사용하였고, 정상 섬유아세포와 종양 섬유아세포는 분석된 단일 세포에 대한 조직 공급원을 기반으로 정의하였다.
DEP의 세포 기원은 세포 유형의 평균 발현 수준을 사용하여 확인하였다. Seurat 패키지의 FindAllMarkers 기능을 사용하여 세포 유형별 유전자를 정의하고, 조정된 p < 0.01을 임계값으로 사용하여 유전자 발현이 세포 유형별인지 여부를 결정하였다. 세포 유형별 평균 발현 수준은 Seurat 패키지의 AverageExpression 기능을 사용하여 결정하되, 평균 발현 수준이 가장 높은 세포 유형을 유전자의 세포 기원으로 간주하였다.
TAM 및 NAM의 정의를 위해서는 이전에 섬유아세포 세포 유형으로 주석이 달린 섬유아세포만 사용하되, 유전자 발현 패턴을 하기 방법으로 클러스터링하였다. ① 모든 매트리솜 유전자를 특징으로 하는 Seurat 패키지의 RunPCA 기능을 사용하여 선형 차원 축소를 수행 ② 매개변수 dims = 1:20과 함께 Seurat 패키지의 FindNeighbors 기능을 사용하여 정규화 및 클러스터링 ③ Seurat 패키지의 FindClusters 함수를 매개변수 resolution = 0.5로 사용 ④ Seurat 패키지의 RunTSNE 함수를 사용하여 dims = 1:20 매개변수를 사용하여 차원 공간에서 섬유아세포를 플로팅. 이후, 특정 조건이 우세한 클러스터(즉, 정상 대 종양)(클러스터 내 세포 90% 이상이 동일한 조건을 가짐)와 2명 이상의 환자로부터 수득된 세포로 구성된 클러스터를 메타클러스터로 다시 클러스터링하였다(도 15; 클러스터 0, 3, 7: 종양섬유아세포 메타클러스터, 클러스터 1, 2, 4, 5, 6: 정상-섬유아세포 메타클러스터). 두 메타클러스터 사이의 종양 관련 및 정상 관련 마커 유전자는 p < 0.01로 조정된 Seurat의 FindMarkers 기능을 사용하여 정의하였고, 종양 관련 매트리솜(TAM; tumor-associated 매트리솜) 및 정상 관련 매트리솜(NAM; normal-associated 매트리솜)는 정상 그룹과 종양 그룹 사이의 평균 단백질 강도의 배수 변화를 계산하여 정의하였다. TAM 마커 유전자 중 종양군에서 단백질의 평균 강도가 높을수록 해당 단백질을 TAM에 포함시켰다. 유사하게, NAM 마커 유전자 중 단백질의 평균 강도가 정상 그룹에서 더 높을 때 단백질이 NAM에 포함되었다.
벌크 조직 RNA-Seq 및 생물정보학 분석
수집된 대장암 조직은 벌크 조직 RNA-Seq를 위해 TRIzol 시약 처리하였고, 인덱싱된 cDNA 시퀀싱 라이브러리는 TruSeq Stranded mRNA LT 시료 준비 키트를 사용하여 RNA 시료로 준비하였다. RNA 무결성 수 및 rRNA 비율의 품질 관리 분석은 2200 TapeStation으로 수행하였다. 인덱싱된 라이브러리는 등몰(equimolar)의 풀로 준비하였으며, NovaSeq 6000에서 시퀀싱하여 시료 라이브러리당 최소 6천만 쌍의 읽기를 생성하였다. 원시 Illumina 시퀀스 데이터는 역다중화하여 fastq 파일로 변환하였고, 어댑터와 저품질 시퀀스를 제거한 후, mRNA 시퀀싱 리드를 HISAT2(버전 2.1.0)로 Genome Reference Consortium의 Homo sapiens 게놈 어셈블리 GRCh37에 매핑하였다. 매핑된 리드는 StringTie(버전 2.1.3b)를 사용하여 알려진 유전자의 백만 개의 매핑된 리드(TPM; transcripts per million mapped reads)당 전사물과 같은 리드 수 및 시료 정규화 값으로 정량화하였다. TCGA, COAD 및 READ 유전자 발현 데이터 세트와 TCGAbiolinks 패키지의 임상 데이터 세트는 CMS 특정 유전자 발현 패턴 분석을 위해 수집하였고, 유전자 발현 정보가 Illumina 플랫폼에서 다운로드된 후 원시 카운트가 정규화된 데이터로 변환하여, TPM 값 및 임상 정보(예: days_to_last_follow_up, death_days_to 및 new_tumor_event 매개변수)를 PFS 분석에 사용하였다. 총 612개의 종양 시료와 51개의 정상 시료를 분석하였다. CMS 분류를 위해 CMSclassifier 패키지를 사용하여 수집된 대장암 조직 및 TCGA 시료의 CMS를 식별하였고, 유전자 발현 값은 TPM 데이터의 log2 변환 후 사용하였으며, 가장 가까운 0.001로 합산하였다. NearestCMS 값과 CMS4 확률은 랜덤 포레스트 알고리즘을 사용하여 계산하였고, 할당된 하위 유형이 단일 하위 유형을 구성하지 않는 모호한 CMS 분류가 있는 시료는 추가 분석에서 제외하였다. CMS4에 풍부한 매트리솜 유전자를 확인하기 위해 TCGA 시료의 정규화된 TPM 데이터를 GSEA에 적용하였다. TAM 또는 NAM으로 정의된 총 38개의 매트리솜 마커를 유전자 세트로 사용하였고, GSEA에서 파생된 농축 점수를 기반으로 핵심 농축 유전자는 CMS4 농축 TAM/NAM 마커로 정의하였다. 각 TCGA 시료에서 특정 유전자 세트의 발현 패턴은 ssGSEA를 사용하여 평가하였다. CMS로 분류된 TCGA 시료의 정규화된 TPM 데이터를 전처리하고, EMT와 관련된 유전자 세트(MSigDB M5930)와 섬유아세포의 TGFβ 반응(PMID의 유전자 세트: 23153532)에 대한 ssGSEA 점수, 및 GSEA의 29개 CMS4 강화 TAM/NAM 분자와 10개 마커로 구성된 맞춤형 유전자 세트 GenePattern 웹 기반 도구의 ssGSEAprojection 패키지를 사용하여 임상적으로 유의한 값을 계산하였다. 계산된 점수는 ssGSEA 점수 사이의 상관 관계를 결정하기 위해 log2 변환 및 정규화하였다.
조직 면역조직화학(IHC)
조직 면역조직화학 연구는 4-nm 포르말린-고정 파라핀 임베디드(FFPE) 종양 조직 슬라이드 섹션에서 수행되었다. 슬라이드는 자일렌 기판과 순수 알코올에서 탈파라핀화된 후, 물로 끝나는 감소하는 알코올 구배에서 다시 수화되었다. 10mM sodium citrate buffer(pH 6.0)에 담긴 슬라이드를 마이크로파 오븐 안에서 10분간 가열한 후 내인성 과산화효소 활성을 30분간 차단하여 메탄올에 녹은 3% 과산화수소를 이용해 항원 회수를 수행하였다. TBS에서 헹군 후, 5% BSA(HAPLN1의 경우) 또는 10% BSA(COL12A1, THBS2의 경우)에서 30분간 배양하여 잠재적인 비특이성 반응을 차단하였고, HAPLN1(goat antihuman polyclonal Ab, 1:400 희석, Biotechne, MN, USA), COL12A1(rabbit antihuman polyclonal Ab, 1:200 희석, Sigma-Aldrich, MA, USA) 또는 THBS2(mouse antihuman monoclonal Ab, 1: 1000, Invitrogen, MA, USA)에 대한 1차 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 슬라이드를 TBS로 세척한 후, TBS에 1:200을 희석한 Vectastain ABC kit(Vector Laboratories, CA, USA)를 사용하여 적절한 2차 항체로 30분간 배양하고 DAB 용액(Dako, CA, USA)을 사용하여 검출하였다. 단면은 헤마톡실린으로 역염색하고, 농도가 증가하는 에탄올로 탈수하고, 커버슬립 아래 synthetic mountant(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)로 마운트했다.
[실험결과]
환자 유래 탈세포화 조직의 정량적 단백질체 분석
대장암(CRC; Colorectal cancer)에서 ECM 단백질의 구성을 조사하기 위해, 인간 종양 조직을 탈세포하여 ECM 단백질을 풍부하게 하였다. 본 발명에서 대장암 조직을 탈세포하고 분석하는 일련의 과정을 모식도로 나타내었다(도 1). 구체적으로, 22명의 대장암 환자로부터 외과적으로 종양 조직, 및 인접된 정상 조직을 수득하였고, 각 환자에 대한 임상 데이터, 종양 단계, 위치 및 컨센서스 분자 아형(CMS)을 요약하였다(도 2). 탈세포된 조직을 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색하였고(도 3), DNA 정량화하여 ECM 단백질의 농축을 확인하였다(도 4). 상기 결과로부터 탈세포화가 핵의 상당한 손실, 및 게놈 DNA의 감소를 유발하나, ECM 구조를 보존한다는 것을 확인하였다. 정상 및 종양 조직 ECM 시료의 프로테오믹스 비교를 위해 동중 탠덤 질량 태그(TMT)에 대한 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)/MS 분석을 수행하였다. 총 24개의 건조 질량을 일치시킨 환자 유래 ECM(pdECM) 시료를 정상 및 종양 조직으로 구분하여 TMT-11plex 분석으로 단백질의 배수 변화를 계산한 결과, 전체적으로 한 세트의 모든 시료에서 "NA" 값이 없는 6,323개의 단백질이 확인되었다. 인간 매트리솜 데이터베이스(Human matrisome Database)에 따르면, 이들 단백질 중 407개는 매트리솜 단백질(콜라겐[COLs], 프로테오글리칸[PGs] 및 ECM 당단백질[GPs]) 및 매트리솜 관련 단백질이었다. 또한, 166개의 핵심 매트리솜 단백질 중 145개와 241개의 매트리솜 관련 단백질 중 182개가 종양 시료가 있는 적어도 모든 세트와 정상 시료가 있는 모든 세트에서 검출되었다. 이를 종래 연구 결과(Vasaikar, S. et al. Proteogenomic analysis of human colon cancer reveals new therapeutic opportunities. Cell 177, 1035-1049. e1019 (2019), 및 Naba, A. et al. Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver. BMC cancer 14, 1-12 (2014))와 비교하면, 두 종래 연구에서는 98개의 핵심 매트리솜 단백질과 79개의 매트리솜 관련 단백질이 검출된 반면, 본 연구에서는 47개의 핵심 매트리솜 단백질과 103개의 매트리솜 관련 단백질만이 검출되었다(도 5). 주목할 것은 FBN3(fibrillin 3), NID2(nidogen 2), ABI3BP(ABI family member 3 binding protein), LAMA3(laminin subunit alpha 3) 및 THBS1(thrombospondin 1)을 포함한 기타 ECM 당단백질이 본 연구인 TMT 기반 플랫폼에서만 검출되었다는 것이다. 이러한 당단백질은 정상 결장 및 종양 시료의 ECM에 보편적으로 존재하는 것이므로, 상기 결과는 ECM이 풍부한 대장암 조직의 TMT 기반 정량적 프로테오믹스 분석이 인간 결장 매트리솜의 가장 큰 데이터 세트를 제공할 수 있음을 시사한다. 또한 기본 조직 프로테오믹스 데이터와 비교하여 핵심 및 관련 매트리솜 구성 요소는 농축의 이점이 있다. 특히, 주로 불용성이고 가교결합된 14개의 핵심 매트리솜 단백질은 본 연구의 플랫폼에서만 검출되었다. pdECM 시료에서 검출된 매트리솜 단백질의 네이티브 조직에 대한 상대적 백분율 조성(RPC)을 조사하기 위해 각 단백질 강도를 모든 단백질 강도의 총합으로 나누어 각 단백질의 RPC를 계산하고 백분율로 표시하였다. 매트리솜 각 범주의 RPC는 각 범주의 매트리솜에 해당하는 단백질의 모든 RPC를 합산하여 결정하였다. 그 결과, 매트리솜 단백질의 총 RPC는 탈세포되지 않은 기본 조직보다 탈세포된 조직 시료에서 실질적으로 더 높게 나타났다(도 6). COL, GP 및 PG를 포함하는 코어 매트리솜의 RPC는 58.67%에 해당하였으며, 이는 천연 조직의 RPC(8.92%)보다 거의 7배 더 높은 것이었다. 또한, 비매트리솜 단백질의 RPC는 다른 탈세포화 연구에서 측정된 RPC(32-41%)와 일치하였다. 연결된 세포 구성 요소를 식별하기 위해 강도가 가장 높은 상위 100개 단백질에 대한 Gene Ontology(GO) 분석을 수행한 결과, ECM 관련 단백질은 pdECM이 풍부한 것으로 나타났지만 핵 및 세포내 단백질은 그렇지 않았다. 대조적으로, 세포질 및 핵 단백질은 탈세포되지 않은 조직에서 더 풍부한 것으로 나타났다(도 7). 이러한 결과는 본 연구의 ECM-단백질 강화 접근법이 LC-MS/MS에 의한 매트리솜 구성 요소의 상세한 식별을 가능하게 함을 시사한다.
정상 및 종양 조직의 pdECM 시료에 대한 정량적 ECM 프로테오믹스 분석
정상 및 종양 조직의 pdECM 시료에서 매트리솜 구성 요소를 조사하기 위해 정량적 프로테옴 프로파일을 비교한 결과, 정상 조직과 종양 조직 모두에서 255개의 매트리솜 단백질 중 123개가 코어 매트리솜 단백질로 확인되었다. 매트리솜 프로필을 사용한 계층적 클러스터링은 여러 환자에 걸쳐 모든 정상 시료와 함께 클러스터링되었고, 유사한 프로테오믹 발현 패턴을 나타내었다. 그러나 종양 시료의 매트리솜은 매우 이질적이었고 정상 시료와 크게 달랐다. GP의 RPC는 종양 조직에서 크게 증가하였고, 또한 종양 조직에서 매트리솜 관련 단백질 및 분비 인자의 RPC가 증가하였다. 반대로 COL의 RPC는 27.8%로 크게 감소하였다. 콜라겐의 전반적인 변화와 일치하여 PG의 RPC는 12.3%에서 3.5%로 감소하였지만, 일부 단백질은 정상 시료보다 종양 시료에서 더 높은 수준을 보였다(도 8). 주성분 분석(PCA)에서는 정상군과 종양군 사이에 차이가 있었지만 정상 시료 간에는 차이가 없었다. 대조적으로, PCA는 종양 시료 사이에서 더 큰 거리를 보였다. 복제 시료는 PCA 플롯에서 서로 가까이 위치하여 프로테오믹스 분석의 재현성을 확인해 주었다. 정상 시료와 종양 시료 사이의 계산된 거리 계수는 정상 조직이 일반적으로 유사하고, 종양 조직이 일반적으로 이질적임을 나타낸다(도 9). 일부 시료는 화학 요법, 천공 또는 스텐트 삽입(SEV01T: 천공; SEV04T: 화학 요법; SEV09N: 스텐트 삽입)과 같은 ECM 구성에 영향을 줄 수 있는 요인으로 인해 분석에서 제외하였다. 제외된 시료는 다른 시료와 구별되는 단백질 발현 패턴을 나타냈으므로, 계층적 클러스터링과 PCA로 분석하였다. 상기 결과는 ECM 구성이 각 임상 시료의 병리학적 및 조직학적 특징과 연관되어 있음을 나타낸다. 다음으로 정상 조직과 종양 조직의 pdECM 시료에서 풍부한 단백질을 비교하였다. 각 조건(정상/종양)의 각 단백질의 RPC에 따라 검출된 단백질의 순위를 매기고 비교한 결과는 855 중 81개의 단백질 구성 요소가 각각 정상 및 종양 조직의 pdECM 시료에서 RPC의 90%를 커버한다는 것을 보여준다(도 10). 이 결과는 정상 조직의 단백질 성분이 종양 조직의 단백질 성분에 비해 시료 간에 더 균일하게 분포되어 있음을 나타낸다. 두 그룹의 각 매트릭스에서 가장 풍부한 상위 6개 단백질은 비슷한 구성과 풍부함을 나타내었다. 그러나 가장 높은 강도를 가진 상위 20개의 매트리솜 단백질은 정상 조직과 종양 조직 간에 차이가 있었으며, 이는 대장암 조직의 매트리솜에 대한 이전 연구와 일치한다. 20개의 단백질 중 13개는 정상 조직과 종양 조직 모두에서 높게 발현되었고, 가장 상위에 랭크된 6개의 단백질은 정상 조직과 종양 조직 모두에서 COL6A1/2/3, COL1A1/2 및 FBN1에 의해 암호화된 단백질이었다. 또한 3개의 VI형 COL(COL6A1, COL6A2 및 COL6A3에 의해 암호화됨) 및 2개의 I형 COL(COL1A1 및 COL1A2에 의해 암호화됨)이 정상(55.6%) 및 종양(31.8%) 조직에서 인간 결장 ECM의 상당 부분을 구성하는 것으로 나타났다. 콜라겐 섬유 조립 및 안정성의 조절에 관여하는 DCN(Decorin) 및 LUM(Lumican)도 정상 조직과 종양 조직 모두에서 풍부한 것으로 나타났으나, 그들의 수준은 종양 조직보다 정상 조직에서 훨씬 더 높았다. 피브리노겐 계열(FGA, FGB 및 FGG), FN1(Fibronectin 1), 변형 성장 인자 베타 유도 단백질TGFβI(transforming growth factor-beta I) 및 TNC(Tenascin C)와 같은 GP는 종양 조직에서 증가된 존재를 보였다. 특히, COL 및 PG의 발현 프로파일은 2개의 MMPs(matrix metalloproteinase; MMP9 및 MMP14) 및 2개의 ADAMs(A Disintegrin And Metalloprotease; ADAM9 및 ADAM10)를 포함하는 금속단백분해효소의 메친신 계열의 수준과 반비례 관계가 있었다. 이러한 금속단백분해효소는 ECM 성분의 단백질 분해를 포함하는 ECM 리모델링에서 중요한 역할을 한다. 따라서 본 연구는 ECM의 주요 성분을 확인하고 대장암 조직에서 ECM의 풍부함과 구성에 상당한 변화를 추적하는데 의의가 있다.
정상 및 종양 조직의 pdECM 시료에서 차별적으로 발현된 매트리솜 단백질
ECM 미세 환경의 조성 변화를 확인하기 위해 정상 조직과 종양 조직의 매트리솜을 차별적으로 발현된 단백질(DEP) 분석으로 비교하였다. 각 단백질에 대해 Welch의 t-테스트에 따라 조정된 p-값과 함께 정상 조직과 종양 조직 간의 배수 변화를 계산하여, 매트리솜 DEP를 화산 플롯으로 요약하였다(도 11). 그 결과, 110개 및 28개의 매트리솜 단백질이 각각 정상 및 종양 조직의 pdECM 시료에서 농축되었다. 기능적 유전자 집합 분석은 섬유아세포 활성화와 관련된 주요 생물학적 용어인 상처 치유 및 ECM 분해를 나타내었다(도 12). 선택된 핵심 매트리솜 단백질의 히트맵은 정상 및 종양 조직에서 상당히 상향 조절된 단백질을 나타낸다(도 13). 총 32개의 코어 매트리솜 단백질이 선택되었는데, 여기에는 모든 종양 농축 단백질, p-값이 가장 낮은 정상 농축 COL 3개, -log10(p-값) > 7인 매트리솜 단백질이 포함된다. 그러나 종양에 풍부한 DEP 중에서 COL12A1(Collagen Type XII Alpha 1 Chain)을 제외하고 GP 그룹 단백질은 단백질 풍부도의 상당한 차이가 있었다. 본 연구의 프로테오믹스 데이터와 일치하여 COL12A1은 대장암을 포함한 다양한 암에서 상향조절 되었고, 종양에 풍부한 GP 중에서 MXRA5(matrix-remodeling associated protein 5)가 가장 큰 통계적 유의성을 나타냈다(p = 7.13 × 10-6). 상기 결과는 MXRA5가 대장암 조직에서 비정상적으로 발현된 이전 연구의 결과와 일치한다. 또한 여러 COL, GP 및 PG가 정상 조직에 풍부하게 존재하였다. 특히, SLRP(small leucine repeat proteoglycans) 계열(예: DCN, LUM, ASPN 및 OGN)의 PG는 정상 ECM에서 가장 크게 농축되었다. 종양 조직에서 단백질분해효소(즉, MMP 및 ADAMTS)의 상향 조절은 프로테아제 소화가 병태생리학적 조건에서 세포외 SLRP의 고갈을 유도할 수 있음을 뒷받침한다. 또한 SLRP(small leucine rich repeat proteins)는 피브릴 조직 및 안정성을 조절하기 때문에, SLRP 고갈은 COL 네트워크 안정성을 방해하고 대장암에서 COL 저하를 가속화하여 ECM 기능 장애를 유발한다. 다음으로 대장암 미세 환경에서 간질 중심 리모델링을 확인하기 위해 매트리솜 단백질의 세포 기원을 평가하였다. 이를 위해 대장암 조직의 공개 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-Seq) 데이터를 재분석하여 매트리솜 단백질의 세포 기원을 조사하였다. 개별 DEP는 DEP를 암호화하는 유전자가 특정 세포 하위 유형에서 유의미하게 차별적으로 발현될 때 "특정 세포 유래"로 간주되었다(p < 0.01로 조정됨). 정상 유래 섬유아세포, 종양 유래 섬유아세포, 기타 간질 세포, 상피 세포, 골수 세포, 비만 세포, 및 T 세포를 포함한 7가지 세포 아형 내에서 가장 현저하게 발현된 아형을 기반으로 138개의 DEP의 세포 기원을 지정하여 분석한 결과, 138개의 DEP 중 99개의 매트리솜 단백질이 특정 세포 유래 단백질로 간주되었다(도 14). 정상 강화 및 종양 강화 DEP 중에서 각각 47개 및 19개의 매트리솜 단백질이 섬유아세포 유래였고, 이에 비해 LAMA3(Laminin Subunit Alpha 3), LAMB3(Laminin Subunit Beta 3), LAMC2(Laminin Subunit Gamma 2), SLPI(Secretory Leukocyte Peptidase Inhibitor), SEMA3B(Semaphorin 3B), MUC5B(Mucin 5B), 및 PLXNB2(Plexin B2)의 7개의 단백질만이 상피 세포에서 파생되었다. 단백질 수준이 유전자 전사 수준과 일관되게 상관되지는 않았지만, 대부분의 종양 농축 DEP는 종양 조직 유래 섬유아세포에 해당하여 암 관련 섬유아세포(CAF)가 TME에서 ECM 리모델링의 주요 결정 요인이라는 개념을 뒷받침하였다. 따라서 이후에는 대장암에서 ECM 중심 미세 환경 리모델링에 대한 포괄적인 이해를 달성하기 위해 종양 ECM과 관련된 섬유아세포의 분자적 특징을 더 연구하였다.
정상 관련 및 종양 관련 매트리솜 단백질 식별을 위한 통합 오믹스 분석
대장암에서 ECM 리모델링에 대한 섬유아세포의 기능적 기여도를 탐색하기 위해 공개된 scRNA-Seq 데이터 세트를 기반으로 3,462개의 섬유아세포를 재분석하였다. 정상 및 종양 메타 클러스터를 각각 정상 유래 및 종양 조직 유래 섬유 아세포로 정의하였고, 각 메타 클러스터에서 차별적으로 발현되는 유전자(정상 조직의 45 개 유전자 및 종양 조직의 33 개 유전자)를 확인하고, 프로테오믹스 데이터 세트를 사용하여 단백질 수준에서 이러한 분자를 분석하였다(도 15). 그 결과, 종양에서 상향 조절된 45개의 매트리솜 유전자에 의해 암호화된 단백질 중에서 18개는 종양 조직 유래 매트리솜 마커가 풍부하였고, 정상 조직에서 상향 조절된 33개의 매트리솜 유전자에 의해 암호화된 단백질 중 20개는 정상 조직 유래 매트리솜 마커가 풍부하였다. 이는 18개의 종양 관련 매트리솜(TAM) 단백질과 20개의 정상 관련 매트리솜(NAM) 단백질을 대장암의 ECM 마커로 정의할 수 있음을 나타낸다(도 16). 프로테오믹스 데이터에서 정량화할 수 있는 38개의 매트리솜 단백질 중 SPARCL1(SPARC-like protein-1)을 제외한 대부분의 NAM은 정상 조직에서 상향 조절되었다. 대조적으로, TAM 단백질은 종양 시료에서 불균일한 상향조절된 발현을 나타내었다. scRNA-Seq 데이터의 도트 플롯 분석은 대부분의 TAM 및 NAM 단백질이 각각 종양 유래 및 정상 유래 섬유아세포와 연관되어 있음을 보여주었다. 특히, SPARCL1은 단백질 수준에서 환자 특이적 발현을 나타내었고, 다른 간질 세포에서는 전사 수준에서 풍부한 발현을 나타내었지만, 정상 유래 섬유아세포에서는 그렇지 않았다. 이 결과는 SPARCL1이 인간 대장암 조직의 내피 세포에 의해 우선적으로 발현된다는 이전 연구 결과와 일치한다. TAM 단백질 중 COL12A1(Collagen Type XII Alpha 1 Chain), CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), THBS2(Thrombospondin 2), MMP14(Matrix metalloproteinase-14) 및 PLOD2(Procollagen-Lysine,2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2)는 종양 유래 섬유아세포 특이 단백질이었다. 종양 유래 섬유아세포의 70% 이상이 다른 간질 세포와 비교하여 유전자 전사의 상향 조절을 나타냈으며, 이는 대장암 조직의 TAM 단백질이 주로 CAF에 의해 생성됨을 나타낸다. TAM과 NAM 중에서 조직 위치 확인을 위해 COL12A1(Collagen Type XII Alpha 1 Chain), THBS2(Thrombospondin 2), HAPLN1(Hyaluronan And Proteoglycan Link Protein 1)의 세 가지 단백질을 선택하였다. scRNA-Seq 데이터는 이러한 단백질이 주로 섬유아세포에 의해 발현됨을 나타낸다. 면역조직화학 염색 결과는 프로테오믹스 분석과 유사한 결과를 보여주었다(도 17). 정상 점막은 COL12A1 및 THBS2의 약한 염색을 나타내었고, 반대로 종양 조직은 이들 단백질의 강한 염색을 나타내었으나, 염색은 거의 독점적으로 간질 세포에 국한되었다. 또한 HAPLN1 염색은 정상점막의 기질에서만 관찰되었으며, 대부분의 상피세포에서는 HAPLN1 염색이 나타나지 않았다. HAPLN1은 다른 ECM 단백질을 안정화하여 ECM 무결성을 유지하는 ECM 단백질이다. 사이 결과는 HAPLN1이 대장암에서 감소된 단백질 발현을 보인다는 이전 보고서와 일치하는데, 이는 아마도 대장암에서 HAPLN1의 손실이 섬유아세포 개조(예: HAPLN1 발현 정상 섬유아세포의 손실)로 인한 결과이기 때문일 것으로 보인다. 따라서 본 연구는 섬유아세포의 전사체적(transcriptomic) 특징이 종양성 ECM 미세 환경의 구성 리모델링을 반영한다는 것을 시사한다.
CMS4-특이적 정상/종양 관련 매트리솜 마커 및 임상적 관련성
최근 대장암에서 ECM 미세 환경의 중요성을 강조하기 위한 전사 프로파일 기반 분자 아형(CMS) 분류법이 개발되었다. CMS는 4개의 대장암 하위 유형을 설명하며, 그 중 중간엽 하위 유형인 CMS4 그룹은 광범위한 간질 침윤(대부분 활성화된 섬유아세포) 및 ECM 구성을 특징으로 하므로, CMS 분류 중 가장 난치성이고 예후가 나쁘다. 최근 연구에 따르면 대장암의 CAF는 뚜렷한 섬유아세포 집단으로 구성되어 있으며, 다른 하위 유형과 비교하여 CMS4 하위 유형이 상당히 풍부하다. 따라서 근섬유아세포가 풍부한 CMS4 하위 유형과 다른 하위 유형 간의 ECM 기능을 비교하였다. The Cancer Genome Atlas (TCGA)-Colon Adenocarcinoma (COAD)/Rectal Adenocarcinoma (READ) 발현 데이터 세트로 단일 시료 유전자 집합 농축 분석(ssGSEA)을 수행하여 TAM 및 NAM의 발현 패턴을 계산한 결과, TAM ssGSEA 점수는 기질이 풍부한 분자 하위 유형(CMS4)에서 다른 세포 유형보다 유의하게 더 높았다. NAM 점수는 종양 조직보다 정상 조직에서 더 높았으며 점수는 종양 조직 유형에 따라 다양하게 나타났다(도 18). 특히, NAM의 수준은 다른 하위 유형보다 CMS4 하위 유형에서 더 높았지만 NAM의 전사 수준은 정상 조직보다 CMS4 하위 유형에서 약간 낮았다. 전반적으로, CMS4의 섬유아세포는 대부분의 ECM 유전자의 증가된 전사 수준을 나타내었으며, 이는 ECM 구성 및 간질 침윤의 분자적 특징과 일치한다.
CMS4 관련 매트리솜 기능을 추가로 특성화하기 위해 ssGSEA에 사용되는 TCGA 데이터 세트로 GSEA를 수행한 결과, 38개의 매트리솜 마커의 유전자 세트를 기반으로 한 GSEA는 다른 하위 유형과 비교하여 CMS4 시료에서 유전자의 상당한 농축을 보여주었다(도 19). 38개의 매트리솜 유전자 중 29개가 CMS4에서 상당히 상향조절 되었으며, 이는 16개의 TAM과 13개의 NAM을 포함한다. 이는 CMS4 진단을 위하여 종양에서 상향 조절되는 유전자뿐 아니라 정상에서 상향 조절되는 유전자를 함께 확인해야 함을 의미한다. 또한 이러한 마커가 상피 중간엽 전이(EMT) 또는 섬유모세포의 TGFβ 반응(즉, CMS4의 주요 특성)과 상관관계가 있는지 확인하기 위해 EMT(MSigDB Hallmark M5930) 및 TGFβ와 관련된 마커 및 유전자 세트를 사용하여 ssGSEA를 수행하였다. 그 결과, 29개의 CMS4가 풍부한 마커의 ssGSEA 점수, EMT 점수 및 TGFβ 반응 점수의 산포도는 다른 하위 유형과 비교하여 마커와 EMT 또는 CMS4의 TGFβ 반응 사이에 더 강한 상관 관계를 보여주었다(도 20). 섬유모세포의 EMT 및 TGFβ 반응은 치사율과 연관되기 때문에 CMS4에서 풍부한 마커는 임상적으로 관련이 있을 수 있다. 임상적 의미에 따라 분자 마커를 정제하기 위해 각 마커에 대한 생존 분석을 수행한 결과, 29 개의 CMS4 특이적 매트리솜 유전자 중 10 개가 무진행생존율(PFS)과 관련이 있는 것으로 나타났다(도 21). 10개 유전자 시그니처는 또한 전체 생존 및 PFS 감소와 함께 불량한 예후를 예측하였다. 마찬가지로 CMS 분류기를 사용하여 CMS4 확률을 계산하면 전체 생존율과 PFS가 감소하여 예후가 좋지 않을 것으로 예측된다. 또한, 10개 유전자의 발현 수준과 CMS4 확률 사이에는 유의한 상관관계가 있는 것으로 나타났다(도 22). 10개 유전자의 정규화된 발현 점수가 0.7 미만인 경우 시료를 CMS4 하위 유형으로 간주하면, 10개의 유전자 중 SPARCL1과 TIMP1을 제외한 8개는 섬유아세포에서 우세한 발현을 보였고 CMS4에서는 고도로 농축되었다(도 23). 따라서, 10개의 임상적으로 중요한 CMS4-특이적 매트리솜 유전자는 TME에서 섬유모세포 집단을 추론하고 CMS4와 다른 아형을 구별하기 위해 사용될 수 있다. 상기 결과는 10개의 ECM 유전자의 활성화 패턴이 특히 CMS4 아형에서 대장암의 간질에 필수적이라는 것을 나타낸다. 이러한 유전자는 불량한 예후와 강하게 연관된 CMS4-특이적 ECM 구성 요소를 식별하는 데 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (19)
- COL14A1(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain), DPT(Dermatopontin), MFAP5(Microfibril Associated Protein 5), MATN2(Matrilin-2), SRPX(Sushi Repeat Containing Protein X-Linked), MFAP4(Microfibril Associated Protein 4), MGP(Matrix Gla Protein), TNXB(tenascin XB protein), EDIL3(EGF Like Repeats And Discoidin Domains 3), LTBP4(latent transforming growth factor beta binding protein 4), SPARCL1(SPARC Like 1), OGN(Osteoglycin), HAPLN1(Hyaluronan And Proteoglycan Link Protein 1), DCN(Decorin), ADAMDEC1(ADAM like decysin 1), A2M(Alpha-2-Macroglobulin), CTSC(Cathepsin C), CST3(cystatin c), CXCL12(C-X-C motif chemokine 12), 및 S100A4(S100 Calcium Binding Protein A4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 대장암의 진단용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 COL12A1(Collagen type XII α1 chain), COL11A1(Collagen Type XI Alpha 1 Chain), CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), FN1(Fibronectin 1), TNC(Tenascin C), SPARC(Secreted Protein Acidic And Cysteine Rich), THBS2(Thrombospondin 2), TIMP1(TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1), MMP14(Matrix Metallopeptidase 14), PLOD2(Procollagen-Lysine,2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2), SERPINH1(Serpin peptidase inhibitor clade H, member 1), LOXL2(Lysyl Oxidase Like 2), MMP11(Matrix Metallopeptidase 11), MMP1(Matrix Metallopeptidase 1), CTSB(Cathepsin B), MMP3(Matrix Metallopeptidase 3), LGALS1(Galectin 1), 및 SFRP4(Secreted Frizzled Related Protein 4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 대장암은 CMS4(consensus molecular subtype 4) 유형의 대장암인 것인, 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 단백질 또는 유전자의 발현 수준은 탈세포된 조직에서 측정되는 것인, 조성물.
- 제 4항에 있어서,
상기 단백질 또는 유전자의 발현 수준은 탈세포된 세포외기질(extracellular matrix)에서 측정되는 것인, 조성물.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
- 제 6항에 있어서,
상기 대장암은 CMS4(consensus molecular subtype 4) 유형의 대장암인 것인, 키트.
- 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 COL14A1(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain), DPT(Dermatopontin), MFAP5(Microfibril Associated Protein 5), MATN2(Matrilin-2), SRPX(Sushi Repeat Containing Protein X-Linked), MFAP4(Microfibril Associated Protein 4), MGP(Matrix Gla Protein), TNXB(tenascin XB protein), EDIL3(EGF Like Repeats And Discoidin Domains 3), LTBP4(latent transforming growth factor beta binding protein 4), SPARCL1(SPARC Like 1), OGN(Osteoglycin), HAPLN1(Hyaluronan And Proteoglycan Link Protein 1), DCN(Decorin), ADAMDEC1(ADAM like decysin 1), A2M(Alpha-2-Macroglobulin), CTSC(Cathepsin C), CST3(cystatin c), CXCL12(C-X-C motif chemokine 12), 및 S100A4(S100 Calcium Binding Protein A4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암을 진단하기 위한 정보 제공 방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 방법은 COL12A1(Collagen type XII α1 chain), COL11A1(Collagen Type XI Alpha 1 Chain), CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), FN1(Fibronectin 1), TNC(Tenascin C), SPARC(Secreted Protein Acidic And Cysteine Rich), THBS2(Thrombospondin 2), TIMP1(TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1), MMP14(Matrix Metallopeptidase 14), PLOD2(Procollagen-Lysine,2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2), SERPINH1(Serpin peptidase inhibitor clade H, member 1), LOXL2(Lysyl Oxidase Like 2), MMP11(Matrix Metallopeptidase 11), MMP1(Matrix Metallopeptidase 1), CTSB(Cathepsin B), MMP3(Matrix Metallopeptidase 3), LGALS1(Galectin 1), 및 SFRP4(Secreted Frizzled Related Protein 4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 대장암은 CMS4(consensus molecular subtype 4) 유형의 대장암인 것인, 방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 단백질 또는 유전자의 발현 수준은 탈세포된 조직에서 측정하는 것인, 방법.
- 제 11항에 있어서,
상기 단백질 또는 유전자의 발현 수준은 탈세포된 세포외기질(extracellular matrix)에서 측정하는 것인, 방법.
- (a) 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 대장암 치료용 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보 물질이 처리된 생물학적 시료에서 COL14A1(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain), DPT(Dermatopontin), MFAP5(Microfibril Associated Protein 5), MATN2(Matrilin-2), SRPX(Sushi Repeat Containing Protein X-Linked), MFAP4(Microfibril Associated Protein 4), MGP(Matrix Gla Protein), TNXB(tenascin XB protein), EDIL3(EGF Like Repeats And Discoidin Domains 3), LTBP4(latent transforming growth factor beta binding protein 4), SPARCL1(SPARC Like 1), OGN(Osteoglycin), HAPLN1(Hyaluronan And Proteoglycan Link Protein 1), DCN(Decorin), ADAMDEC1(ADAM like decysin 1), A2M(Alpha-2-Macroglobulin), CTSC(Cathepsin C), CST3(cystatin c), CXCL12(C-X-C motif chemokine 12), 및 S100A4(S100 Calcium Binding Protein A4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 치료용 약물의 스크리닝 방법.
- 제 13항에 있어서,
상기 스크리닝 방법은,
측정된 단백질 또는 유전자의 발현 수준이 상기 후보물질의 처리 전에 비하여 증가된 경우, 상기 후보물질을 대장암 치료제로 판별하는 것인, 방법.
- 제 13항에 있어서,
상기 방법은,
(c) COL12A1(Collagen type XII α1 chain), COL11A1(Collagen Type XI Alpha 1 Chain), CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1), FN1(Fibronectin 1), TNC(Tenascin C), SPARC(Secreted Protein Acidic And Cysteine Rich), THBS2(Thrombospondin 2), TIMP1(TIMP Metallopeptidase Inhibitor 1), MMP14(Matrix Metallopeptidase 14), PLOD2(Procollagen-Lysine,2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2), SERPINH1(Serpin peptidase inhibitor clade H, member 1), LOXL2(Lysyl Oxidase Like 2), MMP11(Matrix Metallopeptidase 11), MMP1(Matrix Metallopeptidase 1), CTSB(Cathepsin B), MMP3(Matrix Metallopeptidase 3), LGALS1(Galectin 1), 및 SFRP4(Secreted Frizzled Related Protein 4)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제 15항에 있어서,
상기 스크리닝 방법은,
측정된 단백질 또는 유전자의 발현 수준이 상기 후보물질의 처리 전에 비하여 감소된 경우, 상기 후보물질을 대장암 치료제로 판별하는 것인, 방법.
- 제 13항에 있어서,
상기 대장암은 CMS4(consensus molecular subtype 4) 유형의 대장암인 것인, 방법.
- 제 13항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 탈세포된 조직인 것인, 방법.
- 제 18항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 탈세포된 세포외기질(extracellular matrix)인 것인, 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230017914A KR20240125190A (ko) | 2023-02-10 | 2023-02-10 | 대장암 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 진단 방법 |
| PCT/KR2024/001871 WO2024167329A1 (ko) | 2023-02-10 | 2024-02-08 | 대장암 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 진단 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230017914A KR20240125190A (ko) | 2023-02-10 | 2023-02-10 | 대장암 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 진단 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240125190A true KR20240125190A (ko) | 2024-08-19 |
Family
ID=92262987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230017914A KR20240125190A (ko) | 2023-02-10 | 2023-02-10 | 대장암 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 진단 방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240125190A (ko) |
| WO (1) | WO2024167329A1 (ko) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX2020004567A (es) * | 2017-11-06 | 2020-08-13 | Genentech Inc | Metodos diagnosticos y terapeuticos para el cancer. |
| US20200355672A1 (en) * | 2017-11-09 | 2020-11-12 | National University Corporation Tokyo Medical And Dental University | Inhibitor of the Expression of Cancer-Promoting Factors, Screening Method for Active Ingredient Thereof, Expression Cassette Useful in said Method, Diagnostic Drug, and Diagnostic Method |
| AU2019230200A1 (en) * | 2018-03-08 | 2020-10-29 | University Of Notre Dame Du Lac | Systems and methods for assessing colorectal cancer molecular subtype and risk of recurrence and for determining and administering treatment protocols based thereon |
| GB2605702A (en) * | 2019-09-05 | 2022-10-12 | Avail Bio Inc | Methods, compositions, and systems for profiling or predicting an immune response |
| KR20210107492A (ko) * | 2020-02-24 | 2021-09-01 | (재)록원바이오융합연구재단 | 복제수 변이 검출용 표준화 유전자의 선별 방법 및 상기 방법에 의해서 선별된 c-Met 복제수 변이 검출용 조성물 |
| EP4314348A1 (en) * | 2021-03-25 | 2024-02-07 | Oncxerna Therapeutics, Inc. | Targeted therapies in cancer |
-
2023
- 2023-02-10 KR KR1020230017914A patent/KR20240125190A/ko unknown
-
2024
- 2024-02-08 WO PCT/KR2024/001871 patent/WO2024167329A1/ko unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024167329A1 (ko) | 2024-08-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Torres et al. | LOXL2 is highly expressed in cancer-associated fibroblasts and associates to poor colon cancer survival | |
| Arslan et al. | Gene expression studies provide clues to the pathogenesis of uterine leiomyoma: new evidence and a systematic review | |
| US20110182881A1 (en) | Signature and determinants associated with metastasis and methods of use thereof | |
| US20150079078A1 (en) | Biomarkers for triple negative breast cancer | |
| Chang et al. | Identification of candidate nasopharyngeal carcinoma serum biomarkers by cancer cell secretome and tissue transcriptome analysis: potential usage of cystatin A for predicting nodal stage and poor prognosis | |
| Ely et al. | Transcript and proteome analysis reveals reduced expression of calgranulins in head and neck squamous cell carcinoma | |
| Grau et al. | A quantitative proteomic analysis uncovers the relevance of CUL3 in bladder cancer aggressiveness | |
| US20200362420A1 (en) | Non-coding rna for detection of cancer | |
| Fan et al. | Identification of the up-regulation of TP-alpha, collagen alpha-1 (VI) chain, and S100A9 in esophageal squamous cell carcinoma by a proteomic method | |
| Kumar-Sinha et al. | Molecular markers to identify patients at risk for recurrence after primary treatment for prostate cancer | |
| Sanchez-Carbayo | Recent advances in bladder cancer diagnostics | |
| WO2019229302A1 (en) | L1td1 as predictive biomarker of colon cancer | |
| Safaei et al. | Breast cancer biomarker discovery: Proteomics and genomics approaches | |
| Kibar et al. | Prognostic value of cytology, nuclear matrix protein 22 (NMP22) test, and urinary bladder cancer II (UBC II) test in early recurrent transitional cell carcinoma of the bladder | |
| WO2016178236A1 (en) | Methods and kits for breast cancer prognosis | |
| WO2024167329A1 (ko) | 대장암 진단용 바이오마커, 및 이를 이용한 진단 방법 | |
| EP2581745B1 (en) | Composition for diagnosis of lung cancer and diagnosis kit of lung cancer | |
| KR20240126130A (ko) | 대장암 예후 예측용 바이오마커, 및 이를 이용한 예후 예측 방법 | |
| KR20210036676A (ko) | 난소암의 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| US20230288424A1 (en) | Biomarkers for identifying mpmri visable tumours and assessing tumour aggressiveness of prostate cancer | |
| Chen et al. | Integration of the cancer cell secretome and transcriptome reveals potential noninvasive diagnostic markers for bladder cancer | |
| US20240344133A1 (en) | A method of predicting risk of an aggressive or recurrent cancer | |
| Marchi et al. | Evolution of ipsilateral breast cancer decoded by proteogenomics | |
| CA3214819A1 (en) | Protein markers for estrogen receptor (er)-positive luminal a(la)-like and luminal b1 (lb1)-like breast cancer | |
| KR20210150679A (ko) | 거세저항성 전립선암 진단을 위한 정보제공 방법 및 이를 위한 거세저항성 전립선암 진단용 키트 |