KR20240111764A - 발현 효율을 증가시킨 핵산 발현 플랫폼 - Google Patents

발현 효율을 증가시킨 핵산 발현 플랫폼 Download PDF

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KR20240111764A
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박형준
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주식회사 에스엠엘바이오팜
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Abstract

본 개시는 코딩 영역의 하류에 복수의 번역 조절 요소가 삽입된 핵산 분자와, 상기 핵산 분자가 삽입된 재조합 발현 벡터와 같은 핵산 발현 플랫폼 또는 핵산 발현 시스템에 관한 것이다. 본 개시의 핵산 분자를 활용하여 코딩 영역에 삽입된 목적 유전자가 효율적으로 발현될 수 있다. 발현 플랫폼을 활용하여, 리포터 유전자, 항원 및/또는 치료용 단백질 또는 펩타이드의 발현 효율을 향상시킬 수 있다.

Description

발현 효율을 증가시킨 핵산 발현 플랫폼
본 특허출원은 대한민국 정부 과학기술정보통신부의 "신/변종감염병대응플랫폼핵심기술개발사업"의 일환으로서 “새로운 mRNA 백신용 플랫폼 개발"과제 (주관기관: 가톨릭대학교 산학협력단; 과제번호: 1711158916) 및 대한민국정부 식품의약품안전처의 "감염병대응혁신기술지원연구사업'의 일환으로서 "mRNA 백신 등의 독성평가기술개발 연구(1)" 과제(주관기관: 가톨릭대학교 산학협력단; 과제번호: 1475013322)의 수행 결과물에 관한 것이다.
본 개시는 핵산 발현 플랫폼에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발현 효율을 증가시킨 핵산 분자 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터와 같은 핵산 발현 플랫폼 또는 핵산 발현 시스템에 관한 것이다.
1970년대 유전자 재조합 기술이 알려진 이후로, 발현시키고자 하는 관심유전자(Gene Of Interest, GOI)를 발현시킬 수 있는 발현 시스템이 알려져 있다. 이러한 발현 시스템 중의 하나로서 세포-기반 발현 시스템은 미생물이나 진핵세포(eukaryotes)의 발현 시스템을 이용하고, 세포를 함유하지 않는 발현 시스템은 정제된 RNA 중합효소(RNA polymerase), 리보솜(ribosome), tRNA 및 리보뉴클레오티드(ribonucleotides)를 사용하는 게 일반적이다.
특히, 진핵세포에서 유도한 단백질은 발현 이후에도 인산화, 메틸화, 글리코실화 등의 번역후 변형(post-translational modification)이 일어나는데, 미생물은 이러한 번역후 변형 메커니즘을 가지고 있지 않다. 따라서 진핵세포 유도의 단백질을 발현하고자 하는 경우에는 진핵세포 발현 시스템을 사용하여야 한다.
진핵세포 유도의 발현 시스템은 유전자 치료제나 핵산 백신 등으로 활용될 수 있다. 유전자 치료제의 경우에는 다양한 질병을 치료할 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 열린해독틀(ORF)로 이루어지는 관심유전자를 발현 시스템 내에 삽입한다. 핵산 백신의 경우에는 항원으로 발현될 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 열린해독틀로 이루어지는 관심유전자를 발현 시스템 내에 삽입한다. 하지만, 관심유전자의 발현 효율을 향상시킬 수 있는 핵산 발현 시스템은 관련 기술분야에서 지속적으로 요구되고 있다.
본 개시의 목적은 관심유전자의 발현 효율을 향상시킬 수 있는 핵산 발현 플랫폼 또는 핵산 발현 시스템을 제공하고자 하는 것이다.
일 측면에 따르면, 번역 조절 요소; 및 상기 번역 조절 요소와 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역을 포함하고, 상기 번역 조절 요소는 상기 코딩 영역의 상류(upstream)에 위치하는 상류 번역 조절 요소와, 상기 코딩 영역의 하류(downstream)에 위치하는 하류 번역 조절 요소를 포함하고, 상기 하류 번역 조절 요소는 복수의 하류 번역 조절 요소를 포함하는 핵산 분자가 개시된다.
예시적인 실시형태에서, 상기 하류 번역 조절 요소는 상기 코딩 영역의 하류에 위치하는 제 1 하류 번역 조절 요소 및 제 2 하류 번역 조절 요소를 포함할 수 있다.
일례로, 상기 복수의 하류 번역 조절 요소(예를 들어, 제 1 하류 번역 조절 요소 및 제 2 하류 번역 조절 요소)는 각각 인간 troponin T1, solo skeletal type (인간 TNNT1), 인간 albumin, 인간 ferritin light chain (인간 FTL), 인간 C-C motif chemokine ligand (인간 CCL19), 인간 associated migratory cell protein (인간 AAMP), 인간 ribosomal protein S27 (인간 RPS27) 및 인간 defensing alpha 5 (인간 DEFA5)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
상기 복수의 하류 번역 조절 요소(예를 들어, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소 및 상기 제 2 하류 번역 조절 요소)는 각각 독립적으로 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14로 구성되는 군에서 선택되는 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 albumin, 상기 인간 FTL, 상기 인간 CCL19, 상기 인간 AAMP, 상기 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
다른 예시적인 실시형태에서, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 albumin 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 DEFA5 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 FTL 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1, 상기 인간 FTL, 상기 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 CCL19 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1, 상기 인간 FTL, 상기 인간 CCL19, 상기 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 AAMP 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 albumin, 상기 인간 FTL, 상기 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1, 상기 인간 albumin, 상기 인간 FTL, 상기 인간 CCL19, 상기 인간 AAMP, 상기 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 DEFA5 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1, 상기 인간 albumin, 상기 인간 FTL, 상기 인간 CCL19, 상기 인간 AAMP 및 상기 인간 RPS27로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 상기 하류 번역 조절 요소는 상기 제 2 하류 번역 조절 요소의 하류에 위치하는 제 3 하류 번역 조절 요소를 더욱 포함할 수 있다.
상기 제 3 하류 번역 조절 요소는 인간 troponin T1, solo skeletal type (TNNT1), 인간 albumin, 인간 ferritin light chain (FTL), 인간 C-C motif chemokine ligand (CCL19), 인간 associated migratory cell protein (AAMP), 인간 ribosomal protein S27 (RPS27) 및 인간 defensing alpha 5 (DEFA5)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 DEFA5 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 3 하류 번역 조절 요소는 인간 FTL 또는 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
다른 예시적인 실시형태에서, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 albumin 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 DEFA5 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 3 하류 번역 조절 요소는 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 인간 FTL 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 3 하류 번역 조절 요소는 인간 CCL19, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 인간 DEFA5 유래의 전사 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 3 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 FTL 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
상기 상류 번역 조절 요소는 인간 troponin T1, solo skeletal type (인간 TNNT1), 인간 albumin, 인간 ferritin light chain (인간 FTL), 인간 C-C motif chemokine ligand (인간 CCL19), 인간 associated migratory cell protein (인간 AAMP), 인간 ribosomal protein S27 (인간 RPS27) 및 인간 defensing alpha 5 (인간 DEFA5)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
일례로, 상기 상류 번역 조절 요소는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 7로 구성되는 군에서 선택되는 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
상기 핵산 분자는 RNA일 수 있다.
상기 핵산 분자는, 상기 코딩 영역과 작동 가능하게 연결되는 전사 조절 요소를 더욱 포함할 수 있다.
선택적인 실시형태에서, 상기 핵산 분자는 상기 하류 번역 조절 서열의 하류에 위치하는 폴리아데닐레이션 신호 서열 또는 폴리아데노신 서열을 더욱 포함할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 상기 코딩 영역은 리포터 단백질 또는 이의 단편, 및 마커(marker) 또는 선별 단백질 또는 이의 단편 중에서 적어도 하나를 암호화할 수 있다.
다른 예시적인 실시형태에서, 상기 코딩 영역은 항원 또는 이의 단편을 암호화할 수 있다.
예를 들어, 상기 항원은 병원성 항원, 종양 항원, 또는 이들의 변이체 또는 유도체인 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 상기 코딩 영역은 질병 치료를 위한 펩타이드 또는 이의 단편을 암호화할 수 있다.
다른 측면에서, 전술한 핵산 분자가 삽입된 재조합 발현 벡터가 개시된다.
또 다른 측면에서, 전술한 핵산 분자, 또는 전술한 핵산 분자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 생체 내에 주입하고, 상기 주입된 핵산 분자로부터 단백질 또는 펩타이드를 발현시켜 상기 단백질 또는 펩타이드를 제조하는 방법이 개시된다.
본 개시의 핵산 발현 플랫폼은 다수의 번역 조절 서열을 관심유전자의 열린해독틀로 이루어진 코딩 영역의 하류에 배치하도록 설계된다. 핵산 발현 플랫폼을 도입하여, 발현되는 전사체가 생체 내에서 안정적으로 유지될 수 있다. 이에 따라, 본 개시의 핵산 발현 플랫폼을 적용하여, 관심유전자가 최종적으로 발현되는 효율이 향상될 수 있다.
발현 플랫폼을 사용하여, 리포터 유전자, 감염성 항원, 종양 항원 및/또는 치료 목적으로 활용되는 펩타이드 또는 단백질과 같은 다양한 관심유전자의 발현 효율이 향상된다. 따라서, 특정 물질의 존재 여부를 검출 또는 분석하기 위한 용도로서는 물론이고, 유전자 치료제, mRNA 백신 및/또는 단백질 서브유닛 백신과 같은 백신을 제조하는데 본 개시의 발현 플랫폼이 활용될 수 있다.
도 1은 본 개시의 예시적인 실시형태에 따라 관심유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드의 구성을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 개시의 다른 예시적인 실시형태에 따라 관심유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드의 구성을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3 및 도 4는 각각 본 개시의 예시적인 실시예에 따라 Renilla Luciferase를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 핵산 분자를 마우스 근육 유도 세포주인 Nor10 세포에 형질전환 시킨 뒤, 각각 6시간과 24시간 경과 후에 Renilla Luciferase의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5 및 도 6은 각각 본 개시의 예시적인 실시예에 따라 Renilla Luciferase를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 핵산 분자를 인간 유도 세포주인 HeLa 세포에 형질전환 시킨 뒤, 각각 6시간과 24시간 경과 후에 Renilla luciferase의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7 및 도 8은 각각 본 개시의 예시적인 실시예에 따라 Renilla Luciferase를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 핵산 분자를 인간 유도 세포주인 293A 세포에 형질전환 시킨 뒤, 각각 6시간과 24시간 경과 후에 Renilla Luciferase의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9 및 도 10은 각각 본 개시의 예시적인 실시예에 따라 Renilla Luciferase를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 핵산 분자를 마우스의 귀에 주사한 뒤, 6시간 경과 후에 Renilla Luciferase의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11 및 도 12는 각각 본 개시의 예시적인 실시예에 따라 Renilla Luciferase를 암호화하는 코딩 영역을 갖는 핵산 분자를 인간 유도 세포주인 293A 세포에 형질전환 시킨 뒤, 각각 6시간과 24시간 경과 후에 Renilla Luciferase의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 내지 도 12에서 A 내지 G는 각각 하류 번역 조절 서열을 나타내기 위한 것이다. 첫 번째 문자는 제 1 하류 번역 조절 요소, 두 번째 문자는 제 2 하류 번역 조절 요소, 세 번째 문자는 제 3 하류 번역 조절 요소를 나타낸다. A는 인간 TNNT1 유래의 번역 조절 요소인 서열식별번호: 8, B는 인간 albumin 유래의 번역 조절 요소인 서열식별번호: 9, C는 인간 FTL 유래의 번역 조절 요소인 서열식별번호: 10, D는 인간 CCL19 유래의 번역 조절 요소인 서열식별번호: 11, E는 인간 AAMP 유래의 번역 조절 요소인 서열식별번호: 12, F는 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소인 서열식별번호: 13, G는 인간 DEFA5 유래의 번역 조절 요소인 서열식별번호: 14를 각각 하류 번역 조절 서열로 사용한 것을 나타낸다. 또한, 비교예로 사용한 pHJ5 핵산 분자로부터 발현된 펩타이드 또는 단백질의 발현 정도와 비교하였다.
용어의 정의
본 명세서에서 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 자연-발생 L-아미노산 또는 잔기를 포함하는 것으로 의도된다. 아미노산은 D-아미노산뿐만 아니라 화학적으로-변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 유사체, 단백질에 통상적으로 혼입되지 않는 자연-발생 아미노산, 예컨대 노르류신, 및 아미노산의 특징인 것으로 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로-합성된 화합물을 포함한다. 예를 들어, 천연 Phe 또는 Pro와 동일한 펩타이드 화합물의 입체형태 제한을 허용하는 페닐알라닌 또는 프롤린의 유사체 또는 모방체가 아미노산의 정의 내에 포함된다. 이러한 유사체 및 모방체는 본 명세서에서 아미노산의 "기능적 균등물"로서 지칭된다.
예를 들어, 표준 고체-상 합성 기술에 의해 합성된 합성 펩타이드는 유전자에 의해 암호화되는(encoded) 아미노산으로 제한되지 않으며, 이에 따라 주어진 아미노산에 대해 보다 광범위하게 다양한 치환을 허용한다. 유전자 코드에 의해 암호화되지 않은 아미노산은 본 명세서에서 "아미노산 유사체"로서 지칭된다.
일례로, 아미노산 유사체는 Glu 및 Asp에 대한 2-아미노 아디프산 (Aad); Glu 및 Asp에 대한 2-아미노피멜산 (Apm); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노부티르산 (Abu); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노헵탄산 (Ahe); Gly에 대한 2-아미노부티르산 (Aib); Val, Leu 및 Ile에 대한 시클로헥실알라닌 (Cha); Arg 및 Lys에 대한 호모아르기닌 (Har); Lys, Arg 및 His에 대한 2,3-디아미노프로피온산 (Dap); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Asn 및 Gln에 대한 N-에틸아스파라긴 (EtAsn); Lys에 대한 히드록시리신 (Hyl); Lys에 대한 알로히드록시리신 (AHyl); Pro, Ser 및 Thr에 대한 3-(및 4-)히드록시프롤린 (3Hyp, 4Hyp); Ile, Leu 및 Val에 대한 알로-이소류신 (AIle); Arg에 대한 4-아미디노페닐알라닌; Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-메틸글리신 (MeGly, 사르코신); Ile에 대한 N-메틸이소류신 (MeIle); Met 및 다른 지방족 아미노산에 대한 노르발린 (Nva); Met 및 다른 지방족 아미노산을 위한 노르류신 (Nle); Lys, Arg 및 His에 대한 오르니틴 (Orn); Thr, Asn및 Gln에 대한 시트룰린 (Cit) 및 메티오닌 술폭시드 (MSO); 및 Phe에 대한 N-메틸페닐알라닌 (MePhe), 트리메틸페닐알라닌, 할로-(F-, Cl-, Br- 또는 I-)페닐알라닌 또는 트리플루오릴페닐알라닌을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 자연적으로 존재하는 것으로부터 분리하였거나, 재조합 기술 (recombinant technique)에 의하여 또는 화학적으로 합성된 단백질, 단백질 단편 및 펩타이드를 모두 포함한다. 예를 들어 본 개시의 펩타이드는 적어도 5개, 일례로, 적어도 10개의 아미노산으로 구성되어 있다.
특정 실시형태에서, 화합물의 변이체, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 펩타이드 변이체가 제공된다. 본 명세서에서 "펩타이드 변이체 (peptide variants)"란 하나 또는 그 이상의 아미노산이 펩타이드의 아미노산 서열에 치환 (substitutions), 결실 (deletions), 첨가 (additions) 및/또는 삽입 (insertions)되어 있으면서, 원래의 아미노산으로 구성된 펩타이드와 거의 동일한 생물학적 기능을 발휘하는 것을 말한다. 펩타이드 변이체는 원래의 펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성(identity)을 가지고 있어야 한다. 이러한 치환체로서 "보존성"이라고 알려진 아미노산 치환제가 포함될 수 있다. 변이체는 또한 비보존성(nonconservative)의 변화를 포함할 수도 있다. 예시적인 실시형태에서, 변이체 폴리펩타이드의 서열은 5개 또는 그 이하의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입됨으로써, 원래의 서열과 달라진다. 변이체들은 또한 펩타이드의 면역원성(immunogenicity), 2차 구조(secondary structure) 및 수치료성(hydropathic nature)에 최소한의 영향을 주는 아미노산들의 결실 또는 부가에 의해 변화될 수 있다.
"보존성" 치환이란 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었을 때에도 폴리펩타이드의 2차 구조 등에 큰 변화가 없는 것을 의미한다. 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대 극성(polarity), 전하(charge), 수용성(solubility), 소수성(hydrophobicity), 친수성(hydrophilicity) 및/또는 양친화성(amphipathic nature) 등의 유사성을 기초로 하여 얻어질 수 있다.
예를 들어 아미노산은 공통적인 곁사슬 특성에 따라 1) 소수성 (노르류신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신) 2) 중성 친수성 (시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라진, 글루타민), 3) 산성 (아스파르트산, 글루탐산), 4) 염기성 (히스티딘, 리신, 아르기닌), 5) 쇄 방향에 영향을 미치는 잔기 (글리신, 프롤린), 6) 방향족 (트립토판, 티로신, 페닐알라닌)으로 분류될 수 있다. 보존적 치환은 이들 각각의 클래스 중 하나의 구성원을 동일한 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.
아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루탐산 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르트산 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 다음과 같은 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르트산 (+3.0±1); 글루탐산 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 리신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
일반적으로, 본 명세서상에 언급되어 있는 펩타이드들 (융합 단백질 포함) 및 폴리뉴클레오타이드들은 분리된 (isolated) 것이다. "분리된 (isolated)" 펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드란 원래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 자연 상태로 존재하는 단백질은 그 상태에서 함께 존재하는 물질들 전부 혹은 일부를 제거함으로써 분리되는 것이다. 이러한 폴리펩타이드는 적어도 90% 이상의 순도를 지녀야 하며, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가져야 한다. 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내에서 클로닝시킴으로써 분리된다. 본 명세서 상에 언급된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화(encode)되는 재조합 펩타이드는 알려져 있는 많은 발현 벡터들 중 어느 것을 이용하든지 간에 공지의 방법으로 손쉽게 제조될 수 있다. 발현은 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환 된 적절한 숙주 세포(host cell) 내에서 시킬 수 있다. 적절한 숙주 세포에는 원핵세포들(prokaryotes), 효모(yeast) 및 진핵세포들(eukaryotes)이 포함된다. 일례로, 효모, 곤충 세포 또는 포유동물 세포주(Cos 또는 CHO 등의)와 같은 진핵생물 유도의 세포주를 숙주세포로 이용할 수 있다.
본 명세서에서 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 교환 가능하게 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고 DNA (예컨대 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함한다. 핵산 분자의 구성 단위인 "뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 그 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합 효소(polymerase)에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 당 또는 염기가 변형된 유사체 (analogue), 예컨대 메틸화 뉴클레오타이드 및 그 유사체를 포함할 수 있다.
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변이를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 단백질 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 단백질의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 개시의 단백질과 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.
본 개시의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드가 가지는 특징, 예를 들어 백신 및/또는 면역증강제로서의 효과를 갖는 범위에서, 본 개시의 펩타이드 및 핵산 분자는 서열목록에 기재된 아미노산 서열 또는 염기 서열에 한정되지 않는다는 것은 통상의 기술자에게 명확하다. 예를 들어, 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역 및/또는 이로부터 발현되는 재조합 단백질/펩타이드에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 전술한 코딩 영역 및/재조합 단백질과 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 염기 서열의 변이를 가지는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열의 변이를 가지는 단백질/펩타이드일 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 펩타이드 및/또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 개시의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에 전달이 가능하며 바람직하게는 하나 이상의 목적 유전자 또는 서열의 발현이 가능하도록 만들어진 구조물을 의미한다. 예를 들면 벡터에는 바이러스 벡터 (viral vectors), DNA 또는 RNA 발현 벡터 (expression vectors), 플라스미드 (plasmid), 코스미드 (cosmid) 또는 파지벡터 (phage vectors), CCA (cationic condensing agents)와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀 (liposomes)으로 포장된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 프로듀서 세포 (producer cells)와 같은 특정 진핵세포 (eukaryotic cells) 등이 포함된다.
본 명세서에서 "발현 조절 서열(expression control/regulation sequence)" 또는 "발현 조절 요소(expression control/regulation element)"는 핵산 분자의 전사(transcription) 및/또는 전사체(transcript) 형태의 핵산으로부터 번역(translation)을 조절하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 한편, "전사 조절 서열(transcription control/regulation sequence)" 또는 "전사 조절 요소(transcription control/regulation element)"는 핵산의 전사를 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 전사 조절 요소는 구조 프로모터(constituted promoter) 또는 유도 프로모터(inducible promoter)와 같은 프로모터 또는 인핸서(enhancer) 등이 있다.
또한, 전사체 형태의 핵산으로부터 단백질 또는 펩타이드로의 번역을 조절하는 핵산 서열에 대해서 "번역 조절 서열(translation control/regulation sequence)" 또는 "번역 조절 요소(translation control/regulation element)"라는 용어가 사용될 수 있다. 이들 발현 조절 서열/요소, 전사 조절 서열/요소 및/또는 번역 조절 서열/요소는 발현될 서열, 예를 들어 전사 또는 번역될 핵산 서열에 작동적으로 연결 (operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서 용어 "작동 가능하게 연결된 (operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 리보솜 결합부위, 전사 종결서열 등)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
핵산 분자
본 개시는 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결된 코딩 영역의 발현 효율을 향상시킨 핵산 분자 및 이를 포함하는 벡터와 같은 핵산 분자 기반의 발현 플랫폼 또는 발현 시스템에 근거한다. 도 1은 본 개시의 예시적인 실시형태에 따라, 관심유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드의 구성을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 핵산 분자는 번역 개시(translation initiation) 활성을 가지는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 번역 조절 요소(Translation control element, TLCE)와, 번역 조절 요소(TLCE)과 작동 가능하게 연결되며, 관심유전자(Gene of Interest, GOI)의 열린해독틀(open reading frame; ORF)로 이루어진 코딩 영역 (coding region, CR)을 포함할 수 있다.
선택적으로, 핵산 분자는 코딩 영역(CR)과 작동 가능하게 연결되는 전사 조절 요소(TCCE) 및/또는 번역 조절 요소(TLCE)의 하류(downstream)에 위치하는 폴리아데닐레이션 신호 서열 또는 폴리아데노신 서열 (PA) 중에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
번역 조절 요소(TLCE)는 열린해독틀(ORF) 형태로 삽입되는 코딩 영역(CR)과 작동 가능하게 연결되는 번역 개시 활성을 가지는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 번역 조절 요소(TLCE)는 코딩 영역(CR)의 상류(upstream)에 위치하는 상류 번역 조절 요소(U-TLCE) 및/또는 코딩 영역(CR)의 하류(downstream)에 위치하는 하류 번역 조절 요소(D-TLCE)를 포함할 수 있다.
다시 말하면, 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)는 코딩 영역 (CR)의 상류에 위치할 수 있고, 하류 번역 조절 요소(D-TLCE)은 코딩 영역 (CR)의 하류에 위치할 수 있다. 다시 말하면, 코딩 영역(CR)은 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)와, 하류 번역 조절 요소(D-TLCE) 사이에 위치할 수 있으며, 관심유전자의 열린해독틀로 이루어지는 표적 서열(target sequence, TS)을 형성한다.
상류 번역 조절 요소(U-TLCE)은 캡 의존성(cap dependent) 번역 개시 활성을 갖는 5'-비번역영역 (5'Untranslated Region, 5'-UTR)의 전부 또는 일부일 수 있다.
대부분의 진핵세포의 mRNA는 5' 말단에 7-methyl-guanosine(cap, m7G)을 가지는데, 단백질 합성 개시 복합체(translation initiation complex)가 5' 말단에 위치한 cap을 인식하고 개시 코돈인 AUG까지 진행하여 단백질 합성을 시작한다. 즉, mRNA의 5' 말단에 위치한 cap 구조는 단백질 합성을 개시할 뿐만 아니라, nuclease의 작용으로부터 mRNA의 파괴를 막는다.
예를 들어, 시험관내(in vitro)에서 전사의 첫 과정은 pDNA (plasmid DNA)에 제한 효소를 처리하여 선형화시킨 후, 적절한 RNA 중합 효소를 이용하여 제조된 mRNA에 m7G(5')-ppp(5')G (이를 regular cap analog라 함)를 붙여서 capped mRNA를 만들어 사용할 수 있다. 선택적으로 cap analog 없이 시험관내 전사를 수행하고, 상업적으로 이용 가능한 vaccinia virus capping 효소를 사용하여 cap 반응을 수행하는 방법이 있으며, 이러한 cap의 역방향 반응을 막는 'anti-reverse' cap analog (ARCA)를 사용할 수 있다. ARCA를 도입하면, 메틸화가 일어난 guanosine의 3'-O-methylation만이 메틸화가 일어나지 않은 guanosine의 nucleotide에 결합할 수 있다.
일례로, 변형된 5'-Cap 구조는 Cap1(m7G의 인접 뉴클레오타이드 내의 리보오스의 메틸화), Cap2(m7G의 2번째 하류에 위치한 뉴클레오타이드 리보오스의 메틸화), Cap3(m7G의 3번째 하류에 위치한 뉴클레오타이드 리보오스의 메틸화), Cap4(m7G의 4번째 하류에 위치한 뉴클레오타이드 리보오스의 메틸화), ARCA (안티-리버스 Cap 유사체, 변형된 ARCA(예를 들어 포스포티오에이트 변형된 ARCA), 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'-플루오로-구아노신, 7-디아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신, 및 2-아지도-구아노신이다.
예를 들어, 상류 번역 조절 요소(U-TLCE) 및/또는 하류 번역 조절 요소(D-TLCE)는 각각 동물, 예를 들어, 포유강, 구체적으로는 영장목, 보다 구체적으로는 인간으로부터 유도한 캡 의존성 번역 개시 활성을 갖는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 전사체(transcript) 서열로 이루어질 수 있다. 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)는 코딩 영역(CR)으로부터 발현되는 펩타이드 및/또는 단백질의 번역 과정에서 번역개시복합체 (translation initiation complex)가 결합하는 영역으로서, 코딩 영역(CR)의 번역을 유도하는 cis-acting 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상류 번역 조절 요소(U-TLCE)가 캡 의존성 번역 개시 활성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부인 경우, 코딩 영역(CR)의 하류에 위치할 수 있는 하류 번역 조절 요소(D-TLCE)를 포함할 수 있다. 상류 번역 조절 요소(U-TLCE) 및 하류 번역 조절 요소(D-TLCE)를 포함하는 핵산 분자는 코딩 영역(CR)을 구성하는 열린해독틀(ORF)의 발현 효율을 더욱 향상시킬 수 있다. 다시 말하면, 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)와, 하류 번역 조절 요소(D-TLCE)은 코딩 영역(CR)을 형성하는 관심유전자(GOI)의 열린해독틀 또는 이의 전사체의 번역 효율을 향상시키고, 전사체인 mRNA가 세포 내에서 파괴되지 않고 안정적으로 유지되는데 중요한 역할을 한다.
예시적인 실시형태에서, 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)는 인간 troponin T1, slow skeletal type (인간 TNNT1), 인간 albumin (인간 ALB), 인간 ferritin light chain (인간 FTL), 인간 C-C motif chemokine ligand 19 (인간 CCL19), 인간 associated migratory cell protein (인간 AAMP), 인간 ribosomal protein S27 (인간 RPS27) 및 인간 defensing alpha 5 (인간 DEFA5)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 인간 TNNT1 유래의 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)는 서열식별번호: 1의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 ALB 유래의 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)는 서열식별번호: 2의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 FTL 유래의 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)는 서열식별번호: 3의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 CCL19 유래의 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)는 서열식별번호: 4의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 AAMP 유래의 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)는 서열식별번호: 5의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 RPS27 유래의 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)는 서열식별번호: 6의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 DEFA5 유래의 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)는 서열식별번호: 7의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 하지만, 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)가 특정 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 전사체 서열로 한정되지 않는다.
하류 번역 조절 요소(D-TLCE)는 코딩 영역(CR)의 하류(downstream)에 순차적으로 삽입되는 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1) 및 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)로 이루어질 수 있다. 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1) 및 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
일례로, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1) 및 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 각각 독립적으로 인간 TNNT1, 인간 ALB, 인간 FTL, 인간 CCL19, 인간 AAMP, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 하류 번역 조절 요소를 포함할 수 있다.
예를 들어, 인간 TNNT1 유래의 제 1 및 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1, D-TLCE2)는 각각 서열식별번호: 7의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 ALB 유래의 제 1 및 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1, D-TLCE2)는 서열식별번호: 9의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 FTL 유래의 제 1 및 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1, D-TLCE2)는 서열식별번호: 10의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 CCL19 유래의 제 1 및 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1, D-TLCE2)는 서열식별번호: 11의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 AAMP 유래의 제 1 및 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1, D-TLCE2)는 서열식별번호: 12의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 RPS27 유래의 제 1 및 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1, D-TLCE2)는 서열식별번호: 13의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 인간 DEFA5 유래의 제 1 및 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1, D-TLCE2)는 서열식별번호: 14의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 하지만, 제 1 및 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1, D-TLCE2)가 특정 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 전사체 서열로 한정되지 않는다.
예시적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)는 인간 TNNT1 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 ALB, 인간 FTL, 인간 CCL19, 인간 AAMP, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 TNNT1 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL, 인간 CCL19 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래할 수 있다.
선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 TNNT1 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL 또는 인간 CCL19 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 TNNT1 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 CCL19 또는 인간 RPS27 유래의 하부 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
다른 예시적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)는 인간 ALB 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 DEFA5 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)는 인간 FTL 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 TNNT1, 인간 FTL, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 FTL 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 TNNT1, 인간 FTL, 상기 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 FTL 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 TNNT1, 인간 FTL 및 인간 RPS27로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 FTL 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)는 인간 CCL19 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 TNNT1, 인간 FTL, 인간 CCL19, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 CCL19 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL, 인간 CCL19, 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소를 포함할 수 있다.
선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 CCL19 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL 또는 인간 RPS27에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 CCL19 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 CCL19에서 유래한 하류 번역 조절 서열 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 CCL19 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 CCL19 또는 인간 RPS27 유래의 하부 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 CCL19 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL 또는 인간 CCL19 유래의 하부 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)는 인간 AAMP 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 ALB, 인간 FTL, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)는 인간 RPS27 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 TNNT1, 인간 ALB, 인간 FTL, 인간 CCL19, 인간 AAMP, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 RSP27 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 TNNT1, 인간 FTL1, 인간 CCL19, 인간 AAMP, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 RSP27 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL, 인간 CCL19, 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 RSP27 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 RSP27 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 TNNT1, 인간 FTL, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 하부 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 RSP27 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 RPS27 또는 인간 DEFA5 유래의 하부 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 RSP27 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL 유래의 하부 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)는 인간 DEFA5 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 TNNT1, 인간 ALB, 인간 FTL, 인간 CCL19, 인간 AAMP 및 인간 RPS27로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 DEFA5 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 TNNT1, 인간 ALB, 상기 인간 FTL, 인간 AAMP 및 인간 RPS27로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 하부 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 DEFA5 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 ALB, 인간 FTL, 인간 AAMP 및 인간 RPS27로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 DEFA5 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 ALB, 인간 FTL 및 인간 RPS27로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 DEFA5 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL, 인간 CCL9, 인간 AAMP 및 인간 RPS27로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 선택적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)가 인간 DEFA5 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 경우, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL 또는 인간 RPS27 유래의 하류 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
코딩 영역(CR)은 의도한 관심유전자(GOI)의 열린해독틀(ORF)을 포함하고 있다면, 특별히 한정되지 않는다. 예시적인 측면에서, 코딩 영역(CR)은 리포터 단백질 또는 이의 단편, 마커(marker) 또는 선별 단백질 또는 이의 단편, 항원 또는 이의 단편 및 질병 치료를 위한 단백질 또는 이의 단편 중에서 적어도 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 전사체 서열인 열린해독틀(ORF)로 이루어질 수 있다.
일례로, 코딩 영역(CR)은 루시퍼라제 단백질(예를 들어, 레닐라 루시퍼라제), 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP), 향상된 녹색 형광 단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP), 베타-글루쿠로니다제와 같은 글루쿠로니다제(glucuronidase) 및/또는 베타-갈락토시다제와 같은 갈라톡시다제(galactosidase)와 같은 리포터 단백질/리포터 펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 열린해독틀(ORF)로 이루어질 수 있다.
하나의 예시적인 측면에서, 코딩 영역(CR)은 알파-글로빈 및/또는 베타-글로빈과 같은 글로빈 단백질, 갈락토키나아제(galactokinase) 및/또는 잔틴 구아닌 포스포리보실 전이효소 등과 같은 마커 또는 선별 단백질/펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 열린해독틀로 이루어질 수 있다. 그 외에도 다른 리포터 단백질/펩타이드 및/또는 마커 또는 선별 단백질/펩타이드를 암호화하는 열린해독틀(ORF)이 코딩 영역(CR)으로 삽입될 수 있다.
다른 예시적인 측면에서, 코딩 영역(CR)에 삽입되는 항원 유전자는 병원성 항원 또는 이의 단편, 종양 항원, 이들의 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질/펩타이드를 암호화하는 열린해독틀(ORF)로 이루어질 수 있다.
병원성 항원은 개체, 특히 포유동물 개체, 보다 특히 인간 내 면역학적 반응을 일으키는 병원성 유기체, 특히 박테리아, 바이러스 또는 원생동물(다세포) 병원성 유기체로부터 유도된다. 보다 구체적으로, 병원성 항원은 바이러스 또는 박테리아 또는 원생동물 유기체의 표면에 위치한 표면 항원, 예를 들어 단백질(또는 단백질의 절편, 예를 들어 표면 항원의 외부 일부)일 수 있다.
일례로, 병원성 항원은 감염성 질병과 관련된 병원체로부터 유도된 펩타이드 또는 단백질 항원일 수 있다. 보다 구체적으로, 병원성 항원은 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 아나플라즈마 속(Anaplasma genus), 아나플라즈마 파고사이토필리움(Anaplasma phagocytophilum), 브라질구충(Ancylostoma braziliense), 십이지장충(Ancylostoma duodenale), 용혈성 아카노박테리아균(Arcanobacterium haemolyticum), 회충(Ascaris lumbricoides), 아스페르길루스 속(Aspergillus genus), 아스트로비리다에(Astroviridae), 바베시아 속(Babesia genus), 탄저균(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae), BK 바이러스, 블라스토시스티스 호미니스(Blastocystis hominis), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 백일해균(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 속(Borrelia genus), 보렐리아 종(Borrelia spp), 브루셀라 속(Brucella genus), 말레이사상충(Brugia malayi), 부니아바이러스 과(Bunyaviridae family), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) 및 다른 부르크홀데리아 종, 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 부르크홀데리아 슈도말레이, 칼리시비리다에 과(Caliciviridae family), 캄필로박터 속(Campylobacter genus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 종(Candida spp), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 클라미도필라 프시타시(Chlamydophila psittaci), CJD 프리온, 간흡충(Clonorchis sinensis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 페르프린젠스, 클로스트리듐 종(Clostridium spp), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 콕시디오이데스 종(Coccidioides spp), 코로나바이러스(coronaviruses), 디프테리아균(Corynebacterium diphtheria), 콕시엘라부르네티(Coxiella burnetii), 크리민 콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토스포리디움 속(Cryptosporidium genus), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV), 뎅기 바이러스(Dengue viruses) (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 이핵아메바(Dientamoeba fragilis), 에볼라바이러스(Ebolavirus, EBOV), 에키노코쿠스 종(Echinococcus genus), 에를리히아 샤펜시스(Ehrlichia chaffeensis), 엘리키아 에윈기(Ehrlichia ewingii), 엘리키아 속(Ehrlichia genus), 이질 아메바(Entamoeba histolytica), 장구균 속(Enterococcus genus), 장내 바이러스 속(Enterovirus genus), 장내 바이러스(Enteroviruses), 주로 콕사키 A 바이러스(Coxsackie A virus) 및 장내 바이러스 71 (EV71), 표피사상균 종(Epidermophyton spp), 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV), 대장균(Escherichia coli) O157:H7, O111 및 O104:H4, 간질(Fasciola hepatica) 및 거대 간질(Fasciola gigantica), FFI 프리온, 필라리오이데아 상과(Filarioidea superfamily), 플라비바이러스(Flaviviruses), 야토병균(Francisella tularensis), 푸소박테리움 속(Fusobacterium genus), 게오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum), 지알디아편모충(Giardia intestinalis), 악구충속 종(Gnathostoma spp), GSS 프리온, 구아나리토 바이러스(Guanarito virus), 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 헤니파바이러스(Henipavirus) (Hendra virus Nipah virus), 간염 A 바이러스, 간염 B 바이러스(HBV), 간염 C 바이러스(HCV), 간염 D 바이러스, 간염 E 바이러스, 단순포진 바이러스 1 및 2 (HSV-1 및 HSV-2), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), HIV(인간 면역결핍 바이러스, Human immunodeficiency virus), 호르테아 웨넥키(Hortaea werneckii), 인간 보카바이러스(Human bocavirus)(HBoV), 인간 헤르페스 바이러스 6(Human herpesvirus 6, HHV-6) 및 인간 헤르페스 바이러스 7 (HHV-7), 인간 메타뉴모바이러스(Human metapneumovirus, hMPV), 인유두종바이러스(Human papillomavirus, HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(Human parainfluenza viruses, HPIV), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), JC 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 킨젤라 킨가에(Kingella kingae), 클레브시엘라 글라눌로마티스(Klebsiella granulomatis), 쿠루 프리온(Kuru prion), 라싸 바이러스(Lassa virus), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 레슈마니아 속(Leishmania genus), 렙토스피라 속(Leptospira genus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 림프구성 맥락수막염바이러스(Lymphocytic choriomeningitis virus) (LCMV), 마츄포 바이러스(Machupo virus), 말라세지아 종(Malassezia spp), 마르부르그 바이러스(Marburg virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 메타고니무스 요카가와이(Metagonimus yokagawai), 마이크로스포리디아 필룸(Microsporidia phylum), 전염성 연속종 바이러스(Molluscum contagiosum virus) (MCV), 귀밑샘염 바이러스(Mumps virus), 나균(Mycobacterium leprae) 및 마이코박테리아 레프로마토시스(Mycobacterium lepromatosis), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 우르세란스(Mycobacterium ulcerans), 마이코플라즈마 폐렴(Mycoplasma pneumoniae), 파울러 자유아메바(Naegleria fowleri), 아메리카 구충(Necator americanus), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 수막염균(Neisseria meningitides), 노카디아 아스테로이드(Nocardia asteroids), 노카디아 종(Nocardia spp), 온코세르카 볼부루스(Onchocerca volvulus), 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi), 오르토믹소 바이러스과(Orthomyxoviridae family, 인플루엔자), 브라질 파라콕시디오이디즈(Paracoccidioides brasiliensis), 폐흡충종(Paragonimus spp), 폐디스토마(Paragonimus westermani), 파보바이러스(Parvovirus) B19, 파스퇴렐라 속(Pasteurella genus), 플라스모디움 속(Plasmodium genus), 폐포자충(Pneumocystis jirovecii), 폴리오바이러스(Poliovirus), 라비 바이러스(Rabies virus), 호흡기 합포체 바이러스(Respiratory syncytial virus, RSV), 리노바이러스(Rhinovirus), 리노바이러스, 리케치아 아카리(Rickettsia akari), 리케치아 속(Rickettsia genus), 발진티푸스 리케치아(Rickettsia prowazekii), 로키산 홍반열 리케치아(Rickettsia rickettsia), 발진열 리케치아(Rickettsia typhi), 리프트벨리열 바이러스(Rift Valley fever virus), 로타바이러스(Rotavirus), 풍진 바이러스(Rubella virus), 사비아 바이러스(Sabia virus), 살모넬라 속(Salmonella genus), 천공 개선충(Sarcoptes scabiei), SARS 코로나바이러스, 주혈흡충 속(Schistosoma genus), 중증열성혈소판감소증후군바이러스(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV), 시겔라 속(Shigella genus), 신놈브레 바이러스(Sin Nombre virus), 한타바이러스(Hantavirus), 스포로트릭스 셴키(Sporothrix schenckii), 스타필로코커스 속(Staphylococcus genus), 스타필로코커스 속, 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae), 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae), 화농성연쇄구균(Streptococcus pyogenes), 분선충(Strongyloides stercoralis), 테니아 속(Taenia genus), 유구조충(Taenia solium), 진드기매개뇌염(Tickborne encephalitis virus, TBEV), 견회충(Toxocara canis) 또는 고양이 회충(Toxocara cati), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 선모충(Trichinella spiralis), 질트리코 모나스(Trichomonas vaginalis), 백선균 종(Trichophyton spp), 편충(Trichuris trichiura), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 우레아플라즈마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 수두 대상 포진 바이러스(Varicella zoster virus) (VZV), 수두 대상 포진 바이러스 (VZV), 천연두 메이저(Variola major) 또는 천연두 마이너(Variola minor), vCJD 프리온, 베네스 웰라형 마뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 서부형 마뇌염 바이러스(Western equine encephalitis virus), 반크로프트 사상충(Wuchereria bancrofti), 황열병 바이러스(Yellow fever virus), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 및 여시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)로부터 유도될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
선택적인 측면에서, 코딩 영역(CR)은 종양 항원 도는 이의 단편, 이들의 변이체 또는 유도체인 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 열린해독틀(ORF)로 이루어질 수 있다. 종양 항원은 멜라닌 세포-특이적 항원, 고환암 항원 또는 종양 특이적 항원, 예를 들어, CT-X 항원, 비-X CT-항원, CT-X 항원에 대한 결합 파트너 또는 비-X CT-항원 또는 종양 특이적 항원에 대한 결합 파트너, 또는 종양-특이적 항원, 종양 항원의 변이체 또는 유도체일 수 있다.
이러한 종양 항원을 암호화하는 열린해독틀(ORF)은 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, 알파-5-베타-1-인테그린, 알파-5-베타-6-인테그린, 알파-액티닌-4/m, 알파-메틸아실-코엔자임 A 라세메이즈, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, 베타-카테닌/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, 칼레티쿨린(calreticulin), CAMEL, CASP-8/m, 카뎁신 B(cathepsin B), 카뎁신 L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, 코액토신-유사 단백질, 콜라주(collage) XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, 사이클린 B1, 사이클린 D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEKCAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, 헵신, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, 호메오박스 NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, 미숙 라미닌 수용체, 칼리크레인(kallikrein)-2, 크레인-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, 맘마글로빈(mammaglobin) A, MART-1/멜란-A, MART-2, MART-2/m, 기질 단백질(matrix protein) 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, 메소텔린(mesothelin), MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-항원, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, 미오신 클래스 I/m, NA88-A, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V, 네오-PAP, 네오-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, p15, p190 마이너 bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-키나제, Pin-1, Pml/PAR알파, POTE, PRAME, PRDX5/m, 프로스테인, 프로테이나제-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, 서바이빈, 서바이빈-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGF베타, TGF베타RII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, 티로시나제, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1, WT1 및 림프성 혈구의 면역글로불린 유전자형 또는 림프구 혈구의 T 세포 수용체 유전자형, 또는 이들의 단편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 전사체 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 예시적인 측면에서, 코딩 영역(CR)은 치료적 단백질/펩타이드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체인 단백질/펩타이드를 암호화하는 열린해독틀(ORF)로 이루어질 수 있다.
치료 단백질은 유전적 결함의 변형 및 치료, 암 세포 또는 병원체 감염된 세포의 파괴, 면역계 질환 치료, 대사성 또는 내분비 질환의 치료를 할 수 있는, 치료제의 생성에 중요한 역할을 수행할 수 있다. 일례로, 치료 단백질은 유전적 또는 후천적인 것과 독립적으로, 예를 들어 감염성 질병, 종양(neoplasm) (예를 들어 암 또는 종양 질환), 혈액 및 혈액 형성 기관의 질병, 내분비, 영양 및 대사성 질병, 신경계 질병, 순환계 질병, 호흡계 질병, 소환계 질병, 피부 및 피하 조직 질병, 근골격계 질병 및 결합 조직, 및 비뇨생식기계 질병과 같은 다양한 질병의 치료를 포함하는 다양한 목적으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 대사성 또는 내분비 질환의 치료에 사용될 수 있는 단백질(단백질 치료에 사용되는 특정 질병)은 산 스핑고미엘리나아제(Acid sphingomyelinase)(니만 피크병, Niemann-Pick disease), 아디포티드(Adipotide) (비만), 아갈시다제-베타(Agalsidase-beta)(인간 갈락토시다제 A)(파브리 병(Fabry disease); 신장 및 심혈관 합병증을 유도하는 지질의 축적을 방지), 알글루코시다제(Alglucosidase)(폼페병(Pompe disease; 글리코겐 저장 질병 타입 Ⅱ), 알파-갈락토시다제 A(알파-GAL A, 아갈시다제 알파)(파브리 질병), 알파-글루코시다제(글리코겐 저장 질병(GSD), 폼페 병(Morbus Pompe)), 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase) (뮤코다당증 (MPS), 후를러 증후군(Hurler syndrome), 샤이 증후군(Scheie syndrome)), 알파-N-아세틸글루코사미니다제(alpha-Nacetylglucosaminidase)(산필립포 증후군, Sanfilippo syndrome), 암피레굴린(Amphiregulin) (암, 대사성 질환), 안지오포이에틴(Angiopoietin) ((Ang1, Ang2, Ang3, Ang4, ANGPTL2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6, ANGPTL7) (혈관 형성, 혈관 안정), 부타세룰린(Betacellulin) (대사성 질환), 베타-글루쿠로니다제(Beta-glucuronidase)(슬리 증후군(Sly syndrome)), 골 형태발생 단백질(Bone morphogenetic protein) BMPs(BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP10, BMP15) (재생적 영향, 뼈 관련 증상, 만성 신장 질환(CKD)), CLN6 단백질 (CLN6 질병 - 비정형 후기 영아(Atypical Late Infantile), 늦은 발병 변이(Late Onset variant), 조기 유년(Early Juvenile), 뉴런 세로이드 리포푸시노스(Neuronal Ceroid Lipofuscinoses, NCL)), 표피 성장 인자(EGF) (상처 치료, 세포 성장, 증식 및 분화의 조절), 에피겐(Epigen)(대사성 질환), 에피레귤린(Epiregulin) (대사성 질환), 섬유아세포 성장촉진 인자(Fibroblast Growth Factor)(FGF, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13,FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23)(상처 치료, 혈관 생성, 내분비 질환, 조직 재생), 갈술파제(Galsulphase) (뮤코다당침착(Mucopolysaccharidosis) VI), 그렐린 (Ghrelin)(과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS), 비만, 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome), 타입 Ⅱ 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 글루코세레브로시다아제(Glucocerebrosidase) (고셰병(Gaucher's disease)), GM-CSF (재생적 효과, 백혈구 생산, 암), 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자(HB-EGF)(상처 치료, 심장 비대 및 심장 발달 및 기능), 간세포 생장 인자(Hepatocyte growth factor, HGF) (재생 효과, 상처 치료), 헵시딘(Hepcidin)(철 대사 질환, 베타 지중해 빈혈(Beta-thalassemia)), 인간 알부민(알부민의 감소된 생산 (저단백혈증), 증가된 알부민의 감소(신장 증후군), 하이포볼레미아(hypovolaemia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinaemia)), 이둘설파제(Idursulphase) (이두로네이트-2-설파타제, Iduronate-2-sulphatase)(뮤코다당침착(Mucopolysaccharidosis)Ⅱ(헌터 증후군, Hunter syndrome)), 인테그린 αVβ3, αVβ5 및 α5β1(결합 기질 고분자 및 단백질분해효소(Bind matrix macromolecules and proteinases), 혈관 생성), 이우두로네이트 설파타제(Iuduronate sulfatase)(헌터 증후군(Hunter syndrome)), 라로니다제(Laronidase) (뮤코다당침착 I의 후를러 및 후를러-샤이 형태), N-아세틸갈락토사민-4-설파타제(rhASB; 갈설파제(galsulfase), 아릴설파타제 A(Arylsulfatase A)(ARSA), 아릴설파타제 B(ARSB))(아릴설파타제 B 결핍, 마로토-라미 증후군(Maroteaux-Lamy syndrome), 뮤코다당침착 VI), N-아세틸글루코사민-6-설파타제(N-acetylglucosamine-6-sulfatase)(산필리포 증후군(Sanfilippo syndrome)), 신경 성장 인자(Nerve growth factor) (NGF, 뇌 유도된 신경영양성 인자(Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF), 뉴로트로핀-3(Neurotrophin-3, NT-3), 및 뉴로트로핀 4/5(NT-4/5)(재생 효과, 심혈관 질병, 관상동맥 죽상경화증(coronary atherosclerosis), 비만, 제2형 당뇨병, 대사성 증후군, 급성 관동맥 증후군, 치매, 우울증, 정신 분열병(schizophrenia), 자폐증, 레트 증후군(Rett syndrome), 신경성 무식욕증(anorexia nervosa), 신경성 식욕 항진증(bulimia nervosa), 상처 치료, 피부 궤양, 각막 궤양, 알츠하이머병), 뉴레귤린(Neuregulin) (NRG1, NRG2, NRG3, NRG4) (대사성 질환, 정신 분열병), 뉴로필린(Neuropilin) (NRP-1, NRP-2) (혈관 생성, 축색 돌기 유도(axon guidance), 세포 생존, 이동), 오베스타틴(Obestatin) (과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS), 비만, 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome), 제2형 진성 당뇨병), 혈소판 유래 증식 인자(Platelet Derived Growth factor)(PDGF (PDFF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D) (재생 효과, 상처 치료, 혈관 생성에 질환, 동맥 경화증, 섬유증, 암), TGF 베타 수용체 (엔도글린(endoglin), TGF-베타 1 수용체, TGF-베타 2 수용체, TGF-베타 3 수용체) (신장 섬유증(renal fibrosis), 신장 질병, 당뇨병, 궁극적 말기 신장 질환(ESRD), 혈관 생성), 트롬보포이에틴(THPO)(거대 핵세포(Megakaryocyte) 성장 및 발달 인자 (MGDF)) (혈소판 장애, 기증(donation)에 대한 혈소판, 골수 억제 항암 화학요법(myelosuppressive chemotherapy) 이후 혈소판 수의 회복, 변형 성장 인자(Transforming Growth factor) (TGF (TGF-알파, TGF-베타 (TGF베타1, TGF베타2, 및 TGF베타3)))(재생 효과, 상처 치료, 면역력, 암, 심장 질병, 당뇨병, 말판 증후군(Marfan syndrome), 로이 디에츠 증후군(Loeys-Dietz syndrome)), VEGF(VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F 및 PIGF) (재생 효과, 혈관 생성, 상처 치료, 암, 삼투성), 네시리타이드(Nesiritide) (급성 비 대상성 충혈성 심부전(Acute decompensated congestive heart failure), 트립신 (욕창(Decubitus ulcer), 정맥류성 궤양(varicose ulcer), 딱지(eschar)의 창상 절제(debridement), 열개성 상처(dehiscent wound), 화상(sunburn), 태변성 일레우스(meconium ileus)), 부신피질 자극호르몬(adrenocorticotrophic hormone, ACTH) ("에디슨 병, 소세포 암종, 부신백질 이영양증(Adrenoleukodystrophy), 선천성 부신 증식증(Congenital adrenal hyperplasia), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 넬슨 증후군(Nelson's syndrome), 유아성 경련(Infantile spasms)), 심방 나트륨이뇨 펩타이드(Atrial-natriuretic peptide, ANP) (내분비 질환), 콜레시스토키닌(Cholecystokinin) (다양한), 가스트린(Gastrin)(저가스트린혈증, hypogastrinemia), 렙틴(Leptin) (당뇨병(Diabetes), 과트리글리세라이드혈증(hypertriglyceridemia), 당뇨병), 옥시토신(Oxytocin) (모유 영양(breastfeeding) 자극, 분만의 비진행), 소마토스타틴(Somatostatin) (카르시노이드 증후군(carcinoid syndrome)의 대증 요법, 급성 정맥류 출혈(acute variceal bleeding), 및 말단 비대증(acromegaly), 간 및 신장의 다낭성 질병, 신경 내분비 종양에 의한 말단 비대증 및 증상), 바소프레신 (항이뇨 호르몬) (요붕증(diabetes insipidus)), 칼시토닌 (폐경기후 골다공증(Postmenopausal osteoporosis), 고칼슘혈증(Hypercalcaemia), 파제트병(Paget's disease), 골 전이, 환상지통(Phantom limb pain), 척추관 협착증(Spinal Stenosis)), 엑세나티드(Exenatide) (메트포민(metformin) 및 설포닐우레아(sulphonylurea)로 치료에 내성인 제2형 당뇨병), 성장 호르몬 (GH), 소마토트로핀 (GH 결핍 또는 만성 신부전식(chronic renal insufficiency)에 따른 성장 부전), 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome), 터너 증후군, 에이즈 낭비(AIDS wasting) 또는 항바이러스 치료와 함께 악액질(cachexia)), 인슐린 (진성 당뇨병, 당뇨병성 케토애시도시스(diabetic ketoacidosis), 고칼륨혈증(hyperkalaemia)), 인슐린 유사 성장 인자 1, IGF-1 (GH 유전자 결실 또는 심각한 주요 IGF1 결핍(severe primary IGF1 deficiency)로 어린이 성장 부전, 신경퇴행성 질병(neurodegenerative disease), 심혈관 질병, 심부전), 메카세르민 린파베이트(Mecasermin rinfabate), IGF-1 유사체(analog) (GH 유전자 결실 또는 심각한 주요 IGF1 결핍으로 어린이 성장 부전, 신경 퇴행성 질병, 심혈관 질병, 심부전), 메카세르민(Mecasermin), IGF-1 유사체 (GH 유전자 결실 또는 심각한 주요 IGF1 결핍으로 어린이 성장 부전, 신경퇴행성 질병, 심혈관 질병, 심부전), 페그비소만트(Pegvisomant) (말단 비대증(Acromegaly)), 프람린티드(Pramlintide) (진성 당뇨병, 인슐린과 조합), 테리파라타이드(Teriparatide)(인간 파라티로이드 호르몬 잔기 1-34) (심한 골다공증, Severe osteoporosis), 베카프레르민(Becaplermin)(당뇨병성 궤양에 대한 창상 절제 부가(Debridement adjunct)), 디보테르민-알파(Dibotermin-alpha) (골 형태 발생 단백질 2(Bone morphogenetic protein 2)) (척추 융합술(Spinal fusion surgery), 골 상처 회복), 히스트렐린 아세테이트(Histrelin acetate) (고나도트로핀 방출 호르(gonadotropin releasing hormone); GnRH)(조숙(Precocious puberty)), 옥트레오타이드(Octreotide) (말단 비대증, VIP-분비 아데노마 및 전이성 암양종 종양(metastatic carcinoid tumours)의 증상 완화) 및 팔리페르민(Palifermin) (케라틴세포 생장인자(keratinocyte growth factor; KGF)) (화학 요법을 겪는 환자 내 심각한 구강 점막염, 상처 회복)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
한편, 혈액 질환, 순환계 질병, 호흡계 질병, 암 또는 종양 질병, 감염성 질병 또는 면역결핍증과 관련한 단백질(단백질 치료에 사용되는 특정 질병)은 알트플라제(Alteplase) (조직 플라스미노겐 활성자(tissue plasminogen activator); tPA) (폐색전(Pulmonary embolism), 심근경색(myocardial infarction), 급성 허혈성 발작(acute ischaemic stroke), 중심정맥 접근장치의 폐색(occlusion of central venous access devices)), 아니스트리플라제(Anistreplase) (혈전 용해), 안티트롬빈 III (AT-III) (유전적 AT-III 결핍, 혈전 색전증), 비발리루딘(Bivalirudin) (관상동맥 형성술 및 헤파린 유도 저혈소판증에 혈액 응고 위험의 감소), 다르베포이에틴-알파(Darbepoetin-alpha) (만성 신부전(renal insufficiency) 및 만성 신부전(renal failure)(+/- 투석)을 갖는 환자에 빈혈의 치료), 드로트리코긴-알파(Drotrecogin-alpha) (활성화된 단백질 C)(사망의 위험이 높은 중증 패혈증(severe sepsis)), 에리쓰로포이에틴(Erythropoietin), 에포에틴-알파(Epoetin-alpha), 에쓰로포이에틴(erthropoyetin)(만성 질병의 빈혈, 골수이형성(myelodysplasia), 신부전에 또는 화학요법에 따른 빈혈, 수술전 준비), 인자 IX (혈우병(Haemophilia) B), 인자 VIIa (혈우병 A 또는 B 및 인자 VIII 또는 인자 IX에 억제자를 갖는 환자의 출혈), 인자 VIII(혈우병 A), 레피루딘(Lepirudin) (헤파린 유도된 저혈소판증), 단백질 C 농축(concentrate) (정맥혈전증(Venous thrombosis), 전격성자반(Purpura fulminans)), 레테플라제(Reteplase) (tPA의 삭제 돌연변이) (급성 심근경색의 조절, 좌심실 기능의 증진), 스트렙토키나제(Streptokinase) (급성 진화 전층 심근경색(Acute evolving transmural myocardial infarction), 폐색전(pulmonary embolism), 심부정맥 혈전증(deep vein thrombosis), 동맥 혈전증 또는 색전증, 동정맥 캐뉼라의 폐색), 테넥테플라제(Tenecteplase) (급성 심근경색), 우로키나제(Urokinase) (폐색전), 엔지오스타틴(Angiostatin) (암), 항-CD22 면역독소 (재발된(relapsed) CD33+ 급성 골수 백혈병), 데니루킨 디프티톡스(Denileukin diftitox) (피부 T-세포 림프종(Cutaneous T-cell lymphoma, CTCL)), 이뮤노시아닌(Immunocyanin)(방광 및 전립선 암), MPS (메탈로팬스티물린, Metallopanstimulin)(암), 아플리베르셉트(Aflibercept) (비소 세포 폐암 (NSCLC), 전이성 대장암 (mCRC), 호르몬 불응성 전이성 전립선암, 습식 황반변성), 엔도스타틴(Endostatin)(암, 류마티스 관절염뿐만 아니라 크론병, 당뇨병성 망막증, 건선, 및 자궁 내막증과 같은 염증성 질병), 콜라게나제 (만성 피부 궤양의 창상 절제 및 중증 화상 부위, 듀푸이트렌 구축(Dupuytren's contracture), 페이로니병(Peyronie's disease)), 인간 디옥시-리보뉴클레아제 I, 도르나제(dornase) (낭포성 섬유증(Cystic fibrosis); 예견된 40%보다 큰 FVC를 갖는 선택된 환자에 호흡기 감염 감소), 히알루로니다제(Hyaluronidase) (주사된 약물, 특히 안과 수술 및 특정 조영제의 흡수 및 분산을 향상시키는 어쥬번트로 사용됨), 파파인(Papain)(욕창, 정맥류(varicose) 및 당뇨성 궤양, 화상, 수술 후 상처, 모소낭포 상처, 피하 조직 염증(carbuncles), 및 다른 상처와 같은 급성 및 만성 병변에 괴사 조직의 창상 절제 또는 고통(slough)의 액화(liquefication)), L-아스파라기나제(L-Asparaginase) (증식을 위한 외인성 아스파라긴을 필요로 하는, 급성 림프구성 백혈병), 페그-아스파라기나제(Peg-asparaginase) (증식을 위한 외인성 아스파라긴을 필요로 하는 급성 림프구성 백혈병), 라스부리카제(Rasburicase) (항암 치료중인 백혈병, 림프종, 및 고형 종양을 갖는 소아 환자는 종양 용해 증후군을 일으킬 수 있음), 인간 만성 고나도트로핀(Human chorionic gonadotropin, HCG)(보조 생식(Assisted reproduction)), 인간 난포 자극 호르몬(Human follicle-stimulating hormone, FSH) (보조 생식), 루트로핀-알파(Lutropin-alpha) (황체형성 호르몬 결핍과 함께 불임), 프로락틴(Prolactin) (프로락틴 혈증(Hypoprolactinemia), 혈청 프로락틴 결핍, 여성의 난소 기능 장애, 불안, 남자의 동맥성 발기 부전(arteriogenic erectile dysfunction), 조루(premature ejaculation), 정자 감소증(oligozoospermia), 정자 무력증(asthenospermia), 정액낭(seminal vesicles)의 기능 부전, 남성호르몬감소증(hypoandrogenism)), 알파-1-프로테이나제 억제자(선천성 트립신 결핍증(Congenital antitrypsin deficiency)), 락타제(Lactase) (락토스 소화 불능에 따른 가스, 팽만감(bloating), 경련 및 설사), 췌장 효소(Pancreatic enzymes) (리파제(lipase), 아밀라제(amylase), 프로테아제(protease)) (낭포성 섬유증(Cystic fibrosis), 만성 췌장염(chronic pancreatitis), 췌장 부전(pancreatic insufficiency), 포스트-빌로스 II 위 우회술(post-Billroth II gastric bypass surgery), 췌관 폐색(pancreatic duct obstruction), 지방변(steatorrhoea), 소화 불량(poor digestion), 가스, 팽만감), 아데노신 디아미나제(Adenosine deaminase) (페가데마제 보빈(pegademase bovine), PEG-ADA) (아데노신 디아미나제 결핍에 의한 중증 조합된 면역결핍 질병), 아바타셉트(Abatacept) (류마티스성 관절염(특히 TNF 알파 억제에 대해 내성(refractory)일 때)), 알레파셉트(Alefacept)(판 건선(Plaque Psoriasis)), 아나킨라(Anakinra) (류마티스성 관절염), 에타너셉트(Etanercept) (류마티스성 관절염, 다관절 과정 청소년 류마티스성 관절염(polyarticular-course juvenile rheumatoid arthritis), 건선 관절염, 강직성 척수염(ankylosing spondylitis), 판 건선, 강직성 척수염), 인터루킨-1 (IL-1) 수용체 길항제, 아나킨라(Anakinra) (류마티스성 관절염과 관련된 염증 및 연골 퇴행), 티물린(Thymulin) (신경퇴행성 질병, 류마티즘, 신경성 무식욕증), TNF-알파 길항자 (류마티스성 관절염, 강직성 척수염, 크론병, 건선, 화농성 한선염, 난치성 천식과 같은 자가면역 질환), 엔푸빌티드(Enfuvirtide) (HIV-1 감염), 및 티모신(Thymosin) α1(간염 B 및 C)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
코딩 영역(CR)을 구성하는 열린해독틀(ORF)의 길이는 제한이 없으며, 열린해독틀(ORF)의 길이에 따른 발현 효율은 본 개시에 따른 핵산 분자, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 치료 또는 예방을 위한 핵산 백신 등의 개발에서 큰 고려 대상이 아니다. Codon usage는 보통 다양한 종에서 단백질/펩타이드 발현에 영향을 미칠 수 있으나, 인간의 codon usage bias는 보통 단백질/펩타이드 발현에 큰 영향을 미치지 않는다고 알려져 있으므로, 인간을 대상으로 하는 핵산 백신이나 유전자 치료제를 개발할 때 고려 대상이 아니다. 다만, 시작 코돈(initial codon)은 Kozak 서열(예를 들어, GCCACC)을 가지고 있어야 하며, 종결 코돈 근처의 뉴클레오타이드 서열도 최적화할 필요가 있다. 필요한 경우, 코딩 영역(CR)에서 발현하고자 하는 유전자 또는 이의 전사체인 mRNA의 코돈 서열 중 세 번째 부분을 GC로 바꾸어 아미노산의 변화 없이 표적 유전자의 GC%를 증가시켜 mRNA의 안정성을 높일 수 있다.
선택적인 실시형태에서, 핵산 분자는 열린해독틀(ORF) 형태로 연결되는 코딩 영역(CR)의 발현 효율을 증가시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열이 더욱 삽입될 수 있다. 일례로, 핵산 분자는 번역 조절 요소, 예를 들어 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)에 인접하여 핵산 분자의 전사를 촉진하는 전사 조절 요소 (Transcription control element, TCCE)을 가질 수 있다. 예를 들어, 전사 조절 요소 (TCCE)은 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)의 상류에 위치할 수 있다. 이러한 전사 조절 요소(TCCE)은 특별히 제한되는 것은 아니며, 설명의 중복을 피하기 위해서 후술하는 재조합 발현 벡터 부분에서 상세히 설명한다.
그 외에도 핵산 분자는 전술한 번역 조절 요소(TLCE), 코딩 영역(CR) 및 전사 조절 요소(TCCE) 이외에도 코딩 영역(CR)을 구성하는 유전자 또는 이의 전사체 서열로 이루어진 열린해독틀(ORF)의 발현을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열이 삽입될 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)과 코딩 영역(CR)의 개시 코돈 사이에 Kozak 서열이 삽입될 수 있다.
아울러, 코딩 영역(CR)의 하류, 보다 구체적으로는 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)의 하류에 전사된 핵산 분자를 안정화시키면서, 코딩 영역(CR)에 존재하는 유전자 또는 이의 전사체 서열로 이루어지는 열린해독틀(ORF)의 번역 효율을 더욱 향상시킬 수 있는 폴리아데닐레이션 신호 서열 및/또는 폴리아데노신 서열 (PA)이 더욱 삽입될 수 있다.
예를 들어, 본 개시의 핵산 분자가 RNA 형태의 전사체 서열로 이루어지는 경우, 폴리아데노신 서열(PA)은 대략 25개 내지 대략 400개, 예를 들어, 30개 내지 400개, 50 내지 250개, 또는 60 내지 250개의 아데노신으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
다른 예시적인 실시형태에서, 본 개시의 핵산 분자가 DNA 형태의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 경우, 폴리아데닐레이션 신호 서열(PA)이 제 2 하류 번역 조절 서열(D-TLCE2)의 하류에 위치할 수 있다. 일례로, 폴리아데닐레이션 신호 서열(PA)은 SV40, 인간 성장호르몬(human growth factor, hGH), 소 성장 호르몬(Bovine Growth hormone, BGH) 또는 토끼 베타-글로빈(rabbit beta-globin, rbGlob) 등에서 유도한 것을 사용할 수 있지만, 본 개시가 이에 한정되지 않는다.
선택적으로, 폴리아데닐레이션 신호 서열 또는 폴리아데노신 서열(PA)은 다수의 아데노신, 예를 들어, 25개 내지 대략 400개, 30개 내지 400개, 50개 내지 250개, 또는 60개 내지 250개의 아데노신 또는 이의 전사 서열로 이루어진 2개의 뉴클레오타이드 사이에 5'- GATCATCAGT - 3'과 같은 신호 서열이 삽입된 서열로 이루어질 수도 있다.
핵산 분자에 코딩 영역 (CR)을 삽입하기 위하여 핵산 분자는 하나 이상의 클로닝 사이트, 바람직하게는 멀티플 클로닝 사이트(Multiple Cloning Site; MCS)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 클로닝 사이트는 하나 이상의 제한효소(restriction endonuclease) 인식 서열(recognition site) 및/또는 제한효소에 의해 절단되는 서열을 포함할 수 있다. 제한효소는 박테리아나 고세균 등에서 발견되는 자연적인 제한효소는 물론이고, 인위적으로 제조된 제한효소(예를 들어, Zinc finger nuclease이나 TAL effector의 DNA 결합 부위에 근거한 제한효소 또는 PNA-기반의 PNAznymes 등)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 자연적으로 일어나는 제한효소는 1) Type Ⅰ 제한효소 (인식 부위와 떨어지는 부위를 절단하고, ATP, S-adenosyl-L-methionine 및 마그네슘 이온을 필요로 함), 2) Type Ⅱ 제한효소 (인식부위 내부 또는 인식부위에서 약간 떨어진 특정 부위를 절단하며, 대부분 마그네슘 이온을 필요로 함), 3) Type Ⅲ 제한효소 (인식 부위에서 약간 떨어진 부위를 절단하며, ATP는 필요하지만, ATP의 가수분해는 필요 없음), 4) Type Ⅳ 제한효소 (메틸화, 하이드록시메틸화 또는 글루코실-하이드록시메틸화 등 변형된 부위를 표적으로 함), 5) Type Ⅴ 제한효소 (CRISPRs의 cas9-gRNA complex) 등으로 구분될 수 있다.
예를 들어, 다음과 같은 제한효소 인식 부위 및/또는 제한효소 절단 부위 (제한효소)를 사용할 수 있다. 5'-ATCGAT-3'(AngⅠ), 5'-AGGCCT-3'(AatⅠ), 5'-TGATCA-3'(AbaⅠ), 5'-GGATCC-3'(BamHⅠ), 5'-GCAGC(N)8-3'(BbvⅠ), 5'-(N)10CGA(N)6TGC(N)12-3'(BcgⅠ), 5'-(N)8GAG(N)5CTC(N)13-3'(BplⅠ), 5'-GTCTC(N)-3'(BsmAⅠ; Alw26Ⅰ), 5'-ACTGGN-3'(BsrⅠ), 5'-ATCGAT-3'(ClaⅠ), 5'-CTCTTCN-3'(EarⅠ), 5'-CTGAAG(N)16-3'(Eco57Ⅰ), 5'-GAATTC-3'(EcoRⅠ), 5'-CCWGG-3'(EcoRⅡ; W는 A 또는 T), 5'-GATATC-3'(EcoRⅤ), 5'-GGATG(N)9-3'(FokⅠ), 5'-GGCC-3'(HaeⅢ), 5'-AAGCTT-3'(HindⅢ), 5'-CCGG-3'(HpaⅢ), 5'-GGTGA(N)8-3'(HphⅠ), 5'-GGTACC-3'(KpnⅠ), 5'-GATC-3'(MboⅠ), 5'-ACGCGT-3'(MluⅠ), 5'-GCCGGC-3'(NaeⅠ), 5'-GATATG-3'(NdeⅡ), 5'-GCCGGC-3'(NgoMⅣ), 5'-CATG-3'(NlaⅢ), 5'-GCGGCCGC-3'(NotⅠ), 5'-TTAATTAA-3'(PacⅠ), 5'-CTGCAG-3'(PstⅠ), 5'-GAGCTC-3'(SacⅠ), 5'-CCGCGG-3'(SacⅡ), 5'-GTCGAC-3'(SalⅠ), 5'-GCATC(N)5-3'(SfaNⅠ), 5'-CCCGGG-3'(SmaⅠ), 5'-TCGA-3'(TaqⅠ), 5'-TCTAGA-3'(XbaⅠ), 5'-CTCGAG-3'(XhoⅠ), 5'-CGATCG-3'(PvuⅠ) 및 이들의 조합.
다른 예시적인 실시형태에서, 클로닝 사이트는 서열식별번호: 19로 이루어질 수도 있다.
핵산 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 예시적인 실시형태에 따르면, 본 개시에 따른 핵산 분자는 RNA 형태를 가질 수 있다. 코딩 영역(CR)이 전술한 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 열린해독틀(ORF)의 전사체 서열로 이루어지는 등 핵산 분자가 RNA 형태로 이루어지는 경우, DNA 형태의 핵산 분자에 비하여 유리하다.
첫째, RNA 형태의 핵산 분자는 그 특성상 DNA 형태의 핵산 분자와 달리, mRNA로의 전사를 위해서 숙주 세포의 핵 안으로 진입할 필요가 없다. 따라서 돌연변이 유발의 잠재적인 위험이 적고, 생체 내에서 빠르게 분해되기 때문에 안전하다. RNA 형태의 핵산 분자는 핵 내에서 숙주의 염색체 내로 끼어들어갈 가능성이 없으며, 숙주 세포에서 선별 생산하기 위해 사용하는 선별 마커인 항생제 저항 유전자가 RNA 핵산 분자의 제작에 불필요하고, RNA는 DNA에 비하여 반감기가 짧기 때문에 장기 유전자 변형 (persistence genetic transformation)을 유도하지 않는다. 즉, 일반적인 형태의 핵산 분자는 세포 안에 전달되어 단기간만 활성화되어 표적 펩타이드/단백질을 발현하고 수일 안에 효소학적 반응으로 파괴되지만, 최초 발현한 표적 펩타이드/단백질에 대한 특이적인 면역 반응은 남아 있다.
둘째, RNA 형태의 핵산 분자는 상대적으로 DNA 형태의 핵산 분자에 비하여 적은 양을 사용하더라도 원하는 생체 내 면역 반응을 유도할 수 있다. 전술한 바와 같이, RNA 형태의 핵산 분자는 DNA 형태의 핵산 분자와 달리, 핵으로 들어갈 필요가 없고, 세포막만을 통과하면 된다. 따라서, RNA 형태의 핵산 분자를 사용하면, DNA 형태의 핵산 분자보다 적은 양을 사용하더라도 같은 정도의 표적 펩타이드를 발현할 수 있다.
셋째, 모든 제작 공정을 인공적으로 제어할 수 있기 때문에, 생물학적 오염에 대한 위험 없이 소규모 GMP(good manufacturing practice) 생산 시설에서 안전하게 백신을 생산할 수 있다. RNA 형태의 핵산 분자는 소규모 GMP 실험실 수준의 시설만이 필요하며, 직접 감염원 (바이러스 혹은 병원성 미생물)을 다루지 않아도 되기 때문에 신속하게 다양한 백신을 제조, 생산할 수 있다.
넷째, RNA 형태의 핵산 분자는 naked DNA 핵산 분자에 비하여 더욱 강한 면역 반응을 유도할 수 있다. 이는 RNA 핵산 분자의 스템-루프 (stem-loop) 구조 및 RNA 자체 특성으로 인해 유도된 선천성 면역 반응과, 면역된 숙주 세포에서 발현된 표적 펩타이드/단백질에 의해 유도된 후천성 면역 반응이 상호 협력하여 나타내는 것으로 생각된다. 또한 RNA 핵산 분자 자체가 세포 내에서 복잡한 항원 복합체 (complex antigen)을 생산하고 이것이 항원 제시 세포의 MHC (major histocompatiblity complex; 주조직적합성복합체) class Ⅱ에 접근하여 이상적인 백신으로 작용할 수 있다.
다섯째, RNA 핵산 분자는 기존의 DNA 핵산 분자에 비하여 생산이 용이하다. 전술한 바와 같이, RNA 핵산 분자를 생산할 때 감염원을 직접 다룰 필요가 없으며, 대신 발현하고자 하는 감염원의 중화항체 유도 관련 부분 (중화 epitope)의 핵산 서열만을 인공적으로 합성하고, 시험관내 전사 (in vitro transcription, IVT)만으로 대량의 RNA 핵산 분자를 생산할 수 있다. 최근에는 IVT 반응과 관련된 시약, 특히 DNA-의존성 RNA 중합효소가 개선되어 소량의 DNA 주형 (template)을 이용하여 대량의 RNA를 1~2주 안에 신속하게 생산할 수 있다. 또한, 면역 반응을 유도하고자 하는 다수의 항원을 동시에 제작하여 혼합한 후 면역할 수 있으며, 발현하고자 하는 항원의 유전자 길이에 특별한 제약이 없어 RNA 핵산 분자 제작의 응용성 및 간편성이 증가할 수 있다.
다른 예시적인 측면에서, 핵산 분자는 3개 이상의 하류 번역 조절 요소를 포함할 수 있다. 도 2는 본 개시의 다른 예시적인 실시형태에 따라 관심유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드의 구성을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 핵산 분자는 번역 개시(translation initiation) 활성을 가지는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 번역 조절 요소(TLCE)와, 번역 조절 요소(TLCE)과 작동 가능하게 연결되며, 관심유전자(GOI)의 열린해독틀(ORF)로 이루어진 코딩 영역(coding region, CR)을 포함하고, 선택적으로 번역 조절 요소(TLCE)의 상류에 위치하는 전사 조절 요소(TCCE) 및/또는 폴리아데닐레이션 신호 서열(PA)을 포함할 수 있다. 번역 조절 요소(TLCE)는 코딩 영역(CR)의 상류에 위치하는 상류 번역 조절 요소(U-TLCE)와, 코딩 영역(CR)의 하류에 위치하는 하류 번역 조절 요소(D-TLCE)를 포함한다. 본 실시형태에서, 하류 번역 조절 요소(D-TLCE)는 코딩 영역(CR)과, 폴리아데닐레이션 신호 서열(PA) 사이에 순차적으로 위치하는 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1), 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2) 및 제 3 하류 번역 조절 요소(D-TLCE3)를 포함한다. 하류 번역 조절 요소(D-TLCE)가 제 3 하류 번역 조절 요소(D-TLCE3)를 포함한다는 점을 제외하면, 도 1을 참조하면서 설명한 제 1 실시형태의 핵산 분자와 동일할 수 있다.
일례로, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1), 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2) 및 제 3 하류 번역 조절 요소(D-TLCE3)는 각각 독립적으로 인간 troponin T1, solo skeletal type (TNNT1), 인간 albumin, 인간 ferritin light chain (FTL), 인간 C-C motif chemokine ligand (CCL19), 인간 associated migratory cell protein (AAMP), 인간 ribosomal protein S27 (RPS27) 및 인간 defensing alpha 5 (DEFA5)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1), 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2) 및 제 3 하류 번역 조절 요소(D-TLCE3)는 각각 독립적으로 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14로 구성되는 군에서 선택되는 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)는 인간 TNNT1 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 DEFA5 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 3 하류 번역 조절 요소(D-TLCE3)는 인간 FTL 또는 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
다른 예시적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)는 인간 albumin 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 DEFA5 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 3 하류 번역 조절 요소(D-TLCE3)는 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)는 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 FTL 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 3 하류 번역 조절 요소(D-TLCE3)는 인간 CCL19, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 제 1 하류 번역 조절 요소(D-TLCE1)는 인간 DEFA5 유래의 전사 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 2 하류 번역 조절 요소(D-TLCE2)는 인간 TNNT1 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 제 3 하류 번역 조절 요소(D-TLCE3)는 상기 인간 FTL 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함할 수 있다.
재조합 발현 벡터, 발현 컨스트럭트
도 1 및 도 2에 각각 도시된 핵산 분자는 재조합 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. 재조합 발현 벡터는 번역 개시 활성을 가지는 번역 조절 요소(TLCE; 예를 들어 U-TLCE 및 D-TLCE)와, 코딩 영역(CR)을 포함하고, 전사 조절 요소(TCCE) 및 또는 폴리아데닐레이션 신호 서열(PA)을 포함할 수 있다. 즉, 재조합 발현 벡터는 도 1 및 도 2를 참조하면서 설명한 핵산 분자를 포함할 수 있는데, 이 핵산 분자는 다른 핵산과 결합하여 융합 단백질 또는 융합 펩타이드를 암호화할 수도 있다.
예를 들면 벡터에는 바이러스 벡터(viral vectors), DNA 또는 RNA 발현 벡터(expression vectors), 플라스미드(plasmid), 코스미드(cosmid) 또는 파지벡터(phage vectors), CCA(cationic condensing agents)와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀(liposomes)으로 포장된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 프로듀서 세포(producer cells)와 같은 특정 진핵세포(eukaryotic cells) 등이 포함된다.
예시적으로, 본 개시의 핵산 분자는 포유동물 세포 내로 들어가서 발현되도록 구성될 수 있다. 이러한 구성은 감염성 질환의 치료 및/또는 예방 목적에 사용하는 데에 특히 유용할 수 있다. 핵산 분자를 숙주 세포 내에서 발현시키는 데에는 많은 방법이 있으며 적절한 어느 방법도 사용 가능하다. 예를 들어, 본 개시에 따른 핵산 분자는 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노-연관 바이러스 (adeno-associated virus), 레트로 바이러스 (retrovirus), 백시니아 (vaccinia) 또는 다른 폭스 바이러스 (e.q., avian pox virus) 등의 바이러스 벡터에 삽입이 가능하다. 하나의 예시적인 실시형태에 따르면, 전술한 핵산 분자를 적절한 벡터에 삽입한 뒤에 시험관내 전사(in vitro transcription, IVT)를 통하여 RNA 형태의 핵산 분자로 변형될 수 있다.
핵산 분자, 예컨대 DNA를 이러한 벡터에 삽입시키는 기술에 관해서는 이미 잘 알려져 있다. 레트로 바이러스 벡터에는 형질도입 된 세포들의 확인 또는 선택을 쉽게 해 주는 선택 마커 (selectable marker)에 대한 유전자 및/또는 특정한 표적 세포에 대한 수용체 역할을 하는 리간드(ligand)를 암호화하는 유전자와 같은 표적 부위(targeting moiety)를 부가적으로 삽입시킬 수 있다. 표적(targeting)은 또한 항체를 이용한 공지의 방법에 의해서도 이루어질 수 있다.
입수 가능하고 본 개시가 속하는 기술분야에 공지된 다수의 벡터를 본 개시의 목적에 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산 분자의 크기 및 벡터로 형질전환 되는 특정한 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능(이종 폴리뉴클레오타이드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 벡터가 존재하는 특정한 숙주 세포와의 상용성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점(특히 벡터가 원핵세포에 삽입되는 경우), 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및/또는 전사 종결 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 본 개시에 따른 발현 벡터는 코딩 영역(CR) 내에 암호화된 단백질 및/또는 펩타이드(일례로, 리포터 단백질/펩타이드, 항원, 치료용 단백질/펩타이드)의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 요소, 예를 들어, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐레이션 신호 서열, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다. 폴리아데닐레이션 신호 서열(PA)은 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 한다. 인핸서 서열은 프로모터에서 다양한 부위에 위치하여 인핸서 서열이 없을 때의 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 염기서열이다.
숙주가 에스케리키아 (Escherichia) 속 균인 경우에는 신호 서열은 PhoA 신호서열, OmpA 신호서열 등이, 숙주가 바실러스 (Bacillus)속 균인 경우에는 α-아밀라아제 신호서열, 서브틸리신 신호서열 등을 이용할 수 있다. 숙주가 효모인 경우에는 신호 서열은 MF-α 신호서열, SUC2 신호서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 신호서열, a-인터페론 신호서열, 항체 분자 신호서열 등을 이용할 수 있으나, 본 개시가 이에 제한되지 않는다.
벡터의 한 유형은 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 그 내부에 라이게이션(ligation)될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 “플라스미드”이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션 될 수 있는 바이러스 벡터이다. 어떤 벡터(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다. 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주의 게놈과 함께 복제된다. 또한, 한 어떤 벡터는 벡터가 작동 가능하게 연결된 열린해독틀 형태의 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터가 본 명세에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "재조합 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다.
본 개시의 구체적인 실시형태에서, 핵산 분자는 바이러스 발현 시스템 (백시니아 또는 다른 폭스 바이러스, 레트로 바이러스 또는 아데노바이러스)을 이용하여 숙주 세포로 삽입될 수 있다. 예시적으로, 바이러스 벡터에는 HIV, SIV, 설치류 레트로 바이러스 (murine retroviruses), 기본 백혈병 바이러스 (gibbon ape leukemia virus), AAVs (adeno-associated viruses) 및 아데노바이러스 (adenoviruses) 등에서 유도된 레트로 바이러스 벡터를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다(Miller et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10:4239; J. Kolberg 1992, NIH Res. 4:43; Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther. 2:215). 설치류 백혈병 바이러스 (murine leukemia virus, MuLV), 기본 백혈병 바이러스 (gibbon ape leukemia virus, GaLV), 에코트로픽 레트로바이러스 (ecotropic retroviruses), SIV (simian immunodeficiency virus), HIV (human immunodeficiency virus) 등에서 유도된 레트로 바이러스 벡터들이 널리 사용되고 있다(Buchscher et al., 1992, J. Virol, 66(5):2731-2739; Johann et al., 1992, J. Virol. 66(5):1635-1640; Sommerfelt et al., 1990, Virol. 176:58-59; Wilson et al., 1989, J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., 1991, J. Virol. 65:2220-2224; Rosenberg and Fauci 1993 in Fundermental Immunology, Third Edition, W. E. Paul(ed.) Raven Press, Ltd., New York and the references therein; Miller et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:4239; R. Kolberg 1992, J. NIH Res. 4:43; Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther.2:215).
본 개시에 따른 벡터 시스템은 본 개시가 속하는 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 병합된다.
예를 들어, 본 개시의 벡터는 전형적으로 클로닝(cloning)을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 개시의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 개시에 이용될 수 있는 벡터는 본 개시가 속하는 기술분야에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, λGEM.TM.-11 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
구성적 또는 유도성 프로모터(예를 들어, 전사 조절 요소)는 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있는 특정한 상황의 필요에 따라 본 개시에 사용될 수 있다. 다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 소화를 통해 공급원 핵산 분자로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 선택 벡터 내로 삽입함으로써, 펩타이드 및/또는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 전사체의 열린해독틀(ORF)로 이루어진 코딩 영역(CR)을 가지는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터를 둘 다 사용하여 코딩 영역(CR)을 구성하는 유전자 또는 전사체의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 그러나, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 프로모터와 비교하여 발현된 관심유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 얻을 수 있기 때문에 바람직할 수 있다.
예를 들어, 본 개시의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등)와 같은 전사 조절 요소(TCCE), 번역을 개시하기 위한 번역 조절 서열(TLCE), 및 전사/번역 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J.Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 개시의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유도된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터) 또는 박테리오파지에서 유도한 프로모터(예: T7 프로모터, T3 프로모터, SM6 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐레이션 신호 서열(PA)을 일반적으로 갖는다.
또한, 본 개시의 재조합 벡터가 복제 가능한 발현 벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 또한, 재조합 벡터는 선별 마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 본 개시의 벡터는 선별 표지로서, 해당 기술분야에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 선별제(selective agent)로 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환 된 세포를 선별할 수 있다. 선별 마커의 대표적인 예로써, 영양 요구 마커 (auxotrophic marker)인 ura4, leu1, his3 등을 들 수 있으나 상기 예에 의해 본 개시에서 사용될 수 있는 선별 마커의 종류가 제한되는 것은 아니다.
발현 벡터에 서브클론 된 서열을 증폭시키는 여러 가지 시험관내 증폭 기법들(in vitro amplification techniques)이 알려져 있다. 이러한 기법에는 PCR (polymerase chain reaction), LCR (ligase chain reaction), Qβ-복제효소 증폭 (replicase amplification) 및 다른 RNA 중합효소를 이용한 기법들이 있다 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2nd Ed) 1-3; U.S. Patent No. 4,683,202; PCR protocols A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds. Academic Press Inc. San Diego, CA 1990. Improved methods of cloning in vitro amplified nucleic acids are described in U.S. Patent No. 5,426,039).
본 개시의 벡터는 그로부터 발현되는 재조합 단백질 또는 펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6 x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6 x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다. 필요한 경우에 이들 재조합 단백질의 세포외 분비를 촉진할 수 있도록 Fc 절편을 암호화하는 서열이 융합될 수도 있다.
본 개시의 예시적인 실시형태에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6 x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 재조합 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.
전술한 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 본 개시가 속하는 기술분야에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 개시의 벡터를 진핵 세포에 형질전환 시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포(예컨대 SF9 세포) 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 개시의 벡터는 세포를 세포내외(in vivo, ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 유전적으로 변형시키는데 이용될 수 있다. 세포를 유전적으로 변형시키는 방법으로는 세포를 바이러스 벡터로 감염 또는 형질도입 시키는 방법, 인산칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation), 수용체 세포 (recipient cells)를 DNA를 포함하는 세균 프로토플라스트(bacterial protoplasts)와 융합시키는 방법, 수용체 세포에 DNA를 포함하고 있는 리포좀(liposome) 또는 미세소구(microspheres)를 처리하는 방법, 엔도사이토시스(DEAE dextran, receptor-mediated endocytosis), 일렉트로포레이션(electroporation), 마이크로-인젝션(micro-injection) 등을 포함한 여러 가지 방법이 알려져 있다.
예를 들어 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114, 1973), 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580, 1983) 및/또는 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145, 1988) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479, 1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456, 11973), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841, 1982), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10: 87, 1980), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190, 1985), 및/또는 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572, 1990) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다. 숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 재조합 단백질 또는 재조합 펩타이드를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
전술한 핵산 분자 및/또는 유전자 전달체로서 전술한 핵산 분자가 삽입된 발현 시스템인 발현 컨스트럭트(construct)는 어떤 물질의 존재 여부를 검출하기 위한 검출 시스템, 면역 반응을 유도하기 위한 백신 및/또는 질병 치료를 위한 치료제로 활용될 수 있다.
일례로, 핵산 분자 또는 핵산 분자를 포함하는 발현 컨스트럭트의 약학적 유효량을 포함하는 백신 또는 치료제와 같은 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 희석제 및/또는 부형제를 포함할 포함할 수 있다. 본 명세서에서 “약학적 유효량”이란, 본 개시에 따른 핵산 분자의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 의미한다.
또한, 이러한 약학 조성물은 전술한 핵산 분자 또는 발현 컨스트럭트를 안정화시킬 수 있는 양이온성 폴리머, 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 폴리펩타이드와 같은 안정화제; 면역 반응을 강화시킬 수 있는 적어도 하나의 면역증강제; 지속-방출 제제; 및/또는 유효 성분인 핵산 분자를 보호하고 생체 주입 활성을 향상시킬 수 있는 지질나노입자(lipid nano particle, LNP)를 포함할 수 있다.
본 개시의 핵산 분자 또는 발현 컨스트럭트는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 경구, 국소 (협측 및 설하 포함), 직장, 질, 경피, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 피내, 경막내 및 경막외 및 비강내, 및 원하는 경우에 국부 치료, 병변내 투여를 위한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.
본 개시의 핵산 분자 또는 발현 컨스트럭트는 임의의 편리한 투여 형태, 예를 들어 정제, 분말, 캡슐, 용액, 분산액, 현탁액, 시럽, 분무제, 좌제, 겔, 에멀젼, 패치 등으로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 제약 제제에 통상적인 성분, 예를 들어 희석제, 담체, pH 조정제, 감미제, 벌킹제 및 추가의 활성제를 함유할 수 있다
이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 개시를 설명하지만, 본 개시가 하기 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다.
비교예 1: Renilla Luciferase (R/L) 암호화 서열이 삽입된 핵산 분자 제작
인플루엔자바이러스의 Hemagglutin (HA) 암호화 서열이 삽입된 핵산 분자를 제작하였다. 주형 DNA 서열은 다음과 같이 설계하였다.
5'- KpnⅠ 인식 서열 (GGTACC) - T7 프로모터 (서열식별번호: 16) - 인간 troponin T1 (TNNT1) 유래의 상류 번역 조절 요소(서열식별번호: 1) - PacⅠ 인식 서열 (TTAATTAA) - Kozak 서열 (GCCACC) - Renilla Luciferase 암호화 서열(R/L, 서열식별번호: 15) - ClaⅠ 인식 서열(ATCGAT) - 인간 troponin T1 (인간 TNNT1) 유래의 하류 번역 조절 요소(서열식별번호: 8) - EcoRⅠ 인식 서열 (GAATCC) - 폴리아데닐레이션 시그널 (서열식별번호: 17) - 제한 효소 인식 서열 (서열식별번호: 19).
주형 DNA를 pGH 벡터(서열식별번호: 18)의 하류에 삽입, 클로닝(cloning)하고 제한효소로 linearization시켜, in vitro transcription (IVT)를 통해 RNA 플랫폼 형태의 핵산 분자 (이하, "pHJ5L"라 함)를 제작하였다.
실시예 1: Renilla Luciferase (R/L) 암호화 서열이 삽입된 핵산 분자 제작
Renilla Luciferase를 암호화하는 코딩 영역의 하류에 단일 TNNT1 유래의 번역 조절 요소를 대신하여, 2개의 하류 번역 조절 요소를 삽입한 것을 제외하고, 비교예의 절차를 반복하였다. 2개의 하류 번역 조절 요소는 각각 독립적으로 서열식별번호: 8 (인간 TNNT1 유래), 서열식별번호: 9 (인간 albumin 유래), 서열식별번호: 10 (인간 FTL 유래), 서열식별번호: 11 (인간 CCL19 유래), 서열식별번호: 12 (인간 AAMP 유래), 서열식별번호: 13 (인간 RPS27 유래) 및 서열식별번호: 14 (인간 DEFA5 유래)로 구성되는 군에서 선택되었다. 이하, 서열식별번호: 8의 하류 번역 조절 요소를 'A', 서열식별번호: 9의 하류 번역 조절 요소를 'B', 서열식별번호: 10의 하류 번역 조절 요소를 'C', 서열식별번호: 11의 하류 번역 조절 요소를 'D', 서열식별번호: 12의 하류 번역 조절 요소를 'E', 서열식별번호: 13의 하류 번역 조절 요소를 'F', 서열식별번호: 14의 하류 번역 조절 요소를 'G'로 각각 약칭하여 표시한다.
실험예 1: 생체 외 발현
마우스 근육 세포주인 Nor10, 인간 유도의 증식 세포주인 HeLa 및 인간 배아 신장 세포주인 293A 세포주를 각각 48-well plate에 8x104 cells/well의 농도로 접종시켰다. 그 후 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 넣어 24시간 세포가 부착하고 자랄 수 있게 하였다. 비교예 및 실시예에서 제조된 각 mRNA는 500 ng/well의 농도로 형질전환 시켰다. Lipofectamine 2000™은 각각의 mRNA 1 ㎍당 1 ㎕를 사용하여 OPTI-MEM 배지에서 충분히 섞일 수 있도록 30분 이상 처리하였다. mRNA와 Lipofectamine 2000™이 섞이면 세포가 부착된 48-well 플레이트를 꺼내 상층액을 제거하고 PBS로 씻어준 후 다시 제거하였다. 그 위에 배지를 100 ㎕ 넣고 mRNA와 Lipofectamine 2000™의 혼합물을 100 ㎕ 넣었다.
이 때 음성 대조군은 200 ㎕의 배지만 넣었다. 플레이트를 다시 37℃ 인큐베이터에 넣고 6시간과 24시간이 되는 시간에 꺼내서 발현을 확인하였다. 6시간과 24시간이 경과하였을 때, 플레이트를 꺼내 상층액을 모두 제거하고, PBS로 1회 씻어, 그 위에 renilla lucifeares assay system kit (Promega)에 있는 renilla lysis buffer를 80 ㎕씩 넣어 세포를 충분히 파괴해준 뒤 키트의 설명대로 renilla luciferase의 발현 정도를 spectrophotometer로 발광을 측정하였다.
비교예에서 제작된 pHJ5L 핵산 분자를 적용한 Nor10 세포주에서 6시간 경과 후 Renilla Luciferase의 발현량은 2X107, 24시간 경화 후 Renilla Luciferase의 발현량은 2X106이었다. 비교예에서 제작된 pHJ5L 핵산 분자를 적용한 HeLa 세포주에서 6시간 경과 후 Renilla Luciferase의 발현량은 7X107, 24시간 경화 후 Renilla Luciferase의 발현량은 5.5X106이었다. 비교예에서 제작된 pHJ5L 핵산 분자를 적용한 293A 세포주에서 6시간 경과 후 Renilla Luciferase의 발현량은 4.3X107, 24시간 경화 후 Renilla Luciferase의 발현량은 2.2X106이었다.
기본 주형이 되는 핵산 발현 플랫폼은 비교예에서 제조된 pHJ5L로서 이 플랫폼에서 Renilla Luciferase의 발현량을 1로 설정하고, 실시예 1에서 각각 제작된 RNA 발현 플랫폼에서 Renilla Luciferase의 발현량을 pHJ5L에서의 발현량과 비교하였다. 측정 결과를 도 3 내지 도 8에 나타낸다. 도 3 내지 도 8에 나타낸 바와 같이, 2개의 하류 번역 조절 요소가 코딩 영역과 3' 말단 사이에 삽입된 실시예에서 제조된 핵산 분자는 Nor10 세포주, HeLa 세포주, 293A 세포주에서 모두 코딩 영역으로 삽입된 Renilla Luciferase의 발현을 효율적으로 향상시켰다.
실험예 2: 생체 내 발현
비교예 및 실시예 1에서 각각 제작된 mRNA를 LNP(모더나 백신에서 사용된 것과 동일)와 formulation하여, 생체 주입용 조성물을 제조하였다. 마우스는 호흡 마취를 통해 마취한 뒤, 귀를 고정시켰다. 각각의 마우스 귀로 비교예 및 실시예에서 제조된 mRNA가 formulation된 조성물을 5 ㎍/20 ㎕의 농도로 주사하였다. 주사 후 6시간과 24시간에 각각 마우스를 희생하여 귀를 잘라 300 ㎕의 renilla lysis buffer에 담아 가위로 잘게 절단하였다. 절단한 마우스의 귀는 homogenizer를 이용해 더욱 잘게 갈아서 상층액을 하얀색 96-well 플레이트에 20 ㎕씩 넣었다. 이후 renilla luciferase assay kit에 있는 renilla substrate를 이용하여 spectrophotometer로 발광을 측정하였다. 기본 주형이 되는 핵산 발현 플랫폼은 비교예에서 제조된 pHJ5L로서 이 플랫폼에서 Renilla Luciferase의 발현량을 1로 두고, 실시예에서 각각 제작된 RNA 발현 플랫폼에서 Renilla Luciferase의 발현량을 pHJ5L에서의 발현량과 비교하였다. 측정 결과를 도 9와 도 10에 나타낸다. 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 코딩 영역과 3' 말단 사이에 2개의 하류 번역 조절 요소가 삽입된 핵산 분자로부터 Renilla Luciferase의 발현량이 증가하였다.
실시예 2: Renilla Luciferase (R/L) 암호화 서열이 삽입된 핵산 분자 제작
Renilla Luciferase를 암호화하는 코딩 영역의 하류에 2개의 하류 번역 조절 요소를 삽입한 것을 대신하여, 3개의 하류 번역 조절 요소를 삽입한 것을 제외하고, 실시예 1의 절차를 반복하였다. 3개의 하류 번역 조절 요소는 각각 독립적으로 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 하류 번역 조절 요소를 사용하였다.
실험예 3: 생체 외 발현
실시예 2에서 제작한 핵산 분자를 실험예 1과 동일한 방법으로 인간 배아 신장 세포주인 293 A 세포주에 형질전환 시키고, renilla luciferased의 발현 정도를 spectrophotometer로 발광을 측정하였다. 기본 주형이 되는 핵산 발현 플랫폼은 비교예에서 제조된 pHJ5L로서 이 플랫폼에서 Renilla Luciferase의 발현량을 1로 설정하고, 실시예 2에서 각각 제작된 RNA 발현 플랫폼에서 Renilla Luciferase의 발현량을 pHJ5L에서의 발현량과 비교하였다. 측정 결과를 도 11 및 도 12에 나타낸다. 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 3개의 하류 번역 조절 요소가 코딩 영역과 3' 말단 사이에 삽입된 실시예에서 제조된 핵산 분자는 293A 세포주에서 모두 코딩 영역으로 삽입된 Renilla Luciferase의 발현을 효율적으로 향상시켰다.
상기에서는 본 개시의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 개시를 설명하였으나, 본 개시가 상기 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되는 것은 아니다. 오히려 본 개시가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예를 토대로 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 개시의 권리범위에 속한다는 점은, 첨부하는 청구범위에서 분명하다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (28)

  1. 번역 조절 요소; 및
    상기 번역 조절 요소와 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역을 포함하고,
    상기 번역 조절 요소는 상기 코딩 영역의 상류(upstream)에 위치하는 상류 번역 조절 요소와, 상기 코딩 영역의 하류(downstream)에 위치하는 하류 번역 조절 요소를 포함하고,
    상기 하류 번역 조절 요소는 복수의 하류 번역 조절 요소를 포함하는 핵산 분자.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 하류 번역 조절 요소는 상기 코딩 영역의 하류에 위치하는 제 1 하류 번역 조절 요소 및 제 2 하류 번역 조절 요소를 포함하는 핵산 분자.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 복수의 하류 번역 조절 요소는 각각 인간 troponin T1, solo skeletal type (인간 TNNT1), 인간 albumin, 인간 ferritin light chain (인간 FTL), 인간 C-C motif chemokine ligand (인간 CCL19), 인간 associated migratory cell protein (인간 AAMP), 인간 ribosomal protein S27 (인간 RPS27) 및 인간 defensing alpha 5 (인간 DEFA5)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 복수의 하류 번역 조절 요소는 각각 독립적으로 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14로 구성되는 군에서 선택되는 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고,
    상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 albumin, 상기 인간 FTL, 상기 인간 CCL19, 상기 인간 AAMP, 상기 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  6. 제 2항에 있어서,
    상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 albumin 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고,
    상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 DEFA5 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  7. 제 2항에 있어서,
    상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 FTL 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1, 상기 인간 FTL, 상기 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  8. 제 2항에 있어서,
    상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 CCL19 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1, 상기 인간 FTL, 상기 인간 CCL19, 상기 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  9. 제 2항에 있어서,
    상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 AAMP 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 albumin, 상기 인간 FTL, 상기 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  10. 제 2항에 있어서,
    상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1, 상기 인간 albumin, 상기 인간 FTL, 상기 인간 CCL19, 상기 인간 AAMP, 상기 인간 RPS27 및 상기 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  11. 제 2항에 있어서,
    상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 DEFA5 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1, 상기 인간 albumin, 상기 인간 FTL, 상기 인간 CCL19, 상기 인간 AAMP 및 상기 인간 RPS27로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  12. 제 2항에 있어서,
    상기 하류 번역 조절 요소는 상기 제 2 하류 번역 조절 요소의 하류에 위치하는 제 3 하류 번역 조절 요소를 더욱 포함하는 핵산 분자.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 제 3 하류 번역 조절 요소는 인간 troponin T1, solo skeletal type (TNNT1), 인간 albumin, 인간 ferritin light chain (FTL), 인간 C-C motif chemokine ligand (CCL19), 인간 associated migratory cell protein (AAMP), 인간 ribosomal protein S27 (RPS27) 및 인간 defensing alpha 5 (DEFA5)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 DEFA5 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 3 하류 번역 조절 요소는 인간 FTL 또는 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  15. 제 12항에 있어서,
    상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 albumin 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 DEFA5 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 3 하류 번역 조절 요소는 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  16. 제 12항에 있어서,
    상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 인간 RPS27 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 인간 FTL 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 3 하류 번역 조절 요소는 인간 CCL19, 인간 RPS27 및 인간 DEFA5로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  17. 제 12항에 있어서,
    상기 제 1 하류 번역 조절 요소는 인간 DEFA5 유래의 전사 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 2 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 TNNT1 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하고, 상기 제 3 하류 번역 조절 요소는 상기 인간 FTL 유래의 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  18. 제 1항에 있어서,
    상기 상류 번역 조절 요소는 인간 troponin T1, solo skeletal type (인간 TNNT1), 인간 albumin, 인간 ferritin light chain (인간 FTL), 인간 C-C motif chemokine ligand (인간 CCL19), 인간 associated migratory cell protein (인간 AAMP), 인간 ribosomal protein S27 (인간 RPS27) 및 인간 defensing alpha 5 (인간 DEFA5)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나에서 유래한 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  19. 제 1항에 있어서,
    상기 상류 번역 조절 요소는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 7로 구성되는 군에서 선택되는 번역 조절 요소 또는 이의 전사체 서열을 포함하는 핵산 분자.
  20. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 RNA인 핵산 분자.
  21. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산 분자는, 상기 코딩 영역과 작동 가능하게 연결되는 전사 조절 요소를 더욱 포함하는 핵산 분자.
  22. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 상기 하류 번역 조절 서열의 하류에 위치하는 폴리아데닐레이션 신호 서열 또는 폴리아데노신 서열을 더욱 포함하는 핵산 분자.
  23. 제 1항에 있어서,
    상기 코딩 영역은 리포터 단백질 또는 이의 단편, 및 마커(marker) 또는 선별 단백질 또는 이의 단편 중에서 적어도 하나를 암호화하는 핵산 분자.
  24. 제 1항에 있어서,
    상기 코딩 영역은 항원 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 항원은 병원성 항원, 종양 항원, 또는 이들의 변이체 또는 유도체인 펩타이드를 포함하는 핵산 분자.
  26. 제 1항에 있어서,
    상기 코딩 영역은 질병 치료를 위한 펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자.
  27. 제 1항에 기재된 핵산 분자가 삽입된 재조합 발현 벡터.
  28. 제 1항에 기재된 핵산 분자 또는 제 1항에 기재된 핵산 분자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 생체 내에 주입하고, 상기 주입된 핵산 분자로부터 단백질 또는 펩타이드를 발현시켜 상기 단백질 또는 펩타이드를 제조하는 방법.
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