KR20240102867A - 칸나비제롤산 및 이의 유도체를 생산하는 재조합 미생물 및 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 변이를 포함하는 폴리펩타이드, 재조합 벡터, 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산용 재조합 미생물, 및 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산용 재조합 미생물은 생합성 반응성이 증가되어, 칸나비제롤산 및 이의 유도체를 안정적으로 대량생산할 수 있으며, 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산방법은 낮은 생산단가에 높은 생산성 및 수율로 다양한 칸나비노이드를 생산할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산용 재조합 미생물은 생합성 반응성이 증가되어, 칸나비제롤산 및 이의 유도체를 안정적으로 대량생산할 수 있으며, 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산방법은 낮은 생산단가에 높은 생산성 및 수율로 다양한 칸나비노이드를 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 변이를 포함하는 재조합 벡터, 칸나비제롤산 및 이의 유도체를 생산하는 재조합 미생물 및 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산방법에 관한 것이다.
대마(Cannabis sativa)에는 480개 이상의 천연 성분이 있으며, 그 중 66개는 칸나비노이드로 분류된다. 대표적인 칸나비노이드는 테트라하이드로칸나비놀(THC), 칸나비디올(CBD), 칸나비크로멘(CBC), 칸나비제롤(CBG), 칸나비놀(CBN), 칸나비엘소인(CBE), 칸나비트리올(CBT), 칸나비사이클롤(CBL) 등이 있다. 이 중 테트라하이드로칸나비놀(THC)은 중독을 일으키는 물질인 반면, 칸나비디올(CBD)은 THC와 달리 향정신성 효과가 없으며, 오히려 THC의 향정신적 부작용에 대응하는 항불안 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이에 CBD는 부상, 충돌, 타박상 등의 통증, 관절염을 포함한 각종 염증, 불안과 공황장애, 메스꺼움과 구토, 발작과 경련장애, 여드름, 발진과 습진을 포함한 피부증상 개선 등에 사용되고 있다. 칸나비제롤(CBG)은 의료분야에서 다양하게 응용될 수 있는 비정신성 칸나비노이드이다. CBG는 엔도칸나비노이드 시스템에서 CB1과 CB2 수용체와 상호작용하면서 도파민 수치를 증가시켜 수면, 기분, 식욕을 조절하며 뇌에서 GABA(가바수용체) 흡수를 방해하고 세로토닌 수용체를 차단하는 것으로 알려져 있다. CBG는 불안과 우울증, 녹내장과 관련된 안압 등을 낮추며 암세포 성장을 유발하는 수용체를 차단하며 황색포도상구균(MRSA)을 퇴치하기도 한다. 또 염증성 장질환, 신경세포 퇴화, 식욕자극과 방광기능 장애에도 효과적이다.
천연 화합물의 프레닐화는 구조적 다양성을 부가하고, 생물학적 활성을 변화시키고, 치료 가능성을 향상시키는 것으로 알려져 있으나, 프레닐화 화합물(prenylated compound)은 자연적으로 풍부하지 않거나, 분리가 어려운 경우가 많다. 일부 프레닐화 천연 생성물에는 효과가 확인된 프레닐-플라바노이드, 프레닐-스틸베노이드 및 칸나비노이드 등 다양한 종류의 생리활성 분자들이 포함된다. 이 중 대마에 포함된 테트라하이드로칸나비놀(THC)과 칸나비디올(CBD) 등의 칸나비노이드는 그 함유량이 너무 적어 추출이 어렵고 고가여서 의료용 사용은 물론 연구에도 어려움이 있는 것으로 알려져 있다.
칸나비노이드는 인간 내재성 칸나비노이드 시스템(human endocannabinoid system)의 칸나비노이드 수용체(CB1 및 CB2)를 조절하는 생물활성 식물 유래의 천연 생성물의 한 부류로서, 구토, 경련, 진통 및 우울증 억제 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 실제로, 칸나비노이드 요법은 화학요법으로 유발된 메스꺼움, MS 경련 및 중증 간질과 연관된 발작을 치료하기 위한 요법으로 FDA 승인을 받은 것으로 파악된다. 그러나, 이러한 치료 가능성에도 불구하고, 약제학적 등급(>99%)의 칸나비노이드의 생산은 여전히 해결해야할 기술적 과제를 보유하고 있다. 마리화나 및 대마(hemp) 등의 대마 식물(cannabis plant)은 다양한 소량의 칸나비노이드 및 다량의 테트라하이드로칸나비놀산(THCA) 및 칸니비디올산(CBDA)을 포함한다. 그러나, 높은 수준으로 발현하는 CBDA 및 THCA 등의 칸나비노이드조차도, 오염된 칸나비노이드와 구조적으로 유사하고, 식물의 종류별로 칸나비노이드 구성의 가변성(variability)으로 인해 분리가 어려우며, 이러한 문제는 희귀 칸나비노이드의 분리를 더욱 어렵게 만든다. 따라서, 칸나비노이드 및 칸나비노이드 유사체를 생산하기 위한 대체 방법을 개발하기 위해 활발한 연구가 진행되고 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 칸나비제롤산 생합성에 대한 촉매활성이 향상된 개량형 변이체 효소를 개발하고, 해당 효소를 미생물에 도입하여 대마 유래 미량 성분인 칸나비제롤산 및 그 유도체를 안정적으로 대량 생산할 수 있는 기술을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인, 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생합성 반응성이 증가된 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산용 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명은 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인, 폴리펩타이드를 제공할 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 변이를 포함하는 폴리펩타이드 일 수 있다.
상기 프레닐트랜스퍼라제 또는 프레닐 전이효소(prenyltransferase)는 프레닐 이인산 합성효소로도 불리며, 프레닐기를 수용체 분자로 옮기는 효소의 한 종류로서, 프레닐 이인산의 프레닐 사슬 연장을 촉매한다.
본 발명에 있어서, 프레닐트랜스퍼라제는 방향족 기질에 대한 10-탄소 제라닐 그룹의 부착을 촉매하는 NphB 효소일 수 있다.
상기 NphB 효소는 스트렙토마이세스(Streptomyces)로부터 유래된 프레닐트랜스퍼라제로서, 제라닐 피로인산(geranyl pyrophosphate) 및 올리베톨산(olivetolic acid)을 기질로 사용하여 칸나비제롤산을 합성할 수 있고, 상기 효소의 활성 부위(active site)에 돌연변이를 도입하면 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생합성의 반응성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 종래 알려진 NphB 유전자 서열 자체 또는 형질전환할 균주에 맞추어 코돈 최적화된 서열로 이루어질 수 있다. 일 예시로 서열번호 1의 염기서열을 포함하나, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 종래 기술분야에 개시된 NphB 유전자의 서열 또는 서열번호 1의 염기서열과 '실질적 동일성'을 가진 서열은 본 발명의 범주에 포함될 수 있고, 예를 들어, 80% 이상의 서열 상동성, 90% 이상의 서열 상동성을 나타내는 서열을 의미할 수 있다.
일 예시로, 이러한 본 발명의 프레닐트랜스퍼라제 유전자는, NphB 효소의 생물학적 활성을 나타내는 범위 안에서, 서열번호 1의 염기서열의 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 이내의 서열 동일성을 가지는 염기서열일 수 있다.
일 예시로, 이러한 본 발명의 프레닐트랜스퍼라제는, NphB 효소의 생물학적 활성을 나타내는 범위 안에서, 서열번호 2의 아미노산 서열의 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 이내의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 변이는 서열번호 1의 139, 145, 637, 640, 646, 694, 805 또는 811번째 위치의 염기서열 중에서 적어도 하나 이상이 치환된 돌연변이를 포함하는 것일 수 있으며, 이는 프레닐트랜스퍼라제 단백질의 아미노산 서열 기준(서열번호 2)으로는 47, 49, 213, 214, 216, 232, 269 또는 271번째의 아미노산이 치환되는 것일 수 있다.
일 예시로, 이러한 프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 변이는 서열번호 1에서 139 내지 141번째 위치, 145 내지 147번째 위치, 637 내지 642번째 위치, 646 내지 648번째 위치, 694 내지 696번째 위치, 805 내지 807번째 위치, 811 내지 813번째 위치의 염기서열이 치환된 돌연변이를 포함하는 것일 수 있으며, 본 발명에서 프레닐트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 변이는 상기 기재한 돌연변이를 적어도 하나 이상 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환이 포함된 아미노산 서열로 표현되는 것일 수 있으며, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 서열번호 2의 47, 49, 213, 214, 216, 232, 269, 271, 286 및 288번째 위치로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 치환되는 것을 포함하는 것일 수 있다.
일 예시로, 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체 단백질은 서열번호 2에서 47번째 위치의 발린(valine)이 메티오닌(methionine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 알라닌(alanine), 라이신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)으로 치환되거나, 49번째 위치의 발린(valine)이 메티오닌(methionine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 알라닌(alanine), 라이신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)으로 치환되거나, 213번째 위치의 페닐알라닌(phenylalanine)이 티로신(tyrosine)으로 치환되거나, 214번째 위치의 세린(serine)이 알라닌(alanine) 또는 트레오닌(threonine)으로 치환되거나, 216번째 위치의 티로신(tyrosine)이 페닐알라닌(phenylalanine), 메티오닌(methionine), 류신(leucine) 또는 이소류신(isoleucine)으로 치환되거나, 232번째 위치의 알라닌(alanine)이 발린(valine), 메티오닌(methionine), 류신(leucine) 또는 이소류신(isoleucine)으로 치환되거나, 269번째 위치의 트레오닌(threonine)이 발린(valine), 메티오닌(methionine), 류신(leucine) 또는 이소류신(isoleucine)으로 치환되거나, 271번째 위치의 발린(valine)이 페닐알라닌(phenylalanine)로 치환되거나, 286번째 위치의 글라이신(glycine)이 세린(serine)으로 치환되거나 및 서열번호 2의 288번째 위치의 티로신(tyrosine)이 알라닌 (alanine)으로 치환되는 것 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열로 표현되는 단백질을 의미할 수 있다.
바람직하게는, 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체 단백질은 서열번호 2의 213번째 위치의 페닐알라닌(phenylalanine)이 티로신(tyrosine)으로 치환되거나, 및 서열번호 2의 214번째 위치의 세린(serine)이 트레오닌(threonine)으로 치환된 것 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열로 표현되는 단백질을 의미할 수 있다.
일 예시로, 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체 단백질은 서열번호 2에서 286번째 위치의 글라이신(glycine)이 세린(serine)으로 치환되거나 및/또는 서열번호 2의 288번째 위치의 티로신(tyrosine)이 알라닌 (alanine)으로 치환된 것을 포함하는 아미노산 서열로 표현되는 단백질을 의미할 수 있다.
본 발명에서 유전자 변이를 포함하는 프레닐트랜스퍼라제 단백질은 상기 기재한 돌연변이를 적어도 하나 이상 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체는 서열번호 2에서 213번째 위치의 페닐알라닌 (phenylalanine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환되고, 서열번호 2의 286번째 위치의 글라이신(glycine)이 세린(serine)으로 치환되고 및 서열번호 2의 288번째 위치의 티로신(tyrosine)이 알라닌 (alanine)으로 치환된 것을 포함하는 아미노산 서열로 표현되는 단백질(F213Y+G286S+Y288A)일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체는 서열번호 2에서 214번째 위치의 세린 (serine)이 트레오닌 (threonine)으로 치환되고, 서열번호 2의 286번째 위치의 글라이신(glycine)이 세린(serine)으로 치환되고 및 서열번호 2의 288번째 위치의 티로신(tyrosine)이 알라닌 (alanine)으로 치환된 것을 포함하는 아미노산 서열로 표현되는 단백질(S214T+G286S+Y288A)일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드는 프레닐트랜스퍼라제 야생형보다 효소 활성이 증가된 것일 수 있으며, 구체적으로 올리베톨산 및/또는 그 유도체를 칸나비제롤산 (cannabigerolic acid, CBGA) 및/또는 이의 유도체로 전환하는 효소 활성이 증가된 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 서열번호 2에서 214번째 위치의 세린 (serine)이 트레오닌 (threonine)으로 치환되고, 서열번호 2의 286번째 위치의 글라이신(glycine)이 세린(serine)으로 치환되고 및 서열번호 2의 288번째 위치의 티로신(tyrosine)이 알라닌 (alanine)으로 치환된 것을 포함하는 아미노산 서열로 표현되는 프레닐트랜스퍼라제 변이체(S214T+G286S+Y288A) 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드는 다른 변이체와 비교하여 CBGA, CBGCA, CBGVA 및 CBGA-C0 중 하나 이상의 생산 효율이 현저히 우수하며, 구체적으로 CBGA, CBGCA 및 CBGVA 중 하나 이상을 포함하는 칸나비제롤산 또는 이의 유도체의 생산 효율이 우수하다.
본 발명의 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드에서, 프레닐트랜스퍼라제 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 단백질의 정제를 위하여 태그(tag)단백질을 포함할 수 있고, 단백질의 검출, 분리 또는 정제 목적에 적합한 종류의 태그 단백질이라면 그 종류에 제한되지 않는다. 태그 단백질은 예를 들어 히스(his, 폴리히스티딘), FLAG, GST, Myc 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예시로, 본 발명의 프레닐트랜스퍼라제 변이체는 N-말단에 히스 태그를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 친화성 태그를 더 포함할 수 있고, 프레닐트랜스퍼라제 효소와 기질이 반응할 확률을 높힐 수 있는 태그 단백질이라면 그 종류에 제한되지 않는다. 친화성 태그는 예를 들어 SUMO, TrxA, GSP, 말토스-결합 단백질(MBP), Fh8, PelB, 미스틱(MISTIC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예시로, 본 발명의 폴리펩타이드는 MBP 태그 또는 미스틱 태그를 포함할 수 있고, 미스틱 태그는 프레닐트랜스퍼라제 변이체의 C-말단에 연결되는 것일 수 있다.
MBP 태그는 효소 용해도(enzyme solubility) 증가로, 봉입체(inclusion body) 생성을 억제하여 효소와 기질이 반응할 확률이 높아짐에 따라, 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생합성의 반응성을 증가시키는 것일 수 있다.
MISTIC 태그는 효소를 표면에 발현시켜 기질과 반응할 확률이 높아짐에 따라, 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생합성의 반응성을 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 프레닐트랜스퍼라제 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다. 본 발명에서 용어 "재조합 벡터"는 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
또한, 본 발명은 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산용 재조합 미생물을 제공할 수 있다.
칸나비제롤산(cannabigerolic acid, CBGA)는 대마 식물에 존재하는 칸나비노이드의 일종으로, 테트라하이드로칸나비놀산(THCA) 칸나비디올산(CBDA), 칸나비크로멘산(CBCA) 및 칸나비제롤(CBG)의 전구체로 알려져 있으며, 천연 억제제로서 조기 세포 사멸을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 칸나비제롤산은 항균, 항염증 및 통증 완화 효과를 나타내며, 체내 칸나비노이드 시스템과 함께 작동하여 기분과 식욕에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다.
본 발명에 있어서, 칸나비제롤산 유도체는 칸나비제롤산으로부터 유도될 수 있는 화합물을 의미하는 것으로, 일 예시로 CBGCA (칸나비게로르신산 (Cannabigerorcinic Acid)), CBGVA (칸나비게로바린산 (Cannabigerovarinic acid)) 및 CBGA-C0(3-Geranyl-2,4-hydroxybenzoic acid) 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 칸나비제롤산 및/또는 이의 유도체 생산은 올리베톨산(Olivetolic acid) 및/또는 이의 유도체를 칸나비제롤산 및/또는 이의 유도체로 전환하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 일 예시로 올리베톨산 유도체는 오르셀린산(Orsellinic acid), 바린산(Varinolic acid) 및 OA-C0(2,4-Dihydroxybenzoic acid) 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 미생물은 상기 전술한 재조합 벡터로 형질전환된 미생물이거나, 또는 상기 전술한 프레닐트랜스퍼라제 변이체 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 미생물일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 칸나비제롤산 생합성 반응이 증가된 것을 특징으로 하며, 구체적으로 대장균, 박테리아, 효모 또는 곰팡이일 수 있고, 바람직하게는 대장균이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 형질전환은 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포에 효율적으로 도입할 수 있다면 형질전환 방법은 제한되지 않으나, 예를 들면 전기천공법(electroporation), protoplast 사용법, Li+ ion 사용법, lithium acetate법, 효모 세포벽 용해 효소를 이용하는 형질전환법 등의 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산방법을 제공할 수 있다.
상기 생산방법은 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 미생물을 제라닐 피로인산(geranyl pyrophosphate); 및 올리베톨산(olivetolic acid) 및/또는 이의 유도체가 포함된 용액에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 미생물은 상기에서 전술한 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 미생물로서, 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터가 도입되어 형질전환된 미생물일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 생산방법은 1) 전술한 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 단계; 및 2) 상기 형질전환된 미생물을 제라닐 피로인산(geranyl pyrophosphate), 및 올리베톨산(olivetolic acid, OA) 및/또는 이의 유도체가 포함된 용액에서 전세포 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어 칸나비제롤산, 칸나비제롤산의 유도체, 재조합 벡터, 미생물 및 형질전환은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 '전세포 반응(whole-cell reaction)은 미생물을 이용하여 기질을 전환시켜 화합물을 합성 또는 생산하는 반응을 의미하는 것으로, 일 예시로, 본 발명에서 전세포인 대장균은 올리베톨산 및/또는 이의 유도체; 및 제라닐 피로인산을 기질로 이용하여 칸나비제롤산 및/또는 칸나비제롤산 유도체를 생산하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 실시예에서는, 프레닐트랜스퍼라제 유전자의 돌연변이를 포함하는 재조합 벡터를 competent E.coli BL21(DE3)에 도입하였으며, 이후 암피실린으로 형질전환된 E.coli를 선별하였다. 선별된 E.coli는 올리베톨산 및 제라닐 피로인산을 기질로 이용하여 칸나비제롤산 및 칸나비제롤산의 다양한 유도체를 높은 수율로 생산(합성)할 수 있음을 확인하였다. 높은 수율의 생산성 및 다양한 칸나비제롤산 유도체를 생성할 수 있는 효과는 프레닐트랜스퍼라제 유전자의 특정 위치의 염기서열 돌연변이 및 특정 태그 단백질을 통해 효소의 기질에 대한 반응성이 최적화됨에 따라 달성될 수 있는 효과이다.
본 발명은 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산용 재조합 미생물, 및 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산용 재조합 미생물은 생합성 반응성이 증가되어, 칸나비제롤산 및 이의 유도체를 안정적으로 대량생산할 수 있다.
본 발명의 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산방법은 낮은 생산단가에 높은 생산성 및 수율로 다양한 칸나비노이드를 생산할 수 있다.
도 1은 칸나비제롤산(CBGA) 및 CBGA 유도체(a.CBGA; b.CBGCA; c.CBGVA; d.CBGA-C0)에 대한 프레닐트랜스퍼라제(Prenyltransferase, PT) 돌연변이의 전세포 반응 상대 활성도를 나타낸 것이다.
도 2는 합성 GPP(Geranyl pyrophosphate tetrabutyl ammonium salt)와 시약 GPP(Geranyl pyrophosphate lithium salt)의 칸나비제롤산(CBGA) 생성량(전환율)을 비교한 결과이다.
도 3은 S214T 돌연변이의 버퍼 pH별 칸나비제롤산(CBGA) 생성량(전환율)을 비교한 결과이다.
도 4는 합성 GPP(Geranyl pyrophosphate tetrabutyl ammonium salt)의 농도별 칸나비제롤산(CBGA) 생성량(전환율)을 비교한 결과이다.
도 5는 S214T 돌연변이의 농도별 칸나비제롤산(CBGA) 생성량(전환율)을 비교한 결과이다.
도 6의 A 및 B는 대조군과 본 발명의 NphB 돌연변이(S214T, Y288A 및 G286S)를 도입한 경우의 CBGA 생성량 및 시간당 생성량을 비교한 결과이다.
도 7의 a 내지 d는 칸나비제롤산(CBGA) 및 CBGA 유도체의 전세포 반응 LC-MS 분석 결과이다.
도 8의 A 및 B는 친화성 태그 종류별 칸나비제롤산(CBGA) 생성량(전환율)을 비교한 결과이다.
도 9는 친화성 태그를 포함한 벡터 지도(vector map)를 표시한 도면으로, 도 9a는 태그를 유전자의 N-말단에 연결한 것이고, 도 9b는 유전자의 C-말단에 연결한 형태의 구조이다.
도 2는 합성 GPP(Geranyl pyrophosphate tetrabutyl ammonium salt)와 시약 GPP(Geranyl pyrophosphate lithium salt)의 칸나비제롤산(CBGA) 생성량(전환율)을 비교한 결과이다.
도 3은 S214T 돌연변이의 버퍼 pH별 칸나비제롤산(CBGA) 생성량(전환율)을 비교한 결과이다.
도 4는 합성 GPP(Geranyl pyrophosphate tetrabutyl ammonium salt)의 농도별 칸나비제롤산(CBGA) 생성량(전환율)을 비교한 결과이다.
도 5는 S214T 돌연변이의 농도별 칸나비제롤산(CBGA) 생성량(전환율)을 비교한 결과이다.
도 6의 A 및 B는 대조군과 본 발명의 NphB 돌연변이(S214T, Y288A 및 G286S)를 도입한 경우의 CBGA 생성량 및 시간당 생성량을 비교한 결과이다.
도 7의 a 내지 d는 칸나비제롤산(CBGA) 및 CBGA 유도체의 전세포 반응 LC-MS 분석 결과이다.
도 8의 A 및 B는 친화성 태그 종류별 칸나비제롤산(CBGA) 생성량(전환율)을 비교한 결과이다.
도 9는 친화성 태그를 포함한 벡터 지도(vector map)를 표시한 도면으로, 도 9a는 태그를 유전자의 N-말단에 연결한 것이고, 도 9b는 유전자의 C-말단에 연결한 형태의 구조이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 돌연변이 프레닐트랜스퍼라제의 세포 도입
1.1. 프레닐트랜스퍼라제(Prenyltransferase)의 돌연변이 제작
Streptomyces Sp. 프레닐트랜스퍼라제(Prenyltransferase, PT) 유전자는 N-말단 His-tag을 포함하여 코돈 최적화 후 코스모진텍(서울, 대한민국)에서 합성하였다. 프레닐트랜스퍼라제(Prenyltransferase, PT) 단백질 및 이를 암호화하는 서열은 하기 표 1에 기재하였다.
서열 구분 | 서열 (아미노산 서열 또는 염기 서열) | 서열번호 |
프레닐트랜스퍼라제 암호화 서열 |
atgagcgaagcagctgatgtcgaaagagtgtacgctgcgatggaagaggccgccggtcttttaggagtcgcttgcgccagagataagatctaccctctgttatctactttccaggacacattagtagaggggggatctgttgtggtattctcgatggctagtggtcgccattcaactgaactggatttctctataagtgtacctacgagtcatggcgatccctatgccacggtagttgaaaaaggattatttccagctacaggccatcccgttgatgacttactggctgatacacagaaacacttgccagtgagtatgtttgctatcgacggagaggttacaggcggatttaagaagacgtatgcctttttcccaacggacaacatgcctggcgtggctgaactttcagctattccttcgatgccaccggccgtggccgagaatgcagaattgttcgctcgttatggcttagacaaggtacaaatgaccagcatggattacaaaaagagacaagttaatctttatttctctgaacttagcgctcaaacgttagaagctgagagtgtattagctttagtgcgggagcttggcctgcacgttccaaacgaactgggattgaaattttgtaagcgttcattcagtgtatatcctactcttaactgggaaacaggcaaaatcgaccggctttgctttgcagttatctcaaatgatccaactcttgtgccttcatctgatgaaggcgacatagagaaattccataattatgccacaaaggcaccttatgcgtatgtcggagagaaacgcacccttgtttacggtttgaccttatccccgaaagaggagtattacaaattaggtgcttattatcatataacagatgtgcaaagagggttgcttaaagccttcgacagccttgaagactga | 1 |
프레닐트랜스퍼라제 아미노산 서열 |
MSEAADVERVYAAMEEAAGLLGVACARDKIYPLLSTFQDTLVEGGSVVVFSMASGRHSTELDFSISVPTSHGDPYATVVEKGLFPATGHPVDDLLADTQKHLPVSMFAIDGEVTGGFKKTYAFFPTDNMPGVAELSAIPSMPPAVAENAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELSAQTLEAESVLALVRELGLHVPNELGLKFCKRSFSVYPTLNWETGKIDRLCFAVISNDPTLVPSSDEGDIEKFHNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSPKEEYYKLGAYYHITDVQRGLLKAFDSLED | 2 |
In-Fusion cloning kit는 Takara bio(Kyoto, Japan)에서 구매하였다. 수용 E.coli DH5a 및 E.coli BL21(DE3)은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 올리베톨산(Olivetolic acid) 및 제라닐 피로인산 테트라부틸 암모늄염(Geranyl pyrophosphate tetrabutyl ammonium salt)은 합성하였다. 구체적으로 제라닐 피로인산 테트라부틸 암모늄염은 트리스(테트라부틸암모늄) 피로인산수소 0.83 g (0.92 mmol)을 불꽃 건조한 5ml 둥근바닥 플라스크에 투입한 뒤 Ar2로 충진하고, 이에 아세토니트릴(Acetonitrile) 1.9 ml(0.24 M)을 주입하여 흰 현탁액을 제조한다. 제라닐 브로마이드(geranyl bromide) 0.1 g(0.46 mmol)을 주입한 뒤 상온에서 밤새 반응시킨다. TLC로 제나릴 브로마이드가 사라짐을 확인한 뒤 농축하여 용매를 제거하여 연노랑색의 오일, 고체 혼합물을 얻는 방식으로 합성하였다. 바리놀산(Varinolic acid) 및 오르셀린산(Orsellinic acid)은 Cayman Chemical(Michigan, USA)에서 구매하였다. 이외의 모든 시약은 Sigma-Aldrich (St Louis, USA)에서 구매하였다.
컴퓨터 모델링을 기반으로 프레닐트렌스퍼라제의 돌연변이 위치를 선별하였으며, 각 돌연변이는 pET22b(+)-PT를 주형(template)으로 하여 변형된 QuickChangeTM site-directed mutagenesis(위치-지정 돌연변이) 방법을 이용하여 제작되었었다(Nucleic Acids Research. Vol. 32, No. 14, e115). 프라이머 합성(표 2) 및 돌연변이 유전자의 서열 확인은 코스모진텍(서울, 대한민국)에서 진행하였다.
프라이머 구분 | 프라이머 서열 (5' → 3' 방향) | 서열번호 | |
V47L | 정방향 | GGA TCT ctt GTG GTA TTC TCG ATG GCT | 3 |
역방향 | TAC CAC aag AGA TCC CCC CTC TAC TAA | 4 | |
V47M | 정방향 | GGA TCT atg GTG GTA TTC TCG ATG GCT | 5 |
역방향 | TAC CAC cat AGA TCC CCC CTC TAC TAA | 6 | |
V47I | 정방향 | GGA TCT att GTG GTA TTC TCG ATG GCT | 7 |
역방향 | TAC CAC aat AGA TCC CCC CTC TAC TAA | 8 | |
V47A | 정방향 | GGA TCT gct GTG GTA TTC TCG ATG GCT | 9 |
역방향 | TAC CAC agc AGA TCC CCC CTC TAC TAA | 10 | |
V47K | 정방향 | GGA TCT aaa GTG GTA TTC TCG ATG GCT | 11 |
역방향 | TAC CAC ttt AGA TCC CCC CTC TAC TAA | 12 | |
V47R | 정방향 | GGA TCT cgt GTG GTA TTC TCG ATG GCT | 13 |
역방향 | TAC CAC acg AGA TCC CCC CTC TAC TAA | 14 | |
V49L | 정방향 | GTT GTG cta TTC TCG ATG GCT AGT GGT | 15 |
역방향 | CGA GAA tag CAC AAC AGA TCC CCC CTC | 16 | |
V49M | 정방향 | GTT GTG atg TTC TCG ATG GCT AGT GGT | 17 |
역방향 | CGA GAA cat CAC AAC AGA TCC CCC CTC | 18 | |
V49I | 정방향 | GTT GTG ata TTC TCG ATG GCT AGT GGT | 19 |
역방향 | CGA GAA tat CAC AAC AGA TCC CCC CTC | 20 | |
V49A | 정방향 | GTT GTG gca TTC TCG ATG GCT AGT GGT | 21 |
역방향 | CGA GAA tgc CAC AAC AGA TCC CCC CTC | 22 | |
V49K | 정방향 | GTT GTG aaa TTC TCG ATG GCT AGT GGT | 23 |
역방향 | CGA GAA ttt CAC AAC AGA TCC CCC CTC | 24 | |
V49R | 정방향 | GTT GTG cga TTC TCG ATG GCT AGT GGT | 25 |
역방향 | CGA GAA tcg CAC AAC AGA TCC CCC CTC | 26 | |
F213Y | 정방향 | CGT TCA tac AGT GTA TAT CCT ACT CTT | 27 |
역방향 | TAC ACT gta TGA ACG CTT ACA AAA TTT | 28 | |
S214T | 정방향 | TCA TTC act GTA TAT CCT ACT CTT AAC | 29 |
역방향 | ATA TAC agt GAA TGA ACG CTT ACA AAA | 30 | |
S214A | 정방향 | TCA TTC gct GTA TAT CCT ACT CTT AAC | 31 |
역방향 | ATA TAC agc GAA TGA ACG CTT ACA AAA | 32 | |
Y216F | 정방향 | AGT GTA ttt CCT ACT CTT AAC TGG GAA | 33 |
역방향 | AGT AGG aaa TAC ACT GAA TGA ACG CTT | 34 | |
Y216M | 정방향 | AGT GTA atg CCT ACT CTT AAC TGG GAA | 35 |
역방향 | AGT AGG cat TAC ACT GAA TGA ACG CTT | 36 | |
Y216L | 정방향 | AGT GTA ctt CCT ACT CTT AAC TGG GAA | 37 |
역방향 | AGT AGG aag TAC ACT GAA TGA ACG CTT | 38 | |
Y216I | 정방향 | AGT GTA att CCT ACT CTT AAC TGG GAA | 39 |
역방향 | AGT AGG aat TAC ACT GAA TGA ACG CTT | 40 | |
A232I | 정방향 | TGC TTT ata GTT ATC TCA AAT GAT CCA | 41 |
역방향 | GAT AAC tat AAA GCA AAG CCG GTC GAT | 42 | |
A232L | 정방향 | TGC TTT tta GTT ATC TCA AAT GAT CCA | 43 |
역방향 | GAT AAC taa AAA GCA AAG CCG GTC GAT | 44 | |
A232M | 정방향 | TGC TTT atg GTT ATC TCA AAT GAT CCA | 45 |
역방향 | GAT AAC cat AAA GCA AAG CCG GTC GAT | 46 | |
A232V | 정방향 | TGC TTT gta GTT ATC TCA AAT GAT CCA | 47 |
역방향 | GAT AAC tac AAA GCA AAG CCG GTC GAT | 48 | |
T269M | 정방향 | AAA CGC atg CTT GTT TAC GGT TTG ACC | 49 |
역방향 | AAC AAG cat GCG TTT CTC TCC GAC ATA | 50 | |
T269I | 정방향 | AAA CGC atc CTT GTT TAC GGT TTG ACC | 51 |
역방향 | AAC AAG gat GCG TTT CTC TCC GAC ATA | 52 | |
T269L | 정방향 | AAA CGC ctc CTT GTT TAC GGT TTG ACC | 53 |
역방향 | AAC AAG gag GCG TTT CTC TCC GAC ATA | 54 | |
T269V | 정방향 | AAA CGC gtc CTT GTT TAC GGT TTG ACC | 55 |
역방향 | AAC AAG gac GCG TTT CTC TCC GAC ATA | 56 | |
V271F | 정방향 | ACC CTT ttt TAC GGT TTG ACC TTA TCC | 57 |
역방향 | ACC GTA aaa AAG GGT GCG TTT CTC TCC | 58 |
* 변이시킨 위치의 코돈은 소문자로 표시
1.2. 돌연변이 프레닐트랜스퍼라제의 세포 내 발현
야생형 및 돌연변이 유전자 각각의 단백질 발현을 위해 competent E.coli BL21(DE3)로 화학적 방법으로 형질전환(chemical transformation)을 수행하였으며, 이후 암피실린 100 μg/ml을 포함하는 LB(lysogeny broth)-agar 플레이트에서 선별되었다. 선별된 형질전환 BL21 세포는 암피실린 100 μg/ml을 포함하는 3ml의 액상 LB배지에 접종하여 16시간 동안 37 ℃, 200rpm에서 배양하였다. 이후 50ml의 LB-암피실린 배지로 2차 접종하여 OD600이 0.5 수준이 되도록 배양한 후에, 0.8 mM IPTG(isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside)로 20 ℃에서 20시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 20시간 후 세포를 수확하여 원심분리(3000 rpm, 4 ℃)를 수행하여 세포 펠렛(pellet)를 얻었다.
실시예 2: 돌연변이 프레닐트랜스퍼라제에 의한 칸나비제롤산 및 그 유도체 전환을 위한 전세포 반응(Whole-cell reaction)
2.1. 칸나비제롤산 및 그 유도체로의 전환
(1) 실험 방법
올리베톨산 및 그 유도체의 칸나리베롤산 및 유도체로의 전환은 0.9gCDW/L 세포, 1 mM 올리베톨산, 1 mM 제라닐 피로인산 리튬염(Geranyl pyrophosphate lithium salt), 5 mM 염화마그네슘을 첨가한 50 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 8.0)에서 24시간 동안 진행되었다. 정해진 시간 간격으로 100uL씩 샘플을 수득한 후, 메탄올 900uL를 첨가하여 세포를 비활성화하고 0.2 μM PVDF 필터(GE Healthcare, Pittsburgh, USA)로 필터링하고, LC-MS 분석을 수행하였다(도 7).
UPLC 분석은 용제 탈가스(degrassing) 유닛(DGU-20A), 바이너리 펌프(LC- 30AD), 오토샘플러(SIL-30AC), 시스템 컨트롤러 유닛(CBM-20A), 광다이오드 어레이 검출기(SPD-M20A) 및 컬럼 오븐 유닛(CTO-20AC)으로 구성된 ESI-MS(전자분무이온화-질량 분석법) Shimadzu LCMS-2020 system(Shimadzu, Kyoto, Japan)을 사용하여 분석을 수행하였다(분석 조건: 표 3). 올리베톨산과 칸나비제롤산은 각각 258 nm, 220nm PDA 검출기에서 각각 1.7분과 5.1분에 감지되었고 m/z 223.1, 359.2에서 [M-H]-형태의 분자 이온 피크를 확인하였다. 또한 바린산(Varinolic acid)과 CBGVA는 각각 261nm, 227nm에서 2.6분과 10.1분에 감지되었고, m/z 195.2, 331.1에서 [M-H]-형태의 분자 이온 피크를 확인하였다. 오르셀린산(Orsellinic acid)과 CBGCA는 각각 261nm, 220nm에서 1.9분과 8.2분에 감지되었고, m/z 167.2, 303.1에서 [M-H]-형태의 분자 이온 피크를 확인하였다. OA-C0와 CBGA-C0은 각각 261nm, 220nm에서 1.9분과 7.5분에 감지되었고, m/z 153.1, 289.0에서 [M-H]-형태의 분자 이온 피크를 확인하였다(도 7).
(2) 실험 결과
컴퓨터 모델링 기반으로 선별한 프레닐트랜스퍼라제인 NphB 돌연변이(변이체)들의 칸나비제롤산(CBGA) 및 CBGA 유도체에 대한 활성을 전세포 반응으로 측정하였으며, 특정 위치에 돌연변이를 도입(Y288A+G286S)한 돌연변이체를 기준으로, 상기 돌연변이체의 활성을 100%로 놓고 추가적으로 돌연변이를 도입한 돌연변이체들의 상대적 반응 활성도를 비교하였다.
그 결과, CBGA의 경우, S214T 돌연변이체(mutant)가 180%로 가장 높은 활성을 보였으며 A232V, F213Y 돌연변이체는 각각 67%, 64% 수준을 나타내었다(도 1A).
CBGCA의 경우에는, F213Y 돌연변이체가 193%로 가장 높은 활성을 나타내었으며 S214T가 154%로 두번째로 높았다. V47I, V47L, V47M, V49I, V49M 돌연변이체의 활성은 각각 88%, 54%, 82%, 39%, 76%로 기준 돌연변이체(Y288A+G286S)보다 활성이 낮았다(도 1B).
CBGVA는 S214T 돌연변이체가 868%로 가장 높은 활성을 나타내었으며, A232V, F213Y, T269I, T269L, T269V, V47A, V49A 돌연변이체의 활성은 각각 131%, 96%, 197%, 243%, 451%, 140%로 기준 돌연변이체(Y288A+G286S)보다는 높거나 비슷한 활성을 보였다(도 1C).
특히, CBGA-C0는 기준 돌연변이체(Y288A+G286S)의 활성이 측정되지 않아 가장 활성이 높았던 F213Y 돌연변이체를 100%로 기준을 잡았다. 그 결과 A232I, A232L, A232M, A232V는 각각 62%, 68%, 62%, 52%였고 S214T는 30%, T269M은 28%, V261F는 75%, V47L, V47M은 각각 59%, 54%였다(도 1D).
스크리닝 결과, S214T 및 F213Y를 추가로 도입한 돌연변이체가 대부분의 기질에 대해서 기준 돌연변이체(Y288A+G286S)보다 높은 활성을 보였다. S214T와 F213Y의 경우 4가지 기질(올리베톨산(Olivetolic acid), 오르셀린산(Orsellinic acid), 바린산(Varinolic acid) 및 OA-C0(2,4-Dihydroxybenzoic acid)에 공통적으로 적용되는 잔기 부분에 돌연변이를 도입한 것으로, 벤젠링의 2번 자리에 있는 OH기와 결합하여 안정적인 결합 형태를 만들어, 결과적으로 각 기질로부터 생성물인 CBGA, CBGCA, CBGVA, CBGA-C0가 만들어지게 된다.
2.2. 합성 GPP와 시약 GPP의 칸나비제롤산의 생합성 효율 비교
합성 GPP(Geranyl pyrophosphate tetrabutyl ammonium salt)와 시약 GPP(Geranyl pyrophosphate lithium salt)의 칸나비제롤산의 생합성 효율 비교를 위한 전세포 반응은 0.9gCDW/L 세포, 1 mM 올리베톨산, 1 mM 제라닐 피로인산 리튬염(Geranyl pyrophosphate lithium salt) 및 1mM 제라닐 피로인산 테트라부틸 암모늄염(Geranyl pyrophosphate tetrabutyl ammonium salt), 5 mM 염화마그네슘을 첨가한 50 mM Tris-HCl 버퍼 (pH8.0)에서 24시간 동안 반응시켜 생성된 칸나비제롤산을 비교하였다. 정해진 시간 간격으로 100uL씩 샘플을 수득 후 메탄올 900uL를 첨가하여 세포를 비활성화시키고 0.2 μM PVDF 필터 (GE Healthcare, Pittsburgh, USA)로 필터링하고 표 2의 UPLC분석 조건으로 분석하였다.
합성 GPP와 시약 GPP의 CBGA 생성량을 비교한 결과, 6시간이 경과하였을 때 시약 GPP의 경우 0.35mM의 CBGA가 생성된 것과 유사하게, 합성 GPP의 경우에도 CBGA가 0.30mM이 생성됨을 확인하였다. 이는 5% 내외의 수율 차이로서, 합성 GPP로도 CBGA를 성공적으로 생성하는 것을 확인하였다(도 2).
2.3. S214T 돌연변이의 전세포 반응 최적화
(1) 버퍼 pH별 칸나비제롤산 생성량(전환율) 비교
pH 3 내지 10의 버퍼 각각(표 4)에는 0.9gCDW/L 세포, 1 mM 올리베톨산 및 그 유도체, 1.5 mM 제라닐 피로인산 테트라부틸 암모늄염, 5 mM 염화마그네슘을 첨가한 후, 6시간 동안 반응시켜 생성된 칸나비제롤산을 비교하였다. 정해진 시간 간격으로 100uL씩 샘플을 수득 후 메탄올 900uL를 첨가하여 세포를 비활성화시켰으며, 0.2 μM PVDF 필터 (GE Healthcare, Pittsburgh, USA)로 필터링하고 표 3의 UPLC분석 조건으로 분석하였다.
버퍼(100mM) | pH |
구연산 나트륨(Sodium citrate) | 3 |
4 | |
6 | |
인산 칼륨(Potassium Phosphate) | 6 |
7 | |
8 | |
Tris-HCl | 8 |
10 |
전세포 반응 결과 가장 활성이 좋은 S214T 돌연변이체의 전세포 반응 조건을 최적화하였으며, S214T 돌연변이체를 이용하여 버퍼 pH별 CBGA 생성량 비교 실험 결과, Tris-HCl pH 8.0이 가장 높은 활성을 나타냄을 확인하였다. Tris-HCl pH 8.0을 100% 활성이라고 기준 잡았을 때 pH 10에서는 91%로 활성이 크게 감소하지 않았으나 pH 7이하에서는 50%이하로 활성이 떨어지며, pH 4부터는 CBGA는 생성되지 않았다(도 3).
(2) 합성 GPP의 농도별 칸나비제롤산 생성량(전환율) 비교
0.9gCDW/L 세포, 1 mM 올리베톨산 및 그 유도체, 1.5 mM, 3mM, 4.5mM, 6mM 합성 GPP(Geranyl pyrophosphate tetrabutyl ammonium salt), 5 mM 염화마그네슘을 첨가한 후, 6시간 동안 반응시켜 생성된 칸나비제롤산을 비교하였다. 정해진 시간 간격으로 100uL씩 샘플을 수득 후 메탄올 900uL를 첨가하여 세포를 비활성화하고 0.2 μM PVDF 필터 (GE Healthcare, Pittsburgh, USA)로 필터링하고 표 2의 UPLC분석 조건으로 분석하였다.
가장 높은 활성을 보인 Tris-HCl pH 8.0에서, 기질인 GPP의 농도 별로 CBGA 생성량을 비교한 결과, GPP의 농도가 4.5mM 또는 6mM인 경우 모두, 0.34mM로 동일한 농도의 CBGA가 생성되었다(도 4). 따라서 최적 GPP의 농도는 4.5mM로 선택하였다.
(3) 세포 농도별 칸나비제롤산 생성량(전환율) 비교
0.9, 1.8, 3.6, 5.4, 7.2gCDW/L 세포, 1 mM Olivetolic acid 및 그 유도체, 4.5mM 합성 GPP(Geranyl pyrophosphate tetrabutyl ammonium salt), 5 mM 염화마그네슘을 첨가한 후, 30분 동안 반응시켜 생성된 칸나비제롤산을 비교하였다. 100uL 샘플을 수득 후 메탄올 900uL를 첨가하여 세포를 비활성화시켰으며, 0.2 μM PVDF 필터(GE Healthcare, Pittsburgh, USA)로 필터링하고 표 2의 UPLC분석 조건으로 분석하였다.
그 결과, 세포 농도 0.9 gCDW/L에서 CBGA 0.10mM, 세포 농도 1.8 gCDW/L에서 CBGA 0.17mM, 세포 농도 3.6 gCDW/L에서 CBGA 0.28mM, 세포 농도 5.4 gCDW/L에서 CBGA 0.39mM, 세포 농도 7.2 gCDW/L에서 CBGA 0.42mM이 생성되었다(도 5). 세포 농도 5.4 gCDW/L과 7.2 gCDW/L에서 비슷한 농도의 CBGA가 생성되었으므로, 최적 세포 농도는 5.4 gCDW/L로 선택하였다. 결론적으로 S214T 돌연변이체의 최적의 전세포 반응 조건은 Tris-HCl pH 8.0, GPP 4.5mM, 세포 농도 2.88 gCDW/L로 결정되었고, 이러한 조건하에 본 발명의 칸나비제롤산은 30분만에 약 40%의 수율(200mg/L/hr이상의 시간당 생성량)을 보여 CBGA를 생합성할 수 있는 효소인 CsPT4 및 다른 돌연변이체(Y288A+G286S, G286S 및 V49W+Y288P)에 비해 현저히 높은 시간당 생성량을 나타냄을 확인하였다(도 6).
(4) 태그(Tag) 종류별 칸나비제롤산 생성량(전환율) 비교
태그 종류별로 칸나비제롤산 생성량을 비교하기 위하여, 기질과 반응할 확률을 높일 수 있도록 용해도를 향상시킬 수 있는 태그인 SUMO(염기서열: 서열번호 59, 아미노산 서열: 서열번호 64), TrxA(염기서열: 서열번호 60, 아미노산 서열: 서열번호 65), MBP(염기서열: 서열번호 61, 아미노산 서열: 서열번호 66), Fh8(염기서열: 서열번호 62, 아미노산 서열: 서열번호 67)와 효소를 세포 표면에 발현시킬 수 있는 MISTIC(염기서열: 서열번호 63, 아미노산 서열: 서열번호 68) 태그를 이용하여 전세포 반응에 따른 칸나비제롤산 생성량을 비교하였다(도 9a). MISTIC 태그는 NphB 효소의 N말단(MISTIC-N, 도 9a) 또는 C말단(MISTIC-C, 도 9b)에 붙여 칸나비롤산 생성량을 비교하였다. 각 태그 별로 S214T 변이주 세포 0.9gCDW/L 세포를 전세포반응을 진행하였으며, 1 mM 올리베톨산, 1 mM 제라닐 피로인산 리튬염, 5 mM 염화마그네슘을 첨가한 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH8.0)에서 6시간 동안 반응시켰다 (FhB, GST, SUMO, Trx는 반응하지 않음, 도 8A). 상기에서 사용한 태그의 염기서열(표 5) 및 아미노산 서열(표 6)은 하기 표에 기재하였다.
서열 구분 | 염기 서열 | 서열번호 |
SUMO | atgtccgacagcgaggtgaatcaggaagcgaagcctgaagttaagccagaggtaaagcctgaaactcatataaatttgaaagtatcggacggttcgagcgaaatattcttcaaaataaagaagactacgccgcttcgtagactgatggaggcattcgcaaagcggcagggcaaggagatggattctttacgctttttgtatgacggcatacgtatccaggctgaccaaacgccggaagatttggatatggaggacaatgacattatcgaggcccaccgtgaacaaatcggc | 59 |
TrxA | atgtctgataaaatcattcatctgactgacgatagttttgatacggacgtacttaaagcagatggagcaatcttagtagacttttgggccgagtggtgtggtccatgcaaaatgatcgcccccatcttggatgaaattgccgacgaataccagggcaaactgacagtggcaaagctgaacattgaccaaaatcccggcacagccccaaaatacgggattagaggcatacccacgctgttgctttttaagaatggtgaagtcgcagctaccaaggtcggggctttaagcaagggacagttgaaggaatttctggatgccaatcttgcg | 60 |
MBP | atgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcgataaaggctataacggtctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaattaaagtcaccgttgagcatccggataaactggaagagaaattcccacaggttgcggcaactggcgatggccctgacattatcttctgggcacacgaccgctttggtggctacgctcaatctggcctgttggctgaaatcaccccggacaaagcgttccaggacaagctgtatccgtttacctgggatgccgtacgttacaacggcaagctgattgcttacccgatcgctgttgaagcgttatcgctgatttataacaaagatctgctgccgaacccgccaaaaacctgggaagagatcccggcgctggataaagaactgaaagcgaaaggtaagagcgcgctgatgttcaacctgcaagaaccgtacttcacctggccgctgattgctgctgacgggggttatgcgttcaagtatgaaaacggcaagtacgacattaaagacgtgggcgtggataacgctggcgcgaaagcgggtctgaccttcctggttgacctgattaaaaacaaacacatgaatgcagacaccgattactccatcgcagaagctgcctttaataaaggcgaaacagcgatgaccatcaacggcccgtgggcatggtccaacatcgacaccagcaaagtgaattatggtgtaacggtactgccgaccttcaagggtcaaccatccaaaccgttcgttggcgtgctgagcgcaggtattaacgccgccagtccgaacaaagagctggcaaaagagttcctcgaaaactatctgctgactgatgaaggtctggaagcggttaataaagacaaaccgctgggtgccgtagcgctgaagtcttacgaggaagagttggtgaaagatccgcgtattgccgccactatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttctggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaacgccgccagcggtcgtcagactgtcgatgaagccctgaaagacgcgcagact | 61 |
Fh8 | atgccaagcgtgcaagaagttgaaaaattacttcacgttcttgatcggaatggggatgggaaagtgagtgccgaggaattgaaagcatttgcagatgacagtaaatgtcccttggacagtaacaaaattaaggcgtttattaaggaacatgataaaaacaaggatggcaaattggaccttaaagaattagtaagcatcttgagttct | 62 |
MISTIC | atgttttgtacttttttcgagaagcaccaccggaagtgggatatattgttagagaaaagcaccggggtcatggaagcaatgaaggttacatcagaggaaaaagaacaactttccacagccatagaccgcatgaatgagggtcttgatgctttcatccaattgtataacgagtccgaaatagacgagccacttatccagcttgacgatgacacagcggaattgatgaaacaagcccgcgacatgtatggacaggagaagttgaatgagaaattaaacacaatcatcaagcagatattgagcatttctgtgagcgaagaaggcgagaaggaatga | 63 |
서열 구분 | 아미노산 서열 | 서열번호 |
SUMO | MSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIG | 64 |
TrxA | MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLA | 65 |
MBP | MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQT | 66 |
Fh8 | MPSVQEVEKLLHVLDRNGDGKVSAEELKAFADDSKCPLDSNKIKAFIKEHDKNKDGKLDLKELVSILSS | 67 |
MISTIC | MFCTFFEKHHRKWDILLEKSTGVMEAMKVTSEEKEQLSTAIDRMNEGLDAFIQLYNESEIDEPLIQLDDDTAELMKQARDMYGQEKLNEKLNTIIKQILSISVSEEGEKE | 68 |
S214T 돌연변이체를 이용한 태그 종류별 CBGA 생성량 비교 실험 결과, 태그로서 FhB, GST, SUMO 및 Trx를 이용한 경우에는 거의 반응하지 않는 것을 확인하였으며, MBP 및 MISTIC-C 태그는 해당 태그를 포함하지 않은 경우 대비하여, CBGA 생성량이 각각 3배, 6배 증가함을 확인하였다(도 8A). 마찬가지로, CBGA 합성에 대하여 기질로 이용되는, 올리베톨산의 소모속도 역시 MBP 및 MISTIC-C 태그를 이용한 경우에 가장 빠른 것으로 확인하였다(도 8B).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (18)
- 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 프레닐트랜스퍼라제 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인, 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 하나 이상의 아미노산 치환은 서열번호 2의 47, 49, 213, 214, 216, 232, 269, 271, 286 및 288번째 위치로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 치환되는 것을 포함하는 것인, 폴리펩타이드. - 제1항에 있어서,
상기 아미노산 치환은 서열번호 2의 213번째 위치의 페닐알라닌 (phenylalanine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환되거나, 및 서열번호 2의 214번째 위치의 세린 (serine)이 트레오닌 (threonine)으로 치환되는 것으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 폴리펩타이드. - 제1항에 있어서,
상기 아미노산 치환은 서열번호 2의 213번째 위치의 페닐알라닌 (phenylalanine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환되고, 서열번호 2의 286번째 위치의 글라이신(glycine)이 세린(serine)으로 치환되고 및 서열번호 2의 288번째 위치의 티로신(tyrosine)이 알라닌 (alanine)으로 치환되는 것을 포함하는 것인, 폴리펩타이드. - 제1항에 있어서,
상기 아미노산 치환은 서열번호 2의 214번째 위치의 세린 (serine)이 트레오닌 (threonine)으로 치환되고, 서열번호 2의 286번째 위치의 글라이신(glycine)이 세린(serine)으로 치환되고 및 서열번호 2의 288번째 위치의 티로신(tyrosine)이 알라닌 (alanine)으로 치환되는 것을 포함하는 것인, 폴리펩타이드. - 제1항에 있어서,
친화성 태그를 더 포함하는 것인, 폴리펩타이드. - 제6항에 있어서,
상기 친화성 태그는 말토스-결합 단백질(Maltose binding protein, MBP) 태그 또는 미스틱(MISTIC) 태그인, 폴리펩타이드. - 제7항에 있어서,
상기 미스틱 태그는 프레닐트랜스퍼라제 변이체의 C말단에 연결되는 것인, 폴리펩타이드. - 제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제10항의 벡터로 형질전환된 칸나비제롤산 및 이의 유도체 생산용 재조합 미생물.
- 제11항에 있어서,
상기 칸나비제롤산의 유도체는 칸나비게로르신산(cannabigerorcinic acid), 칸나비게로바린산(cannabigerovarinic acid) 및 3-게라닐-2,4-하이드록시벤조산으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상인 것인, 재조합 미생물. - 제11항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 칸나비제롤산 생합성 반응성이 증가된 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물. - 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 미생물을 제라닐 피로인산(geranyl pyrophosphate), 및 올리베톨산(olivetolic acid) 또는 이의 유도체가 포함된 용액에서 배양하는 단계를 포함하는, 칸나비제롤산 또는 이의 유도체 생산방법.
- 제14항에 있어서,
상기 제라닐 피로인산(geranyl pyrophosphate)은 제라닐 피로인산 테트라부틸 암모늄염(Geranyl pyrophosphate tetrabutyl ammonium salt)인 것인, 생산방법. - 제14항에 있어서,
상기 칸나비제롤산의 유도체는 칸나비게로르신산(cannabigerorcinic acid), 칸나비게로바린산(cannabigerovarinic acid) 및 3-게라닐-2,4-하이드록시벤조산으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상인 것인, 생산방법. - 제14항에 있어서,
상기 미생물은 제8항의 벡터로 형질전환된 미생물인 것인, 생산방법. - 제17항에 있어서,
상기 형질전환은 프레닐트랜스퍼라제 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입하고, 항생제를 포함하는 배지에서 배양하여 선별하는 단계를 포함하는 것인, 생산방법.
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