KR20240099343A - 암 및 감염병에 대한 병용 요법 - Google Patents
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Abstract
암 및 감염성 질환에 대한 병용 면역요법. 면역 관문 항체 및 융합 단백질을 포함하는 병용물이 개시된다. 융합 단백질은 다음을 포함한다: CD40-결합 도메인, 항원, CD40-결합 도메인과 항원 사이에 위치한 전위 도메인 및 CD40-결합 도메인과 전위 도메인 사이에 위치한 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위. 항원은 병원체의 항원 또는 종양 항원이다. 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위는 융합 단백질로부터 CD40-결합 도메인을 제거하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 병용물은 항원-특이적 세포-매개 면역 반응을 유도하는데 효과적이며, 이는 종양 및/또는 병원체에 의해 유발되는 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서 이 질환을 치료하는데 유용하다.
Description
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전자 서열 목록의 내용(10040-002PCT_sequence listing_ST26.xml; 크기 79KB; 생성 일자 2022년 8월 23일)은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 병용 요법에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 종양 및 감염병에 대해 T 세포-매개 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 융합 단백질과 면역 관문 항체의 병용에 관한 것이다.
적응성 면역 시스템은 체액성 및 세포-매개 면역을 포함하며, 이들 모두 침입하는 병원체를 파괴하는데 기여한다. B- 및 T-림프구는 각각 항체 및 세포-매개 면역 반응을 담당한다. 암 또는 병원체에 대한 적응성 면역은 미래에 마주칠 것에 대한 향상된 면역 반응을 유도한다. 몇몇 적응성 면역 요법 전략이 임상 환경에서 평가되었다. 그러나 여전히 암과 병원체에 의해 유발되는 감염병에 대한 새로운 면역요법, 예를 들어 병용 면역요법의 개발이 필요하다.
일 양상에서, 본 발명은 다음을 포함하는 병용물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다: (a) T 세포를 활성화할 수 있는 면역 관문 항체; 및 (b) 융합 단백질로서, (i) CD40-결합 도메인; (ii) 항원; (iii) CD40-결합 도메인과 항원 사이에 위치한 전위 도메인; 및 (iv) CD40-결합 도메인과 전위 도메인 사이에 위치한 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위를 포함하는, 융합 단백질.
다른 양상에서, 본 발명은 항원-특이적 세포-매개 면역 반응을 유도하여, 종양 또는 병원체에 의해 유발되는 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서 이를 치료하는데 사용하기 위한 병용물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
도 1 내지 도 4는 벡터 지도이다.
도 5a 내지 도 5e는 본 발명의 다양한 실시형태를 나타내는 개략도이다.
도 6은 각 동물군에서 상대적인 사이토카인 유도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 각 동물군의 비장 세포의 IFN-γ+ 면역스팟(immunospot) 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 각 동물군의 혈청 HPV16 E7-특이적 항체의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 9는 각 동물군의 혈청 HPV18 E7-특이적 항체의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 10은 면역화 일정(상부) 및 PD-1, PD-1과 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군(하부)을 보여준다.
도 11은 PD-1, PD-1과 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군의 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
도 12는 PD-1, PD-1과 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군의 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 13은 PD-1, PD-1과 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군에서 종양이 없는 비율을 보여주는 그래프이다.
도 14는 융합 단백질, CD137 mAb, CD137 mAb와 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군의 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
도 15는 융합 단백질, CD137 mAb, CD137 mAb와 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군의 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5e는 본 발명의 다양한 실시형태를 나타내는 개략도이다.
도 6은 각 동물군에서 상대적인 사이토카인 유도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 각 동물군의 비장 세포의 IFN-γ+ 면역스팟(immunospot) 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 각 동물군의 혈청 HPV16 E7-특이적 항체의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 9는 각 동물군의 혈청 HPV18 E7-특이적 항체의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 10은 면역화 일정(상부) 및 PD-1, PD-1과 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군(하부)을 보여준다.
도 11은 PD-1, PD-1과 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군의 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
도 12는 PD-1, PD-1과 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군의 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 13은 PD-1, PD-1과 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군에서 종양이 없는 비율을 보여주는 그래프이다.
도 14는 융합 단백질, CD137 mAb, CD137 mAb와 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군의 종양 크기를 보여주는 그래프이다.
도 15는 융합 단백질, CD137 mAb, CD137 mAb와 융합 단백질의 병용 또는 위약으로 처리한 동물군의 생존율을 보여주는 그래프이다.
정의
전문 APC 및 비-전문 APC는 I형 MHC 분자를 사용하여 세포막 상에 내인성 펩타이드를 표시한다. 이들 펩타이드는, II형 MHC 분자를 사용하여 전문 APC에 의해 표시되는 외인성 항원과 달리, 세포 자체 내에서 유래한다. 세포독성 T 세포는 I형 MHC 분자에 의해 제시되는 항원과 상호작용할 수 있다.
CD40은 항원-제시 세포(예를 들어, 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포)에서 발현되는 공동자극 단백질이다. CD40L과 CD40의 결합은 항원-제시 세포를 활성화하고 다양한 하류 효과를 유도한다. CD40은 암 면역요법을 위한 약물 표적이다.
용어 "CD40-결합 도메인"은 CD40을 인식하고 여기에 결합할 수 있는 단백질을 의미한다. CD40-결합 도메인은 다음 중 하나로부터 선택될 수 있다: "CD40 리간드(CD40L) 또는 이의 기능적 단편", "항-CD40 항체 또는 이의 기능적 단편".
용어 "CD40L", "CD40 리간드" 및 "CD154"는 호환 가능하다. CD40L은 항원-제시 세포(APC) 상의 CD40(단백질)에 결합하며, 이는 표적 세포 유형에 따라 많은 효과를 유도한다. CD40L은 T 세포 프라이밍(priming) 및 CD40-발현 면역 세포의 활성화를 통한 면역 반응의 공동-자극 및 조절에서 중심적인 역할을 한다. 미국 특허 제5,962,406호에 CD40L의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 개시되어 있다.
용어 "항-CD40 항체" 및 "CD40-특이적 항체"는 호환 가능하다.
용어 "~으로 실질적으로 이루어진다" 또는 "~으로 실질적으로 이루어지는"이 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 기술하는데 사용될 때, 이는 폴리펩타이드가, 단백질 번역 요건에 따라, 그 일부로서 N-말단에 시작 아미노산 "M"(시작 코돈 AUG에서 번역됨)을 갖거나 갖지 않을 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 항원 HPV18 E7 단백질(서열번호 39)이 다른 폴리펩타이드(예를 들어, 다른 항원)에 융합되는 경우, 시작 아미노산 "M"은 생략되거나 유지될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "전위 도메인"(translocation domain)은 융합 단백질 내의 항원을 엔도솜 막을 가로질러 CD40-발현 세포의 세포기질로 전위시키는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드이다. 전위 도메인은 항원 제시를 위해 항원을 I형 주조직적합성 복합체(MHC-1) 경로(즉, 세포독성 T 세포 경로)로 안내하거나 촉진한다.
용어 "슈도모나스 외독소 A(PE) 전위 펩타이드"(Pseudomonas Exotoxin A translocation peptide: TPE)는 PE 도메인 II 펩타이드 또는 전위의 생물학적 활성이 있는 이의 기능적 단편을 의미한다.
용어 "쉬가 독소(Shiga toxin)(Stx) 전위 펩타이드"(TStx)는 Stx 전위 도메인 또는 전위의 생물학적 활성이 있는 이의 기능적 단편을 의미한다.
용어 "퓨린 및/또는 카텝신 L" 또는 "퓨린/카텝신 L"은 호환 가능하다. 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위는 단백질분해효소(퓨린 및/또는 카텝신 L) 민감성 부위를 의미한다. 이것은 퓨린 또는 카텝신 L에 의해, 또는 퓨린과 카텝신 L 모두에 의해 잘릴 수 있는 짧은 펩타이드 서열이다. 이것은 융합 단백질에 도입되는 상기 절단 부위를 포함하는 펩타이드 링커이거나 융합 단백질의 전위 도메인에 존재하는 내재성 단백질분해효소 절단 부위일 수 있다.
용어 "항원" 및 "면역원"은 호환 가능하다. 항원은 종양 항원(암으로부터의 항원 또는 암과 관련된 항원) 또는 병원체의 항원(병원체로부터의 항원)일 수 있는 항원성 단백질을 의미한다.
용어 "종양" 및 "암"은 호환 가능하다.
용어 "암세포의 항원" 및 "종양 항원"은 호환 가능하다.
용어 "종양 항원"은 종양-특이적 항원 및/또는 종양-관련 항원을 의미한다. 종양-관련 항원은 종양 세포의 표면 상에 발현되는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
분화 클러스터 28(Cluster of Differentiation 28: CD28)은 T-세포-특이적 표면 당단백질이다. CD28 수용체는 T 세포가 항원-제시 세포와 접촉하는 동안 자극된다. 이의 기능은 T-세포 활성화, 세포 증식 및 사이토카인 생산의 유도 및 T 세포 생존의 촉진에 관련된다.
용어 "유효량"은 치료받는 대상에게 치료 효과를 부여하는데 필요한 활성 융합 단백질의 양을 의미한다. 유효 투여량은 이 분야의 기술자들이 인식하는 바와 같이, 투여 경로, 부형제의 사용 및 다른 치료 요법과의 공동-사용의 가능성에 따라 달라질 것이다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 질환, 이의 증상 또는 이에 대한 소인을 치유, 완화, 경감, 치료, 개선 또는 예방의 목적으로 암 또는 감염, 또는 이러한 질환에 대한 증상 또는 소인이 있는 이를 필요로 하는 대상에게 유효량의 융합 단백질의 투여를 의미한다. 이러한 대상은 임의의 적합한 진단 방법으로부터의 결과를 기초로 의료 전문가에 의해 식별될 수 있다.
용어 "병용물" 또는 "병용 요법" 또는 "병용 면역요법"은 치료 효과가 있는 하나 이상의 활성 약물 물질의 병용을 의미한다. 병용물은 제1 활성 약물 물질(예를 들어, 면역 관문 항체) 및 제2 활성 약물 물질(예를 들어, 본 발명의 융합 단백질)이 함께 투여될 수 있도록 단일 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 병용물은 하나 초과의 약학적 조성물을 사용하여 제공될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 두 약물 물질이, 예를 들어 서로 다른 시간, 서로 다른 투여 경로 등과 같이 별도로 투여될 수 있도록, 제1 활성 약물 물질은 제1 약학적 조성물로 제공될 수 있고 제2 활성 약물 물질은 제2 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 따라서, 서로 다른 투여 요법으로 두 활성 약물 물질을 제공하는 것도 가능할 수 있다.
"0 내지 12 반복" 또는 "2 내지 6 반복"은 "0 내지 12" 또는 "2 내지 6"의 범위 내의 정수 단위량이 본 발명의 일부로서 구체적으로 개시됨을 의미한다. 따라서, "0, 1, 2, 3, 4, . . . 10, 11 및 12" 또는 "2, 3, 4, 5 및 6" 단위량이 본 발명의 실시형태로서 포함된다.
일 양상에서, 본 발명은 병용물로서, (a) T 세포를 활성화할 수 있는 면역 관문 항체; 및 (b) 융합 단백질로서, (i) CD40-결합 도메인; (ii) 항원; (iii) CD40-결합 도메인과 항원 사이에 위치한 전위 도메인; 및 (iv) CD40-결합 도메인과 전위 도메인 사이에 위치한 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위를 포함하는, 융합 단백질을 포함하는, 병용물에 관한 것이다.
면역 관문 항체는 (1) 억제성 면역 관문을 차단하거나 (2) 자극성 면역 관문을 활성화하여 T 세포 활성화를 복구하거나 향상시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 면역 관문 항체는 (1) 억제성 면역 관문을 표적화할 수 있는 길항 항체(antagonist antibody), (2) 자극성 면역 관문을 표적화할 수 있는 작용 항체(agonist antibody) 또는 (3) 두 면역 관문을 표적화할 수 있는 이중특이성 항체이다. 억제성 면역 관문은 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIGIT, CD96, CD122R, TIM3, VISTA, CEACAM1, SIGLEC-7, SIGLEC-9, SIGLEC-15, KIRi, CD200R, BTLA 및 ILT2를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 자극성 면역 관문은 CD137(4-1BB), OX40, GITR, ICOS, CD27, CD28, CD40, KIRs, CD226 및 CD244를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 면역 관문 항체는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIGIT, CD96, CD122R, TIM3, VISTA, CEACAM1, SIGLEC-7, SIGLEC-9, SIGLEC-15, KIRi, CD200R, BTLA 및 ILT2를 표적화할 수 있는 길항 항체이다. 일부 실시형태에서, 면역 관문 항체는 CD137(4-1BB), OX40, GITR, ICOS, CD27, CD28, CD40, KIRs, CD226 및 CD244를 표적화할 수 있는 작용 항체이다.
일 실시형태에서, 면역 관문 항체는 항-PD-1 항체, 예를 들어, Keytruda®(펨브로리주맙(pembrolizumab)), Opdivo®(니볼루맙(nivolumab)), Libtayo®(세미플리맙(cemiplimab)), Jemperli®(도스타리맙(dostarlimab))이다. 일 실시형태에서, 면역 관문 항체는 항-PD-L1 항체, 예를 들어, Tecentriq®(아테졸리주맙(atezolizumab)), Imfinzi®(더발루맙(durvalumab)) 또는 Bavencio®(아벨루맙(avelumab))이다. 일 실시형태에서, 면역 관문 항체는 항-CTLA-4 항체, 예를 들어, Yervoy®(이필리무맙(ipilimumab))이다. 일 실시형태에서, 면역 관문 항체는 항-LAG3 항체, 예를 들어, 렐라틀리맙(Relatlimab)(BMS-986016)이다. 일 실시형태에서, 면역 관문 항체는 항-TIGIT 항체, 예를 들어, 티라골루맙(tiragolumab)이다. 일 실시형태에서, 면역 관문 항체는 항-CD137 항체, 예를 들어, LVGN6051 또는 우렐루맙(Urelumab)(BMS-663513)이다. 일 실시형태에서, 면역 관문 항체는 항-OX40 항체, 예를 들어, PF-04518600, BMS-986178 또는 MEDI6469이다. 일 실시형태에서, 면역 관문 항체는 CD137/PD-L1 이중특이적 항체, 예를 들어, FS222이다. 일 실시형태에서, 면역 관문 항체는 CD137/OX40 이중특이적 항체, 예를 들어, FS120이다.
일부 실시형태에서, 면역 관문 항체는 완전 항체, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 디아바디(diabody)(dscFv), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 이중특이적-scFv, scFv-Fc, scFc-CH3, 단일 사슬 항원-결합 단편(scFab), 항원-결합 단편(Fab), Fab2, 미니바디(minibody) 또는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 유사체를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질은 I형 MHC 항원 제시 경로를 통해 항원-특이적 T 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 이들은 공통의 작용 메커니즘을 공유한다. 예시로서 18sCD40L-TPE-E7을 사용하면, 작용 메커니즘은 다음과 같다: (1) 18sCD40L-TPE-E7이 CD40-발현 세포(예를 들어, 수지상 세포 또는 대식세포)에 결합하고 CD40-매개 내포작용을 통해 내재화됨; (2) 18sCD40L-TPE-E7이 엔도솜 내에서 퓨린 단백질분해효소 및/또는 카텝신 L 단백질분해효소에 의해 잘려 TPE-E7 단편으로부터 18sCD40L 단편이 제거됨; (3) TPE-E7 단편이 엔도솜의 엔도솜막을 가로질러 세포기질로 전위됨; (4) TPE-E7 단편이 세포기질 프로테아솜(proteasome)에 의해 소화되어 에피토프가 있는 작은 E7 항원이 생성됨; (5) 항원 제시를 위해 E7 항원이 I형 MHC 경로를 통해 전달됨; 및 (6) 이러한 제시된 항원을 인식하는 T-세포에 의해 CD8+ T 세포 특이적 면역 반응이 유도 또는 향상됨.
같은 작용 메커니즘을 E7-TStx-18sCD40L에 적용할 수 있으며, 여기서 퓨린 및/또는 카텝신 L 단백질분해효소 절단은 18sCD40L 단편으로부터 E7-TStx 단편을 제거할 것이다. 따라서, E7-TStx 단편은 엔도솜의 엔도솜막을 가로질러 전위되어 세포기질로 진입하고, 세포기질 프로테아솜에 의해 소화되어 에피토프가 있는 작은 E7 항원을 생성하며; 작은 E7 항원은 항원 제시를 위해 I형 MHC 경로를 통해 전달되고; 이러한 제시된 항원을 인식하는 T-세포에 의해 CD8+ T 세포 특이적 면역 반응이 유도되거나 향상될 것이다.
본 발명의 융합 단백질의 항원과 전위 도메인 사이에 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위는 존재하지 않는다. 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위의 존재와 본 발명의 융합 단백질 내에서의 이의 위치는 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 후 융합 단백질로부터 CD40-결합 도메인의 제거를 허용한다.
일부 실시형태에서, 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위는 4 내지 20개의 아미노산, 바람직하게는 4 내지 10개의 아미노산, 보다 바람직하게는 4 내지 6개의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위는 서열번호 1 또는 2를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이 서열이다.
본 발명의 융합 단백질은 CD40-결합 도메인과 전위 도메인 사이에 존재하는 펩타이드 링커를 더 포함할 수 있으며, 여기서 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위는 상기 펩타이드 링커 내에 존재한다. 펩타이드 링커는 (a) 고정 링커(rigid linker) (EAAAAK)n 또는 (서열번호 38)n; 및 (b) 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위를 포함하는 절단 가능 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 n은 0 내지 12, 바람직하게는 2 내지 6, 보다 바람직하게는 3 내지 4의 정수이고, 상기 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위는 서열번호 1 또는 2를 포함한다. 일 실시형태에서, 펩타이드 링커는 (EAAAAK)3 및 RX1RX2X3R(서열번호 2; 여기서 X1은 A, X2는 Y, X3은 K임)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 펩타이드 링커는 RX1X2R(서열번호 1; 여기서 X1은 V, X2는 A임) 및 (EAAAAK)3을 포함한다.
전위 도메인 및 항원은 전위 도메인이 항원을 엔도솜의 막을 가로질러 전위시키고 세포기질에 진입시켜, CD40-발현 세포 내에서 항원 제시를 위해 항원이 I형 MHC 경로로 향하는 것을 촉진하도록 허용하는 그러한 방향 및/또는 관계로 융합 단백질 내에 위치한다.
전위 도메인은 슈도모나스 외독소 A(PE) 또는 쉬가 독소(Stx)에서 유래할 수 있다. 일 실시형태에서, 전위 도메인은, CD40-결합 도메인이 융합 단백질의 N-말단에 위치한다는 단서 하에, 슈도모나스 외독소 A(PE) 전위 펩타이드(TPE)를 포함하거나 이 전위 펩타이드이다. 다른 실시형태에서, 전위 도메인은, 항원이 융합 단백질의 N-말단에 위치한다는 단서 하에, 쉬가 독소(Stx) 전위 펩타이드(TStx)를 포함하거나 이 전위 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 다음을 순차적으로(N-말단에서 C-말단으로) 포함한다: (a) CD40-결합 도메인; (b) 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위; (c) PE 전위 펩타이드(TPE)를 포함하는 전위 도메인; 및 (d) 항원.
다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 다음을 순차적으로(N-말단에서 C-말단으로) 포함한다: (a) CD40-결합 도메인; (b) 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위를 포함하는 펩타이드 링커; (c) PE 전위 펩타이드(TPE)를 포함하는 전위 도메인; 및 (d) 항원.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 다음을 순차적으로(N-말단에서 C-말단으로) 포함한다: (a) 항원; (b) Stx 전위 펩타이드(TStx)를 포함하는 전위 도메인; (c) 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위; 및 (d) CD40-결합 도메인.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 다음을 순차적으로(N-말단에서 C-말단으로) 포함한다: (a) 항원; (b) Stx 전위 펩타이드(TStx)를 포함하는 전위 도메인; (c) 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위를 포함하는 펩타이드 링커; 및 (d) CD40-결합 도메인.
TPE 또는 TStx는 전위에서 생물학적 활성이 있는 기능적 모이어티이다. 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 PE 또는 Stx 내의 또는 여기에서 유래된 내재성 퓨린 절단 부위로부터 선택된 하나일 수 있다.
일 실시형태에서, PE 전위 펩타이드(TPE)는 슈도모나스 외독소 A 단백질(전장 PE, 서열번호 4)의 도메인 II(253번 내지 364번 아미노산 잔기; 서열번호 9) 또는 이의 기능적 모이어티이다.
일부 실시형태에서, PE 전위 펩타이드(TPE)는 26 내지 112개 아미노산 잔기 길이로 이루어진다. PE 전위 펩타이드(TPE)는 GWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSW(서열번호 5)의 최소 기능적 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, PE 전위 펩타이드(TPE)는 서열번호 5, 6, 7, 8 또는 9에 적어도 95%, 97% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, TPE는 서열번호 5, 6, 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, TPE는 PE280-305(서열번호 5), PE280-313(서열번호 6), PE268-313(서열번호 7), PE253-313(서열번호 8) 또는 PE253-364(서열번호 9; 전장 PE 도메인 II)이다.
일 실시형태에서, Stx 전위 펩타이드(TStx)는 쉬가 독소(Stx) 서브유닛 A(서열번호 10) 또는 쉬가-유사 독소 I(Slt-I) 서브유닛 A(서열번호 11)의 기능적 단편이다. Stx 전위 펩타이드는 전위 기능을 갖지만 서브유닛 A의 세포독성 효과는 없다. 쉬가 독소(Stx) 서브유닛 A와 Slt-I 서브유닛 A 사이의 서열 동일성은 99%이고 두 단백질은 단 하나의 아미노산 차이가 있다.
일부 실시형태에서, Stx 전위 펩타이드(TStx)는 8 내지 84개의 아미노산 잔기 길이로 이루어진다. Stx 전위 펩타이드(TStx)는 LNCHHHAS(서열번호 12)의 최소 기능적 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, Stx 전위 펩타이드(TStx)는 서열번호 12, 13, 14, 15 또는 16에 적어도 95%, 97% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, TStx는 서열번호 12, 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, TStx는 Stx 서브유닛 A의 Stx240-247(서열번호 12), Stx240-251(서열번호 13), Stx211-247(서열번호 14), Stx211-251(서열번호 15) 또는 Stx168-251(서열번호 16)이다.
CD40-결합 도메인은 CD40-발현 세포 상의 CD40 단백질에 결합하는 생물학적 활성이 있는 폴리펩타이드이다. CD40-결합 도메인은 본 발명의 융합 단백질이 CD40-발현 세포(예를 들어, 수지상 세포 또는 대식세포) 상의 CD40 수용체에 결합하는 것을 허용한다. CD40-결합 도메인은 (i) CD40 리간드(CD40L) 또는 이의 기능적 단편; 및 (ii) CD40-특이적 항체 또는 이의 기능적 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있다.
일 실시형태에서, CD40L의 기능적 단편은 상기 생물학적 활성이 있는 잘린 CD40L이며, 전장 CD40L1-261 단백질(서열번호 17)의 막관통 및 세포질 영역이 실질적으로 결여되어 있다.
다른 실시형태에서, CD40L 또는 이의 기능적 단편은 154 내지 261개의 아미노산 잔기 길이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD40L은 서열번호 19의 최소 기능적 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, CD40L 또는 이의 기능적 단편은 154 내지 261개의 아미노산 잔기 길이로 이루어지고 상기 CD40L은 서열번호 19의 최소 기능적 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, CD40L은 서열번호 17, 18 또는 19에 적어도 95%, 97% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, CD40L은 CD40L1-261(서열번호 17), CD40L47-261(서열번호 18) 및 CD40L108-261(서열번호 19)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, CD40-결합 도메인은 CD40-특이적 항체(또는 항-CD40 항체)이다. CD40-특이적 항체는 CD40 단백질을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 항체이다. CD40-특이적 항체는 CD40-발현 세포 상의 CD40 단백질에 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, CD40-특이적 항체는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 여기서 VH는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고 VL은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, CD40-특이적 항체는 단일 사슬 가변 단편(scFv), 디아바디(dscFv), 트리아바디, 테트라바디, 이중특이적-scFv, scFv-Fc, scFc-CH3, 단일 사슬 항원-결합 단편(scFab), 항원-결합 단편(Fab), Fab2, 미니바디 또는 완전 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, CD40-결합 도메인은 중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL) 및 VH 및 VL을 연결하는 유연성 링커(L)를 포함하는 CD40-특이적 scFv(항-CD40 scFv)이다.
일 실시형태에서, CD40-특이적 scFv는 서열번호 20 또는 21을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 CD40-결합 도메인은 (i) CD40-특이적 항체 또는 이의 결합 단편 또는 (ii) CD40-특이적 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 이의 결합 단편이고; 상기 CD40-특이적 항체 또는 상기 CD40-특이적 scFv는 VH 및 VL을 포함하고, 여기서 (a) VH는 서열번호 22를 포함하고; (b) VL은 서열번호 23을 포함한다.
다른 실시형태에서, CD40-특이적 항체 또는 CD40-특이적 scFv는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고; VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, 여기서 (i) VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 서열번호 24, 25 및 26을 포함하고; (ii) VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 27, 28 및 29를 포함한다.
다른 실시형태에서, CD40-결합 도메인은 VH 및 VL을 포함하는 CD40-특이적 scFv이고, 여기서 (a) VH는 서열번호 22를 포함하고; (b) VL은 서열번호 23을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은, 전위 도메인이 PE 전위 펩타이드(TPE)를 포함한다는 단서 하에, 항원의 C-말단에 위치한 소포체(endoplasmic reticulum: ER) 잔류 서열을 더 포함한다. 본 명세서에 사용된 ER 잔류 서열은 서열번호 30, 31, 32, 33 또는 34를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, ER 잔류는 서열번호 30이다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 CD40-결합 도메인과 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위 사이에 위치한 CD28-활성화 펩타이드를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, CD28-활성화 펩타이드는 28 내지 53개의 아미노산 잔기 길이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CD28-활성화 펩타이드는 서열번호 35의 최소 기능적 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, CD28-활성화 펩타이드는 28 내지 53개의 아미노산 잔기 길이로 이루어지며 상기 CD28-활성화 펩타이드는 서열번호 35의 최소 기능적 단편을 포함한다.
다른 실시형태에서, CD28-활성화 펩타이드는 서열번호 35, 36 또는 37에 적어도 95%, 97% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CD28-활성화 펩타이드는 서열번호 35, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CD28-활성화 펩타이드는 서열번호 35, 36 또는 37이다.
본 발명의 융합 단백질 내 항원은 병원체 또는 종양 항원의 항원이다.
병원체는 인간 유두종바이러스(HPV), 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1), 인플루엔자 바이러스, 뎅기 바이러스, A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV), E형 간염 바이러스(HEV), 중증 급성 호흡기 증후군-연관 코로나바이러스(SARS-CoV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV2), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-Cov), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 지카 바이러스, 광견병 바이러스, 천연두 바이러스, 치군군야 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 폴리오바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 한타바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 엔테로바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 수두-대상포진 바이러스(VZV), 헤르페스 B 바이러스-1(CHV-1), 황열 바이러스(YFV), 리프트밸리열 바이러스, 라싸 바이러스, 마르부르그 바이러스, 에볼라바이러스, 노로바이러스, 로타바이러스, 아데노바이러스, 사포바이러스, 아스트로바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 아프리카 돼지열병 바이러스(ASFV), 돼지열병 바이러스(CSFV), 돼지 써코바이러스 2(PCV2), 구제역 바이러스(FMDV), 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV), 돼지 수포병 바이러스(SVDV), 가성광견병 바이러스(PRV), 전염성 위장염 바이러스(TGEV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 전염성 기관지염 바이러스(IBV), 전염성 F낭병 바이러스(IBDV), 마이코플라스마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumoniae), 리케치아 프로바체키(Rickettsia prowazekii), 리케치아 타이피(Rickettsia typhi), 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모디움 말라리아(Plasmodium malariae), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모디움 오발레(Plasmodium ovale), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 클로스트리디움 디피실리(Clostridium Difficile), 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium Botulinum), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 타이피(Typhi), 살모넬라 엔테리카 혈청형 파라타이피(Paratyphi) A, 쉬가 독소-생산 대장균(STEC), 쉬겔라 디센테리아(Shigella dysenteriae), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 엔타메바 히스토라이티카(Entamoeba histolytica), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertusis), B형 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)(HiB), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 실시형태에서, 병원체는 HPV, HIV-1, 인플루엔자 바이러스, 뎅기 바이러스, HAV, HBV, HCV, SARS-CoV, SARS-CoV-2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 특별하게는, 병원체는 HPV, HBV, HCV 및 SARS-CoV2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 항원은 HPV16 E7 단백질, HPV18 E7 단백질, HBV X 단백질(HBx), HBV preS1 단백질, HCV 코어 단백질(HCVcore), SARS-CoV2 스파이크 단백질(CoV2S), SARS-CoV2 외피 단백질, SARS-CoV2 막 단백질 및 SARS-CoV2 뉴클레오캡시드 단백질로부터 선택되거나 유래된 병원체성 항원이다.
다른 실시형태에서, 상기 항원은 원하는 면역 반응을 유도하기 위한 적어도 하나의 에피토프를 포함하며, 바람직하게는 1 내지 50개의 에피토프, 보다 바람직하게는 1 내지 20개의 에피토프를 함유한다.
다른 실시형태에서, 항원은 서열번호 38, 39, 40, 41, 42 또는 43에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 실질적으로 이루어지는 병원체성 항원이다.
다른 실시형태에서, 항원은 서열번호 38, 39, 40, 41, 42 또는 43에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 실질적으로 이루어지는 병원체성 항원이다.
다른 실시형태에서, 항원은 서열번호 38, 39, 40, 41, 42 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 항원은 종양 항원이다. 종양 항원은 종양-관련 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)이다.
일 실시형태에서, 종양 또는 암은 유방암, 결장암, 직장암, 방광암, 자궁내막암, 신장암, 위암, 교모세포종, 간세포암종, 담관암(담관암종), 소세포폐암, 비-소세포폐암(NSCLC), 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 전립선암, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 비-호지킨 림프종 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 종양-관련 항원은 SSX2, MAGE-A3, NY-ESO-1, iLRP, WT12-281, RNF43, CEA-NE3, AFP, ALK, AGR2(Anterior gradient 2), BAGE 단백질, β-카테닌, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, 탄산무수화효소(carbonic anhydrase) IX, 카스파제(caspase)-8, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, 사이클린(cyclin)-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIll, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EphA2, Fra-1, FOLR1, GAGE 단백질(예를 들어, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, 글리피칸(glypican)-3, GM3, gp100, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, MAGE 단백질(예를 들어, MAGE-1, -2, -3, -4, -6 및 -12), MART-1, 메소텔린(mesothelin), ML-IAP, Muc1, Muc16(CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ES01, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA(FOLH1), RAGE 단백질, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, 서바이빈(survivin), TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Tn, TRP-1, TRP-2, 티로시나제(tyrosinase) 및 유로플라킨(uroplakin)-3으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 유래된다.
다른 실시형태에서, 항원은 SSX2, MAGE-A3, NY-ESO-1, iLRP, WT12-281, RNF43 및 CEA-NE3으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 유래된 종양-관련 항원이다.
다른 실시형태에서, 항원은 서열번호 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 종양-관련 항원이다.
다른 실시형태에서, 항원은 서열번호 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 종양-관련 항원이다.
항원은 단일 항원 또는 이의 항원성 단편, 또는 서로 융합된 적어도 두 개의 항원성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 항원일 수 있다. 예를 들어, 항원은 HPV16 E7 단백질의 단일 항원 또는 HPV16 E7과 HPV18 E7 단백질을 포함하는 융합 항원일 수 있다. 융합 항원은 서로 다른 항원성 폴리펩타이드를 연결하는 링커가 있거나 없을 수 있다.
다른 실시형태에서, 항원은 서로 다른 항원을 연결하는 적어도 하나의 링커를 갖는 융합 항원이다.
다른 실시형태에서, 항원은 서로 다른 항원을 연결하는 고정 링커 (EAAAAK)n이 있는 융합 항원이며, 여기서 n은 0 내지 12, 바람직하게는 2 내지 6, 보다 바람직하게는 3 내지 4의 정수이다. 다시 말해, 고정 링커는 서열 EAAAAK(서열번호 56)의 0 내지 12 반복체, 2 내지 6 반복체 또는 3 내지 4 반복체를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 CD40-결합 도메인과 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위 사이에 고정 링커를 더 포함한다. 고정 링커는 아미노산 서열 EAAAAK(서열번호 56)의 0 내지 12 반복체를 포함하는 펩타이드 라이너일 수 있다.
고정 링커는 (EAAAAK)n 또는 (서열번호 56) n일 수 있으며, 여기서 n은 0 내지 12, 바람직하게는 2 내지 6, 보다 바람직하게는 3 내지 4의 정수이다.
다른 실시형태에서, 고정 링커는 서열번호 56의 2 내지 6 반복체 또는 3 내지 4 반복체를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 51, 52, 53, 54 또는 55에 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 실질적으로 이루어진다.
추가로 다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 51, 52, 53, 54 및 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 실질적으로 이루어진다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다: (a) 본 발명에 따른 병용물; 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제.
용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는, 이 분야의 통상의 기술자에게 알려진 것으로서, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 보존제, 등장화제, 흡수 지연제, 염, 약물, 약물 안정화제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료 및 이들의 조합을 포함한다(예를 들어, 참조에 의해 본 명세서에 원용되는, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 치료적 또는 약학적 조성물에 이의 사용이 고려된다.
적합한 보조제에는 사포닌-기반 보조제 및 톨(Toll)-유사 수용체(TLR) 작용제 보조제가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 사포닌-기반 보조제는 GPI-0100, Quil A 또는 QS-21일 수 있다. TLR 작용제 보조제는 TLR3, TLR4 또는 TLR9 작용제, 예를 들어, Poly I:C(TLR3 작용제), 모노포스포릴 지질 A(MPL; TLR4 작용제) 또는 CpG 올리고뉴클레오타이드(TLR9 작용제)로부터 선택될 수 있다. CpG 올리고뉴클레오타이드 보조제에는 A형 CpG(즉, CpG1585, CpG2216 또는 CpG2336), B형 CpG(즉, CpG1668, CpG1826, CpG2006, CpG2007, CpG BW006 또는 CpG D-SL01) 및 C형 CpG(즉, CpG2395, CpG M362 또는 CpG D-SL03)가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 추가로, 다른 보조제 CpG1018(Dynavax) 또한 고려할 만하다. 일부 실시형태에서, 보조제는 CpG 올리고뉴클레오타이드이다.
약학적 조성물은, 경피, 경점막, 비인두, 폐 또는 직접 주사에 적합하거나, 전신성(예를 들어, 비경구) 또는 국소적(예를 들어, 종양내 또는 병변내 주사) 투여를 위한, 경장(enteral) 또는 비경구 투여 형태일 수 있다. 비경구 주사는 정맥내(i.v.), 복강내(i.p.), 근육내(i.m.), 피하(s.c.) 또는 피내(i.d.) 경로를 통해 이루어질 수 있다.
약학적 조성물은 또한 경구로, 예를 들어 정제, 코팅된 정제, 당의정, 경질 및 연질 젤라틴 캡슐의 형태로, 투여될 수 있다.
융합 단백질의 투여량은 제어할 질환, 환자의 연령 및 개별 상태 및 투여 방식에 따라 달라질 수 있다. 투여량은 원하는 치료적 반응을 달성하기 위한 본 발명의 융합 단백질의 약학적 유효량을 얻기 위해서 각 특정 경우의 개별 요구사항에 맞춰질 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 제공받는 성인 환자의 경우 약 0.1 내지 50㎎, 특히 약 0.1 내지 5㎎의 단일 투여량이 고려된다. 질환의 중증도 및 정확한 약동학적 프로파일에 따라, 융합 단백질은 매주, 2주마다 또는 매월 1회 투여량 단위로 투여될 수 있고, 완전하게는 이러한 치료를 충족시키기 위해 사이클 당 1 내지 6회 투여량 단위가 제공될 수 있다.
본 발명은 항원-특이적 세포-매개 면역 반응을 유도하여, 종양 또는 병원체에 의해 유발되는 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서 이를 치료하기 위한 병용물 또는 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항원-특이적 세포-매개 면역 반응을 유도하여, 종양 또는 병원체에 의해 유발되는 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서 이를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 병용물 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항원-특이적 세포-매개 면역 반응을 유도하기 위한 약제(들)의 제조에서 위에서 정의된 융합 단백질의 용도와 결합한 면역 관문 항체의 용도에 관한 것이다.
대안적으로, 본 발명은 항원-특이적 세포-매개 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상에게 유효량의 본 발명의 병용물 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 반응의 유도를 필요로 하는 대상에서 이를 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 병용물 또는 조성물은 종양 또는 비정상적 세포 증식 또는 병원체에 의해 유발되는 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서 이를 치료하는데 유용하다. 비정상적 세포 증식은 암이 되기 전의 병변 또는 종양일 수 있다.
면역 관문 항체 및 융합 단백질을 포함하는 병용물 또는 조성물을 투여하기 위해, 항체 및 융합 단백질은 단일 개체 또는 투여량의 형태로 동시에 환자에게 투여되거나 동시에 또는 순차적으로 별개의 개체로서 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투여는 환자에게 치료적 유효량의 활성 성분을 제공한다. 예를 들어, 융합 단백질은 1일 2회, 1일 1회, 매 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일마다 1회, 또는 1주마다 1회, 2회 또는 3회로, 0.01㎎/㎏, 0.02㎎/㎏, 0.025㎎/㎏, 0.05㎎/㎏, 0.075㎎/㎏, 0.1㎎/㎏, 0.125㎎/㎏. 0.15㎎/㎏, 0.175㎎/㎏, 0.2㎎/㎏, 0.225㎎/㎏, 0.25㎎/㎏, 0.5㎎/㎏, 0.75㎎/㎏, 1㎎/㎏, 1.25㎎/㎏, 1.5㎎/㎏, 1.75㎎/㎏, 2㎎/㎏, 2.25㎎/㎏, 2.5㎎/㎏, 2.75㎎/㎏, 3㎎/㎏, 3.25㎎/㎏, 3.5㎎/㎏, 3.75㎎/㎏, 4㎎/㎏, 4.25㎎/㎏, 4.5㎎/㎏, 4.75㎎/㎏, 약 5㎎/㎏까지 모두 포함하는 사이의 투여량으로 투여될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 치료적 병용물 및 이의 사용을 위한 지침을 함유하는 키트를 제공한다.
약어: MCS, 다중 클로닝 부위(multiple cloning site); 항-PD-1, 항-세포예정사-1(anti-programmed cell death-1); 항-PD-L1, 항-세포예정사 리간드-1(anti-programmed cell death ligand-1); Rap1, Ras-근접-1(Ras-proximate-1) 또는 Ras-관련 단백질 1(Ras-related protein 1); CD40, 분화 클러스터 40(Cluster of differentiation 40); CDR, 상보성-결정 영역(Complementarity-determining region).
실시예
방법 및 재료
표 1은 해당 펩타이드, 폴리펩타이드 및 융합 단백질의 서열번호를 보여준다.
유세포 분석. 비장 세포를 37℃에서 2시간 동안 항원성 자극제로 자극한 다음, 2시간 동안 37℃에서 50㎍/㎖의 브레펠딘(Brefeldin) A 및 모넨신(Monensin)으로 처리하였다. 세포를 수확하고, 0.5% BSA 함유 PBS로 세척하고, 동시에 APC/Cy7-접합 항-CD3 항체, PerCP/Cy5.5-접합 항-CD4 항체, FITC-접합 항-CD8 항체, PE-접합 항-CD44 항체 및 APC-접합 항-CD62L 항체로 염색하였다. 세척 후, 세포를 투과화하고, 고정시키고 동시에 PE-접합 항-IFN-γ 항체, PE/Cy7-접합 항-IL-2 항체 및 eFluor450-접합 항-TNF-α 항체로 세포 내부적으로 염색하였다. Gallios 유세포 분석기 및 Kaluza 소프트웨어를 사용하여 CD8+ 또는 CD4+ 기억 T 세포 표현형(CD3+/CD44hiCD62Llo)을 갖는 비장 세포의 세포 내 사이토카인 특성화(IFN-γ, IL-2 또는 TNF-α)를 추가 분석하였다.
효소-결합 면역점(ELISpot) 분석. 비장 세포를 항원성 자극제의 존재 또는 부재 하에서 2×105 세포/웰의 세포 밀도로 전처리한 쥐 IFN-γ 포획 96-웰 플레이트(CTL IMMUNOSPOT®)에 3반복으로 접종하였다. 37℃ 배양 24시간 후 세포를 버렸다. 세척 후, 2시간 동안 상온에서 비오틴-접합 항-쥐 IFN-γ 항체를 사용하여 포획된 IFN-γ를 검출하였으며 제조사의 지침에 따라 IFN-γ-면역점을 전개하였다. IMMUNOSPOT® S5 마이크로 분석기(CTL)를 사용하여 IFN-γ-면역점의 스캐닝 및 계수를 수행하였다.
간접 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA). 수집한 전혈 시료를 30 내지 60분 동안 4℃에 그대로 둔 다음 10분 동안 5,000g로 원심분리하여 응혈을 펠렛화하였다. 혈청 시료를 -20℃에 보관하였다. 항원-특이적 항체 결합을 위해 정제한 코팅 단백질을 구아니딘 코팅 완충제(2M 구아니딘 염산, 500mM Na2HPO4, 25mM 구연산염, pH 4.0 내지 4.4)로 희석하고 96-웰 플레이트에 1㎍/웰로 분배하였다. 4℃에서 밤새 항온처리한 다음, 96-웰 플레이트를 1% BSA 함유 PBS로 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 혈청 시료를 해동한 다음, 1% BSA 함유 PBS로 10배 연속 희석하였다. 코팅 단백질을 100㎕의 1000배 희석된 혈청 시료와 함께 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 인산염 완충 염수 TWEEN®-20(PBST)으로 4회 세척한 다음, 항원-특이적 항체를 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)-접합 염소 항-생쥐 IgG(1:10,000 희석, Cat#31430, Thermo Fisher Science)로 37℃에서 30분 동안 검출하였다. PBST로 4회 세척한 다음, HRP-매개 발색을 100㎕의 TMB 기질의 존재 하에서 촉매화하였고 100㎕의 1N HCl로 반응중지시켰다. 혈청 시료 내 항원-특이적 항체의 상대적 역가를 450㎚에서의 흡광도로 결정하였다.
통계적 분석. t-검정을 사용하여, p<0.05일 때 결과를 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1
발현 벡터의 제작
CD40L 47-261 -T PE -E7 및 18sCD40L-T PE -E7. 다음을 포함하는 CD40L47-261-TPE-E7 융합 단백질(서열번호 51; 도 5a)을 생성하기 위해 CD40L47-261-TPE-E7 벡터(도 1)를 제작하였다: (a) 잘린 CD40 리간드(CD40L47-261; 서열번호 18); (b) (EAAAAK)3(서열번호 3) 및 RX1RX2X3R(서열번호 2; 여기서 X1은 A, X2는 Y, X3은 K임)을 포함하는 절단 가능한 펩타이드 링커; (c) PE 전위 펩타이드(PE280-305; 서열번호 5); 및 (d) HPV16 E7 단백질(서열번호 38) 및 HPV18 E7 단백질(서열번호 39)을 포함하는 융합 단백질(HPV16/18 E7). 간략하게, CD40L47-261, 절단 가능한 링커 및 PE 전위 펩타이드(PE280-305)를 포함하는 Hin dIIICD40L-링커-PE Nco I, Xho I, Sal I를 암호화하는 DNA 단편을 PCR 합성하고, HindIII/SalI으로 소화시키고, HindIII/XhoI 절단 부위가 있는 pTAC-MAT-Tag-2 플라스미드에 결찰하여 P07-His-pNC 플라스미드(도 2)를 얻었다. His 태그를 보유한 HPV16/18 E7 융합 항원을 암호화하는 다른 DNA 단편을 NcoI/XhoI 부위를 통해 P07-His-pNC 플라스미드(도 2)에 삽입하여 CD40L47-261-TPE-E7 발현 벡터(도 1)를 생성하였다. 절단 가능한 링커는 퓨린 및/또는 카텝신 L 단백질분해효소가 본 발명의 융합 단백질을 잘라 융합 단백질로부터 TPE-E7 단편이 방출되는 것을 가능하게 한다.
위에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여, E7을 임의의 다른 관심 항원(들)으로 대체하고 도 2의 플라스미드에 삽입하여 관심 항원을 포함하는 융합 단백질을 발현하기 위한 도 1과 같은 발현 벡터를 생성할 수 있다.
유사하게, 잘린 CD40 리간드 CD40L47-261(서열번호 18)을 다른 잘린 CD40 리간드인 CD40L108-261(서열번호 19; 18sCD40L)로 대체하여, 18sCD40L-TPE-E7 융합 단백질(서열번호 52; 도 5b)을 생성하기 위한 발현 벡터를 제작하였다.
E7-T Stx -CD40L 47-261 및 E7-T Stx -18sCD40L. 다음을 포함하는 E7-TStx-CD40L47-261 융합 단백질(서열번호 53; 도 5c)을 생성하기 위해 E7-TStx-CD40L47-261 벡터(도 3)를 제작하였다: (a) HPV16 E7 단백질(서열번호 38) 및 HPV18 E7 단백질(서열번호 39)를 포함하는 융합 단백질(HPV16/18 E7); (b) Stx 전위 펩타이드(Stx211-247; 서열번호 14); (c) RX1X2R(서열번호 1; 여기서 X1은 V, X2는 A임) 및 (EAAAAK)3(서열번호 3)을 포함하는 절단 가능한 펩타이드 링커; 및 (d) 잘린 CD40 리간드(CD40L47-261; 서열번호 18).
간략하게, Stx 전위 펩타이드(Stx211-247), 절단 가능한 링커 및 CD40L47-261을 포함하는 Hin dIII, Xho IStx-Linker-CD40L Sal I를 암호화하는 DNA 단편을 PCR 합성하고, HindIII/SalI으로 소화시키고, HindIII/XhoI 절단 부위가 있는 pTAC-MAT-Tag-2 플라스미드에 결찰하여 P08(RP)-His-pNC 플라스미드(도 4)를 얻었다. His 태그를 보유한 HPV16/18 E7 융합 항원을 암호화하는 다른 DNA 단편을 HindIII/XhoI 부위를 통해 P08(RP)-His-pNC 플라스미드(도 4)에 삽입하여 E7-TStx-CD40L47-261 발현 벡터(도 3)를 생성하였다.
절단 가능한 링커는 본 발명의 융합 단백질이 세포 내부 퓨린 및/또는 카텝신 L 단백질분해효소에 의해 잘려 E7-TStx 단편(도 5c)이 방출되는 것을 가능하게 하기 때문에 필수적이다.
E7을 다양한 병원체 또는 암 기원의 임의의 다른 관심 항원(들)으로 대체하고 도 4의 플라스미드에 삽입하여 임의의 관심 항원을 포함하는 융합 단백질을 발현하기 위한 도 3과 유사한 발현 벡터를 생성할 수 있다.
유사하게, 잘린 CD40 리간드 CD40L47-261(서열번호 18)을 다른 잘린 CD40 리간드인 CD40L108-261(서열번호 19; 18sCD40L)로 대체하여, E7-TStx-18sCD40L 융합 단백질(서열번호 54; 도 5d)을 생성하기 위한 발현 벡터를 제작하였다.
비교 목적으로, RAP1-CD28convPEt-E7-K3 융합 단백질("RAP1-E7"로 명명함)을 제작하였다. 이는 RAP1 도메인 III, CD28 서열, 링커, PE 전위 도메인 II(PE268-313), 항원 E7 단백질 및 소포체 잔류 서열을 포함하며, 여기서 항원 E7 단백질은 HPV16 E7 단백질(서열번호 38) 및 HPV18 E7 단백질(서열번호 39)을 포함하는 융합 단백질(HPV16/18 E7)이다. 이 "RAP1-E7" 융합 단백질은 미국 특허 제9,481,714 B2호, 실시예 1에 개시된 기존 작제물과 거의 동일하며, 단지 기존 기술에 개시된 항원 E7 단백질이 HPV16/18 E7 융합 항원이 아닌 HPV16 E7 단백질이었단 점의 차이만 있다.
HBx-preS1-T Stx -18sCD40L. 다음을 포함하는 HBx-preS1-TStx-18sCD40L 융합 단백질(서열번호 55; 도 5e)을 생성하기 위해 HBx-preS1-TStx-18sCD40L 벡터를 제작하였다: (a) HBx 단백질(서열번호 40) 및 HBV preS1 단백질(서열번호 41)을 포함하는 융합 항원(HBx-preS1); (b) Stx 전위 펩타이드(Stx211-247; 서열번호 14); (c) RX1X2R(서열번호 1, 여기서 X1은 V, X2는 A임) 및 (EAAAAK)3(서열번호 3)을 포함하는 절단 가능한 펩타이드 링커; 및 (d) 잘린 CD40 리간드 CD40L108-261(서열번호 19; 18sCD40L).
HBx-preS1-TStx-18sCD40L 벡터는 앞서 언급한 것과 유사한 방법을 사용하여 제작하였으며, 여기서 잘린 CD40 리간드는 CD40L108-261로 대체하였고 융합 항원은 HBx-preS1로 대체하였다.
실시예 2
단백질 발현
발현 벡터를 보유한 대장균 BL21 세포를 37℃에서 선별 항생제를 함유하는 ZY 배지(10g/ℓ 트립톤 및 5g/ℓ 효모 추출물)에서 배양하였다. 배양물이 초기 로그 단계(OD600=2 내지 5)에 도달했을 때, 아이소프로필-1-티오-β-D-갈락토파이란노시드(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside: IPTG)(0.5 내지 2mM)로 융합 단백질의 발현을 유도하였다. IPTG 유도 4시간 후 세포를 수확하고 초음파 처리로 분쇄하였다. 봉입체(inclusion body)를 분리하고 가용화 완충액(6M 구아니딘 염산염, 20mM 인산 칼륨, 500mM NaCl, 20mM 이미다졸, 1mM DTT, pH 7.4)에 용해하여 과발현된 융합 단백질을 회수하였다. 정제 후, 20 내지 50배 부피의 투석 완충액(10mM PBS)으로 4℃에서 밤새 투석하여 융합 단백질의 리폴딩(refolding)을 수행하였다. 리폴딩된 융합 단백질을 환원(다이티오트레이톨(dithiothreitol) 존재 하; +DTT) 및 비-환원(다이티오트레이톨 부재 하; -DTT) 조건 하에서 SDS-PAGE 분석하여 적절하게 리폴딩되었는지를 평가하였다.
실시예 3
융합 단백질의 면역원성 분석
정제한 CD40L47-261-TPE-E7, 18sCD40L-TPE-E7, E7-TStx-18sCD40L 및 RAP1-E7 융합 단백질의 면역원성 분석을 추가로 수행하여 이들의 생물학적 활성을 평가하였다.
암컷 C57BL/6NCrlBltw 생쥐(5 내지 6주령)를 무작위로 다음과 같은 5개의 군(n=5)으로 나누었다: (A) 위약(즉, PBS); (B) CD40L47-261-TPE-E7(100㎍) 융합 단백질; (C) 18sCD40L-TPE-E7(100㎍) 융합 단백질; (D) E7-TStx-18sCD40L(100㎍) 융합 단백질; 및 (E) RAP1-E7(100㎍) 융합 단백질. 융합 단백질을 PBS로 투석하였다. CpG1826(50㎍)을 동물군 B 내지 E에 보조제로 사용하였다. 각 군을 0일에서 부터 7일 간격으로 3회 피하(s.c.) 면역화하였다. 0, 7 및 14일째에 혈액 시료를 수집하였다. 21일째에, 혈액 시료를 수집하고 비장 세포를 FBS(10%) 및 PSA 함유 RPMI 1640 배지에 재현탁하였다.
비장 세포를 사용하여 항원 자극의 존재 및 부재 하에서 CD8+ 및 CD4+ 기억 T 세포의 세포내 사이토카인 유도(IFN-γ, IL-2 및 TNF-α)를 분석하였다. 간략하게, 각 동물군으로부터의 비장 세포를 항원 E7 단백질(2㎍/㎖의 HPV16 E7 펩타이드 풀)로 또는 이 단백질 없이 처리하고 유세포 분석으로 분석하였다. 각 생쥐군의 세포내 사이토카인 유도의 정도 또는 수준을 상대적인 사이토카인 유도로 나타내었으며, 이는 자극 항원 E7의 존재 하에서 사이토카인+/CD8+ 및 사이토카인+/CD4+ 비장 세포의 빈도를 자극하지 않은(처리하지 않은) 대조군의 것에 대해 정규화하여 얻었다.
또한 비장 세포를 사용하여 효소-결합 면역점(ELISpot) 분석으로 항원 자극(2㎍/㎖의 HPV16 E7 펩타이드 풀)의 존재 또는 부재 하에서 IFN-γ-분비 비장 세포의 빈도를 분석하였다. 이 결과를 백만개의 비장 세포 당 IFN-γ+ 면역점으로 나타냈다.
혈액 시료를 사용하여 ELISA로 혈청 HPV16 E7-특이적 및 HPV18 E7-특이적 항체의 수준을 분석하였으며, 여기서 정제한 HPV16 E7 및 HPV18 E7 재조합 단백질을 각각 코팅 단백질로 사용하였다.
도 6은 HPV16 E7 펩타이드 풀을 사용한 비장 세포의 항원 자극 후 사이토카인 유도를 보여준다. CD40L47-261-TPE-E7, 18sCD40L-TPE-E7 또는 E7-TStx-18sCD40L 융합 단백질로 면역화한 동물로부터의 CD8+ 기억 T 세포에서의 IFN-γ 및 TNF-α의 상대적 사이토카인 유도는 RAP1-E7 융합 단백질 또는 위약을 처리한 동물로부터 것에 비해 유의하게 증가한 것으로 나타났으나, IL2의 경우는 그렇지 않았다. 융합 단백질로 처리한 동물군으로부터의 CD4+ 기억 T 세포에서의 IFN-γ, IL2 또는 TNF-α의 상대적 사이토카인 유도는 위약군에 비해 약간, 하지만 유의적이지는 않게 증가한 것으로 나타났다.
이는 본 발명의 융합 단백질이 HPV16 E7 항원의 자극에 반응하여 CD8+ 기억 T 세포에서 IFN-γ와 TNF-α의 분비를 유도함에 있어서 기존 기술의 융합 단백질에 비해 우수하다는 결론을 도출하였다.
도 7은 시험관 내에서 수행한 것으로서 HPV16 E7 펩타이드 풀로 자극한 비장 세포의 IFN-γ+ 면역점을 보여준다. CD40L47-261-TPE-E7, 18sCD40L-TPE-E7, E7-TStx-18sCD40L 또는 RAP1-E7로 면역화한 동물군으로부터의 IFN-γ-분비 비장 세포의 빈도는 위약군에 비해 유의적으로 증가하였다. 특히 E7-TStx-18sCD40L은 CD40L47-261-TPE-E7보다 유의적으로 높은 빈도의 IFN-γ-분비 세포를 유도하였다(p=0.035).
이러한 결과는 본 발명의 융합 단백질이 항원성 HPV16 E7 펩타이드 풀을 사용한 자극 시 또는 자극 후 IFN-γ-분비 T 세포 개체군을 유의적으로 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
도 8은 0, 7 및 14일째에 다양한 융합 단백질로 면역화한 동물에서의 혈청 HPV16 E7-특이적 항체 수준의 결과를 보여준다. CD40L47-261-TPE-E7, 18sCD40L-TPE-E7 또는 E7-TStx-18sCD40L로 접종한 동물의 혈청 HPV16 E7-특이적 항체 수준은 7일째의 2차 접종 후에 증가하기 시작하여, 14일째의 3차 접종 후에 더욱 증가하였고, 21일째에는 위약 또는 RAP1-E7로 처리한 동물보다 높았다.
RAP1-E7(RAP1-CD28convPEt- E7-K3) 융합 단백질은 2번의 접종(0일째 및 7일째) 후 HPV16 E7-특이적 항체 수준을 유도하는데 실패하였다. 14일째의 3차 접종 후 혈청 HPV16 E7-특이적 항체를 유도하기 시작하였고, 혈청 항체 수준은 21일째에 앞서 언급한 본 발명의 융합 단백질로 처리한 동물에 비해 단지 미미한 정도였다. 위에 기술된 것과 같은 요법 및 면역화 일정을 사용하여 동물을 RAP1-CD28convPEt-HBx-K3("RAP1-HBx"로 지칭함)로 접종하였을 때 HBx-특이적 항체를 유도하는 것에서도 유사한 패턴이 관찰되었다. RAP1-E7에서 E7 항원을 HBx 항원으로 대체하여 RAP1-HBx 융합 단백질을 생성하였다. RAP1-HBx 융합 단백질은 14일째의 3차 접종 후 혈청 HBx-특이적 항체 수준을 유도하였고, 21일째의 혈청 항체 수준은 단지 미미한 정도였다(데이터 미제시).
대조적으로, 본 발명의 융합 단백질은 0 및 7일째의 2회의 접종 후 혈청 HPV16 E7-특이적 항체 수준을 유도하였다(도 8).
도 9는 0, 7 및 14일째에 다양한 융합 단백질로 면역화한 동물에서의 혈청 HPV18 E7-특이적 항체 수준을 보여준다. CD40L47-261-TPE-E7, 18sCD40L-TPE-E7 및 E7-TStx-18sCD40L 융합 단백질은 혈청 HPV18 E7-특이적 항체 수준을 위약군에 비해 유의적으로 증가시켰다. 위에 기술된 HBx-preS1-TStx-18sCD40L 융합 단백질의 면역원성 분석을 수행하였다. 이의 결과, HBx-보유 융합 단백질은 적어도 2회의 면역화 후 HBx-특이적 T 세포-매개 및 체액성 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있는 것으로 나타났다(데이터 미제시).
따라서, 본 발명의 융합 단백질은 항원-특이적 항체를 유도함에 있어서 효과적이었으며 항체 유도는 2회의 접종 후에 발생하였다.
요약하면, 본 발명의 항원-보유 융합 단백질은 항원-특이적 T 세포 반응을 효과적으로 유도할 수 있고, 전염증성 사이토카인, 예를 들어 IFN-γ 및 TNF-α의 발현을 효율적으로 증가시킬 수 있고, 항원-특이적 항체 반응을 효율적으로 생성할 수 있다.
실시예 4
효능 분석
HPV 감염 생쥐 모델에서 융합 단백질과 면역 관문 억제제의 병용
CD40L47-261-TPE-E7, 18sCD40L-TPE-E7 및 E7-TStx-18sCD40L 융합 단백질을 각각 면역 관문 억제제 항체(항-PD-1 항체)와 병용하고, 생쥐 HPV16 종양 모델에서 각 병용물의 효능에 대해 시험하였다.
암컷 C57BL/6NCrlBltw 생쥐(5 내지 6주령)를 무작위로 다음과 같은 5개의 군으로 나누었다: (A) 위약(PBS, n=4); (B) 항-PD-1 항체(100㎍; 카탈로그 번호 BE0146, Bio X Cell, Inc.)와 CD40L47-261-TPE-E7(25㎍)의 병용(n=5); (C) 항-PD-1 항체(100㎍)와 18sCD40L-TPE-E7(25㎍)의 병용(n=4); (D) 항-PD-1 항체(100㎍)와 E7-TStx-18sCD40L(25㎍)의 병용(n=5); 및 (E) 항-PD-1 항체 단독(100㎍)(n=5). B군 내지 D군에서, 융합 단백질을 PBS에 용해시키고 CpG1826(50㎍)을 동물 면역화에 보조제로 사용하였다. 도 10은 면역화 일정, 병용 요법 및 투여량을 보여준다.
C57BL/6 생쥐의 폐 상피 세포로부터의 HPV16 E6- 및 E7-발현 종양 세포주(TC-01)를 사용하여 생쥐 HPV16 종양 모델을 확립하였다. 종양 세포는 FBS(10%) 및 페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B(50유닛/㎖) 함유 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 생쥐에 적용하기 위해, 0일째에 각 생쥐의 좌측 옆구리에 종양 세포(0.1㎖ 내 1×105)를 피하 주사하였다. 7, 14 및 21일째에 각 군의 생쥐에 시험 물품(즉, 위약, 항-PD-1 항체 또는 병용 요법)을 3회 투여하였다. 각 투여에서, 융합 단백질은 피하로 제공하였고, 항-PD-1 항체는 복강 내로 제공하였다. 생존한 모든 생쥐는 39일째에 희생시켰다.
종양 크기를 다음의 변형 타원체 공식을 기반으로 캘리퍼 측정값을 곱하여 1주에 2회 결정하였다: 종양 부피 = 1/2(길이×폭 2 ). 생존율 및 무종양 비율을 계산하였다. 길이가 2㎝를 초과하는 종양이 있는 생쥐는 죽은 것으로 간주하였고 측정 가능하거나 감지 가능한 종양 덩어리가 없는 생쥐는 무-종양으로 간주하였다. 각 비교의 유의성은 t-검정을 사용하여 계산하였고, p<0.05인 경우 결과를 유의한 것으로 간주하였다.
접종한 종양이 위약군에서 빠르게 발달하여 25일째에 2마리가 죽었고 이에 따라 21일째까지만 위약군의 데이터를 나타내었다(도 11). CD40L47-261-TPE-E7, 18sCD40L-TPE-E7 또는 E7-TStx-18sCD40L과의 병용으로 항-PD-1 항체를 제공받은 동물군의 종양 덩어리는 적어도 전체 실험 기간 동안에는 거의 완전하게 억제되었다(마지막날은 39일째임). 항-PD-1 항체만을 제공받은 동물군의 종양은 초기에는 잘 제어되었지만, 면역화를 중단한 후에 빠르게 성장하였다. 이러한 결과는 본 발명의 병용물이 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.
위약군에서 모든 생쥐가 35일째에 죽었고, PD-1 만을 제공받은 군은 35일째에 20%의 생존율로 감소한 반면, 각각 18sCD40L-TPE-E7 및 E7-TStx-18sCD40L과의 병용으로 항-PD-1 항체를 제공받은 동물군은 39일째에 100%의 생존율을 유지하였고, CD40L47-261-TPE-E7과의 병용으로 항-PD-1을 제공받은 군은 39일째에 80%의 생존율을 유지하였다(도 12). 이러한 결과는 본 발명의 병용물이 동물 종양 모델에서 생존율을 효과적으로 유지할 수 있음을 나타낸다.
전체 실험 기간 동안(39일째) 위약군 및 PD-1 단독 처리군에서 무-종양 동물을 발견할 수 없었다(도 13). 특히, 본 발명의 병용물을 제공받은 동물군에서 한마리가 측정 가능하거나 감지 가능한 종양없이 생존하고 있음을 발견하였다. 이들 무-종양 생쥐에서 종양 덩어리는 본 발명의 병용물로 3회 면역화를 완료한 후 바로 모두 없어졌다. 따라서, 본 발명의 병용물은 종양의 성장을 강력하게 억제하고 뛰어난 치료 효능을 나타낼 수 있다.
HPV 감염 생쥐 모델에서 E7-T
Stx
-18sCD40L 융합 단백질과 면역 관문 자극제의 병용
위에 기술된 바와 같이 확립된 생쥐 HPV16 종양 모델에서 E7-TStx-18sCD40L 융합 단백질과 면역 관문 자극제 항체(항-CD137 항체)의 병용을 시험하였다.
동물군 나누기 및 면역화 일정은 표 2에 나타내었다. 암컷 C57BL/6NCrlBltw 생쥐(5 내지 6주령)를 무작위로 다음과 같은 4개의 군(각 군의 n=5)으로 나누었다: (1) A군(위약; PBS); (2) B군(E7-TStx-18sCD40L); (3) C군(항-CD137 항체; 카탈로그 번호 BE0239, Bio X Cell, Inc.); 및 (4) D군(E7-TStx-18sCD40L과 항-CD137 항체의 병용).
생쥐에 적용하기 위해, 0일째에 각 생쥐의 좌측 옆구리에 0.1㎖에 1Х106의 높은 농도를 갖는 HPV 종양 세포를 피하 접종하였다. 위약군에서, 14 및 21일째에 PBS를 제공하였다. 각각의 접종(표 2)을 위해, E7-TStx-18sCD40L 융합 단백질을 PBS에 용해시키고, CpG1826(50㎍/1회 투여량)을 첨가한 후 피하 주사하였다. 항-CD137 항체는 복강 내로 제공하였다. 모든 생쥐는 41일째에 희생시켰다.
종양은 위약 및 항-CD137 항체 단독 처리군에서 빠르게 발달하였고, 30일째 부근에 모든 생쥐가 죽어서, 더 이상 데이터를 기록할 수 없었다. 놀랍게도, 항-CD137 항체 단독 처리군은 여기서 종양 억제에 기여하지 않는 것으로 나타났다(도 14).
E7-TStx-18sCD40L을 단독으로 제공받은 군에서 종양 덩어리는 초기에는 잘 제어되었지만, 두 번째의 면역화 후 7일째에 천천히 성장하기 시작하였다. 특히, 단 2회의 접종이 이루어졌고 더 많은 양의 종양 세포를 접종하였음에도(앞서 언급된 PD-1 병용 연구에서 사용된 양의 10배) 융합 단백질의 종양 억제 효과가 마지막 면역화 후 적어도 1주 동안 유지되었다.
항-CD137 항체와 병용하여 E7-TStx-18sCD40L을 제공받은 군에서 종양 덩어리가 억제되었고 42일째에 실험이 끝날 때까지 지속적인 종양 위축이 발견되었다. 관찰 기간이 더 길어지면 종양 덩어리가 완전하게 제거될 수 있음을 합리적으로 추측할 수 있었다. 기대와 달리, 항-CD137 항체는 E7-TStx-18sCD40L 융합 단백질에 상승적 효과를 나타냈다. 이러한 결과는 본 발명의 병용물이 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.
E7-TStx-18sCD40L을 제공받은 군이 40%의 생존율로 감소하였고, 위약 및 항-CD137 항체 단독 처리군 모두 0% 생존율로 감소한 반면, 항-CD137 항체와 E7-TStx-18sCD40L의 병용물을 제공받은 군은 마지막 관찰일까지 100%의 생존율을 유지하였다(도 15). 이러한 결과는 본 발명의 병용물이 생존율을 효과적으로 유지할 수 있음을 나타낸다.
따라서, 항-PD-1 길항제 항체 또는 항-CD137 작용제 항체와 같은 T 세포를 활성화할 수 있는 면역 관문 항체와 E7-보유 융합 단백질의 병용물은 우수한 종양 억제 효과를 나타낼 수 있으며 종양 또는 비정상적인 세포 증식을 치료하는데 사용될 수 있다.
실시예 5
효능 분석: HPV 감염 생쥐 모델에서 HBx-preS1-T
Stx
-18sCD40L 융합 단백질과 면역 관문 항체의 병용
HBV-감염 생쥐 모델에서 면역 관문 억제제(항-PD-1 항체) 또는 면역 관문 자극제(항-CD137 항체)와 HBx-preS1-TStx-18sCD40L의 병용물의 효능에 대해 시험하였다.
생쥐를 다음과 같은 몇개의 군으로 나누었다: 대조군(PBS), 백신군(HBx-preS1-TStx-18sCD40L), PD-1군(항-PD-1 항체), CD137군(항-CD137 항체), PD-1 콤보군(항-PD-1 항체 및 HBx-preS1-TStx-18sCD40L) 및 CD137 콤보군(항-CD137 항체 및 HBx-preS1-TStx-18sCD40). 융합 단백질에 CpG1826을 첨가하고 피하로 제공하였다. 항체는 복강 내로 제공하였다.
HBV-감염 생쥐 모델은 미국 특허 제10,058,606 B2호에 기술된 AAV-HBV 생쥐 모델이며 필요한 경우 적절하게 변형할 수 있다. 간략하게, 수컷 생쥐(5 내지 6주령)을 사용하여 장기간 B형 간염 바이러스를 보유한 동물 모델을 확립하였다. pAAV/HBV1.2 플라스미드와 염수의 혼합물을 고속 모드에서 고압(유체 역학 주사: HDI)으로 생쥐 꼬리 정맥에 정맥 주사하여 플라스미드가 세포막을 관통하여 간세포에 진입하도록 하였다. 플라스미드-보유 간세포는 B형 간염 바이러스 단백질을 발현한다. 바이러스는 간세포 안에서 조립되어 혈액으로 방출될 것이다. 이러한 동물 모델은 만성 B형 간염 증상으로 고통받는 인간 환자를 모방한다.
고압 주사 28일 후, 7일 간격으로 0, 7, 14일째에 3회 투여의 융합 단백질 및/또는 표시된 항체를 각 군의 생쥐에 제공하였다. 고압 주사와 같은 날, 그리고 0, 7, 14, 21, 32 및 42일째에 체중을 측정하였다. 알라닌 아미노기전달효소(ALT), 빌리루빈, 바이러스 DNA 및 표면 항원(HBsAg)의 분석을 위해 혈액을 수집하였다. 첫 번째 접종 후 82일째에 생쥐를 희생시키고 간 핵심 항원(HBcAg)의 양을 분석하였다.
항-PD-1 항체 또는 항-CD137 항체와 병용한 HBx-preS1-TStx-18sCD40의 투여는 HBV 감염 상 뛰어난 치료 효과를 나타낼 것으로 기대된다. 예를 들어, 상기 병용은 바이러스 DNA, HBsAg 및 HBcAg를 감소시키고, HBx-특이적 면역 반응을 유도할 것으로 기대된다. 상기 병용(즉, HBx-보유 융합 단백질과 면역 관문 조절제의 병용)의 사용은 간세포에서의 B형 간염 바이러스의 증식과 HBV 환자에서의 B형 간염 바이러스의 감염을 효과적으로 억제할 것으로 기대된다.
요약하면, 새로운 항원-보유 융합 단백질은 이의 독특한 단백질 설계 및 작용 기작으로 인해 강력한 항원-특이적 T 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 면역 관문 조절제는 억제성 면역 관문(예를 들어, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIGIT, CD96, CD122R, TIM3, VISTA, CEACAM1, SIGLEC-7, SIGLEC-9, SIGLEC-15, KIRi, CD200R, BTLA 및 ILT2)에 길항(antagonize)하여 T 세포 기능을 복구하거나 자극성 면역 관문(예를 들어, CD137, OX40, GITR, ICOS, CD27, CD28, CD40, KIRs, CD226 및 CD244)에 작용(agonize)하여 T 세포를 활성화할 수 있다. 적어도 하나의 적합한 항원이 융합 단백질에 적용되고 적합한 면역 관문 조절제가 선택되는 경우, 이들 모두 T 세포 면역력 향상에 기여하고 이들이 병용으로 사용되는 경우 우수한 치료 효능 달성할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 종양 및 감염성 질환을 치료하기 위한 임의의 기존 공개문헌에 개시되지 않은 병용을 사용하는 독창적인 발명적 개념을 제공한다.
본 명세서에서 인용 및 논의된 모든 참고문헌은 그 전체가 그리고 각 참고문헌이 참조에 의해 개별적으로 원용되는 경우와 같은 정도로 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (15)
- 병용물(combination)로서,
(a) T 세포를 활성화할 수 있는 면역 관문 항체; 및
(b) 융합 단백질로서,
(i) CD40-결합 도메인;
(ii) 항원;
(iii) 상기 CD40-결합 도메인과 상기 항원 사이에 위치한 전위 도메인; 및
(iv) 상기 CD40-결합 도메인과 상기 전위 도메인 사이에 위치한 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위
를 포함하는, 융합 단백질
을 포함하는, 병용물. - 제1항에 있어서, 상기 전위 도메인은 슈도모나스 외독소 A(PE) 전위 펩타이드이며, 상기 CD40-결합 도메인은 상기 융합 단백질의 N-말단에 위치하는, 병용물.
- 제1항에 있어서, 상기 전위 도메인은 26 내지 112개의 아미노산 잔기 길이로 이루어진 PE 전위 펩타이드이며, 상기 PE 전위 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 병용물.
- 제1항에 있어서, 상기 전위 도메인은 쉬가 독소(Shiga toxin)(Stx) 전위 펩타이드이며, 상기 항원은 상기 융합 단백질의 N-말단에 위치하는, 병용물.
- 제1항에 있어서, 상기 전위 도메인은 8 내지 84개의 아미노산 잔기 길이로 이루어진 Stx 전위 펩타이드이며, 상기 Stx 전위 펩타이드는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는, 병용물.
- 제1항에 있어서, 상기 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위는 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단을 통해 상기 융합 단백질로부터 상기 CD40-결합 도메인의 제거를 가능하게 하는, 병용물.
- 제1항에 있어서, 상기 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는, 병용물.
- 제1항에 있어서, 펩타이드 링커를 더 포함하며, 상기 퓨린 및/또는 카텝신 L 절단 부위가 상기 펩타이드 링커 내에 존재하는, 병용물.
- 제1항에 있어서, 상기 CD40-결합 도메인은 CD40 리간드(CD40L) 또는 이의 기능적 단편 또는 CD40-특이적 항체 또는 이의 결합 단편인, 병용물.
- 제1항에 있어서, 상기 CD40-결합 도메인은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CD40 리간드(CD40L) 또는 이의 기능적 단편이며, 상기 CD40L 또는 이의 기능적 단편은 154 내지 261개의 아미노산 잔기 길이를 갖는, 병용물.
- 제1항에 있어서, 상기 항원은 종양 항원이며, 상기 종양은 유방암, 결장암, 직장암, 방광암, 자궁내막암, 신장암, 위암, 교모세포종, 간세포암종, 담관암(담관암종), 소세포폐암, 비-소세포폐암(NSCLC), 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 전립선암, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 비-호지킨 림프종 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 병용물.
- 제1항에 있어서, 상기 항원은 인간 유두종바이러스(HPV), 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1), 인플루엔자 바이러스, 뎅기 바이러스, A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV), E형 간염 바이러스(HEV), 중증 급성 호흡기 증후군-연관 코로나바이러스(SARS-CoV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV2), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-Cov), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 지카 바이러스, 광견병 바이러스, 천연두 바이러스, 치군군야 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 폴리오바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 한타바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 엔테로바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 수두-대상포진 바이러스(VZV), 헤르페스 B 바이러스-1(CHV-1), 황열 바이러스(YFV), 리프트밸리열 바이러스, 라싸 바이러스, 마르부르그 바이러스, 에볼라바이러스, 노로바이러스, 로타바이러스, 아데노바이러스, 사포바이러스, 아스트로바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 아프리카 돼지열병 바이러스(ASFV), 돼지열병 바이러스(CSFV), 돼지 써코바이러스 2(PCV2), 구제역 바이러스(FMDV), 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV), 돼지 수포병 바이러스(SVDV), 가성광견병 바이러스(PRV), 전염성 위장염 바이러스(TGEV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 전염성 기관지염 바이러스(IBV), 전염성 F낭병 바이러스(IBDV), 마이코플라스마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumoniae), 리케치아 프로바체키(Rickettsia prowazekii), 리케치아 타이피(Rickettsia typhi), 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모디움 말라리아(Plasmodium malariae), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모디움 오발레(Plasmodium ovale), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 클로스트리디움 디피실리(Clostridium Difficile), 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium Botulinum), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 타이피(Typhi), 살모넬라 엔테리카 혈청형 파라타이피(Paratyphi) A, 쉬가 독소-생산 대장균(STEC), 쉬겔라 디센테리아(Shigella dysenteriae), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 엔타메바 히스토라이티카(Entamoeba histolytica), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertusis), B형 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)(HiB), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)로 이루어진 군으로부터 선택된 병원체의 항원인, 병용물.
- 제1항에 있어서, 상기 면역 관문 항체는 억제성 면역 관문을 표적화할 수 있는 길항 항체(antagonist antibody), 자극성 면역 관문을 표적화할 수 있는 작용 항체(agonist antibody) 또는 두 면역 관문을 표적화할 수 있는 이중특이성 항체인, 병용물.
- 제13항에 있어서, 상기 억제성 면역 관문은 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIGIT, CD96, CD122R, TIM3, VISTA, CEACAM1, SIGLEC-7, SIGLEC-9, SIGLEC-15, KIRi, CD200R, BTLA 및 ILT2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 병용물.
- 제13항에 있어서, 상기 자극성 면역 관문은 CD137, OX40, GITR, ICOS, CD27, CD28, CD40, KIRs, CD226 및 CD244로 이루어진 군으로부터 선택되는, 병용물.
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|---|---|---|---|
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