KR20240099199A - 재조합 단백질을 발현시키기 위한 dna 구조체 및 숙주 세포 - Google Patents
재조합 단백질을 발현시키기 위한 dna 구조체 및 숙주 세포 Download PDFInfo
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Abstract
재조합 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구조체로서, 여기서 DNA 구조체가:
- 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나―여기서 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열은 TIR 서열임―; 및
- 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
을 포함하며,
여기서 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열이 상기 신호 펩티드를 인코딩하는 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드를 포함한다.
- 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나―여기서 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열은 TIR 서열임―; 및
- 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
을 포함하며,
여기서 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열이 상기 신호 펩티드를 인코딩하는 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드를 포함한다.
Description
본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 재조합 단백질을 발현시키기에 적합한 DNA 구조체(construct)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 DNA 구조체를 포함하는 벡터 및 박테리아 숙주 세포, 및 상기 박테리아 숙주 세포를 람노스(rhamnose)에 노출시켜 상기 재조합 단백질의 발현을 유도함으로써 상기 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
람노스의 대사는 L-람노스가 투과 효소(permease) RhaT를 통해 세포에 흡수된 후, L-람노스 이성화 효소(L-rhamnose isomerase)(RhaA)에 의해 L-람눌로스(L-rhamnulose)로 이성화되고, L-람눌로스는 람눌로키나아제(rhamnulokinase)(RhaB)에 의해 추가로 인산화되고, 최종적으로 람눌로스-1-포스페이트 알도라제(RhaD)에 의해 가수분해되어, 디히드록시아세톤포스페이트 및 L-락트알데하이드를 수득한다 [1]. rhaA, rhaB 및 rhaD 유전자는 rhaBAD로 나타내어지는 오페론(operon)을 형성하고, rhaBAD 프로모터의 도움으로 전사된다 [1]. 다른 시스템과 비교하여, 람노스 대사 경로는 하기에 설명되는 바와 같이 RhaS 및 RhaR로 알려진 2개의 전사 활성인자가 조절을 위하여 필요하다는 사실에 의해 구별된다 [1].
rhaBAD 오페론은 전술한 rhaB, rhaA 및 rhaD 유전자를 각각의 전사 개시 부위를 분리하는 약 240 bp의 DNA를 갖는 rhaSR 오페론으로부터 분기적으로(divergently) 전사하는 양성 조절 이화 오페론(positively regulated catabolic operon)이다 [1]. rhaSR 오페론은 RhaS 및 RhaR을 인코딩(encodes)하며, 여기에서, 이량체 RhaS 및 RhaR 단백질의 각각의 모노머는 2개의 나선-회전-나선 모티프(helix-turn-helix motifs)를 함유하고, DNA의 2개의 주요 그루브(grooves)와 접촉한다. RhaR은 rhaSR 전사 개시 부위에 대하여 -32에서 -82 염기에 이르는 프로모터 DNA를 결합함으로써 전사를 조절한다 [1]. rhaSR 발현 후, RhaS는 rhaBAD 발현을 증가시키기 위하여, 전사 개시 부위에 대하여 -32 내지 -81 염기에서 rhaBAD 오페론의 업스트림(upstream)의 DNA에 결합한다 [1]. 또한, rhaSR-rhaBAD 유전자간 영역은 rhaBAD 오페론의 전사 개시 부위에 대하여 -92.5의 위치(CRP 1)에 CRP 결합 부위, 및 rhaSR 오페론의 전사 개시 부위에 대하여 -92.5의 위치(CRP 2), -115.5의 위치(CRP 3) 및 -116.5의 위치(CRP 4)에 CRP 결합 부위를 함유한다 [1]. 사이클릭 AMP 수용체 단백질(CRP)은 대장균(Escherichia coli)에서 100개가 넘는 프로모터의 발현을 조절한다.
RhaS, RhaR 및 rhaBAD 프로모터를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 구조체는 당해 기술분야에 공지되어 있다. US8138324호는 RhaS, RhaR 및 rhaBAD 프로모터를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 pTACO- 및 pLEMO-유래 플라스미드(즉, DNA 구조체)를 개시한다. 그러나, US8138324호는 람노스 대사 장애를 갖는 숙주 세포를 이용하는 것에 대해서는 침묵하고 있다.
RhaS, RhaR 및 rhaBAD 프로모터를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 pRha-유래 플라스미드에 기초한 DNA 구조체도 예를 들어, Giacalone et al. [5] 또는 Hjelm et al. [2]로부터 당해 기술분야에 또한 공지되어 있다. Giacalone et al.은 예를 들어, 플라스미드 pRha67A 및 pRha109A를 기재하고, Hjelm et al.은 플라스미드 pRha67K를 개시한다.
RhaS, RhaR 및 rhaBAD 프로모터를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 구조체가 당해 기술분야에 공지되어 있으나, 재조합 단백질, 특히 단일클론 항체 또는 그의 단편의 산업적 규모 생산에서 여전히 많은 도전 과제가 있다. 주요 과제는 다음과 같다:
(i) 막, 단백질 및 핵산과 같은 세포 거대분자를 손상시키는 스트레스를 받는 숙주 세포;
(ⅱ) 숙주 세포의 불량한 성장;
(ⅲ) 생산된 재조합 단백질의 불량한 활성; 및/또는
(ⅳ) 낮은 수율로 재조합 단백질을 얻는 것.
따라서, 단일클론 항체 또는 그의 단편과 같은 재조합 단백질의 고수율의 효율적인 제조에 적합한 개선된 DNA 구조체, 및 숙주 세포 및 방법에 대한 요구가 있다.
특히, TNF-알파에 대한 친화력을 갖는 항-종양 괴사 인자(TNF) 단일클론 항체의 인간화된 Fab' 단편(IgG 1 이소형으로부터의)인 세르톨리주맙(Certolizumab)의 효율적인 생산을 위한 숙주 세포 뿐만 아니라 개선된 DNA 구조체가 필요하다. 세르톨리주맙과 약 40kDa 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 컨주게이션은 UCB에 의해 Cimzia®라는 명칭으로 판매하는 의약품인 세르톨리주맙 페골(Certolizumab pegol)이 생성되며, 크론병(Crohn's disease), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis) 및 강직성 척추염(ankylosing spondylitis)의 치료를 위해 피하 주사로 투여된다.
EP1287140호 및 US7012135호와 같은 특허는 세르톨리주맙 생산을 위한 DNA 구조체를 개시한다. 그러나, 진화되지 않은(un-evolved) 번역 개시 영역(translation initiation regions: TIR)을 포함하고, 또한 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 부족한 것으로 보이는, 이러한 DNA 구조체는 높은 수율로 세르톨리주맙을 생산하는데 최적이 아니다.
일반적으로, EP1287140호 및 US7012135호에 개시된 것과 같은 재조합 발현 벡터를 생성하는 경우, TIR은 발현 벡터로부터의 5'UTR(즉, ATG 개시 코돈의 업스트림의 비번역 영역)을 신호 펩티드를 인코딩하는 서열과 융합시켜 형성된다. 상이한 신호 펩티드가 사용될 때마다, 상이한 TIR이 생성된다. 이러한 TIR은 US10696963호 및 WO21158163호 뿐만 아니라 본 발명에 기재된 합성적으로 진화된(synthetically evolved) TIR보다는 임시 유전적 융합(ad hoc genetic fusion)에 의해 형성되었기 때문에 진화되지 않은 것으로 지칭된다.
US6828121호 및 EP1341899호와 같은 특허는 다양한 유형의 항체 및 인간화 Fab' 단편과 같은 항체 단편의 생산을 위한 숙주 세포에 관한 것이다. 이들 숙주 세포에 의해 생산될 수 있는 항체의 일부 구체적인 예시는 항-IgE, 항-IgG, 항-Her-2, 항-CD11a, 항-CD18, 항-CD20 및 항-VEGF이다. US6828121호 및 EP1341899호에 개시된 숙주 세포의 예시는 각각 프로테아제 DegP 및 Prc를 인코딩하는 염색체 degP 및 prc가 결핍되고, 돌연변이 spr 유전자를 보유하는 E. coli 균주이고, 여기서, 돌연변이 spr 유전자의 생성물은 148의 위치에서 트립토판이 아르기닌으로 바뀌는 것을 특징으로 한다. 그러나, US6828121호 및 EP1341899호는 양자 모두 (a) 람노스의 대사와 관련된 숙주 세포의 돌연변이, 및 (b) 세르톨리주맙과 같은 특정 Fab' 단편의 생산에 대해서는 침묵하고 있다.
국제 특허 출원 WO21158163호는 재조합 단백질 생산에서 신호 펩티드의 성능을 조절하기 위해 합성적으로 진화된 TIR을 포함하는 DNA 구조체에 관한 것이다. WO21158163호는 합성적으로 진화된 TIR이 진화되지 않은 TIR에 비해 기술적 이점을 가지고 있음을 분명히 나타낸다. 그러나, WO21158163호는 세르톨리주맙의 최적 발현을 위해 특별히 개발된 합성적으로 진화된 TIR에 대해서는 침묵하고 있다.
WO21158163호는 또한 Pelb 신호 펩티드의 발현을 위한 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 그러나, WO21158163호에는 세르톨리주맙의 최적 발현을 위해 특별히 개발된 뉴클레오티드 서열에 대해서는 침묵하고 있다.
따라서, 세르톨리주맙과 같은 재조합 단백질의 발현을 위한 DNA 구조체, 숙주 세포, TIR 및 신호 펩티드의 최적화가 필요하다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 DNA 구조체의 유리한 기술적 효과를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TIR의 유리한 기술적 효과를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 숙주 세포의 유리한 기술적 효과를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신호 펩티드 뉴클레오티드 서열의 유리한 기술적 효과를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 단백질의 효율적인 생산을 위한 유리한 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 하기에 개시된 본 발명의 측면 중 임의의 하나 이상에 의해 달성되었다.
본 발명의 첫번째 측면은 숙주 세포에서 세르톨리주맙을 발현시키는데 적합한 DNA 구조체에 관한 것으로서, 여기서 세르톨리주맙이 (i) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 (ⅱ) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고,
상기 DNA 구조체는 세르톨리주맙을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 DNA 구조체는 세르톨리주맙의 경쇄 및/또는 세르톨리주맙의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된(operably linked) 신호 펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 더 포함하며,
상기 DNA 구조체는 하기:
- 프로모터(promoter),
- RhaR 전사 활성인자(transcription activator),
- RhaS 전사 활성인자,
- 항생제 내성 마커(antibiotic resistance marker),
- 적어도 하나의 터미네이터(terminator), 및
- 복제 기점(origin of replication),
을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체는 하기:
- 프로모터,
- RhaR 전사 활성인자,
- RhaS 전사 활성인자,
- 항생제 내성 마커,
- 항생제 내성 마커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터,
- 적어도 하나의 터미네이터, 및
- 복제 기점,
을 특징으로 한다.
바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체는 하기:
- rhaBAD 프로모터,
- RhaR 전사 활성인자,
- RhaS 전사 활성인자,
- 항생제 내성 마커,
- 항생제 내성 마커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터,
- rrnB T1 터미네이터,
- rrnB T2 터미네이터, 및
- pMB1 복제 기점,
을 특징으로 한다.
바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체는 하기:
- 항생제 내성 마커가 카나마이신(kanamycin) 내성 마커, 바람직하게 서열 번호 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 카나마이신 내성 마커이며;
- 항생제 내성 마커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터가 AmpR 프로모터, 바람직하게는 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 AmpR 프로모터이며;
- rrnB T1 터미네이터가 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며;
- rrnB T2 터미네이터가 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 그리고/또는
- pMB1 복제 기점이 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것
을 특징으로 한다.
바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체는 하기:
- 항생제 내성 마커가 서열 번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 카나마이신 내성 마커이며;
- 항생제 내성 마커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터가 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AmpR 프로모터이며;
- rrnB T1 터미네이터가 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- rrnB T2 터미네이터가 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 그리고/또는
- pMB1 복제 기점이 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것
을 특징으로 한다.
바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체는 하기:
- rhaBAD 프로모터가 서열 번호 8의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며;
- RhaR 전사 활성인자가 서열 번호 9의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며;
- RhaS 전사 활성인자가 서열 번호 11의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며;
- 항생제 내성 마커가 서열 번호 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 카나마이신 내성 마커이며;
- AmpR 프로모터가 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며;
- rrnB T1 터미네이터가 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며;
- rrnB T2 터미네이터가 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
- pMB1 복제 기점이 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것
을 특징으로 한다.
바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체는 하기:
- rhaBAD 프로모터가 서열 번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- RhaR 전사 활성인자가 서열 번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- RhaS 전사 활성인자가 서열 번호 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- 항생제 내성 마커가 서열 번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 카나마이신 내성 마커이며;
- AmpR 프로모터가 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- rrnB T1 터미네이터가 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- rrnB T2 터미네이터가 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
- pMB1 복제 기점이 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것
을 특징으로 한다.
바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체는 EcoRI, NdeI, NotI, XhoI, PspXI, PaeR71, BbsI, StyI, AvrII, BanI, Acc65I, KpnI, Eco53kI, SacI, BamHI, XbaI, SalI, AccI, PstI, SbfI, SphI 및/또는 HindIII와 같은 제한 효소에 의해 절단될 수 있는 하나 이상의 제한 부위(restriction sites)를 포함할 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체는 상기 재조합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 rhaBAD 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것을 더 포함하고, 여기서 상기 재조합 단백질은 단일클론 항체 또는 그의 단편이고, 바람직하게는 상기 재조합 단백질은 세르톨리주맙이다. 더욱 바람직하게는 상기 재조합 단백질은 (i) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 (ⅱ) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 세르톨리주맙이다.
바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체는
(i) 서열 번호 5의 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세르톨리주맙의 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 (ⅱ) 서열 번호 6의 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세르톨리주맙의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, rhaBAD 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 재조합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 바람직하게는 재조합 단백질을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열 번호 5의 서열을 포함하는 세르톨리주맙의 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 (ⅱ) 서열 번호 6의 서열을 포함하는 세르톨리주맙의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, DNA 구조체는 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 양자 모두에 전사 방향으로 작동 가능하게 연결되는, 신호 펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rhaBAD 프로모터와 작동 가능하게 연결되는 재조합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하고, 바람직하게는 신호 펩티드는 PelB(펙테이트 리아제 B) 신호 펩티드이다.
세르톨리주맙의 경쇄의 뉴클레오티드 서열에 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본 발명에서 PelB1로 지칭된다. PelB1의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 18의 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
세르톨리주맙의 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본 발명에서 PelB2로 지칭된다. PelB2의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 19의 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
생성된 PelB 신호 펩티드는 서열 번호 7 [6]: MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, DNA 구조체는 서열 번호 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 TIR을 포함하며, 여기서 서열 번호 20의 상기 서열은 PelB1의 뉴클레오티드 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드 서열, 즉, 서열 번호 18의 첫번째 9개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 특정 TIR은 본 발명에서 TIR-LC로도 또한 지칭된다.
일 실시 형태에서, DNA 구조체는 서열 번호 21의 서열을 갖는 TIR을 포함하며, 여기서 서열 번호 21의 상기 서열은 PelB2의 뉴클레오티드 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드 서열, 즉, 서열 번호 19의 첫번째 9개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 특정 TIR은 본 발명에서 TIR-HC로도 또한 지칭된다.
바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체가 서열 번호 17의 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열 번호 17의 서열을 포함한다.
본 발명의 두번째 측면은 재조합 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구조체에 관한 것으로서, 여기서 DNA 구조체가:
- 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나―여기서 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열은 TIR 서열임―; 및
- 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
을 포함하며,
여기서 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열이 상기 신호 펩티드를 인코딩하는 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, DNA 구조체는 서열 번호 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 TIR을 포함하며, 여기서 서열 번호 20의 상기 서열은 PelB1의 뉴클레오티드 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드 서열, 즉, 서열 번호 18의 첫번째 9개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 특정 TIR은 본 발명에서 TIR-LC로도 또한 지칭된다.
일 실시 형태에서, DNA 구조체는 서열 번호 21의 서열을 갖는 TIR을 포함하며, 여기서 서열 번호 21의 상기 서열은 PelB2의 뉴클레오티드 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드 서열, 즉, 서열 번호 19의 첫번째 9개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 특정 TIR은 본 발명에서 TIR-HC로도 또한 지칭된다.
일 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이:
- 항체의 경쇄를 인코딩하는 첫번째 뉴클레오티드 서열; 및/또는
- 항체의 중쇄를 인코딩하는 두번째 뉴클레오티드 서열;
에 작동 가능하게 연결된다.
일 실시 형태에서, DNA 구조체는 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열을 포함한다. 상기 샤인-달가르노 서열이 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 ATG 개시 코돈으로부터 업스트림에 위치한다. 일 실시 형태에서, 상기 샤인-달가르노 서열이 항체의 경쇄 및/또는 중쇄에 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 ATG 개시 코돈으로부터 업스트림에 위치한다. 일 실시 형태에서, 상기 샤인-달가르노 서열이 전사 방향으로 뉴클레오티드 서열 AGGAGGAA 및/또는 GAGGAGAA를 포함한다. 바람직하게는, AGGAGGAA는 항체의 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림이다. 바람직하게는, GAGGAGAA는 항체의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림이다. 더욱 바람직하게는, AGGAGGAA는 TIR-LC의 업스트림이다. 더욱 바람직하게는, GAGGAGAA는 TIR-HC의 업스트림이다.
일 실시 형태에서, 신호 펩티드(예를 들어 PelB1)를 인코딩하는 첫번째 뉴클레오티드 서열이 항체의 경쇄를 인코딩하는 첫번째 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
일 실시 형태에서, 신호 펩티드(예를 들어 PelB2)를 인코딩하는 두번째 뉴클레오티드 서열이 항체의 중쇄를 인코딩하는 두번째 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
일 실시 형태에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 각각 인코딩하는 첫번째 뉴클레오티드 서열 및 두번째 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 인코딩한다.
일 실시 형태에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 각각 인코딩하는 첫번째 뉴클레오티드 서열 및 두번째 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 세번째 측면은 신호 펩티드를 발현시키기 위한 DNA 구조체에 관한 것으로서, 여기서 DNA 구조체가 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 18 및 19의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 DNA 구조체가 서열 번호 18 및 19의 뉴클레오티드 서열 양자 모두를 포함한다.
본 발명의 네번째 측면은 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구조체에 관한 것으로서, 여기서 아미노산 서열이:
a. 세르톨리주맙에 대한 아미노산 서열;
b. 세르톨리주맙의 경쇄 아미노산 서열의 N-말단에 융합된(fused) 서열 번호 7의 아미노산 서열의 첫번째 신호 펩티드; 및
c. 세르톨리주맙의 중쇄 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 서열 번호 7의 아미노산 서열의 두번째 신호 펩티드;
를 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 첫번째 신호 펩티드 및 두번째 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 각각 서열 번호 18 및 서열 번호 19의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 다섯번째 측면은 본 발명의 첫번째, 두번째, 세번째 및/또는 네번째 측면에 따른 임의의 DNA 구조체를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 여섯번째 측면은 하기:
a. 람노스 대사에 장애를 입히는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이;
b. (i) DegP 프로테아제의 발현 및/또는 (ⅱ) DegP 프로테아제의 활성에 장애를 입히는 degP 유전자에서의 돌연변이;
c. (i) Prc 프로테아제의 발현 및/또는 (ⅱ) Prc 프로테아제의 활성에 장애를 입히는 prc 유전자에서의 돌연변이; 및
d. spr 유전자에서의 돌연변이;
를 포함하는 염색체를 특징으로 하는 숙주 세포에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 상기 돌연변이가 프레임시프트, 결실, 치환(substitution) 및 삽입(insertion)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서, 람노스 대사에 장애를 입히는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 상기 돌연변이가 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이이다.
일 실시 형태에서, degP 유전자에서의 상기 돌연변이가 degP 결실이다.
일 실시 형태에서, prc 유전자에서의 상기 돌연변이가 prc 결실이다.
일 실시 형태에서, spr 유전자에서의 상기 돌연변이가, spr 유전자에서의 치환으로 인해 148의 위치에서 트립토판이 아르기닌으로 바뀌는 것을 특징으로 하는 sprW148R 돌연변이이다.
일 실시 형태에서, 상기 숙주 세포가:
a. 람노스 대사에 장애를 입히는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이;
b. DegP 프로테아제의 발현에 장애를 입히는 degP 유전자에서의 돌연변이;
c. Prc 프로테아제의 발현에 장애를 입히는 prc 유전자에서의 돌연변이; 및
d. spr 유전자에서의 돌연변이;
를 포함하는 염색체를 특징으로 한다.
일 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포이고, 더욱 바람직하게는 E. coli이고, 가장 바람직하게는 E. coli W3110이다.
일 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 E. coli W3110이고, RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이(frame shift-mutation)를 포함하는 염색체를 포함한다. 이 특정 숙주 세포는 본 발명에서 E. coli W3110 rhaBfs 및 XB17로 지칭된다.
일 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 degP 결실을 포함하는 염색체를 더 포함하는 E. coli W3110 rhaBfs이다. 이 특정 숙주 세포는 본 발명에서 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP 및 XB83으로 지칭된다.
일 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 prc 결실을 포함하는 염색체를 더 포함하는 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP이다. 이 특정 숙주 세포는 본 발명에서 E. coli W3110 rhaBfs ΔdegP Δprc 및 XB152으로 지칭된다.
일 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 sprW148R 돌연변이를 포함하는 염색체를 더 포함하는 E. coli W3110 rhaBfs ΔdegP Δprc이다. 이 특정 숙주 세포는 본 발명에서 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R 및 XB166으로 지칭된다.
본 발명의 일곱번째 측면은 본 발명의 첫번째, 두번째, 세번째 및/또는 네번째 측면에 따른 DNA 구조체를 포함하는 본 발명의 여섯번째 측면에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 여덟번째 측면은 본 발명의 일곱번째 측면에 따른 숙주 세포를 람노스에 노출시켜, 그에 의해 상기 재조합 단백질의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 재조합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 박테리아 숙주 세포로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계로서; 바람직하게는 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의해, 회수된 재조합 단백질을 정제하는 하나 이상의 단계(들)을 선택적으로 더 포함한다.
본 발명의 아홉번째 측면은 본 발명의 첫번째, 두번째, 세번째 및/또는 네번째 측면에 따른 DNA 구조체를 여섯번째 측면에 따른 숙주 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 재조합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 상기 방법은 숙주 세포를 람노스에 노출시켜, 그에 의해 상기 재조합 단백질의 발현을 유도하는 단계를 더 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 방법은 숙주 세포로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계로서; 바람직하게는 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의해, 회수된 재조합 단백질을 정제하는 하나 이상의 단계(들)을 선택적으로 더 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 방법은 정제된 재조합 단백질을 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 더욱 바람직하게는 약 40 kDa 폴리에틸렌 글리콜 모이어티으로 유도체화하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 열번째 측면은 본 발명의 아홉번째 측면에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 재조합 단백질에 관한 것이다. 상기 재조합 단백질은 바람직하게는 항체 또는 이의 단편, 더욱 바람직하게는 Fab' 단편 항체, 가장 바람직하게는 세르톨리주맙이다.
본 발명의 열한번째 측면은 본 발명의 아홉번째 측면에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 세르톨리주맙 바이오시밀러에 관한 것이다. 바람직하게는, 세르톨리주맙 바이오시밀러는 약 40 kDa 폴리에틸렌 글리콜 모이어티과 같은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함한다. 세르톨리주맙 바이오시밀러는 본원에서 세르톨리주맙 바이오시밀러의 분자 구조를 만족스럽게 보호하기 위해 제품별 공정(product-by-process)으로 개시되었다. 바이오시밀러는 기준 제품(reference product)과 매우 유사하다. 즉, 세르톨리주맙 바이오시밀러는 기준 제품의 스폰서가 생산한 세르톨리주맙 페골(Cimzia®)과 매우 유사한 분자 구조 및 생체 활성을 가질 것이다. 또한, 바이오시밀러는 기준 제품과 임상적으로 의미 있는 차이가 없으며, 바이오시밀러에 대해 수행되는 임상시험에서는 약동학 및 면역원성을 평가한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따른 세르톨리주맙 바이오시밀러와 기준 제품의 스폰서의 세르톨리주맙 페골 사이의 작은 구조적 차이는 부분적으로 본 발명의 아홉번째 측면(및 본 발명의 여덟번째 측면)에 따른 방법에 기인할 것이다.
본 발명의 열두번째 측면은 약제로 사용하기 위한, 바람직하게는 크론병, 류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염의 치료에 사용하기 위한 세르톨리주맙 바이오시밀러 또는 이의 유도체에 관한 것이다. 상기 유도체는 바람직하게는 약 40 kDa 폴리에틸렌 글리콜 모이어티와 같은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함한다. 본 발명의 실시 형태는 세르톨리주맙 바이오시밀러를 사용함으로써 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 질병은 크론병, 류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염일 수 있다.
본 발명의 열세번째 측면은 본 발명의 첫번째, 두번째, 세번째 및/또는 네번째 측면에 따른 DNA 구조체를 본 발명의 여섯번째 측면에 따른 숙주 세포에 도입시키는 단계를 포함하는, 신호 펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다양한 측면 (및 그 실시 형태)의 상기 표시된 서열 번호 1 내지 21의 하나 이상은 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로 대체될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "서열 동일성(sequence identity)"은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 관하여 사용되며, 서열 동일성은 특정된 서열의 전체 길이에 걸쳐 있다. 따라서, 서열은 특정된 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 적어도 90 퍼센트, 적어도 92 퍼센트, 적어도 95 퍼센트, 적어도 96 퍼센트, 적어도 97 퍼센트, 적어도 98 퍼센트 또는 적어도 99 퍼센트 동일하다. 따라서, 본 발명의 이러한 서열은 본 발명의 서열에 대한 단일 또는 다중 뉴클레오티드 또는 아미노산 변경(부가, 치환, 삽입 또는 결실)을 포함한다. 아미노산 수준에서, 상기 정의된 서열 동일성을 갖는 바람직한 서열은 본 발명의 서열에 5개 이하, 예를 들어, 단지 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개, 바람직하게 1개, 2개 또는 3개, 더욱 바람직하게 1개 또는 2개의 변경된 아미노산을 함유한다.
도 1 - KTXHIS의 플라스미드 맵
도 2 - KTXHIS 다중 클로닝 부위(MCS)의 뉴클레오티드 서열
도 3 - KTXHIS-Cert-PelB1-LC-PelB2-HC의 플라스미드 맵
도 4 - TIR 라이브러리 선택 및 그로부터 진화된 TIR 분리의 예
도 5 - 배지 분획의 웨스턴 블롯 분석
도 6 - 총 분획의 웨스턴 블롯 분석
도 7 - 발현 시스템 XB62(진화되지 않은 TIR을 갖는 발현 벡터 D37을 함유하는 XB17 숙주 세포)와 XB102(세르톨리주맙 중쇄 발현의 조절을 위해 합성적으로 진화된 TIR을 갖는 발현 벡터 E83을 함유하는 XB17 숙주 세포) 사이의 수율 및 역가(titer) 차이를 검출하기 위해 수행된 NanoDropTM 및 KTA 크로마토그래피.
도 8 - 주변세포질(periplasmic) 추출 후 친화성-HPLC를 통한 비교 발현 분석: XB17 숙주 세포에서 발현된 E83 발현 벡터 대(versus) XB166 숙주 세포에서 발현된 E83 벡터
도 9 - 주변세포질 추출 후 친화성-HPLC를 통한 비교 발현 분석: XB166 숙주 세포에서 발현된 E83 발현 벡터 대 XB166 숙주 세포에서 발현된 E111 벡터
도 2 - KTXHIS 다중 클로닝 부위(MCS)의 뉴클레오티드 서열
도 3 - KTXHIS-Cert-PelB1-LC-PelB2-HC의 플라스미드 맵
도 4 - TIR 라이브러리 선택 및 그로부터 진화된 TIR 분리의 예
도 5 - 배지 분획의 웨스턴 블롯 분석
도 6 - 총 분획의 웨스턴 블롯 분석
도 7 - 발현 시스템 XB62(진화되지 않은 TIR을 갖는 발현 벡터 D37을 함유하는 XB17 숙주 세포)와 XB102(세르톨리주맙 중쇄 발현의 조절을 위해 합성적으로 진화된 TIR을 갖는 발현 벡터 E83을 함유하는 XB17 숙주 세포) 사이의 수율 및 역가(titer) 차이를 검출하기 위해 수행된 NanoDropTM 및 KTA 크로마토그래피.
도 8 - 주변세포질(periplasmic) 추출 후 친화성-HPLC를 통한 비교 발현 분석: XB17 숙주 세포에서 발현된 E83 발현 벡터 대(versus) XB166 숙주 세포에서 발현된 E83 벡터
도 9 - 주변세포질 추출 후 친화성-HPLC를 통한 비교 발현 분석: XB166 숙주 세포에서 발현된 E83 발현 벡터 대 XB166 숙주 세포에서 발현된 E111 벡터
상세한 설명
본 발명의 특정 실시 형태는 항체를 발현시키기 위한 DNA 구조체에 관한 것으로, 여기서 상기 DNA 구조체는 서열 번호 20의 개선된 TIR을 포함한다:
TTGCTCATGAAGTAT
또 다른 구체적인 실시 형태는 항체를 발현시키기 위한 DNA 구조체에 관한 것으로, 여기서 상기 DNA 구조체는 서열 번호 21의 개선된 TIR을 포함한다:
TGTTAAATGAAGTAT
서열 번호 20 및 21의 TIR은 동일한 DNA 구조체에 포함될 수 있다. 이러한 실시 형태의 예는 서열 번호 20의 TIR이 항체의 경쇄 또는 이의 단편(예컨대 세르톨리주맙)을 발현시키는 뉴클레오티드 서열의 업스트림인 반면, 서열 번호 21의 TIR은 항체의 중쇄 또는 이의 단편(예컨대 세르톨리주맙)을 발현시키는 뉴클레오티드 서열의 업스트림인 것이다.
본 발명의 특정 실시 형태는 항체의 쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 서열 번호 18의 개선된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다:
ATGAAGTATCTTCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCA
또 다른 특정 실시 형태는 항체의 쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 서열 번호 19의 개선된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다:
ATGAAGTATCTGTTGCCGACTGCTGCAGCGGGACTGCTGCTGTTAGCGGCACAACCGGCGATGGCG
서열 번호 18 및 19의 PelB 뉴클레오티드 서열은 동일한 DNA 구조체에 포함될 수 있다. 이러한 DNA 구조체의 예는 서열 번호 18의 PelB 뉴클레오티드 서열이 항체의 경쇄 또는 이의 단편(예컨대 세르톨리주맙)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되는 경우, 서열 번호 19의 PelB 뉴클레오티드 서열이 항체의 중쇄 또는 이의 단편(예컨대 세르톨리주맙)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
또 다른 특정 실시 형태에서, 상기에서 설명된 서열 번호 18 내지 21의 서열은 동일한 DNA 구조체에 포함될 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 서열 번호 20 및 21의 TIR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 18 및 19의 신호 펩티드 뉴클레오티드 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드를 포함할 것이다.
본 발명의 다른 특정 실시 형태는 세르톨리주맙과 같은 재조합 단백질의 L-람노스 rhaBAD 프로모터 기반 생산을 조절하는 것에 관한 것일 수 있다. 즉, 세르톨리주맙은 다음을 통해 생산될 수 있다:
a. 세르톨리주맙을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 DNA 구조체에 클로닝하여, 뉴클레오티드 서열이 rhaBAD 프로모터에 작동 가능하게 연결되도록 하는 단계; 및
b. 수득된 뉴클레오티드 서열을 람노스 대사에 장애를 입히는 돌연변이 또는 변형을 포함하는 염색체를 포함하는 박테리아 숙주 세포에 도입하는 단계.
일 실시 형태에서, rhaBAD 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8의 서열(여기서 서열은 도 1 및 도 3에서 "rhaBAD"로 나타내어짐)을 포함한다:
CACCACAATTCAGCAAATTGTGAACATCATCACGTTCATCTTTCCCTGGTTGCCAATGGCCCATTTTCTTGTCAGTAACGAGAAGGTCGCGAATCCAGGCGCTTTTTAGACTGGTCGTA.
DNA 구조체는 RhaR 전사 활성인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, RhaR 전사 활성인자의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 9의 서열(여기서 상기 서열은 도 1 및 도 3에서 "rhaR"로 나타내어짐)을 포함한다:
ATGGCTTTCTGCAATAACGCGAATCTTCTCAACGTATTTGTACGCCATATTGCGAATAATCAACTTCGTTCTCTGGCCGAGGTAGCCACGGTGGCGCATCAGTTAAAACTTCTCAAAGATGATTTTTTTGCCAGCGACCAGCAGGCAGTCGCTGTGGCTGACCGTTATCCGCAAGATGTCTTTGCTGAACATACACATGATTTTTGTGAGCTGGTGATTGTCTGGCGCGGTAATGGCCTGCATGTACTCAACGATCGCCCTTATCGCATTACCCGTGGCGATCTCTTTTACATTCATGCTGATGATAAACACTCCTACGCTTCCGTTAACGATCTGGTTTTGCAGAATATTATTTATTGCCCGGAGCGTCTGAAGCTGAATCTTGACTGGCAGGGGGCGATTCCGGGATTTAACGCCAGCGCAGGGCAACCACACTGGCGCTTAGGTAGCATGGGGATGGCGCAGGCGCGGCAGGTTATTGGTCAGCTTGAGCATGAAAGTAGTCAGCATGTGCCGTTTGCTAACGAAATGGCTGAGTTGCTGTTCGGGCAGTTGGTGATGTTGCTGAATCGCCATCGTTACACCAGTGATTCGTTGCCGCCAACATCCAGCGAAACGTTGCTGGATAAGCTGATTACCCGGCTGGCGGCTAGCCTGAAAAGTCCCTTTGCGCTGGATAAATTTTGTGATGAGGCATCGTGCAGTGAGCGCGTTTTGCGTCAGCAATTTCGCCAGCAGACTGGAATGACCATCAATCAATATCTGCGACAGGTCAGAGTGTGTCATGCGCAATATCTTCTCCAGCATAGCCGCCTGTTAATCAGTGATATTTCGACCGAATGTGGCTTTGAAGATAGTAACTATTTTTCGGTGGTGTTTACCCGGGAAACCGGGATGACGCCCAGCCAGTGGCGTCATCTCAATTCGCAGAAAGAT.
DNA 구조체는 종결 코돈(stop codon)이 없기 때문에 RhaR을 갖는 프레임 내에 있는 RhaR 전사 활성인자의 연장을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, RhaR 전사 활성인자의 연장의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 10의 서열(여기서 상기 서열은 도 1 및 도 3에서 "연장된 rhaR (rhaR extended)"로 나타내어짐)을 포함한다:
AGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAG.
DNA 구조체는 RhaS 전사 활성인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, RhaS 전사 활성인자의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 11의 서열(여기서 상기 서열은 도 1 및 도 3에서 "rhaS"로 나타내어짐)을 포함할 수 있다:
ATGACCGTATTACATAGTGTGGATTTTTTTCCGTCTGGTAACGCGTCCGTGGCGATAGAACCCCGGCTCCCGCAGGCGGATTTTCCTGAACATCATCATGATTTTCATGAAATTGTGATTGTCGAACATGGCACGGGTATTCATGTGTTTAATGGGCAGCCCTATACCATCACCGGTGGCACGGTCTGTTTCGTACGCGATCATGATCGGCATCTGTATGAACATACCGATAATCTGTGTCTGACCAATGTGCTGTATCGCTCGCCGGATCGATTTCAGTTTCTCGCCGGGCTGAATCAGTTGCTGCCACAAGAGCTGGATGGGCAGTATCCGTCTCACTGGCGCGTTAACCACAGCGTATTGCAGCAGGTGCGACAGCTGGTTGCACAGATGGAACAGCAGGAAGGGGAAAATGATTTACCCTCGACCGCCAGTCGCGAGATCTTGTTTATGCAATTACTGCTCTTGCTGCGTAAAAGCAGTTTGCAGGAGAACCTGGAAAACAGCGCATCACGTCTCAACTTGCTTCTGGCCTGGCTGGAGGACCATTTTGCCGATGAGGTGAATTGGGATGCCGTGGCGGATCAATTTTCTCTTTCACTGCGTACGCTACATCGGCAGCTTAAGCAGCAAACGGGACTGACGCCTCAGCGATACCTGAACCGCCTGCGACTGATGAAAGCCCGACATCTGCTACGCCACAGCGAGGCCAGCGTTACTGACATCGCCTATCGCTGTGGATTCAGCGACAGTAACCACTTTTCGACGCTTTTTCGCCGAGAGTTTAACTGGTCACCGCGTGATATTCGCCAGGGACGGGATGGCTTTCTGCAATAA.
DNA 구조체는 "항생제 내성 마커" 또는 "선택 마커(selection marker)"를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 마커는, 그 생성물이 항생제(예를 들어, 클로람페니콜(chloramphenicol), 암피실린(ampicillin), 젠타마이신(gentamycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline), 카나마이신, 네오마이신(neomycin))에 대한 내성 또는 선택적 배지(예를 들어, ura(우라실), leu(류신), trp(트립토판), his(히스티딘))에서 성장할 수 있는 능력을 부여하는 유전자를 함유하는 DNA의 단편이다. 일반적으로, 플라스미드는 박테리아 세포가 플라스미드를 유지하도록 하는 항생제 내성 마커를 함유한다. 본 발명의 일 실시 형태에서, DNA 구조체는 카나마이신 내성 마커의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 실시 형태에서, 카나마이신 내성을 부여하기 위한 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 12의 서열을 포함한다(여기서 상기 서열은 도 1 및 도 3에서 "KanR"로 나타내어짐)을 포함한다:
ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA.
DNA 구조체는 항생제 내성 마커를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 그러한 프로모터는 전술한 단락에서 논의된 항생제 내성 마커의 발현을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 암피실린 내성을 위한 프로모터는 암피실린 내성 마커의 발현을 촉진시킬 수 있을 뿐 아니라, 카나마이신 내성 마커의 발현도 또한 촉진시킬 수 있는, AmpR 프로모터이다. 본 발명의 특정 실시 형태에서, AmpR 프로모터의 핵산 서열은 서열 번호 13의 서열 (여기서 상기 서열은 도 1 및 도 3에서 "AmpR 프로모터"로 나타내어짐)을 포함한다:
CGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGT
DNA 구조체는 rrnB T1 터미네이터 및 rrnB T2 터미네이터를 양자 모두 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. rrnB T1 및 T2 터미네이터는 양자 모두 분리된 형태의 효율적인 전사 터미네이터이나, 함께 사용되는 경우, rrnB T1 및 T2 터미네이터는 더욱 효율적으로 전사를 종료시킬 수 있다.
일 실시 형태에서, rrnB T1 터미네이터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 14의 서열을 포함한다:
CAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAAT
일 실시 형태에서, rrnB T2 터미네이터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 15의 서열을 포함한다:
AGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTT
DNA 구조체는 DNA 복제가 시작되는 특정 뉴클레오티드 서열인 복제 기점을 더 포함할 수 있다. DNA 복제는 이 지점에서 양방향 또는 단방향으로 진행될 수 있다. 일반적으로 사용되는 일부 복제 기점은 ColE1, pMB1, pSC101, R6K, pBR322, R6K, p15A, 및 pUC이다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 복제 기점은 pMB1 또는 그의 유도체이다. 본 발명의 특정 실시 형태에서, pMB1의 핵산 서열은 서열 번호 16의 서열을 포함한다:
TTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAA
일 실시 형태에서, DNA 구조체는 하기:
- rhaBAD 프로모터,
- RhaR 전사 활성인자,
- RhaS 전사 활성인자,
- 항생제 내성 마커,
- 항생제 내성 마커를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터,
- 적어도 하나의 터미네이터, 및
- 복제 기점,
중 하나 이상을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터이다.
일 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 하기:
- rhaBAD 프로모터,
- RhaR 전사 활성인자,
- RhaS 전사 활성인자,
- 항생제 내성 마커,
- 항생제 내성 마커를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터,
- rrnB T1 터미네이터,
- rrnB T2 터미네이터, 및
- 복제 기점,
을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 하기:
- rhaBAD 프로모터,
- RhaR 전사 활성인자,
- RhaS 전사 활성인자,
- 카나마이신 내성 마커,
- AmpR 프로모터,
- rrnB T1 터미네이터,
- rrnB T2 터미네이터, 및
- pMB1 복제 기점,
을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 하기:
- 서열 번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rhaBAD 프로모터,
- 서열 번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RhaR 전사 활성인자,
- 서열 번호 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RhaS 전사 활성인자,
- 서열 번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 카나마이신 내성 마커,
- 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AmpR 프로모터,
- 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rrnB T1 터미네이터,
- 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rrnB T2 터미네이터, 및
- 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pMB1 복제 기점,
을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기 기재된 DNA 구조체로 클로닝되는 재조합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 단일클론 항체 또는 그의 단편, 바람직하게 세르톨리주맙을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 세르톨리주맙을 인코딩하는 핵산은 세르톨리주맙의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일 실시 형태에서, 세르톨리주맙의 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 5의 서열을 포함한다:
gatattcagatgactcagagcccaagttcgctgagcgcttctgttggcgatcgtgtgaccattacatgcaaagcctcacagaacgttggtaccaatgtcgcctggtatcagcagaaacctggaaaagcgcccaaagcgctcatctactcagcgagcttcctgtattcaggcgtgccgtatcgctttagcggctctggttccggtacagactttaccctcacgatttcgtccttacaaccggaagatttcgccacgtactattgccagcaatacaacatctatccgctgacctttggacaaggcaccaaagtggagatcaaacgcactgttgctgcaccgagtgtgttcatctttccaccgtctgatgagcagctgaagtctggtacagcaagtgttgtgtgtctgctgaacaacttctatccgcgtgaagctaaagtacagtggaaagtcgacaatgccttgcaatccgggaatagccaggaaagcgtgactgaacaggacagcaaggattcgacctacagtctgagcagtaccttaaccttgtcgaaagcggattacgagaaacacaaggtctatgcctgtgaagtcacgcaTCAAGGCCTGTCATCGCCTGTTACTAAATCATTTAATAGAGGAGAATGTTAA
본 발명의 일 실시 형태에서, 세르톨리주맙의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 6의 서열을 포함한다:
gaagtgcagcttgtggagtctggaggtggcttagtccagccaggtggttccctgcgcttgtcctgtgcagcgagcgggtatgtAttcacagattatggcatgaactgggttcggcaagcaccaggcaaaggcctcgaatggatggggtggatcaacacgtatattggggaaccgatttatgcggatagcgtcaaaggtcgcttcacgttcagtctggataccagcaaatcaaccgcgtatctccagatgaatagcctccgtgctgaagatactgccgtgtactactgtgcgcgtggttatcgcagttatgcgatggattactggggccaaggcaccttagtcaccgttagttctgcctccaccaaaggcccatcagtgtttccgctggccccttcgtctaaatcgacgagtggtggcacagccgcactgggatgcctggtcaaagactactttcccgaacctgtaaccgtaagctggaatagtggtgctttgacctcaggcgtgcatacgtttccggctgtcctgcagtcatccggtctgtactcgctttcgagcgttgttactgtaccctctagctccctgggcacccagacgtacatctgcaatgtgaaccataagccgtcgaacaccaaagtggacaagaaagttgagccgaaaagctgcgacaaaacgcacacatgtgccgccTAA
일 실시 형태에서, 세르톨리주맙의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산은 세르톨리주맙의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 양자 모두에 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 신호 펩티드가 바람직하게는 MalE, OmpA, PhoA, DsbA 및 Pelb로 구성되는 군으로부터 선택된다. 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
일 실시 형태에서, 세르톨리주맙의 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 18의 서열을 포함하고, 본 발명에서는 또한 PelB 신호 서열 1로도 지칭되며(도 3 참조) PelB1로 약칭된다:
ATGAAGTATCTtCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCA
일 실시 형태에서, 세르톨리주맙의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 19의 서열을 포함하고, 본 발명에서는 또한 PelB 신호 서열 2로도 지칭되며(도 3 참조) PelB2로 약칭된다:
ATGAAGTATCTGTTGCCGACTGCTGCAGCGGGACTGCTGCTGTTAGCGGCACAACCGGCGATGGCG
일 실시 형태에서, DNA 구조체는 서열 번호 20의 개선된 TIR을 포함한다:
TTGCTCATGAAGTAT
일 실시 형태에서, DNA 구조체는 서열 번호 21의 개선된 TIR을 포함한다:
TGTTAAATGAAGTAT
일 실시 형태에서, DNA 구조체는 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열의 TIR을 포함하고, 여기서 이들 TIR 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 18 및 19의 신호 펩티드 뉴클레오티드 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, DNA 구조체는 본 발명에서 KTXHIS-Cert-PelB1-LC-PelB2-HC로도 지칭되는 서열 번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 DNA 구조체는 발현 벡터인 것이 바람직하다.
재조합 단백질을 제조하기 위해 이용되는 박테리아 숙주 세포는 람노스 대사에 장애를 입히는 돌연변이 또는 변형을 갖는 염색체를 포함한다. 박테리아 숙주 세포는 E. coli 세포일 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 박테리아 숙주 세포는 E. coli K-12 세포이며, 더욱 바람직하게 박테리아 숙주 세포는 E. coli W3110 세포이다. 람노스 대사 장애는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서 RhaB를 불활성화시키는 돌연변이에 의해 이루어진다. 대안적으로, 람노스 대사 장애는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 결실된 염색체를 갖는 박테리아 숙주 세포를 이용함으로써 이루어진다; 이것은 예를 들어 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 결실시킴으로써 달성된다. 바람직하게는, 박테리아 숙주 세포의 염색체는 RhaT를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 즉, RhaT 유전자는 무손상(intact)이다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, 박테리아 숙주 세포는 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R이다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, 박테리아 숙주 세포 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R은 KTXHIS-Cert-PelB1-LC-PelB2-HC 발현 벡터를 포함하고, 세르톨리주맙 바이오시밀러의 제조에 사용될 수 있는 세르톨리주맙을 발현시키는 방법에 사용된다.
바이오시밀러는 기준 제품과 매우 유사하며, 즉, 세르톨리주맙 바이오시밀러는 기준 제품의 스폰서(즉, 상품 제조자)가 생산한 세르톨리주맙 페골(Cimzia®)과 매우 유사한 분자 구조 및 기능(즉, 생체 활성)을 갖는다. 또한, 바이오시밀러는 기준 제품과 임상적으로 의미 있는 차이가 없으며, 바이오시밀러에 대해 수행되는 임상시험에서는 약동학 및 면역원성을 평가한다. 가장 중요한 것은, 바이오시밀러가 (a) 의료 기관 승인 표준을 충족시키고, (b) 의료 기관 허가 시설에서 제조되고, (c) 지속적인 안전성을 보장하기 위해 시판-후 조사(post-market surveillance)의 일부로 추적된다는 것이다 (이하에 표시됨, https://www.fda.gov/media/108905/download).
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예 섹션의 실시예 1 내지 9에 개시된 바와 같이 예시될 수 있다.
XB166 숙주 세포 및 KTXHIS-Cert-PelB1-LC-PelB2-HC 발현 벡터와 이들의 조합 사용과 관련된 이러한 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내지만, 단지 예시로서 주어지는 것임을 이해하여야 한다. 본 발명의 상기 개시된 실시 형태 및 하기 실시예로부터, 당해 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 본질적인 특성을 확인할 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명을 다양한 유형의 치료용 항체 및 면역글로불린에 적용하기 위하여 본 발명을 다양하게 변경 및 수정할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 도시되고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 그러한 변형은 또한 첨부된 청구범위 내에 있는 것으로 의도된다. 그러한 변형의 예는 상기 표시된 서열 번호 1 내지 21이 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로 대체될 수 있다는 것이다.
실시예
실시예 1은 본 발명에서 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R로도 또한 지칭되는 XB166 숙주 세포의 구성에 관한 것이다.
실시예 2는 KTXHIS-Cert-PelB1-LC-PelB2-HC 발현 벡터의 구성에 관한 것이다.
실시예 3은 실시예 2에서 개시된 발현 벡터에 의해 발현된 세르톨리주맙의 경쇄 및 중쇄에 관한 것이다.
실시예 4는 본 발명에 따라 제조된 세르톨리주맙에 박테리오파지가 없음을 보여준다.
실시예 5는 TIR 라이브러리 선택 및 진화된 TIR의 분리와 관한 것이다.
실시예 6은 배지 분획 발현의 웨스턴-블롯 분석에 관한 것으로서 - 결과는 세르톨리주맙 중쇄 발현의 조절을 위해 합성적으로 진화된 TIR을 포함하는 E83 발현 벡터가 최고 수준의 세르톨리주맙을 생성했다는 것을 보여준다.
실시예 7은 총 분획 발현의 웨스턴-블롯 분석에 관한 것으로서 - 결과는 세르톨리주맙 중쇄 발현의 조절을 위해 합성적으로 진화된 TIR을 포함하는 E83 발현 벡터가 최고 수준의 세르톨리주맙을 생성했다는 것을 보여준다.
실시예 8은 발현 시스템 XB62(진화되지 않은 TIR 및 세르톨리주맙의 경쇄 및 중쇄에 대한 각각의 뉴클레오티드 서열 업스트림에 PelB 신호 펩티드에 대해 야생형 뉴클레오티드 서열을 갖는 D37 발현 벡터를 포함하는 XB17 숙주 세포)과 XB102(세르톨리주맙 중쇄 발현의 조절을 위해 합성적으로 조작된 TIR을 갖는 발현 벡터 E83을 포함하는 XB17 숙주 세포) 사이의 수율 및 역가 차이를 검출하기 위해 수행된 NanoDrop® 및 KTA 크로마토그래피에 관한 것으로 - 결과는 합성적으로 조작된 TIR(세르톨리주맙 중쇄 발현의 조절을 위한)을 포함하는 발현 벡터 E83을 포함하는 발현 시스템 XB102가 세르톨리주맙의 최고 수율 및 역가를 초래한다는 것을 보여준다.
실시예 9는 숙주 세포 XB17 및 XB166에서의 세르톨리주맙 발현의 비교에 관한 것으로 - 결과는 E111(KTXHIS-Cert-Pelb1-LC-Pelb2-HC)과 함께 XB166 숙주 세포(E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R)를 사용하면 세르톨리주맙의 상대적 수율이 가장 높다는 것을 보여준다.
실시예 1 - 균주 개발
XB166 숙주 세포는 항체 및 항체 단편과 같은 재조합 단백질의 생산을 위해 유전적으로 조작된 E. coli W3310 유도체이다. 더욱이, XB166 숙주 세포는 관심 있는 재조합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 KTXHIS 플라스미드로 클로닝되고 람노스 유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 람노스 유도성 시스템을 위한 균주로 설계되었다.
XB166 숙주 세포는 E. coli(Genetic Stock Center(CGSC), Yale University (New Haven, USA), 카탈로그 번호: 4474. 유전자형: F-, λ-, IN(rrnD-rrnE)1, rph-1)로부터 수득한 모(parental) E. coli 균주 W3110로부터 개발되었다.
XB166은 rhaB 유전자를 비활성화하여 람노스-의존성 프로모터로부터 효율적인 유도를 위해 커스터마이즈되었다[7]. 또한, 항체 단편의 생산에 유용한 세가지의 게놈 변형[8]이 하기의 하위섹션에 상세하게 설명된 대로 도입되었다.
요약하면, XB166 숙주 세포를 개발하는 방법은 하기의 하위섹션에서 상세하게 논의할 다음과 같은 변형 사항을 포함한다:
a) RhaB 프레임 시프트 돌연변이;
b) degP 결실;
c) prc 결실; 및
d) sprW148R 돌연변이.
단계 (a) - RhaB 프레임 시프트 돌연변이의 구성.
모 E. coli 균주 W3110은 카본 소스로서 람노스를 활용할 수 없도록 하는 rhaB의 염색체 사본(chromosomal copy)에서 프레임시프트를 갖는 유도체를 생성하도록 조작되었다. 이를 위해, 유전자 대체 플라스미드 pMAK705-rhaBfs를 사용하여 세포를 유전적으로 조작하였다[9].
조작된 균주는 람노스가 더 이상 카본 소스로서 활용될 수 없음을 확인하기 위해 표현형적으로 테스트되었다. 추가로, rhaB 프레임시프트를 함유하는 염색체 단편을 PCR 증폭시키고, PCR 생성물을 시퀀싱하여, 2개의 염기의 올바른 삽입을 확인하였다(하기 개시된 서열 번호 22에서 밑줄 친 CG 염기 참조):
tgtggcagcaactgattcagcccggcgagaaactgaaatcgatccggcgagcgatacagcacattggtcagacacagattatcggtatgttcatacagatgccgatcatgatcgcgtacgaaacagaccgtgccaccggtgatggtatagggctgcccattaaacacatgaatacccgtgccatgttcgacaatcacaatttcatgaaaatcatgatgatgttcaggaaaatccgcctgcgggagccggggttctatcgccacggacgcgttaccagacggaaaaaaatccacactatgtaatacggtcatactggcctcctgatgtcgtcaacacggcgaaatagtaatcacgaggtcaggttcttaccttaaattttcgacggaaaaccacgtaaaaaacgtcgatttttcaagatacagcgtgaattttcaggaaatgcggtgagcatcacatcaccacaattcagcaaattgtgaacatcatcacgttcatctttccctggttgccaatggcccattttcctgtcagtaacgagaaggtcgcgaattcaggcgctttttagactggtcgtaatgaaattcagcaggatcacattatgacctttcgcaattgtgtcgccgtcgatctcggcgcatccagtgggcgcgtgatgctggcgcgttacgagcgtgaatgccgcagcctgacgctgcgcgaaatccatcgttttaacaatgggctgcatagtcagaacggctatgtcacctgggatgtggatagcctGgaaagtgccattcgccttggattaaacaaggtgtgcgaggaagggattcgtatcgCGatagcattgggattgatacctggggcgtggactttgtgctgctcgaccaacagggtcagcgtgtgggcctgcccgttgcttatcgcgatagccgcaccaatggcctaatggcgcaggcacaacaacaactcggcaaacgcgatatttatcaacgtagcggcatccagtttctgcccttcaatacgctttatcagttgcgtgcgctgacggagcaacaacctgaacttattccacacattgctcacgctctgctgatgccggattacttcagttatcgcctgaccggcaagatgaactgggaatataccaacgccacgaccacgcaactggtcaatatcaatagcgacgactgggacgagtcgctactggcgtggagcggggccaacaaagcctggtttggtcgcccgacgcatccgggtaatgtcataggtcactggatttgcccgcagggtaatgagattccagtggtcgccgttgccagccatgataccgccagcgcggttatcgcctcgccgttaaacggctcacgtgctgcttatctctcttctggcacctggtcattgatgggcttcgaaagccagacgccatttaccaatgacacggcactggcagccaacatcaccaatgaaggcggggcggaaggtcgctatcgggtgctgaaaaatattatgggcttatggctgcttcagcgagtgcttcaggagcagcaaatcaacgatcttccggcgcttatctccgcgacacaggcacttccggcttgccgcttcattatcaatcccaatgacgatcgct
단일 콜로니를 골라내어 LB 베지톤(vegitone)에서 성장시켜 글리세롤 스톡을 제조하였다. XB17로 지정된 생성된 균주 E. coli W3110 rhaBfs는 하기의 유전자 변형을 위한 출발 균주로 사용하였다.
단계 (b) - degP 결실
XB17(E. coli W3110 rhaBfs) 균주는 주변 세포질에서 경쇄의 단백질 분해 감소로 인해 재조합 항체 단편의 높은 수준의 축적을 허용하는 "삼중 돌연변이(triple-mutant)" 숙주 균주를 생성하기 위해 세가지 주요 변형(degP prc spr)을 갖추도록 추가로 조작되었다 [8].
이를 위해, 주변 세포질 세린 엔도프로테아제 DegP를 인코딩하는 유전자의 게놈 사본은 유전자 대체 플라스미드 pMAK705-sacB-DegP를 사용하여 녹-아웃되었으며, 여기서 degP 업스트림 영역에 상동성인 단편이 degP 다운스트림 영역에 상동성인 단편에 융합되었다. 극성 효과(polar effect)를 피하기 위해, 유전자 대체 카세트는 degP 개시 코돈과 마지막 7개의 degP 코돈을 보존하도록 설계되었다. 온도에 민감한 복제 기점 다음으로, 이 유전자 대체 플라스미드는 또한 대항선택(counterselection)을 위한 sacB 유전자를 운반하므로, 이에 따라 균주 구성 후 플라스미드 제거(curing) [10]를 촉진시킨다.
염색체 degP 유전자의 결실은 degP "상흔(scar)" 영역의 PCR 증폭 및 PCR 생성물의 시퀀싱에 의해 확인되었다(하기 서열 번호 23 참조, 여기서 밑줄 친 코돈은 degP 개시 코돈이고 볼드체로 된 코돈은 degP 유전자의 마지막 7개 코돈임):
atataaaaatgtcgctgtaaaacatgtgtttagccatccagatgtcgagcggcttgaattgcagggctatcgggtcattagcggattattagagatttatcgtcctttattaagcctgtcgttatcagactttactgaactggtagaaaaagaacgggtgaaacgtttccctattgaatcgcgcttattccacaaactctcgacgcgccatcggctggcctatgtcgaggctgtcagtaaattaccgtcagattctcctgagtttccgctatgggaatattattaccgttgccgcctgctgcaggattatatcagcggtatgaccgacctctatgcgtgggatgaataccgacgtctgatggccgtagaacaataaccaggcttttgtaaagacgaacaataaatttttaccttttgcagaaactttagttcggaacttcaggctataaaacgaatctgaagaacacagcaattttgcgttatctgttaatcgagactgaaatacATG atctacctgttaatgcagTAAtctccctcaaccccttcctgaaaacgggaaggggttctccttacaatctgtgaacttcaccacaactccatacatcttcatcatcctttaggcatttgcacaatgccgtacgttacgtacttccttatgctaagccgtgcataacggaggacttatggctggctggcatcttgataccaaaatggcgcaggatatcgtggcacgtaccatgcgcatcatcgataccaatatcaacgtaatggatgcccgtgggcgaattatcggcagcggcgatcgtgagcgtattggtgaattgcacgaaggtgcattgctggtactttcacagggacgagtcgtcgatatcgatgacgcggtagcacgtcatctgcacggtgtgcggcaggggattaatctaccgttacggctggaaggtgaaattgtcggcgtaattggcctgacaggtgaaccagagaatctgcgtaaatatggcgaactggtctgcatgacggc
조작된 균주의 단일 콜로니를 골라내어 LB 베지톤에서 성장시켜 글리세롤 스톡을 제조하였다. XB83으로 지정된 생성된 균주 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP는 하기의 유전자 변형을 위한 출발 균주로 사용하였다.
단계 (c) - prc 결실
E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP (XB83)를 시작 균주로 사용하고, 상기에서 설명한 degP 결실과 유사하게 유전자 대체 플라스미드 pMAK705-sacB-prc를 사용하여 prc 유전자를 녹-아웃시켰다. 염색체 prc 유전자의 결실은 prc 상흔 영역의 PCR 증폭 및 PCR 생성물의 시퀀싱에 의해 확인되었다(하기 서열 번호 24 참조, 여기서 밑줄 친 코돈은 prc 개시 코돈이고, 볼드체로 된 코돈은 prc 유전자의 마지막 7개의 코돈임):
tttacggtgttaaacccggcgcaacgcgtgtcgatcttgacggcaacccatgcggtgagctggacgagcaacatgtagagcatgctcgcaagcagcttgaagaagcgaaagcgcgtgttcaggcacagcgtgctgaacagcaagcgaaaaaacgcgaagctgccgcaactgctggtgagaaagaagacgcaccgcgccgcgaacgcaagccacgtccgactacgccacgccgcaaagaaggcgctgaacgtaaacctcgtgcgcaaaagccggtagagaaagcgccaaaaacagtaaaagcacctcgcgaagaacagcacaccccggtttctgacatttcagctctgactgtcggacaagccctgaaggtgaaagcgggtcaaaacgcgatggatgccaccgtattagaaatcaccaaagacggcgtccgcgtccagctgaattcgggtatgtctttgattgtgcgcgcagaacacctggtgttctgaaacggaggccgggccaggcATG caacccgctcccgtcaagTAAtatcaatcaggcacaagaaattgtgcctgattttttaacagcgacaagatgccgtaaatcagatgctacaaaatgtaaagttgtgtctttctggtgacttacgcactatccagacttgaaaatagtcgcgtaacccatacgatgtgggtatcgcatattgcgttttgttaaactgaggtaaaaagaaaattatgatgcgaatcgcgctcttcctgctaacgaacctggccgtaatggtcgttttcgggctggtactgagcctgacagggatacagtcgagcagcgttcaggggctgatgatcatggccttgctgttcggttttggtggttccttcgtttcgcttctgatgtccaaatggatggcattacgatctgttggcggggaagtgatcgagcaaccgcgtaacgaaagggaacgttggctggtcaatactgtagcaacccaggctcgtcaggcggggatcgctatgccgcaagtggctatctacc
조작된 균주의 단일 콜로니를 골라내어 LB 베지톤에서 성장시켜 글리세롤 스톡을 제조하였다. 본원에서 XB152로 지정된 생성된 균주 E. coli W3110 rhaBfs ΔdegP Δprc는 최종 유전 공학 단계를 위한 출발 균주로 사용하였다.
단계 (d) - sprW148R
발현 숙주를 조작하는 마지막 단계는 spr 유전자에서 아미노산 치환을 유도하는 sprW148R 돌연변이를 도입함으로써 삼중 돌연변이 유전자형을 보충하는데 사용되었다. degP 및 prc의 결실로 인해 항체 단편의 경쇄의 단백질 분해가 감소된 균주가 생성될 것으로 예상되는 반면, spr 돌연변이는 더 많은 양의 재조합 단백질을 생산하는 것으로 설명되었다[8].
E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc(XB152)를 개시 균주로서 사용하여, spr 유전자의 게놈 사본을 돌연변이 spr 단편을 함유하는 유전자 대체 플라스미드 pMAK705-sacB-sprW148R을 사용하여 조작하였다[10]. sprW148R 돌연변이를 함유하는 염색체 단편을 PCR 증폭시키고, PCR 생성물을 시퀀싱하여 게놈 spr 유전자가 돌연변이 대립유전자로 올바르게 대체되었는지 확인하였다(하기 서열 번호 25 참조; T에서 A로의 돌연변이는 볼드체로 강조 표시됨):
aacaaacaacatggtcaaatctcaaccgattttgagatatatcttgcgcgggattcccgcgattgcagtagcggttctgctttctgcatgtagtgcaaataacaccgcaaagaatatgcatcctgagacacgtgcagtgggtagtgaaacatcatcactgcaagcttctcaggatgaatttgaaaacctggttcgtaatgtcgacgtaaaatcgcgaattatggatcagtatgctgactggaaaggcgtacgttatcgtctgggcggcagcactaaaaaaggtatcgattgttctggtttcgtacagcgtacattccgtgagcaatttggcttagaacttccgcgttcgacttacgaacagcaggaaatgggtaaatctgtttcccgcagtaatttgcgtacgggtgatttagttctgttccgtgccggttcaacgggacgccatgtcggtatttatatcggcaacaatcagtttgtccatgcttccaccagcagtggtgttattatttccagcatgaatgaaccgtacAggaagaagcgttacaacgaagcacgccgggttctcagccgcagctaataaaccgtttggatgcaatcccttggctatcctgacgagttaactgaaagcactgcttaggcagtgcttttttgttttcattcatcagagaaaatgatgtttccgcgtcttgatccaggctatagtccggtcattgttatcttttaaatgttgtcgtaatttcaggaaattaacggaatcatgttcatacgcgctcccaattttggacgtaagctcctgcttacctgcattgttgcaggcgtaatgattgcgatactggtgagttgccttcagtttttagtggcctggcataagcacgaagtcaaatacgacacactgattaccgacgtacaaaagtatctcgatacctattttgccgacctgaaatccactactgaccggctccagccgctgaccttagatacctgccagcaagctaaccccgaactgaccgcccgcgcagcgtttagcatgaatgtccgaacgtttgtgctggtgaaagataaaa
조작된 균주의 단일 콜로니를 골라내어 LB 베지톤에서 성장시켜 글리세롤 스톡을 제조하였다. 생성된 균주 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R을 XB166으로 지정하였다.
XB166의 유리한 기술적 효과는 실시예 8과 도 8에 상세하게 나와 있고, 설명되어 있다.
실시예 2 - KTXHIS-Cert-PelB1-LC-PelB2-HC
제조된 세르톨리주맙의 첫번째 구조체는 신호 펩티드 OmpA-LC, PelB-HC(유전자 합성됨)를 사용하고 EcoRI 및 HindIII 부위를 통해 KTXHIS 플라스미드에 클로닝되었다. 이 첫번째 구조체로부터, 신호 펩티드(들)은 E coli에서 PCR 단편의 상동 재조합을 사용하여 교환되었다. 본 발명자는 KTXHIS 벡터에서 PelBLC, PelBHC의 몇개의 버전을 만들었으며, 여기서 생성된 PelB의 아미노산 서열은 동일하더라도, 코돈은 상이하였다. 솔직히 말하면 본 발명자는 Kiavash에 의해 어느 것이 개시 플라스미드로 사용되었는지 확신할 수 없다.
세르톨리주맙의 발현을 위한 모 구조체는 신호 펩티드 OmpA(경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림)과 PelB(중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림)로 만들어졌고, EcoRI 및 HindIII 부위(서열 번호 2 참조)를 통해 KTXHIS 플라스미드(서열 번호 1 참조)에 클로닝되었다. 이러한 모 구조체로부터, 기존의 신호 펩티드 뉴클레오티드 서열은 그 다음, E. coli에서의 PCR 단편의 상동 재조합을 사용하여 발현 벡터 D37을 얻는 것으로써 서열 번호 18 및 19의 신호 펩티드 뉴클레오티드 서열로 교체하였다. 세르톨리주맙의 경쇄 및 중쇄의 발현을 조절하는 두 개의 TIR의 합성적 구성 후(하기 실시예 5 내지 10에 설명됨), 서열 번호 17을 포함하는 발현 벡터가 생성되었다.
발현 플라스미드 KTXHIS는 이전에 유럽 특허 출원 EP20201096.3호에 기재되어 있다. 생성된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 본 발명에서는 KTXHIS-Cert-PelB1-LC-PelB2-HC로서 지칭된다. KTXHIS-Cert-PelB1-LC-PelB2-HC의 플라스미드 맵은 도 3에 도시하였다:
GGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACTAGGCTTCCGCGCCCTCATCCGAAAGGGCGTATTCATATATGCGGTGTtAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTATCTTTCTGCGAATTGAGATGACGCCACTGGCTGGGCGTCATCCCGGTTTCCCGGGTAAACACCACCGAAAAATAGTTACTATCTTCAAAGCCACATTCGGTCGAAATATCACTGATTAACAGGCGGCTATGCTGGAGAAGATATTGCGCATGACACACTCTGACCTGTCGCAGATATTGATTGATGGTCATTCCAGTCTGCTGGCGAAATTGCTGACGCAAAACGCGCTCACTGCACGATGCCTCATCACAAAATTTATCCAGCGCAAAGGGACTTTTCAGGCTAGCCGCCAGCCGGGTAATCAGCTTATCCAGCAACGTTTCGCTGGATGTTGGCGGCAACGAATCACTGGTGTAACGATGGCGATTCAGCAACATCACCAACTGCCCGAACAGCAACTCAGCCATTTCGTTAGCAAACGGCACATGCTGACTACTTTCATGCTCAAGCTGACCAATAACCTGCCGCGCCTGCGCCATCCCCATGCTACCTAAGCGCCAGTGTGGTTGCCCTGCGCTGGCGTTAAATCCCGGAATCGCCCCCTGCCAGTCAAGATTCAGCTTCAGACGCTCCGGGCAATAAATAATATTCTGCAAAACCAGATCGTTAACGGAAGCGTAGGAGTGTTTATCATCAGCATGAATGTAAAAGAGATCGCCACGGGTAATGCGATAAGGGCGATCGTTGAGTACATGCAGGCCATTACCGCGCCAGACAATCACCAGCTCACAAAAATCATGTGTATGTTCAGCAAAGACATCTTGCGGATAACGGTCAGCCACAGCGACTGCCTGCTGGTCGCTGGCAAAAAAATCATCTTTGAGAAGTTTTAACTGATGCGCCACCGTGGCTACCTCGGCCAGAGAACGAAGTTGATTATTCGCAATATGGCGTACAAATACGTTGAGAAGATTCGCGTTATTGCAGAAAGCCATCCCGTCCCTGGCGAATATCACGCGGTGACCAGTTAAACTCTCGGCGAAAAAGCGTCGAAAAGTGGTTACTGTCGCTGAATCCACAGCGATAGGCGATGTCAGTAACGCTGGCCTCGCTGTGGCGTAGCAGATGTCGGGCTTTCATCAGTCGCAGGCGGTTCAGGTATCGCTGAGGCGTCAGTCCCGTTTGCTGCTTAAGCTGCCGATGTAGCGTACGCAGTGAAAGAGAAAATTGATCCGCCACGGCATCCCAATTCACCTCATCGGCAAAATGGTCCTCCAGCCAGGCCAGAAGCAAGTTGAGACGTGATGCGCTGTTTTCCAGGTTCTCCTGCAAACTGCTTTTACGCAGCAAGAGCAGTAATTGCATAAACAAGATCTCGCGACTGGCGGTCGAGGGTAAATCATTTTCCCCTTCCTGCTGTTCCATCTGTGCAACCAGCTGTCGCACCTGCTGCAATACGCTGTGGTTAACGCGCCAGTGAGACGGATACTGCCCATCCAGCTCTTGTGGCAGCAACTGATTCAGCCCGGCGAGAAACTGAAATCGATCCGGCGAGCGATACAGCACATTGGTCAGACACAGATTATCGGTATGTTCATACAGATGCCGATCATGATCGCGTACGAAACAGACCGTGCCACCGGTGATGGTATAGGGCTGCCCATTAAACACATGAATACCCGTGCCATGTTCGACAATCACAATTTCATGAAAATCATGATGATGTTCAGGAAAATCCGCCTGCGGGAGCCGGGGTTCTATCGCCACGGACGCGTTACCAGACGGAAAAAAATCCACACTATGTAATACGGTCATACTGGCCTCCTGATGTCGTCAACACGGCGAAATAGTAATCACGAGGTCAGGTTCTTACCTTAAATTTTCGACGGAAAACCACGTAAAAAACGTCGATTTTTCAAGATACAGCGTGAATTTTCAGGAAATGCGGTGAGCATCACATCACCACAATTCAGCAAATTGTGAACATCATCACGTTCATCTTTCCCTGGTTGCCAATGGCCCATTTTCTTGTCAGTAACGAGAAGGTCGCGAATCCAGGCGCTTTTTAGACTGGTCGTAATGAAATTCAGGAGGAAtTgctcATGAAGTATCTtCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCAgatattcagatgactcagagcccaagttcgctgagcgcttctgttggcgatcgtgtgaccattacatgcaaagcctcacagaacgttggtaccaatgtcgcctggtatcagcagaaacctggaaaagcgcccaaagcgctcatctactcagcgagcttcctgtattcaggcgtgccgtatcgctttagcggctctggttccggtacagactttaccctcacgatttcgtccttacaaccggaagatttcgccacgtactattgccagcaatacaacatctatccgctgacctttggacaaggcaccaaagtggagatcaaacgcactgttgctgcaccgagtgtgttcatctttccaccgtctgatgagcagctgaagtctggtacagcaagtgttgtgtgtctgctgaacaacttctatccgcgtgaagctaaagtacagtggaaagtcgacaatgccttgcaatccgggaatagccaggaaagcgtgactgaacaggacagcaaggattcgacctacagtctgagcagtaccttaaccttgtcgaaagcggattacgagaaacacaaggtctatgcctgtgaagtcacgcaTCAAGGCCTGTCATCGCCTGTTACTAAATCATTTAATAGAGGAGAATGTTAAATGAAGTATCTGTTGCCGACTGCTGCAGCGGGACTGCTGCTGTTAGCGGCACAACCGGCGATGGCGgaagtgcagcttgtggagtctggaggtggcttagtccagccaggtggttccctgcgcttgtcctgtgcagcgagcgggtatgtAttcacagattatggcatgaactgggttcggcaagcaccaggcaaaggcctcgaatggatggggtggatcaacacgtatattggggaaccgatttatgcggatagcgtcaaaggtcgcttcacgttcagtctggataccagcaaatcaaccgcgtatctccagatgaatagcctccgtgctgaagatactgccgtgtactactgtgcgcgtggttatcgcagttatgcgatggattactggggccaaggcaccttagtcaccgttagttctgcctccaccaaaggcccatcagtgtttccgctggccccttcgtctaaatcgacgagtggtggcacagccgcactgggatgcctggtcaaagactactttcccgaacctgtaaccgtaagctggaatagtggtgctttgacctcaggcgtgcatacgtttccggctgtcctgcagtcatccggtctgtactcgctttcgagcgttgttactgtaccctctagctccctgggcacccagacgtacatctgcaatgtgaaccataagccgtcgaacaccaaagtggacaagaaagttgagccgaaaagctgcgacaaaacgcacacatgtgccgccTAATAAaagctt
실시예 3 - 재조합 단백질 - 세르톨리주맙
발현 벡터 KTXHIS-Cert-PelB1-LC-PelB2-HC에 의해 발현된 세르톨리주맙 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 3의 서열을 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASFLYSGVPYRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
발현 벡터 KTXHIS-cert-PelB1-LC-PelB2-HC에 의해 발현된 세르톨리주맙 중쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 4의 서열을 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYVFTDYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYIGEPIYADSVKGRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYRSYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCAA
더욱이, 생성된 PelB 신호 펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다[6]: MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA
실시예 4 - 세포 보관(banking)
XB166는 KTXHIS-Cert-Pelb1-LC-Pelb2-HC로 형질전환되었다.
단일 콜로니를 골라서 제한 바이오리액터 배지(Defined Bioreactor Medium :DBM)에서 하룻밤 동안 성장시켜 RCB를 제조하였다. 다음날, 20%(최종 농도) 글리세롤을 무균적으로 첨가하고, 배양액을 분취하여 -80℃에서 보관하였다.
RCB 제조에 사용되는 모든 재료들은 동물이 아닌 것 그리고 인간이 아닌 것에서 유래되었다.
실시예 5 - TIR 라이브러리 선택 및 진화된 TIR의 분리
US10696963호 및 Mirzadeh et al 2015 [11]에 개시되고, 이 실시예에 간략하게 설명된 방법을 활용하여, 숙주 세포 리보솜과 더욱 적합한 TIR을 선택하기 위해 합성적 진화를 사용하였다(유사한 TIR의 합성적 진화에 대해서는 WO21158163호 참조). TIR 라이브러리는 ATG 개시 코돈으로부터 바로 업스트림에 있는 6개의 뉴클레오티드가 완전히 랜덤화되고, ATG 개시 코돈으로부터 바로 다운스트림에 있는 6개의 뉴클레오티드가 동의 코돈(synonymous codon)의 변경만으로 랜덤화되었음을 의미하는 설계로 생성되었다. 각 TIR 라이브러리는 이론적으로 서로 다른 TIR을 갖는＞18,000의 발현 플라스미드를 포함하고 있다. 이 실험에서, β-락타마제에 융합된 발현 카세트 PelBss-세르톨리주맙-LC-PelBss-세르톨리주맙-HC (여기서 "ss"는 신호 서열의 약어임)를 포함하는 발현 플라스미드를 기재된 TIR 라이브러리 생성에 적용하였다. 별도의 실험에서 각 세르톨리주맙 쇄에 대해, TIR 라이브러리를 박테리아로 형질전환시키고, 고정된 양의 람노스와 증가하는 농도의 암피실린을 포함하는 LB 한천 플레이트에 플레이팅하였다(도 4). TIR 라이브러리 플레이트(도 4의 상단 패널/행)으로부터의 콜로니는 고농도의 암피실린에 내성이 있거나, 진화되지 않은 발현 카세트 플레이트(도 4의 하단 패널/행)로부터의 해당 콜로니보다 시각적으로 더 크고, 분리되었고, TIR이 시퀀싱되었다. 동정된 TIR(즉, 합성적으로 진화된 TIR)은 그 다음 더 큰 발효 규모에서 세르톨리주맙 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해 β-락타마제가 없는 플라스미드로 백-엔지니어링(back-engineered)되었다.
상기 기재된 합성적 진화 방법을 사용하여 생성된 TIR의 구체적인 예시는 본 발명에서 TIR-LC로 지칭되며 서열 번호 20을 가지며, 이 TIR-LC는 세르톨리주맙의 경쇄의 발현을 조절한다. 서열 번호 20의 TIR-LC는 실시예 10에서 논의된 E111 발현 벡터에 포함된 TIR이다.
실시예 6 - DASbox® 발효기(즉, DASbox® 미니 바이오리액터 시스템)에서 발현 유도 20시간 후의 배지 분획의 웨스턴-블롯 분석.
세르톨리주맙은 하기:
i. 세르톨리주맙의 중쇄의 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 (서열 번호 19의) 야생형 PelB 신호 펩티드 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화 버전을 포함하는 D36으로 지칭되는 발현 벡터, 및
ii. E81, E82 및 E83 발현 벡터가 각각 세르톨리주맙 중쇄 발현의 조절을 담당하는 TIR(즉, 세르톨리주맙 중쇄의 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 TIR)의 합성적으로 조작된 변형을 포함한다는 점에서 D36 벡터와 상이한, 발현 벡터 E81, E82 및 E83,
를 사용함으로써 발현된다.
E83 발현 벡터에 포함된 합성적으로 조작된 TIR(세르톨리주맙 중쇄 발현의 조절)은 서열 번호 21의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. E81 및 E82 (그리고 연구되고, 개발되고, 테스트된 기타 발현 벡터)의 중쇄의 업스트림에 TIR의 뉴클레오티드 서열은 본 발명에 나타나지 않는다. 중쇄 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 TIR의 합성적 조작의 목적은 세르톨리주맙의 발현에 대한 뉴클레오티드의 치환의 효과를 테스트하는 것이다.
100 μl의 부피의 각 세르톨리주맙 함유 샘플을 14000×g에서 5분 동안 회전시킨 후, 상층액을 분리하고 H2O로 가득 채워 총 100μl가 되도록 하였다. 다음으로, 샘플에 100μl의 2×샘플 버퍼를 첨가한 후 95℃에서 5분간 끓인 후, 각 웰에 동량의 부피를 로딩하였고, 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 단백질 수준은 세르톨리주맙에 대한 항혈청으로 면역-블롯팅하여 시각화하였다. 결과는 왼쪽에서 오른쪽으로 D36, E81, E82 및 E83 발현 벡터를 나타내는 도 5에 도시하였다.
도 5의 웨스턴-블롯에 도시된 대로, E83 발현 벡터는 배지 분획에서 최고 수준의 세르톨리주맙(도에서 단편 항체 Fab'로 표시됨)을 생성하였다. 또한 샘플에서는 Fab' 이량체와 유리 경쇄(LC) 및 중쇄(HC)의 징후가 존재하였다.
실시예 7 - DASbox® 발효기에서 발현 유도 20시간 후 총(배지 및 세포) 분획의 웨스턴-블롯 분석
세르톨리주맙은 D36, E81, E82, E83 발현 벡터를 사용하여 발현되었다.
5μl 부피의 각 샘플을 100μl의 2×샘플 버퍼에 첨가한 후, 95℃에서 5분간 끓인 후, 각 웰에 동량의 부피를 로딩하였고, 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 단백질 수준은 세르톨리주맙에 대한 항혈청으로 면역-블롯팅하여 시각화하였다. 결과는 왼쪽에서 오른쪽으로 D36, E81, E82 및 E83 발현 벡터를 나타내는 도 6에 도시하였다.
도 6의 웨스턴-블롯에 도시된 바와 같이, E83 발현 벡터(세르톨리주맙 중쇄 발현의 조절을 위해 합성적으로 진화된 TIR로 구성됨)는 도면에서 단편 항체 Fab'로 나타낸 바와 같이 최고 수준의 세르톨리주맙을 생성하였다.
실시예 8 - NanoDrop® 및 KTA 크로마토그래피
세르톨리주맙은 (i) 진화되지 않은 TIR 및 세르톨리주맙의 경쇄 및 중쇄에 대한 각 뉴클레오티드 서열 업스트림에 PelB 신호 펩티드에 대해 야생형 뉴클레오티드 서열을 갖는 D37 발현 벡터, 및 (ⅱ) 세르톨리주맙 중쇄 발현의 조절을 위해 합성적으로 조작된 TIR을 포함하는 발현 벡터 E83를 사용함으로써, XB17 숙주 세포 (E. coli W3110 rhaBfs)를 사용하여 발현시켰다.
DASbox® 발효기에서 20시간 동안 발현시킨 후, 발현 시스템 XB102 및 XB62로부터 냉동된 정화된 용해물을 사용하여 세르톨리주맙 정제 실행을 수행하였다. 상기 정화된 용해물은 (1) 약 800-900 Bar에서 3회 계대(passage) 동안 균질화시켰고, (2) 원심분리하였고, (3) 0.45 PES(폴리에테르술폰) 필터로 상등액을 여과함으로써 제조되었다. 보다 구체적으로, 9.5mL의 정화된 용해물을 각 정제 실행을 위해 KTA 크로마토그래피 시스템에 결합된 CaptureSelect™ CH1-XL 컬럼(CH1 도메인에 대한 선택성을 갖는 친화성 수지) 상에 로딩하였으며, 조립된 세르톨리주맙의 대부분을 함유하는, 28mL의 용리 상을 각각의 실행에서 수집하였다.
수집된 용리 풀(elution pool)에서의 단백질 농도는 흡광 계수를 1.6으로 설정하고, 280 nm 파장에서 NanoDrop® 마이크로볼륨 UV-VIS 분광 광도계를 사용함으로써 측정하였다(결과는 도 7의 "Nanodrop" 컬럼 참조). 그 다음, 용리 풀에 있는 단백질의 총량은 28 mL 용리액에 측정된 농도를 곱하여 계산할 수 있다. 그 다음 수집된 용리 풀의 단백질 총량을 컬럼 상에 로딩된 샘플의 부피로 나누어, 정화된 용해물의 수율 목표 단백질을 계산하였고, 이것을 2개의 배치 사이에서 비교하였다.
또한, 흡광 계수를 1.6으로 설정한 Unicorn 내부 평가 소프트웨어(KTA 시스템)를 사용하여 전체 용리 상 및 스트립 상(strip phase)에 걸쳐 단백질 양을 계산함으로써 2개의 수행을 또한 평가하였다(결과는 도 7의 "KTA" 컬럼 참조). 역가 값은 수율 값의 2/3이고, 이것은 컬럼 상에서 정제하기 전 정화 과정에서 손실되는 수확물 내 세포 덩어리의 부피 때문이다.
도 7에 요약된 NanoDrop® 및 KTA 분석 양자의 결과는 합성적으로 조작된 TIR(세르톨리주맙 중쇄 발현 조절)을 포함하는 발현 벡터 E83을 포함하는 발현 시스템 XB102가 세르톨리주맙의 최고 수율 및 역가를 초래한다는 것을 명확하게 나타낸다(세르톨리주맙 중쇄 발현의 조절을 위해 합성적으로 조작된 TIR이 결여된 발현 벡터 D37과 비교하는 경우).
실시예 9 - 숙주 세포 XB17 및 XB166에서의 세르톨리주맙 발현의 비교
세르톨리주맙 발현 수준은 하기의 숙주 세포에서 E83 발현 벡터(세르톨리주맙 중쇄 발현 조절을 위해 합성적으로 조작된 TIR을 포함)를 사용할 때 분석되었다:
- XB17 (E. coli W3110 rhaBfs), 및
- XB166 (E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R).
DASbox® 발효기에서 20시간 동안 발현을 유도한 후, 샘플 1ml를 4℃에서 20분간 13500 rpm으로 원심분리하였다. 펠렛과 배지 분획을 분리시켰고, 펠렛을 0.5ml의 100mM Tris HCl/10mM EDTA, pH 7.4로 재현탁시켰다. 다음으로, 재현탁액을 완전히 와동시킨 후 60℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 펠렛 샘플을 4℃에서 20분 동안 13500 rpm으로 원심분리하여 정화한 후, 상층액(추출된 주변 세포질 샘플)을 수집하였고, DNase(최종 농도 0.02 mg/ml)로 처리하였다. 샘플은 저-단백질 결합 주사기 필터(0.2 μm, Spartan 13, GE Healthcare)를 사용하여 여과시켰다. 주변 세포질 추출 후, 샘플을 14000×g에서 5분 동안 원심분리시킨 후, 상층액 20 μl를 친화성 컬럼(CH1-XL) - HPLC를 사용하여 직접 분석하였다. 단백질 농도는 알려진 농도를 갖는 정제된 세르톨리주맙을 사용하여 표준 곡선과 비교하였다.
도 8에 도시된 결과는 XB166 숙주 세포의 사용이 숙주 세포 XB17에서의 발현과 비교할 때 세르톨리주맙의 상대적 수율을 더 높인다는 것을 나타낸다.
실시예 10 - E83 및 E111 발현 벡터를 사용한 숙주 세포 XB166에서의 세르톨리주맙 발현의 비교
E83 발현 벡터의 상기 기재된 유리한 효과로 인해(실시예 6 내지 9 참조), E83 발현 벡터를 주형으로 사용하여 경쇄 TIR을 합성적으로 진화시켰다(실시예 5에 기재된 일반적인 방법에 따름). 최고의 기술을 갖춘 생성된 벡터는 서열 번호 20(TIR-LC)을 갖는 경쇄의 업스트림에 합성적으로 진화된 TIR로 구성되었다. 상기 벡터는 본 발명에서 E111로 지칭된다.
즉, E111 발현 벡터는 하기:
- 세르톨리주맙의 경쇄의 발현 조절을 위한 서열 번호 20의 합성적으로 진화된 TIR(TIR-LC); 및
- 세르톨리주맙의 중쇄의 발현 조절을 위한 서열 번호 21의 합성적으로 조작된 TIR(TIR-HC);
를 포함한다.
이 실시예는 실시예 9와 유사하지만 하기:
- E83 발현 벡터(세르톨리주맙의 중쇄 만을 조절하기 위해 서열 번호 21의 합성적으로 조작된 TIR을 가짐)를 포함하는 XB166 숙주 세포로서, 여기서 숙주 세포와 벡터의 조합은 도 9에서 XB174로 지칭되는, XB166 숙주 세포; 및
- 세르톨리주맙의 경쇄 및 중쇄의 발현 조절을 위해 각각 서열 번호 20 및 서열 번호 21의 합성적으로 구성된 TIR을 갖는 발현 벡터 E111을 포함하는 XB166 숙주 세포;
사이에서 세르톨리주맙 발현의 차이를 대신 비교했다는 점에서 상이하다.
도 9에 도시된 결과는 발현 벡터 E111의 사용이 E83과 비교했을 경우, 세르톨리주맙의 상대적인 수율이 더 높다는 것을 나타낸다. 다시 말해서, E111 발현 벡터는 하기:
- 중쇄의 조절을 위해 합성적으로 조작된 TIR; 및
- 경쇄의 조절을 위해 합성적으로 진화된 TIR,
를 포함하고, 경쇄 발현의 조절을 위해 합성적으로 진화된 TIR이 없는 E83과 비교할 경우, 세르톨리주맙의 수율이 더 높다.
[참고 문헌]
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Claims (100)
- 재조합 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구조체(DNA construct)로서, 여기서 DNA 구조체가:
- 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나―여기서 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열은 TIR 서열임―; 및
- 신호 펩티드를 인코딩(encodes)하는 뉴클레오티드 서열;
을 포함하며,
여기서 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열이 상기 신호 펩티드를 인코딩하는 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드를 포함하는, DNA 구조체. - 청구항 1에 있어서, TIR 서열이 mRNA 전사체(mRNA transcript)에서 단백질 번역 개시 부위(protein translation initiation site)로서 기능하는 RNA 모티프(RNA motif)로 전사되는, DNA 구조체.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, DNA 구조체가 서열 번호 20의 뉴클레오티드 서열의 TIR을 포함하는 경우, 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, DNA 구조체가 서열 번호 21의 뉴클레오티드 서열의 TIR을 포함하는 경우, 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 19의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, DNA 구조체가 서열 번호 20 및 서열 번호 21의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 DNA 구조체가 신호 펩티드를 인코딩하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 신호 펩티드를 인코딩하는 두번째 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 19의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 서열 번호 20의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 18의 뉴클레오티드 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드를 포함하고, 서열 번호 21의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 19의 뉴클레오티드 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드를 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, DNA 구조체가 상기 재조합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 재조합 단백질이 바람직하게는 항체이고, 여기서 상기 항체가 가장 바람직하게는 단일클론 항체(monoclonal antibody), 다클론 항체(polyclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody) 또는 상기 항체 중 임의의 단편(fragment)인, DNA 구조체.
- 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 재조합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되는(operably linked), DNA 구조체.
- 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이:
- 항체의 경쇄(light chain)를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열; 및
- 항체의 중쇄(heavy chain)를 인코딩하는 두번째 핵산 서열;
을 포함하는, DNA 구조체. - 청구항 8에 있어서, 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이:
- 항체의 경쇄를 인코딩하는 첫번째 뉴클레오티드 서열; 및/또는
- 항체의 중쇄를 인코딩하는 두번째 뉴클레오티드 서열;
에 작동 가능하게 연결되는, DNA 구조체. - 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, DNA 구조체가 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 샤인-달가르노 서열이 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 ATG 개시 코돈으로부터 업스트림(upstream)에 위치하고, 더욱 바람직하게는 상기 샤인-달가르노 서열이 항체의 경쇄에 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 ATG 개시 코돈으로부터 업스트림에 위치하는, DNA 구조체.
- 청구항 8 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 경쇄를 인코딩하는 첫번째 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 3의 아미노산 서열을 인코딩하는, DNA 구조체.
- 청구항 8 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄를 인코딩하는 두번째 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 4의 아미노산 서열을 인코딩하는, DNA 구조체.
- 청구항 8 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 각각 인코딩하는 첫번째 뉴클레오티드 서열 및 두번째 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 인코딩하는, DNA 구조체.
- 청구항 8 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 경쇄를 인코딩하는 첫번째 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 8 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄를 인코딩하는 두번째 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 8 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 각각 인코딩하는 첫번째 뉴클레오티드 서열 및 두번째 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 발현 벡터(expression vector).
- 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체를 포함하거나 또는 청구항 17에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포(host cell)로서, 여기서 상기 숙주 세포가 박테리아 세포이고, 더욱 바람직하게는 대장균(Escherichia coli: E. coli)이고, 가장 바람직하게는 람노스 대사(rhamnose metabolism)에 장애를 입히는(disables) 돌연변이 또는 변형(modification)을 포함하는 염색체를 포함하는 E. coli인, 숙주 세포.
- 청구항 18에 있어서, 상기 숙주 세포가 (i) RhaB를 불활성화시키는, rhaB 유전자의 뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이를 포함하는 염색체, 또는 (ⅱ) RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 결실된(deleted) 염색체를 포함하는, 숙주 세포.
- 청구항 18 또는 청구항 19에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli W3110이고, 바람직하게는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이(frame shift-mutation)를 포함하는 염색체를 포함하는, 숙주 세포.
- 청구항 18 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 하기:
a. RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이;
b. degP 결실;
c. prc 결실; 및
d. sprW148R 돌연변이;
를 포함하는 염색체를 포함하는, 숙주 세포. - 청구항 18 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R인, 숙주 세포.
- 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체에 의해 발현된 RNA.
- 청구항 18 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 사용을 포함하는 재조합 단백질을 발현시키는 방법.
- 청구항 24에 있어서, 숙주 세포로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계를 더 포함하고; 바람직하게는 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의해, 회수된 재조합 단백질을 정제하는 하나 이상의 단계를 선택적으로 더 포함하는, 방법.
- 청구항 24 또는 청구항 25에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 재조합 단백질.
- 숙주 세포에서 세르톨리주맙(Certolizumab)을 발현시키기 위한 DNA 구조체로서,
여기서 세르톨리주맙이 (i) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 (ⅱ) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고,
상기 DNA 구조체는 세르톨리주맙을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 DNA 구조체는 세르톨리주맙의 경쇄 및/또는 세르톨리주맙의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 더 포함하며,
상기 DNA 구조체는 하기:
- rhaBAD 프로모터(promoter),
- RhaR 전사 활성인자(transcription activator),
- RhaS 전사 활성인자,
- 항생제 내성 마커(antibiotic resistance marker),
- 적어도 하나의 터미네이터(terminator), 및
- 복제 기점(origin of replication),
을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는, DNA 구조체. - 청구항 27에 있어서, 상기 DNA 구조체는 항생제 내성 마커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 28에 있어서, 상기 적어도 하나의 터미네이터가 2개의 터미네이터를 포함하고, 바람직하게는 상기 터미네이터는 rrnB T1 터미네이터 및 rrnB T2 터미네이터를 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 29에 있어서, 상기 복제 기점이 pMB1 복제 기점을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 30에 있어서,
- 항생제 내성 마커가 카나마이신(kanamycin) 내성 마커, 바람직하게 서열 번호 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 카나마이신 내성 마커이며;
- 항생제 내성 마커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터가 AmpR 프로모터, 바람직하게는 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 AmpR 프로모터이며;
- rrnB T1 터미네이터가 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며;
- rrnB T2 터미네이터가 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 그리고/또는
- pMB1 복제 기점이 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인, DNA 구조체. - 청구항 31에 있어서,
- 항생제 내성 마커가 서열 번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 카나마이신 내성 마커이며;
- 항생제 내성 마커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터가 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AmpR 프로모터이며;
- rrnB T1 터미네이터가 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- rrnB T2 터미네이터가 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 그리고/또는
- pMB1 복제 기점이 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, DNA 구조체. - 청구항 31 또는 청구항 32에 있어서,
- rhaBAD 프로모터가 서열 번호 8의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열, 바람직하게는 서열 번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- RhaR 전사 활성인자가 서열 번호 9의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열, 바람직하게는 서열 번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- RhaS 전사 활성인자가 서열 번호 11의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열, 바람직하게는 서열 번호 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- 항생제 내성 마커가 서열 번호 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열, 바람직하게는 서열 번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 카나마이신 내성 마커이며;
- AmpR 프로모터가 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열, 바람직하게는 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- rrnB T1 터미네이터가 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열, 바람직하게는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
- rrnB T2 터미네이터가 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열, 바람직하게는 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
- pMB1 복제 기점이 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열, 바람직하게는 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, DNA 구조체. - 청구항 27 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 rhaBAD 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, DNA 구조체.
- 청구항 27 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서, 세르톨리주맙을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열 번호 5의 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세르톨리주맙의 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 (ⅱ) 서열 번호 6의 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 세르톨리주맙의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 27 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서, 세르톨리주맙을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 (i) 서열 번호 5의 서열을 포함하는 세르톨리주맙의 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 (ⅱ) 서열 번호 6의 서열을 포함하는 세르톨리주맙의 중쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 36에 있어서, 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 양자 모두에 전사 방향으로 작동 가능하게 연결되는, DNA 구조체.
- 청구항 27 내지 청구항 37 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드가 MalE, OmpA, PhoA, DsbA 및 Pelb로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 신호 펩티드는 PelB인, DNA 구조체.
- 청구항 27 내지 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서, DNA 구조체가 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하고, 여기서 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열은 TIR 서열이고, 여기서 서열 번호 20 및 21의 뉴클레오티드 서열이 상기 신호 펩티드를 인코딩하는 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드를 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 27 내지 청구항 39 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드가 PelB이고, 여기서 경쇄에 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 18의 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 40에 있어서, 경쇄에 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 18의 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 40 또는 청구항 41에 있어서, DNA 구조체가 서열 번호 20의 뉴클레오티드 서열의 TIR을 포함하고, 여기서 서열 번호 20의 뉴클레오티드 서열은 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 서열 번호 18의 뉴클레오티드 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드를 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 27 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드가 PelB이고, 여기서 중쇄에 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 19의 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 43에 있어서, 중쇄에 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 19의 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 43 또는 청구항 44에 있어서, DNA 구조체가 서열 번호 21의 뉴클레오티드 서열의 TIR을 포함하고, 여기서 서열 번호 21의 뉴클레오티드 서열은 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 서열 번호 19의 뉴클레오티드 서열의 적어도 첫번째 9개의 뉴클레오티드를 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 27 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 구조체가 서열 번호 17의 서열 또는 그것과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열 번호 17의 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 27 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 발현 벡터.
- 청구항 27 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체, 또는 청구항 47에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 여기서 상기 숙주 세포가 박테리아 숙주 세포이고, 바람직하게는 대장균(E. coli)이고, 가장 바람직하게는 람노스 대사에 장애를 입히는 돌연변이 또는 변형을 포함하는 염색체를 포함하는 E. coli인, 숙주 세포.
- 청구항 48에 있어서, 상기 숙주 세포가 (i) RhaB를 불활성화시키는, rhaB 유전자의 뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이를 포함하는 염색체, 또는 (ⅱ) RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 결실된 염색체를 포함하는, 숙주 세포.
- 청구항 48 또는 청구항 49에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli W3110 세포이고, 바람직하게는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이를 포함하는 염색체를 포함하는, 숙주 세포.
- 청구항 22 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 하기:
a. RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이;
b. degP 결실;
c. prc 결실; 및
d. sprW148R 돌연변이;
를 포함하는 염색체를 포함하는, 숙주 세포. - 청구항 22 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R인, 숙주 세포.
- 청구항 27 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체에 의해 발현되는 RNA.
- 청구항 48 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 사용을 포함하는 세르톨리주맙을 발현시키는 방법.
- 청구항 54에 있어서, 숙주 세포로부터 세르톨리주맙을 회수하는 단계를 더 포함하고; 바람직하게는 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의해, 회수된 세르톨리주맙을 정제하는 하나 이상의 단계를 선택적으로 더 포함하는, 방법.
- 청구항 54 또는 청구항 55에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 세르톨리주맙.
- 청구항 54 또는 청구항 55에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 세르톨리주맙 바이오시밀러(biosimilar).
- 약제(medicament)로서 사용하기 위한, 청구항 57에 따른 세르톨리주맙 바이오시밀러 또는 이의 유도체로서, 바람직하게는 유도체가 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(moiety)를 포함하고, 더욱 바람직하게는 유도체가 약 40 kDa의 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는, 세르톨리주맙 바이오시밀러.
- 크론병(Crohn's disease), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis) 및 강직성 척추염(ankylosing spondylitis)의 치료에 사용하기 위한 청구항 58에 따른 세르톨리주맙 바이오시밀러.
- 신호 펩티드를 발현시키기 위한 DNA 구조체로서, 여기서 DNA 구조체가 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 PelB 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 18 및 19의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 60에 있어서, DNA 구조체가 서열 번호 18 및 19의 뉴클레오티드 서열 양자 모두를 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 60에 있어서, DNA 구조체가 서열 번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 60에 있어서, DNA 구조체가 서열 번호 19의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 60 내지 청구항 63 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 발현 벡터.
- 청구항 64에 따른 발현 벡터의 청구항 60 내지 청구항 63 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포로서, 여기서 상기 숙주 세포가 바람직하게는 박테리아 세포이고, 더욱 바람직하게는 대장균(E. coli)이고, 가장 바람직하게는 람노스 대사에 장애를 입히는 돌연변이 또는 변형을 포함하는 염색체를 포함하는 E. coli인, 숙주 세포.
- 청구항 65에 있어서, 상기 숙주 세포가 (i) RhaB를 불활성화시키는, rhaB 유전자의 뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이를 포함하는 염색체, 또는 (ⅱ) RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 결실된 염색체를 포함하는, 숙주 세포.
- 청구항 65 또는 청구항 66에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli W3110이고, 바람직하게는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이를 포함하는 염색체를 포함하는, 숙주 세포.
- 청구항 65 내지 청구항 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 하기:
a. RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이;
b. degP 결실;
c. prc 결실; 및
d. sprW148R 돌연변이;
를 포함하는 염색체를 포함하는, 숙주 세포. - 청구항 65 내지 청구항 68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R인, 숙주 세포.
- 청구항 60 내지 청구항 63 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체에 의해 발현되는 RNA.
- 청구항 65 내지 청구항 69 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 사용을 포함하는 신호 펩티드를 발현시키는 방법.
- 청구항 71에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 PelB 신호 펩티드로서, 여기서 PelB 신호 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, PelB 신호 펩티드.
- 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구조체로서, 여기서 아미노산 서열이:
a. 세르톨리주맙에 대한 아미노산 서열;
b. 세르톨리주맙의 경쇄 아미노산 서열의 N-말단에 융합된(fused) 서열 번호 7의 아미노산 서열의 첫번째 신호 펩티드; 및
c. 세르톨리주맙의 중쇄 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 서열 번호 7의 아미노산 서열의 두번째 신호 펩티드;
를 포함하는, DNA 구조체. - 청구항 73에 있어서, 상기 첫번째 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 73에 있어서, 상기 두번째 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 19의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 구조체.
- 청구항 73 내지 청구항 75 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 발현 벡터.
- 청구항 73 내지 청구항 75 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체 또는 청구항 76에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 여기서 상기 숙주 세포가 바람직하게는 박테리아 세포이고, 더욱 바람직하게는 대장균(E. coli)이고, 가장 바람직하게는 람노스 대사에 장애를 입히는 돌연변이 또는 변형을 포함하는 염색체를 포함하는 E. coli인, 숙주 세포.
- 청구항 77에 있어서, 상기 숙주 세포가 (i) RhaB를 불활성화시키는, rhaB 유전자의 뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이를 포함하는 염색체, 또는 (ⅱ) RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 결실된 염색체를 포함하는, 숙주 세포.
- 청구항 77 또는 청구항 78에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli W3110이고, 바람직하게는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이를 포함하는 염색체를 포함하는, 숙주 세포.
- 청구항 77 내지 청구항 79 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 하기:
a. RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이;
b. degP 결실;
c. prc 결실; 및
d. sprW148R 돌연변이;
를 포함하는 염색체를 포함하는, 숙주 세포. - 청구항 77 내지 청구항 80 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R인, 숙주 세포.
- 청구항 73 내지 청구항 75 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체에 의해 발현된 RNA.
- 청구항 77 내지 청구항 81 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 사용을 포함하는 재조합 단백질을 발현시키는 방법.
- 청구항 83에 있어서, 박테리아 숙주 세포로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계를 더 포함하고; 바람직하게는 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의해, 회수된 재조합 단백질을 정제하는 하나 이상의 단계를 선택적으로 더 포함하는, 방법.
- 청구항 83 또는 청구항 84에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 세르톨리주맙.
- 청구항 83 또는 청구항 84에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 세르톨리주맙 바이오시밀러.
- 약제로서 사용하기 위한, 청구항 86에 따른 세르톨리주맙 바이오시밀러 또는 이의 유도체로서, 바람직하게는 유도체가 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하고, 더욱 바람직하게는 유도체가 약 40 kDa의 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는, 세르톨리주맙 바이오시밀러.
- 크론병, 류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염의 치료에 사용하기 위한 청구항 86 또는 청구항 87에 따른 세르톨리주맙 바이오시밀러.
- 재조합 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포로서, 여기서 숙주 세포가:
a. 람노스 대사에 장애를 입히는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이;
b. (i) DegP 프로테아제의 발현 및/또는 (ⅱ) DegP 프로테아제의 활성에 장애를 입히는 degP 유전자에서의 돌연변이;
c. (i) Prc 프로테아제의 발현 및/또는 (ⅱ) Prc 프로테아제의 활성에 장애를 입히는 prc 유전자에서의 돌연변이; 및
d. spr 유전자에서의 돌연변이;
를 포함하는 염색체를 특징으로 하는, 숙주 세포. - 청구항 89에 있어서, 돌연변이가 프레임시프트, 결실, 치환(substitution) 및 삽입(insertion)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 숙주 세포.
- 청구항 89 또는 청구항 90에 있어서, 람노스 대사에 장애를 입히는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 상기 돌연변이가 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이인, 숙주 세포.
- 청구항 89 내지 청구항 91 중 어느 한 항에 있어서, degP 유전자에서의 상기 돌연변이가 degP 결실인, 숙주 세포.
- 청구항 89 내지 청구항 92 중 어느 한 항에 있어서, prc 유전자에서의 상기 돌연변이가 prc 결실인, 숙주 세포.
- 청구항 89 내지 청구항 93 중 어느 한 항에 있어서, spr 유전자에서의 상기 돌연변이가, spr 유전자에서의 치환으로 인해 148의 위치에서 트립토판이 아르기닌으로 바뀌는 것을 특징으로 하는 sprW148R 돌연변이인, 숙주 세포.
- 청구항 89 내지 청구항 94 중 어느 한 항에 있어서,
a. 람노스 대사에 장애를 입히는 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이가 RhaB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에서의 프레임 시프트-돌연변이인 것;
b. degP 결실;
c. prc 결실; 및
d. sprW148R 돌연변이;
를 포함하는, 숙주 세포. - 청구항 89 내지 청구항 95 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 박테리아 세포, 더욱 바람직하게는 대장균(E. coli), 가장 바람직하게는 E. coli W3110인, 숙주 세포.
- 청구항 89 내지 청구항 96 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli W3110 rhaBfs ΔDegP Δprc sprW148R인, 숙주 세포.
- 청구항 89 내지 청구항 97 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 구조체로 형질전환(transformed)되고, 여기서 상기 재조합 단백질이 바람직하게는 항체이고, 여기서 상기 항체가 가장 바람직하게는 단일클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체 또는 상기 항체의 단편인, 숙주 세포.
- 재조합 단백질을 발현시키는 방법으로서, 다음 단계:
- 청구항 89 내지 청구항 98 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA 구조체로 형질전환시키는 단계;
- 생성된 형질전환된 숙주 세포를 람노스에 노출시켜, 그에 의해 상기 재조합 단백질의 발현을 유도하는 단계; 및
- 숙주 세포로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계로서; 바람직하게는 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의해, 회수된 재조합 단백질을 정제하는 하나 이상의 단계를 선택적으로 더 포함하는, 단계;
를 포함하는, 방법. - 청구항 99에 있어서, 상기 재조합 단백질이 항체이고, 여기서 상기 항체가 바람직하게는 단일클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체 또는 상기 항체의 단편이고, 더욱 바람직하게는 Fab' 단편이고, 가장 바람직하게는 세르톨리주맙인, 방법.
Applications Claiming Priority (6)
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