KR20240099138A - 항-cd161 항체 및 그의 용도 - Google Patents

항-cd161 항체 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20240099138A
KR20240099138A KR1020247009143A KR20247009143A KR20240099138A KR 20240099138 A KR20240099138 A KR 20240099138A KR 1020247009143 A KR1020247009143 A KR 1020247009143A KR 20247009143 A KR20247009143 A KR 20247009143A KR 20240099138 A KR20240099138 A KR 20240099138A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
sequence
cdr
antibody
isolated anti
Prior art date
Application number
KR1020247009143A
Other languages
English (en)
Inventor
앨리슨 티스데일
울리 비알루차
조지 푼코스디
알렉산드리아 푸스코
프라노 어바인
에밀리 로젠트레이터
엘리자베스 스캔론
마이클 배틀스
Original Assignee
이뮤니타스 테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이뮤니타스 테라퓨틱스, 인크. filed Critical 이뮤니타스 테라퓨틱스, 인크.
Publication of KR20240099138A publication Critical patent/KR20240099138A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 일반적으로 항-CD161 항체, 이러한 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 CD161과 연관되거나 또는 그에 의해 매개되는 장애, 예를 들어 특정 암을 치료하기 위해 이러한 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 또한 이들 항체를 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.

Description

항-CD161 항체 및 그의 용도
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 2021년 8월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/236,122호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
<서열 목록>
본 출원은 XML 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유한다. 서열 목록 XML은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2022년 8월 11일에 생성된 XML 파일은 IMT-001WO_SL.xml로 명명되고, 크기는 206,992 바이트이다.
<기술분야>
본 발명은 일반적으로 항-CD161 항체, 이들 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 CD161과 연관되거나 그에 의해 매개되는 장애, 예를 들어 특정 암을 치료하기 위해 이들 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 또한 이들 항체를 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.
항체-지정 치료 접근법을 통한 면역 세포 체크포인트 수용체의 조정은 지난 10년에 걸쳐 관심을 얻고 있다. 이들 수용체 중 다수는 T 세포 체크포인트 조정에 수반된다. 그러나, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 골수 세포 체크포인트 조정이 특히 매우 바람직하고, 주목받고 있다. NK 세포는 광범위한 표적 세포, 예컨대 종양 세포 또는 바이러스 감염된 세포를 인식하고 그에 대한 세포독성을 유도하는 선천성 면역의 일부이다. 활성화된 NK 세포는 전형적으로 세포독성 T 세포와 유사한 수단에 의해, 즉 퍼포린 및 그랜자임을 함유하는 세포용해 과립을 통해 뿐만 아니라 사멸 수용체 경로를 통해 표적 세포를 사멸시킨다. 활성화된 NK 세포는 또한 표적 조직으로의 다른 백혈구의 동원을 촉진하는 염증성 시토카인, 예컨대 IFN-γ 및 케모카인을 분비한다.
NK 세포 수용체 (NKR)는 2가지 주요 구조적 부류로 분류된다: 이뮤노글로불린 및 C-유형 렉틴-유사 (CLR) 슈퍼패밀리. NKR-단백질1 (NKR-P1) (예를 들어, CD161)은 중요한 면역-조절 유전자이며 비장 수지상 세포, T 세포의 하위세트 및 과립구를 포함한 다양한 세포 유형 상에서 발현되는 CLR 막횡단 분자의 패밀리이다. 렉틴-유사 전사체 1 (LLT1), C-유형 렉틴 도메인 패밀리 2 구성원 D (CLEC2D) 또는 파골세포 억제 렉틴 (OCIL) 분자는 CD161 수용체에 대한 동족 리간드이고, 이러한 상호작용은 NK 세포 및 T 세포 기능을 억제한다. CLEC2D의 6종의 스플라이스 변이체가 존재하며, 이소형 1은 NK 세포, T 세포, 단핵구/대식세포, 활성화된 B 세포 및 수지상 세포 상에서 발현되고 인간 NK 세포 활성화 수용체로서 기능하는 정규 서열이다. CLEC2D의 폴리펩티드 쇄는 N-말단 세포질 도메인, 막횡단 도메인, 자루 영역, 및 2개의 예측된 N-글리코실화 부위를 갖는 C-말단 CLR 엑토도메인을 포함하는 다중 도메인을 함유한다.
CLEC2D와 CD161 사이의 상호작용은 대상체의 면역계를 회피하는 특정 암을 비롯한 특정 장애를 유발할 수 있다. 이러한 면역 회피 또는 탈출은 인간 교모세포종 및 다른 질환에서 보고되었다. 더욱이, 배 중심 B 세포 상에서의 CLEC2D 발현은 NK 세포와 항원 제시 세포 (APC) 사이의 교차-대화를 조절하는 것으로 생각된다. 따라서, CLEC2D-CD161 상호작용을 차단하는 것은 다양한 암을 치료하기 위한 새로운 치료 옵션을 제공한다.
CLEC2D-CD161 상호작용의 하류 세포내 신호전달이 잘 규정되지 않았지만, CLEC2D와 CD161 사이의 상호작용은 NK 및 T 세포 기능 둘 다를 억제하는 것으로 나타났다. 특정 암을 치료하는 데 있어서 이루어진 진전에도 불구하고, 특정 암, 특히 면역계를 회피하는 암을 치료하기 위한 신규하고 혁신적인 요법에 대한 필요가 여전히 남아있다.
본 발명은, 부분적으로, 특히 특정 암이 대상체의 면역계를 회피하는 것을 방지하는 데 사용될 수 있는 CLEC2D-CD161 상호작용을 파괴하는 고친화도 항-CD161 항체의 발견에 기초한다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 경쇄 가변 영역; 및 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-CD161 항체를 제공하고, 여기서 (a) CDR-H1 서열은 FX1FX2X3X4AMS (서열식별번호: 1)이고; (b) CDR-H2 서열은 AISX5X6GGX7TX8YADSVKG (서열식별번호: 2)이고; (c) CDR-H3 서열은 AKPLDSSX9WADFX10X11 (서열식별번호: 3)이고; 여기서 X1은 T 또는 A이고; X2는 G, S 또는 E이고; X3은 Q, T, P 또는 R이고; X4는 Y 또는 F이고; X5는 A 또는 G이고; X6은 A, V 또는 S이고; X7은 T 또는 S이고; X8은 K, A 또는 Y이고; X9는 Q, F 또는 L이고; X10은 D 또는 Q이고; X11은 L 또는 A이다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함하고, 여기서 (d) CDR-L1 서열은 RASQX12IX13SWLA (서열식별번호: 4)이고; (e) CDR-L2 서열은 X14ASX15LQX16(서열식별번호: 5)이고; (f) CDR-L3 서열은 QQX17X18X19LPIT (서열식별번호: 6)이고; 여기서 X12는 G, D, 또는 T이고; X13은 D, S, 또는 Y이고; X14는 A, Y, 또는 F이고; X15는 S, A, G, 또는 F이고; X16은 D 또는 S이고; X17은 A, H, 또는 Q이고; X18은 S, D, W, 또는 L이고; X19는 V, D, Y, 또는 K이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 8이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 9이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 10이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 12이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 13이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 14이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 16이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 17이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 18이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 20이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 21이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 22이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 24이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 25이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 26이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 28이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 29이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 30이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 32이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 33이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 34이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 36이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 37이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 38이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 40이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 41이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 42이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 44이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 45이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 46이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 48이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 49이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 50이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 52이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 53이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 54이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 56이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 57이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 58이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 60이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 61이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 62이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 64이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 65이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 66이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 68이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 69이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 70이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 72이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 73이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 74이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 76이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 77이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 78이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 80이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 81이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 82이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 84이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 85이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 86이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 88이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 89이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 90이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 92이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 93이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 94이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 가변 영역이 아미노산 서열: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFX1FX2X3X4AMSWVRQAPGKGLEWVSAISX5X6GGX7TX8YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPLDSSX9WADFX10X11WGRGTLVTVSS (서열식별번호: 188)를 포함하고, 여기서 X1은 T 또는 A이고; X2는 G, S, 또는 E이고; X3은 Q, T, P, 또는 R이고; X4는 Y 또는 F이고; X5는 A 또는 G이고; X6은 A, V, 또는 S이고; X7은 T 또는 S이고; X8은 K, A, 또는 Y이고; X9는 Q, F, 또는 L이고; X10은 D 또는 Q이고; X11은 L 또는 A인 단리된 항-CD161 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 79 및 서열식별번호: 87로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 79 및 서열식별번호: 87로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 경쇄 가변 영역이 아미노산 서열: DIQXaTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQX12IX13SWLAWYQQKPGKAPKXbLIYX14ASX15LQX16GVPSRFSGSGSGTDFTLTIXcSLQPEDFATYYCQQX17X18X19LPITFGGGTKVEIK (서열식별번호: 189)를 포함하고, 여기서 X12는 G, D, 또는 T이고; X13은 D, S, 또는 Y이고; X14는 A, Y, 또는 F이고; X15는 S, A, G, 또는 F이고; X16은 D 또는 S이고; X17은 A, H, 또는 Q이고; X18은 S, D, W, 또는 L이고; X19는 V, D, Y, 또는 K이고; Xa는 M 또는 L이고; Xb는 L 또는 F이고; Xc는 S 또는 N인 단리된 항-CD161 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 83, 및 서열식별번호: 91로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 83, 및 서열식별번호: 91로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 7의 서열에 대해 90% 이상 동일한 (예를 들어, 95% 이상 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 11의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 7의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 11의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 15의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 19의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 15의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 19의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 23의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 27의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 23의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 27의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 31의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 35의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 31의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 35의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 39의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 43의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 39의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 43의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 47의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 51의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 47의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 51의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 55의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 59의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 55의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 59의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 63의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 67의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 63의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 67의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 71의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 75의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 71의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 75의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 79의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 83의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 79의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 83의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 87의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 91의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 87의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 91의 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 경쇄 가변 영역; 및 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 그의 단리된 항-CD161 항체를 제공하고, 여기서 (a) CDR-H1 서열은 FTFX1X2YYMS (서열식별번호: 95)이고; (b) CDR-H2 서열은 YISPSGX3TIX4YADSVKG (서열식별번호: 96)이고; (c) CDR-H3 서열은 ARSLMX5TGTHLYFDL (서열식별번호: 97)이고; 여기서: X1은 G, A, P 또는 S이고; X2는 N, Q 또는 D이고; X3은 A 또는 S이고; X4는 Y 또는 A이고; X5는 A 또는 S이다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함하고, 여기서 (a) CDR-L1 서열은 RASX6X7ISX8WLA (서열식별번호: 98)이고; (b) CDR-L2 서열은 AAX9X10LQS(서열식별번호: 99)이고; (c) CDR-L3 서열은 QQX11TSX12X13PYT (서열식별번호: 100)이고; 여기서 X6은 Q 또는 S이고; X7은 D 또는 G이고; X8은 D 또는 S이고; X9는 E 또는 S이고; X10은 S, A, G, V, 또는 E이고; X11은 A, S, 또는 V이고; X12는 F, T, V, Q, 또는 A이고; X13은 L 또는 P이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 102이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 103이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 104이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 106이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 107이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 108이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 110이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 111이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 112이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 114이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 115이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 116이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 118이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 119이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 120이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 122이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 123이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 124이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 126이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 127이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 128이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 130이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 131이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 132이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 134이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 135이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 136이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 138이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 139이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 140이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 142이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 143이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 144이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 146이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 147이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 148이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 150이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 151이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 152이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 154이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 155이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 156이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 158이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 159이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 160이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 162이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 163이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 164이다.
일부 실시양태에서, (a) CDR-H1 서열은 서열식별번호: 166이고; (b) CDR-H2 서열은 서열식별번호: 167이고; (c) CDR-H3 서열은 서열식별번호: 168이다. 일부 실시양태에서, 대안적으로 또는 추가로, (d) CDR-L1 서열은 서열식별번호: 170이고; (e) CDR-L2 서열은 서열식별번호: 171이고; (f) CDR-L3 서열은 서열식별번호: 172이다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열: QVQLVESGGGLVXaPGGSLRLSCAASGFTFX1X2YYMSWIRQAPGKGLEWVSYISPSGX3TIX4YADSVKGRFTISRDNXbKNXcLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSLMX5TGTHLYFDLWGRGTLVTVSS (서열식별번호: 190)를 포함하고, 여기서 X1은 G, A, P, 또는 S이고; X2는 N, Q, 또는 D이고; X3은 A 또는 S이고; X4는 Y 또는 A이고; X5는 A 또는 S이고; Xa는 K 또는 Q이고; Xb는 A 또는 S이고; Xc는 S 또는 T이다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 157 및 서열식별번호: 165로 이루어진 군으로부터 선택된 것에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 157 및 서열식별번호: 165로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITC RASX6X7ISX8WLAWYQQKPGKAPKLLIYAAX9X10LQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQX11TSX12X13PYTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 191), 여기서: X6은 Q 또는 S이고; X7은 D 또는 G이고; X8은 D 또는 S이고; X9는 E 또는 S이고; X10은 S, A, G, V, 또는 E이고; X11은 A, S, 또는 V이고; X12는 F, T, V, Q, 또는 A이고; X13은 L 또는 P이다.
일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 161, 및 서열식별번호: 169로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 161 및 서열식별번호: 169로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 101의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 105의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 101의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 105의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 109의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 113의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 109의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 113의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 117의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 121의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 117의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 121의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 125의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 129의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 125의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 129의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 133의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 137의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 133의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 137의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 141의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 145의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 141의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 145의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 149의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 153의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 149의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 153의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 157의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 161의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 157의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 161의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 165의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 169의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 95% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 165의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 169의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 다중특이적이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab, Fab', F(Ab')2, Fv, scFv, (scFv)2, 단일 쇄 항체 분자, 이중 가변 도메인 항체, 단일 가변 도메인 항체, 선형 항체, 또는 V 도메인 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 Fc이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 인간 Fc이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택된 부류의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 부류 IgG, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 하위부류의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 비-글리코실화 인간 IgG1 항체이다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 EU 넘버링에 따른 아미노산 위치 N297에서 변형을 갖는 IgG1 Fc 영역 (예를 들어, N297A)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 CD161에의 결합에 대해 본원에 개시된 항-CD161 항체와 경쟁하는 단리된 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 항-CD161 항체에 의해 결합되는 CD161 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 CD161에의 결합에 대해 CLEC2D와 경쟁한다.
일부 실시양태에서, 항체는 CD161에의 CLEC2D의 결합으로 인한 CD161 억제 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, CD161은 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포 또는 시노몰구스 세포이다. 일부 실시양태에서, 항체는 CD161에의 CLEC2D 결합에 의해 T 세포 또는 NK 세포 활성의 억제를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 CLEC2D의 존재 하의 T 세포 또는 NK 세포 활성을 항체의 부재하에 이러한 T 세포 또는 NK 세포 활성과 비교하여 증가시킨다. 일부 실시양태에서, T 세포 또는 NK 세포는 CLEC2D를 발현하는 세포를 포함하는 미세환경 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 항체는 CLEC2D를 발현하는 종양 세포를 함유하는 종양 미세환경에서 T 세포 또는 NK 세포 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성의 증가는 NFAT 신호전달의 증가에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 항체는 1.5 nM 내지 4.1 nM의 T 세포 활성화에 대한 EC50 값을 갖는다. 예를 들어, 항체는 약 1.5 nM, 약 1.7 nM, 약 2.0 nM, 약 2.3 nM, 약 2.5 nM, 약 2.8 nM, 약 3.1 nM, 약 3.3 nM, 약 3.5 nM, 약 3.8 nM, 약 4.1 nM의 T 세포 활성화에 대한 EC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 CLEC2D-매개 억제를 역전시키고, T 세포 활성을 회복시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 1차 항원-특이적 인간 T 세포의 다기능성을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 (i) CD161-CLEC2D 상호작용에 의해 영향을 받는 직접적 T 세포 매개 세포독성을 증진 또는 회복시키거나, (ii) TNFα의 분비를 증가시키거나, (iii) IL-2의 분비를 증가시키거나, (iv) IFNγ의 분비를 증가시키거나, 또는 (v) 특색 (i), (ii), (iii) 또는 (iv)의 임의의 조합을 나타낸다.
일부 실시양태에서, NK 세포 활성의 증가는 CD107a 발현의 증가에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 항체는 0.04 nM 내지 0.38 nM의 NK 세포 활성화에 대한 EC50 값을 갖는다. 예를 들어, 항체는 약 0.04 nM, 약 0.06 nM, 약 0.08 nM, 약 0.1 nM, 약 0.12 nM, 약 0.14 nM, 약 0.16 nM, 약 0.18 nM, 약 0.20 nM, 약 0.22 nM, 약 0.24 nM, 약 0.28 nM, 약 0.30 nM, 약 0.32 nM, 약 0.34 nM, 약 0.36 nM, 약 0.38 nM의 NK 세포 활성화에 대한 EC50 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, NK 세포 활성의 증가는 IFNγ 발현의 증가에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 항체는 0.1 nM 내지 0.5 nM의 NK 세포 활성화에 대한 EC50 값을 갖는다. 예를 들어, 항체는 약 0.1 nM, 약 0.15 nM, 약 0.2 nM, 약 0.25 nM, 약 0.3 nM, 약 0.35 nM, 약 0.4 nM, 약 0.45 nM, 약 0.5 nM의 NK 세포 활성화에 대한 EC50 값을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체는 옥테트 QK384 검정에 의해 측정 시 10 nM 이하, 0.5 nM 이하, 1 nM 이하, 0.5 nM 이하 또는 0.1 nM 이하의 Kd로 인간 CD161에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 옥테트 QK384 검정에 의해 측정 시 1x10-8 내지 1x10-10 M 범위의 Kd로 인간 CD161에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 5 nM 미만, 1 nM 미만 또는 0.5 nM 미만의 CD161 발현 HEK293 세포에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 0.1 - 0.5 nM 범위의 CD161 발현 HEK293 세포에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 세포의 표면 상에 발현된 CD161에의 CLEC2D 결합을 0.1 내지 10 nM 범위의 IC50으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 세포의 표면 상에 발현된 CD161에의 CLEC2D 결합을 10 nM 미만, 5 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만 또는 0.5 nM 미만의 IC50으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 hKLRF1, hKLRF2, hCLEC12B, hCLEC2D, 또는 그의 임의의 조합에 대해 1,000 nM 초과의 Kd를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는, 항체가 포화 항체 조건 하에 CD161에 결합되는 것과 비교하여 2% 미만, 1.5% 미만, 1.2% 미만, 1.1% 미만, 또는 1% 미만의 CD161 상동체 집단에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD161 상동체 집단은 CLEC2D, KLRF1, KLRF2, CLEC12B, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 CLEC2D 발현 세포의 NK 세포 사멸을 증진시킨다. 예를 들어, 특정 상황 하에, 항체는 CD161과 CLEC2D의 상호작용을 차단함으로써 CLEC2D 발현 세포의 NK 세포 사멸을 증진시킨다.
일부 실시양태에서, 항체는 항원-특이적 이펙터 기억 CD4 T 세포의 재활성화를 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 CD161과 CLEC2D의 상호작용을 차단함으로써 항원-특이적 이펙터 기억 CD4 T 세포의 재활성화를 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 MART-1-특이적 T 세포의 시토카인 생산을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 MART-1-특이적 T 세포의 세포독성 기능을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 시토카인 방출 증후군을 유발하지 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (a) 인간 CD161에 결합하는 특색; (b) 인간 CD161 결합 부위에서 인간 CD161에 결합하는 특색; (c) 항-CD161 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 결합되는 CD161 에피토프에 결합하는 특색; (d) CLEC2D 결합 부위에서 또는 그 근처에서 인간 CD161에 결합하는 특색; (e) CD161에의 결합에 대해 CLEC2D와 경쟁하는 특색; (f) CD161에의 CLEC2D의 결합으로 인한 CD161 억제 신호전달을 감소시키는 특색; (g) CD161에의 CLEC2D 결합에 의한 T 세포 활성의 억제를 감소시키는 특색; (h) CD161에의 CLEC2D 결합에 의한 NK 세포 활성의 억제를 감소시키는 특색; (i) CLEC2D의 존재 하의 T 세포 활성을, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 부재 하에서의 이러한 T 세포 활성과 비교하여 증가시키는 특색; (j) CLEC2D의 존재 하의 NK 세포 활성을, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 부재 하에서의 이러한 NK 세포 활성과 비교하여 증가시키는 특색; (k) CLEC2D를 발현하는 세포를 포함하는 미세환경 내에 배치된 T 세포 활성을 증가시키는 특색; (l) CLEC2D를 발현하는 세포를 포함하는 미세환경 내에 배치된 NK 세포 활성을 증가시키는 특색; (m) CLEC2D를 발현하는 종양 세포를 포함하는 종양 미세환경에서 T 세포 활성을 증가시키는 특색; (n) CLEC2D를 발현하는 종양 세포를 포함하는 종양 미세환경에서 NK 세포 활성을 증가시키는 특색; (o) 인간 T 세포 소진을 억제하는 특색; (p) 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포의 활성화를 유도하거나 증가시키는 특색; (q) 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포에 의한 시토카인 생산을 유도하거나 증가시키는 특색; (r) 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포에 의한 그랜자임 B 발현을 유도하거나 증가시키는 특색; (s) 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포의 소진을 감소시키는 특색; (t) (a)-(s)의 임의의 조합을 포함한 특색 (a)-(t) 중 적어도 하나 이상을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 CD161 및 시노몰구스 CD161에 결합하며, 여기서 인간 CD161 및 시노몰구스 CD161에 대한 항체의 결합 친화도는 5x, 10x, 20x, 50x 또는 100x 이하만큼 달라진다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 CD161 및 시노몰구스 CD161에 결합하며, 여기서 인간 CD161 및 시노몰구스 CD161에 대한 항체의 결합력은 5x, 10x, 20x, 50x 또는 100x 이하만큼 달라진다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 항체, 그의 VH, 그의 VL, 그의 경쇄, 그의 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 복수의 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 복수의 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 항체를 숙주 세포를 사용하여 발현시키고, 발현된 항체를 단리하는 것을 포함하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 항체 또는 본원에 개시된 제약 조성물 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 면역요법 (예를 들어, 항-CD161 항체) 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항-CD161 항체 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 종양 미세환경에서 암 세포 또는 다른 세포에 의한 CLEC2D의 발현을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 암은 종양 미세환경에서 암 세포 또는 다른 세포에 의한 CLEC2D의 증가된 발현을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 폐, 신경교종, 결장직장 및 간으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 종양 성장의 감소 또는 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항-CD161 항체 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 인간 CD161과 CLEC2D 사이의 상호작용의 억제 또는 차단을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항-CD161 항체 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 인간 CD161과 CLEC2D 사이의 상호작용을 억제 또는 차단하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 면역 세포 활성화의 유도 또는 증진을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항-CD161 항체 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역 세포 활성화를 유도 또는 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 활성화는 종양 미세환경에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포독성 T 세포 이펙터 반응의 유도 또는 증진을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항-CD161 항체 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 세포독성 T 세포 이펙터 반응을 유도 또는 증진시키는 방법을 제공한다. 상황에 따라, T 세포 이펙터 반응은 (i) 종양 미세환경에 있거나, (ii) 시토카인 생산 (예컨대, IL-2, TNFα, IFNγ 또는 그의 조합)이거나, (iii) 그랜자임 B의 분비이거나, 또는 (iv) (i), (ii) 및 (iii) 중 2종 이상의 조합이다.
본 발명의 이들 및 다른 측면 및 특징은 하기 상세한 설명 및 청구범위에 기재되어 있다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 보다 완전히 이해될 수 있다.
도 1A-1D는 인간 CD161을 외인성으로 발현하는 HEK 293 세포에 대한 예시적인 인간 항-CD161 항체의 결합을 나타내는 그래프이다. Iso Ctrl은 이소형 대조군 항체를 나타낸다.
도 2A-2D는 시노몰구스 CD161을 외인성으로 발현하는 HEK 293 세포에 대한 예시적인 인간 항-CD161 항체의 결합을 나타내는 그래프이다. Iso Ctrl은 이소형 대조군 항체를 나타낸다.
도 3은 인간 CD161 (KLRB1_인간) (서열식별번호: 179)과 그의 상동체 (킬러 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 F 구성원 1_인간 (KLRF1_인간) (서열식별번호: 183), 킬러 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 F 구성원 2_인간 (KLRF2_인간) (서열식별번호: 184), 및 C-유형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 B_인간 (CL12B_인간) (서열식별번호: 185))의 정렬을 나타낸다.
도 4는 인간 CD161 (KLRB1_인간) (서열식별번호: 179)과 C-유형 렉틴 도메인 패밀리 2 구성원 D (CLC2D_인간) (서열식별번호: 186)의 정렬을 나타낸다.
도 5A-5B는 CD161 또는 CD161 상동체를 외인성으로 발현하는 HEK 293 세포 (CLEC2D, KLRF1, KLRF2 및 CLEC12B)에 대한 예시적인 인간 항-CD161 항체의 결합을 나타내는 그래프이다. Iso Ctrl은 이소형 대조군 항체를 나타내고, 널 (null)은 대조군 HEK 293 세포를 나타낸다.
도 6A-6D는 인간 CD161 단백질 및 가용성, 비오티닐화 Fc-인간 CLEC2D (H176C) 단백질을 과다발현하는 HEK293 세포를 사용한, CD161과 CLEC2D 사이의 상호작용의 인간 항-CD161 항체-매개된 차단을 나타내는 그래프이다. Iso Ctrl은 이소형 대조군 항체를 나타낸다.
도 7A-7D는 용량-의존성 방식으로 CD107a 발현에 의해 측정된 바와 같은 인간 NK 세포의 항-CD161 항체-매개 활성화를 나타내는 그래프이다. HP-3G10은 마우스 항-인간 CD161 항체를 나타낸다. Iso Ctrl은 이소형 대조군 항체를 나타낸다.
도 8A-8D는 활성화된 T 세포의 핵 인자 (NFAT) 신호전달에 의해 측정된 바와 같은 외인성 CLEC2D 발현을 사용한 공동-배양 검정에서의 T 세포의 항-CD161 항체-매개 활성화를 나타내는 그래프이다. HP-3G10은 마우스 항-인간 CD161 항체를 나타낸다. 이소형 대조군 항체 (Iso Ctrl)를 대조군으로서 사용하였다.
도 9는 인간 항-CD161 항체, Ab8, Ab9, Ab13, 및 Ab15의 존재 하에 용량-의존성 방식으로 NFAT 신호전달의 회복을 나타내는 그래프이다. 이소형 대조군 항체 (Iso Ctrl)를 대조군으로서 사용하였다.
도 10A-10B는 인간 PBMC (도 10A) 및 시노몰구스 PBMC (도 10B)에 대한 인간 항-CD161 항체, Ab8, Ab9, Ab13, 및 Ab15의 결합을 나타내는 그래프이다. Iso Ctrl은 이소형 대조군 항체를 나타낸다.
도 11은 인간 PBMC (MAIT T 세포, B 세포, 단핵구 및 수지상 세포)에서 면역 세포 집단에 대한 인간 항-CD161 항체, Ab8, Ab9, Ab13 및 Ab15의 결합을 나타내는 막대 그래프이다.
도 12A-12B는 각각 VH 및 VL의 컨센서스 서열을 생성하기 위해 사용된 제1 패밀리의 항체의 정렬을 나타낸다. 도 12A는 나타낸 순서대로 각각 서열식별번호: 188, 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 및 87을 개시하며, 이는 각각 컨센서스 서열 (Cons) 내지 Ab11에 상응한다. 도 12B는 나타낸 순서대로 각각 서열식별번호: 189, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 및 91을 개시하며, 이는 각각 컨센서스 서열 (Cons) 내지 Ab11에 상응한다.
도 13A-13B는 각각 VH 및 VL의 컨센서스 서열을 생성하기 위해 사용된 제2 패밀리의 항체의 정렬을 나타낸다. 도 13A는 나타낸 순서대로 각각 서열식별번호: 190, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157, 및 165를 개시하며, 이는 각각 컨센서스 서열 (Cons), 및 Ab12 내지 Ab20에 상응한다. 도 13B는 나타낸 순서대로 각각 서열식별번호: 191, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161, 및 169를 개시하며, 이는 각각 컨센서스 서열 (Cons) 및 Ab12 내지 Ab20에 상응한다.
도 14A-14B는 FcγRI (도 14A) 및 FcγRII 및 FcγRIII (도 14B)에의 가용성 수용체 결합을 나타내는 ELISA 검정 포맷을 나타낸다. 비오티닐화 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII는 각각 "FcγRI-bio", "FcγRII-bio", "FcγRIII-bio"로 표시된다. 카파 경쇄에 결합하는 마우스 항체는 "마우스 항-카파"로 표시된다. HRP-접합 Fab-항-인간 Fab 단편은 "F(ab')2 항-F(ab')2-HRP"로 표시된다.
도 15A-15E는 Fcγ 수용체, FcγRI (도 15A), FcγRIIA (도 15B), FcγRIIB/C (도 15C), FcγRIIIA (도 15D), 및 FcγRIIIB (도 15E)에 대한 Ab9 또는 야생형 인간 IgG1 항체 ("WT")의 결합 동역학을 예시하는 ELISA 결합 곡선이다. H167 및 R167은 인간 IgG2를 라이게이션하는 능력이 상이한 FcγRIIA의 2개의 대립유전자 변이체를 나타낸다. F176 및 V176은 인간 IgG1 및 IgG3에 결합하는 능력이 상이한 2개의 FcγRIIIA 대립유전자를 나타내며; F176은 저-결합 대립유전자이고, V176은 고 결합 대립유전자이다.
도 16A는 옥테트에 의한 FcRn 결합 방법을 나타낸다. 도 16B-16C는 옥테트에 의해 결정된, Ab9 (도 16B) 및 야생형 인간 IgG1 항체 ("WT") (도 16C)에 대한 예시적인 결합 곡선이다.
도 17A-17B는 CLEC2D를 발현하는 표적 K562 세포 (도 17A) 또는 GFP를 발현하는 표적 K562 세포 (도 17B)에서 용량-의존성 방식으로 CD107a 발현에 의해 측정된 바와 같은 공여자 RTD165로부터 단리된 인간 NK 세포의 항-CD161 항체-매개 활성화를 나타내는 그래프이다. 도 17C-17D는 CLEC2D를 발현하는 표적 K562 세포 (도 17C) 또는 GFP를 발현하는 표적 K562 세포 (도 17D)에서 용량-의존성 방식으로 IFN-γ의 분비에 의해 측정된 바와 같은 공여자 RTD165로부터 단리된 인간 NK 세포의 항-CD161 항체-매개 활성화를 나타내는 그래프이다.
도 17E-17F는 CLEC2D를 발현하는 표적 K562 세포 (도 17E) 또는 GFP를 발현하는 표적 K562 세포 (도 17F)에서 용량-의존성 방식으로 CD107a 발현에 의해 측정된 바와 같은 공여자 MCB117로부터 단리된 인간 NK 세포의 항-CD161 항체-매개 활성화를 나타내는 그래프이다. 도 17G-17H는 CLEC2D를 발현하는 표적 K562 세포 (도 17G) 또는 GFP를 발현하는 표적 K562 세포 (도 17H)에서 용량-의존성 방식으로 IFN-γ의 분비에 의해 측정된 바와 같은 공여자 MCB117로부터 단리된 인간 NK 세포의 항-CD161 항체-매개 활성화를 나타내는 그래프이다.
도 18A-18B는 항-CD161 항체 (Ab9)의 존재 하에 공여자 #1 (도 18A) 또는 공여자 #2 (도 18B)로부터 단리된 인간 NK 세포에 의한 Raji 표적 세포의 사멸을 나타내는 그래프이다.
도 19A-19B는 항-CD161 항체 (Ab9)에 의한 CD161-CLEC2D 상호작용의 차단이 기억 CD4 T 세포에서 증진된 시토카인 (IFNγ에 의해 측정된 바와 같음, 도 19A) 및 증식 (Ki67에 의해 측정된 바와 같음, 도 19B) 반응을 유발한다는 것을 나타내는 그래프이다. T 세포를 6.25 nM의 농도에서 항-CD161 항체 (Ab9), 이소형 대조군의 존재 하에 CEFX 펩티드에 노출시키거나, 또는 처리하지 않고 두었다 (항체 없음). CD4 이펙터 기억 세포 (EM)의 증식을 CD161 발현 CD4 T 세포 (CD161 Pos) 대 CD161 발현이 결여된 CD4 T 세포 (CD161 Neg)에 대해 게이팅함으로써 결정하였다. *P ≤ 0.05 **P ≤ 0.01, (양측 스튜던트 t-검정).
도 20A-20B는 항-CD161 항체 (Ab9)가 시토카인-양성 세포의 백분율로서 (도 20A) 또는 기하 평균 형광 강도 (MFI)로서 (도 20B) 재활성화 시 CD161+ MART-1-특이적 T 세포에서 IFNγ 생산을 증진시켰음을 나타내는 그래프이다. **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001 (양측 스튜던트 t-검정). 도 20C-20D는 항-CD161 항체 (Ab9)가 재활성화 시 MART-1-특이적 T 세포에서 IL-2 (도 20C) 및 TNFα (도 20D) 생산을 증진시켰음을 나타내는 그래프이다. *P ≤ 0.05 **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001 (양측 스튜던트 t-검정).
도 21A-21B는 항-CD161 항체 (Ab9)가 재활성화 시 2명의 공여자로부터의 CD161+ MART-1-특이적 T 세포에서 그랜자임 B 생산을 증진시킨다는 것을 나타내는 그래프이다. 도 21C-21D는 Ab9가 2명의 공여자로부터 수득된 MART-1 특이적 T 세포의 항원 특이적 T 세포독성을 증진시킨다는 것을 나타내는 그래프이다. 생존 표적 세포를 CD19+, NEAR-IR 음성으로 측정하였다. *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, (양측 스튜던트 t-검정).
도 22A-22F는 플레이트 결합된 Ab9와의 인큐베이션 후 자극되지 않은 건강한 인간 PBMC로부터의 시토카인의 유도를 나타내는 그래프이다. 플레이트 결합된 Ab9, 이소형 대조군, 항-CD3 무로모납 (항-CD3), 및 리툭시맙 처리를 이용한 6종의 공여자 인간 PBMC의 처리 (*** p<0.0001). Y축은 Ab9의 첨가에 의해 도출된 낮은 농도의 시토카인 및 무로모납 처리에 의해 방출된 높은 농도를 도시하기 위해 log 척도로 제시된다. 플롯 내의 상이한 점은 개별 PBMC 공여자를 나타낸다.
도 23A-23F는 가용성 Ab9와의 인큐베이션 후 자극되지 않은 건강한 인간 PBMC로부터의 시토카인의 유도를 나타내는 그래프이다. 가용성 Ab9, 이소형 대조군, 항-CD3 무로모납 (항-CD3), 및 리툭시맙 처리를 이용한 6종의 공여자 인간 PBMC의 처리 (*** p<0.0001). Y축은 Ab9의 첨가에 의해 도출된 낮은 농도의 시토카인 및 무로모납 처리에 의해 방출된 높은 농도를 도시하기 위해 로그 척도로 제시된다. 플롯 내의 상이한 점은 개별 PBMC 공여자를 나타낸다. IL-6 플롯 내의 "#" (도 23F)은 낮은 농도의 Ab9에서 단일 공여자에 대해 관찰된 높은 값을 나타내고, 이는 이것이 이상치임을 시사한다.
도 24는 반로그 척도를 사용한 각각의 용량 군에 대한 평균 Ab9 혈청 농도 대 시간 프로파일의 플롯이다.
도 25A-25B는 반로그 척도를 사용한 처리 및 성별별별 평균 Ab9 혈청 농도 대 시간 프로파일의 플롯이다.
본 발명은, 부분적으로, 특히 특정 암이 대상체의 면역계를 회피하는 것을 방지하는 데 사용될 수 있는 CLEC2D-CD161 축을 파괴하는 고친화도 항-CD161 항체의 발견에 기초한다. 본 출원은 추가로 적응증, 예컨대 암의 치료를 위해 이러한 항체 및/또는 제약 조성물을 사용하는 제약 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다. 본 출원에 기재된 항체를 비롯한 본 발명의 다양한 특색 및 측면이 하기에 상세하게 논의된다.
<정의>
본 출원의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기에 정의된다.
본원에 사용된 단수 용어는 "하나 이상"을 의미하고, 문맥상 부적절하지 않는 한 복수형을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노글로불린"은 전형적으로 2쌍의 폴리펩티드 쇄: 한 쌍의 경쇄 (L) 및 한 쌍의 중쇄 (H)를 포함하는 구조적으로 관련된 항체 단백질의 부류를 지칭한다. "무손상 이뮤노글로불린"에서, 이들 쇄의 모든 4개는 디술피드 결합에 의해 상호연결된다. 이뮤노글로불린의 구조는 널리 특징화되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Paul (2013) Fundamental Immunology 7th ed., Ch. 5 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]을 참조한다. 간략하게, 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 CH1, CH2, 및 CH3으로 약칭되는 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 전형적으로 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 CL로 약칭되는 1개의 도메인을 포함한다.
본원에 사용되고 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 무손상 항체 (예를 들어, 무손상 모노클로날 항체), 또는 그의 단편, 예컨대 항체의 Fc 단편 (예를 들어, 모노클로날 항체의 Fc 단편), 또는 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, 모노클로날 항체의 항원-결합 단편), 예컨대 변형되거나, 조작되거나 또는 화학적으로 접합된 무손상 항체, 항원-결합 단편 또는 Fc 단편을 의미하는 것으로 이해된다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 쇄 항체 (예를 들어, scFv), 미니바디, 및 디아바디를 포함한다. 변형 또는 조작된 항체의 예는 키메라 항체, 인간화 항체 및 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함한다. 화학적으로 접합된 항체의 예는 독소 모이어티에 접합된 항체이다.
본원에 사용된 용어 "항-CD161 항체"는 CD161 (예를 들어, 인간 CD161)에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 항-CD161 항체는 CD161 및 CLEC2D의 상호작용을 감소시키거나 방지할 수 있다.
용어 "항원-결합 단편"은 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분을 의미한다. 예시적인 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 또는 재조합 폴리펩티드 내의 단편, 예컨대 중쇄 가변 도메인 (VH)이 링커 (예를 들어, 폴리펩티드 링커)에 의해 단일 폴리펩티드, 미니바디 또는 나노바디 (VHH) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 단일 쇄 항체 결합 부위 (예를 들어, scFv)를 포함한다. 항원-결합 단편은 항체 및 키메라 항원 수용체 (CAR), 예를 들어 항체 또는 항체 단편, 예컨대 scFv로부터 유래된 CAR을 포함한 다양한 맥락에서 발견될 수 있다.
용어 "무손상 항체", "전장 항체" 및 "전체 항체"는 자연 발생 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖고 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, IgG 분자를 지칭하는 데 사용되는 경우, "전장 항체"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체이다.
용어 "Fc 영역"은 자연 발생 항체에서 Fc 수용체 및 보체계의 특정 단백질과 상호작용하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 의미한다. 다양한 이뮤노글로불린의 Fc 영역의 구조, 및 그에 함유된 글리코실화 부위는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 문헌 [Schroeder and Cavacini (2010) J. Allergy Clin. Immunol., 125: S41-52] (그 전문이 참조로 포함됨)을 참조한다. Fc 영역은 자연 발생 Fc 영역, 또는 관련 기술분야 또는 본 개시내용의 다른 곳에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역일 수 있다.
VH 및 VL 영역은 보다 보존된 영역 사이에 배치된 초가변성 영역 ("초가변 영역 (HVR); "상보성 결정 영역" (CDR)으로도 불림)으로 추가로 세분될 수 있다. 보다 보존된 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 각각의 VH 및 VL은 일반적으로 하기 순서로 (N-말단에서 C-말단으로) 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. CDR은 항원 결합에 관여하고, 항체의 항원 특이성 및 결합 친화도에 영향을 미친다. 문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD] (그 전문이 참조로 포함됨)을 참조한다.
"상보성 결정 영역 (CDR)"은 이뮤노글로불린 (Ig 또는 항체) VH β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3개의 초가변 영역 (예를 들어, CDR-H1, CDR-H2 또는 CDR-H3) 중 하나, 또는 항체 VL β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3개의 초가변 영역 (예를 들어, CDR-L1, CDR-L2 또는 CDR-L3) 중 하나를 지칭한다. CDR은 프레임워크 영역 서열 내에 산재된 가변 영역 서열이다. CDR은 관련 기술분야에 널리 인식되어 있고, 예를 들어 카바트에 의해 항체 가변 (V) 도메인 내의 가장 초가변성 영역으로 정의되었다. 문헌 [Kabat et al. (1977) J. Biol. Chem., 252: 6609-6616 and Kabat (1978) Adv. Protein Chem., 32 :1-75]을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다. CDR은 또한 코티아에 의해 보존된 β-시트 프레임워크의 일부가 아닌 잔기로서 구조적으로 정의되었고, 따라서 상이한 입체형태를 적응시킬 수 있다. 문헌 [Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917] (그 전문이 참조로 포함됨)을 참조한다. 카바트 및 코티아 명명법 둘 다 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. AbM, 콘택트 및 IMGT도 또한 CDR을 정의하였다. 정규 항체 가변 도메인 내의 CDR 위치는 수많은 구조의 비교에 의해 결정되었다. 문헌 [Morea et al. (2000) Methods, 20: 267-279 and Al-Lazikani et al. (1997) J. Mol. Biol., 273: 927-48]을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
다수의 초가변 영역 서술이 사용되고 있고, 이는 본원에 포함된다. 카바트 CDR은 서열 가변성에 기초하고, 가장 통상적으로 사용된다. 문헌 [Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE Publishing: 2719] (그 전문이 참조로 포함됨)을 참조한다. 코티아는 대신에 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (상기 문헌 [Chothia and Lesk]). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. 접촉 초가변 영역은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초한다.
보다 최근에, 보편적 넘버링 시스템 이뮤노제네틱스 (IMGT) 인포메이션 시스템(IMMunoGeneTics (IMGT) Information System)TM이 개발되었고 널리 채택되었다. 문헌 [Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77] (그 전문이 참조로 포함됨)을 참조한다. IMGT는 인간 및 다른 척추동물의 이뮤노글로불린 (IG), T 세포 수용체 (TR) 및 주요 조직적합성 복합체 (MHC)에 특수화된 통합된 정보 시스템이다. IMGT CDR은 아미노산 서열 및 경쇄 또는 중쇄 내의 위치 둘 다의 관점에서 언급된다. 이뮤노글로불린 가변 도메인의 구조 내의 CDR의 "위치"는 종 사이에서 보존되고 루프라 불리는 구조에 존재하기 때문에, 구조적 특색에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 시스템을 사용함으로써 CDR 및 프레임워크 잔기가 용이하게 확인된다. 카바트, 코티아 및 IMGT 넘버링 사이의 상응성은 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (상기 문헌 [Lefranc et al.]).
임의의 척추동물 종으로부터의 경쇄는 그의 불변 도메인의 서열에 기초하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2가지 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 중쇄는 5가지 상이한 부류 (또는 이소형): IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 중 하나에 할당될 수 있다. 이들 부류는 또한 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지정된다. IgG 및 IgA 부류는 서열 및 기능의 차이에 기초하여 하위부류로 추가로 분류된다. 인간은 하기 하위부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2.
용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 수반되지는 않지만 다양한 이펙터 기능, 예컨대 Fc 수용체와의 상호작용을 나타내는 경쇄 및 중쇄의 카르복시 말단 부분을 지칭한다. 상기 용어는 항원-결합 부위를 함유하는 이뮤노글로불린의 다른 부분인 가변 도메인에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는 이뮤노글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 및 경쇄의 CL 도메인을 함유한다.
"EU 넘버링 스킴"은 일반적으로 항체 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 상기 문헌 [Kabat et al.]에 보고된 바와 같음). 달리 언급되지 않는 한, EU 넘버링 스킴은 본원에 기재된 항체 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭하는 데 사용된다.
"Fv" 단편은 1개의 중쇄 가변 도메인 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 비-공유결합으로 연결된 이량체를 포함한다.
"Fab" 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 외에도 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab 단편은, 예를 들어 재조합 방법에 의해 또는 전장 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있다.
"F(ab')2" 단편은 힌지 영역 근처에서 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 함유한다. F(ab')2 단편은 예를 들어 재조합 방법에 의해 또는 무손상 항체의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있다. F(ab') 단편은 예를 들어 β-메르캅토에탄올로의 처리에 의해 해리될 수 있다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. VH 및 VL은 일반적으로 펩티드 링커에 의해 연결된다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 187)이고, 여기서 특정 실시양태에서, n = 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
"scFv-Fc" 단편은 Fc 도메인에 부착된 scFv를 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인은 scFv의 C-말단에 부착될 수 있다. Fc 도메인은 scFv에서의 가변 도메인의 배향 (즉, VH -VL 또는 VL -VH)에 따라 VH 또는 VL에 이어질 수 있다. 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 적합한 Fc 도메인이 사용될 수 있다.
용어 "단일 도메인 항체"는 항체의 하나의 가변 도메인이 다른 가변 도메인의 존재 없이 항원에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 단일 도메인 항체 및 그의 단편은 문헌 [Arabi Ghahroudi et al. (1998) FEBS Letters, 414: 521-526 and Muyldermans et al. (2001) Trends in Biochem. Sci., 26: 230-245]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다. 단일 도메인 항체는 또한 sdAb 또는 나노바디로 공지되어 있다.
"다중특이적 항체"는 2개 이상의 상이한 에피토프에 집합적으로 특이적으로 결합하는 2개 이상의 상이한 항원-결합 도메인을 포함하는 항체이다. 2개 이상의 상이한 에피토프는 동일한 항원 (예를 들어, 세포에 의해 발현되는 단일 CD161 분자) 또는 상이한 항원 (예를 들어, CD161 분자 및 비-CD161 분자) 상의 에피토프일 수 있다. 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합한다 (즉, "이중특이적 항체"). 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 3개의 상이한 에피토프에 결합한다 (즉, "삼중특이적 항체"). 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 4개의 상이한 에피토프에 결합한다 (즉, "사중특이적 항체"). 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 5개의 상이한 에피토프에 결합한다 (즉, "오중특이적 항체"). 일부 측면에서, 다중특이적 항체는 6, 7, 8개 또는 그 초과의 상이한 에피토프에 결합한다. 각각의 결합 특이성은 임의의 적합한 원자가로 존재할 수 있다. 다중특이적 항체의 예는 본 개시내용의 다른 곳에 제공된다.
"단일특이적 항체"는 단일 에피토프에 특이적으로 결합하는 1개 이상의 결합 부위를 포함하는 항체이다. 단일특이적 항체의 예는 2가 (즉, 2개의 항원-결합 도메인을 가짐)이지만, 2개의 항원-결합 도메인 각각에서 동일한 에피토프를 인식하는 자연 발생 IgG 분자이다. 결합 특이성은 임의의 적합한 원자가로 존재할 수 있다.
용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체 집단으로부터의 항체를 지칭한다. 실질적으로 동종 항체 집단은 모노클로날 항체의 생산 동안 정상적으로 발생할 수 있는 변이체를 제외하고는, 실질적으로 유사하고 동일한 에피토프(들)에 결합하는 항체를 포함한다. 이러한 변이체는 일반적으로 단지 미량으로 존재한다. 모노클로날 항체는 전형적으로 복수의 항체로부터 단일 항체를 선택하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득된다. 예를 들어, 선택 과정은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론, 효모 클론, 박테리아 클론, 또는 다른 재조합 DNA 클론의 풀로부터의 고유한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 항체는, 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키기 위해 ("친화도 성숙"), 항체를 인간화시키기 위해, 세포 배양에서의 그의 생산을 개선시키기 위해, 및/또는 대상체에서 그의 면역원성을 감소시키기 위해 추가로 변경될 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 한편, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
비-인간 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 인간화 항체는 일반적으로 1개 이상의 CDR로부터의 잔기가 비-인간 항체 (공여자 항체)의 1개 이상의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 항체 (수용자 항체)이다. 공여자 항체는 목적하는 특이성, 친화도 또는 생물학적 효과를 갖는 임의의 적합한 비-인간 항체, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 닭 또는 비-인간 영장류 항체일 수 있다. 일부 경우에, 수용자 항체의 선택된 프레임워크 영역 잔기는 공여자 항체로부터의 상응하는 프레임워크 영역 잔기에 의해 대체된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 기능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어질 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al. (1986) Nature, 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature, 332: 323-329; and Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596]을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
"인간 항체"는, 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 인간 항체-코딩 서열 (예를 들어, 인간 공급원으로부터 수득되거나 신생 설계됨)을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체는 인간화 항체를 포함하지 않는다.
"단리된 항체" 또는 "단리된 핵산"은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 항체 또는 핵산이다. 자연 환경의 성분은 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 예를 들어 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 쿠마시 블루 또는 은 염색에 의한 검출과 함께 환원 또는 비환원 조건 하에 겔 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE)에 의해 균질하게 정제된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함할 수 있는 데, 이는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문이다. 일부 측면에서, 단리된 항체 또는 단리된 핵산은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체 또는 단리된 핵산은 적어도 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량%로 정제된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체 또는 단리된 핵산은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99 부피%로 정제된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체 또는 단리된 핵산은 중량 기준으로 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 내지 100%의 항체 또는 핵산을 포함하는 용액으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체 또는 단리된 핵산은 부피 기준으로 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 내지 100%의 항체 또는 핵산을 포함하는 용액으로서 제공된다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 결합 부위 (예를 들어, 단일 결합 부위)와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원 또는 에피토프) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 본원에 사용되고 달리 나타내지 않는 한, "친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원 또는 에피토프) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 해리 평형 상수 (KD)로 나타내어질 수 있다. 해리 평형 상수에 기여하는 동역학적 성분은 하기에 보다 상세하게 기재된다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함한 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술 (예를 들어, 비아코어(BIACORE)®) 또는 생물층 간섭측정법 (예를 들어, 포르테바이오(FORTEBIO)®, 예를 들어 옥태트 QK384 시스템을 사용함)에 의해 측정될 수 있다.
표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 특정 항원 (예를 들어, 폴리펩티드 표적) 또는 특정 항원 상의 에피토프에 "결합하다", "특이적 결합", "특이적으로 결합하다", "특이적인", "선택적으로 결합하다", 및 "선택적인"이라는 용어는 비-특이적 또는 비-선택적 상호작용 (예를 들어, 비-표적 분자와의 상호작용)과는 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 표적 분자에의 결합을 측정하고, 이를 비-표적 분자에의 결합과 비교함으로써 측정될 수 있다. 특이적 결합은 또한 표적 분자 상에서 인식되는 에피토프를 모방하는 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이러한 경우, 표적 분자에 대한 항체의 결합이 대조군 분자에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우에 특이적 결합이 표시된다. 일부 측면에서, 비-표적 분자에 대한 CD161 항체의 친화도는 CD161에 대한 친화도의 약 40% 미만이다. 일부 측면에서, 비-표적 분자에 대한 CD161 항체의 친화도는 CD161에 대한 친화도의 약 30% 미만이다. 일부 측면에서, 비-표적 분자에 대한 CD161 항체의 친화도는 CD161에 대한 친화도의 약 20% 미만이다. 일부 측면에서, 비-표적 분자에 대한 CD161 항체의 친화도는 CD161에 대한 친화도의 약 10% 미만이다. 일부 측면에서, 비-표적 분자에 대한 CD161 항체의 친화도는 CD161에 대한 친화도의 약 1% 미만이다. 일부 측면에서, 비-표적 분자에 대한 CD161 항체의 친화도는 CD161에 대한 친화도의 약 0.1% 미만이다.
본원에 사용된 용어 "kd" (sec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 이 값은 또한 koff 값으로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "ka" (M-1xsec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 지칭한다. 이 값은 또한 kon 값으로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "KD" (M)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. KD = kd/ka. 일부 실시양태에서, 항체의 친화도는 이러한 항체와 그의 항원 사이의 상호작용에 대한 KD의 관점에서 기재된다. 명확성을 위해, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 보다 작은 KD 값은 보다 높은 친화도 상호작용을 나타내는 반면에, 보다 큰 KD 값은 보다 낮은 친화도 상호작용을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "KA" (M-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합 평형 상수를 지칭한다. KA = ka/kd.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체에 비해 그의 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 모 항체 (즉, 변경된 항체가 유래되거나 설계된 항체)에 비해 하나 이상의 변경 (예를 들어, 하나 이상의 CDR 또는 FR에서)을 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 피코몰 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al. (1992) Bio/Technology, 10: 779-783] (그 전문이 참조로 포함됨)은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기재한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 예를 들어 문헌 [Barbas et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813; Schier et al. (1995) Gene, 169: 147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol., 155: 1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol., 154: 3310-33199; and Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889-896]에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
"Fc 이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에 의해 매개되는 생물학적 활성을 지칭하며, 이러한 활성은 항체 이소형에 따라 달라질 수 있다. 항체 이펙터 기능의 예는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 활성화시키는 C1q 결합, 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 활성화시키는 Fc 수용체 결합, 및 항체 의존성 세포성 식세포작용 (ADCP)을 포함한다.
2개 이상의 항체와 관련하여 본원에 사용된 경우, 용어 "와 경쟁하다" 또는 "와 상호-경쟁하다"는 2개 이상의 항체가 항원 (예를 들어, CD161)에의 결합에 대해 경쟁한다는 것을 나타낸다. 하나의 예시적인 검정에서, CD161을 표면 상에 코팅하고, 제1 CD161 항체와 접촉시킨 후, 제2 CD161 항체를 첨가한다. 또 다른 예시적인 검정에서, 먼저 CD161 항체를 표면 상에 코팅하고, CD161과 접촉시킨 다음, 제2 CD161 항체를 첨가한다. 제1 CD161 항체의 존재가 어느 하나의 검정에서 제2 CD161 항체의 결합을 감소시키는 경우, 항체는 서로 경쟁한다. 용어 "와 경쟁하다"는 또한 하나의 항체가 또 다른 항체의 결합을 감소시키지만, 항체가 역순으로 첨가될 때 경쟁이 관찰되지 않는 항체의 조합을 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 항체는 이들이 첨가된 순서에 상관없이 서로의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, 한 항체는 또 다른 항체의 그의 항원에 대한 결합을 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소시킨다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 CD161에 대한 항체의 친화도 및 항체의 원자가에 기초하여 경쟁 검정에 사용된 항체의 농도를 선택할 수 있다. 이 정의에 기재된 검정은 예시적이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항체가 서로 경쟁하는지를 결정하기 위해 임의의 적합한 검정을 이용할 수 있다. 적합한 검정은, 예를 들어 문헌 [Cox et al., "Immunoassay Methods," in Assay Guidance Manual [Internet], Updated December 24, 2014 (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/; accessed September 29, 2015); Silman et al. (2001) Cytometry, 44: 30-37; and Finco et al. (2011) J. Pharm. Biomed. Anal., 54: 351-358]에 기재되어 있으며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
본원에 사용된 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 KD 값이 마우스 항원을 사용하여 포르테바이오 옥테트 상에서 측정될 수 있는 경우에 마우스 기원의 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다. 일반적으로, 항체는 비-인간 종의 KD (포르테바이오 옥테트에 의해 측정됨)가 인간 종의 것보다 10배 이하 더 약한 (즉, KD 값이 10배 더 높은) 경우에 비-인간 종에 대해 교차-반응성인 것으로 간주될 수 있다. 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 마우스 항원에 대한 KD 값이 각각의 인간 항원에 대한 상응하는 KD 값의 20배 이하일 때 마우스 기원의 동일한 항원과 "교차-반응성"인 것으로 간주된다.
본원에 사용된 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 시노몰구스 원숭이 항원에 대한 KD 값이 각각의 인간 항원에 대한 상응하는 KD 값의 20배 이하일 때 시노몰구스 원숭이 기원의 동일한 항원과 "교차-반응성"인 것으로 간주된다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 빈번하게 표면-접근가능한 아미노산 잔기 및/또는 당 측쇄를 포함하고, 특이적 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 전자에의 결합은 변성 용매의 존재 하에 상실될 수 있지만 후자에의 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 수반되는 아미노산 잔기, 및 결합에 직접 수반되지 않는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 항체가 결합하는 에피토프는 에피토프 결정을 위한 공지된 기술, 예컨대 예를 들어 상이한 점-돌연변이를 갖는 CD161 변이체 또는 키메라 CD161 변이체에의 항체 결합에 대한 시험을 사용하여 결정될 수 있다.
폴리펩티드 서열과 참조 서열 사이의 퍼센트 "동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우에 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후, 참조 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 관련 기술분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, MEGALIGN (DNASTAR), CLUSTALW, CLUSTAL OMEGA, 또는 MUSCLE 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. "보존적 치환" 또는 "보존적 아미노산 치환"은 화학적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산으로의 아미노산의 치환을 지칭한다. 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예로서, 표 1-3에 제공된 아미노산의 군은, 일부 실시양태에서, 서로에 대해 보존적 치환으로 간주된다.
특정 실시양태에서, 서로에 대해 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 선택된 군을 표 1에 나타낸다.
표 1
Figure pct00001
특정 실시양태에서, 서로에 대해 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 추가의 선택된 군을 표 2에 나타낸다.
표 2
Figure pct00002
특정 실시양태에서, 서로에 대해 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 추가의 선택된 군을 표 3에 나타낸다.
표 3
Figure pct00003
추가의 보존적 치환은, 예를 들어 문헌 [Creighton (1993) Proteins: Structures and Molecular Properties 2nd ed. W. H. Freeman & Co., New York, NY]에서 찾아볼 수 있다. 모 항체에서 아미노산 잔기의 1개 이상의 보존적 치환을 생성함으로써 생성된 항체는 "보존적으로 변형된 변이체"로 지칭된다.
용어 "아미노산"은 20개의 통상적인 자연 발생 아미노산을 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 알라닌 (Ala; A), 아르기닌 (Arg; R), 아스파라긴 (Asn; N), 아스파르트산 (Asp; D), 시스테인 (Cys; C); 글루탐산 (Glu; E), 글루타민 (Gln; Q), 글리신 (Gly; G); 히스티딘 (His; H), 이소류신 (Ile; I), 류신 (Leu; L), 리신 (Lys; K), 메티오닌 (Met; M), 페닐알라닌 (Phe; F), 프롤린 (Pro; P), 세린 (Ser; S), 트레오닌 (Thr; T), 트립토판 (Trp; W), 티로신 (Tyr; Y), 및 발린 (Val; V)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그에 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포, 및 이러한 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" (또는 "형질전환된 세포") 및 "형질감염체" (또는 "형질감염된 세포")를 포함하며, 이들은 각각 1차 형질전환된 또는 형질감염된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 이러한 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있고, 돌연변이를 함유할 수 있다.
용어 "치료하는" (및 그의 변경, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료")은 그를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태의 자연적 과정을 변경시키려는 시도의 임상 개입을 지칭한다. 치료는 예방 동안 및 임상 병리상태의 과정 중에 둘 다에서 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 1종 이상의 증상의 호전, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 대상체에게 투여되는 경우에 유익한 또는 목적하는 결과를 가져오기에 충분한 본원에 제공된 항체 또는 제약 조성물, 예컨대 대상체에게 투여되는 경우에 항체 또는 제약 조성물의 양이 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적이거나 또는 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상을 호전시키는 데 효과적인 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투약으로 투여될 수 있고, 특정한 제제 또는 투여 경로로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물 대상체를 의미한다. 예시적인 대상체는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 래트, 소, 말, 낙타, 염소, 토끼, 돼지 및 양을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에 제공된 항체로 치료될 수 있는 질환 또는 상태를 갖는다. 예를 들어, 질환 또는 상태는 암이다.
용어 "패키지 삽입물"은 이러한 치료 또는 진단 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 또는 진단 제품의 상업용 패키지 (예를 들어, 키트)에 통상적으로 포함되는 지침서를 지칭하는 데 사용된다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 지칭한다. 화학요법제는 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다.
용어 "제약 조성물"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 대상체를 치료하는 데 효과적이도록 하는 형태로 존재하고, 제약 조성물에 제공된 양으로 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
용어 "조정하다" 및 "조정"은 언급된 변수의 감소 또는 억제, 또는 다르게는 활성화 또는 증가를 지칭한다.
용어 "증가시키다" 및 "활성화시키다"는 언급된 변수에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 또는 그 초과의 증가를 지칭한다.
용어 "감소시키다" 및 "억제하다"는 언급된 변수에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 그 초과의 감소를 지칭한다.
용어 "효능작용하다"는 수용체의 활성화와 연관된 생물학적 반응을 유도하는 수용체 신호전달의 활성화를 지칭한다. "효능제"는 수용체에 결합하여 그를 효능작용하는 실체이다.
용어 "길항하다"는 수용체의 활성화와 연관된 생물학적 반응을 억제하는 수용체 신호전달의 억제를 지칭한다. "길항제"는 수용체에 결합하여 그를 길항시키는 실체이다. 본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료될 유기체를 지칭한다. 이러한 유기체는 바람직하게는 포유동물 (예를 들어, 뮤린, 원숭이, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 보다 바람직하게는 인간을 포함한다.
표현 "중 적어도 하나"는 문맥 및 용도로부터 달리 이해되지 않는 한, 표현 다음에 언급된 대상 각각 및 언급된 대상 중 2개 이상의 다양한 조합을 개별적으로 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 3개 이상의 언급된 대상과 관련하여 표현 "및/또는"은 문맥으로부터 달리 이해되지 않는 한 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "포함하다", "포함한다", "포함하는", "갖다", "갖는다", "갖는", "함유하다", "함유한다" 또는 "함유하는" (그의 문법적 등가물 포함)의 사용은, 달리 구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 달리 이해되지 않는 한, 일반적으로 개방형으로 및 비제한적으로, 예를 들어 추가의 언급되지 않은 요소 또는 단계를 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약"은 나타낸 값 및 그 값 초과 및 미만의 범위를 나타내고 포괄한다. 특정 실시양태에서, 용어 "약"은 지정된 값 ± 10%, ± 5%, 또는 ± 1%를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 적용가능한 경우에 용어 "약"은 지정된 값(들) ± 그 값(들)의 한 표준 편차를 나타낸다.
본 명세서의 다양한 곳에서, 성분 또는 그의 특색은 군으로 또는 범위로 개시된다. 설명은 이러한 군 및 범위의 구성원의 각각의 및 모든 개별 하위-조합을 포함하는 것으로 구체적으로 의도된다. 다른 예로서, 1 내지 20 범위의 정수는 구체적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20을 개별적으로 개시하는 것으로 의도된다.
명세서 전반에 걸쳐, 조성물이 특정 성분을 갖거나, 포함(including)하거나 또는 포함(comprising)하는 것으로 기재된 경우, 또는 공정 및 방법이 특정 단계를 갖거나, 포함(including)하거나 또는 포함(comprising)하는 것으로 기재된 경우, 추가적으로, 언급된 성분으로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진 본 발명의 조성물이 존재하고, 언급된 공정 단계로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진 본 발명에 따른 공정 및 방법이 존재하는 것으로 고려된다.
본 출원에서, 요소 또는 성분이 언급된 요소 또는 성분의 목록에 포함되고/거나 그로부터 선택되는 것으로 언급되는 경우, 요소 또는 성분은 언급된 요소 또는 성분 중 어느 하나일 수 있거나, 또는 요소 또는 성분은 언급된 요소 또는 성분 중 2개 이상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
추가로, 본원에 기재된 조성물 또는 방법의 요소 및/또는 특색은 본원에서 명시적이든 내포적이든 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 방식으로 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정한 화합물이 언급되는 경우, 문맥으로부터 달리 이해되지 않는 한, 그 화합물은 본 발명의 조성물의 다양한 실시양태에서 및/또는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 출원 내에서, 실시양태는 명확하고 간결한 적용이 기재되고 그려질 수 있는 방식으로 기재되고 도시되었지만, 실시양태는 본 발명의 교시 및 발명(들)으로부터 벗어나지 않으면서 다양하게 조합되거나 분리될 수 있는 것으로 의도되고 인지될 것이다. 예를 들어, 본원에 기재되고 도시된 모든 특색은 본원에 기재되고 도시된 본 발명(들)의 모든 측면에 적용가능할 수 있는 것으로 인지될 것이다.
I. 항-CD161 항체
인간 CD161 (NK 수용체-P1A (NKR-P1A), 킬러 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (KLRB1), 또는 C-유형 렉틴 도메인 패밀리 5 구성원 B (CLEC5B)로도 불림)은 Th17 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 NKT 세포 상에서 발현된다. CD161은 킬러 세포 렉틴-유사 수용체 (KLR) 패밀리에 속하고, 그의 구성원은 리간드 인식을 담당하는 세포외 영역에 1개의 C-유형 렉틴-유사 도메인을 함유한다. 마우스는 활성화 및 억제 수용체 둘 다이면서 NKR-P1 패밀리로 공지된 여러 CD161분자를 갖지만, 인간은 억제 수용체인 단지 1개의 CD161 분자를 갖는다. CD161 수용체는 C-유형 렉틴 도메인 패밀리 2 구성원 D (CLEC2D)로 공지된 리간드에 결합한다 (문헌 [Aldemir et al. (2005) J. Immunol., 175 (12): 7791-5, Rosen et al. (2005) J. Immunol., 175 (12): 7796-9] 참조). CLEC2D는 인간 렉틴-유사 전사체-1분자 (LLT1)로도 공지되어 있다. CD161 패밀리 분자는 디술피드-연결된 동종이량체를 형성하는 유형 II 막횡단 당단백질이다. CD161과 CLEC2D 사이의 상호작용을 억제하는 것은 종양 세포에 반응하여 T 세포의 활성화를 촉진한다. CLEC2D 및 CD161의 모든 오르토로그 및 이소형은 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
인간 CD161의 아미노산 서열은 서열식별번호: 179로 나타내어진다. 서열식별번호: 179의 아미노산 잔기 1-45, 46-66, 및 67-225는 각각 세포질 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포외 도메인을 포함한다. 시노몰구스 CD161, 마우스 CD161 및 래트 CD161의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 180, 181 및 182로 나타내어진다.
인간 CLEC2D의 아미노산 서열은 서열식별번호: 186으로 나타내어진다. 서열식별번호: 186의 아미노산 잔기 1-38, 39-59 및 60-191은 각각 세포질 도메인, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인을 포함한다.
1. 항-CD161 항체의 서열
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 표 4에 열거된 항체로부터 유래된 CD161 (예를 들어, 인간 CD161)에 결합하는 항원-결합 단편을 제공한다.
CD161에 결합하는 예시적인 항체의 서열을 표 4에 나타낸다.
표 4.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
1.1 VH 도메인
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 15의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 23의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 31의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 39의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 47의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 55의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 63의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 71의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 79의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 87의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 101의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 109의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 117의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 125의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 133의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 141의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 149의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 157의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 165의 VH 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157, 및 165에 제공된 예시적인 VH 서열에 대해 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157, 및 165에 제공된 VH 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
1.2 VL 도메인
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 11의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 27의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 35의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 43의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 51의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 59의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 67의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 75의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 83의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 91의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 105의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 113의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 121의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 129의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 137의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 145의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 153의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 161의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 169의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169에 제공된 예시적인 VL 서열에 대해 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169에 제공된 VL 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
1.3 VH-VL 조합
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 서열 및 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7의 VH 서열 및 서열식별번호: 11의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 15의 VH 서열 및 서열식별번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 23의 VH 서열 및 서열식별번호: 27의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 31의 VH 서열 및 서열식별번호: 35의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 39의 VH 서열 및 서열식별번호: 43의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 47의 VH 서열 및 서열식별번호: 51의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 55의 VH 서열 및 서열식별번호: 59의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 63의 VH 서열 및 서열식별번호: 67의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 71의 VH 서열 및 서열식별번호: 75의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 79의 VH 서열 및 서열식별번호: 83의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 87의 VH 서열 및 서열식별번호: 91의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 101의 VH 서열 및 서열식별번호: 105의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 109의 VH 서열 및 서열식별번호: 113의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 117의 VH 서열 및 서열식별번호: 121의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 125의 VH 서열 및 서열식별번호: 129의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 133의 VH 서열 및 서열식별번호: 137의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 141의 VH 서열 및 서열식별번호: 145의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 149의 VH 서열 및 서열식별번호: 153의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 157의 VH 서열 및 서열식별번호: 161의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 165의 VH 서열 및 서열식별번호: 169의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157, 및 165에 제공된 예시적인 VH 서열에 대해 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일성을 갖는 VH 서열, 및 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161, 및 169에 제공된 예시적인 VL 서열에 대해 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157, 및 165에 제공된 VH 서열, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161, 및 169에 제공된 VL 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 11에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 15에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 19에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 23에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 27에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 31에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 35에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 39에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 43에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 47에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 51에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 55에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 59에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 63에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 67에 대해 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 71에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 75에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 79에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 83에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 87에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 91에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 101에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 105에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 109에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 113에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 117에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 121에 대해 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 125에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 129에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 133에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 137에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 141에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 145에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 149에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 153에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 157에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 161에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 165에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 169에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 서열, 예를 들어 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157, 또는 165의 VH 서열, 또는 그의 아미노산 변이체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 중쇄 불변 영역 서열에 공유 연결될 수 있는 것으로 고려된다. 유사하게, 경쇄 가변 영역 서열, 예를 들어 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161, 또는 169의 VL, 또는 이의 아미노산 변이체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 경쇄 불변 영역 서열에 공유 연결될 수 있는 것으로 고려된다.
예를 들어, 항체 분자는 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE의 중쇄 불변 영역으로부터 선택된 중쇄 불변 영역; 특히, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 (예를 들어, 인간) 중쇄 불변 영역으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체 분자는, 예를 들어 카파 또는 람다의 (예를 들어, 인간) 경쇄 불변 영역으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 갖는다. 불변 영역은 항체의 특성을 변형시키기 위해 (예를 들어, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능 및/또는 보체 기능 중 1종 이상을 증가 또는 감소시키기 위해) 변경, 예를 들어 돌연변이될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 이펙터 기능을 갖고, 보체를 고정시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 항체는 이펙터 세포를 동원하거나 보체를 고정시키지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 Fc 수용체에 결합하는 능력이 감소되거나 그러한 능력이 없다. 예를 들어, 이는 Fc 수용체에의 결합을 지지하지 않는 이소형 또는 하위유형, 단편 또는 다른 돌연변이체이고, 예를 들어 돌연변이유발 또는 결실된 Fc 수용체 결합 영역을 갖는다.
1.4 CDR
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157, 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 1 내지 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 2 내지 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, CDR은 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달린다. 일부 측면에서, CDR은 코티아 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달린다. 일부 측면에서, CDR은 AbM 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달린다. 일부 측면에서, CDR은 콘택트 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달린다. 일부 측면에서, CDR은 IMGT 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달린다. 일부 측면에서, CDR은 예시적인 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달리고, 여기서 위치 27-35, 50-65, 및 93-102에서의 아미노산 잔기는 각각 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 나타낸다.
일부 실시양태에서, CDR은 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165의 CDR-H1, CDR-H2 또는 CDR-H3과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는 CDR이다. 일부 실시양태에서, CDR-H1은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 CDR-H1이다. 일부 실시양태에서, CDR-H2는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 CDR-H2이다. 일부 실시양태에서, CDR-H3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 CDR-H3이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 도메인의 1 내지 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 도메인의 2 내지 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 도메인의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, CDR은 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달린다. 일부 측면에서, CDR은 코티아 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달린다. 일부 측면에서, CDR은 AbM 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달린다. 일부 측면에서, CDR은 콘택트 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달린다. 일부 측면에서, CDR은 IMGT 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달린다. 일부 측면에서, CDR은 예시적인 넘버링 시스템을 사용하여 주석이 달리고, 여기서 위치 24-34, 50-56, 및 89-97에서의 아미노산 잔기는 각각 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 나타낸다.
일부 실시양태에서, CDR은 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169의 CDR-L1, CDR-L2 또는 CDR-L3과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는 CDR이다. 일부 실시양태에서, CDR-L1은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 도메인의 CDR-L1이다. 일부 실시양태에서, CDR-L2는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 도메인의 CDR-L2이다. 일부 실시양태에서, CDR-L3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169 및 760으로부터 선택된 VL 도메인의 CDR-L3이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 1 내지 3개의 CDR 및 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 도메인의 1 내지 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 2 내지 3개의 CDR 및 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 도메인의 2 내지 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 3개의 CDR 및 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 도메인의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 측면에서, CDR은 카바트 CDR이다. 일부 측면에서, CDR은 코티아 CDR이다. 일부 측면에서, CDR은 AbM CDR이다. 일부 측면에서, CDR은 콘택트 CDR이다. 일부 측면에서, CDR은 IMGT CDR이다. 일부 측면에서, CDR은 예시적인 CDR이다.
일부 실시양태에서, CDR은 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165의 CDR-H1, CDR-H2 또는 CDR-H3과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성 및 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169의 CDR-L1, CDR-L2 또는 CDR-L3, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는 CDR이다. 일부 실시양태에서, CDR-H1은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 CDR-H1이고; CDR-H2는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 CDR-H2이고; CDR-H3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 101, 109, 117, 125, 133, 141, 149, 157 및 165로부터 선택된 VH 도메인의 CDR-H3이고; CDR-L1은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 도메인의 CDR-L1이고; CDR-L2는 1, 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 도메인의 CDR-L2이고; CDR-L3은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 105, 113, 121, 129, 137, 145, 153, 161 및 169로부터 선택된 VL 도메인의 CDR-L3이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 위치 93-102의 아미노산 잔기가 CDR-H3을 나타내는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160 및 168로부터 선택된 CDR-H3을 포함한다. 일부 측면에서, CDR-H3은 서열식별번호: 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160, 및 168의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CDR-H3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160 및 168로부터 선택된 CDR-H3이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 위치 50-65의 아미노산 잔기가 CDR-H2를 나타내는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159, 및 167로부터 선택된 CDR-H2를 포함한다. 일부 측면에서, CDR-H2는 서열식별번호: 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159, 및 167의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CDR-H2는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159 및 167로부터 선택된 CDR-H2이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 위치 27-35의 아미노산 잔기가 CDR-H1을 나타내는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 150, 158 및 166으로부터 선택된 CDR-H1을 포함한다. 일부 측면에서, CDR-H1은 서열식별번호: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 150, 158, 및 166의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CDR-H1은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 150, 158 및 166으로부터 선택된 CDR-H1이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160 및 168로부터 선택된 CDR-H3 및 서열식별번호: 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159 및 167로부터 선택된 CDR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160 및 168로부터 선택된 CDR-H3, 서열식별번호: 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159 및 167로부터 선택된 CDR-H2, 및 서열식별번호: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 150, 158 및 166으로부터 선택된 CDR-H1을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR-H3은 서열식별번호: 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160 및 168의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖고, CDR-H2는 서열식별번호: 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159 및 167의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖고, CDR-H1은 서열식별번호: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 150, 158 및 166의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CDR-H3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160 및 168로부터 선택된 CDR-H3이고; CDR-H2는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159 및 167로부터 선택된 CDR-H2이고; CDR-H1은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 150, 158 및 166으로부터 선택된 CDR-H1이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 위치 89-97의 아미노산 잔기가 CDR-L3을 나타내는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 108, 116, 124, 132, 140, 148, 156, 164 및 172로부터 선택된 CDR-L3을 포함한다. 일부 측면에서, CDR-L3은 서열식별번호: 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 108, 116, 124, 132, 140, 148, 156, 164 및 172의 CDR-L3과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CDR-L3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 108, 116, 124, 132, 140, 148, 156, 164 및 172로부터 선택된 CDR-L3이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 위치 50-56의 아미노산 잔기가 CDR-L2를 나타내는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 155, 163 및 171로부터 선택된 CDR-L2를 포함한다. 일부 측면에서, CDR-L2는 서열식별번호: 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 155, 163, 및 171의 CDR-L2와 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CDR-L2는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 155, 163, 및 171로부터 선택된 CDR-L2이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 위치 24-34의 아미노산 잔기가 CDR-L1을 나타내는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 106, 114, 122, 130, 138, 146, 154, 162 및 170으로부터 선택된 CDR-L1을 포함한다. 일부 측면에서, CDR-L1은 서열식별번호: 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 106, 114, 122, 130, 138, 146, 154, 162 및 170의 CDR-L1과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CDR-L1은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 106, 114, 122, 130, 138, 146, 154, 162 및 170으로부터 선택된 CDR-L1이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 108, 116, 124, 132, 140, 148, 156, 164 및 172로부터 선택된 CDR-L3 및 서열식별번호: 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 155, 163 및 171로부터 선택된 CDR-L2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 108, 116, 124, 132, 140, 148, 156, 164 및 172로부터 선택된 CDR-L3, 서열식별번호: 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 155, 163 및 171로부터 선택된 CDR-L2, 및 서열식별번호: 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 106, 114, 122, 130, 138, 146, 154, 162 및 170으로부터 선택된 CDR-L1을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR-L3은 서열식별번호: 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 108, 116, 124, 132, 140, 148, 156, 164 및 172의 CDR-L3과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖고, CDR-L2는 서열식별번호: 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 155, 163 및 171의 CDR-L2와 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖고, CDR-L1은 서열식별번호: 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 106, 114, 122, 130, 138, 146, 154, 162 및 170의 CDR-L1과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CDR-L3은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 108, 116, 124, 132, 140, 148, 156, 164 및 172로부터 선택된 CDR-L3이고; CDR-L2는 1, 2, 3 또는 4개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 155, 163 및 171로부터 선택된 CDR-L2이고; CDR-L1은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 106, 114, 122, 130, 138, 146, 154, 162 및 170으로부터 선택된 CDR-L1이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160 및 168로부터 선택된 CDR-H3, 서열식별번호: 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159 및 167로부터 선택된 CDR-H2, 서열식별번호: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 150, 158 및 166으로부터 선택된 CDR-H1, 서열식별번호: 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 108, 116, 124, 132, 140, 148, 156, 164 및 172로부터 선택된 CDR-L3, 서열식별번호: 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 155, 163 및 171로부터 선택된 CDR-L2, 및 서열식별번호: 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 106, 114, 122, 130, 138, 146, 154, 162 및 170으로부터 선택된 CDR-L1을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR-H3은 서열식별번호: 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160 및 168의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖고, CDR-H2는 서열식별번호: 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159 및 167의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖고, CDR-H1은 서열식별번호: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 150, 158 및 166의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖고, CDR-L3은 서열식별번호: 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 108, 116, 124, 132, 140, 148, 156, 164 및 172의 CDR-L3과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖고, CDR-L2는 서열식별번호: 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 155, 163 및 171의 CDR-L2와 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖고, CDR-L1은 서열식별번호: 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 106, 114, 122, 130, 138, 146, 154, 162 및 170의 CDR-L1과 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CDR-H3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160, 및 168로부터 선택된 CDR-H3이고; CDR-H2는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159, 및 167로부터 선택된 CDR-H2이고; CDR-H1은 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 150, 158, 및 166으로부터 선택된 CDR-H1이고; CDR-L3은 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 108, 116, 124, 132, 140, 148, 156, 164, 및 172로부터 선택된 CDR-L3이고; CDR-L2는 1, 2, 3, 또는 4개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 155, 163, 및 171로부터 선택된 CDR-L2이고; CDR-L1은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 이하의 아미노산 치환을 갖는, 서열식별번호: 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 106, 114, 122, 130, 138, 146, 154, 162, 및 170으로부터 선택된 CDR-L1이다. 일부 측면에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 본 단락에 기재된 항체는 본원에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본원에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체는 본원에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 신생 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 8의 CDR-H1, 서열식별번호: 9의 CDR-H2, 서열식별번호: 10의 CDR-H3, 서열식별번호: 12의 CDR-L1, 서열식별번호: 13의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 14의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 16의 CDR-H1, 서열식별번호: 17의 CDR-H2, 서열식별번호: 18의 CDR-H3, 서열식별번호: 20의 CDR-L1, 서열식별번호: 21의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 22의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 24의 CDR-H1, 서열식별번호: 25의 CDR-H2, 서열식별번호: 26의 CDR-H3, 서열식별번호: 28의 CDR-L1, 서열식별번호: 29의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 30의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 32의 CDR-H1, 서열식별번호: 33의 CDR-H2, 서열식별번호: 34의 CDR-H3, 서열식별번호: 36의 CDR-L1, 서열식별번호: 37의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 38의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 40의 CDR-H1, 서열식별번호: 41의 CDR-H2, 서열식별번호: 42의 CDR-H3, 서열식별번호: 44의 CDR-L1, 서열식별번호: 45의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 46의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 48의 CDR-H1, 서열식별번호: 49의 CDR-H2, 서열식별번호: 50의 CDR-H3, 서열식별번호: 52의 CDR-L1, 서열식별번호: 53의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 54의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 56의 CDR-H1, 서열식별번호: 57의 CDR-H2, 서열식별번호: 58의 CDR-H3, 서열식별번호: 60의 CDR-L1, 서열식별번호: 61의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 62의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 64의 CDR-H1, 서열식별번호: 65의 CDR-H2, 서열식별번호: 66의 CDR-H3, 서열식별번호: 68의 CDR-L1, 서열식별번호: 69의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 70의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 72의 CDR-H1, 서열식별번호: 73의 CDR-H2, 서열식별번호: 74의 CDR-H3, 서열식별번호: 76의 CDR-L1, 서열식별번호: 77의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 78의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 80의 CDR-H1, 서열식별번호: 81의 CDR-H2, 서열식별번호: 82의 CDR-H3, 서열식별번호: 84의 CDR-L1, 서열식별번호: 85의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 86의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 88의 CDR-H1, 서열식별번호: 89의 CDR-H2, 서열식별번호: 90의 CDR-H3, 서열식별번호: 92의 CDR-L1, 서열식별번호: 93의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 94의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 102의 CDR-H1, 서열식별번호: 103의 CDR-H2, 서열식별번호: 104의 CDR-H3, 서열식별번호: 106의 CDR-L1, 서열식별번호: 107의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 108의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 110의 CDR-H1, 서열식별번호: 111의 CDR-H2, 서열식별번호: 112의 CDR-H3, 서열식별번호: 114의 CDR-L1, 서열식별번호: 115의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 116의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 118의 CDR-H1, 서열식별번호: 119의 CDR-H2, 서열식별번호: 120의 CDR-H3, 서열식별번호: 122의 CDR-L1, 서열식별번호: 123의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 124의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 126의 CDR-H1, 서열식별번호: 127의 CDR-H2, 서열식별번호: 128의 CDR-H3, 서열식별번호: 130의 CDR-L1, 서열식별번호: 131의 CDR-L2 및 서열식별번호: 132의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 134의 CDR-H1, 서열식별번호: 135의 CDR-H2, 서열식별번호: 136의 CDR-H3, 서열식별번호: 138의 CDR-L1, 서열식별번호: 139의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 140의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 142의 CDR-H1, 서열식별번호: 143의 CDR-H2, 서열식별번호: 144의 CDR-H3, 서열식별번호: 146의 CDR-L1, 서열식별번호: 147의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 148의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 150의 CDR-H1, 서열식별번호: 151의 CDR-H2, 서열식별번호: 152의 CDR-H3, 서열식별번호: 154의 CDR-L1, 서열식별번호: 155의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 156의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 158의 CDR-H1, 서열식별번호: 159의 CDR-H2, 서열식별번호: 160의 CDR-H3, 서열식별번호: 162의 CDR-L1, 서열식별번호: 163의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 164의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 예시적인 넘버링 시스템에 의해 결정 시 서열식별번호: 166의 CDR-H1, 서열식별번호: 167의 CDR-H2, 서열식별번호: 168의 CDR-H3, 서열식별번호: 170의 CDR-L1, 서열식별번호: 171의 CDR-L2, 및 서열식별번호: 172의 CDR-L3을 포함한다.
1.5 컨센서스 서열
각각의 패밀리의 대표적인 항체의 VH 및 VL 서열, 뿐만 아니라 그의 상응하는 CDR 서열을 나타내는 컨센서스 서열을 개발하였다. 각각의 CDR의 위치 내에서 아미노산이 변하는 위치는 X1, X2, X3...으로 나타내어진다. VH 및 VL 서열의 프레임워크 영역 내에서 아미노산이 변하는 위치는 Xa, Xb, Xc...로 나타내어진다. 각각의 X 위치에서 컨센서스 서열을 나타내는 가능한 아미노산이 본원에서 확인된다.
일부 실시양태에서, 항체의 제1 패밀리 (도 12A-12B 참조)가 본원에 제공되며, 여기서 이러한 패밀리의 항체는 하기 6개의 CDR 서열을 포함한다: (a) 서열 FX1FX2X3X4AMS (서열식별번호: 1)를 가지며, 여기서 X1은 T 또는 A이고, X2는 G, S, 또는 E이고, X3은 Q, T, P, 또는 R이고, X4는 Y 또는 F인 CDR-H1; (b) 서열 AISX5X6GGX7TX8YADSVKG (서열식별번호: 2)를 가지며, 여기서 X5는 A 또는 G이고, X6은 A, V, 또는 S이고, X7은 T 또는 S이고, X8은 K, A, 또는 Y인 CDR-H2; (c) 서열 AKPLDSSX9WADFX10X11 (서열식별번호: 3)를 가지며, 여기서 X9는 Q, F, 또는 L이고, X10은 D 또는 Q이고, X11은 L 또는 A인 CDR-H3; (d) 서열 RASQX12IX13SWLA (서열식별번호: 4)를 가지며, 여기서 X12는 G, D, 또는 T이고, X13은 D, S, 또는 Y인 CDR-L1; (e) 서열 X14ASX15LQX16 (서열식별번호: 5)을 가지며, 여기서 X14는 A, Y, 또는 F이고, X15는 S, A, G, 또는 F이고, X16은 D 또는 S인 CDR-L2; 및 (f) 서열 QQX17X18X19LPIT (서열식별번호: 6)를 가지며, 여기서 X17은 A, H, 또는 Q이고; X18은 S, D, W, 또는 L이고; X19는 V, D, Y, 또는 K인 CDR-L3.
일부 실시양태에서, 이러한 패밀리의 항체는 서열식별번호: 188의 VH 서열 및 서열식별번호: 189의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 제1 패밀리 내의 항체가 본원에 제공된다. 도 12A-12B는 각각 각각의 VH 및 VL의 컨센서스 서열을 생성하는 데 사용된 제1 패밀리의 항체의 정렬을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 항체의 제2 패밀리 (도 13A-13B 참조)가 본원에 제공되며, 기서 이러한 패밀리의 항체는 하기 6개의 CDR 서열을 포함한다: (a) 서열 FTFX1X2YYMS (서열식별번호: 95)를 가지며, 여기서, X1은 G, A, P 또는 S이고, X2는 N, Q 또는 D인 CDR-H1; (b) 서열 YISPSGX3TIX4YADSVKG (서열식별번호: 96)를 가지며, 여기서 X3은 A 또는 S이고, X4는 Y 또는 A인 CDR-H2; (c) 서열 ARSLMX5TGTHLYFDL (서열식별번호: 97)을 가지며, 여기서, X5는 A 또는 S인 CDR-H3; (d) 서열 RASX6X7ISX8WLA (서열식별번호: 98)를 가지며, 여기서 X6은 Q 또는 S이고, X7은 D 또는 G이고, X8은 D 또는 S인 CDR-L1; (e) 서열 AAX9X10LQS (서열식별번호: 99)를 가지며, 여기서, X9는 E 또는 S이고, X10은 S, A, G, V 또는 E인 CDR-L2; 및 (f) 서열 QQX11TSX12X13PYT (서열식별번호: 100)를 가지며, 여기서, X11은 A, S 또는 V이고, X12는 F, T, V, Q 또는 A이고, X13은 L 또는 P인 CDR-L3.
일부 실시양태에서, 이러한 패밀리의 항체는 서열식별번호: 190의 VH 서열 및 서열식별번호: 191의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 제2 패밀리 내의 항체가 본원에 제공된다. 도 13A-13B는 각각 각각의 VH 및 VL의 컨센서스 서열을 생성하는 데 사용된 제2 패밀리의 항체의 정렬을 나타낸다.
2. 항-CD161 항체의 기능적 특성
일부 실시양태에서, CD161 항체는 CD161에 결합한다 (예를 들어, 특이적으로 결합한다). 일부 실시양태에서, 인간 CD161은 서열식별번호: 179로 나타내어진다. 일부 실시양태에서, CD161 항체는 인간 CD161에 결합하고, 인간 NK 세포의 활성화를 유도하거나 촉진한다. 일부 실시양태에서, CD161 항체는 인간 CD161에 결합하고, 인간 T 세포의 활성화를 유도하거나 촉진한다.
일부 실시양태에서, CD161 항체는 표준 결합 검정, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭측정법 또는 옥테트 QK384 검정을 사용하여 결정 시 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM 또는 10 pM 이하의 KD로 인간 CD161에 결합한다 (즉, 이보다 강하게 결합함). 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체는 약 10 pM - 약 1 nM, 약 10 pM - 약 0.9 nM, 약 10 pM - 약 0.8 nM, 약 10 pM - 약 0.7 nM, 약 10 pM - 약 0.6 nM, 약 10 pM - 약 0.5 nM, 약 10 pM - 약 0.4 nM, 약 10 pM - 약 0.3 nM, 약 10 pM - 약 0.2 nM, 약 10 pM - 약 0.1 nM, 약 10 pM - 약 50 pM, 약 0.1 nM - 약 10 nM, 약 0.1 nM - 약 9 nM, 약 0.1 nM - 약 8 nM, 약 0.1 nM - 약 7 nM, 약 0.1 nM - 약 6 nM, 약 0.1 nM - 약 5 nM, 약 0.1 nM - 약 4 nM, 약 0.1 nM - 약 3 nM, 약 0.1 nM - 약 2 nM, 약 0.1 nM - 약 1 nM, 약 0.1 nM - 약 0.5 nM, 약 0.5 nM - 약 10 nM, 약 1 nM - 약 10 nM, 약 2 nM - 약 10 nM, 약 3 nM - 약 10 nM, 약 4 nM - 약 10 nM, 약 5 nM - 약 10 nM, 약 6 nM - 약 10 nM, 약 7 nM - 약 10 nM, 약 8 nM - 약 10 nM, 또는 약 9 nM - 약 10 nM 범위의 KD로 인간 CD161에 결합한다.
특정 실시양태에서, 인간 CD161에 결합하는 것에 추가로, 개시된 항체는 또한 마카카 파시쿨라리스 (시노몰구스) CD161에 결합한다. 일부 실시양태에서, 시노몰구스 CD161은 서열식별번호: 180에 의해 나타내어진다. 일부 실시양태에서, CD161 항체는 시노몰구스 CD161에 결합하고, 시노몰구스 NK 세포의 활성화를 유도하거나 촉진한다. 일부 실시양태에서, CD161 항체는 시노몰구스 CD161에 결합하고, 시노몰구스 T 세포의 활성화를 유도하거나 촉진한다. 예를 들어, 항체는 표준 결합 검정, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭측정법 또는 옥테트 QK384 검정을 사용하여 결정 시에 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM 또는 10 pM 이하의 KD로 시노몰구스 CD161에 결합한다 (즉, 이보다 강하게 결합함). 특정 실시양태에서, 항체는 표준 결합 검정, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭측정법 또는 옥테트 QK384 검정을 사용하여 결정 시 약 10 pM - 약 1 nM, 약 10 pM - 약 0.9 nM, 약 10 pM - 약 0.8 nM, 약 10 pM - 약 0.7 nM, 약 10 pM - 약 0.6 nM, 약 10 pM - 약 0.5 nM, 약 10 pM - 약 0.4 nM, 약 10 pM - 약 0.3 nM, 약 10 pM - 약 0.2 nM, 약 10 pM - 약 0.1 nM, 약 10 pM - 약 50 pM, 0.1 nM - 약 10 nM, 약 0.1 nM - 약 9 nM, 약 0.1 nM - 약 8 nM, 약 0.1 nM - 약 7 nM, 약 0.1 nM - 약 6 nM, 약 0.1 nM - 약 5 nM, 약 0.1 nM - 약 4 nM, 약 0.1 nM - 약 3 nM, 약 0.1 nM - 약 2 nM, 약 0.1 nM - 약 1 nM, 약 0.1 nM - 약 0.5 nM, 약 0.5 nM - 약 10 nM, 약 1 nM - 약 10 nM, 약 2 nM - 약 10 nM, 약 3 nM - 약 10 nM, 약 4 nM - 약 10 nM, 약 5 nM - 약 10 nM, 약 6 nM - 약 10 nM, 약 7 nM - 약 10 nM, 약 8 nM - 약 10 nM, 또는 약 9 nM - 약 10 nM 범위의 KD로 시노몰구스 CD161에 결합한다.
특정 실시양태에서, HEK293 발현 CD161 세포로 측정된 EC50에 의해 나타낸 바와 같은 인간 CD161에 대한 본원에 개시된 항체의 친화도는 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.75 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, 0.075 nM, 또는 0.05 nM 이하이다. 특정 실시양태에서, HEK293 발현 CD161 세포로 측정된 EC50에 의해 나타낸 바와 같은 인간 CD161에 대한 본원에 개시된 항체의 친화도는 약 20 nM 내지 약 0.05 nM, 약 20 nM 내지 약 0.075 nM, 약 20 nM 내지 약 0.1 nM, 약 20 nM 내지 약 0.5 nM, 약 20 nM 내지 약 1 nM, 약 10 nM 내지 약 0.05 nM, 약 10 nM 내지 약 0.075 nM, 약 10 nM 내지 약 0.1 nM, 약 10 nM 내지 약 0.5 nM, 약 10 nM 내지 약 1 nM, 약 5 nM 내지 약 0.05 nM, 약 5 nM 내지 약 0.075 nM, 약 5 nM 내지 약 0.1 nM, 약 5 nM 내지 약 0.5 nM, 약 5 nM 내지 약 1 nM, 약 3 nM 내지 약 0.05 nM, 약 3 nM 내지 약 0.075 nM, 약 3 nM 내지 약 0.1 nM, 약 3 nM 내지 약 0.5 nM, 약 3 nM 내지 약 1 nM, 약 3 nM 내지 약 2 nM, 약 2 nM 내지 약 0.05 nM, 약 2 nM 내지 약 0.075 nM, 약 2 nM 내지 약 0.1 nM, 약 2 nM 내지 약 0.5 nM, 약 2 nM 내지 약 1 nM, 약 1 nM 내지 약 0.05 nM, 약 1 nM 내지 약 0.075 nM, 약 1 nM 내지 약 0.1 nM, 약 1 nM 내지 약 0.5 nM, 약 0.5 nM 내지 약 0.05 nM, 약 0.5 nM 내지 약 0.075 nM, 약 0.5 nM 내지 약 0.1 nM, 약 0.1 nM 내지 약 0.05 nM, 약 0.1 nM 내지 약 0.075 nM, 또는 약 0.075 nM 내지 약 0.05 nM이다. 특정 실시양태에서, HEK293 발현 CD161 세포로 측정된 EC50에 의해 나타낸 바와 같은 인간 CD161에 대한 본원에 개시된 항체의 친화도는 약 0.5 nM 내지 약 0.1 nM (예를 들어, 약 0.45 nM, 약 0.4 nM, 약 0.35 nM, 약 0.3 nM, 약 0.25 nM, 약 0.2 nM, 약 0.15 nM, 또는 약 0.05 nM)이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 개시된 항체에 의해 결합되는 것과 동일한 CD161에 존재하는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CD161에의 결합에 대해 개시된 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다.
항체가 개시된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 결합에 대해 개시된 항체와 경쟁하는지 여부를 결정하기 위한 경쟁 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 경쟁 검정은 면역검정 (예를 들어, ELISA 검정, RIA 검정), 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어 분석), 생물층 간섭측정법, 및 유동 세포측정법을 포함한다. 전형적으로, 경쟁 검정은 고체 표면에 결합되거나 세포 표면 상에 발현된 항원 (예를 들어, 인간 CD161 단백질 또는 그의 단편), 시험 CD161-결합 항체 및 참조 항체의 사용을 수반한다. 참조 항체는 표지되고, 시험 항체는 표지되지 않는다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지된 참조 항체의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로, 시험 항체는 과량으로 존재한다 (예를 들어, 1x, 5x, 10x, 20x 또는 100x). 경쟁 검정에 의해 확인된 항체 (즉, 경쟁 항체)는 참조 항체와 동일한 에피토프 또는 유사한 (예를 들어, 중첩) 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체 장애가 발생하도록 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접하는 인접한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
경쟁 검정은 표지의 존재가 결합을 방해하거나 달리 억제하지 않음을 보장하기 위해 양 방향으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 제1 방향에서 참조 항체는 표지되고 시험 항체는 표지되지 않고, 제2 방향에서 시험 항체는 표지되고, 참조 항체는 표지되지 않는다. 시험 항체는 과량의 하나의 항체 (예를 들어, 1x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)가 다른 항체의 결합을, 예를 들어 경쟁적 결합 검정으로 결정 시 적어도 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99% 억제하는 경우에 항원에의 특이적 결합에 대해 참조 항체와 경쟁한다.
한 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 항원 내의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 결정될 수 있다. 하나의 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 아미노산 돌연변이의 하위세트만이 다른 것의 결합을 감소 또는 제거하는 경우, 2개의 항체는 중첩 에피토프에 결합하는 것으로 결정될 수 있다.
여러 보고는 종양 세포 및 면역-억제 세포 상에서의 CLEC2D에 의한 CD161의 활성화가 종양 세포에 대한 T 세포 반응을 약화시킨다는 것을 제시한 바 있다. 따라서, 본 출원은 CD161에 결합하고 CD161과 CLEC2D의 상호작용을 억제하는 능력을 갖는 CD161 항체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CD161 항체는 CLEC2D의 결합을 차단, 억제 또는 길항한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CD161 항체는 CD161에의 결합에 대해 CLEC2D와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CD161 항체는 CD161에의 CLEC2D의 결합으로 인한 CD161 억제 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, CD161은 세포의 표면 상에서 발현된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CD161에의 결합에 대해 CLEC2D와 경쟁하는 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, CD161 항체는 CD161의 리간드-결합 영역과 중첩되는 CD161의 영역에 결합한다. 일부 실시양태에서, CD161 항체는 CD161의 리간드-결합 영역에서 또는 근처에서 결합한다. 일부 실시양태에서, CD161의 리간드-결합 영역은 CLEC2D-결합 영역이다. 일부 실시양태에서, CD161에의 CD161 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합은 CD161에의 CLEC2D의 결합을 방지한다. 일부 실시양태에서, CD161의 차단은 CD161-발현 면역 세포에 의해 생산된 시토카인의 농도를 결정함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 NK 세포 또는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, CD161의 차단은 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포)에 반응하여 CD161-발현 T 세포에 의해 생산된 시토카인의 농도를 결정함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포에 의한 시토카인 생산의 증가는 CD161의 차단을 나타낸다. 일부 실시양태에서, CD161의 차단은 CD161-발현 면역 세포의 증식을 분석함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 증식의 증가는 CD161의 차단을 나타낸다. 일부 실시양태에서, CD161의 차단은 인산화의 정량화 또는 관련 전사 인자에 의해 유도된 유전자 리포터의 발현에 의해 세포 신호전달의 수준을 측정함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 증가된 세포 신호전달은 CD161의 차단을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 CD161 항체는 세포의 표면 상에 발현된 CD161에의 CLEC2D 결합을 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.75 nM, 0.5 nM, 0.1 nM, 0.075 nM, 또는 0.05 nM 이하의 IC50으로 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 항체는 CLEC2D 결합을 약 20 nM 내지 약 0.05 nM, 약 20 nM 내지 약 0.075 nM, 약 20 nM 내지 약 0.1 nM, 약 20 nM 내지 약 0.5 nM, 약 20 nM 내지 약 1 nM, 약 10 nM 내지 약 0.05 nM, 약 10 nM 내지 약 0.075 nM, 약 10 nM 내지 약 0.1 nM, 약 10 nM 내지 약 0.5 nM, 약 10 nM 내지 약 1 nM, 약 5 nM 내지 약 0.05 nM, 약 5 nM 내지 약 0.075 nM, 약 5 nM 내지 약 0.1 nM, 약 5 nM 내지 약 0.5 nM, 약 5 nM 내지 약 1 nM, 약 3 nM 내지 약 0.05 nM, 약 3 nM 내지 약 0.075 nM, 약 3 nM 내지 약 0.1 nM, 약 3 nM 내지 약 0.5 nM, 약 3 nM 내지 약 1 nM, 약 3 nM 내지 약 2 nM, 약 2 nM 내지 약 0.05 nM, 약 2 nM 내지 약 0.075 nM, 약 2 nM 내지 약 0.1 nM, 약 2 nM 내지 약 0.5 nM, 약 2 nM 내지 약 1 nM, 약 1 nM 내지 약 0.05 nM, 약 1 nM 내지 약 0.075 nM, 약 1 nM 내지 약 0.1 nM, 약 1 nM 내지 약 0.5 nM, 약 0.5 nM 내지 약 0.05 nM, 약 0.5 nM 내지 약 0.075 nM, 약 0.5 nM 내지 약 0.1 nM, 약 0.1 nM 내지 약 0.05 nM, 약 0.1 nM 내지 약 0.075 nM, 또는 약 0.075 nM 내지 약 0.05 nM의 IC50으로 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 항체는 CLEC2D 결합을 약 0.1 nM 내지 약 10 nM (예를 들어, 약 0.15 nM, 약 0.2 nM, 약 0.25 nM, 약 0.3 nM, 약 0.35 nM, 약 0.4 nM, 약 0.45 nM, 약 0.5 nM, 약 0.55 nM, 약 0.6 nM, 약 0.65 nM, 약 0.7 nM, 약 0.75 nM, 약 0.8 nM, 약 0.85 nM, 약 0.9 nM, 약 0.95 nM, 약 1 nM, 약 1.5 nM, 약 2 nM, 약 2.5 nM, 약 3 nM, 약 3.5 nM, 약 4 nM, 약 4.5 nM, 약 5 nM, 약 5.5 nM, 약 6 nM, 약 6.5 nM, 약 7 nM, 약 7.5 nM, 약 8 nM, 약 8.5 nM, 약 9 nM, 및 약 9.5 nM)의 IC50으로 감소시킨다.
특정 실시양태에서, CD161 항체는 hKLRF1, hKLRF2, hCLEC12B, hCLEC2D, 또는 그의 임의의 조합에 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1,000 nM, 1,500 nM, 2,000 nM, 3,000 nM, 4,000 nM, 5,000 nM, 10,000 nM, 또는 20,000 nM 또는 그 초과의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD161 항체는 인간 KLRF1에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, CD161 항체는 인간 KLRF2에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, CD161 항체는 인간 CLEC12B에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, CD161 항체는 인간 CLEC2D에 결합하지 않는다.
특정 실시양태에서, CD161 항체는 인간 CD161 및 시노몰구스 CD161에 결합한다. 특정 실시양태에서, 인간 CD161에 대한 결합 친화도 KD (1가 친화도 검정에 의해 측정됨)는 시노몰구스 CD161에 대한 친화도의 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배 또는 약 100배 이내이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CD161 항체는 CD161에의 CLEC2D 결합에 의해 T 세포 또는 NK 세포 활성의 억제를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, CD161에의 CLEC2D 결합에 의한 T 세포 또는 NK 세포 활성의 억제는 대조군 항체 (예를 들어, CD161에 결합하지 않는 항체)와 비교하여 적어도 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 또는 약 100배만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, CD161 항체는 CLEC2D의 존재 하의 T 세포 또는 NK 세포 활성을, 항체 또는 항원 결합 단편의 부재 하에서의 이러한 T 세포 또는 NK 세포 활성과 비교하여 증가시킨다. 특정 실시양태에서, T 세포 또는 NK 세포 활성은 대조군 항체 (예를 들어, CD161에 결합하지 않는 항체)와 비교하여 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 또는 약 100배만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, T 세포 또는 NK 세포는 CLEC2D를 발현하는 세포를 포함하는 미세환경 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, CD161 항체는 CLEC2D를 발현하는 종양 세포를 함유하는 종양 미세환경에서 T 세포 또는 NK 세포 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성의 증가는 NFAT 신호전달의 증가에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, NK 세포 활성의 증가는 CD107a 발현의 증가에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 종양 미세환경에서의 T 세포 또는 NK 세포 활성은 대조군 항체 (예를 들어, CD161에 결합하지 않는 항체)와 비교하여 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 또는 약 100배만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에 기재된 하나 이상의 검정 또는 생물학적 효과에 의해 측정된 바와 같이 CD161 억제 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CD161 항체는 CD161에의 CLEC2D의 결합으로 인한 CD161 억제 신호전달을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, CD161 억제 신호전달은 대조군 항체 (예를 들어, CD161에 결합하지 않는 항체)와 비교하여 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 또는 약 100배만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CD161 항체는 종양 미세환경 내에서 CD8+ T 세포의 활성화 및 시토카인 생산을 촉진한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 대조군 항체 (예를 들어, CD161에 결합하지 않는 항체)와 비교하여 종양 미세환경 내에서 CD8+ T 세포의 시토카인 생산을 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 또는 약 100배 활성화시키고 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 서열식별번호: 7에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 11에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 15에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 19에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 23에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 27에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 31에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 35에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 39에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 43에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 47에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 51에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 55에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 59에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 63에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 67에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 71에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 75에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 79에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 83에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 87에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 91에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 101에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 105에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 105의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 109에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 113에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 117에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 121에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 121의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 125에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 129에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 125의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 133에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 137에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 137의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 141에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 145에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 141의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 145의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 149에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 153에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 149의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 153의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 157에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 161에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 157의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 161의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 (i) 서열식별번호: 165에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 169에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고, (ii) 서열식별번호: 165의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 CD161에의 결합에 대해 경쟁하고/거나 그와 인간 CD161 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
본원에 개시된 항체는 친화도 및/또는 특이성을 비롯한 생화학적 특징을 개선시키고/거나, 응집, 안정성, 침전 및/또는 비-특이적 상호작용을 비롯한 생물물리학적 특성을 개선시키고/거나, 면역원성을 감소시키기 위해 추가로 최적화 (예를 들어, 친화도-성숙)될 수 있다. 예를 들어, DNA 셔플링, 쇄 셔플링, CDR 셔플링, 무작위 돌연변이유발 및/또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 이뮤노글로불린 중쇄 및/또는 이뮤노글로불린 경쇄 내로 다양성이 도입될 수 있다.
특정 실시양태에서, 단리된 인간 항체는 하나 이상의 체세포 돌연변이를 함유한다. 이들 경우에, 항체는 인간 배선 서열로 변형되어 항체를 최적화할 수 있다 (즉, 배선화로 지칭되는 과정).
일반적으로, 최적화된 항체는 그것이 유래된 비-최적화된 (또는 모) 항체와 적어도 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 항원에 대한 친화도를 갖는다. 바람직하게는, 최적화된 항체는 모 항체에 비해 항원에 대해 더 높은 친화도를 갖는다.
본원에 개시된 항체는 표준 시험관내 접합 화학을 사용하여 이펙터 작용제, 예컨대 소분자 독소 또는 방사성핵종에 접합될 수 있다. 이펙터 작용제가 폴리펩티드인 경우, 항체는 이펙터에 화학적으로 접합되거나 또는 융합 단백질로서 이펙터에 연결될 수 있다. 융합 단백질의 구축은 관련 기술분야의 통상의 기술 내에 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 (a)-(t)에 열거된 특징 중 하나 이상을 갖는다: (a) 인간 CD161에 결합하는 특징; (b) 인간 CD161 결합 부위에서 인간 CD161에 결합하는 특징; (c) 항-CD161 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 결합되는 CD161 에피토프에 결합하는 특징; (d) CLEC2D 결합 부위에서 또는 그 근처에서 인간 CD161에 결합하는 특징; (e) CD161에의 결합에 대해 CLEC2D와 경쟁하는 특징; (f) CD161에의 CLEC2D의 결합으로 인한 CD161 억제 신호전달을 감소시키는 특징; (g) CD161에의 CLEC2D 결합에 의한 T 세포 활성의 억제를 감소시키는 특징; (h) CD161에의 CLEC2D 결합에 의한 NK 세포 활성의 억제를 감소시키는 특징; (i) CLEC2D의 존재 하의 T 세포 활성을 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 부재 하의 이러한 T 세포 활성과 비교하여 증가시키는 특징; (j) CLEC2D의 존재 하의 NK 세포 활성을, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 부재 하에서의 이러한 NK 세포 활성과 비교하여 증가시키는 특징; (k) CLEC2D를 발현하는 세포를 포함하는 미세환경 내에 배치된 T 세포 활성을 증가시키는 특징; (l) CLEC2D를 발현하는 세포를 포함하는 미세환경 내에 배치된 NK 세포 활성을 증가시키는 특징; (m) CLEC2D를 발현하는 종양 세포를 포함하는 종양 미세환경에서 T 세포 활성을 증가시키는 특징; (n) CLEC2D를 발현하는 종양 세포를 포함하는 종양 미세환경에서 NK 세포 활성을 증가시키는 특징; (o) 인간 T 세포 소진을 억제하는 특징; (p) 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포의 활성화를 유도하거나 증가시키는 특징; (q) 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포에 의한 시토카인 생산을 유도하거나 증가시키는 특징; (r) 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포에 의한 그랜자임 B 발현을 유도하거나 증가시키는 특징; (s) 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포의 소진을 감소시키는 특징; (t) (a)-(s)의 임의의 조합.
3. 단일특이적 및 다중특이적 항-CD161 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 단일특이적 항체이다. 그러나, 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체이다. 예를 들어, 다중특이적 항체는 1개 초과의 항원, 예를 들어 2개의 항원, 3개의 항원, 항원 또는 5개의 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 CD161 항원 상의 1개 초과의 에피토프, 예를 들어 CD161 항원 상의 2개의 에피토프 또는 CD161 항원 상의 3개의 에피토프에 결합할 수 있다.
많은 다중특이적 항체 구축물이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 제공된 항체는 임의의 적합한 다중특이적 적합한 구축물의 형태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 각각 공통 경쇄 가변 영역과 쌍형성된 적어도 2개의 상이한 중쇄 가변 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 (즉, "공통 경쇄 항체")을 포함한다. 공통 경쇄 가변 영역은 각각의 2개의 상이한 중쇄 가변 영역과 별개의 항원-결합 도메인을 형성한다 (문헌 [Merchant et al. (1998) Nature Biotechnol., 16: 677-681] 참조, 그 전문이 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 이러한 이뮤노글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C-말단 중 1개 이상에 부착된 항체를 포함하는 이뮤노글로불린을 포함한다 (문헌 [Coloma and Morrison (1997) Nature Biotechnol., 15: 159-163] 참조, 그 전문이 참조로 포함됨). 일부 측면에서, 이러한 항체는 4가 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 중쇄 가변 영역 및 적어도 2개의 상이한 경쇄 가변 영역을 포함하는 하이브리드 이뮤노글로불린을 포함한다 (문헌 [Milstein and Cuello (1983) Nature, 305: 537-540; and Staerz and Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 1453-1457] 참조; 각각 그 전문이 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 다중-특이성을 갖지 않는 부산물의 형성을 감소시키는 변경을 갖는 이뮤노글로불린 쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 항체는 미국 특허 번호 5,731,168 (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 하나 이상의 "노브-인투-홀(knobs-into-holes)" 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 Fc 이종-다량체의 어셈블리를 촉진하는 1개 이상의 정전기적 변형을 갖는 이뮤노글로불린 쇄를 포함한다 (WO2009/089004 참조, 그 전문이 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 단일 쇄 분자를 포함한다 (문헌 [Traunecker et al. (1991) EMBO J., 10: 3655-3659; and Gruber et al. (1994) J. Immunol., 152: 5368-5374] 참조; 각각 그 전문이 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 링커의 길이는 목적하는 다중특이성을 갖는 다중특이적 항체의 어셈블리를 촉진하도록 선택된다. 예를 들어, 단일특이적 scFv는 일반적으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인이 12개 초과의 아미노산 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결되는 경우에 형성된다 (미국 특허 번호 4,946,778 및 5,132,405 참조, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 12개 미만의 아미노산 잔기로의 폴리펩티드 링커 길이의 감소는 동일한 폴리펩티드 쇄 상의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 쌍형성을 방지함으로써, 하나의 쇄로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인과 또 다른 쇄 상의 상보적 도메인의 쌍형성을 허용한다. 따라서, 생성된 항체는 다중-특이성을 가지며, 각각의 결합 부위의 특이성은 1개 초과의 폴리펩티드 쇄에 의해 기여된다. 3 내지 12개의 아미노산 잔기의 링커에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄는 우세하게 이량체 (디아바디로 지칭됨)를 형성한다. 링커가 0 내지 2개의 아미노산 잔기인 경우, 삼량체 (트리아바디로 명명됨) 및 사량체 (테트라바디로 명명됨)가 선호될 수 있다. 그러나, 올리고머화의 정확한 유형은 링커 길이 외에도, 아미노산 잔기 조성 및 각각의 폴리펩티드 쇄 내의 가변 도메인의 순서 (예를 들어, VH-링커-VL 대 VL-링커-VH)에 좌우되는 것으로 보인다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 목적하는 수준의 다중특이성에 기초하여 적절한 링커 길이를 선택할 수 있다.
일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 디아바디 (문헌 [Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448] 참조, 그 전문이 참조로 포함됨) 또는 트리아바디 (문헌 [Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods, 248: 47-66] 참조, 그 전문이 참조로 포함됨) 또는 테트라바디 (상기 문헌 참조, 그 전문이 참조로 포함됨)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 삼중특이적 F(ab')3 유도체를 포함한다 (문헌 [Tutt et al. (1991) J. Immunol., 147: 60-69] 참조, 그 전문이 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 가교된 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 4,676,980; 문헌 [Brennan et al. (1985) Science, 229: 81-83; Staerz et al. (1985) Nature, 314: 628-631]; 및 EP 0453082 참조; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 류신 지퍼에 의해 어셈블리된 항원-결합 도메인을 포함한다 (문헌 [Kostelny et al. (1992) J. Immunol., 148: 1547-1553] 참조, 그 전문이 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 다중특이적 항체는 예를 들어 문헌 [Labrijn et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110: 5145-5150; Gramer et al. (2013) mAbs, 5: 962-972; 및 Labrijn et al. (2014) Nature Protocols, 9: 2450-2463] (각각 그 전문이 참조로 포함됨)에서와 같은 듀오바디(DuoBody)®를 포함한다.
4. 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 글리코실화되는 정도를 증가, 감소 또는 제거하도록 변경될 수 있다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 "N-연결된" 또는 "O-연결된"이다. "N-연결된" 글리코실화는 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. "O-연결된" 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 또한 사용될 수 있다.
본원에 제공된 항체에 대한 또는 항체로부터의 N-연결된 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 상기 기재된 트리펩티드 서열 중 1개 이상이 생성 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. O-연결된 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 항체의 서열 내에 또는 (경우에 따라) 그에 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 결실 또는 치환에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 자연 발생 항체와 상이한 글리코실화 모티프를 포함한다. 임의의 적합한 자연 발생 글리코실화 모티프는 본원에 제공된 항체에서 변형될 수 있다. 이뮤노글로불린의 구조적 및 글리코실화 특성은, 예를 들어 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Schroeder and Cavacini (2010) J. Allergy Clin. Immunol., 125: S41-52] (그 전문이 참조로 포함됨)에 요약되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 아스파라긴 297 (Asn 297)에 부착된 올리고사카라이드에 대한 변형을 갖는 IgG1 Fc 영역을 포함한다. 포유동물 세포에 의해 생산된 자연 발생 IgG1 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn 297에 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형, 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다 (문헌 [Wright et al. (1997) TIBTECH, 15: 26-32] 참조, 그 전문이 참조로 포함됨). Asn 297에 부착된 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예컨대 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, Asn 297에 부착된 올리고사카라이드는 변경된 ADCC를 갖는 항체를 생성하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드는 ADCC를 개선시키도록 변경된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드는 ADCC를 감소시키도록 변경된다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 항체는 자연 발생 IgG1 도메인과 비교하여 위치 Asn 297에서 감소된 푸코스 함량을 갖는 IgG1 도메인을 포함한다. 이러한 Fc 도메인은 개선된 ADCC를 갖는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Shields et al. (2002) J. Biol. Chem., 277: 26733-26740] 참조, 그 전문이 참조로 포함됨). 일부 측면에서, 이러한 항체는 위치 Asn 297에 어떠한 푸코스도 포함하지 않는다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO2008/077546 (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 이등분된 올리고사카라이드, 예컨대 GlcNAc에 의해 이등분된 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들어 WO 2003/011878; 및 미국 특허 번호 6,602,684에 기재되어 있으며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들어 WO1997/30087; WO1998/58964; 및 WO1999/22764에 기재되어 있으며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. (1986) Arch. Biochem. Biophys., 249: 533-545]; 미국 특허 공개 번호 2003/0157108; WO2004/056312 참조; 각각 그 전문이 참조로 포함됨), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 또는 FUT8 녹아웃 CHO 세포 (문헌 [Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotech. Bioeng., 87: 614-622; Kanda et al. (2006) Biotechnol. Bioeng., 94: 680-688]; 및 WO2003/085107 참조; 각각 그 전문이 참조로 포함됨)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 비-글리코실화 항체이다. 비-글리코실화 항체는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 측면에서, 비-글리코실화 항체는 항체를 변형시켜 모든 글리코실화 부위를 제거함으로써 생산된다. 일부 측면에서, 글리코실화 부위는 항체의 Fc 영역으로부터만 제거된다. 일부 측면에서, 비-글리코실화 항체는 글리코실화가 불가능한 유기체, 예컨대 이. 콜라이에서 항체를 발현시킴으로써, 또는 무세포 반응 혼합물에서 항체를 발현시킴으로써 생산된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 천연 IgG1 항체와 비교하여 감소된 이펙터 기능을 갖는 불변 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 본원에 제공된 항체의 Fc 영역의 불변 영역의 친화도는 이러한 Fc 수용체에 대한 천연 IgG1 불변 영역의 친화도보다 낮다.
5. Fc 영역
본 개시내용의 항-CD161 항체는 IgG 유형 항체이다. 예를 들어, 표 4에 개시된 각각의 항-CD161 항체는 이뮤노글로불린 Fc 도메인 (예를 들어, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4, 인간 IgA1, 인간 IgA2, 인간 IgD, 인간 IgE 또는 인간 IgM Fc 도메인으로부터 유래된 이뮤노글로불린 Fc 도메인)에 융합된다. 예시적 실시양태에서, 표 4에 개시된 각각의 항-CD161 항체는 인간 IgG1로부터 유래된 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 융합된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 자연 발생 Fc 영역과 비교하여 1개 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 이러한 치환, 삽입 또는 결실은 변경된 안정성, 글리코실화 또는 다른 특징을 갖는 항체를 생성한다. 일부 측면에서, 이러한 치환, 삽입 또는 결실은 비-글리코실화 항체를 생성한다.
특정 실시양태에서, 이뮤노글로불린 Fc 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM Fc 도메인으로부터 유래된다. 단일 아미노산 치환 (카바트 넘버링에 따른 S228P; IgG4Pro로 지정됨)을 도입하여 재조합 IgG4 항체에서 관찰된 이질성을 없앨 수 있다 (문헌 [Angal, S. et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-108] 참조).
일부 측면에서, 본원에 제공된 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체에 대해 변경된 친화도를 갖는 항체 또는 보다 면역학적으로 불활성인 항체를 생성하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 변이체는 전부는 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유한다. 이러한 항체는, 예를 들어 항체의 반감기가 생체내에서 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 활성화 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 경우에 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 Fc 영역은 힌지 안정화 돌연변이 S228P 및 L235E 중 1개 이상을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다 (문헌 [Aalberse et al. (2002) Immunology, 105: 9-19] (그 전문이 참조로 포함됨) 참조). 일부 실시양태에서, IgG4 Fc 영역은 하기 돌연변이: E233P, F234V, 및 L235A 중 1개 이상을 포함한다 (문헌 [Armour et al. (2003) Mol. Immunol., 40: 585-593] 참조,그 전문이 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, IgG4 Fc 영역은 위치 G236에서의 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체 결합을 감소시키는 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 미국 특허 번호 8,394,925 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것과 같은 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 위치 428 및 434에서 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역이고, 여기서 아미노산 치환은 위치 428에서 야생형 아미노산이 아닌 류신 및 위치 434에서 야생형 아미노산이 아닌 세린이고, 폴리펩티드는 항체이고, 넘버링은 카바트 등의 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 S228P, L235E, M428L 또는 N434S 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 M428L 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 N434S 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 M428L 및 N434S 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 M252Y, S254T 및/또는 T256E 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 항체는 PVA236 돌연변이를 포함한다. PVA236은 IgG1의 아미노산 위치 233 내지 236으로부터의 아미노산 서열 ELLG (서열식별번호: 195) 또는 IgG4의 EFLG (서열식별번호: 196)가 PVA에 의해 대체된 것을 의미한다 (미국 특허 번호 9,150,641 (그 전문이 참조로 포함됨) 참조).
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 Fc 영역은 돌연변이 A330S 및 P331S 중 1개 이상을 포함하는 인간 IgG2 Fc 영역이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 Fc 영역은 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 갖는다 (미국 특허 번호 6,737,056 (그 전문이 참조로 포함됨) 참조). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체, 예컨대 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581 (그 전문이 참조로 포함됨) 참조). 일부 실시양태에서, 항체는 아미노산 위치 265에 알라닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 아미노산 위치 297에 알라닌을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG1 불변 영역은 항체의 글리코실화를 방지하기 위해 아미노산 Asn297에서 변형되며, 예를 들어 Asn297Ala (N297A)이다. 특정 실시양태에서, 돌연변이는 Fcγ 수용체 (예를 들어, RI, RIIA, RIIB/C, RIIA 및 RIIIB)에 대한 본원에 개시된 항-CD161 항체의 결합을 제거하는 데 효과적이다. 특정 실시양태에서, 돌연변이는 Fcγ 수용체 (예를 들어, RI, RIIA, RIIB/C, RIIA 및 RIIIB)에 대한 본원에 개시된 항-CD161 항체의 결합을 유의하게 감소시키는 데 효과적이다. 예시적 실시양태에서, 표 4에 개시된 각각의 항-CD161 항체는 아미노산 Asn297에서 변형된 인간 IgG1 불변 영역에 융합된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ADCC를 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환, 예컨대 Fc 영역의 위치 298, 333 및 334 중 1개 이상에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 문헌 [Lazar et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 4005-4010] (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 위치 239, 332 및 330에서 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 반감기를 증가시키는 하나 이상의 변경을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 돌연변이, 예컨대 미국 특허 번호 7,670,600 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 카바트의 EU 넘버링 인덱스에 따라 넘버링된, 야생형 인간 IgG 불변 도메인에 비해 아미노산 잔기 428에서의 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 임의의 특정 이론에 매이지 않지만, 잔기 428에 상응하는 돌연변이를 포함하는 항체는 야생형 인간 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 반감기에 비해 증가된 반감기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 트레오닌, 류신, 페닐알라닌 또는 세린으로의 천연 잔기의 치환이다. 일부 실시양태에서, 항체는 카바트 EU 넘버링 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산 잔기 251-256, 285-290, 308-314, 385-389, 및 429-436 중 1개 이상에서 상응하는 야생형 인간 IgG 불변 도메인에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 이들 위치에서의 특이적 돌연변이 또는 치환은 미국 특허 번호 7,670,600에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
6. 감소된 면역원성을 갖는 항체
항체가 인간에게 투여되는 경우, 항체는 바람직하게는 인간 항체이거나, 또는 인간에서 항원성을 감소시키거나 제거하도록 조작된다. 바람직하게는, 각각의 인간화 항체는 항원이 유래된 비-인간화 마우스 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 항원에 대한 친화도를 갖는다.
한 인간화 접근법에서, 마우스 이뮤노글로불린 불변 영역이 인간 이뮤노글로불린 불변 영역으로 대체된 키메라 단백질이 생성된다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., 1984, PROC. NAT. ACAD. SCI. 81:6851-6855, Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608]; 미국 특허 번호 6,893,625 (Robinson); 5,500,362 (Robinson); 및 4,816,567 (Cabilly)울 참조한다.
CDR 그라프팅으로 공지된 접근법에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR은 또 다른 종으로부터의 프레임워크 내로 그라프트된다. 예를 들어, 뮤린 CDR은 인간 프레임워크 영역 (FR) 내로 그라프팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR은 인간 FR 또는 컨센서스 인간 FR 내로 그라프트된다. 컨센서스 인간 FR을 생성하기 위해, 여러 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 FR을 정렬하여 컨센서스 아미노산 서열을 확인한다. CDR 그라프팅은 미국 특허 번호 7,022,500 (Queen); 6,982,321 (Winter); 6,180,370 (Queen); 6,054,297 (Carter); 5,693,762 (Queen); 5,859,205 (Adair); 5,693,761 (Queen); 5,565,332 (Hoogenboom); 5,585,089 (Queen); 5,530,101 (Queen); 문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536; and Winter (1998) Febs Lett 430: 92-94]에 기재되어 있다.
"초인간화(SUPERHUMANIZATION)™"라 불리는 접근법에서, 인간 CDR 서열은 인간화될 마우스 항체의 것에 대한 인간 CDR의 구조적 유사성에 기초하여 인간 배선 유전자로부터 선택된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,881,557 (Foote); 및 문헌 [Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125]을 참조한다.
면역원성을 감소시키는 다른 방법은 "재성형", "과다키메라화" 및 "베니어링/재표면화"를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Vaswami et al., 1998, Annals Of Allergy, Asthma, & Immunol. 81:105; Roguska et al., 1996, Prot. Engineer 9:895-904]; 및 미국 특허 번호 6,072,035 (Hardman)을 참조한다. 베니어링/재표면화 접근법에서, 뮤린 항체 내의 표면 접근가능한 아미노산 잔기는 인간 항체 내의 동일한 위치에서 보다 빈번하게 발견되는 아미노산 잔기로 대체된다. 이러한 유형의 항체 재표면화는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,639,641 (Pedersen)에 기재되어 있다.
마우스 항체를 인간에서의 의학적 용도에 적합한 형태로 전환시키기 위한 또 다른 접근법은 포유동물 세포에서 항체를 발현시키기 위한 백시니아 바이러스-기반 벡터를 수반하는 악티브맙(ACTIVMAB)™ 기술 (백시넥스, 인크.(Vaccinex, Inc.), 뉴욕주 로체스터)로 공지되어 있다. IgG 중쇄 및 경쇄의 조합 다양성의 높은 수준이 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,706,477 (Zauderer); 6,800,442 (Zauderer); 및 6,872,518 (Zauderer)을 참조한다. 마우스 항체를 인간에서 사용하기에 적합한 형태로 전환시키기 위한 또 다른 접근법은 칼로바이오스 파마슈티칼스, 인크.(KaloBios Pharmaceuticals, Inc.) (캘리포니아주 팔로 알토)에 의해 상업적으로 실시되는 기술이다. 이 기술은 항체 선택을 위한 "에피토프 집중" 라이브러리를 생산하기 위해 독점적 인간 "수용자" 라이브러리의 사용을 수반한다. 마우스 항체를 인간에서의 의학적 사용에 적합한 형태로 변형시키기 위한 또 다른 접근법은 조마 (US) 엘엘씨(XOMA (US) LLC)에 의해 상업적으로 실시되는 인간 조작(HUMAN ENGINEERING)™ 기술이다. 예를 들어, 국제 (PCT) 공개 번호 WO 93/11794 및 미국 특허 번호 5,766,886 (Studnicka); 5,770,196 (Studnicka); 5,821,123 (Studnicka); 및 5,869,619 (Studnicka)를 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
임의의 상기 접근법을 비롯한 임의의 적합한 접근법을 사용하여 항체의 인간 면역원성을 감소 또는 제거할 수 있다.
또한, 마우스에서 완전 인간 항체를 생성하는 것이 가능하다. 임의의 비-인간 서열이 결여된 완전 인간 mAb는 예를 들어 문헌 [Lonberg et al., NATURE 368:856-859, 1994; Fishwild et al., NATURE BIOTECHNOLOGY 14:845-851, 1996; and Mendez et al., NATURE GENETICS 15:146-156, 1997]에 언급된 기술에 의해 인간 이뮤노글로불린 트랜스제닉 마우스로부터 제조될 수 있다. 완전 인간 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 문헌 [Knappik et al., J. MOL. BIOL. 296:57-86, 2000; and Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254:67-84 2001]에 언급된 기술에 의해 파지 디스플레이 라이브러리로부터 제조 및 최적화될 수 있다.
7. 항-CD161 항체-약물 접합체
본 개시내용은 본원에 개시된 항체 중 1종 이상을 함유하는 항체 접합체를 추가로 제공한다. 본원에 사용되고 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체 접합체"는 추가의 관능성 모이어티에 접합된 (예를 들어, 공유 커플링된) 항원-결합 활성 (예를 들어, 항-CD161 항원-결합 활성) 및/또는 Fc 수용체-결합 활성을 포함하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 지칭하는 것으로 이해된다.
특정 실시양태에서, 항체 접합체는 CD161에 특이적으로 결합하는 항체 및 세포독성제를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)이다. 세포독성제는 항-CD161 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, ADC는 세포독성제를 항-CD161 항체에 공유 연결하는 링커를 추가로 포함한다.
생성된 ADC에 유용한 예시적인 세포독성제는, 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 특정 항종양제 또는 항암제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 암 세포의 파괴를 유발한다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 암 세포의 성장 또는 증식을 억제한다. 예시적인 세포독성제는 항혈관신생제, 아폽토시스촉진제, 항유사분열제, 항키나제제, 알킬화제, 호르몬, 호르몬 효능제, 호르몬 길항제, 케모카인, 약물, 전구약물, 독소, 효소, 항대사물, 항생제, 알칼로이드 및 방사성 동위원소를 포함한다.
특정 실시양태에서, 세포독성제는 링커를 통해 항-CD161 항체에 커플링된다. 일부 실시양태에서, ADC를 생성하는 데 사용된 링커는 2개의 반응성 말단: 항체 접합 반응성 말단 및 세포독성제 접합 반응성 말단을 포함한다. 링커의 항체 접합 반응성 말단은 항체 상의 시스테인 티올 또는 리신 아민 기를 통해, 예를 들어 티올-반응성 기, 예컨대 이중 결합, 이탈기, 예컨대 클로로, 브로모 또는 아이오도, R-술파닐 기 또는 술포닐 기, 또는 아민-반응성 기, 예컨대 카르복실 기를 통해 항체에 접합될 수 있다. 링커의 세포독성제 접합 반응성 말단은, 예를 들어 세포독소 상의 염기성 아민 또는 카르복실 기, 전형적으로 카르복실 또는 염기성 아민 기와의 아미드 결합의 형성을 통해 세포독성제에 접합될 수 있다.
ADC의 의도된 목적에 따라, 링커는 비-절단가능한 링커 또는 절단가능한 링커일 수 있다.
8. CD161 항체의 제조 방법
8.1 CD161 항원 제조
본원에 제공된 항체의 단리에 사용된 CD161 항원은 무손상 CD161 또는 CD161의 단편일 수 있다. CD161 항원은 예를 들어 단리된 단백질 또는 세포의 표면 상에 발현된 단백질의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD161 항원은 CD161의 비-자연 발생 변이체, 예컨대 자연에서 발생하지 않는 아미노산 서열 또는 번역후 변형을 갖는 CD161 단백질이다.
일부 실시양태에서, CD161 항원은 예를 들어 세포내 또는 막-관통 서열, 또는 신호 서열의 제거에 의해 말단절단된다. 일부 실시양태에서, CD161 항원은 그의 C-말단에서 인간 IgG1 Fc 도메인 또는 폴리히스티딘 태그에 융합된다.
8.2 모노클로날 항체의 제조 방법
모노클로날 항체는, 예를 들어 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature, 256: 495-497] (그 전문이 참조로 포함됨)에 최초로 기재된 하이브리도마 방법, 및/또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (그 전문이 참조로 포함됨) 참조)을 이용하여 수득할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 파지-디스플레이 라이브러리 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,258,082 (그 전문이 참조로 포함됨) 참조)를 사용하거나, 또는 다르게는 효모-기반 라이브러리 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,691,730 및 9,354,228 (그 전문이 참조로 포함됨) 참조)를 사용하여 수득될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하도록 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding J.W. (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 3rd ed., Academic Press, San Diego, CA] (그 전문이 참조로 포함됨) 참조).
하이브리도마 세포는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩되고 성장된다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 막는다.
유용한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 높은 수준 생산을 지지하고, 배지 조건, 예컨대 HAT 배지의 존재 또는 부재에 감수성이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 MOP-21 및 MC-11 마우스 종양 (솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) (캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능함), 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능함)로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기재되었다 (예를 들어, 문헌 [Kozbor (1984) J. Immunol., 133: 3001] (그 전문이 참조로 포함됨) 참조).
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 생물학적 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 확인 후에, 선택된 클론을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (상기 문헌 [Goding] 참조). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장될 수 있다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다. 따라서, 하이브리도마 세포는 목적하는 특성을 갖는 항체를 코딩하는 DNA의 유용한 공급원으로서 기능할 수 있다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터에 넣을 수 있고, 이어서 이를 달리 항체를 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이), 효모 (예를 들어, 사카로미세스 또는 피키아 종), COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 모노클로날 항체를 생산한다.
8.3 감소된 면역원성을 갖는 항체를 제조하는 방법
인간화 항체는 비-인간 모노클로날 항체의 구조적 부분의 대부분 또는 전부를 상응하는 인간 항체 서열로 대체함으로써 생성될 수 있다. 결과적으로, 항원-특이적 가변기 또는 CDR만이 비-인간 서열로 구성된 하이브리드 분자가 생성된다. 인간화 항체를 수득하는 방법은 예를 들어 문헌 [Winter and Milstein (1991) Nature, 349: 293-299; Rader et al. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95: 8910-8915; Steinberger et al. (2000) J. Biol. Chem., 275: 36073-36078; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033]; 및 미국 특허 번호 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762 및 6,180,370에 기재된 것들을 포함하고; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술에 의해, 예를 들어 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 인간화 마우스)을 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551; Jakobovits et al. (1993) Nature, 362: 255-258; Bruggermann et al. (1993) Year in Immuno., 7: 33]; 및 미국 특허 번호 5,591,669, 5,589,369 및 5,545,807을 참조하고, 이들 각각은 전문이 참조로 포함된다. 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hoogenboom et al. (1991) J. Mol. Biol., 227: 381-388; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597; 및 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905 참조; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨). 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,567,610 및 5,229,275 (이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨) 참조). 인간 항체는 또한 효모-기반 라이브러리로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,691,730 및 9,354,228 (그 전문이 참조로 포함됨) 참조).
키메라 항체를 제조하는 예시적인 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855]에 기재되어 있으며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역)을 인간 불변 영역과 조합하는 재조합 기술을 사용하여 제조된다.
8.4 항체 단편의 제조 방법
본원에 제공된 항체 단편은 본원에 기재된 예시적인 방법 또는 관련 기술분야에 공지된 것들을 포함한 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 적합한 방법은 재조합 기술 및 전체 항체의 단백질분해적 소화를 포함한다. 항체 단편을 제조하는 예시적인 방법은 예를 들어 문헌 [Hudson et al. (2003) Nat. Med., 9: 129-134] (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. scFv 항체의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Plueckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]; WO93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458에 기재되어 있으며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
8.5 다중특이적 항체의 제조 방법
본원에 제공된 다중특이적 항체는 본원에 기재된 예시적인 방법 또는 관련 기술분야에 공지된 것들을 포함한 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 공통 경쇄 항체를 제조하는 방법은 문헌 [Merchant et al. (1998) Nature Biotechnol., 16: 677-681] (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 4가 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 문헌 [Coloma and Morrison (1997) Nature Biotechnol., 15: 159-163] (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 하이브리드 이뮤노글로불린의 제조 방법은 문헌 [Milstein and Cuello (1983) Nature, 305: 537-540; and Staerz and Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 1453-1457]에 기재되어 있으며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다. 노브-인투-홀 변형을 갖는 이뮤노글로불린의 제조 방법은 미국 특허 번호 5,731,168 (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 정전기적 변형을 갖는 이뮤노글로불린의 제조 방법은 WO 2009/089004 (그 전문이 참조로 포함됨)에 제공되어 있다. 이중특이적 단일 쇄 항체를 제조하는 방법은 문헌 [Traunecker et al. (1991) EMBO J., 10: 3655-3659; and Gruber et al. (1994) J. Immunol., 152: 5368-5374]에 기재되어 있으며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다. 링커 길이가 달라질 수 있는 단일쇄 항체의 제조 방법은 미국 특허 번호 4,946,778 및 5,132,405에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다. 디아바디의 제조 방법은 문헌 [Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, , 90: 6444-6448] (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디의 제조 방법은 문헌 [Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods, 248: 47-66] (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 삼중특이적 F(ab')3 유도체의 제조 방법은 문헌 [Tutt et al. (1991) J. Immunol., 147: 60-69] (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 가교된 항체를 제조하는 방법은 미국 특허 번호 4,676,980; 문헌 [Brennan et al. (1985) Science, 229: 81-83; Staerz et al. (1985) Nature, 314: 628-631]; 및 EP 0453082에 기재되어 있으며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
8.6 변이체의 제조 방법
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는, 예를 들어 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 생성될 수 있는 모 항체의 친화도 성숙 변이체이다. 간략하게, 1개 이상의 CDR 잔기가 돌연변이될 수 있고, 변이체 항체 또는 그의 부분이 파지 상에 디스플레이되고, 친화도에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟", 또는 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩되는 잔기 (문헌 [Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol., 207: 179-196] (그 전문이 참조로 포함됨) 참조) 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 이루어질 수 있다.
오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 및 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 예컨대 트리뉴클레오티드-지정 돌연변이유발 (TRIM)을 비롯한 임의의 적합한 방법을 사용하여 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(들)에 가변성을 도입할 수 있다. 일부 측면에서, 여러 CDR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3은 특히 종종 돌연변이를 위해 표적화된다.
가변 영역 및/또는 CDR 내로의 다양성의 도입은 2차 라이브러리를 생산하는 데 사용될 수 있다. 이어서, 2차 라이브러리를 스크리닝하여 개선된 친화도를 갖는 항체 변이체를 확인한다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. (2001) Methods Mol. Biol., 178: 1-37] (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
8.7 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
또한, CD161 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 및 벡터 및 핵산을 포함하는 숙주 세포, 뿐만 아니라 항체의 생산을 위한 재조합 기술이 제공된다.
항체의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산(들)을 단리하고, 추가의 클로닝 (즉, DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입할 수 있다. 일부 측면에서, 핵산은 예를 들어 미국 특허 번호 5,204,244 (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 상동 재조합에 의해 생산될 수 있다.
많은 상이한 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 벡터 성분은 일반적으로 예를 들어 미국 특허 번호 5,534,615 (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 신호 서열, 복제 기점, 1종 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다.
적합한 숙주 세포의 예시적인 예는 임의의 적합한 원핵 (예를 들어, 박테리아), 하등 진핵 (예를 들어, 효모), 또는 고등 진핵 (예를 들어, 포유동물) 세포를 포함한다. 적합한 원핵생물은 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아(Escherichia) (이. 콜라이), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella) (에스. 티피뮤리움(S. typhimurium)), 세라티아(Serratia) (에스. 마르세스칸스(S. marcescans)), 시겔라(Shigella), 바실리(Bacilli) (비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis)), 슈도모나스(Pseudomonas) (피. 아에루기노사(P. aeruginosa)) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 한 유용한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294이지만, 다른 균주, 예컨대 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 및 이. 콜라이 W3110이 또한 적합하다.
원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모가 또한 CD161 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 빵 효모는 통상적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스(Kluyveromyces) (케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus), 케이. 위케라미이(K. wickeramii), 케이. 왈티이(K. waltii), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus)), 야로위아(Yarrowia), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다(Candida) (씨. 알비칸스(C. albicans)), 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 슈완니오미세스(Schwanniomyces) (에스. 옥시덴탈리스(S. occidentalis)), 및 사상 진균, 예컨대 예를 들어 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스페르길루스(Aspergillus) (에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger))가 이용가능하고 유용하다.
유용한 포유동물 숙주 세포는 COS-7 세포, HEK293 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), 마우스 세르톨리 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76) 등을 포함한다.
본 발명의 CD161 항체를 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예를 들어 햄(Ham) F10, 최소 필수 배지 (MEM), RPMI-1640, 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al. (1979) Meth. Enz., 58: 44; Barnes et al. (1980) Anal. Biochem., 102: 255]; 및 미국 특허 번호 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, 및 5,122,469; 또는 WO1990/03430 및 WO1987/00195 (이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 임의의 배지가 사용될 수 있다.
임의의 이들 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제, 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다.
배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내에서 주변세포질 공간에서 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 파편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 예를 들어, 문헌 [Carter et al. (1992) Bio/Technology, 10: 163-167] (그 전문이 참조로 포함됨)은 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하는 절차를 기재한다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 무세포 시스템에서 생산된다. 일부 측면에서, 무세포 시스템은 문헌 [Yin et al. (2012) mAbs, 4: 217-225] (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 시험관내 전사 및 번역 시스템이다. 일부 측면에서, 무세포 시스템은 진핵 세포 또는 원핵 세포로부터의 무세포 추출물을 이용한다. 일부 측면에서, 원핵 세포는 이. 콜라이이다. 항체의 무세포 발현은, 예를 들어 항체가 불용성 응집체로서 세포에 축적되는 경우, 또는 주변세포질 발현으로부터 수율이 낮은 경우에 유용할 수 있다.
항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 일반적으로 먼저 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon)® 또는 밀리포어(Millipore)® 펠콘(Pellcon)® 한외여과 단위를 사용하여 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF는 단백질분해를 억제하기 위해 임의의 상기 단계에 포함될 수 있고, 항생제는 우발적 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 특히 유용한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 포함하는 항체를 정제할 수 있다 (문헌 [Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth., 62: 1-13] (그 전문이 참조로 포함됨)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 유용하다 (문헌 [Guss et al. (1986) EMBO J., 5: 1567-1575] (그 전문이 참조로 포함됨)).
친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 세공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 가공 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(BakerBond) ABX® 수지가 정제에 유용하다.
단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼 상에서의 분별증류, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스® 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 이용가능하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적용될 수 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 일반적으로 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0 내지 약 0.25 M 염)에서 수행되는, 약 2.5 내지 약 4.5의 pH의 용리 완충제를 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
9. 기능적 검정
관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 본원에 제공된 항-CD161 항체 및 항-CD161 ADC를 확인하고 특징화할 수 있다.
9.1 결합, 경쟁 및 에피토프 맵핑 검정
9.1.1 항원-결합 검정
일부 실시양태에서, 항원-결합 활성은 항원-결합 검정을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 검정은 본원에 개시된 항체의 결합 친화도 (KD)를 결정한다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 검정은 CD161 폴리펩티드에 대한 항-CD161 항체의 결합 상호작용에 대한 동역학적 속도 상수 (예를 들어, kon, koff)를 결정한다. 일부 실시양태에서, 표적 분자에 대한 CD161 항체의 결합 상호작용의 동역학적 특징은 옥테트 QK384 검정을 사용하여 결정된다.
항원-결합 활성 검정의 예가 본원에 제공되지만, 본원에 제공된 CD161 항체의 특이적 항원-결합 활성은 또한 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 생물층 간섭측정법 (BLI), 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 동역학적 배제 검정 (KinExA), 겔-이동 검정, 풀-다운 검정, 정량적 이뮤노블롯, 평형 투석, 분석용 초원심분리, 형광 이방성, 용액 평형 적정, 동역학적 배제 검정 및 등온 적정 열량측정법을 사용하는 것을 포함한 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 이들 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 항원-결합 검정은 세포 표면 상에 발현된 CD161 폴리펩티드에 대한 표지된 항-CD161 항체의 결합 친화도를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD161 항체는 형광 분자 (예를 들어, 형광 염료)로 표지된다. 일부 실시양태에서, 결합은 형광 검출 방법 (예를 들어, 유동 세포측정법)을 사용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 항원을 발현하는 세포에 대한 본원에 개시된 항-CD161 항체의 결합은 항원의 발현이 결여된 참조 세포와 비교된다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 검정은 표면 플라즈몬 공명이다. "표면 플라즈몬 공명"은 예를 들어 비아코어(BIAcore) 시스템 (파마시아 바이오센서 아베(Pharmacia Biosensor AB), 스웨덴 웁살라 및 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경의 검출에 의해 실시간 생체특이적 상호작용의 분석을 허용하는 광학 현상을 포함한다. 추가의 설명에 대해서는, 문헌 [Joensson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin., 51: 19-26; Joensson, U., et al. (1991) Biotechniques, 11: 620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit., 8: 125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem., 198: 268-277]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 검정은 생물층 간섭측정법 (BLI)이다. 어구 "생물층 간섭측정법" 또는 "BLI"는 그의 광학 층 검출 표면의 두께에서의 서브-나노미터 변화의 측정을 가능하게 하는 광학 현상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체분자는 센서 표면에 결합하여 광학 층 두께를 변화시킨다. 광학 층 두께 변화의 크기는 결합 분자의 질량 또는 분자량에 비례한다. 일부 실시양태에서, CD161을 센서 표면에 고정시켜 항체에 의한 결합을 측정하며, 여기서 결합은 분자량에서의 변화를 생성하여 광학 층 두께에서의 상응하는 변화를 생성한다. CD161이 센서 표면에 고정된 일부 실시양태에서, 항-CD161 항체의 샘플은 연속 희석에 의해 제조되고 주입되고, KD 값은 항체 농도에 대한 결합 곡선의 모델링으로부터 계산된다. 일부 실시양태에서, BLI는 옥테트 QK384 시스템 (포르테바이오)으로 수행되며, 즉 항원-결합 검정은 옥테트 QK384 검정이다.
9.1.2 리간드-결합 검정
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD161 항체는 인간 CD161에 결합하고, 리간드 결합 검정에 의해 결정 시 CLEC2D에 의한 결합을 차단 또는 억제한다. 리간드 결합 검정은 수용체와 리간드 사이에 발생하는 상호작용 및/또는 친화도의 척도를 제공하는 검정이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 리간드 결합 검정은 수용체 (예를 들어, CD161)에 대한 리간드 분자 (예를 들어, CLEC2D)의 결합의 정도를 결정하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 검정은 리간드와 수용체 사이의 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용체에의 리간드 결합의 정도를 결정하기 위해, 리간드 결합 검정은 리간드:수용체 복합체의 해리를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드:수용체 복합체의 형성 및/또는 해리는 수용체와 복합체화된 형광-표지된 리간드의 검출에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 리간드:수용체 복합체의 형성 및/또는 해리는 리간드와 복합체화된 형광-표지된 수용체의 양의 검출 및/또는 정량화에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 리간드:수용체 복합체의 형성 및/또는 해리는 리간드:수용체 복합체에 특이적으로 결합하는 형광-표지된 항체의 양의 검출 및/또는 정량화에 의해 결정된다. 형광을 검출 및 정량하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 형광 편광 (FP), 형광 이방성 (FA), 유동 세포측정법 및 현미경검사를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 리간드:수용체 복합체의 형성 및/또는 해리는 수용체와 복합체화된 방사성-표지된 리간드의 양의 검출 및/또는 정량화에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 리간드:수용체 복합체의 형성 및/또는 해리는 리간드와 복합체화된 방사성-표지된 수용체의 양의 검출 및/또는 정량화에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 리간드:수용체 복합체의 형성 및/또는 해리는 리간드:수용체 복합체에 특이적으로 결합하는 방사성-표지된 항체의 양의 검출 및/또는 정량화에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 (예를 들어, 항-CD161 항체)는 수용체 (예를 들어, CD161)에 결합하고, 리간드:수용체 복합체 (예를 들어, CD161:CLEC2D 복합체)의 형성을 파괴, 억제 또는 차단한다.
9.1.3 경쟁 검정
2개의 항체들 또는 항체와 또 다른 분자 (예를 들어, CD161의 1개 이상의 리간드) 사이의 경쟁을 측정하기 위한 검정은 관련 기술분야에, 예를 들어 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.] (그 전문이 참조로 포함됨)에 널리 공지되어 있다.
9.1.4 에피토프 맵핑 검정
본원에 기재된 CD161 항체는 CD161 상의 에피토프 결합을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, CD161 리간드 상의 각각의 CD161 항체의 결합 에피토프는 표면 플라즈몬 공명에 의해, 예를 들어 비아코어 8K 기기를 사용하여 결정된다. 본원에 제공된 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위한 검정은 예를 들어 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology, vol. 66, Humana Press, Totowa, N.J.] (그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 펩티드 경쟁에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 질량 분광측정법에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 결정학 (예를 들어, X선 결정학)에 의해 결정된다. 결합된 항체-항원 쌍의 결정 구조는 항원의 에피토프 및 항체의 파라토프 둘 다에서 측쇄 및 주쇄 원자 둘 다로부터의 개별 아미노산 사이의 주요 상호작용의 매우 정확한 결정을 가능하게 한다. 서로 4 옹스트롬 (Å) 내에 있는 아미노산은 일반적으로 접촉 잔기인 것으로 간주된다. 방법론은 전형적으로 항체 및 항원의 정제, 복합체의 형성 및 정제, 이어서 회절-품질 결정을 수득하기 위한 결정화 스크린 및 최적화의 연속 라운드를 수반한다. 구조적 해법은 흔히 싱크로트론 공급원에서 X선 결정학 후에 얻어진다. 따라서, 본 개시내용에 의해 제공된 항-CD161 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 CD161에 결합된 항체, 또는 그의 단편 또는 부분을 포함하는 결정 구조의 X선 결정학적 분석을 통해 평가될 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용이 제공하는 항체가 결합하는 에피토프는 항체 파라토프 잔기의 4 옹스트롬 (Å) 내에 존재하거나 위치하는 인간 CD161 항원 상의 잔기를 결정함으로써 확인된다. 에피토프 맵핑을 위한 다른 구조적 방법은 질량 분광측정법에 커플링된 수소-중수소 교환, 가교-커플링된 질량 분광측정법, 및 핵 자기 공명 (NMR)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 상기 문헌 [Morris (1996), supra; Abbott et al. (2014) Immunology, 142(4): 526-535] 참조).
에피토프 맵핑을 위한 기능적 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 전형적으로 전체 단백질, 단백질 단편 또는 펩티드에의 항체 결합의 평가 또는 정량화를 수반한다. 에피토프 맵핑을 위한 기능적 방법은, 예를 들어 선형 또는 입체형태적 에피토프를 확인하는 데 사용될 수 있고/거나 2개 이상의 별개의 항체가 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는 경우를 추론하는 데 사용될 수 있다. 에피토프 맵핑을 위한 기능적 방법은, 예를 들어 이뮤노블롯팅 검정, 면역침전 검정 및 형광-기반 표지 검정을 포함하며, 여기서 CD161로부터의 중첩 또는 인접 펩티드는 항-CD161 항체 (예를 들어, HP-3G10)와의 반응성에 대해 시험된다. 에피토프 맵핑을 위한 다른 기능적 방법은 어레이-기반 올리고펩티드 스캐닝 (대안적으로 "중첩 펩티드 스캐닝" 또는 "펩스캔 분석"으로 공지됨), 부위-지정 돌연변이유발 (예를 들어, 알라닌-스캐닝 돌연변이유발), 및 고처리량 돌연변이유발 맵핑 (예를 들어, 샷건 돌연변이유발 맵핑)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD161 항체에 의해 결합된 에피토프는 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 사용하여 결정된다. 부위-지정 돌연변이유발 방법은 중요한 아미노산이 단백질 서열을 따라 치환을 체계적으로 도입한 후 항체 결합에 대한 각각의 치환의 효과를 결정함으로써 확인되는 표적화된 부위-지정 돌연변이유발을 수반한다. 이는 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발" (문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-085]), 또는 CD161 내의 아미노산 잔기의 일부 다른 형태의 점 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 알라닌 스캐닝은 폴리펩티드에서 알라닌 잔기를 야생형 잔기로 치환한 후, 알라닌-치환된 유도체 또는 돌연변이 폴리펩티드의 안정성 또는 기능(들) (예를 들어, 결합 친화도)을 평가하고, 야생형 폴리펩티드와 비교하는 것을 수반하는 기술이다. 이론에 얽매이지는 않지만, 제1 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 항원 내의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 제2 이상의 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 경우에, 2종 이상의 항체 (예를 들어, 시험 항체 및 참조 항체)는 동일한 에피토프를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD161 항체에 의해 결합된 에피토프는 샷건 돌연변이유발을 사용하여 결정된다. 샷건 돌연변이유발 맵핑은 표적 유전자에 대한 포괄적인 플라스미드-돌연변이 라이브러리를 이용하고, 여기서 라이브러리 내의 각각의 클론은 고유한 아미노산 돌연변이를 보유하고, 전체 라이브러리는 표적 단백질 내의 모든 아미노산을 포함한다. 돌연변이 라이브러리를 구성하는 클론을 마이크로플레이트에 개별적으로 배열하고, 살아있는 포유동물 세포 내에서 발현시키고, 관심 항체와의 면역반응성에 대해 시험하였다. 항체 에피토프에 중요한 아미노산은 반응성의 상실에 의해 확인되고, 이어서 단백질 구조 상에 맵핑되어 에피토프를 가시화한다. 포유동물 세포 내에서의 표적 단백질 항원의 발현은 종종 표적 단백질 항원의 천연 구조를 제공하며, 이는 선형 및 입체형태적 에피토프 구조 둘 다가 복합 단백질 상에 맵핑되도록 한다. (문헌 [Paes et al. (2009) J. Am. Chem. Soc., 131(20): 6952-6954; Banik and Doranz (2010) Genetic Engineering and Biotechnology News, 3(2): 25-28]).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD161 항체에 의해 결합된 에피토프는 펩티드 스캐닝 방법을 사용하여 결정된다. 펩티드 스캐닝에서, 표적 단백질 (예를 들어, CD161)의 중첩 절편으로부터의 짧은 펩티드 서열의 라이브러리를 관심 항체에 결합하는 그의 능력에 대해 시험한다. 펩티드를 합성하고, "펩스캔" 방법론 (WO1984/03564; WO1993/09872, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨)에서와 같이 고체-상 스크리닝을 위한 임의의 다중 방법에 의해, 예를 들어 ELISA 또는 BIACORE를 사용하여, 또는 칩 상에서 결합에 대해 스크리닝한다 (문헌 [Reineke et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol., 12: 59-64]). 입체형태 에피토프는 스캐폴드 상의 펩티드의 화학적 연결 (CLIPS)을 통해 확인될 수 있다. 펩티드의 느슨한 말단은 합성 스캐폴드 상에 부착되어, 스캐폴딩된 펩티드는 무손상 단백질 내의 상응하는 서열과 동일한 공간 구조를 채택할 수 있다. CLIPS 기술을 사용하여 선형 펩티드를 시클릭 구조 ('단일-루프' 포맷)로 고정시키고, 단백질 결합 부위의 상이한 부분 ('이중-루프', '삼중-루프' 등의 포맷)을 함께 모아, 항체 결합에 대해 검정될 수 있는 입체형태적 에피토프를 생성한다. (미국 특허 번호 7,972,993). 본 개시내용에 의해 제공된 항체에 의해 결합된 에피토프는 또한 컴퓨터 방법을 사용하여 맵핑될 수 있다. 이들 방법에서, 예를 들어 펩티드 단편의 라이브러리가 파지 또는 세포의 표면 상에 디스플레이된다. 이어서, 에피토프는 선택적 결합 검정을 사용하여 이들 단편에 대한 항체를 스크리닝함으로써 맵핑된다. 파지 디스플레이를 사용하여 수득된 선형 친화도-선택된 펩티드에 기초한 입체형태적 에피토프의 예측을 가능하게 하는 다수의 컴퓨터 도구가 개발되었다 (문헌 [Mayrose et al. (2007) Bioinformatics, 23: 3244-3246]). 파지 디스플레이에 의한 입체형태적 에피토프의 검출을 위한 방법이 또한 이용가능하다. 미생물 디스플레이 시스템이 입체형태적 에피토프의 확인을 위해 세포 표면 상에 적절하게 폴딩된 항원 단편을 발현시키는 데 또한 사용될 수 있다 (문헌 [Cochran et al. (2004) J. Immunol. Meth., 287: 147-158; Rockberg et al. (2008) Nature Methods, 5: 1039-1045]). 단백질분해 및 질량 분광분석법을 수반하는 방법이 또한 항체 에피토프를 결정하는 데 사용될 수 있다 (문헌 [Baerga-Ortiz et al. (2002) Protein Sci., 11(6): 1300-1308]). 제한된 단백질분해에서, 항원은 항체의 존재 및 부재 하에 상이한 프로테아제에 의해 절단되고, 단편은 질량 분광측정법에 의해 확인된다. 에피토프는 항체의 결합 시에 단백질분해로부터 보호되는 항원의 영역이다 (문헌 [Suckau et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9848-9852]). 추가의 단백질분해 기반 방법은, 예를 들어 선택적 화학적 변형 (문헌 [Fiedler et al. (1998) Bioconjugate Chemistry, 9(2): 236-234]), 에피토프 절제 (문헌 [Van de Water et al. (1997) Clin. Immunol. Immunopathol., 85(3): 229-235]), 및 최근에 개발된 수소-중수소 (H/D) 교환 방법 (문헌 [Flanagan, N. (2010) Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2): 25-28])을 포함한다.
9.1.5 이펙터 기능에 대한 검정
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD161 항체는 CD161에 결합하고, 면역 세포 이펙터 기능의 활성화를 유도 또는 촉진하며, 여기서 면역 세포는 임의의 CD161-발현 면역 세포이거나, 또는 면역 세포는 CD161-발현 T 세포, CD161-발현 NK 세포 또는 그의 조합이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD161 항체는 CD161에 결합하고, CD161-발현 T 세포 또는 CD161-발현 NK 세포의 활성화, 증식, 시토카인 생산, 세포용해 기능 또는 그의 임의의 조합을 유도 또는 촉진한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD161 항체는 점막-연관 불변 T 세포 (MAIT 세포)를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CD161 항체는 CD161차단에 의해 MAIT 세포를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD161 항체는 CD161에 결합하고, T 세포 활성화, 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응, T 세포 증식, 시토카인 생산 또는 그의 조합을 유도 또는 촉진한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD161 항체는 CLEC2D에 결합하고 CLEC2D에의 CD161 결합과 경쟁하거나 또는 그를 차단한다. 일부 실시양태에서, CD161의 차단은 리간드 (예를 들어, CLEC2D) 결합을 결정함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD161 항체는 CD161-발현 T 세포 또는 CD161-발현 NK 세포 상의 CD161에 결합하고, CLEC2D의 존재 하에 T 세포 또는 NK 세포 면역 세포 이펙터 기능의 활성화를 유도하거나 촉진한다.
일부 실시양태에서, CD161-발현 NK 세포의 활성화는 항-CD161 항체를 CLEC2D의 존재 하에 CD161-발현 NK 세포의 배양물에 첨가함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, CLEC2D 리간드는 NK 세포와 공동-배양된 인간 암 세포에서 발현된다. 인간 NK 세포의 활성화는, 예를 들어 용량-의존성 방식으로 항-CD161 항체에 대한 노출 후에 NK 세포의 CD107a 발현에 의해 측정될 수 있다. 인간 NK 세포의 활성화는, 예를 들어 용량-의존성 방식으로 항-CD161 항체에 대한 노출 후에 IFNγ 분비에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, CLEC2D의 존재 하에 인간 NK 세포에서 억제 신호전달을 차단하는 CD161 항체 유효성은, 예를 들어 실시예 7에서 결정된 바와 같은 EC50 (nM) 값으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, CLEC2D의 존재 하에 인간 NK 세포의 CD161 항체 활성화 또는 차단에 대한 EC50 값은 0.04 nM 내지 0.38 nM이다.
일부 실시양태에서, CD161-발현 T 세포의 활성화는 항-CD161 항체를 CLEC2D의 존재 하에 CD161-발현 T 세포의 배양물에 첨가함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, CLEC2D 리간드는 T 세포와 공동-배양된 인간 암 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화는 조작된 T 세포에서 NFAT-루시페라제 리포터 유전자 시스템 (인비보젠)을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, CLEC2D의 존재 하에 T 세포에서 억제 신호전달을 차단하는 항-CD161 유효성은, 예를 들어 실시예 8 및 9에 기재된 바와 같이 제공된다. 일부 실시양태에서, CLEC2D의 존재 하에 인간 T 세포의 CD161 항체 활성화 또는 차단에 대한 EC50 값은 1.5 nM 내지 4.1 nM이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 CLEC2D-매개 억제를 역전시키고, 1차 NK 세포 및 T 세포 기능을 회복시킬 뿐만 아니라, 항원에 대한 T 세포 회상 반응을 증진시키고, TCR-의존성 방식으로 T 세포 매개 세포독성을 지시한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는, 예를 들어 실시예 13에 기재된 바와 같이 NK 세포 상의 CD161과 표적 세포 상의 CLEC2D의 상호작용을 차단함으로써 NK 세포 사멸의 억제를 역전시킨다. 특정 실시양태에서, 항체는 NK 세포에 의한 세포독성 탈과립화, 뿐만 아니라 IFNγ의 발현을 회복시킨다. 특정 실시양태에서, NK 세포 활성화의 회복은, 예를 들어 용량-의존성 방식으로 항-CD161 항체에 대한 노출 후에 NK 세포의 CD107a 발현에 의해 측정될 수 있다. 인간 NK 세포의 활성화는, 예를 들어 용량-의존성 방식으로 항-CD161 항체에 대한 노출 후에 IFNγ 분비에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 CLEC2D 발현 표적 세포의 NK 세포 사멸을 증진시킨다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는, 예를 들어 실시예 14에 기재된 바와 같이 NK 세포 상의 CD161과 표적 세포 상의 CLEC2D의 상호작용을 차단함으로써 CLEC2D 발현 표적 세포의 NK 세포 사멸을 증진시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는, 예를 들어 실시예 15에 기재된 바와 같이 CLEC2D (단핵구-유래 DC 상에서 발현됨)와의 CD161 (T 세포 상에서 발현됨) 상호작용을 차단함으로써 항원 특이적 이펙터 기억 CD4 T 세포의 재활성화를 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 항원-특이적 이펙터 기억 T (EM 세포)에 의한 증진된 시토카인 생산 및 증가된 증식 (예를 들어, Ki-67 발현에 의해 측정된 바와 같음)을 일으킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는, 예를 들어 실시예 16에 기재된 바와 같이 MART-1-특이적 T 세포의 시토카인 생산을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 CD8+ T 세포로부터의 인터페론 감마 (IFNγ), 인터류킨-2 (IL-2) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)의 생산을, 예를 들어 농도-의존성 방식으로 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는, 예를 들어 실시예 17에 기재된 바와 같이 MART-1 특이적 T 세포의 세포독성 기능을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그랜자임 B 생산 T 세포의 빈도를, 예를 들어 농도-의존성 방식으로 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 건강한 공여자로부터의 비자극 인간 PBMC에서 시토카인 방출 (예를 들어, 시토카인 방출 증후군)을 유도하지 않았다.
이펙터 기능 검정은 문헌 [Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol., 9: 457-492]; 미국 특허 번호 5,500,362, 5,821,337; 문헌 [Hellstrom et al. (1986) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 83: 7059-7063; Hellstrom et al. (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82:1499-1502; Bruggemann et al. (1987) J. Exp. Med., 166: 1351-1361; Clynes et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 95: 652-656]; WO2006/029879; WO2005/100402; 문헌 [Gazzano-Santoro et al. (1996) J. Immunol. Methods, 202: 163-171; Cragg et al. (2003) Blood, 101: 1045-1052; Cragg et al. (2004) Blood, 103: 2738-2743; and Petkova et al. (2006) Int'l. Immunol., 18: 1759-1769] (이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 것들을 포함한 관련 기술분야에 공지된 다양한 시험관내 및 생체내 검정을 사용한다.
10. 제약 조성물
치료 용도를 위해, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항체 접합체는 바람직하게는 제약상 허용되는 담체와 조합된다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충제, 담체 및 부형제를 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼 (예를 들어, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼), 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 아주반트의 예에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Martin (1975) Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA]을 참조한다. 제약상 허용되는 담체는 제약 투여와 상용성인 완충제, 용매, 분산 매질, 코팅, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은, 예를 들어 조성물의 pH, 오스몰농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제제화 물질을 함유할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 적합한 제제화 물질은 아미노산 (예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신); 항미생물제; 항산화제 (예컨대, 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충제 (예컨대, 보레이트, 비카르보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기 산); 벌킹제 (예컨대, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트화제 (예컨대, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)); 착화제 (예컨대, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충전제; 모노사카라이드; 디사카라이드; 및 다른 탄수화물 (예컨대, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질 (예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린); 착색제, 향미제 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체 (예컨대, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대이온 (예컨대, 나트륨); 보존제 (예컨대, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매 (예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알콜 (예컨대, 만니톨 또는 소르비톨); 현탁화제; 계면활성제 또는 습윤제 (예컨대, 플루로닉, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 증진제 (예컨대, 수크로스 또는 소르비톨); 장성 증진제 (예컨대, 알칼리 금속 할라이드, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 제약 아주반트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990) and Adeboye Adejare, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (23d ed. 2020)] 참조).
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 나노입자, 예를 들어 중합체 나노입자, 리포솜 또는 미셀을 함유할 수 있다 (문헌 [Anselmo et al. (2016) Bioeng. Transl. Med., 1: 10-29] 참조).
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 지속- 또는 제어-전달 제제를 함유할 수 있다. 지속- 또는 제어-전달 수단, 예컨대 리포솜 담체, 생침식성 마이크로입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사를 제제화하는 기술은 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 지속-방출 제제는, 예를 들어 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 다공성 중합체 마이크로입자 또는 반투과성 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 지속 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드, L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 에틸렌 비닐 아세테이트, 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산을 포함할 수 있다. 지속 방출 조성물은 또한 관련 기술분야에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 제조될 수 있는 리포솜을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항체 접합체를 함유하는 제약 조성물은 투여 단위 형태로 제공될 수 있고, 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제제화되어야 한다. 투여 경로의 예는 정맥내 (IV), 피내, 흡입, 경피, 국소, 경점막, 척수강내 및 직장 투여이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항체 접합체는 IV 주입에 의해 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항체 접합체는 종양내 주사에 의해 투여된다. 유용한 제제는 제약 기술분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990) and Adeboye Adejare, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (23d ed. 2020)] 참조). 비경구 투여에 적합한 제제 성분은 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함한다.
정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 염수, 정박테리아수, 크레모포르 ELTM (바스프 (BASF), 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 담체는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 안정화제를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 안정화제는 양이온, 예컨대 2가 양이온이다. 특정 실시양태에서, 양이온은 칼슘 또는 마그네슘이다. 양이온은 염, 예컨대 염화칼슘 (CaCl2) 또는 염화마그네슘 (MgCl2)의 형태일 수 있다.
특정 실시양태에서, 안정화제는 약 0.05 mM 내지 약 5 mM의 양으로 존재한다. 예를 들어, 안정화제는 약 0.05 mM 내지 약 4 mM, 약 0.05 mM 내지 약 3 mM, 약 0.05 mM 내지 약 2 mM, 약 0.05 mM 내지 약 1 mM, 약 0.05 mM 내지 약 0.5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 4 mM, 약 0.5 mM 내지 약 3 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2 mM, 약 0.5 mM 내지 약 1 mM, 약 1 mM 내지 약 4 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 2 mM의 양으로 존재할 수 있다.
제약 제제는 바람직하게는 멸균된다. 멸균은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 여과 멸균이 수행될 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 국부로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 투여는 일반적으로 비경구 투여일 것이다. 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 피하로, 보다 더 바람직한 실시양태에서는 정맥내로 투여된다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다.
일반적으로, 활성 성분, 예를 들어 항체의 치료 유효량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 예를 들어 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 투여되는 양은 환자의 체중, 치료될 질환 또는 적응증의 유형 및 정도, 환자의 전반적 건강, 항체의 생체내 효력, 제약 제제, 및 투여 경로와 같은 변수에 좌우될 것이다. 초기 투여량은 목적하는 혈액-수준 또는 조직-수준을 신속하게 달성하기 위해 상한 수준을 넘어 증가될 수 있다. 대안적으로, 초기 투여량은 최적보다 적을 수 있고, 1일 투여량은 치료 과정 동안 점진적으로 증가될 수 있다. 인간 투여량은, 예를 들어 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg으로 실행되도록 설계된 통상적인 I상 용량 증량 연구에서 최적화될 수 있다. 투여 빈도는 투여 경로, 투여량, 항체의 혈청 반감기, 및 치료되는 질환과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 예시적인 투여 빈도는 1일 1회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회이다. 바람직한 투여 경로는 비경구, 예를 들어 정맥내 주입이다. 특정 실시양태에서, 항체는 동결건조된 후 투여 시점에 완충 염수에서 재구성된다. 특정 실시양태에서, 항-CD161 항체의 6 mg (60 kg 환자 체중을 기준으로 0.1 mg/kg)의 출발 용량이 3주마다 1회 (예를 들어, IV를 통해) 투여된다.
11. 투여량 및 단위 투여 형태
인간 치료제에서, 의사는 예방적 또는 치유적 치료에 따라 및 치료될 대상체에 특이적인 연령, 체중, 상태 및 다른 인자에 따라 그 또는 그녀가 가장 적절한 것으로 간주하는 약량학을 결정할 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 제약 조성물 또는 단일 단위 투여 형태이다. 본원에 제공된 제약 조성물 및 단일 단위 투여 형태는 치료 유효량의 1종 이상의 치료 항체를 포함한다.
장애 또는 그의 1종 이상의 증상의 예방 또는 치료에 효과적일 항체의 양은 질환 또는 상태의 성질 및 중증도, 및 항체가 투여되는 경로에 따라 달라질 수 있다. 빈도 및 투여량은 또한 투여되는 특정 요법 (예를 들어, 치료적 또는 예방적), 장애, 질환 또는 상태의 중증도, 투여 경로, 뿐만 아니라 대상체의 연령, 신체, 체중, 반응 및 과거 병력에 따라 각각의 대상체에 대해 특이적인 인자에 따라 달라질 수 있다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 공지된 바와 같이, 상이한 치료 유효량이 상이한 질환 및 상태에 적용가능할 수 있다. 유사하게, 이러한 장애를 예방, 관리, 치료 또는 호전시키는 데 충분하지만, 본원에 제공된 항체 또는 ADC와 연관된 유해 효과를 야기하는 데 불충분하거나 또는 이를 감소시키는 데 충분한 양이 본원에 제공된 투여량 및 용량 빈도 스케줄에 또한 포함된다. 추가로, 대상체에게 본원에 제공된 조성물의 다중 투여량이 투여되는 경우, 모든 투여량이 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 대상체에게 투여되는 투여량은 조성물의 예방적 또는 치료적 효과를 개선시키기 위해 증가될 수 있거나, 또는 특정 대상체가 경험하고 있는 1종 이상의 부작용을 감소시키기 위해 감소될 수 있다.
본 개시내용의 다른 곳에서 보다 상세하게 논의된 바와 같이, 본원에 제공된 항체는 임의로 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 데 유용한 1종 이상의 추가의 작용제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 추가의 작용제의 유효량은 제제에 존재하는 작용제의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 다른 인자에 따라 달라질 수 있다.
12. 치료 용도
본원에 개시된 항체는 본원에 기재된 투여 접근법 중 하나 이상을 통해 제약상 허용되는 투여 형태로 포유동물, 일반적으로 인간에게 투여될 수 있는 것으로 고려된다.
본원에 기재된 임의의 항체는 CD161과 연관된 임의의 질환 또는 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 작용제는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 면역요법 (예를 들어, 항-CD161 항체)을 투여함으로써 달성될 수 있는 암의 치료에 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 본원에 기재된 작용제는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항-CD161 항체를 투여함으로써 달성될 수 있는 자가면역 장애를 치료하는 데 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 면역요법 (예를 들어, 항-CD161 항체) 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항-CD161 항체 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 종양 미세환경에서 암 세포 또는 다른 세포에 의한 CLEC2D의 발현을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 암은 종양 미세환경에서 암 세포 또는 다른 세포에 의한 CLEC2D의 증가된 발현을 특징으로 한다.
임의의 적합한 암은 본원에 개시된 작용제로 치료될 수 있다. 암의 예는 고형 종양, 연부 조직 종양, 조혈 종양 및 전이성 병변을 포함한다. 조혈 종양의 예는 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), B-세포, T 세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수구성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 예를 들어 형질전환된 CLL, 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종 또는 리히터 증후군 (리히터 형질전환)을 포함한다. 고형 종양의 예는 다양한 기관계의 악성종양, 예를 들어 육종, 선암종 및 암종, 예컨대 두경부 (인두 포함), 갑상선, 폐암 (소세포 또는 비소세포 폐암 (NSCLC)), 유방, 림프성, 위장 (예를 들어, 경구, 식도, 위, 간, 췌장, 소장, 결장 및 직장, 항문관), 생식기 및 비뇨생식관 (예를 들어, 신장, 요로상피, 방광, 난소, 자궁, 자궁경부, 자궁내막, 전립선, 고환), CNS (예를 들어, 신경 또는 신경교 세포, 예를 들어 신경모세포종 또는 신경교종), 또는 피부 (예를 들어, 흑색종 및 전이성 메르켈 세포 암종 (MCC))에 영향을 미치는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암은 림프종이다. 특정 실시양태에서, 암은 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)이다. 특정 실시양태에서, 암은 비소세포 폐암 (NSCLC)이다. 특정 실시양태에서, 암은 간세포성 암종 (HCC)이다. 특정 실시양태에서, 암은 삼중-음성 유방암 (TNBC)이다. 특정 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 특정 실시양태에서, 암은 교모세포종이다. 특정 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 간암이다. 일부 실시양태에서, 암은 자궁경부암이다. 특정 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 특정 실시양태에서, 암은 신암이다. 특정 실시양태에서, 암은 폐 선암종이다. 특정 실시양태에서, 암은 신경교종이다. 특정 일부 실시양태에서, 암은 폐암이다. 특정 실시양태에서, 암은 방광암이다. 특정 실시양태에서, 암은 결장 선암종이다. 특정 실시양태에서, 암은 신장암이다.
특정 실시양태에서, CD161 차단 면역요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 암은 면역형광 데이터를 사용하여 확인 시 고밀도의 CLEC2D+ 및 CD161+ 세포를 갖는 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 고밀도의 CLEC2D+ 및 CD161+ 세포를 갖는 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 호지킨 림프종, 및 달리 명시되지 않은 말초 T 세포 림프종 (PTCL-NOS), NK/T 세포 림프종, 역형성 대세포 림프종 (ALCL)을 포함한 T 세포 림프종이다. 특정 실시양태에서, 암은 비소세포 폐암 (NSCLC), 예를 들어 NSCLC-편평 세포 암종 또는 NSCLC-선암종, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC), 삼중 음성 유방암 (TNBC) 또는 피부 편평 세포 암종이다.
특정 상황 하에, 암은 흑색종, 폐, 신경교종, 결장직장 및 간으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 개시내용은 종양 성장의 감소 또는 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항-CD161 항체 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 인간 CD161과 CLEC2D 사이의 상호작용의 억제 또는 차단을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항-CD161 항체 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 인간 CD161과 CLEC2D 사이의 상호작용을 억제 또는 차단하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 면역 세포 활성화의 유도 또는 증진을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항-CD161 항체 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역 세포 활성화를 유도 또는 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 활성화는 종양 미세환경에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포독성 T 세포 이펙터 반응의 유도 또는 증진을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항-CD161 항체 또는 유효량의 본원에 개시된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 세포독성 T 세포 이펙터 반응을 유도 또는 증진시키는 방법을 제공한다. 상황에 따라, T 세포 이펙터 반응은 (i) 종양 미세환경에 있거나, (ii) 시토카인 생산 (예컨대, IL-2, TNFα, IFNγ 또는 그의 조합)이거나, (iii) 그랜자임 B의 분비이거나, 또는 (iv) (i), (ii) 및 (iii) 중 2종 이상의 조합이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD161에의 CLEC2D의 결합으로 인해 유발된 CD161 억제 신호전달을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD161에의 CLEC2D의 결합으로 인해 유발된 T 세포 활성의 억제를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD161에의 CLEC2D의 결합으로 인해 유발된 NK 세포 활성의 억제를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CLEC2D의 존재 하의 T 세포 활성을, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 부재 하에서의 이러한 T 세포 활성과 비교하여 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CLEC2D의 존재 하의 NK 세포 활성을, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 부재 하에서의 이러한 NK 세포 활성과 비교하여 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CLEC2D를 발현하는 세포를 포함하는 미세환경 내에 배치된 T 세포 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CLEC2D를 발현하는 세포를 포함하는 미세환경 내에 배치된 NK 세포 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CLEC2D를 발현하는 종양 세포를 포함하는 종양 미세환경에서 T 세포 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CLEC2D를 발현하는 종양 세포를 포함하는 종양 미세환경에서 NK 세포 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 T 세포 소진을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포의 활성화를 유도하거나 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포에 의한 시토카인 생산을 유도하거나 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포에 의한 그랜자임 B 발현을 유도하거나 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항원-발현 표적 세포에 반응하여 CD161-발현 인간 T 세포의 고갈을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 암의 발병의 지연을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 면역요법 (예를 들어, 면역요법제) (예를 들어, 항-CD161 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항체 접합체)을 투여함으로써 상기 대상체에서 암의 발병을 지연시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 암의 발병의 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 작용제를 투여함으로써 상기 대상체에서 암의 발병을 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 종양 크기의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 작용제를 투여함으로써 상기 대상체에서 종양의 크기를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 전이의 수의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 작용제를 투여함으로써 상기 대상체에서 전이의 수를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 전체 생존, 중앙 생존 기간 또는 무진행 생존의 기간의 연장을 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 작용제를 투여함으로써 상기 대상체에서 전체 생존, 중앙 생존 시간 또는 무진행 생존의 기간을 연장시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 표준 관리 치료에 내성을 갖게 된 대상체에게 본원에 개시된 작용제의 유효량을 투여함으로써 상기 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
13. 조합 요법
본원에 기재된 방법 및 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제 및/또는 양식과 조합하여 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "조합하여" 투여되는 것은, 대상체가 장애를 앓는 과정 동안 대상체에게 2종 (또는 그 초과)의 상이한 치료가 전달되어, 환자에 대한 치료의 효과가 한 시점에서 중첩되도록 하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 특정 실시양태에서, 하나의 치료의 전달이 제2의 전달이 시작될 때도 여전히 일어나고 있어 투여의 면에서 중첩이 존재한다. 이는 때때로 본원에서 "동시" 또는 "공동 전달"로 지칭된다. 다른 실시양태에서, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종료된다. 어느 한 경우의 특정 실시양태에서, 치료는 조합 투여로 인해 보다 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료가 보다 효과적이고, 예를 들어 제2 치료가 제1 치료의 부재 하에 투여되는 것보다 더 적은 제2 치료로 동등한 효과가 관찰되거나 또는 제2 치료가 증상을 더 큰 정도로 감소시키거나, 또는 유사한 상황이 제1 치료로 관찰된다. 특정 실시양태에서, 전달은 증상 또는 장애와 관련된 다른 파라미터의 감소가 다른 치료의 부재 하에 전달된 하나의 치료에 의해 관찰되는 것보다 더 크도록 이루어진다. 2종의 치료의 효과는 부분적으로 상가적이거나, 완전히 상가적이거나, 또는 상가적 효과보다 더 클 수 있다. 제2 치료가 전달될 때, 전달된 제1 치료의 효과가 여전히 검출가능하도록 전달될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 조성물은 1종 이상의 추가의 요법, 예를 들어 수술, 방사선 요법, 또는 또 다른 치료 제제의 투여와 조합하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 추가의 요법은 화학요법, 예를 들어 세포독성제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 요법은 표적화 요법, 예를 들어 티로신 키나제 억제제, 프로테아솜 억제제 또는 프로테아제 억제제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 요법은 항염증성, 항혈관신생, 항섬유화 또는 항증식성 화합물, 예를 들어 스테로이드, 생물학적 면역조정제, 모노클로날 항체, 항체 단편, 압타머, siRNA, 안티센스 분자, 융합 단백질, 시토카인, 시토카인 수용체, 기관지확장제, 스타틴, 항염증제 (예를 들어, 메토트렉세이트) 또는 NSAID를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 요법은 상이한 부류의 치료제의 조합을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 조성물은 제2 체크포인트 억제제와 조합하여 투여된다. 체크포인트 억제제는, 예를 들어 PD-1 길항제, 제2 PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, 아데노신 A2A 수용체 길항제, B7-H3 길항제, B7-H4 길항제, BTLA 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제, TIM-3 길항제, VISTA 길항제 또는 TIGIT 길항제로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 또는 제2 PD-L1 억제제이다. PD-1은 과활성 면역 반응을 방지하기 위해 적절한 시간에 T 세포 활성을 억제하거나 달리 조정하는 면역계 체크포인트로서 기능하는 T 세포의 표면 상에 존재하는 수용체이다. 그러나, 암 세포는 T 세포의 표면 상의 PD-1과 상호작용하는 리간드, 예를 들어 PD-L1을 발현시켜 T 세포 활성을 차단 또는 조정함으로써 이러한 체크포인트를 이용할 수 있다. 예시적인 PD-1/PD-L1 기반 면역 체크포인트 억제제는 항체 기반 치료제를 포함한다. PD-1/PD-L1 기반 면역 체크포인트 억제를 이용하는 예시적인 치료 방법은 미국 특허 번호 8,728,474 및 9,073,994, 및 EP 특허 번호 1537878B1에 기재되어 있고, 예를 들어 항-PD-1 항체의 사용을 포함한다. 예시적인 항-PD-1 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 8,952,136, 8,779,105, 8,008,449, 8,741,295, 9,205,148, 9,181,342, 9,102,728, 9,102,727, 8,952,136, 8,927,697, 8,900,587, 8,735,553, 및 7,488,802에 기재되어 있다. 예시적인 항-PD-1 항체는, 예를 들어 니볼루맙 (옵디보(Opdivo)®, 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니), 펨브롤리주맙 (키트루다(Keytruda)®, 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션), PDR001 (노파르티스 파마슈티칼스), 및 피딜리주맙 (CT-011, 큐어 테크)을 포함한다. 예시적인 항-PD-L1 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 9,273,135, 7,943,743, 9,175,082, 8,741,295, 8,552,154 및 8,217,149에 기재되어 있다. 예시적인 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙 (테센트릭(Tecentriq)®, 제넨테크), 두르발루맙 (아스트라제네카), MEDI4736, 아벨루맙, 및 BMS 936559 (브리스톨 마이어스 스큅 컴퍼니)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 조성물은 CTLA-4 억제제와 조합하여 투여된다. CTLA-4 경로에서, T 세포 상의 CTLA-4와 항원 제시 세포 (암 세포보다는)의 표면 상의 그의 리간드 (예를 들어, B7-1 및 CD86으로도 공지된 CD80)의 상호작용은 T 세포 억제로 이어진다. 예시적인 CTLA-4 기반 면역 체크포인트 억제 방법은 미국 특허 번호 5,811,097, 5,855,887, 6,051,227에 기재되어 있다. 예시적인 항-CTLA-4 항체는 미국 특허 번호 6,984,720, 6,682,736, 7,311,910; 7,307,064, 7,109,003, 7,132,281, 6,207,156, 7,807,797, 7,824,679, 8,143,379, 8,263,073, 8,318,916, 8,017,114, 8,784,815, 및 8,883,984, 국제 (PCT) 공개 번호 WO1998/42752, WO2000/37504, 및 WO2001/14424, 및 유럽 특허 번호 EP 1212422 B1 (이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 예시적인 CTLA-4 항체는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 조성물은 CTLA-4 억제제, 예를 들어 본원에 개시된 CTLA-4 억제제와 조합하여 투여된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 조성물은 IDO 억제제와 조합하여 투여된다. 예시적인 IDO 억제제는 1-메틸-D-트립토판 (인독시모드로 공지됨), 에파카도스타트 (INCB24360), 나복시모드 (GDC-0919) 및 BMS-986205를 포함한다.
본원에 기재된 방법 또는 조성물과 조합하여 투여될 수 있는 예시적인 세포독성제는, 예를 들어 항미세관제, 토포이소머라제 억제제, 항대사물, 단백질 합성 및 분해 억제제, 유사분열 억제제, 알킬화제, 플라틴화제, 핵산 합성의 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDAC 억제제, 예를 들어 보리노스타트 (SAHA, MK0683), 엔티노스타트 (MS-275), 파노비노스타트 (LBH589), 트리코스타틴 A (TSA), 모세티노스타트 (MGCD0103), 벨리노스타트 (PXD101), 로미뎁신 (FK228, 뎁시펩티드)), DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제, 질소 머스타드, 니트로소우레아, 에틸렌이민, 알킬 술포네이트, 트리아젠, 폴레이트 유사체, 뉴클레오시드 유사체, 리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제, 빈카 알칼로이드, 탁산, 에포틸론, 삽입제, 신호 전달 경로를 방해할 수 있는 작용제, 아폽토시스 및 방사선을 촉진하는 작용제, 또는 표면 단백질에 결합하여 독성제를 전달하는 항체 분자 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 조성물로 투여될 수 있는 세포독성제는 백금-기반 작용제 (예컨대, 시스플라틴), 시클로포스파미드, 다카르바진, 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 겜시타빈, 카페시타빈, 히드록시우레아, 토포테칸, 이리노테칸, 아자시티딘, 보리노스타트, 익사베필론, 보르테조밉, 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브로민화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 콜키신, 안트라시클린 (예를 들어, 독소루비신 또는 에피루비신), 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 아드리아마이신, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 리신 또는 메이탄시노이드이다.
본 발명은 또한 세포, 조직 또는 대상체에서 HLA-DR, CD86, CD83, IFNγ, IL-1b, IL-6, TNFα, IL-17A, IL-2 또는 IL-6의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 방법은 세포, 조직 또는 대상체를 유효량의 항체, 융합 단백질 및/또는 항체 접합체, 예를 들어 본원에 개시된 항체, 융합 단백질 또는 항체 접합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포는 수지상 세포 및 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 세포, 조직 또는 대상체에서의 HLA-DR, CD86, CD83, IFNγ, IL-1b, IL-6, TNFα, IL-17A, IL-2 또는 IL-6의 발현은 항체, 융합 단백질 또는 항체 접합체와 접촉되지 않은 유사하거나 또는 달리 동일한 세포 또는 조직에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 적어도 약 600%, 적어도 약 700%, 적어도 약 800%, 적어도 약 900% 또는 적어도 약 1,000%만큼 증가된다. 유전자 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 ELISA에 의해, 또는 루미넥스 멀티플렉스 검정에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 종양으로의 면역 세포의 침윤의 촉진을 필요로 하는 대상체에서 종양으로의 면역 세포의 침윤을 촉진하는 방법을 제공한다. 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포, 예를 들어 CD69+CD8+ 및/또는 GzmB+CD8+ T 세포이다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 자연 킬러 (NK) 세포이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 종양으로의 면역 세포의 침윤은 작용제를 제공받지 않은 유사하거나 또는 달리 동일한 종양 및/또는 대상체에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 적어도 약 600%, 적어도 약 700%, 적어도 약 800%, 적어도 약 900%, 또는 적어도 약 1,000%만큼 증가된다. 종양으로의 면역 세포의 침윤은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 항체 염색에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 세포, 조직 또는 대상체에서 Cd3, Cd4, Cd8, Cd274, Ctla4, Icos, Pdcd1, Lag3, Il6, Il1b, Il2, Ifng, Ifna1, Mx1, Gzmb, Cxcl9, Cxcl12 및/또는 Ccl5의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포, 조직 또는 대상체를 유효량의 본원에 개시된 항체와 접촉시켜 Cd3, Cd4, Cd8, Cd274, Ctla4, Icos, Pdcd1, Lag3, Il6, Il1b, Il2, Ifng, Ifna1, Mx1, Gzmb, Cxcl9, Cxcl12 및/또는 Ccl5의 발현을 상기 작용제와 접촉시키기 전의 세포, 조직 또는 대상체에 비해 증가시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포, 조직 또는 대상체에서 Cd3, Cd4, Cd8, Cd274, Ctla4, Icos, Pdcd1, Lag3, Il6, Il1b, Il2, Ifng, Ifna1, Mx1, Gzmb, Cxcl9, Cxcl12 및/또는 Ccl5의 발현은 이러한 작용제와 접촉되지 않은 유사하거나 또는 달리 동일한 세포, 조직 또는 대상체에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 적어도 약 600%, 적어도 약 700%, 적어도 약 800%, 적어도 약 900% 또는 적어도 약 1,000%만큼 증가된다. 유전자 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 ELISA, 루미넥스 멀티플렉스 검정 또는 나노스트링 기술에 의해 측정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료에 의해 영향을 받는 세포는 종양 세포, 수지상 세포 (DC) 또는 단핵구이다. 특정 실시양태에서, 세포는 단핵구이고, 방법은 단핵구 상의 MHC-II 분자 (예를 들어, HLA-DR)의 증가된 발현을 유발한다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 조직에서의 MHC-II 분자의 발현은 이러한 작용제와 접촉되지 않은 유사하거나 또는 달리 동일한 세포 또는 조직에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 적어도 약 600%, 적어도 약 700%, 적어도 약 800%, 적어도 약 900%, 또는 적어도 약 1,000%만큼 증가된다. 유전자 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 ELISA에 의해, 루미넥스 멀티플렉스 검정에 의해, 또는 유동 세포측정법에 의해 측정될 수 있다.
14. 진단 방법
또한, 대상체로부터의 세포 상의 CD161의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은, 예를 들어 본원에 개시된 항체를 사용한 치료에 대한 반응성을 예측하고 평가하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 질환 또는 상태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 CD161을 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 (a) 대상체로부터 샘플을 받고; (b) 샘플을 본원에 개시된 항체와 접촉시킴으로써 샘플에서 CD161의 존재 또는 수준을 검출하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 암이다. 본원에 제공된 항체는 검출가능한 표지, 예를 들어 형광 표지, 방사성표지 또는 효소 표지로 표지될 수 있다.
단계의 순서 또는 특정 조치를 수행하기 위한 순서는 본 발명이 작동가능하게 유지되는 한 중요하지 않은 것으로 이해되어야 한다. 또한, 2개 이상의 단계 또는 작용이 동시에 수행될 수 있다.
본원에서 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 어휘, 예를 들어 "예컨대" 또는 "포함한"의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하도록 의도되고, 청구되지 않는 한 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 어휘도 임의의 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
<실시예>
이제 일반적으로 기재된 본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이며, 이는 단지 본 발명의 특정 측면 및 실시양태의 예시 목적을 위해 포함되고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1 - CD161 항체의 생성
본 실시예는 하기 기재된 바와 같이 스크리닝 항원으로서 비오티닐화 재조합 CD161 단백질을 사용한 아디맙(Adimab)™ 효모-기반 항체 제시에 의한 CD161 항체의 생성을 기재한다.
1. 재조합 단백질 생산
인간 및 시노몰구스 CD161 표적의 상이한 형태의 세포외 도메인 (ECD) 및 CLEC2D 리간드를 포함하는 여러 재조합 단백질을 생산하여 항체 발견 및 후속 스크리닝 및 특징화를 지지하였다. 모든 단백질은 HEK293 세포 (써모피셔 사이언티픽)의 일시적 형질감염에 의해 생산하였다. 2가 항원을 생성하기 위해 C-말단 또는 N-말단 인간 IgG1 Fc 융합 도메인을 갖는 단백질을 생산하였다. 이들 단백질은 다음을 포함한다:
(1) hCD161 ECD (Q67-S225)-hFc 또는 hKLRB1 ECD (Q67-S225)-hFc - C-말단 인간 IgG1 Fc 도메인을 갖는 인간 CD161 ECD (아미노산 잔기 Q67-S225, 유니프롯 # Q12918); 서열식별번호: 173에 의해 나타내어짐;
(2) cCD161 ECD (Q67-L227)-hFc 또는 cKLRB1 ECD (Q67-L227)-hFc - C-말단 인간 IgG1 Fc 도메인을 갖는 시노몰구스 CD161 ECD (아미노산 잔기 Q67-L227, 유니프롯 # A0A2K5WYI1); 서열식별번호: 176에 의해 나타내어짐;
(3) hFc-hCD161 ECD (Q67-S225) 또는 hFc-hKLRB1 ECD (Q67-S225) - N-말단 인간 IgG1 Fc 도메인을 갖는 인간 CD161 ECD (아미노산 잔기 Q67-S225, 유니프롯 # Q12918); 서열식별번호: 194에 의해 나타내어짐;
(4) hCLEC2D ECD (L71-V191)-hFc 또는 hLLT1 ECD (L71-V191)-hFc- C-말단 인간 IgG1 Fc 도메인을 갖는 인간 CLEC2D ECD (아미노산 잔기 L71-V191, 유니프롯 #Q9UHP7); 서열식별번호: 193에 의해 나타내어짐; 및
(5) hFc-hCLEC2D ECD (L71-H176C-V191) 또는 hFc-hLLT1 ECD (L71-H176C-V191) - N-말단 인간 IgG1 Fc 도메인을 갖는 H176C 돌연변이를 포함하는 인간 CLEC2D ECD (아미노산 잔기 L71-H176C-V191, 유니프롯 #Q9UHP7); 서열식별번호: 175에 의해 나타내어짐. 돌연변이 H176C는 발현된 단백질의 안정성 및 균질성을 증가시키기 위해 추가의 디술피드 가교를 도입하였다.
추가로, 하기 1가 ECD 단백질을 생산하였다:
(1) hCD161 ECD (Q67-S225)-6xHis- C-말단 6xHis 태그 (서열식별번호: 197)를 갖는 인간 CD161 ECD (아미노산 잔기 Q67-S225, 유니프롯 # Q12918); 서열식별번호: 174에 의해 나타내어짐;
(2) hFc-cyCD161 ECD (K68-C74A-S225) 단량체 - N-말단 Fc 이종이량체 융합 파트너를 갖는 C74A 돌연변이를 포함하는 시노 CD161 ECD (아미노산 잔기 K68-C74A-S225). 이 구축물은 HEK293 세포를 2개의 쇄로 공동-형질감염시킴으로써 생성하였으며, 하나는 N-말단 FLAG 태그, 및 이어서 인간 IgG1 Fc (서열식별번호: 178에 의해 나타내어짐)로 이루어지고, 다른 쇄는 N-말단 인간 IgG1 Fc, 및 이어서 시노 CD161 ECD (서열식별번호: 177에 의해 나타내어짐)를 함유하였음; 및
(3) cCD161-IHM 또는 cKLRB1-IHM - 이는 FLAG-뮤린 IgG1 Fc를 시노 KLRB1 IgG1 Fc와 쌍형성함으로써 단량체 시노 KLRB1 Fc 융합 단백질이 뮤린 IgG1 융합체로서 발현된 항원 포맷임.
표준 방법을 사용한 형질감염 및 수거 후, Fc 도메인을 함유하는 단백질을 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, His 태그를 함유하는 단백질을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 응집체의 연마 및 제거를 필요에 따라 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다. 시노 CD161 Fc 단량체 단백질 (cCD161-IHM 또는 cKLRB1-IHM)에 대해, CD161 도메인이 결여된 Fc 동종이량체를 제거하기 위해 단백질 A 정제 후에 추가의 FLAG 태그 정제를 사용하였고; 이어서 목적하는 이종이량체를 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 단리하였다 (문헌 [Brown ME et al. (2020) plos one 15(3): e0229206] 참조). 상기 단백질 서열은 항체 발견 및 스크리닝에 사용된 재조합 단백질을 요약한 표 5에 열거된다.
표 5
Figure pct00011
Figure pct00012
2. 항원 및 세포주 제조
항원 (hKLRB1 ECD (Q67-S225)-hFc; cKLRB1 ECD (Q67-L227)-hFc; hFc-hKLRB1 ECD (Q67-S225); hLLT1 ECD (L71-V191)-hFc; cKLRB1-IHM; 및 hFc-hLLT1 ECD (L71-H176C-V191)를 EZ-링크 술포-NHS-비오티닐화 키트 (써모 사이언티픽, Cat #21425)를 사용하여 비오티닐화하였다.
항원을 ~1 mg/mL로 농축시키고, 완충제를 PBS로 교환한 후, 1:7.5 몰비 비오티닐화 시약을 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 밤새 유지한 후, 또 다른 완충제 교환으로 용액 중 유리 비오틴을 제거하였다. 비오티닐화는 포르테바이오를 통한 표지된 단백질의 스트렙타비딘 센서 결합을 통해 확인하였다.
3. 항-CD161 항체의 단리를 위한 라이브러리 조사 및 선택 방법
나이브 라이브러리 선택
각각 ~109의 다양성의 8종의 나이브 인간 합성 효모 라이브러리를 이전에 기재된 바와 같이 증식시켰다 (예를 들어, 문헌 [Xu et al. (2013) Protein Eng. Des. Sel., 26(10): 663-70]; WO2009/036379; WO2010/105256; 및 WO2012/009568 참조, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨).
처음 2 라운드의 선택을 위해, 밀테니 MACS 시스템을 이용하는 자기 비드 분류 기술을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (예를 들어, 문헌 [Siegel et al., J. Immunol. Methods 286(1-2), 141-153 (2004)] 참조). 간략하게, 효모 세포 (~1010 세포/라이브러리)를 세척 완충제 (포스페이트-완충 염수 (PBS)/0.1% 소 혈청 알부민 (BSA)) 중에서 비오티닐화 이량체 인간 CD161-Fc와 함께 24℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 40 mL 빙냉 세척 완충제로 1회 세척한 후, 세포 펠릿을 20 mL 세척 완충제 중에 재현탁시키고, 스트렙타비딘 마이크로비즈 (500 μL)를 효모에 첨가하고, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 다음에, 효모를 펠릿화하고, 5 mL 세척 완충제 중에 재현탁시키고, 밀테니 LS 칼럼 상에 로딩하였다. 5 mL를 로딩한 후, 칼럼을 3 mL 세척 완충제로 3회 세척하였다. 이어서, 칼럼을 자기장으로부터 제거하고, 효모를 성장 배지 5 mL로 용리시킨 다음, 밤새 성장시켰다.
하기 라운드의 선택을 유동 세포측정법 (FACS)을 사용하여 수행하였다. 효모를 펠릿화하고, 세척 완충제로 3회 세척하고, 24℃에서 감소하는 농도의 비오티닐화 이량체 인간 CD161 (10 nM), 평형 조건 하의 단량체 인간 CD161 (500 nM 내지 4 nM), 비오티닐화 이량체 시노 CD161 (5 nM), 단량체 시노 CD161 (종 교차-반응성을 얻기 위해 500 nM 내지 4 nM), 비오티닐화 이량체 인간 CLEC2DH176C (CD161-특이성을 얻기 위해 이 고도로 구조적으로 유사한 CD161 리간드에 대해 역선택하기 위해 10 nM), 또는 선택으로부터 비-특이적 항체를 제거하기 위해 다중특이성 시약 (PSR)과 함께 인큐베이션하였다. PSR 고갈을 위해, 라이브러리를 이전에 기재된 바와 같이 비오티닐화 PSR 시약의 1:10 희석물과 함께 인큐베이션하였다 (예를 들어, 문헌 [Xu et al. (2013) Protein Eng. Des. Sel., 26(10): 663-70] 참조). 이어서, 효모를 세척 완충제로 2회 세척하고, 1:100 희석된 염소 F(ab')2 항-인간 카파-FITC (LC-FITC) (서던 바이오테크, Cat #2062-02), 및 1:500 희석된 스트렙타비딘-AF633 (SA-633) (라이프 테크놀로지스, Cat # S21375) 또는 1:50 희석된 엑스트라비딘-피코에리트린 (EA-PE) (시그마-알드리치, Cat # E4011), 2차 시약으로 4℃에서 15분 동안 염색하였다. 빙냉 세척 완충제로 2회 세척한 후, 세포 펠릿을 0.3 mL 세척 완충제 중에 재현탁시키고, 스트레이너-캡핑된 분류 튜브로 옮겼다. 분류를 FACS ARIA 분류기 (BD 바이오사이언시스)를 사용하여 수행하고, 분류 게이트를 결정하여 목적하는 특징을 갖는 항체를 선택하였다. 모든 목적하는 특징을 갖는 집단이 얻어질 때까지 선택 라운드를 반복하였다. 분류의 최종 라운드 후에, 효모를 플레이팅하고, 특징화를 위해 개별 콜로니를 골라내었다.
경쇄 배치 셔플 다양화
나이브 산출물로부터의 중쇄를 사용하여, 추가적인 선택 라운드에 사용되는 경쇄 다양화 라이브러리를 제조하였다. 상기 기재된 바와 같이, 즉, 1 라운드의 MACS 및 4 라운드의 FACS로 이들 라이브러리에 대해 선택을 수행하였다. 상이한 FACS 선택 라운드에서, 라이브러리를 예를 들어 PSR 결합, 종 교차-반응성 및 친화도 압력에 대해 항원 적정, 및 나이브 선택 동안 확인된 다양한 빈을 갖는 고친화도 항체를 사용한 에피토프 적용범위에 의해 평가하였다. 분류를 수행하여 목적하는 특징을 갖는 집단을 수득하였다. 각각의 말단 FACS 선택 라운드로부터의 개별 콜로니를 서열분석 및 특징화를 위해 선택하였다.
친화도 성숙
모 클론의 최적화를 3가지 성숙 전략을 이용하여 수행하였다: 경쇄 다양화; CDRH1 및 CDRH2의 다양화; 및 CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3의 다양화.
경쇄 다양화: 나이브 선택 절차로부터 선택된 클론으로부터의 중쇄를 1 x 106의 다양성을 갖는 경쇄 라이브러리 내로 형질전환시켰다. 각각의 라운드에 대해 비오티닐화 이량체 또는 단량체 시노 CD161 항원을 사용하여 1 라운드의 MACS 분류 및 4 라운드의 FACS 분류로 상기 기재된 바와 같이 선택을 수행하였다.
CDRH1 및 CDRH2 선택: 경쇄 다양화 절차로부터 선택된 클론으로부터의 CDRH3을 1 x 108의 다양성의 CDRH1 및 CDRH2 변이체를 갖는 미리 제조된 라이브러리 내로 재조합하고, 단량체 인간 및 시노 CD161 항원을 사용하여 선택을 수행하였다. 친화도 압력은 실온에서 평형 조건 하에 감소하는 농도의 비오티닐화 단량체 CD161 항원 (50 nM 내지 1 nM)을 사용하고, 비오티닐화 항원을 모 Fab와 함께 30분 동안 예비인큐베이션한 후, 상기 예비복합체화된 혼합물을 효모 라이브러리에 선택 혼합물이 평형에 도달하거나 증가된 회합률에 유리하게 하는 시간 동안 적용함으로써 적용하였다. 이어서, 보다 높은 친화도의 항체를 분류할 수 있었다.
CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 선택: CDR3의 어느 한 측면 상의 플랭킹 영역뿐만 아니라 CDRH3 및 CDRL3을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 구입하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 NNK 다양성을 통해 CDR3에서 1개의 아미노산이 다양하였다. CDRH3 올리고뉴클레오티드를 CDRH1 및 CDRH2 선택으로부터 선택된 변이체를 함유하는 중쇄 FR1-FR3 가변 영역과 재조합하고, CDRL3을 CDRL1 및 CDRL2 변이체를 갖는 미리 제조된 라이브러리 내로 재조합하여, ~108의 라이브러리 다양성을 조합하였다. 선택은 4 라운드 동안 FACS 분류를 사용하여 이전 사이클과 유사하게 수행하였다. 각각의 FACS 라운드에 대해, 라이브러리를 PSR 결합 및 친화도 압력에 대해 조사하고, 목적하는 특징을 갖는 집단을 얻기 위해 분류를 수행하였다. 이들 선택에 대한 친화도 압력을 상기 CDRH1 및 CDRH2 선택에서 기재된 바와 같이 수행하였다.
IgG 및 Fab 생산 및 정제
추가의 특징화를 위해 충분한 양의 선택된 항체 (표 6에 제시된 항체 가변 도메인 서열)를 생산하기 위해, 효모 클론을 포화로 성장시킨 다음, 진탕시키면서 30℃에서 48시간 동안 유도하였다. 유도 후에, 효모 세포를 펠릿화하고, 상청액을 정제를 위해 수거하였다. IgG를 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제하고, 아세트산, pH 2.0으로 용리시켰다. Fab 단편을 파파인 소화에 의해 생성하고, 카파셀렉트(KappaSelect) (지이 헬스케어 라이프사이언시스) 상에서 정제하였다.
표 6
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 2 - CD161 항체의 결합 친화도
본 실시예는 실시예 1에서 생성된 다양한 CD161 항체의 동역학 및 친화도를 기재한다.
포르테바이오 친화도 측정은 일반적으로 이전에 기재된 바와 같이 옥테트 HTX 상에서 수행하였다 (예를 들어, 문헌 [Estep et al. (2013) MAbs, 5(2): 270-8] 참조). 간략하게, IgG를 AHC 센서 상에 온-라인으로 로딩함으로써 포르테바이오 친화도 측정을 수행하였다. 센서를 검정 완충제 중에서 30분 동안 오프-라인으로 평형화시킨 다음, 기준선 확립에 대해 60초 동안 온-라인으로 모니터링하였다. 로딩된 IgG를 갖는 센서를 100 nM 항원에 3분 동안 노출시킨 후, 오프-레이트 측정을 위해 검정 완충제로 3-10분 동안 옮겼다. 결합력(Avid) 및 1가 친화도 평가를 각각 이량체 또는 1가 항원을 사용하여 수행하였다. 최적화 동안, Fab를 사용하여 1가 친화도를 또한 평가하였다. 이러한 평가를 위해, 비-비오티닐화 Fc 융합 항원을 AHC 센서 상에 온-라인으로 로딩하였다. 센서를 검정 완충제 중에서 30분 동안 오프-라인으로 평형화시킨 다음, 기준선 확립에 대해 60초 동안 온-라인으로 모니터링하였다. 로딩된 항원을 갖는 센서를 100 nM Fab에 3분 동안 노출시킨 후, 오프-레이트 측정을 위해 검정 완충제로 10분 동안 옮겼다. 동역학적 데이터를 분석하고, 1:1 결합 모델을 사용하여 피팅하고, koff를 kon로 나눔으로써 KD를 계산하였다.
옥테트-기반 실험 (항-CD161 항체의 항체 결합 동역학)에 의해 측정된 CD161 항체의 KD 값을 표 7에 나타내고, 명시된 바와 같이 항체 친화도는 10-7 M 내지 10-10 M이다.
표 7
Figure pct00016
실시예 3 - 항-CD161 항체는 CD161에 결합함 - 세포상 표적 결합
본 실시예는 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD161을 외인성으로 발현하는 HEK293 세포에 결합하는 항-CD161 항체의 능력을 기재한다.
HEK293 세포를 지질-기반 형질감염, 게놈 내로의 무작위 통합 및 항생제 선택에 의해 인간 (h) 또는 시노몰구스 원숭이 (c) CD161 (표 8의 아미노산 서열)을 과다발현하도록 조작하였다.
표 8
Figure pct00017
항체 결합 검정을 위해, hCD161-HEK293, cCD161-HEK293 및 널-HEK293 세포를 0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 포스페이트-완충 염수 (PBSA) 중에서 세척하고, 96 웰 플레이트에 웰당 1 x 104 세포의 밀도로 시딩하였다. 세척된 세포를 PBSA 중에 희석된 항체 적정물 중에 재현탁시키고, 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBSA 중에서 세척하고, PBSA 중에 1:1000 희석된 알렉사 플루오르® 647 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 #109-605-190) 중에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 중에서 세척하고, 2% 포름알데히드를 함유하는 PBS 중에 재현탁시키고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고, BD 심포니 유동 세포측정기로 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
데이터를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 농도에서의 MFI를 계산하고, 그래프패드 프리즘으로 내보냈다. EC50 값을 3 파라미터 비-선형 회귀 피트로 계산하였다.
도 1A-1D는 인간 CD161을 외인성으로 발현하는 HEK 293 세포에 대한 인간 항-CD161 항체의 결합을 나타내는 그래프이다. Iso Ctrl은 이소형 대조군 항체를 나타낸다.
도 2A-2D는 시노몰구스 CD161을 외인성으로 발현하는 HEK 293 세포에 대한 인간 항-CD161 항체의 결합을 나타내는 그래프이다. Iso Ctrl은 이소형 대조군 항체를 나타낸다.
표 9, 도 1A-1D, 및 도 2A-2D에 나타낸 바와 같이, 인간 항-CD161 항체는 hCD161-HEK293 및 cCD161-HEK293에 용량 의존성 방식으로 결합하고, 대략 0.1-0.5 nM의 EC50 값을 갖는다. 형질감염되지 않은 (널) 세포에 대해서는 어떠한 결합도 관찰되지 않았으며, 이는 결합이 CD161에 특이적이었음을 나타낸다.
표 9
Figure pct00018
실시예 4 - 온-셀 상동체 결합 (FACS KLRF1, KLRF2, CLEC12B, CLEC2D)
본 실시예는 CD161에 대한 항체 특이성의 척도로서 CD161 상동체를 외인성으로 발현하는 HEK 293 세포에 대한 항-CD161 항체의 결합을 기재한다. 본 검정에서 관심있는 상동성 단백질은 서열 유사성에 기초하였고; 관심있는 단백질의 정렬은 도 3에 제시된다. 특이성을 또한 CLEC2D에 대해 시험하였다; CD161 및 CLEC2D의 정렬은 도 4에 제시된다.
HEK293 세포를 지질-기반 형질감염, 트랜스포존 매개 통합 및 항생제 선택에 의해 KLRF1, KLRF2, CLEC12B, 또는 CLEC2D (표 10의 CD161 상동체 서열)를 과다발현하도록 조작하였다. 구축물의 안정한 통합을 qPCR에 의해 검증하였다.
표 10
Figure pct00019
CD161 항체를 하기 상술된 바와 같이 단일 포화 농도에서 상기 언급된 각각의 세포주에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다.
항체 결합 검정을 위해, 모든 세포주를 0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 포스페이트-완충 염수 (PBSA) 중에서 세척하고, 96 웰 플레이트에 웰당 4 x 104 세포의 밀도로 시딩하였다. 세척된 세포를 100 nM의 항체 (세포 상의 최대 결합을 측정하기 위한 포화 농도) 중에 재현탁시키고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBSA 중에서 세척하고, PBSA 중에 1:1000 희석된 알렉사 플루오르® 647 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 #109-605-190) 중에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 써모 피셔 어튠(Thermo Fisher Attune) 유동 세포측정기로 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
도 5A-5B는 CD161 또는 CD161 상동체 (CLEC2D, KLRF1, KLRF2 및 CLEC12B)를 외인성으로 발현하는 HEK 293 세포에 대한 인간 항-CD161 항체의 결합을 나타내는 그래프이다. Iso Ctrl은 이소형 대조군 항체를 나타낸다. 널은 대조군 HEK 293 세포를 나타낸다.
데이터를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 샘플에 대한 MFI를 계산하고, 그래프패드 프리즘으로 내보냈다. 도 5A-5B 및 표 11에 나타낸 바와 같이, CD161 상동체를 발현하는 임의의 HEK293 세포주에 대한 유의한 결합은 관찰되지 않았다.
포화 항체 농도 (100 nM)에서의 CD161 결합의 백분율로서, CD161 상동체를 발현하는 세포에 대한 항-CD161 항체의 오프-타겟 결합 평가를 표 11에 나타낸다.
표 11
Figure pct00020
실시예 5 - 항-CD161 항체가 렉틴-유사 전사체 1 (CLEC2D) 결합을 차단함 - 리간드 차단 검정
본 실시예는 인간 CD161 단백질 및 실시예 1에 기재되고 표 5에 제시된 가용성, 비오티닐화 Fc-인간 CLEC2D (H176C) 단백질을 과다발현하는 HEK293 세포를 사용한, CD161과 CLEC2D 사이의 상호작용의 CD161 항체-매개된 차단을 기재한다.
CD161/CLEC2D의 항체-매개 차단을 위해, HEK293-hCD161 세포를 0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 포스페이트-완충 염수 (PBSA) 중에서 세척하고, 96 웰 플레이트에 웰당 1 x 104 세포의 밀도로 시딩하였다. 항체 적정물을 PBSA 중에 희석하고, 비오티닐화 Fc-H176C CLEC2D를 항체의 각각의 적정물에 100 nM의 최종 농도로 첨가하고, 항체/CLEC2D 용액을 HEK293-hCD161 세포와 함께 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBSA 중에서 세척한 다음, 비오티닐화 Fc-H176C CLEC2D 결합을 PBSA 중에 1:1000 희석된 스트렙타비딘, 알렉사 플루오르™ 647 접합체 (써모 피셔, 카탈로그 # S21374)에 의해 검출하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 중에서 세척하고, 2% 포름알데히드를 함유하는 PBS 중에 재현탁시키고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고, 써모 피셔 어튠 유동 세포측정기로 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
데이터를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 농도에서의 MFI를 계산하고, 그래프패드 프리즘으로 내보냈다. EC50 값을 3 파라미터 비-선형 회귀 피트로 계산하였다.
도 6A-6D는 인간 CD161 단백질 및 가용성, 비오티닐화 Fc-인간 CLEC2D (H176C) 단백질을 과다발현하는 HEK293 세포를 사용한, CD161과 CLEC2D 사이의 상호작용의 인간 항-CD161 항체-매개된 차단을 나타내는 그래프이다. Iso Ctrl은 이소형 대조군 항체를 나타낸다.
hCD161-HEK293 세포에의 인간 Fc-H176C CLEC2D 결합의 항체 매개된 차단을 표 12에 나타낸다.
표 12
Figure pct00021
항체의 부재 하에, HEK293 세포 상의 hCD161과 비오티닐화 H176C Fc-CLEC2D 사이의 상호작용을 스트렙타비딘, 알렉사 플루오르™ 647 접합체에 의해 검출하였다. 표 12 및 도 6A-6D에 나타낸 바와 같이, 항-CD161 항체의 존재는 가용성 비오티닐화 Fc-H176C CLEC2D와 hCD161-HEK 세포 사이의 상호작용을 용량 의존성 방식으로 억제하였다. 모든 IC50 값은 0.3 내지 1.7 nM이다.
실시예 6 - CD161-항체는 외인성 CLEC2D 발현을 갖는 공동-배양 검정에서 NK 세포를 활성화시킴
본 실시예는 리간드 CLEC2D를 과다발현하는 표적 세포에 의해 매개되는 인간 NK 세포 상의 억제 신호전달을 차단하는 항-CD161 항체의 능력을 기재한다.
간략하게, NK 세포 (CD3- CD56+)를 자기 비드로의 음성 선택을 사용하여 인간 PBMC로부터 단리하였고, 단리된 NK 세포의 순도는 전형적으로 >90%였다. 단리된 NK 세포를 활성화를 위해 100 ng/mL IL-2를 함유하는 배지에서 배양하였다. IL-2-활성화된 NK 세포를 활성화 24시간 후에 사용하였다.
K562 인간 암 세포를 트랜스포손 조작에 의해 인간 CLEC2D를 과다발현하도록 조작하였다. 세포를 분석 설정 전에 선택 항생제를 갖는 IMDM (이스코브 변형 둘베코 배지) 내에서 배양하였다.
인간 CLEC2D를 발현하는 K562 인간 암 세포를 수거하고, 배양 배지 중에 2 x 106 세포/mL로 재현탁시켰다. 인간 항-CD161 항체 및 마우스 항-인간 CD161 항체 (HP-3G10)를 배양 배지 중에 희석하였다. 활성화된 NK 세포를 수거하고, 세척하고, 배양 배지 중에 2 x 106 세포/mL로 재현탁시켰다. 이어서, K562 암 세포를 IL-2의 존재 하에 항-CD161 항체 및 활성화된 NK 세포와 혼합하였다. CD107a 염색을 CD3- CD56+ 세포에서 분석하여 NK 세포 활성화를 평가하였다.
도 7A-7D는 용량-의존성 방식으로 CD107a 발현에 의해 측정된 바와 같은 인간 NK 세포의 항-CD161 항체-매개 활성화를 나타내는 그래프이다. Iso Ctrl은 이소형 대조군 항체를 나타낸다.
도 7A-7D에 나타낸 바와 같이, 인간 항-CD161 항체는 마우스 항-인간 CD161 항체를 사용하여 달성된 NK 세포 활성화에 비해 용량-의존성 방식으로 CD107a 발현에 의해 측정된 바와 같이 NK 세포 활성화를 증가시킨 반면에, 이소형 대조군은 NK 세포 기능에 대한 효과가 없었다. 추가로, CLEC2D가 결여된 K562 세포를 검정에서 표적 세포로 사용한 경우, CD107a의 전형적인 양은 대략 30%였으며, 이는 항체가 NK 세포의 CLEC2D-매개 억제를 완전히 완화시켰음을 나타낸다. 각각의 항체에 대한 상기 효과에 대한 EC50을 표 13에 열거한다 (NK 세포 기능의 항체 매개된 회복).
표 13
Figure pct00022
실시예 7 - 외인성 CLEC2D 발현을 사용한 공동-배양 검정에서의 T 세포의 항체 활성화
본 실시예는 리간드를 과다발현하는 표적 세포에 의해 매개되는 Jurkat T 세포에 대한 억제 신호전달을 차단하는 항-CD161 항체의 능력을 기재한다.
NFAT-루시페라제 리포터 유전자 (인비보젠)를 갖는 Jurkat T 세포를 렌티바이러스 형질도입에 의해 NY-ESO-1-특이적 TCR 및 인간 CD161 둘 다를 과다발현하도록 조작하였다. 세포를 분석 설정 전에 선택 항생제를 갖는 IMDM 배지 내에서 배양하였다.
K562 인간 암 세포를 렌티바이러스 형질도입에 의해 MHC-I (HLA-A0201)를 과다발현하고, 트랜스포손 조작에 의해 인간 CLEC2D를 과다발현하도록 조작하였다. 세포를 분석 설정 전에 선택 항생제를 갖는 IMDM 배지 내에서 배양하였다.
제0일에, 조작된 K562 세포를 10 μg/mL NY-ESO-1 펩티드 항원, SLLMWITQV (서열식별번호: 192)를 함유하는 배지 중에 5 x 105 세포/mL의 밀도로 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다.
제1일에, Jurkat 이펙터 세포 및 펩티드-로딩된 K562 표적 세포를 96-웰 플레이트에 1:4의 비로 플레이팅하였다. 항-CD161 항체 (인간 항-CD161 항체 및 마우스 항-인간 CD161 항체 (HP-3G10))를 검정 배지 중에 사전-희석하고, 공동-배양물에 1:1 부피 비로 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다.
제2일에, 20 μL의 검정 상청액을 50 μL의 퀀티-루크 루시페라제 검출 시약 (인비보젠)을 함유하는 백색-벽 96-웰 플레이트로 옮겼다. 엔비전 플레이트 판독기 상에서 종점 발광을 판독하였다. 배수 유도는 항체를 함유하지 않는 대조군 웰의 평균 발광 값에 의해 각각의 웰의 발광 값을 정규화함으로써 계산하였다.
도 8A-8D는 NFAT 신호전달에 의해 측정된 바와 같은 외인성 CLEC2D 발현을 사용한 공동-배양 검정에서의 T 세포의 활성화된 T 세포 (NFAT) 신호전달 항-CD161 항체-매개 활성화의 핵 인자를 나타내는 그래프이다. 이소형 대조군 항체를 대조군으로서 사용하였다.
항체의 부재 하에, Jurkat 세포 상의 CD161과 K562 세포 상의 CLEC2D 사이의 상호작용은 NFAT 신호전달을 억제한다. 도 8A-8D에 나타낸 바와 같이, 항-CD161 항체의 존재 하에, 억제 신호는 차단되고, TCR/MHC-I 상호작용을 통한 NFAT 신호전달은 용량-의존성 방식으로 회복된다. 도 8A-8D에 나타낸 바와 같이, 본원에 개시된 인간 항-CD161 항체는 HP-3G10과 비교하여 NFAT 신호전달 (TCR 신호전달로 나타냄)을 회복시키는 데 더 우수하다. 표 14는 계산된 EC50 값을 열거한다.
표 14
Figure pct00023
실시예 8 - 내인성 CLEC2D 발현을 사용한 공동-배양 검정에서의 T 세포의 항체 활성화.
본 실시예는 내인성 리간드 발현을 갖는 표적 세포에 의해 매개되는 Jurkat T 세포 상의 억제 신호전달을 차단하는 항-CD161 항체의 능력을 기재한다.
NFAT-루시페라제 리포터 유전자 (인비보젠)를 갖는 Jurkat T 세포를 렌티바이러스 형질도입에 의해 NY-ESO-1-특이적 TCR 및 인간 CD161 둘 다를 과다발현하도록 조작하였다. 세포를 분석 설정 전에 선택 항생제를 갖는 IMDM 배지 내에서 배양하였다.
MHC-I (HLA-A0201) 및 CLEC2D를 내인성으로 발현하는 NALM6 인간 암 세포를 검정 설정 전에 RPMI 배지에서 배양하였다.
제0일에, NALM6 세포를 1 μg/mL NY-ESO-1 펩티드 항원 (서열식별번호: 192)을 함유하는 배지에 5 x 105 세포/mL의 밀도로 시딩하고, 밤새 인큐베이션하였다.
제1일에, Jurkat 이펙터 세포 및 펩티드-로딩된 NALM6 표적 세포를 96-웰 플레이트에 1:4의 비로 플레이팅하였다. 항-CD161 항체를 검정 배지 중에 사전-희석하고, 공동-배양물에 1:1 부피 비로 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다.
제2일에, 20 μL의 검정 상청액을 50 μL의 퀀티-루크 루시페라제 검출 시약 (인비보젠)을 함유하는 백색-벽 96-웰 플레이트로 옮겼다. 엔비전 플레이트 판독기 상에서 종점 발광을 판독하였다. 배수 유도는 항체를 함유하지 않는 대조군 웰의 평균 발광 값에 의해 각각의 웰의 발광 값을 정규화함으로써 계산하였다.
도 9는 용량-의존성 방식으로 NFAT 신호전달의 회복을 나타내는 그래프이다.
항체의 부재 하에, Jurkat 세포 상의 CD161과 NALM6 세포 상의 CLEC2D 사이의 상호작용은 NFAT 신호전달을 억제한다. 항-CD161 항체의 존재 하에, 억제 신호는 차단되고, TCR/MHC-I 상호작용을 통한 NFAT 신호전달은 도 9에 나타낸 바와 같이 용량-의존성 방식으로 회복된다.
실시예 9 - 항-CD161 항체의 개발가능성
본 실시예는 제조 실행가능성, 구체적 투여 경로에 대한 제제화가능성, 및 생체내 환경과의 상용성, 예컨대 면역원성, 오프-타겟 효과, 및 항-CD161 항체의 반감기를 평가한다.
다중특이성 ELISA
이 방법을 사용하여 마이크로타이터 플레이트-고정된 다중특이성 표적 (dsDNA, 인슐린, 바큘로바이러스 입자 (BVP), HSP70)에의 항체 결합을 확립하였다. 이들 표적에의 항체 결합은 생체내 신속한 항체 클리어런스와 상관관계가 있다 (문헌 [Avery et al. (2018) MAbs, 10(2): 244-255; Jain et al. (2017) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 114(5): 944-949; Kelly et al. (2017) MAbs, 9(7): 1036-1040]). 검정 신호에서의 잠재적인 플레이트-대-플레이트 가변성을 설명하기 위해, 각각의 ELISA 플레이트 상에서 3개의 대조군 항체를 사용하여 검정을 수행하였다. 대조군은 그의 낮은 (아달리무맙, 문헌 [Lapadula et al. (2014) Int. J. Immunopathol. Pharmacol., 27(1 Suppl): 33-38]), 중간 (우스테키누맙, 문헌 [Benson et al. (2011) MAbs, 3(6): 535-545]), 또는 높은 (브리아키누맙, 문헌 [Misselwitza et al. (2020) Digestion, 101(Suppl 1): 69-82]) 다반응성 (문헌 [Jain et al. (2017) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 114(5): 944-949; Kelly et al. (2017) MAbs, 9(7): 1036-1040])을 기반으로 하여 선택하였다.
고 결합 하프-웰 플레이트 (코닝, cat#3690)의 시험 웰을 PBS, pH 7.4 중 다중특이성 시약 (dsDNA (밀리포어, cat#11691112001), 인간 인슐린 (MP 바이오메디칼스, cat#193900), BVP (레이크파마, cat#25690), 인간 HSP70 (알앤디 시스템즈, cat#AP-100)) 웰당 3 μg/mL/25 μl로 4℃에서 밤새 코팅함으로써 전형적인 ELISA를 수행하였다. 플레이트 상의 배경 대조군 웰은 코팅하지 않고 두었다. 플레이트를 세척 완충제 (0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS, pH 7.4)로 3회 세척하고, 차단 완충제 (PBS 중 3% BSA, pH 7.4)로 37℃에서 1시간 동안 즉시 차단하였다. 시험 및 대조군 (막 차단된) 웰에, 100 nM 항-CD161 또는 대조군 항체를 검정 완충제 (0.05% 트윈 20을 함유하는 차단 완충제) 중에 이중으로 첨가하였다 (웰당 25 μL). 37℃에서 45분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 3회 세척하고, HRP-접합 염소 항-인간 IgG 항체 (Fc 감마 단편 특이적, 잭슨 이뮤노리서치, cat#109-035-098)를 37℃에서 45분 동안 첨가하였다 (웰당 25 μL). 플레이트에 고정된 표적에 결합된 항체를 HRP 기질 (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB; 세라케어, cat#5120-0077)을 사용하여 450 nm에서의 흡광도로 결정하였다. 각 항체에 대해, 이중 값을 평균하고, 평균 검정 배경을 차감하였다.
표 15는 모든 20종의 항-CD161 항체 (제1 패밀리 (F1)로부터의 모 모노클로날 항체로부터 생성된 11종의 항체 및 제2 패밀리 (F2)에 대한 모 모노클로날 항체로부터 생성된 9종의 항체)가 플레이트-고정된 다중특이성 표적에 대해 낮은 결합을 갖는다는 것을 나타낸다. 시험 항체 결합은 대조군 낮은 다반응성 항체 아달리무맙의 것의 0.92배 내지 2.8배, 및 인슐린의 경우 1.0배 내지 2.14배, BVP의 경우 0.46배 내지 1.92배, 및 HSP70의 경우 0.64배 내지 4.07배였다. 대조적으로, 높은 다반응성 대조군 항체인 브리아키누맙은 dsDNA에 대해 ~5배 더 크게, 인슐린에 대해 ~17배 더 크게, BVP에 대해 ~8배 더 크게, HSP70에 대해 ~10배 더 크게 결합하면서 아달리무맙보다 플레이트-고정 표적에 훨씬 더 단단하게 결합하였다. 이들 결과는 항-CD161 항체의 다반응성에 대한 낮은 성향을 확인하였다.
표 15
Figure pct00024
1각각의 값은 시험 항체에 대한 검정 신호를 낮은 다반응성 대조군 항체인 아달리무맙에 대한 검정 신호로 나눈 것을 나타낸다.
HIC 결합 (HPLC)
IgG 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 검정하였으며, 이는 이러한 방법론이 불량한 생물물리학적 거동 또는 비-특이성의 유용한 상관관계인 것으로 밝혀졌기 때문이다 (문헌 [Jain et al. (2017) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 114(5): 944-949]). 이러한 이전 연구에 기초하여, 체류 시간에 대한 2개의 역치를 관심 플래그로서 정의하여 항체 후보의 거동을 평가하는 데 사용하였다.
이 검정을 위한 방법론은 이전에 기재되었다 (문헌 [Estep, et al. (2015) MAbs, 7(3): 553-561]). 간략하게, 1 mg/mL의 5 μg 정제된 IgG 샘플을 이동상 A 용액 (1.8 M 황산암모늄 및 0.1 M 인산나트륨, pH 6.5)으로 스파이킹하여 분석 전에 약 1 M의 최종 황산암모늄 농도를 달성하였다. 세팍스 프로테오믹스(Sepax Proteomix) HIC 부틸-NP5 칼럼을 이동상 A 및 이동상 B 용액 (0.1 M 인산나트륨, pH 6.5)의 선형 구배와 함께 20분에 걸쳐 1 mL/분의 유량으로 280 nm에서의 UV 흡광도 모니터링과 함께 사용하였다. 체류 시간을 측정하고, 발생가능성 플래그와 비교하였다: 10.5분 미만의 체류 시간은 우려가 없는 것으로 간주되었고; 10.5-11.5분은 낮은 우려를 가졌고; >11.5분은 높은 우려를 가졌다. IgG에 대한 체류 시간을 표 16에 열거한다.
표 16에 나타낸 바와 같이, 모든 시험된 항체 후보에 대한 체류 시간은 10.5분 미만이었다.
표 16
Figure pct00025
실시예 10 - 인간 및 시노몰구스 PBMC에의 항-CD161 항체 결합의 프로파일링
본 실시예는 내인성 표적 발현을 갖는 세포에 대한 항체의 친화도 및 특이성을 평가하기 위해 인간 또는 시노몰구스 원숭이로부터의 1차 면역 세포에 대한 항-CD161 항체의 결합을 특징화한다.
PBMC 집단에서 인간 및 시노몰구스 원숭이 NK 세포에의 결합.
인간 및 시노몰구스 원숭이 PBMC 집단에서 CD161을 발현하는 것으로 공지된 NK 세포에 결합하는 항-CD161 항체의 능력을 측정하였다.
인간 PBMC (헤마케어, 카탈로그 #20062234)를 PBSA 중에서 세척하고, 96 웰 플레이트에 웰당 2 x 105 세포의 밀도로 시딩한 다음, PBS 중에 1:1000 희석된 라이브/데드 아쿠아 염색 (써모 피셔, 카탈로그 # L34957)과 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBSA 중에서 세척한 다음, PBSA 중에 1:200 희석된 Fc 블록 중에 4℃에서 20분 동안 재현탁시켰다. 세포를 PBSA 중에서 세척한 다음, PBSA 중에 희석된 APC 접합 항체 적정물, 항-인간 CD3 알렉사 플루오르® 700 (바이오레전드, 카탈로그 #300424), 항-인간 CD56 BB700 (BD, 카탈로그 #566573), 항-인간 CD16 V450 (BD, 카탈로그 #644489)을 함유하는 항체 칵테일 중에 재현탁시키고, 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBSA 중에서 세척하고, BD 심포니 유동 세포측정기로 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
시노몰구스 PBMC (월드와이드 프라이메이츠, 카탈로그 # bc347H)를 PBSA 중에서 세척하고, 96 웰 플레이트에 웰당 2 x 105 세포의 밀도로 시딩한 다음, PBS 중에 1:1000 희석된 라이브/데드 아쿠아 염색 (써모 피셔, 카탈로그 # L34957)과 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBSA 중에서 세척한 다음, PBSA 중에 1:200 희석된 Fc 블록 중에 4℃에서 20분 동안 재현탁시켰다. 세포를 PBSA 중에서 세척한 다음, PBSA 중에 희석된 APC 접합 항체 적정물, 항-인간 CD3 APC-Cy™7 (바이오레전드, 카탈로그 #557757), 항-인간 NKp80 PE (바이오레전드, 카탈로그 #346706), 항-인간 CD16 V450 (BD, 카탈로그 #644489)을 함유하는 항체 칵테일 중에 재현탁시키고, 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBSA 중에서 세척하고, BD 심포니 유동 세포측정기로 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
데이터를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 인간 NK 세포를 CD3 음성/CD16 양성/CD56 양성 마커에 의해 확인하였다. 시노몰구스 원숭이 NK 세포를 CD3 음성/CD16 양성/NKp80 양성 마커에 의해 확인하였다. 각각의 농도에서 NK 세포의 CD161 양성 백분율을 계산하고, 그래프패드 프리즘으로 내보냈다. EC50 값을 3 파라미터 비-선형 회귀 피트로 계산하였다.
도 10A-10B는 인간 PBMC (도 10A) 및 시노몰구스 PBMC (도 10B)에 대한 항-CD161 항체의 결합을 나타내는 그래프이다.
hPBMC 및 cPBMC에의 항-CD161 결합을 표 17에 나타낸다.
표 17
Figure pct00026
표 17 및 도 10A-10B에 나타낸 바와 같이, 항체는 PBMC 집단 내의 인간 및 시노몰구스 원숭이 1차 NK 세포에 용량 의존성 방식으로 결합하였다.
실시예 11 - 세포 유형 특이성을 시험하기 위한 인간 PBMC에의 항-CD161 항체 결합의 프로파일링
CD161을 발현하는 것으로 공지된 인간 PBMC에서 면역 세포 집단에만 특이적으로 결합하는 항-CD161 항체의 능력을 평가하였다. 인간 PBMC 내에서, 점막-연관 불변 T (MAIT) 세포는 CD161을 강하게 발현하는 반면 (문헌 [Martin, et al., PLoS Biol., 2009, 7(3): e1000054]), 다른 면역 세포 유형, 예컨대 B 세포, 단핵구 및 수지상 세포는 CD161의 발현이 결여되어 있는 것으로 밝혀졌다.
인간 PBMC (헤마케어, 카탈로그 #20062234)를 1X PBS 중에서 세척하고, 96 웰 플레이트에 웰당 250,000 세포의 밀도로 시딩한 다음, PBS 중에 1:1000 희석된 라이브/데드 아쿠아 염색 (써모 피셔, 카탈로그 # L34957)과 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 염색 완충제 (3% 태아 소 혈청 및 0.2 mM EDTA를 함유하는 1X PBS) 중에서 세척한 다음, 염색 완충제 중에 1:200 희석된 Fc 블록 중에 4℃에서 20분 동안 재현탁시켰다. 세포를 염색 완충제 중에서 세척한 다음, 염색 완충제 중에 희석된 30 nM의 APC 접합 항 CD161 항체, 항-인간 CD3 알렉사 플루오르® 700 (바이오레전드, 카탈로그 #300424), 항-인간 CD56 BB700 (BD, 카탈로그 #566573), 항-인간 CD16 BV786 (바이오레전드, 카탈로그 #302046), 항-인간 CD8 BV711 (바이오레전드, 카탈로그#301044), 항-인간 TCRva7.2 BV421 (바이오레전드, 카탈로그#351794), 항-인간 CD11c FITC (바이오레전드, 카탈로그#371516), 항-인간 CD4 APC-Cy7 (바이오레전드, 카탈로그#300518), 항-인간 CD14 PE-Cy7 (바이오레전드, 카탈로그#367112) 및 항-인간 CD20 PE (바이오레전드, 카탈로그#302306)를 함유하는 항체 칵테일 중에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 염색 완충제 중에서 세척하고, BD 심포니 유동 세포측정기로 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
데이터를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 인간 MAIT T 세포를 CD3 양성/TCRva 7.2 양성 마커에 의해 확인하였다. 인간 B 세포를 CD3 음성/CD20 양성 마커에 의해 확인하고, 인간 단핵구를 CD3 음성/CD14 양성 마커에 의해 확인하고, 인간 수지상 세포를 CD3 음성/CD11c 양성 마커에 의해 확인하였다. 상이한 세포의 CD161 MFI를 30 nM에서 계산하고, 그래프패드 프리즘으로 내보냈다.
도 11은 인간 PBMC (MAIT T 세포, B 세포, 단핵구, 수지상 세포)에서 면역 세포 집단에 대한 항-CD161 항체의 결합을 나타내는 막대 그래프이다.
이소형 대조군에 비해 각각의 세포에의 항 CD161 결합의 배수 MFI 변화를 표 18에 나타낸다.
표 18
Figure pct00027
표 18 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 항 CD161 항체는 인간 PBMC에서 B 세포, 단핵구 및 DC (이소형 대조군에 대한 배수 변화 </ = 1)보다 더 높은 특이성 (이소형 대조군에 대한 배수 변화 >1)으로 인간 1차 MAIT T 세포에 결합하였다.
실시예 12 - Ab9의 Fc 영역 내의 N297A 아미노산 치환은 FcγRII에의 결합을 감소시키고, FcγRI 및 FcγRIII에의 결합을 제거하였음
본 실시예는 야생형 인간 IgG1 항체 ("WT")와 비교할 때 FcγR 및 FcRn에 대한, CD161에 대해 지시된 모노클로날, 비-글리코실화 인간 IgG1 항체인 Ab9의 결합 친화도를 시험하였다.
IgG 항체의 Fc 부분은 면역 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체와 결속될 때 특이적 면역 기능과 연관된 다양한 영역을 갖는다. IgG에 대한 3종의 별개의 Fc 수용체 (FcγR), FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII는 단핵구, 림프구, 다형핵 세포 (PMN)를 포함한 인간 골수 세포와 연관된 것으로 공지되어 있다. IgG의 Fc 부분과 이들 FcγR 중 하나의 결속은 IgG의 Fab 부분에 특이적인 항원을 발현하는 세포의 세포용해로 이어질 수 있다.
인간 IgG1인 Ab9는 CD161이 그의 리간드인 CLEC2D에 결합하는 것을 차단한다. Ab9를 Fc 영역에서의 아스파라긴 (N)에서 알라닌 (A)으로의 치환 (N297A)으로 조작하여 Fcγ 수용체에의 결합을 제거하고, 임의의 바람직하지 않은 세포용해를 제거하였다.
본 실시예에 기재된 실험은 아스파라긴에서 알라닌으로 조작된 아미노산 스위치가 Fcγ 수용체 RI, RIIA, RIIB/C, RIIIA, 및 RIIIB에 대한 Ab9의 결합을 제거하거나 유의하게 감소시키는 데 효과적임을 입증한다. 돌연변이는 FcγR과 상이한 위치에서 IgG1에 결합하는 FcRn에 대한 결합을 유의하게 변경시키지 않았다. 이는 IgG의 긴 반감기를 담당하는 재순환 수용체이고, 따라서 Ab9의 활성에 영향을 미치지 않을 것이다.
ELISA에 의한 Fcγ 수용체 결합
간략하게, 차단 완충제를 갖는 스트렙타비딘 코팅된 투명한 96-웰 플레이트에 대한 항체 Ab9의 결합을 세척 완충제로 3회 세척하였다. PBSA 중 0.25 μg/mL의 비오티닐화 FcγR 100 μL/웰을 플레이트 맵에 따라 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 동안, Ab9 및 WT를 카파 경쇄에 대한 마우스 항체 (압캠 항-카파)와 2:1 비로 실온에서 1시간 동안 예비인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하였다. PBSA 중 100 μL/웰의 3배, 7 포인트, 적정된 IgG 복합체 또는 IgG 단독을 플레이트 맵에 따라 첨가하였다 (IgG 복합체의 경우 25,000 ng/mL의 최고 농도, IgG 단독의 경우 500 ng/mL의 최고 농도). 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 세척 완충제로 3회 세척하였다. PBSA 중에 1:5000 희석된 100 uL/웰의 HRP 접합 Fab-항-인간 Fab 단편 특이적 항체를 플레이트에 첨가한 후, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고, 이어서 HRP 기질 (TMB (TMB 또는 등가물, 즉 세라케어 라이프 사이언시스 인크, 피셔캣# 50-674-93), 100 μL/웰)을 첨가하였다. 색상이 발색되면, 정지 용액을 첨가하고 (100 μL/웰), 플레이트를 450 nm에서의 흡광도로 판독하였다. EC50 값을 3 파라미터 비-선형 회귀로 계산하였다.
도 14A-14B는 FcγRI (도 14A) 및 FcγRII 및 FcγRIII (도 14B)에의 가용성 수용체 결합을 나타내는 ELISA 검정 포맷을 나타낸다. 비오티닐화 FcγRI는 "FcγRI-bio"로 나타낸다. 도 15a-15e는 Fcγ 수용체, FcγRI (도 15a), FcγRIIA (도 15b), FcγRIIB/C (도 15c), FcγRIIIA (도 15d), 및 FcγRIIIB (도 15e)에 대한 Ab9의 결합 동역학을 예시하는 ELISA 결합 곡선이다.
도 15A-15E에 나타낸 바와 같이, Ab9의 Fc 영역에서의 아스파라긴 (N)에서 알라닌 (A)으로의 치환 (N297A)은 야생형 인간 IgG1과 비교하여 FcγRII에의 결합을 감소시켰고, FcγRI 및 FcγRIII에의 결합을 제거하였다. FcγRIIA (R167) 및 FcγRIIA (H167)는 인간 IgG2를 라이게이션하는 그의 능력이 상이한 FcγRIIA의 2개의 대립유전자 변이체를 나타낸다. 유사하게, FcγRIIIa 대립유전자, F176 및 V176은 세포외 도메인의 위치 176에서 1개의 아미노산이 상이하고 인간 IgG1 및 IgG3에 결합하는 그의 능력이 상이하며; F176은 저-결합 대립유전자이고, V176은 고 결합이다.
표 21: ELISA에 의해 결정된 EC50 값. 표에 사용된 약어: n.b.- 결합 없음.
Figure pct00028
옥테트에 의한 Fcγ 수용체 결합
Fcγ 수용체에 대한 Ab9의 결합 동역학을 또한 옥테트 시스템 (포르테바이오) 상에서 생물층 간섭측정법을 통해 평가하였다. 도 16A는 옥테트에 의한 FcRn 결합 방법을 예시한다. pH 5.0 옥테트 완충제 중 3 μg/mL의 Acro FcRn-Bio를 90초 동안 스트렙타비딘 바이오센서 상에 로딩하였다. 180초 동안의 회합 (100 nM, 3배, 7-포인트 적정, pH 5.0 완충제) 및 600초 동안의 pH 5.0 완충제에서의 해리를 측정하였다. 결과를 포르테바이오 데이터 분석 12.0.2.11 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 고정된 로드 샘플을 함유하고 회합 동안 분석물이 없는 참조 샘플 웰을 각각의 샘플로부터 차감하였다. 상위 3개의 농도는 비-특이적 효과 및 불량한 모델 피트로 인해 배제되었다. 동역학 상수는 포괄적인 1:1 동역학 결합 모델을 사용하여 계산하였다.
ELISA 검정과 유사하게, FcRn에의 단단한 결합이 Ab9 및 WT 둘 다에 대해 관찰되었다. 우수한 1:1 모델 피트가 또한 시험된 4가지 농도에 걸쳐 관찰되었다. 도 16B-16C에 나타낸 바와 같이, 옥테트 포맷의 증가된 감수성은 N297A 돌연변이가 FcRn에 대한 Ab9의 결합을 유의하게 변경시키지 않는다는 것을 명백하게 입증하였다. Ab9 및 WT에 대한 계산된 KD 값은 각각 0.086 nM 및 0.13 nM이었다.
실시예 13 - 항-CD161 항체, Ab9는 CLEC2D-매개 억제를 역전시키고, NK 세포 탈과립화 및 IFN-γ 생산을 회복시킴
본 실시예는 NK 세포 상의 CD161과 표적 세포 상의 CLEC2D의 상호작용을 차단함으로써 NK 세포 사멸의 억제를 역전시키는 항-CD161 항체, Ab9의 능력을 평가한다. 간략하게, 본 실시예는 NK 세포의 활성이 항-CD161 항체, Ab9의 존재 및 부재 하에 CLEC2D의 세포 표면 발현을 갖는 표적 세포 대 그의 표면 상에 CLEC2D를 갖지 않는 것에 대해 상이한지 여부를 결정하기 위해 수행하였다. CD107a를 NK 세포의 탈과립화의 마커로서 이용하고, IFN-γ의 분비를 NK 세포 활성화의 추가의 척도로서 검사하였다.
K562 탈과립화 검정
NK 세포를 인간 PBMC (RTD165 및 PBMC-030 (MCB-117))로부터 단리하고, NK 단리 키트를 사용하여 IL-2로 밤새 자극하였다. 검정 내에서 표현형 및 기능에 대해 단리된 CD56+ NK 세포 (이펙터)를 연구하기 위해 8-색상 유동 세포측정 항체 패널을 설계하였다. IL-2 자극된 NK 세포 (이펙터 세포)를 미리 규정된 플레이트 맵당 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다. 시험 물품 (Ab9 또는 이소형 대조군 (D1.3_hIgG1_N297A를 음성 대조군으로서 사용하였음))을 300 nM에서 출발하여 0.018 nM까지 4배 희석으로서 이펙터 세포에 첨가하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 표적 세포를 빛으로부터 보호된 실온에서 20분 동안 셀 트레이스 바이올렛 (CTV)과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 표적 세포를 HI-FBS와 함께 5분 동안 인큐베이션한 다음, 원심분리하였다. 적절한 표적 세포 (대조군 (K562-GFP 세포) 또는 CLEC2D+ (K562-CLEC2D))를 1:5의 최종 이펙터:표적 비로 이펙터 세포에 첨가하고, 37℃/5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고, FACS 완충제에 재현탁시켰다. 표현형결정 항체 (CD3-APC-Cy7, 라이브/데드(LIVE/DEAD)™ 고정성 근-IR, TCRγ δ-APC-Vio770, CD19-APC-Cy7, CD56-BB700, CD107a-PE, IFNγ-FITC)를 첨가하고, 잠시 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 고정/투과화 완충제 중에 20분 동안 재현탁시켰다. 세포를 다시 세척하고, FACS 완충제 중에 밤새 두었다. 다음날, 세포를 원심분리하고 세척하였다. 이어서 항-IFNγ 항체로 세포내 염색하였다. 세포를 원심분리하고, FACS 완충제를 재현탁시킨 후, 심포니 세포 분석기 (BD 바이오사이언시스) 상에서 분석하였다. % CD107+ 세포 및 % IFN-γ 세포를 측정하였다.
도 17A-17H에서 나타난 바와 같이, NK 세포를 항-CD161 항체 (Ab9)와 함께 사전-인큐베이션한 후 CLEC2D를 과다발현하는 K562 세포와 공동-배양한 경우에 CD107a 및 IFN-γ 둘 다의 발현이 증가하였다. CLEC2D가 표적 K562 세포 상에 존재하지 않았을 때 NK 세포에서의 CD107a 발현에 대한 Ab9 항체의 효과는 없었다 (도 17B 및 17F). 추가로, 이소형 대조군 항체의 존재 하에 어떠한 효과도 관찰되지 않았다. 공여자 RTD165로부터의 PBMC는 탈과립화 (도 17A) 및 IFNγ 검정 (도 17C)에서 용량 의존성 방식으로 반응하였다. EC50 값은 탈과립화에 대해 0.2 nM 및 IFNγ에 대해 0.3 nM이었다. 도 17E-17H에서 나타난 바와 같이, 인간 공여자 PBMC-030 (MCB117)으로부터의 IFN-γ의 탈과립화 (도 17E) 및 분비 (도 17F)는 용량 반응을 나타냈다. 탈과립화 및 IFNγ 곡선 둘 다에 대한 EC50은 0.3 nM이었다.
이러한 데이터는 CD161+ NK 세포와 CLEC2D-발현 표적 세포의 상호작용이 NK 세포의 활성화를 억제한다는 것을 시사한다. Ab9의 존재는 이소형 대조군 항체의 존재 하에 관찰되지 않은 효과인 IFN-γ의 발현 뿐만 아니라 NK 세포에 의한 세포독성 탈과립화를 회복시켰다. NK 세포 활성화의 회복은 CD161 활성을 직접 자극하는 것에 의해서가 아니라 CD161/CLEC2D 상호작용의 억제를 통해 발생한다.
실시예 14 - 인간 NK 세포는 항-CD161 항체의 존재 하에 CLEC2D 발현 표적 세포의 보다 높은 세포독성을 나타냄
본 실시예는 NK 세포 상의 CD161과 표적 세포 상의 CLEC2D의 상호작용을 차단함으로써 CLEC2D 발현 표적 세포의 NK 세포 사멸을 증진시키는 항-CD161 항체 (Ab9)의 능력을 평가한다.
NK 세포의 표면 상의 CD161과 그의 리간드인 CLEC2D의 상호작용은 NK 세포의 사멸 기능을 억제하는 것으로 이전에 밝혀졌고 (실시예 6 및 13 참조), 이는 항-CD161 항체를 사용하여 회복될 수 있다.
직접 사멸 검정
간략하게, NK 세포를 2명의 건강한 공여자의 동결된 인간 PBMC로부터 단리하고, IL-2로 밤새 자극하였다. 이어서, IL-2 자극된 NK 세포 (이펙터 세포)를 미리 규정된 플레이트 맵당 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다. 시험 물품 (Ab9 또는 이소형 대조군 (D1.3_hIgG1_N297A를 음성 대조군으로서 사용하였음))을 300 nM에서 출발하여 0.02 nM까지 4배 희석으로서 이펙터 세포에 첨가하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 버킷 림프종 세포주 Raji 세포 (높은 수준의 CLEC2D를 내인성으로 발현하는 표적 세포주, CLEC2D+ 표적 세포)를 빛으로부터 보호된 실온에서 20분 동안 셀 트레이스 바이올렛 (CTV)으로 염색하였다. CTV로 염색한 후, 표적 세포를 열 불활성화-FBS와 함께 5분 동안 인큐베이션한 다음, 원심분리하여 모든 미결합 CTV를 제거하였다. CLEC2D+ 표적 세포를 이펙터 세포에 1:1의 최종 이펙터:표적 비로 첨가하고, 37℃/5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고, FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 이어서 FVD-근 IR로 염색하였다. 다음 날, 세포를 원심분리하고, FACS 완충제 중에 재현탁시킨 후, CTV+ FVD+ 세포에 대해 게이팅함으로써 % 사멸 표적 세포에 대해 심포니™ 세포 분석기 (비디 바이오사이언시스) 상에서 분석하고, 플로우 조™ 상에서 분석하였다. %CTV+FVD+ 집단을 분석함으로써 NK 세포 매개 세포독성을 측정하였다. 도 18A (공여자 #1) 및 18B (공여자 #2)에서 나타난 바와 같이, Ab9는 NK 세포 매개 세포독성의 용량 의존성 증가를 나타내고, 이때 0.01 nM의 Ab9는 어떠한 효능도 나타내지 않고, NK 세포 기능을 강화하는 데 있어서 분자의 높은 효력을 나타내는 두 공여자에 대해 세포독성 활성이 1 nM에서 포화된다.
Ab9 항-CD161 항체의 존재 하에, CD161과 CLEC2D 사이의 상호작용은 효율적으로 차단된다 (이전 실시예 13에 제시됨). 본 실시예는 차단 활성이 CD161을 발현하는 인간 NK 세포의 증진된 세포용해 기능으로 해석되어 내인성으로 높은 수준의 CLEC2D를 발현하는 표적 세포를 사멸시킨다는 것을 나타낸다. 효과는 0.3 nM만큼 낮은 Ab9의 농도에서 발생하였고, 활성의 포화는 1 nM에서 달성되었다.
실시예 15 - 항-CD161 항체의 존재 하에 항원성 펩티드 회상 검정에서 증진된 T 세포 활성화
본 실시예는 CLEC2D (단핵구-유래 DC 상에서 발현됨)와의 CD161 (T 세포 상에서 발현됨) 상호작용을 차단함으로써 항원 특이적 이펙터 기억 CD4 T 세포의 재활성화를 증진시킬 수 있는 항-CD161 항체, Ab9의 능력을 평가한다.
이전에 실시예 7 및 8에 나타낸 바와 같이, 항-CD161 항체는 관련 항원을 디스플레이하는 표적 세포 상에 발현된 CLEC2D와 CD161의 상호작용을 차단함으로써 조작된 Jurkat T 세포주에서 항원-매개 T 세포 수용체 신호전달을 증가시킬 수 있다. 본 실시예는 항-CD161 항체 (Ab9) 처리가 인간 PBMC로부터 확장된 1차 인간 T 세포의 이펙터 기억 하위세트의 재활성화를 증진시키는지 여부를 시험한다.
다양한 병원체로부터의 감염은 항원성 펩티드-특이적 이펙터 T 세포의 활성화 및 확장을 유발한다. 이들 펩티드에 대한 기억 T 세포는 감염원이 제거된 후 오랫동안 순환계 중에 남아있다. 인간 말초 혈액으로부터의 펩티드 반응성 기억 T 세포는 항원 특이적 기억 T 세포 회상 반응으로 지칭되는 HLA-결합된 항원성 펩티드로의 제시 후에 재활성화 및 확장될 수 있다. 펩티드 풀은 단일 공여자로부터 다중 T 세포 전구체를 확장시키는 데 사용될 수 있다. 회상 검정은 이들 전구체 빈도를 추가로 확장시킬 수 있고, PD-1 및 TIGIT를 비롯한 면역 체크포인트 분자를 상향조절하는 것으로 밝혀졌다. 이전의 연구는 이펙터 기억 CD4 및 CD8 T 세포의 하위세트가 CD161을 발현한다는 것을 보여주었다 (문헌 [Truong et al. (2019) Nature Comm., 10:2263] 참조). 본 실시예는 Ab9 처리가 항원-특이적 이펙터 기억 T (EM) 세포에 의한 증진된 시토카인 생산 및 증가된 증식 (Ki-67 발현에 의해 측정된 바와 같음)을 유도한다는 것을 나타낸다.
항원-기반 T 세포 기억 회상 검정
간략하게, CD14+ 단핵구를 밀테니의 전형적 단핵구 단리 키트를 사용하여 음성 선택에 의해 공여자로부터 단리하였다. 100 ng/ml GMCSF 및 20 ng/ml IL-4가 보충된 DC 분화 배지에서 정제된 CD14+ 단핵구를 배양함으로써 단핵구를 수지상 세포로 분화시켰다 (MoDC). 공여자 D10637 (헤마케어)로부터의 정제된 CD14+ 단핵구 (공여자 6으로 불림)를 100 ng/ml GMCSF 및 20 ng/ml IL-4의 존재 하에 12 웰 플레이트에서 웰당 1 x 106 세포로 1 ml의 배지에 플레이팅하였다. 400 μl의 배지를 제거하고, 격일로 (제2일, 제4일 및 제6일) 폐기하고, 시토카인으로 보충된 500 μl의 새로운 배지로 대체하였다. 제6일에, MoDC를 1 μg/ml LPS 및 100 ng/ml IFNγ로 48시간 동안 자극하여 CD161 리간드인 CLEC2D의 발현을 유도하였다 (문헌 [Germain et al. (2011) j. biol. chem., 286(44):37964-37975] 참조). 자가 T 세포를 PBMC를 1 μg/ml CEFX 펩티드 (JPT, cat. PM-CEFX-2)로 보충된 완전 배지에서 24시간 동안 배양함으로써 PBMC로부터 확장시켰다. PBMC를 완전 배지에서 2x 세척함으로써 미결합 펩티드를 제거하였다. 이어서, 세포를 추가의 48시간 동안 6 웰 플레이트의 1개의 웰에서 완전 배지 4 ml 중에 플레이팅하였다. 제3일에, PBMC를 세척하고 계수하였다. 세포를 2.5 ng/ml IL-2, 5 ng/ml IL-7, 및 5 ng/ml IL-15로 보충된 완전 배지 중에 7.5 x 105/ml로 플레이팅하였다. 배지를 제5일에 시토카인이 보충된 완전 배지에서 교환하였다. T 세포 배양물은 1.5 x 106/ml의 밀도를 초과하지 않았다. 제7일에, MoDC를 37℃에서 2시간 동안 CEFX 펩티드 (10 ng/ml)에 노출시켰다. 이어서, CEFX 펩티드 상에서 확장된 자가 T 세포를 96 웰 플레이트에 항체 없이 또는 0.02 nM 내지 100 nM 범위의 농도의 이소형 대조군 항체 (D1.3 이소형 대조군 인간 IgG1 (N297A) 또는 항-CD161 항체 (Ab9)와 함께 1 x 105 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 펩티드 펄스된 MoDC를 PBS로 2회 세척한 다음, 완전 배지 중에 재현탁시키고, 자가 T 세포를 갖는 웰에 0.5 x 105 MoDC/웰의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 공동-배양하였다. 세포를 배양의 최종 6시간 동안 브레펠딘 A에 노출시켜 시토카인 (IFNγ)의 세포내 염색 및 Ki-67 발현을 가능하게 하였다. 세포를 웰로부터 수거하고, Fc-수용체를 차단한 후, 유동 세포측정법을 위해 하기 항체 패널로 표면 염색하였다:
세포를 세척한 다음, 고정시키고 투과화하였다 (시토픽스/시토펌 키트).
ㆍ 근 IR (라이브/데드 염색);
ㆍ APC-CD8 (클론 HIT8a);
ㆍ BV605-CD4 (클론 RPA-74);
ㆍ BV711-CD45RO (클론 UCHL1); 및
ㆍ BV421-CD161 (클론 HP-3G10)
세포를 세척한 다음, 제조업체의 권장에 따라 고정 및 투과화하였다 (시토픽스/시토펌 키트, Cat # BD 554714). 세포내 염색을 하기 항체로 수행하였다: 알렉사-488 Ki67 (클론 Ki-67) 및 PE-IFNγ (클론 B27). 세포를 FACS 염색 완충제 (PBS + 1% FCS) 중에서 3X 세척하고, 심포니™ 세포 분석기 (BD 바이오사이언시스) 상에서 분석하였다. 데이터를 플로우 조™ 상에서 분석하고, 그래프패드 프리즘™을 사용하여 플롯팅하였다. 통계는 그래프패드 프리즘을 사용하여 수행하였다. P-값은 스튜던트 t-검정을 사용하여 복제 데이터세트로부터 분석하였다.
기억 회상 검정에서 항-CD161 항체 (Ab9)의 효과를 조사하기 위해, CMV에 대해 혈청반응양성이었고 CEFX 펩티드 자극에 반응하기 위해 이전에 시험된 공여자로부터의 PBMC를 이용하였다. 수지상 세포로 분화된 단핵구 (MoDc)를 활성화시켜 CLEC2D의 발현을 증가시켰다. 동시에, 자가 T 세포를 활성화시키고, CEFX 펩티드 상에서 7일 동안 확장시켰다. 활성화 후, MoDC를 10 ng/ml의 CEFX 펩티드로 펄싱하고, 이전에 CEFX 펩티드 상에서 확장된 자가 T 세포와 함께 Ab9 또는 이소형 대조군의 존재 또는 임의의 항체 처리의 부재 하에 24시간 동안 공동-배양하였다. 공동-배양 후에 T 세포 마커에 대한 유동 세포측정 염색, 기억 T 세포에 대한 CD45RO, 비-교차-반응성 항체 클론을 사용한 CD161 및 IFNγ 및 Ki67에 대한 세포내 염색을 수행하였다. CD161을 발현하는 CD45RO+ EM CD4 T 세포는 CLEC2D 발현 MoDC의 존재 하에 CD161을 발현하지 않는 CD4 EM 세포보다 더 낮은 IFNγ 생산 및 더 낮은 증식 (Ki67 발현에 의해 측정된 바와 같음)을 가졌으며, 이는 CD161이 T 세포 활성화의 음성 조절인자임을 시사한다. 그러나, 도 19A-19B에 나타낸 바와 같이, Ab9가 CLEC2D와의 CD161 상호작용을 차단하는 데 사용된 경우, 시토카인 생산 및 증식 둘 다는 이소형 대조군과 비교하여 유의하게 증가되었다. 또한, Ab9로의 처리는 CD161+ T 세포에서 나타난 시토카인 및 증식 반응을 CD161을 발현하지 않는 T 세포와 유사한 수준으로 증가시켰으며 (도 19A-19B; CD161 Pos, 대 CD161 neg), 이는 Ab9가 moDC 상의 CLEC2D의 존재에 의해 억제된 CD161+ 세포의 활성을 회복시킨다는 것을 시사한다.
실시예 16 - 항-CD161 항체 (Ab9)는 항원-특이적 인간 CD8+ T 세포의 시토카인 생산을 증진시킴
본 실시예는 T 세포 상의 CD161과 표적 세포 상에 발현된 CLEC2D의 상호작용의 차단을 통해 Raji 표적 세포와의 공동-배양에서 MART-1-특이적 T 세포의 시토카인 생산을 증진시키는 항 CD161 항체 (Ab)의 능력을 평가한다.
종양 미세환경 내의 T 세포로부터의 시토카인의 생산은 항종양 면역에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 종양-침윤 T 세포는 그의 각각의 리간드에 결합 시 T 세포 이펙터 기능을 억제하는 기능을 하는 억제 분자를 발현할 수 있다. T 세포 상의 CD161과 그의 리간드인 CLEC2D 사이의 상호작용은 이전 연구에서 T 세포 시토카인 생산을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Mathewson et al. (2021) Cell, 184(5), 1281-1298] 참조). 항 CD161 항체 (Ab9)는 CLEC2D 발현 표적 세포의 존재 하에 Jurkat T 세포에 의한 IL-2 생산을 회복할 수 있다. 본 실시예는 Ab9가 CD161-발현 1차 인간 T 세포 및 CLEC2D-발현 버킷 림프종 표적 세포주 (Raji)와의 시험관내 공동-배양 동안 이러한 억제 효과를 역전시킨다는 것을 나타낸다. 공동-배양 동안 Ab9의 투여는 CD8+ T 세포로부터 인터페론 감마 (IFNγ), 인터류킨-2 (IL-2) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)의 생산을 농도-의존성 방식으로 유의하게 증진시켰다.
MART-1 항원 특이적 T 세포 시토카인 검정
본 검정에 사용된 T 세포는 T 세포-1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MART-1)으로 불리는 항원에 특이적이었다. 이 항원은 정상 멜라닌세포 상에서 발현되고, 악성 흑색종 샘플 상에서 고도로 발현되어 종양 연관 항원 (TAA)으로서 거동한다. MART-1의 항원성 펩티드 (ELAGIGILTV)는 MHC 부류 I의 HLA-A2 하위유형의 맥락에서 제시된다. 건강한 개체는 시험관내 확장 및 재활성화 시 강력한 항종양 용해 활성을 나타낼 수 있는 높은 빈도의 순환 MART-1 T 세포를 갖는다. 실험은 이펙터로서 MART-1 특이적 CD8+ T 세포 및 표적 세포로서 펩티드-로딩된 HLA-A2+ 종양 세포주를 사용하는 항원 특이적 인간 T 세포 기능적 검정을 개발하기 위해 이를 활용하였다. 이펙터 세포를 초기에 생성하기 위해, MART-1 T 세포를 프라이밍하고, 활성화시키고, MART-1 펩티드로 펄스된 자가 항원-제시 세포의 존재 하에 확장시켰다. 확장 후, 이들 항원 특이적 T 세포를 세포 분류에 의해 풍부화시키고, 후속적으로 MART-1 펩티드로 펩티드 펄스된 표적 세포와의 공동-배양을 통해 재활성화시켰다. 재활성화 시, T 세포 시토카인 반응을 평가하였다.
간략하게, MART-1 항원을 인식하는 인간 CD8+ T 세포를 대략 3주의 과정에 걸쳐 PBMC로부터 확장 및 분류하였다. 재활성화 48시간 전에, MART-1-특이적 T 세포를 세포 분류 (BD 멜로디(BD Melody)™)에 의해 그의 CD161 발현에 대해 풍부화하였다. Ab9 및 상응하는 이소형 대조군 항체를 96-웰 폴리프로필렌 플레이트의 제1 칼럼에서 200 μL의 T 세포 배지 중에 400 nM (4x 최종 농도)로 희석하였다. 20 μL를 180 μL T 세포 배지 내로 옮김으로써 항체를 플레이트에 걸쳐 10배 연속 희석하였다. MART-1-특이적 T 세포를 항체 (Ab9 또는 동위원소 대조군)와 함께 30분 동안 사전-인큐베이션한 다음, MART-1 펩티드-로딩된 또는 비-펩티드 Raji 세포와 밤새 (대략 20시간) 공동-배양하였다. 제조업체의 지침 (메소 스케일 다이아그노스틱스(Meso Scale Diagnostics) 또는 MSD, U-PLEX 면역-종양학 그룹 1 (Cat# K151AEL2))에 따라 시토카인 (그랜자임 (Granzyme) B, IFNγ, IL-2 및 TNFα) 분비 분석을 위해 각각의 샘플로부터의 상청액의 절반을 수거하였다. 브레펠딘 A를 공동-배양물에 첨가한 후, IFNγ 발현의 세포내 검출을 위해 추가로 6시간 인큐베이션하였다. 공동-배양물을 V-바닥 검정 플레이트로 옮기고, 1:1000 NEAR-IR 라이브/데드 염색, 1:20 항-인간 CD8a APC, 1:20 항-인간 CD161 BV421, 및 1:20 항-인간 CD19 PE를 함유하는 표면 염색 마스터 믹스 (FACS 완충제 중에 희석됨)로 염색하였다. 30분 인큐베이션 후에, 세포를 고정 완충제와 함께 30분 동안 인큐베이션함으로써 고정시켰다. 플레이트를 FACS 완충제 중에 재현탁시킨 다음, 호일로 덮고, 4℃에서 밤새 두었다. 플레이트를 회전시키고, 상청액을 제거하고, 공동-배양물을 1X 투과화 완충제 (초순수 중에 1:10 희석된 10X 스톡 투과화 완충제)로 세척하였다. 이 단계를 1회 더 반복하였다. 이어서, 공동-배양물을 (1x 투과 완충제 중에 희석된) 1:20 항-인간 IFNγ FITC를 함유하는 세포내 염색 마스터 믹스와 함께 인큐베이션하였다. 공동-배양물을 다시 회전시키고, 1x 투과화 완충제로 세척하고, FACS 완충제 중에 재현탁시키고, FACS 심포니™ 상에서 분석하였다. 이어서, 데이터를 플로우 조™ 상에서 분석하고, 이어서 그래프패드™ 프리즘 상에서 그래프화 및 통계적 분석하였다.
시토카인 생산을 도출하기 위해, MART-1-특이적 T 세포를 시험관내에서 23일 동안 확장시키고, 후속적으로 Ab9 또는 이소형 대조군의 존재 하에 펩티드-로딩된 Raji 표적 세포와의 공동-배양을 통해 재활성화시켰다. Raji는 CD161에 대한 리간드인 CLEC2D를 내인성으로 발현하는 버킷 림프종 세포주이고, MART-1 펩티드의 외인성 로딩을 허용하기 위해 HLA-A0201을 과다발현하도록 조작되었다.
이소형 대조군과 비교하여, Ab9의 투여는 IFNγ 생산 T 세포의 빈도에서의 농도-의존성 증가를 일으켰다 (도 20A, EC50 = 1.429 nM 또는 0.2 μg/ml). Ab9는 또한 IFNγ 염색의 MFI의 농도-의존성 증가에 의해 명백한 바와 같이 시토카인 생산량을 증대시켰다 (도 20B, EC50 = 0.4363 nM 또는 0.06 μg/ml 및 EC90 8.931 nM 또는 1.29 μg/ml). Ab9를 함유하는 공동-배양물은 IL-2 (도 20C, EC50 = 0.3590 nM 또는 0.0521 μg/ml 및 EC90 = 3.231 nM 또는 0.4685 μg/ml) 및 TNFα (도 20D, EC50 = 0.1966 nM 또는 0.0285 μg/ml 및 EC90 = 1.769 nM 또는 0.2565 μg/ml)의 분비에서의 농도-의존성 증가를 또한 나타냈다. 그랜자임 B는 MSD를 통해 검출불가능한 반면에, 분비된 IFNγ 수준은 표준 곡선 범위를 초과하였다. 시토카인 판독의 요약을 표 19에 제공한다.
표 19: MART-1 항원 특이적 T 세포 시토카인 검정으로부터의 시토카인 판독의 요약.
Figure pct00029
MART-1 특이적 CD161+ CD8+ T 세포 및 CLEC2D-발현 Raji 표적 세포의 공동-배양물에 대한 Ab9의 투여는 T 세포 시토카인 생산을 유의하게 회복시켰다. 이는 IFNγ 양성 세포의 증대 및 IL-2 및 TNFα의 보다 높은 생산을 포함하였으며, 이는 Ab9의 존재 하에 CD161+ MART-1 T 세포의 증가된 다기능성을 시사한다 (표 19). 전반적으로, 이들 연구는 항종양 이익을 제공하는 데 있어서 항체-매개 CD161 차단의 잠재력을 입증한다.
실시예 17 - Ab9에 의한 CD161-CLEC2D 상호작용의 차단은 1차 항원-특이적 인간 MART-1 T 세포의 항종양 세포독성의 회복을 일으킴
본 실시예는 T 세포 상의 CD161과 표적 세포 상에 발현된 CLEC2D의 상호작용의 차단을 통해 Raji 표적 세포와의 공동-배양에서 MART-1-특이적 T 세포의 세포독성 기능을 증진시키는 항 CD161 항체 (Ab9)의 능력을 평가한다.
실시예 13 및 14에 나타낸 바와 같이, 항 CD161 항체 (Ab9)는 인간 NK 세포 탈과립화 및 세포용해 기능을 회복시킬 수 있다. 본 실시예는 Ab9가 CD161-발현 1차 인간 T 세포 및 CLEC2D-발현 버킷 림프종 표적 세포주 (Raji)와의 시험관내 공동-배양 동안 이러한 억제 효과를 역전시킨다는 것을 나타낸다. 공동-배양 동안 Ab9의 투여는 CD8+ T 세포로부터 세포 사멸-유도된 세린 프로테아제, 그랜자임 B의 생산을 농도-의존성 방식으로 유의하게 증진시켰고, 그의 세포독성 기능을 상승시켰다.
MART-1 항원-특이적 T 세포 세포독성 검정
실시예 16과 유사하게, 본 검정에 이용된 T 세포는 MART-1에 특이적이었다. 이펙터 세포를 초기에 생성하기 위해, MART-1 T 세포를 프라이밍하고, 활성화시키고, MART-1 펩티드로 펄스된 자가 항원-제시 세포의 존재 하에 확장시킨다. 확장 후에, 이들 항원 특이적 T 세포는 세포 분류에 의해 풍부화되고, 후속적으로 MART-1 펩티드로 펩티드 펄스된 표적 세포와의 공동-배양을 통해 재활성화된다. 재활성화 시, 표적 세포의 T 세포 매개 사멸을 그의 세포용해 기능의 척도로서 평가하였다.
간략하게, MART-1 항원을 인식하는 인간 CD8+ T 세포를 대략 3주의 과정에 걸쳐 2명의 공여자로부터의 PBMC로부터 확장 및 분류하였다. 이어서, 재활성화 48시간 전에, MART-1-특이적 T 세포를 세포 분류 (BD 멜로디™)에 의해 그의 CD161 발현에 대해 풍부화하였다. Ab9 및 상응하는 이소형 대조군 항체를 96-웰 폴리프로필렌 플레이트의 제1 칼럼에서 200 μL의 T 세포 배지 중에 400 nM (4x 최종 농도)로 희석하였다. 20 μL를 180 μL T 세포 배지 내로 옮김으로써 항체를 플레이트에 걸쳐 10배 연속 희석하였다. MART-1-특이적 T 세포를 항체 (Ab9 또는 이소형 대조군)와 30분 동안 사전-인큐베이션한 다음, MART-1 펩티드-로딩된 또는 비-펩티드 Raji 세포와 밤새 (대략 20시간) 공동-배양하였다. 브레펠딘 A를 공동-배양물에 첨가한 후, 그랜자임 B 발현의 세포내 검출을 위해 추가로 6시간의 인큐베이션을 수행하였다. 공동-배양물을 V-바닥 검정 플레이트로 옮기고, 1:1000 NEAR-IR 라이브/데드 염색, 1:20 항-인간 CD8a APC, 1:20 항-인간 CD161 BV421, 및 1:20 항-인간 CD19 PE를 함유하는 표면 염색 마스터 믹스 (FACS 완충제 중에 희석됨)로 염색하였다. 항 CD19 항체를 사용하여 표적 세포주 Raji를 표지하고, 라이브/데드 염색은 사멸 세포에 의해 우선적으로 흡수된다. 이러한 염색 방법론은 유동 세포측정법에 의해 MART-1 T 세포와의 공동-배양 후에 살아있는 표적 세포 정량화를 가능하게 한다. 30분 인큐베이션 후에, 세포를 고정 완충제와 함께 30분 동안 인큐베이션함으로써 고정시켰다. 플레이트를 FACS 완충제 중에 재현탁시킨 다음, 호일로 덮고, 4℃에서 밤새 두었다. 플레이트를 회전시키고, 상청액을 제거하고, 공동-배양물을 1x 투과화 완충제 (초순수 중에 1:10 희석된 10X 스톡 투과화 완충제)로 세척하였다. 이 단계를 1회 더 반복하였다. 이어서, 공동-배양물을 30분 동안 1:50 항-인간 그랜자임 B BV510 (1x 투과화 완충제 중에 희석됨)을 함유하는 세포내 염색 마스터 믹스와 함께 인큐베이션하였다. 공동-배양물을 다시 회전시키고, 1x 투과화 완충제로 세척하고, FACS 완충제 중에 재현탁시키고, FACS 심포니™ 상에서 분석하였다. 이어서, 데이터를 플로우 조™ 상에서 분석하고, 이어서 그래프패드™ 프리즘 상에서 그래프화 및 통계적 분석하였다.
그랜자임 B 생산 및 T 세포 매개 표적 세포 사멸을 도출하기 위해, MART-1-특이적 T 세포를 시험관내에서 23일 동안 확장시키고, 후속적으로 Ab9 또는 이소형 대조군의 존재 하에 펩티드-로딩된 Raji 표적 세포와의 공동-배양을 통해 재활성화시켰다. 이소형 대조군과 비교하여, Ab9의 투여는 도 21A-21B에 나타낸 바와 같이 2명의 상이한 공여자로부터의 그랜자임 B 생산 T 세포의 빈도에서 농도-의존성 증가를 일으켰다. 이들 분석으로부터의 EC50 및 EC90 값을 표 20에 나타낸다.
게다가, 도 21C-21D에서 공동-배양물로부터의 살아있는 표적 세포의 회수의 유의한 감소에 의해 나타난 바와 같이, Ab9는 또한 이소형 대조군과 비교하여 MART-1 특이적 T 세포의 직접적 세포독성 기능을 증진시켰다. 1 nM에서의 세포독성 포화점이 공여자 둘 다에 대해 관찰되었으며, 이는 T 세포 매개 표적 세포 사멸을 증진시키는 데 있어서 항체의 높은 효력을 나타낸다.
표 20: 그랜자임 B 판독의 요약
Figure pct00030
MART-1 특이적 CD161+ CD8+ T 세포 및 CLEC2D-발현 Raji 표적 세포의 공동-배양물에 대한 Ab9의 투여는 T 세포 이펙터 기능을 유의하게 회복시켰다. 이는 그랜자임 B 양성 세포의 증대 및 Ab9의 존재 하의 CD161+ MART-1 T 세포의 직접적 T 세포-매개 세포독성의 증거를 포함하였으며, 이는 표적 세포 생존의 유의한 감소를 유발하였다. 전반적으로, 이들 연구는 T 세포 세포독성을 회복시킴으로써 항종양 이익을 제공하는 데 있어서 CD161-CLEC2D 상호작용의 항 CD161-매개 차단의 잠재력을 입증한다.
실시예 18 - 건강한 공여자로부터의 인간 PBMC에서의 고정화된 또는 가용성 항-CD161 항체 (Ab9)에 의한 시토카인 방출의 평가
본 실시예는 2가지 상이한 검정 포맷: 플레이트 결합된 및 가용성 형태의 항체를 사용하여 6명의 건강한 공여자로부터의 PBMC에서 시토카인 방출을 유도하는 Ab9의 잠재력을 평가한다. 항-CD20 리툭시맙 (항-CD20 B-세포 고갈성 항체이고 암 환자의 하위세트에서 시토카인 폭풍을 자극하는 것으로 공지됨) 및 항-CD3 무로모납 (공지된 CRS 유도제)을 그의 상응하는 이소형 대조군과 함께 대조군으로서 사용하였다. 평가된 염증유발 시토카인은 IL-2, IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ를 포함하였다.
시토카인 방출 증후군 (CRS; 또는 시토카인 폭풍)은 특정 치료 항체의 사용과 연관된 드문 잠재적 부작용이고, 이환율 및 사망률을 유발할 수 있다. 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하는 시험관내 시토카인 방출 검정은 환자에서 시토카인 폭풍을 예측하는 데 유용한 평가인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Vessillier et al. (2015) J. Immunol. Methods, 424, 43-52] 참조). 주요 마커는 IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-10을 포함한다.
시토카인 방출 검정
플레이트 결합 포맷의 경우, 시험 물품 항체 (Ab9, 이소형 대조군 D1.3과 N297A, 리툭시맙, 무로모납, 항 CD3에 대한 마우스 IgG2A 이소형 대조군 ("이소형 대조군 항체"), 및 D1.3 IgG1 WT 이소형 대조군)를 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰 내로 연속 희석하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 무로모납 및 리툭시맙을 1 μg/웰로 플레이팅하고, 이소형 대조군 항체를 20 μg/웰로 플레이팅하였다. 2시간 후, 항체를 1X PBS로 2회 세척하여 임의의 미결합 항체를 제거하였다.
10 mL 빙냉 FACS 완충제를 각각의 PBMC 공여자#로 표지된 6-50 mL 원추형 튜브에 첨가하여 해동된 PBMC 세척을 준비하였다. 동결된 PBMC를 부분적으로 해동될 때까지 37℃ 수조에 둔 다음, FACS 완충제가 준비된 적절한 튜브에 첨가하였다. PBMC를 자동화 세포 계수기를 사용하여 계수하고, 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. PBMC를 재현탁시키고, 항체-코팅된 마이크로타이터 플레이트에 웰당 200 μL 중 2 x 105 세포로 플레이팅한 다음, 48시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다.
가용성 포맷의 경우, 연속 희석된 항체를 웰당 200 μL 중 2 x 105 세포로 PBMC와 혼합된 각각의 웰에 첨가한 다음, 48시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 무로모납 및 리툭시맙을 5 μg/ml의 최종 농도로 첨가하고, 이소형 대조군 항체 (N297A를 갖는 이소형 대조군 D1.3)를 100 μg/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 48시간 후, 상청액을 원심분리에 의해 수집하고, 메소 섹터 S600 기기 (메소 스케일 다이아그노스틱스, 메릴랜드주 록빌) 상에서 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다. MSD 검정을 제조업체의 지침에 따라 수행하였다 (시토카인 분석을 위한 MSD 키트: U-PLEX 바이오마커 그룹 1 (hu) 검정 (K15067L-2)). 이 키트는 U-PLEX 포맷으로 인간 IFN-γ, IL1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A 및 TNF-α를 검출하기 위한 시약을 포함한다. 데이터 분석을 MSD로부터의 디스커버리 워크벤치(Discovery Workbench) 소프트웨어 상에서 수행한 후, 그래프패드™ 프리즘 상에서 그래프화 및 통계적 분석을 수행하였다.
도 22A-22F 및 도 23A-23F는 각각 플레이트 결합 포맷 및 가용성 포맷을 사용한 Ab9의 존재 하의 시토카인 방출을 나타낸다. Ab9를 0.01 μg/ml 내지 1000 μg/ml의 농도 범위에 대해 시험하고, 이소형 대조군 (N297A를 갖는 이소형 대조군 D1.3)을 100 μg/ml에서 시험하였다. 무로모납 및 리툭시맙 및 그의 상응하는 이소형 대조군을 5 μg/ml의 농도에서 시험하였으며, 이는 시험관내에서 시토카인 방출을 유도하는 것으로 보고되었다. 각각의 이소형 대조군으로부터의 데이터는 이들이 이소형 대조군 (N297A를 갖는 이소형 대조군 D1.3)과 매우 유사하고 많은 지점이 정량 하한치 (LLOQ) 미만이었기 때문에 플롯 상에 제시되지 않는다.
도 22A-22F 및 도 23A-23F에 나타낸 바와 같이, PBMC의 무로모납으로의 처리는 시험된 모든 시토카인의 방출을 유의하게 자극하였다. 그러나, PBMC를 Ab9와 함께 고체 및 수성 상 포맷 둘 다로 인큐베이션한 경우에 시토카인 생산의 유의한 증가는 관찰되지 않았다. 게다가, 리툭시맙으로의 처리는 가용성 포맷의 리툭시맙의 존재 하에 시토카인의 높은 발현을 나타낸 단일 공여자를 제외하고는 두 포맷 모두에서 시토카인 방출을 유도하지 않았다 (도 23A-23F). 항-CD161 항체 (Ab9) 또는 이소형 대조군 (N297A를 갖는 이소형 대조군 D1.3)을 사용한 비자극 PBMC의 처리는 플레이트 결합 및 가용성 포맷 둘 다에서 시토카인 방출을 도출하지 않았다. Ab9의 존재 하에 더 높은 시토카인 생산을 나타낸 IL-6 플롯 (도 23F)에서의 단일 지점이 관찰되었고, 이는 농도-기반 반응이 아니라 단일 공여자에 기인하였다. IL-17A 및 IL-4의 생산을 또한 Ab9 처리에 대해 측정하였지만, 대부분의 값은 LLOQ 미만이었다 (데이터는 제시되지 않음). 이러한 데이터는 Ab9로 치료된 환자에서 시토카인 방출의 위험이 낮다는 것을 시사한다.
실시예 19 - Ab9의 약동학 (PK) 및 독성학 평가
본 실시예는 Ab9의 PK 및 독성학 평가를 예시한다. 시노몰구스 원숭이에서 수행된 비-GLP 용량-범위 발견 (DRF) 연구 (각각 10 mg/kg 및 100 mg/kg으로 매주 1회 3회 용량의 Ab9) 및 4-주 GLP 반복-용량 독성학 연구 (각각 10 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg으로 매주 1회 5회 용량의 Ab9)에서 Ab9의 독성동태학 (TK)을 평가하였다.
비-GLP DRF 독성학 연구
시노몰구스 원숭이에서 비-말단, 비-GLP, DRF 연구를 수행하여 암컷 시노몰구스 원숭이 (3마리 암컷/군)에서 용량당 10 mg/kg 및 100 mg/kg으로 매주 1회씩 총 3회 (제1일, 제8일 및 제15일) 정맥내 (IV) 느린 볼루스 주사 후에 Ab9의 내약성 및 PK를 평가하였다.
표 22: 비-GLP DRF 독성학 연구의 연구 설계.
Figure pct00031
Ab9 노출의 결정을 위해 모든 동물의 말초 정맥으로부터 대략 1 mL의 전혈 샘플을 수집하였다. 샘플을 하기 표적 시점에 수집하였다:
ㆍ 제1일 투여전, 투여후 1시간, 24시간 및 96시간;
ㆍ 제8일 투여전 및 투여후 1시간; 및
ㆍ 제15일 투여전, 투여후 1시간, 24시간, 96시간, 168시간, 336시간, 528시간, 672시간, 840시간 및 1008시간.
혈액 샘플로부터의 혈청 중 Ab9의 정량화를 검증된 생물분석 방법 (효소-연결 면역흡착 검정)을 사용하여 수행하였다.
IV 느린 볼루스 투여와 일치하는 피닉스® 윈논린(WinNonlin)® 버전 8.0을 사용하는 비-구획 접근법을 TK 파라미터 추정에 사용하였다. 개별 Ab9 혈청 농도 및 공칭 시간으로부터 TK 파라미터를 생성하였다. LLOQ 미만의 개별 농도를 TK 데이터 분석에서 0으로 처리하였다.
각각의 용량 군에 대한 평균 Ab9 혈청 농도 대 시간 프로파일의 플롯이 세미로그 스케일을 사용하여 도 24에서 제시된다. 총 3회 용량에 대한 용량 당 10 mg/kg 및 100 mg/kg의 용량으로의 Ab9의 매주 IV 느린 볼루스 (2-3분에 걸침) 투여 후에, 암컷 원숭이를 조사된 Ab9 용량 수준 둘 다에서 6마리 동물 중 4마리에 대해 1,008시간까지 0.625 μg/mL 초과의 농도 (LLOQ)로 Ab9에 전신 노출시켰다. 관찰된 최대 농도 (Tmax)의 시간은 단일 또는 다중 매주 용량 투여 1시간 후에 관찰되었다. 단일 또는 다중 매주 투여 후에 평가된 10배 용량 범위에 걸쳐 Ab9에 대한 노출 (최대 관찰 농도 (Cmax) 및 혈장 농도 시간 곡선하 면적 (AUC))의 대략적인 용량-비례 증가가 있었다. 축적 비는 0.53 내지 1.77 범위였다.
4-주 회복 기간을 갖는 Ab9의 4-주 IV GLP 독성 및 TK 연구
시노몰구스 원숭이에서의 4-주 GLP 연구를 수행하여, 매주 1회씩 5회 (제1일, 제8일, 제15일, 제22일, 및 제29일) IV 느린 볼루스 주사, 이어서 4-주 회복 기간 후에 Ab9의 잠재적 독성 및 TK 프로파일을 평가하였다. 동물에게 Ab9를 용량당 10 mg/kg, 30 mg/kg, 또는 100 mg/kg의 용량으로 또는 비히클 단독으로 투여하였다.
표 23: GLP DRF 독성학 연구의 연구 설계
Figure pct00032
Ab9 노출의 결정을 위해 모든 동물의 말초 정맥으로부터 대략 1 mL의 전혈 샘플을 수집하였다. 샘플을 하기 표적 시점에 수집하였다:
ㆍ 제1일 투여전, 투여후 1시간, 24시간 및 96시간;
ㆍ 제8일 투여전;
ㆍ 제22일 투여전, 투여후 1시간, 24시간 및 96시간; 및
ㆍ 제29일 투여전, 모든 동물로부터 투여후 1시간 및 24시간; 및 모든 회복 동물로부터 투여후 96시간, 168시간, 336시간, 504시간 및 672시간
검증된 전기화학발광 검정을 사용하여 Ab9의 혈청 농도를 측정하였다. 투여 경로와 일치하는 IV 볼루스 모델을 사용하는 피닉스® 윈논린® 버전 8.3.4를 사용하는 비-구획 접근법을 TK 파라미터 추정에 사용하였다. TK 파라미터를 개별 Ab9 혈청 농도 및 공칭 시간으로부터 제1, 22, 및 29일에 생성하였다. LLOQ 미만의 개별 농도를 TK 데이터 분석에서 0으로 처리하였다. TK 파라미터 결정을 위해, 제8일 투여전을 투여후 168시간으로서 제1일 데이터와 함께 사용하고, 제29일 투여전을 투여후 168시간으로서 제22일 데이터와 함께 사용하였다. 각각의 연구일 사이의 TK 결과를 보다 잘 비교하기 위해, 투여후 시간 0에서 시간 24시간까지의 혈장 농도-시간 곡선하 면적 (AUC0-24)을 모든 연구일에 대해 추정하였다.
평균 Ab9 혈청 농도 대 처리 및 성별에 따른 시간 프로파일의 플롯이 세미로그 척도를 사용하여 도 25A-25B에서 제시된다. 수컷 및 암컷 원숭이 사이에서 Ab9 노출의 주요 차이는 관찰되지 않았다. 평균 Tmax는 일반적으로 모든 처리군에 대해 투여 1시간 후에 관찰되었다. Ab9에 대한 노출 (Cmax 및 AUC)은 1회의 단일 IV 용량 후 (제1일) 또는 다중 투여 후 (제22일 및 제29일)에 용량-비례 방식으로 Ab9 용량이 10 mg/kg에서 100 mg/kg으로 증가함에 따라 증가하였다. 평균 제거 반감기 (T½)는 투여후 142시간 내지 282시간의 범위였으며, 이는 mAb에 대한 예상된 PK 거동을 시사한다. 제22일 및 제29일에 축적 비는 모든 처리군에 대해 1.53 내지 2.34 범위였다.
전반적으로, 비-GLP DRF 연구 및 4-주 GLP 독성학 연구 둘 다에서의 Ab9의 PK 분석은 10 mg/kg에서 100 mg/kg으로 Ab9 용량이 증가함에 따라 노출 (Cmax 및 AUC)의 용량-비례 증가를 나타냈다. 평균 T½는 GLP 연구에 대해 투여후 142시간 내지 282시간의 범위였으며, 이는 mAb에 대한 예상된 PK 거동을 시사한다. 상기 나타낸 바와 같이, 투여 기간 전반에 걸쳐 10 mg/kg 및 100 mg/kg의 용량에서 포화 수용체 점유율의 증거에도 불구하고 100 mg/kg의 용량까지 안전성 약리학 소견은 없었다.
본원에 기재된 독성학 및 시험관내 기능적 활성 검정으로부터의 데이터를 사용하여, 21일마다 IV 투여되는 6 mg (60 kg 환자 체중을 기준으로 0.1 mg/kg)의 용량이 수용체 포화에서 의미있는 생물학적 효과를 제공할 수 있고, 그를 필요로 하는 대상체에 의해 잘 허용될 수 있는 것으로 고려된다.
<참조로 포함됨>
본원에 언급된 각각의 특허 및 과학 문헌의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
<등가물>
본 발명은 그의 취지 또는 본질적인 특징으로부터 벗어나지 않으면서 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 모든 측면에서 본원에 기재된 본 발명을 제한하기보다는 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범주는 상기 기재에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위에 의해 나타내어지고, 청구범위의 등가의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화는 그 안에 포괄되는 것으로 의도된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (125)

  1. 단리된 항-CD161 항체로서,
    경쇄 가변 영역; 및
    CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하며, 여기서:
    (a) CDR-H1 서열은 FX1FX2X3X4AMS (서열식별번호: 1)이고;
    (b) CDR-H2 서열은 AISX5X6GGX7TX8YADSVKG (서열식별번호: 2)이고;
    (c) CDR-H3 서열은 AKPLDSSX9WADFX10X11 (서열식별번호: 3)이고;
    여기서:
    X1은 T 또는 A이고;
    X2는 G, S, 또는 E이고;
    X3은 Q, T, P 또는 R이고;
    X4는 Y 또는 F이고;
    X5는 A 또는 G이고;
    X6은 A, V 또는 S이고;
    X7은 T 또는 S이고;
    X8은 K, A 또는 Y이고;
    X9는 Q, F 또는 L이고;
    X10은 D 또는 Q이고;
    X11은 L 또는 A인
    단리된 항-CD161 항체.
  2. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함하고, 여기서
    (d) CDR-L1 서열은 RASQX12IX13SWLA (서열식별번호: 4)이고;
    (e) CDR-L2 서열은 X14ASX15LQX16 (서열식별번호: 5)이고;
    (f) CDR-L3 서열은 QQX17X18X19LPIT (서열식별번호: 6)이고;
    여기서:
    X12는 G, D, 또는 T이고;
    X13은 D, S 또는 Y이고;
    X14는 A, Y, 또는 F이고;
    X15는 S, A, G 또는 F이고;
    X16은 D 또는 S이고;
    X17은 A, H 또는 Q이고;
    X18은 S, D, W 또는 L이고;
    X19는 V, D, Y 또는 K인
    단리된 항-CD161 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 8이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 9이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 10인
    단리된 항-CD161 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 12이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 13이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 14인
    단리된 항-CD161 항체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 16이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 17이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 18인
    단리된 항-CD161 항체.
  6. 제5항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 20이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 21이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 22인
    단리된 항-CD161 항체.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 24이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 25이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 26인
    단리된 항-CD161 항체.
  8. 제7항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 28이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 29이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 30인
    단리된 항-CD161 항체.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 32이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 33이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 34인
    단리된 항-CD161 항체.
  10. 제9항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 36이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 37이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 38인
    단리된 항-CD161 항체.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 40이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 41이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 42인
    단리된 항-CD161 항체.
  12. 제11항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 44이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 45이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 46인
    단리된 항-CD161 항체.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 48이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 49이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 50인
    단리된 항-CD161 항체.
  14. 제13항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 52이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 53이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 54인
    단리된 항-CD161 항체.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 56이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 57이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 58인
    단리된 항-CD161 항체.
  16. 제15항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 60이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 61이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 62인
    단리된 항-CD161 항체.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 64이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 65이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 66인
    단리된 항-CD161 항체.
  18. 제17항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 68이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 69이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 70인
    단리된 항-CD161 항체.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 72이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 73이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 74인
    단리된 항-CD161 항체.
  20. 제19항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 76이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 77이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 78인
    단리된 항-CD161 항체.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 80이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 81이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 82인
    단리된 항-CD161 항체.
  22. 제21항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 84이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 85이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 86인
    단리된 항-CD161 항체.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 88이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 89이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 90인
    단리된 항-CD161 항체.
  24. 제23항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 92이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 93이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 94인
    단리된 항-CD161 항체.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 아미노산 서열: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFX1FX2X3X4AMSWVRQAPGKGLEWVSAISX5X6GGX7TX8YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPLDSSX9WADFX10X11WGRGTLVTVSS (서열식별번호: 188)를 포함하고,
    여기서:
    X1은 T 또는 A이고;
    X2는 G, S, 또는 E이고;
    X3은 Q, T, P 또는 R이고;
    X4는 Y 또는 F이고;
    X5는 A 또는 G이고;
    X6은 A, V 또는 S이고;
    X7은 T 또는 S이고;
    X8은 K, A 또는 Y이고;
    X9는 Q, F 또는 L이고;
    X10은 D 또는 Q이고;
    X11은 L 또는 A인
    단리된 항-CD161 항체.
  26. 제25항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 아미노산 서열: DIQXaTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQX12IX13SWLAWYQQKPGKAPKXbLIYX14ASX15LQX16GVPSRFSGSGSGTDFTLTIXcSLQPEDFATYYCQQX17X18X19LPITFGGGTKVEIK (서열식별번호: 189)를 포함하고,
    여기서:
    X12는 G, D, 또는 T이고;
    X13은 D, S 또는 Y이고;
    X14는 A, Y, 또는 F이고;
    X15는 S, A, G 또는 F이고;
    X16은 D 또는 S이고;
    X17은 A, H 또는 Q이고;
    X18은 S, D, W 또는 L이고;
    X19는 V, D, Y 또는 K이고;
    Xa는 M 또는 L이고;
    Xb는 L 또는 F이고;
    Xc는 S 또는 N인
    단리된 항-CD161 항체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 79 및 서열식별번호: 87로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 83 및 서열식별번호: 91로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 7의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 15의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 19의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 7의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 23의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 27의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 31의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 35의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 39의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 43의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 47의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 51의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 55의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 59의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 63의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 67의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 71의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 75의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 79의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 83의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 87의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 91의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  41. 단리된 항-CD161 항체로서,
    경쇄 가변 영역; 및
    CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하며, 여기서:
    (a) CDR-H1 서열은 FTFX1X2YYMS (서열식별번호: 95)이고;
    (b) CDR-H2 서열은 YISPSGX3TIX4YADSVKG (서열식별번호: 96)이고;
    (c) CDR-H3 서열은 ARSLMX5TGTHLYFDL (서열식별번호: 97)이고;
    여기서:
    X1은 G, A, P 또는 S이고;
    X2는 N, Q 또는 D이고;
    X3은 A 또는 S이고;
    X4는 Y 또는 A이고;
    X5는 A 또는 S인
    단리된 항-CD161 항체.
  42. 제41항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함하고, 여기서
    (a) CDR-L1 서열은 RASX6X7ISX8WLA (서열식별번호: 98)이고;
    (b) CDR-L2 서열은 AAX9X10LQS(서열식별번호: 99)이고;
    (c) CDR-L3 서열은 QQX11TSX12X13PYT (서열식별번호: 100)이고;
    여기서:
    X6은 Q 또는 S이고;
    X7은 D 또는 G이고;
    X8은 D 또는 S이고;
    X9는 E 또는 S이고;
    X10은 S, A, G, V 또는 E이고;
    X11은 A, S, 또는 V이고;
    X12는 F, T, V, Q, 또는 A이고;
    X13은 L 또는 P인
    단리된 항-CD161 항체.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 102이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 103이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 104인
    단리된 항-CD161 항체.
  44. 제43항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 106이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 107이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 108인
    단리된 항-CD161 항체.
  45. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 110이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 111이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 112인
    단리된 항-CD161 항체.
  46. 제45항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 114이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 115이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 116인
    단리된 항-CD161 항체.
  47. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 118이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 119이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 120인
    단리된 항-CD161 항체.
  48. 제47항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 122이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 123이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 124인
    단리된 항-CD161 항체.
  49. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 126이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 127이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 128인
    단리된 항-CD161 항체.
  50. 제49항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 130이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 131이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 132인
    단리된 항-CD161 항체.
  51. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 134이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 135이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 136인
    단리된 항-CD161 항체.
  52. 제51항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 138이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 139이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 140인
    단리된 항-CD161 항체.
  53. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 142이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 143이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 144인
    단리된 항-CD161 항체.
  54. 제53항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 146이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 147이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 148인
    단리된 항-CD161 항체.
  55. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 150이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 151이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 152인
    단리된 항-CD161 항체.
  56. 제55항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 154이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 155이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 156인
    단리된 항-CD161 항체.
  57. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 158이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 159이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 160인
    단리된 항-CD161 항체.
  58. 제57항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 162이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 163이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 164인
    단리된 항-CD161 항체.
  59. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    (a) CDR-H1 서열이 서열식별번호: 166이고;
    (b) CDR-H2 서열이 서열식별번호: 167이고;
    (c) CDR-H3 서열이 서열식별번호: 168인
    단리된 항-CD161 항체.
  60. 제59항에 있어서,
    (d) CDR-L1 서열이 서열식별번호: 170이고;
    (e) CDR-L2 서열이 서열식별번호: 171이고;
    (f) CDR-L3 서열이 서열식별번호: 172인
    단리된 항-CD161 항체.
  61. 제41항 또는 제42항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 아미노산 서열: QVQLVESGGGLVXaPGGSLRLSCAASGFTFX1X2YYMSWIRQAPGKGLEWVSYISPSGX3TIX4YADSVKGRFTISRDNXbKNXcLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSLMX5TGTHLYFDLWGRGTLVTVSS (서열식별번호: 190)를 포함하고,
    여기서:
    X1은 G, A, P 또는 S이고;
    X2는 N, Q 또는 D이고;
    X3은 A 또는 S이고;
    X4는 Y 또는 A이고;
    X5는 A 또는 S이고;
    Xa는 K 또는 Q이고;
    Xb는 A 또는 S이고;
    Xc는 S 또는 T인
    단리된 항-CD161 항체.
  62. 제61항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 아미노산 서열: DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASX6X7ISX8WLAWYQQKPGKAPKLLIYAAX9X10LQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQX11TSX12X13PYTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 191)을 포함하고,
    여기서:
    X6은 Q 또는 S이고;
    X7은 D 또는 G이고;
    X8은 D 또는 S이고;
    X9는 E 또는 S이고;
    X10은 S, A, G, V 또는 E이고;
    X11은 A, S, 또는 V이고;
    X12는 F, T, V, Q, 또는 A이고;
    X13은 L 또는 P인
    단리된 항-CD161 항체.
  63. 제41항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 157 및 서열식별번호: 165로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  64. 제41항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 161 및 서열식별번호: 169로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  65. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 101의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 105의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  66. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 109의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 113의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  67. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 117의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 121의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  68. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 125의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 129의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  69. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 133의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 137의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  70. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 141의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 145의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  71. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 149의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 153의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  72. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 157의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 161의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  73. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 165의 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 169의 서열을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체인 단리된 항-CD161 항체.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 다중특이적인 단리된 항-CD161 항체.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fab, Fab', F(Ab')2, Fv, scFv, (scFv)2, 단일 쇄 항체 분자, 이중 가변 도메인 항체, 단일 가변 도메인 항체, 선형 항체 또는 V 도메인 항체인 단리된 항-CD161 항체.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 스캐폴드를 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  78. 제77항에 있어서, 스캐폴드가 Fc인 단리된 항-CD161 항체.
  79. 제78항에 있어서, 스캐폴드가 인간 Fc인 단리된 항-CD161 항체.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택된 부류의 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  81. 제80항에 있어서, 항체는 부류 IgG, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 하위부류의 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  82. 제74항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 비-글리코실화 인간 IgG1 항체인 단리된 항-CD161 항체.
  83. 제82항에 있어서, 모노클로날 항체가 EU 넘버링에 따른 아미노산 위치 N297에서 변형을 갖는 IgG1 Fc 영역을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  84. 제83항에 있어서, 돌연변이가 N297A인 단리된 항-CD161 항체.
  85. CD161에의 결합에 대해 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항의 항-CD161 항체와 경쟁하는 단리된 항체.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항의 항-CD161 항체에 의해 결합되는 CD161 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CD161에의 결합에 대해 CLEC2D와 경쟁하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  88. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CD161에의 CLEC2D의 결합으로 인한 CD161 억제 신호전달을 감소시키는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, CD161이 세포의 표면 상에서 발현되는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  90. 제89항에 있어서, 세포가 T 세포 또는 NK 세포인 단리된 항-CD161 항체.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 상기 세포가 인간 세포 또는 시노몰구스 세포인 단리된 항-CD161 항체.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 항체는 CD161에의 CLEC2D 결합에 의한 T 세포 또는 NK 세포 활성의 억제를 감소시키는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  93. 제90항 또는 제91항에 있어서, 항체는 CLEC2D의 존재 하의 T 세포 또는 NK 세포 활성을, 항체의 부재 하에서의 이러한 T 세포 또는 NK 세포 활성과 비교하여 증가시키는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  94. 제90항 또는 제91항에 있어서, T 세포 또는 NK 세포가 CLEC2D를 발현하는 세포를 포함하는 미세환경 내에 배치된 것인 단리된 항-CD161 항체.
  95. 제90항 또는 제91항에 있어서, 항체는 CLEC2D를 발현하는 종양 세포를 함유하는 종양 미세환경에서 T 세포 또는 NK 세포 활성을 증가시키는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  96. 제93항 또는 제95항에 있어서, 상기 T 세포 활성의 증가가 NFAT 신호전달의 증가에 의해 결정되는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  97. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 1.5 nM 내지 4.1 nM의 T 세포 활성화에 대한 EC50 값을 갖는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  98. 제93항 또는 제95항에 있어서, 상기 NK 세포 활성의 증가가 CD107a 발현의 증가에 의해 결정되는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  99. 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 0.04 nM 내지 0.38 nM의 NK 세포 활성화에 대한 EC50 값을 갖는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 옥테트 QK384 검정에 의해 측정 시 10 nM, 0.5 nM, 1 nM, 0.5 nM 또는 0.1 nM 이하의 Kd로 인간 CD161에 결합하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  101. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 옥테트 QK384 검정에 의해 측정 시 1e-8 내지 1e-10 M 범위의 Kd로 인간 CD161에 결합하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 5 nM 미만, 1 nM 미만 또는 0.5 nM 미만의 CD161 발현 HEK293 세포에 대한 EC50을 갖는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  103. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 0.1 - 0.5 nM 범위의 CD161 발현 HEK293 세포에 대한 EC50을 갖는 것인 단리된 항-CD161 항체 또는 항원 결합 단편.
  104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 세포의 표면 상에 발현된 CD161에의 CLEC2D 결합을 0.1 내지 10 nM 범위의 IC50으로 감소시키는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  105. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 세포의 표면 상에 발현된 CD161에의 CLEC2D 결합을 10 nM 미만, 5 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만 또는 0.5 nM 미만의 IC50으로 감소시키는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 hKLRF1, hKLRF2, hCLEC12B, hCLEC2D, 또는 그의 임의의 조합에 대해 1,000 nM 초과의 Kd를 갖는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는, 항체가 포화 항체 조건 하에 CD161에 결합되는 것과 비교하여 2% 미만, 1.5% 미만, 1.2% 미만, 1.1% 미만 또는 1% 미만의 CD161 상동체 집단에 결합하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  108. 제107항에 있어서, CD161 상동체 집단이 CLEC2D, KLRF1, KLRF2, CLEC12B 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  109. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 CD161 및 시노몰구스 CD161에 결합하며, 여기서 인간 CD161 및 시노몰구스 CD161에 대한 항체의 결합 친화도가 5x, 10x, 20x, 50x 또는 100x 이하만큼 달라지는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  110. 제1항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 CD161 및 시노몰구스 CD161에 결합하며, 여기서 인간 CD161 및 시노몰구스 CD161에 대한 항체의 결합력이 5x, 10x, 20x, 50x 또는 100x 이하만큼 달라지는 것인 단리된 항-CD161 항체.
  111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  112. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항의 항체, 그의 VH, 그의 VL, 그의 경쇄, 그의 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 폴리뉴클레오티드.
  113. 제112항의 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 복수의 벡터.
  114. 제112항의 폴리뉴클레오티드 또는 복수의 폴리뉴클레오티드, 또는 제113항의 복수의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  115. 항체를 제114항의 숙주 세포와 함께 발현시키고, 발현된 항체를 단리하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  116. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항의 항체 또는 제111항의 제약 조성물 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
  117. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항의 항-CD161 항체 또는 유효량의 제111항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  118. 제117항에 있어서, 암이 종양 미세환경에서 암 세포 또는 다른 세포에 의한 CLEC2D의 발현을 특징으로 하는 것인 방법.
  119. 제117항에 있어서, 암이 종양 미세환경에서 암 세포 또는 다른 세포에 의한 CLEC2D의 증가된 발현을 특징으로 하는 것인 방법.
  120. 제117항에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 신경교종, 결장직장암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  121. 종양 성장의 감소 또는 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항의 항-CD161 항체 또는 유효량의 제111항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장을 감소 또는 억제하는 방법.
  122. 인간 CD161과 CLEC2D 사이의 상호작용의 억제 또는 차단을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항의 항-CD161 항체 또는 유효량의 제111항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 인간 CD161과 CLEC2D 사이의 상호작용을 억제 또는 차단하는 방법.
  123. 면역 세포 활성화의 유도 또는 증진을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항의 항-CD161 항체 또는 유효량의 제111항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역 세포 활성화를 유도 또는 증진시키는 방법.
  124. 제123항에 있어서, 면역 세포 활성화가 종양 미세환경에서 일어나는 것인 방법.
  125. 제123항 또는 제124항에 있어서, 면역 세포가 T 세포 또는 NK 세포인 방법.
KR1020247009143A 2021-08-23 2022-08-23 항-cd161 항체 및 그의 용도 KR20240099138A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163236122P 2021-08-23 2021-08-23
US63/236,122 2021-08-23
PCT/US2022/075370 WO2023028501A1 (en) 2021-08-23 2022-08-23 Anti-cd161 antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240099138A true KR20240099138A (ko) 2024-06-28

Family

ID=83447883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247009143A KR20240099138A (ko) 2021-08-23 2022-08-23 항-cd161 항체 및 그의 용도

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4392451A1 (ko)
KR (1) KR20240099138A (ko)
CN (1) CN118284623A (ko)
AU (1) AU2022332285A1 (ko)
CA (1) CA3229448A1 (ko)
IL (1) IL310662A (ko)
WO (1) WO2023028501A1 (ko)

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
IL97459A0 (en) 1990-03-09 1992-06-21 Hybritech Inc Trifunctional antibody-like compounds as a combined diagnostic and therapeutic agent
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
NL9101953A (nl) 1991-11-21 1993-06-16 Seed Capital Investments Testinrichting omvattende een plaat met een veelvoud van putjes met een bijbehorende doseerinrichting, alsmede een kit die deze inrichtingen omvat en toepassing van de inrichtingen.
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
JP4157160B2 (ja) 1991-12-13 2008-09-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド 改変抗体可変領域の調製のための方法
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
ATE244763T1 (de) 1992-02-11 2003-07-15 Cell Genesys Inc Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US6066718A (en) 1992-09-25 2000-05-23 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5855887A (en) 1995-07-25 1999-01-05 The Regents Of The University Of California Blockade of lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US6051227A (en) 1995-07-25 2000-04-18 The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
JP2001523958A (ja) 1997-03-21 2001-11-27 ブライハム アンド ウィミンズ ホスピタル，インコーポレイテッド 免疫療法のｃｔｌａ−４結合ペプチド
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6872518B2 (en) 1997-09-22 2005-03-29 University Of Rochester Methods for selecting polynucleotides encoding T cell epitopes
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
EA006972B1 (ru) 1998-12-23 2006-06-30 Пфайзер Инк. Моноклональное антитело человека к ctla-4 и способы его применения
US6682736B1 (en) 1998-12-23 2004-01-27 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to CTLA-4
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1792991A1 (en) 1999-08-24 2007-06-06 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP1197755A1 (en) 2000-10-11 2002-04-17 Pepscan Systems B.V. Identification of protein binding sites
DK1355919T3 (da) 2000-12-12 2011-03-14 Medimmune Llc Molekyler med længere halveringstider, sammensætninger og anvendelser deraf
PT2316940E (pt) 2000-12-18 2013-10-16 Dyax Corp Bibliotecas orientadas de pacotes genéticos
EP2298809A3 (en) 2001-07-12 2012-02-15 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
CA2838062C (en) 2001-08-03 2015-12-22 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
ES2654064T3 (es) 2002-07-03 2024-03-13 Ono Pharmaceutical Co Composiciones inmunopotenciadoras que comprenden anticuerpos anti-PD-L1
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
ES2367430T3 (es) 2002-12-23 2011-11-03 Wyeth Llc Anticuerpos contra pd-1 y sus usos.
MXPA06001225A (es) 2003-08-04 2006-04-11 Bristol Myers Squibb Co Metodos de tratamiento de enfermedad cardiovascular usando una molecula soluble de ctla4.
ES2403055T3 (es) 2004-04-13 2013-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-P-selectina
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CN101213297B (zh) 2005-05-09 2013-02-13 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及单独使用或与其它免疫治疗剂联合使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
KR101411165B1 (ko) 2005-07-01 2014-06-25 메다렉스, 엘.엘.시. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날항체
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
KR101586617B1 (ko) 2007-06-18 2016-01-20 머크 샤프 앤 도메 비.브이. 사람 프로그램된 사멸 수용체 ｐｄ-1에 대한 항체
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US8691730B2 (en) 2007-09-14 2014-04-08 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
WO2009100140A1 (en) 2008-02-04 2009-08-13 Medarex, Inc. Anti-clta-4 antibodies with reduced blocking of binding of ctla-4 to b7 and uses thereof
US8927697B2 (en) 2008-09-12 2015-01-06 Isis Innovation Limited PD-1 specific antibodies and uses thereof
WO2010029434A1 (en) 2008-09-12 2010-03-18 Isis Innovation Limited Pd-1 specific antibodies and uses thereof
MX349463B (es) 2008-09-26 2017-07-31 Univ Emory Anticuerpos anti-pd-1, pd-l1 y pd-l2 humanos y usos de los mismos.
PE20120341A1 (es) 2008-12-09 2012-04-24 Genentech Inc Anticuerpos anti-pd-l1 y su uso para mejorar la funcion de celulas t
EP3192811A1 (en) 2009-02-09 2017-07-19 Université d'Aix-Marseille Pd-1 antibodies and pd-l1 antibodies and uses thereof
CN102666582B (zh) 2009-12-22 2016-03-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 序列依赖性聚集
TW201134488A (en) 2010-03-11 2011-10-16 Ucb Pharma Sa PD-1 antibodies
CN105734678B (zh) 2010-07-16 2019-11-05 阿迪马布有限责任公司 合成多核苷酸文库
SI2699264T1 (en) 2011-04-20 2018-08-31 Medimmune Llc Antibodies and other molecules that bind B7-H1 and PD-1
EP3553086A1 (en) 2012-05-31 2019-10-16 Sorrento Therapeutics Inc. Antigen binding proteins that bind pd-l1
MX2016003292A (es) 2013-09-13 2016-06-24 Beigene Ltd Anticuerpos anti-muerte programada 1 y su uso como terapeuticos y diagnosticos.
EP3710039A4 (en) * 2017-11-13 2021-08-04 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR CANCER TREATMENT BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH
US11459389B2 (en) * 2019-10-24 2022-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Monoclonal antibodies that bind human CD161

Also Published As

Publication number Publication date
IL310662A (en) 2024-04-01
CA3229448A1 (en) 2023-03-02
EP4392451A1 (en) 2024-07-03
CN118284623A (zh) 2024-07-02
AU2022332285A1 (en) 2024-02-15
WO2023028501A1 (en) 2023-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3765503B1 (en) Anti-cd25 for tumour specific cell depletion
KR102629403B1 (ko) Vista 항원 결합 분자
JP7335164B2 (ja) 抗ｔｉｇｉｔ抗原結合タンパク質及びその使用方法
JP2022068294A (ja) 抗ｃｄ４０抗体とその使用
US20210269542A1 (en) Anti-gitr antigen-binding proteins and methods of use thereof
US20220324968A1 (en) Antagonists anti-cd7 antibodies
CA3099176A1 (en) Anti-sirp-beta1 antibodies and methods of use thereof
EP4347655A1 (en) Anti-ccr8 antibodies and uses thereof
CA3042727A1 (en) Anti-gitr antigen-binding proteins and methods of use thereof
TW202216198A (zh) 使用抗組織因子抗體之炎性疾病治療
US20220162330A1 (en) Engineering of an antibody for tumor-selective binding of cd47
TW202233677A (zh) Bcma/taci抗原結合分子
KR20240099138A (ko) 항-cd161 항체 및 그의 용도
JP2022553927A (ja) Ｉｌｔ－２阻害剤での癌の処置
RU2795625C2 (ru) Антигенсвязывающие белки против gitr и способы их применения
US20220162305A1 (en) Antibodies having specificity for btn2 and uses thereof
WO2023227641A1 (en) Use of tnf-alpha binding proteins and il-7 binding proteins in medical treatment
TW202342517A (zh) 使用抗組織因子抗體之炎性疾病治療