KR20240094184A - Novel peptide for specific detection of Influenza A virus - Google Patents
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Abstract
본 발명은 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 펩타이드는 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형과 특이적으로 결합할 수 있어 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형을 정확하게 검출할 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 고정된 바이오칩 또한 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 대해 높은 특이성을 나타내는 것을 확인한 바, 이를 이용하여 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형 검출 또는 독감과 같은 인플루엔자 A형 바이러스 감염 질환의 진단 또는 경과 관찰 등에 유용하게 활용할 수 있으므로 인플루엔자 A형 바이러스와 관련된 질병을 해결하는데 크게 기여할 수 있다.The present invention relates to a novel peptide discovered using bacteriophage display screening. According to the present invention, the peptide can specifically bind to the influenza A virus H3N2 subtype and can accurately detect the influenza A virus H3N2 subtype. In addition, it was confirmed that the biochip immobilized with the peptide according to the present invention also exhibits high specificity for the influenza A virus H3N2 subtype. This can be used to detect influenza A virus H3N2 subtype or diagnose influenza A virus infectious diseases such as influenza. Alternatively, it can be useful for progress monitoring, etc., so it can greatly contribute to solving diseases related to influenza A virus.
Description
본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다.The present invention relates to a novel peptide for detecting influenza A virus and its use.
인플루엔자 바이러스는 음성 가닥(negative-sense) RNA 바이러스로서 오르쏘믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 인플루엔자 바이러스 속에 속하고, 직경 100 ~ 120 nm의 구형또는 직경 80 ~ 100 nm, 길이 20 μm의 필라멘트 모양의 형태를 가진다. 상기 인플루엔자 바이러스는 항원성 차이에 의해 A, B, C, D형으로 분류되고, 이 중 사람 인플루엔자 바이러스 A형과 B형이 사람들을 감염시킨다. 특히 인플루엔자 바이러스 A형은 거의 매년 겨울마다 전세계적으로 발생하는 계절성 독감의 원인이다. 이 바이러스는 표면 단백질인 혈구응집소(Hemagglutinin, HA) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H18형까지, 뉴라미니다아제(Neuraminidase, NA) 단백질의 항원 특성에 따라 N1형에서 N11형의 아형으로 분류된다. 또한 이 당단백질이 바이러스 표면에 돌출되어 항체 반응에 중요한 역할을 하며 표면에 HA 단백질은 300 내지 500 개, NA 단백질은 20 내지 50 개 정도 존재한다.Influenza virus is a negative-sense RNA virus that belongs to the influenza virus genus of the Orthomyxoviridae family and has a spherical shape with a diameter of 100 to 120 nm or a filament shape with a diameter of 80 to 100 nm and a length of 20 μm. . The influenza viruses are classified into types A, B, C, and D based on antigenic differences, and among these, human influenza viruses types A and B infect people. In particular, influenza virus type A is the cause of seasonal flu that occurs worldwide almost every winter. This virus is classified into subtypes H1 to H18 based on the antigenic characteristics of the surface protein, hemagglutinin (HA), and from N1 to N11, based on the antigenic characteristics of the neuraminidase (NA) protein. do. Additionally, this glycoprotein protrudes from the surface of the virus and plays an important role in the antibody response. There are about 300 to 500 HA proteins and 20 to 50 NA proteins on the surface.
일반적으로 인플루엔자 바이러스 중 A형 바이러스는 감염성과 병원성 측면에서 가장 대표적이며, 조류 및 사람을 포함하여 다양한 종을 감염시킬 수 있다. 상기 A형 바이러스의 자연 숙주는 야생 철새로 알려져 있으며, 종간감염을 통해 조류로부터 포유류로 전이가 발생하는 것으로 추측되고 있다. 항원 대변이에 의한 A형 바이러스의 유행주기는 약 10 ~ 40 년으로 추정되고, 과거 최소 3번의 인플루엔자 바이러스 대유행 원인이 되었다. In general, among influenza viruses, type A viruses are the most representative in terms of infectivity and pathogenicity, and can infect various species, including birds and humans. The natural host of the type A virus is known to be wild migratory birds, and it is assumed that transfer from birds to mammals occurs through interspecies infection. The epidemic cycle of the type A virus due to antigenic mutation is estimated to be approximately 10 to 40 years, and has been the cause of at least three influenza virus pandemics in the past.
인플루엔자 A형 바이러스 중에서 인플루엔자 A형 H3N2 아형은 조류, 인간, 돼지에서 다양한 변종의 돌연변이가 존재한다. 일반적으로 돼지간에 점염되는 것으로 알려져 있지만, 사람에게서 발견되어 ‘변종’ 바이러스라 인정되었다. 1968년 홍콩에서 유행하며 홍콩 플루라는 이름으로 불리며 전세계적으로 약 100만명의 사람들이 사망하였다. 그리고 2011년 이후 매년 미국에서 계절성 독감을 일으켰으며, 현재는 이 바이러스를 가진 사람들 사이에서 산발적인 감염이 계속 발생하며, CDC(미국질병통제예방센터) 보고에 따르면 대부분 농업 박람회에서 돼지에 장기간 노출되는 것과 관련이 있다고 한다.Among the influenza A viruses, the influenza A H3N2 subtype exists in various mutations in birds, humans, and pigs. It is generally known to infect the liver of pigs, but it was discovered in humans and recognized as a ‘variant’ virus. It was popular in Hong Kong in 1968 and was called Hong Kong flu, killing about 1 million people worldwide. And since 2011, it has caused seasonal flu in the United States every year, and sporadic infections continue to occur among people with the virus, mostly due to long-term exposure to pigs at agricultural fairs, according to a report from the Centers for Disease Control and Prevention (CDC). It is said to be related to this.
H3N2형 인플루엔자는 계절 인플루엔자로 보통 11월에서 다음 해 4월까지 유행하며 12월과 1월에 가장 많은 환자가 발생한다. 인플루엔자 바이러스에 대한 면역력이 없는 5세 미만 어린이, 65세 이상 노인, 임산부, 기저질환이 있는 환자들이 특히 조심해야 하며, 인플루엔자 바이러스에 노출된 후 약 1~4일(평균 2일)의 잠복기 후에 증상이 발생한다. 감염 증상은 갑작스러운 발열과 함께 전형적으로 기침이나 인후통이 발생하며, 무력감, 두통, 근육통, 관절통과 같은 전신 증상이나 기침, 콧물, 호흡곤란과 같은 호흡기 증상이 발생할 수 있다. 합병증을 동반하지 않은 인플루엔자 감염은 치료하지 않아도 자연적으로 3-7일 후에 대부분의 증상이 호전되나 기침과 무력감은 2주 이상 지속될 수 있다. 고위험군에서는 중증 합병증이 동반되거나 기저질환이 악화될 수 있다. 가장 흔한 합병증은 폐렴이며 이외에 기저 심폐질환, 만성 간질환, 만성 실장질환, 중이염 그리고 부비동염 등이 발생할 수 있다.H3N2 influenza is a seasonal influenza that usually spreads from November to April of the following year, with the highest number of cases occurring in December and January. Children under 5 years of age, seniors over 65 years of age, pregnant women, and patients with underlying diseases who do not have immunity to the influenza virus should be especially careful. Symptoms may develop after an incubation period of approximately 1 to 4 days (average 2 days) after exposure to the influenza virus. This happens. Symptoms of infection typically include a cough or sore throat along with a sudden fever, and systemic symptoms such as weakness, headache, muscle pain, and joint pain, or respiratory symptoms such as cough, runny nose, and difficulty breathing may occur. Most symptoms of uncomplicated influenza infection will naturally improve after 3-7 days without treatment, but coughing and weakness may persist for more than 2 weeks. In high-risk groups, severe complications may occur or the underlying disease may worsen. The most common complication is pneumonia, but other complications include underlying cardiopulmonary disease, chronic liver disease, chronic intestinal disease, otitis media, and sinusitis.
지역사회에서 계절 인플루엔자 바이러스가 유행할 때, 이의 진단은 단순히 바이러스 감염여부를 판단하기 위해서가 아니다. 검사 결과에 따라 항바이러스 치료의 여부, 다른 진단 검사 수행 여부, 그리고 감염 예방 및 통제 조치 시행의 여부와 같은 결정에 영향을 미친다. 특히 폐쇄된 환경에서 호흡기 질환이 발생하면 인플루엔자 바이러스 감염 검사는 인플루엔자가 발병의 원인인지 파악하는데 도움이 될 수 있다. 이를 위해 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 여러 진단방법이 개발되었다. 호흡기 검체에서 인플루엔자 바이러스 검출에 사용할 수 있는 진단 테스트에는 분자 진단(신속 분자 진단, 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 기타 핵산 증폭 검사 등) 및 항원 검출 테스트(신속항원검사키트(rapid diagnostics test, RDTs) 및 면역 형광 분석(fluorescence immunoassay))가 있다. 한편, 바이러스 배양 방법도 있으나 이는 공중 보건 목적에는 중요하지만 임상 관리에 정보를 제공하기 위한 부분에는 적절한 결과를 제공하지 않는다. 호흡기 검체에서 인플루엔자 바이러스에 대한 모든 검사의 민감도와 특이성은 검사 방법 및 사용된 특정 검사의 유형, 질병 발병에서 검체 수집까지의 시간, 수집된 검체의 품질, 검체의 호흡기 공급원, 취급 및 표본의 처리 및 표본 수집에서 테스트까지의 시간에 따라 영향을 받는다. When a seasonal influenza virus is prevalent in a community, diagnosis is not simply to determine whether or not the virus is infected. Test results may influence decisions such as whether to take antiviral treatment, whether to perform other diagnostic tests, and whether to implement infection prevention and control measures. Especially when respiratory disease occurs in a closed environment, testing for influenza virus infection can be helpful in determining whether influenza is the cause of the outbreak. For this purpose, several diagnostic methods for influenza virus infection have been developed. Diagnostic tests that can be used to detect influenza viruses in respiratory specimens include molecular diagnostics (rapid molecular diagnostics, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), other nucleic acid amplification tests, etc.) and antigen detection tests (rapid antigen tests, etc.). There are test kits (rapid diagnostics tests (RDTs) and fluorescence immunoassays). Meanwhile, there are also viral culture methods, which, while important for public health purposes, do not provide adequate results to inform clinical management. The sensitivity and specificity of any test for influenza viruses in respiratory specimens depend on the testing method and type of specific test used, the time from disease onset to specimen collection, the quality of the specimen collected, the respiratory source of the specimen, the handling and processing of the specimen, and It is affected by the time from specimen collection to testing.
상기 분자 진단 방법은 결과 수득에 있어 오랜 시간이 걸릴 수 있으며, 살아있는 바이러스 또는 감염이 진행중인 바이러스가 있는 검체에서 바이러스의 RNA 또는 핵산 검출이 반드시 나타나는 것이 아니라는 단점이 있다. 또한 상기 항원 검출 테스트에 속하는 신속 인플루엔자 진단 검사(Rapid Influenza Diagnostic Tests, RIDT)는 높은 특이도를 보이는 대신 높지 않은 민감도(50-70%)를 보이는, 인플루엔자 바이러스 항원 검출 분석법이다. 상기 RIDT 검사법도 일부 검체의 결과가 정확하지 못하며, 특이도와 민감도가 다른 분석법 대비 낮은 문제점이 있다. 특히, 지역사회에서 인플루엔자 바이러스 전염이 최고조에 이를 때 일반적으로 위양성 결과보다 위음성 결과를 더 많이 생성하는 문제점도 있다.The molecular diagnostic method has the disadvantage that it may take a long time to obtain results and that viral RNA or nucleic acid is not necessarily detected in specimens containing live viruses or viruses in progress. In addition, Rapid Influenza Diagnostic Tests (RIDT), which belong to the above antigen detection tests, are influenza virus antigen detection assays that show high specificity but not high sensitivity (50-70%). The RIDT test method also has problems in that the results of some samples are not accurate and its specificity and sensitivity are lower than those of other analysis methods. In particular, there is a problem that more false negative results are generally generated than false positive results when influenza virus transmission is at its peak in the community.
상기 면역 형광 분석은 높지 않은 민감도와 높은 특이도를 가진 분석법으로, 인플루엔자 바이러스 A와 B의 항원을 구분할 수 있으나 A형 인플루엔자 바이러스의 하위분류는 구별이 불가능한 단점이 있다. The immunofluorescence analysis is an analysis method with low sensitivity and high specificity, and can distinguish between antigens of influenza viruses A and B, but has the disadvantage of being unable to distinguish subtypes of influenza A viruses.
따라서 인플루엔자 바이러스에 대해 높은 민감도와 특이도를 보이며, 특히, A형 인플루엔자 바이러스의 하위분류도 정확하고 신속하게 확인할 수 있는 검출 방법이 요구되고 있다.Therefore, there is a need for a detection method that shows high sensitivity and specificity for influenza viruses and, in particular, can accurately and quickly identify subclasses of influenza A viruses.
본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, A형 인플루엔자 바이러스, 특히 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술에 대해 연구하던 중, 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드를 발굴하고 상기 펩타이드가 인플루엔자 A형 H3N2 아형에 대해 높은 특이성과 민감도를 보임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.In order to solve the problems of the prior art, the present inventors were researching a technology that can quickly and accurately detect influenza A virus, especially influenza A virus H3N2 subtype, and specifically bind to influenza A virus H3N2 subtype. The present invention was completed by discovering a new peptide that shows high specificity and sensitivity to influenza A type H3N2 subtype.
따라서 본 발명의 목적은 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 펩타이드를 제공하는 것이다.Therefore, the purpose of the present invention is to provide a peptide for detecting influenza A virus.
본 발명의 다른 목적은 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for detecting influenza A virus.
본 발명의 또 다른 목적은 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting influenza A virus.
본 발명의 또 다른 목적은 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 바이오칩을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a biochip for detecting influenza A virus.
본 발명의 또 다른 목적은 인플루엔자 A형 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting influenza A virus.
본 발명의 또 다른 목적은 인플루엔자 A형 바이러스 감염 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing influenza A virus infection disease.
본 발명의 또 다른 목적은 인플루엔자 A형 바이러스 감염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for providing information on diagnosing influenza A virus infection.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the peptide according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector containing a polynucleotide encoding the peptide according to the present invention.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 20 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열번호로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는, 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 펩타이드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a partial or entire sequence of an amino acid sequence represented by any one sequence number selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 24. Provided is a peptide for detecting influenza A virus, including:
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other objects, the present invention provides a composition for detecting influenza A type virus containing the peptide according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 키트를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a kit for detecting influenza A virus containing the peptide according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 바이오칩을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a biochip for detecting influenza A type virus containing the peptide according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 인플루엔자 A형 바이러스 검출 방법을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention includes the steps of treating a sample with a peptide according to the present invention; and detecting a reaction between the peptide and the sample. It provides a method for detecting influenza A virus.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩펩타이드를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 감염 질환의 진단용 조성물을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a composition for diagnosing influenza A virus infectious disease comprising the peptide according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩펩타이드를 시료에 처리하는 단계를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 감염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, in order to achieve the above-described other object, the present invention provides a method of providing information on the diagnosis of influenza A virus infection, including the step of treating a sample with the peptide according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a polynucleotide encoding a peptide for detecting influenza A virus according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a recombinant expression vector containing a polynucleotide encoding a peptide for detecting influenza A virus according to the present invention.
본 발명에 따른 신규한 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 펩타이드는 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 대해 비특이적 결합이 없으면서도 높은 정확도 및 민감도를 보임을 확인한 바, 이를 이용하여 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형 검출 또는 독감과 같은 인플루엔자 A형 바이러스 감염 질환의 진단 또는 경과 관찰 등에 유용하게 활용할 수 있으므로 인플루엔자 A형 바이러스와 관련된 질병을 해결하는데 크게 기여할 수 있다.It was confirmed that the novel peptide for detecting influenza A virus according to the present invention shows high accuracy and sensitivity without non-specific binding to influenza A virus H3N2 subtype. It can be used to detect influenza A virus H3N2 subtype or to detect influenza A virus H3N2 subtype. It can be useful for diagnosis or follow-up of influenza A virus-infected diseases, so it can greatly contribute to solving diseases related to influenza A virus.
도 1은 박테리오파지 C7C-mer를 통해 발굴한 9개 후보군의 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 대한 결합력을 확인한 결과이다.
도 2는 박테리오파지 12-mer를 통해 발굴한 11개 후보군의 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 대한 결합력을 확인한 결과이다.
도 3은 선별된 후보군을 기반으로 합성한 4개 펩타이드의 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 대한 결합력을 순환전압전류법(Cyclic Voltammetry, CV)으로 평가하기 위한, 센서 표면 처리 과정을 나타낸 도이다.
도 4는 선별된 후보군을 기반으로 합성한 4개 펩타이드의 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 대한 결합력을 CV로 측정한 결과이다.Figure 1 shows the results of confirming the binding ability of 9 candidates discovered through bacteriophage C7C-mer to influenza A type virus H3N2 subtype.
Figure 2 shows the results of confirming the binding ability of 11 candidates discovered through bacteriophage 12-mer to influenza A virus H3N2 subtype.
Figure 3 is a diagram showing the sensor surface treatment process for evaluating the binding ability of four peptides synthesized based on selected candidates to the influenza A virus H3N2 subtype by cyclic voltammetry (CV).
Figure 4 shows the results of measuring the binding affinity of four peptides synthesized based on selected candidates to influenza A virus H3N2 subtype using CV.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 1, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 20 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열번호로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는, 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 펩타이드를 제공한다.The present invention relates to an influenza A type virus comprising a portion or the entire sequence of an amino acid sequence represented by any one sequence number selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 24. Peptides for detection are provided.
CWLLDNSNC(서열번호 1)CWLLDNSNC (SEQ ID NO: 1)
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WAGSKWSLWLTS(서열번호 20)WAGSKWSLWLTS (SEQ ID NO: 20)
STLFRYSHSMDGAWYGGGSK(서열번호 24)STLFRYSHSMDGAWYGGGSK (SEQ ID NO: 24)
상기 서열번호 1, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 20으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열은 박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(phage display peptide library) Ph.D.-C7C(New England BioLab) 또는 Ph.D.-12(New England BioLab)를 이용하여 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 고특이적으로 결합하는 서열을 찾아낸 것이다. 상기 Ph.D.-C7C 또는 Ph.D.-12는 각각 M13 박테리오파지의 게놈중에서 외피단백질(coat protein)의 일종인 pⅢ를 생산하는 유전자 말단에 7개의 무작위 아미노산이 서열 말단에 시스테인(cysteine) 잔기 간 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 고리 모형을 갖는 펩타이드 또는, 12개의 무작위 아미노산 서열을 갖는 선형의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균 (E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 M13 박테리오파지로 구성되어 있다.The amino acid sequence of the peptide according to the present invention, represented by any one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 20, is selected from the bacteriophage random peptide library (phage display peptide library) Ph.D.- A sequence that binds highly specifically to the influenza A virus H3N2 subtype was found using C7C (New England BioLab) or Ph.D.-12 (New England BioLab). The Ph.D.-C7C or Ph.D.-12 each has 7 random amino acids at the end of the gene that produces pIII, a type of coat protein, in the genome of M13 bacteriophage, and a cysteine residue at the end of the sequence. Hundreds of millions of cells were obtained by artificially inserting a gene sequence to express a peptide having a ring shape through a disulfide bond or a linear peptide having a sequence of 12 random amino acids, and then infecting E.coli . It consists of recombinant M13 bacteriophages expressing different peptides.
본 발명에서 사용된 상기 M13 박테리아파지는 특정 형질(strain)의 대장균만 감염되는 성질을 지니는 나노크기의 물질이며 돌연변이를 일으켜 인체에 감염될 가능성에 대해서는 현재까지 전혀 보고된 바 없다. 특히 2006년 FDA의 승인을 얻어 인스턴트식품의 세균 오염 방지용 첨가물로 활용되고 있으며, 항생제의 내성 문제는 해결할 수 있는 대체제뿐만 아니라 인체에 무해한 생체 진화형 나노물질로 각광을 받고 있다. 더불어 상기 박테리아파지를 이용하는 경우, 제조 공정이 간단하며 생산성과 안정성의 향상을 기대할 수 있고, 다양한 유전공학적, 화학적 변형을 활용할 수 있는 장점이 있다.The M13 bacterial phage used in the present invention is a nano-sized material that infects only E. coli of a specific strain, and there has been no report to date about the possibility of it mutating and infecting the human body. In particular, it was approved by the FDA in 2006 and is being used as an additive to prevent bacterial contamination in instant foods. It is attracting attention not only as an alternative that can solve the problem of antibiotic resistance, but also as a bio-evolved nanomaterial that is harmless to the human body. In addition, when using the bacterial phage, the manufacturing process is simple, productivity and stability can be expected to improve, and various genetic engineering and chemical modifications can be used.
더불어 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 기본으로 제작된 것으로, 금 표면에 고정화되었을 때 타겟물질과의 인지(recognition)와 결합(binding)이 보다 용이하게 이루어질 수 있도록, 펩타이드 분자의 유연성(flexibility)을 높이기 위하여 -GGGS- 서열이 반복되도록 합성한 것을 특징으로 한다.In addition, the peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 was produced based on the peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and when immobilized on the gold surface, it recognizes and binds to the target material ( It is characterized by being synthesized so that the -GGGS- sequence is repeated to increase the flexibility of the peptide molecule so that binding can be performed more easily.
따라서 본 발명의 서열번호 1, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 20 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열번호로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는, 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 펩타이드는 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형을 검출하는 것을 특징으로 한다.Therefore, influenza type A, comprising part or the entire sequence of the amino acid sequence represented by any one of the sequence numbers selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 24 of the present invention The virus detection peptide is characterized by detecting the influenza A virus H3N2 subtype.
보다 구체적으로 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형의 적혈구 응집소(Hemagglutinin, HA)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.More specifically, it is characterized by specifically binding to hemagglutinin (HA) of the influenza A virus H3N2 subtype.
본 발명에 따른 펩타이드는 저분자 펩타이드로서 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 거의 없다. 이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다.The peptide according to the present invention is a low-molecular-weight peptide and has the advantage of being three-dimensionally stable due to its small size, easily passing through mucous membranes, and being able to recognize molecular targets even deep in the tissue. In addition, the small molecule peptide according to the present invention is relatively simple to mass produce compared to antibodies and has little toxicity. In addition, the low-molecular-weight peptide according to the present invention has the advantage of high binding affinity to the target substance and does not undergo denaturation even during heat/chemical treatment. Additionally, because the molecule size is small, it can be used as a fusion protein by attaching it to another protein.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하며, N 말단 혹은 C 말단에 다양한 기능기를 포함할 수 있다.In addition, the peptide according to the present invention is characterized as a dimer, trimer, or multimer, and may contain various functional groups at the N-terminus or C-terminus.
상기 다양한 기능기의 예시로서, N 말단의 기능기는 자유아민(free amine), 아세틸화(acetylation), 바이오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, C 말단의 기능기는 유리산(free acid), 아미드화(amidation), 비오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 검출 또는 동정을 위하여 표지될 수 있으며, 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.As an example of the various functional groups, the N-terminal functional group may be any one selected from the group consisting of free amine, acetylation, biotin, and fluorophore, and the C-terminal functional group may be any one selected from the group consisting of free amine, acetylation, biotin, and fluorophore. The functional group may be any one selected from the group consisting of free acid, amidation, biotin, and fluorophore, but is not limited thereto. In addition, the peptide according to the present invention may be labeled for detection or identification, and may be labeled with any one selected from the group consisting of chromogenic enzymes, radioisotopes, chromophores, luminescent substances, and fluorescent substances, but is limited thereto. It doesn't work.
상기 발색효소는 예를 들어, 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)일 수 있고, 상기 방사성 동위원소는 예를 들어, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S일 수 있으며, 상기 발광물질 또는 형광물질은 예를 들어, FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots) 등일 수 있다.The chromogenic enzyme may be, for example, peroxidase or alkaline phosphatase, and the radioactive isotope may be, for example, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S, The luminescent substance or fluorescent substance may be, for example, FITC, RITC, rhodamine, Texas Red, fluorescein, phycoerythrin, quantum dots, etc.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.Similarly, the detectable label may be an antibody epitope, substrate, cofactor, inhibitor, or affinity ligand. This labeling may be performed during the process of synthesizing the peptide of the present invention, or may be additionally performed on the already synthesized peptide.
만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography, FMT)으로 인플루엔자 A형 바이러스에 결합한 펩타이드의 형광 패턴을 관찰할 수 있고, 형광이 관찰되는 패턴에 따라, 인플루엔자 A형 바이러스를 검출할 수 있다. 또는 형광물질로 FITC(Fluorescein isothiocyanate)를 이용하는 경우, 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(여기(Excitation): 495 nm, 방출(Emission): 520 nm)에서 각 펩타이드 농도에 대한 형광세기를 측정하는 방법을 이용할 수 있다.If a fluorescent substance is used as a detectable label, the fluorescence pattern of the peptide bound to the influenza A virus can be observed using fluorescence mediated tomography (FMT), and depending on the pattern in which the fluorescence is observed, the influenza A virus is identified. can be detected. Alternatively, when using FITC (Fluorescein isothiocyanate) as a fluorescent substance, the concentration of each peptide is measured at the maximum wavelength (Excitation: 495 nm, Emission: 520 nm) of FITC linked to the peptide using a fluorometer. A method of measuring the fluorescence intensity can be used.
본 발명의 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.It is clear to those skilled in the art that biological functional equivalents that can be included in the scope of the peptide for detecting influenza A virus of the present invention will be limited to those containing mutations in the amino acid sequence that exhibit biological activity equivalent to the peptide of the present invention.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.These amino acid mutations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc. Analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substitutions shows that arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).In introducing mutations, the hydrophobic index of the amino acid may be considered. Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); Cysteine/Cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.The hydrophobic amino acid index is very important in imparting the interactive biological function of peptides. It is a known fact that similar biological activity can be maintained only when substituted with an amino acid having a similar hydrophobicity index. When introducing a mutation with reference to the hydrophobicity index, substitution is made between amino acids showing a difference in hydrophobicity index, preferably within ±2, more preferably within ±1, and even more preferably within ±0.5.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). Meanwhile, it is also well known that substitution between amino acids with similar hydrophilicity values results in peptides with equal biological activity. As disclosed in U.S. Patent No. 4,554,101, the following hydrophilicity values are assigned to each amino acid residue: arginine (+3.0); Lysine (+3.0); Asphaltate (+3.0±1); glutamate (+3.0±1); serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); threonine (-0.4); Proline (-0.5±1); Alanine (-0.5); histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.When introducing a mutation with reference to the hydrophilicity value, substitution is made between amino acids that show a difference in hydrophilicity value, preferably within ±2, more preferably within ±1, and even more preferably within ±0.5.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.Amino acid exchanges in peptides that do not overall alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most common exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ It is an exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, and Asp/Gly.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 펩타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다. Considering the mutations having the above-mentioned biological equivalent activity, the peptide for detecting influenza A virus of the present invention is interpreted to also include a sequence showing substantial identity with the sequence listed in the sequence listing. The above substantial identity is at least 80% identical when the peptide sequence of the present invention and any other sequence are aligned to correspond as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It means a sequence showing homology, more preferably more than 90% homology. As an alignment method for sequence comparison, any method known in the art can be used without limitation.
본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 T-BOC(tert-butyloxycarbonyl) 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서 N 말단 또는 C 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호한 형태일 수 있다. 즉, 상기 펩타이드의 C 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형되는 것일 수 있다. 또한 상기 펩타이드의 N 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시카르보닐(Fmoc)기, 포르밀(Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기, 스테아릴(Stearyl)기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 기로 변형되는 것일 수 있다.Peptides according to the present invention can be prepared by chemical synthesis known in the art. Representative methods include, but are not necessarily limited to, liquid or solid phase synthesis, fragment condensation, and 9-fluorenylmethoxycarbonyl (F-MOC) or tert-butyloxycarbonyl (T-BOC) chemistry. Additionally, the peptide of the present invention can be produced by genetic engineering methods. First, a DNA sequence encoding the peptide is constructed according to a conventional method. DNA sequences can be constructed by PCR amplification using appropriate primers. Alternatively, DNA sequences may be synthesized by standard methods known in the art, such as using automated DNA synthesizers (e.g., those sold by Biosearch or Applied Biosystems). The constructed DNA sequence is a vector containing one or more expression control sequences (e.g., promoter, enhancer, etc.) that are operably linked to the DNA sequence to control the expression of the DNA sequence. and transform the host cell with the recombinant expression vector formed therefrom. The resulting transformant is cultured under appropriate media and conditions to express the DNA sequence, and a substantially pure peptide encoded by the DNA sequence is recovered from the culture. The recovery can be performed using methods known in the art (eg, chromatography). In the above, 'substantially pure peptide' means that the peptide according to the present invention does not substantially contain any other proteins derived from the host. In addition, the peptide according to the present invention may have its N-terminus or C-terminus modified or protected with various organic groups in order to protect it from protein-cleaving enzymes in vivo and increase its stability. That is, there is no particular limitation as long as the C terminus of the peptide can be modified to increase stability, but it may preferably be modified into a hydroxy group (-OH) or an amino group (-NH 2 ). In addition, the N-terminus of the peptide is not particularly limited as long as it can be modified to increase stability, but is preferably an acetyl group, a fluorenyl methoxycarbonyl (Fmoc) group, or a formyl group. , it may be modified with a group selected from the group consisting of Palmitoyl group, Myristyl group, Stearyl group, and polyethylene glycol (PEG).
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 한다.In addition, the peptide according to the present invention is characterized by having any one of the amino acids among D-type, L-type, peptide mimetics including peptoid monomers, or non-natural amino acids.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for detecting influenza A type virus containing the peptide according to the present invention.
상기 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.In the composition for detecting influenza A virus, the composition includes a peptide consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, a peptide consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, and a peptide consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23. It may further include any one or more selected from the group consisting of.
YTFPNFLNDLSFLGGGSK(서열번호 21)YTFPNFLNDLSFLGGGSK (SEQ ID NO: 21)
YTFPNSLNDLLWLGGGSK(서열번호 22)YTFPNSLNDLLWLGGGSK (SEQ ID NO: 22)
STLWLSWKSMDGAWYGGGSK(서열번호 23)STLWLSWKSMDGAWYGGGSK (SEQ ID NO: 23)
상기 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또한 앞서 기술한 바와 같이 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다. The peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, and the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 are also substantially identical to the sequence listed in the sequence list as described above. It can be interpreted as also including sequences showing (substantial identity). The above substantial identity is at least 80% identical when the peptide sequence of the present invention and any other sequence are aligned to correspond as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It means a sequence showing homology, more preferably more than 90% homology. As an alignment method for sequence comparison, any method known in the art can be used without limitation.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a kit for detecting influenza A virus containing the peptide according to the present invention.
본 발명의 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 키트에는 인플루엔자 A형 바이러스 검출을 위한 펩타이드의 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있고, 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 4℃로 유지된 상태로 제공될 수 있다.The kit for detecting influenza A virus of the present invention may include one or more other component compositions or devices suitable for the analysis method of peptides for detecting influenza A virus, and may contain a composition or device that stably maintains the structure or physiological activity of the peptide. A buffer or reaction solution may be additionally included. Additionally, to maintain stability, it may be provided maintained at 4°C.
인플루엔자 A형 바이러스에 결합한 본 발명에 따른 펩타이드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 키트에 포함되는 펩타이드는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 생체 내에서 인플루엔자 A형 바이러스와의 결합 정도를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 일 구체예로서 본 발명의 키트는 다양한 대상, 예를 들어 인플루엔자 A형 바이러스에 감염된 개체로부터 수득한 시료로부터 인플루엔자 A형 바이러스를 검출하거나, 상기 바이러스에 대한 감염 여부를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 확인은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 진단을 실시할 수 있다.In order to facilitate the identification, detection, and quantification of the peptide according to the present invention bound to the influenza A virus, the peptide included in the kit of the present invention may be provided in a labeled state as described above. On the other hand, when the peptide of the present invention is provided unlabeled, the kit of the present invention may additionally include components for detecting the degree of binding of the peptide of the present invention to influenza type A virus in vitro or in vivo. You can. The component is a known compound for labeling the peptide of the present invention, or an antibody against a specific receptor that binds to the peptide of the present invention or the peptide of the present invention, or a secondary antibody against these for detection through antigen-antibody reaction, and It may be a reagent for its detection. As one embodiment, the kit of the present invention can be used to detect influenza A virus from various subjects, for example, samples obtained from individuals infected with influenza A virus, or to confirm infection with the virus. The confirmation can be performed by modifying a conventional immunoassay method or protocol. For example, diagnosis can be performed by using the peptide of the present invention instead of the antibody in the conventional immunoassay and using the same process.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 바이오칩을 제공한다.In addition, the present invention provides a biochip for detecting influenza A virus containing the peptide according to the present invention.
본 발명에 따른 펩타이드는 바이오칩으로 사용 가능한 다양한 칩(금(gold), 은(silver), 자성 비드(magnetic bead), 실리카(silica), 그래핀(graphene), 탄소 나노튜브(carbon nanotube) 등) 상에 특이적으로 고정될 수 있다. 다만, 본 발명의 특징은 전술한 펩타이드의 특징과 관련되며 이와 같이 펩타이드를 바이오칩으로 제조하는 것은 공지기술에 따라 할 수 있는 부분이다. The peptide according to the present invention can be used as a biochip in various chips (gold, silver, magnetic bead, silica, graphene, carbon nanotube, etc.) It can be specifically fixed on the image. However, the features of the present invention are related to the features of the above-mentioned peptide, and manufacturing the peptide into a biochip can be done according to known techniques.
본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 바이오칩을 이용하여 순환 전압 전류법(cyclic voltammetry)을 수행하는 경우, “클릭 화학(click chemistry)“의 원리를 적용하기 위하여 각 펩타이드의 C-말단에 아지도아세트산(Azidoacetic acid), 아지도라이신 (Azido-lysine), 4-아지도뷰타노산(4-Azidobutanoic acid) 및 5-아지도펜타노산(5-Azidopentanoic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 결합시킨 후, 금(칩, 전극)에 고정시킬 수 있다.When performing cyclic voltammetry using a biochip for detecting influenza A virus containing the peptide according to the present invention, the C- of each peptide is used to apply the principle of “click chemistry.” At the terminal, any selected from the group consisting of Azidoacetic acid, Azido-lysine, 4-Azidobutanoic acid, and 5-Azidopentanoic acid. After combining one or more, they can be fixed to gold (chip, electrode).
상기 “클릭 화학(click chemistry)“이란 부산물을 발생시키지 않으면서, 특정한 두 분자를 연결하는 합성 방식을 의미한다. 열을 가하는 등의 특정한 조건이 없어도 상온, 상압에서 이러한 합성이 가능하다.The term “click chemistry” refers to a synthetic method that connects two specific molecules without generating by-products. This synthesis is possible at room temperature and pressure without any specific conditions such as applying heat.
기존의 “클릭 화학”은 대부분 유기체에 독성이 있는 구리(Cu)를 촉매를 써서 아자이드(Azide) 분자와 알킨(Alkyne) 분자를 합성해 트리아졸을 만드는 방법(CuAAC)을 이용했다. 그러나 이는 촉매의 독성 때문에 많은 생물학적 시스템에 적용이 어려웠다. 이를 극복하기 위하여, SPAAC(strain-promoted alkyne azide cycloaddition)로 알려진 새로운 Copper-free 클릭 화학이 개발되었다. 이는 촉매 사용없이 아지드(Azide)가 표지된 물질과 사이클로옥틴(Cyclooctyne, DBCO)의 일부분의 반응을 기반으로 한다. 사이클로옥틴은 아지드에 대해 특이적인 반응과 함께 내열성이 있어 안정한 트리아졸을 정량적으로 얻을 수 있다. 본 발명에 사용된 펩타이드는 아세트산(Azidoacetic acid), 아지도라이신 (Azido-lysine), 4-아지도뷰타노산(4-Azidobutanoic acid) 및 5-아지도펜타노산(5-Azidopentanoic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 이용해 발현되는 기능기나 링커 길이를 조절할 수 있다. 더불어 형광이 표지된 아지도(Azide with fluorescent dyes), 바이오틴이 표지된 아지도(Biotin azides), PEO 링커가 달린 아지도(Azides with PEO spacer(PEGs)) 등을 통해 다른 형식의 센서 개발에도 사용될 수 있다.Existing “click chemistry” mostly used a method (CuAAC) to create triazoles by synthesizing azide molecules and alkyne molecules using copper (Cu), which is toxic to organisms, as a catalyst. However, this has been difficult to apply to many biological systems due to the toxicity of the catalyst. To overcome this, a new copper-free click chemistry known as strain-promoted alkyne azide cycloaddition (SPAAC) was developed. It is based on the reaction of a portion of cyclooctyne (DBCO) with an azide-labeled material without the use of a catalyst. Cyclooctyne has a specific reaction to azide and is heat resistant, so stable triazole can be obtained quantitatively. The peptide used in the present invention is a group consisting of acetic acid, azido-lysine, 4-Azidobutanoic acid, and 5-Azidopentanoic acid. The length of the expressed functional group or linker can be adjusted using one or more selected from . In addition, Azides with fluorescent dyes, Biotin azides, and Azides with PEO spacer (PEGs) can be used to develop other types of sensors. You can.
따라서 본 발명은 Copper-free 클릭 화학을 기반으로 하며, 이를 통해 기존에 사용되었던 싸이올 그룹(-SH)이나 EDC/NHS(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide) 커플링(coupling) 등을 이용한 방법보다 정량적이며 안정적으로 펩타이드를 전극 표면에 고정한 기술적 특징이 있다.Therefore, the present invention is based on copper-free click chemistry, through which the previously used thiol group (-SH) or EDC/NHS (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide) couple It has the technical feature of fixing the peptide to the electrode surface more quantitatively and stably than methods using coupling.
본 발명에 따른 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 바이오칩을 이용하여 단백질과 단백질 간의 반응, 단백질과 반응리간드 간의 반응, 목적리간드와 반응단백질 간의 반응 또는 목적리간드와 반응리간드간의 반응을 검출할 수 있다. 특히 상기와 같은 전기화학적인 검출기술 또는 분광학적인 검출기술에 적용하는 경우, 시료내 극미량으로 존재하는 인플루엔자 A형 바이러스를 매우 간단하고, 효율적으로 정확하게 검출할 수 있다.Using the biochip for detecting influenza A virus according to the present invention, it is possible to detect the reaction between proteins and proteins, the reaction between proteins and reactive ligands, the reaction between target ligands and reactive proteins, or the reaction between target ligands and reactive ligands. In particular, when applying the electrochemical detection technology or spectroscopic detection technology as described above, the influenza A virus that exists in trace amounts in a sample can be detected very simply, efficiently, and accurately.
상기 반응리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 생체물질, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응단백질은 효소 또는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응 검출은 표지 혹은 비표지체를 이용하여 수행할 수 있다.The reactive ligand may be a low molecular weight biomaterial, peptide, carbohydrate, aptamer, fatty acid, or lipid that reacts with a protein or peptide, but is not limited thereto. Additionally, the reactive protein may be an enzyme or an antibody, but is not limited thereto. Additionally, the target ligand may be a low molecular weight compound, nucleic acid, peptide, carbohydrate, aptamer, fatty acid, or lipid that reacts with a protein or peptide, but is not limited thereto. In addition, detection of the reaction can be performed using labeled or non-labeled substances.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 인플루엔자 A형 바이러스 검출 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the steps of treating a sample with a peptide according to the present invention; and detecting a reaction between the peptide and the sample. It provides a method for detecting influenza A virus.
이를 통해 시료내 인플루엔자 A형 바이러스를 검출할 수 있고, 상기 시료의 수득처인 개체의 인플루엔자 A형 바이러스 감염 여부를 확인할 수 있다.Through this, it is possible to detect the influenza type A virus in the sample and confirm whether the individual from whom the sample was obtained is infected with the influenza type A virus.
본 발명에 있어서 상기 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함하는 의미이다. 더불어 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다. 또한 한편으로 이는 검체 또는 배양물(예를 들어 미생물 배양물)을 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the “sample” is used in the broadest sense. On the one hand, it is meant to include both biological and environmental samples. Additionally, samples may include specimens of synthetic origin. It may also include a sample or culture (eg, a microbial culture). The biological samples include whole blood, plasma, serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, Breath, urine, semen, saliva, peritoneal washings, ascites, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid ), leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple Nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells, cell extract and cerebrospinal fluid ( It may be one or more selected from the group consisting of cerebrospinal fluid, but is not limited thereto.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry), 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 수정 진동자 마이크로밸런스(quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA(Lateral flow assay)/VFA(Variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the method of the present invention, detection of the reaction can be performed using cyclic voltammetry, square wave voltammetry, electrochemical impedance spectroscopy, and quartz crystal microbalance. ), Surface plasmon resonance, LFA (Lateral flow assay)/VFA (Variable flip angle), Enzyme linked immunoassay, Fluorescence resonance energy transfer, and surface-enhanced Raman It may be performed by one or more methods selected from the group consisting of surface-enhanced Raman spectroscopy, but is not limited thereto.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 감염 질환의 진단용 조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a composition for diagnosing influenza A virus infection disease comprising the peptide according to the present invention.
더불어 본 발명은 펩타이드를 시료에 처리하는 단계;를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 감염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of providing information on diagnosing influenza A virus infection, including the step of treating a sample with a peptide.
본 발명에 있어서, 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환, 또는 이의 원인에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.In the present invention, the “diagnosis” refers to determining the susceptibility of an individual to a specific disease or condition, or its cause, determining whether an individual currently has a specific disease or condition, Includes determining the prognosis of a subject with a particular disease or disorder, or therametrics (e.g., monitoring the condition of a subject to provide information about the efficacy of treatment).
상술한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 이용하여 인플루엔자 A형 바이러스, 보다 바람직하게는 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형의 검출이 가능한바, 이를 이용하여 시료 내 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형의 존재 유무를 검출하거나, 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형의 양을 정량하기 위한 용도로 활용될 수 있고, 보다 구체적으로는 독감과 같은 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형 감염 질환을 진단하는데 사용될 수 있다.As described above, it is possible to detect influenza A virus, more preferably influenza A virus H3N2 subtype, using the peptide of the present invention. This can be used to detect the presence or absence of influenza A virus H3N2 subtype in a sample. , It can be used to quantify the amount of influenza A virus H3N2 subtype, and more specifically, it can be used to diagnose influenza A virus H3N2 subtype infectious diseases such as the flu.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 인플루엔자 A형 검출용 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.Additionally, the present invention provides a polynucleotide encoding a peptide for detecting influenza A type according to the present invention.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등을 발현하거나, 또는 발현할 수 있도록 개조된 것으로서, 바람직하게는 본 발명에 따른 인플루엔자 A형 검출용 펩타이드를 발현하는 것이다. 이는 게놈 서열, 게놈 외(extra-genomic) 서열, 플라스미드에 암호화된 서열 및 보다 작은 조작된 유전자 조각 등을 포함한다. As understood by those skilled in the art, the polynucleotide sequence of the present invention expresses or has been modified to express a protein, polypeptide, peptide, etc., and preferably expresses the peptide for detecting influenza A type according to the present invention. It is done. This includes genomic sequences, extra-genomic sequences, plasmid-encoded sequences, and smaller engineered gene fragments.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥(코드서열 또는 안티센스 서열)일 수 있고, 또는 이중 가닥일 수 있으며, 그리고 DNA 분자 (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. 추가의 코딩(coding) 또는 비코딩(non-coding) 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있다. 또한 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지 재료에 연결될 수 있다.As will be appreciated by those skilled in the art, a polynucleotide may be single-stranded (code sequence or antisense sequence), or double stranded, and may be a DNA molecule (genomic, cDNA or synthetic) or an RNA molecule. Additional coding or non-coding sequences may be present within the polynucleotides of the invention. Polynucleotides may also be linked to other molecules and/or support materials.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 그 코딩 서열 자체의 길이에 관계없이, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 조각(부분, segment) 등과 같은 다른 DNA 서열과 결합될 수 있고, 그 결과 자신의 전체 길이는 상당히 달라질 수 있다. 그러므로 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오티드 단편이 적용될 수 있는 것으로 고려되며, 바람직하게 의도하는 재조합 DNA 프로토콜에서 제조 및 사용의 용이함에 의하여 그 전체 길이가 제한될 수 있다.The polynucleotide of the present invention can be combined with other DNA sequences, such as promoters, polyadenylation signals, additional restriction enzyme sites, multiple cloning sites, other coding segments, etc., regardless of the length of the coding sequence itself. can vary significantly, and as a result their overall length can vary significantly. Therefore, it is considered that polynucleotide fragments of almost any length can be applied, and preferably, the overall length may be limited by ease of production and use in the intended recombinant DNA protocol.
더욱이, 유전적 코드의 축중(degeneracy)의 결과로서, 본 명세서에 기재되는 폴리펩타이드를 암호화하는 많은 뉴클레오타이드 서열이 존재한다는 것은, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 자명히 이해될 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 중 몇몇은 임의의 천연 유전자(native gene)의 뉴클레오타이드 서열에 대해서 최소의 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법(codon usage)의 차이로 인해 다른 폴리뉴클레오타이드들(예를 들어 사람 및/또는 영장류의 코돈 선택에 대해서 최적화된 폴리뉴클레오타이드)은 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다.Moreover, it will be readily apparent to those skilled in the art that, as a result of the degeneracy of the genetic code, many nucleotide sequences exist that encode the polypeptides described herein. Some of these polynucleotides possess minimal homology to the nucleotide sequence of any native gene. Nevertheless, other polynucleotides due to differences in codon usage (e.g., polynucleotides optimized for human and/or primate codon selection) are specifically contemplated by the present invention.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 인플루엔자 A형 검출용 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant expression vector containing a polynucleotide encoding the peptide for detecting influenza A type according to the present invention.
본 발명에 있어서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명에 있어서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392(Pharmingen)을 기초로 한다.As used herein, “vector” refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable control sequence capable of expressing the DNA in a suitable host. Vectors can be plasmids, phage particles, or simply potential genomic inserts. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vector, in the present invention “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably. However, the present invention includes other forms of vectors with equivalent functionality as are known or become known in the art. Typical expression vectors for mammalian cell culture expression are based for example on pRK5 (EP 307,247), pSV16B (WO 91/08291) and pVL1392 (Pharmingen).
상기 벡터는 "발현 조절 서열(expression control sequence)"을 포함할 수 있다. 상기 “발현 조절 서열”은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.The vector may include an “expression control sequence.” The “expression control sequence” refers to a DNA sequence essential for the expression of an operably linked coding sequence in a specific host organism. Such regulatory sequences include a promoter to effect transcription, optional operator sequences to regulate such transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosome binding sites, and sequences that regulate termination of transcription and translation. For example, suitable regulatory sequences for prokaryotes include a promoter, optionally an operator sequence and a ribosome binding site. Eukaryotic cells include promoters, polyadenylation signals, and enhancers. The factor that most affects the amount of gene expression in a plasmid is the promoter. As promoters for high expression, SRα promoter, cytomegalovirus-derived promoter, etc. are preferably used. To express the DNA sequence of the present invention, any of a wide variety of expression control sequences can be used in the vector. Examples of useful expression control sequences include, for example, the early and late promoters of SV40 or adenovirus, the lac system, the trp system, the TAC or TRC system, the T3 and T7 promoters, the main operator and promoter region of phage lambda, fd. The regulatory region of the code protein, the promoter for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, the promoters of said phosphatases, such as Pho5, the promoter of the yeast alpha-mating system and prokaryotic or eukaryotic cells or their viruses. Other sequences known to regulate the expression of genes and other sequences and combinations thereof are included. T7 RNA polymerase promoter Φ10 is. It can be usefully used to express proteins in E. coli.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한, 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인해서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다. A nucleic acid is “operably linked” when placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. This may be a gene and regulatory sequence(s) linked in a manner that allows gene expression when a suitable molecule (e.g., transcriptional activation protein) is bound to the regulatory sequence(s). operably linked to DNA, for example, to a pre-sequence or secreted leader peptide; A promoter or enhancer is operably linked to the coding sequence if it affects transcription of the sequence; or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence when it affects transcription of the sequence; Or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence when positioned to facilitate translation. Generally, “operably linked” means that the linked DNA sequences are in contact and, in the case of a secreted leader, in contact and within reading frame. However, the enhancer does not need to be touched. Linking of these sequences is accomplished by ligation at convenient restriction enzyme sites. If such a site does not exist, a synthetic oligonucleotide adapter or linker is used according to a conventional method.
본 발명에 있어서, "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.In the present invention, an “expression vector” is a recombinant carrier into which a heterogeneous DNA fragment is inserted, and generally refers to a double-stranded DNA fragment. Here, heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not naturally found in host cells. Once within the host cell, the expression vector can replicate independently of the host chromosomal DNA and several copies of the vector and its inserted (heterologous) DNA can be generated.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.As is well known in the art, to increase the level of expression of a transfected gene in a host cell, the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that are functional within the selected expression host. Preferably, the expression control sequence and the corresponding gene are contained in one expression vector that also contains a bacterial selection marker and a replication origin. If the expression host is a eukaryotic cell, the expression vector must further include an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
본 발명의 목적 단백질의 DNA 서열을 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adenoassociated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 예로써, 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.A wide variety of expression host/vector combinations can be used to express the DNA sequence of the target protein of the present invention. Expression vectors suitable for eukaryotic hosts include expression control sequences derived from, for example, SV40, bovine papillomavirus, anenovirus, adeno-associated virus, cytomegalovirus and retrovirus. Expression vectors that can be used in bacterial hosts include bacterial plasmids exemplified by those obtained in E. coli, such as pBluescript, pGEX2T, pUCvectors, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 and their derivatives, and wider host ranges such as RP4. plasmids with , phage DNA, which can be exemplified by a wide variety of phage lambda derivatives such as λgt10 and λgt11, NM989, and other DNA phages such as M13 and filamentous single-stranded DNA phages. By way of example, useful expression vectors for yeast cells are the 2μ plasmid and derivatives thereof. A useful vector for insect cells is pVL 941.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.The contents of the present invention described above are applied equally to each other unless they contradict each other, and implementation by a person skilled in the art with appropriate changes is also included in the scope of the present invention.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples, but the scope of the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1. 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 특이적 결합을 보이는 박테리오파지 후보군의 발굴Example 1. Discovery of bacteriophage candidates showing specific binding to influenza A virus H3N2 subtype
인플루엔자 A형 바이러스 특정 아형에 특이적인 펩타이드를 발굴하기 위하여, 먼저 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형(A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1)을 Sino biological사로부터 구입하였다. EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit(Thermo scientific사)를 사용하여 바이오틴화(biotinylation) 과정을 수행한 후 당 분야에 알려진 BCA 분석방법을 이용해 농도를 계산하였다. 그 후 당 분야에 알려진 HABA(4'-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid) 분석방법를 통해 상기 A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1 단백질에 라벨링된 바이오틴을 정량하였다. 그 후 실험에 사용하기 전까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다.In order to discover peptides specific to a specific subtype of influenza A virus, first, influenza A virus H3N2 subtype (A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1) was purchased from Sino biological. After performing a biotinylation process using the EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit (Thermo scientific), the concentration was calculated using a BCA analysis method known in the art. Afterwards, the biotin labeled on the A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1 protein was quantified using the HABA (4'-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid) analysis method known in the art. Afterwards, it was stored in a -20°C freezer until used in the experiment.
상기 바이러스를 이용하여 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형(A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1)에 대한 특이적인 펩타이드를 발굴하였다. 이를 위하여 총 4회의 패닝(panning)을 수행하였으며, 패닝에는 스트렙트아비딘(streptavidin)이 도포되어 있는 96웰 플레이트(Thermo scientific, Cat. No. 15501)를 사용하였다.Using the above virus, a specific peptide for influenza A virus H3N2 subtype (A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1) was discovered. For this purpose, panning was performed a total of four times, and a 96-well plate (Thermo scientific, Cat. No. 15501) coated with streptavidin was used for panning.
바이오틴이 결합된 A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1 단백질 500 nM(100 μL)와 M13 박테리오파지 랜덤 C7C-mer 또는 12-mer 펩타이드 라이브러리(New England BioLab) 각 1013 PFU/mL(1 μL)를 혼합한 후 1시간 동안 상온에서 반응시켜주었다. 반응 완료후 PBS(phosphate buffer saline)로 3회, 5분 동안 세척하고, 스트렙트아비딘이 도포된 96웰 플레이트로 옮겨서 10분 동안 펩타이드가 결합된 바이오틴이 달린 단백질을 고정시켰다. 이에 0.1 mM 비오틴을 넣고 5분동안 반응시켜주면서 스트렙트아비딘에 비특이적으로 결합된 M13 박테리오파지를 제거해주었다. 이 과정 후 결합력이 없는 박테리오파지는 200 μL의 PBST(0.1% Tween-20 포함)로 10번 반복 세척하여 제거하였다. 최종적으로 A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1에 특이적으로 결합하는 파지는 100 μL의 0.2M 글리신-HCl(Glycin-HCl (pH 2.2)) 용액을 이용해 용출하였고, pH의 중화(neutralization)를 위해 15 μL의 트리스-HCl(Tris-HCl (pH 9.1))을 첨가하였다. 상기와 동일한 과정으로 총 4회 반복실험을 통하여 A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1에 결합하는 박테리오파지들을 수득하였다. DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 각각의 아미노산 서열을 확인하였고, 그 중 반복적으로 결합하거나 비슷한 특징을 가지는 펩타이드를 각각 C7C-mer에서 9개, 12-mer에서 11개의 박테리오파지 후보군을 1차적으로 선별하여 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.500 nM (100 μL) of biotinylated A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1 protein and 10 13 PFU/mL (1 μL) each of M13 bacteriophage random C7C-mer or 12-mer peptide library (New England BioLab) ) were mixed and reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the plate was washed three times for 5 minutes with PBS (phosphate buffer saline), transferred to a 96-well plate coated with streptavidin, and the biotinylated protein bound to the peptide was fixed for 10 minutes. Then, 0.1 mM biotin was added and reacted for 5 minutes to remove M13 bacteriophage non-specifically bound to streptavidin. After this process, bacteriophages without binding force were removed by washing repeatedly 10 times with 200 μL of PBST (containing 0.1% Tween-20). Finally, the phage that specifically binds to A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1 was eluted using 100 μL of 0.2M Glycin-HCl (pH 2.2) solution and neutralized. ), 15 μL of Tris-HCl (pH 9.1) was added. Bacteriophages binding to A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1 were obtained through a total of 4 repeated experiments using the same process as above. Each amino acid sequence was confirmed through DNA sequencing, and among them, 9 bacteriophage candidates from C7C-mer and 11 from 12-mer were primarily selected for peptides that bind repeatedly or have similar characteristics, respectively. Shown in Table 1 and Table 2.
실시예 2. 박테리아파지 후보군의 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 대한 결합력 확인Example 2. Confirmation of binding ability of bacterial phage candidates to influenza A virus H3N2 subtype
상기 실시예 1을 통해 선별된 20개의 박테리오파지 후보군을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 분석에 이용하기 위해 각 파지의 증폭을 진행하였다. 파지 스톡(stock)을 미리 배양해둔 E.coli ER2738과 함께 20 mL LB 배지(Lysogeny broth medium)에 넣은 후 37℃에서 210rpm으로 4-5시간 동안 배양하였다. 배양된 박테리오파지 후보군을 12,000g 속도로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 회수한 후 20% PEG(Polyethylene Glycol)/2.5M NaCl을 상층액 용량의 6분의 1(3.3 mL)로 첨가하여 4℃에서 24시간 방치하였다. 이를 12,000g 속도로 15분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고, 이를 1 mL PBS에 녹인 후 다시 14,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 수득하였다. 그 후 상층액 용량의 6분의 1(약 166.7 μL)의 20 % PEG/2.5 M NaCl를 첨가한 후 1시간 동안 얼음에 방치하였다. 그 후 다시 14,000 rpm 속도로 10분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고, 이를 200 μL의 PBS에 녹인 후 당 분야에 알려진 방법에 따라 파지 적정(Titration)을 실시하여 파지의 농도(PFU(Plaque forming units)/mL)를 계산하였다.In order to use the 20 bacteriophage candidates selected through Example 1 in ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) analysis, amplification of each phage was performed. The phage stock was placed in 20 mL LB medium (Lysogeny broth medium) along with pre-cultured E. coli ER2738 and cultured at 37°C and 210 rpm for 4-5 hours. The cultured bacteriophage candidates were centrifuged at a speed of 12,000g for 10 minutes to recover the supernatant, then 20% PEG (Polyethylene Glycol)/2.5M NaCl was added to one-sixth (3.3 mL) of the supernatant volume and incubated at 4°C. was left for 24 hours. This was centrifuged at a speed of 12,000g for 15 minutes to obtain a precipitate, which was dissolved in 1 mL of PBS and centrifuged again at 14,000 rpm for 5 minutes to obtain a supernatant. Afterwards, one-sixth of the volume of the supernatant (approximately 166.7 μL) of 20% PEG/2.5 M NaCl was added and left on ice for 1 hour. Afterwards, centrifugation was performed at 14,000 rpm for 10 minutes to obtain a precipitate, which was dissolved in 200 μL of PBS and phage titration was performed according to a method known in the art to determine the phage concentration (PFU (Plaque forming units). )/mL) was calculated.
선별된 파지와 2가지 목적 단백질(BSA(Bovine serum albumin) 또는 H3N2 단백질)의 결합력을 비교하기 위하여 다음과 같이 ELISA를 진행하였다. 먼저 바이오틴화된 목적 단백질(H3N2/HA1)과 바이오틴화된 BSA 각 100 μL(농도: 250 nM)를 스트렙트아비딘이 코팅되어 있는 96웰 플레이트에 넣어주고, 상온에서 1시간 동안 고정한 후 5% BSA로 상온에서 1시간 블로킹(blocking)을 해주었다. 그 후 PBST로 6번 세척하고 100 μL의 파지 후보군들(농도: 5×1011 PFU/mL)을 단백질들이 고정된 평판에 넣고 상온에 200 rpm으로 교반하며 1시간 동안 결합시켰다. 단백질과 파지의 반응 후 PBST로 6번 세척하고 anti M13-HRP 항체(5% BSA를 포함하는 NaHCO3를 이용해 1 : 5000으로 희석)를 200 μL 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후 PBST로 6번 세척한 후, TMB(3,3´, 5,5´-tetramethylbenzidine)를 이용하여 발색시킨 후, 450nm에서 흡광도(OD)값을 측정하였다. To compare the binding affinity between the selected phage and two target proteins (BSA (Bovine serum albumin) or H3N2 protein), ELISA was performed as follows. First, 100 μL each of biotinylated target protein (H3N2/HA1) and biotinylated BSA (concentration: 250 nM) were added to a 96-well plate coated with streptavidin, fixed for 1 hour at room temperature, and then added with 5% BSA. Blocking was performed at room temperature for 1 hour. After washing six times with PBST, 100 μL of phage candidates (concentration: 5 × 10 11 PFU/mL) were added to the protein-immobilized plate and stirred at 200 rpm at room temperature for 1 hour. After the reaction between protein and phage, the mixture was washed six times with PBST, and 200 μL of anti-M13-HRP antibody (diluted 1:5000 with NaHCO 3 containing 5% BSA) was added and stirred at room temperature for 1 hour. After washing six times with PBST, color was developed using TMB (3,3´, 5,5´-tetramethylbenzidine), and the absorbance (OD) value was measured at 450 nm.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, C7C-mer library에서 수득된 박테리아파지 후보군중 C7C-mer 2R-17 파지(서열번호 1)가 A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1에 대해 가장 높은 결합력을 보였고, BSA에는 상대적으로 낮은 결합력을 보임을 확인하였다. 더불어 도 2에 나타낸 바와 같이, 12-mer library에서 수득된 박테리아 파지 후보군 중 12-mer 3R-12(서열번호 11), 12-mer 3R-21(서열번호 12), 12-mer 4R-30 파지(서열번호 20)가 A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1에 대해 가장 높은 결합력을 보였고, BSA에는 상대적으로 낮은 결합력을 보임을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 1, among the bacterial phage candidates obtained from the C7C-mer library, C7C-mer 2R-17 phage (SEQ ID NO: 1) had the highest binding affinity to A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1. It was confirmed that it showed relatively low binding force to BSA. In addition, as shown in Figure 2, among the bacterial phage candidates obtained from the 12-mer library, 12-mer 3R-12 (SEQ ID NO: 11), 12-mer 3R-21 (SEQ ID NO: 12), and 12-mer 4R-30 phage It was confirmed that (SEQ ID NO: 20) showed the highest binding affinity to A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1, and showed relatively low binding affinity to BSA.
실시예 3. 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 특이적 결합을 보이는 신규 펩타이드 후보군 합성Example 3. Synthesis of new peptide candidates showing specific binding to influenza A virus H3N2 subtype
더불어 4개의 펩타이드를 합성하여 하기 표 3에 나타내었다. 이를 금 전극에 고정하기에 앞서 “클릭 화학(click chemistry)“의 원리를 적용하기 위하여, 각 펩타이드의 C-말단에 아지도아세트산(Azidoacetic acid)을 결합시켰다. 먼저, 상기 표 2의 12-mer 3R-12(YTFPNFLNLSFL, 서열번호 11)를 기반으로 -GGGSK- 서열을 추가하여 H3 BP1 펩타이드를 디자인하였다. -이를 기본 스케폴드(scaffold)로 활용하여 H3 BP2, BP3, BP4 펩타이드를 디자인하여 제작하였으며, 특히 상기 펩타이드들은 친수성(hydrophilicity), 소수성(hydrophobicity)을 지니게 하기 위하여 각 아미노산 조성을 치환시키는 전략을 통해서 합성하였다. 또한, 금 표면에 고정화되었을때 타겟물질과의 인지(recognition)와 결합(binding)이 보다 용이하게 이루어질 수 있도록, 펩타이드 분자의 유연성(flexibility)을 높이기 위하여 -GGGS- 서열이 반복되도록 제작하였다. 하기 표 3에 기재된 총 4가지의 펩타이드 합성은 Peptron 사(대전)에 의뢰하여 제작하였다.In addition, four peptides were synthesized and shown in Table 3 below. Before fixing this to the gold electrode, azidoacetic acid was bound to the C-terminus of each peptide to apply the principle of “click chemistry.” First, the H3 BP1 peptide was designed by adding the -GGGSK- sequence based on the 12-mer 3R-12 (YTFPNFLNLSFL, SEQ ID NO: 11) in Table 2 above. -Using this as a basic scaffold, H3 BP2, BP3, and BP4 peptides were designed and produced. In particular, the peptides were synthesized through a strategy of substituting each amino acid composition to have hydrophilicity and hydrophobicity. did. In addition, the -GGGS- sequence was designed to be repeated to increase the flexibility of the peptide molecule so that recognition and binding with the target material can be made easier when immobilized on the gold surface. The synthesis of a total of four peptides listed in Table 3 below was produced by requesting Peptron (Daejeon).
실시예 4. 순환전압전류법(Cyclic Voltammetry)을 이용한 합성된 신규 펩타이드 후보군의 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 대한 결합력 측정Example 4. Measurement of binding affinity of synthesized new peptide candidates to influenza A virus H3N2 subtype using cyclic voltammetry
상기 실시예 3의 펩타이드를 금 전극에 고정한 후, 순환전압전류법(Cyclic Voltammetry, CV)을 이용하여 A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1에 대한 결합력을 확인하였다.After the peptide of Example 3 was fixed to a gold electrode, its binding ability to A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1 was confirmed using cyclic voltammetry (CV).
상기 실시예 3의 펩타이드를 금 전극에 고정하기 위해 과산화수소(H2O2)와 황산(H2SO4)을 3:7(부피비율)로 혼합한 피라냐 용액(piranha solution)을 이용하여 금 전극의 불순물을 제거하였다. 1%(w/v) 수산화칼륨(KOH) 용액에 10분동안 처리하였고, 2%(v/v) APTES(3-Aminopropyl)triethoxysilane) 용액에 80℃에서 1시간동안 담가 두었다. 그 후 이를 증류수로 6회 세척한 후 0.1 mM DBCO(dibenzocyclooctyne)-sulfo-NHS를 2시간동안 상온에 처리하여 DBCO가 전극 표면에 드러나도록 하였다. 이에 0.1 mM의 각 펩타이드를 상온에서 1시간동안 처리하여, 도 3에 나타낸 바와 같이, 전극의 DBCO와 각 펩타이드의 아지도아세트산이 클릭 화학 반응을 일으키도록 하였으며, 이를 통해 전극 표면에 펩타이드를 고정시켰다. 이후 A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1 단백질(농도: 250 nM) 또는 대조군인 BSA를 각 펩타이드가 고정된 전극에 처리하여 CV으로 각각에 대한 결합력을 측정하였다. 그 결과 도 4와 같이, 상기 표 3에 기재된 4종의 펩타이드 중 H3 BP4(서열번호 24)가 A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1에 대해 가장 높은 결합력을 보임을 확인하였다.In order to fix the peptide of Example 3 to the gold electrode, a piranha solution containing hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and sulfuric acid (H 2 SO 4 ) mixed in a 3:7 (volume ratio) was used to attach the peptide to the gold electrode. Impurities were removed. It was treated in a 1% (w/v) potassium hydroxide (KOH) solution for 10 minutes, and then soaked in a 2% (v/v) APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane) solution at 80°C for 1 hour. Afterwards, it was washed six times with distilled water and then treated with 0.1 mM DBCO (dibenzocyclooctyne)-sulfo-NHS at room temperature for 2 hours to expose DBCO on the electrode surface. Accordingly, 0.1 mM of each peptide was treated at room temperature for 1 hour to cause a click chemical reaction between DBCO of the electrode and azidoacetic acid of each peptide, as shown in Figure 3, and through this, the peptide was fixed to the electrode surface. . Afterwards, A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1 protein (concentration: 250 nM) or BSA as a control was treated with the electrode on which each peptide was immobilized, and the binding force for each was measured by CV. As a result, as shown in Figure 4, it was confirmed that among the four peptides listed in Table 3, H3 BP4 (SEQ ID NO: 24) showed the highest binding affinity to A/H3N2/Hong Kong/4801/2014/HA1.
종합적으로, 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 본 발명의 펩타이드는 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형에 대해 높은 특이성을 보이는 바, 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형을 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였다.Overall, it was confirmed that the peptide of the present invention discovered using bacteriophage display screening shows high specificity for the influenza A virus H3N2 subtype, and can accurately detect the influenza A virus H3N2 subtype.
서열목록 전자파일 첨부Sequence list electronic file attached
Claims (15)
A peptide for detecting influenza A virus, comprising part or the entire sequence of an amino acid sequence represented by any one sequence number selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 24 .
상기 인플루엔자 A형 바이러스는 인플루엔자 A형 바이러스 H3N2 아형인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
According to clause 1,
A peptide, wherein the influenza A virus is an influenza A virus H3N2 subtype.
상기 펩타이드는 인플루엔자 A형 바이러스의 적혈구 응집소(Hemagglutinin, HA)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
According to clause 1,
The peptide is characterized in that it specifically binds to hemagglutinin (HA) of the influenza A virus.
상기 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
According to clause 1,
A peptide, characterized in that the peptide is a dimer, trimer, or multimer.
상기 펩타이드는 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
According to clause 1,
The peptide is characterized in that it is labeled with one selected from the group consisting of a chromogenic enzyme, a radioisotope, a chromophore, a luminescent substance, and a fluorescent substance.
A composition for detecting influenza A virus, comprising the peptide according to any one of claims 1 to 5.
상기 검출용 조성물은 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
According to clause 6,
The detection composition further contains at least one selected from the group consisting of a peptide consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, a peptide consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, and a peptide consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23. A composition for detection, characterized in that it contains.
A kit for detecting influenza A virus, comprising the peptide according to any one of claims 1 to 5.
A biochip for detecting influenza A virus, comprising the peptide according to any one of claims 1 to 5.
Treating a sample with the peptide according to any one of claims 1 to 5; And detecting the reaction between the peptide and the sample. A method for detecting influenza A virus.
상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(cyclic voltammetry), 사각파전압전류법(square wave voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법(electrochemical impedance spectroscopy), 수정 진동자 마이크로밸런스(quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance), LFA(lateral flow assay)/VFA(variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(enzyme-linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(surface-enhanced raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
According to clause 10,
Detection of the reaction can be performed using cyclic voltammetry, square wave voltammetry, electrochemical impedance spectroscopy, quartz crystal microbalance, and surface plasmon resonance ( surface plasmon resonance, lateral flow assay (LFA)/variable flip angle (VFA), enzyme-linked immunoassay, fluorescence resonance energy transfer, and surface-enhanced Raman spectroscopy. A method characterized in that it is performed by one or more methods selected from the group consisting of spectroscopy.
A composition for diagnosing influenza A virus infection disease comprising the peptide according to any one of claims 1 to 5.
A method of providing information on the diagnosis of influenza A virus infection, comprising: treating a sample with the peptide according to any one of claims 1 to 5.
A polynucleotide encoding a peptide for detecting influenza A virus according to claim 1.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240094184A true KR20240094184A (en) | 2024-06-25 |
Family
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