KR20240093455A - 핵산 증폭 방법 및 장치, 및 핵산 검출 방법 및 장치 - Google Patents
핵산 증폭 방법 및 장치, 및 핵산 검출 방법 및 장치 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240093455A KR20240093455A KR1020247008028A KR20247008028A KR20240093455A KR 20240093455 A KR20240093455 A KR 20240093455A KR 1020247008028 A KR1020247008028 A KR 1020247008028A KR 20247008028 A KR20247008028 A KR 20247008028A KR 20240093455 A KR20240093455 A KR 20240093455A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid amplification
- solid
- solid carrier
- amplicon
- Prior art date
Links
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 284
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 277
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 272
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 272
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 89
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 261
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 172
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims abstract description 141
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 132
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 131
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 93
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 83
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 81
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 77
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims abstract description 68
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 49
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims abstract description 38
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 68
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 55
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 51
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 39
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 26
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 26
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 18
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 17
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000000157 electrochemical-induced impedance spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 4
- 238000003380 quartz crystal microbalance Methods 0.000 claims description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 claims description 3
- 230000005279 excitation period Effects 0.000 claims description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 130
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 118
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 72
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 63
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 43
- 238000004497 NIR spectroscopy Methods 0.000 description 38
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 34
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 33
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 31
- 230000008569 process Effects 0.000 description 26
- 101150039085 malB gene Proteins 0.000 description 24
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 21
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 20
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 19
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000002078 nanoshell Substances 0.000 description 16
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 13
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 13
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 11
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 8
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 7
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 7
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 7
- 101150012518 lamB gene Proteins 0.000 description 7
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 6
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000005485 electric heating Methods 0.000 description 5
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 description 5
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 5
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 5
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 4
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007769 metal material Substances 0.000 description 4
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000010897 surface acoustic wave method Methods 0.000 description 4
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 3
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 3
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical group OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 2
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 2
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000005674 electromagnetic induction Effects 0.000 description 2
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3] WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 2
- 239000007777 multifunctional material Substances 0.000 description 2
- 239000002091 nanocage Substances 0.000 description 2
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 229910052596 spinel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011029 spinel Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910020599 Co 3 O 4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910018920 CoO(OH) Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940127399 DNA Polymerase Inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 206010020843 Hyperthermia Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241001508003 Mycobacterium abscessus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 241001455273 Tetrapoda Species 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 229910001566 austenite Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 average size Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- IVMYJDGYRUAWML-UHFFFAOYSA-N cobalt(II) oxide Inorganic materials [Co]=O IVMYJDGYRUAWML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007739 conversion coating Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000017525 heat dissipation Effects 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEIXRCIKZIZYPM-UHFFFAOYSA-M hydroxy(oxo)iron Chemical compound [O][Fe]O AEIXRCIKZIZYPM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000036031 hyperthermia Effects 0.000 description 1
- 238000003312 immunocapture Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N iron oxide Inorganic materials [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021519 iron(III) oxide-hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 229940031182 nanoparticles iron oxide Drugs 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000128 polypyrrole Polymers 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 239000010970 precious metal Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001931 thermography Methods 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
- B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/101—Temperature
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/001—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature by chemical synthesis
- G01N2333/003—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature by chemical synthesis of Peptide-nucleic acids (PNAs)
Abstract
본 발명은 핵산 증폭 방법 및 장치, 핵산 검출 방법 및 장치에 관한 것이다. 핵산 증폭 장치는 반응 유닛, 에너지 여기 유닛, 작동 유닛, 및 보조 냉각 유닛를 포함하고; 반응 유닛은 검출하고자 하는 표적 분석물, 하나 또는 그 이상의 고상 캐리어, 및 핵산 증폭 반응 용액을 포함하고; 각각의 고상 캐리어는 기능화된 특정 표면 리간드를 갖고 있어 검출하려는 표적 분석물의 정제, 분리 및 핵산 증폭 반응을 제공하고, 에너지 여기 유닛의 에너지 아웃풋과 활성화/비활성화 타임 서열은 반응 온도(열) 사이클을 생성하도록 제어됨으로써, 사이클 동안 각 고상 캐리어 주위에 인-시츄 환경이 형성되고, 인-시츄 핵산 증폭 반응은 인-시츄 환경에서 수행되어 앰플리콘을 생성하도록 수행된다.
Description
관련 출원에 대한 참조
본원은 2021년 12월 29일 제출된 국제출원번호 PCT/CN2021/142714에 기초하고, 이로부터 우선권을 주장하고, 그 개시 내용은 그 전체가 참조로 본원에 통합된다.
본원은 핵산 증폭 방법 및 그 장치, 및 핵산 검출 방법 및 그 장치에 관한 것으로, 특히 인-시츄 환경 주위의 고상 캐리어를 형성하고 인-시츄 환경에서 핵산 증폭을 수행하는 방법 및 장치, 및 인-시츄 핵산 증폭의 완료 후 핵산 검출을 수행하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
핵산 증폭 테스트(NAAT; Nucleic acid amplification test)는 감염성 병원체 진단, 유전자 검사, 법과학, 농업, 임상의학 등 분자진단에 널리 응용되어 왔다. 분석물에 미량의 표적 물질만 존재하더라도, 핵산 증폭 테스트는 표적 핵산 단편의 증폭으로 인한 높은 민감도와 특이도를 나타낸다. 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction; PCR)은 표적 핵산 증폭 테스트에 사용되는 방법 중 하나이다. 그것은 새로운 디옥시리보핵산(DNA) 가닥을 생성하는 세 개의 단계를 포함함: (a) 온도를 증가시킴으로써 이중-가닥 DNA를 단일-가닥 DNA(ssDNA)로 변성시킴; (b) 온도를 용융 온도 범위까지 저하시킴으로써 DNA 상보적 서열을 통해 특정 프라이머를 ssDNA 주형에 어닐링함; (c) 열에 안정한 DNA 중합효소의 확장을 통해 새로운 DNA 가닥이 합성됨. 상술한 내용은 2 내지 3개의 온도 범위를 갖는 PCR의 열 사이클이다. 열 사이클의 횟수가 증가함에 따라, 신규 합성된 앰플리콘도 기하급수적으로 생성된다. 그러나, 종래 PCR 기기는 부피가 크고, 가격이 비싸며, 에너지 소비가 높고(전기 가열 모듈 사용), 처리 시간이 길다(보통 1시간 이상).
또한, 등온 핵산 증폭 기술(iNAATs)은 종래의 핵산 증폭 기술(NAATs)을 대체하기 위해 개발되었고, 일정하고 상대적으로 적당한 온도에서 핵산 증폭이 가능하다. 종래 NAATs와 비교하여 iNAATs는 온도 관리 제어(예: 열 사이클, 열 블록의 급속 가열 및 냉각의 설정)의 복잡성, 관련 복합 장치, 및 핵산 증폭에 필요한 전체 동작 시간을 대폭 감소시킨다. 복합 온도 관리 제어의 부재로 인해, iNAATs는 단순 도구(예: 히팅 플레이트, 오븐, 또는 수조)를 사용함으로써 수행될 수 있다. 다양한 iNAAT 방법/기술 중에서, 루프-매개 등온 증폭(LAMP)은 가장 널리 채택되는 방법으로, 이는 주로 LAMP가 DNA 중합효소 억제제(예: 헤모글로빈, IgG 또는 IgM)에 대해 우수한 내성을 갖고 있기 때문이고, 또한, LAMP는 높은 특이성, 높은 민감도 및 높은 증폭 효율을 갖는다. 이는 LAMP가 부분적으로 처리되었거나 미처리된 생물학적 시료에서 표적 DNA 또는 RNA를 직접 증폭할 수 있는 가능성이 있음을 의미한다.
또한, "Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-review and classification of methods for sequence-specific detection"(2020년 2월 14일 Analytical Methods에 게재, Lisa Becherer, Nadine Borst, Mohammed Bakheit, Sieghard Frischmann, Roland Zengerle 및 Felix von Stetten 작성) 명칭의 문헌은 LAMP가 종래의 정량적 PCR(qPCR) 또는 PCR에 비해 10 내지 100배 향상된 감도를 보인다고 제안했다.
또한 “Reduced False Positives and Improved Reporting of Loop-Mediated Isothermal Amplification using Quenched Fluorescent Primers"(2019년 5월 14일 Scientific Reports에 게재되고, Patrick Hardinge 및 James A. H. Murray에 의해 작성) 명칭의 문헌은 LAMP 반응에서는 4 내지 6개의 표적-특이적 프라이머를 사용하기 때문에 2개의 프라이머만 사용하는 종래 PCR에 비해 LAMP의 특이성이 더 우수할 것으로 예상된다고 언급했다. 또한, LAMP는 1시간 내에 109 이상의 DNA 앰플리콘을 생성할 수 있다. 표적 분석물의 존재는 풍부하게 증폭된 DNA 앰플리콘 또는 LAMP의 부산물을 직접 또는 간접적으로 검출하여 확인할 수 있다. 그러나 높은 위양성률과 낮은 차별성으로 인해, LAMP-기반 현장-진료 테스트의 적용은 더욱 제한된다.
종래의 PCR 플랫폼은 주로 열전 소자(예: 펠티에 소자)를 사용하여 프로그래밍된 가열 및 냉각 프로세스를 수행하여 PCR에 필요한 열 사이클을 달성한다. 이 방법은 열전도에만 의존하여 열전소자 및 반응 용액 사이에 열에너지를 전달여, 상대적으로 느린 가열 및 냉각 속도(1.5 내지 3°C/초)로 인해, 결과적으로 전체 PCR 절차의 처리 시간의 지연을 야기한다. ¨Emerging ultrafast nucleic acid amplification technologies for next-generation molecular diagnostics"(2019년 6월 18일 Biosensors and Bioelectronics에 게재됨, by Sang Hun Lee, Seung-Min Park, Brian N. Kim, Oh Seok Kwon, Won-Yep Rho, Bong-Hyun Jun) 명칭의 문헌은 빠른 열 사이클, 낮은 열용량 소재, 높은 열 전도성, 및 고속 DNA 중합효소를 포함하는 초고속 PCR을 달성하기 위한 핵심 요소를 제시한다. 직접적인 분자 진화에 대한 단백질 공학 기술의 발전으로, 고연장률의 2세대 DNA 중합효소(예: KAPA2G, KAPA Biosystems)가 선별되었다. 그것의 연장률은 최대 1kb/초에 도달할 수 있어, PCR 반응에 필요한 시간을 상당히 단축한다. 과거에는, 빠른 열 사이클을 달성하기 위해, PCR 반응량이 모세관이나 미세 유체 칩에서 나노리터 내지 마이크로리터(nL-μL)로 제한되었는데, 증가된 표면적 대 부피 비율은 열 블록 및 PCR 반응 사이의 열 전도 효과를 향상시킨다[예: LightCycler® 2.0 Carousel 기반 시스템(Roche Diagnostics) 또는 미세유체 중합효소 연쇄 반응이 사용됨]. 또한, 열 용량이 낮은 재료는 열 사이클에서 가열 및 냉각을 수행하는 데 활용된다[예: LightCycler® 2.0 캐러셀 기반 시스템(Roche Diagnostics)에서는 공기가 활용됨]. 전체 핵산 증폭은 몇 분 내에 완료될 수 있지만, 여러가지 기술적 문제를 여전히 수반하며, 이는 낮은 앰플리콘 수율, 작은 반응량에서의 증발 및 기포 생성, 플랫폼 확장성 및 열 제어 관리를 포함한다. 따라서 신속한 핵산 증폭/검출은 빠른 열 사이클을 달성하는 것뿐만 아니라, 빠른 온도 사이클을 달성하는 동안 부정적인 영향을 받지 않도록 보장하는 핵산 증폭 전략이다.
전술한 문제들에 대해 많은 연구팀이 연구를 진행하고 개선해 왔다. 예를 들어, McGill University 왕립 학습 발전 기관은 공개 번호 US10,604,798B2의 미국 특허를 보유하고 있다(명칭: "HEATING MECHANISM FOR DNA AMPLIFICATION, EXTRACTION, OR STERILIZATION USING PHOTO-THERMAL NANOPARTICLES"). 해당 요약에는 광열 나노 입자가 외부 광원의 조명 하에서 접촉 및 비접촉 방식으로 PCR 용액을 가열하는 데 사용됨을 개시한다. 다양한 광열 변환 온도 범위는 다양한 강도의 외부 에너지로 나노 입자를 여기시킴으로써 달성되고, 핵산 추출을 위한 멸균, 광열 용해 및 특정 핵산 단편의 증폭이 가능하다. 예를 들어, 캘리포니아 대학교 Regents는 공개 번호 US11,130,993B2("LED DRIVEN PLASMONIC HEATING APPARATUS FOR NUCLEIC ACIDS AMPLIFICATION"라는 명칭)의 미국 특허를 보유하고 있다. 해당 요약은 특정 파장의 발광 다이오드(LED)에 의해 특정 두께의 금 필름을 갖는 3D 소형 반응 챔버에서 생성된 플라즈몬 가열함으로써, LED 조명 조작 하에서 PCR에 대한 빠른 열 사이클이 달성됨을 개시한다. 예를 들어, 시카고 대학은 공개 번호 US11,045,874B2("BIPYRAMID-TEMPLATED SYNTHESIS OF MONODISPERSE NOBLE METAL NANOCRYSTALS"라는 명칭)의 미국 특허를 보유하고 있다. 이중 피라미드 구조로 합성된 금 나노 입자를 사용함으로써, 특정 파장의 LED 조명 아래에서 플라즈몬 가열이 생성하여, 소형 반응 챔버에서 PCR에 필요한 빠른 열 사이클이 가능하다. 위에서 언급한 방법은 귀금속 재료 및 특정 구성을 가진 나노 입자를 사용하여 특정 광원의 여기 하에서 국부적인 표면 플라즈몬 공명(LSPR) 효과를 통해 빛 에너지를 열 에너지(반응 시간 > 100피코초)로 변환한다. 광열변환 특성은 빠르고 즉각적인 반응이라고 볼 수 있다. 플라즈몬 나노스케일 히터의 개념은 빠른 가열 속도를 나타내며, PCR 열 사이클 중에 균일한 열장을 생성한다. 이러한 나노 입자의 농도와 입사광의 강도를 조절함으로써 광열변환 온도의 조작을 쉽게 제어할 수 있다. 그러나 위에서 언급한 방법에는 여전히 극복해야 할 몇 가지 과제와 문제가 있으며, 그 내용은 다음과 같다: (1) 소형 반응 챔버에서의 액체 증발, (2) 플라즈몬 나노 입자의 냉각 효과는 열 사이클 중에 명확하지 않으므로 냉각을 달성하기 위해 외부 장치(예: 냉각 팬)를 사용해야 함, (3) 플라즈몬 나노 입자의 국부적인 표면 플라즈몬 공명을 위한 입사 광원 및 특정 유기 형광 염료의 스펙트럼 사이에 파장 범위가 겹칠 가능성이 존재하며, 이는 형광 기반 정량 PCR에의 적용을 제한할 수 있음.
앞서 언급한 플라즈몬 나노 입자를 이용한 광열가열 방법 외에, 교번 자기장을 인가하여 자기 나노 입자에 열을 유도하는 또 다른 방법도 PCR 핵산 증폭 기술에 채용되고 있다. 예를 들어, National Cheng Kung University의 Dr. Shieh, Dar-Bin이 이끄는 팀은 공개 번호 US10,913,069B2("METHOD AND DEVICE FOR POLYMERASE CHAIN REACTION "라는 명칭)의 미국 특허를 보유하고 있다. 그 청구범위는 대략 200 kHz ~ 500 THz 범위의 주파수를 갖는 전자기 방사선(EMR) 하에서 반응 유닛에 표적 핵산을 함유하는 반응 혼합물과 전이 금속 물질을 함유하는 입자를 포함하는 핵산 증폭 방법을 언급한다. 전이금속 물질의 입자에 의해 발생된 유도열은 PCR 증폭에 사용된다. BMS(Bio Molecular Systems)에서 생산한 Mic qPCR로 알려진 유사한 상용 장치는 전자기 유도 가열을 열원으로 사용하는 세계 최초의 qPCR 기계이다.
광열 나노 입자 또는 자기 나노 입자를 사용하는 가열 방법, 또는 전기 가열 요소를 사용하여 PCR 용액을 가열하는 종래의 PCR과 같은 가열 방법은, 모두 "체적 가열"(즉, 가열을 통해 전체 반응 혼합물의 온도를 증가시키는 것) 범주에 속한다.
이에 반해, GNA Biosolutions(GmbH)는 초고속 PCR을 달성하기 위해 독자적인 PCA(Pulse Controlled Amplification)를 개발했다. ¨Ultra-fast PCR technologies for point-of-care testing" 명칭의 문헌(2017년 10월 12일 Journal of Laboratory Medicine에 게재, Lars Ullerich, Stephanie Campbell, Frank Krieg-Schneider, Federico Bursgens 및 Joachim Stehr 공저) 및 공개 번호 US9,382,583B2의 미국 특허(명칭: "Method for the amplification of nucleic acids using heat transfer for nanoparticles"; 관련 특허 출원: DE102012201475B4, CN107604052A, EP2809806B1, WO2013113910A1)에 따르면, 이번 펄스제어 핵산 증폭 기술은 특정 부위의 '국부적 가열'을 제어하는 기술임이 개시된다. 이 기술은 광열변환 특성을 지닌 프라이머-기능화된 나노 입자, 레이저 광원, 냉각용 대용량 반응액을 통합한다. 단사이클 레이저 펄스(10나노 초 내지 500밀리 초 범위의 레이저 펄스 사이의 시간 인터벌)를 사용하여 특정 금 나노 입자를 선택적으로 조사함으로써, PCR에 필요한 특정 열방사장이 생성되며, 이 방법에 의해 열방사장이 빠르게 생성되고 소산된다. 더욱이, 이 접근법은 레이저 조사 시 금 나노 입자 표면 영역의 미세 환경만 효과적으로 가열했다. 나노 입자에 대한 레이저 조사가 중지되면, 플라즈몬 나노 입자의 높은 표면적 대 부피 비율로 인해, 나노 입자 주변의 광열 유도 열장은 빠르게 소산되고 주변 핵산 증폭 용액의 온도까지 냉각된다. PCA 과정(즉, 연속적이고 반복적인 열 사이클링) 동안, 나노 입자 주위 핵산 증폭 용액의 온도는 거의 변하지 않는다. 상술한 바와 같이, PCA 기술을 사용하면 PCR이 나노 입자의 미세 환경 주변에서 빠른 열 사이클을 달성할 수 있다. 이 기술은 앞서 언급한 "체적 가열"(후속 감지 작업의 정확성에 영향을 미칠 수 있음)로 인해 발생할 수 있는 반응 용액 증발 문제를 크게 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 종래 핵산 증폭 공정(예: PCR)에서 특수하고 정밀한 냉각 장치(예: 냉각 팬 및 온도 피드백 제어 시스템 사용)에 대한 요구 사항도 줄어든다. 그럼에도 불구하고 여전히 고려해야 할 단점이 있으며, 이에 대해서는 다음 단락에서 자세히 논의한다.
또한, 전술한 "펄스 제어 증폭"을 이용하여 "국부적 가열"을 달성하는 현상에 대하여, 이 기술은 "광열 입자"를 사용하여 "국부적 가열"을 달성할 수 있을 뿐만 아니라, "국부적 가열" 현상을 생성하기 위해 다른 원리나 메커니즘을 사용한다. GNA Biosolutions는 공개 번호 EP3733292A1의 유럽 특허(명칭: "METHOD FOR CARRYING OUT A POLYMERASE CHAIN REACTION AND DEVICE FOR CARRYING OUT THE METHOD"; 관련 출원: US2019/0249168A1) 및 "펄스 제어 증폭 - 자원이 제한된 조건에서 현장 진단을 위한 새로운 강력한 도구"라는 명칭의 문헌(2021년 1월 29일 PLOS NEGLECTED TROPICAL DISEASES에 게시, Katharina Muller, Sarah Daßen, Scott Holowachuk, Katrin Zwirglmaier, , Joachim Stehr, Federico Buersgens, Lars Ullerich, Kilian Stoecker)를 보유하고 있다. 이는 PCA 증폭이 신속 에너지 펄스를 사용함으로써 달성되어 마이크로사이클러(핵산 증폭 반응 용기에 직접 내장된 마이크로 금속 발열체)를 가열함을 개시한다. 마이크로초 사이클의 전기 가열을 적용함으로써, 순간적으로 발생하는 방열장은 초소형 금속 발열체의 표면적(설계된 핵산 증폭 반응 영역)에서만 발생한다. 전기 펄스가 중단되면, 금속 발열체의 열은 주변의 대용량 반응 용액에 의해 빠르게 소산되고 냉각된다. 앞서 언급한 온도장의 반복적인 제어와 생성을 통해, 이 설계는 핵산 증폭 반응(예: PCR)에 필요한 온도 사이클의 신속 생성을 가능케 하고, 이를 통해 빠른 핵산 증폭의 목적을 달성한다.
GNA Biosolutions는 앞서 언급한 선행 특허 및 문헌을 바탕으로 초고속 핵산 증폭(예: PCR)과 후속 핵산 검출을 달성하는 독특한 "PCA(Pulse-Controlled Amplification)"를 개발했다. 이 기술은 종래 PCR에서 "체적 가열"로 인해 발생하는 반응 용액 증발 문제를 크게 개선할 수 있으며 종래 핵산 증폭 공정에서 특수 냉각 설계 또는 장치에 대한 요구 사항을 줄여준다.
그러나 PCA 기술은 주로 PCR의 반응 영역 내에서 레이저 조명 빔의 상대적 위치를 동적으로 제어하므로, 고출력 NIR 레이저 빔이 플라즈몬 나노 입자를 트리거링하여 10나노 초에서 500밀리 초에 이르는 매우 짧은 시간 인터벌로 레이저 조명을 사용하여 PCR의 반응 영역 내에서 광열 효과를 생성할 수 있다. PCR의 반응영역 내 플라즈몬 나노 입자의 일부를 선택적이고 특이적으로 조사함으로써, 위에서 언급한 대로 핵산 증폭을 수행하는 데 필요한 온도 필드가 생성된다. 기본적으로 PCA 기술을 수행하는 데에는 기술적 어려움이 있다. 또한 PCA 기술에서 냉각 목적으로 사용되는 PCR 용액의 부피는 상대적으로 크다(예: 100-500 μL). PCA 기술에서는 PCR 용액 내에서 핵산 산물(예: 앰플리콘)이 단일 가닥 DNA(ssDNA) 형태로 생성되기 때문이다. 공개 번호 EP2481817A1(명칭: "Process for detecting nucleic acids")의 유럽 특허에 기술된 바와 같은 앰플리콘의 검출 방법, 공개 번호 EP3733292A1의 유럽 특허 및 M
ller et al. (2020), 은 (프라이머 기능화된) 플라즈몬 나노 입자에 의해 생성된 폴리머(예: 증폭된 자유 단일 가닥 DNA)를 검출함으로써 달성되고, 650 nm 파장에서의 스펙트럼 차이 또는 TaqMan 프로브에 의해 생성된 형광 신호를 기반으로 한다. 전술한 핵산 검출 방법에서는 희석 효과(예를 들어, 대량의 PCR 용액(100-500μL))로 인해, PCA 기술은 앰플리콘의 신호를 축적하기 위해 더 많은 핵산 증폭 열사이클을 수행해야 할 필요성을 야기한다. 이러한 단점은 핵산 증폭 및 검출에 필요한 총 처리 시간에도 영향을 미친다.
또한, GNA Biosolutions의 선행특허에 따르면, PCA 핵산 증폭 방법 및 장치에는 여전히 개선이 필요한 많은 측면이 있으며, 다음과 같이 요약된다.
1. 국부 가열: 단분산된 광열 나노 입자를 대량의 PCR 용액에 통합함으로써, PCA 기술은 "초고속 온도(열) 사이클링”을 통해 "초고속 핵산 증폭”을 가능하게 하고, 초고속 핵산 증폭의 전반적인 과정에서, PCR 용액의 온도에는 큰 변화가 없다. 이러한 기술적 특성은 종래 고속 핵산 증폭 기술의 온도(열) 사이클링 과정에서 미량의 PCR 용액이 증발하는 문제(예: 검출 정확도)를 개선할 수 있다. 그러나 이 기술은 주로 레이저 빔의 상대적 위치와 PCR 반응 내 조명 영역의 동적 제어에 의존한다. 고출력 NIR 레이저 빔이 플라즈몬 나노 입자를 트리거링하여 10나노 초에서 500밀리 초에 이르는 매우 짧은 시간 인터벌로 레이저 조명을 사용하여 PCR의 반응 영역 내에서 광열 효과를 생성하도록 허용한다. PCR의 반응 영역 내 플라즈몬 나노 입자의 일부를 선택적이고 구체적으로 조사함으로써 위에서 언급한 바와 같이 핵산 증폭을 수행하는 데 필요한 온도 장을 생성한다. 기본적으로 이 작업에는 특정 기술적인 어려움이 있다.
2. GNA Biosolutions의 이전 특허에는 2단계 온도(열) 사이클링을 사용하는 PCA 핵산 증폭 반응에 사용되는 PCR이 다음과 같이 언급되어 있음, DNA의 이중 가닥 분리에 필요한 변성 온도 95°C, 올리고 프라이머/프로브 어닐링 및 DNA 중합효소 연장에 필요한 어닐링 및 연장 온도 65°C를 포함한다. PCA 기술은 레이저 끄기 시 플라즈몬 나노 입자의 국부적인 가열을 냉각하기 위해 냉각 매체로 대량의 PCR 용액을 사용하지만(예: 95°C에서 65°C로), 온도차이가 30°C에 불과하기 때문에 PCA 기술의 "즉시 냉각" 효과에 비해 냉각 속도가 빠르지 않을 수 있다.
3. PCA 기술은 대량의 PCR 용액을 냉각 매체로 활용하여 레이저가 꺼질 때 플라즈몬 나노 입자의 국부적 가열을 냉각시킨다. 그러나, PCR 용액 내에서 유리 단일 가닥 DNA(ssDNA) 형태로 생성된 PCA의 앰플리콘은, 대용량 PCR 용액(예: 100-500μL)의 희석 효과로 인해, 이는 앰플리콘의 신호를 축적하기 위해 핵산 증폭의 더 많은 열 사이클이 필요하게 된다. 이러한 단점은 핵산 증폭 및 검출에 필요한 총 처리 시간에 더욱 영향을 미친다.
4. 생물학적 시료에서 복잡한 핵산 분석물을 발견하는 경우: 종래 PCR에서는 핵산 증폭을 수행하기 위해 프라이머 쌍 디자인을 사용한다. 올리고 프라이머 세트와 상보적인 부분적으로 유사하거나 동일한 서열을 포함하는 복잡한 핵산 분석물을 접하는 경우, 이러한 서열은 어닐링 과정 중에 부분적인 혼성화를 겪을 수 있고, 그 결과 비특이적 키메라 부산물이 생성된다. 이는 현장 검사 장치에 대한 부정확한 차별에 기여할 것이다.
따라서, 앞서 언급한 기술적 문제를 피하면서 간단하고 빠른 핵산 증폭 및 검출을 구현하는 방법은 아직 해결되지 않은 중요한 과제로 남아 있다.
종래 기술의 문제점을 고려하여, 본 발명의 목적 중 하나는 핵산 증폭 방법 및 그 장치를 제공하는 것이며, 핵산 증폭에 필요한 쉽고 빠른 온도(열) 사이클링을 가능하게 하며, 핵산 증폭은 고상 캐리어 표면에 부분적으로 고정된 핵산 분자의 증폭을 수반한다. 본 발명의 또 다른 목적은 고상 캐리어 표면의 핵산을 빠르게 정제, 분리 및 농축시키는 것이며, 이를 통해 높은 특이성과 감도로 표적 핵산 분자의 후속 검출 및 분석을 촉진한다.
본 발명의 하나의 목적에 따르면, 다음을 포함하는 핵산 증폭 방법이 제공됨: 적어도 하나의 분석물, 핵산 증폭 용액, 그 내부의 적어도 하나의 고상 캐리어를 포함하는 반응 유닛, 상기 분석물, 상기 핵산 증폭 용액 및 상기 고상 캐리어는 냉각 환경에서 냉각 온도로 유지됨; 외부 에너지의 아웃풋 및 외부 에너지의 온오프(on and off) 타이밍 서열을 모듈레이팅함. 한편, 냉각 환경의 냉각 온도와 조화를 이루어, 이로써 핵산 증폭에 필요한 하나 이상의 온도(열) 사이클이 고상 캐리어(즉, 인-시츄 환경) 주위에서 발생하여 생성되고, 각각의 온도(열) 사이클에서, 모든 고상 캐리어는 외부 에너지의 조사에 따라 트리거링되는 해당 인-시츄 환경을 동시에 형성하고, 고상 캐리어에 대한 외부 에너지가 일시 중지되면 고상 캐리어 주변의 인-시츄 환경이 소산된다. 고상 캐리어의 인-시츄 환경의 형성 및 소산에 의해, 표적 분석물의 존재 하에서 핵산 증폭을 수행할 수 있고, 이로써 앰플리콘이 생성된다.
이 중, 핵산 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR) 또는 등온 핵산 증폭 기술(iNAAT)을 포함한다.
이 중, 열 사이클의 외부 에너지 조사의 각 턴-온(turn-on) 기간 동안, 반응 유닛 내의 모든 고상 캐리어가 동시에 트리거링되고, 그 결과 각 고상 캐리어 주위에 인-시츄 환경이 형성되고, 각각의 캐리어에 고정된 앰플리콘을 추가로 생성한다. 고출력 외부 에너지 조사의 각 턴-온 기간 동안, 고정된 앰플리콘은 변성될 것이고, 앰플리콘의 일부는 각 고상 캐리어에 유지되고, 앰플리콘의 또 다른 부분은 주형으로서 핵산 증폭 용액에 방출되고, 열 사이클의 외부 에너지 조사가 턴-오프되는 각 기간 동안, 각 고상 캐리어의 여기가 중지되고, 각 인-시츄 환경은 냉각 환경의 냉각 온도를 통해 소산된다.
이들 중 효소는 중합효소일 수 있으며, 여기서 중합효소는 DNA 중합효소, RNA 중합효소를 포함하고, 또는 효소는 역전사효소(RT), 리보뉴클레아제(RNase), 헬리카제, DNA 리가제 중 하나 또는 이들의 조합일 수도 있고, 중합효소와 협력하여 작용할 수도 있다.
이 중, 외부 에너지 조사를 각 고상 캐리어에 전달하는 방법에는 접촉식 또는 비접촉 여기 방식이 있다.
이 중 비접촉 여기 방식에는 광열 여기 방식이나 자기 여기 방식이 포함된다. 광열 여기에 사용되는 광원은 가시광선에서 근적외선 스펙트럼까지의 파장 범위와 380나노미터(nm) 내지 1.4마이크로미터(μm)의 파장 범위를 갖는 레이저 또는 LED 어레이 중 하나이다.
이 중 자기 여기 시스템은 교류자기장(ACF)을 이용하여 열을 발생시키는 방식(즉, AMF에 의한 고열)이 있다. 교류 자기장은 교류 자기장 발생기에 의해 생성되며, 교류 자기장의 진폭과 주파수는 고상 캐리어의 핵산 증폭에 필요한 온도 조건에 따라 설정된다. 또한 교류 자기장의 진폭은 0.5 내지 550 kA/m이며, 교류 자기장의 주파수는 3 내지 3,500kHz이다.
이 중 접촉 여기 방식은 전기 가열 방식이고, 전기에너지 전달을 위해 전자회로나 유도자속을 통해 전기 에너지를 전달할 수 있다(무선충전). 전기 가열 모드는 줄(Joule) 가열, 열전 가열 또는 표면 탄성파(SAWs)일 수 있다.
이 중, 고상 캐리어의 전체 부피 대 핵산 증폭 용액의 부피의 비율은 1:200 내지 1:1Х109이다.
이 중, 각 고상 캐리어의 크기는 8 내지 2,000,000 nm 범위이고, 그 중 광열 여기 및 자기장 여기를 위한 고상 캐리어의 바람직한 크기는 8 내지 1,000 나노미터이고; 전기 가열을 위한 고상 캐리어의 바람직한 크기는 1,000 내지 2,000,000나노미터이다.
이 중, 각 고상 캐리어는 구형, 타원체, 원판형, 별형, 막대형, 정사각형, 이방성 구조, 나노쉘, 나노케이지, 쌍뿔형 구조, 마이크로필라멘트 또는 이들 중 둘 이상의 조합의 형상일 수 있다.
이들 중에서, 각각의 고상 캐리어는 반응 유닛 내에 현탁될 수 있거나, 각각의 고상 캐리어는 반응 유닛의 내벽에 묶여 있을 수 있거나, 둘 모두의 조합일 수 있다.
이 중 냉각온도는 -10 내지 50°C이다.
이 중, 반응 유닛 또는 핵산 증폭 용액은 냉각 온도로 사전-냉각되거나, 외부 보조 냉각 유닛에 배치될 수 있으며, 상기 사전-냉각 반응 유닛 또는 외부 보조 냉각 유닛은 하나 이상의 열 사이클 동안 냉각 온도를 유지한다.
이 중 외부 보조 냉각 장치는 얼음, 수팽윤성 고분자, 화학적 흡열 반응물, 열전 냉각 칩 또는 이들 중 어느 2가지의 조합으로 구성된다. 수팽윤성 고분자 고분자는 카르복시메틸셀룰로오스이며, 그 중 화학적 흡열 반응물은 흡열 반응을 수반하는 물에 용해된 질산암모늄 또는 요소이다.
이들 중에서, 시험될 분석물은 세포, 소기관, 박테리아, 바이러스, 원생동물 또는 이들의 조합일 수 있다. 고상 캐리어는 다기능체, 하나 이상의 농축 리간드 및 하나 이상의 증폭 리간드를 포함하며, 그 중, 각각의 농축 리간드가 분석물의 특이적 포획에 사용되는 다기능체 표면에 고정되고; 여기서 증폭 리간드는 다기능체의 표면에도 고정되어 생물학적 물질을 결합하는데 사용된다. 이 중 생물학적 물질로는 분석물에서 방출된 디옥시리보핵산이나 리보핵산, 또는 증폭 리간드에 복제된 후 핵산 증폭 용액으로 방출되는 앰플리콘 등이 있다. 이들 중 농축 리간드는 항체, 핵산 앱타머, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 다당류 또는 이들의 조합일 수 있다. 여기서 증폭 리간드는 핵산 앱타머(aptamer) 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 고상 캐리어에 고정화하기 위한 작용기 변형을 가지며, 1차 아민, 비오틴, 티올 그룹 또는 이들의 조합으로 변형될 수 있다. 생물학적 물질에 대한 혼성화 포획을 위한 올리고뉴클레오티드의 특이성과 안정성을 높이기 위해, 변형은 잠긴 핵산(LNA), 포스포로티오에이트, 모르폴리노 변형 또는 이들의 조합일 수 있다.
이들 중에서, 시험할 분석물은 세포, 소기관, 박테리아, 바이러스, 원생동물 또는 이들의 조합일 수 있다. 고상 캐리어의 일부는 농축체 및 하나 이상의 농축 리간드를 포함하며, 각각의 농축 리간드는 농축체 표면에 고정되어 분석물의 특정 포획에 사용되고; 고상 캐리어의 또 다른 부분은 증폭체 및 하나 이상의 증폭 리간드를 포함하며, 각각의 증폭 리간드는 증폭체 표면에 고정화되어 분석물에서 방출된 생물학적 물질과 결합하는 혼성화에 사용된다. 생물학적 물질은 분석물에서 방출된 디옥시리보핵산 또는 리보핵산이거나 증폭 리간드에서 복제된 후 핵산 증폭 용액으로 방출되는 앰플리콘이다. 이 중 농축체는 농축 리간드만으로 기능화된 다기능체에 해당한다. 이 중 증폭 부분은 증폭 리간드만 갖고 있는 다기능 부분에 해당한다.
이 중, 분석물은 유리 데옥시리보핵산 또는 유리 리보핵산이고, 그 중 각각의 고상 캐리어는 증폭체 및 하나 이상의 증폭 리간드를 포함하고, 각각의 증폭 리간드는 증폭체 표면에 고정되어 분석물의 혼성화 결합에 사용된다.
본 발명의 일 목적에 따르면, 신속 핵산 증폭 플랫폼은 다음을 포함함: 반응 유닛, 보조 냉각 유닛, 외부 에너지 여기 유닛, 통합 드라이버; 여기에서, 반응 유닛은 반응 용액, 분석물, 핵산 증폭 용액, 및 하나 또는 그 이상의 고상 캐리어를 수용하도록 제공됨; 상기 보조 냉각 유닛은 냉각 온도에서 사전 냉각된 핵산 증폭 용액일 수 있고, 또는 상기 반응 유닛 주위에 배치된 외부 보조 냉각 유닛일 수 있고, 상기 반응 유닛을 지속적으로 냉각하고 상기 핵산 증폭 용액을 냉각 온도로 유지함; 외부 에너지 여기 유닛은, 접촉 및 비접촉 에너지를 고상 캐리어에 전달하여 열을 생성하도록 제공됨; 통합 드라이버는, 에너지 아웃풋 및 외부 에너지 여기 유닛의 온오프(on and off) 타이밍 서열을 제어하도록 구성되고; 상기 통합 드라이버는 상기 외부 여기 유닛의 에너지 아웃풋을 모듈레이팅하고 외부 에너지 캘리브레이터 및 온도 검출 유닛에 의해 상기 외부 보조 냉각 유닛의 제어를 피드백하도록 구성됨으로써, 핵산 증폭에 필요한 하나 또는 그 이상의 열 사이클을 생성한다.
본 발명의 또 다른 목적에 따르면, 핵산 검출 방법이 제공되며, 핵산 증폭이 완료된 후 핵산 검출을 위해 다음 단계를 포함함: 작동 유닛은 고상 캐리어 고정된 앰플리콘의 정제, 분리 및 농축을 돕기 위해 사용됨; 검출 모듈은 고상 캐리어에 결합된 앰플리콘에서 발생하는 광학 변화, 열 감지 변화, 전기화학적 변화, 자기 변화 또는 질량 변화(예: 압전) 중 하나 또는 조합을 검출함. 또한, 검출 모듈은 고상 캐리어에 결합된 앰플리콘에 의한 증폭 신호를 검출한다.
이 중, 고상 캐리어에 고정된 앰플리콘의 광학적 변화를 검출하는 방법은, 핵산 태그 또는 앰플리콘에 포함된 형광단으로 표지된 프라이머에 의해 직접 발생하는 빛의 세기 변화를 분광 광도계 또는 형광계로 검출하는 단계, 또는 효소 결합 면역 흡착 측정법에 의해 생성된 광학적 변화 또는 화학발광 변화를 검출하는 단계, 또는 고상 캐리어에 고정된 앰플리콘에 대한 반발력으로 인한 스펙트럼 변화를 검출하는 단계로 구성된다.
이 중, 고상 캐리어에 고정된 앰플리콘의 광학적 변화를 검출하는 방법은, 검출 모듈은 핵산 측면 흐름 스트립 또는 측면 흐름 면역분석 스트립을 포함하고, 광학적 변화를 검출하는 데 사용된다.
이들 중에서, 핵산 측면 흐름 스트립 또는 측면 흐름 면역 분석 스트립의 분석 민감도는 핵산 측면 흐름 스트립 또는 측면 흐름 면역 분석 스트립에 열 감지 검출, 표면 플라즈몬 공명 분광법 또는 그의 임의의 조합과 결합함으로써 향상된다.
이 중, 고상 캐리어에 고정된 앰플리콘에 일어나는 전기화학적 변화를 확인하는 방법은, 효소 결합 면역 흡착 측정법 및 전기화학적 임피던스 분광법과 결합된 전기화학적 검출 중 하나 또는 조합을 포함한다.
이 중, 상기 고상 캐리어에 고정된 상기 앰플리콘에서 발생한 자기 변화에 대한 방법은, 교류(AC) 감수율 측정기, 및 거대 자기저항 측정(GMR), 또는 그 둘의 조합에 의한 주파수-의존 교류 감수율(AC)의 검출을 포함한다.
이 중, 상기 앰플리콘에 발생한 질량 변화에 대한 방법은 쿼츠 크리스탈 미량 천칭(quartz crystal microbalance; QCM)을 사용하여 수행된다.
본 발명의 다른 목적에 따르면, 신속 핵산 검출 장치는, 작동 유닛 및 검출 유닛을 포함하고, 상기 작동 유닛은 고상 캐리어의 정제, 분리 및 농축을 방조하도록 구성되고; 상기 검출 모듈은 상기 고상 캐리어에 고정된 앰플리콘에 발생한 광학 변화, 열 감지 변화, 전기화학 변화, 자기 변화, 또는 질량 변화 중 하나 또는 그 조합을 검출하도록 구성된다.
요약하면, 본 발명은 종래의 핵산 증폭 방법과 다르고, 아래 장점을 갖는다.
(1) 반응 유닛에서의 외부 에너지 여기 특성(즉, 외부 에너지의 크기 및 주파수)과 냉각 효과를 간단히 제어함으로써, 고상 캐리어 표면 주위의 인-시츄 환경 내에서 핵산 증폭에 필요한 온도(열) 사이클을 즉시 생성할 수 있고, 이를 통해 빠른 핵산 증폭의 목적을 달성한다.
(2) 핵산 증폭 용액을 냉각 온도까지 사전 냉각시키고, 또는 보조 냉각 장치를 사용하여 반응 유닛을 냉각 환경에 유지하거나, 비특이적 프라이머 어닐링/연장 및 비표적 핵산 증폭을 억제할 수 있으며, 이를 통해 표적 핵산에 대한 증폭 특이성을 향상시킨다.
(3) 고상 캐리어 표면의 증폭 리간드의 용량이 제한되어 있기 때문에, 고상 캐리어 표면에 고정된 증폭 핵산 분자는 상대적으로 짧은 작동 시간(또는 상대적으로 적은 수의 열 사이클) 내에 포화 상태에 도달할 수 있다. 이는 증폭된 핵산 분자의 후속 검출을 용이하게 한다.
(4) 고상 캐리어의 자기가 강한 경우, 작동 유닛에 의한 자기적 조작을 통해 고상 캐리어에서 생성된 앰플리콘을 더욱 정제 및 농축할 수 있다. 이러한 기술적 특성은 고상 캐리어에 고정된 앰플리콘의 후속 검출을 용이하게 한다(예: 검출 성능 향상).
(5) 핵산 증폭 용액 전체가 낮은 온도로 유지되므로, 이는 열 사이클 동안 반응 용액의 증발 및 기포 생성 문제를 피할 뿐만 아니라 비특이적 핵산 증폭을 억제하거나 감소시키는 장점도 있다.
도 1(a)는 본원의 일 구현예에 따른 신속 온도 증가의 개략도이다.
도 1(b)는 본원의 일 구현예에 따른 신속 온도 증가의 개략도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 고상 캐리어의 구조 및 표면 특성에 대한 개략도이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 핵산 증폭 시스템의 설정의 개략도이다.
도 4(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 반응 유닛 내 핵산 증폭 용액과 혼합된 고상 캐리어의 현탁 상태를 나타낸 개략도이다.
도 4(b)는 본 발명의 일 실시예에 따른 공유 결합에 의해 반응 유닛 바닥의 내벽에 고상 캐리어가 결합된 개략도이다.
도 5는 핵산 증폭 시스템의 개략도로, 본 발명의 일 실시예에서 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위해 광열 변환 능력을 갖는 고상 캐리어를 사용한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 작동 유닛을 이용하여 고상 캐리어에 고정된 앰플리콘을 정제, 분리 및 농축하는 과정의 개략도이다.
도 7(a) 내지 (e)는 수냉식 온-비드(on-bead) 중합효소 연쇄반응(수냉식 온-비드 PCR)의 첫 번째 반응 과정의 개략도이다.
도 7(f) 내지 (g)는 본 발명의 일 실시예에 따른 도 7(a) 내지 (e) 완료 후 2차 반응 과정의 개략도이다.
도 7(h) 내지 (k)는 본 발명의 일 실시예에 따른 도 7(h) 내지 (k) 완료 후 3차 반응 과정의 개략도이다.
도 7(l)은 복수의 광자 사이클을 완료한 후의 개략도이다.
도 8은 본 발명의 핵산 증폭 방법 및 검출 방법의 흐름도이다.
도 9(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 수냉식 온-비드 루프 매개 등온 증폭(수냉식 온-비드 LAMP)을 수행하는 데 사용되는 프라이머 쌍 세트의 개략도이다.
도 9(b) 내지 (e)는 본 발명의 일 실시예에에 따른 펄스 제어 수냉식 온-비드 LAMP를 수행하기 위한 절차의 개략도이다.도 10(a)는 연속 10번의 광자 사이클을 사용하는 NIR 레이저 조사(즉, 광자 사이클 설정, NIR 레이저는 400mW/0.16cm2에서 60초 동안 켜짐, 레이저는 120초 동안 꺼짐) 하에서 고상 캐리어(즉, 자기 금 나노쉘, 2.9x1010 입자/ml, 20 μL)의 마이크로 규모 광열 온도 측정 결과를 보여준다.
도 10(b)는 다양한 여기 전력(즉, 300초 동안 200mW/0.16cm2 ~ 700mW/0.16cm2)을 사용하여 NIR 레이저 조사 하에서 고상 캐리어(즉, 자기 금 나노쉘, 2.9x1010 입자/mL, 20 μL)의 마이크로 규모 광열 온도 측정 결과를 보여준다.
도 11(a)는 본 발명의 일 실시예에서 적용된 NIR 레이저 강도와 단분산 자기 금 나노쉘(MGNs)의 마이크로 규모 광열 변환 온도 사이의 관계에 대한 결과를 보여준다.
도 11(b)는 다양한 출력의 NIR 레이저 조사 후 자기 금 나노쉘의 마이크로 규모 현탁액에 대한 적외선 열 이미지이다.
도 12(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 보조 냉각부의 배치도이다.
도 12(b)는 단분산된 자기 금 나노쉘이 포함된 핵산 증폭 용액의 전체 온도 변화를 상기 보조 냉각 장치를 이용하여 100 광자 사이클로 측정하였다(각 광자사이클은 통합 드라이버에 의해 1.25초 동안 400mW/0.16cm2로 변조되고, 그 후 0.5초 동안 레이저가 꺼진 다음 7.5초 동안 150mW/0.16cm2에서 조사됨).
도 13(a)는 본 발명의 일 실시예에서 검출 전 측면 흐름 면역 분석 스트립의 개략도이다.
도 13(b)는 본 발명의 일실시예에서 측면 흐름 면역 분석 스트립을 이용한 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄반응의 검출 결과에 대한 개략도이다.
도 14(a)는 수냉식 온-비드 PCR 검출의 양성 결과에 대한 모식도로, 이는 도 13(b)에 도시된 바와 같이 플라즈몬 열 감지 및 측면 흐름 면역 분석 스트립을 통합함으로써 달성된다.
도 14(b)는 수냉식 온-비드 PCR 검출 음성 결과의 캐략도로, 이는 도 13(b)에 도시된 바와 같이 플라즈몬 열 감지 및 측면 흐름 면역분석 스트립을 통합함으로써 달성된다.
도 15(a)는 측면 흐름 면역 분석 스트립이 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응의 다양한 광자 사이클(즉, 10 내지 50사이클)에서 MGNs에 고정된 앰플리콘을 검출하는 데 사용되었음을 보여준다. 각 광자 사이클은 통합 드라이버에 의해 1.25초 동안 400mW/0.16cm2로 변조되고, 그 다음 0.5초 동안 레이저를 끈 다음 150mW/0.16cm2에서 7.5초 동안 수행된다.
도 15(b)는 변성 우레아 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응의 다양한 광자 사이클(즉, 10 내지 30사이클)에서 핵산 증폭 용액 중 잔류 앰플리콘을 측정했음을 보여준다.
도 16(a)는 대장균(E.coli) 유래 단순 DNA 시료를 이용하여 종래의 malB 유전자 검출을 위한 중합효소 연쇄 반응의 분석적 민감도와 특이도를 나타낸 결과를 도시한다.
도 16(b)는 대장균 유래 단순 DNA 시료를 이용하여 수냉식 온-비드 PCR 및 측면 흐름 면역분석 스트립을 실시한 분석 민감도 결과이다.
도 17(a)는 다중 병원성 세균 및 E.coli 유래 게놈 DNAs로 구성된 복합 DNA 시료를 이용하여 malB 유전자를 검출하는 종래의 중합효소 연쇄 반응의 민감도 및 특이도 분석 결과이다.
도 17(b)는 다중 병원성 세균 및 E.coli 유래 게놈 DNAs로 구성된 복합 DNA 시료를 이용하여 수냉식 온-비드 PCR 및 측면 흐름 면역 분석 스트립을 실시한 분석 민감도 결과이다.
도 18(a)는 표적 분석물 농축 및 광열 용해 능력에 대한 농축 리간드 기능화된 고상 캐리어의 성능 평가이다. CFU(집락 형성 단위) 테스트는 다양한 전력 밀도(예: 300초 동안 0 ~ 500mW/0.16cm2)를 사용하여 NIR 조사 하에서 표적 분석물(예: E.coli)의 포획 효율과 광열 용해 효율을 평가하는 데 사용된다.
도 18(b)는 본 발명의 일 실시예에 따른 광열 용해, 수냉식 온-비드 PCR 및 측면 흐름 면역 분석 스트립을 결합한 성능 평가이다. 측면 흐름 면역 분석 스트립의 신호 판독값은 다양한 출력의 NIR 조사 하에서 광열 용해 효율을 평가하는 데 활용된다.
도 19(a)는 NIR 레이저 구동 수냉식 온-비드 PCR을 수행하기 위한 전체 작업 과정의 흐름도이다.
도 19(b)는 측면 흐름 면역 분석 스트립을 사용한 NIR 레이저 구동 수냉식 온-비드 PCR의 분석적 민감도 평가이다. 고상 캐리어 혼합물은 두 가지 유형의 기능성 MGNs(즉, 농축 리간드 및 증폭 리간드 기능화된 MGNs)을 포함하고, 다양한 양의 표적 분석물(즉, E.coli)을 첨가한 시료를 사용하여 NIR 레이저 구동 수냉식 온비드 PCR의 분석 감도를 평가하는 데 사용된다.
도 20(a)는 도 19(b)에 도시된 측면 흐름 면역 분석 스트립의 테스트 라인 영역의 이미지를 정량적으로 나타낸 결과이다. 이미지 분석 소프트웨어(예: Image J)는 측면 흐름 면역 분석 스트립에서 테스트 라인의 픽셀 강도를 분석하는 데 사용된다.
도 20(b)는 플라즈몬 열 감지와 종래 측면 면역 분석 스트립을 통합한 결과이고, 측면 흐름 면역 분석 스트립의 테스트 라인 영역에 대한 열 화상은 다양한 808 nm 레이저 조사(즉, 24 mW 또는 140 mW) 하에서 적외선 열 카메라로 캡처되었다.
도 20(c)는 도 20(b)의 열화상에서 배경온도를 뺀 후 플라즈몬 가열의 증가량을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 21(a)는 상대적으로 낮은 냉각 온도 범위를 갖는 핵산 증폭 용액(예: 얼음처럼 차갑고, 차갑고, 서늘한 온도) 하에서 NIR 레이저 구동 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 핵산 증폭 용액의 전체 온도 변화에 대한 결과이다.
도 21(b)는 상대적으로 낮은 냉각 온도 범위를 갖는 핵산 증폭 용액 하에서 NIR 레이저 구동 수냉식 온-비드 PCR을 수행하기 위한 인-시츄 핵산 증폭 평가이다.
도 1(b)는 본원의 일 구현예에 따른 신속 온도 증가의 개략도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 고상 캐리어의 구조 및 표면 특성에 대한 개략도이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 핵산 증폭 시스템의 설정의 개략도이다.
도 4(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 반응 유닛 내 핵산 증폭 용액과 혼합된 고상 캐리어의 현탁 상태를 나타낸 개략도이다.
도 4(b)는 본 발명의 일 실시예에 따른 공유 결합에 의해 반응 유닛 바닥의 내벽에 고상 캐리어가 결합된 개략도이다.
도 5는 핵산 증폭 시스템의 개략도로, 본 발명의 일 실시예에서 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위해 광열 변환 능력을 갖는 고상 캐리어를 사용한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 작동 유닛을 이용하여 고상 캐리어에 고정된 앰플리콘을 정제, 분리 및 농축하는 과정의 개략도이다.
도 7(a) 내지 (e)는 수냉식 온-비드(on-bead) 중합효소 연쇄반응(수냉식 온-비드 PCR)의 첫 번째 반응 과정의 개략도이다.
도 7(f) 내지 (g)는 본 발명의 일 실시예에 따른 도 7(a) 내지 (e) 완료 후 2차 반응 과정의 개략도이다.
도 7(h) 내지 (k)는 본 발명의 일 실시예에 따른 도 7(h) 내지 (k) 완료 후 3차 반응 과정의 개략도이다.
도 7(l)은 복수의 광자 사이클을 완료한 후의 개략도이다.
도 8은 본 발명의 핵산 증폭 방법 및 검출 방법의 흐름도이다.
도 9(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 수냉식 온-비드 루프 매개 등온 증폭(수냉식 온-비드 LAMP)을 수행하는 데 사용되는 프라이머 쌍 세트의 개략도이다.
도 9(b) 내지 (e)는 본 발명의 일 실시예에에 따른 펄스 제어 수냉식 온-비드 LAMP를 수행하기 위한 절차의 개략도이다.도 10(a)는 연속 10번의 광자 사이클을 사용하는 NIR 레이저 조사(즉, 광자 사이클 설정, NIR 레이저는 400mW/0.16cm2에서 60초 동안 켜짐, 레이저는 120초 동안 꺼짐) 하에서 고상 캐리어(즉, 자기 금 나노쉘, 2.9x1010 입자/ml, 20 μL)의 마이크로 규모 광열 온도 측정 결과를 보여준다.
도 10(b)는 다양한 여기 전력(즉, 300초 동안 200mW/0.16cm2 ~ 700mW/0.16cm2)을 사용하여 NIR 레이저 조사 하에서 고상 캐리어(즉, 자기 금 나노쉘, 2.9x1010 입자/mL, 20 μL)의 마이크로 규모 광열 온도 측정 결과를 보여준다.
도 11(a)는 본 발명의 일 실시예에서 적용된 NIR 레이저 강도와 단분산 자기 금 나노쉘(MGNs)의 마이크로 규모 광열 변환 온도 사이의 관계에 대한 결과를 보여준다.
도 11(b)는 다양한 출력의 NIR 레이저 조사 후 자기 금 나노쉘의 마이크로 규모 현탁액에 대한 적외선 열 이미지이다.
도 12(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 보조 냉각부의 배치도이다.
도 12(b)는 단분산된 자기 금 나노쉘이 포함된 핵산 증폭 용액의 전체 온도 변화를 상기 보조 냉각 장치를 이용하여 100 광자 사이클로 측정하였다(각 광자사이클은 통합 드라이버에 의해 1.25초 동안 400mW/0.16cm2로 변조되고, 그 후 0.5초 동안 레이저가 꺼진 다음 7.5초 동안 150mW/0.16cm2에서 조사됨).
도 13(a)는 본 발명의 일 실시예에서 검출 전 측면 흐름 면역 분석 스트립의 개략도이다.
도 13(b)는 본 발명의 일실시예에서 측면 흐름 면역 분석 스트립을 이용한 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄반응의 검출 결과에 대한 개략도이다.
도 14(a)는 수냉식 온-비드 PCR 검출의 양성 결과에 대한 모식도로, 이는 도 13(b)에 도시된 바와 같이 플라즈몬 열 감지 및 측면 흐름 면역 분석 스트립을 통합함으로써 달성된다.
도 14(b)는 수냉식 온-비드 PCR 검출 음성 결과의 캐략도로, 이는 도 13(b)에 도시된 바와 같이 플라즈몬 열 감지 및 측면 흐름 면역분석 스트립을 통합함으로써 달성된다.
도 15(a)는 측면 흐름 면역 분석 스트립이 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응의 다양한 광자 사이클(즉, 10 내지 50사이클)에서 MGNs에 고정된 앰플리콘을 검출하는 데 사용되었음을 보여준다. 각 광자 사이클은 통합 드라이버에 의해 1.25초 동안 400mW/0.16cm2로 변조되고, 그 다음 0.5초 동안 레이저를 끈 다음 150mW/0.16cm2에서 7.5초 동안 수행된다.
도 15(b)는 변성 우레아 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응의 다양한 광자 사이클(즉, 10 내지 30사이클)에서 핵산 증폭 용액 중 잔류 앰플리콘을 측정했음을 보여준다.
도 16(a)는 대장균(E.coli) 유래 단순 DNA 시료를 이용하여 종래의 malB 유전자 검출을 위한 중합효소 연쇄 반응의 분석적 민감도와 특이도를 나타낸 결과를 도시한다.
도 16(b)는 대장균 유래 단순 DNA 시료를 이용하여 수냉식 온-비드 PCR 및 측면 흐름 면역분석 스트립을 실시한 분석 민감도 결과이다.
도 17(a)는 다중 병원성 세균 및 E.coli 유래 게놈 DNAs로 구성된 복합 DNA 시료를 이용하여 malB 유전자를 검출하는 종래의 중합효소 연쇄 반응의 민감도 및 특이도 분석 결과이다.
도 17(b)는 다중 병원성 세균 및 E.coli 유래 게놈 DNAs로 구성된 복합 DNA 시료를 이용하여 수냉식 온-비드 PCR 및 측면 흐름 면역 분석 스트립을 실시한 분석 민감도 결과이다.
도 18(a)는 표적 분석물 농축 및 광열 용해 능력에 대한 농축 리간드 기능화된 고상 캐리어의 성능 평가이다. CFU(집락 형성 단위) 테스트는 다양한 전력 밀도(예: 300초 동안 0 ~ 500mW/0.16cm2)를 사용하여 NIR 조사 하에서 표적 분석물(예: E.coli)의 포획 효율과 광열 용해 효율을 평가하는 데 사용된다.
도 18(b)는 본 발명의 일 실시예에 따른 광열 용해, 수냉식 온-비드 PCR 및 측면 흐름 면역 분석 스트립을 결합한 성능 평가이다. 측면 흐름 면역 분석 스트립의 신호 판독값은 다양한 출력의 NIR 조사 하에서 광열 용해 효율을 평가하는 데 활용된다.
도 19(a)는 NIR 레이저 구동 수냉식 온-비드 PCR을 수행하기 위한 전체 작업 과정의 흐름도이다.
도 19(b)는 측면 흐름 면역 분석 스트립을 사용한 NIR 레이저 구동 수냉식 온-비드 PCR의 분석적 민감도 평가이다. 고상 캐리어 혼합물은 두 가지 유형의 기능성 MGNs(즉, 농축 리간드 및 증폭 리간드 기능화된 MGNs)을 포함하고, 다양한 양의 표적 분석물(즉, E.coli)을 첨가한 시료를 사용하여 NIR 레이저 구동 수냉식 온비드 PCR의 분석 감도를 평가하는 데 사용된다.
도 20(a)는 도 19(b)에 도시된 측면 흐름 면역 분석 스트립의 테스트 라인 영역의 이미지를 정량적으로 나타낸 결과이다. 이미지 분석 소프트웨어(예: Image J)는 측면 흐름 면역 분석 스트립에서 테스트 라인의 픽셀 강도를 분석하는 데 사용된다.
도 20(b)는 플라즈몬 열 감지와 종래 측면 면역 분석 스트립을 통합한 결과이고, 측면 흐름 면역 분석 스트립의 테스트 라인 영역에 대한 열 화상은 다양한 808 nm 레이저 조사(즉, 24 mW 또는 140 mW) 하에서 적외선 열 카메라로 캡처되었다.
도 20(c)는 도 20(b)의 열화상에서 배경온도를 뺀 후 플라즈몬 가열의 증가량을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 21(a)는 상대적으로 낮은 냉각 온도 범위를 갖는 핵산 증폭 용액(예: 얼음처럼 차갑고, 차갑고, 서늘한 온도) 하에서 NIR 레이저 구동 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 핵산 증폭 용액의 전체 온도 변화에 대한 결과이다.
도 21(b)는 상대적으로 낮은 냉각 온도 범위를 갖는 핵산 증폭 용액 하에서 NIR 레이저 구동 수냉식 온-비드 PCR을 수행하기 위한 인-시츄 핵산 증폭 평가이다.
본 발명의 목적, 기술방안 및 이점을 더욱 명확하고 이해하기 쉽게 하기 위해, 첨부된 도면 및 실시예를 결합하여 본 발명에 대한 다음의 상세한 설명을 제공한다. 본 명세서에 기술된 특정 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다는 점에 유의해야 한다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은, 분석물(20), 핵산 증폭 용액(30) 및 반응 유닛(10) 내의 적어도 하나의 고상 캐리어(40)를 제공하는 단계를 포함한다. 반응 유닛(10)은 필요한 냉각 온도를 달성하는 냉각 환경에 안치된다. 상기 냉각 온도 범위는 -10 내지 50°C이다. 바람직한 냉각 온도 범위는 15 내지 30°C 및 30 내지 50°C이고, 최적 냉각 온도 범위는 -10 내지 0°C 및 2 내지 15°C이다. 외부 에너지 여기의 동작 조건을 제어함으로써(예: 에너지 아웃풋 및 주파수 모듈레이팅), 그리고 반응 유닛(10)의 냉각 환경에 의해 달성되는 냉각 효과를 이용함, 반응 유닛(10) 내의 고상 캐리어(40) 표면 주위에 인-시튜 환경(50)이 형성되고, 핵산 증폭에 필요한 온도(열) 사이클링은 인-시츄 환경(50) 내에서 수행되며, 반응 유닛(10) 내의 각 온도(열) 사이클링 동안 고상 캐리어(40) 상에 앰플리콘(60)의 생성을 가능하게 한다. 반응 유닛(10) 내에서 핵산 증폭에 필요한 온도(열) 사이클링은 핵산 변성, 프라이머 어닐링, DNA 중합 효소 연장에 필요한 서로 다른 온도를 의미하지만, 실제 구현이 이에 제한되는 것은 아니라는 점에 유의해야 한다. 각 고상 캐리어의 크기는 8 내지 2,000,000nm이며, 광열 여기 및 자기장 여기를 위한 고상 캐리어의 바람직한 크기는 8 내지 1,000 나노미터이고; 전기 가열을 위한 고상 캐리어의 바람직한 크기는 1,000 내지 2,000,000나노미터이다.
본 발명에서 사용되는 "인-시츄 환경(50)"이라는 용어는 도 1(b)에 도시된 구성을 지칭한다. 반응 유닛(10) 내의 고상 캐리어(40)가 균일하게 분포된 상태(즉, 단분산 현탁액)인 경우, 도 1(a)에 도시된 바와 같이 외부 에너지 여기 조건 및 도 1(b)에 도시된 바와 같이 반응 유닛(10) 내의 냉각 환경의 냉각 온도를 제어함으로써, 외부 에너지에 의해 여기된 고상 캐리어(40)로부터 외부로 방출되는 열 복사장의 크기(즉, 열 전달 거리)는, 외부 에너지 여기의 동작 조건 및 반응 유닛(10) 내의 냉각 환경의 냉각 온도를 제어함으로써 더욱 조화롭게 조정될 수 있으며, 고상 캐리어(40)에 의해 생성된 열 복사장이 서로 중첩되지 않도록 보장하고, 핵산 증폭을 위한 독립적인 공간을 형성하거나, 고상 캐리어(40)의 국부적인 가열 영역으로 지칭되고(도 1(b) 참조), 본 발명에서는 "인-시츄 환경"이라 명명한다. 더욱이, 외부 에너지의 여기가 정지되면, 반응 유닛(10)의 냉각 온도는 열을 빠르게 방출하고 고상 캐리어(40)의 순간 냉각 목적을 달성하는 데 사용된다.
또한, 본 발명에서 용어 "인-시츄 핵산 증폭"은 고상 캐리어(40) 표면의 인-시츄 환경(50)에서 핵산 증폭이 일어나는 것을 의미하며, 앰플리콘(60)은 고상 캐리어(40)의 표면에 고정되어 있다. 앰플리콘(60)은 증폭된 핵산 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 인-시츄 핵산 증폭을 통해 생성된 앰플리콘(60)의 일부는 각 고상 캐리어(40)에 유지되며, 앰플리콘(60)의 다른 부분은 핵산 증폭 용액(30)으로 방출된다.
본 발명에서 핵산 증폭액(30)은 프라이머(301), 뉴클레오티드, 효소 및 반응 첨가제를 포함한다. 효소는 중합효소(302)일 수 있으며, 여기서 중합효소(302)는 DNA 중합효소, RNA 중합효소를 포함하고, 또는 효소는 또한 역전사효소(RT), 리보뉴클레아제(RNase), 헬리카제, DNA 리가제 중 하나 또는 이들의 조합일 수 있고, 중합효소와 협력하여 작용할 수 있다.
본 발명에서, 핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 또는 등온 핵산 증폭 기술(iNAATs)을 포함할 수 있다. 다양한 iNAATs 방법 중에서 루프 매개 등온 증폭(LAMP)이 선호된다. 중합효소 연쇄 반응에서는 변성 온도 범위가 85 내지 95°C인 2단계 온도(열) 사이클 프로그램, 및 60 내지 65°C 범위의 어닐링 및 중합효소 확장 온도가 사용되고; 루프 매개 등온 증폭의 온도 범위는 60 내지 65°C이다.
본 발명의 일 실시예에서, 도 2에 도시된 바와 같이, 고상 캐리어(40)는 다기능체(41), 적어도 하나의 농축 리간드(70), 및 적어도 하나의 증폭 리간드(71)를 포함한다. 각각의 농축 리간드(70)는 다기능체(41)의 표면에 고정된다. 농축 리간드(70)는 항체, 핵산 앱타머, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 다당류 또는 이들의 조합일 수 있다. 증폭 리간드(71)는 다기능체(41)의 표면에 고정된다. 증폭 리간드(71)는 고상 캐리어(40)에 결합하기 위한 작용기로 변형된 핵산 앱타머 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 이는 1차 아민, 비오틴, 티올기 또는 이들의 조합일 수 있다. 이는 또한 생체분자에 결합하는 올리고뉴클레오티드 혼성화의 특이성 및 안정성을 강화하기 위한 변형을 포함할 수 있으며, 변형은 잠긴 핵산(LNA), 포스포로티오에이트, 모르폴리노 변형 또는 이들의 조합일 수 있으나, 그러나 본 발명의 실제 구현은 이에 제한되지 않는다.
본 실시예에 있어서, 선택된 농축 리간드(70)는 특정하여 상술한 분석물(20)을 포획할 수 있다. 테스트할 분석물(20)은 세포, 소기관, 박테리아, 바이러스, 원생동물 또는 이들의 조합일 수 있다. 농축 리간드(70)는 분석물(20)에 특이적으로 결합하며, 분석물(20)이 고상 캐리어(40)의 농축 리간드(70)에 포획되도록 허용한다.
본 실시예에서, 적어도 하나의 증폭 리간드(71)는 다기능체(41)에 기능화되고, 핵산 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브에 결합하는 데 사용된다. 또한, 증폭 리간드(71)는 생물학적 물질(21)에 대한 혼성화 포획을 위해 설계될 수 있고, 이는 열 용해 후 분석물(20)로부터 방출된 핵산 분자이거나 증폭 리간드(71)에 복제된 앰플리콘(60)일 수 있으며, 이후 핵산 증폭 용액(30)으로 방출될 수 있다. 또한, 표지된 프라이머(301)은 핵산 증폭 용액(30)의 앰플리콘에 포함될 수 있다. 표지된 프라이머(301)의 태그 표지는 방사성 동위원소(예: 3H, 14C 및 32P), 디곡신(DIG), 비오틴, 형광단[예: 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 텍사스 레드, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 로다민 B] 및 발광 물질(예: 2',6'-디메틸카르보닐페닐-10-술포프로필아크리디늄-9-카르복실레이트 4'-NHS 에스테르)일 수 있으나, 본 발명의 실제 구현은 이에 제한되지 않는다.
이 실시예에서, 고상 캐리어(40)의 표면은 하나 또는 그 이상의 표면 개질 과정을 거치고, 그 결과 농축 리간드(70)과 증폭 리간드(71)의 이중 기능화가 동시에 형성된다. 이 리간드는 미량의 분석물(20)의 특정 분석에 사용된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 테스트할 분석물(20)은 세포, 소기관, 박테리아, 바이러스, 원생동물, 또는 이들의 조합일 수 있다. 고상 캐리어(40)의 일부는 적어도 하나의 농축 리간드(70)를 갖는 농축체이고, 고상 캐리어(40)의 다른 부분은 적어도 하나의 증폭 리간드(71)를 갖는 증폭체(42)이다. 상기 농축 리간드(70)는 상기 농축체에 고정되고, 상기 농축 리간드(70)는 특히 분석물(20)을 포획하는 데 사용된다. 증폭체(42)에는 증폭 리간드(71)가 고정되어 있고, 증폭 리간드(71)는 분석물(20)에 의해 방출된 생물학적 물질(21) 또는 증폭 리간드(71)에 복제된 후 핵산 증폭 용액(30)에 방출되는 앰플리콘(60)과 결합하는 데 사용된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 분석물(20)은 유리 데옥시리보핵산 또는 유리 리보핵산일 수 있다. 또한, 유리 핵산은 무세포 핵산, 유리 종양 핵산, 또는 이들의 조합을 포함한다. 각각의 고상 캐리어(40)는 증폭체(42) 및 적어도 하나의 증폭 리간드(71)를 포함하며, 증폭 리간드(71)는 증폭체(42)에 고정되고, 증폭 리간드(71)는 분석물(20)에 결합하는 데 사용되거나 증폭 리간드(71)에 복제된 앰플리콘(60)은 이어서 핵산 증폭 용액(30)에 방출된다.
본 발명의 각 실시예에서는, 고상 캐리어(40)가 다양한 외부 에너지 여기 모드와 협력할 수 있도록 하기 위해, 상응하는 고상 캐리어(40)에 대한 다양한 외부 여기 방법이 사용되고, 특정 외부 에너지를 조사하여 광열 변환을 통한 순간 가열 또는 자기 온열 요법을 포함한다. 특정 물질의 증착이나 구조로 이루어진 고상 캐리어(40)는 특정 스펙트럼의 빛을 조사하여 플라즈몬 가열을 이용하여 가열될 수 있으며, 또는 표면에 유기 광열 전환 코팅으로 장식된 고상 캐리어(40)가 가열될 수 있으며; 대안적으로, 고상 캐리어(40)는 자기 캐리어일 수 있으며, AMF(교류 자기장)의 자기 고체 캐리어 매개 변환을 통해 자기 유도 가열이 가능하다. 0.5 내지 550 kA/m 범위의 진폭과 3 내지 3,500 kHz 범위의 주파수를 갖는 외부에서 인가되는 자기장에 자기 고상 캐리어(40)를 안치함으로써, 핵산 변성, 프라이머 어닐링을 수행하기 위해 고상 캐리어(40)에 필요한 국부적 온도 범위, 중합효소 확장이 가능하다.
또한, 고상 캐리어(40) 내의 다기능체(41), 농축체 및 증폭체(42)는 서로 다른 구성을 가질 수 있다. 상기 고상 캐리어(40)는 마그네틱 코어(401) 및 중간층(402)을 포함하는 구형 구조의 형태로 구현될 수 있으며, 외부 광열변환층의 안정성과 유지성을 보장하며 금속 또는 복합재료로 제작될 수 있다. 중간층(402)은 실리콘 쉘일 수 있고, 전체적인 구성은 구, 타원체, 디스크, 별, 막대, 사각형, 이방성 스파이크 구조(즉, 나노스타), 나노쉘, 나노케이지, 이중 피라미드 구조, 마이크로필라멘트 또는 이들 중 둘 이상의 조합일 수 있으나, 이에 국한되지는 않음; 자기 코어(401)는 FeO, Fe2O3, Fe3O4, FeO(OH), Fe(OH)2, Fe(OH)3, CoO, CoO(OH), Co3O4 및 이들의 유도체 또는 이들의 혼합물과 같은 전이 금속 및 이들의 산화물을 포함하지만, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 고상 캐리어(40)의 표면은 금, 은, 팔라듐, 백금 또는 이들의 조합과 같은 LSPR(귀금속층)층 또는 효율적인 광열 변환이 가능한 유기층으로 구성되며, 시아닌, 폴리피롤 또는 그래핀과 같은 근적외선 분광법(NIR) 흡수 스펙트럼을 나타내는 물질을 포함할 수도 있다.
도 3을 참조하면, 본 발명은 급속 핵산 증폭 시스템을 제공하고, 이는 반응 유닛(10), 통합 드라이버(11), 에너지 여기 유닛(12) 및 보조 냉각 유닛을 포함한다. 그 중 반응 유닛(10)는 핵산 증폭 용액(30) 및 복수의 고상 캐리어(40)를 수용하도록 구성되며, 여기서 고상 캐리어(40)는 핵산 증폭 용액(30)에 현탁되어 있고[도 4(a)], 반응 유닛(10)의 내벽에 묶여 있고[도 4(b)], 또는 반응 유닛(10)의 내벽에 내장되어 있다[도 4(c)]. 상기 보조 냉각 유닛은 아래 형태일 수 있다.
1. 핵산 증폭 용액(30)(100μL 이상)은 보조 냉각 장치 역할을 한다. 핵산 증폭 용액(30)은 외부 보조 냉각 유닛(13)을 이용하여 냉각온도까지 사전-냉각 후 반응 유닛(10)에 도입되므로, 반응 유닛(10) 내의 핵산 증폭 용액(30)은 보조 냉각 장치 역할을 할 수 있다. 이러한 형성에서는 외부 에너지가 공급된 후 핵산 증폭 용액(30)의 온도가 점차 증가하지만 반응 중에는 여전히 냉각 온도를 유지한다. 따라서, 후술하는 보조 냉각 유닛에 비해 핵산 증폭 효율이 열악하지만, 전체적인 작업 시간은 종래 중합효소 연쇄 반응의 핵산 증폭에 비해 여전히 짧다.
2. 핵산 증폭 용액(30) 및 외부 보조 냉각 유닛(13)은 서로 협력하여 보조 냉각 유닛을 형성하고, 외부 보조 냉각 유닛(13)은 반응 유닛(10) 주위에 배치되고(도 5 참조), 이는 반응 유닛(10)에 냉각 온도를 지속적으로 제공하며, 반응 유닛(10) 내의 핵산 증폭 용액(30)의 온도가 낮아지고 냉각 온도를 유지하는 결과를 발생시키고, 또한, 온도 감지 유닛(14)(예를 들어 K형 열전대)는 외부 보조 냉각 유닛(13)에 통합되어 외부 보조 냉각 유닛(13)의 순간적인 온도 모니터링 및 온도 피드백 제어를 수행한다. 이는 반응 유닛(10) 내부의 핵산 증폭 용액(30)이 일정한 냉각 온도를 유지하게 하여 신속한 핵산 증폭을 가능하게 한다.
또한, 외부 보조 냉각 유닛(13)은 얼음이나 비열용량이 높은 수팽윤성 고분자(예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스)나 열전냉각칩(예를 들어 펠티에쿨러(Peltier Cooler))으로 선택되어 사용될 수 있다. 외부 보조 냉각 장치(13)는 또한 물(즉, 0.5mL 내지 1mL)일 수 있거나 화학적 흡열 반응물을 포함하도록 선택될 수 있고, 화학적 흡열 반응은 결정이 물에 용해되어 발생함[예: 질산암모늄 몰 용해열(ΔHsol) = 26.2 KJ, 요소(ΔHsol = 15 KJ)].
도 3을 참조하면, 에너지 여기 유닛(12)은 외부 에너지를 고상 캐리어(40)에 직접적이고 효율적으로 제공하며, 그것을 접촉 또는 비접촉 에너지 전달 방식으로 이를 열에너지로 변환한다. 에너지 여기 유닛(12)이 고상 캐리어(40)에 에너지를 제공하기 위해 정지할 때, 보조 냉각 장치에 의해 제공되는 냉각 온도는 고상 캐리어(40)로부터의 열을 신속하게 소산시키고 외부 에너지 조사 시 고상 캐리어(40)에 의해 생성된 열 복사장을 제한하는 데 사용된다. 에너지 여기 유닛(12) 및 보조 냉각 유닛 간의 연계 제어를 통해, 본 발명은 고상 캐리어(40)를 둘러싸는 인-시츄 환경(50)에서 핵산 증폭을 수행하기 위해 필요한 온도(열) 사이클의 빠른 형성을 가능하게 하고, 고상 캐리어(40)의 표면에서 인-시츄 핵산 증폭을 달성한다.
본 발명에 있어서, 상기 접촉 여기 모드는 전기 가열이다. 상기 전기 에너지 전달은 전기 회로 또는 전자기 유도(무선 충전)를 통해 달성될 수 있다. 전기 가열 모듈은 줄(Joule) 가열, 열전 가열, 표면탄성파(SAW) 등으로 열에너지를 생성할 수 있다.
본 발명에서, 고상 캐리어(40)에 대한 비접촉 여기를 위한 바람직한 모드는 플라즈몬 가열이다. 도 3에 도시된 바와 같이, 에너지 여기 유닛(12)은 통합 드라이버(11)(예를 들어, 컴퓨터 및 LabVIEW 제어 소프트웨어로 구성됨)에 의해 구동되어 에너지 아웃풋 및 레이저 온/오프의 타이밍 서열을 제어하고, 고상 캐리어(40)는 반응 유닛(10)의 국부적인 열 복사장 내에서 열 변화를 생성하는 결과를 발생시킨다.
또한, 에너지 여기 유닛(12)은 비접촉 방식에서 고상 캐리어(40)를 트리거링 할 수 있고, 이는 광열 조사 모드로 선택될 수 있다. 도 5에 도시된 바와 같이, 에너지 여기 유닛(12)은 레이저 콜리메이터(121) 및 레이저 이미터(122), 또는 LED 다이오드 광원으로 구성된다. 대안적으로, 에너지 여기 유닛(12)은 고주파 교류 자기장 발생기를 사용함으로써 자기 유도 가열 모드(예를 들어, AMF 에너지를 유도 가열로의 자기 고체 캐리어 매개 변환)를 사용할 수 있으나, 본 발명의 실제 구현은 이에 제한되지 않는다. 에너지 여기 유닛(12)은 고상 캐리어(40) 자체와 주변 인-시츄 환경(50)의 국부적인 가열을 수행하기 위해 주로 사용된다[즉, 수백 나노미터(nm) 내지 수백 마이크로미터(μm) 범위 이내].
본 발명에 따른 핵산 급속 증폭 시스템은 외부 보조 냉각 유닛(13)의 온도 피드백을 검출하는 온도 검출 유닛(14)(예를 들어, K형 열전대); 보조 냉각 장치에서의 핵산 증폭 반응과 에너지 여기 유닛(12)에 의해 고상 캐리어(40)에 제공되는 가열의 공동 제어 하에서, PCR 수행에 필요한 국부 온도(열) 사이클이 빠르게 달성되어, 핵산 증폭이 빠르게 완료될 수 있다.
본 발명에 있어서, 신속 핵산 증폭 시스템은 작동 유닛(15)을 더 포함하며, 이는 영구 자석, 전자석 또는 이들의 조합일 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되지 않고, 작동 유닛(15)은 반응 유닛(10) 내의 고상 캐리어(40)가 간단한 자기 조작을 통해 정제, 분리, 농축/농축 과정을 수행할 수 있도록 하며, 이는 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)의 후속 검출 및 분석을 용이하게(즉, 검출 시 앰플리콘(60)의 신호 판독을 향상시킴) 할 것이지만, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 도 6에 도시된 바와 같이, 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)의 농축(concentration)/농축(enrichment)을 위한 후속 작업 동안, 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)은 간단한 자기 포획을 통해 핵산 증폭 용액(30)으로부터 분리될 수 있다. 이러한 정제 및 분리 과정은 다운스트림 검출 분석에서 핵산 분자 검출에 영향을 미칠 수 있는 간섭 물질(예: 비특이적 앰플리콘, 프라이머(301) 또는 중합효소(302))을 제거할 뿐만 아니라, 후속 분자 검출 성능(예: 분석 감도)도 향상시킨다.
본 발명은 온도 제어 장치를 단순화할 수 있으며, 단 하나의 에너지 여기 유닛(12) 및 외부 에너지 캘리브레이터(16)만으로 국부적인 온도 제어를 달성할 수 있다. 외부 에너지 교정기(16)는 에너지 여기 유닛(12)의 에너지 아웃풋을 교정하는 광도 측정기일 수 있다. 에너지 여기 유닛(12)의 에너지 출력 및 여기 타이밍 순서를 제어하여 고상 캐리어(40) 주위의 국부적인 온도(열) 사이클 제어를 달성함으로써, 모든 고상 캐리어(40) 주위에 인-시츄 환경(50)을 형성한다. 본 발명은 2차원 거울 스캐너를 이용한 2차원 레이저 스캐닝의 필요성을 제거하고, 공개 번호 US9,382,583B2의 GNA 특허(명칭: "Method for the amplification of nucleic acids using heat transfer for nanoparticles")에 개시된 바와 같음, 레이저 빔이 10나노 초 내지 500밀리 초 동안 PCR 시료의 나노 입자 일부에 선택적이고 구체적으로 집중된다.
본 발명의 일 실시예에서, 분석물(20)은 유리 디옥시리보핵산, 리보핵산, 또는 분석물(20)로부터 방출된 생물학적 물질(21)이고, 고상 캐리어(40)는 증폭체(42)로 작용한다. 도 7(a)를 참조하면, 각각의 증폭 리간드(71)는 증폭체(42)의 표면에 고정되고, 증폭 리간드(71)는 혼성화 포획을 통해 분석물(20)의 단일 가닥 또는 생물학적 물질(21)에 결합된다. 도 7(b)를 참조하면, 외부 에너지가 고상 캐리어(40)를 트리거링하여 중합효소(302)로 첫 번째 연장을 수행하기 위한 인-시츄 환경(50)을 생성하는 경우, 핵산 증폭 용액(30)의 중합효소(302)는 분석물(20)/생물학적 물질(21)의 단일 가닥과 증폭 리간드(71)를 각각 DNA 주형과 프라이머로 사용하여 첫 번째 연장을 시작했으며, 그런 다음 새로 합성된 앰플리콘(60)을 생성한다. 도 7(c)에 도시된 바와 같이, 외부 에너지가 잠시 중지된 후, 고상 캐리어(40) 주위의 열장은 보조 냉각 장치에 의해 급속 냉각되고, 그 결과 인-시츄 현장 환경이 빠르게 소산된다. 도 7(d)를 참조하면, 외부 에너지원이 다시 턴온(turn on)되어 변성 단계를 수행하기 위한 인-시츄 환경(50)을 생성하고, 이중 가닥 새로 합성된 앰플리콘(60)이 분리되어 단일 가닥 분석물(20) 및 단일 가닥 앰플리콘(60)을 형성한다. 도 7(e)를 참조하면, 외부 에너지의 잠시 중지는, 인-시츄 환경(50)의 신속한 소산에 기여한다. 핵산 증폭 용액(30) 내 형광단(3011)이 포함된 자유 프라이머(301)는 고상 캐리어(40)에 고정된 새로 합성된 앰플리콘(60)의 단일 가닥과 혼성화되며, 분석물(20)로부터 유래된 단일 가닥은 고상 캐리어(40)에 고정된 다른 증폭 리간드(71)와 재어닐링된다.
도 7(f) 내지 (g)를 참조하면, 외부 에너지원을 다시 턴온하여 프라이머 어닐링/연장 단계를 수행하기 위한 인-시츄 환경(50)을 생성하고, 인-시츄 환경(50)은 자유 프라이머(301)의 Tm(즉, 용융 온도)보다 더 높은 온도를 달성하고 유지할 수 있으며 도 7(e)에서 발생할 수 있는 비특이적 프라이머 결합을 추가로 감소시킬 수 있다. 증폭 리간드(71)에 고정된 새로 합성된 앰플리콘(60)의 단일 가닥, 및 다른 증폭 리간드 (71)과 재어닐링된 분석물(20)의 단일 가닥은 중합효소(302)에 대한 DNA 주형으로 작용하고, 자유 프라이머(301)과 증폭 리간드(71)은 다른 PCR 핵산 증폭 라운드를 위해 중합효소(302)의 연장을 개시하는 프라이머 역할을 하여, 고상 캐리어(40)에서 더 새로 합성된 앰플리콘(60)이 생성되는 결과를 발생시킨다. 도 7(h) 내지 (k)에 도시된 바와 같이, 에너지 여기 유닛(12)에 의해 촉발되는 인-시츄 환경(50)의 다른 열 사이클(예를 들어, 에너지 아웃풋 및 외부 에너지에 대한 온/오프의 타이밍 서열)는, 다른 핵산 증폭 라운드를 개시하여 앰플리콘(60)을 생성한다. 도 7(l)에 도시된 바와 같이, 이는 인-시츄 환경(50)의 다중 사이클을 수행한 후 고상 캐리어(40) 상의 증폭 리간드 용량의 포화 상태에 가까운 앰플리콘(60)의 양을 지칭한다.
본원의 일 실시예에 있어서, 고상 캐리어(40)의 "광열" 여기와 관련하여, 고상 캐리어(40)의 표면은 금 나노쉘(403)로 코팅되는 것이 바람직하다. 금 나노쉘(403)은 자기 코어(401) 및 금 나노 쉘(403)과 자기 코어(401) 사이의 중간층(402)을 포함하며, 이를 통칭하여 "자기 금 나노 쉘, MGN"이라 한다. 광열 여기는 레이저, LED 어레이 또는 이 둘의 조합을 사용하여 달성될 수 있고, 선호되는 외부 에너지원은 레이저이고, 레이저 파장은 주로 가시광선부터 근적외선 스펙트럼(380nm 내지 1.4μm)까지 다양하다. 또한, 자기 금 나노쉘(MGNs)의 단분산 현탁액은 근적외선 흡광도(750 nm 내지 1.4 μm)의 특성을 나타내며, 특히 LSPR(국부 표면 플라즈몬 공명) 흡광도 피크는 808 nm의 파장에 가깝다. 808nm 레이저를 조사하면 MGNs은 매우 효율적으로 광열 변환(즉, 플라즈몬 가열)을 생성할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, "고상 캐리어(40)의 교류 자기장(AMF)에 의한 가열"과 관련하여, 고상 캐리어(40)는 자기 코어(401)를 포함한다. 교류 자기장의 인가 하에, 고상 캐리어(40)는 주로 나노크기 구조의 자화(magnetization) 반전에 기인하는 유도 가열 효과를 나타내고, Nιel 이완 메커니즘(고상 캐리어(40)의 자화 재배향) 및 Brown 이완 메커니즘(수성 매질에서 고상 캐리어(40)의 물리적 회전)을 포함한다. 이러한 가열 능력은 나노 규모 구조의 특성(예: 평균 크기, 구성, 자화 강도, 자기 이방성), 및 적용된 교류 자기장의 진폭(Hac) 및 주파수(f)에 따라 달라진다. 교류 자기장은 교류 자기장 발생기에 의해 생성되며, 교류 자기장의 진폭과 주파수는 각 고상 캐리어(40)에 의해 인-시츄 환경(50)을 형성하는 데 필요한 온도에 필요한 자기장 조건에 기초하여 설정된다. 또한, 교류 자기장의 진폭은 미터당 0.5 내지 550킬로암페어(kA/m)이고, 교류 자기장의 주파수는 3 내지 3,500킬로헤르츠(kHz)이다.
또한, 고상 캐리어(40)는 핵산 증폭 용액(30)과 함께 현탁될 수 있고 안정한 콜로이드성 단분산 현탁액일 수 있고, 단분산 상태는 단일 분산 현탁액을 의미하며, 고상 캐리어(40)의 크기가 나노크기에 도달하면, 고상 캐리어(40)의 표면 전위로 인해 안정한 콜로이드 단분산 용액을 형성하고; 고상 캐리어(40)는 강자기 또는 초상자기 산화철 고상 캐리어(즉, 초상자기 산화철 나노 입자; SPION)일 수 있으며, 특히 Fe3O4(자석), γ-Fe2O3(마그헤마이트) 또는 MIIFe2O4 스피넬 페라이트(MII = Co2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+)를 포함한 스피넬 페라이트 나노물질일 수 있다. 페라이트 나노물질에 Ni, Co 등의 전이금속 원소를 혼합 첨가하여, 외부 교류 자기장 하에서, 더 큰 포화 자화, 안정적인 유효 자기 이방성(Keff) 및 더 강한 자화 손실을 얻을 수 있다.
교류 자기장(AMF) 유도 가열을 위한 고상 캐리어(40)의 크기는 8 내지 1,000nm 범위이다. 공통 분야 외에, 그 모양 유형에는 나노큐브, 나노팔면체, 막대, 원반, 속이 빈 구체, 별, 네발동물 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 적용된 교류 자기장의 진폭(Hac)과 주파수(f)는 넓은 주파수(3 내지 3,500kHz 범위) 및 필드 진폭(0.5 내지 550kA/m 범위)으로 광범위하게 설정될 수 있으며, 각 고상 캐리어(40)에 의해 인-시츄 환경(50)을 형성하는 데 필요한 온도에 필요한 현장 조건을 생성한다.
상기 실시예에서, 다기능체(41)의 표면개질, 농축체, 또는 고상 캐리어(40)의 증폭체(42)는 표면 충전 물질을 더 포함한다. 표면-충진 물질은 고상 캐리어(40)의 뭉침을 방지하기 위해 사용되며, 친수성을 향상시키고 고상 캐리어(40)의 수용성을 부여하고, 중합효소(302)의 흡착 억제를 감소시키고, 고상 캐리어(40)에 단백질과 프라이머(301)가 비특이적으로 흡착되는 것을 방지한다. 표면 충전 물질은 분자량이 5 내지 10kDa인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(72)와 소 혈청 알부민(BSA)(73)일 수 있다. 농축 리간드(70) 또는 증폭 리간드(71)는 고상 캐리어(40)의 표면 충진 물질에 의해 제공되는 작용기와 안정적인 공유 결합을 형성할 수 있으며, 표면 충전 물질에 의해 제공되는 관능기는 이 실시예에서 화학적 가교를 허용하기 위해 카르복실, 아민 또는 티올 그룹에 대해 바람직하다.
도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명의 핵산 증폭 방법은 수냉식 온 비드 중합효소 연쇄 반응 또는 수냉식 온 비드 루프 매개 등온 증폭을 사용하여 수행될 수 있다. 용어 "수냉식"은 냉각이 상술한 보조 냉각 유닛의 방조를 사용하여 달성됨을 의미한다. 용어 "온-비드"는 고상 캐리어(40)에 인-시츄 핵산 증폭을 수행하는 것을 의미한다. 핵산 증폭 방법은 아래 단계를 포함한다:
단계 S10: 복수의 고상 캐리어(40)와 시료를 혼합하는 단계, 시료는 적어도 하나의 분석물(20)을 포함하고, 복수의 고상 캐리어(40)는 적어도 하나의 표적 분석물(20)에 결합하고, 그런 다음 S20 단계로 진행한다.
단계 S20: 반응 유닛(10)에서는 작동 유닛(15)을 이용하여 불순물을 제거하고, 목표 분석물(20)을 농축(concentrate)(농축(enrich))시킨다. 적어도 하나의 분석물(20)이 유리 데옥시리보핵산 또는 리보핵산인 경우, S51 단계로 직접 진행하고; 그렇지 않으면 단계 S30으로 진행한다.
단계 S30: 적어도 하나의 에너지 여기 유닛(12)은 복수의 고상 캐리어(40)에 외부 에너지를 제공하고, 복수의 고상 캐리어(40)의 열장을 분석물(20)의 변성 온도(예를 들어, 80 내지 95°C)까지 상승시킨 후 S40 단계로 진행한다.
단계 S40: 적어도 하나의 분석물(20)은 용해되어 생물학적 물질(21)(예를 들어, 데옥시리보핵산 또는 리보핵산)을 방출한 후 단계 S50으로 진행한다.
단계 S50: 핵산 혼성화 온도에 도달할 때까지 에너지 여기 유닛(12)를 제어하여 복수의 고상 캐리어(40)에 외부 에너지를 제공하고, 복수의 고상 캐리어(40)를 적어도 하나의 생물학적 물질(21)과 결합시키고, 및 작동 유닛(15)을 이용하여 다중 고상 캐리어(40)를 정제, 분리, 농축한 후 S60 단계로 진행한다.
단계 S51: 핵산 혼성화 온도에 도달할 때까지 에너지 여기 유닛(12)을 제어하여 복수의 고상 캐리어(40)에 외부 에너지를 제공하고, 복수의 고상 캐리어(40)를 적어도 하나의 분석물(20)과 결합시키고, 작동 유닛(15)을 이용하여 다중 고상 캐리어(40)를 정제, 분리, 농축한 후 S60 단계로 진행한다.
단계 S60: 작동 유닛(10)에 사전 냉각된 핵산 증폭 용액(30)(즉, 핵산 증폭 용액(30)의 온도가 -10~4°C 범위)을 첨가하고 외부 보조 냉각 유닛(13)과 결합한다. 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 경우, 바로 단계 S70으로 진행한다. 수냉식 수냉 비드 루프 매개 등온 증폭을 수행하는 경우 바로 단계 S71로 진행한다.
단계 S70: 에너지 여기 유닛(12)을 제어하여 상기 복수의 고상 캐리어(40)에 외부 에너지를 제공하고, 고상 캐리어(40)의 인-시츄 환경(50)이 중합효소 연쇄 반응에서 핵산 변성(즉, 90~95°C) 및 프라이머 어닐링/중합효소 연장(즉, 60~65°C)에 필요한 온도에 도달하도록 허용하고, 적어도 하나의 효소는 복수의 고상 캐리어(40)에 대해 인-시츄 핵산 증폭을 수행하기 위해 사용될 것이다. 검출 절차를 수행하는 경우, 단계 S80으로 진행한다.
단계 S71: 에너지 여기 유닛(12)을 제어하여 상기 복수의 고상 캐리어(40)에 외부 에너지를 제공하고, 표면을 둘러싸는 인-시츄 환경(50)이 루프 매개 등온 증폭을 수행하는 데 필요한 온도(즉, 60 내지 65°C)에 도달하도록 허용하고, 적어도 하나의 효소는 복수의 고상 캐리어(40)에 대해 인-시츄 핵산 증폭을 수행하기 위해 사용될 것이다. 검출 절차를 수행하는 경우, 단계 S80으로 진행한다.
단계 S80: 작동 유닛(15)을 사용하여 증폭체(42)를 상청액으로부터 분리한다.
단계 S90: 증폭체(42)에 고정된 앰플리콘(60)의 신호 판독값 변화를 감지하기 위해 검출 모듈(17)을 사용하고, 앰플리콘(60)의 핵산 태그를 효소(즉, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제)와 결합된 항체로 인식함으로써 생성된 비색 변화, 발광 변화 또는 이들의 조합을 검출함으로써 검출한다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 수냉식 온-비드 루프 매개 등온 증폭(LAMP)이 수행된다. 도 9(a)에 도시된 바와 같이, 특정 프라이머(301)(즉, FIP, BIP) 중 적어도 하나로 기능화된 고상 캐리어는 수냉식 온-비드 루프 매개 등온 증폭을 수행하기 위한 증폭체(42)의 역할을 한다. 도 9(b)에 도시된 바와 같이, 상기 표적 핵산 서열은 분석물(20) 또는 생물학적 물질(21)에 방출될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 적어도 한 쌍의 특정 프라이머(301)는 3개의 프라이머 쌍(FIP, BIP, LF, LB, B3 및 F3)을 포함하고, 증폭체(42)에서 수냉식 온-비드 루프 매개 등온 증폭이 가능하다. 먼저, 외부 에너지 여기 유닛(12)를 오프시키고, 증폭체(42)는 기능화된 특정 프라이머(301)에 의한 DNA 혼성화를 통해 표적 핵산 서열을 포획할 것이다. 상기 핵산 서열은 분석체(20) 또는 생물학적 물질(21)일 수 있다[도 9(b)에 도시된 바와 같음]. 그러면 외부 에너지 여기 유닛(12)은 짧은 인터벌(예를 들어, 0.5 내지 3초) 동안 턴온되고, 증폭체(42)는 루프 매개 등온 증폭을 수행하는 데 적합한 온도 범위의 열장을 순간적으로 생성하며, 초기 확장은 중합효소(302)에 의해 수행된다[도 9(c)에 도시된 바와 같음]. 이후, 외부 에너지 여기 유닛(12)을 짧은 인터벌(예를 들어, 0.5 내지 1초) 동안 오프시키고, 증폭체(42)에 의해 생성된 열장은 빠르게 소산되어 루프 매개 등온 증폭을 수행하기 위한 중합효소(302)의 효소 활성을 중단시킨다[도 9(d)에 도시된 바와 같음]. 도 9(b)에서 도 9(d)까지의 단계는 앰플리콘(60)이 증폭체(42)의 용량의 포화 상태에 도달할 때까지 사이클적으로 반복된다[도 9(e)에 도시된 바와 같음]. 온-비드 LAMP 수냉이 완료된 후, 증폭체(42)의 앰플리콘(60)은 그 후 작동 유닛(15)에 의해 농축(concentrated)(농축(enriched)) 및 정제될 수 있다. 증폭체(42)에 대한 이러한 정제 및 분리 절차는 또한 온-비드 LAMP/RT-LAMP를 수냉식 한 후 앰플리콘(60)의 특정 검출을 돕기 위해서도 사용된다. LAMP/RT-LAMP 반응을 위한 FIP 및 BIP 프라이머의 3' 말단 사이에 "내부 영역"이 있는 진양성" 앰플리콘(60)은 분리되어 자기 캡처를 통해 비특이적 검출을 제거할 수 있고, 이는 수냉식 온-비드 LAMP/RT-LAMP에 의해 생성된 앰플리콘(60)의 검출을 위한 분석 특이성을 향상시키고 검출 시 위양성 발생을 감소시킨다.
또한, GNA Biosolutions의 공개 번호 US9,382,583 B2의 미국 특허 공개에 따르면, 광열 고상 캐리어(40)에 "국부적 가열"이 발생하는 것은 다음 조건에 기초한다. 에너지 여기의 인터벌이 임계 여기 인터벌(t1)보다 짧거나 같은 경우, 임계 여기 인터벌 (t1)은 다음 방정식으로 나타낼 수 있다.
t1: 나노 입자 사이의 평균 거리에서 하나의 나노 입자에서 다음 나노 입자로 열이 확산되는 데 필요한 시간을 지칭한다.
s1: 는 여기 기간(즉, 임계 여기 인터벌(t1)) 동안 고상 캐리어(40)의 열 전면이 얼마나 멀리 퍼지는지 측정하는 스케일링 계수를 나타낸다. 광 조사 시 고상 캐리어(40)에 국부적인 가열이 발생하는 경우, s1은 1보다 작거나 같다;
|X|는 각각의 고상 캐리어(40) 간의 평균 거리를 지칭한다.
D는 고상 캐리어(40) 간의 매체의 열확산 계수를 지칭한다.
상기 특허에 개시된 조건에 따르면, 복잡하고 정교한 2차원 거울 스캐너로 제어되는 2차원 레이저 스캐닝을 사용해야 하며, 레이저 빔이 10나노 초 내지 500밀리 초 동안 핵산 용액(30) 내의 플라즈몬 나노 입자의 일부에 선택적이고 특이적으로 집중된다. 따라서, 전술한 특허의 전반적인 실시에 있어서, 핵산 용액(30) 내 플라즈몬 입자의 빛 조사의 시간과 상대적인 위치를 제어하려면 위에서 언급한 것과 같은 작용을 정밀하게 제어할 필요가 있으며, 이는 PCA 기술의 성공적인 구현을 위한 중요한 요소이다.
대조적으로, 본 발명은 외부 에너지에 의해 고상 캐리어(40)의 여기를 제어하는 상대적으로 쉬운 전략을 제공하며, 고상 캐리어(40)를 둘러싸는 국부적인 열 복사 발생의 결과가 발생한다. 우선, 본 발명은 핵산 증폭 용액(30)에 현탁된 고상 캐리어(40)를 사용하며, 핵산 용액(30)의 부피에 대한 고상 캐리어(40)의 총 부피의 비율은, 1:200 내지 1:1Х109 범위이다. 바람직한 부피 비율은 1:1Х104 ~ 1:1Х108이고, 임계 여기 인터벌(t1) 여기(즉, s1; 스케일링 계수) 동안 고상 캐리어(40) 간의 거리 및 고상 캐리어(40)의 열 전단의 거리 확산이 크게 증가함을 의미한다. 따라서, 더 긴 임계 여기 인터벌(t1)은 고상 캐리어(40)에 대한 레이저 조사를 모듈레이팅하여 고상 캐리어(40)를 둘러싸는 국부적인 열 복사를 생성하는 데 사용될 수 있다.
또한, 핵산 증폭 용액(30)은 외부 보조 냉각 유닛(13) 내에 안치되고, 이는 레이저 조사 시 고상 캐리어(40)에 의해 생성된 국부적인 열장(즉, 인-시츄 환경(50))의 확산을 대폭 제한하는 냉각 환경을 제공하며, 서로 다른 고상 캐리어(40)에 의해 생성된 국부적인 열장이 서로 중첩되지 않고 독립적인 상태로 유지되도록 보장한다. 이러한 관점에서, 본 발명은 에너지 여기 유닛(12) 및 반응 유닛(10) 사이의 상대적인 이동을 제어할 필요가 없는데(즉, 핵산 용액(30) 내 플라즈몬 나노 입자의 일부에 대한 레이저 빔의 조사 방향을 매우 짧은 인터벌로 제어함), 상대적으로 긴 여기 인터벌(1초 내지 수십 초 범위)을 사용하여 "모든" 부유(suspended) 고상 캐리어(40)를 여기시킬 수 있고, 고상 캐리어(40)는 테더링되거나 고상 캐리어(40)는 반응 유닛(10)의 내벽에 내장된다. 또한, 각각의 에너지 여기 유닛(12)이 활성화되는 동안, 에너지 여기 유닛(12) 및 반응 유닛(10) 사이의 상대적인 움직임의 제어는 구현되지 않는다. 상술한 특성은 GNA Biosolutions의 미국 특허(공개 번호 US 9,382,583)에 개시된 바와 다른 차이점을 갖는다.
고상 캐리어(40)의 표면적 대 부피 비율이 높기 때문에, 고상 캐리어(40)는 분석물(20)의 앰플리콘(60)을 분리/농축하기 위한 효율적인 플랫폼 역할을 할 뿐만 아니라 분석물(20)에서 유래하는 잠재적인 억제 물질을 제거하는 데에도 사용될 수 있다. 또한, 인-시츄 핵산 증폭은 고상 캐리어(40) 주변 공간에 형성된 인-시츄 환경(50)에서 수행된다. 고상 캐리어(40)의 표면에 고정된 앰플리콘(60)의 용량이 제한되어 있기 때문에, 이는 상대적으로 짧은 작동 시간(또는 상대적으로 적은 수의 핵산 증폭 사이클)에 고상 캐리어(40) 용량의 포화 상태를 달성할 수 있게 한다. 이는 앰플리콘(60)의 후속 검출을 용이하게 한다.
도 10(a) 및 도 10(b)를 참조하면, 본 발명의 실시예에서, 선택된 자기 금 나노쉘(MGNs)은 고상 캐리어(40)로 선택되고, 광열 변환 및 광열 안정성이 우수한 특성을 나타내고, MGNs의 최적의 국부 표면 플라즈몬 공명(LSPR) 파장은 780 내지 1,000nm에 위치하며, 선호되는 범위는 800 내지 950nm이다. 본 실시예에서, 단분산 MGN 현탁액(즉, 2.9Х1010 입자/mL, 20ul의 입자 농도)의 마이크로 규모 광열 온도 측정 평가는 연속적인 10 광자 사이클로 808nm 레이저 조사 하에서 수행되었다. 도 10(a)에 도시된 바와 같이, 808 nm 광섬유 결합 레이저는 LabVIEW 소프트웨어에 의해 구동된 통합 드라이버(11)에 의해 제어되어 연속 10번의 광자 사이클을 수행한다(즉, 광자 사이클 설정, 400mW/0.16cm2에서 60초 동안 NIR 레이저를 켜고 120초 동안 레이저 끄기). 단분산 MGN 현탁액의 가장 높은 광열 변환 온도는 연속 10번의 광자 사이클 동안 62.29 ± 1.06°C에서 측정되었으며, 변동 계수는 1.70%였다. 이 결과는 MGNs이 우수한 광열 안정성을 나타냄을 보여주고, 고출력 레이저 조사 시 고상 캐리어(40)의 구성 변화로 인한 광열 온도에 큰 변화가 없음을 보여준다. 도 10(b)에 도시된 바와 같이, 고상 캐리어(즉, 자기 금 나노쉘, 2.9x1010 입자/ml, 20 μL)의 다양한 여기 전력(예: 200mW/0.16cm2, 250mW/0.16cm2, 300mW/0.16cm2, 400mW/0.16cm2, 500mW/0.16cm2, 600mW/0.16cm2, 700mW/0.16 cm2)의 NIR 레이저 조사 하에서 300초 동안의 마이크로 규모 광열 온도 측정 결과이다. 또한, 1 W/0.16 cm2의 레이저 조사 하에서 MGNs이 없는 블랭크 시료 용액의 마이크로 스케일 광열 온도 측정도 대조군으로 포함되었다. 단분산 MGN 현탁액의 광열 온도 모니터링은 정상-상태 가열로 측정되었다(즉, 레이저 조사 시간은 180초 이상). 결과는 MGNs이 MGNs의 우수한 광열 변환 특성을 가지며, 정상 상태의 광열 온도가 입력 레이저 파워에 비례한다는 것을 보여준다.
도 11(a) 및 도 11(b)를 참조하면, 단분산된 MGNs 현탁액의 마이크로 스케일에서 광열 온도 측정을 통해, 도 10(b)에서 언급한 고상 캐리어의 마이크로 규모 광열 온도 측정 결과에 기초한 것이다. 우리는 적용된 NIR 레이저 파워 강도와 단분산 MGNs 현탁액의 마이크로 스케일 광열 변환 온도의 선형 교정 곡선을 확립했다(즉, 선형 방정식: y = 0.0778x + 44.126; R2 = 0.9104). 본 발명의 일 실시예에서, 도 11(a)의 상부 패널은, 이는 세포 열 용해 및 DNA 변성을 수행하는 데 필요한 온도 범위(85 내지 95°C)를 나타내고, 도 11(a)의 하부 패널은 PCR에서 프라이머 어닐링/중합효소 연장을 수행하거나 루프 매개 등온 증폭(LAMP)에서 중합효소 연장을 수행하는 데 필요한 온도 범위(55 내지 65°C)를 나타낸다. 또한, 마이크로 스케일에서의 광열 변환 온도는 핵산 증폭을 수행하기 위한 인-시츄 환경(50)의 실제 온도 범위를 추정하는 데 사용된다. 도 11(b)에 도시된 바와 같이, 다양한 출력(예: 200mW/0.16cm2, 250mW/0.16cm2, 400mW/0.16cm2)의 NIR 레이저 조사 하에서 단분산된 MGN 현탁액의 적외선 열 이미지이다. 광열 변환 온도는 반응 유닛(10)에서 MGN 현탁액의 정상 상태에서 측정되고 레이저 조사 하에 열 카메라로 즉시 기록되었다. 도 11(b)의 상부 패널은 808 nm 레이저 파워(즉, 200 mW/0.16 cm2, 250 mW/0.16 cm2, 400 mW/0.16 cm2)을 조사한 블랭크 시료 용액의 적외선 열화상 결과, 및 27.9~29°C의 정상 상태 범위에서 광열 변환 온도를 나타내고, 이는 주변 환경 온도에 가깝다. 단분산 MGN 현탁액의 정상 상태에서 광열 변환 온도는 다양한 파워(예: 200mW/0.16cm2, 250mW/0.16cm2, 400mW/0.16cm2)의 레이저 조사에서 각각 51.6°C, 63.9°C 및 79.1°C이다.
도 12(a) 및 도 12(b)를 참조한다. 이는 보조 냉각 유닛의 레이아웃에 관한 본 발명의 실시예이다. 100 광자 사이클의 NIR 레이저 조사 하에서 단분산 MGNs을 포함한 핵산 증폭 용액의 전체 온도 변화(즉, 각 광자 사이클은 통합 드라이버에 의해 400mW/0.16cm2에서 1.25초 동안 모듈레이팅 된 후, 0.5초 동안 레이저를 끄고, 150mW/0.16cm2에서 7.5초 동안 조사됨). 도 12(a)에 도시된 바와 같이, 본 실시예에서 보조 냉각 장치의 레이아웃은 대용량의 핵산 증폭 용액(30)(즉, 부피가 100μL) 및 외부 보조 냉각 유닛(13)을 포함한다. 본 실시예에서, 외부 보조 냉각 유닛(13)은 열용량이 높은 물질(즉, 얼음, 물 550μL)을 사용하여 핵산 증폭 용액(30)이 포함된 반응 유닛(10)을 둘러싸며, 이는 반응 유닛(10) 내의 핵산 증폭 용액(30)의 냉각 온도(즉, 2 내지 10°C)를 유지하는데 용이하다. 도 12(b)에 도시된 바와 같이, 레이저 조사의 100 광자 사이클 동안 5.8Х108 입자 수의 MGNs으로 현탁된 핵산 증폭 용액의 전체 온도 모니터링이 측정되고 사전 냉각된 핵산 용액(30)의 다른 부피(즉, 20 및 100 uL)를 사용하여 핵산 용액(30)에 기록한다. 도 12(a)에 도시된 바와 같이, 그루핑(grouping)은 외부 보조 냉각 유닛(13)가 활용되는 지 여부에 기초한다. 또한 상기 핵산 증폭 용액(30)은 제어 그룹으로 기능한다. 그 다음, 상술한 작동 조건의 조합이 핵산 증폭 용액(30)의 온도를 냉각 온도 범위(즉, 2 내지 10°C)에서 얼마나 많은 외부 레이저 조사 사이클(즉, 광자 사이클) 하에서 유지할 수 있는 지 여부도 평가된다. 또한, NIR 레이저 조사 사이클에 따라 핵산 증폭 용액(30)의 온도가 변화하는 지 여부도 평가된다. 실험 그룹에는 외부 보조 냉각 유닛(13)를 갖춘 100 μL MGNs 현탁액, 외부 보조 냉각 유닛(13)를 갖춘 100μL 블랭크 시료 용액, 외부 보조 냉각 유닛(13)이 없는 100 μL MGNs 현탁액, 및 외부 보조 냉각 유닛이 없는 20μL MGNs 현탁액을 포함했다. 도 12(b)에 도시된 바와 같이, 핵산 증폭 용액의 온도와 레이저 조사 사이클은 각각 왼쪽과 오른쪽의 Y축에 해당하며, 왼쪽과 오른쪽의 Y축은 핵산 증폭 용액의 온도(°C)와 레이저 파워(mW)에 해당한다. 결과는 외부 보조 냉각 유닛(13)을 갖춘 대용량 핵산 증폭 용액(30)(즉, 100 μLMGNs 현탁액)의 실험 대조군은, 핵산 증폭 용액(30)의 온도를 냉각 온도 범위(2 내지 10°C) 내에서 유지할 수 있고, 65번의 광자 사이클 동안 큰 온도 변동이 없었음을 보여준다. 또한, 광 사이클의 작동 조건을 협력시켜, 대용량의 핵산 증폭 용액(30) 및 외부 보조 냉각 유닛(13), 우리의 결과는 레이저 조사에 의해 유도된 MGNs의 가열 모드가 "국부 가열" 모드에 속한다는 것을 보여주고, 이는 가열이 인-시츄 환경(50)으로 제한된다.
도 13(a) 및 도 13(b)는 본 발명의 실시예를 도시하는데, 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)을 사용하여 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응에 의해 생성된 앰플리콘(60)을 검출한다. 도 13(a)에 도시된 바와 같이, 수냉식 온 비드 중합효소 연쇄 반응 후, MGNs의 자기적 특성으로 인해, MGNs에 고정된 앰플리콘(60)은 자기 작동 유닛(15)에 의해 정제 및 농축(concentrate)/농축(enrich)하는 데 사용될 뿐만 아니라 핵산 증폭 용액(30)에 존재하는 비특이적 핵산 산물 및 기타 물질(예: 프라이머(301) 또는 중합효소(302))을 제거할 수도 있다. 자기 분리의 절차 후, 정제되고 농축된 앰플리콘(60)-고정된 MGNs은 TBST 완충액으로 재현탁시켰고, 그런 다음 빠른 검출은 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)을 사용하여 수행되었다. 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)은 액체가 모세관 현상에 의해 이동하는 다양한 다공성 막으로 구성된다. 도 13(a) 및 도 13(b)에 도시된 바와 같이, 본 실시예에서 MGNs에 고정된 앰플리콘(60)은 핵산 태그에 통합되고, 이는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 프라이머(301)이다. 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)으로 검출하는 동안, MGNs에 고정된 앰플리콘(60)을 포함하는 액체는 특정 항체가 결합된 콜로이드 금을 포함하는 결합 패드를 통해 이동하고, 액체 혼합물은 콜로이드 금과 접합된 방출된 항체를 포함하고 MGNs에 고정된 앰플리콘(60)은 스트립을 따라 검출 영역으로 이동하고, 특정 포획 항체가 다공성 막에 분배되어 테스트 라인(1711)(즉, 항-플루오레세인 이소티오시아네이트 항체의 침착) 및 대조 라인(1712)(즉, 항-마우스 항체의 침착)을 형성한다. 상기 혼합액에 대한 항체인식은 테스트 라인 및 대조 라인에서 일어나는 반면, 그와 대응되는 영역(예를 들어, 테스트 라인(1711) 또는 대조 라인(1712)에 형성된 라인)에서는 시각적 검사를 위한 판독이 발생한다. 이 감지 절차는 3 내지 5분 내에 완료될 수 있으며, 대조 라인의 반응은 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)을 통해 적절한 액체 흐름을 나타낸다.
도 14(a) 및 도 14(b)는 본 발명의 다른 실시예를 나타내는데, 도 13(b)에 도시된 바와 같이 플라즈몬 열 감지 및 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)을 통합한다. 플라즈몬 열 감지 기술은 종래 측면 흐름 면역 측정 스트립(171)의 분석 민감도를 향상시킬 수 있다. 도 14(a)는 MGNs에 고정된 앰플리콘(60)이 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 프라이머(301)와 통합됨을 보여준다. 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)을 이용한 검출에 있어서, MGNs에 고정된 앰플리콘(60)의 핵산 태그는 측면 흐름 스트립(171)의 테스트 라인(1711)에 분배된 항-플루오레세인 이소티오시아네이트 항체에 의해 인식되고 포획되고, 육안 검사를 위한 판독 결과를 발생시킨다. 근적외선 영역에서 MGNs의 독특한 LSPR 특성으로 인해, 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 테스트 라인(1711)에 증착된 MGNs은 NIR 레이저 조사 하에서 플라즈몬 가열을 생성할 수 있다. 본원의 실시예에서, NIR 레이저-결합 적외선 열 센서(172)는 플라즈몬 열 감지를 수행하기 위한 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)과 통합된다. 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 분석 민감도와 비교하면, 플라즈몬 열 감지는 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 결과 해석에 대해 더 나은 민감도를 갖는다. 도 14(b)는 도 13(b)에 도시된 바와 같이 플라즈몬 열 감지 및 측면 흐름 면역 분석 스트립을 통합함으로써 검출된, 수냉식 온-비드 핵산 증폭의 음성 결과가 검출된 개략도이다. MGNs에 고정된 앰플리콘(60)은 테스트 라인(1711)에 분배된 항-플루오레세인 이소티오시아네이트 항체에 의해 인식되고 포획되지 않으므로, NIR 레이저 결합 적외선 열 센서(172)로 검출 중인 테스트 라인(1711)에서 상당한 플라즈몬 가열이 발생하지 않는다.
도 15(a) 및 도 15(b)를 참조한다. 이는 수냉식 온-비드 PCR 및 측면 흐름 면역 분석 스트립으로 인-시츄 증폭 및 후속 검출을 수행하는 본 발명의 일 실시예이다. 본 실시예에서, 종래의 Escherichia coli(E. coli ATCC35218)의 PCR 검출에 사용된 malB 유전자 단편이 검출 대상으로 선택된다. 다양한 광자 사이클(즉, 10 내지 50 사이클 범위; 각각의 광자 사이클은 400mW/0.16cm2에서 1.25초 동안 통합 드라이버에 의해 모듈레이팅 된 후, 0.5초 동안 레이저가 꺼지고, 그런 다음 150mW/0.16cm2에서 7.5초 동안 조사함)에서의 수냉식 온-비드 PCR의 성능 평가는 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)으로 분석된다. MGNs(즉, 고상 캐리어(40)) 상의 malB 유전자 유래 앰플리콘(amplicon)을 분석하는 것 외에, 핵산 증폭 용액(30) 내 malB 유전자 유래 앰플리콘(60)도 우레아 아가로스 겔을 이용하여 분석된다. 도 15(a)에 도시된 바와 같이, 광자 사이클 수가 증가함에 따라, 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 테스트 라인(1711)에 대한 육안 검사 판독값도 점차적으로 증가한다. 낮은 증폭 성능 문제는 초증폭의 광자 사이클에서 NIR 레이저 모듈레이션의 시간 인터벌이 매우 짧기 때문에 발생하는데, 이는 광자 사이클의 수를 증가시킴으로써 개선될 수 있다. 도 15(b)에 도시된 바와 같이, 핵산 증폭 용액(30)의 MalB 유전자 유래 앰플리콘도 우레아 아가로스 겔로 분석된다. 우선, 작동 유닛(15)은 MGNs 및 핵산 증폭 용액(30)의 상청액을 분리하는 데 사용되고, 핵산 용액(30)의 상청액의 DNA는 에탄올 침전으로 농축되고, 농축된 DNA는 고농도 요소와 열로 처리되어 DNA를 변성시킨다. 다음으로, 변성 우레아 아가로스 겔 전기영동은 수행하여 핵산 증폭 용액(30)의 상청액에 잔류 앰플리콘(60)이 있는지 분석하도록 수행된다. 정제된 MalB-FITC 단편은 FITC로 표지된 MalB 유전자의 앰플리콘이며, 앰플리콘(60)에 대한 양성 대조군으로 사용된다. 정제된 B3-FITC 표지 프라이머는 FITC로 표지된 B3 프라이머이며, 프라이머의 양성 대조군으로 사용된다. 우리의 결과는 10 내지 30사이클 범위의 다양한 광자 사이클 후에 상청액에서 자유 프라이머(301)만이 검출되었으며, 핵산 증폭 용액(30)의 상청액에는 앰플리콘(60)이 존재하지 않았음을 나타냈다. 이는 MGNs에서 핵산 증폭이 발생했음을 간접적으로 증명하고; 도 15(b)에서, DNA 사다리는 "L"로 표시된 DNA 분자량에 대한 참조 마커로서 추가되고; 또한, 가열 및 변성되지 않은 시료는 도 15(b)에서 "N"으로 표지되었고, 가열 및 변성된 것은 "D"로 표지되었다.
도 16(a) 및 도 16(b)를 참조한다. 본 발명의 일 실시예이다. MalB 유전자 검출을 위한 종래 중합효소 연쇄 반응과 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응의 성능 비교는 단순 DNA 시료를 이용하여 평가되었다. 단순 DNA 시료는 게놈 DNAs가 그와 상응하는 미생물 균주에서 파생되었음을 의미한다. 도 16(a)에 도시된 바와 같이, 종래 중합효소 연쇄 반응의 분석 민감도는 다양한 카피 넘버(즉, Escherichia coli의 malB 유전자의 0, 10, 102, 103, 104, 105, 106 카피)를 함유한 게놈 DNA를 40 열 사이클(즉, 각 열 사이클 설정: 15초 동안 95°C, 후속 30초 동안 60°C) 하에서 평가되었고, malB 앰플리콘(60)은 아가로스 겔로 분석되었다. 도 16(a)의 하부 패널에 도시된 바와 같이, malB 유전자를 검출하기 위한 종래 중합효소 연쇄 반응의 분석적 특이성 외에도 주형 대조(NTC) 및 다른 미생물에서 유래한 게놈 DNAs를 사용하지 않고 평가되었다. 도 16(a)의 하부 패널은 왼쪽의 DNA 분자량 표준을 보여주는데, 이는 아래와 같음, 템플릿 제어가 없는 간단한 시료, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus ATCC: BAA977, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Mycobacterium abscessus, Candida albicans, Aspergillus niger 및 Escherichia coli ATCC: 왼쪽에서 오른쪽으로 35218. 단순 시료는 왼쪽에서 오른쪽으로 1 내지 12로 표지된다. 우리의 결과는, 단순 DNA 시료를 이용하여 malB 유전자를 검출하는 종래의 중합효소 연쇄 반응의 LOD(검출한계)는 반응당 10 내지 102 카피 범위였으며, 종래의 malB 유전자 검출을 위한 중합효소 연쇄 반응은 분석 특이도가 우수함을 보여주었다. 유사하게, 측면 흐름 면역 분석 스트립과 결합된 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응의 분석 민감도는 0, 1, 10, 102, 103 및 104 카피의 다양한 malB 유전자 카피 수를 함유한 게놈 DNA를 사용하여 평가되었고, 이는 Escherichia coli 유래 게놈 DNA의 0, 0.00675, 0.0675, 0.675, 6.75 및 67.5 피코그램(pg)에 해당한다. 도 16(b)에 도시된 바와 같이, 상기 결과는 측면 흐름 면역 분석 스트립과 결합된 수냉식 온-비드 PCR의 LOD가 반응당 10 내지 102개 카피 범위임을 보여주었고, 이는 malB 유전자 검출을 위한 기존 PCR의 분석 민감도와 유사하다.
도 17(a) 및 도 17(b)를 참조한다. 이는 본 발명의 일 실시예이다. 종래 중합효소 연쇄 반응 및 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응의 성능 비교는 복합 DNA 시료를 갖는 malB 유전자를 검출하기 위해 평가되었다. 복합 DNA 시료는 E. coli(ATCC: 35218)의 게놈 DNA 외에, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus(ATCC: BAA977), Streptococcus agalactiae 및 Enterococcus faecalis를 포함한 인간의 5가지 다른 일반적인 병원성 미생물로부터 유래된 게놈 DNAs를 포함한다. 도 17(a)에 도시된 바와 같이, malB를 검출하기 위한 유전자 종래 중합효소 연쇄 반응의 분석 민감도 비교는 다양한 수의 malB 유전자(즉, 0, 1, 10, 102, 103, 104, 105 및 106 카피)를 6.75 ng(106 카피와 동일함)의 상술한 5가지 다른 일반적인 병원성 미생물로부터 유래한 게놈 DNA와 혼합함으로써 평가되었다. 40회 열 사이클(즉, 각 열 사이클의 설정: 95°C에서 15초, 후속 60°C에서 30초) 후, malB 앰플리콘(60)은 아가로스 겔로 분석되었다. 우리의 결과는 malB 유전자를 검출하기 위한 종래 중합효소 연쇄 반응의 LOD는 반응당 105개 카피만큼 크게 감소함을 보여주었다. 도 17(b)에 도시된 바와 같이, 유사하게, malB 유전자를 검출하기 위한 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)과 결합된 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응의 분석 민감도는 상술한 복합 DNA 시료로 평가되었다. 우리의 결과는 측면 흐름 면역 분석 스트립과 결합된 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응의 LOD가 여전히 반응당 10 및 102 카피로 유지되는 것을 보여주었다. 또한, 우리의 결과는 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)과 결합된 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응의 분석 감도는 분석물(20)에서 유래된 핵산의 복잡성에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 입증했다.
도 18(a) 및 도 18(b)를 참조한다. 본 발명의 일 실시예이고, 이는 기능성 리간드가 고정된 고상 캐리어(40)(즉, 농축체 및 증폭체(42))와 혼합된 현탁액의 표적 농축 및 광열 용해 성능 평가이다. 집락 형성 유닛(colony-forming-units; CFUs) 테스트는 다양한 전력 밀도(예: 300초 동안 0 내지 500mW/0.16cm2)의 NIR 조사 시 표적 분석물(20)(예: E. coli)의 포획 효율과 광열 용해 효율을 평가하는 데 사용된다. 우선, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 실험은 농축체 및 증폭체(42)를 포함하는 혼합 현탁액을 사용함으로써 수행되었다. 농축체 및 증폭체(42)는 모두 자기 금 나노쉘(MGSn)에 속한다. 농축체는 E. coli 세포(즉, 표적 분석물(20))를 특이적으로 포획하는 데 사용되고, 농축체에 포획된 E. coli는 작동 유닛(15)에 의한 자기 포획을 통해 정제 분리되고, 그 후 농축체에 포획된 표적 분석물(20)을 광열 용해시키고, 여기서 분석물(20)은 완충액 또는 바이오시료에 현탁된 E. coli 세포(ATCC:35218)이고, 광열 용해 과정은 E. coli로부터의 생물학적 물질 방출 결과를 발생시킨다. 증폭체(42)는 혼성화 포획을 통해 E. coli로부터 방출된 생물학적 물질(21)과 결합하는 데 사용된다. 도 18(a)에 도시된 바와 같이, 혼합된 현탁액은 농축체 및 증폭체(42)를 포함한다. 농축체는 농축 리간드(70)로 기능화되고(즉, E. coli의 O 및 K 항원에 대한 특이적 항체), 증폭체(42)는 증폭 리간드(71)로 기능화된다(즉, malB F3 프라이머(301)는 E. coli에 고유한 malB 유전자 내의 서열을 특이적으로 혼성화 할 수 있다). 도 18(a)의 상부 패널에 도시된 바와 같이, 본 실시예에서, 20μL의 혼합 현탁액의 혼합물은 동량의 농축체 및 증폭체 42, 1μL의 E. coli 용액(즉, OD600에서 0.01; 8Х103 CFUs)을 포함하며, 1% BSA를 함유한 TBST 완충액 19 μL을 포함한다. 실온에서 20분 동안 면역 포획하는 과정을 거친 후, 농축체 및 증폭체(42)는 자기 작동 유닛(15)를 통해 정제 및 농축될 것이고, 그 후 TBST 완충액으로 세척된다. 농축체에서 포획된 대장균은 집락 형성 유닛 테스트를 사용함으로써 평가될 것이며, 우리의 결과는 농축체를 갖는 특정 농축이 낮은 배경 및 매우 특이적인 대장균 포획을 달성할 수 있음을 확인하였다. 그러나, 상기 실시예의 단계는 증폭체(42)만을 함유하는 현탁액으로 수행되는 경우, 대장균을 효과적으로 포획할 수 없으며, 이는 대장균의 특정 포획이 농축체에서만 발생한다는 증거를 제공한다. 도 18(a)의 하부 패널에 도시된 바와 같이, 본 발명의 다른 실시예에서, 농축체의 광열 용해 성능은 다양한 출력(즉, 0mW/0.16cm2, 300mW/0.16cm2, 400mW/0.16 cm2 및 500 mW/0.16cm2)에서 5분 동안 808nm 레이저 조사 하에 트리거링된 농축체에 포획된 대장균이 함유된 현탁액을 사용함으로써 평가되었다. 광열 용해 과정을 거친 후, 농축체와 자유 농축체에 포획된 대장균이 함유된 현탁액을 LB 플레이트에서 배양하고, 농축체에서 포획된 대장균의 생존율은 플레이트에서 눈에 보이는 박테리아 성장의 콜로니를 직접 계수함으로써 결정되었다. 대장균의 열 유도된 세포 사멸에 대한 농축체의 광열 용해 효율은 콜로니-형성 단위 테스트를 사용함으로써 평가되었다. 배양 접시에 CFUs가 없는 경우, 농축체에 포획된 대장균이 광열 용해 과정을 통해 완전히 용해되었음을 나타낸다. 우리의 결과는 400mW/0.16cm2로 5분간 연속 레이저 조사하는 것이 농축체에 포획된 대장균을 대부분 용해시키기에 충분함을 보여주었다. 도 18(b)에 도시된 바와 같이, 다양한 레이저 파워 하에서 농축체 및 증폭체(42)를 포함하는 혼합 현탁액의 광열 용해 성능이 평가되는데, 이 실시예에서, 성능 평가는 수냉식 온-비드 PCR을 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)과 통합한다. 다양한 레이저 파워 하에서 광열 용해의 절차 후, malB 유전자 단편을 함유한 생물학적 물질(21)은 대장균(ATCC: 35218)으로부터 방출된다. malB 유전자 단편은 증폭체(42)에 기능화된 증폭 리간드(71)에 의해 인식되고 포획되며, malB-포획 증폭체(71)는 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위해 레이저 여기를 받는다. 후속하여, 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 테스트 라인에 대한 신호 판독은 다른 힘을 가진 NIR 레이저 조사 하에서 농축체 및 증폭체(42)의 광열 용해 효율을 평가하는 데 사용된다. 우리의 결과는 400mW/0.16cm2에서의 5분간의 연속 레이저 조사가 광열 용해를 수행하는 데 가장 적합한 조건임을 보여주었다. 이 결과는 도 18(a)의 상술한 콜로니-형성 유닛(CFUs)의 결과와 일치한다.
도 19(a) 및 도 19(b)를 참조한다. 이는 시료 전처리의 전반적인 과정(즉, 표적 분석물(20) 농축 및 광열 용해 과정)을 수행하기 위한 농축체와 증폭체(42)의 혼합 현탁액을 포함하는 현탁액, 수냉식 온-비드 PCR 및 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)을 이용한 본 발명의 실시예이다. 본 통합 플랫폼에서는, 농축체 및 증폭체(42)가 자기 금 나노쉘(MGNs)에 속하며, 농축 리간드(70)는 대장균의 O 항원과 K 항원에 대해 특이적으로 항체로 기능화되고, 증폭 리간드(71)은 malB 유전자의 서열을 인식하고 포획할 수 있는 F3 프라이머(301)(즉, malB F3 프라이머)로 기능화된다. 대장균(대장균 ATCC: 35218)의 세포 수는 600nm에서의 광학 밀도(즉, OD600=1, 8x108 CFU/ml)로부터 추정되고, 그런 다음 다양한 양의 대장균은 분석물(20)(즉, 0 CFUs, 8 CFUs, 8Х10 CFUs, 8Х102 CFUs 및 8Х103 CFUs)으로 TBST 완충액에 첨가되었다. 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)과 결합된 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응은 통합 플랫폼의 분석 민감도 및 전체 처리 시간을 평가하도록 활용되었다. 도 19(a)에 도시된 바와 같이, 통합 플랫폼의 운영 절차 흐름도에는 최소한 네 가지 주요 단계가 포함됨: “표적 분석물(20)을 포획하고 농축하는 단계”, "분석물의 광열 용해 및 방출된 생물학적 물질(21)의 포획 단계", "레이저 여기를 이용한 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄반응" 및 "측면 흐름 면역 분석 스트립(171)을 사용한 검출".
"표적 분석물(20)의 포획 및 농축" 과정에서 농축체의 현탁액 5μL, 증폭체(42)의 현탁액 15μL, 분석물(20) 1μL는 1% 소 혈청 알부민을 포함하는 19 μL의 TBST 완충액에 첨가되었고, 그런 다음 25°C에서 20분간 진탕하면서 배양하였다. 이는 증폭체(42) 상에서 기능화된 증폭 리간드(71)가 대장균의 세포를 포획할 수 있게 하며, 후속적으로, 자기 분리는 작동 유닛(15)으로 농축체 및 증폭체(42)를 농축(concentrate)(농축(enrich))하고, 상청액을 제거하고 TBST 완충액으로 불순물을 제거하는 데 사용된다. 이 단계는 25분 내에 완료될 수 있다.
분석물의 광열 용해 및 방출된 생물학적 물질(21)의 포획"의 단계. "표적 분석물(20)을 포획 및 농축"하는 과정을 거친 후, 혼합 농축체 및 증폭체(42)는 20μL의 TBST 완충액에 재현탁되었고, 그런 다음 400mW에서 5분간 연속 808nm 레이저를 조사하여 광열 용해를 수행하였고, 그런 다음 생물학적 물질(21)이 용해된 분석물(20)에서 방출된다. 방출된 생물학적 물질(21)은 혼성화 포획을 통해 증폭체(42)에 증폭 리간드(71)에 의해 결합된다. 자기 작동 유닛(15)은 농축체 및 증폭체(42)를 농축하고, 상청액의 표적 분석물(20)에서 유래된 추정 PCR 억제 물질을 제거하는 데 사용된다. 후속하여, 사전 냉각된 100μL의 핵산 증폭 용액(30)을 첨가하여 혼합 농축체 및 증폭체(42)를 재현탁한다.
"레이저 여기를 사용한 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응"의 단계. “분석물의 광열 용해 및 방출된 생물학적 물질(21)의 포획” 과정을 거친 후, 혼합 농축체 및 증폭체(42)를 사전-냉각된 핵산 증폭 용액(30)에 재현탁시키거나 외부 보조 냉각 유닛(13)에 배치하고, 상기 사전-냉각 반응 유닛(10) 또는 외부 보조 냉각 유닛(13)는 냉각 온도를 유지하고, 그런 다음 40개의 광자 사이클이 있는 NIR 레이저 조사 하에서 여기된다(즉, 각 광자 사이클은 통합 드라이버에 의해 1.25초 동안 400mW/0.16cm2로 모듈레이팅 되고, 그 다음 0.5초 동안 레이저를 끈 다음, 150mW/0.16cm2에서 7.5초 동안 조사함). 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 체인 후. 자기 작동 유닛(15)은 그 다음 농축체 및 증폭체(42)를 농축하고 상등액을 제거하는 데 사용되고, 20μL의 TBST 완충액을 첨가하여 혼합 농축체 및 증폭체(42)를 재현탁한다. 이 단계는 6분 내에 완료될 수 있다.
"측면 흐름 면역 분석 스트립(171)을 이용한 검출"의 단계. "레이저 여기를 이용한 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄반응" 과정을 거쳐, 혼합 농축체 및 증폭체(42)는 TBST 완충액에 재현탁되고, 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)을 사용하여 검출된다. 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 테스트 라인(1711)에 대한 신호 판독값은 육안 검사를 통해 직접 관찰될 수 있고, 또는 NIR 레이저 결합 적외선 열 센서(172)를 갖춘 플라즈몬 열 감지를 사용하여 검출될 수 있다. 이 단계는 3 내지 5분 내에 완료될 수 있다. 통합 플랫폼의 전반적인 단계는 45분 내에 완료될 수 있다.
도 19(b)에 도시된 바와 같이, 도 19(a)에 도시된 전반적인 단계가 완료되었고, 이는 수냉식 온-비드 중합효소 연쇄 반응 및 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)에 의한 후속 검출의 단계를 포함한다. 우리의 결과는 신호 판독값은 반응당 대장균 8 CFU의 분석 민감도로 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 테스트 라인(1711)에서 시각적으로 관찰될 수 있음을 보여주었다.
도 20(a), 도 20(b), 도 20(c)를 참조한다. 이는 본 발명의 다른 실시예로, 표적 분석물 농축, 광열 용해 및 수냉식 온-비드 PCR 과정을 거친 후, 측면 흐름 면역 분석 스트립(171) 및 기존 측면 흐름 면역분석 스트립(171)과 결합된 플라즈몬 열 감지의 분석 성능 비교이다. 도 19(b)에 도시된 바와 같이, 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 테스트 라인(1711)에서의 밴드 강도(즉, 테스트 라인의 픽셀 강도)는 이미지 분석 소프트웨어(즉, Image J)를 사용함으로써 분석되었다. 다양한 대장균 로딩(즉, 반응당 대장균의 0 CFUs, 8 CFUs, 8Х10 CFUs, 8Х102 CFUs, 및 8Х103 CFUs) 하에서 분석된 테스트 라인(1711)에서의 밴드 강도는 도 20(a)에 도시된다. 이미지 정량 분석은 이미지 분석과 결합된 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 분석 민감도가 반응당 8 CFU의 대장균을 달성할 수 있는 것으로 나타났으나, 반응당 8 내지 8Х10 CFUs의 대장균에서 테스트된 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 테스트 라인(1711)에서의 밴드 강도는 육안 검사를 통해 도전적이었다. 본 발명의 실시예에서, 플라즈몬 열 감지를 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)과 통합하는 방법은 종래의 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)에 비해 식별율을 획기적으로 향상시킬 수 있다. 도 20(b)에 도시된 바와 같이, 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 테스트 라인(1711)을 포함하는 검출 영역은 NIR 레이저 결합 적외선 열 센서(172)에 의해 각각 생성된 24mW/0.16cm2 및 140mW/0.16cm2의 808nm 레이저 출력이 조사되었으며, 그런 다음 NIR 레이저 결합 적외선 열 센서(172)는 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 테스트 라인(1711)에 초점을 맞춰 열 영상을 캡처하는 데 사용된다. 도 20(c)에 도시된 바와 같이, 배경 환경의 주변 온도를 뺀 후, 열 온도 차이의 정량적 결과는 808nm 레이저 조사 하에서 에너지 출력이 24mW/0.16cm2 및 140mW/0.16cm2인 열화상을 각각 최소 120초 동안 촬영하여 얻었다. 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)과 결합된 NIR-레이저 결합 적외선 열 센서의 LOD는 블랭크의 평균(즉, 대장균의 0 CFU)에 블랭크의 표준 편차의 3배를 더한 값으로 추정된다. LOD 값(즉, 명시된 신뢰도 수준으로 블랭크가 없는 것과 구별될 수 있는 광열 온도 차이의 가장 낮은 양)은 도 20(c)에서 빨간색 점선으로 표시된다. 우리의 결과는 반응당 8CFU에서 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)과 결합된 NIR-레이저 결합 적외선 열 센서의 광열 온도 차이는 24mW/0.16cm2 및 140mW/0.16cm2의 파워로 레이저 조사 하에서 각각 26.83°C 및 42.87°C이다. 다양한 레이저 조사 하에서 광열 온도 차이는 LOD 값(예: LOD=11.82°C, 24mW/0.16cm2; LOD=16.76°C, 140mW/0.16cm2)보다 훨씬 높다. 우리의 결과는 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)으로 플라즈몬 열 감지를 통합하는 방법은 상대적으로 적은 양의 표적 분석물(20)을 함유한 시료의 식별율을 크게 향상시킬 수 있음을 입증했다.
수냉식 온 비드 PCR의 인-시츄 증폭 성능에 대한 핵산 증폭 용액(30)의 냉각 온도의 영향을 이해하기 위해, 외부 보조 냉각 유닛(13)(예: 얼음 팩 또는 대형 얼음 팩)의 존재 또는 부재, 흡열 물질의 특정 비열 용량(예: 얼음 팩의 크기, 핵산 증폭 용액(30)의 부피)를 테스트함으로써, 레이저 여기 하에서 빠른 열 방출의 영향에 대한 문제를 추가로 조사하였다. 핵산 증폭 용액(30)의 전체 온도 차이(T; °C)는 수냉식 온-비드 PCR의 수행 동안 다양한 상술한 조건 하에서 모니터링되었다. 모든 실험군은 "O군"(즉, 외부 보조 냉각 유닛(13)으로서의 얼음 팩, 100μL 핵산 증폭 용액(30)), "Non 그룹"(즉, 얼음 팩 없는, 100 μL 핵산 증폭 용액(30)), "Non(2x) 그룹"(즉, 얼음 팩 없는, 200 μL 핵산 증폭 용액(30)), 및 "E 그룹"(즉, 확대된 얼음 팩, 100 μL 핵산 증폭 용액(30))으로 분류되었다. 각 실험 그룹에는 두 개의 중복 실험이 포함되어 있으며 각 실험에는 2.8Х108 입자에서 동일한 양의 MGNs이 있다. 얼음 팩은 물 550μL를 얼려 준비하였고, 확대 얼음 팩은 물 2,200μL를 얼려 준비했다. 도 21(a)를 참조하면, 본 발명의 실시예에서, 증폭체(42)로는 직경 190 nm의 MGNs이 사용되었고, 수냉식 온-비드 PCR 반응은 50 광자 사이클(즉, 각각의 광자 사이클의 설정: 690mW에서 1.25초 동안 NIR 레이저 조사, 이어서 7.5초 동안 360mW에서 레이저 조사) 조사 하에 앞서 언급한 그룹화에 따라 서로 다른 초기 온도에서 수행되었다. 수냉식 온-비드 PCR을 수행하는 동안 핵산 증폭 용액(30)의 전체적인 온도차를 열전대 센서로 즉시 모니터링되고 기록되었다. 도 21(b)를 참조하면, 위에서 언급한 그룹의 각 실험에 대해, 핵산 용액(30)의 냉각 온도에 대한 수냉식 온-비드 PCR의 인-시츄 증폭 성능은 비드-기반 효소 결합 면역 흡착 분석법(비드-기반 ELISA)에 의해 평가되었다. 왼쪽의 Y축은 산점도에 해당하며, 수냉식 온-비드 PCR을 수행한 후 핵산 증폭 용액(30)의 온도 차이를 나타낸다. "O1 그룹"의 온도차는 11.2°C(3.8 내지 15°C), "O2 그룹"은 10.1°C(2.1 내지 12.2°C), "Non-1 그룹"의 온도차는 16.8°C(13.5 내지 30.3°C), "Non-2 그룹"의 온도 차이는 20.1°C(12.6 내지 32.7°C), "Non(2x)-1 그룹"의 온도 차이는 14.2°C(17.2 내지 31.4°C), "Non(2x)-2 그룹"의 온도 차이는 14.8°C(17.5 내지 32.3°C), 'E1 그룹'의 온도차는 9.8°C(1.1 내지 10.9°C), "E2 그룹"의 온도 차이는 6.7°C(-8.7 내지 -2°C)였다. 오른쪽의 Y축은 히스토그램 플롯에 해당하고, 비드-기반 ELISA에 의해 생성된 450nm(A450)에서의 흡광도 값을 나타내며, 핵산 용액(30)의 냉각 온도에 대한 수냉식 온-비드 PCR의 정량적 성능 평가는 비드-기반 ELISA에 의해 평가되었다. 비드-기반 ELISA에 의해 생성된 450 nm에서의 더 높은 흡광도 값은 이것이 수냉식 온-비드 PCR 동안 더 나은 인-시츄 증폭 성능을 가짐을 나타낸다. "O1 그룹"의 흡광도는 0.147, "O2 그룹"의 흡광도는 0.168, "Non-1 그룹"의 흡광도는 0.132, "Non-2 그룹"의 흡광도는 0.120, "Non(2x)-1 그룹"의 흡광도는 0.128, "Non(2x)-2 그룹"의 흡광도는 0.138, "E1 그룹"의 흡광도는 0.148, "E2 그룹"의 흡광도는 0.195였다. 우리의 결과는 핵산 증폭 용액(30)의 온도차가 더 작을수록, 수냉식 온-비드 PCR의 인-시츄 증폭 성능이 더 개선됨도 보여주었다. 외부 보조 냉각 유닛(13)은 더 개선된 조건을 제공하여 핵산 증폭 용액(30)이 냉각 온도 범위 내에서 유지되기 용이하도록 하고, 그 냉각 성능은 단순히 미리 냉각된 핵산 증폭 용액(30)을 대량(즉, 100 내지 200μL)으로 사용하는 것보다 훨씬 더 뛰어나다.
본 발명의 실시예에서, 수냉식 온-비드 PCR은 NIR 레이저 조사를 이용한 광자 사이클 하에서 수행되었으며, 여기서 고상 캐리어(40) 주위에 생성된 열 사이클은 광자 사이클에 의해 제어되고, 통합 드라이버(11)에 의해 변조된 NIR 레이저 조사의 파워 아웃풋 및 온오프의 타이밍 서열을 포함한다. 각각의 광자 사이클은 고상 캐리어(40) 주위에서 생성된 열 사이클을 트리거링했고, 이는 핵산 변성, 프라이머 어닐링, 중합효소 확장의 순차적 과정을 포함한다. 핵산 변성을 수행하는 광자 사이클의 인터벌은 0.5 내지 5초, 바람직하게는 1 내지 2.5초이며, NIR 레이저의 파워 범위는 400 내지 800mW/0.16cm2이고, 핵산 변성을 수행하기 위한 고상 캐리어(40) 주위에서 생성된 온도는 85 내지 95°C 범위이고, 바람직하게는 95°C 이다. 프라이머 어닐링과 중합효소 연장을 수행하는 광자 사이클의 인터벌은 2 내지 5초, 바람직하게는 5 내지 15초이고, 레이저 파워는 100 내지 400mW/0.16cm2이며, 프라이머 어닐링 및 중합효소 연장을 수행하기 위한 고상 캐리어(40) 주위에서 생성된 온도는 55 내지 65°C, 바람직하게는 60°C이다. 또한, 수냉식 온-비드 PCR을 수행하기 위한 50개의 광자 사이클의 총 처리 시간은 5 내지 15분이다.
본 발명은 핵산 검출 방법으로서, 전술한 고상 캐리어(40)는 자성을 나타내고, 수냉식 온-비드 PCR 과정을 거친 후, 표적 앰플리콘(60)이 생성되어 고상 캐리어(40)에 고정되고, 고상 캐리어(40)에 고정된 표적 앰플리콘(60)의 검출은 다음 단계와 같이 수행됨:
작동 유닛(15)을 사용하여 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)의 정제, 분리 및 종축을 방조함;
검출 모듈(17)을 사용하여 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)에 발생하는 광학 변화, 열 감지 변화, 전기화학 변화, 자기 변화, 또는 질량 변화 중 어느 하나 또는 그의 조합을 검출한다.
본 발명에서, 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)의 광학적 변화를 검출하는 방법은, 핵산 태그로 표지된 프라이머(301) 또는 앰플리콘(60)에 포함된 형광단(3011)에 의해 직접 생성된 빛 강도의 변화를 분광 광도계 또는 형광계로 검출하는 단계, 또는 효소 결합 면역 흡착 측정법에 의해 생성된 광학적 변화 또는 화학발광 변화를 검출하는 단계, 또는 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)에 대한 반발력으로 인한 스펙트럼 변화를 검출하는 단계로 구성된다.
본 발명에서, 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)의 광학적 변화를 검출하는 방법에 있어서, 여기서 검출 모듈은 핵산 측면 흐름 스트립 또는 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)을 포함하고, 열 감지, 표면 강화 라만 분광법(SERS) 또는 이들의 조합을 추가로 결합하여, 핵산 측면 흐름 스트립 검출 또는 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 감도가 향상된다.
본 발명에 있어서, 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)에서 발생하는 자기 변화에 대한 방법은, AC 감수율 측정기, 및 거대 자기 저항 측정(GMR) 또는 이 둘의 조합에 의한 주파수-의존 AC 감수율의 검출을 포함한다.
본 발명에 있어서, 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)에 발생한 전기화학 변화는, 효소 결합 면역 흡착 측정법 및 전기화학적 임피던스 분광법(EIS)과 결합된 전기화학적 검출 중 하나 또는 조합을 포함한다.
본 발명에 있어서, 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)에 발생한 질량 변화의 방법은 쿼츠(quartz) 크리스탈 미량 천칭(microbalance)을 사용하여 수행된다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 수냉식 온-비드 PCR을 수행하기 위한 다양한 실험적 검증을 완료하였다. 우선, 적용된 NIR 레이저 파워 및 고상 캐리어(40) 현탁액의 마이크로 규모 광열 변환 온도의 선형 캘리브레이션 곡선이 확립되어 고상 캐리어(40)에서 인-시츄 증폭을 수행하는 데 적합한 온도 범위를 추정하였다. 외부 에너지 여기의 광자 사이클의 최적 조건(예: 아웃풋 파워 및 조사 주파수) 외에도 핵산 증폭 용액(30)의 냉각 온도가 인-시츄 증폭 성능에 미치는 영향도 논의되었다. 외부 에너지에 의해 유도된 고상 캐리어(40)의 국부적인 가열 및 PCR 반응 용액(30)에 의해 제공되는 냉각 온도의 협력에 의해, 고상 캐리어(40) 주위에 생성된 빠른 열 사이클이 달성될 수 있다. 또한, 고상 캐리어(40)에서 생성된 앰플리콘(60)의 검출을 수행하기 위한 후속 모드 및 분석물(20)의 전처리를 위한 작동 예도 논의되었다. 종합하면, 우리의 결과는 본 발명의 통합 플랫폼이 시료 입력 및 결과 출력 방식에서 표적 분석물 농축, 신속한 핵산 증폭 및 검출을 달성할 수 있음을 입증했다. 또한, 본 발명은 핵산-기반 현장 검사(point-of-care testings; POCTs)에 적용될 수 있다. 결론적으로, 본 발명은 아래 장점을 제공한다:
1. 표면적 대 부피 비율이 높은 고상 캐리어(40)를 사용함으로써, 표면의 리간드 조합은 의도된 적용(예: 항체, 핵산 앱타머, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 다당류 또는 이들의 조합)에 따라 유연하게 기능화될 수 있다.
2. 외부 에너지 여기, 및 핵산 증폭 용액(30) 또는 보조 냉각 유닛에 의해 제공되는 냉각 온도의 조화를 제어함으로써, 본 발명은 세포의 인-시츄 용해, 분석물(20)로부터 방출된 표적 핵산의 혼성화 포획, 및 고상 캐리어(40)의 표면(즉, 인-시츄 환경(50))에서 인-시츄 핵산 증폭을 수행하는 데 필요한 국부적인 온도 조건을 신속하게 달성할 수 있다.
3. 고상 캐리어(40)의 표면에 상술한 인-시츄 환경(50)이 발생하였기 때문에, 인-시츄 핵산 증폭은 고상 캐리어(40)의 표면에 인접한 공간으로 제한된다. 고상 캐리어(40) 주위의 사전 냉각된 핵산 증폭 용액(30)은 고상 캐리어(40)로부터의 열을 빠르게 소산시킬 뿐만 아니라, 외부 여기 시 고상 캐리어(40)의 열 전면 확산을 더욱 제한한다. 이러한 국부 가열의 효과는 고상 캐리어(40)의 표면에 인접한 공간이 독립적인 인-시츄 환경(50)을 형성하는 데 기여한다. 그러나 비 인-시츄 환경(50)에서는 사전 냉각된 핵산 증폭 용액(30)의 냉각 온도가 중합효소 활성을 억제하여, 비특이적 증폭의 발생을 감소시킬 수 있다. 또한, 수냉식 온-비드 PCR의 기술적 특징은 고상 캐리어(40)에서 인-시츄 핵산 증폭을 수행하기 위한 열장 분할을 생성하도록 하며, 이는 액적 디지털 PCR(ddPCR) 또는 에멀전 PCR의 개념과 유사하며, 독립적인 PCR 반응이 물리적으로 격리된 챔버에서 일어나는 경우, PCR 반응은 수만 개의 나노리터 크기의 물방울로 더 분할된다. 그러나, ddPCR이나 에멀전 PCR에서 발생하는 PCR 반응의 물리적 분할과 달리, 개시된 발명의 "가상 에멀전 PCR 또는 가상 액적 디지털 PCR"의 기술적 특징은, 테스트 시료를 물리적으로 분리된 액적으로 분할하기 위해 추가적인 액적 생성기와 미네랄 오일 및 계면활성제의 도움이 필요하지 않음을 의미한다. 수냉식 온-비드 PCR에서 가상 분할의 효과는 분석물(20)의 복잡성으로 인해 발생하는 핵산 증폭 및 후속 검출 반응에 미치는 영향을 줄일 수 있다.
4. 핵산 증폭 용액(30)의 저온은 종래의 소형화된 핵산 증폭 장치에서 발생하는 증발, 기포 발생 등의 기술적 문제를 획기적으로 개선한다.
5. 본 발명은 자기 작동 유닛(15)의 도움을 받아 고상 캐리어(40) 상의 인-시츄 환경(50)에서 인-시츄 핵산 증폭, 및 고상 캐리어(40)에 고정된 앰플리콘(60)의 후속 정제, 분리 및 농축을 수행하는 데 필요한 초고속 열 사이클을 달성할 수 있다. 이러한 발전으로 핵산 증폭 및 검출에 필요한 전체 처리 시간이 크게 단축된다.
6. 본 발명은 핵산 증폭을 수행하는 열 관리를 대폭 단순화한다.
7. 분석물(20)의 단순화된 전처리 및 앰플리콘(60)의 검출: 자성 고상 캐리어(40)는 분석물(20), 생물학적 물질(21), 및 앰플리콘(60)의 정제 및 농축(concentration)(농축(enrichment))에 적용될 수 있다. 또한, 고상 캐리어(40)는 측면 흐름 면역 분석 스트립(171)의 테스트 라인(1711)에 신호 물질로 기능할 수 있다(예를 들어, 테스트 라인에 시각적으로 관찰 가능한 밴딩을 형성하고 플라즈몬 열 감지를 통해 감지된 열 이미지의 밴딩을 형성함). 전체적으로, 고상 캐리어(40)의 고유한 특성을 이용한다(예: 자성, 기능화된 농축 및 증폭 리간드, LSPR 및 플라즈몬 가열). 이러한 특성은 분석물(20)의 전처리, 및 분석물(20) 및 앰플리콘(60)의 검출을 용이하게 한다.
이상 본 발명에 대한 간략한 설명은 본 발명의 여러 측면과 기술적 특징에 대한 기본적인 설명을 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 간략한 설명은 본 발명을 상세하게 표현한 것이 아니다. 그러므로 그 목적은 발명의 핵심적이거나 필수적인 구성요소를 구체적으로 열거하거나 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. 이는 단지 본 발명의 여러 개념을 간결하게 제시하기 위한 것이다.
10: 반응 유닛
11: 통합 드라이버
12: 에너지 여기 유닛
121: 레이저 콜리메이터
122: 레이저 방출기
13: 외부 보조 냉각 유닛
14: 온도 검출 유닛
15: 작동 유닛
16: 외부 에너지 캘리브레이터
17: 검출 모듈
171: 측면 흐름 면역 분석 스트립
1711: 테스트 라인
1712: 제어 라인
172: NIR 레이저-결합 적외선 열 센서
20: 분석물
21: 생물학적 물질
30: 핵산 증폭 용액
301: 프라이머
3011: 형광단
302: 중합 효소
40: 고상 캐리어
401: 자기 코어
402: 중간층
403: 금 나노쉘
41: 다기능체
42: 증폭체
50: 인-시츄 환경
60: 앰플리콘
70: 농축 리간드
71: 증폭 리간드
72: 폴리에틸렌 글리콜
73: 소 혈청 알부민
S10-S90: 단계
S100-S400: 단계
11: 통합 드라이버
12: 에너지 여기 유닛
121: 레이저 콜리메이터
122: 레이저 방출기
13: 외부 보조 냉각 유닛
14: 온도 검출 유닛
15: 작동 유닛
16: 외부 에너지 캘리브레이터
17: 검출 모듈
171: 측면 흐름 면역 분석 스트립
1711: 테스트 라인
1712: 제어 라인
172: NIR 레이저-결합 적외선 열 센서
20: 분석물
21: 생물학적 물질
30: 핵산 증폭 용액
301: 프라이머
3011: 형광단
302: 중합 효소
40: 고상 캐리어
401: 자기 코어
402: 중간층
403: 금 나노쉘
41: 다기능체
42: 증폭체
50: 인-시츄 환경
60: 앰플리콘
70: 농축 리간드
71: 증폭 리간드
72: 폴리에틸렌 글리콜
73: 소 혈청 알부민
S10-S90: 단계
S100-S400: 단계
Claims (22)
- 핵산 증폭 방법에 있어서,
적어도 하나의 분석물, 적어도 하나의 핵산 증폭 용액, 그 내부의 적어도 하나의 고상 캐리어를 포함하는 반응 유닛을 제공함, 상기 반응 유닛, 및 상기 반응물, 상기 핵산 증폭 용액, 및 상기 고상 캐리어를 포함하는 그 내부의 내용물은 냉각 환경에서 냉각 온도로 유지됨; 냉각 환경의 냉각 온도와 협력하여 외부 에너지의 아웃풋 및 온오프(on and off) 타이밍 서열을 모듈레이팅함으로써, 핵산 증폭에 필요한 하나 또는 그 이상의 열 사이클이 생성됨, 각각의 열 사이클에서, 모든 고상 캐리어는 외부 에너지에 의해 여기되는 각각의 인-시츄(in-situ) 환경을 동시에 형성함, 고상 캐리어에 대한 외부 에너지가 중지되므로, 인-시츄 환경은 소산함; 인-시츄 환경의 반복적인 형성 및 소산 동안 상기 고상 캐리어, 상기 분석물, 및 상기 핵산 증폭 용액에 상기 핵산 증폭이 발생함으로써, 앰플리콘(amplicons)을 생성함을 특징으로 하는,
핵산 증폭 방법. - 제1항에 있어서,
상기 열 사이클의 각각의 여기 기간 동안, 상기 반응 유닛 내의 모든 고상 캐리어는 동시에 여기되어, 각각의 고상 캐리어 주위에 인-시츄 환경의 형성을 야기하고, 각각의 캐리어에 앰플리콘이 생성되고; 상기 앰플리콘의 일부는 각각의 고상 캐리어 내에 유지되고, 상기 앰플리콘의 다른 일부는 핵산 증폭 용액에 방출되고, 상기 열 사이클의 각각의 비여기(non-excitation) 기간 동안, 각각의 고상 캐리어의 여기가 중지되고, 각각의 인-시츄 환경은 냉각 환경의 냉각 온도를 통해 소산되는,
핵산 증폭 방법. - 제1항에 있어서,
상기 고상 캐리어의 부피와 상기 핵산 증폭 용액의 부피의 비(ratio)는 1:200 내지 1:1Х109인,
핵산 증폭 방법. - 제1항에 있어서,
각각의 고상 캐리어의 사이즈는 추가로 8 내지 2,000,000 nm의 범위 내인,
핵산 증폭 방법. - 제1항에 있어서,
상기 냉각 온도 범위는 -10 내지 50°C인,
핵산 증폭 방법. - 제1항에 있어서,
상기 반응 유닛 또는 상기 핵산 증폭 용액은 냉각 온도까지 사전 냉각되거나 외부 보조 냉각 유닛에 안치되고, 상기 사전 냉각 반응 유닛 또는 상기 외부 보조 냉각 유닛은 하나 또는 그 이상의 열 사이클 동안 냉각 온도를 유지하는 것을 특징으로 하는,
핵산 증폭 방법. - 제1항에 있어서,
상기 분석물은 세포, 소기관, 박테리아, 바이러스, 원생동물, 또는 그의 조합인,
핵산 증폭 방법. - 제7항에 있어서,
상기 고상 캐리어는:
다기능체;
적어도 하나의 농축 리간드, 상기 농축 리간드는 상기 다기능체의 표면에 결합되고, 상기 분석물을 포획하는 데 사용됨;
적어도 하나의 증폭 리간드, 상기 증폭 리간드는 상기 다기능체의 표면에 결합되고, 생물학적 물질을 결합하는 데 사용됨
를 포함하는 것을 특징으로 하는,
핵산 증폭 방법. - 제8항에 있어서,
상기 생물학적 물질은 상기 분석물로부터 방출된 디옥시리보핵산 또는 리보핵산이거나, 증폭 리간드에 복제되고 핵산 증폭 용액에 순차적으로 방출된 앰플리콘인,
핵산 증폭 방법. - 제7항에 있어서,
상기 고상 캐리어의 일부는:
농축체;
적어도 하나의 농축 리간드, 상기 농축 리간드는 상기 농축체의 표면에 결합되고, 상기 분석물을 포획하는 데 사용됨;
을 포함하고,
상기 고상 캐리어의 일부는:
증폭체;
적어도 하나의 증폭 리간드, 상기 증폭 리간드는 상기 증폭체의 표면에 결합되고, 상기 분석물에 의해 방축된 생물학적 물질을 포획하는 데 사용됨
을 포함하는,
핵산 증폭 방법. - 제10항에 있어서,
상기 생물학적 물질은 상기 분석물로부터 방출된 디옥시리보핵산 또는 리보핵산이거나, 증폭 리간드에 복제되고 핵산 증폭 용액에 순차적으로 방출되는 앰플리콘인 것을 특징으로 하는,
핵산 증폭 방법. - 제1항에 있어서,
상기 분석물은 유리 디옥시리보핵산 또는 유리 리보핵산인,
핵산 증폭 방법. - 제12항에 있어서,
상기 고상 캐리어는:
증폭체;
적어도 하나의 증폭 리간드, 각각의 상기 증폭 리간드는 상기 증폭체의 표면에 결합되고, 상기 분석물을 포획하는 데 사용됨
을 포함하는,
핵산 증폭 방법. - 신속 핵산 증폭 플랫폼에 있어서,
반응 유닛에 있어서, 반응 용액, 분석물, 핵산 증폭 용액, 및 하나 또는 그 이상의 고상 캐리어를 수용하도록 구성됨;
보조 냉각 유닛에 있어서, 이는 냉각 온도에서 사전 냉각된 핵산 증폭 용액이거나, 상기 반응 유닛 주위에 배치된 외부 보조 냉각 유닛이고, 이는 상기 반응 유닛을 지속적으로 냉각하고 상기 핵산 증폭 용액을 냉각 온도로 유지함;
외부 에너지 여기 유닛에 있어서, 고상 캐리어를 여기하여 열을 생성하도록 구성됨;
통합 드라이버에 있어서, 에너지 아웃풋 및 외부 에너지 여기 유닛의 온오프(on and off) 타이밍 서열을 모듈레이팅하도록 구성됨; 상기 통합 드라이버는 상기 외부 여기 유닛의 에너지 아웃풋을 모듈레이팅하고 외부 에너지 캘리브레이터 및 온도 검출 유닛 각각에 의해 상기 외부 보조 냉각 유닛의 제어를 피드백하도록 구성됨으로써, 핵산 증폭에 필요한 하나 또는 그 이상의 열 사이클을 생성함,
을 포함하는,
신속 핵산 증폭 플랫폼. - 핵산 검출 방법에 있어서,
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 핵산 검출 방법을 완료한 후 핵산 검출을 위한 아래 단계:
작동 유닛을 사용하여 상기 고상 캐리어에 고정된 상기 앰플리콘을 정제, 분리 및 농축하도록 방조함;
검출 모듈을 사용하여 상기 고상 캐리어에 고정된 앰플리콘에 발생하는 광학 변화, 열 감지 변화, 전기화학 변화, 자기 변화, 또는 질량 변화 중 어느 하나 또는 그의 조합을 검출함
을 포함하는,
핵산 검출 방법. - 제15항에 있어서,
상기 앰플리콘에 발생한 광학 변화에 대한 방법은,
상기 앰플리콘을 형광단으로 표지된 핵산 태그와 혼합하고, 분광 광도계를 사용하여 광 강도를 검출하거나, 또는 효소-결합 면역 흡착 측정법을 사용한 앰플리콘에 의해 생성된 광학 변화 또는 화학 발광 변화를 검출하거나, 또는 고상 캐리어에 대한 앰플리콘의 결합으로부터 야기된 스펙트럼 변화를 검출함
을 포함하는,
핵산 검출 방법. - 제16항에 있어서,
상기 앰플리콘에 발생한 광학 변화에 대한 방법은,
상기 검출 모듈은 핵산 측면 흐름 스트립 또는 측면 흐름 면역 분석 스트립을 포함하고, 이는 생성된 광학 변화를 검출하는 데 사용되는,
핵산 검출 방법. - 제17항에 있어서,
상기 핵산 측면 흐름 스트립 또는 측면 흐름 면역 분석 스트립의 분석 민감도는 상기 핵산 측면 흐름 스트립 또는 상기 측면 흐름 면역 분석 스트립을 열 감지 검출, 표면 플라즈몬 공진 분광법, 또는 그의 임의의 조합과 결합함으로써 강화되는,
핵산 검출 방법. - 제15항에 있어서,
상기 고상 캐리어에 고정된 앰플리콘에 발생한 전기화학 변화에 대한 방법은,
효소-결합 면역 흡착 측정법 및 전기화학 임피던스 분광법으로 커플링된 전기 화학 검출 중 하나 또는 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는,
핵산 검출 방법. - 제15항에 있어서,
상기 앰플리콘에서 발생한 자기 변화에 대한 방법은,
교류 감수율 측정기, 및 거대 자기저항 측정, 또는 그 둘의 조합에 의한 주파수-의존 교류 감수율의 검출을 포함하는,
핵산 검출 방법. - 제15항에 있어서,
상기 앰플리콘에 발생한 질량 변화에 대한 방법은 쿼츠(quartz) 크리스탈 미량 천칭(microbalance)을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는,
핵산 검출 방법. - 신속 핵산 검출 장치에 있어서,
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항으로부터 획득한 앰플리콘의 정제, 분리 및 농축을 방조하도록 구성되는 작동 유닛;
상기 고상 캐리어에 고정된 앰플리콘에 발생한 광학 변화, 열 감지 변화, 전기화학 변화, 자기 변화, 또는 질량 변화 중 하나 또는 그 조합을 검출하도록 구성되는 검출 모듈
을 포함하는,
신속 핵산 검출 장치.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240093455A true KR20240093455A (ko) | 2024-06-24 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Point-of-care diagnostics for infectious diseases: From methods to devices | |
| JP6475645B2 (ja) | 核酸の増幅のための方法 | |
| Zheng et al. | Rapid developments in lateral flow immunoassay for nucleic acid detection | |
| US9556474B2 (en) | Multicolor microwave-accelerated metal-enhanced fluorescence (M-MAMEF) | |
| US7998672B2 (en) | Simultaneous amplification and detection of ribonucleic acid be an optical method using surface plasmon resonance | |
| KR101433208B1 (ko) | 실시간으로 ｐｃｒ의 다중 분석을 위한 시스템과 방법 | |
| Kim et al. | State of diagnosing infectious pathogens using colloidal nanomaterials | |
| Aslan et al. | Microwave-Accelerated Metal-Enhanced Fluorescence (MAMEF) with silver colloids in 96-well plates: Application to ultra fast and sensitive immunoassays, High Throughput Screening and drug discovery | |
| KR102458825B1 (ko) | 핵산 검출 방법 | |
| JP2008543279A (ja) | 磁気検出を伴った核酸の増幅 | |
| Jia et al. | based point-of-care testing of SARS-CoV-2 | |
| JP4847961B2 (ja) | 微小粒子に自己集合体を形成させる方法及び標的分析物の検出方法 | |
| Li et al. | Applications of hybridization chain reaction optical detection incorporating nanomaterials: A review | |
| RU2666910C1 (ru) | Способ суперамплификации с пцр | |
| Zor et al. | Carbon dots in the detection of pathogenic bacteria and viruses | |
| Wang et al. | Microfluidic-assisted integrated nucleic acid test strips for POCT | |
| KR20240093455A (ko) | 핵산 증폭 방법 및 장치, 및 핵산 검출 방법 및 장치 | |
| BRPI0715904A2 (pt) | mÉtodo e sistema para monitorar um processo enzimÁtico em uma molÉcula biolàgica | |
| TWI813125B (zh) | 核酸擴增方法及其裝置暨核酸檢測方法與其裝置 | |
| AU2021480874A1 (en) | Nucleic acid amplification method and device, and nucleic acid detection method and device | |
| US20230405597A1 (en) | Nucleic acid amplification system and method thereof | |
| Deng et al. | Nanotechnology-leveraged nucleic acid amplification for foodborne pathogen detection | |
| US20210379581A1 (en) | Magnetic PCR Assay And Uses Thereof | |
| TWI765431B (zh) | 核酸放大系統及其方法 | |
| WO2023055340A1 (en) | Apparatuses with immobilized capture agents in a reaction region of a chamber |