KR20240093392A - 질병 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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마이크로바 아이피 피티와이 리미티드
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Abstract

본 개시내용은 일반적으로 박테리아 균주를 포함하는 치료 조성물 및 질병의 치료 또는 예방 방법 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 인간 소화관으로부터 분리된 박테리아 균주를 포함하는 조성물 및 염증성 및 자가면역 장애의 치료 또는 예방에서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

질병 치료용 조성물 및 방법
본 발명은 일반적으로 박테리아 균주를 포함하는 치료 조성물 분야 및 질병의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 소화관으로부터 분리된 박테리아 균주를 포함하는 조성물 및 염증성 및 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서의 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 2021년 5월 10일에 출원된 "질병 치료용 조성물 및 방법"이라는 명칭의 호주 가출원 번호 2021901387 및 2022년 5월 6일에 출원된 "질병 치료용 조성물 및 방법"이라는 명칭 2022901200에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인간 장내 미생물군은 페르미쿠테스(Firmicutes), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 푸소박테리아(Fusobacteria) 및 베루코미크로비아(Verrucomicrobia)를 포함하는 몇 가지 박테리아 문에 속하는 500-1000개 이상의 다양한 계통형을 포함한다. 두 가지 주요 문인 박테로이데테스(Bacteroidetes)와 페르미쿠테스(Firmicutes)는 장내 미생물의 90% 이상을 차지한다(Arumugam et al., 2011). 인간 장의 박테리아 군집화로 인해 발생하는 성공적인 공생 관계는 다양한 대사, 구조, 보호 및 기타 유익한 기능을 가져왔다. 장내 세균은 위장관을 따라 소화를 조절하는 주요 조절자이다; 공생 박테리아는 담즙산, 지질, 아미노산, 비타민 및 단쇄지방산(SCFA)을 포함한 많은 영양소와 대사산물의 추출, 합성 및 흡수에 중요한 역할을 한다. 최근에는 선천성 및 적응성 면역 세포의 발달, 항상성, 기능을 조절하는 데 있어서 장내 미생물군과 그 산물의 면역학적 중요성이 인정되었다(Brestoff 및 Atris, 2013).
이제 장내 미생물군집이 숙주 장 점막 면역 및 염증 소인을 조절한다는 사실이 점차 인식되었고(Geva-Zatorsky et al., 2017; Kabat et al., 2014), 이는 새로운 치료 개입을 위한 새로운 길을 열어준다.
염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD)을 비롯한 많은 염증성 및 자가면역 질환에서 미생물군 구성의 극적인 변화가 기록되었다. 특정 박테리아 균주가 동물 장에 미칠 수 있는 잠재적인 긍정적 효과를 인식하여 다양한 질병 치료에 사용하기 위한 다양한 균주가 제안되었다. 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 균주를 포함한 특정 균주는 다양한 장외 염증 및 자가면역 질환을 치료하는 데 사용하도록 제안되었다(Goldin & Gorbach, 2008; Azad et al., 2013 참조). 그러나 특정 박테리아 균주가 위장관에 국소적으로 그리고 신체 전체에 전신적으로 미치는 정확한 영향은 아직 해결되지 않았다. 결과적으로, 인간 위장관의 다양한 질병과 다양한 박테리아 균주 간의 관계는 아직 명확하게 밝혀지지 않았다.
IBD(두 가지 주요 질병 하위 유형인 크론병(Crohn’s disease; CD) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis; UC) 포함)은 위장관의 간헐적이고 무력화되는 염증을 특징으로 한다. 2017년에는 전 세계적으로 680만 명이 IBD를 앓고 있는 것으로 추산되며, 미국과 유럽에서 유병률이 가장 높았다(GBD 2017; Inflammatory Bowel Disease Collaborators, 2019). 최대 20%의 환자가 16세 이전에 진단되며 소아 발병 IBD(paediatric-onset IBD; PIBD)는 성장 및 심리사회적 발달에 부정적인 영향을 미치는 더욱 복잡하고 공격적인 질병과 관련이 있다.
현재 IBD에 대한 치료법은 없으며 장기간의 임상 관리에는 탁월한 안전성 프로필을 갖춘 효과적인 치료법이 필요하다. 그러나 기존 치료법은 다양한 결함을 나타내며 완화 기간은 일반적으로 짧다. 더욱이, PIBD 치료법은 조기 발병과 더 공격적인 질병으로 인해 점진적인 장 손상이 발생하고 수술이 필요한 경우에는 효과적이지 않다. 환자의 삶의 질을 향상시키고, 장기간에 걸쳐 관해를 유지하며, 수술을 줄이고, 개인 및 공중 보건 비용을 절감하기 위해 보다 효과적이고 안전한 치료법을 개발하는 것이 시급하다.
IBD에 대한 기존 치료법은 강한 부작용, 낮은 순응도(평균 비순응률 50%(Chan et al., 2017 참조)) 및 높은 비용으로 인해 차선책으로 인식된다. 더욱이, 질병 없는 관해(remission)를 장기간 유지하기 위한 효과적인 해결책은 없다. 경증에서 중등도의 궤양성 대장염 발적과 관해 유지를 위해 가장 널리 사용되는 1차 치료법 중 하나인 메살민은 반응률이 40~70%, 관해율은 15~20%이다(Karagozian & Burakoff, 2007).
염증성 및 자가면역 장애를 치료하는 새로운 방법에 대한 요구가 업계에 존재한다. 또한 장내 세균을 사용하는 새로운 치료법을 개발하려면 장내 세균의 잠재적인 효과를 특성화해야 한다는 요구 사항도 있다.
본 발명은 부분적으로 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis)의 박테리아 균주가 장 장벽 기능을 향상시키거나 향상시킨다는 발명자의 확인에 기초하고 있다. 이러한 고려에 기초하여, M. 파에시스(M. faecis) 균주는 후술하는 바와 같이 염증성 및 자가면역 장애를 치료 및 예방하기 위한 치료 적용에 특히 적합하다고 제안된다.
본 발명자들은 염증성 및 자가면역 장애를 치료 및 예방하는데 사용될 수 있는 메디테라네이박터 파에시스 종의 생존 가능한 박테리아 균주를 포함하는 새로운 조성물을 개발하였다.
따라서, 한 측면에서 본 발명은 V21/006223, V21/006224, V21/006225 또는 V21/006226 중 어느 하나의 수탁번호로 기탁된 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 균주의 세포 또는 이의 변이체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 세포는 적어도 부분적으로 분리된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 V21/006223, V21/006224, V21/006225 또는 V21/006226 중 어느 하나의 수탁번호로 기탁된 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 균주 또는 그 변이체의 생물학적으로 순수한 배양물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 및 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 세포 또는 배양물을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1-24 중 어느 하나와 약 97.5%, 98%, 98.5% 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖거나, 서열번호 1-24 중 어느 하나 이상으로 표시되는 16S rRNA 유전자 서열을 갖는 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 서열번호 1-24에 제시된 16S rRNA 서열로부터 독립적으로 선택된 16S rRNA 서열의 2개 이상의 카피(예: 2개 카피, 3개 카피, 4개 카피, 5개 카피, 6개 카피, 7개 카피, 8개 카피)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 종의 박테리아 균주의 16S rRNA 서열과 약 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 박테리아 균주와 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
관련 측면에서, 본 발명은 M. 파에시스(M. faecis) 및 M. 락타리스(M. lactaris)의 가장 최근 공통 조상(most recent common ancestor; MRCA)의 계통발생적 후손인 박테리아 균주와 함께 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 적합하게는, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의된다. 일부 실시양태에서, 상기 계통수는 GTDB의 릴리스 95(r95)에 의해 생성되지만, 임의의 적합한 후속 릴리스는 적용 가능한 결과와 동일하게 제공되는 것으로 간주된다. 이러한 유형의 일부 바람직한 구현예에서, 박테리아 균주는 M. 파에시스이다. 일부 대안적 실시양태에서, 박테리아 균주는 M. 락타리스이다.
일반적으로, 상기 박테리아 균주는 적어도 부분적으로 분리된다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 살아있는 것이다. 일부 대안적인 실시 형태에서, 상기 박테리아 균주는 죽은 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 프리바이오틱을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 건조된 형태로 제제화된다. 전형적으로, 상기 조성물은 동결건조, 분무 건조, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이들의 조합으로부터 선택된 기술을 사용하여 건조된다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 경구 투여용으로 제제화된다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 세포 내에서 신호 변환 및 활성화 전사인자 3(signal transducer and activator of transcription 3; STAT3) 신호전달을 약화시키거나 손상시키는 제제를 생성한다.
이러한 유형의 일부 실시양태에서, 제제는 소분자, 펩티드 또는 뉴클레오티드이다. 일반적으로 이 물질은 박테리아 균주에 의해 방출된다.
일부 실시양태에서, 상기 제제는 STAT3, JAK2, TYK 또는 IL-23 중 어느 하나에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 프로피오네이트, 락테이트, 아세테이트 및 포름산염을 포함하거나 이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 대사산물을 생성한다. 일부 동일한 실시양태 및 일부 다른 실시양태에서, 상기 M. 파에시스 균주는 부티레이트를 생성하지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 M. 파에시스 균주는 비타민 B12를 생성한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체의 장 장벽 기능을 회복 또는 개선하는 방법을 제공하며, 이 방법은 개체에 메디테라네이박터 파에시스 종의 박테리아성 균주를 투여하여 장 장벽 기능을 회복 또는 개선시키는 단계를 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 상기 장 장벽 기능의 회복 또는 개선은 (i) 뮤신의 질 및/또는 양의 증가; (ii) 밀착연접 단백질의 완전성 개선; (iii) 내강 내용물의 전신 순환으로의 이동 감소; 또는 (iv) 장궤양 및/또는 장 상처의 감소 중 어느 하나 이상을 특징으로 한다.
일부 실시예에서, 상기 내강 내용물은 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 장 장벽 기능의 회복 또는 개선은 대상체의 전신 염증의 감소를 초래한다. 이러한 유형의 일부 실시양태에서, 상기 전신 염증은 건강한 피험자의 염증성 사이토카인 수준과 비교하여 피험자에서 염증성 사이토카인(예: IL-1β IL-8, IL-6 및 TNF)의 수준이 증가하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체의 장 장벽 기능을 유지하는 방법을 제공하며, 이 방법은 개체에 메디테라네이박터 파에시스 종의 박테리아 균주를 투여하여 개체의 장 장벽 기능을 유지하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에 메디테라네이박터 파에시스 균주의 박테리아 균주를 투여하여 개체의 염증을 감소시키는 단계를 포함하는, 개체의 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 염증은 장 환경에 국한되거나 전신 염증이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체의 점막 치유를 유도 또는 강화하는 방법을 제공하며, 이 방법은 개체에 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주를 상피 세포 이동, 증식 및/또는 분화를 유도하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 개체의 점막 치유는 하나 이상의 대변 또는 혈청 마커를 사용하여 측정될 수 있다. 하나의 예로서, 하나 이상의 상기 대변 마커는 칼프로텍틴, 락토페린, 메탈로프로테이나제(MMP)-9 및 리포칼린-2를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 NFκB 경로를 약화시켜 염증을 감소시킨다. 이러한 유형의 일부 실시 형태에서, 상기 박테리아 균주는 NFκB, TNF, IFN-γ, IL-1β, IL-8 및 MCP-1을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 전사 인자, 사이토카인 또는 케모카인의 생성을 억제한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표적 세포에서 STAT3 신호전달을 차단하거나 억제하는 방법을 제공하며, 이 방법은 세포에서 STAT3 신호전달을 차단하거나 달리 억제하기 위해 세포를 메디테라네이박터 파에시스 종의 박테리아 세포 제제의 적어도 하나의 가용성 성분과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이 측면의 방법은 시험관내에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 상기 표적 세포는 리포터 세포(예를 들어, HEK 세포), 면역 세포(예를 들어, Th17 면역 세포), 상피 세포 또는 내피 세포로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포이다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 세포 제제는 박테리아 세포 배양물이다. 따라서 상기 가용성 성분은 박테리아 세포 배양물의 가용성 분획(예를 들어, 세포 배양 상층액)을 포함하거나, 구성되거나, 본질적으로 구성될 수 있다. 상기 가용성 성분은 박테리아 세포 배양물의 일부 불용성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 가용성 성분은 실질적으로 박테리아 배양물 전체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 가용성 성분에는 박테리아 세포가 실질적으로 고갈되어(depleted ) 있다.
일부 대안적인 실시양태에서, 상기 박테리아 세포 제제는 박테리아 세포 용해물이다. 이러한 유형의 예시적인 실시양태에서, 상기 가용성 성분은 세포 용해물의 가용성 분획과 관련될 수 있다. 상기 가용성 분획은 원심분리를 포함한 임의의 방법에 의해 적합하게 달성될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포에서 STAT3 신호전달을 차단하거나 달리 억제하는 방법을 제공하며, 이 방법은 Mediterraneibacter faecis 종의 박테리아 균주를 대상체에게 투여하여 세포의 STAT3 신호전달을 차단하거나 억제하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이 측면의 방법은 생체내에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 상기 세포는 면역 세포(예를 들어, Th17 면역 세포) 또는 상피 세포이다.
일부 실시양태에서, 상기 세포는 상피 세포이고, 박테리아 균주 또는 박테리아 균주에 의해 생성된 대사산물은 개체에서 IL-22의 생성을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 STAT3의 직접 억제제 또는 간접 억제제인 분자를 생산한다. 예를 들어, 상기 박테리아 균주는 IL-23 폴리펩티드, JAK2 폴리펩티드, TYK2 폴리펩티드 또는 STAT3 폴리펩티드 중 적어도 하나를 직접적으로 억제하는 대사산물을 생산할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 및 본원의 다른 곳에서 기술된 방법에 사용된 박테리아 균주는 프로피오네이트, 락테이트, 아세테이트 및 포름산염으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물을 생성한다. 일부 동일한 실시양태 및 일부 대안적인 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 비타민 B12를 생성한다. 일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 부티레이트를 생성하지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종의 박테리아 균주의 16S rRNA 서열과 약 97.5%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다.
일부 대안적인 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 서열번호 1-24 중 어느 하나와 약 97.5%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖거나, 또는 상기 박테리아 균주는 서열번호 1 내지 24 중 어느 하나로 표시되는 16S rRNA 유전자 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 서열번호 1-24로 표시되는 16S rRNA 서열로부터 독립적으로 선택된 16S rRNA 서열의 2개 이상의 카피(예: 2개 카피, 3개 카피, 4개 카피, 5개 카피, 6개 카피, 7개 카피, 8개 카피)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 M. 락타리스의 박테리아 균주의 16S rRNA 서열과 약 97.5%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다.
일부 대안적인 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 서열번호 29-32 중 어느 하나 이상과 약 97.5%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖거나, 또는 상기 박테리아 균주는 서열번호 29-32 중 어느 하나 이상으로 표시되는 16S rRNA 유전자 서열을 갖는 경우.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 V21/006223, V21/006224, V21/006225 또는 V21/006226 중 어느 하나의 수탁번호로 기탁된 M. 파에시스 균주 또는 이의 유도체이다.
바람직하게는, 상기 박테리아 균주는 적어도 부분적으로 분리된다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 상기 약학 조성물은 건조 조성물이다. 일부 실시양태에서, 상기 건조 조성물은 입자, 과립 및 분말로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 예로서, 상기 약학 조성물은 동결건조, 분무 건조, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이들의 조합으로 처리된 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 약학 조성물은 경구 투여용으로 제제화된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체의 염증성 또는 자가면역 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 유효량의 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 박테리아 균주를 개체에 투여함으로써 염증성 또는 자가면역 장애를 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 염증성 또는 자가면역 장애는 염증성 장 질환(크론병 또는 궤양성 대장염 등); 천식(알레르기성 천식 또는 호중구성 천식 등); 관절염(류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 또는 청소년 특발성 관절염 등); 지방간 질환(비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 등); 강직성 척추염; 건선; 전신홍반루푸스(SLE); 경피증; 쇼그렌 증후군; 혈관염; 제1형 당뇨병을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 염증성 또는 자가면역 장애는 염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD)이다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 개체의 적어도 하나의 세포에서 STAT3 신호전달을 차단하거나 억제한다. 일반적으로, 상기 세포는 상피 세포, 내피 세포 또는 면역 세포(예를 들어, Th17 면역 세포)이다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 프로피오네이트, 락테이트, 아세테이트 및 포름산염을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물을 생성한다. 일부 동일한 실시야태 및 일부 다른 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 부티레이트를 생성하지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 메디테라네이박터 속의 박테리아성 균주의 16S rRNA 서열과 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다.
대안적으로, 일부 실시형태에서 상기 박테리아 균주는 서열번호 1-24와 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖거나, 또는 상기 박테리아 균주는 서열번호 1~24 중 어느 하나로 표시되는 16S rRNA 서열을 갖는다.
대안적으로, 일부 실시양태에서 상기 박테리아 균주는 서열 번호 29-32 중 어느 하나 이상과 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖거나, 또는 상기 박테리아 균주는 서열번호 29-32 중 어느 하나 이상으로 표시되는 16S rRNA 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 박테리아 균주는 적어도 부분적으로 분리된다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 약학 조성물로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 입자, 과립 및 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 건조 조성물이다. 예를 들어, 상기 조성물은 동결건조될 수 있다. 대안적으로, 상기 조성물은 분무 건조, 유동층 건조 또는 진공 건조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 경구 투여용으로 제제화된다.
한 측면에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis)의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 메디테라네이박터 락타리스(Mediterraneibacter lactaris)의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염증성 또는 자가면역 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염증성 또는 자가면역 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis)의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 V21/006223, V21/006224, V21/006225 또는 V21/006226 중 어느 하나의 수탁번호로 기탁된 M. 파에시스 균주 또는 이의 변이체이다.
관련된 측면에서, 본 발명은 염증성 또는 자가면역 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 메디테라네이박터 락타리스의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 염증성 또는 자가면역 장애는 염증성 장 질환(크론병 또는 궤양성 대장염 등); 천식(알레르기성 천식 또는 호중구성 천식 등); 관절염(류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 또는 청소년 특발성 관절염 등); 지방간 질환(비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 등); 강직성 척추염; 건선; 전신홍반루푸스(SLE); 경피증; 쇼그렌 증후군; 혈관염; 제1형 당뇨병에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 염증성 또는 자가면역 장애는 염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD)이다.
한 측면에서, 본 발명은 염증성 또는 자가면역 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 메디테라네이박터 파에시스의 박테리아 균주; 및 항염증제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항염증제는5-아미노살리큘레이트, 코르티코스테로이드, 아자티오프린(azathioprine), 인플릭시맙(infliximab) 및 아달리무맙(adalimumab)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염증성 또는 자가면역 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 메디테라네이박터 파에시스의 박테리아 균주; 및 영양 보충제를 포함한다.
일부 관련된 측면에서, 본 명세서에 기술된 기술은 프로바이오틱스 형태로 박테리아 종 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 프로바이오틱스는 장내 미생물 생태를 개선하고, 미생물 불균형의 증상을 완화하고, 건강을 증진하고/하거나 염증성 및/또는 자가면역 장애를 치료 또는 예방하는 데 효과적이다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 개시내용은 여기에 제시된 특정 실시예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 GTDB의 bac120 계통발생수의 노드 52630을 집중적으로 표시하는 그래픽 계통발생수를 제공한다. GTDB 트리는 120개의 보존된 단일 복사본 박테리아 마커 유전자의 연결된 정렬로 구성된 게놈 트리(tree)이다(Parks et al. 2018). M. 락타리스 및 M. 파에시스(노드 52630)의 가장 최근 공통 조상(MRCA)이 강조 표시되어 있다.
도 2는 광범위한 염증성 및 자가면역 장애와 박테리아성 균주 연관성을 그래프로 나타낸 것이다. 6,020명의 피험자의 고해상도 장내 메타게놈 데이터를 사용하여 (A) M. 파에시스 및 (B) M. 락타리스가 건강한 인간(검은 막대)에서 널리 퍼져 있지만 다양한 의학적 상태(줄무늬 막대)에서는 고갈되는 것으로 확인했다. 표시된 모든 연관성은 FDR < 0.01(Fisher의 정확한 테스트)을 갖는다.
도 3은 M. 파에시스 균주의 계통발생, 대사 및 형태를 그래프로 나타낸 것이다. (A)는 GTDB(릴리스 95)의 고품질 참조 게놈에서 얻은 120개의 박테리아 특이적 단일 복사본 마커 유전자의 정렬로 구성된 게놈 트리(tree)를 나타낸다. 1000회 반복에서 계산된 비모수적 부트스트랩 값이다. (B)는 MH-23 분리물의 그람 염색이 이는 형태(morphology)를 보여주는 MH23-1을 분리하는 것을 나타낸다.
도 4는 나이브(naive) 동물에 대한 M. 파에시스의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. (A)는 나이브 C57Bl/6 마우스에 대한 M. 파에시스 MH23-1의 효과를 평가하는 데 사용된 모델 개요를 나타낸다. (B)는 M. 파에시스 MH23-1을 사용한 치료가 나이브 동물의 체중에 거의 영향을 미치지 않음을 나타낸다. (C)-(D)는 M. 파에시스 MH23-1을 처리한 경우 나이브 동물에서 비히클(vehicle) 처리 대조군에 비해 결장 길이 또는 결장 중량/길이 비율에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. (E)-(G)는 M. 파에시스 MH23-1를 사용한 치료는 나이브 동물의 비히클 치료 대조군에 비해 상피 손상, 염증 또는 혈관과다증에 효과가 없음을 나타낸다. (H)는 M. 파에시스 MH23-1을 사용한 치료가 나이브 동물의 비히클 치료 대조군에 비해 장 조직학에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 모든 데이터는 평균 및 표준편차로 보고되었다. ns, 중요하지 않음(not significant); * p < 0.05.
도 5는 M. 파에시스 MH23-1이 장 장벽 기능을 회복시킴을 나타내는 그래픽 표현을 제공한다. (A)는 M. faecis MH23-1의 치료 효능을 평가하는 데 사용된 DSS 모델의 개요를 나타낸다. (B)는 건강 및 DSS 처리 샘플에서 비히클, 프레드니손, F. 프라우스니치이(F. prausnitzii) A2-165 및 M. 파에시스의 일일 치료 효과. 모든 치료 그룹을 DSS + 비히클 그룹과 비교한 것이다. 다중 비교를 위해 Dunnett의 테스트와 함께 양방향 아노바(Anova)를 사용하여 중요성을 결정했다. (C)는 1일, 2일, 6일에 평가된 대장염의 내시경 평가 결과이다. 모든 그룹은 적절하게 다중 비교를 위한 Dunn의 보정(1일) 또는 Dunnett의 보정을 사용한 단방향 Anova(2, 6일)를 사용하여 각 개별 날짜에 대해 DSS + 비히클 그룹과 비교되었다. 모든 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시된다. (D) 비히클, 프레드니손 또는 M. 파에시스 MH23-1로 처리된 C57Bl/6 마우스의 대표적인 장 조직학 이미지이다. (E) DSS 치료는 조직병리학적 점수의 증가를 가져오며, 이는 프레드니손, F. 프라우스니치이 A2-165 및 M. faecis MH23-1을 사용한 치료에 의해 개선된다. 모든 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시된다. 모든 그룹을 DSS + 비히클 그룹과 비교하고 다중 비교를 위해 Dunnett의 테스트와 함께 단방향 Anova를 사용하여 중요성을 결정했다. (F) DSS 치료는 프레드니손 또는 M. 파에시스 MH23-1 치료로 개선되는 상피 손상의 증가를 초래한다. 모든 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시된다. 모든 그룹은 다중 비교를 위한 Dunn의 보정과 함께 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 DSS + 비히클 그룹과 비교되었다. (G) DSS 치료는 프레드니손 또는 M. faecis MH23-1 치료로 개선되는 염증 점수의 증가를 초래한다. 모든 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시된다. 모든 그룹은 다중 비교를 위한 Dunnett의 보정이 포함된 단방향 Anova를 사용하여 DSS + 비히클 그룹과 비교되었다. (H)는 비히클, 프레드니손, F.프라우스니치이 또는 M. 파에시스 MH23-1로 처리된 C57Bl/6 마우스의 대변 내 리포칼린-2 농도이다. 다중 비교를 위해 Dunnett의 테스트와 함께 단방향 Anova를 사용하여 중요성을 결정했다. (I)는 DSS 처리가 장세포에 비해 잔 세포의 수를 크게 감소시키며 이는 M. 파에시스 MH23-1을 처리하면 개선됨을 나타낸다. 모든 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시된다. 모든 그룹은 다중 비교를 위한 Dunnett의 보정과 함께 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 DSS + 비히클 그룹과 비교되었다. (J) DSS 처리는 M. 파에시스 MH23-1 처리에 의해 개선되지만 프레드니손이나 F. 프라우스니치이 A2-165 처리에 의해 개선되지 않는 알시안 블루 염색 비율의 상당한 감소를 가져온다. 모든 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시된다. 모든 그룹은 다중 비교를 위해 Dunnett의 T3 보정과 함께 Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 테스트를 사용하여 DSS + 비히클 그룹과 비교되었다. (ns: 중요하지 않음; *, p<0.05; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001). (K) M. 파에시스 MH23-3의 치료 효능을 평가하는 데 사용된 DSS 모델의 개요이다. (L) DSS + 비히클 그룹과 비교하여 모든 그룹의 대장염에 대한 내시경 평가 결과이다. 모든 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시된다. (M) DSS 치료는 조직병리학적 점수의 증가를 가져오며, 이는 프레드니손 및 M. 파에시스 MH23-3 치료에 의해 개선됨을 나타낸다. 모든 데이터는 평균 및 표준편차로 제시되었으며 모든 그룹은 DSS + 비히클 그룹과 비교되었다. (N) DSS 치료는 프레드니손 또는 M. faecis MH23-3 치료로 개선되는 상피 손상의 증가를 초래함을 나타낸다. 모든 데이터는 평균 및 표준편차로 제시되었으며 모든 그룹은 DSS + 비히클 그룹과 비교되었다. (O) DSS 치료는 프레드니손 또는 MH23-3 치료에 의해 완화되는 염증 점수의 증가를 초래한다. 모든 데이터는 평균 및 표준편차로 제시되었으며 모든 그룹은 DSS + 차량 그룹과 비교되었다. (P)는 비히클, 프레드니손 또는 M. 파에시스 MH23-3으로 처리된 C57Bl/6 마우스 ±DSS의 대변 내 리포칼린-2 농도이다. 모든 데이터는 평균 및 표준편차로 제시되었으며 모든 그룹은 DSS + 비히클 그룹과 비교되었다. (Q) M. 파에시스 MH23-3의 치료 효능을 평가하는 데 사용된 TNBS 모델의 개요이다. (R) DSS 치료는 조직병리학적 점수의 증가를 가져오며, 이는 프레드니손 및 M. 파에시스 MH23-3 치료에 의해 개선됨을 나타낸다. 모든 데이터는 평균 및 표준편차로 제시되었으며 모든 그룹은 DSS + 비히클 그룹과 비교되었다. (S) 비히클, 프레드니손 또는 M. 파에시스 MH23-1로 처리된 C57Bl/6 마우스 ± TNBS의 대표적인 장 조직학 이미지이다. (ns: 중요하지 않음; *, p<0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001).
도 6은 시험관 내에서 STAT3 및 NF-kB 활성화를 억제하는 M. 파에시스의 그래프 표현을 제공한다. (A)-(C) HEKBlue IL 23 리포터 세포주를 M. faecis MH23-1, MH23-3 및 MH23-4의 무세포 상층액으로 처리하면 STAT3 신호 전달이 억제된다(t-테스트, n = 3, (A) p < 0.0001, (B) p < 0.0001, (C) p = 0.002). (D)-(F) M. 파에시스 균주 MH23-1, MH23-3 및 MH23-4의 무세포 상층액을 크기 분획화했다. <3KDa 분획은 37℃ 또는 97℃에서 열처리하고, HEKBlue IL-23 리포터 세포주를 테스트했다. 열처리 후에도 모든 분획은 여전히 STAT3 신호 전달을 억제할 수 있다(t-테스트, n = 6; (D) p = 0.0068, p = 0.0186, p = 0.0005; (E) p = 0.0008, p = 0.0021, p = 0.0002, (F) p < 0.0001, p < 0.0001, p <0.0001).
도 7은 가이트 상피 세포(guyt epithelial cells)에서의 사이토카인 발현의 그래프 표현을 제공한다. (A) M. 파에시스 MH23-1 배양 상층액은 HCT116 장 상피 세포에서 IL-1β 매개 IL-8 분비를 억제한다. (B) THP-1이 활성 대식세포로 PMA 의존적으로 성숙된 후, M. 파에시스 MH23-4 및 MR1 상층액은 LPS로 공동 자극할 때 (A) IL-8 및 (B) TNF 생산 수준을 감소시다. 따라서 C. 볼타에(C. bolteae)와 같은 IBD와 관련된 박테리아로 세포를 처리하면 TNF 수준이 증가한다(ANOVA 테스트, n = 3; p = 0.0026). 모든 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시된다.
도 8은 MH23의 GPCR 히트(hit)의 히트맵(heatmap)을 보여준다. M. 파에시스 MH23-1에 대한 작용제(파란색) 및 길항제(녹색) 히트(hit)의 히트맵(heatmap)이다. 오른쪽의 범례는 각 히트(hit)에 대한 활성화 비율을 나타낸다.
도 9는 M. 파에시스가 hPBMC 유래 CD3+ 및 CD3- 세포에서 IL-22 및 IFNγ를 조절하는 것을 그래프로 나타낸 것이다. (A) M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-2 무세포 상청액 처리는 자극되지 않은 PBMC에서만 T 세포의 증가를 유도한다(ANOVA 테스트, n = 6, 처리되지 않은 p = 0.0010, +PIM p = 0.0937). (B)-(C) M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-2 무세포 상층액 처리는 NK 세포의 증가를 유도하지 않거나((B) ANOVA 테스트, n = 6; 처리되지 않은 p = 0.0396; +PIM p = 0.0275), 또는 수지상 세포를 감소시킨다((C) ANOVA 테스트, n = 6; 미처리 p = 0.1994; +PIM p = 0.3827). (D)-(F) CD3- 및 CD3+ 세포는 M. faecis MH23-1 및 MH23-2의 무세포 상등액으로 처리할 때 IFNγ 발현을 극적으로 감소시킨다. CD3-세포는 또한 M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-2의 무세포 상청액으로 처리했을 때 IL-22 발현의 증가를 보여주었다(ANOVA 테스트, n = 7, (D) p < 0.0001, (E) p < 0.0001, (F) p = 0.0189).
도 10은 M. 파에시스가 인간 장 상피 세포의 이동을 촉진한다는 것을 보여주는 그래프를 제공한다. (A) HCT116 결장암 세포의 이동에 대한 M. 파에시스 균주 MH23-1 및 MH23-2의 멸균 배양 상청액 추출물의 효과를 연구하기 위해 Transwell 이동 분석을 사용했다. 혈청이 부족한 조건(0.5% FBS)에서, 처리되지 않은 HCT116 세포와 Ty 배지 추출물로 처리된 세포는 트랜스웰 챔버의 바닥측면으로의 유사한 배경 수준의 이동을 보여주었다. 챔버 바닥에 M. 파에시스 추출물을 첨가하는 경우 Ty 대조군에 비해 HCT116 세포의 기저측면으로의 이동이 크게 증가했다(Ty, Cn = 6개의 기술적 반복; MH23-1, MH23-1 n = 4개의 기술적 반복, 각각 3개의 생물학적 반복에 대해; Dunnett의 다중 비교 테스트 ** P = 0.0035, **** P < 0.0001).
도 11은 M. 락타리스의 항-STAT3 활성화 활성을 그래프로 나타낸 것이다. (A) M. 락타리스 ATCC 29176 무세포 배양 상청액 및 <3 kDa 분획은 STAT3 활성화를 억제한다. (B) M. 락타리스 MH54 무세포 배양 상층액 및 <3 kDa 분획은 STAT3 활성화를 억제한다. 샘플은 unpaired t-test를 사용하여 비교되었다. p < 0.05, p < 0.01, p < 0.0001.
도 12는 장벽 무결성(integrity)에 대한 M. 파에시스의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. (A) M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-3 무세포 배양 상등액은 IFN-γ를 개선하여 TEER로 평가한 TY 배지 대조군과 비교하여 24시간 처리 후 장벽 무결성에 대한 변화를 유도했다. (B) M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-3 무세포 배양 상등액은 IFN-γ를 개선하여 TEER로 평가한 TY 배지 대조군과 비교하여 144시간 처리 후 TEER의 장벽 무결성에 대한 변화를 유도했다. (C) M. 파에시스 MH23-3 배양 상층액 추출물은 YG/V 배지 대조군에 비해 IFN-γ 처리 후 장벽 무결성의 복원을 촉진한다. 샘플은 unpaired t-test를 사용하여 비교되었다. *, p<0.05; **, p < 0.01; *** p < 0.001: **** p < 0.0001.
서열에 대한 간략한 설명
1. 정의
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기술된다. 본 발명의 목적을 위해, 다음 용어를 하기에 정의한다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, "구성(an element)"는 하나의 구성 또는 하나 이상의 구성을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약(about)"은 이 기술 분야의 당업자에게 쉽게 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 의미한다. 본 명세서에서 값 또는 매개변수에 대한 "약"이라는 언급은 그 값 또는 매개변수 자체에 관한 실시예를 포함(및 설명)한다.
본원에 사용된 용어 "투여(administering)"는 원하는 부위에 제제의 적어도 부분적 전달을 초래하는 방법 또는 경로에 의해 본원에 개시된 제제(예를 들어, 박테리아)를 개체에 배치하는(placement) 것을 의미한다. 본원에 개시된 화합물을 포함하는 조성물은 개체에 효과적인 생물학적 활성 또는 치료 효과를 초래하는 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 인간의 신체적 활동(예를 들어 주사, 섭취 행위, 적용 행위 및/또는 전달 장치 또는 기계의 조작)을 포함한다. 그러한 활동은 수행될 수 있다(예: 의료 전문가 및/또는 치료를 받는 대상에 의해).
구체적으로, 본 명세서에 사용된 "투여하다(administer)" 및 "투여(administration)"는 한 사람이 다른 사람에게, 두 번째 사람으로부터 받은 지시와 독립적으로 또는 그에 따라 특정 방식 및/또는 특정 목적으로, 살아있는 박테리아, 죽은 박테리아, 박테리아로부터 유래된 소비된 배지, 박테리아의 세포 펠렛, 박테리아에 의해 생산된 정제된 단백질, 프리바이오틱스, 소분자, 또는 이들의 조합을 섭취하도록 지시하는 실시양태를 포함한다. 실시예의 비제한적인 예에는 한 사람이 다른 사람에게 특정 방식 및/또는 특정 목적으로 살아있는 박테리아, 죽은 박테리아, 박테리아로부터 유래된 소비된 배지, 박테리아의 세포 펠렛, 박테리아에 의해 생산된 정제된 단백질, 프리바이오틱스, 소분자, 또는 이들의 조합를 섭취하도록 지시하는 상황이 포함되며, 여기에는 의사가 환자에게 행동 및/또는 치료 과정을 처방하는 경우, 부모가 미성년자 사용자(예: 어린이)에게 해당 제품을 섭취하도록 명령하는 경우, 트레이너가 사용자(예: 운동선수)에게 특정 행동 및/또는 치료 과정을 따르도록 조언하는 경우, 또는 제조업체, 유통업체 또는 마케팅 담당자가 제품 판매 또는 마케팅과 관련하여 제공되는 포장이나 기타 재료에 대한 광고나 라벨링을 통해 최종 사용자에게 사용 조건을 권장하는 경우가 포함된다. 일부 실시양태에서, 상기 개시된 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 척수강내, 피하, 설하, 협측, 직장, 질, 안구 경로, 시신경 경로, 비강, 흡입, 분무, 피부, 경피 또는 이들의 조합에 의해 투여될 수 있고, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제와 함께 전달을 위해 제제화될 수 있다. 주목할 점은, 개시된 조성물이 세균불균형 및 그 후유증을 개선하기 위한 치료를 위한 다중 제형 및 전달 방식을 포함하지만, 프로바이오틱스와 같은 생균치료제(live biotherapeutic product)는 일반적으로 정맥내, 근육내 또는 복강내로 투여되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 이러한 전달 방식은 박테리아 대사의 소분자 생성물에 사용될 가능성이 높다.
"동시에 투여하는(administration concurrently)" 또는 "동시에 투여하는(administering concurrently)" 또는 "공동 투여하는(co-administering)" 등의 용어는 이러한 모든 활성제를 단일 조성물로 투여할 때 획득되는 결과와 동등하도록, 2개 이상의 활성제를 함유하는 단일 조성물을 투여, 또는 각각의 활성제를 별도의 조성물로서 투여 및/또는 동시적으로(contemporaneously), 또는 동시에(simultaneously), 또는 충분히 짧은 기간 내에 순차적으로 전달하는 것을 의미한다. "동시에(simultaneously)"는 활성제가 실질적으로 동시에 투여되고, 바람직하게는 동일한 제형으로 함께 투여되는 것을 의미한다. "동시적으로 (contemporaneously)"는 활성 제제가 시간에 맞춰 투여되는 것을 의미하며, 예를 들어 하나의 제제가 다른 제제 전후 약 1분 내지 약 1일 이내에 투여될 수 있다. 어떤 동시적인 시간이라도 유용하다. 그러나, 동시에 투여되지 않는 경우, 제제는 약 1분 내지 약 8시간 이내에, 적합하게는 약 1시간 미만 내지 약 4시간 내에 투여되는 경우가 종종 있을 것이다. 동시적으로 투여되는 경우, 제제는 대상체의 동일한 부위에 적합하게 투여된다. "동일 사이트"라는 용어는 정확한 위치를 포함하지만 약 0.5 내지 약 15cm 이내일 수 있으며, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5cm 이내일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "별도로(separately)"는 제제가 간격을 두고, 예를 들어 약 하루 내지 몇 주 또는 몇 달의 간격으로 투여된다는 것을 의미한다. 활성제는 어느 순서로든 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "순차적으로(sequentially)"는 제제가 순서대로, 예를 들어 분, 시간, 일 또는 주의 간격으로 투여된다는 것을 의미한다. 적절한 경우 활성제는 규칙적인 반복 주기로 투여될 수 있다.
"제제(agent)"라는 용어에는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화합물이 포함된다. 이 용어는 또한 염, 에스테르, 아미드, 전구약물, 활성 대사산물, 유사체 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에 구체적으로 언급된 화합물의 약학적으로 허용 가능하고 약리학적 활성 성분을 포함한다. 상기 용어가 사용되는 경우, 이는 활성 제제 자체뿐만 아니라 약학적으로 허용되는 약리학적 활성 염, 에스테르, 아미드, 전구약물, 대사산물, 유사체 등을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "제제"라는 용어는 협소하게 해석되지 않고 소분자, 단백질성 분자(예: 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질)뿐만 아니라 이를 포함하는 조성물, 그리고 RNA, DNA 및 이의 모방체 및 화학적 유사체와 같은 유전적 분자, 그리고 세포 작용제까지 확장된다. 용어 "제제"는 본원에 언급된 폴리펩티드뿐만 아니라 해당 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 생산하고 분비할 수 있는 세포를 포함한다. 따라서, "제제"라는 용어는 다양한 세포에서 발현 및 분비를 위한 바이러스 또는 비바이러스 벡터, 발현 벡터 및 플라스미드와 같은 벡터를 포함하는 핵산 구성물까지 확장된다.
바이오마커의 "양(amount)" 또는 "수준(level)"은 시료에서 검출 가능한 수준을 말한다. 이는 당업자에게 공지되어 있고 또한 본 명세서에 개시된 방법에 의해 측정될 수 있다. 평가된 바이오마커의 발현 수준 또는 양은 치료에 대한 반응을 결정하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라 대안(또는)으로 해석될 때 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
"혐기성"이라는 용어는 성장을 위해 산소가 필요하지 않음을 의미한다. 혐기성 박테리아 균주는 절대혐기성 박테리아 균주(즉, 산소의 존재로 인해 피해를 받는 균주); 공기저항성 혐기성균(즉, 성장을 위해 산소를 사용할 수 없지만 산소의 존재를 견딜 수 있는 것); 및 조건성 혐기성균(즉, 산소 없이 자랄 수 있지만 산소가 있는 경우 산소를 사용하는 것)를 포함한다.
"혐기성 조건"은 미생물이 말단 전자 수용체로 사용하기에는 발효 배지 내 산소 농도가 너무 낮은 조건으로 정의된다. "혐기성 조건"은 <3mmol/L/h, 바람직하게는 <2.5mmol/L/h, 더 바람직하게는 <2mmol/L/h, 가장 바람직하게는 <1.5mmol/L/h의 속도로 배지에 산소가 전혀 첨가되지 않거나 소량의 산소가 첨가되는 조건으로 추가로 정의될 수 있다. "혐기성 조건"은 특히 산소가 완전히 없는(=0mmol/L/h 산소) 것, 또는 예를 들어 <0.5 ~ <1mmol/L/h의 속도로 배지에 소량의 산소가 첨가된 것을 의미한다. "혐기성 대사(Anaerobic metabolism)"는 산소가 NADH에 포함된 전자의 최종 수용체가 아닌 생화학적 과정을 의미한다. 혐기성 대사는 산소 이외의 화합물이 말단 전자 수용체 역할을 하는 혐기성 호흡과 NADH의 전자를 활용하여 발효 경로를 통해 환원된 생성물을 생성하는 기질 수준 인산화로 나눌 수 있다.
"탄소원"이라는 용어는 일반적으로 미생물 성장을 유지하는데 적합한 기질 또는 화합물을 의미한다. 탄소원은 중합체, 탄수화물, 알코올, 산, 알데히드, 케톤, 아미노산, 펩티드 등을 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어, 단당류(예: 포도당, 과당, 자일로스), 올리고당(예: 수크로스, 유당), 다당류(예: 전분, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스), 리그노셀룰로오스 물질, 지방산(즉, 숙신산염, 젖산염, 아세트산염), 글리세롤 등 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 포도당이나 셀룰로오스와 같은 광합성 생성물일 수 있다.
탄소원으로 사용되는 단당류는 셀룰로오스, 전분 및 펙틴의 산 또는 효소 가수분해물과 같은 다당류의 가수분해 생성물일 수 있다. 여기서 "에너지원"이라는 용어는 화학유기영양 대사에서 탄소원이 이화작용 동안 전자 공여체로서 그리고 세포 성장 동안 탄소원으로서 모두 사용되기 때문에 용어 "탄소원"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "구균(cocci)"은 구형, 난형 또는 실질적으로 원형에 가까운 세포 형태를 갖는 것을 의미한다(예를 들어, 광학 현미경으로 검사할 때). 이 모양은 포도구균(Staphylococci) 또는 연쇄상구균(Streptococci) 속의 박테리아 균주의 모양과 유사하다(예: 광학 현미경으로 검사할 때). 박테리아 균주(예: "구균")의 특징적인 모양은 미생물학 분야에서 일반적으로 사용되는 분류 기준이다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"이라는 단어는 언급된 단계 또는 구성 또는 단계 또는 구성의 그룹을 포함하지만 다른 단계 또는 구성 또는 단계 또는 구성의 그룹을 배제하는 것을 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다. 따라서, "포함하는" 등의 용어의 사용은 나열된 구성요소가 필수이거나 필수이지만, 다른 구성요소는 선택적이며 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다. "구성된(consisting of)"은 "구성된(consisting of)"이라는 문구 뒤에 오는 모든 것을 포함하고 제한하는 것을 의미한다. 따라서 "구성된"이라는 문구는 나열된 구성이 필수이거나 필수이며 다른 구성이 존재할 수 없음을 나타낸다. "본질적으로 구성된다(consisting essentially of)"는 문구 뒤에 나열된 모든 구성을 포함하는 것을 의미하며, 나열된 구성에 대한 공개에 명시된 활동이나 행위를 방해하거나 기여하지 않는 다른 구성으로 제한된다. 따라서 "본질적으로 구성되는"이라는 문구는 나열된 구성이 필수이거나 필수이지만 다른 구성은 선택 사항이며 나열된 구성의 활동이나 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.
본원에 사용된 "배양하기(culturing)", "배양(culture)" 등은 세포 집단(또는 단일 세포)이 시험관 내에서 세포의 성장 또는 유지를 뒷받침하는 것으로 밝혀진 조건 하에서 인큐베이션되는 절차로, 시험관 내에서 사용되는 일련의 절차를 의미한다. 해당 기술 분야에서는 배양 시스템에서 정의해야 하는 다양한 형식, 배지, 온도 범위, 가스 농도 등을 인식하고 있다. 매개변수는 선택된 형식과 여기에 개시된 방법을 실행하는 개인의 특정 요구에 따라 달라질 것이다. 그러나 배양 매개변수의 결정은 본질적으로 일반적인 것으로 인식된다."감소하다", "감소하다", "감소하다", "억제하다", "억제하다", "감쇠하다" 등의 용어는 모두 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 본원에서 사용된다.
"감소하다(decrease)", "감소하다(reduced)", "감소하다(reduction)", "억제하다(inhibit)", "억제하다(suppress)", "감쇠하다(attenuate)" 등의 용어는 모두 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 이들 용어는 전형적으로 기준 수준과 비교하여 10% 이상의 감소(예를 들어, 주어진 치료 또는 제제의 부재)를 의미하고, 예를 들어 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상,약 30% 이상,약 35% 이상,약 40% 이상,약 45% 이상,약 50% 이상,약 55% 이상,약 60% 이상, 약 65% 이상,약 70% 이상,약 75% 이상,약 80% 이상,약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상 또는 그 이상의 감소를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "감소(reduction)", "억제(suppression)" 및 "억제(inhibition)"는 기준 수준과 비교하여 완전한 억제 또는 감소를 필요로 하지 않는다. "완전 억제(Complete inhibition)" 등은 기준 수준과 비교하여 100% 억제를 의미한다. 감소는 바람직하게는 정상 범위 내로 허용되는 수준까지 낮아질 수 있다(예: 특정 장애가 없는 개인의 경우).
"증가된(increased)", "증가(increase)", "강화(enhance)" 또는 "활성화(activate)"라는 용어는 모두 통계적으로 유의한 양만큼의 증가를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 용어 "증가하다", "증가하다", "강화하다" 또는 "활성화하다"는 기준 수준(예를 들어, 주어진 치료 또는 제제의 부재)과 비교하여 적어도 10%의 증가를 의미할 수 있고, 예를 들어 기준 수준과 비교하여 적어도 약 10%의 증가, 예를 들어 약 20% 이상, 약 25% 이상,약 30% 이상,약 35% 이상,약 40% 이상,약 45% 이상,약 50% 이상,약 55% 이상,약 60% 이상, 약 65% 이상,약 70% 이상,약 75% 이상,약 80% 이상,약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상 또는 기준 수준과 비교하여 최대 100% 증가 또는 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 기준 수준과 비교하여 2배에서 10배 이상 증가한 것을 의미할 수 있다. 지표 또는 증상의 맥락에서 "증가"는 해당 수준의 통계적으로 유의미한 증가를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "분리된"은 (1) 처음 생산되었을 때 관련된 구성 요소 중 적어도 일부에서(인간 대변과 같은 자연 환경에서든, 인공 성장 배지로 구성된 페트리 플레이트와 같은 실험 환경에서든) 분리된 것 및/또는 (2) 사람의 손에 의해 생산, 준비, 정제 및/또는 제조된 것을 포함한다. 분리된 박테리아, 단백질, 대사산물 또는 이들의 조합은 초기에 결합되었던 다른 성분의 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 이상으로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분리된 박테리아, 단백질, 대사산물, 또는 이들의 조합은 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 이상 순수하다. 본 명세서에 사용된 물질은 다른 성분(다른 박테리아 종 등)이 실질적으로 없는 경우 "순수한" 물질이다. "정제하다(purify)", "정제하다(purifying)" 및 "정제된(purified)"이라는 용어는 박테리아 배양 또는 관련 기술(예: 화학)에 대한 통상의 기술자가 인식하는 바와 같이 처음 생산되거나 생성될 때(예: 자연이나 실험 환경에서) 또는 초기 생산 후 임의의 시간 동안 연관된 구성 요소 중 적어도 일부로부터 분리된 박테리아 또는 기타 물질을 의미한다. 박테리아 또는 박테리아 개체군은 박테리아 또는 박테리아 개체군을 포함하는 물질 또는 환경과 같이 생산 시 또는 이후에 분리된 경우 정제된 것으로 간주될 수 있으며, 정제된 박테리아 또는 박테리아 개체군은 최대 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 이상까지 다른 물질을 함유할 수 있으며 여전히 "분리된" 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 정제된 박테리아 및 박테리아 개체군은 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%,약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 이상 순수하다. 본원에 제공된 박테리아 조성물의 경우, 조성물에 존재하는 하나 이상의 박테리아 유형은 박테리아 유형을 함유하는 물질 또는 환경에 생산 및/또는 존재하는 하나 이상의 다른 박테리아로부터 독립적으로 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 또는 박테리아 집단은 단일 박테리아 염색을 포함하는 경우 "분리"된다. 일부 실시양태에서, 이러한 분리된 박테리아는 다른 분리된 박테리아와 혼합되거나 투여될 수 있다(예를 들어, 정의된 분리된 박테리아 집단에서). 박테리아 조성물 및 이의 박테리아 성분은 일반적으로 잔류 서식지 산물(residual habitat product)로부터 정제된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "게놈"은 미생물의 유전자(코딩 핵산 서열) 및 비코딩 핵산 서열을 포함하는 DNA를 포함하므로, 예를 들어 미생물의 코딩 및 비코딩 DNA에 핵산이 도입되는 것을 포함한다.
"그람 변수(Gram-variable)"라는 용어는 그람 균주 시험에서 양성 결과 및/또는 음성 결과를 나타내는 것(즉, 크리스탈 바이올렛 염색 시약의 색상을 유지함)을 의미한다. 박테리아에 의한 크리스탈 바이올렛 염색의 유지는 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸 층의 두께와 관련이 있다. 그람 양성균은 더 두꺼운 펩티도글리칸 층을 가지고 있다. 그람 염색은 일반적으로 미생물학 분야에서 박테리아 균주를 분류하는 데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "장"은 소화관으로도 알려진 인간 위장관을 지칭하는 것으로 이해된다. 장은 입, 인두, 식도, 위, 소장(십이지장, 공장, 회장), 대장(맹장 및 결장) 및 직장을 포함한다. 전체 소화관에는 다양한 종류의 미생물이 서식할 수 있지만, 종 수와 바이오매스 측면에서 장내 미생물군집의 대부분은 장(소형 및 대형)에 존재한다.
"마커", "바이오마커" 등의 용어는 생물학적 시스템의 생리학적 상태의 지표로서 측정될 수 있는 모든 화합물을 의미한다. 상기 마커는 아미노산 서열, 핵산 서열 및 이의 단편을 포함하는 바이오마커일 수 있다. 예시적인 바이오마커에는 사이토카인, 케모카인, 성장 및 혈관 신생 인자, 전이 관련 분자, 암 항원, 세포사멸 관련 단백질, 효소, 프로테아제, 접착 분자, 세포 신호 전달 분자 및 호르몬이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 마커는 또한 일부 실시예에서 생물학적 시스템에서 유의하게 대사되지 않을 수 있는 당일 수 있다. 당은 예를 들어 만니톨, 락툴로스, 수크로스, 수크랄로스 및 이들 중 임의의 조합일 수 있다.
"측정(Measuring)" 또는 "측정(measurement)"은 해당 물질의 정성적 또는 정량적 농도 수준의 유도를 포함하여 샘플 내 특정 물질의 존재, 부재, 수량 또는 양(유효량일 수 있음)을 평가하는 것을 의미한다. 그렇지 않으면 피험자의 임상 매개변수 값 또는 분류를 평가한다. 대안적으로, 용어 "분석(assaying)", "검출(detecting)" 또는 "검출(detection)"은 본 명세서에 기술된 모든 측정 또는 측정을 지칭하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "점막 치유"는 손상된 점막층을 나타내는 하나 이상의 특성의 개선을 의미한다. 이러한 특징은 일반적으로 대장 내시경 검사로 결정되며 홍반, 혈관 패턴의 손실, 부서짐, 출혈, 미란 및 궤양을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 어떤 상황에서는 점막 치유란 손상된 점막층을 특징으로 하는 해로운 영향이 완전히 개선되는 것을 의미한다. 대안적으로, 점막 치유는 손상된 점막층을 특징으로 하는 하나 이상의 부정적인 효과의 감소 또는 개선을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약학 조성물"은 약학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 약학 산업에서 일반적으로 사용되는 담체)와 조합된 활성제를 의미한다.
"약학적으로 허용되는"이라는 문구는 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증 없이 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태을 지칭하기 위해 본원에서 사용되었다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 물 이외의 담체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체의 임의의 측면은 크림, 에멀젼, 겔, 리포솜, 나노입자 및/또는 연고일 수 있다. 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 인공 또는 조작된 담체(예를 들어, 활성 성분이 자연에서 또는 자연 내에서 발생하는 것으로 발견되지 않는 담체)일 수 있다.
"계통발생수(phylogenetic tree)"라는 용어는 정의된 계통발생 재구성 알고리즘 세트(예를 들어, 절약, 최대 가능성 또는 베이지안(Bayesian))를 사용하여 생성된 하나의 유전자 서열과 다른 유전자 서열의 진화 관계를 그래픽으로 표현한 것을 의미한다. 트리의 노드는 고유한 조상 시퀀스를 나타내며 모든 노드의 신뢰도는 분기 불확실성을 측정하는 부트스트랩 또는 베이지안 사후 확률에 의해 제공된다.
일부 실시양태에서, 용어 "균주"는 계통발생수의 말단 잎을 지칭하고 특정 유전자 서열에 의해 정의된다. 특정 유전자 서열은 GTDB-tk(Chaumeil et al. 2020) 또는 해당 분야에 알려진 다른 도구를 사용하여 게놈 어셈블리에서 추출된 120개의 편재 단일 복사본 단백질(Parks et al. 2018)의 연결된 정렬일 수 있다.
"계통군(clade)"라는 용어는 계통발생수에서 안정 노드(부트스트랩 값 >90%)의 하류에 있는 계통발생수의 구성원 세트를 의미한다. 계통군은 공통 조상의 모든 계통발생적 후손을 대표하는 관련 유기체 그룹이다. 계통발생수는 별개의 단계통 진화 단위인 계통발생수의 말단 리프(leaves) 세트로 구성된다.
본 명세서에 사용된 "프리바이오틱"은 숙주에게 이익을 줄 수 있는(또는 그렇지 않을 수 있는) 위장 미생물총의 조성 및/또는 활성 모두에서 특정 변화를 허용하는 성분을 의미하는 것으로 이해된다. 선호되는 프리바이오틱스는 프로바이오틱스 조성물 또는 이의 유익한 기능의 성장을 촉진하지만 병원체 또는 병원성과 관련된 유전자(예: 독소)의 성장을 촉진하지 않는 것들이 될 것이다.
본 명세서에 사용된 "프로바이오틱스"는 현재 세계보건기구(WHO)가 정의한 바와 같이 "적절한 양으로 투여될 때 숙주에게 건강상 이점을 제공하는 살아있는 미생물"을 의미하는 것으로 이해된다.
"종"이라는 용어는 97% 이상의 16S 리보솜 RNA(rRNA) 서열 상동성과 70% 이상의 게놈 혼성화를 가지며 다른 모든 유기체와 충분히 다르기 때문에 별개의 단위로 인식될 정도로 밀접하게 관련된 유기체의 집합으로 정의된다. 종 및 기타 계통발생적 식별은 미생물학 분야의 당업자에게 알려진 분류에 따른다.
본 명세서에 사용된 "개체(subject)"는 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류에는 침팬지, 사이노몰구스 원숭이, 거미원숭이, 짧은꼬리원숭이(예: 붉은털원숭이)가 포함된다. 설치류에는 생쥐, 요금, 우드 척, 흰 족제비, 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 사냥 동물에는 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종(예: 집고양이), 개과 종(예: 개, 여우, 늑대), 조류(예: 닭, 에뮤, 타조), 어류(예: 송어, 메기, 연어)가 포함된다. 일부 실시양태에서 개체는 포유동물(예를 들어, 영장류(예를 들어, 인간))이다. "개인(individual)", "환자(patient)" 및 "피험자(subject)"라는 용어는 개체, 대상체, 대상과 더불어 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게는 대상은 포유동물이다. 포유동물은 인간, 인간이 아닌 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있으나 이들 예에 국한되지는 않는다. 인간 이외의 포유동물은 염증성 및 자가면역 장애의 동물 모델(예를 들어 장 장벽 기능 모델)을 나타내는 대상으로서 유리하게 사용될 수 있다. 대상은 남성(수컷)일 수도 있고 여성(암컷)일 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하다(treat)", "치료(treatment)", "치료하는(treating)" 등은 치료학적 치료법을 지칭하며, 여기서 그 목적은 질병 또는 장애(예: 염증성 또는 자가면역 장애)와 관련된 상태의 진행 또는 중증도를 반전, 완화, 개선, 억제, 둔화 또는 중지시키는 것이다. "치료하다"라는 용어는 염증성 또는 자가면역 장애와 관련된 상태, 질병 또는 장애의 적어도 하나의 부작용 또는 증상을 감소시키거나 완화시키는 것을 포함한다. 하나 이상의 증상이나 임상 지표가 감소하면 치료는 일반적으로 "효과적"이다. 또는 질병의 진행이 감소되거나 중단되면 치료가 "효과적"이다. 즉, "치료"에는 증상이나 지표의 개선뿐 아니라 치료가 없을 때 예상되는 증상과 비교하여 증상의 진행 또는 악화를 중단하거나 적어도 늦추는 것도 포함된다. 유익하거나 원하는 임상 결과에는 검출 가능 여부에 관계없이; 하나 이상의 증상의 완화, 질병의 범위 감소, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 개선 또는 경감, 완화(부분적이든 전체적이든) 및/또는 사망률 감소가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 질병의 "치료"라는 용어에는 질병의 증상이나 부작용(고식적 치료(palliative treatment) 포함)을 완화하는 것도 포함된다. 치료가 효과적인 것으로 간주되기 위해 장애(즉, 질병의 완전한 회복 또는 부재)를 치료할 필요는 없다.
일부 실시양태에서, 서열분석은 16S rRNA 유전자 서열분석을 포함하며, 이는 "16S 리보솜 RNA 서열분석", 16S rDNA 서열분석 또는 "16s rRNA 서열분석"으로도 지칭될 수 있다. 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석은 여러 종의 박테리아 사이에 고도로 보존되어 있지만 진핵생물 종에는 존재하지 않기 때문에 유전학 연구에 사용될 수 있다. 고도로 보존된 영역 외에도 16S rRNA 유전자는 종마다 다른 9개의 초가변 영역(V1-V9)을 포함한다. 16S rRNA 유전자 서열분석은 일반적으로 16S rRNA 유전자의 보존된 영역에 결합하는 다수의 범용 프라이머를 사용하는 것, 박테리아의 16S rRNA 유전자 영역(초가변 영역 포함)을 증폭하는 PCT, 여기에 설명된 차세대 서열분석 기술을 사용하여 증폭된 16S rRNA 유전자의 서열분석을 포함한다(또한, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,654,418; 6,344,316; 및 8,889,358; 및 미국 특허 공개 번호 US2013/157,265 및 US2018/195,111을 참조, 이들 각각은 그 전문이 참고로 포함됨).
본 명세서에 기술된 각 실시예는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 각각의 실시예에 준용하여 적용된다.
2. 박테리아 균주
본 발명의 조성물은 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주를 포함한다. 실시예는 이 속의 박테리아가 손상된 장 장벽 기능과 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 데 유용하다는 것을 입증한다. 바람직한 박테리아 균주는 M. 파에시스 종이다.
메디테라네이박터(Mediterraneibacter)는 클로스트리디아(Clostridia) 강에 속하는 박테리아 속이다. 과학적 분류는 다음과 같다: 박테리아(계); 피르미쿠테스(문); 클로스트리디아(강); 오실로스피랄레스(목); 아쿠타리박테리아과(과); 메디테라네이박터(속). 메디테라네이박터 속 박테리아는 구균 모양의 그람 반응 가변 비운동성 박테리아이며 절대혐기성 박테리아이다. 이러한 기준은 박테리아 균주의 계통발생적 분류를 알 수 있기 때문에 중요하다. 예를 들어, 박테리아 종 M. 파에시스는 이전에 특히 이러한 기준에 따라 루미노코쿠스(Ruminococcus) 및 Faecalicatena(파에칼리카테나) 속에 속하는 것으로 분류되었다.
M. 파에시스 균주(이전에는 루미노코수스 파에시스로 특성화됨)는 Kim et al., 2011에 기재되어 있으며, 현재 분류학적 재분류는 Togo et al., 2018에 기재되어 있다. 표준 균주 M. 파에시스 Eg2(=JCM 15917)는 사람의 대변에서 분리되었다(Kim et al., 2011). M. 파에시스 유형 균주 JCM 15917의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 GenBank 접근 번호는 NR_116747이다.
메디테라네이박터 속 및 M. 파에시스 종의 호흡(breath)은 Oren et al., 2015 및 Whitman et al., 2018에 설명된 분류 체계인 게놈 분류 데이터베이스 참조 트리에 의해 정의된다.
수탁 번호 V21/006223 하에 기탁된 M. 파에시스 박테리아(즉, M. 파에시스 MH23-1)는 실시예에서 시험되었으며 본 발명의 바람직한 균주 중 하나이다. M. 파에시스 균주 MH23-1은 2021년 3월 31일 Microba IP Pty Ltd(388 Queen Street, 브리즈번, QLD 4000, 호주)에 의해 국제 기탁 기관인 국립 측정 연구소(National Measurement Institute; NMI, 1/153 Bertie Street, 포트 멜버른, 빅토리아, 3207, 호주)에 "Mediterraneibacter faecis MH23-1"로 기탁되었으며 수탁 번호 V21/006223이 지정되었다.
시험된 M. 파에시스 MH23-1 균주에 대한 예시적인 16S rRNA 서열은 서열번호 1-6에 기재되어 있다. M. 파에시스 종의 박테리아 균주는 그의 게놈 내에 단일 16 rRNA 서열을 포함할 수 있거나, 보다 바람직하게는 그의 게놈 내에 2개 이상의 16S rRNA 서열(예: 2개 카피, 3개 카피, 4개 카피, 5개 카피, 6개 카피, 7개 카피, 8개 카피 또는 8개 이상 카피)을 포함할 수 있다. 가장 바람직한 구현예 중 일부에서, M. 파에시스 MH23-1 균주는 서열번호 1-6에서 확인되는 16S rRNA 서열의 6개 카피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 균주가 서열 번호 1-6 중 어느 하나에 상응하는 16S rRNA 서열을 포함하는지 여부를 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 결정함으로써 박테리아성 균주가 M. 파에시스 MH23-1 균주인 것으로 식별될 수 있다. M. 파에시스 균주 MH23-1의 게놈은 염색체와 플라스미드로 구성된다. M. 파에시스 균주 MH23-1에 대한 염색체 서열은 서열번호 1에 제공된다. 이 서열은 Illumina NovSeq6000 플랫폼을 사용하여 생성되었다.
또한, 균주 MH23-1과 밀접하게 관련된 박테리아 균주는 장 장벽 기능 회복에 대한 유익한 효과를 통해 염증성 및 자가면역 장애를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 것으로 실시예에 나타나 있다.
예를 들어, 수탁 번호 V21/006224로 기탁된 M. 파에시스 박테리아(즉, M. 파에시스 MH23-2)는 실시예에서 테스트되었으며 본 발명의 바람직한 균주 중 또 다른 하나이다. M. 파에시스 균주 MH23-2는 2021년 3월 31일 Microba IP Pty Ltd(388 Queen Street, 브리즈번, QLD 4000, 호주)에 의해 국제 기탁 기관인 국립 측정 연구소(National Measurement Institute; NMI, 1/153 Bertie Street, 포트 멜버른, 빅토리아, 3207, 호주)에 "Mediterraneibacter faecis MH23-2"로 기탁되었으며 수탁 번호 V21/006224가 지정되었다.
시험된 M. 파에시스 MH23-2 균주에 대한 예시적인 16S rRNA 서열은 서열번호 7-12에 제시되어 있다. 가장 바람직한 일부 구현예에서, M. 파에시스 MH23-2 균주는 서열번호 7-12로 식별되는 16S rRNA 서열의 6개 카피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 균주가 서열 번호 7-12 중 어느 하나에 상응하는 16S rRNA 서열을 포함하는지 여부를 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 결정함으로써 박테리아 균주가 M. 파에시스 MH23-2 균주인 것으로 식별될 수 있다. M. 파에시스 균주 MH23-2의 게놈은 염색체와 플라스미드로 구성된다. M. 파에시스 균주 MH23-2에 대한 염색체 서열은 서열번호 26에 제공된다.
또한, 수탁 번호 V21/006225로 기탁된 M. 파에시스 균주(즉, M. 파에시스 MH23-3)도 실시예에서 테스트되었으며 이는 본 발명의 바람직한 균주 중 또 다른 하나이다. M. 파에시스 균주 MH23-3은 2021년 3월 31일 Microba IP Pty Ltd(388 Queen Street, 브리즈번, QLD 4000, 호주)에 의해 국제 기탁 기관인 국립 측정 연구소(National Measurement Institute; NMI, 1/153 Bertie Street, 포트 멜버른, 빅토리아, 3207, 호주)에 "Mediterraneibacter faecis MH23-3"으로 기탁되었으며 수탁 번호 V21/006225가 지정되었다.
시험된 M. 파에시스 MH23-3 균주에 대한 예시적인 16S rRNA 서열은 서열번호 13-18에 제시되어 있다. 가장 바람직한 일부 구현예에서, M. 파에시스 MH23-2 균주는 서열번호 13-18로 식별되는 16S rRNA 서열의 6개 카피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 균주가 서열 번호 13-18 중 어느 하나에 상응하는 16S rRNA 서열을 포함하는지 여부를 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 결정함으로써 박테리아 균주가 M. 파에시스 MH23-3 균주인 것으로 식별될 수 있다. M. 파에시스 균주 MH23-3의 게놈은 염색체와 플라스미드로 구성된다. M. 파에시스 균주 MH23-3에 대한 염색체 서열은 서열번호 27에 제공된다.
추가로, 수탁 번호 V21/006226로 기탁된 M. 파에시스 균주(즉, M. 파에시스 MH23-4)도 실시예에서 테스트되었으며 이는 본 발명의 바람직한 균주 중 또 다른 하나이다. M. 파에시스 균주 MH23-4은 2021년 3월 31일 Microba IP Pty Ltd(388 Queen Street, 브리즈번, QLD 4000, 호주)에 의해 국제 기탁 기관인 국립 측정 연구소(National Measurement Institute; NMI, 1/153 Bertie Street, 포트 멜버른, 빅토리아, 3207, 호주)에 "Mediterraneibacter faecis MH23-4"으로 기탁되었으며 수탁 번호 V21/006226가 지정되었다.
시험된 M. 파에시스 MH23-4 균주에 대한 예시적인 16S rRNA 서열은 서열번호 19-24에 제시되어 있다. 가장 바람직한 일부 구현예에서, M. 파에시스 MH23-2 균주는 서열번호 19-24로 식별되는 16S rRNA 서열의 6개 카피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 균주가 서열 번호 19-24 중 어느 하나에 상응하는 16S rRNA 서열을 포함하는지 여부를 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 결정함으로써 박테리아 균주가 M. 파에시스 MH23-4 균주인 것으로 식별될 수 있다. M. 파에시스 균주 MH23-4의 게놈은 염색체와 플라스미드로 구성된다. M. 파에시스 균주 MH23-4에 대한 염색체 서열은 서열번호 28에 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 박테리아성 균주는 M. 파에시스의 박테리아성 균주의 16S rRNA 서열과 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 박테리아성 균주는 서열번호 1-24 중 어느 하나와 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리아성 균주는 서열번호 1-6 중 하나 이상으로 표시되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일부 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 박테리아성 균주는 서열번호 7-12 중 하나 이상으로 표시되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일부 대안적인 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 박테리아성 균주는 서열번호 13-18 중 하나 이상으로 표시되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일부 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 박테리아성 균주는 서열번호 19-24 중 하나 이상으로 표시되는 16S rRNA 서열을 갖는다.
박테리아 균주의 게놈은 서열번호 1-6에 제시된 16S rRNA 서열 각각을 포함할 수 있다. 대안적으로, 박테리아 균주의 게놈은 서열번호 7-12에 제시된 16S rRNA 서열 각각을 포함할 수 있다. 대안적으로, 박테리아 균주의 게놈은 서열 번호 13-18에 제시된 16S rRNA 서열 각각을 포함할 수 있다. 대안적으로, 박테리아 균주의 게놈은 서열 번호 19-24에 제시된 16S rRNA 서열 각각을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 박테리아성 균주는 서열번호 25-28 중 어느 하나와 서열 동일성을 갖는 염색체를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 박테리아성 균주는 서열번호 25-28의 적어도 60%(예를 들어 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상)에 걸쳐 서열번호 25-28 중 어느 하나와 서열 동일성이 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% 또는 100% 이상의 서열 동일성)인 염색체를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 박테리아 균주는 서열 번호 25-28의 70%에 걸쳐 서열 번호 25-28 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성, 또는서열 번호: 25-28의 80%에 걸쳐 서열 번호: 25-28 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25-28의 90%에 걸쳐 서열 번호: 25-28 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25-28의 100%에 걸쳐 서열 번호: 25-28 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25-28의 70%에 걸쳐 서열 번호: 25-28 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25-28의 80%에 걸쳐 서열 번호: 25-28 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성, 또는,서열 번호: 25-28의 90%에 걸쳐 서열 번호: 25-28 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성, 또는,서열 번호: 25-28의 100%에 걸쳐 서열 번호: 25-28 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25-28의 70%에 걸쳐 서열 번호: 25-28 중 어느 하나에 대해 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25-28의 80%에 걸쳐 서열 번호: 25-28 중 어느 하나에 대해 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25-28의 90%에 걸쳐 서열 번호: 25-28 중 어느 하나에 대해 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25-28의 100%에 걸쳐 서열 번호: 25-28 중 어느 하나에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 염색체를 포함할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 균주는 수탁번호 V21/006223 하에 기탁된 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 균주이다. 이는 실시예에 제시된 DSS 마우스 모델에서 테스트되고 질병 치료에 효과적인 것으로 나타난 예시적인 M. 파에시스 MH23-1 균주이다. 따라서, 본 발명은 수탁번호 V21/006223으로 기탁된 M. 파에시스 균주 또는 이의 변이체의 분리된 세포와 같은 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 수탁 번호 V21/006223으로 기탁된 M. 파에시스 균주의 세포 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 수탁번호 V21/006223 하에 기탁된 M. 파에시스 균주의 생물학적으로 순수한 배양물을 제공한다.
일부 대안적 실시양태에서, 본 발명은 수탁 번호 V21/006224로 기탁된 M. 파에시스 균주 또는 이의 변이체의 분리된 세포와 같은 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 수탁 번호 V21/006224로 기탁된 M. 파에시스 균주의 세포 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 수탁 번호 V21/006224로 기탁된 M. 파에시스 균주의 생물학적으로 순수한 배양물을 제공한다.
일부 대안적 실시양태에서, 본 발명은 수탁 번호 V21/006225로 기탁된 M. 파에시스 균주 또는 이의 변이체의 분리된 세포와 같은 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 수탁 번호 V21/006225로 기탁된 M. 파에시스 균주의 세포 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 수탁 번호 V21/006225로 기탁된 M. 파에시스 균주의 생물학적으로 순수한 배양물을 제공한다.
일부 대안적 실시양태에서, 본 발명은 수탁 번호 V21/006226로 기탁된 M. 파에시스 균주 또는 이의 변이체의 분리된 세포와 같은 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 수탁 번호 V21/006226로 기탁된 M. 파에시스 균주의 세포 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 수탁 번호 V21/006226로 기탁된 M. 파에시스 균주의 생물학적으로 순수한 배양물을 제공한다.
V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 중 어느 하나의 수탁번호로 기탁된 균주의 변이체는 딸균주(후손) 또는 원본으로부터 배양(서브클로닝)된 균주일 수 있다. 본 발명의 균주의 변이체는 생물학적 활성을 제거하지 않고, 예를 들어 유전적 수준에서 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 변이체 균주는 치료적으로 활성이다. 변이 균주는 변이된 원래 V21/006223, V21/006224, V21/006225 또는 V21/006226 균주와 비슷한 활성을 갖는다. 특히, 변이 균주는 실시예에 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있는 실시예에 표시된 대로 적어도 하나의 질병 모델(예: 대장염)에서 필적할 만한 효과를 유도할 것이다. V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 계통 중 어느 하나의 변이체는 일반적으로 각각의 V21/006223, V21/006224, V21/006225 또는 V21/006226 계통의 생물형일 것이다.
수탁 번호 V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 하에 기탁된 M. 파에시스 균주의 세포에 대한 언급은 수탁 번호 V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료 효능 특징을 갖는 모든 세포를 포함하며, 이러한 세포는 본 발명에 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 박테리아 균주는 M. 락타리스의 박테리아 균주의 16S rRNA 서열과 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 박테리아성 균주는 서열번호 29-32 중 어느 하나와 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일부 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 박테리아 균주는 서열번호 29-32로 표시되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 박테리아 균주의 게놈은 서열 번호 29-32 중 어느 하나에 제시된 16S rRNA 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 종의 게놈은 16S rRNA 서열의 적어도 3개 카피를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 박테리아성 균주는 서열번호 33-38 중 어느 하나와 서열 동일성을 갖는 염색체를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 박테리아성 균주는 서열번호 33-38의 적어도 60%(예를 들어 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상)에 걸쳐 서열번호 33-38 중 어느 하나와 서열 동일성이 적어도 90%(예를 들어, 적어도 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% 또는 100% 이상의 서열 동일성)인 염색체를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 박테리아 균주는 서열번호 33-38의 70%에 걸쳐 서열 번호 33-38 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열번호 33-38의 80%에 걸쳐 서열번호 33-38 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열번호 33-38의 90%에 걸쳐 서열 번호: 33-38 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열 번호: 33-38의 100%에 걸쳐 서열 번호: 33-38 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열 번호: 33-38의 70%에 걸쳐 서열 번호: 33-38 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호 33-38의 80%에 걸쳐 서열번호 33-38 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호 25-28의 90%에 걸쳐 서열번호 33-38 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호 33-38의 100%에 걸쳐 서열번호 33-38 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호 33-38의 70%에 걸쳐 서열번호 33-38 중 어느 하나에 대해 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열번호 33-38의 80%에 걸쳐 서열번호 33-38 중 어느 하나에 대해 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열번호 33-38의 90%에 걸쳐 서열번호 33-38 중 어느 하나에 대해 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열번호 33-38의 100%에 걸쳐 서열번호 33-38 중 어느 하나에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 염색체를 포함할 수 있다.
2.1 박테리아 생물형(biotype)
수탁번호 V21/006223, V21/006224, V21/006225, V21/006226 중 어느 하나로 기탁된 세균의 생물형인 박테리아 균주 역시 염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 것으로 기대된다. 생물형은 생리학적, 생화학적 특성이 동일하거나 매우 유사한 밀접하게 관련된 계통이다.
수탁 번호 V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 중 어느 하나로 기탁된 박테리아의 생물형이고 본 발명에 사용하기에 적합한 균주는 수탁 번호 V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226으로 기탁된 박테리아에 대한 다른 뉴클레오티드 서열을 서열 분석함으로써 식별될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 전체 게놈이 서열분석될 수 있고, 본 발명의 생물형 균주는 이의 적어도 80%에 걸쳐(예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 또는 전체 게놈에 걸쳐)) 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 생물형 균주를 식별하는 데 사용하기 위한 다른 적합한 서열에는 hsp60 또는 BOX, ERIC, (GTG)5 또는 REP와 같은 반복 서열이 포함될 수 있다(Masco et al., 2003; Kim et al., 2019). 바이오타입 균주는 수탁번호 V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 중 어느 하나로 기탁된 박테리아의 상응하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 균주는 수탁 번호 V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 중 어느 하나로 기탁된 박테리아의 생물형이고, 제한 단편 분석 및/또는 PCR 분석, 예를 들어 형광 증폭 단편 길이 다형성(FAFLP) 및 반복 DNA 요소(rep)-PCR 지문 채취, 단백질 프로파일링, 또는 부분 16S 또는 23s rRNA 서열 분석을 사용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 기술은 다른 적합한 M. 파에시스 균주를 확인하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 균주는 기탁 번호 V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 중 어느 하나로 기탁된 박테리아의 생물형이고, 본 발명에 사용하기에 적합한 균주는 리보솜 증폭 DNA 제한 분석(amplified ribosomal DNA restriction analysis ; ARDRA)에 의해 분석될 때, 예를 들어, Sau3AI 제한 효소를 사용할 때 수탁 번호 V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 중 어느 하나로 기탁된 박테리아와 동일한 패턴을 제공하는 균주이다(예시적인 방법과 지침은 Srutkova et al., 2011 참조).
일부 구현예에서, 본 발명에 유용한 박테리아 균주는 박테리아 균주에 의한 대사산물의 생산 및 소비를 일상적으로 프로파일링함으로써 식별될 수 있다. 상기 및 본원의 다른 곳에서 기술된 박테리아 균주는 프로피오네이트, 락테이트, 아세테이트 및 포름산염의 생산에 영향을 미치는 것으로 예측된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 박테리아 균주는 프로피오네이트, 락테이트, 아세테이트 및 포름산염 중 하나 이상의 대사산물의 생체내 생산을 유도한다. 추가로, 일부 실시양태에서 본 발명의 박테리아 균주는 부티레이트를 생성하지 않는다.
수탁번호 V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 중 어느 하나로 기탁된 박테리아의 생물형과 같이 본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 다른 메디테라네이박터 균주는 실시예에 기술된 분석을 포함하여 임의의 적절한 방법 또는 전략을 사용하여 식별될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 균주는 실시예에 기술된 바와 같이 혐기성 TY 또는 PYG 배지에서 배양하고/하거나 DSS-유도 장 장벽 기능 모델에 박테리아를 투여한 후 사이토카인/케모카인 수준을 평가함으로써 식별될 수 있다. 특히, 수탁 번호 V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 중 어느 하나로 기탁된 박테리아와 유사한 성장 패턴, 대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 박테리아 균주가 본 발명에 유용할 수 있다. 유용한 균주는 V21/006223, V21/006224, V21/006225 및 V21/006226 균주 중 어느 하나와 유사한 면역조절 활성을 가질 것이다. 특히, 생물형 균주는 숙주 장 기능에 필적할만한 효과를 유도할 것이다. 더욱이, 생물형은 질병 모델(예: 대장염, 천식, 관절염, 다발성 경화증 및 포도막염 질환 모델)에서 유사한 효과를 가질 것이며 사이토카인/케모카인 수준에 있어서 실시예에 나타난 효과와 비교할 만한 효과를 가질 것으로 예상되며, 이는 실시예에 기술된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인할 수 있다.
2.2 박테리아 균주 생존력
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 내의 박테리아성 균주는 생존 가능하다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아 균주는 생존 가능하며 장에 부분적으로 또는 전체적으로 군집화할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아 균주는 살아 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물에 포함된 박테리아 균주는 열사멸(heat-killed)되지 않았다. 본 발명의 박테리아는 생존 불가능한 박테리아에 의해 나타나지 않는 면역 조절 효과를 가질 수 있는데, 예를 들어 생존 불가능한 박테리아는 대사산물을 생성할 수 없고 다른 방식으로 면역계와 상호작용할 수 없기 때문이다. 생존 가능한 박테리아의 세포 표면은 죽은 박테리아, 특히 열로 죽은 박테리아와 상당히 다를 가능성이 높다.
일부 대안적인 실시양태에서, 그 박테리아는 생존 가능하지 않다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는 박테리아가 열사멸된다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 자연 발생적이다. 예를 들어, 박테리아 균주는 포유동물의 소화관에서 분리되었다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 유전적으로 조작되지 않았다. 예를 들어, 박테리아 균주는 재조합 DNA로 형질전환되지 않았다.
2.3 항생제 내성
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아성 균주는 테트라사이클린, 바시트라신, 아목시실린, 암피실린, 아르베카신 및 디베카신, 아즈로실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 세프토비프롤, 클라리스로마이신, 도리페넴, 에리쓰로마이신, 푸시드산, 겐타마이신, 그레파플록사신, 이미페넴, 조사마이신, 메로페넴, 메지오실린, 피페라실린, 리팜핀, 리팍시민, 로키타마이신, 로사라마이신, 록시트로마이신, 스피라마이신, 스트렙토마이신, 설파메톡사졸/트리메토프림, 텔리스로마이신, 티카르실린, 티카르실린/클라불라네이트, 토수플록사신, 트리메토 프림 및 버지니아마이신 중 하나 이상에 내성이다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 퀴노프리스틴-달포프리스틴에 감수성이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 테트라사이클린 및/또는 바시트라신에 내성이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 β-락탐 항생제에 내성이다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 테트라이클린에 내성이다.
3. 조성물
본원에서는 상기 및/또는 본원의 다른 곳에 기술된 박테리아 균주 또는 균주들의 치료 유효량을 포함하거나, 구성하거나, 본질적으로 구성하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물 중 박테리아는 균주, 종, 작동 분류 단위(operational taxonomic unit; OTU), 전체 게놈 서열, 16S rRNA 서열, 또는 상이한 유형의 박테리아를 정의하기 위한 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 식별될 수 있다.
3.1 가장 최근 공통 조상(Most recent common ancestor; MRCA)
일부 실시양태에서, 조성물은 M. 파에시스 및 M. 락타리스의 MRCA의 계통발생적 후손인 박테리아 균주의 유효량을 포함한다(도 1). 바람직하게는 계통발생적 분류는 GTDB(Parks et al., 2018)에 의해 정의된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 계통발생적 분류는 GTDB 릴리스 95(r95)에 정의된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 박테리아 균주가 M. 파에시스 및 M. 락타리스의 MRCA의 자손인지 여부를 결정하는 것은 당업계에 공지된 계통발생적 분류 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, M. 파에시스, M. 락타리스 및 제3의 관심 분류군(예를 들어, 분류될 분류군)이 포함된 뿌리 계통수를 사용할 수 있으며, 다음과 같은 분석 패키지가 적용된다: 관심 분류군이 본 발명의 조성물에 유용한지 여부를 결정하기 위한 계통발생학 및 진화(ape”; https://cran.r-project.org/web/packages/ape/index.html) 및 비교 생물학(“phytools”; http://cran.r-project.org/web/packages/phytools/index.html)을 위한 계통발생 도구의 분석. 상기 ape와 phytools는 모두 분자 진화와 계통발생학을 연구하는 데 사용하기 위해 R 언어로 작성된 패키지이다. ape 및 phytools 패키지는 계통발생 및 진화 분석 방법을 제공하며 이들의 사용은 당업자에게 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 다음 스크립트가 사용될 수 있다:
library("ape")
library("phytools")
input.tree = read.tree(file="tree_file")
medi = ('s_Mediterraneibacter_faecis', 's_Mediterraneibacter_lactaris'))
medi.node = getMRCA(input.tree, medi)
medi.tree = extract.clade(input.tree, medi.node)
print(medi.tree$tip.label)
일부 실시양태에서, 스크립트가 실행된 후 관심 분류군이 인쇄된 목록(printed list)에 있으면 이는 두 종의 MRCA의 후손이다.
다른 실시양태에서, 다른 분석 패키지를 사용하고 다른 프로그래밍 언어에 기초한 방법을 포함하여, 당업계에 공지된 다른 계통발생적 그룹화 방법을 사용하여 박테리아 균주가 M. 파에시스 및 M. 락타리스의 MRCA(그림 1)의 자손인지 여부를 결정할 수 있다.
다른 실시양태에서, 박테리아 종은 이미 루미노코카세과의 구성원으로 확인된 종으로부터의 16S rDNA 서열과 서열 동일성을 갖는 16S rDNA 서열을 갖는 경우 박테리아 종은 루미노코카세과의 구성원이다. 하나의 실시양태에서, 박테리아 종이 Ruminococcaceae 과에 속하는지 여부를 확인하는 것은 Yarza et al., 2014, Nature Reviews Microbiology 12:635-645, 및 Stackebrandt, E. & Ebers, J., 2006, Microbiol. Today 8:6-9에 설명된 방법을 사용하여 수행되며 이는 여기에 참조로 포함된다.
3.2 16S rRNA 서열 동일성.
일부 실시양태에서, 16S rRNA 서열은 분류될 박테리아 종에 대해 획득되거나 결정된다. 이 쿼리 16S rRNA 서열은 이미 메디테라네이박터 속의 구성원으로 분류된 박테리아 종의 16S rRNA 서열과 비교된다. 일부 실시양태에서, 쿼리(query) 16S rRNA 서열은 서열번호 1-24 중 어느 하나에 제시된 16S rRNA 서열과 비교된다. 일부 대안적 실시양태에서, 쿼리 16S rRNA 서열은 서열번호 29-32 중 어느 하나에 제시된 16S rRNA 서열과 비교된다. 일부 실시양태에서,쿼리 16S rRNA 서열은 이미 메디테라네이박터 속의 구성원으로 분류된 박테리아 종에 대해 알려진 모든 16S rRNA 서열과 비교된다. 다른 실시양태에서, 질의 16S rDNA 서열은 이미 메디테라네이박터 속의 구성원으로 분류된 박테리아 종에 대한 모든 공지된 16S rDNA 서열의 서브세트와 비교된다. 쿼리 서열과 비교된 서열 사이의 동일성 백분율이 결정된다. 쿼리 서열의 식별율이 정의된 임계값을 초과하는 것으로 결정되면, 분류될 박테리아 종은 메디테라네이박터 속의 구성원으로 분류된다.
일부 실시양태에서, 역치 서열 동일성은 95%이다. 일부 실시양태에서, 역치 서열 동일성은 97.5%이다. 일부 실시양태에서, 역치 서열 동일성은 99.0%이다. 일부 실시양태에서, 역치 서열 동일성은 94.5%, 94.6%, 94.7%, 94.8%, 94.9%, 95.0%, 95.1%, 95.2%, 95.3%, 95.4%, 95.5%, 95.6%, 95.7%, 95.8%, 95.9%, 96.0%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97.0%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.5%, 97.6%, 97.7%, 97.8%, 97.9%, 98.0%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%.99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%이다.
일부 실시양태에서, 16S rDNA 서열은 분류될 박테리아 종에 대해 획득되거나 결정된다. 이 쿼리 16S rDNA 서열은 이미 Ruminococcaceae 계통의 구성원으로 분류된 박테리아 종의 16S rDNA 서열과 비교된다. 일부 실시양태에서, 쿼리 16S rDNA 서열은 표 11에 나열된 16S rDNA 서열과 비교된다. 일부 실시양에서, 쿼리 16S rDNA 서열은 이미 루미노코카세아과의 구성원으로 분류된 박테리아 종에 대해 알려진 모든 16S rDNA 서열과 비교된다. 다른 실시양태에서, 쿼리 16S rDNA 서열은 루미노코카세과(Ruminococcaceae) 과의 구성원으로 이미 분류된 박테리아 종에 대한 모든 공지된 16S rDNA 서열의 서브세트와 비교된다. 쿼리 서열과 비교된 서열 사이의 동일성 백분율이 결정된다. 쿼리 서열의 동일성 백분율이 정의된 임계값을 초과하는 것으로 결정되면, 분류될 박테리아 종은 루미노코카세과(Ruminococcaceae) 과의 구성원으로 분류된다.
일부 실시양태에서, 역치 서열 동일성은 95%이다. 일부 실시양태에서, 역치 서열 동일성은 98.7%이다. 일부 실시양태에서, 역치 서열 동일성은 94.8%이다. 일부 실시양태에서, 역치 서열 동일성은 94.5%, 94.6%, 94.7%, 94.8%, 94.9%, 95.0%, 95.1%, 95.2%, 95.3%, 95.4%, 95.5%, 95.6%, 95.7%, 95.8%, 95.9%, 96.0%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97.0%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.5%, 97.6%, 97.7%, 97.8%, 97.9%, 98.0%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%.99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%이다.
4. 박테리아 균주의 기능적 특징
장 장벽 조절 장애는 전신 염증을 유발하는 원형 기능이다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 박테리아 균주 및 상기 균주를 포함하는 조성물은 장 장벽 기능을 향상시키는 데 효과적이다.
개체에서 전신 염증을 유발하는 장 장벽 조절 장애에 의해 매개되는 모든 염증성 또는 자가면역 장애는 상기 및/또는 본원의 다른 곳에서 기술된 박테리아 균주를 이용한 치료에 적용 가능하다.
4.1 장 장벽 기능
장 장벽(gut barrier, intestinal barrier로도 알려짐) 기능은 외부 세계와의 점막 경계면에서 수송 및 숙주 방어 메커니즘을 조절한다. 세포간 및 세포주위 플럭스는 막 펌프, 이온 채널 및 밀착 접합에 의해 엄격하게 제어되어 투과성을 생리학적 요구에 맞게 조정한다. 모든 수준의 교란, 특히 침투성 증가로 인한 박테리아 전좌와 손상된 상피 및 T 세포 상호작용으로 인한 구강 내성 붕괴로 인해 염증 및 조직 손상이 발생할 수 있다.
지질다당류(LPS) 및 기타 염증성 화합물과 같은 외부(즉, 비숙주) 물질이 장의 내강 측면에서 순환계로 이동하는 것은 상피 장벽에 의해 억제된다. 이 상피 장벽의 기능 중 하나는 밀착 접합에 의해 수행된다. 밀착연접부 또는 폐쇄연대(zonula occludens)는 막이 서로 결합하여 체액에 대한 사실상 불침투성 장벽을 형성함으로써 소화관의 내강에서 혈관계를 분리하는 두 개의 상피 세포가 밀접하게 연관된 영역이다. 따라서, 밀착 접합 장벽 기능의 감소는 LPS와 같은 바람직하지 않은 물질의 장 내강에서 순환계로의 전위를 증가시키는 결과를 가져오는 것으로 입증되었다.
본 발명은 개체의 장 장벽 기능을 회복 또는 개선시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 개체에 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis)의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 투여하여 개체의 장 장벽 기능을 회복 또는 개선시키는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 장 장벽 완전성은 장 장벽 기능의 척도를 의미한다. 높은 장 장벽 완전성은 장 또는 장 투과성의 부족과 연관될 수 있으며, 여기서 높은 수준의 장 투과성은 낮은 장 장벽 완전성을 나타낸다. 관련된 실시양태에서, 본 발명은 또한 건강하거나 정상적인 장 장벽 기능을 유지하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 장 장벽 조절 장애의 위험이 높은 것으로 간주되는 개체(예를 들어, IBD가 완화된 개체)인 장 장벽 조절 장애를 예방하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시료(및 특히 생물학적 시료)에서 측정된 적어도 하나의 바이오마커는 대상의 장 장벽 완전성의 변화, 특히 개선을 평가하기 위해 사용된다.
본 명세서에 제공된 방법 및 용도의 일부 실시양태에서, M. 파에시스의 박테리아성 균주를 포함하는 조성물은 대상체로부터의 샘플에서 장 장벽 완전성의 하나 이상의 바이오마커의 수준을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 바이오마커에 따라, 마커 수준의 증가 또는 감소는 장 장벽 완전성 증가 및/또는 장 투과성 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 혈관신생 인자, 효소, 프로테아제, 부착 분자, 세포 신호 전달 분자, 호르몬 또는 당으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 사이토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 케모카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 성장 인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 혈관신생 인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 접착 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 세포 신호전달 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 호르몬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 당을 포함한다.
본 명세서는 장 투과성의 바이오마커에 대한 분석을 제공한다. 혈액(혈장 또는 혈청)또는 조직과 같은 피험자로부터의 생물학적 샘플은 LPS, 유도다당류 검출(LPSBP), 장내 신호 검출(IFABP), 조눌린, 박테리아 및/또는 16S rRNA 중 하나 이상을 포함하는 임의의 적합한 바이오마커의 수준을 측정하는 데 사용될 수 있지만 이들 마커에 제한되지는 않는다. LPS, I-FABP 및 조눌린은 효소 결합 면역흡착 분석("ELISA")에 의해 측정될 수 있다. ELISA를 위한 기술 및 키트는 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 혈액, 혈청, 타액, 소변 및/또는 혈장의 대조군과 비교할 때 LPS, I-FABP 및/또는 조눌린의 증가는 장 투과성 증가의 지표로 사용되며 이에 따라 장 장벽 완전성이 낮아진다.
LPSBP는 또한 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대조군과 비교할 때 더 높거나 더 낮은 LPSBP의 유의한 변화는 증가된 장 투과성의 지표로서 사용될 수 있고 감소된 장 장벽 완전성을 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 박테리아 16S rRNA의 증가는 장 투과성 증가, 따라서 장 장벽 완전성 감소의 지표로 사용된다. 박테리아 16S rRNA는 표준 핵산 분리 프로토콜을 사용하여 혈액, 혈청, 장기 조직 또는 소변에서 정제될 수 있다. 이는 예를 들어 상업적으로 이용 가능하다. 단리된 핵산은 박테리아 16S rRNA 서열에 특이적인 프라이머를 사용한 qPCR 증폭 또는 박테리아 16S rRNA에 특이적인 프라이머를 사용한 증폭 및 생성된 앰플리콘의 서열분석에 의해 검출될 수 있다.
장 상피 세포에 의해 발현되고 장 투과성을 조절하는 밀착연접 단백질도 장 투과성의 바이오마커로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 장 투과성 및 장 장벽 완전성의 변경을 결정하기 위해 밀착 접합 단백질을 분석한다. 일부 실시양태에서, 측정된 단백질은 클라우딘, 오클루딘, ZO-1 및 E-카데린(부착 접합) 단백질을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다른 밀착연접 단백질도 분석할 수 있다. 일부 실시양태에서, 밀착연접 단백질은 면역조직화학적 염색을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 밀착연접 단백질은 ELISA를 사용하여 측정된다.
일부 실시양태에서, 장 투과성 및 장 장벽 완전성의 변경을 결정하기 위해 혈장 시트룰린을 분석한다. 혈장 시트룰린 수준의 감소는 장 장벽 투과성의 증가를 나타내는 상피 세포 질량의 손실에 해당한다.
일부 실시양태에서,상기 방법에는 수크랄로스와 같은 불용성 당의 경구 투여, 하나 이상의 정의된 기간 후 소변이나 혈액과 같은 체액 수집, 표준 임상 분석 기술을 통해 체액에 포함된 불용성 당의 측정이 포함된다. 불용성 당에는 만니톨, 락툴로스, 수크로스, 수크랄로스 및 이들의 조합이 포함될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 장 장벽 완전성은 시험관내 분석을 사용하여 측정된다. 장 장벽 기능을 측정하는 데 적합한 특히 바람직한 시험관내 분석은 경상피 전기 저항(TEER)에 의한 것이다. 이러한 분석법은 해당 분야에 잘 알려져 있다(예: Srinivasan, 2015; 및 Lea, 2015).
4.2 점막 치유
점막 치유는 염증성 및 자가면역 질환의 치료 효과를 평가하는 중요한 종점이 되었다. 현재 IBD(예: CD 및 UC) 임상 시험에서 사용되는 완전 점막 치유의 정의는 "모든 염증성 및 궤양성 병변이 완전히 없음"이지만, 이 정의에는 검증이 부족하고 점막 개선 및 점막 치유 등급이 포함되지 않는다.
점막 치유는 주로 장 염증의 내시경 평가에 의해 정의된다. 내시경 검사 시 점막 치유 여부를 평가하기 위해 다양한 내시경 채점 시스템이 개발되었다. 이러한 지표를 사용하면 점막 치유의 다소 확실한 종료점 및 그에 따른 모든 점막 궤양의 완전한 소멸이 충족되지 않는 경우에도 내시경 병변의 개선 여부를 결정할 수 있다. 1987년에 도입된 임상 Mayo 스코어의 내시경 구성 요소는 현재 임상 실습에서 가장 많이 사용되는 점막층 스코어이다(Schroeder et al., 1987 참조). 여기에는 홍반, 혈관 패턴의 상실, 취약성, 출혈, 미란 및 궤양 변수가 포함되며 범위는 0~3이다. MH는 일반적으로 0(정상 점막) 또는 1(점막 홍반, 혈관 패턴 감소, 경미한 부서짐)의 점수로 간주된다(D'Haens, 2007).
일부 다른 실시양태에서, 환자가 굴곡성 구불창자경 검사에 의해 평가된 내시경 하위 점수가 0 또는 1인 것으로 결정될 때 점막 치유가 발생한 것으로 결정된다. 그러한 특정 실시양태에서, 점막 치유를 경험한 환자는 내시경 하위 점수가 0인 것으로 결정된다.
코르티코스테로이드와 아미노살리실레이트는 모두 수십 년 동안 사용되어 왔으며 점액층을 복구하기 위해(예: UC 환자에서) 가장 일반적으로 처방되는 약물 중 하나이다(Carvalho and Cotter, 2017). 점막 염증을 감소시키는 메커니즘에는 핵 인자(NF)-kB 발현 및 염증성 사이토카인(세포 이동 및 상피 세포주의 증식을 직접 조절함) 제어가 포함된다. 항-TNF 약물(예: infliximab, adalimumab 및 golimumuab)은 점막 손상의 여러 단계에서 작용하여 고유판 내에서 염증성 침윤 및 T 세포 증식을 제한하고(Baert, 1999) 금속단백분해효소 및 전염증성 분자의 발현을 하향 조절한다(Baert, 1999). 그들은 또한 재생 과정에 작용하여 장 투과성과 점막 분비를 강화하고 섬유아세포를 활성화하며 상피 재생을 유지함으로써 점막의 보호 능력을 회복시킨다(Suenaert, 2002).
점막 치유를 평가하는 다른 측정법은 바이오마커 C-반응성 단백질 및 칼프로텍틴의 측정을 포함하여 당업계에 잘 알려져 있다. 점막 치유 평가를 위해 시험관 내 바이오마커 분석법을 사용하는 이점은 이러한 분석법이 일반적으로 피험자에게 훨씬 덜 침습적이라는 것이다. 조직병리학은 염증의 또 다른 척도이며, 이는 점막 치유에 특히 유익한 것으로 인용되어 왔다.
4.3 STAT3 신호전달 경로
사이토카인 경로는 염증 및 면역의 여러 측면을 포함하여 광범위한 생물학적 기능을 매개한다. JAK1, JAK2, JAK3 및 티로신 키나제 2(TYK2)를 포함한 야누스 키나제(JAK)는 유형 I 및 유형 II 사이토카인 수용체와 결합하고 사이토카인 신호 전달을 조절하는 세포질 티로신 키나제이다. 동족 수용체와의 사이토카인 결합은 수용체 관련 JAK의 활성화를 유발하고 이는 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT) 단백질의 JAK 매개 티로신 인산화를 유도하고 궁극적으로 특정 유전자 세트의 전사 활성화를 유도한다(Schindler et al., 2007, J. Biol. Chem. 282: 20059-63). 사이토카인 수용체는 일반적으로 이종이량체로 기능하며, 그 결과 한 가지 유형 이상의 JAK 키나제가 일반적으로 사이토카인 수용체 복합체와 연관된다. 다양한 사이토카인 수용체 복합체와 관련된 특정 JAK는 많은 경우 유전 연구를 통해 결정되었으며 다른 실험적 증거에 의해 확증되었다.
STAT3은 IBD를 포함한 여러 자가면역 및 염증성 장애의 활성화에 중요한 역할을 한다. 본 발명의 박테리아성 균주는 IL-23 매개 STAT3 활성화를 유의하게 억제한다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 STAT3 신호전달(즉, IL-23 매개 STAT3 신호전달)을 억제하거나 달리 억제하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 및/또는 본원의 다른 곳에 기술된 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 박테리아성 균주는 STAT3 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제한다. 일부 실시양태에서, M. 파에시스 균주는 STAT3 폴리펩티드에 직접 결합하는 생활성 분자를 생산한다. 일부 대안적 실시양태에서, 박테리아 균주는 예를 들어 IL-23 매개 STAT3 신호전달 경로에서 STAT3의 상류 분자에 결합하거나 STAT3 활성을 조절하는 분자에 결합함으로써 STAT3 활성화의 간접적인 억제제이다(예: 유비퀴틴화). 예시적인 예로서, 생물활성제는 IL-23 매개 STAT3 신호전달 경로를 억제하기 위해 IL 23, JAK2 또는 TYK2 중 어느 하나에 직접 결합하거나 길항할 수 있다.
4.4 Th17 염증 반응
본 발명의 일부 박테리아 조성물은 Th17 염증 반응을 감소시키는데 효과적이다. 특히, 상기 및 본원의 다른 곳에 기술된 조성물을 사용한 치료는 Th17 경로 사이토카인(TNF, IL-22, IL-21 및 IL-17 포함)을 조절할 수 있으며, Th17 경로에 의해 매개되는 상태의 동물 모델에서 임상적 개선을 가져올 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 염증성 및 자가면역 장애, 일부 실시양태에서는 Th17에 의해 매개되는 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 데 유용할 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 Th17 염증 반응의 상승을 감소 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
Th17 세포는 다른 사이토카인 중에서 IL 17A, IL 17F, IL-21 및 IL-22를 생산하는 T 보조 세포의 하위 집합이다. Th17 세포 분화는 IL 23에 의해 유도될 수 있다. 이들 사이토카인 및 기타 물질은 Th17 경로의 중요한 부분을 형성한다. Th17 경로는 다수의 염증성 및 자가면역 질환에 기여하고 기초가 되는 잘 확립된 염증 신호 전달 경로이다(예를 들어 Ye, 2015; Fabro, 2015; Yin, 2014; Cheluvappa, 2014; Schieck, 2014; Balato, 2014에 설명되어 있음). Th17에 의해 매개되는 일부 질병은 Th17 경로를 억제함으로써 개선되거나 완화될 수 있으며, 이는 Th17 세포의 분화 감소, 활성 감소 또는 Th17 경로 사이토카인 수준의 감소를 통해 이루어질 수 있다. Th17 경로에 의해 매개되는 질병은 IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26, IL-9와 같은 Th17 세포에 의해 생성된 사이토카인의 수준 증가를 특징으로 할 수 있다(Monteleone, 2011에서 리뷰됨). Th17 경로에 의해 매개되는 질병은 STAT3 또는 IL-23 수용체와 같은 Th17 관련 유전자의 발현 증가를 특징으로 할 수 있다. Th17 경로에 의해 매개되는 질병은 Th17 세포 수준의 증가와 연관될 수 있다.
IL-17은 T 세포 활성화를 호중구 활성화 및 동원에 연결하는 핵심 사이토카인이므로, IL-17은 선천 면역에서 중추적인 역할을 한다. 그러나 호중구 활성화에서의 역할로 인해 염증성 장 질환, 건선 및 류마티스 관절염과 같은 염증성 자가면역 질환에 기여할 수 있다. 본 명세서에 사용된 IL-17은 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F를 포함하는 IL-17 패밀리의 임의의 구성원을 의미할 수 있다. IL-17 매개 질환 및 질환은 IL-17의 높은 발현 및/또는 질환 또는 질환에 의해 영향을 받는 조직 내 IL-17 양성 세포의 축적 또는 존재를 특징으로 한다. 마찬가지로, IL-17 매개 질환 및 상태는 높은 IL-17 수준 또는 IL-17 수준의 증가에 의해 악화되고, 낮은 IL-17 수준 또는 IL-17 수준의 감소에 의해 완화되는 질환 및 상태이다. IL-17 염증 반응은 국소적이거나 전신적일 수 있다.
Th17 경로에 의해 매개될 수 있는 질병 및 상태의 예에는 염증성 장 질환(예: 크론병 및 궤양성 대장염); 다발성 경화증; 관절염(예: 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 및 청소년 특발성 관절염); 시신경척수염(데빅병); 강직성 척추염; 척추관절염; 건선; 전신홍반루푸스; 체강 질병; 천식(알레르기성 천식 또는 호중구성 천식 등); 만성 폐쇄성 폐질환(COPD); 암(유방암, 결장암, 폐암 또는 난소암 등); 포도막염; 공막염; 혈관염; 베체트병; 죽상경화증; 아토피성 피부염; 기종; 치주염; 알레르기 성 비염; 및 동종 이식 거부가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 일부 측면에서 본 발명은 상기 및/또는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 조성물을 투여함으로써 이들 상태 또는 질병 중 하나 이상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 이들 상태 또는 질환은 STAT3 신호전달 경로에 의해 매개된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 이들 상태 또는 질환은 Th17 경로를 통해 매개된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 Th17 경로에 의해 매개되는 질환 또는 상태의 치료 또는 예방에서 Th17 세포 분화를 감소시키는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 염증성 또는 자가면역 장애를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것이며, 여기서 상기 치료 또는 예방은 Th17 염증 반응의 상승을 감소 또는 예방함으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 염증성 또는 자가면역 장애가 있는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 것이며, 여기서 환자는 IL-17 수준이 상승했거나 Th17 세포가 상승했거나 Th17 염증 반응을 나타내고 있다. 특정 실시양태에서, 환자는 만성 염증성 또는 자가면역 장애 또는 상태로 진단되었을 수 있거나, 본 발명의 조성물은 만성 염증성 또는 자가면역 장애 또는 상태로 발전하는 염증성 또는 자가면역 장애 또는 상태를 예방하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 TNF 억제제를 사용한 치료에 반응하지 않을 수 있다. 본 발명의 이러한 용도는 이전 단락에 나열된 임의의 특정 질병 또는 상태에 적용될 수 있다.
상기 Th17 경로는 종종 만성 염증성 및 자가면역 장애와 연관되므로, 본 발명의 조성물은 위에 나열된 만성 질환 또는 상태를 치료하거나 예방하는 데 특히 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 만성 질환 환자에게 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 만성 질환의 발병을 예방하는데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 Th17 경로에 의해 매개되는 질환 및 상태를 치료하고 Th17 염증 반응을 해결하는 데 유용할 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 만성 질환을 치료 또는 예방하고, 다른 치료법(TNF 억제제 치료 등)에 반응하지 않은 환자의 질병을 치료 또는 예방하고/하거나 Th17 세포와 관련된 조직 손상 및 증상을 치료 또는 예방하는 데 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, IL-17은 연골 및 뼈 조직에서 기질 파괴를 활성화하는 것으로 알려져 있고, IL-17은 연골 세포 및 조골세포에서 기질 생성에 대한 억제 효과를 가지므로, 본 발명의 조성물은 뼈 침식 또는 연골 손상을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물을 사용한 치료는 IL-17 수준, 특히 IL-17A 수준의 감소 또는 상승을 예방한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물을 사용한 치료는 IFN-γ 또는 IL-6 수준의 감소를 제공하거나 상승을 예방한다. 이러한 사이토카인의 상승된 수준을 감소시키거나 예방하는 것은 염증성 및 자가면역 장애 및 상태, 특히 Th17 경로에 의해 매개되는 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
4.5 Th1 염증 반응
CD4+ T 세포는 염증성 질환/장애 발병에서 중요한 역할을 하며, CD4+ T 세포의 많은 부분집합이 만성 장 염증을 지속시키는 동인으로 확인되었다(Imam et al., 2018 참조). 예를 들어, T 헬퍼 1형(Th1) 세포는 IBD 환자의 장관에 축적되며 질병과 직접적으로 연관되어 있다. 인터페론-γ(IFN-γ)는 Th1 세포에 의해 생성되는 정의 사이토카인이다. 장 염증 동안 TNF와 결합된 IFN-γ는 장 상피 세포 β-카테닌 신호 전달을 유도하고 이들의 분화와 증식을 제한하는 것으로 제안되었다(Imam et al., 2018).
5. 치료방법
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 상기 및/또는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 박테리아성 균주를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 염증성 또는 자가면역 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
적합하게는, 상기 염증성 장 질환(크론병 또는 궤양성 대장염 등); 천식(알레르기성 천식 또는 호중구성 천식 등); 관절염(류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 또는 청소년 특발성 관절염 등); 지방간 질환(비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 등); 강직성 척추염; 건선; 전신홍반루푸스(SLE); 경피증; 쇼그렌 증후군; 혈관염; 제1형 당뇨병을 포함하는 군으로부터 선택된다.
5.1 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Disease; IBD)
본 발명의 실시예는 본 발명의 조성물이 장 장벽 기능에 유익한 회복 효과를 가지며 항염증 특성도 갖고 따라서 IBD 치료에 유용할 수 있음을 입증한다. 따라서, 일부 실시양태에서 본 발명은 염증성 장질환을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아성 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 메디테라네이박터 균주를 사용한 치료가 마우스 질병 모델에서 대장염의 중증도를 감소시킨다는 것을 확인했다. 따라서, 본 발명의 조성물은 염증성 질환의 치료에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 IBD의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 궤양성 대장염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 크론병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 IBD의 치료, 특히 대장염 및 궤양성 대장염의 치료에서 궤양화 및/또는 출혈을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 대상에서 IBD를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 종의 박테리아성 균주를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 개체에 메디테라네이박터 파에시스 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 대장염(특히 궤양성 대장염)을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 궤양화 및/또는 출혈을 포함하는 대장염(특히 궤양성 대장염)의 적어도 하나의 부작용을 감소시키는 방법을 제공한다.
IBD는 다양한 환경적 요인과 유전적 요인에 의해 발생할 수 있는 복잡한 질병이다. IBD 발병에 기여하는 요인으로는 식이, 미생물군, 장 투과성, 장 감염에 대한 염증 반응 증가에 대한 유전적 민감성 등이 있다. 염증성 장질환의 증상으로는 복통, 구토, 설사, 직장 출혈, 골반 부위의 심한 내부 경련/근육 경련, 체중 감소 및 빈혈이 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 IBD와 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키는데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IBD의 하나 이상의 증상을 예방하는데 사용하기 위한 것이다.
IBD는 심혈관 질환, 신경심리학적 장애 및 대사 증후군과 같은 다른 질환 또는 상태를 동반할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IBD를 수반하는 하나 이상의 질병 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
IBD는 일반적으로 생검이나 대장내시경검사로 진단된다. 대변 칼프로텍틴의 측정은 IBD의 예비 진단에 유용하다. IBD 진단을 위한 다른 검사실 검사에는 전체 혈구수, 적혈구 침강 속도, 종합 대사 패널, 대변 잠혈 검사 또는 C 반응성 단백질 검사가 포함된다. 일반적으로 IBD 진단을 확인하기 위해 실험실 검사와 생검/대장내시경 검사를 함께 사용한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 IBD로 진단된 대상체에서 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서 상기 IBD는 크론병 및/또는 궤양성 대장염이다. 위에서 광범위하게 설명한 바와 같이, 연구에 따르면 STAT3 신호 전달 및 NFκB 신호 전달 경로 매개 사이토카인(예: IL-17, TNF, IL-21, IL-22)을 포함하되 이에 국한되지 않는 여러 염증성 사이토카인이 크론병 및 궤양성 대장염 환자의 염증성 점막에서 상향조절되는 것으로 나타났다. 따라서 STAT3 신호전달 경로 매개 사이토카인 활성 및/또는 NFκB 신호전달 경로 매개 사이토카인의 억제는 크론병 및 궤양성 대장염 치료에 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 크론병 및/또는 궤양성 대장염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
크론병 및 궤양성 대장염은 유전적 위험 요인, 식이, 흡연 및 음주와 같은 기타 생활 방식 요인 및 미생물군집 구성을 포함하는 일련의 가능한 원인을 갖는 복잡한 질병이다. 크론병은 위장관 어디에서나 나타날 수 있는 반면, 궤양성 대장염은 일반적으로 대장과 결장에 많이 나타난다.
IBD의 위장관 증상은 경증부터 중증까지 다양하며 복통, 설사, 대변혈, 회장염, 배변 증가, 고창 증가, 장 협착증, 구토 및 항문 주위 불편함을 포함한다. 본 발명의 조성물은 크론병 및/또는 궤양성 대장염의 하나 이상의 위장 증상을 예방하는 치료에 사용될 수 있다.
크론병 및 궤양성 대장염의 전신 증상에는 사춘기 동안 성장을 유지할 수 없는 것과 같은 성장 결함, 식욕 감소, 발열 및 체중 감소가 포함된다. 크론병의 장외(extra-intestinal) 특징으로는 포도막염, 광증, 상공막염, 담석, 혈청음성 척추관절병증, 관절염, 골부착염, 결절성 홍반, 괴저성 농피증, 심부 정맥 혈전증, 폐색전증, 자가면역 용혈성 빈혈, 곤봉 및 골다공증이 있다. 장외 특징은 위장관 외부에서 나타나는 크론병 및/또는 궤양성 대장염과 관련된 추가 상태이다. 크론병 환자는 또한 발작, 뇌졸중, 근육병증, 말초 신경병증, 두통 및 우울증과 같은 신경학적 합병증에 대한 감수성이 증가한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 크론병 및/또는 궤양성 대장염의 하나 이상의 전신 증상의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 크론병 및/또는 궤양성 대장염의 하나 이상의 장외 특징의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
크론병 및 궤양성 대장염의 진단에는 일반적으로 위내시경 및/또는 대장내시경 및 일반적으로 회장의 생검, 방사선 검사, 전체 혈구 수치, C-반응성 단백질 검사 및 적혈구 침강 속도와 같은 다양한 검사 및 수술 절차를 수행하는 단계가 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 크론병 또는 궤양성 대장염으로 진단된 대상체에서 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 크론병 또는 궤양성 대장염으로 진단된 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
크론병 및 궤양성 대장염은 프레드니손과 같은 코르티코스테로이드, 아자티오프린과 같은 면역억제제, 또는 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 베돌리주맙 및 에트롤리주맙과 같은 생물학적 제제와 같은 다수의 치료제로 치료될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 위에 나열된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가 치료제와 조합하여 크론병 또는 궤양성 대장염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 추가 치료제는 크론병 및/또는 궤양성 대장염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
5.2 자가면역질환
인간의 경우, 장 염증의 징후는 제1형 당뇨병(type 1 diabetes; T1D)과 같은 많은 자가면역 질환의 임상적 발병 전에 검출 가능하다(Bosi, 2006). 유사하게, 당뇨병 저항성 쥐와 비교하여 당뇨병에 걸리기 쉬운 쥐에서 췌도염이 발생하기 전에 증가된 장 투과성이 나타난다(Meddings, 1999; Neu, 2005). 이러한 연구 결과는 후속 항원 밀매 증가 및 저등급 장 염증 발생으로 인한 장 장벽 완전성 파괴가 제1형 당뇨병 발병에 앞서 발생하며 당뇨병으로 인한 대사 변화(즉, 고혈당증)에 이차적이기보다는 병인과 직접적으로 관련되어 있음을 나타낸다. 위장 장벽은 내강 내용물과 인체 사이의 접촉을 방지하는 기본적인 문지기이다. 장벽은 점액층과 장상피 장벽(intestinal epithelial barrier; IEB)으로 구성되며, 둘 다 공생 박테리아, 병원균 및 식품 항원이 내강에서 장 조직 및 전신 순환으로 이동하는 것을 방지하는 데 중요하다. IEB는 밀착(tight) 접합 접착 분자(junctional adhesion molecules; JAM), 트리셀룰린 및 앙굴린으로 구성된 복잡한 접합 시스템에 의해 함께 유지되는 단일 층의 상피 세포이며, 그 자체와 세포내 스캐폴딩 단백질, 즉 조눌라 폐색 단백질(ZO)과의 상호 작용은 단단한 접합 무결성을 유지하는 데 필수적이다. T1D의 환자 및 쥐 모델에서 IEB의 변형이 장 염증과 연관되어 보고되었다(Meddings, 1999; Sapone, 2006). 더욱이, 항균 펩타이드 및 뮤신과 같은 면역조절 분자를 포함하는 중요한 장 장벽인 장 점액층의 중요성이 최근 보고되었다(Sorini et al., 2019 참조).
일부 실시양태에서, 메디테라네이박터 파에시스 종으로부터의 박테리아 균주는 알레르기성 천식 또는 호중구성 천식과 같은 천식의 치료 또는 예방에 치료적 이점을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 개체의 천식 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 천식의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 메디테라네이박터 파에시스 종의 박테리아성 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, M. 파에시스 종으로부터의 박테리아 균주는 GVHD의 치료 또는 예방에 치료적 이점을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 GVHD의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 GVHD의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 M. 파에시스 종의 박테리아성 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, M. 파에시스 종으로부터의 박테리아 균주는 관절염, 예컨대 류마티스 관절염, 골관절염, 건선 관절염 또는 연소성 특발성 관절염의 치료 또는 예방에 치료적 이점을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 개체의 관절염 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 관절염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 M. 파에시스 종의 박테리아성 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, M. 파에시스 종으로부터의 박테리아 균주는 다발성 경화증의 치료 또는 예방에 치료적 이점을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 개체의 다발성 경화증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 다발성 경화증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 M. 파에시스 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, M. 파에시스 종으로부터의 박테리아 균주는 건선의 치료 또는 예방에 치료적 이점을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 개체의 건선의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 M. 파에시스 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물 또는 건선의 치료 또는 예방에서의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, M. 파에시스 종으로부터의 박테리아 균주는 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus; SLE)의 치료 또는 예방에 치료적 이점을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 SLE의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 SLE의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 M. 파에시스 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, M. 파에시스 종으로부터의 박테리아성 균주는 동종이식 거부반응의 치료 또는 예방에 치료적 이점을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 개체의 동종이식 거부반응의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 동종이식 거부반응의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 M. 파에시스 종의 박테리아성 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
6. 제형
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 40개 미만의 상이한 박테리아 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 30종 미만의 상이한 박테리아 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 20종 미만의 상이한 박테리아 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 10개 미만의 상이한 박테리아 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 5개 미만의 상이한 박테리아 균주를 포함한다. 일부 바람직한 일부 실시양태에서, 조성물은 3개 미만의 상이한 박테리아 균주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 클로스티디움(Clostidium) 속의 박테리아를 포함하지 않는다.
본 발명의 조성물은 박테리아(즉, 살아있는 박테리아 및/또는 죽은 박테리아)를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 조성물은 동결건조 형태로 제제화된다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 박테리아 균주를 포함하는 과립 또는 젤라틴 캡슐, 예를 들어 경질 젤라틴 캡슐을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 동결건조된 박테리아를 포함한다. 박테리아의 동결건조는 잘 정립된 절차이며 관련 지침은 예를 들어 참고문헌에서 확인할 수 있다(Miyamoto-Shinohara, 2008; Day & Stacey, 2007).
본 발명의 조성물은 살아있는 활성 박테리아 배양물을 포함할 수 있다. 실시예는 본 발명의 박테리아 배양물이 치료적으로 효과적이라는 것을 입증한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아 균주는 불활성화되지 않았으며, 예를 들어 열 불활성화되지 않았다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아성 균주는 사멸되지 않았으며, 예를 들어 열 사멸되지 않았다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아성 균주는 약독화되지 않았으며, 예를 들어 열로 약독화되지 않았다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아성 균주는 사멸, 불활성화 및/또는 약독화되지 않았다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아 균주는 살아 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 내 박테리아성 균주는 생존 가능하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아 균주는 장에 부분적으로 또는 전체적으로 군집화할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아 균주는 생존 가능하고 부분적으로 또는 전체적으로 장에 군집화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 살아있는 박테리아 균주와 사멸된 박테리아 균주의 혼합물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 박테리아 균주를 장으로 전달할 수 있도록 캡슐화된다. 캡슐화는 예를 들어 pH 변화에 의해 유발될 수 있는 압력, 효소 활성 또는 물리적 분해와 같은 화학적 또는 물리적 자극으로 인한 파열을 통해 표적 위치에 전달될 때까지 조성물이 분해되는 것을 방지한다. 적절한 캡슐화 방법을 사용할 수 있다. 예시적인 캡슐화 기술에는 다공성 매트릭스 내 포획, 고체 담체 표면에서의 부착 또는 흡착, 응집 또는 가교제에 의한 자가 응집, 미세다공성 막 또는 마이크로캡슐 뒤의 기계적 봉쇄가 포함된다. 본 발명의 조성물을 제조하는 데 유용할 수 있는 캡슐화에 대한 지침은 해당 분야에서 널리 이용 가능하다(예를 들어, Mitropoulou, 2013; 및 Kailasapathy, 2002).
조성물은 경구 투여될 수 있고 정제, 캡슐 또는 분말 형태일 수 있다. 메디테라네이박테리아 속의 박테리아는 절대혐기성균이기 때문에 캡슐화된 제품이 선호된다.
본 발명의 조성물은 치료 유효량의 본 발명의 박테리아 균주를 포함한다. 치료학적 유효량의 박테리아 균주는 환자에게 유익한 효과를 발휘하기에 충분하다. 치료학적 유효량의 박테리아 균주는 환자의 장으로의 전달 및/또는 부분적 또는 전체적 콜로니화를 초래하기에 충분할 수 있다.
예를 들어 성인 인간의 경우 박테리아의 적합한 일일 복용량은 약 1 x 103내지 약 1 x 1011집락 형성 단위(CFU)일 수 있으며; 예를 들어, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 106 내지 약 1 x 1010 CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1011 CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 108에서 약 1 x 1011 CFU일 수 있다.
특정 실시양태에서, 박테리아의 용량은 하루에 적어도 109개 세포, 예를 들어 하루에 적어도 1010개, 적어도 1011개, 또는 적어도 1012개 세포이다.
특정 실시양태에서, 조성물의 용량은 조성물의 중량을 기준으로 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 콜로니 형성 단위(CFU)/g의 양으로 박테리아 균주를 포함할 수 있다. 복용량은 성인에게 적합할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 약 1 x 103내지 약 1 x 1011CFU/g; 예를 들어, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU/g; 또 다른 예에서는 약 1 x 106 내지 약 1 x 1010 CFU/g; 또 다른 예에서는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1011 CFU/g; 또 다른 예에서는 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU/g; 다른 예에서는 약 1 x 108 내지 약 1 x 1011 CFU/g, 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU/g이다. 예를 들어 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU/g이다. 투여량은 예를 들어 1g, 3g, 5g, 10g일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 및/또는 본원의 다른 곳에 기술된 조성물은 조성물의 중량을 기준으로 그램당 약 1 x 103내지 약 1 x 1011콜로니 형성 단위의 양의 박테리아 균주를 포함하거나, 구성하거나, 본질적으로 구성한다.
일부 실시양태에서, 상기 및/또는 본원의 다른 곳에 기술된 조성물은 박테리아 균주를 500 mg 내지 1000 mg, 600 mg 내지 900 mg, 700 mg 내지 800 mg, 500 mg 내지 750 mg 또는 750 mg 내지 1000 mg의 용량으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 제약 조성물을 제공하며, 여기서 상기 제약 조성물 중 동결건조된 박테리아는 500mg 내지 1000mg, 600mg 내지 900mg, 700mg 내지 800mg, 500mg 내지 750mg, 또는 750mg 내지 1000mg의 용량으로 투여된다.
상기 조성물은 프로바이오틱으로서 제제화될 수 있다. FAO/WHO는 프로바이오틱스를 적절한 양으로 투여했을 때 숙주에게 건강상의 이점을 제공하는 살아있는 미생물로 정의한다.
일반적으로, 본 발명의 조성물과 같은 프로바이오틱은 임의로 적어도 하나의 적합한 프리바이오틱 화합물과 조합된다. 상기 프리바이오틱 화합물은 일반적으로 올리고당이나 다당류, 당 알코올과 같은 비소화성 탄수화물이며 상부 소화관에서 분해되거나 흡수되지 않는다. 알려진 프리바이오틱스에는 이눌린 및 트랜스갈락토리고당과 같은 상용 제품이 포함된다.
다른 프리바이오틱 화합물(예: 비타민 C)은 산소 제거제로서 포함될 수 있으며 생체 내 전달 및/또는 부분적 또는 전체 집락화 및 생존을 개선할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 우유 또는 유장 기반 발효 유제품과 같은 식품 또는 영양 제품으로, 또는 의약품으로 경구 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 전체 중량 조성물에 대해 약 1 내지 약 30중량%(예를 들어, 5 내지 20중량%)의 양으로 프리바이오틱 화합물을 포함한다. 알려진 프리바이오틱스에는 이눌린 및 트랜스갈락토리고당과 같은 상용 제품이 포함된다.
일부 실시양태에서, 상기 프리바이오틱은 프락토올리고당(fructooligosaccharides; FOS), 단쇄 프락토올리고당, 이눌린, 이소말톨올리고당, 펙틴, 자일로올리고당(xylooligosaccharides ; XOS), 키토사놀리고당(chitosanoligosaccharides ; COS), 베타-글루칸, 경작검 변형 및 저항성 전분, 폴리덱스트로스, D 타가토스, 아카시아 섬유, 캐롭, 귀리 및 감귤 섬유를 포함하거나 이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄수화물이다. 한 측면에서, 프리바이오틱스는 단쇄 프락토올리고당이다. 단쇄 FOS는 소화 가능한 탄수화물이 아니며 일반적으로 사탕무 설탕의 전환으로 얻어지며 세 개의 포도당 분자가 결합된 자당 분자를 포함한다.
본 발명의 조성물은 약학적 부형제 핸드북(Handbook of Pharmaceutical Excipients)에 기술된 것과 같은 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다. 치료 용도로 허용되는 담체 또는 희석제는 제약 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 레밍턴 제약 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences)에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예에는 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로오스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨, 소르비톨 등이 포함된다. 적합한 희석제의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물이 포함된다. 약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약학 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 약제학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 이에 더하여 하나 이상의 적합한 결합제, 윤활제, 현탁화제, 코팅제 및/또는 가용화제를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예에는 전분, 젤라틴, 포도당과 같은 천연 당, 무수 유당, 자유 유동 유당, β-락토스, 옥수수 감미료, 아카시아, 트라가칸트 또는 알긴산 나트륨과 같은 천연 및 합성 검, 카르복시메틸 셀룰로오스 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 적합한 윤활제의 예에는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨 등이 포함된다. 방부제, 안정제, 염료 및 심지어 향미제도 약학적 조성물에 제공될 수 있다. 보존제의 예에는 벤조산나트륨, 소르브산, 시스테인 및 4-히드록시벤조산의 에스테르가 포함된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 보존제는 벤조산나트륨, 소르브산 및 4-히드록시벤조산의 에스테르로부터 선택된다. 항산화제 및 현탁제도 사용될 수 있다. 적합한 담체의 추가 예는 자당이다. 적합한 보존제의 추가 예는 시스테인이다.
본 발명의 조성물은 식품으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 식품은 영양 보충제와 같이 본 발명의 치료 효과 외에 영양적 이점을 제공할 수 있다. 유사하게, 식품은 본 발명의 조성물의 맛을 향상시키거나 제약 조성물보다는 일반적인 식품과 더 유사하게 함으로써 조성물을 소비하기에 더 매력적으로 만들기 위해 제제화될 수 있다. 상기 우유 기반 제품은 우유, 산양유, 양유, 탈지유, 전유, 분유와 유청을 가공하지 않고 재결합한 우유, 또는 요구르트, 응고 우유, 두부, 신 우유, 신 우유, 버터 우유 및 기타 신(sour) 우유 제품과 같은 가공된 제품일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 우유 기반 제품으로 제제화된다. "우유 기반 제품"이라는 용어는 다양한 지방 함량을 갖는 액체 또는 반고체 우유 기반 또는 유장 기반 제품을 의미한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 메디테라네이박터 속의 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하고, 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나, 또 다른 종으로부터의 박테리아를 아주 미미하거나 생물학적으로 관련되지 않은 양으로만 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 다른 종으로부터의 박테리아를 최소한 또는 생물학적으로 관련되지 않은 양만을 포함하는 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는, 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 메디테라네이박터 속의 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하고, 임의의 다른 속의 박테리아를 함유하지 않거나, 다른 속의 박테리아를 최소한이거나 생물학적으로 관련되지 않은 양만을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 메디테라네이박터 속의 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하고, 임의의 다른 속으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나, 또 다른 속으로부터의 박테리아를 최소한이거나 생물학적으로 관련되지 않은 양만을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 단일 박테리아 종을 함유하고 임의의 다른 박테리아 종은 함유하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 단일 박테리아성 균주를 함유하고 임의의 다른 박테리아성 균주를 함유하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 M. 파에시스 균주의 박테리아만을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 다른 박테리아 균주 또는 종을 최소한으로 또는 생물학적으로 관련되지 않은 양으로만 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 다른 유기체 종이 실질적으로 없는 배양물일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 건조된 형태일 수 있으며 다른 유기체 종이 실질적으로 없을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 임의의 다른 균주로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 치료에 사용하기 위한 또 다른 균주로부터의 박테리아의 최소량 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함하는 메디테라네이박터 속의 단일 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 단일 박테리아성 균주 또는 종을 함유하고 임의의 다른 박테리아성 균주 또는 종은 함유하지 않는다. 이러한 조성물은 다른 박테리아 균주 또는 종을 최소한으로 또는 생물학적으로 관련되지 않은 양으로만 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 다른 유기체 종이 실질적으로 없는 배양물일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 박테리아 균주 또는 종으로 구성된다. 특정 구현예에서, 조성물은 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개의 박테리아 균주 또는 종으로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 동일한 종(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 45개 이상의 계통) 내에서 하나 이상의 균주를 포함하고, 선택적으로 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 동일한 종(예: 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 미만의 계통) 내의 50개 미만의 균주를 포함하고, 선택적으로 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 동일한 종 내로부터의 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25 또는 31-50개의 균주를 포함하고, 선택적으로 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 동일한 속(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 23, 25, 30, 35 또는 40종 이상)으로부터의 하나 초과의 종을 포함하고, 선택적으로 임의의 다른 속으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 동일한 속(예: 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3종 미만) 내의 50개 미만의 종을 포함하고, 선택적으로 임의의 다른 속의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 동일한 속에 속하는 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1- 2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25 또는 31-50개의 종을 포함하고, 선택적으로 임의의 다른 속의 박테리아를 함유하지 않는다. 본 발명은 전술한 것의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 박테리아 균주 또는 종을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 45개 이상의 계통) 내에서 하나 이상의 균주를 포함하고, 선택적으로 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종(예: 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 미만의 계통) 내에서 50개 미만의 균주를 포함하고, 선택적으로 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종 내의 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1 -3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25 또는 31- 50개 균주를 포함하고, 임의로 다른 종의 박테리아를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 속(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 23, 25, 30, 35 또는 40종 이상) 내의 하나 이상의 종을 포함하고, 임의로 다른 속(genus)의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 동일한 속(예: 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3종 미만)으로부터의 50종 미만을 포함하고, 선택적으로 임의의 다른 속으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 동일한 속으로부터의 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1 -2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25 또는 31-50개의 균주를 포함하고, 선택적으로 임의의 다른 속으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 본 발명은 전술한 것의 임의의 조합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 1-50개의 별개의 박테리아 균주, 예컨대 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1 -10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 또는 2개의 별개의 박테리아 균주를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1- 10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 또는 2개의 별개의 박테리아 균주, 예컨대 1-50개의 별개의 박테리아 균주를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 균주 V21/006223, V21/006224, V21/006225 또는 V21/006226 중 어느 하나와 동일한 안전성 및 치료 효능 특징을 갖는 박테리아 균주를 추가로 포함한다.
본 발명의 조성물이 하나 이상의 박테리아성 균주, 종 또는 속을 포함하는 일부 실시양태에서, 개별 박테리아성 균주, 종 또는 속은 개별, 동시 또는 순차적 투여를 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 하나 이상의 박테리아 균주, 종 또는 속을 모두 포함할 수 있거나, 박테리아 균주, 종 또는 속은 별도로 저장되어 별도로, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 니다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 박테리아 균주, 종 또는 속은 별도로 저장되지만 사용 전에 함께 혼합된다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 조성물은 본 발명의 박테리아 균주를 장으로 전달 및/또는 장의 부분적 또는 전체적 군집화를 가능하게 하기 위해 위장관(gastrointestinal ; GI)에 투여되어야 한다. 즉, 박테리아는 위장관의 일부 또는 전체에 군집을 형성할 수 있으며 이러한 군집화는 일시적이거나 영구적일 수 있다. 보다 구체적으로, "장의 전체 군집화"라는 문구는 박테리아가 장의 모든 부분(즉, 소장, 대장 및 직장)에 군집화되었음을 의미한다. 추가로 또는 대안적으로, "완전 집락화(total colonisation)"라는 용어는 박테리아가 장의 일부 또는 전체 부분에 영구적으로 접목되는 것을 의미한다.
유사하게, "장의 부분적 군집화"라는 문구는 박테리아가 장의 모든 부분이 아닌 일부에 군집화했음을 의미한다. 추가로 또는 대안적으로, "부분적 집락화(partial colonisation)"라는 용어는 박테리아가 장의 일부 또는 전체 부분에 일시적으로 생착(engraft)되는 것을 의미한다.
박테리아 생착의 일시적인 정도는 세척기간(washout period; 즉, 투여 간격의 결론과 존재하는 본 발명의 박테리아성 균주의 검출가능한 수준이 없는 사이의 기간)을 결정하기 위해 투여 간격이 끝난 후 주기적으로(예를 들어, 매일 또는 매주) 본 발명의 박테리아 균주의 풍부도를 평가(예를 들어, 대변 샘플에서)함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세척기간(washout period)은 14일 이하, 12일 이하, 10일 이하, 7일 이하, 4일 이하, 3일 이하, 2일 이하, 또는 1일 이하이다.
일부 실시양태에서, 상기 또는 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 박테리아는 일시적으로 대장에 생착(engraft)된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 박테리아 균주는 인간 성인 대변으로부터 획득된다. 본 발명의 조성물이 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 일부 실시양태에서, 모든 박테리아 균주는 인간 성인 대변으로부터 얻어지거나, 다른 박테리아 균주가 존재하는 경우에는 최소한의 양으로만 존재한다. 상기 박테리아는 이들 인간 성인 대변으로부터 얻어지고 본 발명의 조성물에 사용된 후에 배양되었을 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 메디테라네이박터 박테리아 균주는 본 발명의 조성물에서 유일한 치료 활성 제제이다. 일브 실시양태에서, 상기 조성물 중 박테리아 균주는 본 발명의 조성물 중 유일한 치료 활성 제제이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 시판 승인을 요구할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 박테리아 균주가 건조된 형태인 상기 약학 조성물을 제공한다. 어떤 경우에는 박테리아 균주가 투여 전에 재구성된다. 어떤 경우에는 상기 재구성운 여기에 설명된 희석제를 사용하여 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 박테리아 균주가 분무 건조된 상기 약학 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 박테리아 균주가 동결건조되거나 분무 건조되고 살아있는 상기 약학 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 박테리아 균주가 동결건조되거나 분무 건조되고 생존가능한 상기 약학 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 박테리아 균주가 동결건조되거나 분무 건조되고 장에 부분적으로 또는 전체적으로 군집화할 수 있는 상기 약학 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 박테리아 균주가 건조되고(예를 들어, 동결건조되거나 분무 건조됨), 생존 가능하며, 장에 부분적으로 또는 전체적으로 군집화할 수 있는 상기 약학 조성물을 제공한다. 일부 동일한 실시양태 및 일부 대안적인 실시양태에서, 상기 박테리아 균주는 일시적으로 장에 군집을 형성한다.
일부 경우에, 상기 동결건조되거나 분무 건조된 박테리아 균주는 투여 전에 재구성된다. 어떤 경우에는 재구성이 여기에 설명된 희석제를 사용하여 이루어진다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아성 균주; 및 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학조성물을 제공하며, 여기서 상기 박테리아 균주는 이를 필요로 하는 개체에 투여될 때 염증성 또는 자가면역 장애를 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 염증성 또는 자가면역 장애는 염증성 장 질환(예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염); 천식(알레르기성 천식 또는 호중구성 천식 등); 관절염(예: 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 또는 청소년 특발성 관절염); 지방간 질환(예: 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)); 강직성 척추염; 건선; 전신홍반루푸스(SLE); 경피증; 쇼그렌 증후군; 혈관염; 제1형 당뇨병을 포함하는 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 박테리아 균주의 양이 조성물의 중량을 기준으로 그램당 약 1 x 103내지 약 1 x 1011 콜로니 형성 단위(CFU)인 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 1g, 3g, 5g 또는 10g의 용량으로 투여되는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 경구, 직장, 피하, 비강, 협측 및 설하로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 투여되는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로오스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 담체를 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 에탄올, 글리세롤 및 물을 구성된 군으로부터 선택된 희석제를 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 전분, 젤라틴, 포도당, 무수 유당, 자유 유동 유당, 베타-유당, 옥수수 감미료, 아카시아, 트라가칸스, 알긴산나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨 및 염화나트륨으로 구성된 군으로부터 선택되는 부형제를 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 보존제, 항산화제 및 안정화제 중 하나 이상을 추가로 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 벤조산나트륨, 소르브산 및 4-히드록시벤조산의 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 보존제를 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 박테리아 균주가 건조된 형태(예를 들어, 동결건조, 분무 건조, 유동층 건조 등)인 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 조성물을 밀봉된 용기에 약 4℃ 또는 약 25℃에서 저장하고, 용기를 상대습도 50%의 조건에 보관하는 경우, 집락 형성 단위로 측정된 박테리아 균주의 80% 이상이 약 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 1.5년, 2년, 2.5년 또는 3년 이상의 기간 후에도 남아 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 조성물을 포함하는 밀봉된 용기에 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 밀봉된 용기는 봉지 또는 병이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 조성물을 포함하는 주사기로 제공된다.
본 발명의 조성물은 일부 실시양태에서 약학 제제로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 정제 또는 캡슐 형태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 캡슐은 젤라틴 캡슐("겔-캡")이다. 캡슐은 경질 또는 연질 캡슐일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 연질 캡슐이다. 연질 캡슐은 캡슐 껍질에 존재하는 연화제, 예를 들어 글리세롤, 소르비톨, 말티톨 및 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 특정 탄력성과 부드러움을 가질 수 있는 캡슐이다. 상기 연질 캡슐은 예를 들어 젤라틴이나 전분을 기반으로 생산될 수 있다. 상기 젤라틴 기반 연질 캡슐은 다양한 공급업체로부터 시판된다. 예를 들어 경구 또는 직장 투여와 같은 투여 방법에 따라 연질 캡슐은 다양한 모양을 가질 수 있으며, 예를 들어 원형, 타원형, 직사각형 또는 어뢰 모양일 수 있다. 상기 연질 캡슐은 예를 들어 Scherer 공정, Accogel 공정 또는 액적 또는 취입 공정과 같은 통상적인 공정에 의해 생산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 경구로 투여된다. 경구 투여에는 삼키는 과정이 포함될 수 있으므로 화합물이 위장관으로 들어간다.
경구 투여에 적합한 약학적 제제에는 고체 플러그, 고체 미립자, 반고체 및 액체(다중 상 또는 분산 시스템 포함), 예를 들어 정제; 다중 또는 나노 입자, 액체(예: 수용액), 에멀젼 또는 분말을 함유하는 연질 또는 경질 캡슐; 사탕(액체 충전 포함); 씹는다; 젤; 빠르게 분산되는 제형; 영화; 난자; 스프레이; 및 협측/점막 접착 패치 등이 있다.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 제제는 장용성 제제, 즉 경구 투여에 의해 장으로 본 발명의 조성물을 전달하는 데 적합한 위장 내성 제제(예를 들어 위 pH에 대한 내성)이다. 상기 장용성 제제는 박테리아 또는 조성물의 다른 성분이 산에 민감한 경우(예를 들어 위 조건에서 분해되기 쉬운 경우) 특히 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 장용성 제제는 장용성 코팅을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 장용 코팅된 투여 형태이다. 예를 들어, 상기 제제는 장용성 정제 또는 장용성 캡슐제 등일 수 있다. 장용 코팅은 통상적인 장용 코팅, 예를 들어 경구 전달을 위한 정제, 캡슐 등에 대한 통상적인 코팅일 수 있다. 상기 제제는 필름 코팅, 예를 들어 장용성 중합체(예를 들어, 산불용성 중합체)의 얇은 필름 층을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 장용성 제제는 본질적으로 장용성, 예를 들어 장용성 코팅이 필요 없는 위장 저항성이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 제제는 장용성 코팅을 포함하지 않는 장용성 제제이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 열겔화 물질로 제조된 캡슐이다. 일부 실시양태에서, 상기 열겔화 물질은 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC)와 같은 셀룰로오스 물질이다. 일부 실시예에서, 상기 캡슐은 어떠한 필름 형성 폴리머도 함유하지 않는 쉘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 캡슐은 쉘을 포함하고, 쉘은 하이드록시프로필메틸셀룰로오스를 포함하며 임의의 필름 형성 중합체를 포함하지 않는다(미국 특허 공개 번호 2016/0067188에 설명됨). 일부 구현예에서, 제형은 본질적으로 장용성 캡슐(예를 들어, Capsugel의 VCAPS®)이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 M. 파에시스의 박테리아 균주를 포함하는 프로바이오틱 또는 의료 식품이다. 상기 박테리아는 예를 들어 프로바이오틱스, 캡슐, 정제, 캐플릿, 알약, 트로키, 로젠지, 분말 및/또는 과립으로 투여될 수 있다. 이 균주는 기능 식품, 일반 식품, 의료 식품 또는 의약품으로 제형화될 수도 있다. 박테리아는 대변 이식의 일부로 또는 좌약을 통해 투여될 수도 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같이, 상기 조성물은 장으로의 전달을 위해 제제화되고, 일부 실시 형태에서는 상기 조성물은 프리바이오틱을 추가로 포함할 수 있다.
6.1 추가 제제와의 병용투여
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 (예를 들어 요법의 일부로서) 대상체에게 제2 작용제 및/또는 치료법을 공동 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 병용 요법은 사용되는 경우 특정 적응증에 맞게 조정된다. 예를 들어, M.파에시스 종의 균주가 염증성 장애(예: 염증성 장 질환)를 치료하기 위해 투여되는 경우, 이는 염증성 장애의 임상 치료를 위해 승인된 업계에 공지된 항염증제 또는 치료법과 함께 투여될 수 있다. 다른 적응증은 예를 들어, 해당 분야에 공지되어 있거나 해당 적응증의 임상 치료용으로 승인된 제제와 조합하여 본원에 기술된 M.파에시스 종의 균주를 사용하여 유사하게 치료될 수 있다.
염증성 장 질환의 치료에 사용될 수 있는 적합한 항염증제는 5-아미노살리큘레이트, 코르티코스테로이드, 아자티오프린, 인플릭시맙 및 아달리무맙을 포함하는 군을 포함하지만 반드시 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 항염증제를 추가로 포함하는 상기 기재된 바와 같은 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 선택적으로 단일 조성물, 또는 대안적으로 2개 이상의 별개의 조성물의 형태일 수 있다.
7. 스크리닝 방법
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 박테리아성 균주를 확인하는 방법을 포함한다. 이러한 방법에는 일반적으로 특정 기능적 활성을 갖는 박테리아 균주에 대한 스크리닝이 포함된다. 적합한 분석에는 아래 예에 설명된 분석이 포함되지만 장 장벽 기능, 점막 치유, NFκB 억제 또는 STAT3 신호 전달 억제를 측정하기 위한 모든 분석도 동일하게 적용 가능하다.
일부 실시양태에서, 상기 스크리닝 방법은 STAT3 신호 전달 경로를 억제하거나 억제하는 메디테리아네박터 박테리아 균주의 능력을 확인한다. 예시적인 예로서, 본 발명은 표적 세포에서 STAT3 신호전달의 활성화를 차단하거나 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 표적 세포에서 STAT3 신호전달의 활성화를 차단하거나 그렇지 않으면 억제하기 위해 표적 세포를 메디테리아네박터 파에시스 종의 박테리아 세포 제제의 적어도 가용성 성분과 접촉시키는 단계를 포함한다.
이러한 유형의 일부 실시양태에서, 상기 표적 세포는 기능성 리포터 세포(예를 들어, HEK 세포), 면역 세포(예를 들어, Th17 면역 세포), 상피 세포 및 내피 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 박테리아 세포 제제는 박테리아 세포 배양물을 포함한다. 적합하게는, 상기 가용성 성분은 박테리아 세포 배양물의 상등액을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 일부 실시양태에서, 상기 가용성 성분에는 박테리아 세포가 실질적으로 고갈되어 있다.
일부 대안적인 실시양태에서, 상기 박테리아 세포 제제는 박테리아 세포 펠릿을 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포 펠릿의 박테리아 세포는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 용해된다. 세포 용해 후, 세포 용해물 가용성 분획이 불용성 분획으로부터 분리되는 것이 일반적이다. 상기 세포 용해물은 스크리닝 분석이 진행되기 전에 추가 처리(예: 완충액에 희석, 또는 처리 시약에 노출)를 거칠 수 있다.
8. 투여 방식(Modes of administration)
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 본 발명의 박테리아 균주를 장으로 전달할 수 있도록 위장관(GI tract)에 투여되어야 한다. 즉, 본 발명의 조성물은 본 발명의 박테리아 균주를 장으로 전달할 수 있도록 위장관에 투여되도록 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 박테리아 균주를 장으로 전달하고 장의 부분적 또는 전체적 군집화를 가능하게 하기 위해 위장관에 투여되도록 제제화된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 폼, 스프레이 또는 겔로서 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 예를 들어 테오브로마 오일(코코아 버터), 합성 경지방(예를 들어, suppocire®, WITEPSOL), 글리세로젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜 또는 비누 글리세린 조성물 형태의 직장 좌약과 같은 좌약으로 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 비위관, 입위관, 위관, 공장조루술관(jejunostomy tube; J-튜브), 경피 내시경 위루술(percutaneous endoscopic gastrostomy; PEG) 또는 위, 공장(jejunum) 및 기타 적합한 접근 포트에 대한 접근을 제공하는 흉벽 포트 등의 포트와 같은 관을 통해 위장관에 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 1회 투여될 수 있거나, 치료 요법의 일부로서 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 매일(1회 또는 수회) 투여되어야 한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 장기간, 예를 들어 적어도 1주, 2주, 1개월, 2개월, 6개월 또는 1년 이상 동안 매일, 2일마다 또는 매주와 같이 정기적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 7일, 14일, 16일, 21일 또는 28일 동안 또는 7일, 14일, 16일, 21일 또는 28일 이하 동안 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 16일 동안 투여된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 치료에는 환자의 장내 미생물군의 평가가 수반된다. 본 발명의 균주의 전달 및/또는 부분 또는 전체 집락화가 달성되지 않아 효능이 관찰되지 않는 경우 치료를 반복할 수 있거나, 전달 및/또는 부분 또는 전체 집락화가 성공적이고 효능이 관찰되는 경우 치료를 중단할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 자궁 내 및/또는 출생 후 아이에게 발생하는 염증성 또는 자가면역 장애(여기에 기재된 것과 같은)를 예방하기 위해 임신한 동물, 예를 들어 인간과 같은 포유동물에게 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 STAT3 신호전달 경로에 의해 매개되는 질환 또는 상태, 또는 STAT3 신호전달 경로에 의해 매개되는 질환 또는 상태의 위험; 또는 염증성 또는 자가면역 장애(여기에 개시된 것과 같은)가 있는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 상기 조성물은 또한 건강한 환자에서 STAT3 신호전달 경로에 의해 매개되는 질병 또는 상태의 발병을 예방하기 위한 예방적 조치로서 투여될 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물은 염증성 또는 자가면역 장애, 특히 미생물총-장 축(microbiota-gut axis)에 의해 매개되는 염증성 또는 자가면역 장애로 진단되었거나, 염증성 또는 자가면역 장애, 특히 미생물총-장 축에 의해 매개되는 염증성 또는 자가면역 장애의 위험이 있는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 상기 조성물은 또한 건강한 환자에서 염증성 또는 자가면역 장애, 특히 미생물총-장 축에 의해 매개되는 염증성 또는 자가면역 장애의 발병을 예방하기 위한 예방 조치로서 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비정상적인 장내 미생물군을 갖는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 환자는 메디테리아네이박터, 특히 M. 파에시스에 의한 집락화가 감소되거나 없을 수 있다.
본 발명의 조성물은 영양 보충제와 같은 식품으로 투여될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 인간 질병의 예방 또는 치료를 위한 것이지만, 가금류, 돼지, 고양이, 개, 말 또는 토끼와 같은 단위 포유동물을 포함하는 동물을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 동물의 성장 및 성능을 향상시키는 데 유용할 수 있다. 동물에게 투여하는 경우 경구 위관 영양법을 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물이 투여될 개체는 성인 인간이다. 일부 실시양태에서, 조성물이 투여될 대상은 인간 유아이다.
9. 배양방법
본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 예를 들어 참고문헌(Handbook of Microbiological Media, 2010; Hunter-Cevera, 1996)에 상세히 설명된 표준 미생물학 기술을 사용하여 배양될 수 있다.
배양에 사용되는 고체 또는 액체 배지는 예를 들어 TY 또는 PYG 배지에서 선택될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 예시적인 배지 제제에는 하기 표 1에 제공된 것들이 포함된다.
배양 배지 제제
TY PYG YG/V
트립톤 10 g 20 g --
식물성 트립톤 20 g
효모 추출물 2.5 g Tabffff10 g 10 g
포도당 4 g 10 g 10 g
셀로비오스 1 g --- ---
말토스 1 g --- ---
헤민 용액(Hemin solution) 10 mL 1 mL ---
아세트산 1.9 mL --- ---
염 2* 38 mL 38 mL 38 g
염 3* 38 mL 38 mL 38 g
중탄산나트륨 8 g 8 g 8 g
레사주린(Resazurin) 1 mL 1 mL 1 mL
시스테인 1 g 1 g 1 g
물 1000 mL까지 1000 mL까지 1000 mL까지
*염 2: K2HPO4 6 g/L
*염 3: KH2PO4 6 g/L, (NH4)2SO4 6 g/L, NaCl 12 g/L, MgSO4.7H2O 2.5 g/L, CaCl2.2H2O 1.6 g/L
레사주린 스톡 1000x (0.1%): 100 mg in 100 mL H2O. 추가 세부적 조성은 McSweeney et al. 참조
본 발명을 쉽게 이해하고 실제적인 효과를 얻을 수 있도록 하기 위해, 특히 바람직한 구현예를 다음의 비제한적인 실험예를 통해 설명할 것이다.
실시예
건강, IBD 및 기타 질병과 메디테라네이박터의 연관성
염증성 장 질환은 건강한 장과 비교했을 때 IBD 장에서 선택된 장내 세균의 유병률과 풍부함 둘 다의 상당한 감소와 함께 미생물군집의 구조 기능 변화를 특징으로 한다. 몇몇 연구에서는 이들 박테리아가 IBD 발병을 조절할 수 있음을 보여주었다(Mallone et al., 2011; Sokol et al., 2008). 그러나 새로운 치료법을 개발하기 위해 이러한 박테리아를 사용하는 데 중요한 장애물은 저해상도 16S rRNA 기반 프로파일링이 낮은 분류학적 수준(즉, 속, 종, 계통)에서 건강 및 IBD 관련 계통을 정확하게 구별할 만큼 충분한 분해능을 제공하지 못한다는 것이다.
8,000명이 넘는 피험자에 대한 고해상도 장내 메타게놈 데이터와 관련 숙주 메타데이터가 포함된 마이크로바 디스커버리 데이터베이스(Microba Discovery Database; MDD)를 사용하여 M. 파에시스 및 M. 락타리스가 건강한 인간에게 널리 퍼져 있지만 염증성 질환 및 자가면역 질환에서는 거의 발견되지 않는 것으로 확인했다(도 2 및 표 2). 주요 아형인 궤양성 대장염과 크론병을 포함한 IBD에서 가장 강력한 효과가 관찰되었습니다(도 2).
M. 파에시스/M. 락타리스과 장애의 연관성
질환 P-값
M. 파에시스 		P-값
M. 락타리스
천식(Asthma) 1.10 x 10-5 0.00094
관절에 영향을 미치는 자가면역 질환(예: 강직성 척추염) 6.50 x 10-5 0.00078
건선성 관절염 4.60 x 10-5 0.0013
류머티스성 관절염 2.90 x 10-5 0.0065
지방간 4.50 x 10-5 1.50 x 10-7
IBD 1.90 x 10-5 2.40 x 10-8
크론병 2.50 x 10-5 4.70 x 10-6
궤양성 대장염 2.40 x 10-5 5.80 x 10-5
비알코올성 지방간 질환 0.022 0.038
전신 자가면역 질환(예: 루푸스, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혈관염) 6.40 x 10-5 0.018
M. 파에시스의 분리 및 게놈 규모 분석.
4개의 MH23 분리주는 평균 뉴클레오티드 동일성에 기초하여 이전에 특성화된 여러 분리주를 결합한 메디테라네이박터 속에 위치한다(Togo et al., 2018). M. 파에시스의 계통발생 및 기능적 잠재력은 게놈 분류 데이터베이스(GTDB; gtdb.ecogenomic.org(도 3))에서 공개적으로 이용 가능한 고품질 메디테라네이박터 sp.의 게놈을 사용하여 조사되었다. M. 파에시스는 현재 GTDB에서 이용 가능한 40개의 고품질 게놈과 MAG를 갖춘 메디테라네이박터 속의 가장 잘 대표되는 종이다. 이는 메디테라네이박터 락타리스와 뚜렷한 클러스터를 형성하며 메디테라네이박터 토크 및 기타 여러 비배양 종과 분리되어 있다(도 3A). 흥미롭게도 M. 파에시스 게놈은 두 개의 계통군으로 클러스터되어 이 종이 두 개의 하위 그룹으로 나뉘어져 있음을 나타낸다. M. 파에시스 게놈의 대사 재구성을 통해 단쇄 지방산인 프로피오네이트, 락테이트, 아세테이트 및 포름산염을 생산할 수 있지만 부티레이트는 생산하지 못하는 능력이 밝혀졌다(표 3). CAZymes의 다양한 프로필이 분리물 간에 공유되어 섬유 분해에 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다. M. 파에시스는 또한 인간 장내 미생물군집에서 비교적 희귀한 람노스를 포함하여 광범위한 단당류를 탄소원으로 사용할 것으로 예측된다(표 3). 흥미롭게도 M. 파에시스는 나머지 20가지 단백질 생성 아미노산 외에도 셀레노시스테인을 합성할 것으로 예측된다.
SCFA 생산의 대사 재구성 분석
M. faecis
SCFA MH23-1 MH23-2 MH23-3 MH23-4
포메이트 + + + +
아세테이트 + + + +
프로피오네이트 + + + +
부티레이트 - - - -
이소부티레이트 - - - -
발레레이트 - - - -
아이소밸레이트 - - - -
2-메틸부타노에이트 - - - -
락테이트 + + + +
M. 파에시스 균주의 예측 가능한 당질 탄소원
M. 파에시스 균주
1 2 3 4
단당류 포도당 + + + +
L-람노스 + + + +
과당 + + + +
D-갈락토스 + + + +
D-글루코네이트 + + + +
N-아세틸글루코사민 + + + +
D-갈락투로네이트 - - - +
이당류 트레할로스 + + + +
락토오스 + + + +
멜리비오스 + + + +
수크로스 + + + +
D-만노피라노실-N-아세틸-D-글루코사민 - - - +
라미나리비오스 분해 - - + +
다당류 녹말 + + + +
글리코겐 + + + +
건강에 대한 M. 파에시스의 역할과 IBD의 병인을 더 잘 이해하기 위해 희석-멸종 농축을 생성한 다음 단일 콜로니에 대한 플레이팅을 통해 M. 파에시스 MH23-1, MH23-2, MH23-3 및 MH23-4로 지칭한 4개의 새로운 균주를 3명의 건강한 인간 기증자로부터 분리했다. 모든 균주는 TY 및 PYG 배지에서 잘 자랐으며 그람 양성 및 때때로 그람 가변 염색 사슬 형성 구균으로 관찰되었다(도 3B). 비교 게놈 분석을 통해 M. 파에시스 MH23 균주가 M. 파에시스 종 내에서 높은 신뢰도(100% 부트스트랩 지원)로 클러스터링된 것으로 나타났다. M. 파에시스 MH23-1과 MH23-2는 둘 다 매우 유사하며 유전자 구성과 신테니의 사소한 차이는 공유된 진화 역사를 시사한다. 대조적으로, M. 파에시스 MH23-3과 MH23-4는 서로 달랐고 M. 파에시스 MH23-1과 MH23-2는 모두 달랐다(도 3A). M. 파에시스 MH23-1, MH23-2 및 MH23-3는 클러스터 1에 속해 있는 반면 M. 파에시스 MH23-4는 클러스터 2에 속해 있다. 예상대로 분리물은 사용된 농축 배지와 일치하는 포도당, 과당 및 N-아세틸글루코사민을 활용할 것으로 예측되었다.
M. 파에시스 MH23-1은 생체 내에서 장 장벽 기능을 향상시킴.
건강한 장에서 M. 파에시스의 역할을 평가하기 위해, 나이브 C57Bl/6 SPF 마우스를 M. 파에시스 MH23-1로 8일 동안 처리하였다(도 4A). 이 치료 기간 동안 일반적인 외모, 행동, 자세, 이동성 및 신경학적 행동의 이환이나 변화는 관찰되지 않았다. 유사하게, 비히클 대조군에 비해 M. 파에시스 MH23-1 처리된 동물의 체중에는 유의미한 변화가 없었다; 결장 길이와 무게/길이 비율도 영향을 받지 않았다(도 4B-4D). M. 파에시스 MH23-1은 상피 손상, 염증 및 혈관과다증을 단독으로 평가하거나 결합된 조직병리학적 점수로 평가하여 결정한 대로 비히클과 비교할 때 결장에서 어떠한 중요한 조직학적 변화도 일으키지 않았다(도 4E-4H).
DSS 유발 장 장벽 기능 장애의 급성 쥐 모델에서 M. 파에시스 MH23-1의 치료 효능을 검사했으며, 양성 대조군으로서 프레드니손(prednisonse) 및 F. 프라우스니치이(F. prausnitzii) A2-165를 사용했다(도 5A). DSS 처리는 비히클 대조군에 비해 상당한 장 장벽 기능 장애를 초래했다. 또한, 장 장벽 기능의 정확하고 신뢰할 수 있는 지표인 것으로 나타난 체중이 크게 감소했다(도 5B)(Britto et al., 2019). 예상한 대로 프레드니손은 DSS 유발 체중 감소를 악화시켰으나(Yamamoto et al., 2013), DSS 유발 체중 감소는 M. faecis MH23-1 또는 F. 프라우스니치이 A2-165(도 5B) 처리로 개선되었다. 내시경 분석 결과, 모든 치료군에서 1일차 기준 시점부터 2일차와 6일차에 질병 활성도가 점진적으로 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 F. 프라우스니치이 A2-165 또는 M. 파에시스 MH23-1을 사용한 치료는 비히클 치료군에 비해 질병 활동이 크게 감소했다(도 5C).
DSS 처리된 마우스의 조직학적 분석에서는 선와의 손실, 상피 침식 및 궤양을 특징으로 하는 상당한 장 손상이 나타났다. 특히, M. 파에시스 MH23-1을 사용한 치료는 조직병리학적 치유(도 5D,E), 상피 손상 및 염증 점수의 개선(도 5E-G)으로 입증된 바와 같이 선와 재형성 및 재상피화(도 5D)를 특징으로 하는 병리학에서 상당한 개선을 가져왔다. 이와 일관되게 M. 파에시스 MH23-1로 치료하면 대변의 리포칼린-2에 의해 결정된 장 염증이 감소했다(도 5H). 조직학적 분석 결과 M. 파에시스 MH23-1 처리 후 상피 잔 세포가 증가한 것으로 나타났다(도 5I). 이는 알시안 블루(Alcian blue) 염색에 의해 결정된 DSS 처리 대조군에 비해 점액 생산이 증가한 것과 관련이 있다(도 5J). 예상대로 프레드니손과 F. 프라우스니치이 A2-165도 질병 병리학에서 상당한 개선을 가져왔다.
종합해 보면, 이들 데이터는 M. 파에시스 MH23-1이 DSS 처리된 마우스 또는 미경험 마우스에서 어떠한 부작용도 일으키지 않았으며, 이는 M. 파에시스 MH23-1은 최종 DSS 투여 후 단 2일 만에 장 장벽 기능과 점막 치유의 개선을 촉진함을 보여준다.
본 발명자들은 또한 DSS 유도된 쥐 대장염의 치료 모델에서 M. 파에시스 MH23-3의 효능을 조사했다(도 5K). 내시경 분석 결과 프레드니손 또는 M. 파에시스 MH23-1을 사용한 치료는 비히클 치료군에 비해 질병 활성도가 크게 감소한 것으로 나타났다(도 5L). DSS를 처리한 쥐의 조직학적 분석에서는 선와 손실, 상피 침식 및 궤양을 특징으로 하는 심각한 장 손상이 나타났다. 특히, M. 파에시스 MH23-3을 사용한 치료는 조직병리학적 치유, 상피 손상 및 염증 점수의 개선으로 입증된 바와 같이 선와 재형성 및 재상피화를 특징으로 하는 병리학에서 상당한 개선을 가져왔다(도 5M-O). 이와 일관되게 M. 파에시스 MH23-3으로 치료하면 대변의 리포칼린-2에 의해 결정된 장 염증이 감소했다(도 5P).
TNBS-유발 대장염의 급성 쥐 모델에서 M. 파에시스 MH23-3의 치료 효능을 또한 양성 대조군으로서 사이클로스포린 A를 사용하여 조사하였다(도 5Q). TNBS 처리상당한 조직학적 손상을 초래했으며 이는 사이클로스포린 A 또는 M. 파에시스 MH23-3(도 5R-S)을 사용한 치료로 개선되었다.
M. 파에시스는 시험관 내에서 STAT3 및 NF-κB 활성화를 억제함
DSS 처리된 동물에서 관찰된 조직학적 염증 및 재상피화에 대한 극적인 효과를 고려하여, 본 발명자들은 다음으로 IBD 관련 면역 경로를 조절하는 M. 파에시스의 능력을 조사했다. IL-23에 의한 면역 반응은 IBD 발병의 핵심이며 임상적으로 인식된 표적이다(Britto et al., 2019; 및 Yamamoto et al., 2013). STAT3의 IL-23 매개 활성화를 억제하는 M. 파에시스 MH23-1, MH23-3 및 MH23-4의 능력을 HEK-Blue™ IL-23 리포터 세포주를 사용하여 조사했다. HEK-Blue™ IL-23 리포터 세포주는 IL-23 자극에 반응하는 STAT3 유도성 SEAP 리포터 유전자를 운반한다. 예상한 대로, STAT3의 IL-23 매개 활성화는 토파시티닙에 의해 예방될 수 있다(도 6A-C). M. 파에시스 MH23-1, MH23-3 및 TY 배지에서 성장한 MH23-4로부터 제조된 무세포 배양 상층액은 SEAP 리포터 활성을 억제했다(도 6A-C). M. faecis 배양 상층액으로 처리한 후에는 세포독성 효과가 관찰되지 않았다. 본 발명자들은 크기분획, 열처리 및 단백질분해효소 K 처리를 통해 배양상등액(CS)의 생화학적 특성을 평가했다. 이 접근법에 의해 M. 파에시스의 STAT3 억제 활성이 <3 kDa 분획과 연관되어 있고 열처리에 의해 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다(도 6D-F).
마지막으로, IL-23 매개 STAT3 활성화에 대한 성장 배지 의존성 효과의 영향을 조사했다. TY 또는 PYG 배지에서 성장한 균주로부터 제조된 CS는 강력한 STAT3 억제 활성을 나타냈다. 균주가 BHI, Wilkins-Chalgren 배지(WCB) 또는 MCM에서 성장했을 때 최소한의 STAT3 억제 활성이 있었다(도 7G). 이는 다른 박테리아 종의 활동에 영향을 미치는 문화의 영양 요인의 영향에 대한 이전 보고서와 일치한다(예: Giri et al., 2019; Toshimitsu et al., 2017). 따라서 이러한 결과는 다른 박테리아 종에 대해 이전에 설명한 것처럼 M. 파에시스에 의한 면역조절 생리활성물질의 생산이 특정 영양 인자에 의해 향상될 수 있음을 시사한다(Wlodarska et al., 2017; Zelante et al., 2013).
NF-κB 활성화를 방지하는 M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-2의 능력은 인간 장 상피 HCT116 세포주에서 IL-8 분비를 평가함으로써 검사되었다(Kunsch et al., 1993). IL-8 발현은 NF-κB에 의해 조절되며(Zhu et al., 2021), 예상대로 HCT116 세포를 IL-1β로 처리하면 IL-8 분비가 크게 증가하여 약리학적 억제제인 인돌-3-카비놀을 사용하여 예방할 수 있다. 특히, M. 파에시스 MH23-1의 무세포 CS는 배지 대조군에 비해 IL-8 분비를 억제했다(도 7A). 추가적으로, NF-κB 활성을 억제하는 M. 파에시스 MH23-4의 능력은 인간 단핵구 유래 대식세포에서 TNF의 발현을 평가함으로써 테스트되었다. THP-1 세포를 M. 파에시스 MH23-4의 LPS 및 무세포 배양 상층액으로 공동 자극했다. M. 파에시스 MH23-4와 F. 프라우스니치이 A2-165는 모두 TNF의 발현을 억제할 수 있었다(도 7B). 대조적으로, 클로스트리듐 볼테아(clostridium bolteae) BAA-613(IBD 관련 종의 대표적인 균주(Lloyd-Price, 2019))로 제조된 무세포 CS는 M. 파에시스의 실질적인 항염증 활성을 뒷받침하는 TNF 발현을 억제하지 못했다. 종합하면, 이는 M. 파에시스가 IBD 염증 반응을 뒷받침하는 주요 경로의 활성화를 조절한다는 것을 보여준다.
M. 파에시스는 GPCR 활성을 조절함
점막 치유를 유도하는 M. faecis의 능력을 더 잘 이해하기 위해, M. faecis MH23-1 및 MH23 2의 면역조절 능력을 고처리량 gpcrMAXsm GPCR 분석 패널 및 SelectScreen 세포 기반 경로 프로파일링 분석을 사용하여 평가했다. gpcrMAXsm 및 SelectScreen 분석은 각각 168개 및 38개 경로로 구성된다. 스크리닝할 시료의 수를 최소화하기 위해 저분자량 비극성 대사산물을 추출하기 위해 Colosimo 등이 채택한 방법을 사용하여 조대사산물 추출물을 제조했다(Colosimo et al., 2019). 접종되지 않은 대조 배지를 유사하게 준비하고, 각 샘플을 작용제 및 길항제 모드로 분석하고 Eurofins가 설명하는 기준을 사용하여 확실한 히트를 식별했다. 첫 번째 통과 화면에서 M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-2는 역치 수준 이상으로 β-arrestin 모집을 유도했으며 배지 대조와 크게 달랐다. 특히, M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-2는 대조 배지에 비해 각각 N-포르밀화 펩타이드 및 트립타민에 대한 수용체인 GPCR FPR1 및 HTR2C에 대해 작용제 활성을 나타냈다. 또한, 두 균주 모두 DRD2S의 도파민 매개 활성화에 대해 길항제 활성을 보인 반면, M. 파에시스 MH23-1은 추가적으로 ADRB1의 이소프로테레놀 매개 활성화 및 DRD3의 도파민 매개 활성화에 대해 길항제 활성을 나타냈다. 조대사산물 추출물은 분석의 민감도를 감소시킬 수 있으므로(예: Colosimo et al., 2019), 엄격한 임계값을 충족하지 못했지만 배지 대조와 다른 히트도 검사되었다. 이 확장된 목록에서 M. 파에시스에 의해 잠재적으로 변조될 수 있는 여러 다른 GPCR이 확인되었다. 높은 신뢰도 및 중간 신뢰도 히트는 이후 생물학적 복제 배양으로 평가되었으며 M. 파에시스 균주 MH23-1 및 MH23-2가 모두 중간 신뢰도 임계값에서 FRP1을 활성화하고 M. 파에시스 MH23-1이 HTR2C를 추가로 활성화했음을 확인했다(도 7). 유사하게, M. 파에시스 MH23-2는 중간 신뢰도 임계값에서 MC1R의 멜라노탄 II 매개 활성화 및 GIPR의 GIP 매개 활성화에 대해 길항제 활성을 나타냈다(도 8).
별도로, Pathway Hunter 분석을 사용하여 M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-2가 모두 리포터 세포주에서 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT)의 뉴로트로핀-3 활성화를 억제한다는 것을 확인했다.
M. 파에시스는 PBMC CD3+ 및 CD3- 세포에서 사이토카인을 조절함
M. 파에시스에 의해 생산된 생리활성 물질이 말초 면역 세포에 직접적인 영향을 미칠 수 있다는 가설을 세웠다. 이 가설을 조사하기 위해 먼저 T 세포(CD3+ CD4+, CD3+ CD8+, CD3+ TCRγδ+), 자연 살해 세포(CD56+) 및 항원 제시 세포(CD11b+, CD11b+ CD80+, CD11c+, CD11c+ CD80+)의 IL-6 매개 활성화를 방지하는 M. 파에시스 배양 상층액의 능력을 평가했다. M. 파에시스 MH23 CS로 처리하는 경우, 전체 CD3+ T 세포 집단과 CD3+ CD4+, CD3+ CD8+의 CD69 발현 집단의 형광 강도(GMFI)의 기하 평균이 증가했지만, TY 배지 대조군에 비해 CD3+ TCRγδ 세포 하위 집단은 그렇지 않았다. 또한 M. 파에시스 MH23-2 상청액 또는 M. 파에시스 MH23-1 상청액 및 PIM으로 처리한 후 CD69 발현 자연 살해 세포 집단의 GMFI가 증가했다. 대조적으로, TY 배지 대조군에 비해 HLA-DR 발현 CD11b+ CD80+ HLA-DR+ 세포(도 9C) 및 CD11b+(MH23-1 및 MH23-2), CD11b+ CD80+(MH23-1 및 MH23-2), CD11c+(MH23-2) 및 CD11c+ CD80+(M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-2) 세포 집단의 GMFI가 완만하게 감소했다(도 9A-C).
다음으로, 말초 혈액으로부터 유래된 CD3+ 및 CD3- 세포에서 사이토카인 생산에 대한 M. 파에시스 CS의 효과를 평가했다. PMA/이오노마이신/모넨신으로 자극된 CD3+ 및 CD3- 세포는 IFNγ 생산이 크게 증가하는 것이 특징이다. M. 파에시스 균주 MH23-1 또는 MH23-2 CS로 처리하면 TY 배지에 비해 IFNγ 생산이 기본 수준으로 억제되었다(도 9D-E; p < 0.01). 별도로, M. 파에시스 MH23-1 또는 MH23-2 배양 상층액으로 처리하면 CD3-세포에서 TY 배지에 비해 IL-22 생산이 유도된다(도 9F). 종합하면, 이는 M. 파에시스가 Th1 및 Th17 면역 유발 반응의 특징으로 간주되는 주요 사이토카인을 조절할 수 있음을 보여준다.
M. 파에시스는 장 상피 세포 이동을 촉진함
장 장벽의 손상은 일반적으로 염증성 및 자가면역 질환에서 발생한다. 장 상피 세포의 빠른 이동은 항상성을 다시 확립하는 상처 치유 과정의 중요한 구성 요소이다. M. 파에시스가 분비하는 생리활성 물질이 장 상피 세포의 운동성에 영향을 미칠 수 있는지 조사하기 위해 Transwell® 이동 분석을 사용했다. HCT116 세포를 Transwell® 챔버의 정점에 시딩하고 M. 파에시스 추출물이 챔버의 기저측면으로의 이동을 촉진하는 능력을 평가했다. DMEM 처리된 세포는 기본 수준의 세포 이동을 가졌고 이는 TY 배지를 사용한 처리에 영향을 받지 않았다(도 10A,B). 특히, M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-2를 사용한 치료는 모두 HCT116 세포의 이동을 크게 촉진했다(도 10 A 및 B).
M. 파에시스의 이동 촉진 효과는 IncuCyte 스크래치 상처 분석을 사용하여 추가로 확인되었다. 스크래치 상처 유도 후, HCT116 세포는 TY 배지로 처리된 대조군 세포에 비해 M. 파에시스 균주 MH23-1 및 MH23-2의 추출물이 있는 경우 상처 폐쇄 속도가 가속화된 것으로 나타났다(도 10 C 및 D).
M. 락타리스는 IL-23 매개 STAT3 활성화를 억제함
상기 결과를 고려하여, 이러한 결과가 염증성 및 자가면역 질환과도 연관되어 있는 매우 유사한 박테리아 종에 적용(extrapolated)될 수 있음을 확인하기 위해 노력하였다. 이와 관련하여, HEK Blue IL-23 리포터 세포주를 사용하여 STAT3의 IL-23 매개 활성화를 억제하는 두 가지 M. 락타리스 종(M. 락타리스 ATCC 29176 및 M. 락타리스 MH54)의 배양 상청액의 능력을 평가했다. HEK Blue IL-23 세포주에는 IL-23에 의해 발현이 유도되는 STAT3 반응성 SEAP 리포터가 포함되어 있다. 범(pan) JAK 억제제인 토파시티닙을 사용한 치료는 IL-23 매개 SEAP 발현을 억제한다. TY 배지를 사용한 처리는 STAT3의 IL-23 매개 활성화를 어느 정도 억제하는 결과를 가져왔다(도 11). 본 발명자들은 STAT3 활성을 조절하는 배양 상청액 및 <3 kDa 상청액 분획의 능력을 조사하였다. 억제 효과가 저분자량 생체활성물질에 기인하고 약물 개발에 더 적합하다는 장점이 있을 것이라는 가설이 제기되었기 때문에 <3 kDa 분획을 평가했다.
두 M. 락타리스 균주 모두 IL-23 매개 STAT3 활성화를 억제했다(도 1A-B). 특히, M. 락타리스 <3 kDa 분획은 IL-23 매개 STAT3 활성화를 무세포 배양 상등액과 유사한 정도로 억제했다.
M. 파에시스는 장 장벽 기능을 지원하고 장 장벽 무결성을 향상시킴
장 상피 세포는 숙주 조직을 장내 미생물 및 내강 내용물로부터 분리하는 물리적 및 생화학적 장벽을 형성한다(Peterson and Artis, 2014). 손상된 장 장벽 기능은 IBD를 포함한 여러 질병의 발병에 연루되어 있으며(Vanuytsel et al., 2021) 질병 결과를 개선하기 위한 치료 표적으로 제안되었다(Sommer et al., 2021). 장 상피 세포 장벽의 완전성은 경상피 전기 저항(trans-epithelial electrical resistance; TEER)이라는 간단하고 비침습적인 방법을 사용하여 평가할 수 있다. TEER 분석에서는 상피 세포층에 전류를 가하고 저항을 측정한다. TEER 값의 감소는 장벽이 손상되었음을 나타낸다. TEER 측정은 단일 배양 세포층의 장벽 무결성에 대한 비침습적 측정을 위한 "황금 표준(gold standard)"을 구성한다.
본 발명자들은 T84 장 상피 세포주를 사용하여 장벽 기능을 조절하는 M. 파에시스의 능력을 평가했다. 24시간 동안 IFN-γ로 처리한 후 저항성이 크게 감소하여 장벽 투과성이 증가했음을 나타낸다. 예상한 대로, 토파시티닙 치료(Sayoc-Becerra et al., 2020 참조)는 TEER 감소를 크게 개선했다. M. 파에시스 균주 MH23-1 또는 MH23-3의 <3 kDa 분별 배양 상등액으로 처리하는 경우, TY 배지 대조군에 비해 TEER의 감소가 개선되었다(도 12A). IFN-γ 처리 후 144시간에 배양 상등액 M. 파에시스 균주 MH23-1 또는 MH23-3을 사용한 처리는 TY 배지 대조군에 비해 TEER 감소를 개선했다(도 12B).
다음으로 본 발명자들은 IFNγ 치료 후 장벽 완전성 복원을 촉진하는 MH23 추출물의 능력을 평가했다. 72시간 동안 IFNγ로 치료하면 TEER이 크게 감소했다. 이전 보고서(Boivin et al., 2009)와 일관되게, NF-κB 억제제 PDTC는 TEER에 대한 IFNγ 치료의 영향을 개선했다. YG/V 배지 추출물을 사용한 처리는 TEER에 영향을 미치지 않았지만 MH23-3 배양 상층액 추출물은 YG/V 대조군에 비해 TEER의 상당한 증가를 가져왔고 이는 향상된 장벽 무결성을 나타낸다(도 12C). 종합적으로 말하자면, 이들 데이터는 M. 파에시스가 장 장벽 무결성의 유지 및 복원을 지원하는 저분자량 성분을 생산한다는 것을 보여준다.
대사산물의 식별
M. 파에시스가 치료 효능에 기여하는 대사산물을 생산한다는 가설을 세웠다. 이에, 무세포 배양 상청액에서 YG/V 배지 대조군에 비해 2배 이상 증가한 22개의 대사산물(레벨 1 또는 2a로 분류됨)을 확인했다(표 5). 여기에는 이전에 염증, 면역 세포 침윤, 산화 스트레스 및 장 장벽 기능을 조절하는 것으로 알려진 대사산물(예: 오르니틴(Qi et al., 2019 참조) (1), N-아세틸-시스테인 (e.g. (Masnadi Shirazi et al., 2021, 및 You et al., 2009), 피로갈롤(Chicas et al., 2020) 및 프로피오닐카르니틴(Scioli et al., 2014) 등이 포함되었다.
상청액의 대사산물 식별
이름 배수 변화
오르니틴 2806.953702
N-아세틸글루탐산 272.2521184
N8-아세틸스페르미딘 113.9090955
NAD+ 53.59550359
N-아세틸-시스테인 27.95733379
크레아티닌 15.82069695
알로푸리놀 10.81125942
이노신 9.58598181
델타데세노락톤 9.004221142
δ-글루코노락톤 6.313585578
호모시스테인 5.314445862
아세틸히스티딘 5.202521545
카바모일라스파르테이트 5.190828821
피로갈롤 4.091891298
아데닌 3.260166157
잔토신 3.112303737
프로피오닐카르니틴 2.947440406
4-메틸-2-옥소발레르산 2.709985519
크로톤산 2.40415397
4-하이드록시-2,5-디메틸-3(2H)-푸라논 2.289388196
유리딘 2.109979308
리보플라빈 2.100136471
재료 및 방법
박테리아 균주, 배양 조건 및 분석.
대변 샘플을 위장 장애 병력이 없는 건강한 인간 성인으로부터 수집하고 동일한 중량의 멸균 무산소 글리세롤 용액과 혼합했다(McSweeney et al., 2005). 기증자는 대변 샘플을 수집하기 전 3개월 동안 항생제를 섭취하지 않았다. M. 파에시스 및 패칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii)는 무산소 대기(85% N2:10% CO2:5% H2) 조성의 Coy 비닐 혐기성 챔버에서 일상적으로 처리되었다. M. 파에시스는 TY 또는 PYG 배지(McSweeney et al., 2005에 설명됨)에서 일상적으로 배양되었으며 F. prausnitzii는 TY 배지(McSweeney, 2005)에서 배양되었다. 모든 분리물은 3mL의 활발하게 성장하는 배양물을 동일한 부피의 글리세롤 용액과 혼합하고 -80°C에서 보관하여 비축되었다.
M. 파에시스의 분리.
M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-2의 강화는 0.47%의 상대 존재비로 존재하는 M. 파에시스를 기증자 대변 샘플에 셰들러 브로쓰(Schaedler broth)에 접종한 다음 순차적으로 희석하여 소멸시킴으로써 생성되었다. 희석-멸종 배양 시리즈를 순서대로 분석하고 상대 풍부도 14%의 M. 파에시스를 사용한 농축 배양을 확인했다. 이 농축물은 이후 셰들러 브로쓰에서 희석되어 소멸되었으며, M. 파에시스가 42% 상대 풍부도로 농축된 배양 시리즈가 확인되었다. 아미노글리코사이드 항생제를 생략한 박테로이데스 담즙 에스큘린 아가(Bacteroides Bile Esculin Agar)에 줄무늬를 표시하여 콜로니를 회수하고 M. 파에시스 MH23-1 및 MH23-2로 명명된 2개의 분리주를 전체 게놈 서열 분석으로 식별했다. M. 파에시스 MH23-3은 기증자 대변 샘플에 M. 파에시스를 상대 존재비 0.12%로 효모 N-아세틸글루코사민 브로쓰(효모 N-아세틸글루코사민 국물의 조리법은 포도당이 동일한 양의 N-아세틸글루코사민으로 대체된다는 점을 제외하면 표 1의 YG 배지와 같음)에 접종한 다음 순차적으로 희석하여 멸종시켰다. 47.8%의 M. 파에시스 농축이 확인되었으며, 이후 0.5% v/v 나트륨 아지드 용액(10% w/v)이 보충된 TY 배지에 줄무늬를 표시하여 무균 분리물을 생성했다. M. 파에시스 MH23-3은 전체 게놈 서열 분석으로 확인되었다. M. 파에시스 MH23-4는 기증자 대변 샘플에 M. 파에시스를 상대 풍부도 0.37%로 YF(Yeast Fructose) 브로쓰(YF 브로쓰의 조리법은 포도당이 동일한 양의 과당으로 대체된다는 점을 제외하면 표 1의 YG 배지와 같다)에 접종한 다음 순차적으로 희석하여 멸종시켰다. 94.8%의 M. 파에시스 농축이 확인되었으며 이후 TY 배지에 줄무늬를 표시하여 무균 분리물이 생성되었다. M. 파에시스 MH23-4는 전체 게놈 서열 분석으로 확인되었다.
M. 락타리스의 분리.
M. 락타리스(균주 14.1.C2, MH54)는 위장 장애 병력이 없는 건강한 피험자의 대변 샘플을 사용하여 분리되었다. M. 락타리스 및 M. 토크(M. torques)는 무산소 대기(85% N2:10% CO2:5% H2) 조성의 Coy 비닐 혐기성 챔버에서 일상적으로 처리되었다. M. 락타리스 및 M. 토크는 TY 또는 YG/V 배지를 사용하여 일상적으로 배양되었다(표 1). M. 락타리스 MH54는 TY 한천에서 분리되었다. 모든 분리물은 3mL의 활발하게 성장하는 배양물을 동일한 부피의 글리세롤 용액과 혼합하여 저장하고 -80℃에서 보관했다.
신진대사 재건.
EnrichM(버전 0.5.2)의 주석 기능을 사용하여 단백질 코딩 서열을 예측하고 주석을 달았다. 간단히 말해서, richM은 -p 메타 모드에서 prodigal(버전 2.6.3)을 사용하여 단백질 코딩 서열을 식별한다. 그런 다음 DIAMOND(버전 2.0.4)를 사용하여 UniRef100 데이터베이스(2020년 11월 다운로드)에 대해 아미노산 서열을 검색하고 E.C., TCDB 및 에그노그 분류는 UniRef와 함께 배포된 idmapping 파일에서 상속된다. Pfam(릴리스 33.0), tigrfam(릴리스 15.0) 및 dbcan2(2019년 9월 다운로드)에 대한 Hmmer hmmsearches(버전 3.1b2)를 사용하여 기능 도메인, 주요 대사 마커 및 탄수화물 활성화(CAZy) 효소에 각각 주석을 달았다. 대사 경로는 수동으로 정의된 대사 경로 정의에 대해 주석과 해당 게놈 위치를 평가하는 richM의 분류 기능을 사용하여 식별되었다. 필요한 단백질의 >80%를 암호화하고 필요한 모든 신테니 검사를 통과하는 경로는 게놈에 존재하는 것으로 간주된다. 이러한 자동 예측 경로는 수동으로 평가되었다. 또한, 장내 미생물에 의해 암호화되는 일반적인 생합성 경로를 식별하기 위해gutSMASH(버전 1.0.0)가 적용되었다.
계통발생수
게놈 트리는 메디테라니박터 속(NCBI r95) 및 4개의 MH23 분리주 내에서 checkM 분석으로부터 90% 이상은 완전 그리고 5% 이하는 오염으로 정의된 고품질 게놈으로부터 구성되었다. 각 게놈에 대해 gtdbtk 식별을 사용하여 각 게놈에서 122개의 박테리아 특이적으로 보존된 마커 유전자 세트를 추출했다. 이러한 유전자는 HMM 프로파일을 위해 정렬되었고, gtdbtk 정렬을 사용하여 단일 정렬로 연결되었으며, gtdbtk 추론과 함께 FastTree(버전 2.1.10)를 사용하여 정렬로부터 최대 가능성 계통수를 구성했다. 비모수적 부트스트랩 값은 GenomeTreetk(v0.1.6)를 사용하여 1000회 반복에서 추론되었다.
동물 실험을 위한 박테리아 균주의 준비.
M. 파에시스 및 F. 프라우스니치이 균주를 TY 배지에서 초기 정지상으로 성장시켰다. 개별 배양물의 세포 밀도는 헬베르 계수 챔버(Helber Counting Chamber)를 사용하여 계산되었다. 박테리아 위관 용액을 제조하기 위해 개별 배양물을 멸균 중질 미네랄 오일 층 아래에서 5,000g으로 10분간 원심분리한 후 무세포 상등액을 폐기했다. 세포 펠렛을 1.5 mL의 멸균 혐기성 완충 희석액(염 용액 2 및 3 각각 38mL/L(McSweeney et al., 2005), 0.1%(w/v) 레자주린 용액 1mL/L, L-시스테인 1g/L)으로 세척한 후 다시 원심분리했다. 마지막으로, 세척된 세포 펠릿을 절반 농도의 글리세롤 용액(무산소 완충 희석제 중 15% v/v 글리세롤 용액)에 최종 농도가 1 x 109개 세포/mL가 되도록 재현탁하고, 분취하고 필요할 때까지 -80℃에서 동결시켰다. 단일 분취량을 해동하고 한천 플레이트에 줄무늬를 표시하여 세포 제제의 생존성을 확인했다. 개별 균주 제제의 동일성과 순도는 전체 게놈 서열 분석을 통해 확인되었다.
DSS로 인한 장 장벽 기능 장애의 급성 모델
동물 자원 센터(Animal Resources Centers; 호주, 서호주)에서 구입한 6주령 C57BL/6 암컷 마우스를 무작위로 추출한 후 실험 전 7일 동안 공동 사육했다. 장 장벽 기능 장애를 유도하기 위해 생쥐를 6일 동안 식수에 3% DSS를 자유롭게 첨가하여 처리했다. 나이가 일치하지 않은 대조군 마우스를 처리하고 DSS가 없는 식수를 받았다. 모든 처리는 DSS 제공 하루 전에 시작되었으며 모든 마우스는 최종 DSS 처리 이틀 후에 희생되었다. 치료를 위해 마우스를 이소플루오란으로 마취시키고 200μl의 박테리아 제제 또는 비히클 대조군을 경구 위관 영양 공급했다. 마취 후 복강내 주사를 통해 프레드니손(2mg/kg)을 투여했다. 체중과 대변 일관성을 매일 기록했다. 대변 샘플은 매일 수집되었다. 희생 후 분석을 위해 결장, 간 및 비장을 수집했다. 심장 천자(cardiac puncture)를 통해 혈액을 수집했다. 치료 모델에서는 동물 자원 센터(호주 서호주)에서 구입한 6주령 C57BL/6 암컷 마우스를 무작위로 추출한 후 실험 전 7일 동안 공동 수용했다. 장 장벽 기능 장애를 유도하기 위해 생쥐를 6일 동안 식수에 2.5% DSS를 자유롭게 첨가하여 처리했다. 나이가 일치하지 않은 대조군 마우스를 처리하고 DSS가 없는 식수를 받았다. 모든 처리는 DSS 처리 완료 2일 전에 시작되었으며 모든 마우스는 최종 DSS 처리 5일 후에 희생되었다. 치료를 위해 마우스를 이소플루오란으로 마취시키고 200μl의 박테리아 제제 또는 비히클 대조군을 경구 위관 영양 공급했다. 마취 후 복강내 주사를 통해 프레드니손(2mg/kg)을 투여했다. 대변 샘플을 매일 수집하고 희생 후 분석을 위해 결장을 수집했다.
내시경 및 조직학적 점수 결정(Endoscopic and Histological scoring).
결장 점막 염증 정도를 평가하기 위해 1일, 2일 및 6일에 작은 동물 위장 내시경(Karl Storz Endoskope, 독일 투틀링겐 소재)으로 동물을 검사했다(Marks et al., 2015; and Liu et al., 2019). 간략하게, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 직장을 통해 결장경을 삽입하였다. HD 비디오로 캡처한 이미지를 맹검 방식으로 검사하여 질병 병리의 존재와 정도를 평가했다(표 6). 조직학적 채점은 본질적으로 해당 분야에서 이전에 설명된 대로 수행되었다(Marks et al., 2015 참조). 간단히 말해서, 샘플을 4% 포르말린에 고정하고 파라핀을 포매하고 절개했다(embedded and sectioned). 조직 절편은 질병 병리학을 평가하기 위해 헤마톡실린과 에오신으로 염색되었고, 점액 생산을 평가하기 위해 알시안 블루로 염색되었다. 슬라이드는 Aperio 디지털 이미징 시스템(Leica Biosystems, Nußloch, Germany)을 사용하여 이미지화되었다. 대장염 중증도를 등급화하기 위해 조직 절편의 염증 정도(대장염 활성, 표 6 참조) 및 상피 손상(상피 증식과 손상의 복합, 표 6 참조)을 확립된 채점 시스템을 사용하여 반정량적으로 등급을 매겼다(표 7). 그런 다음 샘플을 무작위로 추출한 후 훈련된 위장관 병리학자가 맹검 방식으로 점수를 매겼다.
대장내시경 검사를 통한 장 장벽 기능 장애의 점수 결정
Feature 점수
결장벽의 두꺼워짐
투명한 0
보통의 1
두드러진 2
투명하지 않음 3
혈관 패턴의 변화
정상 0
보통의 1
두드러진 2
출혈 3
점막 표면의 세분성
없음 0
보통의 1
두드러진 2
극심한 3
대변 일관성/점액 분비
일반적이고 단단함 0
여전히 모양이 있는 가벼운 점액 1
모양이 잡히지 않은 점액 2
확산 3
관련 지역의 정도
0-5% (없음) 0
5-20% (불균형) 1
20-50% (보통) 2
>50% (우세함) 3
조직학적 대장염의 점수 결정
염증 점수 (0-4점)
0 염증의 증거가 없음
1 분산된 침윤성 단핵구로 인한
낮은 수준의 염증(1-2개 병소만)
2 여러 병소가 있는 중등도의 염증
3 혈관 밀도가 증가하고 벽이 두꺼워지는
높은 수준의 염증
4 경벽 백혈구 침윤 및 잔세포 손실로 인한
최대 심각도의 염증
부상 점수 (0-3점)
0 상피 손상 없음
1 수시 상피 병변
2 1-2 궤양의 병소
3 광범위한 궤양
대장염 활동도(아래 나열된 측정값에 따른 종합 점수(/15))
과혈관화(Hypervascularisation) 중증도에 따라, 0-3
단핵 세포의 존재 중증도에 따라, 0-3
상피 증식 중증도에 따라, 0-3
상피 손상 중증도에 따라, 0-3
호중구의 존재 중증도에 따라, 0-3
림프 집합체 0-2점, 여기서, 0 = 0, 1 = ≤2, 및 2 = ≥2
대장염의 TNBS 모델
5마리 또는 10마리의 수컷 BALB/c 마우스 그룹이 사용되었다. 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산 용액을 투여하기 전(2일차 TNBS 챌린지. 원위 대장염은 TNBS(0.1mL 50% 에탄올 중 1mg)를 결장내 주입하여 유발되었음), 마우스를 밤새(1일) 금식시킨 후, 용액이 결장에 남아 있는지 확인하기 위해 동물을 30초 동안 수직 자세로 유지했다. 치료를 위해, 1일차(즉, TNBS 1일 전)부터 5일차까지 총 5일 동안 M. 파에시스 MH23-3 200μl를 1x109개 세포/일 또는 비히클(멸균 글리세롤 및 인산염 용액)로 마우스에 경구 위관영양 공급했다. 양성 대조군 사이클로스포린 A는 총 4일 연속(1-4일) 동안 1일차(즉, TNBS 1일 전)부터 4일차까지 매일 1회 경구 위관 영양법으로 75mg/kg을 투여했다. TNBS 챌린지 당일, 비히클, M. faecis MH-23.3 및 사이클로스포린 A를 TNBS 2시간 전에 투여했다. 심장 천자를 통해 모든 동물로부터 혈액을 수집했다; 결장 조직도 수확하고 사이토카인 측정을 위해 액체 질소로 급속 냉동했다. 5일째에, 마우스를 CO2 질식으로 안락사시켰다. 각 결장을 제거하고 세척한 후 항문으로부터 4cm 떨어진 곳에서 잘라냈다. 조직절편은 10% 포르말린에 고정하였고, 조직병리학적 검사를 위해 70% 에탄올에 보관하였다.
TNBS 대장염의 조직병리학적 채점
4 마이크로미터 조직 절편을 절단하고 광학 현미경(LEICA DM2700 M, USA) 하에서 조직학적 분석(대장염 점수 결정; 본질적으로 Dieleman LA et al., 1998에 기술된 바와 같음)을 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색했다. 조직학적 기준에는 점막 구조의 이상, 염증 정도, 침식 또는 궤양, 상피 재생 및 질병 과정에 의한 침범 비율이 포함되었다. 채점은 동물당 각 결장의 두 부분을 검사하여 관찰자의 발견을 기반으로 했다. 대장염에 대한 총 점수(총 대장염 지수)가 추가되어 조직학적 점수 범위가 0에서 40까지 통합되었다:
통합된 조직학적 점수
점막 구조의 이상 없음(정상)
초점에 대한 최소, 고유판을 초과하지 않음
경미한 이상, 낭성 확장/비정상 선와의
중등도 또는 다초점 이상
심각하고 전체 음와와 상피가 손실됨		 0
1
2
3
4
염증의 정도 없음
집중적이고 분산된 세포의 경우 최소(<10%)
약함(mild) (10-25%)
점막하층까지 확장된 중등도의 염증 세포
심각한 경벽 백혈구가 점막에서 장막으로 침윤됨		 0
1
2
3
4
침식 또는 궤양 침식, 궤양 또는 육아 조직 없음
고유판을 초과하지 않는 최소 또는 초점
명백한 침식
중등도, 궤양
심한 궤양 또는 육아조직		 0
1
2
3
4
상피 재생 완전한 재생 또는 정상 조직
거의 완전한 재생
크립트(cyrpt) 고갈을 통한 재생
표면 상피가 손상되지 않음
조직 복구 없음		 0
1
2
3
4
참여율 없음
1-25%
26-50%
51-75%
76-100%		 0
1
2
3
4
2x 섹션의 경우 0~20점 사이의 점수를 얻고 총 범위 0~40의 점수를 추가한다.
STAT3 억제 활동의 특성 분석.
STAT3 억제 활성을 평가하기 위해, 3개의 독립적인 콜로니를 접종하고 초기 정지기까지 성장시켰다. 그런 다음, 각 종자 배양액을 사용하여 3개의 생물학적 복제물에서 6개의 기술적 복제물을 각각 생성하는 2개의 기술적 복제물을 접종했다. 기술적 복제물은 초기 정지 단계까지 성장한 다음 이전에 설명한 대로 세포가 없는 배양 상층액을 수확했다(Giri et al., 2019). 제조사(Merck Millipore)의 지시에 따라 3 kDa CENTRICON® 컬럼을 통과시켜 배양 상층액을 크기별로 분류했다.
STAT3 활성은 HEK Blue IL-23 세포주(Invivogen)를 사용하여 평가되었다. 간략하게, 웰당 50,000개의 세포를 검정 시작 24시간 전에 96-웰 플레이트에 3중으로 접종했다. 박테리아 상청액 또는 멸균 박테리아 배지를 최종 농도 10%, 25% 또는 50% v/v로 최종 농도 5ng/mL의 재조합 인간 IL-23(rhIL-23, R&D 시스템)과 혼합했다. 이어서, 이 혼합물을 세포에 직접 첨가하고 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. STAT3 활성화를 억제하는 상청액의 능력을 Janus 키나제 억제제 토파시티닙(10μM)과 비교했다. STAT3 규제 SEAP 리포터 활동은 제조업체(Invivogen)가 권장하는 대로 Quanti Blue 솔루션을 사용하여 평가되었다. 결과는 최소 3번의 독립적인 실험의 평균입니다. 세포독성은 MTT 분석을 사용하여 평가되었다. 간략하게, MTT를 최종 농도 1.2mM로 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양한 후 DMSO로 고정시켰다. 제조업체(Invitrogen, Thermo Fisher, Australia)에서 권장하는 대로 540nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가했다.
사이토카인 생산 분석.
Ella 시스템(R&D Systems), 또는 IL-8 Human Uncoated ELISA Kit(Thermo Fisher, Australia)를 사용하여 사이토카인 생산을 평가했다. Ella 기반 실험의 경우 THP-1 세포의 웰당 1 x 104개 세포를 96웰 플레이트에 접종했다. 24시간 배양 후, THP-1을 최종 농도 20μM의 PMA로 24시간 동안 유도하여 대식세포로 분화시켰다. 분화된 THP-1 세포를 LPS(1 μM) 및 적절한 샘플로 처리하고 37°C에서 6시간 및 24시간 동안 배양했다. 이 시점에서 제조업체의 지침에 따라 Ella 시스템에서 세포 상청액을 수집하고 분석했다.
ELISA 분석을 위해, HCT116 세포의 웰당 1 x 104 세포를 이중 96 웰 플레이트에 접종했다. HCT116 세포를 IL 1β(10ng) 및 인돌-3-카비놀(5μM) 또는 배양 상층액(10% v/v)으로 적절하게 처리하고 37°C에서 16시간 동안 배양했다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 IL-8 인간 코팅되지 않은 ELISA 키트를 사용하여 세포 상청액을 수집하고 분석했다.
GPCR 및 세포 경로 면역 조절 활성.
GPCR 활성을 조절하는 장내 세균의 능력은 본질적으로 Colosimo et al.(Colosimo et al., 2019)에 의해 설명된 대로 평가되었다. 간단히 말하면, 단일 콜로니를 접종하고 초기 정지 단계까지 성장시켰다. 이 "종자 배양액(seed culture)" 브로쓰를 사용하여 600mL의 TY 브로쓰를 접종하고 배양액을 초기 정지 단계까지 배양했다. 배양 상청액은 배양물을 4000g에서 30분 동안 원심분리한 후 제조사의 지침(Sartorius Vivaflow® 50 Ultrafilteration Unit 3 kDa MWCO PES)에 따라 3 kDa 필터를 통해 무세포 상청액을 통과시켜 제조되었다. 활성화된 Amberlite XAD-7 수지를 3 kDa 여과된 무세포 상청액(10% w/v) 400 mL에 첨가하고, 슬러리를 밤새 4℃에서 부드럽게 진탕시켰다. 수지를 수집하고 400mL의 탈이온수로 세척한 다음 120mL의 100% 메탄올과 혼합했다. 가볍게 흔들면서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 메탄올 용출물을 수집했다. 120mL의 100% 메탄올에서 두 번째 용출은 이전에 설명한 대로 수행되었으며 두 가지 용출은 최종적으로 합쳐지고 회전 증발기를 사용하여 진공 하에서 건조되었다. 추출물을 100% DMSO(이후 1000X로 지칭함)에 완전히 재현탁시키고 -20℃ 에서 보관했다.
M. 파에시스 제제의 GPCR 조절 활성은 작용제 및 길항제 모드에서 gpcrMAXSM GPCR 분석 패널(Eurofins, USA)을 사용하여 평가되었다. Eurofins에서 설명한 대로 작용제 및 길항제의 높은 신뢰도 히트가 확인되었다. 작용제 및 길항제 중간 신뢰도 히트는 % 활성/억제율이 ≥10%인 점을 제외하고는 Eurofins에서 설명한 대로 확인되었다. 효능제 모드의 경우, 세포를 상청액 추출물과 함께 배양하여 반응을 유도했다. 작용제 활성은 다음 공식을 사용하여 계산되었다: 활성 퍼센트 = 100% × (시험 샘플의 평균 RLU - 비히클 대조의 평균 RLU)/(평균 MAX 대조 리간드 - 비히클 대조의 평균 RLU). 길항제 모드의 경우, 세포를 상등액 추출물과 함께 사전 배양한 다음, 각각의 EC80 농도에서 알려진 GPCR 특이적 작용제로 처리했다. 길항 활성은 억제율 = 100% × [1 - (시험 샘플의 평균 RLU - 비히클 대조군의 평균 RLU)/(EC80 대조군의 평균 RLU - 비히클 대조군의 평균 RLU)]를 사용하여 계산되었다. SelectScreen™ 세포 기반 경로 분석(Thermo Fisher, USA)은 작용제 및 길항제 모드에서 상층액 추출물을 사용하여 수행되었다. 활성화제 분석시 활성도는 다음 공식을 사용하여 계산되었다: 활성 백분율 = 100% × (반응 비율(상층액) - 반응 비율(활성화 대조 없음)/(반응 비율(전체 활성화 대조) - 반응 비율(활성화 대조 없음)). 억제제 분석에서의 억제도는 다음 공식을 사용하여 계산되었다: 억제율 = 100% × [1 - (반응 비율(상등액) - 반응 비율(활성화 대조 없음)/(반응 비율(EC80 대조) - 반응 비율(활성화 대조 없음)). 작용제 및 길항제 히트는 Thermo Fisher에 의해 설명된 대로 확인되었다.
세포 이동 분석.
IncuCyte® Live-Cell Imaging System(Essen BioScience) 및 트랜스웰 이동 분석을 사용하여 M. 파에시스의 멸균 배양 상청액에 노출되는 동안 HCT116 세포의 이동을 평가했다. 인간 HCT116 장 상피 세포를 10% FBS 및 1% Pen/Strep이 보충된 McCoys 5a 배지에서 유지했다. IncuCyte® 스크래치 상처 분석을 위해 3.5 x 104 HCT116 세포를 폴리-L-오르니틴 코팅된 IncuCyte® ImageLock 96-웰 플레이트(Essen BioScience)에 플레이팅했다. 24시간 후, IncuCyte® WoundMaker 도구를 사용하여 거의 융합된 세포 단층에 균일한 스크래치 상처를 유도했다. 세포를 DPBS로 2회 세척한 후 200μL 0.5% FBS McCoys 5a 배지 중 1%(v/v)의 M. faecis로부터의 고정상 배양 상청액을 첨가했다. 접종되지 않은 박테리아 배지(1%)는 음성 대조군으로 사용되었다. 자극제를 첨가한 직후, 플레이트를 IncuCyte® 시스템으로 옮기고 72시간에 걸쳐 2시간마다 각 웰을 영상화하여 세포 이동을 모니터링했다. 데이터 분석은 통합 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
TRANSWELL® 분석을 통해 세포 이동을 평가하기 위해 3.5 x 104 HCT116 세포를 24웰 플레이트(기공 크기 8μm, Corning Costar)에 있는 TC 처리된 폴리카보네이트 멤브레인이 있는 6.5mm 삽입의 상단 구획에 있는 100μL 10% FBS 배양 배지에 접종했다. 600 μL 10% FBS 배양 배지를 하부 구획에 첨가했다. 세포를 24시간 동안 정치시켰다. DPBS 세척 후 0.5% FBS 배지 100μL 및 600μL를 상단 및 하단 구획에 각각 첨가했다. 그런 다음, M. 파에시스의 0.4x 농축 추출물을 하단 구획에 첨가했다. 이러한 박테리아 추출물은 이전에 설명한 대로 Amberlite XAD-7 수지를 사용하여 제조되었다. 16시간 후, 세포를 DPBS로 세척하고, 막 상단에 부착된 세포를 면봉으로 조심스럽게 제거하였다. 막 바닥에 이동한 세포를 70% 에탄올에 10분간 고정한 후 0.25% 크리스탈 바이올렛에 5분간 염색하였다. TRANSWELL® 인서트를 물로 세척하고 건조시킨 다음 멤브레인을 유리 슬라이드에 물에 용해된 50% 글리세롤로 장착하고 즉시 이미지화했다. TRANSWELL® 실험은 생물학적 및 기술적 삼중으로 수행되었으며 각 반복에 대해 막의 대표 이미지 2개를 10x 배율로 촬영했다. 이동된 세포 수는 ImageJ를 사용하여 자동으로 계산되었으며 평균 세포 수가 표시되었다. 세포 이동 정도는 3개의 생물학적 복제물과 3개의 기술적 복제물로부터 웰당 2개의 현미경 영역에서 이동된 세포의 평균 수로 표현되었다.
PBMC 면역조절 활성의 특성화.
PBMC는 이전에 설명된 대로 추출되었다(Mallone et al., 2011). 간단히 말하면, PBMC는 Ficoll/Lymphoprep 구배(Stemcell)를 사용하여 혈액 샘플에서 분리하고 80°C에서 냉동한 후 액체 질소에 보관했다. 실험을 위해 24웰 플레이트에 250,000 PBMC/웰을 시딩했다. PBMC를 37°C에서 14시간 동안 IL-1β(50ng/mL), IL-6(10ng/mL)로 자극하고 37°C에서 4시간 동안 PMA/Ionomycin/Monensin(각각 40ng/mL, 1mg/mL, 2mg/mL)으로 자극했다. 처리되지 않은 대조군을 음성 대조군으로 사용하였다. 지시된 경우, PBMC는 10% v/v의 최종 농도에서 박테리아 상등액 또는 박테리아 배지 대조군을 사용하여 37℃에서 30분 동안 전처리되었다. PBMC는 자극되지 않고 처리되지 않은 인간 PBMC에 대한 항체 적정 최적화를 수행한 후 결정된 희석액을 사용하여 다음 세포 마커에 대해 염색되었다: CD3, CD4, CD8, CD69, TCRγδ, CD56, CD11b, CD11c 및 CD80. PBMC는 최종적으로 Cytoflex S(Beckman Coulter)로 분석되었고 데이터는 FloJo V10으로 분석되었다.
PBMC 배양 상청액에 존재하는 사이토카인을 특성화하기 위해, 상기 기재된 바와 같이 자극된 PBMC로부터의 세포 배양 배지 상청액을 수집하고 -80℃에서 보관하였다. 이후 이들 상층액을 해동하여 LEGENDplex 인간 염증 패널 I 분석(BioLegend)에 사용하여 사이토카인 생산(IL-1β, IFN-α2, IFN-γ, TNF, MCP-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-18, IL-23 및 GM- CSF)에 대한 효과를 확인했다. 희석되지 않은 상등액을 특정 분석물에 대한 항체에 접합된 포획 비드와 함께 배양했다. 세척 후, 비오티닐화된 검출 항체 혼합물을 첨가하여 "포획 비드-분석물-검출 항체" 샌드위치를 만든다. 스트렙타비딘-피코에리트린(SA-PE)을 첨가하여 비오틴화된 검출 항체에 결합한다. 최종 세척 후, 혼합물은 비드가 크기와 내부 형광 강도에 따라 구별되는 유동 세포측정법으로 분석된다. 사이토카인 농도는 PE 형광과 BioLegend의 LEGENDplex 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 알려진 사이토카인 농도의 표준 곡선과 비교하여 결정된다. 비드의 독특한 크기와 형광 특성으로 인해 13가지 사이토카인을 동시에 측정할 수 있다.
경상피전기저항(Trans-Epithelial Electrical Resistance; TEER)을 이용한 상피 장벽 무결성 분석.
장벽 완전성의 손실을 방지하는 MH23의 능력은 T84 장 상피 세포의 융합성 단층에 걸친 경상피 전기 저항을 측정함으로써 평가되었다. T84 세포는 CellBank Australia에서 구입하여 5% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle Medium Nutrient Mixture 12(DMEM/F12, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양되었다. T84 세포를 400μl 배지에서 웰당 60,000개 세포의 밀도로 0.4μm 기공 크기(PSHT010R5)를 갖는 24웰 Millicell 폴리카보네이트 세포 배양 삽입물에 시딩하고, 24ml의 배지를 단일 웰 피더 트레이에 첨가했다. 두 구획의 미디어 교체는 이틀마다 수행되었다. 배양 7일 후, 세포 배양 삽입물이 포함된 플레이트 어셈블리의 상부를 피더 트레이에서 24웰 수용 트레이(PSMW010R5)로 옮겼으며, 각 웰에는 800μl 배지가 들어 있다. 각 우물의 TEER 값은 Millicell ERS-2 전압계를 사용하여 매일 측정되었다. 모든 웰의 셀이 1500Ω 이상의 안정적인 TEER 판독값에 도달하면 실험이 시작되었다. Tofacitinib(75μM), 3kDa 여과된 박테리아 배지(TY) 또는 T84 배지에서 5%, 10% 또는 20%로 희석된 3kDa 여과된 MH23 박테리아 상등액을 정점 구획에 첨가했다. 1시간 전 처리 후 IFNγ(50ng/ml)를 기저외측에 첨가하여 장벽 무결성을 파괴하고 48시간 처리 후에 제거했다. 24시간마다 처리제와 배지를 새로 고치고 TEER 값을 두 번 측정했다. 각각 중복 측정된 2개의 생물학적 복제물로부터의 데이터는 대조군(처리되지 않은 T84 세포)과 비교하여 TEER 값의 백분율 차이로 제시되었다. 통계적 유의성은 짝을 이루지 않은 t-검정에 의해 결정되었다.
Maestro Pro 시스템을 사용하여 장벽 무결성의 회복을 촉진하는 MH23의 능력도 평가했다. 간략하게, T84 세포는 T75 플라스크 내 10% 열 불활성화 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 (DMEM/F12)에서 37℃, 5% CO2에서 대략 75% 합류할 때까지 성장시켰다. 세포를 96웰 CytoView-Z 플레이트에 총 0.2mL/웰로 0.1 x 106개 세포의 밀도로 시딩하고 Maestro Pro 시스템(Axion BioSystems, 미국 조지아주 애틀랜타 소재)에서 37°C, 5% CO2에서 배양했다. 배지는 3일마다 새로 고쳐졌다. 안정적인 TEER 측정이 확립되면(파종 후 약 100시간), 세포를 재조합 인간 IFNγ(100ng/mL, R&D 시스템, 미국 미네소타주 미니애폴리스)로 자극했다. 자극 후 72시간에 세포를 dPBS(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 세척하고 배지를 DMEM/F12로만 교체하거나 Pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC; 50μM), 1x YG/가 보충된 DMEM/F12로 교체했다. V 배지 대조 또는 이전에 설명한 대로 Amberlite XAD-7 수지를 사용하여 제조된 1x MH23-3 박테리아 배양 상청액 추출물. 모든 조건은 4중으로 분석되었다. 처리 후 5시간에 TEER 측정값을 기록하고, 관찰된 처리 효과를 대조군(처리되지 않은 T84 세포)과 비교하여 TEER 값의 백분율 차이로 표시했습니다. 통계적 유의성은 짝을 이루지 않은 t-검정에 의해 결정되었다.
대사분석(Metabolomic analysis)
M. 파에시스 MH23에 의해 생성된 대사산물을 평가하기 위해, 6개의 독립적인 콜로니를 접종하고 초기 정지기까지 성장시켰다. 그런 다음 각 종자 배양액을 사용하여 6개의 생물학적 복제물에서 12개의 기술적 복제물을 생성하는 YG/V의 두 가지 기술적 복제물을 접종했다. 기술적인 복제물을 초기 정지 단계까지 성장시킨 다음, 혐기성 챔버에서 3분간 12,550g으로 원심분리한 후 세포가 없는 배양 상층액을 수확했다. 배양 상청액을 드라이아이스에 급속 냉동시킨 후 테스트할 때까지 -80℃에 보관했다.
샘플 분석은 MS-Omics(덴마크)에 의해 다음과 같이 수행되었다. 분석은 Thermo Q Exactive HF MS와 연결된 Thermo Scientific Vanquish LC를 사용하여 수행되었다. 전기분무 이온화 인터페이스가 이온화 소스로 사용되었다. 분석은 음이온 및 양이온화 모드에서 수행되었다. UPLC는 Catalin et al.에 의해 설명된 프로토콜의 약간 수정된 버전을 사용하여 수행되었다. (UPLC/MS Monitoring of Water-Soluble Vitamin Bs in Cell Culture Media in Minutes, Water Application note 2011, 720004042en). 피크 영역은 Liquid Discoverer 3.1(Thermo Scientific)을 사용하여 추출되었다. 화합물의 식별은 4가지 레벨에서 수행되었다; 레벨 1: 머무름 시간(사내 정품 표준과 비교), 정확한 질량(허용 편차 3ppm) 및 MS/MS 스펙트럼으로 식별, 레벨 2a: 보유 시간별 식별(사내 정품 표준과 비교), 정확한 질량(허용 편차 3ppm), 레벨 2b: 정확한 질량(3ppm의 허용 편차 포함) 및 MS/MS 스펙트럼으로 식별, 레벨 3: 정확한 질량만으로 식별(허용 편차 3ppm).
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시 내용은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서의 임의의 참고문헌의 인용은 그러한 참고문헌이 본 출원에 대한 "선행 기술"로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
명세서 전반에 걸쳐, 본 발명을 임의의 하나의 실시예 또는 특정 특징들의 집합으로 제한하지 않고 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하는 것이 목적이다. 그러므로 당업자는 본 개시 내용에 비추어 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 예시된 특정 실시예에서 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 그러한 모든 수정 및 변경은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도되었다.
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Claims (153)

  1. V21/006223, V21/006224, V21/006225 또는 V21/006226 중 어느 하나의 수탁번호로 기탁된 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 균주 또는 그 변이체의 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 적어도 부분적으로 분리된 세포인 것을 특징으로 하는, 세포.
  3. V21/006223, V21/006224, V21/006225 또는 V21/006226 중 어느 하나의 수탁번호로 기탁된 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 균주 또는 그 변이체의 생물학적으로 순수한 배양물.
  4. 제1항 또는 제2항의 세포, 또는 제3항의 배양물을 포함하는 조성물.
  5. 서열번호 1-24 중 어느 하나 이상과 약 97.5%, 98%, 98.5% 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖거나, 서열번호 1-24 중 어느 하나 이상으로 표시되는 16S rRNA 유전자 서열을 갖는 박테리아 균주를 포함하는 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  7. 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 종의 박테리아 균주의 16S rRNA 서열과 약 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 박테리아 균주와 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  8. M. 파에시스(M. faecis) 및 M. 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 박테리아 균주와 함께 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 적어도 부분적으로 분리된 것인 조성물.
  11. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아성 균주는 살아 있거나 죽은 것인 조성물.
  12. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 건조된 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐, 정제, 환제, 트로키제, 로젠지, 분말 또는 과립으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 동결건조, 분무 건조, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이들의 조합에 의해 건조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 소화관으로의 전달을 위해 제제화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 프리바이오틱을 추가로 포함하는 조성물.
  17. 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 박테리아 균주를 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 박테리아 균주는 적어도 부분적으로 분리된 것인 조성물.
  19. 제4항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 클로스트리듐(Clostridium) 속의 박테리아를 포함하지 않는 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 세포 내에서 신호 변환 및 활성화 전사인자 3(signal transducer and activator of transcription 3; STAT3) 신호전달을 약화시키거나 손상시키는 제제를 생성하는 것을 특징으로 하는 세포, 배양물 또는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 제제는 소분자, 펩티드 또는 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세포, 배양물 또는 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 제제는 박테리아에 의해 방출되는 세포, 배양물 또는 조성물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 STAT3, JAK2, TYK 또는 IL-23 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 세포, 배양물 또는 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 프로피오네이트, 락테이트, 아세테이트 및 포름산염을 포함하거나 이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 대사산물을 생성하는 것을 특징으로 하는 세포, 배양물 또는 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 부티레이트를 생성하지 않는 것을 특징으로 하는 세포, 배양물 또는 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 비타민 B12를 생성하는 세포, 배양물 또는 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종인 것을 특징으로 하는 세포, 배양물 또는 조성물.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 락타리스(M. lactaris) 종인 것을 특징으로 하는 세포, 배양물 또는 조성물.
  29. 제4항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 식품 또는 음료 제품.
  30. 장 장벽 기능을 회복 또는 개선시키기 위하여 개체에 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주를 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 장 장벽 기능을 회복 또는 개선하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 락타리스(M. lactaris) 종인 특징으로 하는 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장 장벽 기능의 회복 또는 개선은 (i) 뮤신의 질 및/또는 양의 증가; (ii) 밀착연접 단백질의 완전성 개선; (iii) 내강 내용물(luminal contents)의 전신 순환으로의 이동 감소; 또는 (iv) 장궤양 및/또는 장 상처의 감소 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 내강 내용물은 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)를 포함하는 방법.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장 장벽 기능 장애의 회복 또는 개선이 대상체의 전신 염증의 감소를 초래하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 개체로부터의 샘플 내 염증성 사이토카인(예를 들어, IL-1β, IL-8, IL-6 및 TNF)의 수준이 미리 결정된 역치를 초과하는 경우 개체에서 전신 염증이 있는 것으로 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 개체의 점막 치유를 유도하기 위하여; 개체에 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주를 상피 세포 이동 및/또는 증식을 유도하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 개체의 점막 치유를 유도 또는 강화하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 락타리스(M. lactaris) 종인 특징으로 하는 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 점막 치유는 하나 이상의 대변 또는 혈청 마커를 사용하여 측정되는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 하나 이상의 대변 마커는 칼프로텍틴, 락토페린, 메탈로프로테이나제(MMP)-9 및 리포칼린-2를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 점막 치유는 내시경 점수를 사용하여 측정되는 방법.
  47. 치료 유효량의 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주를 개체에 투여하여 개체의 염증을 감소시키는 단계를 포함하는, 개체의 염증을 감소시키는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 락타리스(M. lactaris) 종인 특징으로 하는 방법.
  52. 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증은 장 환경에 국한되거나 전신 염증인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 (예를 들어, NFκB를 감소 또는 억제함으로써) NFκB 경로를 약화시키는 것인 방법.
  54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아성 균주는 TNF, IFN-γ, IL-1β, IL-8 및 MCP-1을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인 또는 케모카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 표적 세포에서 STAT3 신호전달의 활성화를 차단하거나 억제하기 위해, 표적 세포를 메디테라네이박터 속의 박테리아 세포 제제의 적어도 하나의 가용성 성분과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포에서 STAT3 신호전달의 활성화를 차단하거나 억제하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 락타리스(M. lactaris) 종인 특징으로 하는 방법.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포는 리포터 세포(예를 들어, HEK 세포), 면역 세포(예를 들어, Th17 면역 세포), 상피 세포 및 내피 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 세포 제제는 박테리아 세포 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 가용성 성분은 상기 박테리아 세포 배양물의 상등액(supernatant)을 포함하는 방법.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 성분은 박테리아 세포가 실질적으로 고갈된 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 세포 제제는 박테리아 세포 펠릿을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 가용성 성분은 용해된 세포의 가용성 분획을 포함하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 가용성 분획은 원심분리에 의해 불용성 세포 분획으로부터 실질적으로 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 개체에 메디테라네이박터 속의 박테리아 균주를 투여하여 개체의 장 환경에서 STAT3 신호전달을 차단하거나 억제하는 단계를 포함하는, 개체의 장 환경에서 STAT3 신호전달을 차단하거나 억제하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 락타리스(M. lactaris) 종인 특징으로 하는 방법.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포(예를 들어, Th17 면역 세포), 상피 세포 또는 내피 세포인 방법.
  74. 제68항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 상피 세포이고, 상기 박테리아 균주 또는 분자는 대상체에서 IL-22의 생성을 증가시키는 방법.
  75. 제68항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 STAT3의 직접 억제제 또는 간접 억제제인 분자를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 IL-23 폴리펩티드, JAK2 폴리펩티드, TYK2 폴리펩티드 또는 STAT3 폴리펩티드 중 적어도 하나를 직접적으로 억제하는 분자를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제30항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 프로피오네이트, 락테이트, 아세테이트 및 포름산염 중 하나 이상의 대사산물을 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제30항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아성 균주는 비타민 B12를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제30항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 부티레이트를 생성하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제30항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종의 박테리아 균주의 16S rRNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97% 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖거나,
    상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 박테리아 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제30항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 서열번호 1-24 중 하나 이상과 적어도 97.5%, 98%, 98.5% 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖거나,
    상기 박테리아 균주는 서열번호 1-24 중 어느 하나 이상으로 표시되는 16S rRNA 유전자 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제30항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 V21/006223, V21/006224, V21/006225 또는 V21/006226 중 어느 하나의 수탁번호로 기탁된 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 균주 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제30항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 적어도 부분적으로 단리된 것인 방법.
  84. 제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물로 제제화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 조성물은 건조된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 조성물은 입자, 과립 및 분말을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 조성물은 동결건조, 분무 건조, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이들의 조합에 의해 건조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 경구 투여용으로 제제화되는 것인 방법.
  89. 유효량의 메디테라네이박터속 박테리아 균주를 개체에 투여하여 염증성 또는 자가면역 장애를 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는, 개체에서 염증성 또는 자가면역 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종인 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 락타리스(M. lactaris) 종인 특징으로 하는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 염증성 또는 자가면역 장애는 염증성 장 질환(크론병 또는 궤양성 대장염 등); 천식(알레르기성 천식 또는 호중구성 천식 등); 관절염(류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 또는 청소년 특발성 관절염 등); 지방간 질환(비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 등); 강직성 척추염; 건선; 전신홍반루푸스(SLE); 경피증; 쇼그렌 증후군; 혈관염; 제1형 당뇨병을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  95. 제89항 또는 제94항에 있어서, 상기 염증성 또는 자가면역 장애는 염증성 장질환(IBD)인 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제89항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아성 균주는 개체에 투여될 때 개체의 적어도 하나의 세포에서 STAT3 신호전달을 차단하거나 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 세포는 상피 세포, 면역 세포(예를 들어, Th17 면역 세포) 또는 내피 세포인 방법.
  98. 제89항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 프로피오네이트, 락테이트, 아세테이트 및 포름산염을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물을 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제89항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 부티레이트를 생성하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제89항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 비타민 B12를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제89항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 종의 박테리아 균주의 16S rRNA 서열과 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 제89항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 서열번호 1-24 중 어느 하나 이상과 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 이상 동일한 16S rRNA 서열을 갖거나, 상기 박테리아 균주 서열번호 1-24 중 어느 하나 이상으로 표시되는 16S rRNA 유전자 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 제89항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 적어도 부분적으로 단리된 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 제89항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 약학 조성물로 제제화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 조성물은 건조된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 조성물은 입자, 과립 및 분말을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
  107. 제104항 또는 제105항에 있어서, 상기 조성물은 동결건조, 분무 건조, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이들의 조합에 의해 건조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  108. 제89항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증제가 상기 개체에 공동 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 항염증제는 5-아미노살리큘레이트, 코르티코스테로이드, 아자티오프린(azathioprine), 인플릭시맙(infliximab) 및 아달리무맙(adalimumab)을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
  110. 제30항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 개체에 조성물을 투여하기 전에 개체에 M. 파에시스(M. faecis) 장내 세균이 결핍되어 있음을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 개체에서 결핍을 확인하는 단계는 16S rRNA 서열분석 및/또는 전체 게놈 서열분석에 의해 개체의 대변 내 M. 파에시스(M. faecis) 박테리아를 측정하는 단계을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  112. 제30항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 살아 있거나 죽은 것임을 특징으로 하는 조성물.
  113. 제30항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 프리바이오틱을 추가로 포함하는 조성물.
  114. 제30항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 박테리아 균주를 추가로 포함하는 조성물.
  115. 제30항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  116. 제30항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  117. 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주를 포함하는, 치료에 사용하기 위한 조성물.
  118. 제117항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 조성물.
  119. 제118항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  120. 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis)의 박테리아 균주를 포함하는, 치료에 사용하기 위한 조성물.
  121. 메디테라네이박터 락타리스(Mediterraneibacter lactaris)의 박테리아 균주를 포함하는, 치료에 사용하기 위한 조성물.
  122. 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주를 포함하는, 염증성 또는 자가면역 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
  123. 제122항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 조성물.
  124. 제123항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  125. 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 박테리아 균주를 포함하는, 염증성 또는 자가면역 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
  126. 메디테라네이박터 락타리스(Mediterraneibacter lactaris)의 박테리아 균주를 포함하는, 염증성 또는 자가면역 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
  127. 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주의, 염증성 또는 자가면역 장애 치료용 약제를 제조하기 위한 용도.
  128. 제127항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 용도.
  129. 제128항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 용도.
  130. 염증성 또는 자가면역 장애 치료용 약제 제조에 있어서 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 박테리아 균주의 용도.
  131. 염증성 또는 자가면역 장애 치료용 약제 제조에 있어서 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter lactaris) 박테리아 균주의 용도.
  132. 제122항 내지 제131항에 있어서, 상기 염증성 또는 자가면역 장애는 염증성 장 질환(크론병 또는 궤양성 대장염 등); 천식(알레르기성 천식 또는 호중구성 천식 등); 관절염(류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 또는 청소년 특발성 관절염 등); 지방간 질환(비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 등); 강직성 척추염; 건선; 전신홍반루푸스(SLE); 경피증; 쇼그렌 증후군; 혈관염; 제1형 당뇨병을 포함하는 군으로부터 선택되는, 조성물 또는 용도.
  133. 제122항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 또는 자가면역 장애는 염증성 장 질환(예를 들어, 크론병 또는 궤양성 대장염)인 조성물 또는 용도.
  134. 제122항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 V21/006223, V21/006224, V21/006225 또는 V21/006226 중 어느 하나의 수탁번호로 기탁된 메디테라네이박터 파에시스(Mediterraneibacter faecis) 균주 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  135. 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주; 및 항염증제를 포함하는, 염증성 또는 자가면역 장애를 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
  136. 제135항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 조성물.
  137. 제136항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  138. 제135항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종인 것을 특징으로 하는 조성물.
  139. 제135항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 락타리스(M. lactaris) 종인 것을 특징으로 하는 조성물.
  140. 제135항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항염증제는 5-아미노살리큘레이트, 코르티코스테로이드, 아자티오프린(azathioprine), 인플릭시맙(infliximab) 및 아달리무맙(adalimumab)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  141. 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주; 및 영양 보충제를 포함하는, 염증성 또는 자가면역 장애를 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
  142. 제141항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 조성물.
  143. 제142항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  144. 제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종인 것을 특징으로 하는 조성물.
  145. 제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 락타리스(M. lactaris) 종인 것을 특징으로 하는 조성물.
  146. 개체의 건강을 유지하거나 개선하기 위하여, M. 파에시스(M. faecis) 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 개체의 건강을 개선 또는 유지하는 방법.
  147. 제146항에 있어서, 상기 개체에 영양 보충제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  148. 메디테라네이박터(Mediterraneibacter) 속의 박테리아 균주; 및 영양 보충제를 포함하는, 식용 또는 음용 제품.
  149. 제148항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 및 락타리스(M. lactaris)의 MRCA의 계통발생적 후손인 것을 특징으로 하는 제품.
  150. 제149항에 있어서, 상기 MRCA는 게놈 분류 데이터베이스(GTDB)의 r95로부터의 bac120 계통발생수의 노드 52630에서 정의되는 것을 특징으로 하는 제품.
  151. 제148항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 파에시스(M. faecis) 종인 것을 특징으로 하는 제품.
  152. 제148항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 M. 락타리스(M. lactaris) 종인 것을 특징으로 하는 제품.
  153. 제148항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영양 보충제는 프리바이오틱인 제품.
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