KR20240083173A - 산성 조성물에서 피코시아닌의 개선된 안정화 - Google Patents

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악셀 아딴
올리비에 까냑
브라이언 에이빌즈
제니퍼 미첼 자비스
조디 레너 낸츠
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더 윌리엄슨 그룹 엘엘씨
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Abstract

본 기술은 일반적으로 안정화된 피코시아닌을 포함하는 산성 조성물을 비롯하여 이러한 산성 조성물을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

산성 조성물에서 피코시아닌의 개선된 안정화
본 기술은 일반적으로 안정화된 피코시아닌을 포함하는 산성 조성물을 비롯하여, 이러한 산성 조성물을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다.
피코시아닌은 그들이 첨가되는 제품에 파란색 색상을 부여하는 식품 색소이다. 스피룰리나로부터 추출된 피코시아닌은 오늘날 FDA가 승인한 유일한 천연 파란색 색소이다 (FR Doc No: 2013-19550). 이것은 식품에서 파란색 색소로서 사용을 위해 분말 형태, 또는 액체 형태로 판매된다.
그러나 스피룰리나-유래 피코시아닌은 5 이하의 산성 pH에서 불안정하다는 단점을 가져서, 색소 손실 및 침전을 초래하여, 이의 사용이 제한된다. 최선의 경우, 안정성 상실이 대략 pH 4에서 발생된다 (스피룰리나-유래 피코시아닌 Linablue®의 기술 사양 참조; http://www.dlt-spl.co.jp/business/en/spirulina/ linablue.html). 결론적으로, 스피룰리나-유래 피코시아닌이 식품 색소로서 또는 이의 항산화 성질을 위해 사용될 수 없는, 많은 산성 식품 조성물, 특히 탄산 및 비-탄산 음료가 존재한다.
스피룰리나-유래 피코시아닌과 대조적으로, 갈디에리아 (Galdieria) 또는 시아니디오피카에 (Cyanidiophycae)로부터 추출된 피코시아닌이 산성 pH에 대한 내성 능력을 갖는다는 것이, 이전에 WO 2017/050918에서 입증되었고, 이를 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
그러나, 산업적 상황에서 산성 음료에서 피코시아닌의 사용은 훨씬 더 복잡하다. 실제로, 저온살균같은, 열 처리 이후에, 가속 노화 시험을 후속하여, 피코시아닌이 상당히 손실되었고, 이러한 손실은 녹색 색조가 출현되면서 색상의 점진적인 변화와 연관있다는 것이 시험에서 확인되었다. 조건에 따라서, 이들 색상 변화는 총체적이다. 이러한 안정성 결여는 제품 마케팅에 문제가 될 수 있다.
스피룰리나-유래 피코시아닌의 안정화를 위해서, 람다-카라기난같은 황산화 다당류가 이미 개시되어 있다. 그러나, 식품 조성물에 대량의 첨가제를 첨가하는 것은 적합하지 않다.
이러한 관점에서, 산성 조성물, 특히 산성 음료의 상황에서 피코시아닌을 안정화시키거나 또는 피코시아닌에 의해 제공되는 색소를 안정화시키는 방법을 발견하는 것이 필요하다.
다양한 양태에 따라서, 본 기술은 피코시아닌을 포함하는 산성 조성물에 관한 것으로서, 피코시아닌은 약 0.001 wt%와 약 0.1 wt% 사이 범위의 양으로 조성물에 존재한다.
다양한 양태에 따라서, 본 기술은 본 명세서에 정의된 바와 같은 산성 조성물을 포함하는 탄산 음료에 관한 것이다.
다양한 양태에 따라서, 본 기술은 본 명세서에 정의된 바와 같은 산성 조성물로 이루어지는 탄산 음료에 관한 것이다.
본 발명자는 산성 조성물 중 피코시아닌의 안정화를 위해서 소량의 황산화 다당류를 사용할 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 이와 같이, 일 양태에 따라서, 본 기술은 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류를 포함하는 산성 조성물에 관한 것으로서, 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류는 약 0.20:1과 약 20:1 사이, 바람직하게 약 0.25:1과 약 10:1 사이의 비 또는 약 0.3:1과 약 10:1 사이, 바람직하게 약 1:1과 약 10:1 사이, 여전히 바람직하게 약 0.3:1과 약 0.6:1 사이, 약 0.9:1과 약 2.4:1 사이 또는 약 0.3:1과 1.5 사이의 비로 조성물에 존재한다.
본 기술은 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류를 포함하는 산성 조성물에 관한 것으로서, 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류는 약 0.25:1과 약 1:1 사이의 비로 조성물에 존재한다.
다른 구현예에서, 본 기술은 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류를 포함하는 산성 조성물에 관한 것으로서, 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류는 약 0.25:1, 약 0.3:1, 약 1:3, 약 0.5:1, 약 0.75:1, 약 0.6:1, 약 1:1, 약 1.5:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 약 5:1 또는 약 6:1의 비로 조성물에 존재한다.
다양한 양태에 따라서, 본 기술은 갈디에리아 추출물을 포함하는 산성 조성물에 관한 것으로서, 갈디에리아 추출물은 약 0.004 wt%와 약 0.4 wt% 사이 범위의 양으로 조성물에 존재한다.
다양한 양태에 따라서, 본 기술은 본 명세서에 정의된 바와 같은 산성 조성물을 포함하는 식품에 관한 것이다.
다양한 양태에 따라서, 본 기술은 본 명세서에 정의된 바와 같은 산성 조성물로 이루어지는 식품에 관한 것이다.
다양한 양태에 따라서, 본 기술은 피코시아닌을 포함하는 농축 액상 조성물에 관한 것으로서, 피코시아닌은 약 50 mg/L와 약 2500 mg/L 사이 범위의 양으로 농축 조성물에 존재한다.
다양한 양태에 따라서, 본 기술은 본 명세서에 정의된 바와 같은 농축 액상 조성물을 포함하는 식품에 관한 것이다.
다양한 양태에 따라서, 본 기술은 본 명세서에 정의된 바와 같은 농축 액상 조성물로 이루어지는 식품에 관한 것이다.
본 개시의 다른 양태 및 특성은 첨부된 도면과 함께 특정 구현예의 하기 설명을 고찰 시 당업자에게 자명해 질 것이다.
본 개시에 기술되는 구현예의 모든 특성은 상호 배타적이지 않고, 서로 조합될 수 있다. 예를 들어, 한 구현예의 구성요소는 추가 언급없이 다른 구현예에서 이용될 수 있다. 하기의 첨부된 도면을 참조하여 특정 구현예의 구체적인 설명이 하기 본 명세서에 제공된다:
도 1 은 모델 음료 시스템에서 4시간 동안 피코시아닌의 열 안정성 시험의 결과를 보여주는 도면으로서, 모델 음료 시스템은 0.1%, 0.2%, 또는 0.4% 갈디에리아 추출물을 포함하고, 육안 비교를 위해서 가열 후 모두 0.1%로 희석되었다.
도 2A 는 비타민 C가 존재하거나 또는 부재하는 0.2% 갈디에리아 추출물을 포함하는 전해질 음료 및 제1 모델 시리즈에서 피코시아닌의 8-주 안정성을 보여주는 도면이다.
도 2B 는 비타민 C가 존재하거나 또는 부재하는 0.2% 갈디에리아 추출물을 포함하는 전해질 음료 및 제1 모델 시리즈에서 피코시아닌의 8-주 안정성 후 결과표를 도시한다.
도 3A 는 비타민 C가 존재하거나 또는 부재하는 0.2% 및 0.4% 갈디에리아 추출물을 포함하는 제2 모델 음료 시리즈에서 피코시아닌의 8-주 안정성을 보여주는 도면이다.
도 3B 는 비타민 C가 존재하거나 또는 부재하는 0.2% 및 0.4% 갈디에리아 추출물을 포함하는 제2 모델 음료 시리즈에서 피코시아닌의 8-주 안정성 후 결과 표를 도시한다.
도 4 는 0.01% 및 0.02% 갈디에리아 추출물이 존재하는 모델 음료에 대한 안정성 시험 결과를 보여주는 도면이다.
도 5 는 0.01% 갈디에리아 추출물을 포함하는 모델 음료의 안정성에 대한 고온, 단시간 저온살균 (HTST, 본 출원에서는 또한 급속 저온살균이라고도 함)의 저온살균 효과를 보여주는 도면이다.
도 6 은 0.01% 갈디에리아 추출물을 포함하는 모델 음료의 안정성에 대한 람다 카라기난의 효과를 보여주는 도면이다.
도 7 은 갈디에리아 추출물 -카라기난 (5:1) 함유 음료와 상업적으로 시판되는 음료 Gatorade® 및 Powerade® (dE CMC 1.99)의 비교를 도시한다.
도 8 은 상이한 비율의 갈디에리아 추출물:람다 카라기난을 포함하는 음료의 dE CMC에 대한 HTST 저온살균의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 9 는 실시예 10ter의 상이한 음료의 HTST 후 평균 dE CMC를 표시한 도표이다.
도 10 은 실시예 10ter에 따른 HTST 이전 (좌측 병) 및 이후 (우측 병)에, 상이한 함량의 갈디에리아 추출물 (음료의 총 중량에 대해 0,1 중량% 또는 0,2 중량%)을 포함하는 음료의 도면이다.
도 11 은 실시예 10bis 및 10ter에 따른 상이한 음료의 광 시험 후 평균 dE CMC를 보여주는 도표이다.
도 12 는 실시예 10bis 및 10ter에 따른 광 시험 이전 (좌측 병) 및 이후 (우측 병)에, 비타민 C가 존재하거나 또는 부재하는 상이한 함량의 갈디에리아 추출물 (음료의 총 중량에 대해 0,1 중량% 또는 0,2 중량%)을 포함하는 몇개 음료의 도면이다.
도 13 은 실시예 10ter에 따른 상이한 음료의 가속 안정성 시험 이후 평균 dE CMC를 표시하는 도표이다.
도 14 는 실시예 10ter에 따른 가속 안정성 시험 이전 (좌측 병) 및 이후 (우측 병)에 상이한 함량의 갈디에리아 추출물 (음료의 총 중량에 대해 0,1 중량% 또는 0,2 중량%)을 포함하는 몇개 음료의 도면이다.
도 15A 는 상이한 pH에서 5:1 비로 갈디에리아 추출물 및 람다 카라기난을 포함하는 음료의 도면이다.
도 15B 는 상이한 pH에서 5:1 비로 갈디에리아 추출물 및 람다 카라기난을 포함하는 음료의 색상 측정표이다.
도 16A 는 상이한 pH에서 5:1 비로 스피룰리나 추출물 및 람다 카라기난을 포함하는 음료의 도면이다.
도 16B 는 상이한 pH에서 5:1 비로 스피룰리나 추출물 및 람다 카라기난을 포함하는 음료의 색상 측정표이다.
도 17A 는 상이한 pH에서 1:1 비로 갈디에리아 추출물 및 람다 카라기난을 포함하는 음료의 도면이다.
도 17B 는 상이한 pH에서 1:1 비로 갈디에리아 추출물 및 람다 카라기난을 포함하는 음료의 색상 측정표이다.
도 18A 는 상이한 pH에서 1:1 비로 스피룰리나 추출물 및 람다 카라기난을 포함하는 음료의 도면이다.
도 18B 는 상이한 pH에서 1:1 비로 스피룰리나 추출물 및 람다 카라기난을 포함하는 음료의 색상 측정표이다.
도 19 는 람다 카라기난의 함량이 상이하고, pH가 상이한, 갈디에리아 또는 스피룰리나 추출물을 포함하는 몇개 음료의 HTST 후 평균 dE CMC를 표시한 도표이다.
도 20 은 람다 카라기난의 함량이 상이하고, pH 3.0 및 4.0인, 갈디에리아 또는 스피룰리나 추출물을 포함하는 몇개 음료의 HTST 후 평균 dE CMC를 표시하는 도표이다.
본 기술은 하기에 더욱 상세하게 설명된다. 이 설명은 기술을 구현할 수 있는 모든 상이한 방식, 또는 본 기술에 첨가될 수 있는 모든 특성에 관한 상세한 목록을 의도하는 것이 아니다. 예를 들어, 일 구현예와 관련하여 예시된 특성은 다른 구현예에 통합될 수 있고, 특정 구현예와 관련하여 예시된 특성이 해당 구현예에서 삭제될 수도 있다. 또한, 본 명세서에서 제안되는 다양한 구현예에 대한 수많은 변동 및 첨가는 변동 및 첨가가 본 기술을 벗어나지 않는 본 개시의 견지에서 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 하기 설명은 기술의 일부 특정 구현예를 예시하려는 의도이고, 이의 모든 순열, 조합, 및 변동을 철저하게 명시하려는 것이 아니다.
본 명세서에서 사용되는, 단수형 "한", "일" 및 "그"는 문맥에서 달리 명확하게 명시하지 않으면 다수 참조를 포함한다.
본 명세서에서 종료점에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내에 숨겨진 모든 수치를 포함하려는 의도이다 (예를 들어, 1 내지 5의 언급은 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 4.32, 및 5를 포함함).
용어 "약"은 본 명세서에서 명확하게 또는 그렇지 않게 사용되고, 본 명세서에서 제공되는 모든 분량은 실제 제공되는 값을 지칭하는 것을 의미하며, 또한 그러한 소정 값에 대한 실험 및/또는 측정 조건에 기인하여 등가량 및 근사치를 포함해, 당분야의 통상의 기술을 기반으로 합리적으로 추론될 수 있는 그러한 소정 값에 대한 근사치를 지칭하는 것을 의미한다. 예를 들어, 소정 값 또는 범위의 상황에서 용어 "약"은 소정 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게 15% 이내, 보다 바람직하게 10% 이내, 보다 바람직하게 9% 이내, 보다 바람직하게 8% 이내, 보다 바람직하게 7% 이내, 보다 바람직하게 6% 이내, 및 보다 바람직하게 5% 이내인 값 또는 범위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 경우 "및/또는"의 표현은 2개의 명시된 특성 또는 성분의 각각이 나머지와 함께이거나 또는 없는 특정 개시로서 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 본 명세서에서 개별적으로 제시되는 것처럼, (i) A, (ii) B, 및 (iii) A 및 B의 각각에 대한 특정 개시로서 간주되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "포함하다"는 이 단어에 후속되는 항목을 포함하지만, 특별히 언급되지 않은 항목을 배제하는 것은 아님을 의미하는 이의 비제한적인 의미로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는, 표현 "wt%" 및 "%"는 달리 정의하지 않으면, 조성물의 총 중량에 대한 성분의 중량%로서 정의된다.
본 기술의 의미에서, 피코시아닌의 "안정성"은 열처리 및/또는 장기간 저장 하에 산성 환경에서 이의 색상, 강도 및 투명도를 유지하는 이의 능력을 의미한다.
피코시아닌은 주위 온도에서 암실 또는 광선 중에서 장기간 저장 및/또는 고온에 노출 이후에 침전이 적고/적거나, 흐릿함이 적고/적거나 상당한 색변화가 적을 때 개선되거나 또는 증강된 안정성을 갖는 것으로 간주된다. 육안으로 침전 및 흐릿함을 관찰할 수 있고 색변화는 람다 최대값을 연구하는 분광광도측정법을 통해서 또는 dE CMC를 결정하는 비색법을 통해서 추적할 수 있다.
색상은 수성 용액 경우에 분광광도계를 사용하고, 반고체 및 고체 조성물의 경우에 DigiEye 색측정법 및 이미지화 시스템을 사용해 측정된다. CIE L*a*b* 값 및 색상각 (h)이 계산된다. 색도계 측정은 반대색설을 기반으로 색의 수치를 제공하고, 여기서 CIE L*a*b* 는 다음을 나타낸다 (CIELAB 색공간):
L* 척도: 명 대 암으로서, 낮은 숫자 (0-50)는 암을 나타내고, 높은 숫자 (51 - 100)는 명을 나타낸다.
a* 척도: 붉은색 대 녹색으로서, 양수는 붉은색을 나타내고, 음수는 녹색을 나타낸다.
b* 척도: 노란색 대 파란색으로서, 양수는 노란색을 나타내고, 음수는 파란색을 나타낸다.
dE는 색차의 전반적인 척도이다. 색 변화는 2의 dE CMC로부터 가시적인 것으로 간주되며, dE CMC가 높을수록 피코시아닌의 불안정성이 높아진다. 3 이하의 dE CMC는 가시적인 변화가 없음을 의미하는 것으로 간주된다.
산성 조건에서, 음으로 하전된 다중-황산화 카라기난, 예컨대, 예를 들어 람다 및 아이오타 카라기난은 양으로 하전된 피코시아닌과 복합체를 형성하여 응집을 방지하고, 색을 안정시키는 것으로 가정된다. 산성 조건에서, 예를 들어, 아이오타 및 람다 카라기난같은, 다중-황산화 카라기난의 첨가에 따라서 색상의 분명한 변화가 관찰된다.
일 구현예에서, 본 기술은 최종 제품에 사용되는 피코시아닌의 용량에 따라서, 색소 효과가 다소 확연하였다는 것을 보여준 실험에 기인한다. 반직관적으로, 조성물에 존재한 피코시아닌이 많을수록, 더 높은 불안정성이 얻어졌다. 다른 한편으로, 낮은 농도 사용 시, 색변화는 제한적이었고, 때때로 인간의 눈에 거의 보이지 않았다.
또한 카라기난의 첨가는 피코시아닌의 열 안정성을 개선시키는 것으로 확인되었다. 일반적으로, 고온, 단시간 저온살균 (HTST 저온살균, 급속 저온살균이라고도 함)에 노출될 때, 피코시아닌의 색은 점차 흐려진다.
피코시아닌 및 카라기난의 조합이 음료에서 파란색 1을 대체하는데 사용될 수 있는 색상을 생성하도록 허용한다는 것을 추가로 확인하였다. 특히, 바람직한 구현예에서, 본 기술에 따른 산성 조성물은 5:1의 비로 갈디에리아의 피코시아닌-카라기난 (1.5:1 피코시아닌: 카라기난)을 포함하고, 2.5 미만의 갈디에리아와 파란색 1 음료 사이의 dE CMC를 제공하므로, 파란색 1 함유 음료의 색에 부합하는 색을 제공한다.
농축된 피코시아닌 (예를 들어, 전형적으로 약 0.3%와 약 10% 사이의 피코시아닌을 포함하는 조성물)이 산성 조건에서 가열되었을 때, 녹색 추출물이 형성되었고, 이러한 녹색 추출물은 식품 및 음료 적용 분야에 사용될 수 있다는 것이 추가로 확인되었다. 따라서, 본 기술은 또한 시아니디알레스 (Cyanidiales) 목, 바람직하게 시아니디오스키존 (Cyanidioschyzon), 시아니디움 (Cyanidium) 또는 갈디에리아 (Galdieria) 속, 여전히 바람직하게 갈디에리아 술푸라리아 (Galdieria sulphuraria), 시아니디움 칼다리움 (Cyanidium caldarium), 또는 시아니디오스키존 메롤라에 (Cyanidioschyzon merolae) 종의 조류 또는 미세조류로부터 추출된 피코시아닌을 기반으로 하는 녹색 색소를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 기술에서 유용한 피코시아닌은 갈디에리아세아에 (Galdieriaceae)로부터 추출되고, 일부 예에서, 갈디에리아 (Galdieria)로부터 추출된 피코시아닌일 수 있다. 일부 예에서, 피코시아닌은 갈디에리아 추출물의 성분이다.
전형적으로, 분말 중 착색제는 E10=180의 10% 착색제 희석물의 흡광도를 나타내기 위해서 약 25%와 약 30% 사이의 피코시아닌을 포함한다. 예시 목적을 위해서, 1 g의 갈디에리아 추출물은 적어도 하나의 희석제 예컨대 물, 전화당, 수크로스, 및/또는 말토덱스트린과 혼합되어 약 0.25 g과 약 0.30 g 사이의 피코시아닌을 포함하게 된다.
일부 구현예에서, 본 기술의 피코시아닌은 추출된 피코시아닌이다. 피코시아닌은 당분야에 공지된 프로토콜, 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는, WO 2020/144331에 기술된 것과 같은 프로토콜을 사용해 갈디에리아로부터 추출될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 기술의 피코시아닌은 추출된 피코시아닌이다. 일부 구현예에서, 본 기술의 피코시아닌은 단리된 피코시아닌이다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 " 추출된" 및 "단리된"은 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98% 초과의 순도 또는 약 99% 초과의 순도를 생성하는, 크로마토그래피, 증류, 추출, 또는 유사한 기술을 사용하여, 천연 공급원 (예를 들어, 갈디에리아)로부터 단리된 성분을 의미한다.
일부 구현예에서, 본 기술의 피코시아닌은 정제된 피코시아닌, 특히 피코시아닌의 정제된 추출물이다. "정제된 추출물"이란, 피코시아닌을 유지하면서, 수용성 성분 (단백질, 이온, 당류)의 일부가 액체 분리 방법 예컨대 제한없이, 한외여과, 중공 섬유 여과, 또는 이온-교환 크로마토그래피, 당업자에게 공지된 방법을 통해 제거된 조 추출물을 의미한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 사용되는 갈디에리아 추출물은 정제된 갈디에리아 추출물이다.
이하에서 간단히 "피코시아닌"으로 지칭되는, 총 피코시아닌 함량은 존재할 경우 알로피코시아닌 및 C-피코시아닌의 총합이다.
일부 구현예에서 본 명세서에 개시된 "정제된" 성분은 70% 초과의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서 본 명세서에 개시된 "정제된" 성분은 80% 초과의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서 본 명세서에 개시된 "정제된" 성분은 90% 초과의 순도, 95% 초과의 순도, 또는 98% 초과의 순도를 갖는다.
피코시아닌은 발색단에 공유 결합된 아포단백질로 구성된 알파 및 베타 서브유닛을 포함하는 피코빌리단백질이다. 상이한 피코시아닌은 그들의 알파-서브유닛 및 베타-서브유닛 아포단백질의 서열에 의해 본질적으로 구별된다.
특정 구현예에 따라서, 본 기술의 산성 조성물, 특히 산성 식품 조성물은 α-서브유닛 아포단백질이 SEQ ID NO: 1 (등록 번호 YP_009051179.1)을 포함하고, β-서브유닛 아포단백질이 SEQ ID NO: 2 (등록 번호 YP_009051180.1) 또는 이의 변이체를 포함하는, 산성-pH-내성 피코시아닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술은 피코시아닌을 포함하는 산성 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 산성 조성물은 추출된 피코시아닌, 단리된 피코시아닌 또는 정제된 피코시아닌을 포함한다.
본 기술의 산성 조성물은 고체, 페이스트 또는 액체일 수 있는 산성 식품 조성물일 수 있다. 일부 예에서, 산성 식품 조성물은 탄산 음료이다. 일부 다른 예에서, 산성 식품 조성물은 유제품, 예컨대, 제한없이, 요거트이다.
산성 조성물, 특히 산성 식품 조성물이란, 본 기술에 따라서, 4.0 이하의 pH를 갖는, 유리하게 약 2.5와 약 3.5 사이의 pH, 유리하게 약 3.0 초과 및 약 4.0 이하의 pH를 갖는 조성물을 의미한다.
일부 구현예에서, 산성 조성물, 특히 산성 식품 조성물은 α-서브유닛 아포단백질이 SEQ ID NO: 1 (등록 번호 YP_009051179.1)로 기재된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 갖고, β-서브유닛 아포단백질이 SEQ ID: 2 (등록 번호 YP_009051180.1)에 기재된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 갖는 산성-pH-내성 피코시아닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 산성 조성물, 특히 산성 식품 조성물은 C-피코시아닌과 조합된 알로피코시아닌을 더 포함할 수 있다.
일부 예에서, 상기 알로피코시아닌의 알파-서브유닛 아포단백질은 SEQ ID NO: 3 (등록 번호 YP_009051103.1)으로 기재된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 갖고, β-서브유닛 아포단백질은 SEQ ID NO: 4 (YP_009051104.1)로 기재된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 알로피코시아닌의 알파-서브유닛 아포단백질은 SEQ ID NO: 3 (등록 번호 YP_009051103.1)으로 기재된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 이루어지고, β-서브유닛 아포단백질은 SEQ ID NO: 4 (YP_009051104.1)로 기재된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 이루어진다.
단백질의 특징은 특히, 이의 아미노산 조성 및 이의 등전점 (pI)에 의존적이다. 등전점은 단백질이 순전하를 운반하지 않는 용액의 pH, 또는 달리 말해서, 분자가 전기적으로 중성이고 단백질은 서로를 끌어당겨서, 응집되고 침전되는 경향이 있는 pH이다. 그들 등전점 이상의 pH에서, 단백질은 음으로 하전되어 서로를 밀어내는 경향이 있다.
Patrickios 및 Yamasaki가 기술한 계산 절차를 사용한 다양한 단백질의 등전점의 비교 분석 (Polypeptide Amino Acid Composition and Isoelectric Point. II. Comparison between Experiment and Theory. Analytical Biochemistry. 231, 1, 1995: 82-91.1995)은 실험적으로 관찰된 산성 pH 내성과 이론적 계산 간에 일정 상관성을 보여준다.
출원인이 수행한 연구는 피코시아닌의 산성 pH 내성은 상기 피코시아닌의 α 서브유닛의 아미노산 서열과 연관될 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 피코시아닌의 α 서브유닛의 아미노산 서열 내에서, 처음 26개 아미노산의 정체가 특히 중요할 수 있다는 것을 주목한다. 특히 시아니디오스키존 (Cyanidioschyzon), 시아니디움 (Cyanidium) 또는 갈디에리아 (Galdieria) 속, 보다 특히 갈디에리아 술푸라리아 (Galdieria sulphuraria), 시아니디움 칼다리움 (Cyanidium caldarium) 및 시아니디오스키존 메롤라에 (Cyanidioschyzon merolae) 균주의 미세조류 균주의 배양으로 수득된 피코시아닌의 경우이다.
일부 구현예에서, 본 기술의 조성물은 적어도 하나의 피코시아닌을 포함할 수 있고, 이의 적어도 하나의 아포단백질, 특히 α-서브유닛은 낮은 등전점을 가져서 산성 pH에서 더 나은 안정성을 허용할 수 있다. 낮은 등전점이란 3 이하, 우선적으로 2.5 이하, 보다 우선적으로 2.2 이하의 등전점을 의미한다. 일부 구현예에서, 본 기술의 조성물은 적어도 하나의 피코시아닌을 포함할 수 있고, 이의 적어도 하나의 아포단백질, 특히 α-서브유닛은 3 이하, 우선적으로 2.5 이하, 보다 우선적으로 2.2 이하의 등전점을 가질 수 있다.
산성 조성물, 특히 산성 식품 조성물은 그의 α-서브유닛 아포단백질이 낮은 등전점을 가질 수 있는 적어도 하나의 피코시아닌, 보다 특히 그의 α-서브유닛 아포단백질이 SEQ ID NO: 1로 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있는 적어도 하나의 피코시아닌을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 산성 조성물, 특히 산성 식품 조성물은 그의 α-서브유닛 아포단백질이 낮은 등전점을 갖는 적어도 하나의 피코시아닌, 보다 특히 α-서브유닛 아포단백질이 SEQ ID NO: 1로 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이의 변이체로 이루어지는 적어도 하나의 피코시아닌을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변이체"는 기준 서열의 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변형되고, 상기 기준 서열과 동일한 기능적 성질, 특히 산성 환경에서 동일한 안정성을 갖는, 기준 서열에 상응하는 단백질 서열, 이 경우에 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 단백질을 의미한다.
일부 예에서, 본 기술의 변이체는 피코시아닌의 α-서브유닛과 적어도 약 83% 서열 동일성, 및 피코시아닌의 베타 서브유닛과 적어도 약 82% 서열 동일성을 갖는다. 일부 다른 예에서. 일부 예에서, 본 기술의 변이체는 α (SEQ ID NO: 1) 및 β (SEQ ID NO: 2) 서브유닛과 적어도 약 90% 동일성, 바람직하게 α (SEQ ID NO: 1) 및 β (SEQ ID NO: 2) 서브유닛과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는다.
유사하게, 알로피코시아닌 경우에, 변이체는 알로피코시아닌의 α-서브유닛과 적어도 약 89% 서열 동일성, 및 알로피코시아닌의 β-서브유닛과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다.
당업자는 그들이 원하는 통상의 방법, 특히 BLASTP 프로그램 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 사용하여 단백질 서열 동일성을 측정하는 방법을 알고 있다.
본 기술에 포괄되는 변이체의 식별은 당분야에 공지된 방법을 사용하여서 예컨대 변이체가 산성 pH에서 안정성 시험을 통해 본래 아미노산 서열과 동일한 구조적 및 기능적 성질을 유지한다는 것을 검증하여서, 예를 들어, 본 출원의 실시예에 제시된 시험같은 시험을 수행하여서 확인될 수 있다.
본 기술의 폴리펩티드는 이의 기능을 실질적으로 변형시키지 않고 적어도 하나의 아미노산의 치환, 삽입 및/또는 결실을 통해서 변형될 수 있다. 예를 들어, 소정 위치에서 아미노산의 다른 화학적으로 동등한 아미노산으로의 치환은 단백질의 성질에 실질적으로 영향을 미치지 않는 서열 변이의 알려진 예이다. 이들 "보존적" 치환은 하기 아미노산 그룹 내에서 교환으로서 정의될 수 있다: i) Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; ii) Asp, Asn, Glu, Gln; iii) His, Arg, Lys; iv) Met, Leu, Ile, Val, Cys; 및 v) Phe, Tyr, Trp.
따라서, 본 기술에 따른 C-피코시아닌 및/또는 알로피코시아닌의 아포단백질의 변이체는 상응하는 기준 서열에 대해서 1개와 30개 사이의 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본 기술에 따른 C-피코시아닌 및/또는 알로피코시아닌의 아포단백질의 변이체는 상응하는 기준 서열에 대해서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 피코시아닌의 α 및/또는 β 서브유닛의 변이체는 기준 단백질의 성질 및 상기 명시된 상동성/동일성 백분율을 보유한다.
일부 구현예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실로부터 유래되는, 본 기술의 산성 조성물에 유용한 피코시아닌의 α-서브유닛 아포단백질 변이체는 수득된 변이체가 기준 단백질의 성질 및 상기 명시된 동일성 백분율을 유지하는 한, 상응하는 기준 서열에 대해서 1 내지 27개 아미노산 차이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 기준 서열의 치환, 삽입 및/또는 결실로부터 유래되는, 본 기술의 산성 조성물에 유용한 피코시아닌의 α-서브유닛 아포단백질 변이체 및 본 기술에 따른 산성 조성물에 유용한 피코시아닌의 β-서브유닛 아포단백질 변이체는 수득된 변이체가 기준 단백질의 성질 및 상기 명시된 동일성 백분율을 보유하는 한, 상응하는 기준 서열에 대해서 1 내지 30개 아미노산 차이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실로부터 유래되는, 본 기술의 산성 조성물에서 유용한 C-피코시아닌의 α-서브유닛 아포단백질 변이체, 본 기술에 따른 산성 조성물에서 유용한 알로피코시아닌의 α-서브유닛 아포단백질 변이체는 수득된 변이체가 기준 단백질의 성질 및 상기 명시된 동일성 백분율을 보유하는 한, 상응하는 기준 서열에 대해서 1 내지 24개 아미노산 차이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실로부터 유래되는, 본 기술의 산성 조성물에서 유용한 C-피코시아닌의 α-서브유닛 아포단백질 변이체, 본 기술에 따른 산성 조성물에서 유용한 알로피코시아닌의 β-서브유닛 아포단백질 변이체는 수득된 변이체가 기준 단백질의 성질 및 상기 명시된 동일성 백분율을 보유하는 한, 상응하는 기준 서열에 대해서 1 내지 20개 아미노산 차이를 포함할 수 있다.
고려되는 기준 서열 (피코시아닌 α 및/또는 β 서브유닛 및/또는 알로피코시아닌 α 및/또는 β 서브유닛)과 무관하게, 상기 서브유닛의 변이체는 수득된 변이체가 기준 단백질의 성질 및 상기 명시된 동일성 백분율을 보유하는 한, 상응하는 기준 서열에 대해서 1 내지 15개 아미노산 차이, 바람직하게 1 내지 10개 아미노산 차이, 특히 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개 또는 7개 또는 8개 또는 9개 또는 10개 아미노산 차이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 알로피코시아닌 또는 이의 변이체와 혼합되거나, 또는 단독으로, 산성 조성물, 특히 산성 식품 조성물에서 유용한, C-피코시아닌 또는 이의 변이체는 C-피코시아닌 또는 이의 관심 변이체를 천연적으로 발현하는 천연 유기체의 배양을 통해서 또는 상기 C-피코시아닌 또는 이의 변이체를 생산하는 이의 능력에 대해 선택된 C-피코시아닌 또는 이의 관심 변이체를 발현하도록 유전적으로 형질전환된 유기체의 배양에 의해서 수득될 수 있다. 본 기술에 따른 조성물에서 유용한 C-피코시아닌 또는 이의 관심 변이체를 천연적으로 발현하는 천연 유기체의 예는 시아니디알레스 (Cyanidiales) 목의 조류 또는 미세조류를 포함한다. 시아니디알레스 (Cyanidiales) 목은 시아니디아세아에 (Cyanidiaceae) 과 및 갈디에리아세아에 (Galdieriaceae) 과를 포함하고, 그들 자체는 시아니디오스키존 (Cyanidioschyzon), 시아니디움 (Cyanidium) 및 갈디에리아 (Galdieria) 속으로 세분되고, 이들 구성원은 특히 시아니디오스키존 메롤라에 (Cyanidioschyzon merolae) 10D, 시아니디오스키존 메롤라에 (Cyanidioschyzon merolae) DBV201, 시아니디움 칼다리움 (Cyanidium caldarium), 시아니디움 대달룸 (Cyanidium daedalum), 시아니디움 막시뭄 (Cyanidium maximum), 시아니디움 파르티툼 (Cyanidium partitum), 시아니디움 룸펜스 (Cyanidium rumpens), 갈디에리아 대달라 (Galdieria daedala), 갈디에리아 막시마 (Galdieria maxima), 갈디에리아 파르티타 (Galdieria partita), 갈디에리아 플레그레아 (Galdieria phlegrea), 및 갈디에리아 술푸라리아 (Galdieria sulphuraria) 종을 포함한다. 특히 갈디에리아 술푸라리아 (시아니디움 칼다리움 (Cyanidium caldarium)이라고도 함) 균주를 특히 언급할 수 있다.
따라서, 본 기술의 구현예에 따라서, 산성 조성물, 특히 산성 식품 조성물은천연 유기체 예컨대 시아니디알레스 목의 조류 또는 미세조류, 특히 시아니디아세아에 과 또는 갈디에리아세아에 과의 천연 유기체로부터의 산성-pH-내성 피코시아닌을 포함한다. 일부 예에서, 산성 조성물, 특히 산성 식품 조성물은 시아니디오스키존, 시아니디움, 갈디에리아 속에 속하고, 유리하게 시아니디움 및 갈디에리아 속의 종으로부터 선택되는 천연 유기체로부터의 산성-pH-내성 피코시아닌을 포함한다. 일부 다른 예에서, 산성 조성물, 특히 산성 식품 조성물은 시아니디오스키존 메롤라에 10D, 시아니디오스키존 메롤라에 DBV201, 시아니디움 칼다리움, 시아니디움 대달룸, 시아니디움 막시뭄, 시아니디움 파르티툼, 시아니디움 룸펜스, 갈디에리아 대달라, 갈디에리아 막시마, 갈디에리아 파르티타, 갈디에리아 플레그레아, 갈디에리아 술푸라리아 종으로부터 선택되는 천연 유기체로부터의 산성-pH-내성 피코시아닌을 포함한다.
일부 추가 예에서, 본 기술에 따른 산성 식품 조성물은 천연 미세조류 예컨대 갈디에리아 술푸라리아, 시아니디움 칼다리움 또는 시아니디오스키존 메롤라에로부터의 산성-pH-내성 피코시아닌을 포함한다. 보다 우선적으로, 산성-pH-내성 피코시아닌은 갈디에리아 술푸라리아 및 시아니디움 칼다리움으로부터 선택되는 천연 미세조류로부터 기원한다.
상기 피코시아닌 또는 이의 변이체를 생산하는 이의 능력에 대해 선택되는 피코시아닌 또는 이의 관심 변이체를 발현하도록 형질전환되는 유기체의 예로서, SEQ ID NO: 1 및/또는 SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3 및/또는 SEQ ID NO: 4의 아포단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물을 언급할 수 있고, 상기 미생물은 또한 발색단의 생산 및 아포단백질에 대한 이의 결합을 위해 필요한 생합성 경로를 포함한다. 본 기술에 따른 식품 조성물에서 사용되는 C-피코시아닌 및/또는 알로피코시아닌을 생산하도록 변형될 수 있는 미생물로서 특히 효모를 언급할 수 있다. 본 기술에 따른 조성물에서 유용한 피코시아닌을 생산할 수 있는 천연 및/또는 변형된 유기체를 배양하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 당업자에게 충분히 공지된, 시아니디알레스 목의, 시아니디아세아에 과 또는 갈디에리아세아에 과의 배양은 혼합영양 방식으로 수행될 수 있고, 일반적으로 빛이 색소의 생합성에 필수적이다. 이러한 산업적 배양은 대용량 (즉, 1,000-리터, 10,000-리터, 20,000-리터, 100,000-리터) 발효조에서 수행될 수 있다. 배양은 당업자에게 공지된 조건 하에서 수행될 수 있다. 이는 회분식 방식, 유가식 방식, 또는 연속 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에서 유용한 피코시아닌은 약 400 nm와 약 550 nm 사이, 또는 약 420 nm와 약 500 nm 사이, 또는 약 430 nm와 약 480 nm 사이, 또는 약 455 nm의 파장을 갖는 광선과 함께 혼합영양 방식으로 배양된, 상기 정의된 바와 같은, 시아니디알레스 목의 조류의 배양을 통해서 수득되는 생물량으로부터 추출될 수 있다. 상기 파장의 광선을 포함하는 넓은 스펙트럼을 갖는 "백색"광일 수 있다. 또한, 상기 파장으로 이루어지는 좁은 스펙트럼의 광선일 수도 있다. 혼합영양 방식으로 시아니디알레스 생물량의 산업적 제조를 위한 이러한 방법, 및 이렇게 수득되는 생물량은 특히 프랑스 특허 출원 FR 15 59072에 기술되어 있고, 이의 내용은 참조로 본 명세서에 편입된다.
본 기술의 목적은 피코시아닌이 산성 pH에서 개선되거나 또는 증강된 안정성을 입증하는 산성 조성물을 제공하는 것이다. 산성 조성물이란, 본 기술에 따라서, 미네랄 또는 유기산 및 피코시아닌을 포함하는 임의 조성물을 의미한다. 상기 조성물은 산성 pH를 가지고, 산성-pH-내성 피코시아닌이 도입되는, 액체, 유체 또는 점성, 페이스트 또는 고체일 수 있다. 산성 pH에서 "개선된" 또는 "증강된" 안정성이란, 피코시아닌을 함유하는 용액의 열 및/또는 저장 처리 시, 색 강도가 보다 양호하게 유지된다는 것을 의미한다. 증강성은 람다 최대값을 추적하는 분광광도측정법을 통해서 또는 dE CMC를 추적하는 비색법을 통해서 측정될 수 있다.
수성 액상 조성물의 경우에, pH는 일반적인 방식으로 측정된다. 비수성 액상 조성물, 또는 페이스트 또는 고형 조성물의 경우에, pH는 미네랄 또는 유기산 및 피코시아닌을 포함하여, 그 안에 함유된 가용성 화합물을 용해시키기에 충분한 양의 물 중에 조성물의 용해 후 측정된다. 본 기술의 조성물에서 사용될 수 있는 미네랄산의 예는 탄산, 인산, 염산, 황산, 과염소산, 술폰산 및 질산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 예는 유기산 예컨대 시트르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 및 숙신산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 기술에 따른 조성물은 수성 액상 조성물로서, 임의로 겔 형태이거나, 또는 수성 용액에 용해되도록 디자인된 페이스트 또는 고형 조성물 또는 물을 포함하는 고형 또는 페이스트 조성물이다. 본 기술의 다른 구현예에 따라서, 산성 조성물 페이스트 또는 고형 조성물은 습한 환경에서 저장 및/또는 적용되도록 의도된다.
산성 식품 조성물이란, 본 기술에 따라서, 인간 또는 동물이 섭취하도록 디자인되고, 전술된 정의에 속하는 임의 조성물을 의미한다. 뉴트라수티컬 산성 조성물은 본 기술의 상황 내에서 산성 식품 조성물의 전의 내에 속하는 것으로 간주되어야 한다.
본 기술에 따른 산성 식품 조성물은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 그들은 인간 또는 동물에게 유익한 그들 건강 특성 또는 그들 영양 공급이 확인된 활성 화합물과 회합되는 구조적 성분을 포함할 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 본 기술에 따른 산성 식품 조성물은 또한 식품 첨가제 예컨대 텍스처링제, 풍미제, 보존제, 또는 당업자에게 충분히 공지된 임의 성분을 포함할 수도 있다. 담체는 물 및/또는 단백질 및/또는 지방 및/또는 섬유 및/또는 당류를 포함할 수 있다. 담체의 성분은 오직 구조적 성질만을 가질 수 있지만, 일반적으로 그들의 영양 공급으로 알려져 있다.
본 기술에 따른 산성 식품 조성물은 바로 사용가능할 수 있거나 또는 식용 식품을 제조하기 위해 고형, 페이스트 또는 액상 조제물에 첨가되는 식품 첨가제의 형태일 수 있다.
식품 조성물의 경우에, 산은 식품에 승인된 산성화제의 목록, 특히 탄산, 인산, 시트르산, 말산, 타르타르산, 락트산, 및 시트르산으로부터 선택될 수 있다.
본 기술에 따른 비-식품 산성 조성물과 관련하여, 그들은 특히, 약학, 수의학 또는 미용 조성물일 수 있고, 이러한 조성물에서 사용되고 알려져 있는 임의의 첨가제 및/또는 활성제를 더 포함할 수 있다.
본 기술에 따른 고형, 액상 또는 페이스트 산성 조성물에서, 피코시아닌은 예를 들어, 분말 형태로 혼입될 수 있다. 상기 산성 조성물, 특히 상기 산성 식품 조성물은 따라서 임의의 공지된 통상적인 형태, 예컨대 크림, 겔, 발포체, 페이스트 등일 수 있다. 고형 식품 조성물의 예는 케이크 또는 비스킷, 조리용 건조 식품, 가용성 분말, 젤라틴성 고형 조성물 (젤리), 발포체 등을 포함한다.
본 기술에 따라서, 상기 액상 산성 조성물은 피코시아닌이 용해된 수성 조성물일 수 있다. 이것은 특히 이의 제조 또는 이의 섭취 동안 고형 식품에 첨가되거나 또는 섭취되도록, 바로 사용가능한 조성물의 형태일 수 있거나 또는 희석용 액상 농축물의 형태일 수 있고, 예를 들어, 농축된 액상 "토핑 (topping)" 조성물은 색상을 제공하도록 케이크에 적용된다. 이들 농축된 조성물 중에서, 임의로 알콜을 함유하는 시럽을 언급할 수 있다.
본 기술에 따른 액상 산성 조성물은 다양한 점도를 가질 수 있고, 첨가제 예컨대 점도제, 겔화제, 및 당업자에게 공지되고 액상 식품 조성물의 제조에 전형적인 다른 구조화 첨가제를 포함할 수 있다.
본 기술의 일 구현예에 따라서, 액상 식품 조성물은 탄산 산성 음료이다. 소다, 주스, 스포츠 음료, 에너지 음료, 회복 음료 등을 특히 언급할 수 있다. 이들 음료의 조성물은 당업자에게 충분히 공지되어 있고, 특히 당, 미네랄 염, 식품 첨가제, 용해 가스 등을 포함할 수 있다. 본 기술에 따른 음료는 일반적으로 적용되는 색소가 전체적으로 또는 부분적으로 본 기술에 따른 산성-pH-내성 피코시아닌으로 대체된 통상의 산성 음료이다.
본 발명자는 반직관적인 방식으로, 더 많은 피코시아닌이 조성물에 농축될수록, 안정성이 낮아져서, 최종 제품의 색이 더 많이 변형된다는 것을 발견하였다. 그러므로, 보다 색채가 풍부한 제품을 얻기 위해서 피코시아닌, 특히 C-피코시아닌 함량을 감소시키는 것을 추천하고, 다른 말로, 제품의 색상을 증가시키기 위해 착색제의 분량을 감소시키는 것을 추천한다.
일부 구현예에서, 피코시아닌은 이하에서 또한 "저함량"이라고도 하는, 피코시아닌의 개선된 안정성을 허용하는 양으로 본 기술의 산성 조성물에 존재한다. 일부 예에서, 피코시아닌은 약 0.001 wt%와 약 0.1 wt% 사이, 또는 약 0.001 wt%와 약 0.05 wt% 사이, 또는 약 0.001 wt%와 약 0.025 wt% 사이, 또는 약 0.0025 wt%와 약 0.010 wt% 사이, 또는 약 0.0025 wt%와 약 0.005 wt% 사이 범위의 양으로 산성 조성물에 존재한다. 일부 예에서, 피코시아닌은 약 2.5 mg/L와 약 2500 mg/L 사이, 약 25 mg/L와 약 300 mg/L 사이, 또는 약 50 mg/L와 약 100 mg/L 사이 범위의 양으로 산성 조성물에 존재한다. 이들 구현예의 일부 구현에서, 산성 조성물은 액상 산성 조성물이다.
산성 조성물이 바로 사용가능한 음료 유형인 구현예에서, 피코시아닌 함량은 약 25 mg/L와 약 300 mg/L 사이, 또는 약 50 mg/L와 약 100 mg/L 사이 범위일 수 있다.
산성 조성물이 사용 전에 희석을 위한 농축 액상 조성물 (예를 들어, 시럽)인 구현예에서, 피코시아닌 함량은 약 50 mg/L와 약 2500 mg/L 사이, 또는 약 500 mg/L와 약 1000 mg/L 사이 범위일 수 있다.
산성 조성물이 고형 조성물인 구현예에서, 피코시아닌 함량은 약 0.01 mg/g과 약 10 mg/g 사이, 또는 약 0.1 mg/g과 약 5.0 mg/g 사이, 또는 약 0.25 mg/g과 약 2.5 mg/g 사이 범위일 수 있다.
일부 구현예에서, 갈디에리아 추출물은 피코시아닌의 개선된 안정성을 허용하는 양으로 본 기술의 산성 조성물에 존재한다. 일부 예에서, 갈디에리아 추출물은 약 0.004 wt%와 약 0.4 wt% 사이, 또는 약 0.004 wt%와 약 0.2 wt% 사이, 또는 약 0.004 wt%와 약 0.1 wt% 사이, 또는 약 0.01 wt%와 약 0.04 wt% 사이, 또는 약 0.01 wt%와 약 0.02 wt% 사이 범위의 양으로 산성 조성물에 존재한다. 일부 예에서, 갈디에리아 추출물은 약 10 mg/L와 약 10 g/L 사이, 약 100 mg/L와 약 1200 mg/L 사이, 또는 약 200 mg/L와 약 400 mg/L 사이 범위의 양으로 산성 조성물에 존재한다. 이들 구현예의 일부 구현에서, 산성 조성물은 액상 산성 조성물이다.
산성 조성물이 바로 사용가능한 음료 유형인 구현예에서, 갈디에리아 추출물은 약 100 mg/L와 약 1200 mg/L 사이, 또는 약 200 mg/L와 약 400 mg/L 사이 범위일 수 있다.
산성 조성물이 사용 전에 희석을 위한 농축 액상 조성물 (예를 들어, 시럽)인 구현예에서, 갈디에리아 추출물 함량은 약 200 mg/L와 약 10 g/L 사이, 또는 약 2000 mg/L와 약 4000 mg/L 사이 범위일 수 있다.
산성 조성물이 고형 조성물인 구현예에서, 갈디에리아 추출물 함량은 약 0.04 mg/g과 약 40 mg/g 사이, 또는 약 0.4 mg/g과 약 20 mg/g 사이, 또는 약 1 mg/g과 약 10 mg/g 사이 범위일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 기술의 조성물은 하나 이상의 황산화 다당류를 더 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 황산화 다당류는 다중-황산화 카라기난이다. 카라기난은 해초로부터 얻어지고, 그들은 돌돌 감겨진 나선형 구조를 형성할 수 있는 고도로 유연한 분자이다. 카라기난은 반복되는 갈락토스 단위를 갖는 선형 다당류로서 특징지어진다. 카라기난은 술폰화 정도에 따라 분류된다. 단일-황산화 카라기난의 예에는 k-카라기난, g-카라기난 및 o-카라기난이 있다. 이황산화 카라기난의 예에는 i-카라기난, d-카라기난, m-카라기난 및 q-카라기난이 있다. 삼황산화 카라기난의 예는 l-카라기난 및 v-카라기난이다.
다중-황산화 카라기난은 이당류 단위 당 적어도 2개 술페이트 기, 바람직하게 2개 또는 3개 술페이트 기를 함유하는 카라기난이다. 본 기술에서 사용될 수 있는 다중-황산화 카라기난의 예는 i-카라기난, d-카라기난, m-카라기난, 0-카라기난, l-카라기난 및 v-카라기난, i-카라기난, d-카라기난, m-카라기난, 0-카라기난, l-카라기난 및 v-카라기난의 가수분해 산물을 포함하지만, 이에 제한되지 않고; 보다 바람직하게는 i-카라기난 및 l-카라기난, 및 이의 가수분해 산물이고, 가장 바람직하게는 l-카라기난 및 가수분해된 l-카라기난이다.
일부 구현예에서, 본 기술의 조성물의 카라기난 함량은 약 0.006 wt%와 약 0.6 wt% 사이, 또는 약 0.02 wt%와 약 0.5 wt% 사이, 또는 0.03 wt%와 약 0.4 wt% 사이, 또는 약 0.05 wt%와 약 0.3 wt% 사이, 또는 약 0.005 wt%와 약 0.1 wt% 사이, 또는 약 0.001 wt%와 약 0.1 wt% 사이, 또는 약 0.05 wt%와 약 0.1 wt% 사이 범위이다.
일부 구현예에서, 본 기술의 산성 조성물에 존재하는 피코시아닌 추출물 대 카라기난의 중량비는 조성물의 수분 함량 및 pH에 의존적이다. 적어도 약 45 wt% 및 최대로 약 95 wt%의 높은 수분 함량에서, 피코시아닌 추출물 (약 25% 내지 약 30% 피코시아닌을 함유하는 피코시아닌 추출물) 및 카라기난 간 중량비 (피코시아닌 추출물:카라기난)는 약 1:1과 약 10:1 사이, 또는 약 1:1과 약 5:1 사이, 또는 약 1:1과 약 4:1 사이, 또는 약 1:1과 약 3:1 사이, 또는 약 1:1과 약 2:1 사이 범위이다. 일부 구현예에서, 이러한 높은 수분 함량에서 조성물의 pH는 약 2.0과 약 3.7 사이, 또는 약 2.2와 약 3.5 사이, 또는 약 2.3과 약 3.3 사이 범위이다.
적어도 15 wt% 및 45 wt% 미만의 물의 낮은 수분 함량에서, 피코시아닌 추출물 (약 25% 내지 약 30% 피코시아닌을 함유하는 피코시아닌 추출물) 및 카라기난 간 중량비는 적어도 약 2 및 약 2.5 미만의 pH에서 1:1.5, 바람직하게 1:1과 10:1 사이 범위이다. 피코시아닌 및 카라기난 간 중량비는 적어도 약 2.5 및 약 2.9 미만의 pH에서, 약 1:2, 바람직하게 1:1과 약 10:1 사이 범위이고, 피코시아닌 추출물 및 카라기난 간 중량비는 적어도 약 2.9 및 약 4 미만의 pH에서 약 1:1과 약 10:1 범위이다. 피코시아닌 및 카라기난은 바람직하게 액상 공급원료에 용해된다. 용해된다는 것은 피코시아닌 및 카라기난이 수성 용액 중에 머무르는 것을 의미한다. 용액은 눈에 투명하고, 침전물 또는 부유 미립자가 보이지 않는다.
피코시아닌 구성이 색상에 영향을 미친다고 알려져 있다. pH가 감소되고 C-피코시아닌의 평형상태가 단량체로 이동함에 따라서, 색상은 진한 파란색에서 청록색으로 변화된다 (Buchweitz, 2016). 일반적으로, 3.9 이하의 pH 값에서 C-피코시아닌의 평형상태는 단량체로 이동한다. 색 성능은 색상 측정 (CIE L*a*b* 및 h 값, 상기 참조) 및 파란색 흡광도의 총합을 사용해 평가된다.
임의 이론에 국한되지 않고, 산성 조건에서, 음으로 하전된 다중-황산화 카라기난, 예컨대, 예를 들어 람다 및 아이오타 카라기난은 양으로 하전된 피코시아닌과 복합체를 형성하여, 응집을 방지하고 색을 안정화시킨다고 가정된다. 그러나, 산성 조건, 특히 2.6과 4.0 사이의 pH에서, 예를 들어, 아이오타 및 람다 카라기난과 같은, 다중-황산화 카라기난의 첨가에 따라 색상의 분명한 변화가 관찰된다. 카라기난의 첨가는 색상을 더 밝게 (더 높은 L*), 덜 파란색/보다 노란색 (더 높은 b*)으로 변화시킨다.
피코시아닌 결정을 위한 표준 방법은 광도계 측정으로 천연 피코시아닌 함량 (mg/ml)을 계산하도록 Yoshikawa & Belay (2008)에 의해 확립되었다. 이것은 620 nm 및 650 nm에서 흡광도 측정 및 이들 파장에서 pH 6.0에서 C-피코시아닌 및 알로피코시아닌의 소광 계수에 의존한다. 다중-황산화 카라기난의 첨가는 피코시아닌 피크의 형상을 변화시키고, 일부 경우에, 피크 최대치가 620 nm에서 660 nm - 670 nm 사이로 이동한다. 620 nm 및 650 nm에서 흡광도 측정만을 사용한 피코시아닌 함량 계산은 다중-황산화 카라기난을 함유하는 용액에 대한 피코시아닌 함량을 과소평가한다. 따라서, 색 유지 규모를 결정하기 위해서, A620 nm - A750 nm, A650 nm - A750 nm, 및 A667 nm - 750 nm에서 파란색 흡광도 측정의 총합을 계산하고 사용한다. 스피룰리나-추출물 중 총 피코시아닌 함량은 하기 열거된 pH 6.0에서 Yoshikawa & Belay (2008) 방법을 사용해 계산된다.
알로피코카닌 () = 0.18 (A650nm - A750nm) - 0.042(A620nm -A750nm)
C-피코시아닌 () = 0.162(A620nm - A750nm) - 0.098(A650nm -A750nm)
총 피코시아닌 () = 알로피코카닌 () + C-피코시아닌 ()
조성물에 첨가되는 C-피코시아닌의 양을 결정하기 위해서, 갈디에리아 추출물의 용량 수준은 갈디에리아 추출물 중 총 C-피코시아닌 함량이 곱해진다.
일부 구현예에서, 액상 조성물의 피코시아닌 함량은 약 0.001 wt%와 약 0.1 wt% 사이, 또는 약 0.003 wt%와 약 0.5 wt% 사이, 또는 약 0.007 wt%와 약 0.4 wt% 사이, 또는 약 0.01 wt%와 약 0.4 wt% 사이이다.
스피룰리나-추출물 함유 피코시아닌의 문제점은 산성화된 수성 시스템에 대한 적용이다. 스피룰리나 단백질 (피코시아닌 포함)은 pH가 약 2.7과 약 6.0 사이일 때 용액으로부터 침전된다. 침전은 즉시 또는 수 주 후에 일어날 수 있고, 이것은 용액의 점도, 이온 강도, 첨가 순서, 온도, 및 pH와 같은 인자들에 의존적이다. 응집/침전은 육안으로 평가되고, 색 손실의 원인일 수 있다. 산성화 및/또는 처리 후 750 nm에서 높은 흡광도는 단백질 응집/침전에 대한 강력한 잠재성을 의미할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 기술에 따른 산성 조성물은 3.9, 3.8, 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3, 3.2, 3.1, 3.0, 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2, 2.1 미만의 pH를 갖고, 여전히 바람직하게, pH는 2.0 이상이다.
3.0 초과 및 4.0 이하의 pH 하에서 0.3:1과 0.6:1 사이 비로 저함량의 갈디에리아 유래 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류, 특히 람다 카라기난의 조합이 특히 유리하다.
일부 구현예에서, 본 기술의 조성물은 추가 성분 예컨대 예를 들어 감미제, 안정화제, 킬레이트화제, 산, 단백질, 염, 풍미제, 비타민, 미네랄, 색소, 증점제 및 보존제를 포함한다.
본 기술의 조성물은 피코시아닌 함량에 기인하여 파란색을 가질 수 있지만, 파란색을 기반으로 하는 다른 색은 조성물에 다른 색소를 혼합하는 방식으로 수득될 수 있다. 조성물은 다른 색소, 예컨대 사플로민 (홍화), 안토시아닌, 카로테노이드, 베타닌, 아나토, 리코펜, 커큐민, 및 엽록소를 함유할 수 있다. 색소는 파란색 피코시아닌 함유 조성물에 첨가되어서 예를 들어, 사플로민을 사용하는 녹색같은, 다른 색에 혼합될 수 있다.
감미제의 예는 전화당, 수크로스, 고프룩토스 옥수수 시럽, 옥수수 시럽, 프룩토스, 글루코스, 트레할로스, 락토스, 꿀, 아가베, 스테비아, 수크랄로스, 아스파탐, 네오탐, 아세술팜 포타슘, 나한과, 또는 사카린이다. 보존제의 예는 염, 소르브산, 벤조산, 나타마이신, 니신 및 술파이트이다. 염의 예는 염 형성 음이온 예컨대 예를 들어 아세테이트, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 옥시드, 포스페이트, 소르베이트, 벤조에이트, 헥사메타포스페이트 또는 술페이트와 함께 양으로 하전된 양이온 예컨대 칼슘, 마그네슘, 포타슘, 소듐 또는 구리와 형성될 수 있는 이온성 화합물이다. 산의 예는 인산, 시트르산, 락트산, 말산, 아디프산, 타르타르산 또는 소듐 산 파이로포스페이트이다. 증점제의 예는 젤라틴, 전분, 펙틴, 곤약, 또는 한천이다.
본 기술에 따른 조성물은 킬레이트화제라고도 할 수 있는, 킬레이터를 함유할 수 있다. 킬레이터는 킬레이트를 형성하여서 그들이 결합하는 분자/원자의 화학적 및/또는 물리적 상태에 영향을 미치는 결합제이다. 킬레이터는 색 유지를 개선시킬 수 있고, 다중-황산화 카라기난과 상승적으로 작용하는 것으로 확인되었다. 킬레이트화제는 합성 및 천연 화합물일 수 있고, 특히 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 및/또는 이의 Na, K, Ca 염 (EDTA), L-글루탐산 N,N-디아세트산 테트라소듐 염 (GLDA), 소듐 헥사메타포스페이트, 글루타티온, 메탈로테이오네인, 2,3-디머랍토-1-프로판술폰산, 클로렐라, 마늘, 고수, 셀레늄, 밀크 시슬, 비타민 C, 비타민 E, 시트레이트, 포도씨 추출물, 케르세틴, 및 리포산의 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 킬레이트화제는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 및/또는 이의 Na, K, Ca 염 (EDTA) 및 L-글루탐산 N,N-디아세트산 테트라소듐 염 (GLDA)의 군으로부터 선택된다. EDTA는 이의 Na, K, Ca 염, 예컨대 예를 들어 칼슘 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트, 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트, 테트라소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트, 디포타슘 에틸렌디아민테트라아세테이트, 및 트리포타슘 에틸렌디아민테트라아세테이트와 함께 에틸렌 디아민 테트라 아세트산으로 간주된다. 칼슘 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트는 CaNa2 EDTA로 약칭되고, 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트는 Na2 EDTA로 약칭되고, 테트라소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트는 Na4 EDTA로 약칭되고, 디포타슘 에틸렌디아민테트라아세테이트는 K2 EDTA로 약칭되고, 트리포타슘 에틸렌디아민테트라아세테이트는 K3 EDTA로 약칭된다. 여전히 바람직하게 킬레이트화제는 비타민 C 및/또는 EDTA이다. 킬레이트화제는 약 1 ppm과 약 2000 ppm 사이 범위의 양으로 조성물에 존재할 수 있다. 1 ppm의 킬레이트화제는 0.0001 wt%로 이해되어야 하고; 예를 들어, 30 ppm의 EDTA는 0.003 wt%이다. EDTA는 약 10 ppm과 약 300 ppm 사이, 약 15 ppm과 약 200 ppm 사이, 또는 약 20 ppm과 약 100 ppm 사이 범위의 양으로 조성물에 존재할 수 있다.
EDTA 및 피코시아닌 (예컨대 갈디에리아 추출물 유래 피코시아닌)은 바람직하게 약 4:1과 약 1:200 사이, 또는 약 2:1과 약 1:125 사이, 또는 약 1:1과 약 1:75 사이의 중량비로 본 기술의 조성물에 존재한다.
조성물은 전형적으로 소비되기 전에 운송 및 저장된다. 이들 조성물이 상하지 않고, 소비에 안전하다는 것을 보장하기 위해서, 열처리, 보존제, 수분 활성, 또는 상기의 조합이 사용된다.
고온 단시간 (210℃, 6초) 처리 시 및 보존제가 카라기난없는 용액에 사용될 때 상당한 파란색 손실이 관찰된다.
조성물은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라서 수득될 수 있다: a) 물에 다중-황산화 카라기난을 첨가하여 용해시키고 육안 관찰로 결정하여, 다중-황산화 카라기난이 용해될 때까지 혼합하는 단계; b) 피코시아닌 함유 갈디에리아-추출물을 첨가하고, 적어도 5의 pH, 바람직하게 5와 10 사이의 pH에서 용해될 때까지 혼합하는 단계; c) 산 또는 산성화 성분을 첨가하는 단계; d) 임의로 감미제, 풍미제, 비타민, 미네랄, 염, 완충제, 또는 다른 음료 성분을 첨가하는 단계; e) 임의로 킬레이트화제, 예컨대 EDTA를 첨가하는 단계; f) 임의로 다른 색소, 예컨대 안토시아닌을 첨가하는 단계; g) 임의로 첨가제, 예컨대 보존제를 첨가하는 단계; h) 액체를 적어도 65℃ 까지 열처리하거나; 또는 비 열처리 및 냉간 충전, 또는 둘의 조합을 통해 a)-h)의 혼합물을 처리하는 단계. 피코시아닌 함유 갈디에리아 추출물은 5.0 이상의 pH에서 임의로 다른 성분의 존재 하에서 용해된 다중-황산화 카라기난에 첨가되는 것이 중요하다. 피코시아닌을 탈안정화시킬 수 있는 화합물 목록은 산, 안토시아닌, 홍화, 및 알콜을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 산은 가수분해된 카라기난을 제조하는데 사용될 수 있지만, 가수분해된 카라기난의 전하는 피코시아닌과 혼합 전에 적어도 5의 pH로 중화되어야 한다.
피코시아닌을 탈안정화시키지 않는 성분은 방법의 단계 a) 동안 또는 그 이전에 첨가될 수 있다. 다중-황산화 카라기난은 용해를 개선시키기 위해서 예를 들어 비-산성 탄수화물 예컨대 수크로스 또는 말토덱스트린과 건식 혼합될 수 있다. 단계 c) (산 또는 산성화 성분의 첨가 단계)는 단계 d), e), 또는 f) 이전 또는 이후에 수행될 수 있다. 단계 h)는 바람직하게 단계 a)-g) 이후에 수행된다. 존재하는 경우에, 보존제 (단계 g)는 바람직하게 보존제의 용해도 제한으로 인해서 a) 단계 이전 또는 그 동안에 첨가된다.
카라기난은 반복 황산화 갈락토스 단위를 갖는 선형 다당류이다. 갈락토스 단위 사이의 글리코시드 연결은 열 및 산에 의한 가수분해를 겪는다. 가수분해된 다중-황산화 카라기난은 또한 피코시아닌을 안정화시키는 것으로 확인되었지만, 가수분해된 다중-황산화 카라기난의 전하는 피코시아닌과 복합체 형성 이전에 5 이상의 pH로 중화되어야만 한다. 가수분해 및 비-분해 다중-황산화 카라기난 둘 모두는 침전을 방지하기 위해서 피코시아닌의 첨가 전에 5 이상의 pH를 가져야 한다. 바람직하게 다중-황산화 카라기난을 함유하는 용액의 pH는 피코시아닌의 첨가 전에 5와 10 사이, 보다 바람직하게 5.5와 9.9 사이이다.
본 기술은 또한 약 3.6 또는 3.6 미만의 pH에서 수성 용액 중 피코시아닌을 약 30℃ 내지 약 90℃의 온도에서 가열하는 단계를 포함하는, 녹색 색소를 제조하기 위한 방법에 관한 것으로서, 피코시아닌은 시아니디알레스 목, 바람직하게 시아니디오스키존, 시아니디움, 또는 갈디에리아 속, 여전히 바람직하게 갈디에리아 술푸라리아, 시아니디움 칼다리움, 또는 시아니디오스키존 메롤라에 종의 조류 또는 미세조류로부터 추출된다.
바람직한 구현예에서, 수성 용액은 약 0.3%와 약 10% 사이의 피코시아닌, 여전히 바람직하게 약 0.1%와 약 1% 사이의 피코시아닌을 포함한다.
특정 구현예에서, 녹색 색소를 제조하기 위한 방법은 가열 온도가 약 30℃ 내지 약 90℃, 특히 약 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃ 이상인 것을 특징으로 한다. 여전히 바람직하게 가열 온도는 약 40℃ 내지 약 90℃, 특히 약 50℃ 내지 약 85℃, 보다 더 바람직하게 약 60℃ 내지 약 80℃이다.
특정 구현예에서, 녹색 색소를 제조하기 위한 방법은 수성 용액의 pH가 바람직하게 약 2.0과 4.0 사이, 여전히 바람직하게 대략 3.0인 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에 따라서, 녹색 색소를 제조하기 위한 방법은 상기 기술된 것과 같은 아미노산 서열, 구조 및 기능적 성질을 갖는 산성-pH-내성 피코시아닌인 피코시아닌의 사용을 포함한다.
녹색 색소를 제조하기 위한 방법의 가열 단계는 약 1분과 약 480분 사이, 바람직하게 약 60분과 약 360분 사이, 여전히 바람직하게 약 120분과 약 300분 사이를 포함하는 지속기간을 가질 수 있다. 온도가 높을수록, 지속기간은 더 짧을 필요가 있다는 것을 유의해야 한다.
특히 바람직한 구현예에서, 녹색 색소를 제조하기 위한 방법은 약 70℃와 80℃ 사이의 온도에서 약 200분과 약 280분 사이 동안 가열하는 단계를 포함한다.
본 기술은 또한 이러한 방법으로 수득된 녹색 색소에 관한 것이다. 따라서 상기 녹색 색소는 또한 녹색 피코시아닌이라고 하고, 상기 녹색 피코시아닌은 약 120°와 190°사이의 색상각을 갖는다.
다른 구현예에서, 본 기술은 상기 기술된 방법을 통해서 피코시아닌으로부터 수득된 녹색 색소를 안정화시키기 위한 방법에 관한 것으로서, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 및/또는 이의 Na, K, Ca 염 (EDTA), L-글루탐산 N,N-디아세트산 테트라소듐 염 (GLDA), 소듐 헥사메타포스페이트, 글루타티온, 메탈로테이오네인, 2,3-디머랍토-1-프로판술폰산, 클로렐라, 마늘, 고수, 셀레늄, 밀크 시슬, 비타민 C, 비타민 E, 시트레이트, 포도씨 추출물, 케르세틴, 및 리포산의 군, 바람직하게 비타민 C 및/또는 EDTA로부터 선택되는 적어도 하나의 킬레이터와 상기 색소를 혼합하는 단계를 포함한다.
당업자는 비타민 C가 피코시아닌을 탈안정화시킬 수 있는 화합물이라는 것을 알고 있다는 점을 유의해야 한다. 따라서, 본 기술에서 발명자가 안정화제로서 비타민 C를 사용한다는 것은 특히 놀라운 일이다.
바람직하게, 상기 기술된 방법에 의해 피코시아닌으로부터 수득된 녹색 색소를 안정화시키기 위한 방법은 적어도 하나의 황산화 다당류를 첨가하는 단계를 더 포함하고, 상기 황산화 다당류는 상기 기술된 바와 같다.
본 기술은 상기 기술된 바와 같은 방법에 의해서 피코시아닌으로부터 수득된 안정화된 녹색 색소에 관한 것이다.
바람직하게, 수득된 안정화된 녹색 색소는 열 및/또는 광 노출 하에서 안정하다.
일정 구현예에서, 안정화되거나 또는 그렇지 않은, 본 기술에 따른 녹색 색소는 고체, 페이스트, 또는 액체 형태일 수 있다.
본 기술은 또한 상기 기술된 제조 방법에 의하 피코시아닌으로부터 수득된 녹색 색소 또는 상기 기술된 안정화 방법에 의해서 피코시아닌으로부터 수득된 안정화된 녹색 색소를 포함하는 생산물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 기술에 따른 산성 조성물, 식품 및/또는 농축된 액체는 녹색 색소 형태의 피코시아닌을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
바람직한 구현예에 따라서, 상기 녹색 색소는 저온살균, 예컨대 급속 저온살균으로 처리되었다.
다른 양태에 따라서, 본 기술은 피코시아닌의 열 안정성 및/또는 광 안정성을 개선시키기 위한 방법에 관한 것으로서, a) 물에 적어도 하나의 황산화 다당류를 첨가하고 용해시키는 단계, b) 피코시아닌을 첨가하고 적어도 5.0의 pH, 바람직하게 5.0과 10.0 사이의 pH에서 용해될 때까지 혼합하는 단계를 포함한다.
이 방법의 경우에, 일부 구현예에서, 본 기술의 조성물은 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 황산화 다당류를 포함한다.
이 방법의 경우에, 피코시아닌은 바람직하게 상기 기술된 것과 같은 아미노산 서열, 구조 및 기능적 성질을 갖는 산성-pH-내성 피코시아닌이다.
이 방법의 경우에, 피코시아닌은 본 기술에 따른 녹색 피코시아닌일 수 있다.
더 높은 농도에서, 녹색으로의 변화가 일어난다는 것을 놀랍게도 관찰하였다. 따라서, 본 발명은 적어도 0.1%의 피코시아닌, 예컨대 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 바람직하게 약 0.1%와 약 10% 사이의 피코시아닌, 여전히 바람직하게 약 0.1%와 약 1% 사이의 피코시아닌을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 피코시아닌은 (갈디에리아 피코시아닌)이다. 상기 조성물은 염기성, 중성, 또는 산성 pH를 가질 수 있다.
바람직하게, 상기 조성물은 산성 조성물, 즉 4.0 미만의 pH, 바람직하게 2.0과 4.0 사이의 pH를 갖는 조성물이다.
본 기술은 본 명세서에 기술된 특성의 모든 가능한 조합에 관한 것이고, 특히 청구항에 표시된 특성의 조합이 바람직하다는 것을 유의한다. 그러므로, 본 기술에 따른 조성물과 관련된 특성의 모든 조합, 본 기술에 따른 과정과 관련된 특성의 모든 조합 및 본 기술에 따른 조성물과 관련된 특성 및 본 기술에 따른 과정과 관련된 특성의 모든 조합이 본 명세서에 기술된다는 것을 이해할 것이다.
본 기술의 장점 중 하나는 하기 실시예에서 확인할 수 있듯이, 산성-pH-내성 피코시아닌에 의해 제공되는 착색이 시간 경과에 따라 보다 안정적이라는 사실이다.
본 기술의 다른 양태 및 특성은 실시예 및 도면을 읽으면 자명해질 것이다.
실시예
실시예 1: 갈디에리아 술푸라리아로부터 피코시아닌의 생산
균주: 갈디에리아 술푸라리아 (시아니디움 칼다리움이라고도 함) UTEX#2919. 회분식 배양 배지: 30 g/L 글리세롤, 8 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L KH2PO4, 716 mg/L MgSO4, 44 mg/L CaCl2, 3 mL/L의 Fe-EDTA 원액 (6.9 g/L FeSO4 및 9.3 g/L EDTA-Na2) 및 4 mL/L의 미량 금속 용액 (3.09 g/L EDTA-Na2; 0.080 g/L CuSO4,5H2O; 2.860 g/L H3BO3; 1.820 g/L MnCl2; 0.220 g/L ZnSO4,7H2O.
배양 조건: 배양은 본 명세서에서 참조로 편입되는 국제 특허 출원 WO 2020161280에 기술된 바와 같이 유가식 방식으로 컴퓨터-제어 자동 시스템이 구비된 1 ㎥ 유용한-부피 반응기에서 수행된다. 공급 배지 경우, 탄소원의 분량은 배양의 목표 건조 질량에 따라 조정된다. 배지의 다른 모든 성분은 실시예에서 정의된 회분식 배지에 사용되는 비율을 따르면서 첨가된다. 배양물 pH는 염기 (14% 암모니아 용액 (wNH3/w)) 및/또는 산 (4N 황산 용액)을 첨가하여 조절된다. 배양 온도는 37℃로 설정된다. 세포 성장의 추적은 800 nm에서 흡광도를 측정하여 상이한 시간에 수행되고, 건조 질량의 측정은 여과를 통해 수행된다. 성장 종료 시에 배양의 성능 특징은 하기 표 1에 요약된다.
건조물 그램 당 세포내 피코시아닌 함량의 측정은 [Modeste and colleagues, Toxicology Research and Applications VOL. 3, 1 - 13, 2019]에 의한 추출을 사용하여 측정되었고, Tris-Cl 완충액으로 포스페이트 완충액을 대체하여 [Yoshikawa and Beal, JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 91, NO. 3, 2008]에 기술된 방법으로 측정되었다.
실시예 2: 피코시아닌의 추출
균주 갈디에리아 술푸라리아 (UTEX#2919) 및/또는 시아니디오스키존 메롤라에 (ACUF199)는 실시예 1의 조건 하에서 배양되었다. 이어서 피코시아닌은 WO 2020/161280 및 WO 2018/17833에 기술된 프로토콜에 따라 추출되었고, 이들 둘 모두는 참조로 본 명세서에 편입된다. 관심 피코시아닌 이외에도, 다른 수용성 단백질을 포함하는 추출물 ("피코시아닌 추출물" 또는 "조 추출물"이라고도 함)이 수득되었다. 피코시아닌 추출물은 사용되는 추출 및/또는 정제 방법에 따라서 몇가지 가능한 품질을 가질 수 있다. 예를 들어, 조 추출물은 정제된 추출물에서 발견되는 것에 비해서, 피코시아닌 이외에도, 더 높은 양의 수용성 단백질을 함유하게 된다. 순도 지수는 전통적으로 280 nm 대비 618 nm (피코시아닌의 비흡광도)에서 용액의 흡광도의 비를 계산하여서 표시되고, 방향족 아미노산의 비흡광도는 총 단백질 수준의 아이디어를 제공한다. 이 비가 낮을수록, 용액 중 피코시아닌 이외의 단백질의 양은 더 높아진다. 조 추출물은 Spectrum® Labs의 KrosFlo® 접선 흐름 여과 시스템을 사용해 정제되었다. 표 2는 정제 이전 및 이후에 피코시아닌 추출물의 순도 지수 측정을 표시한다.
실시예 3: 음료 중 4시간 동안 피코시아닌의 안정성
실시예 1 및 2에 요약된 바와 같은 갈디에리아로부터 정제된 피코시아닌 추출물은 상이한 농도의 갈디에리아 추출물 (약 25% 피코시아닌을 함유하는 갈디에리아 추출물)이 음료의 총 중량의 0.4% (즉, 0.10% 피코시아닌), 0.2% (즉, 0.05% 피코시아닌), 및 0.1% (즉, 0.025% 피코시아닌)의 양으로 첨가된 음료 모델 (물, 7% 수크로스, 시트르산 pH 3)에서 안정성 시험 (4시간, 43℃)을 수행하는데 사용되었다.
안정성은 음성 대조군 (4℃에서 유지) 및 43℃ 처리 샘플 간 dE CMC 값을 사용하여 색차를 측정하여 평가되었다. 모델 음료는 3가지 상이한 갈디에리아 추출물 농도: 0.1%, 0.2%, 및 0.4%, 즉, 0.03 wt%, 0.06 wt% 및 0.10 wt%의 피코시아닌과 함께, 7 wt% 과립당으로 제조되었고, 50% 시트르산 용액을 사용해 pH 3.0으로 조정되었다. 샘플은 43℃ 오븐에 4시간 동안 놓여졌고, 색도계에서 측정하여 dE CMC 값을 얻었다. dE CMC가 2 이상일 때, 색차는 인간 육안으로 검출가능하다.
이 실험의 결과는 도 1에 표시되고, 시각적 비교를 위해 열처리 이후 0.1% 까지 희석된 모든 3가지 농도를 보여준다. 가장 왼쪽의 음료는 0.1% w/w 갈디에리아 추출물이고, 열처리 후에 1.9의 평균 dE CMC를 가졌다. 중간 음료는 0.2% w/w 갈디에리아 추출물이고, 열처리 후 5.475의 평균 dE CMC를 가졌다. 가장 오른쪽 음료는 0.4% w/w 갈디에리아 추출물이고, 열처리 후 16.45의 평균 dE CMC를 가졌다. 이들 결과는 조성물 중에 존재하는 피코시아닌이 많을수록, 제품 및/또는 착색은 안정성이 낮아진다는 것을 의미한다.
실시예 4: 제1 음료 시리즈에서 8주 동안 피코시아닌의 안정성
모델 음료는 8주 안정성에 대해 시험되었다. 모델 음료는 표 3에 표시된 대로 제제화되었다. 표 4는 표시된 모델 음료에 대한 전해질의 함량을 표시하고, 표 5는 표시된 모델 음료에 대한 전해질 혼합 제제를 표시한다. 갈디에리아 추출물은 약 30% 피코시아닌을 함유한다.
참조 음료는 HTST 저온살균 (BottomLine Pasteurizer, Advantage Engineering)을 사용하여 30초 동안 75℃에서 저온살균된 이후에 얼음조에서 냉각되었다. 냉각 후에, 음료는 4℃ (이것은 대조군으로서 제공됨), 암실 중 32℃, 암실 및 광선 중 25℃를 포함한 다양한 온도에서 저장되었다. 음료는 8주에 관찰 및 사진을 위해 제거되었다. 도 2A2B 는 0.2% 갈디에리아 추출물이 존재하는 전해질 음료 및 모델 음료에 대한 안정성 시험의 결과를 도시한다. 0.2%의 갈디에리아에서 음료 저장 동안 현저한 변화가 있었다. 저장 동안 색상각의 감소는 파란색에서 녹색으로 색상 변화를 의미하고, 따라서 파란색은 저장 시간이 증가함에 따라서 녹색의 뉘앙스를 보이고, 더 높은 저장 온도는 녹색쪽으로 더 많은 변화를 일으킨다는 것을 주목할 수 있다.
실시예 5: 제2 음료 시리즈에서 8주 동안 피코시아닌의 안정성
모델 음료는 8주 안정성에 대해 시험되었다. 모델 음료는 표 6에 표시된 대로 제제화되었다. 표 7은 표시된 모델 음료에 대한 전해질 혼합물 제제를 보여준다. 갈디에리아 추출물은 약 30% 피코시아닌을 함유한다.
도 3A 3B 는 0.2% 및 0.4% 갈디에리아 추출물이 존재하는 모델 음료에 대한 안정성 시험의 결과를 도시한다. 비타민 C의 첨가는 비타민 C 무첨가에 비해서 암화 (L* 값 감소)를 초래한다. 비타민 C가 부재하는 것과 비타민 C가 존재하는 것 간에 분명한 색상차는 아마도 암화 효과에 기인하는 듯하다. 비타민 C의 첨가는 갈디에리아의 피코시아닌을 기반으로 색상에 대해서 약간의 보호 효과를 보인다.
실시예 6: 비타민 C의 부재 하에 음료에서 4주 동안 피코시아닌의 안정성
비타민 C 부재 하에 음료에서 피코시아닌의 안정성을 평가하였다. 모델 음료는 표 8에 표시된 대로 제제화되었다. 이전 표 7은 표시된 모델 음료에 대한 전해질 혼합물 제제를 표시한다. 갈디에리아 추출물은 약 30% 피코시아닌을 함유한다.
참조 음료는 HTST 저온살균 (BottomLine Pasteurizer, Advantage Engineering)을 사용하여 30초 동안 75℃에서 저온살균된 이후에 얼음조에서 냉각되었다. 냉각 후에, 음료는 4℃ (이것은 대조군으로서 제공됨), 암실 중 32℃, 암실 및 광선 중 25℃를 포함한 다양한 온도에서 저장되었다. 음료는 4주에 관찰 및 사진을 위해 제거되었다. 도 4A 4B 는 0.01% 및 0.02% 갈디에리아 추출물이 존재하는 모델 음료에 대한 안정성 시험의 결과를 도시한다. 색상각은 0.02% 및 0.01% 갈디에리아에 대해서 4주 이후에 모든 저장 조건에 대해 거의 일정하게 유지되고, 달리 말해서, 갈디에리아가 0.01% 및 0.02%의 농도로 사용되었을 때, 음료 색에서 유의한 변화가 관찰되지 않았다. dE CMC 값 <3에서, 색변화는 거의 보이지 않았다. 불안정성을 일으키는 기전은 실제로 알려져 있지 않지만, 산성 pH와 연관있다. pH가 산성일수록, 피코시아닌은 더욱 불안정해진다.
실시예 7: 람다 카라기난과 조합된 갈디에리아 추출물의 안정성
모델 음료에서 갈디에리아 추출물의 안정성에 대한 람다 카라기난의 효과를 평가하였다. 모델 음료 (대조군)는 탈이온수에 과립당 12 wt%를 용해시켜서 만들었고, 음료의 총 중량에 대해, 0.05%의 갈디에리아 추출물 분말 (갈디에리아 추출물은 약 30% 피코시아닌을 함유함), 즉 0.015%의 피코시아닌, 또는 음료의 총 중량에 대해, 0.01%의 갈디에리아 추출물 분말, 즉 0.003%의 피코시아닌이었다. 람다 카라기난 분말은 1.5:1의 피코시아닌:카라기난 비를 얻기 위해서 상이한 농도로 모델 음료에 첨가되었다. 이어서 음료의 pH는 50% 시트르산을 사용하여 3으로 조정되었다. 조제물은 급속 저온살균을 통해 색변화에 대해 시험되었다. 모델 음료 및 카라기난 함유 음료를 20 ml 섬광 바이알에 넣은 다음에 80℃ 수조에서 4분 동안 침지시켰다. 이어서 바로 바이알을 얼음물에 담그고 나서 비색계로 내용물을 측정하였다. HTST 저온살균을 모의하기 위해서 각각의 음료 바이알을 80℃ 수조에 4분 동안, 그리고 이어서 얼음조에 4분 동안 두었다. 이후 dE CMC를 측정하여 색 손실을 결정하였다. dE CMC가 >2인 경우에, 가시 범위 내에 있다. 산성 음료 중 람다 카라기난의 존재는 열 안정성을 더 양호하게 하였고, 파란색 1과 유사한 색상이었다.
도 5도 6 은 급속 저온살균으로 인한 최종 색 손실을 보여준다. 각 도면에서 좌측은 비가열된 바이알이고 우측은 가열된 바이알이다. 갈디에리아의 피코시아닌: 카라기난 사진 (우측)에 비해서 대조군 사진 (좌측)에서 더 많은 색 손실을 확인할 수 있다. 이는 람다 카라기난이 갈디에리아를 안정화시키고 가열 조건에서 색을 보존하는데 도움이 된다는 것을 확인시켜 준다. 갈디에리아 0.05% 모델 음료 대조군 (좌측)은 HTST 저온살균 이후에 5.0의 dE CMC를 가진데 반해서 1.5:1 비의 갈디에리아: 카라기난 (0.0015% 갈디에리아 피코시아닌:0.01% 카라기난) (우측)은 HTST 저온살균 이후 3.4의 dE CMC를 갖는다. 이들 결과는 더 높은 농도의 갈디에리아는 생산물을 덜 안정하게 만들고, 또한 람다 카라기난은 열처리 동안 피코시아닌에 대해 보호 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
도 7 은 상업적으로 입수가능한 음료 Gatorade® 및 Powerade® (dE CMC 1.99)와 갈디에리아 피코시아닌:카라기난 (1.5:1) 함유 음료의 비교를 도시한다. 좌측 바이알은 파란색 Powerade를 함유하는 중간의 바이알 및 파란색 Gatorade를 함유하는 우측의 바이알과 비교된 1.5:1 비의 갈디에리아 피코시아닌:카라기난 모델 음료 (0.05% 갈디에리아 추출물, 0.025% 카라기난)를 보여준다. 갈디에리아 음료 및 Powerade 및 Gatorade 음료 간에 측정된 dE CMC는 1.99이다. 이것은 가시 범위 내이다. 이러한 낮은 deCMC 값은 파란색 1 함유 음료에 대한 갈디에리아 피코시아닌:카라기난 (1.5:1) 음료의 색 일치를 의미한다.
실시예 8: 급속 저온살균 시 상이한 비의 피코시아닌: 카라기난의 안정성
모델 음료 (대조군)는 탈이온수에 과립당 12 wt% 및 상이한 농도의 추출물 분말을 용해시키고 50% 시트르산 용액으로 pH를 3.0으로 조정하여 만들었다. 시험 음료는 상이한 농도로 모델 음료에 람다 카라기난 분말을 첨가한 다음에, 50% 시트르산을 사용하여 음료를 3.0의 pH로 더 조정하여 제조되었다. 적용된 피코시아닌 및 카라기난의 농도는 이하 표 9에 표시된다.
급속 저온살균을 통해 색 변화에 대해 조제물을 시험하였다. 모델 음료 및 카라기난 함유 음료는 20 ml 섬광 바이알에 넣은 다음에 80℃ 수조에서 4분 동안 침지시켰다. 그 다음에 바이알을 바로 얼음물에 담구고 나서 비색계에서 내용물을 측정하였다. 도 8 은 상이한 비의 갈디에리아 피코시아닌: 람다 카라기난의 음료의 HTST 저온살균을 도시한다. dE CMC 값 <2는 0.3:1, 및 0.6:1의 비에서 있어서, 갈디에리아:람다 카라기난의 이상적인 비가 약 0.6:1과 약 0.3:1 사이임을 의미한다.
실시예 9: 급속 저온살균 시 람다 카라기난과 조합된 갈디에리아 추출물의 안정성
카라기난 무함유 모델 음료 (대조군)는 탈이온수에 과립당을 용해시키고 갈디에리아 분말을 0.05% 농도로, 즉 조성물의 총 중량에 대해서 0.015%의 피코시아닌을 첨가하고, 50% 시트르산 용액으로 조성물의 pH를 3.0으로 조정하여 제조되었다. 시험 음료는 갈디에리아 분말 및 람다 카라기난을 5:1 비로 혼합하고, 탈이온수에 12 wt%를 얻도록 과립당을 용해시켜서 제조되었다. 다음으로 pH는 50% 시트르산을 사용해 3.0으로 조정되었다. 급속 저온살균을 통한 색 변화에 대해 조제물을 시험하였다. 모델 음료 및 카라기난 함유 음료를 20 ml 섬광 바이알에 넣은 다음에 80℃ 수조에서 4분 동안 침지시켰다. 그 다음에 바로 바이알을 얼음물에 담구고 나서 비색계에서 내용물을 측정하였다. 표 10은 dE CMC 결과를 제공한다. 결과는 모델 음료 카라기난이 열처리 동안 색에 대한 보호 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 카라기난이 부재하는 모델 음료는 좌측 사진에서 확인되는 바와 같이, 가시 범위 밖에 있는, 4.37의 평균 dE CMC를 갖는데 반해서, 카라기난 함유 음료는 1.225의 평균 dE CMC를 가져서, 좌측 사진에서 확인되는 바와 같이, 이것이 가시 범위 내에 있다는 것을 의미한다. 이것은 열처리 하에서 피코시아닌 음료 중 람다 카라기난의 보호 효과를 더욱 증명한다.
실시예 10: 음료에서 사용을 위한 녹색 농축물의 제조
녹색 농축물은 갈디에리아 추출물을 포함하는 음료에서 사용을 위해 제조되었다. 음료는 다음과 같이 제조되었다: 음료의 총 중량체 대해서 1 중량% 갈디에리아 추출물 (분말 형태, 0.30 중량%의 피코시아닌)을 DI수에 용해시켰고, 50% 시트르산으로 pH 3.0으로 조정하고, 75℃ 수조에 4시간 동안 두어서 녹색 액체를 획득하였다. 이 녹색 액체를 이어서 12% 당과 함께 2.5% 농도로 모델 음료에 첨가하였다.
실험: 가속화된 저장 기간 안정성에 대한 43℃ 오븐에서 녹색 음료의 안정성 시험. 녹색 음료는 43℃ 오븐에 배치시켰고, 3일 및 4일 후에 시험되었다. 표 11은 가속화된 저장 기간 조건에서 녹색 음료를 보여준다. 43℃ 오븐에서 3일 및 4일 후에, 녹색 음료는 각각 3.22 및 4.07의 dE CMC로서 가시 범위 밖이었다. 일부 예에서, 카라기난은 조성물이 녹색 변화를 겪은 이후에 조성물에 첨가될 수 있었다.
실시예 10bis : 갈디에리아 피코시아닌 및 비타민 C로 제조된 녹색 음료의 안정성
녹색 갈디에리아 농축물은 다음과 같이 제조된다:
1. 1%의 갈디에리아 분말을 탈이온수에 희석한다;
2. pH는 시트르산을 사용해 3.0으로 조정한다;
3. 단계 2에서 수득된 조성물을 75℃ 수조에서 4시간 동안 가열한다.
이어서 몇개 샘플은 다음을 함유하도록 이전에 수득된 녹색 추출물을 사용해 제조된다:
- 12 중량%의 결정질 수크로스; 및
- 0.1 중량% 및 0.2 중량%의 녹색 갈디에리아 농축물 또는 0.02 중량%의 분말 갈디에리아 파란색 추출물; 및
- 임의로 300 ppm의 비타민 C.
표준 파란색 갈디에리아 및 녹색 갈디에리아 추출물 간에 수득된 색상은 표 12에 표시된다.
각각의 샘플은 Suntest XLS+.에서 2시간, 광처리 이전 및 이후에 ColorQuest 비색계에서 dE CMC에 대해 시험된다. 광처리를 겪은 샘플에 대한 dE CMC는 도 11도 12에 표시된다. 결과는 비타민 C가 광처리 시에 보호 효과를 가졌다는 것을 보여준다.
실시예 10ter : 갈디에리아 피코시아닌으로 제조된 녹색 음료의 안정성
녹색 갈디에리아 농축물은 실시예 10bis에서 이전에 기술된 바와 같이 제조된다. 이어서 몇개 샘플은 다음을 함유하도록 이전에 수득된 녹색 추출물로 제조된다:
- 12 중량%의 결정질 수크로스; 및
- 0.1 중량% 및 0.2 중량%의 녹색 갈디에리아 농축물 또는 0.02 중량%의 분말 갈디에리아 파란색 추출물. 각각의 샘플은 하기 처리 이전 및 이후에 ColorQuest 비색계에서 dE CMC에 대해 시험된다:
HTST 저온살균 (80℃, 5분); 광처리: Suntest XLS+에서 2시간; 및
가속화된 열 안정성 (4일, 40℃ 오븐).
HTST를 겪은 샘플에 대한 dE CMC는 도 9도 10에 표시된다. 이들 결과의 관점에서, 녹색 음료는 파란색 (대조군)에 비해서 HTST에서 더 안정하다. 광처리를 겪은 샘플에 대한 dE CMC는 도 11도 12에 표시된다. 결과는 녹색 음료가 파란색 (대조군)에 비해서 빛에서 더 안정하다는 것을 보여준다. 가속화된 안정성 처리를 겪은 샘플에 대한 dE CMC는 도 13도 14에 표시된다. 음료 시스템 중에서 더 낮은 농도의 녹색은 파란색 대조군 음료에 비해서 더 안정한 것으로 증명된다. 사용률과 가속화된 열 안정성 간에 반비례 관계가 존재한다. 상기 관점에서, 녹색 갈디에리아 농축물 음료는 열 및 빛 하에서 안정하다.
실시예 11: 상이한 pH 하에서 람다 카라기난과 조합된 상이한 피코시아닌 추출물의 안정성
음료는 12% 당으로 만들어졌고, pH는 50% 시트르산 용액을 사용해 조정되었다. 색 함량은 0.06%의 갈디에리아 및 스피룰리나 추출물, 즉 음료의 총 중량에 대해서 0.018 중량%의 피코시아닌이었고, 람다-카라기난은 0.01% 및 0.06%로 첨가되었다. "모델" 또는 "대조군" 음료는 카라기난이 첨가되지 않는다. "그대로" 음료는 시트르산 첨가없이 제조된 음료이다. 적용된 피코시아닌 및 카라기난의 각 농도는 이하 표 13에 표시된다.
조제물은 HTST 저온살균을 통한 색 변화에 대해 시험되었다. 모델 음료 및 카라기난 함유 음료는 20 ml 섬광 바이알에 넣은 다음에 80℃ 수조에서 4분 동안 침지되었다.
이하 도 15A 내지 18B 는 열처리 전에 다양한 pH 수준에서 카라기난 음료를 도시한다. 갈디에리아 및 스피룰리나 둘 모두는 pH가 감소됨에 따라서 카라기난 시스템에서 녹색이 되기 시작하는데 반해서, 갈디에리아는 스피룰리나에 비해서 보다 노란색의 색조를 갖는다. 역시 열처리 전에, 스피룰리나 대조군 음료는 침전되어서 pH 3.5 이하에서 흐릿해지는 반면, 갈디에리아 대조군은 반투명하였고 침전되지 않았다.
dE CMC는 ColorQuest 비색계에서 측정되었고, 도 19에 기록되었다. 이들 결과는 카라기난 함유 음료가 카라기난을 함유하지 않은 대조군 음료에 비해서 보다 더 열 안정하다는 것을 보여준다. 그러나, 스피룰리나 및 갈디에리아 음료는 다양한 출발 pH 수준에서 카라기난의 존재 하에서 상이하게 거동한다. 예를 들어, pH 3.2에서, 0.3:1 갈디에리아 음료는 스피룰리나 음료에 비해 더 안정하였고, "그대로" 샘플은 pH 4.3에서 그 반대가 사실이었다.
이들 결과는 갈디에리아 추출물 및 카라기난 둘 모두를 함유하는 음료가 스피룰리나 추출물 및 카라기난 둘 모두를 함유하는 음료에 비해서 보다 더 열 안정하다는 것을 보여준다.
또한, 갈디에리아 유래 피코시아닌 및 카라기난을 갖는 산성 조성물은 pH가 3.0 초과 및 4.0 이하일 때 스피룰리나 유래 피코시아닌을 갖는 것에 비해서 열처리 하에서 훨씬 더 안정하다고 결론내릴 수 있다.
실시예 12: 급속 저온살균 시 상이한 비의 피코시아닌: 카라기난의 안정성
음료는 12% 당으로 만들었고, pH는 50% 시트르산 용액을 사용해 3.0 및 4.0로 조정되었다. 색 함량은 0.06%의 갈디에리아 및 스피룰리나 추출물, 즉, 음료의 총 중량에 대해 0.018 중량%의 피코시아닌이었고, 람다-카라기난은 0.01% 및 0.06%로 첨가되었다. 적용된 피코시아닌 및 카라기난의 각 농도는 이전에 표시된 표 13에서와 동일하다. "모델" 또는 "대조군" 음료는 카라기난이 첨가되지 않는다.
HTST 저온살균을 통한 색 변화에 대해 조제물을 시험하였다. 모델 음료 및 카라기난 함유 음료를 20 ml 섬광 바이알에 넣은 다음에 80℃ 수조에서 4분 동안 침지시켰다. 열처리 이전에, 색상은 카라기난을 포함하는 갈디에리아 및 스피룰리나 기반 음료 간에 상이하다. 갈디에리아 경우는 스피룰리나의 것에 비해서 더 많은 노란색 색조를 갖는다. dE CMC는 ColorQuest 비색계에서 측정되었고, 도 20에 기록되었다. 20 은 pH 3.0 및 4.0에서 카라기난이 첨가된 갈디에리아 및 스피룰리나 음료의 비교를 도시한다. 결과는 스피룰리나-카라기난 함유 음료는 pH 4.0에서 동일한 pH에서의 갈디에리아-카라기난 음료와 상이하게 거동한다는 것을 더욱 증명한다. 이들 결과는 갈디에리아 추출물 및 카라기난 둘 모두를 함유하는 음료가 카라기난을 함유하지 않는 대조군 음료 및 스피룰리나 추출물 및 카라기난 둘 모두를 함유하는 음료에 비해 보다 더 열 안정하다는 것을 보여준다. 또한, 갈디에리아 유래 피코시아닌 및 카라기난이 존재하는 산성 조성물은 pH가 3.0 초과 및 4.0 이하일 때 스피룰리나 유래 피코시아닌이 존재하는 것에 비해서 열처리 하에서 훨씬 더 안정하다고 결론내릴 수 있다.
서열 정보:
Figure pct00021
본 명세서에 인용된 모든 참조문헌, 및 그들의 참조 문헌은 추가적이거나 또는 대안적인 상세 설명, 특성, 및/또는 기술 배경의 교시를 위해서 적절한 경우에 그들 전체로 본 명세서에 참조로 편입된다.
본 개시는 특히 특정 구현예를 참조하여 표시되고 기술되었지만, 상기 개시된 변동 및 다른 특성 및 기능, 또는 이의 대안은 바람직하게 많은 다른 상이한 시스템 또는 적용에 조합될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 또한, 다양한 현재 예측하지 못하거나 또는 예상하지 못한 대안, 변형, 변이 또는 개선을 이후에 당업자가 만들 수 있을 것이며, 그 역시 하기 청구항에 포괄하고자 한다.
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Claims (54)

  1. 피코시아닌을 포함하는 산성 조성물로서, 피코시아닌은 약 0.001 wt%와 약 0.1 wt% 사이 범위의 양으로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 피코시아닌은 약 0.001 wt%와 약 0.05 wt% 사이 범위의 양으로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 피코시아닌은 약 0.001 wt%와 약 0.025 wt% 사이 범위의 양으로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 피코시아닌은 약 0.0025 wt%와 약 0.010 wt% 사이 범위의 양으로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 피코시아닌은 약 0.0025 wt%와 약 0.005 wt% 사이 범위의 양으로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌은 피코빌리단백질이고, 이의 아포단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 산성 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌의 α-서브유닛 아포단백질은 SEQ ID NO: 1을 포함하고, 피코시아닌의 β-서브유닛 아포단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 산성 조성물.
  8. 제7항에 있어서, α-서브유닛 아포단백질은 SEQ ID NO: 1로 이루어지고, β-서브유닛 아포단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 이의 변이체로 이루어지는 것인 산성 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌은 시아니디알레스 (Cyanidiales) 목의 조류 또는 미세조류로부터 추출되는 것인 산성 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌은 시아니디아세아에 (Cyanidiaceae) 과의 조류 또는 미세조류로부터 추출되는 것인 산성 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌은 갈디에리아세아에 (Galdieriaceae) 과의 조류 또는 미세조류로부터 추출되는 것인 산성 조성물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌은 시아니디오스키존 (Cyanidioschyzon), 시아니디움 (Cyanidium) 또는 갈디에리아 (Galdieria) 속의 조류 또는 미세조류로부터 추출되는 것인 산성 조성물.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌은 시아니디오스키존 메롤라에 (Cyanidioschyzon merolae) 10D, 시아니디오스키존 메롤라에 (Cyanidioschyzon merolae) DBV201, 시아니디움 칼다리움 (Cyanidium caldarium), 시아니디움 대달룸 (Cyanidium daedalum), 시아니디움 막시뭄 (Cyanidium maximum), 시아니디움 파르티툼 (Cyanidium partitum), 시아니디움 룸펜스 (Cyanidium rumpens), 갈디에리아 대달라 (Galdieria daedala), 갈디에리아 막시마 (Galdieria maxima), 갈디에리아 파르티타 (Galdieria partita), 갈디에리아 플레그레아 (Galdieria phlegrea), 갈디에리아 술푸라리아 (Galdieria sulphuraria), 우선적으로 갈디에리아 술푸라리아 (Galdieria sulphuraria), 시아니디움 칼다리움 (Cyanidium caldarium), 및 시아니디오스키존 메롤라에 (Cyanidioschyzon merolae)종으로부터 선택되는 종의 조류 또는 미세조류로부터 추출되는 것인 산성 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌은 산성-pH-내성 피코시아닌인 산성 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약 4 이하의 pH를 갖는 것인 산성 조성물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약 3 초과 및 약 4 이하의 pH를 갖는 것인 산성 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 황산화 다당류의 양을 더 포함하는 것인 산성 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류는 약 0.20:1과 약 20:1 사이, 바람직하게 약 0.25:1과 약 10:1 사이 또는 약 1:1 내지 약 10:1, 여전히 바람직하게 약 0.3:1과 약 1.5:1 사이의 비로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 적어도 하나의 황산화 다당류는 카라기난인 산성 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 카라기난은 다중-황산화 카라기난인 산성 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 다중-황산화 카라기난은 람다 카라기난인 산성 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 액체인 것을 특징으로 하는 것인 산성 조성물.
  23. 제22항에 따른 산성 조성물을 포함하는 탄산 음료.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고체인 것을 특징으로 하는 것인 산성 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 피코시아닌 함량은 0.25 mg/g 내지 2.5 mg/g인 것을 특징으로 하는 것인 산성 조성물.
  26. 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류를 포함하는 산성 조성물로서, 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류는 약 0.20:1과 약 20:1 사이, 바람직하게 약 0.25:1과 약 10:1 사이의 비 또는 약 1:1과 약 10:1 사이, 여전히 바람직하게 약 0.3:1과 약 1.5:1 사이의 비로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 적어도 하나의 황산화 다당류는 카라기난인 산성 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 카라기난은 다중-황산화 카라기난인 산성 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 다중-황산화 카라기난은 람다 카라기난인 산성 조성물.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌은 약 0.05 wt%와 약 0.1 wt% 사이 범위의 양으로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 황산화 다당류는 약 0.001 wt%와 0.1 wt% 사이 범위의 양으로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  32. 제26항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 황산화 다당류는 약 0.05 wt%와 0.1 wt% 사이 범위의 양으로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  33. 제26항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류는 약 1:1과 약 4:1 사이의 비로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  34. 제26항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류는 약 1:1과 약 3:1 사이의 비로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  35. 제26항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌 및 적어도 하나의 황산화 다당류는 약 1:1과 약 2:1 사이의 비로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  36. 제26항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약 4 이하의 pH를 갖는 것인 산성 조성물.
  37. 제26항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약 3 초과 및 약 4 이하의 pH를 갖는 것인 산성 조성물.
  38. 갈디에리아 추출물을 포함하는 산성 조성물로서, 갈디에리아 추출물은 약 0.004 wt%와 약 0.4 wt% 사이 범위의 양으로 조성물에 존재하는 것인 산성 조성물.
  39. 제1항 내지 제22항 및 제24항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 정의된 바와 같은 산성 조성물을 포함하는 식품.
  40. 피코시아닌을 포함하는 농축 액상 조성물로서, 피코시아닌은 약 50 mg/L와 약 2500 mg/L 사이 범위의 양으로 농축 조성물에 존재하는 것인 농축 액상 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 피코시아닌은 약 500 mg/L와 약 1000 mg/L 사이 범위의 양으로 농축 조성물에 존재하는 것인 농축 액상 조성물.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 적어도 하나의 황산화 다당류를 더 포함하는 것인 농축 액상 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 적어도 하나의 황산화 다당류는 카라기난인 농축 액상 조성물.
  44. 제56항에 있어서, 카라기난은 람다 카라기난인 농축 액상 조성물.
  45. 제53항 내지 제57항 중 어느 하나의 항에 정의된 바와 같은 농축 액상 조성물을 포함하는 식품.
  46. 제39항 또는 제45항에 있어서, 4 미만의 pH를 갖는 것인 식품.
  47. 제39항, 제45항 또는 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 가열되었고/되었거나 빛에 노출된 것을 특징으로 하는 것인 식품.
  48. 제39항, 제45항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 저온살균, 예컨대 급속 저온살균이 수행된 것인 식품.
  49. 제1항 내지 제22항, 제24항, 또는 제40항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피코시아닌은 열 및/또는 광 노출에 안정한 것인 조성물.
  50. 피코시아닌의 열 안정성 및/또는 광 안정성을 개선시키기 위한 방법으로서,
    a) 물에 적어도 하나의 황산화 다당류를 첨가하고 용해시키는 단계; 및
    b) 피코시아닌을 첨가하고 적어도 5의 pH, 바람직하게 5와 10 사이의 pH에서 용해될 때까지 혼합시키는 단계
    를 포함하는 것인 개선 방법.
  51. 녹색 색소를 제조하는 방법으로서, 약 30℃ 내지 약 90℃의 온도에서 약 3.6 또는 3.6 미만의 pH의 수성 용액 중에 피코시아닌을 가열하는 단계를 포함하고, 피코시아닌은 시아니디오스키존 (Cyanidioschyzon), 시아니디움 (Cyanidium) 또는 갈디에리아 (Galdieria) 속의 조류 또는 미세조류로부터 추출되는 것인 제조 방법.
  52. 제51항에 따른 방법을 사용하여 수득된 녹색 피코시아닌.
  53. 제52항에 있어서, 제50항에 따른 방법에 의해서 안정화되는 것인 녹색 피코시아닌.
  54. 제52항에 따른 녹색 색소 또는 제53항에 따른 안정화된 녹색 색소를 포함하는 생산물.
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