KR20240066998A - Method for cell panning - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 패닝 방법, 상기 방법에 이용되는 벡터, 및 상기 방법에 이용되는 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 세포 패닝 방법에 따르면, 표적 항원에 특이적인 결합력을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 높은 정확도로 선별할 수 있다.The present invention relates to methods of cell panning, vectors used in the methods, and transformed cells used in the methods. According to the cell panning method of the present invention, antibodies or antigen-binding fragments thereof that have specific binding ability to the target antigen can be selected with high accuracy.
Description
본 발명은 세포 패닝 방법, 상기 방법에 이용되는 벡터, 및 상기 방법에 이용되는 형질전환된 세포에 관한 것이다.The present invention relates to methods of cell panning, vectors used in the methods, and transformed cells used in the methods.
파지 디스플레이(phage display) 기술은 박테리오 파지의 표면에 항체의 단편을 발현시켜 스크리닝하는 기술로, M13 PIII 파지에 기반한 디스플레이 기술이 가장 널리 이용되고 있다. 이러한 파지 디스플레이 기술은 유전자 재조합으로 발현된 항체 단편을 박테리오파지의 표면에 발현시켜 일반적인 패닝(panning) 또는 비드 패닝(bead panning) 방법으로 스크리닝을 진행한다. 패닝에 사용되는 항원은 대부분 정제된 재조합 단백질을 항원으로 사용한다. 일부 세포 표면 단백질은 그들의 고유 형태를 유지하는 재조합 형태로 발현될 수 없기 때문에, 재조합 단백질을 사용하여 선별된 항체는 세포 표면 상의 원래 단백질에 결합하지 않을 수 있는 문제가 있다.Phage display technology is a screening technology that expresses antibody fragments on the surface of bacteriophages, and display technology based on M13 PIII phage is the most widely used. This phage display technology expresses antibody fragments expressed through genetic recombination on the surface of bacteriophages and performs screening using general panning or bead panning methods. Most antigens used in panning are purified recombinant proteins. Because some cell surface proteins cannot be expressed in a recombinant form that maintains their native conformation, there is a problem that antibodies selected using recombinant proteins may not bind to the original protein on the cell surface.
일반적인 세포 패닝 방법은 도 1에 나타낸 바와 같이, 증폭된 파지 디스플레이 라이브러리를 표적 항원이 과발현된 세포주와 일정 시간 동안 반응을 시키고, 결합하지 않은 파지를 세척한 다음, 표적 항원에 결합한 파지를 얻기 위해 트립신(Trypsin) 또는 트리에틸아민(triethylamine: TEA)을 처리하는 단계를 거친다. 그러나, 상기 세포 패닝 방법은 표적 항원뿐만 아니라 그 이외의 세포 단백질에 결합한 파지도 같이 회수되는 문제가 있다. 또한, 표적 항원을 과발현시킨 경우에도 세포에서 표적 항원의 분포가 크지 않기 때문에, 회수된 대부분의 파지는 표적 항원보다는 다른 항원에 결합하는 비특이적 결합력을 갖는 파지일 확률이 더 높다.As shown in Figure 1, the general cell panning method is to react the amplified phage display library with a cell line overexpressing the target antigen for a certain period of time, wash the unbound phage, and then use trypsin to obtain the phage that bound to the target antigen. It goes through a treatment step with trypsin (Trypsin) or triethylamine (TEA). However, the cell panning method has the problem of recovering not only the target antigen but also phages bound to other cell proteins. In addition, even when the target antigen is overexpressed, since the distribution of the target antigen in the cell is not large, it is more likely that most of the recovered phages are phages with non-specific binding ability to bind to other antigens rather than the target antigen.
따라서, 표적 항원에 특이적인 결합력을 갖는 양성 파지를 선별하기 위한 기술이 필요한 실정이다.Therefore, there is a need for technology to select positive phages that have specific binding ability to the target antigen.
이에 본 발명자들은 표적 항원에 특이적인 결합력을 갖는 양성 파지를 효율적으로 선별하기 위한 기술을 개발하고자 연구한 결과, 종래기술과 비교하여 현저하게 높은 정확도로 양성 파지를 선별할 수 있는 세포 패닝 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors conducted research to develop a technology to efficiently select positive phages with specific binding ability to the target antigen, and as a result, established a cell panning method that can select positive phages with significantly higher accuracy compared to the prior art. By doing this, the present invention was completed.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, 표적 항원에 특이적인 결합력을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 선별하기 위한 세포 패닝 방법을 제공한다.To achieve the above object, one aspect of the present invention provides a cell panning method for selecting an antibody or antigen-binding fragment thereof having specific binding ability to a target antigen.
본 발명의 다른 측면은, 상기 방법에 이용되는 벡터를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a vector used in the above method.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환된 세포를 제공한다.Another aspect of the present invention provides transformed cells into which the vector has been introduced.
본 발명의 세포 패닝 방법에 따르면, 표적 항원에 특이적인 결합력을 갖는 파지 즉, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 높은 정확도로 선별할 수 있다.According to the cell panning method of the present invention, phages with specific binding ability to the target antigen, that is, antibodies or antigen-binding fragments thereof, can be selected with high accuracy.
도 1은 일반적인 세포 패닝 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 세포외 도메인과 세포내 도메인 사이에 트롬빈 절단 부위를 추가하고 용출 시 트롬빈을 이용하여 항원에 결합된 항체만을 선별하는 방법을 나타낸 모식도이다. 여기서, (A)는 기존 방법에 따른 선별 방법을, (B)는 본 발명에 따른 선별 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 pcDNA3 벡터에 항원의 세포외 도메인 및 트롬빈 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 부가하여 제작한 발현 벡터를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 각 회차에 따라 얻은 수득물을 사용하여 표적 항원에 대한 폴리 파지 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 DLL3에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 모노 파지 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5b는 DLL3에 특이적으로 결합하는 항체를 최종 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 FACS를 수행한 결과를 나타낸 도면이다. 여기서, 총 47개의 테스트 클론 중 음성 및 양성으로 확인된 각각의 파지에 대한 일 예를 나타낸 것이다. 또한, Reference 1 및 2는 ㈜와이바이오로직스에서 개발한 항-DLL3 항체이다.
도 6a 내지 도 6c는 PTK7(PTK7 ECD-ICD1, PTK7 ECD-ICD2, PTK7 ECD-ICD3)에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 모노 파지 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 여기서, ICD1, ICD2, ICD3은 다른 ICD 유전자 3종류를 사용한 것을 표시한 것이다.
도 6d는 PTK7에 특이적으로 결합하는 항체를 최종 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 FACS를 수행한 결과를 나타낸 도면이다. 여기서, 총 90개의 테스트 클론 중 양성 및 음성으로 확인된 각각의 파지에 대한 일 예를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7c는 NECTIN4(NECTIN4 ECD-ICD1, NECTIN4 ECD-ICD2, NECTIN4 ECD-ICD3)에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 모노 파지 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 여기서, ICD1, ICD2, ICD3은 다른 ICD 유전자 3종류를 사용한 것을 표시한 것이다.
도 7d는 NECTIN4에 특이적으로 결합하는 항체를 최종 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 FACS를 수행한 결과를 나타낸 도면이다. 여기서, 총 83개의 테스트 클론 중 양성 및 음성으로 확인된 각각의 파지에 대한 일 예를 나타낸 것이다.
도 8a는 SIGLEC10(Sialic Acid Binding Ig Like Lectin 10) 재조합 단백질을 적용하여 수행한 기존 파지 디스플레이 패닝 방법을 나타내는 모식도이다.
도 8b는 SIGLEC10 재조합 단백질을 적용하여 수행한 기존 파지 디스플레이 패닝 방법을 통해 SIGLEC10에 특이적으로 결합하는 항체를 최종 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8c는 SIGLEC10 재조합 단백질을 적용하여 수행한 기존 파지 디스플레이 패닝 방법을 통해 SIGLEC10에 특이적으로 결합하는 항체를 최종 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 FACS를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a는 SIGLEC10 서열을 포함하는 합성 펩티드를 적용하여 수행한 기존 펩티드 파지 디스플레이 패닝 방법을 나타내는 모식도이다.
도 9b는 기존 펩티드 파지 디스플레이 패닝 방법을 통해 SIGLEC10에 특이적으로 결합하는 항체를 최종 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9c는 기존 펩티드 파지 디스플레이 패닝 방법을 통해 SIGLEC10에 특이적으로 결합하는 항체를 최종 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 FACS를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10a는 SIGLEC10의 세포외 도메인(EDC)을 HEK293E 동물세포에 과발현시킨 세포주를 적용하여 수행한, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포-기반 파지 디스플레이 패닝 방법을 나타내는 모식도이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포-기반 파지 디스플레이 패닝 방법을 통해 SIGLEC10에 특이적으로 결합하는 항체를 최종 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10c는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포-기반 파지 디스플레이 패닝 방법을 통해 SIGLEC10에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하고, 선별된 항체를 사용하여 FACS를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11a는 일반 HEK293E 세포를 대상으로 본 발명의 일 실시예에 따른 항-SIGLEC10 항체의 결합력을 테스트한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11b는 인간 SIGLEC7 발현 HEK293E 세포를 대상으로 본 발명의 일 실시예에 따른 항-SIGLEC10 항체의 결합력을 테스트한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11c는 인간 SIGLEC10 발현 HEK293E 세포를 대상으로 본 발명의 일 실시예에 따른 항-SIGLEC10 항체의 결합력을 테스트한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12a는 인간 SIGLEC7 일시적 발현 HEK293E 세포를 대상으로 본 발명의 일 실시예에 따른 항-SIGLEC10 항체의 결합력을 테스트한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12b는 원숭이 SIGLEC10 일시적 발현 HEK293E 세포를 대상으로 본 발명의 일 실시예에 따른 항-SIGLEC10 항체의 결합력을 테스트한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12c는 인간 SIGLEC10 일시적 발현 HEK293E 세포를 대상으로 본 발명의 일 실시예에 따른 항-SIGLEC10 항체의 결합력을 테스트한 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 1 is a schematic diagram showing a general cell panning method.
Figure 2 is a schematic diagram showing a method of adding a thrombin cleavage site between the extracellular and intracellular domains of an antigen and selecting only antibodies bound to the antigen using thrombin during elution, according to an embodiment of the present invention. Here, (A) schematically shows the selection method according to the existing method, and (B) schematically shows the selection method according to the present invention.
Figure 3 schematically shows an expression vector constructed by adding the nucleotide sequence encoding the extracellular domain of the antigen and the thrombin cleavage site to the pcDNA3 vector.
Figure 4 is a graph showing the results of polyphage ELISA for the target antigen using the results obtained in each round.
Figure 5a is a graph showing the results of selecting antibodies that specifically bind to DLL3 and performing monophage ELISA using the selected antibodies.
Figure 5b is a diagram showing the results of final selection of antibodies specifically binding to DLL3 and FACS using the selected antibodies. Here, an example of each phage confirmed as negative and positive among a total of 47 test clones is shown. Additionally, Reference 1 and 2 are anti-DLL3 antibodies developed by Y Biologics Co., Ltd.
Figures 6a to 6c are graphs showing the results of selecting antibodies that specifically bind to PTK7 (PTK7 ECD-ICD1, PTK7 ECD-ICD2, PTK7 ECD-ICD3) and performing monophage ELISA using the selected antibodies. am. Here, ICD1, ICD2, and ICD3 indicate the use of three different ICD genes.
Figure 6d is a diagram showing the results of final selection of antibodies specifically binding to PTK7 and FACS using the selected antibodies. Here, an example of each phage confirmed as positive and negative among a total of 90 test clones is shown.
Figures 7a to 7c are graphs showing the results of selecting antibodies that specifically bind to NECTIN4 (NECTIN4 ECD-ICD1, NECTIN4 ECD-ICD2, NECTIN4 ECD-ICD3) and performing monophage ELISA using the selected antibodies. am. Here, ICD1, ICD2, and ICD3 indicate the use of three different ICD genes.
Figure 7d is a diagram showing the results of final selection of antibodies specifically binding to NECTIN4 and FACS using the selected antibodies. Here, an example of each phage confirmed as positive and negative among a total of 83 test clones is shown.
Figure 8a is a schematic diagram showing the existing phage display panning method performed by applying SIGLEC10 (Sialic Acid Binding Ig Like Lectin 10) recombinant protein.
Figure 8b is a graph showing the results of final selection of antibodies specifically binding to SIGLEC10 through the existing phage display panning method performed by applying SIGLEC10 recombinant protein, and ELISA using the selected antibodies.
Figure 8c is a diagram showing the results of final selection of antibodies specifically binding to SIGLEC10 through the existing phage display panning method performed by applying SIGLEC10 recombinant protein, and performing FACS using the selected antibodies.
Figure 9a is a schematic diagram showing the existing peptide phage display panning method performed by applying a synthetic peptide containing the SIGLEC10 sequence.
Figure 9b is a graph showing the results of final selection of antibodies specifically binding to SIGLEC10 through the existing peptide phage display panning method and ELISA using the selected antibodies.
Figure 9c is a diagram showing the results of final selection of antibodies specifically binding to SIGLEC10 through the existing peptide phage display panning method and performing FACS using the selected antibodies.
Figure 10a is a schematic diagram showing a cell-based phage display panning method according to an embodiment of the present invention, performed by applying a cell line overexpressing the extracellular domain (EDC) of SIGLEC10 in HEK293E animal cells.
Figure 10b is a graph showing the results of final selection of antibodies specifically binding to SIGLEC10 through a cell-based phage display panning method according to an embodiment of the present invention, and ELISA using the selected antibodies.
Figure 10c is a diagram showing the results of selecting an antibody that specifically binds to SIGLEC10 through a cell-based phage display panning method according to an embodiment of the present invention, and performing FACS using the selected antibody.
Figure 11a is a graph showing the results of testing the binding affinity of the anti-SIGLEC10 antibody according to an embodiment of the present invention to normal HEK293E cells.
Figure 11b is a graph showing the results of testing the binding affinity of an anti-SIGLEC10 antibody according to an embodiment of the present invention to HEK293E cells expressing human SIGLEC7.
Figure 11c is a graph showing the results of testing the binding affinity of an anti-SIGLEC10 antibody according to an embodiment of the present invention to HEK293E cells expressing human SIGLEC10.
Figure 12a is a graph showing the results of testing the binding affinity of an anti-SIGLEC10 antibody according to an embodiment of the present invention to HEK293E cells transiently expressing human SIGLEC7.
Figure 12b is a graph showing the results of testing the binding affinity of the anti-SIGLEC10 antibody according to an embodiment of the present invention to HEK293E cells transiently expressing monkey SIGLEC10.
Figure 12c is a graph showing the results of testing the binding affinity of an anti-SIGLEC10 antibody according to an embodiment of the present invention to HEK293E cells transiently expressing human SIGLEC10.
세포 패닝 방법Cell Panning Method
본 발명의 일 측면은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 라이브러리로부터 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 추출하는 세포 패닝(cell panning) 방법을 제공한다. 이때, 상기 세포 패닝 방법은 하기의 단계를 포함한다:One aspect of the present invention provides a cell panning method for extracting an antibody or fragment thereof that specifically binds to a target protein from a library of antibodies or antigen-binding fragments thereof. At this time, the cell panning method includes the following steps:
(i) 상기 표적 단백질 및 프로테아제 절단 부위(protease cleavage site)를 포함하는 융합 단백질이 표면에 발현된 세포를 준비하는 단계;(i) preparing cells on which a fusion protein containing the target protein and a protease cleavage site is expressed on the surface;
(ii) 상기 세포 및 상기 라이브러리를 결합시키는 단계;(ii) combining the cells and the library;
(iii) 상기 세포를 세척하는 단계;(iii) washing the cells;
(iv) 상기 세척된 세포에 프로테아제를 가하여 표적 단백질 및 이에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 용출시키는 단계; 및(iv) adding protease to the washed cells to elute the target protein and the antibody or antigen-binding fragment thereof bound thereto; and
(v) 상기 (iv) 용출물로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하는 단계.(v) Obtaining an antibody or antigen-binding fragment thereof from the eluate (iv).
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin: Ig)"과 상호교환적으로 사용된다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond: SS-bond)로 결합한다. 항체는 예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM일 수 있다. 상기 항체는 모노클론 항체 또는 폴리클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 동물 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 또는 인간 항체일 수 있다. As used herein, the term "antibody" is used interchangeably with the term "immunoglobulin (Ig)." A complete antibody has two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain binds to the heavy chain through a disulfide bond (SS-bond). The antibody may be, for example, IgA, IgD, IgE, IgG, or IgM. The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. The antibody may be an animal-derived antibody, a mouse-human chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody.
본 명세서에서 사용된 용어, "항원 결합 단편(antigen-binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 말한다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fv, Fab, Fab', Fv F(ab')2, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), Bis-scFv, 나노바디(nanobody), 또는 이들의 조합일 수 있다.As used herein, the term "antigen-binding fragment" refers to a fragment of the overall structure of an immunoglobulin, and refers to a portion of a polypeptide containing a portion to which an antigen can bind. For example, the antigen-binding fragment is scFv, (scFv) 2 , Fv, Fab, Fab', Fv F(ab') 2 , diabody, triabody, tetrabody, Bis- It may be an scFv, a nanobody, or a combination thereof.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 변형된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 접합(conjugation) 또는 결합, 당화(glycosylation), 태그 부착, 또는 이들의 조합으로 변형된 것일 수 있다. 상기 항체는 항암제와 같은 다른 약물과 접합될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 호스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase: HRP), 알칼린 포스파타아제, 합텐(hapten), 비오틴, 스트렙타비딘, 형광 물질, 방사성 물질, 양자점, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol: PEG), 히스티딘 태그, 또는 이들의 조합과 결합된 것일 수 있다. 상기 형광 물질은 Alexa Fluor®532, Alexa Fluor®546, Alexa Fluor®568, Alexa Fluor®680, Alexa Fluor®750, Alexa Fluor®790, 또는 Alexa Fluor®350일 수 있다.The antibody or antigen-binding fragment thereof may be modified. For example, the antibody or antigen-binding fragment thereof may be modified by conjugation or binding, glycosylation, tagging, or a combination thereof. The antibody can be conjugated with other drugs such as anticancer drugs. For example, the antibody or antigen-binding fragment thereof may include horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, hapten, biotin, streptavidin, fluorescent substances, radioactive substances, quantum dots, and polyethylene. It may be combined with glycol (polyethylene glycol: PEG), a histidine tag, or a combination thereof. The fluorescent material may be Alexa Fluor®532, Alexa Fluor®546, Alexa Fluor®568, Alexa Fluor®680, Alexa Fluor®750, Alexa Fluor®790, or Alexa Fluor®350.
본 명세서에서 사용된 용어, "세포 패닝(cell panning)"은 "세포-기반 패닝(cell-based panning)" 또는 "바이오패닝(biopanning)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 세포 패닝은 파지의 외피(coat)에 펩티드를 디스플레이(display)하는 파지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 수용체 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩티드를 표면에 발현하고 있는 파지만을 선택하는 과정을 말한다.As used herein, the term "cell panning" refers to "cell-based panning" or may be used interchangeably with "biopanning" The cell panning selects only phages that express peptides on the surface that have the property of binding to target molecules (antibodies, enzymes, cell surface receptors, etc.) from a phage library that displays peptides on the phage coat. It refers to the process of selection.
상기 방법은 (i) 표적 단백질 및 프로테아제 절단 부위(protease cleavage site)를 포함하는 융합 단백질이 표면에 발현된 세포를 준비하는 단계를 포함한다.The method includes the step of (i) preparing a cell on which a fusion protein containing a target protein and a protease cleavage site is expressed on the surface.
상기 융합 단백질은 표적 단백질 및 프로테아제 절단 부위(protease cleavage site)를 포함한다.The fusion protein includes a target protein and a protease cleavage site.
상기 표적 단백질은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 기타 자연적으로 발생된 화합물이거나 합성된 화합물일 수 있다. 구체적으로, 표적 단백질은 폴리펩티드 또는 단백질이며, 세포 표면에 존재하는 단백질일 수 있다. 상기 표적 단백질은 표적 단백질 또는 표적 항원의 세포외 도메인(extracellular domain)일 수 있다.The target protein may be a polypeptide, carbohydrate, nucleic acid, lipid, hapten, or other naturally occurring or synthetic compound. Specifically, the target protein is a polypeptide or protein, and may be a protein present on the cell surface. The target protein may be an extracellular domain of a target protein or target antigen.
상기 프로테아제 절단 부위는 당업자에게 알려진 프로테아제 절단 부위가 모두 이용가능하다. 상기 프로테아제 절단 부위는 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 아스파라진 펩티드 분해효소(lyase)로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제로 절단가능한 부위일 수 있다.As for the protease cleavage site, all protease cleavage sites known to those skilled in the art can be used. The protease cleavage site may be a site cleavable by a protease selected from the group consisting of serine protease, cysteine protease, threonine protease, aspartic protease, glutamic acid protease, metalloprotease, and asparagine peptidase (lyase).
상기 프로테아제 절단 부위는 트롬빈, 퓨린, 인자 Xa, 메탈로프로테아제, 엔테로키나제, 카텝신, HRV3C(Human Rhinovirus 3C) 프로테아제 및 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 절단 가능한 부위일 수 있다. 트롬빈에 절단 가능한 부위는 다음과 같은 조건에 따라 선택될 수 있다(CHANG J., Eur J Biochem, vol.151, issue 2, pp.217-224 (1985)). 참고로, "-∥-"는 절단되는 부위를 나타낸다.The protease cleavage site may be a cleavable site for one or more selected from the group consisting of thrombin, purine, factor there is. The cleavable site for thrombin can be selected according to the following conditions (CHANG J., Eur J Biochem , vol.151, issue 2, pp.217-224 (1985)). For reference, "-∥-" indicates the area to be cut.
조건 1: A-B-Pro-Arg-∥-X-Y (A, B는 각각 소수성의 아미노산, X, Y는 비산성의 아미노산임)Condition 1: A-B-Pro-Arg-∥-X-Y (A, B are hydrophobic amino acids, X, Y are non-acidic amino acids, respectively)
일 실시예로서 프로테아제 절단 부위는 "LVPRGS (서열번호 1)"의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다. As an example, the protease cleavage site may be a peptide consisting of the amino acid sequence "LVPRGS (SEQ ID NO: 1)".
조건 2: Gly-Arg-∥-Gly Condition 2: Gly-Arg-∥-Gly
또한, 트롬빈에 절단 가능한 부위는 다음과 같은 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다(Maike Gallwitz et al., PloS one, vol. 7, issue 2 (2012)).Additionally, the cleavable site for thrombin may be a peptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of the following amino acid sequences (Maike Gallwitz et al., PloS one , vol. 7, issue 2 (2012)).
LTPRGVRL (서열번호 2)LTPRGVRL (SEQ ID NO: 2)
LWPRGVRL (서열번호 3)LWPRGVRL (SEQ ID NO: 3)
LTPRGWRL (서열번호 4)LTPRGWRL (SEQ ID NO: 4)
상기 프로테아제 절단 부위는 상기 표적 단백질과 상기 세포 사이에 위치할 수 있다.The protease cleavage site may be located between the target protein and the cell.
상기 융합 단백질은 제2 단백질을 더 포함할 수 있다. 상기 제2 단백질은 융합 단백질의 부가적인 구성요소로서 표적 단백질을 제외한 임의의 항원일 수 있다.The fusion protein may further include a second protein. The second protein is an additional component of the fusion protein and may be any antigen other than the target protein.
상기 제2 단백질은 리포터 또는 마커 단백질일 수 있다. 상기 리포터는 루시퍼라아제(luciferase), GFP(Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein), mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein), BFP(Blue Fluorescent Protein), CFP(Cyan Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), AzG(Azami Green), HcR(HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP(Blue Fluorescent Protein)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.The second protein may be a reporter or marker protein. The reporter includes luciferase, GFP (Green Fluorescent Protein), RFP (Red Fluorescent Protein), mRFP (Monomeric Red Fluorescent Protein), BFP (Blue Fluorescent Protein), CFP (Cyan Fluorescent Protein), and YFP (Yellow Fluorescent Protein). Protein), AzG (Azami Green), HcR (HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein), and BFP (Blue Fluorescent Protein).
상기 제2 단백질은 막투과 단백질 또는 세포내 도메인일 수 있다.The second protein may be a transmembrane protein or an intracellular domain.
상기 융합 단백질은 N 말단으로부터 표적 단백질, 프로테아제 절단 부위 및 제2 단백질의 순서로 이루어질 수 있다.The fusion protein may be composed of a target protein, a protease cleavage site, and a second protein in the following order from the N terminus.
상기 융합 단백질은 표적 단백질의 C 말단 또는 표적 단백질과 제2 단백질의 사이에 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 프로테아제를 이용하여 표적 단백질에 특이적으로 결합한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 세포로부터 분리할 수 있다. 보다 상세하게는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 파지 디스플레이에 발현된 형태일 경우, 표적 단백질에 특이적으로 결합한 파지만을 선별할 수 있다.The fusion protein includes a protease cleavage site at the C terminus of the target protein or between the target protein and the second protein, and an antibody or antigen-binding fragment thereof specifically bound to the target protein can be isolated from the cell using a protease. . More specifically, when an antibody or antigen-binding fragment thereof is expressed on phage display, only phages that specifically bind to the target protein can be selected.
상기 융합 단백질이 표면에 발현된 세포는 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터가 도입된 형질전환된 세포일 수 있다.The cell on which the fusion protein is expressed on the surface may be a transformed cell into which a polynucleotide encoding the fusion protein or a vector containing the same has been introduced.
상기 방법은 (ii) 상기 세포 및 상기 라이브러리를 결합시키는 단계를 포함한다.The method includes the step of (ii) combining the cells and the library.
상기 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 상기 파지 디스플레이 라이브러리(또는 파지 라이브러리)는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 상기 파지 디스플레이 라이브러리는 복수의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 파지의 입자 표면에 발현하는 파지의 집합을 말한다. 항체 라이브러리로부터 임의의 항원에 대해 특이적 항체를 분리하기 위해서는 매우 높은 다양성이 요구되며, 서로 다른 항체 클론들로 이루어진 라이브러리가 구축되어 사용될 수 있다. 상기 파지는 박테리오파지일 수 있다.The library may be a phage display library. The phage display library (or phage library) may include antibodies or antigen-binding fragments thereof. The phage display library refers to a collection of phages that express a plurality of antibodies or antigen-binding fragments thereof on the surface of phage particles. In order to isolate specific antibodies for any antigen from an antibody library, a very high diversity is required, and a library composed of different antibody clones can be constructed and used. The phage may be a bacteriophage.
상기 결합은 당업자에게 알려진 조건 또는 완충액 이용 등의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 결합은 0℃ 내지 실온에서 수행될 수 있다.The binding may be performed using conditions known to those skilled in the art or methods such as using a buffer solution. For example, the bonding may be performed at 0° C. to room temperature.
상기 세포 및 상기 라이브러리를 결합하여, 상기 세포의 표면에 존재하는 임의의 항원과 파지 디스플레이 라이브러리의 파지가 결합할 수 있다. 이 경우, 표적 항원뿐만 아니라 세포 표면의 단백질에 파지가 결합할 수 있다.By combining the cells and the library, the phage of the phage display library can bind to any antigen present on the surface of the cell. In this case, the phage can bind not only to the target antigen but also to proteins on the cell surface.
상기 방법은 (iii) 상기 세포를 세척하는 단계를 포함한다. 상기 세척에 의해 세포에 결합하지 않은 파지를 제거할 수 있다. 상기 세척은 당업자에게 알려진 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 완충액은 PBS, DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 등일 수 있다.The method includes the step of (iii) washing the cells. Phage that does not bind to cells can be removed by the washing. The washing can be performed using a buffer known to those skilled in the art. The buffer solution may be PBS, DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline), etc.
상기 방법은 (iv) 상기 세척된 세포에 프로테아제를 가하여 표적 단백질 및 이에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 용출시키는 단계를 포함한다.The method includes the step of (iv) adding protease to the washed cells to elute the target protein and the antibody or antigen-binding fragment thereof bound thereto.
상기 프로테아제(protease)는 단백질을 이루고 있는 아미노산 간의 펩티드 결합을 가수분해하는 효소를 말한다. 상기 프로테아제는 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 아스파라진 펩티드 분해효소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.The protease refers to an enzyme that hydrolyzes peptide bonds between amino acids forming proteins. The protease may be selected from the group consisting of serine protease, cysteine protease, threonine protease, aspartic protease, glutamic acid protease, metalloprotease, and asparagine peptidase.
상기 프로테아제는 트롬빈, 퓨린, 인자 Xa, 메탈로프로테아제, 엔테로키나제, 카텝신, HRV3C(Human Rhinovirus 3C) 프로테아제 및 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 프로테아제에 의해, 상기 세포의 표면에 존재하는 표적 단백질에 특이적으로 결합한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 선별할 수 있다.The protease may be selected from the group consisting of thrombin, purine, factor Using the protease, an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a target protein present on the surface of the cell can be selected.
상기 방법은 (v) 상기 (iv) 용출물로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하는 단계를 포함한다.The method includes the step of (v) obtaining an antibody or antigen-binding fragment thereof from the eluate (iv).
상기 용출물로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하는 단계는 당업자에게 알려진 분리 또는 정제 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 분리 또는 정제 방법은 크로마토그래피, 여과, 원심분리, 투석, 면역블로팅, 침전, 분리정제, 건조, 농축 등의 방법을 이용하여 수행할 수 있다.The step of obtaining an antibody or antigen-binding fragment thereof from the eluate can be performed using separation or purification methods known to those skilled in the art. The separation or purification method can be performed using methods such as chromatography, filtration, centrifugation, dialysis, immunoblotting, precipitation, separation and purification, drying, and concentration.
상기 방법은 (vi) 수득된 항체 또는 이의 항원 결합 단편들을 증폭시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 파지를 이용할 경우, 수득된 파지를 헬퍼 파지(helper phage)의 존재 하에서 제2 세포, 즉 증폭 세포에 접종할 수 있다. 상기 헬퍼 파지는 파지 또는 파지미드(phagemid)가 파지 입자로 조립되도록 필요한 유전정보를 제공하는 파지이다. 파지미드에는 파지 유전자 중 gIII 혹은 그 일부만이 존재하므로 파지 또는 파지미드로 형질전환된 숙주세포(형질전환체)를 헬퍼 파지로 감염시켜 나머지 파지 유전자를 공급할 수 있다. M13K07 혹은 VCSM13 등의 종류가 있으며, 대부분 카나마이신(kanamycin) 등 항생제 내성 유전자를 포함하여 헬퍼 파지에 감염된 형질전환체를 선택할 수 있다. 또한, 조립 신호(packaging signal)에 결함이 있으므로 헬퍼 파지 유전자보다 파지미드 유전자가 선별적으로 파지 입자 속으로 조립될 수 있다.The method may further include the step of (vi) amplifying the obtained antibody or antigen-binding fragments thereof. When using phage, the obtained phage can be inoculated into a second cell, that is, an amplification cell, in the presence of a helper phage. The helper phage is a phage that provides the necessary genetic information so that the phage or phagemid can be assembled into phage particles. Since only gIII or part of the phage genes are present in phagemid, the remaining phage genes can be supplied by infecting a host cell (transformant) transformed with phage or phagemid with a helper phage. There are types such as M13K07 or VCSM13, and most of them contain antibiotic resistance genes such as kanamycin, so transformants infected with helper phage can be selected. Additionally, because the packaging signal is defective, phagemid genes may be selectively assembled into phage particles rather than helper phage genes.
상기 증폭된 항체 또는 이의 항원 결합 단편들을 라이브러리 대신에 제공하여, 상기 단계 (ii) 내지 단계 (v)를 반복할 수 있다.The amplified antibodies or antigen-binding fragments thereof may be provided instead of the library, and steps (ii) to (v) may be repeated.
상기 방법은 상기 단계 (ii) 전에, 상기 융합 단백질을 발현하지 않는 세포와 상기 라이브러리를 결합하여 표적 항원에 비특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제거하는 단계, 소위 프리-클리어링(pre-clearing) 단계를 더 포함할 수 있다.The method includes, before step (ii), combining the library with cells that do not express the fusion protein to remove antibodies or antigen-binding fragments thereof that non-specifically bind to the target antigen, so-called pre-clearing. ) may further include steps.
기존의 패닝 방법은 통상적으로 3회 내지 4회의 반복적인 실험을 통해 이루어지는데, 타겟 이외의 물질에 대한 비특이적인 결합으로 노이즈(noise)가 발생하는 단점이 있다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 패닝 방법은 도 4에 도시된 바와 같이, 2회의 패닝만으로도 항원에 대한 양성 클론을 유의미하게 추출할 수 있는 장점이 있다.Existing panning methods are typically performed through repeated experiments three to four times, but have the disadvantage of generating noise due to non-specific binding to materials other than the target. However, as shown in FIG. 4, the cell panning method according to an embodiment of the present invention has the advantage of significantly extracting positive clones for an antigen with only two panning operations.
세포 패닝 방법에 이용되는 벡터Vectors used in cell panning methods
본 발명의 다른 측면은, 표적 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.Another aspect of the invention is a first polynucleotide encoding a target protein; and a second polynucleotide encoding a protease cleavage site.
상기 벡터는 제2 단백질을 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.The vector may further include a third polynucleotide encoding a second protein.
상기 표적 단백질, 프로테아제 절단 부위 및 제2 단백질은 전술한 바와 같다.The target protein, protease cleavage site, and second protein are as described above.
본 명세서에서 사용된 용어, "폴리뉴클레오티드"는 "핵산"으로도 지칭되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.As used herein, the term "polynucleotide", also referred to as "nucleic acid", refers to a polymer of nucleotides of any length. Specifically, the polynucleotide may be DNA or RNA.
본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 일 실시예에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 운반하거나 발현시키기 위한 물질을 의미한다. 상기 벡터는 발현 벡터, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체를 포함한다.The term "vector" used herein refers to a material for transporting or expressing a polynucleotide encoding a fusion protein according to one embodiment. The vectors include expression vectors, plasmids, phage vectors, viral vectors, episomes and artificial chromosomes.
상기 벡터는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.The vector can be introduced into a host cell and recombined and inserted into the host cell genome. Alternatively, the vector is understood as a nucleic acid vehicle containing a polynucleotide sequence capable of spontaneous replication as an episome. The vectors include linear nucleic acids, plasmids, phagemids, cosmids, RNA vectors, viral vectors and analogs thereof. Examples of viral vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 또는 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)일 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다.The vector may be plasmid DNA, phage DNA, etc., commercially developed plasmids (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP, etc.), E. coli-derived plasmids (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids, etc. (pUB110, pTP5, etc.), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24, YCp50, etc.), phage DNA (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP, etc.), animal viral vectors (retrovirus, adenovirus, etc.) It may be a virus (adenovirus, vaccinia virus, etc.), or an insect viral vector (baculovirus, etc.). Since the expression level and modification of the protein of the vector varies depending on the host cell, the host cell most suitable for the purpose can be selected and used.
상기 벡터는 5'말단으로부터 표적 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 벡터는 표적 단백질 및 프로테아제 절단 부위를 포함하는 융합 단백질의 발현을 위한 것일 수 있다. 상기 발현은 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합 단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.The vector may be one in which a first polynucleotide encoding a target protein and a second polynucleotide encoding a protease cleavage site are operably linked from the 5' end. The vector may be for expression of a fusion protein containing a target protein and a protease cleavage site. The expression is understood to mean transcription of the DNA sequence, translation of the mRNA transcript and secretion of the fusion protein product or fragment thereof. A useful expression vector may be RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) or variants thereof. The expression vector may include a human CMV (cytomegalovirus) promoter to promote continuous transcription of the target gene in mammalian cells, and a polyadenylation signal sequence to increase the steady-state level of RNA after transcription.
세포 패닝 방법에 이용되는 형질전환된 세포Transformed cells used in cell panning methods
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환된 세포를 제공한다.Another aspect of the present invention provides transformed cells into which the vector has been introduced.
상기 벡터는 전술한 바와 같다.The vector is the same as described above.
상기 세포는 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 원핵세포로서 대장균을 사용할 수 있다. 예를 들어, 진핵세포로서 효모를 사용할 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있다. 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용가능하다.The cells are host cells and may include cells of prokaryotic, eukaryotic, mammalian, plant, insect, fungal or cellular origin. For example, Escherichia coli can be used as the prokaryotic cell. For example, yeast can be used as the eukaryotic cell. For example, mammalian cells may include CHO cells, F2N cells, CSO cells, BHK cells, Bowes melanoma cells, HeLa cells, 911 cells, AT1080 cells, A549 cells, HEK 293 cells, or HEK293T cells. there is. Any cell that can be used as a mammalian host cell known to those skilled in the art can be used.
상기 형질전환은 상기 세포로 벡터를 도입하는 것을 말한다. 상기 형질전환은 형질도입 및 형질감염을 포함할 수 있다. 상기 형질전환은 CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.The transformation refers to introducing a vector into the cell. The transformation may include transduction and transfection. The transformation is performed using CaCl 2 precipitation, Hanahan method, which increases efficiency by using a reducing substance called DMSO (dimethyl sulfoxide) in CaCl 2 precipitation, electroporation, calcium phosphate precipitation, protoplasm fusion method, and silicon carbide fiber. Stirring method using, Agrobacteria-mediated transformation method, transformation method using PEG, dextran sulfate, lipofectamine, and drying/inhibition-mediated transformation method, etc. can be used.
상기 형질전환된 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.The method of culturing the transformed cells can be performed using methods widely known in the art. Specifically, the culture may be continuously cultured in a batch process or fed batch or repeated fed batch process.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
I. 기존 세포 패닝I. Panning existing cells
비교예 1. 기존 세포 패닝 방법Comparative Example 1. Existing cell panning method
세포 패닝 방법은 크게 하기 4 단계로 이루어진다.The cell panning method largely consists of the following four steps.
i) 항원-제시 세포 및 항체-제시 라이브러리를 준비하는 단계;i) preparing antigen-presenting cells and antibody-presenting libraries;
ii) 결합 단계;ii) combining step;
iii) 세척 단계; 및iii) washing step; and
iv) 용출 단계.iv) Elution step.
단계 i)에서, 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 세포에 형질감염시켜 항원-제시 세포를 제작하고, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 파지(phage) 라이브러리를 준비한다.In step i), antigen-presenting cells are produced by transfecting cells with a vector containing a polynucleotide encoding the antigen, and a phage library containing a polynucleotide encoding the antibody is prepared.
단계 ii)에서, 형질감염된 세포와 파지 라이브러리를 인큐베이션하여 결합시킨다.In step ii), the transfected cells and the phage library are incubated to allow binding.
단계 iii)에서, 세척을 통해 라이브러리 중 결합되지 않은 파지(즉, 항체)를 제거한다.In step iii), unbound phage (i.e., antibodies) in the library are removed through washing.
단계 iv)에서, 형질감염된 세포에 결합된 파지(즉, 항체)만을 추출한다.In step iv), only phage (i.e. antibodies) bound to the transfected cells are extracted.
II. 트롬빈 절단 부위를 추가한 항원을 이용한 세포 패닝II. Cell panning using antigen with added thrombin cleavage site
실시예 1. 트롬빈 절단 부위를 추가한 항원을 이용한 세포 패닝 방법(프리-클리어링 단계 불포함)Example 1. Cell panning method using antigen with added thrombin cleavage site (pre-clearing step not included)
실시예 1.1. 트롬빈 절단 부위를 갖는 항원을 발현하는 벡터의 준비Example 1.1. Preparation of vectors expressing antigens with thrombin cleavage sites
pcDNA3 벡터에 항원의 세포외 도메인 및 트롬빈 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 부가하여 발현 벡터를 제작하였다(도 3). 이때, 트롬빈 절단 부위는 항원의 세포외 도메인과 막투과 단백질 사이에 위치하도록 발현 벡터를 제작하였다. 항원을 생산하는 방법은 대한민국 공개특허 제10-2018-0016320호, 제10-2022-0088847호 등을 참조한다. 사용된 트롬빈 절단 부위의 아미노산 서열은 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(서열번호 1)으로서, 이를 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열은 어느 것을 사용하여도 무방하다.An expression vector was created by adding the nucleotide sequence encoding the extracellular domain of the antigen and the thrombin cleavage site to the pcDNA3 vector (Figure 3). At this time, the expression vector was constructed so that the thrombin cleavage site was located between the extracellular domain of the antigen and the transmembrane protein. For methods of producing antigens, refer to Korean Patent Publication Nos. 10-2018-0016320 and 10-2022-0088847. The amino acid sequence of the thrombin cleavage site used is Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO: 1), and any nucleotide sequence capable of encoding this may be used.
실시예 1.2. 형질감염Example 1.2. transfection
형질감염 전날 형질감염시킬 세포를 3.5x106 cells/mL 내지 4x106 cells/mL로 준비하고, 세포를 고포도당 DMEM (10%(v/v) FBS + 1%(w/v) Antibiotics 함유) 배지를 함유한 90 mm 배양 접시에 접종하였다. 다음날 기존에 있던 고포도당 DMEM (10%(v/v) FBS + 1%(w/v) Antibiotics 함유) 배지를 제거하고 9 mL의 새로운 배지로 바꿔, 항원-제시 세포를 준비하였다.The day before transfection, cells to be transfected were prepared at 3.5x10 6 cells/mL to 4x10 6 cells/mL, and the cells were cultured in high-glucose DMEM (containing 10% (v/v) FBS + 1% (w/v) Antibiotics) medium. was inoculated into a 90 mm culture dish containing . The next day, the existing high-glucose DMEM (containing 10% (v/v) FBS + 1% (w/v) Antibiotics) medium was removed and replaced with 9 mL of new medium to prepare antigen-presenting cells.
항체-제시 라이브러리의 형질감염을 위해, 1.5 mL 마이크로튜브 2개에 고포도당 DMEM (10%(v/v) FBS + 1%(w/v) Antibiotics 함유) 배지를 500 ㎕씩 넣어주었다. 배지가 들어있는 1.5 mL 마이크로튜브에 준비된 벡터와 폴리에틸렌이민(polyethylenimine: PEI)을 넣어주었다. 벡터가 들어있는 배지 500 ㎕와 PEI가 들어있는 배지 500 ㎕를 하나로 합쳐준 뒤 약 15분 내지 약 20분 동안 인큐베이션하여 반응물을 준비하였다.For transfection of the antibody-presenting library, 500 μl of high-glucose DMEM (containing 10% (v/v) FBS + 1% (w/v) Antibiotics) medium was added to two 1.5 mL microtubes. The prepared vector and polyethylenimine (PEI) were added to a 1.5 mL microtube containing medium. A reaction product was prepared by combining 500 ㎕ of medium containing the vector and 500 ㎕ of medium containing PEI into one and incubating for about 15 to 20 minutes.
그 후, 1 mL 피펫으로 세포 배양 접시의 벽면을 통해 준비된 반응물을 넣어주었다. 형질감염 후 약 48시간 뒤에 세포 패닝을 진행하였다.Afterwards, the prepared reaction was added through the wall of the cell culture dish using a 1 mL pipette. Cell panning was performed approximately 48 hours after transfection.
실시예 1.3. 세포 패닝Example 1.3. cell panning
단계 1) 형질감염 후 48시간 뒤에 Accutase cell detachment solution과 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 세포를 회수하였다.Step 1) 48 hours after transfection, cells were recovered with Accutase cell detachment solution and DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline).
단계 2) 회수한 세포를 1300 rpm의 속도에서 3분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 세포에 10 mL의 DPBS-RED(2%(v/v) FBS 함유) 및 600 ㎕의 준비된 라이브러리를 첨가하고, 혼합기에서 30분 동안 인큐베이션하여 결합시켰다.Step 2) The recovered cells were centrifuged at 1300 rpm for 3 minutes to remove the supernatant. 10 mL of DPBS-RED (containing 2% (v/v) FBS) and 600 μl of the prepared library were added to the cells and incubated in a mixer for 30 minutes to allow binding.
단계 3) 30분 뒤 1300 rpm의 속도에서 3분 동안 원심분리한 후, 상등액을 버리고 세포 펠릿은 10 mL의 DPBS(2%(v/v) FBS 함유)로 풀어주었다.Step 3) After 30 minutes, centrifugation was performed at 1300 rpm for 3 minutes, the supernatant was discarded, and the cell pellet was dissolved in 10 mL of DPBS (containing 2% (v/v) FBS).
단계 4) 풀어준 세포를 15 mL 코니칼 튜브로 옮겨준 다음, 혼합기에서 5분 동안 세척하고, 같은 과정을 5번 반복하였다.Step 4) The released cells were transferred to a 15 mL conical tube, washed in a mixer for 5 minutes, and the same process was repeated 5 times.
단계 5) 세척이 완료된 세포에 500 ㎕의 트롬빈 용출 완충액을 넣어 세포를 풀어주었다. 풀어진 세포를 1.5 mL 마이크로튜브로 옮기고, 혼합기에서 밤새 인큐베이션하였다. 이때, 15 mL 코니칼 튜브에 남아있는 DPBS(2%(v/v) FBS 함유)를 1 mL 피펫으로 완전히 제거한 후 용출 완충액을 넣어주었다.Step 5) 500 ㎕ of thrombin elution buffer was added to the washed cells to release them. The released cells were transferred to a 1.5 mL microtube and incubated in a mixer overnight. At this time, the DPBS (containing 2% (v/v) FBS) remaining in the 15 mL conical tube was completely removed with a 1 mL pipette, and then the elution buffer was added.
- 트롬빈 용출 완충액 제조(볼텍싱 하지 않음)- Preparation of thrombin elution buffer (without vortexing)
·트롬빈 절단 완충액 490 ㎕ (-20℃ 보관)·Thrombin cleavage buffer 490 ㎕ (stored at -20℃)
·비오틴화된 트롬빈 10 ㎕ (-80℃ 보관)·Biotinylated thrombin 10㎕ (stored at -80℃)
단계 6) 다음날, 세포를 13000 rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하였다. 500 ㎕의 상등액을 OD600 = 0.45 내지 0.5까지 키운 XL1-Blue 컴피턴트(competent) 세포 10 mL에 넣고, 반응물을 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하였다.Step 6) The next day, the cells were centrifuged at a speed of 13000 rpm for 10 minutes. 500 μl of the supernatant was added to 10 mL of XL1-Blue competent cells grown to OD 600 = 0.45 to 0.5, and the reaction was incubated in a 37°C incubator for 1 hour.
단계 7) 1시간 뒤 세포를 플레이팅하고, 세포를 배양하여 세포로부터 증폭된 파지를 수득하였였다.Step 7) After 1 hour, the cells were plated and the cells were cultured to obtain amplified phage from the cells.
단계 8) 세포로부터 증폭된 파지를 이용하여 단계 2의 과정부터 반복하였다. 2회 차 및 3회 차의 경우, 라이브러리 대신 단계 7의 증폭된 파지를 이용하였다.Step 8) The process from step 2 was repeated using the phage amplified from the cells. For rounds 2 and 3, the amplified phage from step 7 was used instead of the library.
실시예 2. 트롬빈 절단 부위를 추가한 항원을 이용한 세포 패닝 방법(프리-클리어링 단계 포함)Example 2. Cell panning method using antigen with added thrombin cleavage site (including pre-clearing step)
실시예 2.1. 트롬빈 절단 부위를 갖는 항원을 발현하는 벡터의 준비Example 2.1. Preparation of vectors expressing antigens with thrombin cleavage sites
실시예 1.1에 기재된 방법과 동일하게 벡터를 준비하였다.The vector was prepared in the same manner as described in Example 1.1.
실시예 2.2. 형질감염Example 2.2. transfection
실시예 1.2.에 기재된 방법과 동일하게 형질감염을 수행하였다.Transfection was performed in the same manner as described in Example 1.2.
실시예 2.3. 세포 패닝Example 2.3. cell panning
단계 1) 형질감염 후 48시간 뒤에 Accutase cell detachment solution과 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 세포를 회수하였다.Step 1) 48 hours after transfection, cells were recovered with Accutase cell detachment solution and DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline).
단계 2) 회수한 세포를 1300 rpm의 속도에서 3분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 혼합기에서 다음과 같은 조건으로 블로킹(blocking) 및 프리-클리어링(pre-clearing)을 진행하였다.Step 2) The recovered cells were centrifuged at 1300 rpm for 3 minutes to remove the supernatant. Blocking and pre-clearing were performed in the mixer under the following conditions.
- 1회 차 블로킹 및 프리-클리어링 과정- 1st blocking and pre-clearing process
HEK293E 세포 단독: 10 mL의 DPBS-RED(2%(v/v) FBS 함유) + 600 ㎕의 라이브러리(15 mL 코니칼 튜브)HEK293E cells alone: 10 mL of DPBS-RED (containing 2% (v/v) FBS) + 600 μl of library (15 mL conical tube)
형질감염 세포: 10 mL의 DPBS-RED(2%(v/v) FBS 함유)(50 mL 코니칼 튜브)Transfection cells: 10 mL of DPBS-RED (containing 2% (v/v) FBS) (50 mL conical tube)
- 2회 차 및 3회 차의 블로킹 및 프리-클리어링 과정- 2nd and 3rd rounds of blocking and pre-clearing process
HEK293E 세포 단독: 15 mL의 DPBS-RED(2%(v/v) FBS 함유) + 15 mL의 파지 상등액(50 mL 코니칼 튜브)HEK293E cells alone: 15 mL of DPBS-RED (containing 2% (v/v) FBS) + 15 mL of phage supernatant (50 mL conical tube)
형질감염 세포: 15 mL의 DPBS-RED(2%(v/v) FBS 함유)(50 mL 코니칼 튜브)Transfection cells: 15 mL of DPBS-RED (containing 2% (v/v) FBS) (50 mL conical tube)
단계 3) 약 3 내지 약 5시간 후 HEK293E 세포 단독만 10,000 rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하고 상등액을 회수하였다.Step 3) After about 3 to about 5 hours, HEK293E cells alone were centrifuged at a speed of 10,000 rpm for 10 minutes and the supernatant was recovered.
단계 4) HEK293E 세포 단독의 상등액과 형질감염 세포를 50 mL 코니칼 튜브에 하나로 합치고, 혼합기에서 30분 동안 인큐베이션하여 결합시켰다.Step 4) The supernatant of HEK293E cells alone and the transfected cells were combined into one 50 mL conical tube and incubated in a mixer for 30 minutes to combine.
단계 5) 30분 뒤 1300 rpm의 속도에서 3분 동안 원심분리한 후, 상등액을 버리고 세포 펠릿은 10 mL의 DPBS(2%(v/v) FBS 함유)로 풀어주었다.Step 5) After 30 minutes, centrifugation was performed at 1300 rpm for 3 minutes, the supernatant was discarded, and the cell pellet was dissolved in 10 mL of DPBS (containing 2% (v/v) FBS).
단계 6) 풀어준 세포를 15 mL 코니칼 튜브로 옮겨준 다음, 혼합기에서 5분 동안 세척하고, 같은 과정을 5번 반복하였다.Step 6) The released cells were transferred to a 15 mL conical tube, washed in a mixer for 5 minutes, and the same process was repeated 5 times.
단계 7) 세척이 완료된 세포에 500 ㎕의 트롬빈 용출 완충액을 넣어 세포를 풀어주었다. 풀어진 세포를 1.5 mL 마이크로튜브로 옮기고, 혼합기에서 밤새 인큐베이션하였다. 이때, 15 mL 코니칼 튜브에 남아있는 DPBS(2%(v/v) FBS 함유)를 1 mL 피펫으로 완전히 제거한 후 용출 완충액을 넣어주었다.Step 7) 500 ㎕ of thrombin elution buffer was added to the washed cells to release them. The released cells were transferred to a 1.5 mL microtube and incubated in a mixer overnight. At this time, the DPBS (containing 2% (v/v) FBS) remaining in the 15 mL conical tube was completely removed with a 1 mL pipette, and then the elution buffer was added.
- 트롬빈 용출 완충액 제조(볼텍싱 하지 않음)- Preparation of thrombin elution buffer (without vortexing)
·트롬빈 절단 완충액 490 ㎕ (-20℃ 보관)·Thrombin cleavage buffer 490 ㎕ (stored at -20℃)
·비오틴화된 트롬빈 10 ㎕ (-80℃ 보관)·Biotinylated thrombin 10㎕ (stored at -80℃)
단계 8) 다음날, 세포를 13000 rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하였다. 500 ㎕의 상등액을 OD600 = 0.45 내지 0.5까지 키운 XL1-Blue 컴피턴트(competent) 세포 10 mL에 넣고, 반응물을 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하였다.Step 8) The next day, the cells were centrifuged at a speed of 13000 rpm for 10 minutes. 500 μl of the supernatant was added to 10 mL of XL1-Blue competent cells grown to OD 600 = 0.45 to 0.5, and the reaction was incubated in a 37°C incubator for 1 hour.
단계 9) 1시간 뒤 세포를 플레이팅하고, 세포를 배양하여 세포로부터 증폭된 파지를 수득하였였다.Step 9) After 1 hour, the cells were plated and the cells were cultured to obtain amplified phage from the cells.
단계 10) 세포로부터 증폭된 파지를 이용하여 단계 2의 과정부터 반복하였다.Step 10) The process from step 2 was repeated using the phage amplified from the cells.
실시예 3. 폴리 파지 ELISAExample 3. Polyphage ELISA
각 회차의 세포 패닝을 통해 얻어진 폴리(poly) scFv-파지 항체 풀(pool)의 항원 특이성을 알아보기 위해 폴리 파지 ELISA를 수행하였다.Poly phage ELISA was performed to determine the antigen specificity of the poly scFv-phage antibody pool obtained through each round of cell panning.
구체적으로, 항원-6x His와 항원-hFc로 각각 코팅한 면역-플레이트(immuno-plate)와 비특이적 결합(non-specific binding)의 지표로 사용된 ITGA6-Fc 단백질로 코팅된 면역-플레이트를 이용하여 각 회차에서 얻어진 파지 풀로 동시에 ELISA를 수행하였다. ELISA의 음성 대조군(negative control)으로 항체가 디스플레이되지 않은 M13 파지인 AB#38을 같이 사용하였다.Specifically, using an immuno-plate coated with antigen-6x His and antigen-hFc, respectively, and an immuno-plate coated with ITGA6-Fc protein, which was used as an indicator of non-specific binding. ELISA was performed simultaneously with the phage pool obtained from each round. AB#38, an M13 phage that does not display antibodies, was used as a negative control for ELISA.
실시예 4. 모노 파지 ELISAExample 4. Monophage ELISA
실시예 3의 폴리 파지 ELISA에서 결합능이 큰 것으로 확인된 3회 차 세포 패닝의 양성 파지 풀로부터 수천여 개의 모노 클론들을 선별하였다. 이들을 96-딥웰 플레이트(96-deep well plate)에서 헬퍼 파지를 감염시켜 배양한 다음, 상층액에 존재하는 모노 scFv-파지를 항원이 코팅된 면역-플레이트에 옮겨 ELISA를 수행하였다. 이때, 항원-6x His 또는 항원-hFc에 대한 모노 파지 ELISA와 비특이적 항원 대조군인 IGA6-Fc 단백질에 대한 ELISA도 동시에 수행하여, 얻어진 양성 파지 클론이 항원에 특이적인지를 확인하였다.Thousands of monoclones were selected from the positive phage pool of the third round of cell panning, which was confirmed to have high binding ability in the polyphage ELISA of Example 3. They were cultured by infecting helper phage in a 96-deep well plate, and then the mono scFv-phage present in the supernatant was transferred to an antigen-coated immuno-plate and ELISA was performed. At this time, monophage ELISA for antigen-6x His or antigen-hFc and ELISA for IGA6-Fc protein, a non-specific antigen control, were simultaneously performed to confirm whether the obtained positive phage clone was specific for the antigen.
실시예 5. 결합 특이도 분석Example 5. Binding specificity analysis
모노 파지 ELISA를 통해 최종 선별된 클론들에 대해서 각각 ELISA 및 FACS(유세포 분석기인 CytoFLEX(Beckman Coulter, 미국)를 사용)를 수행하여 결합 특이도를 분석하였다.The binding specificity was analyzed by performing ELISA and FACS (using a flow cytometer, CytoFLEX (Beckman Coulter, USA)), respectively, on the clones finally selected through monophage ELISA.
III. 세포 패닝 횟수에 따른 선별 효율성의 평가III. Evaluation of selection efficiency according to cell panning number
실시예 6. 세포 패닝Example 6. Cell Panning
실시예 2에 기재된 바와 같은 방법으로 세포 패닝을 수행하였다. 음성 대조군으로서 용출 완충액을 사용하고, 트롬빈 용출 완충액 대신 TEA 용출 완충액을 사용하여 용출을 수행하였다. 그리고 1 내지 3회에 걸쳐 세포 패닝을 수행하였다.Cell panning was performed in the same manner as described in Example 2. Elution buffer was used as a negative control, and elution was performed using TEA elution buffer instead of thrombin elution buffer. Then, cell panning was performed 1 to 3 times.
실시예 7. 폴리 파지 ELISAExample 7. Polyphage ELISA
각 회차에 따라 얻은 수득물을 사용하여 표적 항원에 대한 폴리 파지 ELISA (실시예 3 참조)를 수행하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.Polyphage ELISA (see Example 3) for the target antigen was performed using the product obtained in each round, and the results are shown in Figure 4.
도 4에 나타난 바와 같이, 트롬빈을 사용한 용출 시 TEA를 사용한 음성 대조군에 비해, 2회 세포 패닝 후에 항원 결합력이 높은 클론들을 상당수 얻은 것을 확인하였다.As shown in Figure 4, compared to the negative control using TEA during elution using thrombin, it was confirmed that a significant number of clones with high antigen binding affinity were obtained after cell panning twice.
실시예 8. 모노 파지 ELISAExample 8. Monophage ELISA
실시예 7에서 선별된 모노 클론들을 사용하여 모노 파지 ELISA(실시예 4 참조)를 수행하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.Monophage ELISA (see Example 4) was performed using the monoclones selected in Example 7, and the results are shown in Table 1.
표 1에 나타난 바와 같이, 용출 완충액에 따라 양성 파지의 획득 확률에 차이가 발생하는 것을 확인하였다. 즉, 트롬빈 용출 완충액을 사용한 용출에 의해 더 많은 양성 파지를 획득하였다.As shown in Table 1, it was confirmed that there was a difference in the probability of acquiring positive phages depending on the elution buffer. That is, more positive phages were obtained by elution using thrombin elution buffer.
IV. 특정 항원에 대한 항체들의 선별 시험IV. Screening test for antibodies to specific antigens
실시예 9. 항-DLL3 항체의 선별Example 9. Selection of anti-DLL3 antibodies
실시예 2에 기재된 방법을 이용하여 DLL3(delta-like ligand 3)에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였고, 실시예 3 및 4에 기재된 방법에 따라 ELISA를 수행하여 항원에 특이적인 클론들을 최종 선별한 다음, 이들에 대하여 실시예 5에 기재된 방법에 따라 ELISA 및 FACS를 수행하였다.Antibodies specifically binding to DLL3 (delta-like ligand 3) were selected using the method described in Example 2, and ELISA was performed according to the method described in Examples 3 and 4 to finally select antigen-specific clones. Then, ELISA and FACS were performed on them according to the method described in Example 5.
모노 파지 ELISA를 수행한 결과를 도 5a에 나타내었다. 도 5a에서, X 축은 표적 항원 이외의 불특정 항원에 대한 결합력("NEGATIVE")을 나타내고, Y 축은 표적 항원에 대한 결합력("POSITIVE")을 나타낸다. 두 수치의 접점을 원형으로 표시하고, 여기서 1개의 원형은 scFv 파지 클론 1종에 대한 결합력(특이적 또는 비특이적)을 나타낸다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, 상당수의 양성 클론이 확인되었다.The results of monophage ELISA are shown in Figure 5a. In FIG. 5A, the The contact point of the two numbers is indicated by a circle, where one circle represents the binding affinity (specific or non-specific) to one type of scFv phage clone. As shown in Figure 5A, a significant number of positive clones were identified.
이들 양성 클론들을 최종 선별한 다음 이들에 대해 ELISA(결과 미첨부) 및 FACS(도 5b 참조, 일 예만 도시)를 수행하였고, 이들 결과를 기반으로 최종 양성으로 선별한 결과를 표 2에 나타내었다.After final selection of these positive clones, ELISA (results not attached) and FACS (see FIG. 5B, only an example) were performed on them, and the results of final positive selection based on these results are shown in Table 2.
표 2에 나타난 바와 같이, 최종 양성으로 확인된 클론은 총 47개의 클론 중 37개로 확인되어, 약 78% 수준으로 양성 파지를 획득하였다.As shown in Table 2, the final clones confirmed to be positive were 37 out of a total of 47 clones, and positive phages were obtained at about 78%.
실시예 10. 항-PTK7 항체의 선별Example 10. Selection of anti-PTK7 antibodies
실시예 2에 기재된 방법을 이용하여 PTK7(Protein Tyrosine Kinase 7)에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였고, 실시예 3 및 4에 기재된 방법에 따라 ELISA를 수행하여 항원에 특이적인 클론들을 최종 선별한 다음, 이들에 대하여 실시예 5에 기재된 방법에 따라 ELISA 및 FACS를 수행하였다.Antibodies specifically binding to PTK7 (Protein Tyrosine Kinase 7) were selected using the method described in Example 2, and ELISA was performed according to the method described in Examples 3 and 4 to finally select antigen-specific clones. Next, ELISA and FACS were performed on them according to the method described in Example 5.
모노 파지 ELISA를 수행한 결과를 도 6a 내지 도 6c에 나타내었다. 도 6a 내지 도 6c에서, X 축은 표적 항원 이외의 불특정 항원에 대한 결합력("NEGATIVE")을 나타내고, Y 축은 표적 항원에 대한 결합력("POSITIVE")을 나타낸다. 두 수치의 접점을 원형으로 표시하고, 여기서 1개의 원형은 scFV 파지 클론 1종에 대한 결합력(특이적 또는 비특이적)을 나타낸다. 도 6a 내지 도 6c에 나타난 바와 같이, 대부분의 클론이 양성인 것으로 확인되었다.The results of monophage ELISA are shown in Figures 6A to 6C. In FIGS. 6A to 6C, the The contact point of the two numbers is indicated by a circle, where one circle represents the binding affinity (specific or non-specific) to one type of scFV phage clone. As shown in Figures 6A to 6C, most clones were confirmed to be positive.
이들 양성 클론들을 최종 선별한 다음 이들에 대해 ELISA(결과 미첨부) 및 FACS(도 6d 참조, 일 예만 도시)를 수행하였고, 이들 결과를 기반으로 최종 양성으로 선별한 결과를 표 3에 나타내었다. 도 6d에서, 비교군으로 항-PTK7 모노클론 항체인 Cofetuzumab(화이자)을 사용하였다.After final selection of these positive clones, ELISA (results not attached) and FACS (see FIG. 6d, only an example) were performed on them, and the results of final positive selection based on these results are shown in Table 3. In Figure 6d, Cofetuzumab (Pfizer), an anti-PTK7 monoclonal antibody, was used as a comparison group.
표 3에 나타난 바와 같이, 최종 양성으로 확인된 클론은 총 90개의 클론 중 82개로 확인되어, 약 91% 수준으로 양성 파지를 획득하였다.As shown in Table 3, the final clones confirmed to be positive were 82 out of a total of 90 clones, and positive phages were obtained at about 91%.
실시예 11. 항-NECTIN4 항체의 선별Example 11. Selection of anti-NECTIN4 antibodies
실시예 2에 기재된 방법을 이용하여 NECTIN4(Nectin Cell Adhesion Molecule 4)에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였고, 실시예 3 및 4에 기재된 방법에 따라 ELISA를 수행하여 항원에 특이적인 클론들을 최종 선별한 다음, 이들에 대하여 실시예 5에 기재된 방법에 따라 ELISA 및 FACS를 수행하였다.Antibodies specifically binding to NECTIN4 (Nectin Cell Adhesion Molecule 4) were selected using the method described in Example 2, and ELISA was performed according to the method described in Examples 3 and 4 to finally select antigen-specific clones. Then, ELISA and FACS were performed on them according to the method described in Example 5.
모노 파지 ELISA를 수행한 결과를 도 7a 내지 도 7c에 나타내었다. 도 7a 내지 도 7c에서, X 축은 표적 항원 이외의 불특정 항원에 대한 결합력("NEGATIVE")을 나타내고, Y 축은 표적 항원에 대한 결합력("POSITIVE")을 나타낸다. 두 수치의 접점을 원형으로 표시하고, 여기서 1개의 원형은 scFV 파지 클론 1종에 대한 결합력(특이적 또는 비특이적)을 나타낸다. 도 7a 내지 도 7c에 나타난 바와 같이, 대부분의 클론이 양성인 것으로 확인되었다.The results of monophage ELISA are shown in Figures 7A to 7C. In Figures 7a to 7c, the The contact point of the two numbers is indicated by a circle, where one circle represents the binding affinity (specific or non-specific) to one type of scFV phage clone. As shown in Figures 7A to 7C, most clones were confirmed to be positive.
이들 양성 클론들을 최종 선별한 다음 이들에 대해 ELISA(결과 미첨부) 및 FACS(도 7d 참조, 일 예만 도시)를 수행하였고, 이들 결과를 기반으로 최종 양성으로 선별한 결과를 표 4에 나타내었다. 도 7d에서, 비교군으로 항-NECTIN4 항체-약물 접합체인 Padcev(한국아스텔라스제약)을 사용하였다.After final selection of these positive clones, ELISA (results not attached) and FACS (see FIG. 7D, only an example) were performed on them, and the results of final positive selection based on these results are shown in Table 4. In Figure 7d, Padcev (Astellas Pharmaceuticals Korea), an anti-NECTIN4 antibody-drug conjugate, was used as a comparison group.
표 4에 나타난 바와 같이, 최종 양성으로 확인된 클론은 총 83개의 클론 중 81개로 확인되어, 약 97.5% 수준으로 양성 파지를 획득하였다.As shown in Table 4, the final clones confirmed to be positive were 81 out of a total of 83 clones, and positive phages were obtained at about 97.5%.
실시예 12. 기존 파지 디스플레이 패닝을 이용한 항-SIGLEC10 항체의 선별Example 12. Selection of anti-SIGLEC10 antibodies using conventional phage display panning
실시예 12.1. 항원 준비Example 12.1. Antigen preparation
SIGLEC10(Sialic Acid Binding Ig Like Lectin 10) 재조합 단백질을 면역흡착튜브(Immunosorb tube)에 코팅한 후 블로킹(blocking)을 수행하였다.SIGLEC10 (Sialic Acid Binding Ig Like Lectin 10) recombinant protein was coated on an immunosorb tube and then blocking was performed.
실시예 12.2. 인간 항체 라이브러리 파지 준비Example 12.2. Human antibody library phage preparation
2.7x1010의 다양성을 가진 인간 scFv 라이브러리 파지((주)와이바이오로직스)를 대장균에 감염시킨 후, 얻어진 대장균을 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 상층액을 PEG(polyethylene glycol)로 농축한 다음, 이를 PBS(phosphate buffered saline) 완충용액에 녹여 인간 항체 라이브러리 파지를 준비하였다.After infecting E. coli with a human scFv library phage (Y Biologics Co., Ltd.) with a diversity of 2.7x10 10 , the obtained E. coli was cultured at 30°C for 16 hours. The culture medium was centrifuged, the supernatant was concentrated with PEG (polyethylene glycol), and then the human antibody library phage was prepared by dissolving it in PBS (phosphate buffered saline) buffer solution.
실시예 12.3. 바이오패닝Example 12.3. biopanning
실시예 12.1.의 면역흡착튜브에 실시예 12.2.의 라이브러리 파지를 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그다음 1x PBST와 1x PBS로 세척한 후, 100 mM TAE와 Tris-HCl(pH 7.5) 용액을 차례로 처리하여 항원에 특이적으로 결합한 scFv-파지들만을 용출시켰다. 용출된 파지를 다시 대장균에 감염시켜 증폭시키는 패닝 과정을 통해 파지의 풀(pool)을 얻었다. 이후, 1회 차 패닝에서 증폭된 파지를 가지고 PBST(PBS + tween-20) 세척 단계에서 횟수만 늘리고, 나머지는 동일한 방법으로 2회 차와 3회 차 패닝을 수행하였다.The library phage of Example 12.2 was added to the immunoadsorption tube of Example 12.1 and reacted at room temperature for 2 hours. Then, after washing with 1x PBST and 1x PBS, the cells were sequentially treated with 100 mM TAE and Tris-HCl (pH 7.5) solutions to elute only the scFv-phages that specifically bound to the antigen. A pool of phages was obtained through a panning process in which the eluted phages were re-infected with E. coli and amplified. Afterwards, with the phage amplified in the first round of panning, only the number of times in the PBST (PBS + tween-20) washing step was increased, and the second and third rounds of panning were performed in the same manner.
실시예 12.4. 폴리 파지 ELISAExample 12.4. Polyphage ELISA
각 회차(round)의 패닝을 통해 얻어진 폴리(poly) scFv-파지 항체 풀의 항원 특이성을 알아보기 위해 폴리 파지 ELISA를 수행하였다. SIGLEC10 항원을 코팅한 면역-플레이트(immuno-plate)와 비특이적 결합(nonspecific binding)의 지표로 사용된 ITGA6-Fc 단백질로 코팅된 면역-플레이트를 이용하여 각 회차에서 얻어진 파지 풀로 동시에 ELISA를 수행하였다. ELISA의 음성 대조군(negative control)으로 항체가 디스플레이되지 않은 M13 파지인 AB#38을 같이 사용하였다.Poly phage ELISA was performed to determine the antigen specificity of the poly scFv-phage antibody pool obtained through each round of panning. ELISA was simultaneously performed on the phage pools obtained in each round using an immuno-plate coated with SIGLEC10 antigen and an immuno-plate coated with ITGA6-Fc protein, which was used as an indicator of nonspecific binding. AB#38, an M13 phage that does not display antibodies, was used as a negative control for ELISA.
실시예 12.5. 모노 파지 ELISAExample 12.5. Monophage ELISA
폴리 파지 ELISA에서 결합능이 큰 것으로 확인된 3회 차 패닝의 파지 풀로부터 수천여 개의 모노 클론들을 선별하였고, 이들을 96-딥웰 플레이트(96-deep well plate)에서 헬퍼 파지를 감염시켜 배양하였다. 그다음, 상층액에 존재하는 모노 scFv-파지를 SIGLEC10이 코팅된 면역-플레이트에 옮겨 ELISA를 수행하였다. 이때, SIGLEC10 항원에 대한 모노 파지 ELISA와 비특이적 항원 대조군인 IGA6-Fc 단백질에 대한 ELISA도 동시에 수행하여, 얻어진 파지 클론이 SIGLEC10에 특이적인지를 확인하였다.Thousands of monoclones were selected from the phage pool of the third round of panning, which was confirmed to have high binding ability in polyphage ELISA, and these were cultured by infecting helper phage in a 96-deep well plate. Next, the mono scFv-phage present in the supernatant was transferred to an immuno-plate coated with SIGLEC10 and ELISA was performed. At this time, monophage ELISA for SIGLEC10 antigen and ELISA for IGA6-Fc protein, a non-specific antigen control, were simultaneously performed to confirm whether the obtained phage clone was specific for SIGLEC10.
실시예 12.6. 항-SIGLEC10 항체의 선별Example 12.6. Selection of anti-SIGLEC10 antibodies
실시예 12.1. 내지 실시예 12.3.의 일련의 과정에 따라 SIGLEC10에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였고(도 8a), 실시예 12.4. 및 12.5.에 기재된 방법에 따라 폴리 파지 ELISA 및 모노 파지 ELISA를 수행(결과 미첨부)하여 양성 클론들을 선별하였다. 그리고 이들 선별된 클론들에 대해 ELISA 및 FACS를 수행하여 최종 선별하였다. 이때, ELISA는 하기 표 5에 나타낸 태그(tag)가 컨쥬게이션 되어 있는 항원을 사용하여 수행하였다.Example 12.1. Antibodies that specifically bind to SIGLEC10 were selected according to the series of procedures from Example 12.3 to Example 12.3 (FIG. 8a), and Example 12.4. and polyphage ELISA and monophage ELISA were performed according to the method described in 12.5 (results not attached) to select positive clones. Then, ELISA and FACS were performed on these selected clones for final selection. At this time, ELISA was performed using an antigen conjugated with the tag shown in Table 5 below.
ELISA를 수행한 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이 SIGLEC10 재조합 단백질을 적용한 기존 파지 디스플레이 패닝에 의해 Ab08, Ab09, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab24, Ab26, Ab27 및 Ab28의 항-SIGLEC10 항체를 선별하였다.As a result of performing ELISA, as shown in Figure 8b, anti-SIGLEC10 of Ab08, Ab09, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab24, Ab26, Ab27 and Ab28 was detected by conventional phage display panning applying SIGLEC10 recombinant protein. Antibodies were selected.
또한, 이들에 대해 FACS를 수행한 결과를 도 8c에 나타내었으며, 양성 파지를 획득함을 확인하였다.In addition, the results of FACS on these are shown in Figure 8c, and it was confirmed that positive phages were obtained.
실시예 13. 기존 펩티드 파지 디스플레이 패닝을 이용한 항-SIGLEC10 항체의 선별Example 13. Selection of anti-SIGLEC10 antibodies using existing peptide phage display panning
실시예 13.1. 항원 준비Example 13.1. Antigen preparation
SIGLEC10 서열을 포함하는 합성 펩티드를 면역흡착튜브(Immunosorb tube)에 코팅한 후 블로킹(blocking)을 수행하였다.A synthetic peptide containing the SIGLEC10 sequence was coated on an immunosorbent tube and then blocking was performed.
실시예 13.2. 인간 항체 라이브러리 파지 준비Example 13.2. Human antibody library phage preparation
실시예 12.2.에 기재된 방법과 동일하게 인간 항체 라이브러리 파지를 준비하였다.A human antibody library phage was prepared in the same manner as described in Example 12.2.
실시예 13.3. 바이오패닝Example 13.3. biopanning
실시예 13.1.의 면역흡착튜브에 실시예 13.2.의 라이브러리 파지를 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 실시예 12.3.에 기재된 방법과 동일하게 바이오패닝을 수행하였다.The library phage of Example 13.2 was added to the immunoadsorption tube of Example 13.1 and reacted at room temperature for 2 hours. Afterwards, biopanning was performed in the same manner as described in Example 12.3.
실시예 13.4. 폴리 파지 ELISAExample 13.4. Polyphage ELISA
실시예 12.4.에 기재된 방법과 동일하게 폴리 파지 ELISA를 수행하였다.Polyphage ELISA was performed in the same manner as described in Example 12.4.
실시예 13.5. 모노 파지 ELISAExample 13.5. Monophage ELISA
실시예 12.5.에 기재된 방법과 동일하게 모노 파지 ELISA를 수행하였다.Monophage ELISA was performed in the same manner as described in Example 12.5.
실시예 13.6. 항-SIGLEC10 항체의 선별Example 13.6. Selection of anti-SIGLEC10 antibodies
실시예 13.1. 내지 실시예 13.3.의 일련의 과정에 따라 SIGLEC10에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였고(도 9a), 실시예 12.4. 및 12.5.에 기재된 방법에 따라 폴리 파지 ELISA 및 모노 파지 ELISA를 수행(결과 미첨부)하여 양성 클론들을 선별하였다. 그리고 이들 선별된 클론들에 대해 ELISA 및 FACS를 수행하여 최종 선별하였다.Example 13.1. Antibodies that specifically bind to SIGLEC10 were selected according to the series of procedures from Example 13.3 to Example 13.3 (FIG. 9a), and Example 12.4. and polyphage ELISA and monophage ELISA were performed according to the method described in 12.5 (results not attached) to select positive clones. Then, ELISA and FACS were performed on these selected clones for final selection.
ELISA를 수행한 결과, 도 9b에 나타낸 바와 같이 SIGLEC10 서열을 포함하는 합성 펩티드를 적용한 기존 펩티드 파지 디스플레이 패닝에 의해 Ab16의 항-SIGLEC10 항체를 선별하였다.As a result of ELISA, the anti-SIGLEC10 antibody of Ab16 was selected by conventional peptide phage display panning using a synthetic peptide containing the SIGLEC10 sequence, as shown in Figure 9b.
또한, 이들에 대해 FACS를 수행한 결과를 도 9c에 나타내었으며, 양성 파지를 획득함을 확인하였다.In addition, the results of FACS on these are shown in Figure 9c, and it was confirmed that positive phages were obtained.
실시예 14. 신규 세포-기반 파지 디스플레이 패닝을 이용한 항-SIGLEC10 항체의 선별Example 14. Selection of anti-SIGLEC10 antibodies using novel cell-based phage display panning
실시예 14.1. 항원 준비 Example 14.1. Antigen preparation
SIGLEC10의 세포외 도메인(EDC)을 HEK293E 동물세포에 과발현(over expression, O/E)시킨 세포주를 준비하였다.A cell line was prepared in which the extracellular domain (EDC) of SIGLEC10 was overexpressed (O/E) in HEK293E animal cells.
실시예 14.2. 인간 항체 라이브러리 파지 준비Example 14.2. Human antibody library phage preparation
실시예 12.2.에 기재된 방법과 동일하게 인간 항체 라이브러리 파지를 준비하였다.A human antibody library phage was prepared in the same manner as described in Example 12.2.
실시예 14.3. 바이오패닝Example 14.3. biopanning
실시예 14.1.의 면역흡착튜브에 실시예 14.2.의 라이브러리 파지를 넣고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 그다음 DPBS로 세척한 후, 트롬빈 용출을 처리하여 항원에 특이적으로 결합한 scFv-파지들만을 회수하였다. 용출된 파지를 다시 대장균에 감염시켜 증폭시키는 패닝 과정을 통해 양성 파지의 풀(pool)을 얻었다. 이후, 1회 차 패닝에서 증폭된 파지를 가지고 동일한 방법으로 2회 차와 3회 차 패닝을 수행하였다.The library phage of Example 14.2 was added to the immunoadsorption tube of Example 14.1 and reacted at room temperature for 30 minutes. Then, after washing with DPBS, thrombin elution was performed to recover only scFv-phages that specifically bound to the antigen. A pool of positive phages was obtained through a panning process in which the eluted phages were re-infected with E. coli and amplified. Afterwards, the second and third rounds of panning were performed in the same manner using the phage amplified in the first round of panning.
실시예 14.4. 폴리 파지 ELISAExample 14.4. Polyphage ELISA
실시예 12.4.에 기재된 방법과 동일하게 폴리 파지 ELISA를 수행하였다.Polyphage ELISA was performed in the same manner as described in Example 12.4.
실시예 14.5. 양성 파지 선별Example 14.5. Positive phage selection
실시예 12.5.에 기재된 방법과 동일하게 모노 파지 ELISA를 수행하였다.Monophage ELISA was performed in the same manner as described in Example 12.5.
실시예 14.6. 항-SIGLEC10 항체의 선별Example 14.6. Selection of anti-SIGLEC10 antibodies
실시예 14.1. 내지 실시예 14.3.의 일련의 과정에 따라 SIGLEC10에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였고(도 10a), 실시예 12.4. 및 12.5.에 기재된 방법에 따라 폴리 파지 ELISA 및 모노 파지 ELISA를 수행(결과 미첨부)하여 양성 클론들을 최종 선별하였다. 그리고 이들 선별된 클론들에 대해 ELISA 및 FACS를 수행하여 최종 선별하였다.Example 14.1. Antibodies that specifically bind to SIGLEC10 were selected according to the series of procedures from Example 14.3 to Example 14.3 (FIG. 10a), and Example 12.4. And positive clones were finally selected by performing polyphage ELISA and monophage ELISA (results not attached) according to the method described in 12.5. Then, ELISA and FACS were performed on these selected clones for final selection.
ELISA를 수행한 결과, 도 10b에 나타낸 바와 같이 SIGLEC10의 세포외 도메인(EDC)을 HEK293E 동물세포에 과발현시킨 세포주를 적용한 세포-기반 파지 디스플레이 패닝에 의해 Ab23의 항-SIGLEC10 항체를 선별하였다.As a result of ELISA, as shown in Figure 10b, anti-SIGLEC10 antibody of Ab23 was selected by cell-based phage display panning using a cell line overexpressing the extracellular domain (EDC) of SIGLEC10 in HEK293E animal cells.
또한, 이들에 대해 FACS를 수행한 결과를 도 10c에 나타내었으며, 양성 파지를 획득함을 확인하였다.In addition, the results of FACS on these are shown in Figure 10c, and it was confirmed that positive phages were obtained.
실시예 15. 선별된 항-SIGLEC10 항체의 특이성 및 결합력 평가Example 15. Evaluation of specificity and binding capacity of selected anti-SIGLEC10 antibodies
실시예 15.1. 인간 SIGLEC7 또는 SIGLEC10의 안정적 발현 세포주를 이용한 항-SIGLEC10 항체의 특이성 및 결합력 평가Example 15.1. Evaluation of specificity and binding capacity of anti-SIGLEC10 antibody using cell lines stably expressing human SIGLEC7 or SIGLEC10
인간 SIGLEC7 또는 SIGLEC10이 안정적으로 발현하는 HEK293E 세포와 발현하지 않는 HEK293E 세포 각각을 시료당 0.5x105개의 세포가 되도록 준비하였다. 그다음, 선별된 항-SIGLEC10 항체를 각각 일정한 배수로 희석한 후 준비된 세포와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 이후, 세포를 2% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 PBS(#LB001-02, welgene)로 3회 세척하였다. 그다음, FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광물질이 결합된 항-인간 IgG 항체(#FI-3000, Vectorlabs) 또는 PE-anti-hIgG 항체(#555787, BD)를 사용하여 4℃에서 20분간 반응시킨 후, 상기와 동일하게 세척하였다. 세포를 0.5 ㎖의 2% FBS(#26140-079, Thermo)가 포함된 PBS로 현탁시킨 후, 유세포 분석기인 CytoFLEX(Beckman Coulter, 미국)를 사용하여 결합력을 분석하였다.HEK293E cells stably expressing human SIGLEC7 or SIGLEC10 and HEK293E cells not expressing human SIGLEC7 or SIGLEC10 were prepared at 0.5x10 5 cells per sample. Next, the selected anti-SIGLEC10 antibodies were each diluted to a certain multiple and then reacted with the prepared cells at 4°C for 30 minutes. Afterwards, the cells were washed three times with PBS (#LB001-02, welgene) containing 2% fetal bovine serum. Next, react at 4°C for 20 minutes using an anti-human IgG antibody (#FI-3000, Vectorlabs) or a PE-anti-hIgG antibody (#555787, BD) conjugated with a FITC (fluorescein isothiocyanate) fluorescent substance. Washed in the same manner as above. The cells were suspended in PBS containing 0.5 ml of 2% FBS (#26140-079, Thermo), and then the binding force was analyzed using a flow cytometer, CytoFLEX (Beckman Coulter, USA).
이때, 테스트 샘플은 상기 실시예 12.에서 기존 파지 디스플레이 패닝을 이용하여 선별된 항-SIGLEC10 항체(Ab08, Ab09, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27 및 Ab28), 상기 실시예 13.에서 기존 펩티드 파지 디스플레이 패닝을 이용하여 선별된 항-SIGLEC10 항체(Ab16), 및 상기 실시예 14.에서 세포-기반 파지 디스플레이 패닝을 이용하여 선별된 항-SIGLEC10 항체(Ab23)를 대상으로 수행하였다.At this time, the test sample was an anti-SIGLEC10 antibody (Ab08, Ab09, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, and Ab28) selected using existing phage display panning in Example 12. ), an anti-SIGLEC10 antibody (Ab16) selected using conventional peptide phage display panning in Example 13, and an anti-SIGLEC10 antibody (Ab23) selected using cell-based phage display panning in Example 14. ) was carried out targeting.
인간 SIGLEC7 또는 SIGLEC10이 발현하지 않는 HEK293E를 대상으로 선별된 항-SIGLEC10 항체의 특이성을 분석한 결과, 대조항체인 S10-C(Reference) 및 Ab14, Ab23, Ab26은 비특이성을 나타내었다(도 11a).As a result of analyzing the specificity of anti-SIGLEC10 antibodies selected for HEK293E, which does not express human SIGLEC7 or SIGLEC10, the control antibodies S10-C (Reference), Ab14, Ab23, and Ab26 showed non-specificity (FIG. 11a) .
또한, 인간 SIGLEC7을 안정적으로 발현하는 HEK293E/hSIGLEC7 세포주를 대상으로 선별된 항-SIGLEC10 항체의 특이성을 분석한 결과, 대조항체인 S10-C 및 Ab14, Ab23, Ab24는 비특이성을 나타내었다(도 11b).In addition, as a result of analyzing the specificity of anti-SIGLEC10 antibodies selected for the HEK293E/hSIGLEC7 cell line stably expressing human SIGLEC7, the control antibodies S10-C, Ab14, Ab23, and Ab24 showed non-specificity (Figure 11b) ).
반면, 인간 SIGLEC10을 안정적으로 발현하는 HEK293E/hSIGLEC10 세포주를 대상으로 선별된 항-SIGLEC10 항체의 특이성을 분석한 결과, 대조항체인 S10-C 및 Ab10, Ab11, Ab14, Ab23은 특이적 결합을 나타내었다(도 11c).On the other hand, as a result of analyzing the specificity of anti-SIGLEC10 antibodies selected against the HEK293E/hSIGLEC10 cell line stably expressing human SIGLEC10, the control antibodies S10-C and Ab10, Ab11, Ab14, and Ab23 showed specific binding. (Figure 11c).
특히, 본 발명에 따른 세포 패닝 방법(실시예 14)을 이용하여 선별된 항-SIGLEC10 항체인 Ab23의 특이성이 우수함을 알 수 있었다.In particular, it was found that Ab23, an anti-SIGLEC10 antibody selected using the cell panning method according to the present invention (Example 14), had excellent specificity.
실시예 15.2. 원숭이 SIGLEC10, 인간 SIGLEC7 또는 SIGLEC10의 일시적 형질감염 세포주를 이용한 항-SIGLEC10 항체의 특이성 및 결합력 평가Example 15.2. Evaluation of specificity and avidity of anti-SIGLEC10 antibodies using transiently transfected cell lines of monkey SIGLEC10, human SIGLEC7, or SIGLEC10
원숭이 SIGLEC10, 인간 SIGLEC7 또는 SIGLEC10을 일시적으로 형질감염시킨 HEK293E 세포 각각을 시료당 0.5x105 세포가 되도록 준비하였다. 이후, 실시예 15.1.에 기재된 방법과 동일하게 항-인간 IgG 항체(#FI-3000, Vectorlabs) 또는 PE-anti-hIgG 항체(#555787, BD)와 반응시키고, FACS를 사용하여 선별된 항-SIGLEC10 항체의 결합력을 분석하였다. 이때, 테스트 샘플은 실시예 15.1.에 제시된 바와 동일하게 실시예 12. 내지 실시예 14.에서 선별한 항-SIGLEC10 항체를 대상으로 수행하였다.HEK293E cells transiently transfected with monkey SIGLEC10, human SIGLEC7, or SIGLEC10 were prepared at 0.5x10 5 cells per sample. Then, reacted with anti-human IgG antibody (#FI-3000, Vectorlabs) or PE-anti-hIgG antibody (#555787, BD) in the same manner as described in Example 15.1, and selected anti- The binding affinity of SIGLEC10 antibody was analyzed. At this time, the test sample was performed on the anti-SIGLEC10 antibody selected in Examples 12 to 14 in the same manner as shown in Example 15.1.
인간 SIGLEC7을 일시적으로 형질감염시킨 HEK293E/hSIGLEC7 세포주를 대상으로 선별된 항-SIGLEC10 항체의 특이성을 분석한 결과, Ab24는 비특이성을 나타내었다(도 12a).As a result of analyzing the specificity of the selected anti-SIGLEC10 antibody against the HEK293E/hSIGLEC7 cell line transiently transfected with human SIGLEC7, Ab24 showed non-specificity (FIG. 12a).
한편, 원숭이 SIGLEC10을 일시적으로 형질감염시킨 HEK293E/cynoSIGLEC10 세포주를 대상으로 선별된 항-SIGLEC10 항체의 특이성을 분석한 결과, 대조항체인 S10-C(Reference) 및 Ab08, Ab10, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab23, Ab24, Ab25, Ab27, Ab28은 결합을 나타내었으며, 이 중 Ab14, Ab15, Ab16, Ab23, Ab24, Ab25는 대조항체보다 우수한 결합력을 나타내었다(도 12b).Meanwhile, as a result of analyzing the specificity of anti-SIGLEC10 antibodies selected for the HEK293E/cynoSIGLEC10 cell line transiently transfected with monkey SIGLEC10, the control antibodies S10-C (Reference) and Ab08, Ab10, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab23, Ab24, Ab25, Ab27, and Ab28 showed binding, and among them, Ab14, Ab15, Ab16, Ab23, Ab24, and Ab25 showed better binding ability than the control antibody (FIG. 12b).
이에 반해, 인간 SIGLEC10을 일시적으로 형질감염시킨 HEK293E/hSIGLEC10 세포주를 대상으로 선별된 항-SIGLEC10 항체의 특이성을 분석한 결과, 대조항체인 S10-C(Reference) 및 Ab08, Ab10, Ab11, Ab14, Ab15, Ab23, Ab24, Ab25, Ab27, Ab28은 결합을 나타내었으며, 이 중 특이적으로 Ab23이 대조항체보다 우수한 결합력을 나타내었다(도 12c).In contrast, as a result of analyzing the specificity of anti-SIGLEC10 antibodies selected for the HEK293E/hSIGLEC10 cell line transiently transfected with human SIGLEC10, the control antibodies S10-C (Reference) and Ab08, Ab10, Ab11, Ab14, and Ab15 were analyzed. , Ab23, Ab24, Ab25, Ab27, and Ab28 showed binding, and among these, Ab23 specifically showed better binding ability than the control antibody (FIG. 12c).
이러한 일련의 결과를 통해, 기존 파지 디스플레이 패닝 방법(실시예 12)이나 기존 펩티드 파지 디스플레이 패닝 방법(실시예 13)으로 선별된 양성 파지에 포함된 항체들은 실제 세포 기반 항원-항체 결합 결과를 확인해 보면 비특이적 결합인 경우이거나 혹은 표적 항원에 잘 결합하지 않은 경우인 반면, 본 발명에 따른 세포 패닝 방법(실시예 14)을 이용할 경우, 표적 항원에 특이적인 결합력을 갖는 항체, 예컨대, 항-SIGLEC10 항체를 높은 정확도로 선별할 수 있음을 알 수 있었다.Through this series of results, the antibodies contained in positive phages selected by the existing phage display panning method (Example 12) or the existing peptide phage display panning method (Example 13) can be confirmed by checking the actual cell-based antigen-antibody binding results. In the case of non-specific binding or not binding well to the target antigen, when using the cell panning method (Example 14) according to the present invention, an antibody with specific binding ability to the target antigen, such as an anti-SIGLEC10 antibody, is used. It was found that selection could be made with high accuracy.
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Claims (18)
(i) 표적 단백질 및 프로테아제 절단 부위(protease cleavage site)를 포함하는 융합 단백질이 표면에 발현된 세포를 준비하는 단계;
(ii) 상기 세포 및 상기 라이브러리를 결합시키는 단계;
(iii) 상기 세포를 세척하는 단계;
(iv) 상기 세척된 세포에 프로테아제를 가하여 표적 단백질 및 이에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 용출시키는 단계; 및
(v) 상기 (iv) 용출물로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하는 단계.A cell panning method for extracting an antibody or fragment thereof that specifically binds to a target protein from a library of antibodies or antigen-binding fragments thereof, comprising the following steps:
(i) preparing cells on which a fusion protein containing a target protein and a protease cleavage site is expressed on the surface;
(ii) combining the cells and the library;
(iii) washing the cells;
(iv) adding protease to the washed cells to elute the target protein and the antibody or antigen-binding fragment thereof bound thereto; and
(v) Obtaining an antibody or antigen-binding fragment thereof from the eluate (iv).
상기 표적 단백질은 표적 항원의 세포외 도메인(extracellular domain)인 것인, 방법.According to paragraph 1,
Method, wherein the target protein is an extracellular domain of the target antigen.
상기 프로테아제 절단 부위는 상기 표적 단백질과 상기 세포 사이에 위치하는 것인, 방법.According to paragraph 1,
The method wherein the protease cleavage site is located between the target protein and the cell.
상기 프로테아제 절단 부위는 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 아스파라진 펩티드 분해효소(lyase)로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제로 절단가능한 부위인 것인, 방법.According to paragraph 1,
The protease cleavage site is a site cleavable by a protease selected from the group consisting of serine protease, cysteine protease, threonine protease, aspartic protease, glutamic acid protease, metalloprotease, and asparagine peptidase (lyase).
상기 프로테아제 절단 부위는 트롬빈, 퓨린, 인자 Xa, 메탈로프로테아제, 엔테로키나제, 카텝신, HRV3C(Human Rhinovirus 3C) 프로테아제 및 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 절단 가능한 부위인 것인, 방법.According to paragraph 1,
The protease cleavage site is a site capable of being cut by one or more selected from the group consisting of thrombin, purine, factor In,method.
상기 트롬빈에 절단 가능한 부위는 다음의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인 것인, 방법.
1) A-B-Pro-Arg-X-Y (A, B는 각각 소수성의 아미노산, X, Y는 비산성의 아미노산), 또는
2) Gly-Arg-GlyAccording to clause 5,
The method wherein the thrombin cleavable site is a peptide consisting of the following amino acid sequence.
1) AB-Pro-Arg-XY (A and B are hydrophobic amino acids, respectively, and X and Y are non-acidic amino acids), or
2) Gly-Arg-Gly
트롬빈에 절단 가능한 부위는 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 이루어진 펩티드인 것인, 방법.According to clause 5,
A method wherein the thrombin cleavable site is a peptide selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4.
상기 융합 단백질은 제2 단백질을 더 포함하는 것인, 방법.According to paragraph 1,
The method of claim 1, wherein the fusion protein further includes a second protein.
상기 제2 단백질은 막투과 단백질 또는 세포내 도메인인 것인, 방법.According to clause 8,
The method wherein the second protein is a transmembrane protein or an intracellular domain.
상기 융합 단백질은 N 말단으로부터 표적 단백질, 프로테아제 절단 부위 및 제2 단백질의 순서로 이루어지는 것인, 방법.According to clause 8,
The method wherein the fusion protein consists of a target protein, a protease cleavage site, and a second protein in the following order from the N terminus.
상기 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리인 것인, 방법.According to paragraph 1,
A method wherein the library is a phage display library.
상기 프로테아제는 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 아스파라진 펩티드 분해효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.According to paragraph 1,
The method of claim 1, wherein the protease is selected from the group consisting of serine protease, cysteine protease, threonine protease, aspartic protease, glutamic acid protease, metalloprotease, and asparagine peptidase.
상기 프로테아제는 트롬빈, 퓨린, 인자 Xa, 메탈로프로테아제, 엔테로키나제, 카텝신, HRV3C(Human Rhinovirus 3C) 프로테아제 및 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.According to paragraph 1,
The method of claim 1 , wherein the protease is selected from the group consisting of thrombin, purine, factor
상기 방법은 (vi) 수득된 항체 또는 이의 항원 결합 단편들을 증폭시키는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.According to paragraph 1,
The method further comprises the step of (vi) amplifying the obtained antibody or antigen-binding fragments thereof.
상기 증폭된 항체 또는 이의 항원 결합 단편들을 라이브러리 대신에 제공하여, 상기 단계 (ii) 내지 단계 (v)를 반복하는 것인, 방법.According to clause 14,
A method wherein the amplified antibody or antigen-binding fragments thereof are provided instead of a library, and steps (ii) to (v) are repeated.
상기 방법은 상기 단계 (ii) 전에, 상기 융합 단백질을 발현하지 않는 세포와 상기 라이브러리를 결합하여 표적 항원에 비특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제거하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.According to paragraph 1,
The method further includes, before step (ii), combining the library with cells that do not express the fusion protein to remove antibodies or antigen-binding fragments thereof that non-specifically bind to the target antigen.
프로테아제 절단 부위를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.A first polynucleotide encoding a target protein; and
A vector comprising a second polynucleotide encoding a protease cleavage site.
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