KR20240060024A - Biomarker composition for predicting brain tumor and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, P16INK4a 과발현이 관찰된 경우 항상 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 관찰되지 않았으며, P16INK4a 이 과발현되지 않은 경우 CDKN2A 및 CDKN2B가 결손이 있거나 없음을 관찰하여 P16INK4a를 이용하여 뇌종양 예후 예측용 바이오마커로 활용할 수 있다.The present invention relates to a biomarker composition for predicting brain tumor prognosis containing P16 INK4a protein or the gene encoding it as an active ingredient. When P16 INK4a overexpression was observed, deletion of CDKN2A and CDKN2B was not always observed, and P16 INK4a If not overexpressed, P16 INK4a can be used as a biomarker for predicting brain tumor prognosis by observing whether CDKN2A and CDKN2B are defective or absent.
Description
본 발명은 뇌종양 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.The present invention provides a biomarker composition for predicting brain tumor prognosis.
신경계 교종은 중추신경계에 발생하는 다양한 예후를 보이는 질환군이다. 그 중에서도 교모세포종은 예후가 가장 불량한 원발성 뇌종양으로, 수술적 제거 후 항암치료와 방사선치료를 하더라도 생존기간이 길지 않아 새로운 치료법이 절실한 질환이다. 반면에 IDH 유전자 변이가 있는 교종은 항암치료에 대한 반응이 좋아 상대적으로 생존률이 높다. 이렇게 다양한 경과를 보이는 신경계 교종의 예후를 예측하고, 치료를 위한 표적을 발견하기 위해 유전자 변이에 대한 많은 연구가 있어 왔다. 최근에는 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 있으면 상대적으로 예후가 좋지 않음이 알려져, 새로 발표된 WHO의 중추신경계 종양 분류에서는 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손 여부가 진단 또는 예후 예측의 중요한 인자로 포함되고 있다. Neurological gliomas are a group of diseases that occur in the central nervous system and have diverse prognoses. Among them, glioblastoma is a primary brain tumor with the poorest prognosis, and the survival period is not long even with chemotherapy and radiation treatment after surgical removal, so new treatments are urgently needed. On the other hand, gliomas with IDH gene mutations respond well to chemotherapy and have a relatively high survival rate. There has been a lot of research on genetic mutations to predict the prognosis of nervous system glioma, which shows a variety of courses, and to discover targets for treatment. Recently, it has been known that deletion of CDKN2A and CDKN2B has a relatively poor prognosis, and in the newly published WHO classification of central nervous system tumors, deletion of CDKN2A and CDKN2B is included as an important factor in diagnosis or prognosis.
또한 최근에는 뇌수막종에서도 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 있는 경우 예후가 좋지 않은 것으로 확인되어, 새로운 WHO 분류에서 CDKN2A 및 CDKN2B 검사를 뇌수막종에서 권장하고 있다. 하지만 대부분의 뇌수막종은 조직학적으로 양성이고 CDKN2A 및 CDKN2B가 대부분 정상이기 때문에, 모든 뇌수막종에 대해 CDKN2A 및 CDKN2B를 확인하는 것은 비효율적이다.Additionally, it has recently been confirmed that meningiomas with CDKN2A and CDKN2B defects have a poor prognosis, and CDKN2A and CDKN2B tests are recommended in the new WHO classification for meningiomas. However, because most meningiomas are histologically benign and CDKN2A and CDKN2B are mostly normal, it is inefficient to check CDKN2A and CDKN2B for all meningiomas.
한편, P16INK4a는 G1 단계에서 S 단계로의 세포 주기 진행을 늦추어 세포 분열을 늦추어 종양 억제자 역할을 하는 단백질로, CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) 유전자에 의해 발현된다. Meanwhile, P16 INK4a is a protein that acts as a tumor suppressor by slowing cell division by slowing down the cell cycle progression from the G1 phase to the S phase, and is expressed by the CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) gene.
CDKN2A 및 CDKN2B의 결손을 확인하기 위해서는 FISH, NGS 및 CGH 등 시간이 걸리고 비용이 많이 드는 검사 방법을 필수적으로 적용하여야 하는데, 환자가 고비용을 이유로 검사하지 않을 수 있으며 또한 검사기간이 비교적 길어 이로 인해 치료가 지체될 수 있다는 문제가 있다. 나아가, 많은 국가나 기관에서는 해당 검사를 수행할 자원이 부족하여 수행하지 못하는 경우가 많다.In order to confirm CDKN2A and CDKN2B defects, time-consuming and expensive testing methods such as FISH, NGS, and CGH must be applied. However, patients may not undergo testing due to the high cost, and the testing period is relatively long, which results in treatment. There is a problem that there may be a delay. Furthermore, many countries or institutions are often unable to perform the relevant tests due to a lack of resources.
따라서, 바이오마커를 이용하여 CDKN2A 및 CDKN2B 에 대한 FISH, NGS, CGH 등의 검사가 필요한 경우를 1차적으로 선별하여, 뇌교종과 뇌수막종을 포함한 뇌종양과, 다른 종양에 대해 불량한 예후를 확인하는 비교적 저렴한 선별검사가 필요한 실정이다. Therefore, by using biomarkers to primarily select cases that require tests such as FISH, NGS, and CGH for CDKN2A and CDKN2B, it is a relatively inexpensive method to confirm poor prognosis for brain tumors, including glioma and meningioma, and other tumors. Screening tests are necessary.
본 발명의 목적은 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 데에 있다.The purpose of the present invention is to provide a biomarker composition for predicting brain tumor prognosis containing the P16 INK4a protein or the gene encoding it as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 목적은 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 하는 뇌종양 예후 예측용 조성물을 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for predicting brain tumor prognosis, which contains as an active ingredient an agent that measures the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 뇌종양 예후 예측용 키트를 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide a kit for predicting brain tumor prognosis comprising the composition.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 뇌종양 환자에서 분리된 시료로부터 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및 (3) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 없다고 판단하는 단계;를 포함하는 뇌종양 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is (1) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it from a sample isolated from a brain tumor patient; (2) comparing the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it with a normal control group; and (3) determining that there is no defect in CDKN2A and CDKN2B when the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it is higher than the control group. To provide a method of providing information for predicting brain tumor prognosis, including a step. there is.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 뇌종양 환자에서 분리된 시료로부터 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및 (3) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 없다고 판단하는 단계;를 포함하는 뇌종양에서 CDKN2A 및 CDKN2B의 상태 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is (1) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it from a sample isolated from a brain tumor patient; (2) comparing the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it with a normal control group; and (3) determining that there is no defect in CDKN2A and CDKN2B when the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it is higher than the control group. .
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 인체에서 분리된 뇌종양 조직세포 시료에 후보물질을 처리하는 단계; (2) 상기 후보물질을 처리한 시료에서 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 후보물질을 처리하지 않는 대조군과 비교하여 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 증가하는 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 뇌종양 악성화 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is (1) processing a candidate material on a brain tumor tissue cell sample isolated from the human body; (2) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it in the sample treated with the candidate material; and (3) comparing the expression level of the protein or the gene encoding the protein with a control group that does not treat the candidate material and selecting a candidate material in which the expression level of the protein or the gene encoding the protein increases. The purpose is to provide an inhibitor screening method.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a biomarker composition for predicting brain tumor prognosis containing P16 INK4a protein or the gene encoding it as an active ingredient.
또한, 본 발명은 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 하는 뇌종양 예후 예측용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for predicting brain tumor prognosis, which contains as an active ingredient an agent that measures the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 뇌종양 예후 예측용 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a kit for predicting brain tumor prognosis comprising the composition.
또한, 본 발명은 (1) 뇌종양 환자에서 분리된 시료로부터 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및 (3) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 없다고 판단하는 단계;를 포함하는 뇌종양 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides the following steps: (1) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it from a sample isolated from a brain tumor patient; (2) comparing the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it with a normal control group; and (3) determining that CDKN2A and CDKN2B are not defective when the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it is higher than the control group.
또한, 본 발명은 (1) 뇌종양 환자에서 분리된 시료로부터 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및 (3) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 없다고 판단하는 단계;를 포함하는 뇌종양에서 CDKN2A 및 CDKN2B의 상태 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides the following steps: (1) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it from a sample isolated from a brain tumor patient; (2) comparing the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it with a normal control group; and (3) determining that there is no deletion of CDKN2A and CDKN2B when the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it is higher than the control group.
또한, 본 발명은 (1) 인체에서 분리된 뇌종양 조직세포 시료에 후보물질을 처리하는 단계; (2) 상기 후보물질을 처리한 시료에서 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 후보물질을 처리하지 않는 대조군과 비교하여 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 증가하는 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 뇌종양 악성화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the steps of (1) treating a brain tumor tissue cell sample isolated from the human body with a candidate material; (2) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it in the sample treated with the candidate material; and (3) comparing the expression level of the protein or the gene encoding the protein with a control group that does not treat the candidate material and selecting a candidate material in which the expression level of the protein or the gene encoding the protein increases. A method for screening inhibitors is provided.
본 발명은 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, P16INK4a 과발현이 관찰된 경우 항상 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 관찰되지 않았으며, P16INK4a 이 과발현 관찰되지 않은 경우 CDKN2A 및 CDKN2B가 결손이 있거나 없음을 관찰하여 P16INK4a를 이용하여 뇌종양 예후 예측용 바이오마커로 활용할 수 있다.The present invention relates to a biomarker composition for predicting brain tumor prognosis containing P16 INK4a protein or the gene encoding it as an active ingredient. When P16 INK4a overexpression was observed, deletion of CDKN2A and CDKN2B was not always observed, and P16 INK4a If overexpression is not observed, the presence or absence of CDKN2A and CDKN2B can be observed and used as a biomarker for predicting brain tumor prognosis using P16 INK4a .
도 1은 P16INK4a 염색을 통해 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손 여부를 확인하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 수술 후 조직검사에서 P16INK4a 에 대한 항체의 면역조직화학염색을 진행한 결과이다.
도 3은 P16INK4a 과발현 여부에 따른 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손 여부를 확인한 결과이다. (P16INK4a 과발현은 ‘1’로 표시, CDKN2A 또는 CDKN2B의 비결손은 ‘nodel’, 결손은 ‘del’로 표시함.)Figure 1 shows a schematic diagram for confirming the presence or absence of CDKN2A and CDKN2B through P16 INK4a staining.
Figure 2 shows the results of immunohistochemical staining with an antibody against P16 INK4a in a post-operative biopsy.
Figure 3 shows the results of confirming whether CDKN2A and CDKN2B are defective depending on whether P16 INK4a is overexpressed. (P16 INK4a overexpression is indicated as '1', non-deletion of CDKN2A or CDKN2B is indicated as 'nodel', and deletion is indicated as 'del'.)
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 뇌종양 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.The present invention provides a biomarker composition for predicting brain tumor prognosis, comprising the P16 INK4a protein or the gene encoding it as an active ingredient.
상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자가 과발현되면 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 없을 수 있다.If the P16 INK4a protein or the gene encoding it is overexpressed, there may be no deletion of CDKN2A and CDKN2B.
상기 뇌종양은 신경교종 또는 뇌수막종일 수 있다.The brain tumor may be a glioma or meningioma.
본 발명의 "바이오마커"는 뇌종양이 발생한 대상체의 조직 또는 세포를 정상 대조군의 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비하여 질환이 발생한 대상체의 조직 또는 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.The "biomarker" of the present invention is a substance that can diagnose the tissues or cells of a subject with a brain tumor by distinguishing them from the tissues or cells of a normal control group, and shows an increase or decrease in the tissues or cells of a subject with a disease compared to the normal control group. It includes organic biomolecules such as proteins or nucleic acids, lipids, glycolipids, glycoproteins, etc.
본 명세서에서 용어 "예후 예측"은 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 예측이란 질환의 치료 후 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.As used herein, the term “prognosis prediction” refers to the act of predicting the course and outcome of a disease in advance. More specifically, prognosis prediction refers to the fact that the course of a disease after treatment may vary depending on the patient's physiological or environmental condition, and is interpreted to mean all actions that predict the course of the disease after treatment by comprehensively considering the patient's condition. It can be.
본 발명의 목적상 상기 예후 예측은 암 환자의 치료 후, 질환의 경과 및 완치 여부를 미리 예상하여 암환자의 무병 생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 치료 후 암 환자의 무병 생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 암 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 치료 후 암 환자의 무병 생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 암 환자로부터 암이 재발하거나 또는 암으로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다.For the purpose of the present invention, the prognosis prediction can be interpreted as the act of predicting the disease-free survival rate or survival rate of a cancer patient by predicting the course of the disease and whether the cancer patient will be cured after treatment. For example, predicting "the prognosis is good" means that the cancer patient's disease-free survival rate or survival rate after treatment is high, meaning that the cancer patient is likely to be cured, while predicting "the prognosis is bad" means that the cancer patient's disease-free survival rate or survival rate is high after treatment. The disease-free survival rate or survival rate of post-cancer patients is low, which means that there is a high possibility that cancer will recur or die due to cancer.
또한, 본 발명은 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 하는 뇌종양 예후 예측용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for predicting brain tumor prognosis, which contains as an active ingredient an agent that measures the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it.
상기 제제는, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 앱타머 또는 화합물일 수 있다.The agent may be a primer or probe that specifically binds to the gene, an antibody, peptide, peptide mimetics, aptamer, or compound that specifically binds to the protein.
본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화등으로 변형시킬 수 있다.The term “primer” used in the present invention refers to a short gene sequence that serves as the starting point for DNA synthesis and an oligonucleotide synthesized for use in diagnosis, DNA sequencing, etc. The primers can generally be synthesized and used in a length of 15 to 30 base pairs, but may vary depending on the purpose of use, and can be modified by methylation, capping, etc. by known methods.
본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.The term “probe” used in the present invention refers to a nucleic acid that can specifically bind to mRNA of a few bases to hundreds of bases in length, produced through enzyme-chemical separation purification or synthesis. The presence or absence of mRNA can be confirmed by labeling it with a radioactive isotope or enzyme, and it can be designed, modified and used by known methods.
본 발명에서 사용된 용어 “항체”는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 P16INK4a에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.The term “antibody” used in the present invention is a term known in the art and refers to a specific immunoglobulin directed against an antigenic site. The antibody in the present invention refers to an antibody that specifically binds to P16 INK4a of the present invention, and the antibody can be prepared according to conventional methods in the art. The types of antibodies include polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, and all immunoglobulin antibodies are included. The antibody is meant to be intact, with two full-length light chains and two full-length heavy chains. Additionally, the above antibodies also include special antibodies such as humanized antibodies.
본 발명에서 사용된 용어 “펩타이드”는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한, 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.The term “peptide” used in the present invention has the advantage of high binding capacity to the target substance and does not undergo denaturation even during heat/chemical treatment. Additionally, because the molecule size is small, it can be used as a fusion protein by attaching it to another protein. Specifically, it can be used by attaching it to a polymer protein chain, so it can be used as a diagnostic kit and drug delivery material.
본 발명에서 사용된 용어 “앱타머”는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한종류의 단일 가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.The term “aptamer” used in the present invention refers to a special type of single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) that has a stable tertiary structure and is capable of binding to a target molecule with high affinity and specificity. It refers to a type of composed polynucleotide. As described above, aptamers can specifically bind to antigenic substances in the same way as antibodies, but are composed of polynucleotides that are more stable than proteins, have a simpler structure, and are easier to synthesize, so they can be used as replacements for antibodies. You can.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 뇌종양 예후 예측용 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a kit for predicting brain tumor prognosis comprising the composition.
본 발명의 “키트”는 바이오마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소 반응 정지액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.The “kit” of the present invention consists of an antibody that specifically binds to a biomarker component, a secondary antibody conjugate conjugated with a label that develops color by reaction with the substrate, a color-generating substrate solution that will undergo color development with the label, and a washing solution. and enzyme reaction stopping solution, etc., and may be manufactured into a number of separate packaging or compartments containing the reagent components used.
또한, 본 발명은 (1) 뇌종양 환자에서 분리된 시료로부터 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및 (3) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 없다고 판단하는 단계;를 포함하는 뇌종양 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides the following steps: (1) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it from a sample isolated from a brain tumor patient; (2) comparing the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it with a normal control group; and (3) determining that CDKN2A and CDKN2B are not defective when the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it is higher than the control group.
상기 시료는 뇌종양 조직일 수 있다.The sample may be brain tumor tissue.
또한, (1) 뇌종양 환자에서 분리된 시료로부터 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및 (3) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 없다고 판단하는 단계;를 포함하는 뇌종양에서 CDKN2A 및 CDKN2B의 상태 스크리닝 방법을 제공한다.Additionally, (1) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it from a sample isolated from a brain tumor patient; (2) comparing the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it with a normal control group; and (3) determining that there is no deletion of CDKN2A and CDKN2B when the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it is higher than the control group.
또한, (1) 인체에서 분리된 뇌종양 조직세포 시료에 후보물질을 처리하는 단계; (2) 상기 후보물질을 처리한 시료에서 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 후보물질을 처리하지 않는 대조군과 비교하여 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 증가하는 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 뇌종양 악성화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, (1) processing a candidate material on a brain tumor tissue cell sample isolated from the human body; (2) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it in the sample treated with the candidate material; and (3) comparing the expression level of the protein or the gene encoding the protein with a control group that does not treat the candidate material and selecting a candidate material in which the expression level of the protein or the gene encoding the protein increases. A method for screening inhibitors is provided.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, to aid understanding of the present invention, it will be described in detail through examples. However, the following examples are merely illustrative of the content of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples. Examples of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those with average knowledge in the art.
<실시 예 1><Example 1> P16P16 INK4a INK4a 면역 염색immunostaining
수술로 절제된 신경 교종(IRB No. AJOUIRB-KSP-2020-218)으로 제작된 대표적인 파라핀 블록으로 4㎛ 두께의 조직 절편을 제작한 후 슬라이드 위에 부착시켰다. 부착된 조직을 60℃에서 40분 동안 열처리한 후 자동면역염색기 BenchMark GX IHC system (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA)를 이용하여 염색하였다. Cell Conditioning 1 (Catalog No: 0579801001, Ventana Medical Systems, Inc.)으로 32분간 전처리를 하고, 1차 항체로 CINtec p16 Histology (Catalog No: 06695248001, Ventana Medical Systems, Inc.)을 이용하여 32분간 인큐베이싱 한 후 사용된 검출 시약으로 Optiview DAB IHC Detection Kit (Catalog No: 06396500001, Ventana Medical Systems, Inc.)를 이용하여 발색한 후 헤마톡실린 II (Catalog No: 05277965001, Ventana Medical Systems, Inc.) 16분, Bluing Reagent (Catalog No: 05266769001, Ventana Medical Systems, Inc.) 4분 처리하였다. 마지막으로 슬라이드를 계면활성제를 이용하여 세척한 후 봉입했다.A 4-μm-thick tissue section was prepared from a representative paraffin block made from a surgically resected glioma (IRB No. AJOUIRB-KSP-2020-218) and then attached on a slide. The attached tissue was heat treated at 60°C for 40 minutes and then stained using an automated immunostainer, BenchMark GX IHC system (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA). Pretreatment with Cell Conditioning 1 (Catalog No: 0579801001, Ventana Medical Systems, Inc.) for 32 minutes, and incubation for 32 minutes using CINtec p16 Histology (Catalog No: 06695248001, Ventana Medical Systems, Inc.) as the primary antibody. After isocating, the detection reagent used was Optiview DAB IHC Detection Kit (Catalog No: 06396500001, Ventana Medical Systems, Inc.), and then hematoxylin II (Catalog No: 05277965001, Ventana Medical Systems, Inc.) 16 minutes, Bluing Reagent (Catalog No: 05266769001, Ventana Medical Systems, Inc.) was treated for 4 minutes. Finally, the slide was washed using surfactant and then sealed.
결과 판독은 세포질 또는 핵과 세포질에 강양성인 종양 세포가 미만성으로 분포하는 경우 양성으로 판독하고 국소적인 종양세포 양성이나 염색이 안 된 경우는 음성으로 판독했다.The results were read as positive if strongly positive tumor cells were diffusely distributed in the cytoplasm or nucleus and cytoplasm, and as negative if tumor cells were localized positive or lacked staining.
그 결과, 도 2에 따르면, P16INK4a 이 과발현된 부분은 염색이 짙은 색으로 된 것을 확인할 수 있는 반면, P16INK4a 이 과발현되지 않은 부분은 염색이 연하게 된 것을 확인할 수 있었다.As a result, according to Figure 2, it was confirmed that the staining of the part where P16 INK4a was overexpressed became dark, while the staining of the part where P16 INK4a was not overexpressed was confirmed to be light.
<실시 예 2><Example 2> CDKN2A 및 CDKN2B 유전자 분석CDKN2A and CDKN2B gene analysis
수술로 절제된 신경 교종으로 제작된 대표적인 파라핀 블록에서 유전체 DNA를 추출한 후 Bioruptor Pico Sonication System (Diagenode, Belgium)를 이용하여유전체 DNA를 약 250bp 길이로 자랐다. 일루미나 시퀀싱을 위하여 준비된 유전체 DNA 라이브러리를 단일가닥핵산과 결합시킨 후 Celemics target enrichment kit (Celemics, Seoul, Republic of Korea)을 이용하여 표적지역인 CDKN2A 및 CDKN2B 유전자 부분을 캡처했다. 캡처된 표적지역을 증폭하고 Illumina NextSeq550 instrument (Illumina, San Diego, CA, USA)을 이용하여 시퀀싱 했다.Genomic DNA was extracted from a representative paraffin block prepared from a surgically resected glioma, and the genomic DNA was grown to a length of approximately 250 bp using the Bioruptor Pico Sonication System (Diagenode, Belgium). After combining the genomic DNA library prepared for Illumina sequencing with single-stranded nucleic acid, the target regions of CDKN2A and CDKN2B genes were captured using the Celemics target enrichment kit (Celemics, Seoul, Republic of Korea). The captured target region was amplified and sequenced using an Illumina NextSeq550 instrument (Illumina, San Diego, CA, USA).
그 결과, 도 3에 따르면, 총 96개의 예시 중에서 30개의 예시에서 P16INK4a 과발현이 관찰되었으며 이들 모두 CDKN2A 및 CDKN2B 결손이 관찰되지 않았다. 그에 반해, P16INK4a 과발현이 관찰되지 않았던 66개의 예시 중 22개의 예시는 CDKN2A 또는 CDKN2B의 결손이 관찰되지 않았고, 30개의 예시는 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 관찰되었으며 나머지 14개의 예시에서는 CDKN2A의 결손만 관찰되었다.As a result, according to Figure 3, P16 INK4a overexpression was observed in 30 examples out of a total of 96 examples, and CDKN2A and CDKN2B deletions were not observed in any of them. In contrast, among the 66 examples in which P16 INK4a overexpression was not observed, 22 examples had no CDKN2A or CDKN2B deletion, 30 examples had CDKN2A and CDKN2B deletion, and in the remaining 14 examples, only CDKN2A deletion was observed. It has been done.
즉, P16INK4a 과발현이 관찰된다면 CDKN2A 및 CDKN2B 결손이 관찰되지 않으므로 추가적으로 FISH, NGS 및 CGH 등의 검사를 진행할 필요가 없이 신경교종의 예후가 좋음을 알 수 있다. 반면, P16INK4a 과발현이 관찰되지 않는 경우에만 추가적으로 FISH, NGS 및 CGH 등의 검사를 진행하여 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손 여부를 확인할 수 있다.In other words, if P16 INK4a overexpression is observed, CDKN2A and CDKN2B deletions are not observed, so it can be seen that the prognosis of glioma is good without the need to conduct additional tests such as FISH, NGS, and CGH. On the other hand, only when P16 INK4a overexpression is not observed, additional tests such as FISH, NGS, and CGH can be performed to confirm whether CDKN2A and CDKN2B are defective.
따라서, FISH, NGS 및 CGH 등의 검사를 진행하기 전에 P16INK4a를 이용하여 선별적으로 CDKN2A 및 CDKN2B 결손 여부를 확인해 뇌종양 예후 예측용 바이오마커 조성물로 사용할 수 있다.Therefore, before performing tests such as FISH, NGS, and CGH, P16 INK4a can be used to selectively check for CDKN2A and CDKN2B deletions and can be used as a biomarker composition for predicting brain tumor prognosis.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. The description of the present invention described above is for illustrative purposes, and those skilled in the art will understand that the present invention can be easily modified into other specific forms without changing the technical idea or essential features of the present invention. will be. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the claims described below, and all changes or modified forms derived from the meaning and scope of the claims and their equivalent concepts should be construed as being included in the scope of the present invention.
Claims (10)
상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자가 과발현되면 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 없는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.In claim 1,
remind When the P16 INK4a protein or the gene encoding it is overexpressed, A biomarker composition characterized by no deletion of CDKN2A and CDKN2B.
상기 뇌종양은 신경교종 또는 뇌수막종인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물. In claim 1,
A biomarker composition, wherein the brain tumor is a glioma or meningioma.
상기 제제는, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.In claim 4,
The composition is characterized in that the agent is a primer or probe that specifically binds to the gene, an antibody, peptide, peptide mimetics, aptamer, or compound that specifically binds to the protein.
(2) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및
(3) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 없다고 판단하는 단계;를 포함하는 뇌종양 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.(1) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it from a sample isolated from a brain tumor patient;
(2) comparing the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it with a normal control group; and
(3) determining that CDKN2A and CDKN2B are not defective when the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it is higher than that of the control group.
상기 시료는 뇌종양 조직인 것을 특징으로 하는 정보를 제공하는 방법.In claim 7,
A method of providing information, wherein the sample is brain tumor tissue.
(2) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및
(3) 상기 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군보다 높은 경우 CDKN2A 및 CDKN2B의 결손이 없다고 판단하는 단계;를 포함하는 뇌종양에서 CDKN2A 및 CDKN2B의 상태 스크리닝 방법.(1) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it from a sample isolated from a brain tumor patient;
(2) comparing the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it with a normal control group; and
(3) determining that there is no defect in CDKN2A and CDKN2B when the expression level of the P16 INK4a protein or the gene encoding it is higher than the control group; A method for screening the status of CDKN2A and CDKN2B in a brain tumor comprising a.
(2) 상기 후보물질을 처리한 시료에서 P16INK4a 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(3) 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 후보물질을 처리하지 않는 대조군과 비교하여 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 증가하는 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 뇌종양 악성화 억제제 스크리닝 방법.(1) Processing a candidate material on a brain tumor tissue cell sample isolated from the human body;
(2) measuring the expression level of P16 INK4a protein or the gene encoding it in the sample treated with the candidate material; and
(3) above A brain tumor malignancy inhibitor screening method comprising: comparing the expression level of the protein or the gene encoding the protein with a control group that does not treat the candidate material and selecting a candidate material in which the expression level of the protein or the gene encoding the protein increases.
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Int. J. Cancer (Pred. Oncol.): 74, 255-259 (1998.12.06. 공개) |
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