KR20240057784A - 돌마자 정원세포의 동결 보존 용액 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
돌마자 정원세포의 동결 보존 용액 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 돌마자 정원세포의 동결 보존 용액 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 돌마자 정원세포-특이적 동결 보존용 조성물은 돌마자 정원세포의 동결시 생존율을 높여줄 뿐만 아니라, 정원세포의 기능성을 보존하는 우수한 효과를 달성하므로, 돌마자 유전자원 확보에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 돌마자(Microphysogobio yaluensis) 정원세포의 동결 보존 용액 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
잉어과 모래무지아과 모래주사속(Microphysogobio)에 속하는 돌마자(Microphysogobio yaluensis)는 하천 중하류의 모래와 자갈이 깔린 옅고 깨끗한 하천에서 부착조류와 수서곤충의 유생 등을 먹고 사는 담수어류로 우리나라에만 분포하고 있어 보전 대책 마련이 시급하다. 돌마자와 같이 보전 가치가 높은 담수어류 종의 증식, 복원을 위해 야생 개체를 이용한 인공증식 기술개발이 우선적으로 수행되어 왔다. 그러나, 인공증식에 의한 어류 종 복원은 질병 발생, 천재지변으로 인해 일시에 유전자원이 소실될 위험성이 높아 유전자원을 안전하게 장기보존하기 위한 기술 개발이 요구된다.
한편, 생식세포 및 그들의 수정으로 생성되는 배아는 하나의 개체로 발생할 수 있는 능력을 보유하고 있어서 어류의 배아, 알, 정자를 액체질소 내에 초저온 동결보존할 경우, 어류 유전자원의 장기보존 기법으로 활용이 가능하다. 어류 유전자원을 안정적으로 장기보존하기 위한 목적으로 어류의 배아, 알, 정자의 초저온동결보존 기술개발에 대한 연구가 수행되어 왔으나, 어류의 배아와 난자는 크기가 크고, 난황이 많으며, 높은 수분함량과 두꺼운 융모막 때문에 성공적인 동결보존에는 한계가 있다.
따라서, 우리나라 고유어종 돌마자의 유전자원을 안정적으로 보존하기 위하여 돌마자에 최적화된 동결보존용액 개발의 중요성이 부각되고 있다.
이에, 본 발명자들은 돌마자 유전자원 복원과 우수한 후대의 생산에 필요한 동결 보존 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 어류의 정소 조직 내에 존재하는 정원세포(spermatogonia)에 대해 최적화된 초저온동결 보존용 조성물이 정원세포의 기능을 손상시키지 않으면서 부화에 성공할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존제를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 손상 방지 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG); 트레할로스(trehalose); 및 난황(egg yolk)을 포함하는 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG); 트레할로스(trehalose); 및 난황(egg yolk)을 포함하는 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존제를 제공한다.
즉, 본 발명은 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia)에 대해 종특이적으로 최적화된 동결 보존 용도를 제공한다는 데 특징이 있다.
본 발명에 있어서, '동결 보존'은 동결 시 돌마자 정소 내 정원세포의 손상을 막고, 돌마자 정소 내 정원세포(spermatogonia)를 동결로 인한 물리적 화학적 스트레스로부터 보호하는 역할을 수행하는 것을 포함하여, 돌마자 정소 내 정원세포(spermatogonia)를 동결하고 그 기능을 보존할 수 있게 하는 것을 의미하며, 동결 손상 보호와 상호 교환적으로 사용할 수 있다.
본 발명에서 동결 보존용 조성물의 유효성분으로서 사용되는 에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG); 트레할로스(trehalose); 및 난황(egg yolk)은, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 직접 제조하거나 통상 시판되고 있는 제품을 구입하여 이용할 수 있으며, 특별히 그 종류에 제한이 없다.
또한, 본 발명에 따른 동결 보존용 조성물은 상기 유효성분 외에도, 종래에 동결 보존제로서 알려져 있던 성분들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 1.3M의 에틸렌글리콜; 0.1M 트레할로스; 및 10%(v/v) 난황을 포함하며, HEPES, NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4, 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), CaCl2·2H2O, 및 MgCl2·6H2O를 더 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 조성물은, 증류수 내 55.27 mM HEPES, 375.48 mM NaCl, 7.28 mM KCl, 23.10 mM KH2PO4, 3.82 mM Na2HPO4, 3.64 mM sodium pyruvate, 2.6 mM CaCl2·2H2O, 및 1.4 mM MgCl2·6H2O가 포함되고 pH 7.8로 조정된 35.2%의 extender를 포함하여, 여기에 1.3M의 에틸렌글리콜; 0.1M 트레할로스; 및 10%(v/v) 난황을 포함할 경우, 동결 후 해동시킨 정원세포의 증식능이, 비동결시킨 일반 정상 대조군과 유사한 수준임을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 동결 보존용 조성물은 동결된 정원세포를 370일 이상 장기간 동안 보존하였다. 본 발명의 동결 보존용 조성물은 동결 과정에서 유발되는 화학적 물리적 스트레스로부터 정원세포를 효과적으로 보호하여 동결된 정원세포를 장기간 보존할 수 있는 것을 특징으로 한다. 특히, 본 발명의 동결 보존용 조성물을 이용하면, 동결된 정원세포를 가혹한 초저온 환경인 -196℃에서 보존을 수행하여도, 그 정원세포의 생존율을 높게 유지시키며 370일 동안 보존시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 돌마자의 정원세포에, 상술한 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존용 조성물 또는 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존제를 처리하여 동결시키는 단계를 포함하는, 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존 방법 또는 동결 손상 방지 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 동결은 액체 질소에 침지하여 -1℃/min의 냉각 속도로 동결시키며, 상기 동결 보존은 300 내지 400 일 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 동결된 돌마자의 정원세포를 해동하는 경우에는 20 내지 30℃ 조건, 예를 들어, 25℃에서 해동시키는 것이 바람직하다.
또한, 상기 돌마자 정원세포는 균질화된 돌마자 정소 조직에 포함된 것이며, 상기 돌마자로부터 분리된 정소 조직은, 본 발명의 동결 보존용 조성물 또는 동결 보존제를 처리하기 전 또는 후에, 균질화시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 상기 균질화는 당 분야에서 통상적으로 사용하는 균질화 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 유효성분을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 돌마자 정원세포-특이적 동결 보존용 조성물은 돌마자 정원세포의 동결시 생존율을 높여줄 뿐만 아니라, 정원세포의 기능성을 보존하는 우수한 효과를 달성하므로, 돌마자 유전자원 확보에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 초저온 동결보존 대상 어류인 돌마자를 보여준다.
도 2는 본 발명의 초저온 동결보존에 사용된 돌마자의 정소를 보여준다.
도 3은 본 발명의 초저온 동결보존 과정에 대한 모식도이다.
도 4는 본 발명의 돌마자 정소 조직에 대한 침투성 동결보호제의 종류(A) 및 농도(B) 조건에 따른 정소 세포의 생존율 결과를 보여준다. 검은색 막대 내 숫자는 각각의 실험에 사용된 정소 조직의 총개수를 나타내며, 3 반복 실험을 수행하여 통계적으로 처리하였다.
도 5는 본 발명의 돌마자 정소 조직에 대한 비침투성 동결보호제의 종류(A) 및 농도(B) 조건에 따른 정소 세포의 생존율 결과를 보여준다. 검은색 막대 안 숫자는 각각의 실험에 사용된 정소 조직의 총개수를 나타내며, 3 반복 실험을 수행하여 통계적으로 처리하였다.
도 2는 본 발명의 초저온 동결보존에 사용된 돌마자의 정소를 보여준다.
도 3은 본 발명의 초저온 동결보존 과정에 대한 모식도이다.
도 4는 본 발명의 돌마자 정소 조직에 대한 침투성 동결보호제의 종류(A) 및 농도(B) 조건에 따른 정소 세포의 생존율 결과를 보여준다. 검은색 막대 내 숫자는 각각의 실험에 사용된 정소 조직의 총개수를 나타내며, 3 반복 실험을 수행하여 통계적으로 처리하였다.
도 5는 본 발명의 돌마자 정소 조직에 대한 비침투성 동결보호제의 종류(A) 및 농도(B) 조건에 따른 정소 세포의 생존율 결과를 보여준다. 검은색 막대 안 숫자는 각각의 실험에 사용된 정소 조직의 총개수를 나타내며, 3 반복 실험을 수행하여 통계적으로 처리하였다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 정액 체취 및 동결
본 발명자들은, 충청북도 영동군 심천면에서 확보한 평균 표준체장(standard length) 7.2±0.7cm의 돌마자의 정소를 분리 및 동결하였다(도 3).
간략하게는, 복강 내 정소 적출을 위해 돌마자를 10분간 마취 후 에탄올로 소독 후 복부를 수술용 가위로 절개하고 정소를 적출하여 사용 전까지 10% (v/v) Fetal bovine serum (FBS)와 1% (v/v) penicillin & streptomycin 혼합용액이 함유된 1 ml의 Leibovitz L-15 배지에 침지시켰다. 정소에 묻은 이물질을 닦고 미세가위를 이동해 0.1 mg으로 절편화한 후, 500 ㎕의 동결액이 함유된 1.2 ml cryovial에 정소조직이 충분히 잠기도록 침지시켰다.
실시예 2. 동결보호제 조건에 따른 정원세포의 생존율 측정
본 발명자들은, 종특이적으로 돌마자의 안전한 유전 자원을 확보하고 보존하는 데 필요한 돌마자 정원세포의 동결 보존액 조성의 최적 조건을 확인하고자, 다양한 동결보호제 조건으로 동결된 정원세포를 해동하여 정원세포의 생존율을 측정하였다.
이때, 상기 동결 보존액은 35.2%의 extender(증류수 내 55.27 mM HEPES, 375.48 mM NaCl, 7.28 mM KCl, 23.10 mM KH2PO4, 3.82 mM Na2HPO4, 3.64 mM sodium pyruvate, 2.6 mM CaCl2·2H2O, 및 1.4 mM MgCl2·6H2O, pH 7.8로 조정)가 기본적으로 함유되며, 실험 디자인에 따라 침투성 동결보호제[methanol (MET), ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG), dimethyl sulfoxide (DMSO) 및 glycerol (GLY)] 또는 비침투성 동결보호제[glucose, lactose, trehalose, egg yolk 및 bovine serum albumin(BSA)]를 농도에 따라 첨가하였다.
정소 조직과 동결보존액이 들은 1.2 ml cryovial을 얼음에서 1시간 동안 방치하여 평형화를 유도한 다음, 완만동결용기(CoolCell FTS30, USA)에 넣어 -80℃ deep freezer에서 90분간 동결하였다. 냉각속도 최적화 실험에서는 냉각속도 조절을 위하여 controlled-rate freezer(-0.5℃/min, -1℃/min, -5℃/min 및 -10℃/min cooling rate)를 이용하여 동결하였다. -80℃까지 정소 조직이 동결된 후, cryovial을 꺼내어 액체질소(-196℃)에 2일간 동결 보존하였다. 액체질소에 동결 보존된 정소조직을 꺼내어 15℃, 20℃, 25℃ 및 30℃ 증류수에서 1분 30초 이상 해동하였다. 해동된 정소를 10%(v/v) FBS와 1%(v/v) penicillin & streptomycin 혼합용액이 함유된 Leibovitz L-15 배지 1 ml에서 10분 동안 재수화(rehydration)한 뒤 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)를 이용해 배지를 씻어내었다.
해동된 정소 조직은 10%(v/v) 0.05% trypsin-EDTA이 추가된 1,000 ㎕ Leibovitz L-15 배지용액에서 30분간 처리하면서 조직이 완전히 세포단위로 분해될 수 있도록 매 10분마다 피펫팅하였다. 조직을 완전히 분해(균질화)한 후 세포 현탁액에 10%(v/v) FBS와 1%(v/v) penicillin & streptomycin 혼합용액이 함유된 Leibovitz L-15 배지 6 ml을 추가하여 효소의 불활성화를 유도하였다. 그 다음 세포 현탁액을 40㎛ cell strainer에 통과시켜 조직 찌꺼기 등을 제거하고 원심분리(1,500 rpm, 4분)하여 정소조직에서 유래되는 단일 세포들을 회수하였다. 회수된 세포들은 10% FBS 함유 Leibovitz L-15 배지에 현탁하여 세포 계수를 실시하였다.
세포의 생존은 trypan blue 염색을 통해 확인되었으며 생존한 세포 및 죽은 세포들의 계수는 hemocytometer를 이용하여 현미경 하에서 실시되었다. 생존율은 전체 세포 수[생존한 세포(trypan blue(-) + 죽은 세포(trypan blue(+)]에 대한 생존한 세포의 백분율로 나타내었다.
그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, 침투성 동결보호제가 각각 포함된 동결보존용액에서 동결-해동된 돌마자 정소 조직 유래 세포의 생존율을 측정했을 때, 1.3 M 농도의 methanol, EG, PG, DMSO, glycerol에 대해 각각 38.2 ± 8.4%, 59.0 ± 4.1%, 20.9 ± 3.6%, 56.9 ± 6.9%, 22.7 ± 8.0%의 세포 생존율을 확인하였다.
통계분석(one-way ANOVA with Tukey test)에 따르면, 1.3 M 농도의 methanol, EG, DMSO가 포함된 동결보존용액에서 초저온 동결되었을 때 다른 동결보호제에 비해 유의적으로 높은 세포 생존율을 나타냈다.
상기 세 가지 동결보호제 중 EG와 DMSO 실험구의 세포 생존율이 methanol 실험구에 비해 높았기 때문에 농도 조건 최적화를 위한 실험으로 EG와 DMSO를 선별하였다.
또한, EG와 DMSO의 최적 농도를 결정하기 위해, 서로 다른 농도(1.0∼1.6 M) 조건에 따른 생식소 동결보존 실험을 실시하였다.
그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, 1.0, 1.3, 1.6 M EG와 1.0, 1.3, 1.6 M DMSO를 포함하는 동결보호제 각각에 대해 56.0 ± 8.2%, 62.9 ± 4.0%, 34.2 ± 4.2%, 53.2 ± 3.6%, 55.7 ± 3.9%, 40.2 ± 3.7%의 해동 후 세포 생존율이 확인되었다.
통계분석(one-way ANOVA with Tukey test)에 따르면, 1.3 M 농도의 EG가 포함된 동결보존액에서 동결되었을 때, 가장 유의하고 높은 세포 생존율을 나타냈으므로, 돌마자 정소 조직에 대한 침투성 동해방지제의 최적 조건은 1.3 M EG인 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명자들은 정소 조직의 동결-해동 후 세포 생존율을 더욱 증대시키기 위해, 세포막 침투성 동결보호제의 최적 조건 하에서 비침투성 동해방지제를 추가하여 동결 효율을 조사하였다.
본 실시예는 두 단계로 진행되었고, 첫 번째 단계에서 잘 알려진 세 종류의 비침투성 동결보호제인 glucose, lactose, trehalose을 각각 추가하여 최적 종류 조건을 조사하였고, 두 번째 단계에서는 10% egg yolk(v/v)와 1.5% bovine serum albumin(BSA) 조건에서 비침투성 동결보호제의 최적 농도 조건을 조사하였다.
그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, 1.3 M EG에 0.1 M glucose, 0.1 M lactose, 0.1 M trehalose, 10% egg yolk 및 1.5% BSA가 추가된 동결액에서 동결-해동된 돌마자 정소 조직 유래 세포의 생존율을 측정했을 때, 10% egg yolk를 포함하는 0.1 M glucose, lactose, trehalose 실험군 각각에 대해 53.8 ± 3.5%, 55.5 ± 2.1%, 67.8 ± 3.7%의 세포 생존율이 측정되었고, 1.5% BSA를 포함하는 0.1 M glucose, lactose, trehalose 실험군 각각에 대해 59.0 ± 8.0%, 56.1 ± 7.9%, 62.4 ± 2.8%의 세포 생존율이 측정되었다.
또한, 비침투성 동결보호제 trehalose의 최적 농도를 결정하기 위해, 10% egg yolk 및 1.5% BSA가 추가된 동결액에서 0.1∼0.3 M 농도의 trehalose를 각각 포함하는 동결액을 제조하여 정소 조직 동결을 실시하였다.
그 결과, 도 5B에 나타낸 바와 같이, 10% egg yolk에 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M trehalose를 포함하는 동결액과 1.5% BSA에 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M trehalose를 포함하는 동결액 각각에 대해 70.5 ± 2.8%, 57.2 ± 1.1%, 54.8 ± 3.1%, 61.2 ± 6.8%, 58.2 ± 6.7%, 47.2 ± 7.2%의 해동 후 정소 세포 생존율이 측정되어, 10% egg yolk와 0.1 M trehalose가 포함된 실험구에서 가장 높은 세포 생존율이 측정되었다.
이러한 결과들을 종합해 봤을 때, 돌마자 정소 조직의 초저온동결보존을 위한 최적 조건은 동결보존용액 조성(1.3 M EG, 0.1 M trehalose, 10% egg yolk), 냉각속도 -1℃/min, 해동온도 25℃이었고, 최적 조건에서 70.5 ± 2.8%의 해동 후 정소 세포 생존율을 얻을 수 있었다. 이는, 초저온 동결된 정소세포의 생존율에 있어 세포막 비침투성 동결보호제 보다 세포막 침투성 동결보호제의 영향이 더 큰 것을 의미하며, 유리화동결(vitrification)과 달리 완만동결(slow-freezing)의 경우, 세포막 침투성 동결보호제가 세포 내부로 침투하고 해동 후에 물과 치환되는 과정을 거치기 때문에 세포막 침투성 동결보호제의 영향이 더 컸던 것으로 예상된다. 특히, 다른 실험군에서는 70% 이상의 해동 후 생존율이 확인되지 않았으므로, 상기의 결과는 동결보존용액 조성(1.3 M EG, 0.1 M trehalose, 10% egg yolk)이 돌마자 정원 세포 동결 보존에 가장 최적의 조합임을 보여주는 결과이다.
실시예 3. 동결 조건에 따른 정원세포의 생존율 측정
본 발명자들은, 돌마자의 안전한 유전 자원을 확보하고 보존하는 데 필요한 돌마자 정원세포의 동결시 최적 조건을 확인하고자, 다양한 조건으로 동결된 정원세포를 해동하여 정원세포의 생존율을 측정하였다.
이때, 상기 실시예 2에서 선별된 최적의 동결보존용액 조성(1.3 M EG, 0.1 M trehalose, 10% egg yolk)을 이용하여, 해동 온도 25℃ 조건에서 각각의 냉각속도(-0.5℃/min, -1℃/min, -5℃/min 및 -10℃/min cooling rate)에 따른 최적화 실험을 실시하였다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 냉각 속도에 따른 돌마자의 정소세포 생존율을 측정하고, 각각의 실험값에 대한 통계분석(one-way ANOVA with Tukey test)했을 때, -1℃/min의 냉각속도에서 유의적으로 가장 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었다.
| -0.5℃/min | -1℃/min | -5℃/min | -10℃/min | |
| 돌마자의 정소 세포 생존율(%) | 42.6 ± 2.5a | 73.2 ± 1.4b | 28.5 ± 1.8c | 14.7 ± 1.1d |
데이터는 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± 표준 오차로 표시된다. P < 0.05의 통계적 유의 수준을 사용하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 통계적 유의성을 결정했다.
실시예 4. 해동 조건에 따른 정원세포의 생존율 측정
본 발명자들은, 돌마자의 안전한 유전 자원을 확보하고 보존하는 데 필요한 돌마자 정원세포의 해동시 최적 조건을 확인하고자, 동결된 정원세포를 다양한 조건으로 해동하여 정원세포의 생존율을 측정하였다.
이때, 상기 실시예 2에서 선별된 최적의 동결보존용액 조성(1.3 M EG, 0.1 M trehalose, 10% egg yolk) 및 상기 실시예 3에서 선별된 냉각속도 -1℃/min 조건에서, 각각의 해동온도(15℃, 20℃, 25℃ 및 30℃)에 따른 최적화 실험을 실시하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 해동온도에 따른 돌마자의 정소세포 생존율을 측정하고, 각각의 실험값에 대한 통계분석(one-way ANOVA with Tukey test)했을 때, 25℃ 해동온도 조건에서 가장 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었다.
| 15℃ | 20℃ | 25℃ | 30℃ | |
| 돌마자의 정소 세포 생존율(%) | 66.9 ± 3.5a | 70.8 ± 2.7a | 73.1 ± 4.5a | 72.9 ± 4.0a |
데이터는 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± 표준 오차로 표시된다. P < 0.05의 통계적 유의 수준을 사용하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 통계적 유의성을 결정했다.
실시예 5. 동결 기간에 따른 정원세포의 생존율 측정
본 발명자들은, 돌마자의 안전한 유전 자원을 확보하고 보존하는 데 필요한 돌마자 정원세포의 동결시 최적 조건을 확인하고자, 다양한 기간으로 동결된 정원세포를 해동하여 정원세포의 생존율을 측정하였다.
이때, 상기 실시예 2에서 선별된 최적의 동결보존용액 조성(1.3 M EG, 0.1 M trehalose, 10% egg yolk), 상기 실시예 3에서 선별된 냉각속도 -1℃/min 및 상기 실시예 4에서 선별된 해동온도 25℃ 조건에서, 액체질소 내에 초저온(-196℃) 동결보존된 기간에 따른 돌마자의 정소세포 생존율을 확인하기 위한 실험을 실시하였다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 초저온 동결보존된 기간에 따른 돌마자의 정소세포 생존율을 측정하고, 각각의 실험값에 대한 통계분석(one-way ANOVA with Tukey test)했을 때, 동결보존 기간 1일∼370일에 따른 세포생존율은 유의적 차이를 보이지 않았다.
이는, 동결보존 기간에 상관없이, 본 발명의 최적 조건에 따라 동결 및 해동된 돌마자의 유전자원이 액체질소 내에서 안정적으로 보존된다는 것을 입증한다.
| 1일 | 2일 | 30일 | 56일 | 370일 | |
| 돌마자의 정소 세포 생존율(%) | 70.5 ± 2.8a | 73.8 ± 3.8a | 70.1 ± 2.5a | 74.2 ± 5.0a | 72.5 ± 2.7a |
데이터는 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± 표준 오차로 표시된다. P < 0.05의 통계적 유의 수준을 사용하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 통계적 유의성을 결정했다.
실시예 6. 해동된 정원세포의 증식률 측정
본 발명자들은, 본 발명의 돌마자 정원세포의 최적 동결 보존액 조성 및 조건이 동결 후 해동된 정원세포의 정상적 증식에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
이에, 돌마자의 유전자원을 안정적으로 보존하기 위한 최적화 조건(동결보존용액 조성 1.3 M EG, 0.1 M trehalose, 10% egg yolk, 냉각속도 -1℃/min, 해동온도 25℃)에서 370일간 초저온 동결보존된 세포는, 생체 내 정상적 증식 여부 판단을 위해 PKH26 Cell Linker Kit (Sigma-Aldrich)를 이용하여 세포막을 형광염색하고 50um의 직경을 가진 미세유리관을 이용하여 약 40도의 각도에서 갓 부화한 돌마자 부화자어의 복강 내로 개체 당 5,000 세포를 미세현미 주입하였다. 동결세포의 증식률 판단을 위해 이식 후 50일째 부화 자어의 생식선 내에 형광염색 세포가 증식하고 있는 개체를 계수화했고 비동결 실험구는 대조구로 사용하였다.
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 돌마자의 동결보존 정원세포의 생체 내 증식률을 측정했을 때, 동결실험구와 비동결실험구의 증식률은 각각 62.3 ± 4.1 및 58.0 ± 3.3였으며, 통계분석(Student's t-test)했을 때 두 실험구 간에 유의적인 차이는 없었다.
즉, 동결 정소세포 내에 존재하는 정원세포(spermatogonia)의 증식률(proliferation rate)이 비동결 세포와 차이가 없다는 것은, 본 발명의 초저온 동결보존 최적화 조건에서 동결보존된 돌마자의 정소세포가 성공적으로 동결보존되었을 뿐만 아니라, 돌마자의 유전자원을 안정적으로 보존될 수 있음을 입증한다.
| 370일 동결 실험구 | 비동결 실험구 | |
| 돌마자 정원세포의 증식률(%) | 62.3 ± 4.1a | 58.0 ± 3.3a |
데이터는 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± 표준 오차로 표시된다. 두 그룹 간의 비교에는 스튜던트 t-검정이 사용되었다. P < 0.05는 통계적 유의성을 나타낸다.
따라서, 결론적으로 본 발명의 초저온 동결보존 최적화 조건에 따라 종특이적으로 동결보존된 돌마자의 정소세포는, 발생학적 차이가 없는 인공수정 또는 체외수정에 이용가능할 뿐 아니라, 성공적으로 유전자원 보전에 달성할 수 있음을 보여준다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
Claims (16)
- 에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG); 트레할로스(trehalose); 및 난황(egg yolk)을 포함하는 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 1.3M의 에틸렌글리콜; 0.1M 트레할로스; 및 10%(v/v) 난황을 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 HEPES, NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4, 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), CaCl2·2H2O, 및 MgCl2·6H2O를 더 포함하는 것인, 조성물.
- 에틸렌글리콜(ethylene glycol, EG); 트레할로스(trehalose); 및 난황(egg yolk)을 포함하는 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존제.
- 제4항에 있어서,
상기 동결 보존제는 1.3M의 에틸렌글리콜; 0.1M 트레할로스; 및 10%(v/v) 난황을 포함하는 것인, 동결 보존제.
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 HEPES, NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4, 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), CaCl2·2H2O, 및 MgCl2·6H2O를 더 포함하는 것인, 동결 보존제.
- 돌마자의 정원세포에, 제1항의 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존용 조성물 또는 제4항의 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존제를 처리하여 동결시키는 단계를 포함하는, 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 돌마자 정원세포는 균질화된 돌마자 정소 조직에 포함된 것인, 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 동결은 액체 질소에 침지하여 -1℃/min의 냉각 속도로 동결시키는 것인, 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 동결된 돌마자의 정원세포는 20 내지 30℃ 조건에서 해동시키는 것인, 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 동결 보존은 300 내지 400 일 동안 수행되는 것인, 방법.
- 돌마자의 정원세포에, 제1항의 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존용 조성물 또는 제4항의 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 보존제를 처리하여 동결시키는 단계를 포함하는, 돌마자(Microphysogobio yaluensis)의 정원세포(spermatogonia) 동결 손상 방지 방법.
- 제12항에 있어서,
상기 돌마자 정원세포는 균질화된 돌마자 정소 조직에 포함된 것인, 방법.
- 제12항에 있어서,
상기 동결은 액체 질소에 침지하여 -1℃/min의 냉각 속도로 동결시키는 것인, 방법.
- 제12항에 있어서,
상기 동결된 돌마자의 정원세포는 20 내지 30℃ 조건에서 해동시키는 것인, 방법.
- 제12항에 있어서,
상기 동결 보존은 300 내지 400 일 동안 수행되는 것인, 방법.
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