KR20240056484A - 2가 분자 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 초기 빌딩 블록 및 암호화 영역을 포함하는 2가 또는 다가 선형 개시자 핵산에 관한 것이다. 선형 개시자 핵산은 2가 또는 다가 분자를 생성하기 위한 암호화된 화합물의 합성에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 일부 양태에서 선형 개시자 핵산, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 선형 개시자 핵산으로부터 화합물을 합성하는 방법 및 합성된 화합물을 사용하여 원하는 특성을 갖는 암호화된 분자를 식별하는 방법에 관한 것이다.
조합 화학 분야는 단일 공정으로 많은 수의 화합물을 제조하는 것을 가능하게 만들었다. 이러한 조합 라이브러리는 이러한 화학적 하위 단위의 첨가를 암호화하는 핵산에 조립될 수 있는 연속적인 화학적 하위 단위(예를 들어, 빌딩 블록)로부터 합성된다. 생성된 라이브러리 화합물은 원하는 특성(표적 분자에 대한 결합을 포함하나 이에 제한되지 않음)을 보유하는지 테스트할 수 있다. 이러한 많은 방법의 성공에도 불구하고, 기존 방법은 상호 작용이 적은 수로 존재하거나 라이브러리 화합물 자체가 적은 수로 존재하는 경우 라이브러리 화합물과 표적 분자 간의 상호 작용을 감지하는 데 어려움을 겪는다.
따라서, 라이브러리 화합물과 표적 분자 사이의 상호작용 수를 증가시키는 라이브러리를 포함하여 개선된 화합물 라이브러리에 대한 필요성이 업계에 존재한다. 또한, 개선된 라이브러리 화합물을 합성하는 방법도 필요하다.
선형 개시자 핵산을 제조하는 방법이 본 명세서에 기술되어 있다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산을 제조하는 방법이 있는데, 선형 개시자 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록 및 암호화 영역을 포함하고; 제 1 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역의 상류에 있는 제 1 부위에 부착되고, 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역의 하류에 있는 제 2 부위에 부착되며; 방법은 선형 개시자 핵산을 형성하기 위해 원형화된 핵산을 절단하는 단계를 포함하며; 원형화된 핵산은 (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록, 및 (iv) 암호화 영역을 포함하고; (i) 및 (iii)은 (ii)의 반대쪽 말단에 부착되고, 절단은 절단 가능한 링커를 절단한다.
일부 실시태양에서, 절단은 효소적 절단에 의한다. 일부 실시태양에서, 효소적 절단은 제한 소화에 의한다. 일부 실시태양에서, 절단은 화학적 절단에 의한다.
일부 실시태양에서, 원형화된 핵산은 원형화된 핵산을 형성하기 위해 선형 전구체 핵산을 결찰하는 단계를 포함하는 방법에 의해 형성되며; 선형 전구체 핵산은 (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록, 및 (iv) 암호화 영역을 포함하고; (i) 및 (iii)은 선형 전구체 핵산에서 (ii)의 반대쪽 말단에 부착되고; (i), (ii) 및 (iii)은 각각 선형 전구체 핵산에서 (iv)의 상류 또는 하류에 있다. 일부 실시태양에서, 결찰은 스플린트(splint) 결찰이다. 일부 실시태양에서, 결찰은 블런트(blunt) 결찰이다.
일부 실시태양에서, 암호화 영역은 복수의 코돈을 포함한다. 일부 실시태양에서, 복수의 코돈 중 적어도 하나의 코돈은 5 내지 60개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 코돈은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 또는 둘 다에 대한 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화한다. 일부 실시태양에서, 복수의 코돈은 복수의 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화한다.
일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 제 1 링커 및 제 2 링커를 포함하며, 제 1 링커는 제 1 초기 빌딩 블록을 선형 개시자 핵산에 부착하고, 제 2 링커는 제 2 초기 빌딩 블록을 선형 개시자 핵산에 부착한다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록은 공유 결합에 의해 제 1 링커에 부착되고, 제 2 초기 빌딩 블록은 공유 결합에 의해 제 2 링커에 부착된다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아니다.
일부 실시태양에서, 암호화 영역은 2 내지 20개의 코돈을 포함한다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 5 내지 20개의 코돈을 포함한다.
일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 개재 서열이다. 일부 실시태양에서, 개재 서열은 4 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시태양에서, 개재 서열은 비뉴클레오타이드 모이어티이다.
(i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록, 및 (iv) 암호화 영역을 포함하는 선형 전구체 핵산이 본 명세서에 추가로 기술되며, (i) 및 (iii)은 선형 전구체 올리고뉴클레오타이드에서 (ii)의 반대쪽 말단에 부착되며; (i), (ii) 및 (iii)은 각각 선형 전구체 핵산에서 (iv)의 상류 또는 하류에 있다. 선형 전구체 핵산의 일부 실시태양에서, 5' 및 3' 종단은 뉴클레오타이드 스플린트에 비공유 결합된다.
(i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록, 및 (iv) 암호화 영역을 포함하는 원형화된 핵산이 본 명세서에 추가로 기술되며; (i)와 (iii)은 (ii)의 반대쪽 말단에 부착된다.
다음 단계를 포함하여 화합물을 합성하는 방법이 본 명세서에 추가로 기술되어 있다: (a) 복수의 선형 개시자 핵산을 포함하는 분자 풀을 제공하는 단계, 각각의 선형 개시자 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록 및 복수의 코돈을 포함하는 암호화 영역을 포함하며; 제 1 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역의 상류에 있는 부위에 부착되고, 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역의 하류에 있는 제 2 부위에 부착된다; (b) 안티 코돈과 암호화 영역의 코돈 중 적어도 하나의 혼성화를 허용하는 조건하에서 선형 개시자 핵산 중 적어도 하나를 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 안티 코돈과 접촉시키는 단계, 폴리머 빌딩 블록은 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록과 반응하여 공유 결합을 형성한다.
화합물 합성 방법의 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록, 및 (iv) 암호화 영역을 포함하는 원형화된 핵산의 절단 부위에서 절단 가능한 링커의 절단에 의해 형성되며; (i) 및 (iii)은 원형화된 핵산에서 (ii)의 반대쪽 말단에 부착된다.
화합물 합성 방법의 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 5' 말단에 개재 서열의 제 1 부분을 포함하고, 3' 말단에 개재 서열의 제 2 부분을 포함하고; 선형 개시자 핵산은 (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 제한 부위를 포함하는 개재 서열, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록 및 (iv) 암호화 영역을 포함하는 원형화된 핵산에서 제한 부위의 제한 소화에 의해 형성되었으며; (i) 및 (iii)은 원형화된 핵산에서 (ii)의 반대쪽 말단에 부착된다.
화합물 합성 방법의 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 5' 말단에 절단 가능한 링커의 제 1 부분을 포함하고, 3' 말단에 절단 가능한 링커의 제 2 부분을 포함하며; 선형 개시자 핵산은 (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 제한 부위를 포함하는 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록 및 (iv) 암호화 영역을 포함하는 원형화된 핵산에서 제한 부위의 제한 소화에 의해 형성되었으며; (i) 및 (iii)은 원형화된 핵산에서 (ii)의 반대쪽 말단에 부착된다.
화합물 합성 방법의 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 본 명세서에 기술된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다.
화합물 합성 방법의 일부 실시태양에서, 방법은 제 1 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물 및 제 2 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물을 형성하기 위해 단계(b)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다. 화합물 합성 방법의 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물과 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물은 동일하다.
화합물 합성 방법의 일부 실시태양에서, 폴리머 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아니다. 화합물 합성 방법의 일부 실시태양에서, 합성된 화합물은 핵산 또는 핵산 유사체를 포함하지 않는다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
본 발명의 대표적인 실시태양은 다음 도면을 참조하여 개시된다. 설명된 실시태양은 도시된 정확한 세부사항에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1은 본 명세서에 기술된 방법에 의해 제조된, 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 및 복수의 코돈을 포함하는 암호화 영역을 포함하는 선형 개시자 핵산을 도시한다. 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 링커를 통해 선형 개시자 핵산에 부착된다.
도 2는 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 복수의 코돈을 포함하는 암호화 영역, 및 절단 가능한 링커를 포함하는 선형 전구체 핵산을 도시한다. 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 각각 절단 가능한 링커의 상류 위치 및 하류 위치에 부착된다. 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록 및 절단 가능한 링커는 각각 암호화 영역의 상류이다.
도 3a는 비공유 원형화된 핵산을 형성하기 위해 결찰을 위해 스플린트된(splinted) 선형 전구체 핵산을 도시한다. 선형 전구체 핵산의 5' 및 3' 종단은 뉴클레오타이드 스플린트에 비공유 결합되어 있다.
도 3b는 블런트 말단 결찰 전 선형 전구체 핵산의 방향을 도시한다. 선형 전구체 핵산은 블런트 말단 결찰 시 원형화된 핵산을 형성한다.
도 4는 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 암호화 영역 및 절단 가능한 링커를 포함하는 원형화된 핵산을 도시한다. 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 각각 절단 가능한 링커의 상류 위치 및 하류 위치에 부착된다.
도 5는 결찰에 사용된 스플린트가 부착된 원형화된 핵산의 절단 가능한 링커 내의 절단 부위를 도시한다. 절단 부위는 선형 개시자 핵산을 생성하기 위해 제한 효소에 의해 절단되는(예를 들어, 점선에서) 인식 서열을 포함하는 제한 부위(예시적인 제한 부위가 도시된다)일 수 있다. 대안적으로, 절단 부위는 화학적 절단에 의해 절단되어 선형 개시자 핵산을 생성할 수 있다.
도 6은 본 명세서에 기술된 바와 같이 중간체 원형화된 핵산을 사용하여 선형 전구체 핵산으로부터 선형 개시자 핵산을 제조하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 7은 본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산 및 안티 코돈으로부터 화합물을 합성하는 방법을 도시한다. 안티 코돈은 폴리머 빌딩 블록을 운반하며, 안티 코돈은 폴리머 빌딩 블록에 상응하고 이를 식별한다. 안티 코돈은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역의 복수의 코돈 중 적어도 하나에 혼성화된다. 안티 코돈의 혼성화 시, 폴리머 빌딩 블록은 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록과 결합하여 공유 결합을 형성한다.
도 8은 제 1 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물 및 제 2 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물을 도시한다. 제 1 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물과 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물은 도시된 바와 같이 동일하지만 상이할 수 있다.
도 1은 본 명세서에 기술된 방법에 의해 제조된, 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 및 복수의 코돈을 포함하는 암호화 영역을 포함하는 선형 개시자 핵산을 도시한다. 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 링커를 통해 선형 개시자 핵산에 부착된다.
도 2는 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 복수의 코돈을 포함하는 암호화 영역, 및 절단 가능한 링커를 포함하는 선형 전구체 핵산을 도시한다. 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 각각 절단 가능한 링커의 상류 위치 및 하류 위치에 부착된다. 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록 및 절단 가능한 링커는 각각 암호화 영역의 상류이다.
도 3a는 비공유 원형화된 핵산을 형성하기 위해 결찰을 위해 스플린트된(splinted) 선형 전구체 핵산을 도시한다. 선형 전구체 핵산의 5' 및 3' 종단은 뉴클레오타이드 스플린트에 비공유 결합되어 있다.
도 3b는 블런트 말단 결찰 전 선형 전구체 핵산의 방향을 도시한다. 선형 전구체 핵산은 블런트 말단 결찰 시 원형화된 핵산을 형성한다.
도 4는 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 암호화 영역 및 절단 가능한 링커를 포함하는 원형화된 핵산을 도시한다. 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 각각 절단 가능한 링커의 상류 위치 및 하류 위치에 부착된다.
도 5는 결찰에 사용된 스플린트가 부착된 원형화된 핵산의 절단 가능한 링커 내의 절단 부위를 도시한다. 절단 부위는 선형 개시자 핵산을 생성하기 위해 제한 효소에 의해 절단되는(예를 들어, 점선에서) 인식 서열을 포함하는 제한 부위(예시적인 제한 부위가 도시된다)일 수 있다. 대안적으로, 절단 부위는 화학적 절단에 의해 절단되어 선형 개시자 핵산을 생성할 수 있다.
도 6은 본 명세서에 기술된 바와 같이 중간체 원형화된 핵산을 사용하여 선형 전구체 핵산으로부터 선형 개시자 핵산을 제조하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 7은 본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산 및 안티 코돈으로부터 화합물을 합성하는 방법을 도시한다. 안티 코돈은 폴리머 빌딩 블록을 운반하며, 안티 코돈은 폴리머 빌딩 블록에 상응하고 이를 식별한다. 안티 코돈은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역의 복수의 코돈 중 적어도 하나에 혼성화된다. 안티 코돈의 혼성화 시, 폴리머 빌딩 블록은 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록과 결합하여 공유 결합을 형성한다.
도 8은 제 1 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물 및 제 2 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물을 도시한다. 제 1 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물과 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물은 도시된 바와 같이 동일하지만 상이할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 선형 개시자 핵산을 제조하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산은 2가 분자(예를 들어, 합성된 화합물의 다가 표시를 허용하는 분자)의 합성을 허용하며, 이는 하류 화합물 분석 동안 반응성과 표적 결합을 증가시킨다. 각각 합성된 화합물을 포함하는 이들 2가 분자의 풀은 표적에 대한 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 표적(예를 들어, 표적 단백질)은 고체 지지체 상에 고정된 다음, 특정 2가 분자가 표적에 결합할 수 있도록 2가 분자 풀과 함께 배양될 수 있다. 결합하지 않는 2가 분자는 세척되어 제거될 수 있다. 마지막으로, 고정된 표적에 결합된 2가 분자는, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 서열분석(합성된 화합물의 합성을 식별하고 암호화함)에 의해 식별될 수 있다. 동일한 2가 분자에 부착된 합성된 화합물의 두 복사물이 동시에 결합될 수 없을 정도로 표적 단백질의 임의의 두 복사물이 멀리 떨어져 고정되어 있는 조건하에서, 2가 분자의 합성된 화합물은 표적에 대한 합성된 화합물의 단일 복사물에 비해 약 두 배 크기인 표적에 대한 겉보기 친화력을 가질 것이다. 동일한 2가 분자에 부착된 합성된 화합물의 두 복사물이 동시에 표적의 두 복사물에 결합할 수 있도록 표적 단백질이 서로 충분히 가깝게 고정되면, 결합력 효과가 겉보기 친화력을 합성된 화합물의 한 복사물을 포함하는 1가 분자의 친화력보다 훨씬 크게 할 것이다. 따라서, 합성된 화합물의 2개 이상의 복사물을 포함하는 2가 분자를 사용하는 분석은 1가 분자를 사용하는 분석에 비해 더 민감하며 표적 단백질에 대한 친화력이 약한 합성된 화합물을 재현적으로 포착하고 식별하는 데 도움이 된다. 수천 또는 수백만 개의 후보 분자가 포함된 스크린에서, 이러한 2가 분자를 사용하면 표적에 대한 강력한 결합제와 표적에 대한 중간 결합제를 모두 식별하는 데 도움이 된다. 그런 다음 중간 정도의 결합만 가진 후보는 정제되고 최적화하여 표적에 대한 친화력을 높일 수 있다. 따라서 이들 2가 분자의 사용은 표적에 대한 1가 분자의 약하거나 중간 정도의 결합으로 인해 추가 개발에서 제외될 분자의 식별을 허용한다.
본 발명의 2가 분자는 선형 개시자 핵산으로부터 제조된다. 선형 개시자 핵산은 제 1 빌딩 블록, 제 2 빌딩 블록, 및 복수의 코돈을 포함하는 암호화 영역을 포함한다(도 1의 예시적인 선형 개시자 핵산 참조). 암호화 영역은 적어도 제 1 합성 단계 후에 초기 빌딩 블록에 부착되는 폴리머 빌딩 블록에 더하여 제 1 초기 빌딩 블록 및/또는 제 2 초기 빌딩 블록에 해당하고 이를 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 하나의 초기 빌딩 블록이 다른 폴리머 빌딩 블록과 함께 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 한, 초기 빌딩 블록으로 사용될 수 있는 분자 또는 화합물의 유형은 일반적으로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록은 제 2 초기 빌딩 블록과 동일하다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록은 뉴클레오타이드 또는 이의 유도체 또는 폴리머가 아니다. 일부 실시태양에서, 제 2 초기 빌딩 블록은 뉴클레오타이드 또는 이의 유도체 또는 폴리머가 아니다.
도 1은 복수의 코돈(예를 들어, 102)을 포함하는 암호화 영역(101)을 포함하는 예시적인 선형 개시자 핵산(100)을 도시한다. 선형 개시자 핵산(100)은 추가적인 비암호화 영역(예를 들어, 107)을 포함할 수 있다. 선형 개시자 핵산(100)은 링커(105)에 의해 연결된 "상류" 제 1 초기 빌딩 블록(103) 및 링커(106)에 의해 연결된 "하류" 제 2 초기 빌딩 블록(104)를 포함한다. 제 1 초기 빌딩 블록(103)은, 일부 실시태양에서, 제 2 초기 빌딩 블록(104)과 동일한 화학적 실체일 수 있다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록(103)은 제 2 초기 빌딩 블록(104)과 다른 화학적 실체일 수 있다. 링커(105) 및 링커(106)는 동일하거나 상이할 수 있다.
선형 개시자 핵산은 선형 전구체 핵산으로부터 제조될 수 있다. 도 2는 본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산을 제조하는데 유용한 예시적인 선형 전구체 핵산(200)을 도시한다. 선형 전구체 핵산(200)은 링커(206)에 의해 제 1 초기 빌딩 블록(204)에 연결되고 링커(205)에 의해 제 2 초기 빌딩 블록(203)에 연결되는 복수의 코돈(예를 들어, 202)을 포함하는 암호화 영역(201)을 포함한다. 선형 전구체 핵산(200)은 추가적인 비암호화 영역(예를 들어, 207)을 포함할 수 있다. 절단 가능한 링커(208)는 제 2 초기 빌딩 블록(203)의 하류 및 제 1 초기 빌딩 블록(204)의 상류에 위치한다. 제 1 초기 빌딩 블록(204) 및 제 2 초기 빌딩 블록(203)은 동일하거나 상이할 수 있다. 링커(206) 및 링커(205)는 동일하거나 상이할 수 있다.
선형 전구체 핵산으로부터 선형 개시자 핵산을 형성하기 위해, 선형 전구체 핵산은 중간체 비공유 원형화된 핵산을 형성할 수 있다. 도 3a는 복수의 코돈(예를 들어, 302)을 포함하는 암호화 영역을 포함하는 예시적인 비공유 원형화된 핵산(300)을 도시한다. 비공유 원형화된 핵산(300)은 추가적인 비암호화 영역(예를 들어, 307)을 포함할 수 있다. 핵산 말단에서 제 1 초기 빌딩 블록(304)은 링커(306)에 의해 연결되고 제 2 초기 빌딩 블록(303)은 링커(305)에 의해 연결된다. 절단 가능한 링커(301)는 제 2 초기 빌딩 블록(303)의 하류 및 제 1 초기 빌딩 블록(304)의 상류에 위치한다(즉, 2개의 초기 빌딩 블록 사이에). 비공유 원형화된 핵산(300)은 스플린트(308)에 의해 말단의 결찰 반응에 적합한 방향으로 유지된다. 스플린트(308)는 혼성화에 의해 비공유 원형화된 핵산(300)의 말단과 연관될 수 있다. 제 1 초기 빌딩 블록(304)과 제 2 초기 빌딩 블록(303)은 동일하거나 상이할 수 있다. 링커(306) 및 링커(305)는 동일하거나 상이할 수 있다. 도 3b는 복수의 코돈(예를 들어, 3302)을 포함하는 암호화 영역을 포함하는 추가의 예시적인 비공유 원형화된 핵산(3300)을 도시한다. 비공유적으로 원형화된 핵산(3300)은 추가적인 비암호화 영역(예를 들어, 3307)을 포함할 수 있다. 비공유 원형화된 핵산(3300)은 링커(3306)에 의해 연결된 제 1 초기 빌딩 블록(3304) 및 링커(3305)에 의해 연결된 제 2 초기 빌딩 블록(3303)을 포함한다. 절단 가능한 링커(3301)는 제 2 초기 빌딩 블록(3303)의 하류 및 제 2 초기 빌딩 블록(3304)의 상류에 있다(즉, 2개의 초기 빌딩 블록 사이에). 제 1 초기 빌딩 블록(3304) 및 제 2 초기 빌딩 블록(3303)은 동일하거나 상이할 수 있다. 링커(3306) 및 링커(3305)는 동일하거나 상이할 수 있다. 비공유 원형화된 핵산(3300)은 블런트 말단 결찰에 적합한 공간 배향으로 예시된다. 결찰 단계 이전에 블런트 말단 결찰에서 예상되는 것처럼, 이 배향은 일시적이며 안정적인 배향을 나타내려는 의도가 없다는 것이 이해된다.
비공유 원형화된 핵산은 결찰에 의해 공유적으로 원형화되어 원형화된 핵산을 형성할 수 있다. 도 4는 복수의 코돈(예를 들어, 402)을 포함하는 암호화 영역을 포함하는 예시적인 원형화된 핵산(400)을 도시한다. 원형화된 핵산(400)은 추가적인 비암호화 영역(예를 들어, 407)을 포함할 수 있다. 원형화된 핵산(400)은 링커(406)에 의해 연결된 제 1 초기 빌딩 블록(404) 및 링커(405)에 의해 연결된 제 2 초기 빌딩 블록(403)을 포함한다. 절단 가능한 링커(401)는 제 1 초기 빌딩 블록(404)의 상류 및 제 2 초기 빌딩 블록(403)의 하류에 있다(즉, 2개의 초기 빌딩 블록 사이에). 제 1 초기 빌딩 블록(404) 및 제 2 초기 빌딩 블록(403)은 동일하거나 상이할 수 있다. 링커(406) 및 링커(405)는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산은 원형화된 핵산에서 절단 가능한 링커의 절단에 의해 형성된다. 도 5는 복수의 코돈(예를 들어, 502)을 포함하는 암호화 영역을 포함하는 예시적인 원형화된 핵산(500)을 도시한다. 선형 개시자 핵산(500)은 추가적인 비암호화 영역(예를 들어, 508)을 포함할 수 있다. 원형화된 핵산은 링커(506)에 의해 연결된 제 1 초기 빌딩 블록(504) 및 링커(505)에 의해 연결된 제 2 초기 빌딩 블록(503)을 포함한다. 절단 가능한 링커(501)는 제 1 초기 빌딩 블록(504) 및 제 2 초기 빌딩 블록(503)의 상류에 위치한다. 반응성 실체(507)(제한 효소와 같은 효소, 또는 절단 가능한 링커를 절단할 수 있는 화학물질일 수 있음)는 절단 가능한 링커(501)를 부위(예를 들어, 제한 부위; 예시적인 제한 부위가 도시됨)에서 절단하여 원형화된 핵산(500)을 선형화한다. 이 예에서, 원형화된 핵산은 스플린트를 포함한다. 원형화된 핵산 서열에 혼성화된 스플린트는 절단될 수 있는 (예를 들어, 제한 부위에 의해; 예시적인 절단 부위는 도면 하단에 표시된 순서에서 점선으로 표시된다) 절단 가능한 링커(501)(이 경우, 제한 부위)를 형성한다. 도면 하단의 서열은 제 1 및 제 2 초기 빌딩 블록의 부착을 허용하는 아민-T(각 T 위에 수직 막대로 표시된 아민-T)를 함유하는 짧은 프라이머를 도시한다. 하단 서열은 예시적인 스플린트이다. 예비 실험에서, 아민-T 부착 부위를 갖는 예시적인 스플린트 및 예시적인 프라이머는 수직 점선으로 표시된 절단 부위를 표적으로 하는 제한 효소에 의해 효율적으로 절단되었다(데이터는 도시되지 않음).
도 6은 선형 전구체 핵산(600)으로부터 선형 개시자 핵산(603)을 제조하기 위한 예시적인 작업 흐름을 도시한다. 선형 전구체 핵산(600)은 비공유 원형화된 핵산(601)을 형성하고(이 예에서는 스플린트에 의한 혼성화에 의함) 결찰(효소에 의한 것이든 다른 것이든)에 의해 공유적으로 원형화되어 원형화된 핵산(602)를 형성한다. 원형화된 핵산(602)은 절단되어(예를 들어, 제한 효소의 활성에 의해 또는 화학적 절단에 의해) 선형 개시자 핵산(603)을 형성한다.
본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산은 합성된 화합물을 제조하는 데 유용하다. 도 7은 화합물(즉, 본 발명의 2가 분자)을 합성하는 방법에서 예시적인 합성 단계(즉, 초기 빌딩 블록에 빌딩 블록을 첨가하는 단계)를 도시한다. 복수의 코돈을 포함하는 암호화 영역을 포함하는 선형 개시자 핵산(700)이 제공된다. 선형 개시자 핵산(700)은 제 1 초기 빌딩 블록(704) 및 제 2 초기 빌딩 블록(705)을 포함한다. 안티 코돈(702) 및 폴리머 빌딩 블록(703)을 포함하는 하전된 안티 코돈(701)은 선형 개시자 핵산(700) 상의 코돈에 혼성화된다. 폴리머 빌딩 블록을 제 1 초기 빌딩 블록(705) 또는 제 2 초기 빌딩 블록(704)으로 전달하여 분자(706 또는 707)를 형성하는 결합 반응이 발생한다. 추가 폴리머 빌딩 블록을 제 1 초기 빌딩 블록(705) 또는 제 2 초기 빌딩 블록(704)으로 전달하기 위해 공정이 반복될 수 있다.
일련의 합성 반응 후에, 합성된 화합물은 본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산으로부터 형성될 수 있다. 도 8은 예시적인 합성된 화합물(800)을 도시한다. 합성된 화합물(800)은 제 1 초기 빌딩 블록(803) 및 제 2 초기 빌딩 블록(805)을 포함한다. 제 1 초기 빌딩 블록(803)은 제 1 폴리머 빌딩 블록(801) 및 제 2 폴리머 빌딩 블록(802)에 결합되고; 이들 3개의 빌딩 블록은 제 1 암호화 영역(804)을 형성한다. 제 2 초기 빌딩 블록(805)은 제 3 폴리머 빌딩 블록(806) 및 제 4 폴리머 빌딩 블록(807)에 연결되고; 이들 3개의 빌딩 블록은 제 2 암호화 영역(808)을 형성한다. 제 1 암호화 영역(804) 및/또는 제 2 암호화 영역(808)은 표적에 결합하는 능력과 같은 바람직한 특성에 대해 평가될 수 있다. 제 1 암호화 영역(804) 및 제 2 암호화 영역(808)의 빌딩 블록은 합성된 화합물(800)의 암호화 영역에 의해 식별된다. 제 1 암호화 영역(804) 및 제 2 암호화 영역(808)의 빌딩 블록은 도 8에서 동일하게 도시되나 상이할 수 있다. 폴리머 빌딩 블록(801, 802, 806, 807)은 예시적이며 임의의 적합한 폴리머 빌딩 블록일 수 있다. 따라서, 제 1 암호화 영역(804)을 포함하는 합성된 화합물은 제 2 암호화 영역(808)을 포함하는 합성된 화합물과 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시태양에서, 제 1 링커는 제 1 초기 빌딩 블록을 선형 개시자 핵산에 부착시키고 제 2 링커는 제 2 초기 빌딩 블록을 선형 개시자 핵산에 부착시킨다. 일부 실시태양에서, 제 1 링커 및/또는 제 2 링커는 공유 결합에 의해 제 1 초기 빌딩 블록 및/또는 제 2 초기 빌딩 블록에 부착된다. 다양한 링커가 당업계에 알려져 있으며, 제 1 링커는 제 2 링커와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록은 개시자 핵산 상의 암호화 영역의 상류인 부위에 부착되고, 제 2 초기 빌딩 블록은 개시자 핵산 상의 암호화 영역의 하류인 제 2 부위에 부착된다. 일부 양태에서, 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아니다.
본 명세서에 기술된 핵산은 다수의 코돈을 포함하는 암호화 영역을 포함한다. 예를 들어, 암호화 영역은 약 2 내지 약 20개의 코돈, 예를 들어 약 2 내지 약 10개의 코돈, 약 10 내지 20개의 코돈, 약 5 내지 약 15개의 코돈, 약 10 내지 약 15개의 코돈, 및 그 사이의 값 및 범위를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 코돈을 포함한다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 약 5 내지 약 20개의 코돈을 포함한다. 예를 들어, 복수의 코돈 중 하나의 코돈은 약 8 내지 약 30개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 코돈은 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화함으로써 선형 개시자 핵산 상의 화합물의 합성을 암호화(예를 들어, 지시)하는 데 사용될 수 있다. 폴리머 빌딩 블록은 초기 빌딩 블록(예를 들어, 제 1 초기 빌딩 블록 및/또는 제 2 초기 빌딩 블록) 중 하나에 첨가되거나 초기 빌딩 블록 중 하나에 직접 또는 간접적으로 부착되는 다른 폴리머 빌딩 블록에 첨가된다. 두 경우 모두, 암호화 영역의 코돈은 일련의 합성 단계를 통해 선형 개시자 핵산에 폴리머 빌딩 블록을 첨가하도록 지시한다. 초기 빌딩 블록을 포함하여 이러한 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 영역은 암호화된 영역이라고 한다. 선형 개시자 핵산이 정확히 2개의 초기 빌딩 블록(즉, 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록)을 갖는 경우, 분자는 각 암호화된 영역에 하나 이상의 폴리머 빌딩을 첨가하도록 지시하는 하나 이상의 합성 단계 후에 제 1 암호화 영역(제 1 초기 빌딩 블록과 하나 또는 더 많은 폴리머 빌딩 블록) 및 제 2 암호화 영역(제 2 초기 빌딩 블록 및 하나 이상의 폴리머 빌딩 블록을 포함함)을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 폴리머 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아니다. 일부 실시태양에서, 하나의 폴리머 빌딩 블록이 다른 폴리머 빌딩 블록 또는 초기 빌딩 블록과 함께 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 한, 폴리머 빌딩 블록으로 사용될 수 있는 분자 또는 화합물의 유형은 일반적으로 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 적어도 하나의 코돈은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 또는 둘 다에 대한 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화한다. 일부 실시태양에서, 복수의 코돈은 복수의 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화한다. 복수의 폴리머 빌딩 블록의 각 폴리머 빌딩 블록은 상이할 수도 있고 동일할 수도 있다. 대안적으로, 복수의 폴리머 빌딩 블록의 일부 폴리머 빌딩 블록은 동일할 수 있는 반면, 복수의 폴리머 빌딩 블록의 다른 폴리머 빌딩 블록은 상이할 수 있다.
절단 가능한 링커는 선형 전구체 핵산 및 원형화된 핵산(본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산 생성 시 중간 분자임) 상의 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록 사이의 분리를 허용한다. 절단 가능한 링커는 효소 절단(예를 들어, 제한 소화) 또는 화학적 절단에 의해, 원형화된 핵산이 절단될 때 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록이 선형 개시자 핵산의 반대쪽 말단에(또는 근처에) 있도록 배향된다. 따라서, 절단 가능한 링커는 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록의 부착 부위 사이의 핵산 서열(개재 서열이라고도 함)일 수 있거나, 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록의 부착 부위 사이의 화학적으로 절단 가능한 링커일 수 있다.
한 양태에서, 선형 개시자 핵산을 제조하는 방법은 원형화된 핵산의 절단을 포함하며, 원형 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 암호화 영역 및 절단 가능한 링커를 포함한다. 예시적인 원형 핵산이 도 4에 제공된다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 약 2 내지 약 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 화학적으로 절단 가능한 링커이다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 2개의 뉴클레오타이드를 순서대로 연결하는 화학적으로 절단 가능한 링커이다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 제한 소화 동안 제한 효소에 의해 절단될 수 있는 제한 부위인 인식 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 개재 서열이다. 일부 실시태양에서, 개재 서열은 뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시태양에서, 개재 서열은 약 8 내지 약 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시태양에서, 개재 서열은 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 가능하게 하는 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 개재 서열은 우라실 DNA 글리코실라제(UDG) 또는 포름아미도피리미딘 DNA 글리코실라제(FpG)에 의한 절단을 가능하게 하는 염기(예를 들어, 변형된 염기, 예컨대 데옥시우리딘(dU))를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 원형화된 핵산에서, 절단 가능한 링커는 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록의 부위 사이의 부위에 위치한다. 도 5에 도시된 바와 같이. 원형화된 핵산의 절단 가능한 링커가 절단된다. 절단 가능한 링커는 절단에 의해 분리되며, 절단 가능한 링커의 제 1 부분(예를 들어, 5' 말단)과 절단 가능한 링커의 제 2 부분(예를 들어, 3' 말단)이 분리된다. 절단 가능한 링커의 절단은 효소적 절단(예를 들어, 제한 부위에서의 제한 소화)에 의해 이루어질 수 있거나, 절단 가능한 링커의 절단은 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 절단 가능한 링커는 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록의 부위 사이에 위치하므로, 원형화된 핵산의 절단은 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록의 부위 사이에서 발생한다. 원형화된 핵산의 절단 가능한 링커가 절단되면, 선형 개시자 핵산이 형성되며, 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산의 반대쪽 말단에 부착된다. 따라서, 선형 개시자 핵산을 제조하는 방법은 제 1 초기 빌딩 블록을 제 2 초기 빌딩 블록으로부터 분리하여 이들이 선형 개시자 핵산의 반대쪽 말단에 있도록 하는 것을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 선형 전구체 핵산을 제공한다. 예시적인 선형 전구체 핵산이 도 2에 예시된다. 선형 전구체 핵산은 선형 개시자 핵산을 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 이 방법은 예를 들어 결찰에 의해 선형 전구체 핵산을 원형화하는 단계를 포함한다. 선형 전구체 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 암호화 영역 및 절단 가능한 링커를 포함한다. 제 1 초기 빌딩 블록의 부위와 제 2 초기 빌딩 블록의 부위는 선형 전구체 핵산 상의 절단 가능한 링커 부위를 플랭킹한다. 일부 실시태양에서, 각각의 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록 및 절단 가능한 링커는 선형 전구체 핵산의 암호화 영역의 하류에 있다. 일부 실시태양에서, 각각의 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록 및 절단 가능한 링커는 선형 전구체 핵산의 암호화 영역의 상류에 있다.
일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산(예시적인 선형 전구체 핵산은 도 2에 예시된다)은 결찰되어 원형화된 핵산을 형성한다(예시적인 원형화된 핵산은 도 4에 예시되며; 예시적인 방법은 도 6에 예시된다). 일부 실시태양에서, 결찰은 뉴클레오타이드 스플린트를 사용하는 스플린트 결찰이다. 일부 실시태양에서, 전구체 핵산의 5' 및 3' 종단은 뉴클레오타이드 스플린트에 비공유적으로 결합된다. 스플린트를 포함하는 예시적인 비공유 원형화된 핵산이 도 3a, 예를 들어, 308에 예시된다. 일부 실시태양에서, 결찰은 뉴클레오타이드 스플린트의 사용을 필요로 하지 않는 블런트 말단 결찰이다. 블런트 말단 결찰에 적합한 배향의 예시적인 핵산이 도 3b에 예시된다. 일부 실시태양에서, 스플린트는 절단 가능한 링커의 절단 후에 제거된다. 스플린트는 절단 가능한 링커의 절단이 발생한 후 선형 개시자 핵산의 합성에 더 이상 필요하지 않기 때문에, 스플린트의 제거는 하류 공정에 유리할 수 있다. 일부 실시태양에서, 스플린트를 제거하는 것은 스플린트를 절단하는 것을 포함한다. 예를 들어, 스플린트는 하나 이상의 데옥시우리딘(dU) 염기를 스플린트에 통합하고 이어서 우라실 DNA 글리코실라제(UDG)로 소화함으로써 절단될 수 있다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커와 스플린트는 둘 다 하나 이상의 dU 염기를 포함한다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커의 dU 염기(들) 및 스플린트는 UDG와의 동일한 반응에서 절단된다.
다른 양태에서, 본 발명은 원형화된 핵산을 제공한다. 원형화된 핵산은 절단되어(예를 들어, 원형화된 핵산의 절단 가능한 링커가 절단될 수 있음) 선형 개시자 핵산을 형성할 수 있다. 원형화된 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 절단 가능한 링커 및 암호화 영역을 포함한다. 절단 가능한 링커는 원형화된 핵산 상의 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록의 부위 사이의 부위에 위치하여, 절단 가능한 링커의 절단은 선형 개시자 핵산의 반대쪽 말단에 있는 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록의 부위를 생성한다.
다른 양태에서, 본 발명은 화합물을 합성하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 화합물을 합성하면 화합물의 다중 복사물을 표시하는 분자가 생성된다(즉, 화합물의 2가 표시 또는 다가 표시). 예를 들어, 한쪽 말단에 제 1 초기 빌딩 블록과 반대쪽 말단에 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 선형 개시자 핵산은 제 1 초기 블록 및/또는 제 2 초기 빌딩 블록에 하나 이상의 폴리머 블록을 첨가하는 합성 라운드에 적용된다. 제 1 초기 빌딩 블록과 부착된 폴리머 빌딩 블록은 표적에 대한 결합과 같은 바람직한 특성에 대해 테스트될 수 있다. 유사하게, 제 2 초기 빌딩 블록과 부착된 폴리머 빌딩 블록은 표적에 대한 결합과 같은 바람직한 특성에 대해 테스트될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "화합물"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리머 빌딩 블록에 부착된 제 1 초기 빌딩 블록 및/또는 하나 이상의 폴리머 빌딩 블록에 부착된 제 2 초기 빌딩 블록을 의미할 수 있다.
화합물의 합성은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역에 의해 암호화(예를 들어, 지시)될 수 있다. 일부 실시태양에서, 합성된 화합물은 제 1 초기 빌딩 블록을 포함한다. 일부 실시태양에서, 합성된 화합물은 제 2 초기 빌딩 블록을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물은 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물과 동일하다.
개시자 핵산의 반대 말단 근처 부위에 위치하는 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 개시자 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록 모두에서 화합물의 합성을 지시하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 2개의 암호화된 영역을 포함하는 선형 개시자 핵산으로부터 분자가 형성된다. 제 1 암호화 영역은 제 1 초기 빌딩 블록과 하나 이상의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물을 포함한다. 제 2 암호화 영역은 제 2 초기 빌딩 블록과 하나 이상의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물을 포함한다. 이 시스템은 유연성을 갖도록 고안되었으며, 따라서 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 제 1 초기 빌딩 블록 및 동일한 초기 빌딩 블록에 부착된 폴리머 빌딩 블록은 동일하거나 상이할 수 있다.
예시적인 실시태양에서, 제 1 암호화 영역과 제 2 암호화 영역은 동일한 화학 구조를 포함한다. 예를 들어, 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록이 동일하고, 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록에 부착된 폴리머 빌딩 블록의 종류와 순서가 동일한 경우(예를 들어, 도 8 참조), 그러면 전체 분자는 특정 표적 분자에 대해 향상된 결합 특성을 가질 것이다. 표적에 결합하는 화합물을 식별하기 위해 고안된 분석에서, 분자가 동일한 암호화 영역의 2개 이상의 복사물을 표시할 때, 상기 암호화 영역의 단일 복사물만 표시하는 분자와 비교하여, 결합이 약한 화합물은 더 효율적으로 식별될 수 있다.
추가적인 예시적 실시태양에서, 제 1 암호화 영역과 제 2 암호화 영역은 상이한 화학 구조를 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 암호화 영역의 제 1 초기 빌딩 블록은 제 2 암호화 영역의 제 2 초기 빌딩 블록과 상이하다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록에 부착된 폴리머 빌딩 블록의 유형 및/또는 순서는 상이하다. 예를 들어, 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록이 상이하고, 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록에 부착된 폴리머 빌딩 블록의 유형과 순서가 상이한 경우, DNA 암호화 라이브러리에서 고유한 분자의 총 수가 증가한다. DNA 암호화 라이브러리에서 고유한 분자의 총 수를 늘리면 원하는 특성을 가진 분자(예를 들어, 표적 결합 분자)가 감지될 가능성을 마찬가지로 증가시킨다. 추가적으로, 2개의 별개의 암호화된 영역을 포함하는 분자는 시스템에서 핵산 가닥의 수를 증가시키지 않고 합성된 화합물의 수를 두 배로 늘리며, 이는 DNA 암호화 라이브러리의 합성에서 제한 요인일 수 있다.
일부 실시태양에서, 다수의 선형 개시자 핵산을 포함하는 분자 풀이 제공된다. 분자 풀의 예시적인 선형 개시자 핵산이 도 7의 700에 예시된다. 일부 실시태양에서, 복수의 선형 개시자 핵산 중 적어도 하나의 선형 개시자 핵산은 본 발명에 의해 제공된 방법에 따라 제조된다. 일부 실시태양에서, 복수의 선형 개시자 핵산 중 각각의 선형 개시자 핵산은 본 발명에 의해 제공된 방법에 따라 제조된다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 원형화된 핵산의 절단에 의해(예를 들어, 절단 가능한 링커의 효소적 절단 또는 화학적 절단에 의해) 형성된다. 원형화된 핵산은 선형 전구체 핵산의 말단의 결찰에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시태양에서, 효소적 절단은 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 포함한다. 예를 들어, 개재 서열은 우라실 DNA 글리코실라제(UDG) 또는 포름아미도피리미딘 DNA 글리코실라제(FpG)에 의한 절단을 가능하게 하는 염기(예를 들어, 변형된 dU 염기)를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 효소적 소화는 제한 소화를 포함하고, 제한 소화는 원형화된 핵산의 개재 서열의 제한 부위에서 발생한다. 일부 실시태양에서, 제한 소화는 원형화된 핵산의 절단 가능한 링커의 제한 부위에서 발생한다.
일부 실시태양에서, 복수의 선형 개시자 핵산 중 각각의 선형 개시자 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 및 복수의 코돈을 포함하는 암호화 영역을 포함한다. 제 1 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역 상류에 있는 부위에 부착될 수 있고 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역 하류에 있는 제 2 부위에 부착될 수 있다.
도 7 및 8에 예시된 바와 같은 화합물의 합성 방법의 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산 중 적어도 하나는 적어도 하나의 하전된 안티 코돈과 접촉된다. 하전된 안티 코돈은 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 안티 코돈이다. 안티 코돈은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역의 코돈 중 적어도 하나와 혼성화할 수 있다. 안티 코돈은 비암호화 영역과 반응하지 않을 수 있다. 일부 실시태양에서, 안티 코돈의 폴리머 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산의 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록과 반응하여 공유 결합을 형성한다. 일부 실시태양에서, 폴리머 빌딩 블록과 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록의 반응은 합성된 화합물을 생성한다. 일부 실시태양에서, 안티 코돈은 폴리머 빌딩 블록과 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록의 반응 후에 선형 개시자 핵산으로부터 제거된다(예를 들어, 혼성화되지 않는다). 일부 실시태양에서, 안티 코돈의 제거는 안티 코돈이 (예를 들어, 우라실 DNA 글리코실라제(UDG)에 의해) 절단될 수 있는 하나 이상의 변형된 염기(예를 들어, dU 염기(들))를 포함할 때 더 효율적이며, 따라서 선형 개시자 핵산으로부터 안티 코돈을 절단하고 제거한다. 선형 개시자 핵산으로부터 안티 코돈의 제거는 안티 코돈을 포함하는 제 2 하전된 안티 코돈 및 폴리머 빌딩 블록의 제 2 복사물이 선형 개시자 핵산의 암호화 영역의 적어도 하나의 코돈과 혼성화되도록 허용한다. 선택적으로, 제 2 하전된 안티 코돈은 제 1 하전된 안티 코돈과 동일한 폴리머 빌딩 블록을 포함하고, 제 2 안티 코돈은 제 1 안티 코돈과 선형 개시자 핵산의 암호화 영역의 동일한 코돈에 혼성화할 수 있다. 제 2 안티코돈의 제 2 폴리머 빌딩 블록은 반응하지 않은 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록과 반응하여 공유 결합을 형성하고 합성된 화합물을 생성한다.
화합물 합성 방법의 일부 실시태양에서, 추가 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 하나 이상의 추가 하전된 안티 코돈은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역의 코돈 중 적어도 하나에 혼성화하며, 추가 폴리머 빌딩 블록은 제 1 초기 빌딩 블록 및/또는 제 2 초기 빌딩 블록에서 연장된 폴리머 빌딩 블록과 반응한다. 일부 실시태양에서, 도 8에 예시된 바와 같이 제 1 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 화합물 및 제 2 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 화합물은 안티 코돈의 혼성화 및 폴리머 빌딩 블록의 반응을 반복함으로써 합성된다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록에서 연장되는 합성된 화합물은 제 2 초기 빌딩 블록에서 연장되는 합성된 화합물과 동일하다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록에서 연장되는 합성된 화합물은 제 2 초기 빌딩 블록에서 연장되는 합성된 화합물과 상이하다. 일부 실시태양에서, 합성된 화합물은 핵산 또는 핵산 유사체를 포함하지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 제공된 선형 개시자 핵산은 도 8에 도시된 바와 같이 합성된 화합물을 포함하는 분자를 제조하는 데 사용될 수 있다. 분자는 이작용성 또는 다작용성이며, 둘 다 화합물의 합성을 암호화하고(예를 들어, 각각 제 1 및 제 2 암호화 영역인 808 및 804) 합성된 화합물을 식별하는 핵산 부분(800)을 포함하고, (예를 들어, 초기 및 폴리머 빌딩 블록을 포함하는) 합성된 화합물을 추가로 포함한다. 중요한 것은, 화합물이 동일할 수도 있고 상이할 수도 있으며, 이는 위에서 기술한 대로 다른 이점을 제공한다. 분자는 복수의 합성된 화합물을 가짐으로써, 즉, 2가 또는 다가 표시는 합성된 화합물 라이브러리의 스크리닝 효율을 향상시킨다.
정의
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명백히 나타내지 않는 한 복수형을 포함한다.
본 명세서에서 값 또는 매개변수에 대한 "약"이라는 언급은 그 값 또는 매개변수 자체에 관한 변형을 포함한다(및 기술한다). 예를 들어, "약 X"에 관한 기술은 "X"에 대한 기술을 포함한다.
본 명세서에 기술된 본 발명의 양태 및 변형은 양태 및 변형으로 "이루어진" 및/또는 "필수적으로 이루어진"을 포함하는 것으로 이해된다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "혼성화하다", "혼성화하는" 및 "혼성화된"은 DNA에 대한 구아닌-시토신 및 아데닌-티민(G-C 및 A-T) 쌍과 RNA에 대한 구아닌-시토신 및 RNA에 대한 아데닌-우라실(G-C 및 A-U) 쌍을 포함하는 왓슨-크릭 염기 쌍을 포함한다. 이들 용어는 상보적이고 암호화 영역에 혼성화하는 안티 코돈 또는 안티 암호화 영역으로 불리는 상보적인 뉴클레오타이드 가닥에 대한 뉴클레오타이드 가닥의 선택적 인식의 맥락에서 사용된다.
본 명세서에 기술된 핵산의 특징의 위치를 기술하는 맥락에서 용어 "말단" 및 "종단"은 선형 핵산 분자의 절대 말단 또는 절대 종단 근처에 있는 위치를 의미하는 데 동의어로 사용된다. 예를 들어, 핵산의 5' 말단에 있는 20개의 핵산 중 어느 하나에 연결된 초기 빌딩 블록은 핵산의 "5' 말단" 또는 "5' 종단"에 있는 위치에 있는 것으로 기술될 수 있다.
"2가 분자"라는 용어는 올리고뉴클레오타이드, 적어도 하나의 암호화 부분, 및 적어도 2개의 초기 빌딩 블록을 함유하는 다기능 분자를 지칭한다. "다가 분자"는 올리고뉴클레오타이드, 적어도 하나의 암호화 부분, 및 2개 이상의 빌딩 블록(예를 들어, 적어도 2개의 초기 빌딩 블록 및 적어도 하나의 폴리머 빌딩 블록)을 함유하는 다기능 분자를 설명하는 데 기술된다. 2가 또는 다가 분자의 맥락에서, 적어도 2개의 초기 빌딩 블록은 동일할 수 있으며, 핵산 또는 핵산 유사체가 아니다.
다기능 분자의 "암호화 부분"은 다기능 분자의 "암호화 영역"의 섹션을 의미한다. 이 암호화 부분은 폴리머 빌딩 블록을 포함하고 초기 빌딩 블록을 포함하며, 다기능 분자에 대한 부착은 암호화 영역의 코돈에 의해 암호화 및/또는 지시된다.
본 명세서에 사용된 용어 "상류" 및 "하류"는 DNA 또는 RNA 서열 상의 특징의 상대적 위치를 지칭하는 데 사용된다. "상류"는 DNA 또는 RNA 가닥의 5' 말단을 향하고, "하류"는 DNA 또는 RNA 가닥의 3' 말단을 향한다. 이중 가닥 DNA 서열에서의 위치 지정을 고려할 때, "상류" 및 "하류"는 모두 올리고뉴클레오타드의 암호화 가닥에서의 위치 지정을 의미한다.
"암호화 영역"이라는 용어는 선형 개시자 핵산의 빌딩 블록을 식별하는 데 사용되는 선형 개시자 핵산의 영역을 기술하는 데 사용된다. 예를 들어, 암호화 영역은 화합물의 합성을 암호화하고 지시하는 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 암호화 영역은 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 어느 안티 코돈이 선형 개시자 핵산에 혼성화하여 암호화된 화합물을 합성할 수 있는 지를 결정한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 해당 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 중간 값, 및 해당 언급된 범위 내의 임의의 다른 명시된 또는 중간 값은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 명시된 범위가 상한 또는 하한을 포함하는 경우, 포함된 한도 중 어느 하나를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 사용된 섹션 제목은 구성 목적만을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 기술은 당업자가 본 발명을 만들고 사용할 수 있도록 제공되며 특허 출원 및 이의 요구 사항의 맥락에서 제공된다. 기술된 실시태양에 대한 다양한 수정은 당업자에게 쉽게 명백할 것이며 본 명세서의 일반적인 원리는 다른 실시태양에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 도시된 실시태양에 제한되도록 의도되지 않고, 본 명세서에 기술된 원리 및 특징과 일치하는 가장 넓은 범위에 따라야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원의 개시 내용은 각각 그 전체가 참고로 포함된다. 참고로 포함된 참고문헌이 본 개시 내용과 상충되는 경우, 본 개시 내용이 우선권을 갖는다.
본 출원에 언급된 특허 문서, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함하는 모든 간행물은 각각의 개별 간행물이 개별적으로 참조로 포함되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체가 참조로 포함된다. 본 명세서에 제시된 정의가 본 명세서에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개 출원 및 기타 간행물에 제시된 정의와 반대되거나 일치하지 않는 경우, 본 명세서에 기술된 정의가 본 명세서에 참조로 포함된 정의보다 우선한다. 본 명세서에 사용된 섹션 제목은 구성 목적으로만 사용되며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
선형 개시자 핵산의 제조 방법
본 명세서에 제공된 방법은, 일부 양태에서, 선형 개시자 핵산을 만드는 것과 관련이 있다. 예시적인 선형 개시자 핵산이 도 1에 예시된다. 선형 개시자 핵산은 빌딩 블록(예를 들어, 합성된 화합물)의 다중표시에 적합한 암호화된 분자이다. 다중표시 분자는 빌딩 블록의 단일 복사물을 갖는 화합물의 조합 라이브러리에 비해 증가된 표적 결합으로 인해 유리하다. 이러한 선형 개시자 핵산은 조합 라이브러리 생성을 위한 연속적인 반응 단계의 반응 효율을 증가시킬 뿐만 아니라 생성된 화합물(예를 들어, 합성된 화합물을 포함하는 암호화된 분자)도 결합 표적에 효과적일 것이며 및/또는 표적은 낮은 숫자로 존재할 수 있다.
일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록 및 암호화 영역을 포함한다. 본 명세서에 제공된 선형 개시자 핵산을 만드는 방법은 선형 전구체 핵산으로 시작할 수 있다. 선형 전구체 핵산은 절단 가능한 링커를 플랭킹하는 위치에 부착된 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록을 포함한다. 각각의 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록 및 절단 가능한 링커는 선형 전구체 핵산의 암호화 영역의 모든 상류 또는 모든 하류에 있다. 복수의 코돈을 포함하는 암호화 영역은 개시자 빌딩 블록에 부착되는 폴리머 빌딩 블록에 더하여 제 1 개시자 빌딩 블록 및 제 2 개시자 빌딩 블록에 상응하고 이를 식별하는 데 사용될 수 있다.
선형 전구체 핵산은 원형화되어 원형화된 핵산을 형성할 수 있다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 선형 전구체 핵산은 스플린트 결찰 또는 블런트 말단 결찰에 의해 원형화된다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산의 원형화는 선형 전구체 핵산의 3' 및 5' 종단의 스플린트 결찰에 의해 촉진된다(도 6에 예시된 바와 같음). 생성된 원형화된 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 절단 가능한 링커 및 암호화 영역을 포함한다. 도 6에 도시된 바와 같이, 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 원형화된 핵산의 절단 가능한 링커를 플랭킹하는 부위에 부착된다.
원형화된 핵산은 절단 가능한 링커에서 절단될 수 있다. 일부 실시태양에서, 원형화된 핵산은 효소적 절단 또는 화학적 절단에 의해 절단 가능한 링커에서 절단된다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 제 1 초기 빌딩 블록 부위와 제 2 초기 빌딩 블록 부위 사이의 부위에 위치한다. 일부 실시태양에서, 절단은 절단 가능한 링커에서 발생하며, 절단은 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록 사이에서 발생한다. 일부 실시태양에서, 원형화된 핵산의 절단은 선형 개시자 핵산을 생성하고, 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록은 핵산의 반대쪽 말단 근처의 부위로 이동된다. 도 6은 원형화된 핵산의 절단이 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록 사이에서(예를 들어, 절단 가능한 링커에서) 발생하여, 암호화 영역의 상류에 있는 부위에 부착된 제 1 초기 빌딩 블록 및 암호화 영역의 하류에 있는 부위에 부착된 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 선형 개시자 핵산을 형성한다.
그런 다음, 선형 개시자 핵산 풀은 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 화합물의 합성을 암호화하고 지시할 수 있도록 조합 화학 라이브러리를 생성을 위해 사용될 수 있다.
빌딩 블록
본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산은 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물을 조합하여 만드는 데 사용된다. 선형 개시자 핵산은 초기에 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록을 운반한다. 선형 개시자 핵산의 암호화 영역은 제 1 및 제 2 초기 빌딩 블록에 대한 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 지시한다. 이러한 첨가는 일련의 합성 단계에 의해 이루어지며, 각 단계에서는 추가 폴리머 빌딩 블록을 순서대로 첨가한다. 원하는 길이에서, 초기 빌딩 블록(제 1 초기 빌딩 블록이든 제 2 초기 빌딩 블록이든)과 이에 부착된 폴리머 빌딩 블록은 2가 분자의 암호화된 영역 중 하나를 형성한다. 그런 다음 암호화된 영역은 표적(예를 들어, 표적 단백질)에 결합하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 이어서, 표적 단백질에 결합하는 암호화된 영역은, 예를 들어, 암호화된 영역을 암호화한 핵산 서열을 서열 분석함으로써 식별될 수 있다. 그런 다음 2가 분자의 새로운 라이브러리를 생성하고 표적 단백질에 대한 보다 효율적인 결합제에 대해 해당 라이브러리를 테스트함으로써 후보 암호화된 영역의 하나 이상의 빌딩 블록을 교환하는 것이 가능하다. 이러한 절차를 따르면 특정 표적의 고친화성 결합제의 식별을 가능하게 한다.
본 명세서에 사용된 "빌딩 블록"은 다른 화학 구조 단위(예를 들어, 다른 빌딩 블록)에 화학적으로 연결될 수 있는 화학 구조 단위이다. "빌딩 블록"은 초기 빌딩 블록 또는 폴리머 빌딩 블록을 의미할 수 있다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산을 제조하는 방법은 하나 이상의 빌딩 블록을 필요로 한다. 빌딩 블록은 초기 빌딩 블록 또는 폴리머 빌딩 블록을 포함할 수 있다. 폴리머 빌딩 블록은 초기 빌딩 블록에 부착된다(즉, 결합된다). 일부 실시태양에서, 폴리머 빌딩 블록은 초기 빌딩 블록과 반응하여 공유 결합을 형성한다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산은 하나 이상의 초기 빌딩 블록을 포함한다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록을 포함한다.
일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아니다. 일부 실시태양에서, 초기 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아니다. 일부 실시태양에서, 폴리머 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아니다. 일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 빌딩 블록이 다른 화학 구조 단위(예를 들어, 폴리머 빌딩 블록과 같은 다른 빌딩 블록에 존재하는 다른 화학 구조 단위)에 연결되는 화학 반응을 겪게 하는 하나, 둘 또는 그 이상의 반응성 화학 그룹을 갖는다. 일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 공유 결합에 의해 다른 화학적 구조 단위(예를 들어, 다른 빌딩 블록)에 연결된다.
빌딩 블록이 화학적 결합을 형성하는 반응을 겪을 때 빌딩 블록의 반응성 화학 그룹의 일부 또는 전부가 손실될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 용액의 빌딩 블록은 2개의 반응성 화학 그룹을 가질 수 있다. 이 예에서, 용액의 빌딩 블록은 빌딩 블록 사슬의 일부인 빌딩 블록의 반응성 화학 그룹과 반응하여 사슬의 길이를 늘리거나 사슬에서 가지를 연장할 수 있다. 빌딩 블록이 용액의 맥락에서 또는 반응물로 언급되는 경우, 빌딩 블록은 적어도 하나의 반응성 화학 그룹을 포함하는 것으로 이해되지만 두 개 이상의 반응성 화학 그룹을 포함할 수 있다. 빌딩 블록이 폴리머, 올리고머 또는 빌딩 블록 자체보다 큰 분자의 맥락에서 참조되는 경우, 빌딩 블록은 하나 이상의 화학 반응 그룹이 반응할지라도 더 큰 분자의 (모노머) 단위로서 빌딩 블록의 구조를 갖는 것으로 이해된다.
하나의 빌딩 블록이 다른 빌딩 블록과 함께 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 한, 빌딩 블록으로 사용될 수 있는 분자 또는 화합물의 유형은 일반적으로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아니다. 일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 화학적 구조 단위이다.
일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 말단 단위 역할을 하는 하나의 화학적 반응 그룹을 갖는다. 일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 적합한 반응성 화학 그룹을 갖는다. 일부 실시태양에서, 제 1 개시제 빌딩 블록, 제 2 개시제 빌딩 블록, 및 폴리머 빌딩 블록은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 적합한 반응성 화학 그룹을 갖는다. 빌딩 블록에 적합한 반응성 화학 그룹은 1차 아민, 2차 아민, 카복실산, 1차 알코올, 에스터, 티올, 아이소시아네이트, 클로로포르메이트, 설포닐 클로라이드, 티오노카보네이트, 헤테로아릴 할라이드, 알데하이드, 할로아세테이트, 아릴 할라이드, 아지드, 할라이드, 트라이플레이트, 다이엔, 친디엔체, 보론산, 알카인 및 알켄을 포함한다.
결합 화학 반응은 올리고뉴클레오타이드의 존재와 호환된다면, 임의의 결합 화학 반응을 사용하여 빌딩 블록을 연결할 수 있다(예를 들어, 초기 빌딩 블록을 폴리머 빌딩 블록에 그리고 폴리머 빌딩 블록을 폴리머 빌딩 블록에).
예시적인 결합 화학 반응은 DNA 연결 아민과 같은 아민과 Fmoc 보호된 아미노산 또는 기타 다양하게 치환된 카복실산의 반응에 의한 아미드의 형성; DNA 연결 아민을 포함하는 아민과 아이소시아네이트 및 다른 아민의 반응에 의한 요소의 형성(요소화); DNA 연결 아민을 포함하는 아민과 클로로포메이트 및 알코올의 반응에 의한 카바메이트 형성(카바모일화); DNA 연결 아민을 포함하는 아민과 염화술포닐의 반응에 의한 술폰아미드 형성; DNA 연결 아민을 포함하는 아민과 티오노카보네이트 및 다른 아민의 반응에 의한 티오요소의 형성(티오요소화); DNA 연결 아민을 포함하는 아민과 헤테로아릴 할라이드의 반응에 의한 아닐린의 형성(SNAr); DNA 연결 아민을 포함하는 아민과 알데히드의 반응에 이어 환원에 의한 2차 아민의 형성(환원성 아민화); DNA 연결 아민을 포함하는 아민의 클로로아세테이트에 의한 아실화에 이어 다른 아민에 의한 염화물 치환에 의한 펩토이드 형성(SN2 반응); DNA 연결 아민을 포함하는 아민을 아릴 할라이드로 치환된 카복실산으로 아실화한 후 치환된 알카인에 의한 할라이드의 치환에 의한 알카인 함유 화합물의 형성(소노가시라 반응); DNA 연결 아민을 포함하는 아민을 아릴 할라이드로 치환된 카복실산으로 아실화한 후 치환된 보론산에 의한 할라이드의 치환에 의한 바이아릴 화합물의 형성(스즈키 반응); DNA 연결 아민을 포함하는 아민과 염화시아누르의 반응에 이어 다른 아민, 페놀 또는 티올과의 반응에 의해 치환된 트리아진의 형성(시아누릴화, 방향족 치환); DNA 연결 아민을 포함하는 아민을 할라이드 또는 트라이플레이트와 같은 적합한 이탈기로 치환된 카복실산으로 아실화한 후, 이탈기에 의한 다른 아민의 대체에 의한 2차 아민을 형성(SN2/SN1 반응); 및 아민을 알켄 또는 알카인을 함유하는 화합물로 치환하고 생성물을 아지드 또는 알켄과 반응시킴으로써 고리형 화합물의 형성(딜스-알더 및 위스헨 반응)을 포함한다. 반응의 특정 실시태양에서, 1차 아민, 2차 아민을 포함하는 아민기, 카복실산, 1차 알코올, 에스터, 티올, 아이소시아네이트, 클로로포르메이트, 설포닐 클로라이드, 티오노카보네이트, 헤테로아릴 할라이드, 알데하이드, 클로로아세테이트, 아릴 할라이드, 알켄, 할라이드, 보론산, 알카인 및 알켄과 반응하는 분자는 약 30 내지 약 330 달톤의 분자량을 갖는다.
결합 반응의 일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 상기 화학 반응 중 임의의 것을 사용하여 DNA 연결 아민을 비롯한 아민을 아민, 티올, 할라이드, 보론산, 알카인 또는 알켄과 같은 2차 반응성 그룹을 갖는 분자로 대체함으로써 첨가될 수 있다. 그런 다음 2차 반응성 그룹은 적절한 반응성 그룹을 포함하는 빌딩 블록과 반응할 수 있다. 예시적인 2차 반응성 그룹 결합 화학 반응은 DNA 연결 아민을 포함하는 아민을 Fmoc-아미노산으로 아실화한 후 보호기의 제거 및 새로 탈보호된 아민을 알데하이드 및 보로하이드라이드로 환원성 아민화; DNA 연결 아민을 포함하는 아민과 알데하이드 및 보로하이드라이드의 환원성 아민화, 이어서 현재 치환된 아민과 염화시아누르의 반응, 이어서 트리아진으로부터 또 다른 염화물을 티올, 페놀 또는 다른 아민으로 대체; DNA 연결 아민을 포함하는 아민을 헤테로아릴 할라이드로 치환된 카복실산으로 아실화한 후 할라이드를 대체하고 아닐린 또는 티오에터를 형성하기 위한 다른 아민 또는 티올과 SNAr 반응; 및 DNA 연결 아민을 포함하는 아민을 할로방향족기로 치환된 카복실산으로 아실화한 후 소노가시라 반응에서 할라이드를 알카인으로 치환; 또는 보론산 에스터 매개 스즈키 반응에서 아릴기에 의한 할라이드의 치환을 포함한다.
일부 실시태양에서, 결합 화학 반응은 당업계에 공지된 적합한 결합 형성 반응을 기초로 한다. 예를 들어, March, Advanced Organic Chemistry, fourth edition, New York: John Wiley and Sons (1992), Chapters 10 to 16; Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry, Part B, Plenum (1990), Chapters 1- 11; and Coltman et al, Principles and Applications of Organotransition Metal Chemistry, University Science Books, Mill Valley, Calif. (1987), Chapters 13 to 20 참조; 이의 각각은 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.
일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 빌딩 블록을 부착(예를 들어, 반응)하기 위해 사용되는 반응성 그룹 또는 그룹들에 더하여 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 이러한 추가 작용기 중 하나 이상은 이러한 작용기의 원치 않는 반응을 방지하기 위해 보호될 수 있다. 다양한 작용기에 대한 적절한 보호기가 당업계에 공지되어 있다(전문이 참조로 본 명세서 포함된 Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, second edition, New York: John Wiley and Sons (1991)). 특히 유용한 보호기는 t-부틸 에스터 및 에터, 아세탈, 트리틸 에터 및 아민, 아세틸 에스터, 트라이메틸실릴 에터, 트라이클로로에틸 에터 및 에스터 및 카바메이트를 포함한다.
빌딩 블록이 다른 빌딩 블록과 공유 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 반응기와 상용성인 한, 빌딩 블록의 유형은 일반적으로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아니다.
적합한 빌딩 블록은 펩타이드, 사카라이드, 당지질, 지질, 프로테오글리칸, 당펩타이드, 설폰아마이드, 핵단백질, 요소, 카바메이트, 바이닐계 폴리펩타이드, 아마이드, 바이닐계 술폰아마이드 펩타이드, 에스터, 사카라이드, 탄산염, 펩티딜포스포네이트, 아자티드, 펩토이드(올리고 N-치환 글리신), 에터, 에톡시포름아세탈 올리고머, 티오에터, 에틸렌, 에틸렌 글리콜, 다이설파이드, 아릴렌 설파이드, 뉴클레오타이드, 모르폴리노, 이민, 피롤리논, 에틸렌이민, 아세테이트, 스티렌, 아세틸렌, 바이닐, 인지질, 실록산, 아이소시아나이드, 아이소시아네이트 및 메타크릴레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 화학식(I)의 (BI)M 또는 (B2)κ는 각각 독립적으로 폴리펩타이드, 폴리사카라이드, 폴리글리코지질, 폴리지질, 폴리프로테오글리칸, 폴리글리코펩타이드, 폴리술폰아마이드, 폴리핵단백질, 폴리우레아, 폴리카바메이트, 폴리바이닐성 폴리펩타이드, 폴리아마이드, 폴리 바이닐성 술폰아마이드 펩타이드, 폴리에스터, 폴리사카라이드, 폴리카보네이트, 폴리펩티딜포스포네이트, 폴리아자티드, 폴리펩토이드(올리고 N-치환 글리신), 폴리에터, 폴리톡시포름아세탈 올리고머, 폴리티오에터, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리디설파이드, 폴리아릴렌 설파이드, 폴리뉴클레오타이드, 폴리모르폴리노, 폴리이민, 폴리피롤리논, 폴리에틸렌이민, 폴리아세테이트, 폴리스티렌, 폴리아세틸렌, 폴리바이닐, 폴리인지질, 폴리실록산, 폴리아이소시아나이드, 폴리아이소시아네이트 및 폴리메타크릴레이트를 포함하는 M 또는 K 단위를 갖는 이들 빌딩 블럭의 폴리머를 나타낸다. 화학식(I)의 분자의 특정 실시태양에서, 약 60 내지 약 95를 포함하고 약 70 내지 약 90%를 포함하는 약 50 내지 약 100의 빌딩 블록은 약 40 내지 약 350 달톤을 포함하고, 약 50 내지 약 200 달톤을 포함하는 약 30 내지 약 500 달톤의 분자량을 갖는다.
2개의 반응성 그룹을 갖는 빌딩 블록은 각 빌딩 블록을 하나의 단위로 함유하는 선형 올리고머 또는 폴리머 구조, 또는 선형 비폴리머 분자를 형성하는 것으로 이해된다. 또한, 3개 이상의 반응기를 갖는 빌딩 블록은 3개 이상의 반응기를 갖는 각 빌딩 블록에 분지를 갖는 분자를 형성할 수 있는 것으로 이해된다.
본 명세서에 기술된 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 또는 이의 전구체 분자(예를 들어, 선형 전구체 핵산 또는 원형화된 핵산)에 부착될 수 있다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산에 부착된다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역에 비해 특정 부위에서 선형 개시자 핵산에 부착된다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역의 상류인 제 1 부위에 부착된다. 일부 실시태양에서, 제 2 초기 빌딩 블록은 개시자 핵산 상의 암호화 영역 하류에 있는 제 2 부위에 부착된다. 대안적으로, 제 1 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역 하류에 있는 제 1 부위에 부착될 수 있고, 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역 상류에 있는 제 2 부위에 부착될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법의 일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 아래에 기술된 바와 같이 선형 개시자 핵산, 원형화된 핵산 및/또는 선형 전구체 핵산에 부착된다. 일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 링커에 의해 선형 개시자 핵산 또는 이의 전구체에 부착된다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산 또는 이의 전구체는 제 1 링커 및 제 2 링커를 포함한다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산 또는 이의 전구체는 2개 이상의 링커를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "링커"는 선형 개시자 핵산 또는 이의 전구체에 빌딩 블록을 부착하는 이작용성 분자 또는 이의 일부를 의미한다.
일부 실시태양에서, 제 1 링커는 제 1 초기 빌딩 블록을 선형 개시자 핵산 또는 이의 전구체에 부착시킨다. 일부 실시태양에서, 제 2 링커는 제 2 초기 빌딩 블록을 선형 개시자 핵산 또는 이의 전구체에 부착시킨다. 일부 실시태양에서, 빌딩 블록은 공유 결합에 의해 링커(예를 들어, 제 1 링커 또는 제 2 링커)에 부착된다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록은 공유 결합에 의해 제 1 링커에 부착된다. 일부 실시태양에서, 제 2 초기 빌딩 블록은 공유 결합에 의해 제 2 링커에 부착된다. 일부 실시태양에서, 제 1 링커는 제 2 링커와 동일하다. 일부 실시태양에서, 제 1 링커는 제 2 링커와 상이하다.
다양한 구입 가능한 링커는 본 방법의 응용분야에 잘 따른다. 링커의 예는 PEG(예를 들어, 아지도-PEG-NHS, 아지도-PEG-아민 또는 다이-아지도-PEG), 또는 알케인 산 사슬 모이어티(예를 들어, 5-아지도펜탄산, (S)-2-(아지도메틸)-1-Boc-피롤리딘, 4-아지도아닐린, 또는 4-아지도-부탄-1-오산 N-하이드록시숙신이미드 에스터); PEG(예를 들어, SM(PEG)n NHS-PEG-말레이미드), 알케인 사슬(예를 들어, 3-(피리딘-2-일다이설파닐)-프로피온산-Osu 또는 설포숙신이미딜 6-(3'-[2-피리딜다이티오]-프로피온아미도)헥사노에이트))와 같은 티올 반응성 링커; 및 아미노 변형제(예를 들어, 6-(트라이플루오로아세틸아미노)-헥실-(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)-포스포르아미다이트), 티올 변형제(예를 들어, 5-트리틸-6-메르캅토헥실-1-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포르아미다이트, 또는 화학적으로 공반응성 쌍 변형제(예를 들어, 6-헥신-1-일-(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)-포스포르아미다이트, 3-다이메톡시트리틸옥시-2-(3-(3-프로파르길옥시프로판아미도)프로판아미도)프로필-1-0-숙시노일, 장쇄 알킬아미노 CPG, 또는 4-아지도-부탄-1-오산 N-하이드록시숙신이미드 에스터))와 같은 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 아미다이트; 및 이들의 호환 가능한 조합을 포함하나 이에 제한되지 않을 수 있다.
빌딩 블록은 초기 빌딩 블록 또는 폴리머 빌딩 블록을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 폴리머 빌딩 블록은 초기 빌딩 블록에 부착된다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 폴리머 빌딩 블록은 초기 블록에 부착된다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 폴리머 빌딩 블록은 제 1 초기 블록에 부착된다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 폴리머 빌딩 블록은 제 2 초기 블록에 부착된다. 일부 실시태양에서, 복수의 폴리머 빌딩 블록은 초기 빌딩 블록에 부착된다(예를 들어, 연장된다). 일부 실시태양에서, 복수의 폴리머 빌딩 블록은 제 1 빌딩 블록에 부착된다(예를 들어, 연장된다). 일부 실시태양에서, 복수의 폴리머 빌딩 블록은 제 2 빌딩 블록에 부착된다(예를 들어, 연장된다). 일부 실시태양에서, 초기 빌딩 블록에 폴리머 빌딩 블록을 부착하는 것은 폴리머 빌딩 블록을 초기 빌딩 블록과 반응시키는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 반응은 공유 결합의 형성을 포함한다.
많은 종류의 화학 반응이 본 발명에 사용 가능하다(예를 들어, 초기 빌딩 블록과 폴리머 빌딩 블록의 반응 및 폴리머 빌딩 블록과 다른 폴리머 빌딩 블록의 반응을 위해). 이론적으로, DNA를 화학적으로 변경하지 않는 모든 화학 반응이 사용될 수 있다. DNA와 호환되는 것으로 알려진 반응은 위티그 반응, 헥 반응, 호머-워드워스-에몬스 반응, 헨리 반응, 스즈키 결합, 소노가시라 결합, 위스헨 반응, 환원성 아민화, 환원성 알킬화, 펩타이드 결합 반응, 펩토이드 결합 형성 반응, 아실화, SN2 반응, SNAr 반응, 설포닐화, 요소화, 티오요소화, 카바모일화, 벤즈이미다졸, 이미다졸리디논, 퀴나졸리논, 아이소인돌리논, 티아졸, 이미다조피리딘의 형성, 글리옥살을 형성하는 다이올 절단, 딜스-알더 반응, 인돌-스티렌 결합, 마이클 첨가, 알켄-알카인 산화 결합, 알돌 반응, Fmoc-탈보호, 트라이플루오로아세트아마이드 탈보호, Alloc-탈보호, Nvoc 탈보호 및 Boc-탈보호를 포함하나 이에 제한되지 않는다. (Handbook for DNA-Encoded Chemistry (Goodnow R. A., Jr., Ed.) pp 319-347, 2014 Wiley, N.Y. March, Advanced Organic Chemistry, fourth edition, New York: John Wiley and Sons (1992), Chapters 10 to 16; Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry, Part B, Plenum (1990), Chapters 1-11; and Coltman et al., Principles and Applications of Organotransition Metal Chemistry, University Science Books, Mill Valley, Calif. (1987), Chapters 13 to 20 참조; 이의 각각은 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다)
원형화된
핵산 및 선형 전구체 핵산
원형화된 핵산이 본 명세서에서 추가로 기술된다. 원형화된 핵산은 본 명세서에 기술된 선형 전구체 핵산으로부터 형성될 수 있다. 선형 전구체 핵산은 결찰에 의해 원형화되어 원형화된 핵산을 형성한다. 원형화된 핵산이 절단되면 선형 개시자 핵산이 생성된다. 일부 실시태양에서, 개시자 핵산을 형성하기 위해 원형화된 핵산을 절단하는 단계를 포함하는 선형 개시자 핵산을 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 원형화된 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 절단 가능한 링커, 제 2 초기 빌딩 블록 및 암호화 영역을 포함한다. 예시적인 원형화된 핵산이 도 4에 예시된다. 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 원형화된 핵산의 절단 가능한 링커를 플랭킹한다.
원형화된 핵산은 선형 전구체 핵산으로부터 형성될 수 있다. 선형 전구체 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 절단 가능한 링커, 제 2 초기 빌딩 블록 및 암호화 영역을 포함한다. 예시적인 선형 전구체 핵산이 도 2에 예시된다. 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 전구체 핵산 상의 절단 가능한 링커를 플랭킹하는 위치에 부착된다. 일부 실시태양에서, 각각의 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록 및 절단 가능한 링커는 선형 전구체 핵산 상의 암호화 영역의 상류에 있다. 일부 실시태양에서, 각각의 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 및 절단 가능한 링커는 선형 전구체 핵산 상의 암호화 영역의 하류에 있다. 일부 실시태양에서, 원형화된 핵산은 선형 전구체 핵산을 원형화(예를 들어, 결찰에 의해)함으로써 형성된다.
일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산은 선형 전구체 핵산의 암호화 영역에 상응하는(예를 들어, 상보적인) 서열을 포함하는 RNA 가닥(dsDNA 주형으로부터 생성될 수 있음)으로부터 형성될 수 있다. 선형 전구체 핵산을 형성하는 예시적인 방법에서, 2개의 변형된 염기를 포함하는 핵산 프라이머가 얻어질 수 있고, 2개의 초기 빌딩 블록(예를 들어, 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록)이 각각 변형된 염기에 결합될 수 있다. 초기 빌딩 블록을 포함하는 프라이머는 선형 전구체 핵산의 암호화 영역에 상응하는 서열을 포함하는 RNA 가닥과의 역전사 반응을 위한 프라이머로 사용되어, RNA/DNA 이종이중체를 형성한다. 일부 실시태양에서, RNA/DNA의 이종이중체는 절단되어(예를 들어, 열, 열 및 염기에 의해, 또는 RNase I, RNase A 또는 RNase H와 같으나 이에 제한되지 않는 적절한 RNase를 사용하여), 단일 가닥 DNA를 남겨두고, 이에 따라 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 절단 가능한 링커 또는 절단 가능한 링커를 포함하는 개재 서열, 및 암호화 영역을 포함하는 선형 전구체 분자를 형성한다. 선형 전구체 핵산을 형성하는 다른 예시적인 방법에서, 2개의 변형된 염기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 얻을 수 있고, 그런 다음 추가적인 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드(합성되거나 구입할 수 있음)와 결찰되어 선형 전구체 핵산을 형성할 수 있다. 선형 전구체 핵산을 형성하는 또 다른 예시적인 방법에서, 비대칭 PCR은 dsDNA 주형의 암호화 가닥을 우선적으로 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 그런 다음, 비대칭 PCR의 생성물은 변형된 염기(제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록에 대한 부착 부위임)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 결찰될 수 있다. dsDNA 주형은 당업계의 임의의 적합한 수단을 사용하여 제조될 수 있다.
선형 전구체 분자는 원형화된 핵산을 형성하기 위해 결찰될 수 있다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 분자의 5' 및 3' 종단은 원형 핵산을 형성하기 위해 결찰된다. 일부 실시태양에서, 리가아제는 선형 전구체 핵산의 3' 및 5' 말단을 연결하는 데 사용된다.
일부 실시태양에서, 결찰은 효소 수단(예를 들어, 효소 결찰을 수행하기 위한 리가아제)을 통한 결찰이다. 일부 실시태양에서, 결찰은 화학적 결찰을 포함한다. 일부 실시태양에서, 결찰은 주형 의존적 결찰을 포함한다. 일부 실시태양에서, 결찰은 주형 독립적 결찰을 포함한다.
일부 실시태양에서, 결찰은 효소적 결찰을 포함한다. 일부 실시태양에서, 효소적 결찰은 리가아제의 사용을 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 사용된 리가아제는 폴리뉴클레오타이드를 함께 연결하거나 단일 폴리뉴클레오타이드의 말단을 연결하는 데 일반적으로 사용되는 효소를 포함한다. RNA 리가아제, DNA 리가아제 또는 다른 다양한 리가아제가 2개의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 선형 전구체 핵산의 종단)을 함께 연결하는 데 사용될 수 있다. 리가아제는 ATP 의존성 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 리가아제, NAD-i 의존성 이중 가닥 DNA 또는 RNA 리가아제 및 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 리가아제, 예를 들어 EC 6.5.1.1(ATP 의존성 리가아제), EC 6.5.1.2(NAD+ 의존성 리가아제), EC 6.5.1.3(RNA 리가아제)에 기술된 리가아제 중 임의의 것을 포함한다. 리가아제의 구체적인 예는 대장균 DNA 리가아제, Tth DNA 리가아제, 써모콕커스 종(균주 9°N) DNA 리가아제(9°N™ DNA 리가아제, New England Biolabs), Taq DNA 리가아제, Ampligase™(Epicentre Biotechnologies) 및 T3 DNA 리가아제, T4 DNA 리가아제 및 T7 DNA 리가아제와 같은 파지 리가아제 및 이의 돌연변이와 같은 박테리아 리가아제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 리가아제는 T4 RNA 리가아제이다. 일부 실시태양에서, 리가아제는 splintR 리가아제이다. 일부 실시태양에서, 리가아제는 단일 가닥 DNA 리가아제이다. 일부 실시태양에서, 리가아제는 T4 DNA 리가아제이다. 일부 실시태양에서, 리가아제는 DNA-스플린트된 DNA 리가아제 활성을 갖는 리가아제이다. 일부 실시태양에서, 리가아제는 RNA-스플린트된 DNA 리가아제 활성을 갖는 리가아제이다.
일부 실시태양에서, 열안정성 DNA 리가아제(예를 들어, Taq DNA 리가아제)와 같은 고충실도 리가아제가 사용된다. 열안정성 DNA 리가아제는 높은 온도에서 활성화되므로, DNA 가닥의 녹는 온도(Tm) 근처의 온도에서 결찰을 배양하여 추가 식별이 가능하다. 이는 어닐링된 완전 염기쌍 기재에 비해 어닐링된 불일치 기재(미스매치 주변에서 약간 더 낮은 Tm을 가질 것으로 예상됨)의 농도를 선택적으로 감소시킨다. 따라서, 고충실도 리가아제는 리가아제 활성 부위의 고유 선택성과 균형 잡힌 조건의 조합을 통해 달성되어 어닐링된 불일치 dsDNA의 발생률을 줄일 수 있다.
일부 실시태양에서, 결찰은 블런트 결찰이다. 블런트 말단 결찰에 적합한 배향의 예시적인 선형 전구체 핵산이 도 3b에 도시된다. 블런트 결찰은 결찰 부위에 단일 가닥 오버행이 없는 핵산 분자의 결찰을 포함한다.
일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산의 결찰은 스플린트 결찰이며, 결찰은 리가아제 및 선형 전구체 핵산의 핵산 분자에 상보적인 스플린트를 사용하여 수행된다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산은 스플린트와 혼성화한다. 일부 실시태양에서, 스플린트는 뉴클레오타이드 스플린트이다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산은 뉴클레오타이드 스플린트에 결합된다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산은 뉴클레오타이드 스플린트에 비공유적으로 결합된다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산의 5' 및 3' 종단은 뉴클레오타이드 스플린트에 비공유 결합된다.
일부 실시태양에서, 스플린트는 선형 전구체 핵산의 5' 및 3' 종단에 또는 그 근처에서 혼성화된다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산의 5' 및 3' 종단 또는 그 부근의 어닐링된 영역은 상이한 특성을 갖는다. 예를 들어, 선형 전구체 핵산의 5' 및 3' 종단 또는 그 근처의 어닐링된 영역은 상이한 용융 온도(Tm), 상이한 서열, 상이한 길이 등을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 스플린트는 선형 전구체 핵산의 다른 말단과 비교하여 선형 전구체 핵산의 하나의 어닐링된 영역(예를 들어, 5' 및 3' 종단 또는 그 근처)에서 더 높은 Tm을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드 사이의 분자간 어닐링과 대조적으로, 스플린트의 Tm은 스플린트와 선형 전구체 핵산 사이의 분자내 어닐링을 촉진하도록 선택된다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산의 분자간 어닐링/고리화 결찰은 스플린트 자체의 분자간 어닐링/고리화 결찰보다 발생할 가능성이 10 내지 100배 더 높다. 일부 실시태양에서, 스플린트는 선형 전구체 핵산의 다른 말단에 비해 선형 전구체 핵산의 한쪽 말단(예를 들어, 5' 및 3' 종단) 상의 더 많은 수의 핵산에 혼성화할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 스플린트는 선형 전구체 핵산의 5' 및 3' 종단에서 또는 그 근처에서 비대칭적으로(예를 들어, 선형 전구체 핵산에 혼성화하는 상이한 Tm 및/또는 상이한 길이를 가짐) 혼성화한다. 예를 들어, 스플린트의 한 말단은 선형 전구체 핵산이 결찰되는 온도보다 높은 Tm을 갖고, 다른 말단은 선형 전구체 핵산이 결찰되는 온도와 유사한 Tm을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 스플린트-선형 전구체 핵산 혼성화 복합체의 말단 사이의 Tm 및/또는 서열 혼성화 길이의 차이는 전술한 바와 같이 선형 전구체 핵산의 효과적인 고리화 결찰을 촉진한다. 일부 실시태양에서, 스플린트는 5' 및 3' 종단 근처에서 어닐링하여, 스플린트에 의해 연결된 선형 전구체 핵산의 두 말단으로 구성된 단일 가닥 비상보적 영역이 존재한다. 일부 실시태양에서, 이들 비주형 말단은 CIRCLIGASE™(Lucigen, Wisconsin, USA) 또는 열안정성 5' App DNA/RNA 리가아제(New England BioLabs, Massachusetts, USA)와 같은 단일 가닥 DNA를 결찰할 수 있는 효소에 의해 결찰될 수 있다. 일부 실시태양에서, 스플린트가 사용되지 않으며, 고리화는 열안정성 5' App DNA/RNA 리가아제와 같은 리가아제를 사용하여 직접적으로 수행된다. 당업자는 먼저 선형 전구체 핵산의 5' 말단을 아데닐화할 필요성을 인식할 것이다. 또한, 당업자는 스플린트가 사용되지 않는 경우 분자간 결찰의 가능성을 인식할 것이다. 분자간 결찰 생성물로부터 분자내 결찰 생성물을 정제하는 수단은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시태양에서, 결찰은 T4 RNA 리가아제로 수행된다(당업자는 이 효소의 사용이 RNA로 구성된 스플린트를 필요로 한다는 것을 이해할 것이다). 선형 전구체의 5' 말단과 3' 말단을 서로 연결하기 위한 다른 효소적 방법이 존재하며, 이들 말단을 작동 가능하게 연결하는 임의의 적합한 수단이 선택될 수 있다.
일부 실시태양에서, 뉴클레오타이드 스플린트는 약 8개 내지 약 100개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산은 스플린트의 약 10개 내지 약 100개 뉴클레오타이드에 혼성화된다. 일부 실시태양에서, 스플린트는 결찰 부위의 한쪽 면에서 약 4 내지 약 40개 뉴클레오타이드 및 결찰 부위의 다른 면에서 약 4 내지 약 40개 뉴클레오타이드의 선형 전구체 핵산에 혼성화된다. 일부 실시태양에서, 스플린트는 결찰 부위의 양쪽에서 동일한 수의 뉴클레오타이드를 갖는 선형 전구체 핵산에 결합된다. 일부 실시태양에서, 스플린트는 결찰 부위의 양쪽에서 서로 다른 수의 뉴클레오타이드를 사용하여 선형 전구체 핵산에 결합된다(예를 들어, 비대칭적으로 혼성화됨). 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산에 대한 스플린트의 비대칭 혼성화는 위에 기술된 바와 같이 선형 전구체 핵산의 원형화 결찰에 유리하다.
암호화 영역 및 선택적
비암호화
영역
본 명세서에 기술된 핵산은 다수의 코돈을 포함하는 암호화 영역, 및 선택적으로 비암호화 영역을 포함한다. 암호화 영역은 하류 분석 동안 선형 개시제 분자의 빌딩 블록(예를 들어, 개시제 빌딩 블록 및/또는 폴리머 빌딩 블록) 및 이로부터 합성된 화합물을 정확하게 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 올리고뉴클레오타이드를 포함하거나 올리고뉴클레오타이드이다. 암호화 영역은 선형 개시자 핵산으로부터 화합물의 합성을 암호화하고 지시할 수 있으며; 암호화 영역은 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 어느 안티코돈이 선형 개시자 핵산에 혼성화할 수 있는지를 결정하고, 이에 따라 어떤 폴리머 빌딩 블록이 초기 빌딩 블록 및/또는 초기 빌딩 블록으로부터 연장된 폴리머 빌딩과 반응하여 특이적으로 암호화된 화합물을 합성할 수 있는지를 결정한다. 암호화 영역(들) 및 선택적 비암호화 영역(들)에 대한 추가 기술은 US 2020/0263163 A1 및 US 2019/0169607 A1에서 찾을 수 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시태양에서, 암호화 영역은 약 1% 내지 100%, 예를 들어 약 50% 내지 약 100% 또는 약 90% 내지 약 100%의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 함유한다.
제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 선형 개시자 핵산은 화합물을 합성하는 데 사용될 수 있다. 화합물은 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록에 폴리머 빌딩 블록을 부착하여 형성된다. 폴리머 빌딩 블록은 먼저 각각을 안티코돈에 부착하여 하전된 안티코돈을 형성한 다음 하전된 안티 코돈을 선형 개시자 핵산의 암호화 영역에 있는 코돈에 혼성화함으로써 추가된다. 그런 다음 폴리머 빌딩 블록은 안티 코돈에서 선형 개시자 핵산의 암호화된 영역으로 전달된다(초기 빌딩 블록에 결합하거나 폴리머 빌딩 블록에 결합하여). 일반적으로 모든 폴리머 빌딩 블록은 모든 안티 코돈에 부착될 수 있다. 따라서, 선형 개시자 핵산의 서열이 알려져 있고(PCR에 의해 결정될 수 있음), 화합물 합성 중 각각의 독특한 안티 코돈에 사용되는 폴리머 빌딩 블록이 알려진 경우, 합성된 화합물의 정체는 결정될 수 있다.
일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 적어도 2개의 코돈을 포함하는 적어도 하나의 암호화 영역을 포함하며, 적어도 2개의 코돈은 선형 개시자 핵산 또는 이로부터 합성된 화합물의 빌딩 블록에 상응하고 이를 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 암호화 영역은 PCR에 의해 증폭되어 적어도 하나의 암호화 영역의 복사물을 생성할 수 있고, 원본 또는 복사물은 선형 개시자 핵산의 적어도 하나의 암호화 영역의 서열을 결정하기 위해 서열분석될 수 있다. 결정된 서열은 초기 빌딩 블록과 이로부터 연장되는 폴리머 빌딩 블록의 정체를 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역의 서열은 합성된 화합물(예컨대 초기 빌딩 블록 및 이로부터 확장되는 폴리머 빌딩 블록)을 합성하는 데 사용되는 일련의 조합 화학 단계와 상관될 수 있다.
일부 실시태양에서, 암호화 영역은 이중 가닥이다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 단일 가닥이다. 암호화 영역은 복수의 코돈을 포함한다. 암호화 영역의 코돈 수는 암호화 영역과 혼성화할 수 있는 고유한 안티 코돈 수를 결정한다. 코돈의 수가 2개 미만이면, 암호화된 부분이 너무 작아서 실용적이지 않을 수 있다. 코돈의 수가 20을 너무 많이 초과하면, 합성 비효율로 인해 정확한 합성이 방해될 수 있다. 따라서, 코돈의 수는 일반적으로 이러한 하한과 상한 사이의 값이다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 약 2 내지 약 21개 코돈, 예를 들어 약 2 내지 약 20개 코돈, 약 5 내지 약 15개 코돈, 및 약 10 내지 약 21개 코돈 중 임의의 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 약 21개 미만의 코돈, 예를 들어 약 20개, 15개, 5개 또는 3개 코돈 중 임의의 것 미만을 포함한다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 코돈을 포함한다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 약 5 내지 약 20개의 코돈을 포함한다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역의 코돈은 서로 겹칠 수 있다.
DNA 암호화 합성은 위에서 기술한 코돈을 사용하여 안티 코돈과 혼성화한다. DNA 암호화 합성에 사용되는 코돈은 일반적으로 자연에서 사용되는 코돈(즉, mRNA를 따라 리보솜에 의해 검색되는 코돈)보다 길다. 코돈의 길이가 약 6개 뉴클레오타이드 미만인 경우, 코돈은 암호화된 영역의 합성을 정확하게 지시하지 못할 수 있다. 코돈이 약 50개 초과의 뉴클레오타이드와 같이 너무 길면, 코돈이 교차 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 교차 반응성은 선형 핵산의 암호화 영역을 합성하는 데 사용되는 합성 단계를 정확하게 지시하고 식별하는 암호화 영역의 능력을 방해할 것이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 암호화 영역의 복수의 코돈 중 각 코돈은 약 6 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 6 내지 약 20개, 약 8 내지 약 30개, 약 15 내지 약 25개, 및 약 30 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 각각의 코돈은 약 50개 미만의 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 또는 6개의 뉴클레오타이드 중 임의의 것 미만을 포함한다. 일부 실시태양에서, 각각의 코돈은 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 각각의 코돈은 약 8 내지 약 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시태양에서, 암호화 영역의 하나 이상의 코돈은 중첩된다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역의 코돈 중 적어도 2개는 서로 확장되도록 중첩되지만, 단, 중첩되는 코돈은 약 20% 내지 1%, 약 10% 내지 2%를 포함하는 동일한 뉴클레오타이드의 약 30% 내지 1%만을 공유한다. 선형 개시자 핵산의 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 약 60% 내지 100%, 약 80% 내지 100%를 포함하는 약 30% 내지 100% 단일 가닥이다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 각각 적어도 하나의 코돈을 포함하는 적어도 2개의 암호화 영역을 포함하며, 암호화 영역 중 적어도 2개는 인접해 있다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 적어도 2개의 암호화 영역을 포함하며, 적어도 2개의 암호화 영역은 선형 개시자 핵산의 암호화된 부분의 합성을 지시하거나 기록하지 않는 뉴클레오타이드 영역(예를 들어, 합성된 화합물)에 의해 분리된다.
선형 개시자 핵산은 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 상보적 안티 코돈(즉, 하전된 안티 코돈)에 선택적으로 혼성화함으로써 화합물의 합성을 지시할 수 있다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역의 코돈은 초기 빌딩 블록에 부착된 폴리머 빌딩 블록의 신원에 고유한 것(예를 들어, 상응하는 것)이다. 일부 실시태양에서, 안티 코돈은 폴리머 빌딩 블럭 및 암호화 영역 내의 복수의 코돈 중 적어도 하나와 혼성화하는 적어도 하나의 상응하는 안티 코돈을 포함한다.
일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산의 암호화 영역에 있는 적어도 하나의 코돈은 초기 빌딩 블록에 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화한다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 코돈은 제 1 초기 빌딩 블록에 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호호한다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 코돈은 제 2 초기 빌딩 블록에 대한 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화한다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 코돈은 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록에 대한 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화한다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 코돈은 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록에 대한 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화한다.
일부 실시태양에서, 복수의 코돈 중 적어도 하나의 코돈은 복수의 폴리머 빌딩 블록 중 하나의 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화한다. 일부 실시태양에서, 복수의 코돈 중 각각의 코돈은 복수의 폴리머 빌딩 블록 중 하나의 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화한다. 일부 실시태양에서, 복수의 코돈은 복수의 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화한다.
일부 실시태양에서, 암호화 영역은 천연 및 비천연 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 적합한 뉴클레오타이드는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 티민(T)을 포함하는 DNA의 천연 뉴클레오타이드(데옥시리보핵산) 및 아데닌(A), 우라실(U), 구아닌(G), 및 시토신(C)의 RNA(리보핵산)의 천연 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 적합한 염기는 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 데옥시시티딘, 이노신, 디아미노 퓨린과 같은 천연 염기; 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, C5-프로피닐시티딘, C5-프로피닐우리딘, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-메틸시티딘, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 4-((3-(2-(2-(3-아미노프로폭시)에톡시)에톡시)프로필)아미노)피리미딘-2(1H)-온, 4-아미노-5-(헵타-1,5-다이인-1-일)피리미딘-2(1H)-온, 6-메틸-3,7-다이하이드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온, 3H-벤조[b]피리미도[4,5-e][1,4]옥사진-2(10H)-온 및 2-티오시티딘과 같은 염기 유사체; 2'-O-메틸화 염기 및 2'-플루오로 염기를 포함하는 2'-치환 뉴클레오타이드와 같은 변형된 뉴클레오타이드; 및 2'-플루오로리보스, 리보오스, 2'-데옥시리보오스, 아라비노스, 및 헥소오스와 같은 변형된 당; 및/또는 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 결합과 같은 변형된 포스페이트 그룹을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 폴리머인 것으로 이해된다. 특정 실시태양에서, 암호화 영역은 연속 염기를 함유할 필요는 없다. 특정 실시태양에서, 암호화 영역은 링커 모이어티 또는 비뉴클레오타이드 분자가 산재될 수 있다.
일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산의 암호화 영역은 약 5% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 80%, 약 80% 내지 99%, 약 90% 내지 약 99% 또는 약 100% DNA 뉴클레오타이드를 포함하는 약 5% 내지 100%를 함유한다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 약 5% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 99% 또는 약 100% RNA 뉴클레오타이드를 포함하는 약 5% 내지 약 100%를 함유한다. 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 각각 특정 백분율의 DNA 뉴클레오타이드 또는 RNA 뉴클레오타이드를 포함하고, 나머지 백분율은 각각 DNA 뉴클레오타이드의 RNA 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 비암호화 영역 또는 복수의 비암호화 영역을 추가로 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 용어 "비암호화 영역"은 선형 개시자 핵산으로부터 화합물을 합성하는 데 사용되는 임의의 안티 코딩 핵산에 상응하지 않는 선형 개시자 핵산의 영역을 의미한다. 일부 실시태양에서, 비암호화 영역은 선택적이다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 2 내지 약 4개의 비암호화 영역을 포함하여 2 내지 약 9개의 비암호화 영역을 포함하는 1 내지 약 20개의 비암호화 영역을 함유한다. 일부 실시태양에서, 비-암호화 영역은 약 12개 내지 약 40개 뉴클레오타이드 및 약 8개 내지 약 30개 뉴클레오타이드를 포함하는 약 4개 내지 약 50개 뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 비-암호화 영역은 교차 혼성화를 감소시키는 이중 가닥이다.
비암호화 영역의 첨가는 교차 혼성화를 피하거나 감소시키기 위해 암호화 영역에서 코돈을 분리할 수 있는데, 그 이유는 교차 혼성화가 선형 개시자 핵산으로부터 합성된 화합물의 정확한 암호화를 방해할 것이기 때문이다. 또한, 비암호화 영역은 단지 안티 코돈과의 혼성화 또는 암호화 이외의 기능을 선형 개시자 핵산의 암호화 영역에 추가할 수 있다. 비암호화 영역은 암호화 영역의 코돈이 산재될 수 있다. 예를 들어, 암호화 영역의 2개 코돈은 비암호화 영역에 의해 분리될 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 암호화 영역은 하나 이상의 비암호화 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 비암호화 영역은 형광 표지 또는 방사성 표지와 같은 표지로 변형될 수 있다. 이러한 표지는 선형 핵산의 시각화 또는 정량화를 촉진할 수 있다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 비암호화 영역은 처리를 용이하게 하는 작용기 또는 테더로 변형된다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 비-암호화 영역은 교차 혼성화를 감소시키는 이중 가닥(예를 들어, "차단된다")이다. 적합한 비암호화 영역은 전형적으로 선형 개시자 핵산의 핵산 부분의 PCR 증폭을 방해하지 않는 것으로 선택된다(예를 들어, 비암호화 영역은 화합물을 합성하는 데 사용되는 빌딩 블록의 식별을 방해하지 않는다).
절단 가능한 링커
본 명세서에 기술된 방법에 사용하기 위한 절단 가능한 링커는 절단될 수 있는 링커이다. 예를 들어, 원형화된 핵산에서, 절단 가능한 링커의 절단은 원형화된 핵산을 선형화시켜 본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산을 형성하게 한다.
일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 핵산을 포함한다. 절단 가능한 링커는 일부 실시태양에서 약 3 내지 약 30개 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 3 내지 약 10개, 약 8 내지 약 20개, 및 약 15 내지 약 20개 뉴클레오타이드를 포함하는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 변형된 핵산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 핵산을 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 인식 서열을 포함하는 제한 부위이고, 인식 서열은 절단 가능한 링커를 절단하는 제한 효소에 의해 인식된다.
일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 화학적 절단을 위한 기질인 결합일 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 화학적으로 절단 가능한 링커(예를 들어, 루테늄 촉매에 의해 절단될 수 있는 올레핀)이다. 일부 실시태양에서, 화학적으로 절단 가능한 링커는 비뉴클레오타이드 모이어티를 포함한다. 절단성 링커로서 기능할 수 있는 비뉴클레오타이드 모이어티는, 예를 들어, 이황화 결합, 광절단성 링커, 카바모일에틸 설폰(전형적으로 염기에 의해 절단됨) 및 다이올(전형적으로 과요오드산나트륨에 의해 절단됨)을 포함한다. 또한 Gartner et al., Multistep Small-Molecule Synthesis Programmed by DNA Templates, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 35, 10304-06 참조. 일부 실시태양에서, 화학적으로 절단 가능한 링커는 산 절단 가능하거나, 환원성 이황화물에 의해 절단 가능하거나, 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 화학 반응에 의해 절단 가능할 수 있다. 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커의 의도된 표적 부위에서만 원형화된 핵산을 특이적이고 정밀하게 절단하는 특정 유형의 화학적 절단 능력에 기초하여 선택될 수 있다.
일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 개재 서열이다. 본 명세서에 사용된 "개재 서열"은 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록 사이에 위치하는 올리고뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시태양에서, 개재 서열은 약 5 내지 약 60개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어 약 5 내지 약 20개, 약 8 내지 약 30개, 약 25 내지 약 40개, 및 약 30 내지 약 60개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시태양에서, 개재 서열은 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개 뉴클레오타이드 길이이다.
절단 방법
절단 가능한 링커는 선형 개시자 핵산을 생성하기 위해 본 명세서에 기술된 방법으로 절단될 수 있다. 원형화된 핵산의 절단은 한쪽 말단에 제 1 초기 빌딩 블록이 있고 반대쪽 말단에 제 2 개시 빌딩 블록이 있는 선형 개시자 핵산을 생성한다. 예시적인 선형 개시자 핵산이 도 1에 예시된다. DNA 또는 DNA/RNA 이종이중 절단 방법의 주요 부류는 가수분해 절단(예를 들어, 포스포다이에스터 결합에서의 절단)과 산화 절단(예를 들어, 당 또는 염기에서의 절단)을 포함한다.
일부 실시태양에서 절단은 효소적이다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커의 절단은 제한 소화에 의해 이루어진다. 절단 가능한 링커 및 부착된 제한 효소를 갖는 예시적인 원형화된 핵산이 도 5에 예시된다. 제한 소화는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA)를 특정 서열, 예를 들어, 인식 서열에서 더 작은 조각으로 절단하는 과정을 포함한다. 제한 소화는 인식 서열을 포함하는 제한 부위에서 특정 효소(예를 들어, 제한 효소)로 핵산 분자를 절단하는 것을 포함헌다. 일부 실시태양에서, 인식 서열은 약 3 내지 약 20개의 핵산 길이, 예를 들어 약 3 내지 약 6개, 약 5 내지 약 8개, 약 8 내지 약 12개, 또는 약 10 내지 약 20개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 인식 서열은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 인식 서열은 5'에서 3' 방향의 서열과 동일한 3'에서 5' 방향의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 회문식)을 포함한다.
본 명세서에 기술된 방법에 적용할 수 있는 다양한 부류/유형의 제한 효소가 있다. 핵산(예를 들어, DNA)을 절단하기 위해, 제한 효소는 이중 나선의 각 당-인산 골격(즉, 각 가닥)을 통해 한 번씩 두 개의 절개를 만든다. 일부 실시태양에서, 제한 효소는 인식 서열을 포함하는 제한 부위에서 DNA 이중 나선을 절단한다. 일부 실시태양에서, 제한 효소는 인식 서열을 포함하는 제한 부위에서 DNA/RNA 이종이중체를 절단한다. 일부 실시태양에서, 다양한 유형의 제한 효소는 핵산을 다르게 절단한다. 예를 들어, 한 제한 효소는 3개 염기쌍 서열을 절단할 수 있는 반면, 다른 제한 효소는 8개 염기쌍 서열을 절단할 수 있다. 일부 실시태양에서, 제한 소화를 위한 절단 조건(예를 들어, 완충액, pH, 온도 및 기타 요인)은 사용되는 제한 효소의 독특한 특성에 기초하여 결정된다. 일부 실시태양에서, 제한 효소는 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IV, 유형 V 또는 인공 제한 효소이다. 일부 실시태양에서, 제한 효소는 EcoRI, EcoRII, BamHI, HindIII, TaqI, NotI, HinFI, Sau3AI, PvuII, SmaI, HaeIII, HgaI, AluI, EcoRV, EcoP15I, KpnI, PstI, SacI, SalI, ScaI, SpeI, SphI, StuI 또는 XbaI 중 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 제한 소화 동안 제한 효소에 의해 표적화(예를 들어, 절단)될 수 있는 인식 서열을 포함하는 제한 부위를 포함한다. 일부 실시태양에서, 원형화된 핵산 상의 절단 가능한 링커는 제한 소화에 의해 절단되어 선형 개시자 핵산을 생성한다.
일부 실시태양에서, 원형화된 핵산 상의 절단 가능한 링커는 비효소적 절단에 의해 절단된다. 일부 실시태양에서, 절단은 화학적 절단이다. 화학적 절단은 변형 부위에서 핵산의 특정 절단을 기반으로 한다. 일부 실시태양에서, 화학적 절단은 다이메틸 설페이트에 의한 절단, 포름아미도피리미딘-DNA 글리코실라제(Fpg), 우라실 DNA 글리코실라제(UDG) 절단 및 카바모일 설폰의 절단을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시태양에서, 화학적 절단은 과요오드산나트륨에 의한 다이올의 절단을 포함한다. 일부 실시태양에서, 화학적 절단은 루테늄 촉매에 의한 올레핀의 절단이다.
일부 실시태양에서, 절단 정도는 겔 전기영동 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 기술에 의해 평가될 수 있다.
화합물 합성 방법
본 명세서에 제공된 방법은 일부 양태에서 선형 개시자 핵산으로부터 화합물을 합성하는 것과 관련이 있다(즉, 조합 화학). 화합물은 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록에 부착된 적어도 하나의 폴리머 빌딩 블록을 포함한다. 일부 실시태양에서, 화합물은 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함한다. 합성된 화합물은 선형 개시자 핵산에 연결되어 있으며, 둘 다 합성된 화합물의 합성을 암호화하고 합성된 화합물을 식별한다. 화합물을 합성하는 추가적인 예시적인 방법은 US 2019/0169607 A1 및 US 2020/0263163 A1에 개시되며, 이들 모두는 본 명세서에 기술된 선형 개시자 핵산으로부터 화합물을 합성하는 데 적용될 수 있다.
도 1에 예시된 바와 같이, 선형 개시자 핵산은 복수의 코돈으로 구성된 암호화 영역을 포함하며, 암호화 영역은 선형 개시자 핵산으로부터 합성되고 이에 의해 암호화되는 화합물의 빌딩 블록 서열에 상응하고 이를 식별하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 제공된 선형 개시자 핵산으로부터 합성된 암호화된 화합물은 조합 화학 분야에서 유용하다. 합성 방법은 선형 개시자 핵산 풀에 의해 지시되는 대규모로 2가 또는 다가 분자 라이브러리의 합성을 허용한다. 그런 다음 화합물 라이브러리는 이들 중 어느 것이 표적에 대한 결합과 같이 선택한 응용분야에 대해 원하는 특성을 가지고 있는지 확인하기 위해 테스트될 수 있다. 본 발명의 이점은 단일 분자 상에 합성된 화합물의 2가 표지를 가능하게 한다는 것이다. 달리 말하면, 선형 개시자 핵산은 적어도 2개의 화합물의 합성을 위해 암호화할 수 있다: 하나는 제 1 초기 빌딩 블록과 이로부터 연장되는 하나 이상의 폴리머 빌딩 블록을 포함하고, 하나는 제 2 초기 빌딩 블록과 이로부터 연장되는 하나 이상의 폴리머 빌딩 블록을 포함한다. 한 분자에 두 개의 합성된 화합물이 있으면 결합력 효과가 생성될 수 있으며, 이는 표적 분자에 대한 분자(즉, 적어도 두 개의 합성 화합물에 결합된 선형 개시자 핵산)의 결합을 향상시킨다.
도 7의 다이어그램은 선형 개시자 핵산으로부터 화합물을 합성하는 방법의 순차적 단계를 포함하는 본 발명의 방법을 예시한다. 일부 실시태양에서, 복수의 선형 개시자 핵산을 포함하는 분자 풀이 제공된다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 본 명세서에 기술된 임의의 방법에 의해 합성된다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록은 제 2 초기 빌딩 블록과 비교하여 선형 개시자 핵산의 반대쪽 말단에 있다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산의 5' 말단에 있다. 일부 실시태양에서, 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산의 5' 말단에 있다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산의 3' 말단에 있다. 일부 실시태양에서, 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산의 3' 말단에 있다.
일부 실시태양에서, 화합물의 합성에 사용되는 선형 개시자 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 절단 가능한 링커 및 암호화 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 5' 말단에 절단 가능한 링커의 제 1 부분을 포함하고 3' 말단에 절단 가능한 링커의 제 2 부분을 포함한다. 일부 실시태양에서, 절단 가능한 링커는 개재 서열이다.
일부 실시태양에서, 화합물의 합성에 사용되는 선형 개시자 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 개재 서열 및 암호화 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록 및/또는 제 2 초기 빌딩 블록은 링커를 통해 선형 개시자 핵산에 부착된다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 5' 말단에 개재 서열의 제 1 부분을 포함하고 3' 말단에 개재 서열의 제 2 부분을 포함한다. 일부 실시태양에서, 화합물의 합성에 사용되는 선형 개시자 핵산은 원형화된 핵산으로부터 형성된다. 일부 실시태양에서, 원형화된 핵산은 제한 소화(예를 들어, 제한 효소에 의해)를 거쳐 선형 개시자 핵산을 형성하는 제한 부위(예를 들어, 인식 서열을 포함)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 원형화된 핵산은 제한 부위를 포함하지 않고 대신 화학적 절단을 거쳐 선형 개시자 핵산을 형성한다. 일부 실시태양에서, 원형화된 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 개재 서열(예를 들어, 제한 부위 또는 화학적 절단 부위를 포함), 제 2 초기 빌딩 블록 및 암호화 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록은 원형화된 핵산 내의 개재 서열의 반대쪽 말단에 부착된다.
일부 실시태양에서, 화합물 합성을 위한 선형 개시자 핵산을 형성하는 데 사용되는 원형화된 핵산은 선형 전구체 핵산으로부터 형성된다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 개재 서열(예를 들어, 제한 부위 또는 화학적 절단 부위를 포함), 제 2 초기 빌딩 블록 및 암호화 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 전구체 핵산의 개재 서열의 반대쪽 말단에 부착되고, 각각 선형 전구체 핵산의 암호화 영역의 상류 또는 하류에 있다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산의 5' 및 3' 종단은 결찰되어(예를 들어, 스플린트 결찰에 의해) 원형화된 핵산을 형성한다.
일부 실시태양에서, 화합물의 합성에 사용되는 선형 개시자 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 절단 가능한 링커 및 암호화 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록 및/또는 제 2 초기 빌딩 블록은 링커를 통해 선형 개시자 핵산에 부착된다. 일부 실시태양에서, 선형 개시자 핵산은 5' 말단에 절단 가능한 링커의 제 1 부분을 포함하고 3' 말단에 절단 가능한 링커의 제 2 부분을 포함한다. 일부 실시태양에서, 화합물의 합성에 사용되는 선형 개시자 핵산은 원형화된 핵산으로부터 형성된다. 일부 실시태양에서, 원형화된 핵산은 제한 소화(예를 들어, 제한 효소에 의해)되어 선형 개시자 핵산을 형성하는 제한 부위(예를 들어, 인식 서열을 포함)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 원형화된 핵산은 제한 부위를 포함하지 않고 대신 화학적 절단을 거쳐 선형 개시자 핵산을 형성한다. 일부 실시태양에서, 원형화된 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 절단 가능한 링커(예를 들어, 제한 부위 또는 화학적 절단 부위를 포함), 제 2 초기 빌딩 블록 및 암호화 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록은 원형화된 핵산 내 절단 가능한 링커의 반대쪽 말단에 부착된다.
일부 실시태양에서, 화합물 합성에 사용되는 선형 개시자 핵산을 형성하는 데 사용되는 원형화된 핵산은 선형 전구체 핵산으로부터 형성된다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 절단 가능한 링커(예를 들어, 제한 부위 또는 화학적 절단 부위를 포함), 제 2 초기 빌딩 블록 및 암호화 영역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 전구체 핵산의 절단 가능한 링커의 반대쪽 말단에 부착되고 각각 선형 전구체 핵산의 암호화 영역의 상류 또는 하류에 있다. 일부 실시태양에서, 선형 전구체 핵산의 5' 및 3' 종단은 결찰되어(예를 들어, 스플린트 결찰에 의해) 원형화된 핵산을 형성한다.
선형 개시자 핵산 중 적어도 하나는 하전된 안티 코돈과 접촉될 수 있다. 일부 실시태양에서, 하전된 안티 코돈은 폴리머 빌딩 블록 및 상기 하전된 안티 코돈의 폴리머 빌딩 블록에 상응하고 이를 식별하는 안티 코돈을 포함한다. 일부 실시태양에서, 하전된 안티코돈의 안티코돈은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역의 코돈 중 적어도 하나에 상보적이며, 조건이 허용되는 경우, 안티 코돈은 암호화 영역의 코돈의 적어도 하나와 혼성화된다(도 7). 하전된 안티 코돈의 폴리머 빌딩 블록은 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다. 일부 실시태양에서, 폴리머 빌딩 블록은 "빌딩 블록" 섹션에 나열된 예시적인 빌딩 블록 중 임의의 것일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 폴리머 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아니다.
제 2 폴리머 빌딩 블록은 미반응된 제 1 초기 빌딩 블록 또는 미반응된 제 2 초기 빌딩 블록에 부착될 수 있다. 추가로, 일부 실시태양에서, 제 2 폴리머 빌딩 블록은 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록과 반응한 제 1 폴리머 빌딩 블록에 부착될 수 있다. 일부 실시태양에서, 제 2 폴리머 빌딩 블록은 제 1 폴리머 빌딩 블록과 동일하다. 일부 실시태양에서, 제 2 폴리머 빌딩 블록은 제 1 폴리머 빌딩 블록과 상이하다. 일부 실시태양에서, 제 2 하전된 안티 코돈을 첨가하기 전에, 제 1 안티 코돈(예를 들어, 제 1 하전된 안티 코돈의 안티 코돈)은 선형 개시자 핵산에서 제거된다. 일부 실시태양에서, 제 1 안티코돈을 제거하는 것은 선형 개시자 핵산의 코돈으로부터 제 1 안티 코돈을 혼성화 해제하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 안티 코돈을 제거하는 것은 제 1 안티 코돈을 절단하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 안티 코돈은 제한 소화와 같은 효소적 소화에 의해 또는 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)에 의해 절단된다. 예를 들어, 제 1 안티 코돈은 선형 개시자 핵산으로부터 제 1 안티 코돈의 제거를 촉진하기 위해 dU 염기를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 제 1 안티코돈의 dU 염기는 UDG에 의해 절단된다. 일부 실시태양에서, 절단된 제 1 안티코돈의 더 짧은 단편은 더 낮은 용융 온도를 가지며, 따라서 선형 개시자 핵산의 코돈에 대한 더 낮은 친화도를 갖는다. 따라서, 절단된 제 1 안티 코돈은 선형 개시자 핵산에 대한 혼성화를 위해 들어오는 전장의 제 2 하전된 안티 코돈에 의해 대체될 수 있으며, 제 2 하전된 안티 코돈은 제 1 하전된 안티 코돈의 안티 코돈으로서 선형 개시자 핵산의 동일한 코돈에 혼성화되는 안티 코돈을 포함한다.
예를 들어, 일부 실시태양에서 선형 개시자 핵산은 제 2 폴리머 빌딩 블록 및 제 2 폴리머 빌딩 블록에 상응하고 이를 식별하는 제 2 안티 코돈을 포함하는 제 2 하전된 안티 코돈과 접촉된다. 일부 실시태양에서, 제 1 안티코돈은 선형 개시자 핵산을 제 2 안티 코돈과 접촉시키기 전에 선형 개시자 핵산으로부터 제거된다(예를 들어, 위에서 기술한 바와 같이 효소적 소화, 예컨대 UDG 절단에 의해). 일부 실시태양에서, 제 2 안티 코돈은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역의 코돈 중 적어도 하나에 혼성화한다. 일부 예에서, 제 2 하전된 안티 코돈은 제 1 하전된 안티 코돈의 폴리머 빌딩 블록과 동일한 폴리머 빌딩 블록, 및 제 1 하전된 안티 코돈의 안티 코돈과 동일한 안티 코돈을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 2 안티 코돈은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역과 제 1 안티코돈의 동일한 코돈에 혼성화한다. 일부 실시태양에서, 제 2 안티코돈은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역의 상이한 코돈과 제 1 안티코돈에 혼성화한다. 일부 실시태양에서, 제 2 하전된 안티 코돈의 제 2 폴리머 빌딩 블록은 제 1 폴리머 빌딩 블록과 반응하여 공유 결합을 형성한다. 일부 실시태양에서, 제 2 하전된 안티 코돈의 제 2 폴리머 빌딩 블록은 미반응된 제 1 초기 빌딩 블록 또는 미반응된 제 2 초기 빌딩 블록과 반응하여 공유 결합을 형성한다.
선형 개시자 핵산을 폴리머 빌딩 블록 및 안티 코돈을 포함하는 하전된 안티 코돈과 접촉시키고, 안티 코돈을 선형 개시자 핵산의 암호화 영역의 코돈 중 하나 이상과 혼성화시키고 폴리머 빌딩 블록을 선형 개시자 핵산에 이전에 부착된 빌딩 블록과 반응시켜 공유 결합을 형성하는 방법은 여러 번 반복될 수 있다. 일부 실시태양에서, 이 방법은 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 반복된다. 일부 실시태양에서, 이 방법은 제 1 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물 및 제 2 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물을 형성한다.
일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물은 링커를 통한 선형 개시자 핵산의 핵산 부분(예를 들어, 암호화 영역, 비암호화 영역 및/또는 절단 가능한 링커 또는 개재 서열)에 부착된다.
선형 개시자 핵산의 핵산 부분은 합성된 화합물의 기능성을 방해하지 않도록 설계될 수 있다. 일부 실시태양에서, 화합물의 합성은 암호화 정보의 손실을 감소시키기 위해 선형 개시자 핵산의 핵산 부분과 상용성인 조건하에서 일어난다. 예를 들어, 고온, 산성 환경, 산화제 및 전이 금속 이온에서의 장기간 반응과 같은 극단적인 반응 조건은 선형 개시자 핵산의 핵산 부분을 분해할 수 있다.
일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물과 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물은 상이하다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물과 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물은 동일하다. 일부 실시태양에서, 합성된 화합물은 "빌딩 블록" 섹션에 나열된 예시적인 빌딩 블록 중 임의의 것일 수 있지만 이에 제한되지 않는 폴리머 빌딩 블록을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물은 핵산 또는 핵산 유사체를 포함하지 않는다.
실시예
본 출원은 본 출원의 예시적인 실시태양으로서 제공되는 다음의 비제한적인 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 다음 실시예는 실시태양을 더 완전하게 설명하기 위해 제시되며 결코 본 출원의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 출원의 특정 실시태양이 본 명세서에 도시되고 기술되었지만, 그러한 실시태양은 단지 예로서 제공된다는 것이 명백할 것이다. 당업자는 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변형, 변화 및 대체를 알 수 있다. 본 명세서에 기술된 실시태양에 대한 다양한 대안이 본 명세서에 기술된 방법을 실행하는데 채용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예
1. 선형 개시자 핵산의 합성.
이 예는 선형 개시자 핵산의 합성을 설명한다. 특히, 본 실시예는 선형 전구체 핵산 및 원형화된 핵산으로부터 선형 개시자 핵산의 합성을 설명한다.
도 6은 선형 전구체 핵산 출발 물질로부터 선형 개시자 핵산을 제조하는 예시적인 방법을 예시한다. 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 선형 전구체 핵산은 스플린트 결찰 또는 블런트 말단 결찰에 의해 원형화된다. 제 1 초기 빌딩 블록 부위와 제 2 초기 빌딩 블록 부위 사이의 부위에 위치한 절단 가능한 링커는 제한 소화 또는 화학적 절단에 의해 절단된다. 원형화된 핵산이 절단되면 선형 개시자 핵산이 생성되며, 제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 핵산의 반대쪽 말단 근처 부위로 이동된다.
선형 개시자 핵산 풀은 제 1 초기 빌딩 블록 및 제 2 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 화합물의 합성을 암호화하고 지시하기 위해 조합 화학 라이브러리의 생성을 위해 사용된다.
실시예
2. 화합물의 합성.
본 실시예는 도 1에 도시된 예시적 다이어그램에 도시된 바와 같이 선형 개시자 핵산으로부터 화합물의 합성을 설명한다.
선형 개시자 핵산의 풀이 제공되며, 선형 개시자 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 블록 및 암호화 영역을 포함한다. 도 7에 예시된 바와 같이, 적어도 하나의 하전된 안티 코돈(폴리머 빌딩 블록을 운반하는 안티 코돈, 예를 들어 제 1 하전된 안티 코돈)은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역 내의 복수의 코돈 중 적어도 하나의 코돈과 혼성화할 수 있다. 제 1 하전된 안티 코돈은 폴리머 빌딩 블록 및 선형 개시자 핵산의 코돈에 상보적인 안티 코돈을 포함한다. 폴리머 빌딩 블록은 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록과 반응하고 공유 결합한다.
두 번째, 선택적으로 동일한 폴리머 빌딩 블록은 미반응된 제 1 초기 빌딩 블록 또는 미반응된 제 2 초기 빌딩 블록에 부착될 수 있다. 제 1 하전된 안티 코돈은 선형 개시자 핵산으로부터 제거(예를 들어, 절단되고 혼성화되지 않음)되고, 폴리머 빌딩 블록의 두 번째 복사물 및 선형 개시자 핵산의 코돈에 상보적인 안티 코돈을 포함하는 제 2 하전된 안티 코돈은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역 내의 복수의 코돈 중 적어도 하나의 코돈과 혼성화할 수 있다. 일부 실시예에서, 제 2 하전된 안티 코돈은 제 1 하전된 안티 코돈의 폴리머 빌딩 블록과 동일한 폴리머 빌딩 블록, 및 제 1 하전된 안티 코돈의 안티 코돈과 동일한 안티 코돈을 포함한다. 이들 실시예에서, 제 2 하전된 안티 코돈의 안티 코돈은 제 1 하전된 안티 코돈의 안티 코돈과 동일한 선형 개시자 핵산의 코돈에 상보적이다. 제 2 하전된 안티 코돈 상의 폴리머 빌딩 블록의 두 번째 복사물은 반응하지 않은 제 2 초기 빌딩 블록과 반응하고 공유 결합한다.
선택적으로, 상이하거나 동일한 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 다양한 추가 안티 코돈은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역의 코돈에 혼성화할 수 있다. 이러한 방법은 궁극적으로 제 1 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성 화합물 및 제 2 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성 화합물을 형성할 수 있다. 일부 실시예에서, 도 8에 도시된 바와 같이, 제 1 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물과 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물은 동일하다. 대안적으로, 제 1 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물과 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물은 상이할 수 있다.
합성된 화합물은 선형 개시자 핵산의 암호화 영역에 상응하고 이에 의해 식별될 수 있다. 화합물은 특정 특성(예를 들어, 특정 표적 분자에 대한 결합)을 보유하는 화합물을 선택하기 위해 하류 분석을 거칠 수 있다. 상기 특성에 대해 선택된 화합물의 암호화 영역은 PCR 증폭되어 빌딩 블록의 동일성을 결정할 수 있다.
Claims (31)
- 선형 개시자 핵산을 제조하는 방법으로서,
선형 개시자 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록 및 암호화 영역을 포함하고;
제 1 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역의 상류에 있는 제 1 부위에 부착되고 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역의 하류에 있는 제 2 부위에 부착되며;
방법은 선형 개시자 핵산을 형성하기 위해 원형화된 핵산을 절단하는 단계를 포함하며;
원형화된 핵산은 (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록, 및 (iv) 암호화 영역을 포함하고;
(i) 및 (iii)은 (ii)의 반대쪽 말단에 부착되고, 절단은 절단 가능한 링커를 절단하는 것인 선형 개시자 핵산을 제조하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
절단은 효소적 절단에 의한 것인 방법. - 제 2 항에 있어서,
효소적 절단은 제한 소화에 의한 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
절단은 화학적 절단에 의한 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
원형화된 핵산은 원형화된 핵산을 형성하기 위해 선형 전구체 핵산을 결찰하는 단계를 포함하는 방법에 의해 형성되며; 선형 전구체 핵산은 (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록, 및 (iv) 암호화 영역을 포함하고; (i) 및 (iii)은 선형 전구체 핵산에서 (ii)의 반대쪽 말단에 부착되고; (i), (ii) 및 (iii)은 각각 선형 전구체 핵산에서 (iv)의 상류 또는 하류에 있는 것인 방법. - 제 5 항에 있어서,
결찰은 스플린트(splint) 결찰인 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
결찰은 블런트(blunt) 결찰인 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
암호화 영역은 복수의 코돈을 포함하는 것인 방법. - 제 8 항에 있어서,
복수의 코돈 중 적어도 하나의 코돈은 5 내지 60개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법. - 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
적어도 하나의 코돈은 제 1 초기 빌딩 블록, 제 2 초기 빌딩 블록, 또는 둘 다에 대한 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화하는 것인 방법. - 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
복수의 코돈은 복수의 폴리머 빌딩 블록의 첨가를 암호화하는 것인 방법. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
선형 개시자 핵산은 제 1 링커 및 제 2 링커를 포함하며, 제 1 링커는 제 1 초기 빌딩 블록을 선형 개시자 핵산에 부착하고, 제 2 링커는 제 2 초기 빌딩 블록을 선형 개시자 핵산에 부착하는 것인 방법. - 제 12 항에 있어서,
제 1 초기 빌딩 블록은 공유 결합에 의해 제 1 링커에 부착되고, 제 2 초기 빌딩 블록은 공유 결합에 의해 제 2 링커에 부착되는 것인 방법. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 1 초기 빌딩 블록과 제 2 초기 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아닌 것인 방법. - 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
암호화 영역은 2 내지 20개의 코돈을 포함하는 것인 방법. - 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
암호화 영역은 5 내지 20개의 코돈을 포함하는 것인 방법. - 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
절단 가능한 링커는 개재 서열인 방법. - 제 17 항에 있어서,
개재 서열은 4 내지 30개 뉴클레오타이드 길이인 방법. - 제 18 항에 있어서,
개재 서열은 비뉴클레오타이드 모이어티인 방법. - (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록, 및 (iv) 암호화 영역을 포함하는 선형 전구체 핵산으로서, (i) 및 (iii)은 선형 전구체 올리고뉴클레오타이드에서 (ii)의 반대쪽 말단에 부착되며; (i), (ii) 및 (iii)은 각각 선형 전구체 핵산에서 (iv)의 상류 또는 하류에 있는 것인 선형 전구체 핵산.
- 제 20 항에 있어서,
5' 및 3' 종단은 뉴클레오타이드 스플린트에 비공유 결합되는 것인 전구체 핵산. - (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록, 및 (iv) 암호화 영역을 포함하는 원형화된 핵산으로서, (i)와 (iii)은 (ii)의 반대쪽 말단에 부착되는 것인 원형화된 핵산.
- 다음 단계를 포함하여 화합물을 합성하는 방법:
(a) 복수의 선형 개시자 핵산을 포함하는 분자 풀을 제공하는 단계, 각각의 선형 개시자 핵산은 제 1 초기 빌딩 블록, 제2 초기 빌딩 블록 및 복수의 코돈을 포함하는 암호화 영역을 포함하며; 제 1 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역의 상류에 있는 부위에 부착되고, 제 2 초기 빌딩 블록은 선형 개시자 핵산 상의 암호화 영역의 하류에 있는 제 2 부위에 부착된다;
(b) 안티 코돈과 암호화 영역의 코돈 중 적어도 하나의 혼성화를 허용하는 조건하에서 선형 개시자 핵산 중 적어도 하나를 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 안티 코돈과 접촉시키는 단계, 폴리머 빌딩 블록은 제 1 초기 빌딩 블록 또는 제 2 초기 빌딩 블록과 반응하여 공유 결합을 형성한다. - 제 23 항에 있어서,
선형 개시자 핵산은 (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록, 및 (iv) 암호화 영역을 포함하는 원형화된 핵산의 절단 부위에서 절단 가능한 링커의 절단에 의해 형성되며; (i) 및 (iii)은 원형화된 핵산에서 (ii)의 반대쪽 말단에 부착되는 것인 방법. - 제 23 항에 있어서,
선형 개시자 핵산은 5' 말단에 개재 서열의 제 1 부분을 포함하고, 3' 말단에 개재 서열의 제 2 부분을 포함하고; 선형 개시자 핵산은 (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 제한 부위를 포함하는 개재 서열, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록 및 (iv) 암호화 영역을 포함하는 원형화된 핵산에서 제한 부위의 제한 소화에 의해 형성되며; (i) 및 (iii)은 원형화된 핵산에서 (ii)의 반대쪽 말단에 부착되는 것인 방법. - 제 23 항에 있어서,
선형 개시자 핵산은 5' 말단에 절단 가능한 링커의 제 1 부분을 포함하고, 3' 말단에 절단 가능한 링커의 제 2 부분을 포함하며; 선형 개시자 핵산은 (i) 제 1 초기 빌딩 블록, (ii) 제한 부위를 포함하는 절단 가능한 링커, (iii) 제 2 초기 빌딩 블록 및 (iv) 암호화 영역을 포함하는 원형화된 핵산에서 제한 부위의 제한 소화에 의해 형성되며; (i) 및 (iii)은 원형화된 핵산에서 (ii)의 반대쪽 말단에 부착되는 것인 방법. - 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
선형 개시자 핵산은 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되는 것인 방법. - 제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 1 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물 및 제 2 초기 빌딩 블록으로부터 연장되는 복수의 폴리머 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물을 형성하기 위해 단계(b)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - 제 27 항에 있어서,
제 1 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물과 제 2 초기 빌딩 블록을 포함하는 합성된 화합물은 동일한 것인 방법. - 제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리머 빌딩 블록은 핵산 또는 핵산 유사체가 아닌 것인 방법. - 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
합성된 화합물은 핵산 또는 핵산 유사체를 포함하지 않는 것인 방법.
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