KR20240055847A

KR20240055847A - 식물에서 비타민 d 수준을 개선하는 방법

Info

Publication number: KR20240055847A
Application number: KR1020247012105A
Authority: KR
Inventors: 캐시 마틴; 지 리
Original assignee: 존 인스 센터
Priority date: 2021-09-14
Filing date: 2022-09-12
Publication date: 2024-04-29
Also published as: CA3231622A1; WO2023041492A1; CN117999348A; GB202113075D0; AU2022346143A1

Abstract

식물에서 프로비타민 D₃ 및/또는 비타민 D₃의 수준을 증가시키는 방법이 기재되어 있다. 토마토 식물이 유전자 변형되어 7-데하이드로콜레스테롤 리덕타제 활성의 감소를 초래한다.

Description

식물에서 비타민 D 수준을 개선하는 방법

본 발명은 식물에서 비타민 D (vitamin D) 및/또는 프로비타민 D (provitamin D)의 수준을 개선하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 수득된 식물 및 이의 과실, 및 본 발명의 식물로부터 제조된 식품 (foodstuffs)에 관한 것이다.

비타민 D는 골격 발달에 영향을 미치는 결핍 질병 (deficiency diseases), 구체적으로 소아에서 구루병 (rickets), 및 성인에서 골연화증 (osteomalacia) 및 골다공증 (osteoporosis)을 예방하는 능력이 확인되었다¹. 비타민 D는 2가지 하이드록실화 반응을 통해, 칼슘 항상성 뿐만 아니라 심장, 뼈, 폐, 내장, 유선 및 뇌를 포함하는 다수의 장기에서 신호전달 기능을 하는 스테로이드 호르몬 생체활성을 가진 산물로 전환된다². 결과적으로, 비타민 D 결핍은 면역 기능 및 염증에 영향을 미치고, 암, 구체적으로 유방암 및 결장암^3,4, 파킨슨병⁵, 우울증⁶, 신경인지 저하⁷, 치매⁸ 위험의 증가와 관련이 있으며, 최근에는 COVID-19 감염의 중증도⁹와 관련이 있다. 비타민 D는 피부가 UV-B 광¹⁰에 노출된 후에, 인간이 7-데하이드로콜레스테롤 (7-dehydrocholesterol: 7-DHC)로부터 합성할 수 있지만, 주요 공급원은 음식물이다¹¹. 전 세계적으로 약 10억 명의 사람들이 비타민 D 부족으로 고통받고 있는 것으로 추정되며¹², 그 수는 부적절한 식단으로 인해 크게 증가하고 있다. 부족한 비타민 D 상태는 모든 연령 그룹에서 주요 공중 보건 문제이다. 유럽 식품 안전청 (European Food Safety Authority)은 1세 초과의 건강한 개인의 경우 적절한 섭취량을 1일 15 μg으로 정의하였고, 미국 국립보건원 (National Institutes of Health)에서는 소아의 경우 1일 15 μg을 권장하고, 70세 초과의 성인의 경우 1일 20 μg까지 증가시킨다. 일반적으로, 이러한 섭취량은 강화 식품 (fortified foods) 또는 비타민 D 보충제를 통한 보충 없이 식품 공급원을 통해 달성할 수 없다. 인간은 UV-B 복사에 노출된 후에 7-DHC로부터 스스로 비타민 D₃를 합성할 수 있기 때문에, 비타민 D₃ 부족을 교정하기 위한 대부분의 조언은 일광에 대한 노출을 늘리는 것에 기반한다. 그러나, 일광에 적절히 노출된 개인이라도, 노인 (＞70세)의 피부에서 프로비타민 D₃ 수준의 저하, 피부 멜라닌 함량 증가, UV-B 침투를 감소시키는 화상 흉터 조직, 및 장 흡수장애 증후군 예컨대 크론병, 및 기타 내인성 요인으로 인해, 비타민 D₃ 부족은 흔한 증상이다. 또한, UV-B 복사에 노출되면 피부암이 발생할 수 있다는 우려로 인해 일광욕을 하는 사람들이 감소하고 있으며, 일광욕을 하는 사람들은 자외선 차단 지수가 높은 UV-차단 선스크린을 사용하게 되면서, 이는 비타민 D의 생성을 제한한다.

비타민 D₂는 원래 식물에서 확인되었지만, 이는 결국 진균 감염으로 인한 것으로 밝혀졌다¹³. 프로비타민 D₃ (7-DHC)는 토마토와 같은 일부 식물에서, 주로 잎에서 콜레스테롤 및 스테로이드성 글리코알칼로이드 (SGA) 합성 경로를 통해 합성된다. 토마토 잎이 UV-B에 노출되면 비타민 D₃를 생성하지만, 일반적으로 식물은 상대적으로 부족한 식이 공급원으로 간주되며, 최선의 공급원은 생선 및 유제품이다. 버섯 및 효모는 UV-B 광에 노출된 후에, 비타민 D₂의 공급원으로서 사용될 수 있지만, 여러 역학적 연구 (epidemiological studies)에서 비타민 D₂는 비타민 D₃보다 생물학적 유효성이 유의미하게 더 낮은 것으로 보고되었다^14,15. 비거니즘 (veganism)의 인기가 높아지면서 추가 보충제 없이는 비타민 D가 결핍될 가능성이 높은 식단의 비율이 증가하고 있으며, 이러한 경우 버섯으로부터 비타민 D₂를 섭취해야 한다.

비타민 D 및/또는 프로비타민 D의 수준이 증가된 식물을 제공하는 것이 유익할 것이다.

발명의 요약

본 발명자들은 가지과 식물 (Solanaceous plants)에서 피토스테롤 생합성 경로의 부분적 중복 (duplication)을 활용하여, 게놈 편집 (genome editing)을 통해 토마토에서 프로비타민 D₃를 축적하도록 조작하여, 폐기물로부터 보충제를 생산할 수 있는 바이오 강화 식품 (biofortified food)을 제공하였다.

본 발명의 제1 양상에서, 식물에서 프로비타민 D₃ 수준을 개선하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 식물에서 7-데하이드로콜레스테롤 리덕타제 (7-dehydrocholesterol reductase: 7-DR)의 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 식물은 7-DR 유전자의 중복을 갖는 식물이고; 여기서, 바람직하게는 유전자좌들 중 하나가 활성의 감소를 위한 표적이다. 본원에 기재된 바와 같이, 7-DR2 효소는 토마토 식물의 잎 및 과실에서 토마틴 (tomatine) 합성을 위해 프로비타민 D₃/7-DHC를 콜레스테롤로 전환시킨다. 결과적으로, 토마토에서 7-DR2의 활성을 억제하면 피토스테롤 및 브라시노스테로이드 생합성에 어떤 영향도 주지 않고 7-DHC가 축적될 수 있다. 상기 유전자 및 효소는 본원에서 Sl7-DR2 (즉, 토마토-특이적 유전자)로 지칭되지만, 이는 다른 식물 종의 호모로그 (homologs) 및 오르토로그 (orthologs)를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

"활성 감소 (reducing activity)"는 효소 활성 또는 발현의 감소 또는 폐지를 의미할 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 방법은 기능 상실 돌연변이 (loss of function mutation)를 7-DR 유전자 (바람직하게는 Sl7-DR2 유전자)의 적어도 하나의 카피에 도입하는 단계를 포함한다. 상기 돌연변이는 코딩 서열에 존재할 수 있다. 상기 돌연변이는 삽입, 결실 또는 변경일 수 있다. 구체예에서, 상기 기능 상실 돌연변이는 Sl7-DR2 유전자의 다수의 카피들에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 상기 돌연변이는 게놈 편집, 바람직하게는 ZFNs, TALENs 또는 CRISPR에 의해 도입된다. 일부 구체예에서, 돌연변이 유발원 (예: 방사선)을 사용하여 돌연변이를 도입할 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 유전자의 적어도 하나의 카피에 도입될 수 있으며, 게놈에 다수의 돌연변이들을 갖는 식물, 예를 들어 동형접합 식물 (homozygous plants)을 생성하는데 통상적인 재배 기술이 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 전사후 기술 (post-transcriptional techniques)은 효소 활성을 감소 또는 폐지하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, RNAi, CRISPRi, 또는 안티센스 기술은 모두 효소 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 siRNA 또는 안티센스 분자를 식물에 도입하는 단계를 포함할 수 있거나; 또는 siRNA 또는 안티센스 분자를 코딩하는 핵산 서열을 식물에 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 식물 게놈에 안정하게 혼입될 수 있다.

효소 활성이 감소되는 경우 (폐지되지는 않음), 상기 활성은 바람직하게는 야생형 또는 대조 식물에서의 수준과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 또는 초과 만큼 감소한다. 효소 활성을 결정하는 방법은 당업자의 전문 지식 내에 있다.

구체예에서, 상기 식물에서 7-DHC 수준은 야생형 또는 대조 식물에서의 수준과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 또는 초과 만큼 증가한다.

상기 방법은 식물 또는 식물의 일부를 UVB 복사에 노출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 노출은 바람직하게는 식물에 존재하는 적어도 일부 7-DHC를 비타민 D₃로 전환시키기에 충분한 세기에서 일정 시간 동안 수행한다. 이러한 구체예에서, 비타민 D₃의 수준은 야생형 또는 대조 식물에서의 수준과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 또는 초과 만큼 증가한다.

일부 구체예에서, 상기 식물은 UV-B 광의 과실로의 침투를 증가시키는 돌연변이를 추가로 보유한다. 예를 들어, 토마토의 y 돌연변이는 '핑크 토마토 (pink tomatoes)'의 스킨 (skin)으로부터 UV-보호 플라보놀의 손실을 유발하여, 추가의 침투를 허용한다. 상기 방법은 이러한 돌연변이를 본 발명의 식물에 도입하는 단계를 포함할 수 있고; 이는 통상적인 재배 기술, 또는 표적화된 게놈 편집에 의해 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 이러한 돌연변이를 이미 보유하고 있는 식물에 적용될 수 있으며; 즉, 돌연변이체 식물은 Sl7-DR2 활성의 감소를 위한 배경 (background)으로서 사용된다.

일 구체예에서, 상기 식물은 숙성 과실에서 엽록소 분해에 영향을 미치는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 보유한다. 일례로는 토마토의 staygreen 유전자좌의 돌연변이이다. 이러한 돌연변이는 숙성 과실에서 7-DHC 수준을 추가로 상승시키는데 도움이 될 수 있다. 이러한 특성의 축적은 ZFNs, TALENs 또는 CRISPR를 사용한 게놈 편집, 또는 유전자이입 (introgression)을 통해 달성될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 식물 또는 식물의 일부를 가공하여 7-DHC 및/또는 비타민 D₃를 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 구체예는 식물의 일부가 전형적으로 소비되지 않는 경우; 예를 들어, 토마토를 수확한 후에 토마토 식물의 잎 또는 줄기를 처리하는 경우에 특히 유용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상에서, 유전자 변경된 식물 (genetically altered plant), 이의 일부 또는 식물 세포가 제공되며, 여기서 상기 식물, 이의 일부 또는 식물 세포는 7-데하이드로콜레스테롤 리덕타제의 활성이 감소되어 있다. 상기 식물, 이의 일부 또는 식물 세포는 7-DR 유전자 (바람직하게는 Sl7-DR2 유전자)에 기능 상실 돌연변이를 포함할 수 있다.

상기 식물 일부는 종자, 과실, 뿌리, 괴경, 잎, 꽃일 수 있다.

상기 각 양상에서, 상기 식물은 바람직하게는 가지과 (Solanaceae), 더 바람직하게는 가지속 (Solanum spp)의 구성원이다. 상기 식물은 토마토 (Solanum lycopersicum), 감자 (Solanum tuberosum), 가지 (Solanum melongena)로부터 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 식물은 고추속 (Capsicum spp), 예를 들어 C. 안누움 (C. annuum), C. 박카툼 (C. baccatum), C. 치넨세 (C. chinense), C. 프루테센스 (C. frutescens), 및 C. 푸베센스 (C. pubescens)일 수 있다 (이들은 피망 (bell peppers) 및 칠리 페퍼 (chili peppers)를 포함한다). 또 다른 구체예에서, 상기 식물은 꽈리속 (Physalis spp), 예를 들어 토마티요 (tomatillos)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상에서, 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 식물 또는 식물 자손이 또한 제공된다. 또 다른 양상에서, 상기 기재된 식물로부터 유래된 화분 (pollen), 번식체 (propagule), 자손 (progeny) 또는 식물의 일부가 제공되며, 여기서 상기 화분, 번식체, 자손 또는 일부는 7-DR 유전자 (바람직하게는 Sl7-DR2 유전자)에 기능 상실 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양상에서, 본 발명의 식물 또는 식물 일부로부터 생산된 식품 (food product)이 제공된다.

일부 연구에서 비타민 D 또는 프로비타민 D를 식단에 보충하면 혈청 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준을 감소시키는데 유익한 효과를 가질 수 있다고 나타내었다. 그러므로, 본 발명은 본 발명의 식물 또는 이로부터 제조된 식품의 섭취에 의해, 이를 필요로 하는 인간 또는 동물 대상체에서 콜레스테롤 수준을 감소시키는 잠재적인 경로를 제공한다. 일 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 인간 또는 동물 대상체에서 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기재된 식물 또는 식품을 섭취하는 단계를 포함한다. 또한, 인간 또는 동물 대상체에서 콜레스테롤 수준을 감소시키는데 사용하기 위한, 본원에 기재된 식물 또는 식품이 제공된다.

도 1은 Sl7-DR2 동형접합 녹-아웃 계통에서 7-DHC의 축적을 보여준다.
a, 토마토에서 콜레스테롤생성 경로 (연녹색으로 표시) 및 피토스테롤 생합성 경로 (연오렌지색으로 표시)는 Sonawane 등에 의해 재도시되었다. 7-DHC는 7-DR2에 의해 콜레스테롤로 전환되고, 이는 UVB 광에 노출되면 비타민 D₃로 전환될 수 있다. SMO, C-4 스테롤 메틸 옥시다제; C5-SD1, 스테롤 C-5(6) 불포화효소 1.　b, 5개의 독립적 Sl7-DR2-녹아웃 계통이 게놈 편집에 의해 생성되었다. 상단: 엑손이 회색 화살표로 표시된 Sl7-DR2　유전자의 도식적 구조. 하단: 각 계통에서 회복된 돌연변이는 연청색으로 강조 표시된다. CRISPR-Cas9-표적 서열 및 프로토스페이서-인접 모티프 서열은 각각 청색 및 적색으로 표시된다.　c, 다양한 숙성 단계 (IMG, 미성숙 녹색; MG, 성숙 녹색; 채색기 (Breaker), 과실이 숙성으로 전환; B + 7, 채색기-숙성 과실 후 7일)에서 야생형 (WT) 및 Sl7-DR2-녹아웃 토마토 과실에서의 7-DHC 함량. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표시된다. 좌측에서 우측으로: n = 14, 19, 16, 15, 16, 14, 13, 11, 18, 13, 10, 15, 15, 14, 17, 11, 11, 15, 9, 17, 14, 17, 15 및 15개의 생물학적으로 독립적인 과실 샘플들. ND, 검출되지 않음 (not detected).　d, 야생형 및 Sl7-DR2-녹아웃 계통의 잎 중 7-DHC 함량. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표시된다. 좌측에서 우측으로: n = 4, 5, 5, 4, 5 및 4개의 생물학적으로 독립적인 잎 샘플들. 각 과실 숙성 단계 (c) 또는 잎 (d)에서 WT 및 돌연변이체 간의 통계적 유의성은 two-tailed　t-테스트를 사용하여 평가하였다 (^* P≤0.05, ^** P≤0.01, ^*** P≤0.001, ^**** P≤0.0001).
도 2는 WT 및 Sl7-DR2 녹-아웃 돌연변이체 계통에서 SGAs 및 콜레스테롤의 위치화 및 정량적 비교, 및 Sl7-DR2 녹-아웃에서 UV-B 복사에 의한 7-DHC의 비타민 D₃로의 전환을 보여준다.
a, 7-DHC (m/z　367.33), 및 이의 레이저-유도 유도체 이온 (m/z　365.32), 콜레스테롤 (m/z　369.35) 및 α-토마틴 (m/z　1,034.55)의 MALDI 이미지. 스케일 바, 2 mm. HotMetal2 색상 스케일은 전체 이온 전류-정규화 세기의 범위를 나타낸다. 야생형 및 돌연변이체 샘플에 대해 동일한 대사산물은 동일한 스케일 세기로 표시된다. 잠재적으로 상이한 이온화 효율로 인해 MALDI 이미지를 사용하여 다양한 대사산물의 상대 존재비 (relative abundance)를 비교하는 것은 간단하지 않다.　b, 야생형 및 Sl7-DR2-녹아웃 계통의 잎들의 α-토마틴 함량 (평균 ± s.e.m,　각 계통에 대해 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 잎 샘플).　c, 야생형 및 Sl7-DR2-녹아웃 계통의 적색-숙성 (채색기 후 7일) 과실의 상대 에스쿨레오시드 A (esculeoside A) 함량 (평균 ± s.e.m). 좌측에서 우측으로: n = 6, 6, 5, 8, 10 및 10개의 생물학적으로 독립적인 과실 샘플.　d, 야생형 및 Sl7-DR2-녹아웃 계통의 잎 중 콜레스테롤 함량 (평균 ± s.e.m). 좌측에서 우측으로, n = 4, 5, 5, 4, 5 및 4개의 생물학적으로 독립적인 잎 샘플. e, 대조군 및 UVB-처리된 잎 또는 과실에서 7-DHC 및 비타민 D₃ 함량 (평균 ± s.e.m, 대조군 및 MUT#2의 각 단계에서 n = 4개의 생물학적으로 독립적인 잎 또는 과실 샘플). Mut#2의 조직을 UVB 광으로 1시간 동안 조사하였다. 실험은 3회 반복하였다. ND, 검출되지 않음. WT 및 돌연변이체 값들 간의 통계적 유의성 (b-d), 및 대조군 및 UVB-처리 조직 간의 통계적 유의성 (e)은 two-tailed　t-테스트를 사용하여 평가하였다 (^* P≤0.05, ^** P≤0.01, ^*** P≤0.001, ^**** P≤0.0001).
도 3은 WT 및 Sl7-DR2 녹-아웃 식물의 비교를 보여준다.
a 야생형 및 Sl7-DR2 돌연변이체의 성체 식물 (Adult plants). 스케일 바, 20 cm. b 야생형 및 Sl7-DR2 녹 아웃 계통 유래의 잎 중 스티그마스테롤 (Stigmasterol) 함량 (평균 ± s.e.m, n=3). WT 및 돌연변이체 간의 통계적 유의성은 two-tailed t-테스트를 사용하여 평가하였다. 유의미한 차이가 검출되지 않았다. 해당하는 경우 P 값에 대한 소스 데이터 (source data)를 참조한다. c 7-데하이드로콜레스테롤 (m/z 367.33) 및 이의 레이저-유도 유도체 이온 (m/z 365.32, m/z 363.31), 콜레스테롤 (m/z 369.35) 및 α-토마틴 (m/z 1034.55)의 MALDI 이미지. 스케일 바, 2 mm. HotMetal2 색상 스케일은 전체 이온 전류 (TIC)-정규화 세기의 범위를 나타낸다. 야생형 및 돌연변이체 샘플에 대해 동일한 대사산물은 동일한 스케일 세기로 표시된다. 상세한 내용은 온라인 방법을 통해 확인할 수 있다. d 야생형 및 Sl7-DR2 녹아웃 계통의 미성숙 녹색 과실 중 α-토마틴 함량 (평균 ± s.e.m,　n = 3).　WT 및 돌연변이체 간의 통계적 유의성은 two-tailed t-테스트를 사용하여 평가하였다 (^*P≤0.05, ^**P≤0.01). 해당하는 경우 P 값에 대한 소스 데이터를 참조한다. e 과실 숙성기 (IMG, 미성숙 녹색; MG, 성숙 녹색; B, 채색기; B + 7, 채색기 후 7일) 중에 야생형 (WT) 및 Sl7-DR2 녹 아웃 토마토 과실 중 콜레스테롤 함량 (평균 ± s.e.m). 좌측에서 우측으로, n = 14, 19, 16, 15, 16, 14, 13, 11, 18, 13, 10, 15, 15, 14, 17, 11, 11, 15, 9, 17, 14, 17, 15, 및 15. WT 및 돌연변이체 간의 통계적 유의성은 two-tailed t-테스트를 사용하여 평가하였다 (^*P≤0.05, ^**P≤0.01, ^***P≤0.001, ^****P≤0.0001). 해당하는 경우 P 값에 대한 소스 데이터를 참조한다.
도 4는 WT 및 Sl7-DR2 녹-아웃 식물의 추가 비교를 보여준다.
a 야생형 및 Sl7-DR2 돌연변이체의 잎에서 콜레스테롤 및 피토스테롤 생합성 경로들에서 유전자의 상대 발현 수준 (평균 ± s.e.m). SlActin을 내부 표준물질로서 사용하였다. WT, n=5; Sl7-DR2 KO, n=15 (Sl7-DR2에서 동일한 돌연변이를 보유하는 각 Mut#1, Mut#2 및 Mut#3의 5개 샘플들의 조합). b 야생형 및 Sl7-DR2 돌연변이체의 잎에서 SlC5-SD1의 상대 발현 수준. SlActin을 내부 표준물질로서 사용하였다 (평균 ± s.e.m, n=5). WT 및 돌연변이체 간의 통계적 유의성은 two-tailed t-테스트를 사용하여 평가하였다 (^*P≤0.05, ^**P≤0.01). 해당하는 경우 P 값에 대한 소스 데이터를 참조한다. c 분석된 샘플 및 해당 인증 표준물질로부터 7-데하이드로콜레스테롤 (7-DHC), 비타민 D3 및 콜레스테롤의 대표적인 LC-MS 스펙트럼. d 2시간의 UV 복사가 존재하는 경우 및 이의 부재의 경우에 따른 Mut#1 잎 조직 추출물 (각각 연청색 및 검정색으로 표시), 및 표준 믹스 (10 μM의 7-DHC, 비타민 D3 및 콜레스테롤)의 오버레이 크로마토그램, m/z=385.3442-385.3480. UV 조사한 샘플에서는 비타민 D3가 많이 생성되었다.

발명의 상세한 설명

본 발명을 더욱 상세하게 설명할 것이다. 하기 구절에서, 본 발명의 다양한 양상들이 더 상세하게 정의된다. 이렇게 정의된 각 양상은 달리 명백하게 지시하지 않는 한 임의의 다른 양상 또는 양상들과 조합될 수 있다. 구체적으로, 바람직하거나 또는 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 또는 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.

본 발명의 실시는 달리 명시하지 않는 한, 당해 분야의 기술 내에 있는 식물학, 미생물학, 조직 배양, 분자 생물학, 화학, 생화학 및 재조합 DNA 기술, 생물정보학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에 상세히 설명되어 있다.

본 발명의 목적을 위해, "유전자 변경된 (genetically altered)" 또는 "돌연변이체 (mutant)" 식물은 자연 발생 야생형 (WT) 식물과 비교하여 유전자 변경된 식물이다. 일 구체예에서, 돌연변이체 식물은 자연 발생 야생형 (WT) 식물과 비교하여 돌연변이유발 방법, 예컨대 본원에 기재된 돌연변이유발 방법을 사용하여 변경된 식물이다. 일 구체예에서, 상기 돌연변이유발 방법은 표적화된 게놈 변형 또는 게놈 편집이었다. 표적화된 게놈 변형 또는 표적화된 게놈 편집은 상동성 재조합 (HR)-매개 재조합 이벤트를 통해 게놈 편집을 자극하기 위해 표적화된 DNA 이중가닥 절단 (double-strand breaks: DSBs)을 사용하는 게놈 조작 기술이다. 일 구체예에서, 돌연변이는 ZFNs, TALENs 또는 CRISPR를 사용하여 도입된다. 바람직한 일 구체예에서, 표적화된 게놈 편집 기술은 CRISPR이다. 게놈 편집에서 이러한 기술의 사용은 당해 기술 분야, 예를 들어 US 8,697,359 및 여기에 인용된 참고문헌에 잘 설명되어 있다.

또 다른 구체예에서, 통상적인 돌연변이유발 기술, 예컨대 T-DNA 삽입 돌연변이유발 또는 임의의 알려진 물리적 또는 화학적 돌연변이유발원이 본원에 기재된 유전자를 파괴하는데 사용될 수 있다. 추가적 일례에서, 하나 이상의 유전자의 발현은 당업자에게 알려진 유전자 침묵화 방법의 사용, 예컨대 하나 이상의 유전자에 대한 작은 간섭 핵산 (small interfering nucleic acids: siNAs)을 사용하여 전사 또는 번역 수준에서 감소시킬 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 siNA는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), antagomirs 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 포함할 수 있다.

일례에서, 돌연변이를 사용하여 네이티브 7-DR 유전자 (바람직하게는 Sl7-DR2 유전자)의 발현을 녹다운 (knock down)하거나 또는 녹아웃 (knock out)할 수 있다. 그러므로, 이 예에서, 식물에서 7-DHC의 생산은 변경된 식물 게놈의 존재에 의해 부여되며, 식물에서 발현된 이식유전자의 존재에 의해 부여되는 것은 아니다. 즉, 유전자 변경된 식물은 이식유전자가 없는 것으로 설명될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 대안적인 일 구체예에서, 유전자 변경된 식물은 유전자이식 식물일 수 있다.

본원에서 사용된, 용어 "식물 (plant)"은 식물 전체, 식물의 자손, 및 종자, 과실, 싹, 줄기, 잎, 뿌리 (괴경 포함), 꽃, 조직 및 기관을 포함하는 식물 일부를 포함한다. 용어 "식물"은 또한 식물 세포, 현탁 배양물, 캘러스 조직, 배아, 분열조직 영역, 배우체, 포자체, 화분 및 소포자를 포함한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 본 발명의 식물의 수확 가능한 부분으로 확장되고, 종자, 잎, 과실, 꽃, 줄기, 뿌리, 뿌리줄기, 괴경 및 구근으로 확장되지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 양상은 또한 건조 펠렛 또는 분말, 오일, 지방 및 지방산, 전분 또는 단백질과 같은, 이러한 식물의 수확 가능한 부분으로부터 유래된, 바람직하게는 직접 유래된 산물까지 확장된다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 식물 또는 이의 일부로부터 유래된 제품, 더 바람직하게는 식품에 관한 것이다.

가장 바람직한 일 구체예에서, 상기 식물 일부 또는 수확 가능한 산물은 과실이다. 그러므로, 본 발명의 추가 일 양상에서, 본원에 기재된 식물로부터 생산된 과실이 제공된다.

대안적인 일 구체예에서, 상기 식물 일부는 본원에 기재된 유전자 변경된 식물의 화분, 번식체 또는 자손이다. 따라서, 본 발명의 추가 일 양상에서, 본원에 기재된 식물로부터 생산된 화분, 번식체 또는 자손이 제공된다.

본 발명의 모든 양상에 따라 본원에서 사용된 대조 식물은 본 발명의 방법에 따라 변형되지 않은 식물이다. 일 구체예에서, 상기 대조 식물은 야생형 식물이다. 상기 대조 식물은 전형적으로 동일한 식물 종이고, 바람직하게는 변형된 식물과 동일한 유전자 배경을 갖는 식물이다.

본원에서 "Sl7-DR2" (예: Sl7-DR2 유전자 또는 Sl7-DR2 효소)에 대한 언급이 있는 경우, 이는 본원에 기재된 특정 토마토 이소형뿐만 아니라 다른 식물의 호모로그 및 오르토로그를 포함하는 것으로 의도된다. 당업자는 서열 비교 및 보존된 도메인의 확인에 의해 적합한 호모로그를 확인할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 서열을 확인하는데 사용될 수 있는 예측변수가 당해 기술 분야에 존재한다. 호모로그의 기능은 당해 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 따라서 상동성 서열이 확인되면 서열 정렬을 수행함으로써 상동성 위치를 결정할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열은 또한 다른 식물에서 본 발명을 수행하는데 적용될 수 있다.

본원에 언급된 용어 "도입 (introduction)", "형질감염 (transfection)" 또는 "형질전환 (transformation)"은 전달에 사용된 방법에 관계없이, 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 구조체 (예: 본원에 기재된 핵산 구조체 또는 게놈 편집 구조체)를 숙주 세포 내로 전달하는 것을 포함한다. 기관발생 (organogenesis) 또는 배아발생 (embryogenesis)에 의해 후속 클론 증식이 가능한 식물 조직은 유전자 구조체로 형질전환되고, 그로부터 식물 전체가 재생될 수 있다. 선택된 특정 조직은 형질전환되는 특정 종에 대해 이용 가능하고, 이에 가장 적합한 클론 증식 시스템에 따라 달라질 것이다. 예시되는 조직 표적에는 잎 디스크, 화분, 배아, 자엽, 배축, 거대배우체, 캘러스 조직, 기존 분열 조직 (예: 정단 분열조직, 액아 및 뿌리 분열조직), 및 유도된 분열 조직 (예: 자엽 분열조직 및 배축 분열조직)을 포함한다. 그 다음에 생성된 형질전환된 식물 세포를 사용하여 당업자에게 알려진 방식으로 형질전환된 식물을 재생할 수 있다.

식물의 형질전환은 이제 많은 종들에서 통상적인 기술이 되었다. 당업자에게 알려진 임의의 여러 형질전환 방법을 사용하여 관심 있는 하나 이상의 게놈 편집 구조체를 적합한 전구 세포 (ancestor cell)에 도입할 수 있다. 식물 조직 또는 식물 세포로부터 식물의 형질전환 및 재생에 대해 설명된 방법은 일시적 또는 안정적인 형질전환을 위해 활용될 수 있다.

형질전환 방법에는 리포솜, 전기천공, 유리 DNA 흡수를 증가시키는 화학물질, DNA를 식물에 직접 주입 (미세주입), 유전자 총 (또는 바이오리스틱 입자 전달 시스템 (biolistic particle delivery systems)), 리포펙션, 바이러스 또는 화분을 사용한 형질전환, 및 마이크로프로젝션 (microprojection)의 사용을 포함한다. 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 초음파-매개 유전자 형질감염, 광학 또는 레이저 형질감염, 탄화규소 섬유를 사용한 형질감염, 원형질체의 전기천공, 식물 물질로의 미세주입, DNA 또는 RNA-코팅 입자 충격, (비-통합) 바이러스를 사용한 감염 등과 같은 방법으로부터 선택될 수 있다. 유전자이식 식물은 또한 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 매개 형질전환을 통해 생산될 수 있다.

선택적으로, 형질전환된 식물을 선택하기 위해, 일반적으로 형질전환에서 수득된 식물 물질을 선택 조건에 적용하여 형질전환된 식물이 비형질전환된 식물과 구별될 수 있도록 한다. 예를 들어, 종자를 심고, 초기 성장 기간 후에, 분무를 통해 적합한 선택을 수행할 수 있다. 추가 가능성은 형질전환된 종자만이 식물로 성장할 수 있도록 적절한 선택제를 사용하여 적절한 경우 멸균 후 아가 플레이트에서 종자를 성장시키는 것이다. 대안적으로, 어떤 선택도 수행하지 않고, 종자를 심고, 성장시키며, Sl7-DR2 활성 수준 또는 7-DHC 수준을 적절한 시기에 당해 기술 분야의 표준 기술을 사용하여 측정한다. 이식유전자의 도입을 피하는 이러한 대안은 이식유전자가 없는 식물을 생산하는데 바람직하다.

DNA 전달 및 재생 후에, 추정적으로 형질전환된 식물은 또한 예를 들어 관심 돌연변이의 존재, 카피 수 및/또는 게놈 조직을 검출하기 위해 PCR을 사용하여 평가할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 새로 도입된 DNA의 통합 및 발현 수준은 Southern, Northern 및/또는 Western 분석을 사용하여 모니터링할 수 있으며, 모든 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.

상기 방법은 바람직하게는 추가 증식을 위해 하나 이상의 돌연변이된 식물을 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 선택된 식물은 클론 증식 또는 고전적 재배 기술과 같은 다양한 수단에 의해 증식될 수 있다. 예를 들어, 1세대 (또는 T1) 형질전환된 식물이 자가수정되고, 동형접합인 2세대 (또는 T2) 형질전환체가 선택된 다음에, 상기 T2 식물은 고전적 재배 기술을 통해 추가로 증식될 수 있다. 생성된 형질전환된 유기체는 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 이들은 형질전환된 세포 및 비형질전환된 세포의 키메라; 클론 형질전환체 (예: 발현 카세트를 함유하도록 형질전환된 모든 세포); 형질전환된 조직 및 비형질전환된 조직의 그래프트 (예: 식물의 경우, 형질전환된 근경의 비형질전환된 접순에의 그래프트)일 수 있다.

실시예

프로비타민 D₃/7-DHC가 토마토 잎에서 확인되었지만, 이는 녹색 과실에서의 토마틴 및 숙성 과실에서의 에스쿨레오시드와 같은 SGAs의 형성에서 중간체로서 역할을 하는 과실에서는 일반적으로 축적되지 않는다¹⁶. 최근에는 피토스테롤 및 브라시노스테로이드 생합성을 담당하는 일부 효소의 특정 이소형을 갖는 중복 경로가 SGAs의 형성을 위한 콜레스테롤을 생산하고, 토마토를 포함한 가지과 종에서 작동하는 것으로 밝혀졌다 (ref.¹⁷, 도 1의 a). 가지과 식물에서 스테롤 및 콜레스테롤 생합성의 이러한 부분적 분리는 중요한 호르몬 (브라시노스테로이드), 및 살진균, 항미생물, 및 살충 특성을 가진 보다 특수한 스트레스 화학물질인 SGAs의 합성을 위한 대사 유연성을 가능하게 한다. 토마토에서 콜레스테롤 및 SGA 생합성에 대한 이러한 '중복' 경로의 존재는 프로비타민 D₃/7-DHC의 조작을 비교적 간단하게 만든다. 7-데하이드로콜레스테롤 리덕타제 (Sl7-DR2)의 특정 이소형은 프로비타민 D₃/7-DHC를 콜레스테롤로 전환하여 잎 및 과실에서 토마틴을 합성한다 (도 1의 a). 결과적으로, 토마토에서 Sl7-DR2의 활성을 억제하면 피토스테롤 및 브라시노스테로이드 생합성에 아무런 영향을 주지 않고 7-DHC가 축적될 수 있다. 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 Sl7-DR2의 녹아웃을 형성하여 토마토에서 7-DHC 수준 증가에 대한 Sl7-DR2 활성을 차단하는 효능을 테스트하였다. 2개의 sgRNAs를 Sl7-DR2 단백질을 코딩하는 유전자의 제2 엑손 내의 서열에 대해 디자인하였고 (도 1의 b), 여기서 sgRNAs 및 Sl7-DR1 유전자 간의 임의의 상동성을 최소화하도록 주의해야 한다. 본 발명자들은 T1 세대 내에서 Sl7-DR2 유전자의 5개의 독립적 녹아웃 대립유전자를 회수하였고, 이 중 3개는 2개의 sgRNAs 간에 엑손 2 서열 108 bp의 동일한 결실을 수행하였다. 2개의 다른 녹-아웃 대립유전자는 1 bp의 삽입과 2 bp의 결실, 또는 제2 엑손에서 1 bp 만의 삽입에 의해 형성하였고, 이들 모두 프레임 이동을 유발하고, Sl7-DR2 단백질의 조기 종료를 예측하였다 (도 1의 b). 동형접합 녹-아웃 대립유전자는 T1 세대에서 회수되었고, Cas 9 유전자를 운반하는 T-DNA 및 sgRNA 서열이 결여된 동형접합 녹-아웃 계통은 T2 세대 내의 5개의 계통들 중 4개에 대해 회수하였다.

분리 후에 T2 세대에서 독립적으로 유래된 Sl7-DR2의 동형접합 녹-아웃 대립유전자 5개 (4개는 CRISPR/Cas9 T-DNA가 결여됨)를 선택하였다. 이들 돌연변이체 계통에서 7-DR1 유전자의 오프-타겟 편집 (off-target edits)이 검출되지 않았다. 다양한 숙성 단계에서의 과실 및 잎에서 7-DHC 함량뿐만 아니라, 다른 피토스테롤, 콜레스테롤 및 SGAs의 수준을 분석하였다. 편집 및 대조 야생형 토마토 식물의 스테롤 및 프로비타민 D₃ 프로파일은 LC-MS를 사용하여 결정하였다^16,18.

Sl7-DR2 활성의 손실은 토마토 계통의 성장 또는 발달에 영향을 미치지 않았다 (도 3의 a). 이는 브라시노스테로이드 생합성의 억제로 인해 왜소해진 애기장대 (Arabidopsis) (DWARF5)에서 피토스테롤 생합성에 관여하는 동등한 유전자의 기능 상실 돌연변이의 표현형과 대조된다¹⁹. 피토스테롤 대사작용에 대한 Sl7-DR2에서의 돌연변이 효과의 결여는 야생형 및 편집된 계통의 잎들에서, 토마토에서 피토스테롤 경로의 최종 산물인 스티그마스테롤의 수준들을 비교함으로써 확인하였다 (도 3의 b). 야생형 대조 식물에서, 7-DHC는 미성숙 녹색 과실에서만 검출되었으며, 숙성 중인 과실 및 숙성 과실에서는 검출되지 않았다. 대조적으로, Sl7-DR2 활성의 상실은 잎 및 녹색 과실에서 프로비타민 D₃/7-DHC 수준의 실질적 증가를 초래하였다 (도 1의 c 및 d). 7-DHC의 수준은 Sl7-DR2 돌연변이체의 숙성 과실에서 더 낮았지만, 비타민 D₃로 비례적으로 전환할 경우 (예: UV-B 광으로 처리하여) 1개 또는 2개의 토마토를 섭취함으로써 보충제용 RDA (1일 10 μg)에 해당하는 양의 비타민 D₃를 수득할 수 있을 정도로 충분히 높았다. 7-DHC 수준이 저하되는 노인의 경우, 프로비타민 D₃/7-DHC로 바이오 강화된 과실을 섭취하면 이들의 결핍을 해결할 수 있다.

MALDI-이미지에서는 프로비타민 D₃/7-DHC의 증가가 토마토 과육 및 껍질 모두에 분포되어 있었음을 보여주었다 (도 2의 a, 도 3의 c). 토마틴 및 데하이드로토마틴은 과실 숙성 중에 에스쿨레오시드 A 및 B로 분해되며, 이는 숙성 과실에서 토마틴이 낮은 수준으로 감소한다는 것을 의미한다²⁰. 돌연변이체 및 야생형 녹색 과실의 MALDI-이미지에서는 α-토마틴이 대조군에서보다 Sl7-DR2 돌연변이체에서 더 낮은 것을 보여주었고 (도 2의 a, 도 3의 c, d), 잎 분석에서는 α-토마틴이 제거되지는 않았지만 돌연변이체에서 실질적으로 더 낮은 수준을 나타내었다 (도 2의 b). SGA인, 에스쿨레오시드 A 수준의 강력한 감소가 또한 대조 계통과 비교하여 돌연변이체의 숙성 과실에서 관찰되었다 (도 2의 c). SGAs가 독성물질 (toxicants)/항영양물질 (antinutritionals)인 것으로 보고되었으며 소비자에게 알레르기를 일으킬 수 있기 때문에 이들의 감소는 유익한 것으로 간주될 수 있다. 흥미롭게도, 잎 또는 과실에서 콜레스테롤 수준은 대조군과 비교하여 강하하지 않았으며, 대부분의 돌연변이체 계통에서 콜레스테롤 수준은 과실 (도 2의 a, 도 3의 e) 및 잎 (도 2의 d) 모두에서 야생형 대조군에서보다 더 높았다. 이는 SGA 생합성 경로에 따른 플럭스 차단이 피토스테롤 경로 (또는 적어도 Sl7-DR1)의 효소에 의해 촉매되는 중간체의 플럭스 증가로 보완되어 콜레스테롤 생성을 보충하고, SGA 축적의 감소를 제한할 수 있음을 시사한다. 그러나, 이는 WT 및 돌연변이체 계통의 잎에서 이러한 유전자들의 qRT-PCR 분석에 의해 나타낸 바와 같이 각 경로에서 효소를 코딩하는 유전자의 발현에 보상적인 변화를 수반하지 않는다 (도 4의 a). 야생형과 비교하여 돌연변이체에서 전사체 수준에서 일관된 변화를 보인 유일한 유전자는 피토스테롤 경로에서 SlC5-SD1이었고, 이는 대조군에서보다 약 30% 만큼 일관되게 더 낮은 전사체 수준을 보여주었다. (도 1의 a, 도 4의 b).

Sl7-DR2 돌연변이체 식물에서 7-DHC 수준의 상승이 비타민 D₃로 전환될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 Japelt 등에 의해 설명된 바와 같이 잎 및 슬라이스된 과실을 UV-B 광으로 1시간 조사하여 처리하였다¹⁸. 잎의 처리는 이러한 전환에 매우 효과적이어서 건조 중량 1 g당 거의 200 μg의 비타민 D₃를 생산하였다 (도 2의 e). 녹색 과실로부터 비타민 D₃의 수득율은 건조 중량 1 g당 약 0.3 μg으로 더 낮았으며, 적색 과실의 경우 건조 중량 1 g당 평균 약 0.2 μg으로 더 낮았다. 과실에서 이러한 더 낮은 값은 녹색 과실 및 적색 숙성 과실에서 7-DHC 전구체 함량이 잎과 비교하여 저하되었음을 반영하였다 (도 2의 e). 그러나, 중간-크기 토마토의 건조 중량이 약 8-10 g이라는 점을 고려하면, 단일 Sl7-DR2 돌연변이체에서 달성할 수 있는 비타민 D₃ 수준은 미국 및 유럽 국가의 RDA (1일 10-15 μg)에 대해 녹색 과실의 경우 30%, 적색 과실의 경우 20%에 가깝다. 명확하게, 숙성 과실에서 7-DHC 수준을 추가로 상승시키는 것이 바람직할 것이다. 토마토를 일광-건조시킴으로써 프로비타민 D₃의 비타민 D₃으로의 전환이 증진될 수 있다.

콜레스테롤/SGA 생합성을 위한 중복 경로는 가지 (Solanum melongena), 감자 (Solanum tuberosum) 및 고추 (Capsicum annuum)를 포함하여, 가지과의 다른 식량 작물에 존재한다¹⁷. 토마토의 잎 및 녹색 과실에서 콜레스테롤/SGA 생합성, 7-DHC 축적 및 광합성 사이의 밀접한 연관성 (도 1의 c-d, 도 2의 b-d, 도 3의 d-e)은 과실을 먹는 경우 녹색일 수 있는 고추에서 Sl7-DR2 활성의 녹-아웃이 비타민 D₃에 있어서 식물성 식품의 바이오 강화에 효과적인 추가 경로를 제공할 수 있음을 시사한다. 또한, '핑크 토마토'의 스킨으로부터 UV-보호 플라보놀의 손실을 유발하는 토마토의 y 돌연변이와 같은, 신선한 과일에 UV-B 광의 투과를 증가시키는 돌연변이가 또한 UV-B 노출 후에 프로비타민 D₃의 비타민 D₃로의 전환을 증가시킬 수 있다. 이러한 축적은 추가 유전자-편집 또는 유전자이입을 통해 달성될 수 있다²¹. 신선한 과실에 비타민 D₃를 강화하는 것에 추가하여, Sl7-DR2 돌연변이체의 잎은 프로비타민 D₃의 풍부한 공급원이므로, 토마토 재배로부터 나오는 식물성 폐기물을 사용하여 식물 유래 비타민 D₃ 보충제를 제조하는데 중요한 새로운 공급 원료를 제공할 수 있고, 이는 비건 (vegans)에게 적합할 수 있다.

방법

식물 물질

토마토 (Solanum lycopersicum) cv. Money Maker 식물 및 Sl7-DR 2 녹-아웃 돌연변이체를 John Innes Centre (Norwich, UK)의 온실에서 평균 주위 온도 20℃ 내지 22℃에서 재배하였다. 필요한 경우 매일 16시간의 광을 유지할 수 있도록 보조 조명을 이용할 수 있었다.

플라스미드 제작

Sl7-DR2 (Solyc06g074090) 유전자의 엑손 2에 존재하는 2개의 특정 표적 서열 (도 1의 b)을 선택하여 Sl7-DR2 녹-아웃 돌연변이체를 생성하였다. 이들을 PCR에 의해 sgRNA 스캐폴드에 도입하였다. sgRNA 발현 카세트를 제조하기 위해, 각 sgRNA 앰플리콘 및 합성된 U6-III 프로모터 (pICSL90001)를 GoldenGate Level 1 수용체 (pICH47732 및 pICH47742)에 클로닝하였다. Cas9 발현 카세트 및 카나마이신 내성 (nptII) 발현 카세트를 함유하는 Level 2 binary 벡터인, pICSL002203을 Sl7-DR2 CRISPR/Cas9 구조체를 생성하기 위한 목적 벡터 (destination vector)로서 사용하였다. 플라스미드들 pICSL90001, pICH47732, pICH47742 및 pICSL002203은 The Sainsbury Laboratory (TSL) SynBio 그룹 (http://synbio.tsl.ac.uk/)에서 친절하게 제공하였다. sgRNA 효율은 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes) (균주 ArATCC15834)를 사용하여 토마토를 공동-형질전환하여 테스트하였다²². Sl7-DR2의 엑손 2의 서열은 제조자의 지침 (Thermo Fisher Scientific)에 따라 sgRNA 표적 서열 서열번호: 1 (F: TGTTTCACTGGGCTGGTTTAGC 및 서열번호: 2R: GAGAAGTCTTTCACCATGTCACGA)이 플랭킹된 프라이머를 사용하여 Phire Plant Direct PCR 마스터 믹스로 모근 (hairy roots)으로부터 직접 PCR로 증폭하였다.

토마토 안정한 형질전환

Sl7-DR2 CRISPR/Cas9 구조체를 안정한 형질전환을 위해 아그로박테리움 투메파시엔스 (균주 AGL1)로 형질전환하였고, 이는 이전에 Galdon-Armero et al. (2020)²³에 의해 보고된 바와 같이 표준 형질전환 프로토콜에 따라 떡잎 (cotyledons)을 초기 외식편으로 사용하여 수행하였다.

Sl7-DR2 녹 아웃 계통의 스크리닝

제조자의 지침에 따라, DNeasy® Plant 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 미세하게 분쇄된 잎 조직 분말로부터 DNA를 단리하였다. 5개의 독립적인 Sl7-DR2 녹 아웃 계통은 sgRNA 표적 서열 서열번호: 3 (F: TGTTTCACTGGGCTGGTTTAGC 및 서열번호: 4 R: GAGAAGTCTTTCACCATGTCACGA)이 플랭킹된 프라이머로 유전자형을 분석하여 수득하였고, 시퀀싱 분석으로 확인하였다.

정량적 실시간 PCR 분석

Trizol 방법 (Sigma-Aldrich)을 사용하여 토마토 잎 조직으로부터 전체 RNA를 추출하였다. DNase I (Roche)-처리된 RNA를 SuperScript^TM III (Invitrogen)를 사용하여 역전사하였다. SYBR® Green JumpStart^TM Taq ReadyMix^TM (Sigma)는 X96 Touch^TM Real-Time PCR 검출 시스템 (Biorad)을 사용하여 모든 RT-qPCR 반응을 수행하는데 사용하였다. 데이터는 CFX Maestro 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. SlActin (Solyc03g078400)을 하우스-키핑 참조 유전자로서 선택하였다. 유전자의 상대 발현은 ΔCt 방법으로 계산하였다. 유전자-특이적 프라이머는 하기 표에 열거된, NCBI 프라이머 BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용하여 디자인하였다.

MALDI 이미지 분석

과실의 동결-절편을 Dong et al. (2020)²⁴에 의해 이미 설명된 바와 같이 수행하였다. 신선한 미성숙 녹색 과실 (개화 후 약 16일)를 액체 질소에서 급속-냉동시킨 다음에, 드라이 아이스 상의 평면 금속 홀더에 M1 임베딩 매트릭스 (Thermo Scientific)에 포매하였다. 포매된 조직을 CryoStar NX70 Microtome (Thermo Scientific)으로 전달하고, -18℃에서 적어도 3시간 동안 열 평형을 유지하였다. 상기 조직을 35 μm 두께 절편으로 절단하고, Superfrost Plus 슬라이드 (Thermo Scientific)에서 해동시킨 후에, 데시케이터 (desiccator)에서 진공 건조하였다.

광학 이미지는 Canon MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo 렌즈를 구비한 Canon 5D Mark IV 카메라 (Canon Inc, Ota, Tokyo, Japan)를 1:1 비율로 사용하여 촬영하였다. 이미지 raw 파일은 Capture One photo 에디팅 소프트웨어 (Capture One, Frederiksberg, Denmark)를 사용하여 처리하였다.

절편들은 약 3 μg mm^-2의 밀도로 80% 메탄올/0.05% TFA 중 10 mg ml^-1의 DHB 용액으로 SunCollect MALDI 스프레이어 (SunChrome, Friedrichsdorf, Germany)를 사용하여 2,5-디하이드록시벤조산 매트릭스 (DHB)로 커버하였다.

MALDI 이미징은 355 nm에서 작동하는 2.5 kHz Nd:YAG 레이저가 장착된 MALDI 광원 (Waters, Wilmslow, UK)을 갖춘 Synapt G2-Si 질량 분광분석기로 수행하였다. 상기 슬라이드를 기기 금속 홀더에 고정하고, 평판 스캐너 (flat-bed scanner, Canon)로 스캔하였다. 상기 이미지는 하기 파라미터를 사용하여 HDImaging 소프트웨어 버전 1.4 (Waters)에서 패턴 파일 및 수집 방법을 생성하는데 사용하였다: 전체 절편 면적 약 400 mm², 낮은 설정 (60 μm)에서 레이저 빔 직경, 105 μm 스텝 크기, 절편당 약 36k 픽셀, MALDI-MS 포지티브 감도 모드, m/z 50-1200, 스캔 시간 0.5초, 레이저 반복 속도 1 kHz, 레이저 에너지 200. 이온 이동도 (ion mobility) 측정의 경우, 하기 추가 조정 페이지 설정과 함께 MALDI-HDMS 모드에서 동일한 파라미터를 사용하였다: 트랩 DC 바이어스 (Trap DC Bias): 45.0, 전달 웨이브 속도 (Transfer Wave Velocity) (m/s): 315, IMS 웨이브 높이 (IMS Wave Height) (V): 40.0, 선형 램프로 가능한 가변 웨이브 속도 (Variable Wave Velocity Enabled with linear ramp), 웨이브 속도 시작 (Wave Velocity Start) (m/s): 1500.0, 웨이브 속도 종료 (Wave Velocity End) (m/s): 200.0. 적인 클러스터 (red phosphorous clusters)를 기기 보정 (instrument calibration) 및 잠금 질량 보정 (lock mass correction)에 사용하였다. 전체 절편의 총 스캔 시간은 10-12시간이었고, 잠금 질량은 10분마다 2초 동안 획득하였다.

상기 MS raw 파일은 하기 파라미터로 HDI1.4에서 처리하였다: 2000개의 가장 풍부한 피크 검출, m/z 윈도우 0.05, MS 분해능 10,000, 잠금 질량 526.554 (적인 클러스터). 처리된 데이터는 HDI1.4에 로딩하고, 전체 이온 함량 (TIC)으로 정규화하였다. 이미지는 HotMetal2 색상 스케일을 사용하여 생성하였고, png 이미지 파일로 내보냈다. 평균 스펙트럼의 비교 및 생성을 위해, MS raw 데이터를 imzml로 변환시키고, Scils Lab MVS 소프트웨어 버전 2021c Premium 3D (SCiLS, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)를 사용하여 분석하였다.

관심 화합물인 7-데하이드로콜레스테롤, 콜레스테롤 및 α-토마틴은 동일한 기기에서 분석된 실제 표준물질의 표류 시간 (drift time) 및 질량 (mass)을 비교하여 확인하였다. MALDI 중에 7-데하이드로콜레스테롤, 비타민 D₃ 및 콜레스테롤에 대해 검출된 질량은 하기 표에 열거하였다. 콜레스테롤은 MALDI-TOF 질량 분광분석 중에 레이저-유발 산화에 취약하고²⁵, 7-데하이드로콜레스테롤은 비-효소적 자동산화 경향이 훨씬 더 높은 것으로 보고되었다^26,27. MALDI 중에 생성된 표준물질의 피크들 중에서, 이들의 특이성 및 상대 존재비를 고려하여, 367.33, 365.32 및 363.31을 7-데하이드로콜레스테롤의 대표 질량으로 선택하였고, 369.35 및 1034.55를 각각 콜레스테롤 및 α-토마틴의 대표 질량으로 선택하였다.

^*cholcal: 콜레칼시페롤, 비타민 D₃; 7dh: 7-데하이드로콜레스테롤 (7-DHC); chol: 콜레스테롤.

스테롤 분석

스테롤 추출 및 분석 방법은 Jaepelt et al. (2011)¹⁶로부터 수정하였다. 동결-건조된 물질 (약 20 mg)을 칭량하여 2 mL 에펜도르프 튜브에 넣고, 100 μL의 60% 수산화칼륨 (Sigma-Aldrich), 500 μL의 96% 에탄올 (Sigma-Aldrich) 및 300 μL의 15% 아스코르브산 (Sigma-Aldrich)과 혼합하였다. 상기 튜브를 열진탕기 (Eppendorf)에서 22℃에서 약 18시간 동안 진탕하였다. 펜탄 중 20% 에틸 아세테이트 (v/v) (750 μL)를 부가하고, 플랫 진탕기에서 30분 동안 진탕한 후에, 실온에서 5분 동안 2000 x g로 원심분리하였다. 유기층을 새로운 2 ml 에펜도르프 튜브로 전달하였다. 추출 단계를 2회 반복하였다. 전체 추출물을 0.1 mol L^-1 염산 500 μL로 튜브를 30회 뒤집어서 세척하여 알칼리를 완전히 제거하였다. 1000 x g로 2분 동안 원심분리한 후에 2 mL 에펜도르프 튜브로 상부 층을 전달하였다. 'Very Low BP Mix' 프로그램에 따라 Genevac EZ-2 Elite 증발기를 사용하여 전체 추출물을 증발 건조시켰다. 잔류물을 최종적으로 200 μL 메탄올에 재용해시키고, 0.22 μm 나일론 Corning^® Costar^® Spin-X^® 튜브 필터 (Sigma-Aldrich)를 통해 여과하였다. 샘플은 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다.

스테롤 화합물을 동일한 기기에서 분석된 실제 표준물질의 체류 시간 및 질량 분광분석 스펙트럼을 비교하여 확인 및 정량화하였다: 7-데하이드로콜레스테롤, 비타민 D₃, 콜레스테롤, 스티그마스테롤 (Sigma-Aldrich). 액체 크로마토그래피 분석은 온도조절 컬럼 구획이 장착된 Dionex UltimMate (Thermo Fisher Scientific)에서 수행하였다. 크로마토그래피 분리는 50×2.1 mm 2.6 μ Kinetex F5 컬럼 (Phenomenex)에서 0.6 mL min^-1의 유속으로 수행하였다. 용매는 Milli-Q 물 중 0.2% 포름산 및 25% 아세토니트릴 (v/v) (A) 대 100% 메탄올 (B)이었다. 구배 프로그램은 하기와 같았다: 0.5분 동안 60% B, 7분 동안 85% B로 선형 구배, 0.5분 동안 100% B로 선형 구배, 1분 동안 등방성 용출, 다시 60% B로 0.5분 선형 구배 및 3.5분 동안 재평형화하여 총 실행 시간은 13분임. 상기 컬럼을 40℃로 유지하였다. 5 μL의 샘플을 주입하였다. 질량 분광분석은 대기압 화학 이온화 (atmospheric pressure chemical ionisation: APCI) 소스를 구비한 Q Exactive Orbitrap 질량 분광분석기 (Thermo Scientific)를 사용하여 수행하였다. 상기 MS는 m/z 180-2000의 70,000 해상도로 전체 스캔을 수집하도록 설정하였으며, 상위 4개 이온들의 데이터 의존적 MS2를 m/z 4.0의 단리 폭, 30% 정규화된 충돌 에너지에서 수집하도록 설정하였다. 그 다음에 이들 이온들은 다음으로 가장 풍부한 이온을 위해 5초 동안 무시하였고; 동위원소 피크를 또한 무시하였다. 데이터-의존적 MS2 분석은 17,500 해상도, 최대 이온 시간 50 msec, 자동 이득 제어 목표 (automatic gain control target) 1×105 이온으로 수행하였다. MS 스캔은 최대 이온 시간 50 msec, 자동 이득 제어 목표 3×106 이온이었다. 스프레이 챔버 조건은 231℃ 모세관 온도, 21.25 유닛의 차단 가스 (sheath gas), 5 유닛의 보조 가스 (aux gas), 예비 가스 (spare gas) 없음, 4 μA 전류, 363℃ 프로브 히터 온도, 및 50V S-렌즈 RF이었다. 기기 제어 및 데이터 수집에는 Xcalibur 소프트웨어 (version 4.3, Thermo Scientific)를 사용하였다.

SGA 분석

SGA 추출은 Itkin et al. (2011)²⁸이 설명한 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 동결-건조된 샘플 (잎 또는 과실) 20 mg을 100% 메탄올 1 mL에서 초음파 처리하고, 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 4000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상등액을 수집하고, 4000 rpm으로 3분간 원심분리하고, 0.22 μ 필터로 여과하였다. 샘플 추출물은 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다. α-토마틴은 체류 시간 및 질량 분광분석 스펙트럼을 실제 표준물질 (Sigma-Aldrich)과 비교하여 확인하고 정량화하였다. 에스쿨레오시드 A는 이전에 공개된 스펙트럼 및 상대 체류 시간과 비교한 질량 분광분석 스펙트럼에 기반하여 확인하였다 (Itkin et al. 2011).

크로마토그래피 분리는 50×2.1 mm 2.6 μ Kinetex EVO C18 컬럼 (Phenomenex)에서 0.6 mL min^-1의 유속으로 수행하였다. 용매는 Milli-Q 물 중 0.1% 포름산 (v/v) (A) 대 100% 아세토니트릴 (B)이었다. 구배 프로그램은 하기와 같았다: 4분 동안 2% B에서 40% B까지의 선형 구배, 그 다음에 2분 동안 95% B까지의 선형 구배, 1분 동안 등용매 용출 및 다시 2% B로의 0.1분 선형 구배, 및 2.1분 동안 재평형화하여 전체 실행 시간은 9.2분임. 전기분무 이온화 (ESI) 소스를 갖춘 Q Exactive Orbitrap 질량 분광분석기 (Thermo Scientific)를 사용하여 질량 분광분석을 수행하였다. 다른 모든 설정은 스테롤 분석에 대해 상기 설명한 것과 동일하였다.

UV 처리

UV 노출 전에 과실을 1 mm 슬라이스로 절단하였다. 잎 또는 과실 조직을 반전된 단파장 투과조명기 (inverted short wavelength transilluminator) 20 cm 아래에서 1시간 동안 UV-B 광 (3.2 mW cm^-2)에 노출시켰다. 하기 분석을 위해 처리 후에 샘플을 액체 질소에서 즉시 동결시켰다.

통계 분석

본 문서에서의 모든 실험은 독립적으로 적어도 3회 반복하였고, 대표적인 데이터 세트로부터의 결과를 제시한다. 모든 수치 값은 평균 ± s.e.m으로 표시된다. 통계 분석에는 GraphPad Prism (version 9.2.0)을 사용하였다. 야생형 및 돌연변이체 간의 통계적 차이는 two-tailed Student's t-테스트를 사용하여 수행하였다.

Claims

식물에서 7-데하이드로콜레스테롤 리덕타제 (7-dehydrocholesterol reductase: 7-DR)의 활성을 감소시키는 단계를 포함하는,
식물에서 프로비타민 D₃ (provitamin D₃) 수준을 개선하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 식물에서 7-DR 유전자에 의해 코딩되는 효소의 활성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 식물 게놈은 상기 7-DR 유전자의 중복 (duplication)을 포함하고, 상기 하나 이상의 돌연변이를 7-DR2 유전자에 도입하는 것인 방법.
청구항 2 또는 3에 있어서, 돌연변이체 식물을 재배하여 상기 돌연변이에 대한 동형접합 (homozygous) 식물을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
청구항 1에 있어서, 전사후 기술 (post-transcriptional technique)을 사용하여 효소 활성을 감소시키거나 또는 폐지하는 것인 방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 또는 상기 식물의 일부를 UV-B 복사에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 UV-B 광의 과실로의 침투를 증가시키는 돌연변이를 보유하는 것인 방법.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 또는 상기 식물의 일부를 가공하여 7-DHC 및/또는 비타민 D₃를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
유전자 변경된 식물 (genetically altered plant), 이의 일부 또는 식물 세포로서, 7-데하이드로콜레스테롤 리덕타제의 활성이 감소된 것인 유전자 변경된 식물, 이의 일부 또는 식물 세포.
청구항 9에 있어서, 7-DR 유전자에 기능 상실 돌연변이 (loss of function mutation)를 포함하는 것인 식물, 이의 일부 또는 식물 세포.
청구항 10에 있어서, 상기 기능 상실 돌연변이는 7-DR2 유전자에 존재하는 것인 식물, 이의 일부 또는 식물 세포.
청구항 1 내지 8 중 어느 한 항, 또는 청구항 9 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 가지과 (Solanaceae), 더 바람직하게는 가지속 (Solanum spp)의 구성원이고, 가장 바람직하게는 토마토 (Solanum lycopersicum), 감자 (Solanum tuberosum), 가지 (Solanum melongena)로부터 선택되는 것인 방법, 또는 식물, 이의 일부 또는 식물 세포.
청구항 9 내지 11 중 어느 한 항에 따른 식물 또는 식물 일부로부터 생산된 식품 (food product).