KR20240055728A - Retgc 유전자 요법 - Google Patents
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Abstract
본원은 망막 막 구아닐릴 시클라아제 1(RetGC1)의 발현을 위한 발현 작제물, 바이러스 게놈 및 벡터뿐만 아니라 본원에 개시된 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, GUCY2D 유전자의 하나 이상의 돌연변이와 관련된 망막 질환의 치료가 필요한 대상체에서 망막 질환을 치료하는 방법을 포함하여, 본원에 개시된 발현 작제물 및 벡터를 사용하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 개시된 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
Description
본 개시내용은 일반적으로 분자 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 망막 질환의 치료를 위한 유전자 요법용 조성물 및 방법을 제공한다.
망막 막 구아닐릴 시클라아제(RetGC)는 광수용체 외부 분절의 디스크 막에 위치하며 광수용체 생리학 내 주요 효소 중 하나로서 포유동물의 간상체와 원뿔체 내에서 광전환의 두 번째 메신저인 고리형 구아노신 모노포스페이트(cGMP)를 생산한다. 광수용체 여기 및 회복 동안 두 개의 RetGC 동위효소인 RetGC1 및 RetGC2(각각 GC-E 및 GC-F 또는 ROSGC1 및 ROSGC2라고도 함)는 구아닐릴 시클라아제 활성화 단백질(GCAP)에 의해 매개되는 칼슘 되먹임(feedback)에 의해 엄격하게 조절된다.
RetGC를 암호화하는 유전자인 GUCY2D 내 100개가 넘는 돌연변이는 상염색체 열성 레베르 선천성 흑암시 1형(arLCA 또는 LCA1) 또는 상염색체 우성 원뿔체-간상체 이영양증(adCRD)라는 두 개의 주요 질환을 유발하는 것으로 공지되어 있다. CRD에서 변성은 원뿔체에서 시작되고 영향을 받지 않은 망막의 황반 내에 원뿔체가 많이 존재하므로 중심 시야의 상실로 이어진다. 간상체의 변성이 원뿔체의 변성으로 이어질 시에 CRD는 완전한 실명으로 이어질 수 있다. LCA1 표현형은 훨씬 더 중증으로 생애 극 초기에 나타나는 광수용체 기능 상실 및 실명을 동반한다.
따라서, GUCY2D 돌연변이(LCA1 및 CRD를 포함하되 이에 국한되지 않음)와 관련된 망막 질환 치료를 위한 신규 요법이 시급히 필요하다.
일 양태에서, 본 개시내용은 (a) 광수용체 세포에서 발현을 부여하는 프로모터 서열 및 (b) 망막 막 구아닐릴 시클라아제 1(RetGC1)을 암호화하는 핵산 서열로서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물을 제공한다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 로돕신 키나아제(RK) 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7을 포함한다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8을 포함한다.
일 실시양태에서, 발현 작제물은 전사후 조절 요소를 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 전사후 조절은 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함한다. 일 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 10과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 10을 포함한다.
일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 RetGC1(GUCY2D) 유전자로부터의 코딩 서열(cds)이다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 코돈-최적화된 서열이다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13을 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 14와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 14를 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 12와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 단백질을 암호화한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 12를 포함하는 단백질을 암호화한다.
일 실시양태에서, 발현 작제물은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH-polyA) 신호를 포함한다. 일 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 11과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 11을 포함한다.
일부 실시양태에서, 발현 작제물은 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 작제물은 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본원에 개시된 발현 작제물을 포함하는 벡터가 제공된다. 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일 실시양태에서, 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터이다. 일 실시양태에서, 벡터는 AAV 혈청형 AAV2로부터 유래된 게놈을 포함한다. 일 실시양태에서, 벡터는 AAV7m8로부터 유래된 캡시드를 포함한다.
일 양태에서, 본원에 개시된 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 양태에서, 망막 질환의 치료가 필요한 대상체에서 망막 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 망막 질환은 GUCY2D 유전자 내 하나 이상의 돌연변이와 관련되고, 해당 방법은 본원에 개시된 벡터 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 망막 질환은 원뿔체-간상체 이영양증(CRD) 또는 레베르 선천성 흑암시 1형(LCA1)이다. 일 실시양태에서, 망막 질환은 LCA1이다.
일 양태에서, 간상체 cGMP 특이적 3',5'-고리형 포스포디에스테라제 서브유닛 β(PDE6β)의 발현 증가를 필요로 하는 대상체 내에서 간상체 cGMP 특이적 3',5'-고리형 포스포디에스테라제 서브유닛 β(PDE6β)의 발현을 증가시키는 방법이 제공되며, 해당 방법은 대상체에게 본원에 개시된 벡터 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 광수용체 내 고리형 구아노신 모노포스페이트(cGMP) 수준 증가를 필요로 하는 대상체 내에서 광수용체 내 고리형 구아노신 모노포스페이트(cGMP) 수준을 증가시키는 방법이 제공되며, 해당 방법은 대상체에게 본원에 개시된 벡터 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시양태에서, 벡터 또는 약학적 조성물은 안내 주사에 의해 투여된다. 실시양태에서, 벡터 또는 약학적 조성물은 대상체의 중심 망막에 주사된다.
도 1은 세포 층을 보여주는 인간 망막의 모식도이다.
도 2는 20주차의 야생형(WT) 및 RetGC KO iPSC 망막 오가노이드를 보여준다. 가장 윗줄은 WT와 RetGC KO 모두에서 주변 테두리에 외부 분절 '솔 가장자리'가 있는 전체 오가노이드를 보여주는 명시야 이미지이다. 가운데 줄. 원뿔체와 간상체 외부 및 내부 분절은 원뿔체 옵신과 로돕신으로 염색되어 있다. 외부(OPL) 및 내부 플렉시폼 층(IPL)의 시냅스는 Ribeye 및 VGlut로 염색한다. 양극성 및 아마크린/신경절 세포는 PKCa 및 칼레티닌으로 염색한다. RetGC는 WT에서 광수용체 외부 분절에 국소화되어 있고 RetGC KO 오가노이드에는 부재한다.
도 3은 40일차부터 220일차까지 대조군 및 RetGC KO 오가노이드(β 튜블린으로 정규화)의 전체 WT 및 RetGC KO 오가노이드의 총 단백질 발현(웨스턴 블롯)을 보여준다.
도 4는 AAV 7m8 캡시드에 패키징된 4개의 전이유전자 카세트의 설계를 보여준다. RK 및 CMV 프로모터는 WPRE 요소와 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH-polyA) 신호의 유무와 관계 없이 WT GUCY2D 유전자와 통합되어 있다.
도 5는 WT 및 형질 전환된 RetGC KO 오가노이드의 PDE6 염색 강도를 보여준다. 로돕신 및 PDE6β로 염색된 망막 오가노이드 외부 분절의 대표 이미지.
도 6은 로돕신 양성 외부 분절 내의 PDE6β염색 강도에 대한 정량적 면역형광을 보여준다. 각 점은 개별 오가노이드의 타일 스캔을 나타낸다. 염색 강도는 동일한 블록에서 처리, 염색 및 이미징된 WT 오가노이드의 백분율로 표시된다.
도 7은 7m8 벡터를 이용한 형질도입 후 망막 오가노이드에서 RetGC 및 β 튜블린(하우스키핑)의 단백질 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. β 튜블린에 대한 RetGC의 웨스턴 블롯 신호의 비율 측정 밀도계 정량화가 표시되어 있다.
도 8은 FRET 검정에 의한 cGMP 농도[nM]의 정량화를 보여준다. 흡광도 판독값은 총 단백질 양[ug]으로 정규화되었다. WT 대 RetGC 녹아웃(비형질도입 NT) 오가노이드는 네 가지 벡터로 형질도입된 오가노이드와 비교되었다(각 실험군당 n=7개의 배아체(EB)).
도 2는 20주차의 야생형(WT) 및 RetGC KO iPSC 망막 오가노이드를 보여준다. 가장 윗줄은 WT와 RetGC KO 모두에서 주변 테두리에 외부 분절 '솔 가장자리'가 있는 전체 오가노이드를 보여주는 명시야 이미지이다. 가운데 줄. 원뿔체와 간상체 외부 및 내부 분절은 원뿔체 옵신과 로돕신으로 염색되어 있다. 외부(OPL) 및 내부 플렉시폼 층(IPL)의 시냅스는 Ribeye 및 VGlut로 염색한다. 양극성 및 아마크린/신경절 세포는 PKCa 및 칼레티닌으로 염색한다. RetGC는 WT에서 광수용체 외부 분절에 국소화되어 있고 RetGC KO 오가노이드에는 부재한다.
도 3은 40일차부터 220일차까지 대조군 및 RetGC KO 오가노이드(β 튜블린으로 정규화)의 전체 WT 및 RetGC KO 오가노이드의 총 단백질 발현(웨스턴 블롯)을 보여준다.
도 4는 AAV 7m8 캡시드에 패키징된 4개의 전이유전자 카세트의 설계를 보여준다. RK 및 CMV 프로모터는 WPRE 요소와 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH-polyA) 신호의 유무와 관계 없이 WT GUCY2D 유전자와 통합되어 있다.
도 5는 WT 및 형질 전환된 RetGC KO 오가노이드의 PDE6 염색 강도를 보여준다. 로돕신 및 PDE6β로 염색된 망막 오가노이드 외부 분절의 대표 이미지.
도 6은 로돕신 양성 외부 분절 내의 PDE6β염색 강도에 대한 정량적 면역형광을 보여준다. 각 점은 개별 오가노이드의 타일 스캔을 나타낸다. 염색 강도는 동일한 블록에서 처리, 염색 및 이미징된 WT 오가노이드의 백분율로 표시된다.
도 7은 7m8 벡터를 이용한 형질도입 후 망막 오가노이드에서 RetGC 및 β 튜블린(하우스키핑)의 단백질 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. β 튜블린에 대한 RetGC의 웨스턴 블롯 신호의 비율 측정 밀도계 정량화가 표시되어 있다.
도 8은 FRET 검정에 의한 cGMP 농도[nM]의 정량화를 보여준다. 흡광도 판독값은 총 단백질 양[ug]으로 정규화되었다. WT 대 RetGC 녹아웃(비형질도입 NT) 오가노이드는 네 가지 벡터로 형질도입된 오가노이드와 비교되었다(각 실험군당 n=7개의 배아체(EB)).
본 발명은 망막 막 구아닐릴 시클라아제 1(RetGC1)의 발현을 위한 발현 작제물, 바이러스 게놈 및 벡터, 그리고 GUCY2D 유전자의 하나 이상의 돌연변이와 관련된 망막 질환을 치료하기 위한 발현 작제물, 바이러스 게놈 및 벡터를 사용하는 방법을 제공한다.
RetGC
RetGC는 광수용체의 간상체와 원뿔체에서 cGMP의 합성을 촉매한다. 이처럼 RetGC는 시각 주기 동안 cGMP 보충을 매개하여 광전환에 필수적인 역할을 한다.
광수용체 흥분과 회복 동안 두 개의 RetGC 동위효소인 RetGC1과 RetGC2(각각 GC-E와 GC-F 또는 ROSGC1과 ROSGC2로 공지됨)는 구아닐릴 시클라아제 활성화 단백질(GCAP)이 매개하는 칼슘 되먹임에 의해 긴밀하게 조절된다.
RetGC1의 역할은 빛에 노출된 후 cGMP 수치를 보충하는 것이다. 어두운 곳에서는 cGMP 수치가 일정한 속도로 유지되어 cGMP 게이트 채널이 열려 있고 내부 전류의 유입을 허용하여 세포의 부분적인 탈분극을 유지한다. 빛에 노출되면 cGMP 가수분해와 채널 폐쇄로 이어져 세포 내 Ca2+ 의 급격한 감소와 세포의 과분극이 촉진된다. 낮은 Ca2+ 농도에서는 구아닐레이트 시클라아제 활성화 단백질(GCAP)이 GC1 활성을 자극하여 cGMP 합성, 채널 재개방, 암 상태 회복을 유도한다.
빛 광자가 외부 분절을 통과하면 외부 분절의 막에 내장된 옵신에 의해 포획된다. 두 번째 메신저인 cGMP는 시각 주기의 신호 전달 단계에서 주요 구성 요소이다. 외부 분절의 세포질에서 합성과 분해의 균형이 시각 주기의 신호 전달 단계를 제어한다. RetGC에 의해 촉매되는 반응에 의해 GTP에서 생성된다. cGMP는 Ca2+ 이온의 유입을 허용하는 채널에 결합한다. 빛이 투과하면 PDE6에 의해 cGMP가 가수분해되어 GMP로 전환되고, 이 때 cGMP 채널이 닫힌다. 이렇게 하면 Ca2+ 의 유입이 억제되어 디스크 막 밖으로 배출되면서 농도가 감소한다.
광전환 주기에서 광자는 간상체의 로돕신과 원뿔체의 원뿔체 옵신에 흡수되어 11-시스(cis) 망막이 모든 트랜스 망막으로 전환된다. 모든 트랜스 망막은 G 단백질 트랜스듀신의 알파 서브유닛을 활성화하고, 이 과정에서 GDP가 GTP로 전환된다. 이렇게 생성된 GTP는 포스포디에스테라아제 6(PDE6)의 감마 서브유닛을 활성화하여 cGMP 생성을 억제할 수 있게 한다. 이로 인해 cGMP 게이트 채널이 닫히고 칼슘 이온의 유입이 중단된다. 암 상태의 GCAP는 칼슘 이온에 결합되어 RetGC와 결합하지 못한다. 명 상태의 GCAP에서 Ca2+를 방출하면 GCAP가 RetGC와 결합하여 cGMP를 생성할 수 있다. 이와 동시에 로돕신 키나아제를 통한 인산화와 아레스틴과의 결합에 의해 모든 트랜스가 비활성화된다. G 단백질 트랜스듀신에 결합된 GTP는 다시 GDP로 전환된다. 그 후 전체 주기가 반복된다.
RetGC1은 사람에서 GUCY2D 유전자에 의해, 마우스에서 Gucy2e 유전자에 의해 암호화된다. RetGC2는 인간에서 GUCY2F 유전자에 의해 암호화된다.
RetGC1을 암호화하는 GUCY2D 유전자의 돌연변이는 인간에게 중증의 망막 질환을 유발하며, 주로 상염색체 우성 원뿔체-간상체 이영양증(adCRD) 또는 상염색체 열성 레베르 선천성 흑암시 1형(arLCA)을 일으킨다. CRD에서는 원뿔체에서 퇴행이 시작되어 영향을 받지 않은 망막의 황반에 원뿔체가 많이 존재하기 때문에 중심 시야가 상실된다. 원뿔체가 퇴행한 후 간상체가 퇴행하면 CRD는 완전한 실명으로 이어질 수 있다. LCA1 표현형은 훨씬 더 중증으로 나타나며, 광수용체 기능 상실과 실명이 아주 이른 시기에 나타난다. LCA(12형)의 발병에 관여하는 또 다른 유전자는 망막 변성 3(RD3) 단백질을 코딩하는 rd3로, 이 유전자는 GCAP 매개 RetGC1의 활성화를 효과적으로 억제하고 광수용체에서 내부 분절에서 외부 분절로의 RetGC1 이동에 관여하는 역할을 한다.
총 144개의 서로 다른 GUCY2D 돌연변이가 기술되었다. 대부분(127개 돌연변이)은 영향을 받은 환자에서 LCA 표현형을 초래한다. LCA 관련 돌연변이는 일반적으로 열성 및 결손(주로 프레임 시프트, 넌센스 및 스플라이싱 돌연변이)이며 RetGC 효소의 모든 도메인에 영향을 미칠 수 있지만, CRD 돌연변이는 주로 우성 미스센스이며 이량체화 도메인에 해당하는 “핫스팟 영역”인 E837과 T849 사이의 위치에 밀집되어 있다.
LCA1 환자는 생후 1년 이내에 증상이 나타나며 시력 저하, 망막전위도(ERG) 반응의 감소 또는 기록 불가, 안진, 손발가락-안구(digito-ocular) 징후 및 겉으로 보기에 정상인 안저가 있는 것으로 일반적으로 기술된다. 이 질환과 관련된 광수용체 변성의 정도에 대한 보고는 상충되는 부분이 있다. 두 개의 사후 망막(26주 된 조산아와 12세 기증자)에 대한 조직병리학적 분석은 간상체와 원뿔체 모두에서 광수용체 변성의 징후를 나타냈다. 이후 최첨단 생체내 영상(예를 들어, 빛간섭단층촬영)을 사용한 연구에서는 53세 환자에게서 명백한 퇴행이 발견되지 않았다. 최신 연구에 따르면 LCA1 환자는 높은 수준의 시각 장애에도 불구하고 중심와 원뿔체 외측 분절 이상과 일부 환자의 중심와 원뿔체 손실을 제외하고는 정상적인 광수용체 층상 구조를 유지하는 것으로 나타났다.
CRD에서 간상체 기능의 이상은 원뿔체 기능의 이상보다 덜 중증이며 원뿔체 기능 장애보다 질병의 진행 과정에서 나중에 발견될 수 있다. 진단은 전기 생리학적 평가에 의해 확립되며 기능적 결과는 질병의 단계와 개인의 나이에 따라 다르다. 원뿔체-간상체 이영양증의 진단은 말초 및 중심 시야 손실의 입증으로 강화될 수 있다.
발현 작제물
일 양태에서, 발현 작제물로서, (a) 광수용체 세포에서 발현을 부여하는 프로모터 서열, 및 (b) 망막 막 구아닐릴 시클라아제(RetGC1)를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 핵산 서열을 포함하는, 발현 작제물이 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된"은 RetGC1에 대한 코딩 서열(cds)과 인접한 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터) 및 RetGC1의 발현을 제어하기 위해 트랜스로 또는 거리를 두고 작용하는 발현 조절 서열 모두를 지칭한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하며; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 단백질 처리 및/또는 분비를 향상시키는 서열을 포함한다.
예를 들어 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 다수의 발현 조절 서열이 당업계에 공지되어 있으며 원하는 발현 유형에 따라 RetGC1(GUCY2D) 전이유전자의 발현을 유도하는데 활용될 수 있다. 진핵 세포의 경우, 발현 조절 서열은 전형적으로 프로모터, 인핸서, 및 스플라이스 공여체 및 수용체 부위를 포함할 수 있는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 서열은 RetGC1을 암호화하는 서열 뒤와 3' ITR 서열 앞에 일반적으로 삽입된다. 본원에 개시된 방법에 유용한 rAAV의 또 다른 조절 구성요소는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)이다. IRES 서열은 단일 유전자 전사체로부터 하나 이상의 폴리펩티드를 생산하는 데 사용될 수 있다. IRES(또는 기타 적합한 서열)는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 함유하는 단백질을 생산하거나 동일한 세포로부터 또는 동일한 세포 내에서 두 개의 서로 다른 단백질을 발현하는 데 사용된다. 예시적인 IRES는 광수용체, RPE 및 신경절 세포에서 전이유전자 발현을 지원하는 폴리오바이러스 내부 리보솜 진입 서열이다. 바람직하게는, IRES는 rAAV 벡터에서 RetGC1을 암호화하는 서열의 3'에 위치한다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 로돕신 키나아제(RK) 프로모터 서열을 포함한다. 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7을 포함한다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열을 포함한다. 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 광수용체 세포에 특이적이며, 즉 프로모터는 광수용체 세포에서는 활성을 가지지만 다른 세포 유형에서는 활성이 감소되거나 전혀 없다.
일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 RetGC1(GUCY2D) 유전자로부터의 코딩 서열이다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화된 서열이다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13을 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 14를 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 단백질을 암호화한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 12를 포함하는 단백질을 암호화한다.
일 실시양태에서, 발현 작제물은 전사후 조절 요소를 포함한다. 일 실시양태에서, 발현 작제물은 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 10을 포함한다.
일 실시양태에서, 발현 작제물은 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일 실시양태에서, 발현 작제물은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH-polyA) 신호를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 11을 포함한다.
일 실시양태에서, 발현 작제물은 하나 이상의 역말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, ITR 서열은 AAV 혈청형 2로부터 유래된다. 일 실시양태에서, 5' ITR 서열은 서열번호: 5와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 5' ITR 서열은 서열번호: 5를 포함한다. 일 실시양태에서, 3' ITR 서열은 서열번호: 6과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 3' ITR 서열은 서열번호: 6을 포함한다.
벡터
일 양태에서, 전이유전자 또는 발현 작제물을 세포 내로 도입하기 위한 재조합 벡터 및 그의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, 재조합 벡터는 숙주 세포에서 DNA의 복제 및 적절한 수준의 표적 세포에서의 표적 유전자의 발현을 제공하는 DNA 분절을 포함하는 추가의 DNA 요소를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 포함한다. 당업자는 발현 조절 서열(프로모터, 인핸서 등)이 표적 세포에서 표적 유전자의 발현을 촉진하는 능력에 기초하여 선택된다는 것을 인식하고 있다. 본원에 사용된 "벡터"는 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포 내로 전달될 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비히클을 의미한다. 벡터의 비제한적 예에는 재조합 플라스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 미니 염색체, DNA 미니서클, 또는 바이러스(바이러스 유래 서열 포함)가 포함된다. 벡터는 또한 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포 내로 전달될 핵산을 포함하는 비리온을 지칭할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 재조합 바이러스 게놈을 포함하는 비리온을 지칭하며, 여기서 바이러스 게놈은 하나 이상의 ITR 및 전이유전자를 포함한다.
일 실시양태에서, 재조합 벡터는 바이러스 벡터 또는 다수의 바이러스 벡터의 조합이다.
일 양태에서, 본원에 개시된 발현 작제물 중 임의의 것을 포함하는 벡터가 제공된다.
일 양태에서, (a) 광수용체 세포 내 발현을 부여하는 프로모터 서열 및 (b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공되며, 여기서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 RK 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7을 포함한다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 CMV 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 광수용체 세포에 특이적이다.
일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 RetGC1(GUCY2D) 유전자로부터의 코딩 서열이다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화된 서열이다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13을 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 14를 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 단백질을 암호화한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 12를 포함하는 단백질을 암호화한다.
일 실시양태에서, 벡터는 전사후 조절 요소를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, 벡터는 WPRE를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 10을 포함한다.
일 실시양태에서, 벡터는 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, 벡터는 BGH-polyA 신호를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 11을 포함한다.
일 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 역말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, ITR 서열은 AAV 혈청형 2로부터 유래된다. 일 실시양태에서, 5' ITR 서열은 서열번호: 5와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 5' ITR 서열은 서열번호: 5를 포함한다. 일 실시양태에서, 3' ITR 서열은 서열번호: 6과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 3' ITR 서열은 서열번호: 6을 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 서열번호: 1 내지 4의 서열 중 임의의 것과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) RK 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 핵산 서열;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 벡터는 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) CMV 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 핵산 서열;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 프로모터 서열로서, 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9, 서열번호: 13, 또는 서열번호: 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 프로모터 서열로서, 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9, 서열번호: 13, 또는 서열번호: 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 프로모터 서열로서, 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1 단백질은 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하며, 여기서 RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 프로모터 서열로서, 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1 단백질은 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하며, 여기서 RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 7을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9, 서열번호: 13, 또는 서열번호: 14를 포함하는, 핵산 서열;
(c) 서열번호: 10을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 8을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9, 서열번호: 13, 또는 서열번호: 14를 포함하는, 핵산 서열;
(c) 서열번호: 10을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 7을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1 단백질은 서열번호: 12를 포함하고, 여기서 RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 핵산 서열;
(c) 서열번호: 10을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 8을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1 단백질은 서열번호: 12를 포함하고, 여기서 RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 핵산 서열;
(c) 서열번호: 10을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
바이러스 벡터
표적 세포, 조직, 또는 오가노이드 내 표적 유전자의 발현을 위한 바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어, AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 또는 합성 바이러스 벡터(예를 들어, 키메라 바이러스, 모자이크 바이러스, 또는 유사형 바이러스, 및/또는 외래 단백질, 합성 중합체, 나노입자, 또는 소분자를 함유하는 바이러스)를 포함한다.
AAV 벡터
아데노 연관 바이러스(Adeno-associated virus, AAV)는 효율적인 복제를 촉진하기 위해 헬퍼 바이러스가 필요한 작은 단일-가닥 DNA 바이러스이다. 4.7kb의 AAV 게놈은 두 개의 역말단 반복부(ITR)와 각각 Rep 단백질 및 Cap 단백질을 암호화하는 두 개의 오픈 리딩 프레임을 특징으로 한다. Rep 리딩 프레임은 분자량이 78kD, 68kD, 52kD 및 40kD인 네 개의 단백질을 암호화한다. 해당 단백질은 주로 AAV 복제, AAV를 숙주 세포의 염색체로의 구조 및 통합을 조절하는 기능을 한다. Cap 리딩 프레임은 비리온 캡시드를 형성하는 분자량 85kD(VP1), 72kD(VP2) 및 61kD(VP3)의 세 개의 구조적 단백질을 암호화한다. AAV 비리온 내 전체 단백질 중 80% 이상이 VP3를 포함한다. 5' 및 3' 말단에서 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임 플랭킹(flanking)은 약 145bp 길이의 역말단 반복부(ITR)이다. 두 개의 ITR은 AAV 복제, 구조, 패키징 및 AAV 게놈 통합에 필수적인 유일한 시스(cis) 요소이다. 전체 rep 및 cap 도메인은 잘라져 치료적 또는 리포터 전이유전자로 대체될 수 있다.
재조합 아데노 연관 바이러스 "rAAV" 벡터는 임의의 아데노 연관 바이러스 혈청형으로부터 유래된 임의의 벡터가 포함된다. rAAV 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자, 바람직하게는 Rep 및/또는 Cap 유전자를 가질 수 있지만 기능성 플랭킹 ITR 서열을 유지한다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 rAAV 게놈 및 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온이다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 본원에 개시된 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바이러스 벡터는 RetGC1을 암호화하는 서열에 대해 각각 5' 및 3'에 위치한 AAV 5' ITR 및 3' ITR을 포함하는 핵산을 포함한다. 그러나 특정 실시양태에서, 핵산이 일렬로, 예를 들어 5'에서 3'으로 또는 선단에서 말단으로, 또는 또 다른 대안적인 구성으로 배열된 5' ITR 및 3' ITR 서열을 함유하는 것이 바람직할 수 있다. 기타 실시양태에서, 핵산이 ITR의 다중 카피를 함유하거나, RetGC1을 암호화하는 서열에 대해 5' 및 3' 모두에 위치하는 5' ITR(또는 반대로, 3' ITR)을 갖는 것이 바람직할 수 있다. ITR 서열은 이종 분자의 바로 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있거나, 개재 서열이 있을 수 있다. ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열일 필요는 없으며, 서열이 기능적 구조, 복제 및 패키징을 제공하는 한 변경될 수 있다(예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 삭제 또는 치환에 의함). ITR은 본원에 기술된 바와 같이 AAV2로부터, 또는 기타 AAV 혈청형 중에서 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 예를 들어 AAV1(즉, AAV1 ITR 및 AAV1 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV2(즉, AAV2 ITR 및 AAV2 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV3(즉, AAV3 ITR 및 AAV3 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV4(즉, AAV4 ITR 및 AAV4 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV5(즉, AAV5 ITR 및 AAV5 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV6(즉, AAV6 ITR 및 AAV6 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV7(즉, AAV7 ITR 및 AAV7 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV8(즉, AAV8 ITR 및 AAV8 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV9(즉, AAV9 ITR 및 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAVrh74(즉, AAVrh74 ITR 및 AAVrh74 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAVrh.8(즉, AAVrh.8 ITR 및 AAVrh.8 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), 또는 AAVrh.10(즉, AAVrh.10 ITR 및 AAVrh.10 캡시드 단백질을 포함하는 AAV)이다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 하나의 AAV 혈청형으로부터의 ITR 및 상이한 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 함유하는 위형화된 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 위형화된 AAV는 AAV2/9(즉, AAV2 ITR 및 AAV9 캡시드 단백질을 함유하는 AAV)이다. 일부 실시양태에서, 위형화된 AAV는 AAV2/10(즉, AAV2 ITR 및 AAV10 캡시드 단백질을 함유하는 AAV)이다.
일부 실시양태에서, 위형화된 AAV는 AAV2/7m8(즉, AAV2 ITR 및 AAV7m8 캡시드 단백질을 함유하는 AAV)이다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh74, AAVrh.8 또는 AAVrh.10으로부터의 캡시드 단백질 중 하나 이상의 키메라를 함유하는 캡시드 단백질과 같은 재조합 캡시드 단백질을 함유한다. 실시양태에서, 캡시드는 AAV2 변이체 rAAV2-레트로(본원에 참조로 통합된 WO 2017/218842로부터의 서열번호: 44)와 같은 변이체 AAV 캡시드이다.
일 양태에서, (a) 광수용체 세포에서 발현을 부여하는 프로모터 서열 및 (b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공되며, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 RK 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7을 포함한다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 CMV 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 광수용체 세포에 특이적이다.
일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 RetGC1(GUCY2D) 유전자로부터의 코딩 서열이다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화된 서열이다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13을 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 14를 포함한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 단백질을 암호화한다. 일부 실시양태에서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 12를 포함하는 단백질을 암호화한다.
일 실시양태에서, 바이러스 게놈은 전사후 조절 요소를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, 바이러스 게놈은 WPRE를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 10을 포함한다.
일 실시양태에서, 바이러스 게놈은 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, 바이러스 게놈은 BGH-polyA 신호를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 11을 포함한다.
일 양태에서, 바이러스 게놈은 하나 이상의 역말단 반복부(ITR)을 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, ITR 서열은 AAV 혈청형 2로부터 유래된다. 일 실시양태에서, 5' ITR 서열은 서열번호: 5와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 5' ITR 서열은 서열번호: 5를 포함한다. 일 실시양태에서, 3' ITR 서열은 서열번호: 6과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 3' ITR 서열은 서열번호: 6을 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 서열번호: 1 내지 4의 임의의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) RK 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 핵산 서열;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) CMV 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 핵산 서열;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9, 서열번호: 13, 또는 서열번호: 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9, 서열번호: 13, 또는 서열번호: 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1 단백질은 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1 단백질은 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 7을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9, 서열번호: 13, 또는 서열번호: 14를 포함함;
(c) 서열번호: 10을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 8을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9, 서열번호: 13, 또는 서열번호: 14를 포함함;
(c) 서열번호: 10을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 7을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1 단백질은 서열번호: 12를 포함하고, 여기서 RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 10을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 8을 포함하는 프로모터 서열;
(b) RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 RetGC1 단백질은 서열번호: 12를 포함하고, 여기서 RetGC1 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 10을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 11의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
기타 바이러스 벡터는 아데노바이러스(AV) 벡터, 예를 들어 인간 아데노바이러스 2형 및 인간 아데노바이러스 5형에 기반한 벡터를 포함하며, E1 및 E3 영역의 결실을 통해 복제에 결함이 생기도록 만들어졌다. 전사 카세트가 E1 영역에 삽입되어 재조합 E1/E3 결실 AV 벡터가 수득될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 바이러스 코딩 서열을 함유하지 않는 헬퍼 의존성 고용량 아데노바이러스 벡터(고용량, "게놈이 없는(gutless)" 또는 "게놈이 제거된(gutted)" 벡터라고도 공지되어 있음)를 포함한다. 해당 벡터는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스-작용 요소, 주로 역말단 반복 서열(ITR) 및 패키징 신호(CY)를 포함한다. 해당 헬퍼 의존적인 AV 벡터 게놈은 수백 개의 염기쌍 내지 최대 대략 36kb의 외래 DNA를 운반할 수 있는 잠재력을 가지고 있다.
대안적으로, 렌티바이러스 벡터와 같은 기타 체계를 사용할 수도 있다. 렌티바이러스 기반 체계는 분열 세포뿐만 아니라 비분열 세포도 형질도입할 수 있어 예를 들어 CNS의 비분열 세포를 표적으로 하는 적용에 유용하다. 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스에서 유래되었으며, 해당 바이러스와 마찬가지로 숙주 게놈에 통합되어 매우 장기적인 유전자 발현 가능성을 제공한다.
발현 카세트를 함유하는 표적 유전자를 운반하는 플라스미드, YAC, 미니염색체 및 미니서클을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 양이온성 지질, 중합체 또는 둘 모두를 운반체로 사용하는 비바이러스 벡터 체계에 의해 세포 또는 유기체에 도입될 수도 있다. 공액 폴리-L-리신(PLL) 중합체 및 폴리에틸렌이민(PEI) 중합체 체계도 벡터를 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 세포에 벡터를 전달하는 기타 방법은 유체역학적 주입 및 전기천공, 세포 배양 및 유기체 모두에 대한 초음파 사용을 포함한다. 유전자 전달을 위한 바이러스 및 비바이러스 전달 체계에 대한 검토는 본원에 참조로 통합된 Nayerossadat, N. 외(Adv Biomed Res. 2012; 1:27)를 참조한다.
rAAV 비리온 생산
본원에 개시된 rAAV 비리온은 당업자에게 공지된 재료 및 방법뿐만 아니라 본원에 기술된 재료 및 방법을 사용하여 구성 및 생산될 수 있다. 본 개시내용의 임의의 실시양태를 구성하는 데 사용되는 해당 공학적 방법은 핵산 조작에 있어 당업자에게 공지되어 있으며 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기법을 포함한다. 예를 들어, Sambrook 외, “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989), 및 Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989); 및 국제특허공보 제WO 95/13598호를 참조한다. 추가로, 아데노바이러스 캡시드 내에서 rAAV 카세트를 생산하는 데 적합한 방법은 미국 특허 제5,856,152호 및 제5,871,982호에 기술되어 있다.
간단히 말해서, rAAV 게놈을 rAAV 비리온으로 패키징하기 위해서는 숙주 세포는 AAV rep 및 AAV cap 또는 이의 기능적 단편뿐만 아니라 AAV 생산에 필수적인 헬퍼 유전자를 발현하는 데 필수적인 서열을 함유하여 사용된다. AAV rep 및 cap 서열은 본원에 확인된 바와 같이 AAV 공급원으로부터 획득된다. AAV rap 및 cap 서열은 당업자에게 공지된 임의의 방식으로 숙주 세포에 도입될 수 있으며, 여기에는 형질감염, 전기천공, 리포솜 전달, 막 융합 기법, 고속 DNA 코팅 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질체 융합이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 일 실시양태에서, rap 및 cap 서열은 하나 이상의 핵산 분자에 의해 숙주 세포로 형질감염되고 세포 내에서 에피솜으로서 안정적으로 존재할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, rep 및 cap 서열은 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 또 다른 실시양태에서는, rep 및 cap 서열이 숙주 세포 내에서 일시적으로 발현된다. 예를 들어, 해당 형질감염에 유용한 핵산 분자는 5′ 내지 3′의 프로모터, 프로모터와 rep 유전자 서열의 시작 부위 사이에 개재된(interpose) 선택적 스페이서, AAV rep 유전자 서열 및 AAV cap 유전자 서열을 포함한다.
rep 및 cap 서열은 이의 발현 조절 서열과 더불어 단일 벡터로 공급되거나, 각 서열이 이의 자체 벡터로 공급될 수 있다. 바람직하게는, rep 및 cap 서열은 동일한 벡터로 제공된다. 대안적으로, 숙주 세포에 도입될 것인 기타 DNA 서열을 함유하는 벡터로 rep 및 cap 서열이 공급될 수도 있다. 바람직하게는, 해당 작제물에 사용되는 프로모터는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 구성적, 유도성 또는 천연 프로모터일 수 있다. rep 및 cap 단백질을 제공하는 분자는 해당 구성요소를 숙주 세포로 전달하는 임의의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 해당 분자는 플라스미드 형태이며, 마커 유전자와 같은 기타 비바이러스 서열을 함유할 수 있다. 해당 분자는 AAV ITR을 함유하지 않으며 일반적으로 AAV 패키징 서열을 함유하지 않는다. 상동 재조합의 발생을 피하기 위해 이 플라스미드에서는 기타 바이러스 서열, 특히 아데노바이러스의 서열을 피한다. 해당 플라스미드는 세포에 안정적으로 형질감염될 수 있도록 구성되는 것이 바람직하다.
rep 및 cap을 제공하는 분자는 숙주 세포에 일시적으로 형질감염될 수 있지만, 숙주 세포는 숙주 세포 내 기능적 rep 및 cap 단백질을 발현하는 데 필요한 서열로, 예를 들어 에피솜으로 또는 숙주 세포의 염색체에 통합하여 안정적으로 형질도입되는 것이 바람직하다. 이렇게 안정적으로 형질감염된 숙주 세포의 발현을 조절하는 프로모터에 따라, rep/cap 단백질은 일시적으로 발현될 수 있다(예를 들어, 유도성 프로모터의 사용을 통해).
본 개시내용의 실시양태를 구성하기 위해 이용되는 방법은 상기 참고문헌에 기술된 것과 같은 통상적인 유전 공학 또는 재조합 공학 기술이다. 예를 들어, rAAV는 제조업체의 지침에 따라 인산칼슘 방법(Clontech) 또는 Effectene 시약(캘리포니아주 발렌시아 소재 Qiagen)을 사용하는 삼중 형질감염 방법을 활용하여 생산될 수 있다. 또한 이하의 실시예에서 사용된 방법에 대해서는 전이유전자, AAV rep 및 cap을 함유하는 헬퍼 플라스미드, E2A, E4Orf6 및 VA의 아데노바이러스 헬퍼 기능을 공급하는 플라스미드를 갖는 플라스미드를 이용하는 Herzog 외, 1999, Nature Medic., 5(1):56-63를 또한 참조한다. 본원은 특정 작제물의 예시적인 실시예를 제공하지만, 당업자는 본원에 제공된 정보를 사용하여 스페이서, 프로모터 및 적어도 하나의 번역 개시 및 종결 신호와 폴리아데닐화 부위의 선택적 추가를 포함한 기타 요소를 선택하여 기타 적합한 작제물을 선택하고 설계할 수 있다.
이어서, rAAV 비리온으로 패키징될 rAAV 게놈, AAV rep 서열 및 AAV cap 서열을 함유하는, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 바이러스를 함유하는 숙주 세포를, 이들의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 배양하여 rAAV 비리온이 생산된다. 적합한 바이러스 헬퍼 유전자, 예를 들어, 아데노바이러스 E2A, E4Orf6 및 VA와 같은 다른 가능한 헬퍼 유전자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로, 바람직하게는 별도의 플라스미드 상에서 배양에 제공될 수 있다. 그 후, RetGC1 전이유전자의 발현을 지시하는 재조합 AAV 비리온은 오염성 헬퍼 바이러스 또는 야생형 AAV가 부재한 상태에서 세포 또는 세포 배양으로부터 단리된다.
RetGC1 전이유전자의 발현은 당업계에 공지된 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 시험관내에서 감염될 수 있고, 세포 내 전이유전자의 카피 수는 서던 블롯팅(Southern blotting) 또는 정량 중합효소 연쇄반응법(PCR)으로 모니터링될 수 있다. RNA 발현 수준은 노던 블롯팅(Northern blotting) 또는 정량 역전사효소(RT)-PCR로 모니터링될 수 있으며; 단백질 발현 수준은 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 면역조직화학, 효소결합면역흡착검정(ELISA), 방사면역검정(RIA) 또는 하기 실시예에서 상세히 설명하는 특정 방법을 통해 모니터링될 수 있다.
약학적 조성물
본원에는 본원에 개시된 임의의 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
RetGC1을 암호화하는 유전자를 함유하는 rAAV는 바람직하게는 통상적인 방법에 의해 오염을 평가한 후 보관 및/또는 환자에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물로 제형화된다.
본원에 개시된 벡터의 제형물은 적절한 생리학적 수준에서 pH를 유지하기 위해 약학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 비히클 또는 담체, 특히 완충 식염수 또는 예를 들어, HEPES인 기타 완충제와 같은 망막하 주사에 적합한 것의 사용을 포함한다.
본 개시내용의 벡터는 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 해당 조성물은 벡터 이외에 약학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 또는 당업자에게 잘 공지된 기타 첨가제를 포함할 수 있다. 해당 물질은 독성이 없어야 하고 활성 성분의 효능을 방해해서는 안 된다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 특성은 투여 경로에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 약학적 조성물은 전형적으로 액체 형태이다. 액체 약학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 추가 담체는 본원에 참고로 통합된 국제특허공보 제WO 00/15822호에 제공되어 있다. 생리 식염수 용액, 염화마그네슘, 덱스트로스 또는 기타 당류 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다. 일부 경우에 플루론산(PF68) 0.001%과 같은 계면활성제가 사용될 수 있다. 일부 경우에 링거 주사(Ringer's Injection), 유산을 가한 링거 주사(Lactated Ringer's Injection), 또는 하트만 용액(Hartmann's solution)이 사용된다. 요구에 따라 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다.
지연 방출을 위해, 벡터는 당업계에 공지된 방법에 따라 생체적합성 중합체로부터 형성된 마이크로캡슐 내 또는 리포솜 담체 체계 내와 같은 서방형을 위해 제형화된 약학적 조성물에 포함될 수 있다
벡터를 장기간 보관할 경우 글리세롤이 존재하는 상태에서 냉동될 수 있다.
치료 방법
GUCY2D 유전자 내 하나 이상의 돌연변이와 관련된 망막 질환의 치료가 필요한 대상체에서 망막 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 대상체에게 본원에 개시된 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 또한, 망막 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 망막 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 망막 질환은 GUCY2D 유전자의 하나 이상의 돌연변이와 연관되며, 해당 방법은 본원에 개시된 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서는 망막 질환의 치료가 필요한 대상체에서 망막 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 벡터가 제공되며, 여기서 망막 질환은 GUCY2D 유전자의 하나 이상의 돌연변이와 연관되어 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 GUCY2D 유전자에 돌연변이를 보유한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "포유동물"은 인간, 실험 동물, 가정용 애완동물, 및 농장 동물을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 포유동물은 인간 또는 소, 말, 개, 양, 또는 고양이 등과 같은 비-인간 포유동물을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 개인 및 환자도 본원의 대상체이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "치료하다(treat)", "치료된(treated)", "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"는 치료적 치료를 지칭하며, 여기서 목적은 원하지 않는 생리학적 병태, 장애 또는 질환을 늦추거나(완화하거나) 유익한 또는 원하는 임상 결과를 얻기 위한 것이다. 본 개시내용의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는 증상의 완화; 하나 이상의 증상의 병태, 장애 또는 질환의 정도 감소; 병태, 장애 또는 질환 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음); 병태, 장애 또는 질환의 발병 지연 또는 진행 늦춤; 병태, 장애 또는 질환 상태의 하나 이상의 증상의 개선; 및 관해(부분적 또는 전체적을 불문함), 또는 병태, 장애 또는 질환의 향상 또는 개선을 포함한다. 치료는 과도한 수준의 부작용 없이 임상적으로 유의한 반응을 이끌어내는 단계를 포함한다. 치료는 치료를 받지 않을 시에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것도 포함한다. 용어 "예방하다(prevent)", "예방(prevention)" 등은 질병 또는 장애가 명백히 발병하기 전에 질병 또는 장애가 발달하는 것을 방지하거나 질병 또는 장애의 정도를 최소화하거나 발병 과정을 늦추기 위해 행동하는 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 치료 성공은 시력, 망막전위도(ERG) 반응, 안진 감소, 손발가락-안구 징후의 변화 및 조직병리학적 분석 또는 광간섭 단층촬영 중 하나 이상에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 망막 질환은 원뿔체-간상체 이영양증(CRD) 또는 레베르 선천성 흑암시 1형(LCA1)이다. 일 실시양태에서, 망막 질환은 LCA1이다. 일 실시양태에서, 망막 질환은 CRD이다.
일 측면에서, 하기를 포함하는 방법이 제공된다:
(a) 대상체가 GUCY2D 유전자 내 돌연변이를 갖고 있는지 여부를 결정하는 단계; 및
(b) 대상체가 GUCY2D 유전자 내 돌연변이를 갖고 있을 시, 대상체에게 본원에 개시된 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계.
투여 경로 및 방법
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 벡터 또는 약학적 조성물은 안내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 벡터 또는 약학적 조성물은 직접적인 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 벡터 또는 약학적 조성물은 대상체의 중심 망막에 투여된다.
본 개시내용의 벡터의 용량은 다양한 파라미터, 특히 치료 대상 환자의 연령, 체중 및 병태, 특정 안구 질환 및 질환이 진행성인 경우 그 질환이 발달한 정도, 투여 경로 및 요구되는 레지멘에 따라 결정될 수 있다. 다시 말하지만, 의사는 임의의 특정 환자에게 요구되는 투여 경로 및 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 프로모터 서열의 조절하에 RetGC1을 암호화하는 핵산 서열을 보유하는 RetGC1의 유효량은 약 1×109 내지 2×1012 rAAV 게놈 입자 또는 1×1010 내지 2×1011 게놈 입자 범위가 바람직하다. “게놈 입자”는 (실시간 PCR과 같은) 서열 특정 방법으로 정량화될 수 있는 단일 가닥 DNA 분자를 함유하는 AAV 캡시드로 본원에 정의된다. 일부 실시양태에서, 약 1×109 내지 2×1012 rAAV 게놈 입자는 약 150 내지 약 800μl의 부피로 제공된다. 일부 실시양태에서, 약 1×1010 내지 2×1011 rAAV 게놈 입자는 약 250 내지 약 500μl의 부피로 제공된다. 여전히 해당 범위 내 기타 투여량은 주치의가 선택할 수 있다.
용량은 단회 용량으로 제공될 수 있지만, 다른 눈에 대해 반복될 수 있거나 벡터가 (수술 합병증과 같은) 어떠한 이유로 망막의 정확한 영역을 표적으로 삼지 못하는 경우에는 반복될 수 있다. 치료는 바람직하게는 각 눈에 대한 단일 영구 치료이지만, 예를 들어 향후 몇 년 내 및/또는 상이한 AAV 혈청형을 사용한 반복 주사가 고려될 수 있다. 이와 같이, 본원에 개시된 약학적 조성물의 다회 "부스터" 투여량을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 안구 표적 세포 내부의 전이유전자의 기간에 따라, 6개월 간격으로 또는 첫 번째 투여 후 매년 부스터 투여량을 전달할 수 있다. 해당 부스터 투여량 및 그에 대한 필요성은 예를 들어 당업계에 공지된 망막 및 시각 기능 테스트 및 시각 행동 테스트를 사용하여 주치의에 의해 모니터링될 수 있다. 기타 유사한 테스트를 사용하여 시간 경과에 따른 치료받은 대상체의 상태를 확인할 수 있다. 주치의가 적절한 테스트를 선택할 수 있다. 여전히 대안적으로, 본원에 개시된 방법은 야생형 망막에서 발견되는 수준에 가까운 시각 기능 수준을 허용하기 위해 단일 또는 다중 감염에서 더 많은 부피의 벡터를 함유하는 용액을 주사하는 것을 포함할 수도 있다.
추가 방법
일 양태에서, 간상체 cGMP-특이적 3',5'-사이클릭 포스포디에스테라제 서브유닛 β(PDE6β)의 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 간상체 cGMP-특이적 3',5'-사이클릭 포스포디에스테라제 서브유닛 β(PDE6β)의 발현을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 개시된 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 양태에서, 세포에서 간상체 cGMP-특이적 3',5'-사이클릭 포스포디에스테라제 서브유닛 β(PDE6β)의 발현을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포를 본원에 개시된 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다.
일 양태에서, 광수용체에서 cGMP 수준의 증가를 필요로 하는 대상체의 광수용체에서 cGMP 수준을 증가시키는 방법이 제공되며, 해당 방법은 대상체에게 본원에 개시된 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 세포 내 광수용체의 cGMP 수준을 증가시키는 방법이 제공되며, 해당 방법은 세포를 본원에 개시된 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다.
제조 물품 및 키트
또한, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 키트 또는 제조 물품이 제공된다. 양태에서, 키트는 적합한 패키징에 본원에 기술된 조성물(예를 들어, 전이유전자를 암호화하는 RetGC1의 전달을 위한 조성물)을 포함한다. 본원에 기술된 (주사용 안구 조성물과 같은) 조성물에 적합한 패키징은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 (밀봉된 바이알과 같은) 바이알, 용기, 앰플, 병, 단지, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 Mylar 또는 밀봉된 비닐봉지)을 포함한다. 해당 제조 물품은 추가로 멸균 및/또는 밀봉될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 해당 키트는 본원에 기술된 용도와 같이 조성물을 사용하는 방법에 대한 지침(들)을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 키트는 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 조성물의 투여를 수행하거나 본원에 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 키트는 표적 세포에서 전이유전자를 암호화하는 RetGC1의 발현을 위한 rAAV, 주사에 적합한 약학적으로 허용되는 담체, 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 주사를 수행하기 위한 지침이 담긴 패키지 삽입물을 포함한다.
본 발명은 기술된 특정 분자, 조성물, 방법론, 또는 프로토콜에 국한되지 않는 것으로 이해되어야 하며, 이는 다양할 수 있기 때문이다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료는 본 발명의 실시양태를 실행하거나 테스트하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본원의 본 발명의 개시 내용은 해당 특정 특징의 모든 가능한 조합을 포함한다는 것이 추가로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 특징이 본 발명의 특정 양태 또는 실시양태, 또는 특정 청구항의 맥락에서 개시되는 경우, 해당 특징은 또한 본 발명의 기타 특정 양태 및 실시양태와의 조합 및/또는 맥락에서, 그리고 일반적으로 본 발명 내에서 가능한 정도까지 사용될 수 있다.
2개 이상의 정의된 단계를 포함하는 방법에 대해 본원에서 언급되는 경우, 정의된 단계는 임의의 순서로 또는 동시에 수행될 수 있으며(문맥상 그러한 가능성이 배제되는 경우 제외), 방법은 수행되는 하나 이상의 기타 단계를 포함할 수 있다. 정의된 단계 이전, 정의된 두 단계 사이 또는 정의된 모든 단계 이후(문맥에서 해당 가능성을 배제하는 경우 제외).
기타 참조된 모든 특허 및 출원은 그 전체가 본원에 참조로 통합되어 있다. 또한, 본원에 참조로 포함된 참고문헌의 용어 정의 또는 사용이 본원에 제공된 해당 용어의 정의와 일치하지 않거나 상반되는 경우, 본원에 제공된 해당 용어의 정의가 적용되며 참고문헌의 해당 용어의 정의는 적용되지 않는다.
본 발명의 이해를 보다 촉진하기 위해, 하기의 구체적인 실시양태가 주어진다. 하기의 실시예는 본 발명의 전체 범위를 제한하거나 정의하는 것으로 읽혀서는 안 된다.
실시예
실시예 1: GUCY2D의 돌연변이와 관련된 망막 질환에 대한
시험관내
질환 모델로서 RetGC 녹아웃(KO) 오가노이드의 생성
RetGC KO 오가노이드를 생성하기 위해, 발달 중 여러 시점에 야생형(WT) 망막 오가노이드를 수확했다. 망막 오가노이드 발달 중 다양한 시점에 망막 특이적 마커와 함께 각각 qPCR 및 웨스턴 블롯/면역형광법을 통해 GUCY2D mRNA 및 RetGC 단백질 수준을 측정했다. WT 인간 섬유아세포를 재프로그래밍하고, 에피솜 재프로그래밍 인자 및 CRISPR/CAS9을 사용하여 GUCY2D-RetGC를 삭제하도록 유전자를 편집했다. KO 유도만능줄기세포(iPSC) 클론을 편집되지 않은(WT) 동종 대조군 주(control line)와 함께 망막 오가노이드로 분화시켰다. 발달의 예상 시점에서 광수용체 마커의 존재 및 RetGC 단백질의 부재를 확인했다.
RetGC 단백질은 포유동물 망막의 광수용체 외부 분절로 전위되었다. 면역형광법을 통해 WT 오가노이드의 외부 분절 구조에서 RetGC 단백질을 검출할 수 있었고, 여기서 이 단백질은 로돕신과 함께 공동국소화되었다. 면역형광법과 웨스턴 블롯을 통해 성숙한 RetGC KO 오가노이드 내에서 RetGC 단백질의 손실이 확인되었다. 또한 GUCY2D(RetGC) mRNA가 유의하게 감소했다.
외부 분절에서 RetGC가 손실된 것 외에도, RetGC KO 오가노이드의 외부 분절에서 광전환 단백질 포스포디에스테라아제-6-베타(PDE6β)가 감소된 것으로 밝혀졌다. PDE6β는 광전환 주기에 핵심적인 역할을 한다. 빛 자극을 받으면 PDE6β에 의해 cGMP가 GMP로 가수분해되어 외부 분절 디스크의 cGMP 채널이 닫히고 광수용체 세포의 과분극을 유발한다.
상기에서 언급한 RetGC KO 오가노이드의 특성은 이러한 오가노이드가 단백질 수준 회복을 위한 RetGC 바이러스 벡터의 효능을 테스트하기 위한 시험관내 질병 모델로 활용될 수 있음을 보여주었다.
실시예 2: RetGC KO 오가노이드의 특성 분석
확립된 분화 프로토콜을 사용하여 인간 유도 만능 세포(hiPSC)로부터 RetGC KO 및 WT 망막 오가노이드를 생성했다. 이 분화 프로토콜은 140일(20주) 째에 '성숙한' 망막 오가노이드를 생성하여 AAV 형질도입 실험에 사용할 수 있었다. 성숙한 망막 오가노이드는 형태학적으로 구분할 수 있는 퇴행 징후 없이 최대 300일(43주)까지 배양 상태를 유지할 수 있었다.
인간의 신경 망막은 수평 세포, 양극성 세포, 아마크린 세포, 뮬러 신경교세포 및 신경절 세포, 광수용체, 망막 색소 상피 세포를 포함한 여러 층의 신경 세포로 구성되어 있다(도 1). 시험관내에서 생성된 오가노이드는 위의 망막 세포 유형이 적절한 층에 배열되고 두 개의 시냅스 층으로 연결된 신경 망막의 적층 형태를 반영한다.
면역형광법, 웨스턴 블롯 및 qPCR 기법을 사용하여 WT 및 RetGC KO 오가노이드의 특성을 분석했다. WT 및 RetGC KO 세포주 모두에서 생체내 인간 망막과 망막 오가노이드 간의 망막 형태 유사성을 식별하고 기술하기 위해 망막의 다양한 세포 유형에 대한 관련 마커를 사용했다. 도 2는 원뿔체 및 간상체 광수용체에 대한 LM 옵신과 로돕신, 외부 플렉시폼 층의 시냅스에 대한 Ribeye와 V Glut, 양극성, 수평 및 아마크린 세포에 대한 PKCα와 칼레티닌의 동결절편 및 면역 염색 이미지를 보여준다. 명시야 이미지는 광수용체 외부 분절인 '솔 가장자리'가 보이는 성숙한 오가노이드를 묘사한다. 도 3의 그래프는 망막 오가노이드의 발달의 시간 과정(40일 내지 220일)에 따른 RetGC 단백질 발현 분석을 보여준다. RetGC 단백질 수준은 WT에 비해 RetGC KO 오가노이드에서 유의하게 감소한다.
실시예 3: KO 오가노이드에서 RetGC 발현을 회복하기 위한 벡터 설계
도 4와 같이 네 가지 발현 작제물 중 하나를 포함하는 바이러스 벡터를 설계했다. 발현 작제물은 다음의 두 가지 프로모터를 갖는다: RK(광수용체에 특이적인 로돕신 키나아제 프로모터에서 유래)와 CMV(사이토메갈로바이러스에서 유래). 일부 발현 작제물에는 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)도 함유한다. 모든 바이러스 게놈은 7m8 캡시드로 패키징되었다.
WT 및 RetGC KO 망막 오가노이드는 140일 내지 204일의 범위의 연령에서 네 가지 바이러스 벡터로 형질도입되었고, 21일 동안 배양된 후 수확 및 분석되었다. 형질도입된 오가노이드는 면역형광법, 웨스턴 블로팅, qPCR, cGMP FRET 분석법을 사용하여 평가했다.
네 가지 AAV 7m8 벡터 모두 성공적으로 인간 광수용체를 형질도입하고 총 RetGC 단백질 정량(웨스턴 블롯) 및 mRNA(qPCR)를 통해 결정된 바와 같이 RetGC KO 망막 오가노이드에서 RetGC 단백질 발현을 유도했다. 7m8 CMV-RetGC 및 7m8 RK-RetGC에 의해 전달된 형질도입 RetGC는 광수용체 외부 분절의 정확한 세포 내 구획에서 면역형광법으로 검출할 수 있었다.
실시예 4: AAV 벡터 유도 RetGC 발현으로 광수용체 외부 분절에서 PDE6β 발현 회복
도 5는 WT, 비형질도입 망막 오가노이드 및 바이러스 벡터 형질도입 망막 오가노이드에서 PDE6β의 면역 염색을 보여준다. PDE6β를 로돕신 단백질과 함께 염색하여 모든 오가노이드에서 외부 분절의 존재를 확립하고, WT 대조군과 비교하여 비형질도입 대조군에서 PDE6β단백질이 얼마나 감소했는지를 보여준다. 바이러스 벡터를 이용한 형질도입 후, PDE6β단백질의 회복을 확인했다.
WT 대조군 망막 오가노이드에 비해 형질도입되지 않은 RetGC KO의 PDE6β염색 강도가 유의하게 감소했다 p<0.005(다중 비교를 위해 Kruskal-Wallis 테스트를 적용한 일원분산분석(ANOVA) 테스트). 로돕신 양성 외부 분절의 염색 강도를 여러 WT, RetGC KO 및 형질전환 오가노이드에서 정량화했다. 7m8-CMV-RetGC 및 7m8-RK-RetGC로 처리한 오가노이드에서 PDE6β발현이 WT 수준에 가깝게 회복되었다. 7m8-CMV-RetGC-WPRE 및 7m8-RK-RetGC-WPRE는 KO에 비해 개선되었지만 다른 두 벡터와 같은 수준은 아니었다(도 6 및 표 1).
표 1. 외부 분절에서 PDE6β발현의 회복. SD=표준 편차. 각 벡터에 대해 n=4.
실시예 5: AAV 벡터 유도 RetGC 발현으로 RetGC 단백질 수준 회복
RetGC 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 검정했다. 도 7에서 볼 수 있듯이, 벡터 7m8-CMV-RetGC(WT의 30%), 7m8-CMV-WPRE-RetGC(WT의 47%), 7m8-RK-RetGC(WT의 27%)로 형질도입한 EB에서 형질도입하지 않은 EB에 비해 RetGC 발현이 더 높았다. 각 실험 군에 대해 두 개의 검체를 수확하여 단백질 발현 분석을 위해 처리했다.
실시예 6: AAV 벡터 유도 RetGC 발현은 빛 자극 후 오가노이드의 총 cGMP 수준 회복시킴
RetGC 활성을 측정하기 위해 Europium Cryptate(기증자)로 표지된 특정 항체와 d2 시약(수용체)으로 표지된 cGMP를 사용하여 경쟁 검정 형식으로 cGMP의 정량적 측정을 수행했다. 검출 원리는 HTRF®기술을 기반으로 한다. 염료가 근접해 있을 때 광원(레이저 또는 플래시 램프)으로 도너를 여기시키면 억셉터를 향한 형광 공명 에너지 전달(FRET)이 촉발되고, 그러면 특정 파장(665nm)에서 형광을 발산한다. 검체에 존재하는 cGMP는 두 컨쥬게이트 간의 결합과 경쟁하여 FRET 발생을 방지한다. 특정 신호는 cGMP 농도에 반비례한다.
7m8 벡터로 형질도입된 WT 및 KO 오가노이드와 형질도입되지 않은 오가노이드를 빛/어둠의 주기에 노출시켜 cGMP의 생성을 유도했다. 사용된 빛 자극 프로토콜은 광수용체를 단리하기 위해 오가노이드를 해부하기 전에 5분간 백색광 자극을 주고 5분간 어둠에 노출하는 방식으로 구성되었다. 연구 프로토콜에 기술된 대로 검체를 해부하고 적색광 아래에서 IBMX(PDE 억제제)가 있는 상태에서 용혈했다. 이 검정은 표준 곡선과 비교하여 cGMP [nM] 농도를 결정하고 얻은 값을 검체당 총 단백질 양 [ug]으로 정규화했다. 통계 분석은 비형질도입 KO 대조군(NT)과 비교하여 검체 간의 통계적 차이를 평가하기 위해 수행되었다.
도 8의 그래프에서 볼 수 있듯이, RetGC KO 오가노이드(NT)는 빛 자극 후 cGMP 수치가 유의하게 감소했다(WT의 20%). 형질도입 후, 벡터 7m8-CMV-GUCY2D (WT의 +76%, p=0.0043) 및 7m8-RK-GUCY2D (WT의 +37%, p=0.0494)로 형질도입된 KO RetGC-GUCY2D 오가노이드에서 통계적으로 유의한 cGMP 증가가 발견되었다. WPRE 요소를 지닌 CMV 및 RK 벡터를 모두 사용한 형질도입은 통계적으로 유의하지는 않지만 WT 검체에서 발견된 것과 비슷한 평균값으로 cGMP의 증가를 가져왔다. 그래프는 군당 3개 또는 4개의 형질도입 오가노이드를 사용한 두 개의 개별 실험에서 얻은 결과를 보여준다(도 8). 총 cGMP 수준이 WT 수준을 충족하고 초과했다는 점이 관찰된 것은 빛에 민감한 인간 광수용체의 맥락에서 상기에서 언급된 벡터의 기능적 효능을 입증한다.
서열 개요
전술한 본 발명의 서면 설명은 통상의 기술자가 현재 최선의 방안으로 간주되는 것을 제조하여 사용할 수 있도록 하나, 통상의 기술자는 본 발명의 특정 실시양태, 방법 및 실시예의 변형, 조합 및 등가물의 존재를 이해하고 인식할 것이다.
Claims (35)
- 발현 작제물로서,
(a) 광수용체 세포에서 발현을 부여하는 프로모터 서열, 및
(b) 망막 막 구아닐릴 시클라아제 1(RetGC1)을 암호화하는 핵산 서열
을 포함하며;
상기 핵산 서열은 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 발현 작제물. - 제1항에 있어서, 프로모터 서열이 로돕신 키나아제(RK) 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열인, 발현 작제물.
- 제2항에 있어서, 프로모터 서열이 서열번호: 7과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
- 제3항에 있어서, 프로모터 서열이 서열번호: 7의 서열인, 발현 작제물.
- 제2항에 있어서, 프로모터 서열이 서열번호: 8과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
- 제5항에 있어서, 프로모터 서열이 서열번호: 8을 포함하는, 발현 작제물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 작제물이 전사후 조절 요소를 추가로 포함하는, 발현 작제물.
- 제7항에 있어서, 전사후 조절 요소가 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함하는, 발현 작제물.
- 제7항에 있어서, 전사후 조절 요소가 서열번호: 10과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
- 제9항에 있어서, 전사후 조절 요소가 서열번호: 10을 포함하는, 발현 작제물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열이 야생형 RetGC1 유전자인, 발현 작제물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열이 코돈-최적화된 서열인, 발현 작제물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열이 서열번호: 9, 서열번호: 13, 또는 서열번호: 14와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
- 제13항에 있어서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열이 서열번호: 9, 서열번호: 13, 또는 서열번호: 14를 포함하는, 발현 작제물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열이 서열번호: 12와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
- 제15항에 있어서, RetGC1을 암호화하는 핵산 서열이 서열번호: 12를 포함하는 단백질을 암호화하는, 발현 작제물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 작제물이 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는, 발현 작제물.
- 제17항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH-polyA) 신호를 포함하는, 발현 작제물.
- 제17항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 서열번호: 11과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
- 제19항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 서열번호: 11을 포함하는, 발현 작제물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 작제물이 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
- 제21항에 있어서, 발현 작제물이 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 발현 작제물.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 발현 작제물을 포함하는 벡터.
- 제23항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인, 벡터.
- 제24항에 있어서, 벡터가 아데노 연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터인, 벡터.
- 제25항에 있어서, 벡터가 AAV 혈청형 AAV2로부터 유래된 게놈을 포함하는, 벡터.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 벡터가 AAV7m8로부터 유래된 캡시드를 포함하는, 벡터.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항의 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 망막 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 망막 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 망막 질환은 GUCY2D 유전자 내 하나 이상의 돌연변이와 연관되며, 상기 방법은 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제28항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 망막 질환이 원뿔체-간상체 이영양증(CRD) 또는 레베르 선천성 흑암시 1형(LCA1)인, 방법.
- 제30항에 있어서, 망막 질환이 LCA1인, 방법.
- 간상체 cGMP 특이적 3',5'-고리형 포스포디에스테라제 서브유닛 β(PDE6β)의 발현 증가를 필요로 하는 대상체에서 간상체 cGMP 특이적 3',5'-고리형 포스포디에스테라제 서브유닛 β(PDE6β)의 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제28항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 광수용체 내 고리형 구아노신 모노포스페이트(cGMP) 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 광수용체 내 고리형 구아노신 모노포스페이트(cGMP) 수준을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제28항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 안내 주사에 의해 투여되는, 방법.
- 제34항에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 대상체의 중심 망막에 주사되는, 방법.
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