KR20240055482A - 글리코겐 가인산분해효소 (pygl) 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

글리코겐 가인산분해효소 (pygl) 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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임동철
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류재윤
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Abstract

본 발명은 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 통해 궤양성 대장염 등의 염증성 장 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 그리고, 본 발명의 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 통해 가인산분해효소(PYGL) 활성을 감소시키는 물질을 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질의 후보물질로 결정할 수 있다.

Description

글리코겐 가인산분해효소 (PYGL) 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions for the treatment of inflammatory bowel disease comprising glycogen phosphorylase (PYGL)}
본 발명은 글리코겐 가인산분해효소 (PYGL) 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)은 자가면역질환의 일종으로, 장에 만성적인 원인불명의 염증을 일으키는 질환이다. 상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC) 및 크론병(Crohn’s disease)을 포함하고, 정확한 병인은 아직 밝혀지지 않았으나, 유전학적 소인이 있는 사람에서 장관 내 세균에 대해 부적절한 면역반응에 의해 유발된다. 선천면역세포인 호중구와 대식세포는 물론 후천면역세포인 림프구 등 장면역계의 지속적이거나 부적절한 활성화는 결국 점막 파괴 및 궤양을 초래한다. 염증 상태의 장관의 점막에서 다양한 염증성 사이토카인들이 생성·분비되며 이 중 TNF-α(종양괴사인자-α)는 궤양성 대장염 환자의 대장 루멘과 대장 상피세포에서 높게 나타나며, 최근 연구에 의하면 TNF-α는 궤양성 대장염의 병인으로 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
궤양성 대장염 치료를 위하여 1차 약제로 5-ASA (메살라민)을 처방하거나, 증상에 따라 스테로이드를 처방하기도 하며, 면역억제제를 포함한 생물학적 제제가 사용되기도 한다. 현재 궤양성 대장염 환자의 20-40%는 통상적인 약물치료에 실패하거나, 65-80%의 환자는 항 TNF- α 제제로 대표되는 생물학적 제제로도 완전한 관해를 유도하는데 실패하고 있다. 관해가 유도되더라도 생물학적 제제와 같은 고분자 단백질은 자가 항체가 형성되어 장기 치료시 반응이 소실되어 재발률이 높고, 결국 대장절제술을 받아야 하는 비율이 높다. 또한, 생물학적 제제는 고가의 비용은 물론이고, 주사제이므로 복용편의성이 낮다. 따라서, 이러한 단점을 개선한 새로운 기전의 경구용 저분자 신약의 개발의 필요성이 지속적으로 제기되어 있다.
한국 등록특허공보 제10-2426921호 (2022.07.26)
본 발명의 해결 과제는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하고, 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결 과제는 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결 과제는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제 (medicament)를 제조하기 위한, 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제의 용도(use)를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 해결 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따라, 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제는 하기 화학식 1 내지 8 로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며,
하기 화학식 1 로 표시되는 화합물은 N-(5-하이드록시-3,4,6-트라이메틸피리딘-2-일)-5-메틸-1H-인돌-2-카복사마이드 (INV-101)이고,
하기 화학식 2 로 표시되는 화합물은 CP-91149 이고,
하기 화학식 3 으로 표시되는 화합물은UC-205686이고,
하기 화학식 4 로 표시되는 화합물은 PSN-357이고,
하기 화학식 5 로 표시되는 화합물은GSK-1362885이고,
하기 화학식 6 으로 표시되는 화합물은 CP-368296 (Ingliforib)이고,
하기 화학식 7 으로 표시되는 화합물은 Z13865200141 이고,
하기 화학식 8 로 표시되는 화합물은 AVE-5688 이다.
<화학식 1>
<화학식 2>
<화학식 3>
<화학식 4>
<화학식 5>
<화학식 6>
<화학식 7>
<화학식 8>
일 구현예에서, 상기 염증성 장 질환은 장염, 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 크론친화성 세포종, 과민성 대장 증후군, 출혈성 직장 궤양, 회장낭 염(pouchitis), 소화성 궤양, 장관형 베체트병, 및 위염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 1) 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 를 발현하는 세포에 시험 물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1) 의 세포에서 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 의 활성을 측정하는 단계; 및
3) 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 의 활성을 감소시키는 시험 물질을 염증성 장 질환 치료제의 후보 물질로 결정하는 단계를 포함하는, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 의 활성의 측정은 포도당-1-인산(G-1-P) 검출을 이용하여 측정하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 염증성 장 질환은 장염, 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 크론친화성 세포종, 과민성 대장 증후군, 출혈성 직장 궤양, 회장낭 염(pouchitis), 소화성 궤양, 장관형 베체트병, 및 위염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제 (medicament)를 제조하기 위한, 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제의 용도(use)가 제공된다.
본 발명의 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 통해 궤양성 대장염 등의 염증성 장 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 통해 가인산분해효소(PYGL) 활성을 감소시키는 물질을 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질의 후보물질로 결정할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
첨부된 도면은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 기술적 사상이 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 시험물질 (INV-101, CP-91149 및 UC-205686) 의 in vitro PYGL 저해능을 나타내는 그래프이다.
도 2a는 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 체중변화를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 TNBS 에 의해 유도된 지 8일차의 랫드의 체중을 나타낸 그래프이다.
도 3은 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 질병 진행 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는TNBS 에 의해 유도된 랫드의 대장의 형태학적 변화를 나타낸 사진이다.
도 5는 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 대장의 단위 길이당 무게를 나타낸 그래프이다.
도 6은 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 대장 조직의 H&E 염색 사진이다.
도 7은 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 대장 조직의 손상 정도 점수를 나타낸 그래프이다.
도 8은 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 대장 조직에서 염증 사이토카인 발현을 나타낸 것이다.
도 9a는 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 대장조직의 염증 신호 활성화 정도를 나타낸 것이다 (RIP1, RIP3, JAK1, JAK2, JAK3).
도 9b는 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 대장조직의 염증 신호 활성화 정도를 나타낸 것이다 (STAT1, STAT3, NF-κB).
도 10은 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 대장조직의 MPO 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11a는 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 혈중 TNFα 농도를 나타낸 그래프이다.
도 11b는 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 혈중 IL-6 농도를 나타낸 그래프이다.
도 11c는 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 혈중 IL-1β 농도를 나타낸 그래프이다.
도 11d는 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 혈중 CRP 농도를 나타낸 그래프이다.
도 12a는 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 혈중 글리코겐 가인산분해효소 (PYGL) 농도를 나타낸 그래프이다.
도 12b는 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 혈중 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 활성을 나타낸 그래프이다.
도 13은 TNBS 에 의해 유도된 랫드의 대장 조직의 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 활성을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며, 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명은, 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제 (medicament)를 제조하기 위한, 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제의 용도(use)를 제공한다.
글리코겐 가인산분해효소 또는 글리코겐 인산화효소는 말단 알파-1-글리코시드 결합에서 글루코오스-1,4-포스페이트를 방출함으로써 동물에서 글리코겐의 분해를 촉매하는 효소이다. 이 효소는 활성 인산화 형태인 phosphorylase A 와 비활성 인산화 형태인 phosphorylase B의 두 가지 형태로 존재하고, 두 가지 형태는 모두 동종이량체로 존재한다. 글리코겐 가인산분해효소 저해제의 글리코겐 분해 억제 효과를 이용하여 당뇨병 치료제 연구가 많이 진행되었다. 본 발명에서, 글리코겐 가인산분해효소 저해제는 면역반응과 관련된 세포내 신호전달 및 ROS 발생을 조절하여 면역세포 매개 염증반응을 조절함으로써 염증성 장 질환 치료효과를 가진다. 기존에 알려진 염증성 장 질환 치료제 약물들은 사이토카인을 저해하는 메커니즘을 가지고 있어 예기치 못한 부작용이 발생할 수 있으나, PYGL 저해제는 면역세포 대사 조절을 통해 염증반응을 조절하여 염증성 장 질환을 치료하는 것이므로 위와 같은 부작용이 없다는 장점이 있다.
본 발명에서, 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 저해제는 하기 화학식 1 내지 8 로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며,
하기 화학식 1 로 표시되는 화합물은 N-(5-하이드록시-3,4,6-트라이메틸피리딘-2-일)-5-메틸-1H-인돌-2-카복사마이드 (INV-101)이고,
하기 화학식 2 로 표시되는 화합물은 CP-91149 이고,
하기 화학식 3 으로 표시되는 화합물은UC-205686이고,
하기 화학식 4 로 표시되는 화합물은 PSN-357이고,
하기 화학식 5 로 표시되는 화합물은GSK-1362885이고,
하기 화학식 6 으로 표시되는 화합물은 CP-368296 (Ingliforib)이고,
하기 화학식 7 으로 표시되는 화합물은 Z13865200141 이고,
하기 화학식 8 로 표시되는 화합물은 AVE-5688 이다.
<화학식 1>
<화학식 2>
<화학식 3>
<화학식 4>
<화학식 5>
<화학식 6>
<화학식 7>
<화학식 8>
본 발명에서, 상기 염증성 장 질환은 장염, 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 크론친화성 세포종, 과민성 대장 증후군, 출혈성 직장 궤양, 회장낭 염(pouchitis), 소화성 궤양, 장관형 베체트병, 및 위염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서, 상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염일 수 있다.
궤양성 대장염은 대장의 점막 또는 점막하층에 염증 또는 궤양이 생기는 질환이며, 소장 및 대장 전체에 산발적으로 발생하는 염증성 장 질환인 크론병과는 다르게 직장에서 시작되어 대장 안쪽으로 연결된 병변을 특징으로 한다. 궤양성 대장염 환자의 대부분은 하루 수회의 혈액과 점액이 섞인 묽은 변 또는 설사를 하며, 심한 경우 복통, 탈수, 발열, 구토, 체중 감소 등의 증상을 호소한다. 대부분의 궤양성 대장염은 만성 재발성 경과를 보이며, 재발할수록 상태가 악화된다.
또한, 본 발명은 1) 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 를 발현하는 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1) 의 세포에서 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 의 활성을 측정하는 단계; 및 3) 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 의 활성을 감소시키는 시험 물질을 염증성 장 질환 치료제의 후보 물질로 결정하는 단계를 포함하는, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 의 활성의 측정은 포도당-1-인산(G-1-P) 검출을 이용하여 측정하는 것일 수 있다.
상기 포도당-1-인산(G-1-P) 은 글리코겐이 글리코겐 가인산분해효소에 의해 분해되어 생성되는 물질이다. 글리코겐 가인산분해효소의 활성은 포도당-1-인산의 검출 신호의 세기에 비례한다.
본 발명에서, 상기 염증성 장 질환은 장염, 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 크론친화성 세포종, 과민성 대장 증후군, 출혈성 직장 궤양, 회장낭 염(pouchitis), 소화성 궤양, 장관형 베체트병, 및 위염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등 이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 포함할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물의 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 착색제, 향미제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일내지 유사한 것들을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 유효성분 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르며, 환자에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 예를 들면, 상기 유효성분은 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.001 내지 90 % 중량백분율로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
N-(5-하이드록시-3,4,6-트라이메틸피리딘-2-일)-5-메틸-1H-인돌-2-카복사마이드 (화합물 INV-101)
본 발명의 실시예로서 사용한 화합물 N-(5-하이드록시-3,4,6-트라이메틸피리딘-2-일)-5-메틸-1H-인돌-2-카복사마이드 [N-(5-hydroxy-3,4,6-trimethylpyridin-2-yl)-5-methyl-1H-indole-2-carboxamide, INV-101] 의 화학식은 하기 화학식 1 로 표시된다.
<화학식 1>
1H-NMR ((CD3)2SO) δ 11.54 (d, J= 1.1 Hz, 1H), 10.22 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.30 (dd, J = 12.6, 4.9 Hz, 2H), 7.03 (dd, J = 8.4, 1.4 Hz, 1H), 2.36 (d, J = 8.1 Hz, 6H), 2.17 (s, 3H), 2.04 (s, 3H).
실험예 1. 화합물 INV-101 (실시예) 의 PYGL 저해능 확인 시험
글리코겐 가인산분해효소 비색 분석 키트(Glycogen Phosphorylase Colorimetric Assay Kit)를 이용하여 본 발명의 실시예인 화합물 INV-101 의 PYGL 저해능을 확인하였다. 본 실험에서는 토끼 근육 글리코겐 가인산분해효소 (RMGPa) 를 사용하였다. 실험 물질 또는 비이클(vehicle) (1.0% DMSO 내) 은 37 °C 에서 15분 동안 5μg/ml 의 효소와 함께 변형된(modified) 이미다졸 완충액 (pH6.8) 에서 사전 인큐베이션시켰다. 양성 대조군으로 UC-205686 (0.03μM) 및 CP-91149 (3μM) 이 사용하였다. 반응은 다른 30분 인큐베이션 기간 동안 4mg/ml 글리코겐의 첨가로 개시되었다. 생성된 NADPH 의 양은 340nm 에서 분광광도계로 분석하였다. 물질들은 정확한 IC50 분석을 위하여 최소 10 개의 저해 농도 (100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0 μM) 에서 측정하였다. RMGPa 의 활성은 글루코오스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate) 를 검출하여 측정하였다.
상기 물질들의 RMGPa저해능 결과는 도 1 및 하기 표 1 과 같다. PYGL 저해제로 알려져 있는 CP-91149 및 UC-205686 의 IC50 은 각각 2.53 μM 및 0.016 μM 이고, INV-101 의 IC50 은 0.085 μM 로 측정되었다. 상기 실험예 1 의 결과로부터, 본 발명의 화합물 INV-101 (실시예) 은 강력한 PYGL 저해제임을 알 수 있다.
화합물 종 Conc. %Inh. IC50
CP-91149
 rabbit 3μM 64 2.53 μM
INV-101 (BJ-80F)
 rabbit 0.1μM 57 0.085 μM
UC-205686
 rabbit 0.03μM 74 0.016 μM
실험예 2. TNBS로 유도한 염증성 장질환 랫드 모델에서 PYGL저해제인 화합물 INV-101 (실시예) 의 경구 투여 in vivo 효능 시험
1. 시험 방법
(1) 실험동물 및 그룹화
동물은 7-8주령 된 Sprague Dawley Rat을 오리엔트바이오(Korea)로부터 구입하여 7일간 일반 고형사료로 안정화시킨 후 실험에 이용하였다. 실험 기간 중 사료와 물을 자유로이 공급하였고, 사육실의 온도는 25±1 ℃, 상대습도는 50±10%로 유지시켰다. 점등 관리는 자동조명조절기에 의해 12시간 명암주기(light-dark cycle)로 조절하였다. 실험군은 각 군당 8마리로 하여 평균 체중이 250±20 g이 되도록 무작위 블록 설계 (randomized block design)에 의하여 7군 (정상군, TNBS-Vehicle 투여군, TNBS+Filgotinib 30 mg/kg 투여군, TNBS+UC-205686 10 mg/kg 투여군, TNBS+INV-101 1 mg/kg투여군, TNBS+INV-101 3 mg/kg투여군, TNBS+INV-101 10 mg/kg투여군)으로 나누어 실험하였다.
(2) TNBS 직장 투여 장염 유발
24시간 절식한 랫드를 디에틸 에테르로 마취한 후, 폴리에틸렌 카테터를 연결한 1 mL주사기를 이용하여 결장의 내강에 50 v/v% 에탄올로 희석한 5% TNBS를 0.8 mL을 천천히 주입한 후, 항문으로 5% TNBS가 새어 나오는 것을 방지하기 위하여 랫드를 거꾸로 세운 상태에서 60초 동안 정치시켰다. 대조군은 비이클(vehicle) [50v/v% ethanol]만을 다른 군과 마찬가지 방법으로 주입하였다.
(3) 　약물　투여
TNBS를 투여한 당일 약물 투여는 TNBS 투여 2시간 후 약물의 최초 경구 투여를 실시하고 다음 날부터 6일 동안 매일 일정한 시간에 경구 투여하였다.
(4) 체중 관찰
디지털 체중계를 이용하여 절식 단계부터 TNBS 투여 및　약물　투여과정 동안 각 랫드의 체중 변화를 관찰하였다.
(5) 심장채혈 및 혈액 분석
최후 약물 투여 전 24시간 절식시킨 후 최후 약물 투여 1시간 내에 랫드를 마취시킨 후 심장채혈을 실시하였다.
(가) 혈청 사이토카인측정
혈청을 분리한 후 -80°C 냉동고에 분주하여 보관하였고, 각 사이토카인 측정 당일에 해동하여 각 ELISA kit (CRP, TNFα, IL-6, IL-1β, PYGL)를 이용하여 정량하였다.
(나) 혈액 PYGL 활성 측정
글리코겐 가인산분해효소 활성 키트(Glycogen phosphorylase activity kit, BioVision)를 이용하여 혈액 PYGL 활성을 측정하였다.
(6) 대장 무게 측정
랫드의 대장을 적출하여 항문으로부터 5-6 cm사이의 조직을 1 cm 길이로 잘라서 조직의 무게를 측정하였다.
(7) Myeloperoxidase (MPO) 측정
조직 내 호중구의 침윤한 정도를 확인하기 위해 호중구 정량하는 지표인 효소 MPO 양을 측정하였다. 대장 1 cm 크기를 차가운 PBS로 세척하고 무게를 측정하여 조직의 무게 10 mg당 용해 완충액(lysis buffer, pH7.4, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM tris, 10% glycerin, 1 mM PMSF, 1 μg/mL leupeptin and 28 μg/mL aprotinin) 500 μL를 첨가한 후 Bead Blaster® D2400 homogenizer (Benchmark Scientific, NJ, USA)를 이용하여 균질화하였다. 균질화한 시료를 1500ｘg, 5분으로 2회 원심분리하여 상등액을 얻은 다음, 이 상등액 100 μL를 MPO ELISA kit (HK210, Hycult Biotechnology, Netherlands)를 이용하여 측정하였다. 항-랫트 MPO 항체(Anti-rat MPO antibody)가 코팅된 96 well에 앞의 상등액을 100 μL 첨가하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 세척 완충액으로 3회 세척하고 여기에 재구성 추적자 (reconstituted tracer)을 100 μl 첨가하여 실온에서 1시간 반응하고 3회 반복 세척한 다음, 스트렙타비딘-과산화효소 접합체(streptavidin-peroxidase conjugate)를 100 μL 첨가하고 실온에서 1시간 반응한 후, 세척하고 TMB 기질 용액(substrate solution)을 100 μL 가하여 반응 30분 후에 반응 종결액(stop solution) 100 μl 로 정지시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. MPO 활성도는 25˚C에서 1분 동안 물에서 과산화수소 1 μM이 환원되는 수치를 의미하여 이것을 대장 조직 균질액 1 mL에 포함된 MPO 양으로 계산하였다.
(8) 대장 조직 병리 관찰
10% 중성 완충 포르말린(neutral buffered formalin)에 고정시킨 대장 조직의 H&E 염색 및 면역염색을 진행하였다.
(가) H&E 염색 및 조직 손상 측정
H&E 염색 후 현미경 하에서 관찰하여 점막 손상 및 회복 정도를 하기 표2 와 같이 점수화하였다.
점막상피
1. 궤양: 없음 (0); 경증(mild) 표면 (1); 보통 (2); 광범위한 전체 두께 (extensive-full thickness) (3)
고유층 (Lamina propria)
2. 염증 세포 침윤물: 없음 (0); 경증(mild) (1); 보통 (2); 심함 (3)
3. 혈관성 : 없음 (0); 경증(mild) (1); 보통 (2); 심함 (3)
4. 콜라겐 침착: 없음 (0); 경증(mild) (1); 보통 (2); 심함 (3)
점막하층
5. 염증세포 침윤물: 없음 (0); 경증(mild) (1); 보통 (2); 심함 (3)
6. 콜라겐 침착: 없음 (0); 경증(mild) (1); 보통 (2); 심함 (3)
7. 혈관성 : 없음 (0); 경증(mild) (1); 보통 (2); 심함 (3)
8. 부종 : 없음 (0); 경증(mild) (1); 보통 (2); 심함 (3)
점막상피
1. 궤양: 없음 (0); 경증(mild) 표면 (1); 보통 (2); 광범위한 전체 두께 (extensive-full thickness) (3)
고유층 (Lamina propria)
최대 점수: 30
(나) 대장조직 사이토카인 발현변화 측정 (ELISA 및 WB)
대장 조직을 갈아서 단백질을 추출하여 ELISA 및 WB (p-STAT1/3, STAT1/3, NF-κB, p-I-κB, I-κB, p-RIP1/3, RIP1/3, p-JAK1/2/3, TNFα, IL-6, IL-1β, IL-12, IL-17, NOS2)을 실시하였다.
(다) 대장조직 염증신호 활성화(phosphorylation) 확인
대장조직 염증신호 활성화정도는 WB으로 확인하였으며, p-STAT1/3 과 NF-kB의 시그널링(signaling)은 세포질(cytosol) 과 핵(Nucleus) 분획 각각에 대해 확인하였다.
(9) 대장 조직의 PYGL 활성 측정
글리코겐 가인산분해효소 활성 키트 (Glycogen phosphorylase activity kit, Bio Visoln) 을 이용하여 대장 조직의 PYGL 활성을 측정하였다.
2. 시험 결과
(1) TNBS로 유도한 장염증 랫드 모델에서 약물 투여에 따른 체중변화
TNBS 처리 전의 몸무게를 기준으로 7일간 매일 일정시간에 몸무게의 변화를 관찰한 결과, 도 2a에서 보는 바와 같이 정상 대조군의 체중은 계속해서 몸무게가 증가함을 보이고, TNBS 단독 투여군은 몸무게가 서서히 감소하여 투여 8일째에는 실험 시작시점 대비 23%의 체중 감소가 확인되었다 (도 2b). 각 약물투여군의 체중 회복률은 하기 표 3 과 같다. 필고티닙(Filgotinib) (30 mg/kg) 및 UC-205686 (10 mg/kg) 은 양성 대조군으로 사용되었다.
체중 회복률 (%)
Filgotinib (30mg/kg) INV-101 (1mg/kg) INV-101 (3mg/kg) INV-101 (10mg/kg) UC-205686 (10mg/kg)
22.59 ± 25.0 29.99 ± 23.4 21.15 ± 13.5 44.69 ± 24.2 28.84 ± 25.8
질병진행정도(Disease Activity Index, DAI)로 확인한 경우, TNBS 단독 투여군의 경우 질병진행 정도가 TNBS 투여 5일째에 최고에 달한 후 감소되는 경향을 보였다. 약물투여군의 경우 INV-101 10mg/kg 투여군의 경우 약물투여 3일째이후부터 확연한 감소를 보였다 (도 3). 반면 필고티닙 30 mg/kg, UC-205689 10 mg/kg, INV-101 1 mg/kg, INV-101 3mg/kg 의 경우는 서로간의 유의성은 없으나, TNBS 단독군에 비해 질병정도가 감소하였다.
(2) 대장 조직 형태 및 무게 변화
(가) 대장의 형태학적 변화
약물투여 7일 후에 대장을 적출하여 육안으로 살펴본 결과, TNBS를 단독으로 처리한 랫드의 대장은 대조군에 비하여 부종과 유착이 많이 관찰되었으며 충수돌기의 부종 또한 증가하였다. 또 일부에서는 염증이 심화되어 다른 장기 조직들과 유착현상이 나타났다 (도 4). 약물을 처리한 군에서는 TNBS군에서 나타난 부종과 충혈이 억제되었으며 특히 INV-101 의 경우 농도의존적 효과를 보였으며, INV-101 10mg/kg 투여군의 경우는 정상대조군과 유사할 정도로 회복을 보였으며, 대조약물 필고티닙 30 mg/kg 또는 UC-205689 10 mg/kg 보다 월등히 우수하였다.
(나) 대장 무게 변화
랫드의 대장을 적출하여 맹장(cecum)부터 직장까지 전체 길이의 무게를 측정한 결과, 비이클-처리 대조군에 비해 TNBS 단독 처리군의 경우 부종이 있으며 장의 무게가 유의적으로 증가하였고, 시험 물질을 투여한 그룹에서는 장의 무게가 TNBS 처리군에 비해 유의적으로 감소하였다. 화합물E투여 그룹의 효과가 가장 우수하였다 (도 5). INV-101 10mg/kg 투여군의 경우는 회복률이 73.1% 였으며, 대조약물 필고티닙 30 mg/kg의 회복률 55.1% 또는 UC-205689 10 mg/kg의 회복률 49.6%보다 월등히 우수하였다 (표4).
대장의 단위길이당 무게 회복률 (%)
Filgotinib (30mg/kg) INV-101 (1mg/kg) INV-101 (3mg/kg) INV-101 (10mg/kg) UC-205686 (10mg/kg)
55.13 ± 22.6 58.20 ± 30.1 25.03 ± 30.4 73.11 ± 25.9 49.6 ± 45.2
(3) 적출 대장의 조직 병리
(가) H&E 염색 및 조직 손상 정도
장 조직의 손상 정도 및 약물 투여에 의한 회복 정도를 확인하기 위해 H&E 염색을 실시하고, 정상대조군에 비해 TNBS 단독 투여 군에서 현저한 장점막 손상을 확인하였으며, 시험 화합물 투여에 의해 장점막 회복을 확인할 수 있었으며, INV-101 10mg/kg의 개선 효과가 가장 우수하였다(도 6).
표 2의 평가법에 의해 H&E로 염색된 조직의 손상의 정도를 측정하여 점수로 변환하여 분석한 결과, TNBS 단독 처리군에서는 점막조직의 궤양, lamina propria와 점막하층으로 염증세포의 침윤, 혈관분포, 섬유화 (collagen fiber 축적) 및 부종성 변화를 나타내었으며, 화합물 투여에 의해 장조직 손상정도가 완화되었다. INV-101은 용량의존적 효과를 보였으며, INV-101 10mg/kg 투여군의 효과가 대조약물 필고티닙 30 mg/kg 또는 UC-205689 10 mg/kg보다 월등히 우수하였다 (도 7).
(나) 대장조직 사이토카인 발현 변화
TNBS로 유도된 장염 마우스의 대장조직에서 염증 사이토카인 발현(TNFα, IL-6, IL-1β, IL-12, IL-17, NOS2)이 현저히 증가되어 있으며, 화합물 투여에 의해 거의 감소함을 확인하였다. INV-101은 용량의존적 효과를 보였으며, INV-101 10mg/kg 투여군의 효과가 대조약물 필고티닙 30 mg/kg 또는 UC-205689 10 mg/kg보다 월등히 우수하였다 (도 8).
(다) 대장조직 염증신호 활성화 정도
대장조직에서 TNBS에 의해 유도된 RIP-1/RIP-3의 인산화와 JAK2/JAK3의 인산화 및 STAT1/STAT3의 인산화가 화합물 투여에 의해 유의하게 억제됨을 확인하였다. INV-101은 용량의존적 효과를 보였으며, INV-101 10 mg/kg 투여군의 효과가 대조약물 필고티닙 30 mg/kg 또는 UC-205689 10 mg/kg보다 월등히 우수하였다 (도 9a). 또한, TNBS에 의해 유도된 STAT3와 NF-κB가 핵으로 이동하는 것을 INV-101 10 mg/kg 투여에 의해 정상대조군 수준으로 억제됨을 확인하였다(도 9b).
(4) 대장 조직 중 MPO 변화
MPO는 호중구에서 주로 발견되는 효소로서 조직에서 MPO의 존재는 호중구 침윤의 지표가 되며, 이는 곧 염증반응의 지표로써 염증성 대장염에 의한 장 손상 수치와 상관성을 나타낸다.
정상군에 비해 TNBS처리군에서 MPO 수치가 현저히 높게 나타났으며 화합물 투여에 의해 MPO 활성이 유의적으로 감소하였다. INV-101 10 mg/kg 투여군의 효과가 대조약물 필고티닙 30 mg/kg 또는 UC-205689 10 mg/kg보다 월등히 우수하였다(도 10).
(5) 혈액 분석
(가) 혈청 사이토카인 측정
혈중 사이토카인의 변화 정도를 각각의 엘라이자 키트(ELISA kit)를 이용하여 측정한 결과, TNBS단독투여군에서 증가된 사이토카인 TNFα, IL-6, IL-1β, CRP 이 화합물 처리에 의해 유의하게 억제됨을 확인하였다. 염증 사이토카인 억제 정도는 INV-101 10 mg/kg > INV-101 3 mg/kg = UC-205689 10 mg/kg > INV-101 1 mg/kg > 필고티닙 30 mg/kg 의 순으로 효과가 우수하였다 (도 11a 내지 11d).
(나) 혈액 중 PYGL 분비 양 및 활성 변화
TNBS로 유도된 장염 랫드의 혈액 중 PYGL의 양이 정상 대비 4배 정도 증가하였으며, 화합물 투여 그룹에서 유의하게 억제되었으며, INV-101 10 mg/kg 의 억제효과가 가장 강력하였으며, 나머지 그룹은 유사한 수준을 보였다(도 12a). 반면, TNBS 투여군에서 현저히 증가된 혈중 PYGL 효소 활성은 INV-101에 의해 용량의존적으로 억제되었으며, INV-101 10 mg/kg > INV-101 3 mg/kg > INV-101 1 mg/kg = UC-205689 10 mg/kg > 필고티닙 30 mg/kg 의 순으로 효과가 우수하였다(도 12b). 특히 가장 강력한 억제활성을 보인 INV-101 10 mg/kg의 경우는 정상 대조군 수준으로 회복시킴을 확인하였다.
(6) 대장 조직의 PYGL 활성
TNBS로 유도된 장염 랫드의 대장 조직의 PYGL의 양이 정상 대비 3배 정도 증가하였으며, 화합물 투여 그룹에서 유의하게 억제되었으며, INV-101 10 mg/kg 의 억제효과가 가장 강력하였으며, 나머지 그룹은 유사한 수준을 보였다. 반면, TNBS 투여군에서 현저히 증가된 대장 PYGL 효소 활성은 INV-101에 의해 용량의존적으로 억제되었으며, INV-101 10 mg/kg > INV-101 3 mg/kg > INV-101 1 mg/kg = UC-205689 10 mg/kg = 필고티닙 30 mg/kg 의 순으로 효과가 우수하였다(도 13). 특히 가장 강력한 억제활성을 보인 INV-101 10 mg/kg의 경우는 정상 대조군 수준으로 회복시킴을 확인하였다.
상기 실험예 2의 결과에 의하면, 본 발명의 PYGL 저해제인 화합물 INV-101 은 TNBS로 유도한 대장 염증 및 손상을 용량의존적으로 회복시켰으며, 혈중 및 대장조직의 염증 사이토카인의 생성을 억제하고, 혈중PYGL의 증가를 억제할 뿐 아니라 증가된 PYGL 활성도 유의하게 억제하였다. 이러한 결과로부터 PYGL 저해제인 화합물 INV-101이 PYGL활성 억제와 장염을 억제하는 효능이 매우 우수한 치료제 후보물질임이 확인되었다.
또한, 상기 실험예 2 의 결과에 따라, PYGL 저해능을 가지는 물질이 염증성 장질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있으며, 기존약물을 대체하여 사용 가능함을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 글리코겐 가인산분해효소 (PYGL) 저해제를 유효성분으로 포함하는, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 글리코겐 가인산분해효소 (PYGL) 저해제는 하기 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    <화학식 1>

    <화학식 2>

    <화학식 3>

    <화학식 4>

    <화학식 5>

    <화학식 6>

    <화학식 7>

    <화학식 8>

  3. 제 1 항에 있어서, 상기 염증성 장 질환은 장염, 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 크론친화성 세포종, 과민성 대장 증후군, 출혈성 직장 궤양, 회장낭 염(pouchitis), 소화성 궤양, 장관형 베체트병, 및 위염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염인, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 1) 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 를 발현하는 세포에 시험 물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1) 의 세포에서 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 의 활성을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 의 활성을 감소시키는 시험 물질을 염증성 장 질환 치료제의 후보 물질로 결정하는 단계
    를 포함하는, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 글리코겐 가인산분해효소(PYGL) 의 활성의 측정은 포도당-1-인산(G-1-P) 검출을 이용하여 측정하는, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 염증성 장 질환은 장염, 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 크론친화성 세포종, 과민성 대장 증후군, 출혈성 직장 궤양, 회장낭 염(pouchitis), 소화성 궤양, 장관형 베체트병, 및 위염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.

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