KR20240053668A - Wet-AMD의 유전자 치료를 위한 AAV - Google Patents
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Abstract
본 발명은 VEGF에 대한 나노바디를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터, 특히 AAV 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 눈에서 나노바디의 안정적인 발현을 제공하기 위해 예를 들어 유리체강내 주사에 의해 벡터를 투여하는 것을 포함하는 Wet-AMD를 치료하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 유전자 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Wet-AMD의 유전자 치료를 위한 AAV 벡터에 관한 것이다.
연령관련 황반변성(age-related macular degeneration)은 중심 시력의 점진적인 상실을 특징으로 하는 다양한 질병을 설명하는 임상 용어이다. AMD는 많은 산업화된 국가에서 노인들의 시력 상실의 주요 원인이다. 시력 상실은 눈의 뒤쪽에 있는 고밀도의 원추형 광수용체(photoreceptor)로 구성된 영역인 황반(macula)의 점진적인 변성으로 인해 발생하며, 이는 높은 시력, 중심 시력에 특화되어 있다.
AMD는 건성(비-신생혈관) AMD 및 습성 AMD로 나타날 수 있다. 건성 AMD는 보다 흔하고(사례의 85-90%) 경증 형태의 AMD이며, 황반 내부 및 아래에 작고 둥근 흰색-노란색 병변(드루젠(drusen))을 특징으로 한다. 눈이 노화됨에 따라 광수용체와 주변 조직의 잔해(debris)가 브루흐 막(Bruch's membrane) 내부 및 위에 축적되고(건성 AMD), 이는 염증을 일으키고 염증 세포를 망막에 동원시킨다. 이들 세포와 망막 색소 상피(retinal pigment epithelium, RPE)는 혈관이 성장하도록 자극하는 VEGF를 비롯한 사이토카인을 생성한다. 이 단계에서 건성 AMD는 습성 AMD로 진행된다. 누출된 혈관에서 나온 혈액과 체액은 광수용체와 시력에 필요한 신경을 손상시켜, 치료하지 않으면 영구적인 시력 상실을 초래할 수 있다(습성 AMD).
베바시주맙(Bevacizumab)(아바스틴(Avastin)), 콘베르셉트(Conbercept) 및 애플리버셉트(Aflibercept)와 같은 습성 AMD 치료를 위해 시중에서 판매되는 일부 약물이 있다. 그러나, 이러한 약물은 정기적으로 투여해야 하며 비용이 많이 든다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 대한 인간화 나노바디(nanobody)(Nb24)가 습성 AMD 치료에 효과적인 것으로 보고되었다(CN110452297B). 그러나 약물의 반복 투여 없이, 바람직하게는 제한된 용량, 더욱 바람직하게는 단일 용량의 투여에 의해 습성 AMD 치료에 대한 원하는 효과를 달성할 수 있는 방법이 여전히 필요하다.
요약
첫 번째 측면에서, 본 발명은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택되는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물(construct)을 제공한다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4, 5 및 7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5이다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 링커를 통해 제1 뉴클레오티드 서열에 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열번호 15, 16 및 18로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터 또는 CMV로부터의 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제1 프로모터는 서열번호 26 또는 27의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 제1 인핸서를 포함한다. 바람직하게는, 제1 인핸서는 제1 프로모터의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 인핸서는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 초기(early) 인핸서이다. 일부 구현예에서, 제1 인핸서는 서열번호 25를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 코딩 서열의 하류에 제1 폴리아데닐화(polyadenylation) 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 폴리아데닐화 신호 서열은 서열번호 31 및 32로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 제1 인트론을 포함한다. 바람직하게는, 제1 인트론은 제1 뉴클레오티드 서열의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 인트론은 길이가 적어도 200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 제1 인트론은 서열번호 28을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택되는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4, 5 및 7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5이다.
일부 구현예에서, 제2 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터 또는 CMV로부터의 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 프로모터는 서열번호 26 또는 27의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 발현 카세트는 제2 인핸서를, 바람직하게는 제2 프로모터의 상류에 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 인핸서는 CMV 초기 인핸서이다. 일부 구현예에서, 제2 인핸서는 서열번호 25를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 발현 카세트는 코딩 서열의 하류에 제2 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리아데닐화 신호 서열은 서열번호 31 및 32로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제2 발현 카세트는 제2 인트론을, 바람직하게는 제3 뉴클레오티드 서열의 상류에 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 인트론은 길이가 적어도 200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 제2 인트론은 서열번호 28을 포함한다.
일부 구현예에서, 구축물은 재조합 AAV의 게놈을 포함한다. 일부 구현예에서, 구축물은 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus)(AAV)의 5' 및 3' 역 말단 반복부(inverted terminal repeat)(ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' ITR은 AAV ITR130 및/또는 AAV ITR 105이다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' ITR 양자 모두는 AAV ITR130이다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 게놈을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구축물 또는 AAV를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 발명의 rAAV를 포함한다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 rAAV 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구축물, rAAV 또는 약제학적 조성물의 용도를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 질병은 습성 AMD이다. 일부 구현예에서, rAAV, 약제학적 조성물 또는 약제는 유리체강내(intravitreal) 주사에 의해 투여된다.
도 1은 pGCB108 백본을 가진 예시된 플라스미드의 맵을 나타낸 것이다.
도 2는 pelB 신호 서열을 갖는 나노바디를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열을 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다. 도 2A는 인간화 나노바디 HuNb24를 발현하는 11개의 구축물을 포함하는 1가(mono-valent) 나노바디를 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다(도 2A). 도 2B-2G는 2가((bi-valent) Nb24를 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다. 요소 "CMVen"은 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소(서열번호 25)를 나타내고; 요소 "CB 프로모터"는 닭 베타-액틴 프로모터(서열번호 26)를 나타내고; 요소 "hGbin 인트론"은 닭 베타-액틴 유전자의 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론(서열번호 28)을 나타내고, 요소 "CoHuNb24-n"은 Nb24 나노바디를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열(서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택됨)을 나타내고; 요소 "HA" HA 태그를 인코딩하는 서열(서열번호 30)을 나타내고, 요소 "rGB 폴리(A) 신호"는 토끼 글로빈 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호 서열(서열번호 31)을 나타내고; 요소 "CBA 프로모터"는 "CMVen" 및 "CB 프로모터"를 나타내고; 요소 "(G4S)n"은 (G4S)4, (G4S)3, (G4S)2 및 G4S(각각 서열번호 36, 37, 38 및 39)로부터 선택되는 링커에 대한 코딩 서열을 나타내고; 요소 "hGH 폴리(A)"는 인간 성장 인자 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호 서열(서열번호 32)을 나타내고; 요소 "Co3.1HuNb24"는 Nb24 나노바디를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열(서열번호 40)을 나타내고; 요소 "hIgG1Fc"는 인간 IgG1 Fc 영역을 인코딩하는 서열(서열번호 42)을 나타낸다. 하기 도면에서 동일한 명칭을 가진 요소는 동일한 서열을 나타낸다.
도 3은 벤치마크 유전자인 Beovu-scFv(서열번호 43)를 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다.
도 4A-4C는 상이한 신호 서열("IL2signal", 서열번호 41) 및 선택적으로 인간 IgG1 Fc 영역을 갖는 Nb24를 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 Nb24를 발현하는 2개의 카세트를 포함하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다. 요소 "CMV 프로모터"는 "CMVen" 및 CMV로부터의 프로모터(서열번호 44)를 나타낸다.
도 6은 변경된 인트론("pCI 인트론", 서열번호 29)을 갖는 Nb24를 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 웨스턴 블롯팅에 의한 1가 Nb24의 발현의 검출을 나타낸 것이다. 도 7A는 막의 이미지를 나타낸 것이며, 여기서 숫자 (1-11)로 표시된 레인은 각각 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-n (n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11)로 형질감염된 세포의 상청액에 해당한다. 레인 "P"는 양성 대조군이고, 레인 "sup"은 형질감염되지 않은 세포의 상청액에 해당한다. 도 7B는 "1"로 정의되는 Nb24-11(서열번호 11을 포함하는 플라스미드)의 발현 수준으로 정규화된 웨스턴 블롯팅의 정량화를 나타낸 것이다.
도 8은 웨스턴 블롯팅에 의한 1가 및 2가 Nb24의 발현의 비교를 나타낸 것이다. 숫자 (1-8)로 표시된 레인은 1가 및 2가 Nb24를 발현하기 위한 플라스미드로 형질감염된 세포의 상청액에 해당하고, "sup" 레인은 형질감염되지 않은 세포의 상청액에 해당한다.
- 1로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig;
- 2 또는 6으로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-hIgG1Fc;
- 3으로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1Co3.1Nb24(IL2 signal)-HA;
- 4로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1Co3.1Nb24(IL2 signal)-hIgG1Fc;
- 5로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4(IL2 signal)-HA;
- 7로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-2; 및
- 8로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4.
도 9는 웨스턴 블롯팅에 의한 다양한 전략으로 구축된 플라스미드의 발현의 검출을 나타낸 것이다. 레인은 다음과 같이 플라스미드에 해당한다.
- 레인 1 및 7: pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv;
- 레인 2: pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig;
- 레인 3: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA;
- 레인 4: pCB108-5ITR130-CBA-pCI-Nb24-5-hGHpA;
- 레인 5: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)4-Nb24-5-HA
- 레인 6: pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA;
- 레인 8: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5; 및
- 레인 9: 음성 대조군.
도 10은 웨스턴 블롯팅에 의한 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA(레인 1) 및 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA(n=1-4 (각각 레인 2-5, 구축물 #36-33)를 사용한 발현의 검출을 나타낸 것이다.
도 11은 다양한 버전의 Nb24 발현의 검출을 나타낸 것이다. "F1F3"으로 표시된 레인은 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv로 형질감염된 세포에 해당하며; "G4S4"로 표시된 레인은 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)4-Nb24-5-HA에 의해 형질감염된 세포에 해당하고; "Codon3.1"로 표시된 레인은 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig로 형질감염된 세포에 해당하고; "CBA-CMV"로 표시된 레인은 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA로 형질감염된 세포에 해당하고; "Nb24-5"로 표시된 레인은 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA로 형질감염된 세포에 해당한다.
도 12는 VEGF에 대한 항체의 결합을 나타낸 것이다. 도 12A에서 "HuNb24-5-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA에 의해 발현된 산물을 나타내고, "Beovu-scFv-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv에 의해 발현된 산물을 나타내고, OD525는 플레이트 백그라운드를 나타낸다. 도 B에서 "CMV-Nb24-5-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "G4S4-Nb24-5-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)4-Nb24-5-HA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "Nb24-5-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "F1F3-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv에 의해 발현된 산물을 나타낸다. 도 12C에서, 플롯 1-4는 각각 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA (n=1-4)에 의해 발현된 산물을 나타내고; 플롯 5는 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-7-HA에 의해 발현된 산물을 나타내고; 플롯 6은 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-4-HA에 의해 발현된 산물을 나타낸다. 도 12D에서, "Beovu-scFv-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv에 의해 발현된 산물을 나타내고; "Nb24-5"는 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "Nb24-4-G4S4-Nb24-7"은 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-7-HA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "Nb24-7-G4S4-Nb24-7"은 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-7-(G4S)4-Nb24-7-HA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "Codon3.1Nb24-G4S4-Codon3.1Nb24"는 pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig에 의해 발현된 산물을 나타낸다.
도 13은 VEGFR2에 대한 Nb24의 억제를 나타낸 것이다. 도 13A는 2가 Nb24s의 억제를 나타내고, 도 13B는 1가 Nb24와 2가 Nb24 사이의 비교를 나타낸 것이다.
도 14A는 VEGFR2의 VEGF에 대한 결합을 나타내고, 도 14B는 결합에 대한 VEGF에 대한 항체의 억제를 나타낸 것이다.
도 15A는 VEGF의 VEGFR2에 대한 결합의 용량 곡선을 나타내고, 도 15B는 결합에 대한 2가 Nb24의 용량 의존적 억제를 나타낸 것이다.
도 16은 rAAV의 제조를 위한 헬퍼 플라스미드(도 16A) 및 패키징 플라스미드(도 16B)의 맵을 나타낸 것이다.
도 17은 Wet AMD 모델(더치 벨티드 토끼(Dutch belted Rabbit))에 투여된 AAV의 효과를 나타낸 것이다. 형광 누출이 있는 부위는 망막 혈관신생의 심각도를 나타낸다. 도 17D의 왼쪽 패널에 대한 동물은 D7 이후 설사를 겪었으므로 D9에 확인하였고 D11에 사망하였다. 부검에서는 병태생리학의 다른 변화를 발견하지 못하였다.
도 18은 VEGFR2에 대한 Nb24의 억제를 평가하는 ELISA를 나타낸 것이다.
도 19는 VEGF에 대한 2가 Nb24의 결합을 평가하는 ELISA를 나타낸 것이다. "24-5-G4Sn-24-5"(n=1-4), "24-4-G4S4-24-7" 및 "24-4-G4S4-24-7"은 각각 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA (n=1-4), pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-4-HA, 및 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-7-HA에 의해 발현된 산물을 나타낸다.
도 20 및 21은 rAAV 게놈의 변성 전기영동을 나타낸 것이다.
도 22는 VEGF에 대한 2가 Nb24의 결합을 평가하는 ELISA를 나타낸 것이다. "24-5-G4S2-24-5", "24-5-G4S2-24-7" 및 "24-7-G4S2-24-5"는 각각 하기 플라스미드에 의해 발현된 산물을 나타낸다.
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)2-Nb24-5-HA,
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)2-Nb24-7-HA, 및
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-7-(G4S)2-Nb24-5-HA.
도 2는 pelB 신호 서열을 갖는 나노바디를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열을 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다. 도 2A는 인간화 나노바디 HuNb24를 발현하는 11개의 구축물을 포함하는 1가(mono-valent) 나노바디를 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다(도 2A). 도 2B-2G는 2가((bi-valent) Nb24를 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다. 요소 "CMVen"은 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소(서열번호 25)를 나타내고; 요소 "CB 프로모터"는 닭 베타-액틴 프로모터(서열번호 26)를 나타내고; 요소 "hGbin 인트론"은 닭 베타-액틴 유전자의 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론(서열번호 28)을 나타내고, 요소 "CoHuNb24-n"은 Nb24 나노바디를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열(서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택됨)을 나타내고; 요소 "HA" HA 태그를 인코딩하는 서열(서열번호 30)을 나타내고, 요소 "rGB 폴리(A) 신호"는 토끼 글로빈 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호 서열(서열번호 31)을 나타내고; 요소 "CBA 프로모터"는 "CMVen" 및 "CB 프로모터"를 나타내고; 요소 "(G4S)n"은 (G4S)4, (G4S)3, (G4S)2 및 G4S(각각 서열번호 36, 37, 38 및 39)로부터 선택되는 링커에 대한 코딩 서열을 나타내고; 요소 "hGH 폴리(A)"는 인간 성장 인자 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호 서열(서열번호 32)을 나타내고; 요소 "Co3.1HuNb24"는 Nb24 나노바디를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열(서열번호 40)을 나타내고; 요소 "hIgG1Fc"는 인간 IgG1 Fc 영역을 인코딩하는 서열(서열번호 42)을 나타낸다. 하기 도면에서 동일한 명칭을 가진 요소는 동일한 서열을 나타낸다.
도 3은 벤치마크 유전자인 Beovu-scFv(서열번호 43)를 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다.
도 4A-4C는 상이한 신호 서열("IL2signal", 서열번호 41) 및 선택적으로 인간 IgG1 Fc 영역을 갖는 Nb24를 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 Nb24를 발현하는 2개의 카세트를 포함하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다. 요소 "CMV 프로모터"는 "CMVen" 및 CMV로부터의 프로모터(서열번호 44)를 나타낸다.
도 6은 변경된 인트론("pCI 인트론", 서열번호 29)을 갖는 Nb24를 발현하는 구축물의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 웨스턴 블롯팅에 의한 1가 Nb24의 발현의 검출을 나타낸 것이다. 도 7A는 막의 이미지를 나타낸 것이며, 여기서 숫자 (1-11)로 표시된 레인은 각각 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-n (n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11)로 형질감염된 세포의 상청액에 해당한다. 레인 "P"는 양성 대조군이고, 레인 "sup"은 형질감염되지 않은 세포의 상청액에 해당한다. 도 7B는 "1"로 정의되는 Nb24-11(서열번호 11을 포함하는 플라스미드)의 발현 수준으로 정규화된 웨스턴 블롯팅의 정량화를 나타낸 것이다.
도 8은 웨스턴 블롯팅에 의한 1가 및 2가 Nb24의 발현의 비교를 나타낸 것이다. 숫자 (1-8)로 표시된 레인은 1가 및 2가 Nb24를 발현하기 위한 플라스미드로 형질감염된 세포의 상청액에 해당하고, "sup" 레인은 형질감염되지 않은 세포의 상청액에 해당한다.
- 1로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig;
- 2 또는 6으로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-hIgG1Fc;
- 3으로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1Co3.1Nb24(IL2 signal)-HA;
- 4로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1Co3.1Nb24(IL2 signal)-hIgG1Fc;
- 5로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4(IL2 signal)-HA;
- 7로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-2; 및
- 8로 표시된 레인: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4.
도 9는 웨스턴 블롯팅에 의한 다양한 전략으로 구축된 플라스미드의 발현의 검출을 나타낸 것이다. 레인은 다음과 같이 플라스미드에 해당한다.
- 레인 1 및 7: pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv;
- 레인 2: pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig;
- 레인 3: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA;
- 레인 4: pCB108-5ITR130-CBA-pCI-Nb24-5-hGHpA;
- 레인 5: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)4-Nb24-5-HA
- 레인 6: pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA;
- 레인 8: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5; 및
- 레인 9: 음성 대조군.
도 10은 웨스턴 블롯팅에 의한 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA(레인 1) 및 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA(n=1-4 (각각 레인 2-5, 구축물 #36-33)를 사용한 발현의 검출을 나타낸 것이다.
도 11은 다양한 버전의 Nb24 발현의 검출을 나타낸 것이다. "F1F3"으로 표시된 레인은 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv로 형질감염된 세포에 해당하며; "G4S4"로 표시된 레인은 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)4-Nb24-5-HA에 의해 형질감염된 세포에 해당하고; "Codon3.1"로 표시된 레인은 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig로 형질감염된 세포에 해당하고; "CBA-CMV"로 표시된 레인은 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA로 형질감염된 세포에 해당하고; "Nb24-5"로 표시된 레인은 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA로 형질감염된 세포에 해당한다.
도 12는 VEGF에 대한 항체의 결합을 나타낸 것이다. 도 12A에서 "HuNb24-5-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA에 의해 발현된 산물을 나타내고, "Beovu-scFv-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv에 의해 발현된 산물을 나타내고, OD525는 플레이트 백그라운드를 나타낸다. 도 B에서 "CMV-Nb24-5-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "G4S4-Nb24-5-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)4-Nb24-5-HA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "Nb24-5-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "F1F3-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv에 의해 발현된 산물을 나타낸다. 도 12C에서, 플롯 1-4는 각각 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA (n=1-4)에 의해 발현된 산물을 나타내고; 플롯 5는 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-7-HA에 의해 발현된 산물을 나타내고; 플롯 6은 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-4-HA에 의해 발현된 산물을 나타낸다. 도 12D에서, "Beovu-scFv-HA"는 pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv에 의해 발현된 산물을 나타내고; "Nb24-5"는 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "Nb24-4-G4S4-Nb24-7"은 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-7-HA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "Nb24-7-G4S4-Nb24-7"은 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-7-(G4S)4-Nb24-7-HA에 의해 발현된 산물을 나타내고; "Codon3.1Nb24-G4S4-Codon3.1Nb24"는 pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig에 의해 발현된 산물을 나타낸다.
도 13은 VEGFR2에 대한 Nb24의 억제를 나타낸 것이다. 도 13A는 2가 Nb24s의 억제를 나타내고, 도 13B는 1가 Nb24와 2가 Nb24 사이의 비교를 나타낸 것이다.
도 14A는 VEGFR2의 VEGF에 대한 결합을 나타내고, 도 14B는 결합에 대한 VEGF에 대한 항체의 억제를 나타낸 것이다.
도 15A는 VEGF의 VEGFR2에 대한 결합의 용량 곡선을 나타내고, 도 15B는 결합에 대한 2가 Nb24의 용량 의존적 억제를 나타낸 것이다.
도 16은 rAAV의 제조를 위한 헬퍼 플라스미드(도 16A) 및 패키징 플라스미드(도 16B)의 맵을 나타낸 것이다.
도 17은 Wet AMD 모델(더치 벨티드 토끼(Dutch belted Rabbit))에 투여된 AAV의 효과를 나타낸 것이다. 형광 누출이 있는 부위는 망막 혈관신생의 심각도를 나타낸다. 도 17D의 왼쪽 패널에 대한 동물은 D7 이후 설사를 겪었으므로 D9에 확인하였고 D11에 사망하였다. 부검에서는 병태생리학의 다른 변화를 발견하지 못하였다.
도 18은 VEGFR2에 대한 Nb24의 억제를 평가하는 ELISA를 나타낸 것이다.
도 19는 VEGF에 대한 2가 Nb24의 결합을 평가하는 ELISA를 나타낸 것이다. "24-5-G4Sn-24-5"(n=1-4), "24-4-G4S4-24-7" 및 "24-4-G4S4-24-7"은 각각 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA (n=1-4), pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-4-HA, 및 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-7-HA에 의해 발현된 산물을 나타낸다.
도 20 및 21은 rAAV 게놈의 변성 전기영동을 나타낸 것이다.
도 22는 VEGF에 대한 2가 Nb24의 결합을 평가하는 ELISA를 나타낸 것이다. "24-5-G4S2-24-5", "24-5-G4S2-24-7" 및 "24-7-G4S2-24-5"는 각각 하기 플라스미드에 의해 발현된 산물을 나타낸다.
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)2-Nb24-5-HA,
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)2-Nb24-7-HA, 및
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-7-(G4S)2-Nb24-5-HA.
1. 정의
달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 용어는 당업자가 알고 있는 것과 동일한 의미를 가지며, 본 발명의 실시는 당업자의 지식 내에 있는 미생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 기술을 사용할 것이다.
본원에서 사용되는 "Nb24"는 VEGF에 대한 인간화 나노바디를 지칭하며, 이는 Novamab에 의해 식별되며, 서열번호 23의 아미노산 서열 및 이의 코딩 서열을 갖는다. "Nb24-n"은 코딩 서열의 코돈 최적화된 버전, 또는 그의 발현 생성물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "나노바디", 또는 "단일 도메인 항체"라고도 하는 용어는 알파카의 말초혈액에서 최초로 발견된 경쇄가 자연적으로 결여되어 있는 항체이다. 나노바디에는 단 하나의 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)(VHH)과 두 개의 통상적 CH2 및 CH3 영역이 포함되어 있다. 개별적으로 클로닝 및 발현된 VHH는 구조가 안정적이고 원래의 중쇄 항체에 필적하는 항원 결합 활성을 가지며, 표적 항원에 결합하는 것으로 알려진 가장 작은 단위이다. 본 발명에서 용어 "나노바디"는 이의 VHH를 포함한다. VHH 결정(crystal)은 2.5 nm이고, 길이는 4 nm이며, 분자량은 15 KDa에 불과하다.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 파보바이러스과(Parvoviridae) 계통의 구성원이다. 이는 단순한 단일 가닥 DNA 바이러스이며, 복제를 위해서는 헬퍼 바이러스(예컨대 아데노바이러스)가 필요하다. 야생형 AAV의 게놈은 약 4.7 킬로베이스(kb)를 포함하고, 두 개의 역 말단 반복(ITR) 서열 사이에 cap과 rep 유전자를 포함하며, 길이는 약 145개 뉴클레오티드이고, DNA 복제가 시작되는 동안 프라이머 역할을 하는 헤어핀 구조로 접힐 수 있는 중단된(interrupted) 팔린드로믹(palindromic) 서열이 있다. cap 유전자는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하고, rep 유전자는 AAV의 복제 및 통합에 관여한다. AAV는 다양한 세포를 감염시킬 수 있으며, 바이러스 DNA는 rep 산물이 존재하는 경우 인간 염색체 19번에 통합될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "역 말단 반복부" 또는 "ITR"은 대칭성 때문에 그렇게 명명된 AAV 바이러스 시스(cis)-요소를 지칭한다. 이러한 요소는 AAV 게놈의 효율적인 증식에 필수적이다. 본 발명에서, 용어 "ITR"은 공지된 천연 AAV 혈청형(serotype)의 ITR, 상이한 혈청형으로부터 유래된 ITR 요소의 융합에 의해 형성된 키메라 ITR, 및 그의 기능적 변이체를 지칭한다.
재조합 AAV 입자의 생산에는 3개의 플라스미드, 즉 외인성 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 플라스미드, REP 및/또는 CAP 단백질을 인코딩하는 패키징 플라스미드, 및 헬퍼 플라스미드가 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드 구축물(construct)"은 자연 발생 유전자로부터 분리되거나 자연 발생하지 않는 핵산 세그먼트를 함유하도록 변형된 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 구축물이 본 발명의 코딩 서열을 발현하는데 필요한 제어 서열을 함유하는 경우, 폴리뉴클레오티드 구성물은 "발현 카세트"를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 핵산 분자(예를 들어, 100개의 염기 및 최대 30 킬로베이스 길이) 및 메신저 RNA(mRNA) 또는 miRNA 단편 또는 분자의 서열에 상보적(complementary)(안티센스)이거나 동일한(센스) 서열을 통상적으로 지칭한다. 이 용어는 전사되거나 전사되지 않는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭할 수도 있다.
본원에서 사용되는 용어 "외인성 폴리뉴클레오티드"는 그것이 위치하는 숙주로부터 유래되지 않은 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이는 숙주의 DNA와 동일하거나 이종(heterologous)일 수 있다. 일 예는 벡터에 삽입된 관심 서열이다. 이러한 외인성 DNA 서열은 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 RNA를 포함한 다양한 소스로부터 유래될 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 또한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "발현 카세트"는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 제공된 추가의 뉴클레오티드, 예를 들어 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형 및 분비를 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리펩티드 생산에 관련된 모든 단계를 포함한다.
"제어 서열"은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요하거나 유익한 모든 요소를 포함한다. 각각의 제어 서열은 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 천연이거나 이질적일 수 있거나, 서로 천연이거나 이질적일 수 있다. 이러한 제어 서열에는 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 인핸서, 신호 펩티드 서열 및 전사 종결자가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 최소한, 제어 서열에는 프로모터와 전사 및 번역의 종료를 위한 신호가 포함된다.
예를 들어, 제어 서열은 적합한 프로모터 서열, 즉 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 폴리펩티드의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 함유한다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 대장균(E. coli)의 lac 오페론일 수 있다. 프로모터는 또한 돌연변이체, 절단형(truncated) 및 하이브리드 프로모터를 포함하며, 숙주 세포에 상동성 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로부터 얻어질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 제어 서열이 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 대해 적절한 위치에 배치되어 제어 서열이 폴리펩티드 코딩 서열의 발현을 지시하는 구성을 지칭한다.
Nb24를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 발현을 개선하기 위해 다양한 조작을 받을 수 있다. 벡터에 삽입하기 전에, 발현 벡터나 숙주에 따라 폴리뉴클레오티드를 조작하는 것, 예컨대 코돈 최적화가 바람직하거나 필요하다. 재조합 DNA 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 기술은 해당 분야에 잘 알려져 있다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합"은 DNA 재조합(클로닝) 방법을 사용하여 생성되었으며 천연 또는 야생형 핵산, 벡터, 폴리펩티드 또는 단백질과 구별되는 핵산, 벡터, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 아미노산의 중합체를 지칭하고 전장 단백질 및 이의 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 rAAV 벡터의 수용자(recipient)로서 사용될 수 있거나 사용되어 온 예를 들어 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 지칭한다. 이 용어는 형질도입된(transduced) 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열이 형질도입된 세포를 지칭한다. 단일 모세포의 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 모세포와 형태나 게놈 또는 전체 DNA 보체에서 완전히 동일할 필요는 없는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는"은 생리학적으로 허용 가능하고 인간에게 투여되었을 때 일반적으로 독성이나 알레르기 또는 이와 유사한 비정상적인(untoward) 반응, 예컨대 위장 장애, 현기증 등을 일으키지 않는 분자 엔터티 및 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 인간, 침팬지 및 기타 유인원과 같은 인간이 아닌 영장류 및 원숭이 종; 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 농장 동물; 개 및 고양이와 같은 가축 포유동물; 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 설치류를 포함한 실험 동물을 포함하나 이제 제한되지는 않는다. 이 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서 성인과 신생아 대상체 뿐만 아니라 남성이든 여성이든 태아도 포함되는 것으로 의도된다.
2. VEGF에 대한 인간화 나노바디를 발현하기 위한 구축물
유전자 치료는 질병 발병의 기초가 되는 결함이 있는 유전자를 교정하고, 대상체의 관심 세포에 외인성 유전자를 도입하여 특정 질병 치료에 유용한 외인성 유전자의 산물을 발현시키는 것을 목표로 한다. 이 목적을 위한 일반적인 접근 방식은 기능성 유전자를 핵으로 전달하는 것이다. 이 유전자는 관심 세포의 게놈에 삽입되거나 에피솜으로(episomal) 남아 있을 수 있다. 대상체의 표적 세포에 기능성 유전자를 전달하는 것은 바이러스 벡터의 사용을 포함한 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다. 이용 가능한 많은 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 등) 중에서 AAV는 유전자 치료에서 다용도 벡터로 인기를 얻고 있다.
AAV로부터 유래된 벡터는 유전 물질 전달에 특히 매력적인데, (i) 이들은 근육 섬유 및 뉴런을 포함하는 다양한 비분열 및 분열 세포 유형을 감염(형질도입)시킬 수 있고; (ii) 이들은 바이러스 구조 유전자가 없으므로 바이러스 감염에 대한 자연 숙주 세포 반응, 예를 들어 인터페론 매개 반응이 제거되고; (iii) 야생형 바이러스는 인간의 어떤 병리와도 관련이 없었고; (iv) 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있는 야생형 AAV와 달리, 복제 결핍(replication-deficient) AAV 벡터는 일반적으로 에피솜으로 지속되므로 삽입성 돌연변이 유발(mutagenesis) 또는 종양 유전자 활성화의 위험을 제한하고; 및 (v) 다른 벡터 시스템과 달리 AAV 벡터는 상당한 면역 반응을 유발하지 않으므로(ii 참조) 치료용 도입유전자(transgene)의 장기간 발현을 허용하기(단 유전자 산물이 거부되지 않는 경우) 때문이다. AAV 벡터는 또한 높은 역가로 생산될 수 있으며, 동맥내, 정맥내 또는 복막내 주사는 단일 주사를 통해 설치류의 중요한 근육 영역으로 유전자 전달을 허용하는 것으로 보고되었다.
Nb24는 VEGF가 VEGFR에 결합하는 것을 차단하여 VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하는데 효과가 있는 것으로 보고되었다. 표적 세포에서 Nb24를 높은 수준으로 장기간 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드 구축물을 제공하는 것이 바람직하다.
따라서 본 발명은 대상체의 관심 세포에서 Nb24를 발현하기 위한 폴리뉴클레오티드 구축물, 바람직하게는 AAV 벡터를 제공하고자 한다.
본 발명은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 신호 펩티드 및 Nb24를 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물을 제공하며, 여기서 제1 뉴클레오티드 서열 코돈은 숙주, 바람직하게는 인간에서의 발현을 위해 최적화된다.
일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4, 5 및 7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5이다.
본 발명자들은 놀랍게도 2가(bi-valent) Nb24를 인코딩하는 구축물이 1가(mono-valent) Nb24를 인코딩하는 구축물보다 더 높은 발현을 달성한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 2가 Nb24, 즉 단일 폴리펩티드 내 Nb24의 2개의 카피를 발현하기 위한 폴리뉴클레오티드 구축물을 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 링커를 통해 제1 뉴클레오티드 서열에, 바람직하게는 제1 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열번호 15, 16 및 18로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18이다.
본 발명자들은 놀랍게도 동일한 코딩 서열을 갖는 2가 Nb24를 인코딩하는 구축물이 바이러스 품질(게놈 완전성(integrity))을 저하시킨다는 사실을 발견하였다. 따라서, 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 66-441에서 제2 뉴클레오티드 서열과 동일하지 않다.
펩티드 링커는 일반적으로 Ser 및 Gly 잔기의 조합과 같이 약 4-20개 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 짧은 펩티드일 수 있다. 본 발명의 구축물에서 링커는 이러한 펩티드 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 링커이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 펩티드 링커 (G4S)n, n=1-4를 인코딩한다. 일부 구현예에서 링커는 서열번호 36, 37, 38 및 39, 또는 그의 축퇴 변이체(degenerated variant)로부터 선택된다.
구축물은 일반적으로 발현을 위해 포유동물 세포(예컨대 인간 세포)로 전달된다. 이러한 구축물에는 종종 높은 수준의 발현을 위한 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 Rous 육종 바이러스(RSV)의 긴 말단 반복부가 포함된다. 이러한 프로모터-인핸서는 다양한 세포 유형에서 활성을 갖는다. 조직 및 세포 유형 프로모터 및 인핸서 영역도 발현에 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터/인핸서 영역에는 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유방 종양 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질, 알파 1 항트립신, 베타 글로빈, 미엘린(myelin) 염기성 단백질, 미오신 경쇄 2 및 성선 자극(gonadotropic) 방출 호르몬 유전자 조절과 같은 유전자로부터의 영역이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 제1 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터 또는 CMV로부터의 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제1 프로모터는 서열번호 26 또는 27의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 26 또는 27과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 제1 인핸서를 포함한다. 바람직하게는, 제1 인핸서는 제1 프로모터의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 인핸서는 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서이다. 일부 구현예에서, 제1 인핸서는 서열번호 25, 또는 서열번호 25와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
진핵 세포에서의 발현을 증가시키기 위해 구축물에 진핵 유기체로부터 유래된 인트론을 포함시키는 것이 또한 바람직하다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 제1 인트론을 포함한다. 바람직하게는, 제1 인트론은 제1 뉴클레오티드 서열의 상류에 있다.
본 발명자는 놀랍게도 더 긴 인트론을 포함시키면 발현이 증가된다는 사실을 발견하였다. 일부 구현예에서, 제1 인트론은 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 제1 인트론은 서열번호 28, 또는 서열번호 28과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구축물은 전사체의 프로세싱을 위한 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 코딩 서열의 하류에 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 폴리아데닐화 신호 서열은 서열번호 31 및 32, 또는 서열번호 31 또는 32와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다.
본 발명자는 또한 이중-카세트 구축물이 단일-카세트 구축물보다 더 높은 발현을 달성했다는 점에 주목하였다. 따라서, 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택되는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4, 5 및 7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제3 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5이다.
일부 구현예에서, 제2 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터 또는 CMV로부터의 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 프로모터는 서열번호 26 또는 27의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 26 또는 27과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 발현 카세트는 제2 인핸서를, 바람직하게는 제2 프로모터의 상류에 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 인핸서는 CMV 초기 인핸서이다. 일부 구현예에서, 제2 인핸서는 서열번호 25, 또는 서열번호 25와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 발현 카세트는 코딩 서열의 하류에 제2 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리아데닐화 신호 서열은 서열번호 31 및 32, 또는 서열번호 31 또는 32와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제2 발현 카세트는 제2 인트론을, 바람직하게는 제3 뉴클레오티드 서열의 상류에 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 인트론은 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 제2 인트론은 서열번호 28, 또는 서열번호 28과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 구축물은 5'에서 3'의 순서로 인핸서, 프로모터, 인트론, Nb24를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 단일 발현 카세트를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 32를 포함한다.
일부 구현예에서, 구축물은 5'에서 3'의 순서로 인핸서, 프로모터, 인트론, 제1 뉴클레오티드 서열, 링커 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 단일 발현 카세트를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 36, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 39, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다.
일부 구현예에서, 구축물은 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 31을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 31을 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 1, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 2, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 3, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 6, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 8, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 9, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 10, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 11, 서열번호 32를 포함한다.
일부 구현예에서, 구축물은 재조합 AAV의 게놈을 포함한다. 일부 구현예에서, 구축물은 아데노 관련 바이러스(AAV)의 5' 및 3' 역 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' ITR은 AAV ITR130 및/또는 AAV ITR 105이다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' ITR 양자 모두는 AAV ITR130이다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 AAV ITR105이고, 3' ITR은 AAV ITR130이다. 일부 구현예에서, 5' ITR130은 서열번호 33이다. 일부 구현예에서, 3' ITR130은 서열번호 34이다. 일부 구현예에서, 5' ITR105는 서열번호 35이다.
3. 재조합 AAV 및 약제학적 조성물
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 게놈을 포함하는 재조합 AAV를 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 신호 펩티드 및 Nb24를 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하며, 여기서 제1 뉴클레오티드 서열 코돈은 숙주, 바람직하게는 인간에서의 발현을 위해 최적화된다.
일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4, 5 및 7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5이다.
본 발명자들은 놀랍게도 2가 Nb24를 인코딩하는 구축물이 1가 Nb24를 인코딩하는 구축물보다 더 높은 발현을 달성한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 2가 Nb24, 즉 단일 폴리펩티드 내 Nb24의 2개의 카피를 발현하기 위한 폴리뉴클레오티드 구축물을 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 링커를 통해 제1 뉴클레오티드 서열에, 바람직하게는 제1 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열번호 15, 16 및 18로부터 선택된다.
본 발명자들은 놀랍게도 동일한 코딩 서열을 갖는 2가 Nb24를 인코딩하는 구축물이 바이러스 품질(게놈 완전성)을 저하시킨다는 사실을 발견하였다. 따라서, 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 66-441에서 제2 뉴클레오티드 서열과 동일하지 않다.
일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15이다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16이다.
펩티드 링커는 일반적으로 Ser 및 Gly 잔기의 조합과 같이 약 4-20개 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 짧은 펩티드일 수 있다. 본 발명의 구축물에서 링커는 이러한 펩티드 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 링커이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 펩티드 링커 (G4S)n, n=1-4를 인코딩한다. 일부 구현예에서 링커는 서열번호 36, 37, 38 및 39, 또는 그의 축퇴 변이체로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 5'에서 3'의 순서로 다음을 포함하는 2가 Nb24에 대한 코딩 서열을 포함한다,
서열번호 5, 서열번호 37, 및 서열번호 15,
서열번호 5, 서열번호 37, 및 서열번호 18,
서열번호 4, 서열번호 37, 및 서열번호 16,
서열번호 4, 서열번호 37, 및 서열번호 18,
서열번호 7, 서열번호 37, 및 서열번호 15,
서열번호 7, 서열번호 37, 및 서열번호 16,
서열번호 5, 서열번호 38, 및 서열번호 15,
서열번호 5, 서열번호 38, 및 서열번호 18,
서열번호 4, 서열번호 38, 및 서열번호 16,
서열번호 4, 서열번호 38, 및 서열번호 18,
서열번호 7, 서열번호 38, 및 서열번호 15, 또는
서열번호 7, 서열번호 38, 및 서열번호 16.
일부 구현예에서, 제1 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터 또는 CMV로부터의 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제1 프로모터는 서열번호 26 또는 27의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 26 또는 27과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 제1 인핸서를 포함한다. 바람직하게는, 제1 인핸서는 제1 프로모터의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 제1 인핸서는 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서이다. 일부 구현예에서, 제1 인핸서는 서열번호 25, 또는 서열번호 25와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
진핵 세포에서의 발현을 증가시키기 위해 구축물에 진핵 유기체로부터 유래된 인트론을 포함시키는 것이 또한 바람직하다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 제1 인트론을 포함한다. 바람직하게는, 제1 인트론은 제1 뉴클레오티드 서열의 상류에 있다.
본 발명자는 놀랍게도 더 긴 인트론을 포함시키면 발현이 증가된다는 사실을 발견하였다. 일부 구현예에서, 제1 인트론은 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 제1 인트론은 서열번호 28, 또는 서열번호 28과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구축물은 전사체의 프로세싱을 위한 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 코딩 서열의 하류에 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 폴리아데닐화 신호 서열은 서열번호 31 및 32, 또는 서열번호 31 또는 32와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 구축물은 5'에서 3'의 순서로 인핸서, 프로모터, 인트론, 제1 뉴클레오티드 서열, 링커 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 단일 발현 카세트를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 5, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 37, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 4, 서열번호 38, 서열번호 18, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 15, 서열번호 32를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 37, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 5'에서 3'의 순서로 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 7, 서열번호 38, 서열번호 16, 서열번호 32를 포함한다.
일부 구현예에서, 구축물은 아데노 관련 바이러스(AAV)의 5' 및 3' 역 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' ITR은 AAV ITR130 및/또는 AAV ITR 105이다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' ITR 양자 모두는 AAV ITR130이다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 AAV ITR105이고, 3' ITR은 AAV ITR130이다. 일부 구현예에서, 5' ITR130은 서열번호 33이다. 일부 구현예에서, 3' ITR130은 서열번호 34이다. 일부 구현예에서, 5' ITR105는 서열번호 35이다.
본 발명은 또한 rAAV를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, rAAV는 rAAV의 게놈을 포함하는 도입유전자 플라스미드, REP 및/또는 CAP 단백질을 인코딩하는 패키징 플라스미드, 및 헬퍼 플라스미드를 함유하는 시스템, 예를 들어 rAAV의 게놈을 포함하는 도입유전자 플라스미드, REP 및/또는 CAP 단백질을 인코딩하는 패키징 플라스미드, 및 헬퍼 플라스미드를 포함하는 포유동물 세포와 같은 숙주 세포에 의해 제조된다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 rAAV의 게놈을 포함하는 플라스미드와 같은 벡터를 제공한다.
일부 구현예에서, rAAV는 Crosson SM et al. (Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018; 10:1-7)에 기재된 바와 같이 패키징될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV는 인간 혈청형 1 AAV(hAAV1), hAAV 2, hAAV 3, hAAV 4, hAAV5, hAAV6, hAAV7, hAAV8, hAAV9, hAAV10 및 hAAV11로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV는 hAAV2이다. 일부 구현예에서, rAAV는 hAAV9이다.
본 발명의 AAV를 함유하는 약제학적 조성물은 선택된 양의 rAAV를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합함으로써 임의의 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다.
담체 또는 부형제의 선택은 투여 전문가의 기술 범위 내에 있으며 다양한 파라미터에 따라 달라질 수 있다. 여기에는 예를 들어 투여 방식(즉, 전신, 경구, 국소(local), 국소(topical) 또는 기타 모든 방식) 및 치료되는 질병이 포함된다. 본원에 제공된 rAAV의 투여에 적합한 약제학적 담체 또는 비히클에는 특정 투여 방식에 적합한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 담체가 포함된다. 일부 구현예에서, 치료되는 질병은 습성 AMD이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 유리체강내 주사용으로 제제화된다.
4. VEGF 관련 질병의 치료
본 발명은 본 발명의 rAAV 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질병은 습성 AMD이다. 일부 구현예에서, rAAV 또는 약제학적 조성물은 유리체강내 주사에 의해 투여된다.
본 발명은 VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구축물, rAAV 또는 약제학적 조성물의 용도를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 질병은 습성 AMD이다. 일부 구현예에서, 약제는 유리체강내 주사에 의해 투여된다.
본 발명은 VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 rAAV 또는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 질병은 습성 AMD이다. 일부 구현예에서, 약제는 유리체강내 주사에 의해 투여된다.
구현예
조항 1. 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택되고, 바람직하게는 서열번호 4, 5 및 7로부터 선택되는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 2. 조항 1에 있어서, 제1 발현 카세트가 링커를 통해 제1 뉴클레오티드 서열에 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 여기서 제1 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 66-441에서 제2 뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 3. 조항 1 또는 2에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 서열번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22로부터 선택되고, 바람직하게는 서열번호 15, 16 및 18로부터 선택되는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 4. 조항 2 또는 3에 있어서, 링커가 서열번호 36, 37, 38 및 39로부터 선택되고, 바람직하게는 서열번호 37 및 38로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 5. 조항 2-4 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드 구축물이 5'에서 3'의 순서로 다음을 포함하는 2가 Nb24에 대한 코딩 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물,
서열번호 5, 서열번호 37, 및 서열번호 15,
서열번호 5, 서열번호 37, 및 서열번호 18,
서열번호 4, 서열번호 37, 및 서열번호 16,
서열번호 4, 서열번호 37, 및 서열번호 18,
서열번호 7, 서열번호 37, 및 서열번호 15,
서열번호 7, 서열번호 37, 및 서열번호 16,
서열번호 5, 서열번호 38, 및 서열번호 15,
서열번호 5, 서열번호 38, 및 서열번호 18,
서열번호 4, 서열번호 38, 및 서열번호 16,
서열번호 4, 서열번호 38, 및 서열번호 18,
서열번호 7, 서열번호 38, 및 서열번호 15, 또는
서열번호 7, 서열번호 38, 및 서열번호 16.
조항 6. 조항 1-5 중 어느 하나에 있어서, 제1 프로모터가 닭 베타-액틴 프로모터 또는 CMV로부터의 프로모터인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 7. 조항 6에 있어서, 제1 프로모터가 서열번호 26 또는 27의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 8. 조항 1-7 중 어느 하나에 있어서, 제1 발현 카세트가 제1 인핸서를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 9. 조항 8에 있어서, 제1 인핸서가 제1 프로모터의 상류에 있는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 10. 조항 8에 있어서, 제1 인핸서가 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 11. 조항 7-10 중 어느 하나에 있어서, 제1 인핸서가 서열번호 25를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 12. 조항 1-11 중 어느 하나에 있어서, 제1 발현 카세트가 코딩 서열의 하류에 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 13. 조항 12에 있어서, 제1 폴리아데닐화 신호 서열이 서열번호 31 및 32로부터 선택되는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 14. 조항 1-13 중 어느 하나에 있어서, 제1 발현 카세트가 제1 인트론을, 바람직하게는 제1 뉴클레오티드 서열의 상류에 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 15. 조항 14에 있어서, 제1 인트론이 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 16. 조항 14에 있어서, 제1 인트론이 서열번호 28을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 17. 조항 1 또는 2에 있어서, 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택되는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 18. 조항 17에 있어서, 제3 뉴클레오티드 서열이 서열번호 4, 5 및 7로부터 선택되는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 19. 조항 17 또는 18에 있어서, 제2 프로모터가 닭 베타-액틴 프로모터 또는 CMV로부터의 프로모터인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 20. 조항 19에 있어서, 제2 프로모터가 서열번호 26 또는 27을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 21. 조항 17-20 중 어느 하나에 있어서, 제2 발현 카세트가 제2 인핸서를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 22. 조항 21에 있어서, 제2 인핸서가 제2 프로모터의 상류에 있는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 23. 조항 21에 있어서, 제2 인핸서가 CMV 초기 인핸서인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 24. 조항 23에 있어서, 제2 인핸서가 서열번호 25를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 25. 조항 17-24 중 어느 하나에 있어서, 제2 발현 카세트가 코딩 서열의 하류에 제2 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 26. 조항 25에 있어서, 제2 폴리아데닐화 신호 서열이 서열번호 31 및 32로부터 선택되는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 27. 조항 17-26 중 어느 하나에 있어서, 제2 발현 카세트가 제2 인트론을, 바람직하게는 제3 뉴클레오티드 서열의 상류에 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 28. 조항 27에 있어서, 제2 인트론이 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 29. 조항 27에 있어서, 제2 인트론이 서열번호 28을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 30. 조항 1-29 중 어느 하나에 있어서, 구축물이 재조합 AAV의 게놈을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 31. 조항 30에 있어서, 구축물이 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 5' 및 3' 역 말단 반복부(ITR) 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 32. 조항 31에 있어서, 5' 및 3' ITR이 AAV ITR130 및/또는 AAV ITR 105인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 33. 조항 32에 있어서, 5' 및 3' ITR 양자 모두가 AAV ITR130인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
조항 34. 조항 1-33 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 게놈을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV).
조항 35. 조항 34의 AAV를 포함하는 약제학적 조성물.
조항 36. 조항 34의 rAAV 또는 조항 35의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
조항 37. 조항 36에 있어서, 질병이 Wet-AMD인, 방법.
조항 38. 조항 37에 있어서, rAAV 또는 약제학적 조성물이 유리체강내 주사에 의해 투여되는 것인, 방법.
조항 39. 조항 1-33 중 어느 하나의 구축물 또는 조항 34의 rAAV를 포함하는 숙주 세포.
조항 40. VEGF와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 조항 1-33 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 구축물, 조항 34의 rAAV, 조항 35의 약제학적 조성물, 또는 조항 39의 숙주 세포의 용도.
조항 41. 조항 40에 있어서, 질병이 Wet-AMD인, 용도.
조항 42. 조항 41에 있어서, 약제가 유리체강내 주사에 의해 투여되는 것인, 용도.
조항 43. VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하는 용도를 위한, 조항 34의 rAAV 또는 조항 35의 약제학적 조성물.
조항 44. 조항 43에 있어서, 질병이 Wet-AMD인, 용도를 위한 rAAV 또는 약제학적 조성물.
조항 45. 조항 44에 있어서, rAAV 또는 약제학적 조성물이 유리체강내 주사에 의해 투여되는 것인, 용도를 위한 rAAV 또는 약제학적 조성물.
발명의 이점
본 발명은 Nb24의 발현을 증가시키고, Nb24의 활성(VEGF에 대한 결합 및/또는 VEGFR2와 같은 VEGFR에 대한 억제)을 증가시키고/시키거나 바이러스 품질을 개선시키는 폴리뉴클레오티드, 구축물, 벡터 및 rAAV를 제공한다.
실시예
하기 실시예는 본 출원에 대한 어떠한 제한이 아니라 단지 설명을 위해 제공된다.
실시예
1.
VEGF
나노바디
또는
VEGF
항체를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열을 포함하는 벡터의 구축
1.1. Nb24 나노바디 (인간화) 코돈 최적화된 플라스미드의 구축
사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소(서열번호 25) 및 닭 베타-액틴 프로모터(서열번호 26)와 함께 pGCB108 플라스미드를 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB, 카탈로그 E2621)를 사용하여 닭 베타-액틴 유전자의 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론(F1으로 지칭됨, 서열번호 28) 및 신호 서열을 포함하는 Nb24 나노바디를 인코딩하는 코돈 최적화된 서열(서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로부터 선택됨), 및 rGBpoly A 신호 서열(서열번호 31)과 함께 깁슨 어셈블하여(Gibson Assembled) 11개의 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-n(n=1-11, 도 1 및 도 2A 참조)를 생성하였다. 제한 매핑(AgeI(R3552L) 및 KpnI(R3142L), 양자 모두 NEB에서 제공, 제조업체의 지침에 따름) 및 DNA 시퀀싱(GENEWIZ, Suzhou, China)을 수행하여 올바른 플라스미드 구축을 확인하였다.
1.2. 2가 Nb24 나노바디 플라스미드의 구축
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5의 rGBpoly A 신호 서열(서열번호 31)을 hGHpolyA 서열(서열번호 32)로 대체하여 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA를 생성하고; Gibson Assembly에 의해 링커(G4S)n을 사용하여 2개의 Nb24-5 서열(서열번호 5 및 서열번호 16)을 결찰시켜 2가 Nb24 나노바디 플라스미드를 구축하였고, 그 결과 서열번호 5, G4S 링커(서열번호 36, 37, 38, 또는 39) 및 서열번호 16을 포함하는 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA(n=1-4, 도 2B), 뿐만 아니라 서열번호 5, 서열번호 38 및 서열번호 18을 포함하는 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)2-Nb24-7-HA, 및 서열번호 7, 서열번호 38 및 서열번호 16을 포함하는 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-7-(G4S)2-Nb24-5-HA를 생성하였다.
플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5_stuffer는 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA의 서열번호 32의 다운스트림에 서열번호 49의 스터퍼 서열을 첨가하여 구축하였다. 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)4-Nb24-5-HA _stuffer는 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)4-Nb24-5-HA의 hGHpolyA 서열의 하류에 서열번호 49의 뉴클레오티드 1-1800을 삽입하여 구축하였다.
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4 및 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-7을 기반으로, pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-4-hGHpA 및 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-7-hGHpA를 중간체로 사용하여 유사한 방법을 사용하여 하기의 2가 플라스미드를 구축하였다:
- 서열번호 4, 서열번호 36, 및 서열번호 15를 포함하는 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-4-HA(도 2C),
- 서열번호 4, 서열번호 36, 및 서열번호 18을 포함하는 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-7-HA(도 2D), 및
- 서열번호 7, 서열번호 36, 및 서열번호 15를 포함하는 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-7-(G4S)4-Nb24-7-HA(도 2E).
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5의 신호 서열(서열번호 5의 뉴클레오티드 1-66)을 IL2 신호 서열(서열번호 41)로 교체하고; Nb24-5 서열(서열번호 16)을 링커 (G4S)4로 연결된 2개의 Nb24 서열(Co3.1HuNb24, 서열번호 40)로 교체하고; 선택적으로 HA 태그(서열번호 30)를 hIgG1Fc(서열번호 42)로 교체함으로써 추가의 2가 플라스미드를 구축하였고, 그 결과 하기 플라스미드를 생성하였다:
- pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig(도 2F); 및
- pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-hIgG1Fc(도 2G).
제한 매핑 및 DNA 시퀀싱을 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 수행하여 올바른 플라스미드 구축을 확인하였다.
1.3. 벤치마크 항- VEGF 플라스미드의 구축
pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv 플라스미드(도 3)를 다음과 같이 구축하였다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소 및 닭 베타-액틴 프로모터와 함께 pGCB108 플라스미드를 닭 베타-액틴 유전자의 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론(F1) 및 Beovu-scFv 서열(서열번호 43)의 PCR 산물과 함께 Gibson 어셈블하였다. 제한 매핑 및 DNA 시퀀싱을 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 수행하여 올바른 플라스미드 구축을 확인하였다.
1.4. IL2 신호 펩티드 Nb24 나노바디 플라스미드의 구축
1) 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4에서 Nb24-4-HA의 신호 펩티드를 인코딩하는 서열(서열번호 4의 위치 1-66)을 Gibson Assembly에 의해 IL2 신호 펩티드를 인코딩하는 서열(서열번호 41)로 교체하여 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4(IL2 신호)-HA (도 4A)를 구축하였다.
2) pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4(IL2 신호)-HA에서 Nb24-4 서열을 Co3.1Nb24(서열번호 40) DNA 서열로 교체하여 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Co3.1Nb24(IL2 신호)-HA(도 4B)를 구축하였고, HA 태그를 인코딩하는 서열을 hIgG1Fc를 인코딩하는 서열(서열번호 42)로 추가로 대체하여 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Co3.1Nb24(IL2 신호)-hIgG1Fc(도 4C)를 구축하였다. 제한 매핑 및 DNA 시퀀싱을 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 수행하여 올바른 플라스미드 구축을 확인하였다.
1.5. 이중 프로모터 플라스미드의 구축
플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA(도 5)를 다음과 같이 구축하였다: pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5의 프로모터를 T4 DNA 결찰을 사용하여 CMV 프로모터(서열번호 44)로 교체하고; CMV-F1Nb24-5-rGBpA의 GOI를 추가 제한 효소(NotI)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고; 제한 효소 분해 및 T4 DNA 결찰을 사용하여 CMV-F1Nb24-5-rGBpA의 GOI를 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA의 hGHpolyA 서열의 하류에 결찰시켜 이중 프로모터 플라스미드를 트랜스로(in trans) 구축하였다. 제한 매핑 및 DNA 시퀀싱을 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 수행하여 올바른 플라스미드 구축을 확인하였다.
1.6. 상이한 인트론과 ITR을 사용한 플라스미드 구축
플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5의 F1을 pCI(서열번호 29)로 변경하고, 제조업체의 지침에 따라 T4 DNA 결찰(T4 DNA 리가제, NEB, M0202L)을 사용하여 5ITR130(서열번호 33)을 5ITR105(서열번호 35)로 교체하여 플라스미드 pGCB108-5ITR130-CBA-pCI-Nb24-5-hGHpA(도 6)를 구축하였다. 제한 매핑 및 DNA 시퀀싱을 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 수행하여 올바른 플라스미드 구축을 확인하였다.
실시예
2. 코돈 최적화 플라스미드를 사용한
Nb24
나노바디의
발현
Expi293 세포(Thermo Fisher Scientific)를 제조사의 프로토콜에 따라 37℃, 8% CO2, 80% 습도에서 배양하였다. Expi293 세포를 2.5×106개 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에 시딩하고, 제조업체의 프로토콜(Thermo Fisher Scientific)에 따라 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-n(n=1-11)으로 형질감염시켰다. 형질감염 효율을 나타내는 기준으로서 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv를 각각의 CoNb24 도입유전자에 1:9의 비율로 첨가하였다. 형질감염 72시간 후에 배양물의 상청액을 수집하였다.
동일한 부피의 Nb24 상청액을 PAGE 용 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔에 로딩하였다(1 μl 환원 + 9 μl 4Xli-cor 단백질 로딩 + 30 μl sup, 200V, 22분). iBlot® 2 Gel Transfer Device(Thermo Fisher Scientific) 및 iBlot® 2 Transfer Stack(니트로셀룰로오스, 일반 크기)을 사용하여 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 차단 완충액(Odyssey, Li-Cor)으로 1시간 인큐베이션하고 3회 헹군 후(1분/헹굼), 막을 동일한 완충액에서 1차 항체(항-HA 토끼(Thermo, PA1-985), 1:5000, 4℃, 하룻밤)로 탐침(probe)하고, 이어서 3회 헹군 다음(1분/헹굼) 당나귀 항-토끼(Donkey Anti-rabbit) 800CW, (1:5000) (카탈로그 번호 REF926-32213, Li-Cor)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. TBST(희석된 Pierce™ 20X TBS Tween™ 20 Buffer, Thermo Fisher Scientific의 카탈로그 번호: 28360)로 2시간 동안 세척한 후(15분/세척), 오디세이 적외선 이미저(Odyssey Infrared Imager)(Li-Cor)를 사용하여 면역반응을 시각화하였다.
도 7A에 도시된 바와 같이, 모든 11개의 코돈 최적화된 플라스미드(pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-n, n=1-11)는 Nb24를 효율적으로 발현할 수 있다. 플라스미드의 발현은 신호의 강도를 기준으로 계산하였으며, pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-11에 의한 발현을 기준으로 정규화하였고, 이는 "1"로 표시하였다. 더 높은 발현이 3개의 플라스미드(pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4, -5 및 -7)에서 관찰된 한편, pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5에 의한 발현이 가장 높았고 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-11 보다 2배 이상 높았다(도 7B).
실시예
3. 2가
Nb24
나노바디의
발현
3.1. Expi293 세포(Thermo)를 배양하고 제조사의 프로토콜에 따라 하기 플라스미드로 형질감염시켰다:
- pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig;
- pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-hIgG1Fc;
- pGCB108-ITR130-AMDF1Co3.1Nb24(IL2 신호)-HA;
- pGCB108-ITR130-AMDF1Co3.1Nb24(IL2 신호)-hIgG1Fc;
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4(IL2 신호)-HA;
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-2; 및
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4.
형질감염 72시간 후 세포 상청액을 수집하고 웨스턴 블롯팅으로 테스트하였다. 세포 배양 및 형질감염, 그리고 웨스턴 블롯팅은 1차 항체를 희석(1:2000)한 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였고, 항-Fc HRP(1:3000, invitrogen, A18823)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하여 hIgG1Fc를 인코딩하는 플라스미드를 검출하였고, Odyssey Infrared Imager(Li-Cor)를 사용하여 시각화하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, 2가 플라스미드(1, 2, 4 및 6으로 표시된 레인)는 1가 플라스미드(3, 5, 7 및 8로 표시된 레인)에 비해 더 높은 발현 수준을 달성하였다.
3.2. Expi293 세포를 배양하고 제조사의 프로토콜에 따라 하기 플라스미드로 형질감염시켰다:
- pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv;
- pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig;
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA;
- pCB108-5ITR130-CBA-pCI-Nb24-5-hGHpA;
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)4-Nb24-5-HA;
- pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA; 및
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5.
형질감염 72시간 후 세포 상청액을 수집하고 웨스턴 블롯팅으로 테스트하였다. 세포 배양 및 형질감염, 그리고 웨스턴 블롯팅은 2차 항체를 희석(1:2500)한 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, 이중 프로모터 플라스미드(pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA, 레인 3)는 단일 프로모터 플라스미드(pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig, 레인 2)와 비교하여 Nb24 발현이 증가한 것으로 나타났다.
또한 더 짧은 인트론을 포함하는 플라스미드(pCB108-5ITR130-CBA-pCI-Nb24-5-hGHpA, 레인 4)가 감소된 Nb24 발현을 나타내는 것으로 나타났다.
3.3. Expi293 세포를 배양하고 제조사의 프로토콜에 따라 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA 및 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA로 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후 세포 상청액을 수집하고 웨스턴 블롯팅으로 테스트하였다. 세포 배양 및 형질감염, 그리고 웨스턴 블롯팅은 2차 항체를 희석(1:2500)한 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 10에 나타내었다: 1가 Nb24의 발현 수준은 2가 Nb24에 비해 낮으며, 2가 Nb24는 링커의 길이로 인해 크기가 서로 구별되는 반면, 발현 수준은 유사하였다.
실시예
4.
Nb24의
다양한 버전의 발현
Expi293 세포를 배양하고 제조사의 프로토콜에 따라 하기 플라스미드로 형질감염시켰다:
- pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv;
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)4-Nb24-5-HA;
- pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig;
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA; 및
- pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA.
형질감염 72시간 후 세포 상청액을 수집하고 웨스턴 블롯팅으로 테스트하였다. 세포 배양 및 형질감염, 그리고 웨스턴 블롯팅은 2차 항체를 희석(1:2500)한 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 11에 도시된 바와 같이, 플라스미드의 도입유전자는 잘 발현되었고, 1가 Nb24의 발현 수준은 이중 프로모터 구축물을 사용하여 약간 더 높았으며, Nb24-5에 의해 암호화된 2가 Nb24(서열번호 5 및 16)가 Co3.1 HuNb24(서열번호 40)에 의해 암호화된 것보다 높았다.
실시예
5.
VEGF에
대한
HuNb24의
결합
HuNb24의 결합을 VEGFA-165(R&D systems 293-VE/CF)를 사용한 ELISA로 테스트하였다. 구체적으로, expi293 세포에 플라스미드 pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA 및 pGCB108-ITR130-AMDF1-Beovu-scFv를 형질감염시켜 HuNb24를 발현시키고, 형질감염된 세포(이하 각각 Nb24 및 Beovu로 지칭함)의 배양물의 상청액을 형질감염 72시간 후에 수집하였다. 상청액의 농도를 실시예 2에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯팅에 의해 결정하였다. ELISA는 다음과 같이 수행하였고, 형질감염되지 않은 세포로부터의 상청액을 음성 대조군으로 사용하였다.
ELISA 플레이트(Corning, REF3690)에 VEGFA-165를 1 μg/ml의 농도로, 50 μl/웰에서 플레이트의 절반-웰 높이로 밤새 코팅하였다. 스타터 차단제(StartingBlock™ T20(TBS) 차단 완충액, Thermo Fisher Scientific의 카탈로그 번호: 37543)와 함께 실온에서 부드럽게 진탕하면서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 미리 희석한 Nb24 상청액과 Beovu 상청액을 ELISA 플레이트에 첨가하고, 이어서 실온에서 부드럽게 진탕하면서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 차단제를 제거한 후, 1차 항체(토끼 항-HA, Thermo, PA1-985)를 차단 완충액(StartingBlock™ T20 (TBS) Blocking Buffer, Thermo Fisher Scientific의 카탈로그 번호: 37543)으로 희석(1:5000)하고, ELISA 플레이트(50 μl/웰)에 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 250 rpm으로 부드럽게 진탕하면서 인큐베이션하였다. 1XTBST 완충액으로 3회 세척 후, 2차 항체(염소 항-토끼-HRP, Invitrogen, 3146)를 차단 완충액으로 희석(1:5000)한 후 ELISA 플레이트에 (50 μl/웰) 첨가하고 이어서 부드럽게 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 1XTBST로 3회 세척한 후, TMB 기질(Thermo Scientific, REF34028)을 플레이트에 첨가하였다(50 μl/웰); 5-10분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 2 M H2SO4를 첨가하여 TMB 반응을 중단시켰다. ELISA 플레이트의 OD450 및 OD525를 검출하였다. 인간 VEGFA에 대한 Nb24 및 Beovu의 용량 의존적 결합을 Graph pad prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
또한, 위에서 설명한 대로 발현된 1가 및 2가 Nb24의 결합에 대해 하기 플라스미드를 테스트하였다:
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA;
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA (n=1-4);
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-4-HA;
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-7-HA;
- pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-7-(G4S)4-Nb24-7-HA; 및
- pGCB108-ITR130-AMDF1 Bi-huNb24-pCDNA3.1+-HA_IL2sig.
도 12에 도시된 바와 같이, 1가 및 2가 Nb24는 VEGF에 잘 결합하였다. 또한, 1가 및 다양한 2가 Nb24에 대한 표준 곡선은 유사한 모양이었다(도 12C 및 12D).
실시예
6.
Nb24에
의한
VEGFR2의
억제
Nb24에 의한 VEGFR2/NFAT 리포터-HEK293 세포(BPS Bioscience, Catalog #: 79387)에서 VEGF의 키나제 활성의 억제를 다음과 같이 테스트하였다.
VEGFR2/NFAT 리포터-HEK293 세포를 제조사의 지침에 따라 완전 성장 배지에서 배양하고, 배양물에서 수확하고, 흰색 투명 바닥 96웰 마이크로플레이트(PerkinElmer, 6005)에 완전 성장 배지 100 μl 중 웰당 ~40,000개 세포의 밀도로 접종하였다. 세포를 CO2 인큐베이터에서 37℃로 약 16시간 동안 인큐베이션하였다. 완전 성장 배지를 제거하고 80 μl의 분석 배지(제조업체의 지침에 따라)를 추가하였다. 세포를 CO2 인큐베이터에서 37℃로 약 1시간 동안 인큐베이션하였다. VEGF와 1가 Nb24 및 2가 Nb24의 혼합물은 a) 분석 배지 중의 VEGF 용액(250 ng/ml)을 준비하고; b) 분석 배지 중의 연속 희석된 Nb24 용액을 준비하고(초기 농도 10 μg/ml, 2X 연속 희석, 12개 샘플, 마지막 지점은 분석 배지만 사용); c) VEGF 용액 30 μl와 연속 희석된 2가 Nb24 용액 30 μl를 혼합하고 실온에서 150 rpm으로 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하여 제조하였다. 혼합물 20 μl를 세포를 포함하는 웰에 이중으로 첨가하고, 백그라운드 발광을 결정하기 위해 100 μl의 분석 배지를 무세포 대조 웰에 첨가하였다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 37℃로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 분석은 권장 지침에 따라 ONE-Step™ 루시퍼라제 분석 키트(ONE-Glo™ 루시퍼라제 분석 시스템, 선택된 카탈로그 번호: Promega의 E6120)를 사용하여 수행하였으며: 웰당 최종 ONE-Step™ 루시퍼라제 시약 100 μl를 추가하고 웰을 실온에서 ~15 내지 30분 동안 흔든 후 루미노미터(luminometer)를 사용하여 발광을 측정하였다.
억제를 발광에 의해 나타내었으며, 이는 각 웰의 발광 판독값에서 평균 백그라운드 발광(무세포 대조군 웰)을 빼서 계산하였다.
도 13A에 도시된 바와 같이, 2가 Nb24는 1.449-2.478 nM의 IC50으로 VEGF의 키나제 활성을 억제하는데 있어서 유사하다(하기 표 1 참조).
표 1. 2가 Nb24의 IC50
도 13B에 도시된 바와 같이, 2가 Nb24는 1가 Nb24보다 더 강한 억제를 나타내었다.
실시예
7.
VEGFR2의
VEGF에
대한 결합
인간 VEGFR2의 인간 VEGF에 대한 결합을 ELISA에 의해 검출하였다.
ELISA 플레이트에 VEGFA-165를 1 μg/ml의 농도로, 50 μl/웰에서 플레이트의 절반-웰 높이로 밤새 코팅하였다. 스타터 차단제와 함께 실온에서 부드럽게 진탕하면서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 미리 희석한 인간 VEGFR2/KDR Fc 키메라 단백질(RnD systems 및 Novamab)을 ELISA 플레이트에 첨가하고 이어서 실온에서 부드럽게 진탕하면서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 차단제를 제거한 후, 검출 항체(토끼 항-인간 FC HRP, Thermo)를 차단 완충액으로 1:5000으로 희석하고 50ul/웰을 첨가하고 250 rpm으로 부드럽게 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 1XTBST로 3회 세척한 후, TMB 기질을 플레이트에 첨가하였다(50 μl/웰). 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션한 후, 2 M H2SO4를 첨가하여 TMB 반응을 중단시켰다. ELISA 플레이트의 OD450 및 OD525를 검출하였다. 인간 VEGF에 대한 VEGFR2의 용량 의존적 결합을 Graph pad prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
도 14A에 도시된 바와 같이, VEGFR2는 Nb24 부재 하에 인간 VEGF에 결합할 수 있다.
유사한 절차에 따라 경쟁적 ELISA도 수행하였으며, 연속 희석된 Nb24 또는 Beovu 용액을 사전 희석된 인간 VEGFR2/KDR Fc 키메라 단백질(1 μg/ml)과 1:1(v/v)의 비율로 혼합하였다.
도 14B에 도시된 바와 같이, VEGFR2의 VEGF에 대한 결합은 Nb24 및 Beovu에 의해 억제되었다.
실시예
8.
VEGF의
VEGFR2에
대한 결합
VEGF의 VEGFR2에 대한 결합을 다음과 같이 세포 기반 검정에 의해 검출하였다.
1) VEGFR2/NFAT 리포터 HEK293 재조합 세포는 제조사의 프로토콜에 따라 배양하였다.
2) HEK293 재조합 세포에 대한 VEGF 용량 반응을 VEGFA-165를 사용하여 제조사(BPS Bioscience)의 프로토콜에 따라 수행하였다.
3) 루시퍼라제 분석은 ONE-Step™ Luciferase Assay 키트를 사용하여 수행하였다.
4) 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)을 이용하여 데이터를 계산하였다.
도 15A에 도시된 바와 같이, hVEGF는 Nb24의 부재 하에 VEGFR2를 발현하는 세포에 대해 17.43 ng/ml의 EC50으로 용량 의존적 결합을 나타내었다.
VEGF(25 ng/ml)와 연속 희석된 Nb24-5(G4S)4Nb24-5의 혼합물을 사용함으로써 약간 변형시킨 실시예 6에 기재된 분석을 수행하여 VEGF와 VEGFR2의 결합에 대한 Nb24의 효과를 검출하였다. VEGF의 VEGFR2에 대한 결합은 30.40 ng/ml의 EC50으로 Nb24에 의해 억제되는 것으로 나타났다(도 15B).
실시예 9. Nb24를 인코딩하는 벡터를 이용한 유전자 치료
표 2에 나열된 재조합 AAV(그룹 3-8)를 Crosson SM et al. 2018에 기재된 것과 유사한 방법으로 제조하였으며, 다양한 패키징 플라스미드와 도입유전자 플라스미드를 사용하였다. 간략하게, 무혈청 바이러스 생산 배지 OPM-293 CD05(Shanghai OPM Biosciences Co.Ltd. 카탈로그: 81075-001) 내 3E6 세포/ml 293VPC 세포(Thermo, 카탈로그 A35347)를 폴리에틸렌이민을 사용하여 헬퍼 플라스미드, rep/cap을 인코딩하는 패키징 플라스미드 및 아래의 도입유전자 플라스미드로 삼중 형질감염시켰다.
- 헬퍼 플라스미드(Crosson Sm et al.에 기재된 바와 같은 Ad E2A, E4 및 VA RNA 헬퍼 유전자를 함유하는 "pHelper", 이의 맵은 도 16A에 도시되어 있음);
- 패키징 플라스미드, 예시적인 맵이 도 16B에 도시되어 있으며, 여기서 "AAV2 Cap"은 AAV2-m2(그룹 3의 경우, 서열번호 44)의 Cap 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체될 수 있고, AAV9(그룹 4 및 6의 경우, 서열번호 45), AAV2.GL(그룹 5의 경우, 서열번호 46), AAV2-7m8-flank(그룹 7의 경우, 서열번호 47), 또는 AAV2-NN(그룹 8의 경우, 서열번호 48), "AAV2 Rep"는 야생형 AAV2 Rep 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
- 도입유전자 플라스미드, pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA(그룹 3 및 5-8의 경우), 또는 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA(그룹 4의 경우).
37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 수확하고 요오딕사놀 구배(iodixanol gradient)를 통해 바이러스 입자를 정제하였다(Crosson SM et al. 참조).
rAAV를 ddPCR에 의해 역가에 대해 테스트하였으며, 이들은 모두 1012 바이러스 게놈(vg)/mL보다 높은 수준이었다(표 2 참조). 구체적으로, ddPCR을 Bio-Rad의 QXDx AutoDG ddPCR System과 QXDx Universal Kit for AutoDG ddPCR System을 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였고, 하기의 프라이머와 프로브를 사용하였다.
qPCR-AMD-24-5-F GAGTGCGAGCTGGTGAG (서열번호 50)
qPCR-AMD-24-5-R GCGTAGTCCCTGCTGATG (서열번호 51)
qPCR-AMD-24-5-P CAAGGACGGCAGCACCTACTACAC (서열번호 52)
유전자 치료는 더치 벨티드(Dutch belted, DB) 토끼(JOINN New Drug Development Center, Ltd.)에서 수행하였다.
구체적으로, 각각 2020년 4월과 2020년 7월에 DL-α-AAA의 유리체강내 주사(intravitreal injection, IVI)에 의해 더치 벨티드(DB) 토끼의 두 코호트의 오른쪽 눈(OD) 한쪽에만(unilaterally) 망막 신생혈관(RNV)을 유도하였다. 실험 눈의 RNV를 2021년 4월 24일과 5월 16일에 각각 안저 영상(fundus imaging)과 망막 형광 혈관조영술(FA)로 평가하였으며, 눈에 보이는 RNV와 형광 누출이 있는 토끼를 유전자 치료 대상으로 선정하였다.
RNV의 중증도를 전자 안저 영상의 형광 누출 영역(픽셀)을 측정하여 수치적으로 등급을 매겼다. 선택된 동물을 무작위로 그룹화하였으며(n=3/그룹) 그룹 간 누출 영역에 큰 차이가 없는지 확인하였다(데이터는 표시되지 않음).
대조군 및 rAAV를 포함하여 표 2에 나열된 테스트 물품을 100 μl/눈의 용량으로 유리체강내(IVT) 주사에 의해 동물의 오른쪽 눈에 투여하였다. AMD에 대한 시판 약물인 Eylea®를 양성 대조군으로 사용하고, 비히클을 음성 대조군으로 사용하였다. 테스트된 물품의 효과를 안저 영상 및 망막 형광 혈관조영술(FA)에 의해 통해 평가하였다.
표 2. 테스트된 벡터(역가는 ddPCR로 확인함)
비히클은 RNV로 인한 플루오레세인(fluorescein) 누출을 변경하지 않았으며(도 16A), IVT 후 눈의 염증 반응은 무시할 만한 수준인 반면, Eylea®(4 mg/100ul)는 RNV로 인한 누출을 완전히 중단시켰고(도 16B), 눈의 염증 반응은 방수(aqueous humor), 유리체액(vitreal humor)의 세포 침윤 및 유리체 혼탁(vitreal cloudiness)을 포함하여 경미한 것으로 관찰되었다.
그룹 3에서는 RNV로 인한 누출이 투여 후 14일 동안 개선되지 않았으며(도 16C), 눈의 염증 반응의 중증도는 경미했고 Eylea 그룹에서 관찰된 것과 유사하였다.
그룹 4에서는 RNV 누출에 대한 상당한 치료 효능이 유도되었으며(도 16D), 눈의 염증 반응은 유리체액의 세포 침윤 및 유리체 혼탁을 포함하여 경증 내지 중등도였다.
그룹 5에서는 RNV 누출에 대한 상당한 치료 효능이 유도되었으며(도 16E) 눈의 염증 반응은 방수, 유리체액의 세포 침윤 및 명백한 유리체 혼탁을 포함하여 중등도였다.
그룹 6에서는 RNV로 인한 누출이 투여 후 14일 동안 개선되지 않았으며(도 16F), 경증 내지 중등도 정도의 유리체 세포 침윤 및 혼탁이 주요 관찰이었다.
그룹 7에서는 RNV로 인한 누출이 투여 후 14일에 부분적으로 개선되었으며(도 16G), 방수, 유리체액의 경미한 세포 침윤 및 유리체 혼탁이 주요 관찰이었다.
그룹 8에서는 RNV로 인한 누출이 투여 후 14일에 부분적으로 개선되었으며(도 16H), 유리체액에서의 중간 정도의 세포 침윤 및 혼탁이 주요 관찰이었다.
실시예 10. Nb24를 인코딩하는 구축물의 최적화
본 실시예는 Nb24를 인코딩하는 최적의 구축물을 얻기 위해 수행하였다.
10.1 2가 Nb24는 1가 Nb24보다 VEGFR2에 대해 더 높은 억제를 달성하였다.
Expi293 세포를 실시예 2에 따라 하기 플라스미드로 형질감염시켰다:
pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA, 및
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)2-Nb24-7-HA.
상청액 중의 1가 및 2가 Nb24를 실시예 2에 기술된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 정량화하고 일련의 농도로 희석하였다. VEGFR2에 대한 억제는 실시예 7에 기술된 바와 같이 ELISA로 테스트하였고, 상업적으로 이용 가능한 제품인 Lucentis(NOVARTIS, SAWE7)를 기준으로 사용하였다.
도 18에 도시된 바와 같이, 2가 Nb24는 1가 Nb24보다 5X 더 나은 IC50을 나타낸 반면(25.6 nM 대 132.5 nm), Lucentis는 62.1 nM의 IC50을 나타내었다.
10.2. 링커 (G4S)3 또는 (G4S)2가 있는 2가 Nb24는 (G4S)1 또는 (G4S)4가 있는 것보다 더 높은 친화성을 나타내었다.
Expi293 세포를 실시예 2에 따라 하기 플라스미드로 형질감염시켰다:
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA (n=1-4);
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-4-HA, 및
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-7-HA.
VEGF에 대한 2가 Nb24의 결합을 실시예 5에 기재된 바와 같이 테스트하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 곡선의 모양은 유사하였다. 링커 (G4S)3 및 (G4S)2를 포함하는 2가 Nb24는 링커 (G4S)1 및 (G4S)4를 포함하는 것(각각 400.2 nM 및 463.8 nM)보다 더 낮은 EC50 값(각각 345.5 nM 및 376.1 nM)을 나타내었다.
10.3. 동일한 코딩 서열을 갖는 2가 Nb24를 인코딩하는 rAAV는 바이러스 품질이 좋지 않은 것으로 나타났다.
rAAV를 실시예 9에 기재된 방법으로 제조하였으며 도입유전자 플라스미드는 다음 중에서 선택하였다:
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)n-Nb24-5-HA (n=1-4),
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5_stuffer,
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)4-Nb24-5-HA_stuffer,
pGCB108-ITR130-AMDF1huNb24-5-hGHpA,
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-HA-CMV-AMDF1-Nb24-5-HA,
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-4-HA,
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-4-(G4S)4-Nb24-7-HA, 및
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-7-(G4S)4-Nb24-7-HA.
생성된 rAAV를 표 3 및 4에 나타내었다.
rAAV를 95℃에서 5분 동안 가열하고 전기영동을 위해 변성(denaturing) 겔에 로드하였다(20V, 하룻밤, 4℃).
표 3. 도 20의 rAAV 정보(레인 1 및 13: GeneRuler 1kb Plus DNA 래더, 레인 2는 양성 대조군인 rAAV 게놈)
표 4. 도 21의 rAAV 정보(레인 1 및 19: GeneRuler 1kb Plus DNA 래더, 레인 4는 양성 대조군인 rAAV 게놈)
도 20 및 21에 도시된 바와 같이, 동일한 코딩 서열을 갖는 2가 Nb24를 인코딩하는 rAAV는 게놈의 전기영동에서 두 개의 밴드를 나타내었는데(도 20의 레인 4, 6 및 12, 및 도 21의 레인 7-9 및 12-18). 이는 해당 rAAV 집단이 이질적인(heterogeneous) 게놈을 포함함을 나타내고, 즉, 바이러스 품질이 좋지 않음(게놈 완전성(integrity)이 좋지 않음)을 나타내는 것인 반면, 서로 다른 코딩 서열을 갖는 2가 Nb24를 인코딩하는 rAAV는 단일 밴드를 나타내었는데(도 20의 레인 8), 이는 균질한(homogeneous) 게놈, 즉 유리한 바이러스 품질(원하는 게놈 완전성)을 나타낸다.
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)2-Nb24-7-HA 및 pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)2-Nb24-7-HA로부터 선택되는 도입유전자 플라스미드, 및 각각 AAV2-7m8 및 AAV9로부터 선택되는 Cap 폴리펩티드를 인코딩하는 패키징 플라스미드를 사용하여 rAAV를 또한 제조하였다. 생성된 rAAV로부터 분리된 게놈의 변성 전기영동에서도 단일 밴드가 나타났으며, 이는 균질한 게놈, 즉 유리한 바이러스 품질(원하는 게놈 완전성)을 나타낸다.
서로 다른 코딩 서열을 갖는 2가 Nb24를 인코딩하는 rAAV는 바이러스 품질 면에서 동일한 코딩 서열을 갖는 2가 Nb24를 인코딩하는 rAAV에 비해 이점을 달성한 것으로 결론지어졌다.
10.4. 2가 구축물에서 Nb24에 대한 코딩 서열의 배열은 발현에 큰 영향을 미치지 않는다.
Expi293 세포를 실시예 2에 따라 하기 플라스미드로 형질감염시켰다:
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)2-Nb24-5-HA,
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-5-(G4S)2-Nb24-7-HA, 및
pGCB108-ITR130-AMDF1Nb24-7-(G4S)2-Nb24-5-HA.
상청액 중의 2가 Nb24를 실시예 2에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해 정량화하고, 일련의 농도로 희석하였다. VEGFR2에 대한 억제를 실시예 6에 기재된 바와 같이 시험하였다. 결과를 도 22에 나타내었다. 3개의 플라스미드에 의해 발현된 2가 Nb24는 발현 수준 및 VEGFR2에 대한 억제에서 서로 유의한 차이를 나타내지 않았다.
서열 목록
서열번호 1 (huNb24-1)
ATGAAATACCTACTCCCCACCGCTGCCGCCGGCCTGTTACTGCTCGCGGCGCAGCCTGCCATGGCA
GAGGTGCAATTGCAAGAGAGCGGCGGCGGCCTTGTGCAGCCTGGTGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCACCGCTAGCGGCTTCACCTTCGACGACCCCGACGTGGGCTGGTTCAGACAAGCCCCCGGCAACGAGTGCGAGCTGGTGAGCACCATCAGCAAGGACGGCAGCACCTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCGACAGCAACCCCATCGCCCCCATCAGAACCTGCCTGGGCTGGTACAACTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
서열번호 2 (huNb24-2)
ATGAAATACCTGCTGCCTACCGCCGCTGCCGGCCTGCTGCTGCTCGCCGCCCAGCCCGCCATGGCC
GAAGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGAGGACTGGTCCAGCCTGGAGGCAGCCTGCGGCTGAGCTGTACAGCTTCTGGCTTTACCTTCGACGACCCCGACGTGGGCTGGTTCCGGCAGGCCCCTGGCAACGAGTGCGAGCTGGTGTCCACCATCAGCAAGGACGGCTCTACATACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGATTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAAGATACCGCCGTGTATTACTGCGCCGCTGATTCTAATCCTATCGCCCCAATCAGAACATGCCTGGGCTGGTACAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCAGC
서열번호 3 (huNb24-3)
ATGAAATACCTGCTGCCTACAGCCGCCGCTGGCCTGCTGCTCCTGGCCGCTCAGCCAGCTATGGCC
GAAGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGAGGCGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGCACAGCCAGCGGCTTTACCTTCGACGACCCTGATGTGGGCTGGTTCCGGCAGGCCCCCGGAAATGAGTGCGAGCTGGTCAGCACCATCAGCAAGGACGGCTCTACCTACTACACCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGATTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGCGGGCCGAAGATACCGCCGTGTATTACTGCGCCGCCGACAGCAACCCCATCGCCCCTATCAGAACATGTCTGGGCTGGTACAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGC
서열번호 4 (huNb24-4)
ATGAAATACCTGCTGCCTACAGCCGCCGCTGGCCTGCTGCTCCTGGCCGCTCAGCCAGCTATGGCC
GAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCACCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACCCCGACGTGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAACGAGTGCGAGCTGGTGAGCACCATCAGCAAGGACGGCAGCACCTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCGACAGCAACCCCATCGCCCCCATCAGGACCTGCCTGGGCTGGTACAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
서열번호 5 (huNb24-5)
ATGAAGTACCTGCTGCCCACCGCCGCCGCCGGCCTGCTGCTGCTGGCCGCCCAGCCCGCCATGGCC
GAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCACCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACCCCGACGTGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAACGAGTGCGAGCTGGTGAGCACCATCAGCAAGGACGGCAGCACCTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCGACAGCAACCCCATCGCCCCCATCAGGACCTGCCTGGGCTGGTACAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
서열번호 6 (huNb24-6)
ATGAAGTACCTGCTGCCTACAGCCGCTGCTGGACTGCTGCTTCTTGCTGCTCAACCTGCCATGGCC
GAGGTCCAGCTTCAAGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTACCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATCCTGATGTCGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGAAACGAGTGTGAACTGGTGTCCACCATCAGCAAGGACGGCAGCACCTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTATTATTGTGCCGCCGACAGCAACCCTATCGCTCCCATCAGAACATGCCTCGGCTGGTACAACTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
서열번호 7 (huNb24-7)
ATGAAGTACTTGCTGCCCACTGCTGCGGCTGGCCTGCTCCTTCTGGCGGCTCAACCTGCCATGGCG
GAAGTGCAACTGCAGGAGTCCGGTGGGGGTCTGGTTCAGCCCGGCGGATCCCTGCGGCTTAGCTGTACCGCGTCCGGTTTCACCTTCGATGACCCTGACGTGGGCTGGTTCCGTCAGGCCCCAGGCAACGAGTGTGAACTGGTGTCCACCATCTCCAAGGATGGGTCCACCTACTATACCGATTCTGTGAAAGGCCGCTTTACCATCAGTCGCGATTACGCTAAGAATACCGTGTACTTGCAGATGAATTCCCTCCGTGCCGAGGACACCGCGGTTTACTATTGTGCCGCAGACAGCAACCCTATTGCTCCCATCAGAACCTGCCTTGGTTGGTACAATTACTGGGGTCAGGGAACCTTGGTCACAGTGTCTAGC
서열번호 8 (huNb24-8)
ATGAAATACCTGTTGCCCACTGCAGCCGCTGGACTGCTCCTGTTGGCTGCCCAGCCCGCGATGGCC
GAGGTACAGCTTCAGGAATCCGGCGGTGGCCTTGTGCAACCCGGTGGCTCTTTGCGGCTGAGCTGCACTGCTTCTGGCTTTACCTTCGATGACCCAGACGTTGGATGGTTTCGGCAGGCCCCGGGTAACGAGTGTGAACTGGTGTCTACCATCAGTAAAGACGGCAGCACATACTATACAGATAGCGTTAAAGGCAGGTTTACCATTTCACGTGACTACGCCAAGAACACAGTGTATCTGCAGATGAACAGCTTGAGGGCGGAGGATACAGCTGTCTATTACTGTGCAGCTGACTCTAACCCGATCGCGCCCATCCGGACGTGTCTGGGCTGGTATAACTATTGGGGCCAGGGCACGCTCGTTACTGTGTCATCC
서열번호 9 (huNb24-9)
ATGAAGTACCTCCTGCCTACCGCTGCGGCCGGACTGCTTCTCTTGGCCGCTCAGCCGGCTATGGCA
GAGGTCCAACTGCAAGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGTTCTCTCAGGCTGTCATGCACAGCGAGCGGATTCACATTTGACGATCCTGATGTAGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCTGGAAATGAATGTGAGTTGGTCAGCACTATCAGCAAGGATGGTTCTACATATTACACTGACTCTGTAAAGGGCAGATTCACTATTAGTAGGGATTATGCGAAGAACACCGTTTACCTTCAGATGAACAGTCTGCGCGCAGAGGACACTGCAGTGTATTACTGCGCTGCCGACTCCAATCCAATCGCTCCCATTCGTACATGCCTTGGCTGGTACAATTATTGGGGCCAGGGAACCTTGGTGACCGTGAGCAGC
서열번호 10 (huNb24-10)
ATGAAGTACCTGCTGCCTACAGCCGCTGCTGGACTGCTGCTTCTTGCTGCTCAACCTGCCATGGCC
GAGGTCCAGCTTCAAGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTACCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATCCTGATGTCGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGAAACGAGTGTGAACTGGTGTCCACCATCAGCAAGGACGGCAGCACCTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTATTATTGTGCCGCCGACAGCAACCCTATCGCTCCCATCAGAACATGCCTCGGCTGGTACAACTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
서열번호 11 (huNb24-11)
ATGAAATACTTGCTTCCCACGGCAGCTGCCGGACTCCTCCTGTTGGCTGCGCAACCCGCGATGGCT
GAAGTTCAACTCCAGGAATCTGGGGGAGGTCTCGTACAGCCTGGAGGCAGTTTGAGGCTGTCTTGTACTGCGAGTGGCTTTACATTTGACGATCCCGACGTTGGGTGGTTTCGGCAAGCCCCGGGGAATGAATGTGAGCTTGTCAGTACTATATCCAAGGACGGTAGCACGTACTACACAGACTCCGTGAAGGGCAGATTTACAATTAGCAGGGACTATGCTAAGAATACCGTGTATTTGCAGATGAACAGTCTCAGGGCGGAGGATACAGCTGTTTATTACTGTGCAGCAGACTCTAATCCGATTGCGCCGATTCGGACATGCCTGGGCTGGTATAACTATTGGGGTCAAGGCACGCTTGTCACTGTTAGCAGT
서열번호 12 (huNb24-1 신호 없음)
GAGGTGCAATTGCAAGAGAGCGGCGGCGGCCTTGTGCAGCCTGGTGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCACCGCTAGCGGCTTCACCTTCGACGACCCCGACGTGGGCTGGTTCAGACAAGCCCCCGGCAACGAGTGCGAGCTGGTGAGCACCATCAGCAAGGACGGCAGCACCTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCGACAGCAACCCCATCGCCCCCATCAGAACCTGCCTGGGCTGGTACAACTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
서열번호 13 (huNb24-2 신호 없음)
GAAGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGAGGACTGGTCCAGCCTGGAGGCAGCCTGCGGCTGAGCTGTACAGCTTCTGGCTTTACCTTCGACGACCCCGACGTGGGCTGGTTCCGGCAGGCCCCTGGCAACGAGTGCGAGCTGGTGTCCACCATCAGCAAGGACGGCTCTACATACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGATTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAAGATACCGCCGTGTATTACTGCGCCGCTGATTCTAATCCTATCGCCCCAATCAGAACATGCCTGGGCTGGTACAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACAGTGTCCAGC
서열번호 14(huNb24-3 신호 없음)
GAAGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGAGGCGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGCACAGCCAGCGGCTTTACCTTCGACGACCCTGATGTGGGCTGGTTCCGGCAGGCCCCCGGAAATGAGTGCGAGCTGGTCAGCACCATCAGCAAGGACGGCTCTACCTACTACACCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGATTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGCGGGCCGAAGATACCGCCGTGTATTACTGCGCCGCCGACAGCAACCCCATCGCCCCTATCAGAACATGTCTGGGCTGGTACAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGC
서열번호 15 (huNb24-4 신호 없음)
ATGAAATACCTGCTGCCTACAGCCGCCGCTGGCCTGCTGCTCCTGGCCGCTCAGCCAGCTATGGCC
GAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCACCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACCCCGACGTGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAACGAGTGCGAGCTGGTGAGCACCATCAGCAAGGACGGCAGCACCTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCGACAGCAACCCCATCGCCCCCATCAGGACCTGCCTGGGCTGGTACAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
서열번호 16 (huNb24-5 신호 없음)
GAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCACCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGACCCCGACGTGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAACGAGTGCGAGCTGGTGAGCACCATCAGCAAGGACGGCAGCACCTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCGACAGCAACCCCATCGCCCCCATCAGGACCTGCCTGGGCTGGTACAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
서열번호 17 (huNb24-6 신호 없음)
GAGGTCCAGCTTCAAGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTACCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATCCTGATGTCGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGAAACGAGTGTGAACTGGTGTCCACCATCAGCAAGGACGGCAGCACCTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTATTATTGTGCCGCCGACAGCAACCCTATCGCTCCCATCAGAACATGCCTCGGCTGGTACAACTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
서열번호 18 (huNb24-7 신호 없음)
GAAGTGCAACTGCAGGAGTCCGGTGGGGGTCTGGTTCAGCCCGGCGGATCCCTGCGGCTTAGCTGTACCGCGTCCGGTTTCACCTTCGATGACCCTGACGTGGGCTGGTTCCGTCAGGCCCCAGGCAACGAGTGTGAACTGGTGTCCACCATCTCCAAGGATGGGTCCACCTACTATACCGATTCTGTGAAAGGCCGCTTTACCATCAGTCGCGATTACGCTAAGAATACCGTGTACTTGCAGATGAATTCCCTCCGTGCCGAGGACACCGCGGTTTACTATTGTGCCGCAGACAGCAACCCTATTGCTCCCATCAGAACCTGCCTTGGTTGGTACAATTACTGGGGTCAGGGAACCTTGGTCACAGTGTCTAGC
서열번호 19 (huNb24-8 신호 없음)
GAGGTACAGCTTCAGGAATCCGGCGGTGGCCTTGTGCAACCCGGTGGCTCTTTGCGGCTGAGCTGCACTGCTTCTGGCTTTACCTTCGATGACCCAGACGTTGGATGGTTTCGGCAGGCCCCGGGTAACGAGTGTGAACTGGTGTCTACCATCAGTAAAGACGGCAGCACATACTATACAGATAGCGTTAAAGGCAGGTTTACCATTTCACGTGACTACGCCAAGAACACAGTGTATCTGCAGATGAACAGCTTGAGGGCGGAGGATACAGCTGTCTATTACTGTGCAGCTGACTCTAACCCGATCGCGCCCATCCGGACGTGTCTGGGCTGGTATAACTATTGGGGCCAGGGCACGCTCGTTACTGTGTCATCC
서열번호 20 (huNb24-9 신호 없음)
GAGGTCCAACTGCAAGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGTTCTCTCAGGCTGTCATGCACAGCGAGCGGATTCACATTTGACGATCCTGATGTAGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCTGGAAATGAATGTGAGTTGGTCAGCACTATCAGCAAGGATGGTTCTACATATTACACTGACTCTGTAAAGGGCAGATTCACTATTAGTAGGGATTATGCGAAGAACACCGTTTACCTTCAGATGAACAGTCTGCGCGCAGAGGACACTGCAGTGTATTACTGCGCTGCCGACTCCAATCCAATCGCTCCCATTCGTACATGCCTTGGCTGGTACAATTATTGGGGCCAGGGAACCTTGGTGACCGTGAGCAGC
서열번호 21 (huNb24-10 신호 없음)
GAGGTCCAGCTTCAAGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTACCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATCCTGATGTCGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGAAACGAGTGTGAACTGGTGTCCACCATCAGCAAGGACGGCAGCACCTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACTACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTATTATTGTGCCGCCGACAGCAACCCTATCGCTCCCATCAGAACATGCCTCGGCTGGTACAACTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCATCT
서열번호 22 (huNb24-11 신호 없음)
GAAGTTCAACTCCAGGAATCTGGGGGAGGTCTCGTACAGCCTGGAGGCAGTTTGAGGCTGTCTTGTACTGCGAGTGGCTTTACATTTGACGATCCCGACGTTGGGTGGTTTCGGCAAGCCCCGGGGAATGAATGTGAGCTTGTCAGTACTATATCCAAGGACGGTAGCACGTACTACACAGACTCCGTGAAGGGCAGATTTACAATTAGCAGGGACTATGCTAAGAATACCGTGTATTTGCAGATGAACAGTCTCAGGGCGGAGGATACAGCTGTTTATTACTGTGCAGCAGACTCTAATCCGATTGCGCCGATTCGGACATGCCTGGGCTGGTATAACTATTGGGGTCAAGGCACGCTTGTCACTGTTAGCAGT
서열번호 23 (Nb24 아미노산 서열)
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFDDPDVGWFRQAPGNECELVSTISKDGSTYYTDSVKGRFTISRDYAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAADSNPIAPIRTCLGWYNYWGQGTLVTVSS
서열번호 24 (pelB 신호 aa 서열)
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA
서열번호 25 (구축물 1 내 CMV IE 인핸서)
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTAC
서열번호 26 (CB 프로모터)
TGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGG
서열번호 27 (CMV 프로모터)
GTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT
서열번호 28 (베타-글로빈 인트론)
TCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATT
서열번호 29 (pCI, 프로메가 키메라 인트론)
GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG
서열번호 30 (HA 태그)
TACCCATACGACGTGCCCGACTACGCC
서열번호 31 (토끼 글로빈 polyA)
GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCG
서열번호 32 (hGH poly A)
GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTT
서열번호 33 (5' ITR130)
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
서열번호 34 (3' ITR130)
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
서열번호 35 (5' ITR105)
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTG
서열번호 36 (G4S4)
GGAGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGATCCGGAGGAGGCGGCTCC
서열번호 37 (G4S3)
GGAGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCCGGAGGAGGCGGCTCC
서열번호 38 (G4S2)
GGAGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCT
서열번호 39 (G4S1)
GGAGGAGGCGGCTCT
서열번호 40 (Co3.1 HuNb24)
GAAGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCAGGAGGCTCTCTGAGGCTGTCTTGTACCGCTTCTGGCTTTACATTTGATGATCCTGATGTGGGCTGGTTTAGACAGGCTCCTGGCAATGAGTGTGAGCTGGTGAGCACCATTAGTAAGGATGGTAGTACATACTACACAGATTCTGTGAAGGGCAGGTTTACTATTTCTAGAGATTACGCTAAGAACACAGTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCGCCGACTCTAACCCTATCGCTCCTATTAGAACCTGCCTGGGCTGGTACAATTACTGGGGACAGGGCACACTGGTGACCGTCAGCTCT
서열번호 41 (IL2 신호 서열)
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서열번호 42 (구축물 20 내 hIgG1Fc)
GAGCCCAAGTCTTGTGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGCCCTGCTCCAGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTCTTCCTGTTCCCACCTAAGCCTAAGGATACACTGATGATCAGCCGAACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCATGAGGATCCTGAGGTGAAGTTTAACTGGTACGTGGACGGAGTGGAGGTGCATAACGCCAAGACAAAGCCAAGAGAGGAGCAGTATAACTCAACATACAGAGTGGTCAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGTAATAAGGCTCTGCCAGCTCCAATTGAAAAGACAATTAGTAAGGCTAAGGGACAGCCAAGGGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCTTCTAGAGAGGAAATGACAAAGAACCAGGTGAGTCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTTTACCCTAGTGATATTGCCGTAGAGTGGGAATCTAACGGACAACCTGAAAACAACTATAAGACAACACCTCCTGTGCTGGACTCTGACGGATCTTTCTTTCTGTATAGTAAGCTGACTGTGGATAAGAGTAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCTTGTAGCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAACCATTATACACAGAAGTCTCTGAGCCTGAGCCCTGGCAAG
서열번호 43 (pelB 신호를 포함하는 Beovu-scFv)
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서열번호 44 (AAV2-m2)
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서열번호 45 (AAV9)
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서열번호 46 (AAV2.GL)
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서열번호 47 (AAV2-7m8-flank)
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서열번호 48 (AAV2-NN)
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서열번호 49 (alb-stuffer)
TTTCATTGGCTGCCAACCGATTACAAAATTCATAATATTCTTGCCAAAAAATTGTTTGACTAAATCCCTTGTGTATATTTACCATCTGGAACTGTTTTCTCCACAAGACCTTGTCAATGTATTAAAGTTGTGTAAAACATCTTATCAAATTTTACATAAGAGTTTAAACGATTTGTACCTTTTATTCATTACCATGGTATTTAACTGTAATTTCCCACTTGAACATTTTAGTTCTTGGTGTTTGCAATTTAGTTCTCAGTGTTTAGTAATTACTAACCAAACTAAATACTTTGCTTAGAAATAAGACATACTGAAAGAGTTAAGTCCCAAATTGCATCTATTGCTAATTCCAAGTGTGCTTTTACCTATAGATAATGAAAAATTTACACACAAGTACTCACGCATGCACACACACATATACATACATACATATTTTAGGGCTTCTGTGTCTTTTTTACTATTCCAAAGCCATTCTGTCTGAAAAAGCTGATGTTGCCTCAGATGCAAACTAAGAAAAAGACATAGCAACAATAACAAGTAAGATAGGACTTAGAAATTCCATGTTCCCATTCCTGCTGTGGCCCACATGTGATTCAAGCCCTGAGATAGGCTATTTAGATTCAGTGTGAGTATATCTCATGGGATCTTCAGTTAAGCAGAGATGGAGAGGAAAATGGACCCAAATGAGATGATGATTATCTTTGCCATAATATACAATAGGACAGGCTGACCCCAAATTCTCTGTAGGTTATGAGAACCCTTGACCTTCACCAGGCATAGGATTCTTTCCATCCCTGTTTCATATTTTTTTCCTTTCTCTCTTTCAATAAGTAGAAAAATCACATGTTCTTTTATGTTGCTTTAAATTTCAAAATAAATTTAACATTATGTCTAAAAACAAAGCGAAGGAAGAATAATTTTTTAAATATTTCATAAATCTTCCTTCCCTACCCAAGGTTCTTATCTCTACCTCAGAAAAGCTATCCTACCTCTGCCCTTTTGCTCAGAATATGAAGAACTACTGAGCTCAACCAGTAGGAAGAACAACTTTCTCTGATACTACAGAACAATAATTAGTACTAAGCCAGTTATTTTACTTAATTAAATAACTCAGTCAGTCAAAACCAGTAGTCAAATTTCCTCATGGCACATAGAGGCACAGAGACTAACAAAGTATTATTTTTTCTACTCAGTCTTATAATGAAAGAAAATTTTTTCTATTCAGTCTTACAATGAAAGAAATTATTTTCTATAATCTTATGTTATTTCTTCTTCAGAAATGGGTACTAATTAACTAATAAAGCACAGAAGAGGAAAAAATCAAAGCTAGATGGATGATAGATACATAGATAGATAGGAAGATTTTTTTTAATGACTCAAGGGAGTCCTGAAAGGAAATACCAGACTTGTCTTTCTGACTACAGATGAACAGACATAAAACAAGTGTGCCTATTTTCCATTGAAGAAAAACAAGCATTTTTTCTAAAGCCAGAAAAACCTACATCTGAAAAGAAAAAAGAAACTATTCTAAGTTAAGAAAATAATTCTTTCTTGGATAAATTATGTCAACTTTTAACTTCCTAGAAATTGTAGGCATTATTTATTAGAAGTCAGTAACCAACTCTAGCTTTTTCCTTGTAGAAGTCCCTGGGAAAGGCCTACCCAAACATAAAATCCTTACTGTTGAATACAATTGTTACTAATTGACAAATTCAGGCCTTTGTCACTCTCACATATACTTTGTGCATACTTTTTCATTTAACAAATGAAAAGAATAATATTAGTCCATTTAGTTTTCACCACAACATTATAATGTAATATATTGTTAAATACAAAGAAACCTAAAAAAATCTCAAATTCATCATGACTGAATAGAAACTTTGAATTGATTTTCCTATATCTAATGAAGAGCCCTAGCTTTAAAACAAAATTGATGAAACCTAAAAGAATCTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTCGCTCTTTCGCCCAGACTGGAGTGCAGTGGCACTATCTCGGCTCACTTGCAAGCTCCGCCTCCCGAGTTCACGCCATTCTTCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCCCGCCATCACGCCCGGCTAATTTTTTGTATCTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCGTGTGCCAGGGTGGTCTCGATCTCCTGACCTCGTCATCCGCCCACCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGTCATGAGCCA
서열번호 50 프라이머 qPCR-AMD-24-5-F
GAGTGCGAGCTGGTGAG
서열번호 51 프라이머 qPCR-AMD-24-5-R
GCGTAGTCCCTGCTGATG
서열번호 52 프로브 qPCR-AMD-24-5-P
CAAGGACGGCAGCACCTACTACAC
Claims (24)
- 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열번호 4, 5 및 7로부터 선택되는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호 15, 16 및 18로부터 선택되는 링커를 통해 제1 뉴클레오티드 서열에 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물(construct).
- 제1항에 있어서, 링커가 서열번호 37 및 38로부터 선택되는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터가 서열번호 26 또는 27의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 인핸서를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제4항에 있어서, 제1 인핸서가 제1 프로모터의 상류에 있는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제4항에 있어서, 제1 인핸서가 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 초기(early) 인핸서인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 코딩 서열의 하류에 폴리아데닐화(polyadenylation) 신호 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제7항에 있어서, 제1 폴리아데닐화 신호 서열이 서열번호 31 및 32로부터 선택되는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 인트론을, 바람직하게는 제1 뉴클레오티드 서열의 상류에 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제9항에 있어서, 제1 인트론이 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제9항에 있어서, 제1 인트론이 서열번호 28을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 구축물이 재조합 AAV의 게놈을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제12항에 있어서, 구축물이 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV)로부터 유래된 5' 및 3' 역 말단 반복부(inverted terminal repeat, ITR) 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제13항에 있어서, 5' 및 3' ITR이 AAV ITR130 및/또는 AAV ITR 105인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제14항에 있어서, 5' 및 3' ITR 양자 모두가 AAV ITR130인, 폴리뉴클레오티드 구축물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 게놈을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV).
- 제16항의 AAV를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제16항의 rAAV 또는 제17항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제18항에 있어서, 질병이 Wet-AMD인, 방법.
- 제19항에 있어서, rAAV 또는 약제학적 조성물이 유리체강내(intravitreal) 주사에 의해 투여되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 구축물, 또는 제15항의 rAAV를 포함하는 숙주 세포.
- VEGF와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 VEGF와 관련된 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 구축물, 제16항의 rAAV, 제17항의 약제학적 조성물, 또는 제21항의 숙주 세포의 용도.
- 제22항에 있어서, 질병이 Wet-AMD인, 용도.
- 제23항에 있어서, 약제가 유리체강내 주사에 의해 투여되는 것인, 용도.
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