KR20240047909A

KR20240047909A - 비만의 치료 또는 예방용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20240047909A
Application number: KR1020230122409A
Authority: KR
Inventors: 엄수종; 박의현
Original assignee: 세종대학교산학협력단
Priority date: 2022-10-05
Filing date: 2023-09-14
Publication date: 2024-04-12

Abstract

본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 비만의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 화학식 1의 화합물 등을 포함함으로써 PPAR-γ의 전사 활성을 억제하고 비만 등 PPAR-γ의 과발현에 의해 발생되는 질환의 치료 또는 예방 효과를 나타내는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

비만의 치료 또는 예방용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING OBESITY}

본 발명은 비만의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

시코닌은 자초(Lithospermum erythrorhizon)에서 발견되는 생리활성 성분 중 하나이다. 항산화, 항균, 항염증 및 항응고 효과가 있음이 알려진 바 있다.

PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)는 주로 지방 대사에 관여하는 유전자 또는 지방세포(adipocyte)의 분화에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 전사인자이다. PPAR-γ은 비만, 당뇨병, 죽상동맹경화증 및 암을 포함하는 여러 질병들과 연관된 것으로 알려져 있기에, PPAR-γ 의 활성을 조절함으로써 여러 질병의 치료법을 제시하고자 하는 시도가 있어왔고, 그 중에서, PPAR-γ와 유사한 기능을 수행하는 agonist의 경우 고지혈증 및 고혈당증의 치료에 사용될 수 있음이 밝혀진 바 있다.

따라서 PPAR-γ과 결합하여 그 전사활성을 억제 또는 촉진할 수 있는 새로운 물질을 발굴할 경우 PPAR-γ에 의해 유발될 수 있는 여러 질환의 치료 또는 예방이 가능하므로, PPAR-γ의 새로운 조절자의 발굴이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제0967814호

본 발명은 비만의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 PPAR-γ에 결합하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 PPAR-γ의 활성을 조절하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 비만의 치료 또는 예방용 약학 조성물:

[화학식 1]

(식 중, R은 다음 1 내지 18 중 어느 하나의 치환기임 .)

2. 위 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 PPAR-γ 결합용 조성물.

3. 위 2에 있어서, 결합은 시험관 내(in vitro)에서 이루어지는 PPAR-γ 결합용 조성물.

4. 위 화학식 1로 표시되는 화합물을 시료에 처리하는 단계를 포함하는 PPAR-γ 활성 조절 방법.

5. 위 4에 있어서, 활성 조절은 PPAR-γ의 활성 촉진 또는 활성 억제인 PPAR-γ 활성 조절 방법.

6. 위 4에 있어서, 시료는 지방 세포(adipose cell), 지방 조직 유래 줄기세포(adipose derived stem cells, ADSCs) 및 지방전구 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 세포인 PPAR-γ 활성 조절 방법.

7. 위 4에 있어서, 화학식 1로 표시되는 화합물을 시험관 내에서(in vitro) 상기 시료에 처리하는, PPAR-γ 활성 조절 방법.

화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 PPAR-γ에 직접 결합하여 그 전사 활성을 억제한다.

본 발명의 약학 조성물은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함함으로써 PPAR-γ의 전사 활성을 억제하고 그에 따라 비만 치료 또는 예방 효과를 나타낸다.

도 1은 시코닌의 3T3-L1 세포에서 지방세포 분화억제 효과를 확인한 것이다.
도 2는 분화가 진행된 3T3-L1 세포로부터 축적되어 있던 지방을 용출하여 지방의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 분화가 진행된 3T3-L1 세포에서 지방세포분화에 관여하는 유전자의 mRNA 발현량을 측정한 것이다.
도 4는 293T 세포에서 시코닌 처리 여부에 따른 PPARγ 전사 활성의 감쇄를 luciferase reporter gene analysis로 확인한 것이다.
도 5는 3T3-L1 세포에서 rosiglitazone 또는 시코닌 처리에 따른 Fabp4 mRNA 발현량을 측정한 것이다.
도 6은 His-PPAR-γ LBD 단백질과 시코닌의 결합력을 MST assays로 확인한 것이다.
도 7은 시코닌 처리 유무에 따른 PPAR-γ과 CBP(aa.602-1095)간 결합 여부를 GST-pull down assays로 확인한 것이다.
도 8은 시코닌 처리 유무에 따른 Fabp4 또는 Retn 프로모터의 H3K4me3 또는 H3K27me3의 수준을 ChIP assay로 확인한 것이다.

본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염(이하, ‘화학식 1의 화합물 등’이라고 합니다)을 포함하는 비만의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 화학식 1의 화합물 등을 포함하는 PPAR-γ 결합용 조성물을 제공한다.

본 발명은 화학식 1의 화합물 등을 시료에 처리하는 단계를 포함하는 PPAR-γ 활성 조절 방법을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은 화학식 1의 화합물 등을 포함함으로써 PPAR-γ의 전사 활성을 억제하고 비만 등 PPAR-γ의 과발현에 의해 발생되는 질환의 치료 또는 예방 효과를 나타낸다.

시코닌은 다음 화학식 2의 구조를 갖는 화합물이다. 화학식 1에서 R이 1번 치환기인 경우이다.

[화학식 2]

시코닌은 PPAR-γ에 직접 결합하여 길항제로서 PPAR-γ의 활성을 조절할 수 있다. 시코닌은 PPAR-γ 단백질의 리간드 결합 도메인 부위에 결합할 수 있고 이 경우 리간드가 PPAR-γ에 결합하는 것을 조절하거나 리간드와 PPAR-γ간 결합을 조절한다. 시코닌이 PPAR-γ에 결합하여 PPAR-γ 리간드가 PPAR-γ에 결합하는 것이 방해되는 경우 PPAR-γ에 의한 전사 활성이 억제될 수 있다.

시코닌 유도체는 화학식 1에서 R이 2번 내지 18번 치환기인 경우이다. 치환기 번호 순서대로 디옥시시코닌, 아세틸시코닌, 프로피오닐시코닌, 이소부틸시코닌, 이소발레릴시코닌, 안젤릴시코닌, β,β-디메틸아크릴시코닌, 티글로일시코닌, 테트라크릴시코닌, 벤조닐시코닌, 1-메톡시아세틸시코닌, β-하이드록시이소발레릴시코닌, β-아세톡시이소발레릴시코닌, (15번 치환기 화합물 무명), 아르네빈-5, 리소스퍼미딘-A 및 리소스퍼미딘-B이다.

시코닌의 약학적으로 허용되는 염은 PPAR-γ에 직접 결합할 수 있는 것이라면 그 결합의 세기, 결합의 위치, 결합이 PPAR-γ의 전사활성에 미치는 영향 등에 제한 없이 본 발명의 범위에 포함된다.

화학식 1의 화합물 등과 PPAR-γ의 결합은 시험관 내(in vitro)에서 이루어지는 것일 수 있다. 예컨대 수용액 상에서 정제된 PPAR-γ 단백질에 결합하는 것을 의미할 수 있고, 또는 배양 중인 세포에서 세포가 발현하는 PPAR-γ 단백질에 결합하는 것일 수 있다.

화학식 1의 화합물 등이 배양 중인 세포에서 세포가 발현하는 PPAR-γ 단백질에 결합하는 경우 PPAR-γ 단백질의 전사 활성을 조절할 수 있다. PPAR-γ 단백질은 세포 내에서 리간드와 결합하는 경우 타겟 유전자 프로모터의 히스톤 메틸화를 유도하거나 억제하는 공동 활성 인자로 기능할 수 있는데, 화학식 1의 화합물 등과 PPAR-γ의 결합에 의하여 리간드와 PPAR-γ 단백질 간 결합이 방해되는 경우 염색체에서 히스톤 메틸화를 유도하거나 억제하는 기능을 수행할 수도 있다.

활성 조절은 예를 들면, PPAR-γ의 전사 활성을 촉진하는 것일 수 있고, 또는 PPAR-γ의 전사 활성을 억제하는 것일 수 있다. PPAR-γ와 화학식 1의 화합물 등의 결합에 의하여 PPAR-γ의 리간드와의 결합을 억제시킬 수 있고, 또는 그 결합을 유도할 수 있으므로 리간드의 종류에 따라 PPAR-γ의 전사 활성을 촉진 또는 유도할 수 있다.

본 발명의 활성 조절 방법에 있어서, 시료는 PPAR-γ 단백질을 포함하는 것이라면 그 종류에 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 예를 들면, 정제 또는 세포로부터 추출된 PPAR-γ 단백질을 포함하는 수용액일 수 있고, 또는 지방 세포(adipose cell), 지방 조직 유래 줄기세포(adipose derived stem cells, ADSCs) 및 지방전구 세포를 포함하는 군에서 선택되는 세포일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

화학식 1의 화합물 등을 시료에 처리하는 단계는 시험관 내(in vitro)에서 이루어지는 것일 수 있다. 시험관 내의 예로는 수용액 상 또는 배양 중인 세포일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 시료가 세포인 경우, 시료에 전달되는 효율 증가를 위하여 화학식 1의 화합물 등을 전달체에 담지하여 전달할 수 있다. 전달체의 예를 들면, 양전하성 폴리머, 리포좀, 지질나노입자, 금 또는 반도체 나노결정 입자가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예로 보다 상세하게 설명한다.

실험예 1. 시약 및 화학물질

Oil Red O(ORO), dexamethasone(Dex), 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), insulin, dimethylsulfoxide(DMSO), rosiglitazone과 시코닌은 Sigma(St. Louis, MO, USA) 제품을 구매하여 사용하였다. Fetal bovine serum(FBS)와 bovine serum(BS) 은 GIBCO(Grand Island, NY, USA)제품을 구매하여 사용하였다. 오염 방지를 위해 antibiotics/antimycotics 는 Invitrogen(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)사의 제품을 구매하였다.

실험예 2. 세포배양 및 지방세포분화

세포배양 및 지방세포 분화의 전반적인 실험방법은 기존 논문에 공개된 방법을 참고하여 수행하였다. 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC) 로부터 구매하였고, 10% BS, 1% antibiotics/antimyotics가 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 지방세포 분화를 위해 3T3-L1 세포는 6 well plate에 1×10⁶개의 세포를 분주한 후 세포밀도가 100 %가 되기를 기다린 후, 다시 2일간 더 배양하여 분화를 시작하였다. 분화시작을 위해서는 0 일째에 10 % FBS에 0.5 μM dexamethasone, 100 μM IBMX, 그리고 1 μg/mL 인슐린을 첨가 한 후 대조군으로 DMSO, 실험군에는 시코닌 1.0 μM을 처리하여 2 일간 배양하였다. 2 일째부터는 10 % FBS에 1 μg/mL 인슐린이 첨가된 DMEM 배지에 대조군에는 DMSO, 실험군에는 시코닌 1.0 μM을 첨가하여 배향하였고, 2 일마다 배지를 교환해 주었다.

실험예 3. Oil Red O 염색

Oil Red O 염색방법은 기존 논문에 공개된 방법을 참고하여 수행하였다. 분화가 완료된 3T3-L1 세포는 PBS (pH 7.4) 2 mL 로 2 회 세척하였고, 10 % 포르말린(formalin)이 함유된 PBS에서 10 분간 상온에서 고정하였다. 고정이 끝난 후 멸균된 증류수를 사용해 2 회 세척하였고 0.5 % Oil Red O 가 함유된 60 % 이소프로판올 2 mL를 이용하여 10 분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 멸균 증류수 2 mL을 사용하여 3 회 세척하였고 현미경을 이용하여 사진을 촬영한 후, 100% 이소프로판올 2 mL을 사용하여 세포에 축적된 지질성분을 추출하여 500 nm 의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

실험예 4. 전체 RNA 분리 및 real-time quantitative PCR (RT-qPCR)

전체 RNA 분리 및 RT-qPCR 분석은 기존 논문에 공개된 방법을 참고하여 수행하였다. 분화가 끝난 3T3-L1 세포로부터 전체 RNA의 추출은 Invitrogen 사의 TRIzol 용액을 사용하여 수행하였다. 분리된 전체 RNA로부터 cDNA 합성은 Invitrogen사의 MMLV reverse transcriptase와 random primers를 사용하여 회사가 제공하는 실험방법을 토대로 수행하였다. 표적 유전자의 발현을 확인하기 위한 PCR반응은 Bio-Rad사의 iQ SYBR green Supermix와 Icycler GFX96 real-time PCR detection system을 활용하여 수행하고 분석하였다. 모든 유전자의 mRNA 발현수준은 GAPDH mRNA발현량으로 보정하여 분석하였다.

실험예 5. Transient transfection and Luciferase reporter gene 분석

Reporter gene 분석을 위해, HEK293 세포를 12 well plate에 1×10⁵개의 세포를 분주하고 37 ℃에서 5 % 이산화탄소가 유지되는 습윤 배양기에서 24 시간 배양하였다. PPARγ, PPARE-tk-luciferase, SV-40-β-galactosidase를 발현하는 각각의 플라스미드들을 Invitrogen 사의 Lipofectamin 용액을 사용하여 혼합한 후 세포에 처리하고, 4시간동안 반응을 시켰다. 반응이 끝난 후 5 % charcol-stripped FBS가 함유된 배지로 교환하면서 1 μM의 rosiglitazone (PPARγ의 대표적 agonist)과 시코닌 (0.2, 0.5, 1.0 μM)을 처리하여 24 시간 배양하였다. 배양이 끝난 세포는 PBS 로 1회 세척 후 Promega사의 luciferase lysis buffer 100 μL을 사용하여 용출하여 그 중 20 μL을 Promega사의 Luciferin 20 μL와 혼합하여 Luminometer로 활성을 측정하였다. Transfection 효율에 대한 보정을 위한 β-galactosidase 분석은 세포 용출액 20 μL와 ONPG (4 mg/mL) 50 μL를 LacZ buffer 500 μL에 혼합하여 20 분간 반응한 후, 1M Na2CO3250μL를 추가하여 반응을 종결하였다. 반응이 종결된 용액 200 μL를 405 nm에서 흡광도를 측정하여 각각의 luciferase 활성에 대하여 보정을 하였다.

실험예 6. Microscale thermophoresis (MST) 분석

PPARγ와 시코닌의 결합 해리상수(KD)를 결정하기 위해 His가 연결된 PPARγ의 ligand binding domain (LBD, 아미노산 315-505)을 가지고 있는 단백질 (His-PPARγ LBD)을 HiTrap Chelating HP column (GE Healthcare, USA)를 사용하여 분리 및 정제하였다. 정제된 His-PPARγ LBD 는 NanoTemper Technologies사의 His-Tag labeling Red-Tris NTA 키트를 사용하여 회사가 제공하는 실험방법대로 표지 하였다. 800 nM의 His-PPARγ LBD 단백질을 PBST (0.1% Triton X-100, 0.5% Tween 20, pH 7.5 in PBS) 100 μL를 Red-Tris NTA dye 용액 (Red-NTA dye 1.0 μL, PBST 99.0 μL) 100 μL와 혼합한 후 빛을 차단하여 상온에서 1시간동안 반응하여 염색하였다. 해리상수 측정을 위해 시코닌이 농도별로 용해되어 PBS-T 버퍼에 40 nM의 His-PPARγ LBD를 혼합한 후 미세유리관 (Glass Capillary)에 주입하여 Monolith NT.115 Pico기기에서 MST를 측정하였다. 측정된 수치는 NanoTemper software (MO Affinity analysis v2.2.7)를 이용하여 분석하여 해리상수를 결정하였다.

실험예 7. Glutathione S-Transferase (GST) pull-down assays

리간드와 결합한 상태의 PPARγ와 CBP의 결합을 시코닌이 억제할 수 있는지 분석하기 위해 GST pull-down 분석을 수행하였다. GST 혹은 GST-CBP (아미노산 1-460 and 602-1095) 단백질은 Glutathione-Sepharose bead (GE Healthcare)를 이용하여 분리 및 정제하였다. 분리 및 정제된 His-PPARγ LBD 단백질 1 μg 과 GST 혹은 GST-CBP 단백질 1 μg을 binding buffer (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, 0.1 % Nonidet-40) 50 μL와 혼합하고, rosiglitazone 혹은 시코닌을 첨가하여 30 분 동안 30 ℃에서 반응하였다. Binding buffer로 미리 평형화 된 50 % 농도의 Glutathione-Sepharose beads 100 μL를 추가한 후 7 rpm의 느린 속도로 교반하면서 1 시간 더 반응을 유지하였다. 반응이 끝난 bead는 binding buffer 300 μL 로 3 회 세척한 후, 2x SDS loading buffer 50 μL 를 가하여 끓는 물에서 10 분 동안 반응한 후 anti-His 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

실험예 8. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays

분화가 완료된 3T3-L1 세포에 4 % formaldehyde 가 함유된 배지를 가해 37 ℃에서 10 분간 고정한 후 PBS 10 mL를 사용하여 2 회 세척 한 후, 원심분리기를 3,000 rpm으로 상온에서 10 분간 작동하여 세포들을 침전시키고 SDS lysis buffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride) 200 μL로 현탁하여 얼음에서 10 분간 용해하였다. 용출된 세포현탁액은 sonicator를 이용하여 분쇄하고, 다시 원심분리기에서 13,000 rpm으로 4 ℃에서 10 분간 분리하여 상층 액을 확보하였다. 상층액 50 μL와 ChIP dilution buffer (0.01 % SDS, 1.1 % Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl) 450 μL를 혼합한 후, 항체 1 μg을 가한 후 4 ℃에서 2 시간 동안 회전교반기에서 느린 속도(7 rpm)로 immunoprecipitation 반응을 수행하였다. Santacruz사의 Protein A/G plus Agarose 50 μL 추가 한 후 다시 1 시간 동안 회전교반기에서 느린 속도(7 rpm)로 반응을 수행하였다. 반응이 끝난 후 High salt washing buffer (0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl), Low salt washing buffer (0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl), LiCl washing buffer(0.25 M LiCl, 1 % IGEPAL-CA630, 1 % deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1), Tris-EDTA (pH 8.0) buffer 1 mL 씩을 사용하여 agarose bead를 세척하였다. 세척이 끝난 agarose bead는 elution buffer(1% SDS, 0.1M NaHCO3)250μL를 사용하여 2 회 용출하여 한 개의 마이크로튜브에 모았다. 회수된 크로마틴 침전물 복합체는 55 ℃에서 4 시간 동안 reverse cross-link 및 단백질변성 반응 후 protease 1 μg을 추가하여 55 ℃에서 1 시간 동안 단백질을 용해시킨 후 에탄올 침전방법을 적용하여 DNA 조각들을 회수하였다. 회수된 DNA 조각들은 Bio-Rad사의 iQ SYBR green Supermix와 Icycler GFX96 real-time PCR detection system을 활용하여 수행하고 분석하였다.

실시예 1. 시코닌의 지방세포 분화 억제 확인

시코닌이 지방세포분화에 미치는 영향을 분석하기 위해 3T3-L1 세포주의 지방세포분화를 수행하였고, Oil Red O 염색을 수행하여 측정하였다. 실험결과 지방세포분화 중 시코닌이 처리되면 3T3-L1 세포의 지방세포분화가 억제되었다(도 1). 지방세포 분화를 통해 축적된 지질의 양을 측정한 결과 1.0 μM 농도의 시코닌이 처리된 경우 대조군 대비 20.7 % 수준까지 지질축적이 억제되었다(도 2). Fabp4와 Adipoq는 지방세포 분화 중 지질축적에 중요한 기능을 하는 유전자이므로 두 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 3T3-L1 세포의 지방세포 분화 중 처리된 시코닌은 Fabp4와 Adipoq, Retn의 mRNA의 발현을 억제하였다(도 3). 이 유전자들은 PPARγ의 표적유전자로서 시코닌에 의해 발현이 억제되었고, 이는 시코닌이 PPARγ의 활성을 억제할 가능성을 예측하게 해준다.

실시예 2. 시코닌의 PPARγ의 전사활성능 확인

시코닌이 PPARγ의 전사활성을 억제하는지 분석하기 위해 reporter gene assay를 수행하였다. 293T 세포에 PPARγ를 발현하는 벡터, PPARE-tk-luciferase, SV-40-β-galactosidase를 transfection한 후 rosiglitazone 1.0 μM 혹은 시코닌을 농도를 다르게 처리하여 24 시간 배양하였다. 실험 결과, rosiglitazone에 의해 증가된 PPARγ의 전사활성이 시코닌에 의해 억제됨을 확인하였다(도 4). 세포 내에서 PPARγ 표적유전자의 mRNA발현이 시코닌에 의해 억제되는지 분석하기 위하여 3T3-L1 세포주에 rosiglitazone 혹은 시코닌 처리하여 실험을 수행하였다. 실험 결과, rosiglitazone에 의해 증가된 Fabp4 mRNA의 발현이 시코닌이 처리된 경우 감소되었음을 재확인하였다(도 5). 이 결과들은 시코닌이 rosiglitazone과 경쟁하여 PPARγ의 전사활성을 억제한다는 사실을 알려주며, 시코닌과 PPARγ가 직접 결합하는 길항제(antagonist)로 작용할 가능성을 제시한다.

실시예 3. 시코닌과 PPARγ의 LBD 결합 여부 확인

시코닌이 PPARγ의 전사활성을 억제하는 현상이 직접결합으로 인한 기전인지 확인하기 위해 MST assays를 수행하였다. MST assays는 미량의 단백질과 화학물질의 결합유무 및 결합력의 수준을 측정할 수 있는 분석 방법이다. His-PPARγ LBD 단백질과 시코닌의 결합력을 측정한 결과 해리상수 (KD) 1.4 ± 0.13 μM 수준임으로 나타났다(도 6). 이 결과는 PPARγ와 시코닌이 직접 결합한다는 사실을 증명해 주며, PPARγ의 합성 agonist인 rosiglitazone이 PPARγ와 0.4 μM 수준의 해리상수를 가지는 것과 비교할 때 매우 강력한 결합임을 알려준다.

PPARγ의 LBD 내부에 리간드 활성을 가진 rosiglitazone이 들어가 결합하면, LBD의 형태가 CBP와 같은 공동 활성자(co-activator)를 끌어오도록 변화하여 PPARγ의 전사활성을 촉진하게 된다. 이때 시코닌이 rosiglitazone과 경쟁하여 PPARγ의 LBD에 결합할 수 있는지 시험관 수준에서 분석하였다. 분석방법은 앞서 언급된 GST pull-down assay 방법을 이용하여 분석하였다. PPARγ-LBD 단백질과 GST가 fusion된 CBP (AA 1-460)은 rosiglitazone이 있을 경우 결합한다는 것을 볼 수 있다. 이때 시코닌의 농도가 증가하면 CBP와 PPARγ의 결합이 해리된다(도 7). GST-CBP(aa.602-1095)은 PPARγ와 결합하지 못하는 음성 대조군이다. 이 결과는 시코닌이 PPARγ의 리간드와 경쟁하여 PPARγ의 LBD에 직접 결합한다는 것을 증명한다.

실시예 4. 시코닌의 PPARγ의 활성 조절 기전 확인

시코닌이 PPARγ와 직접 결합하므로 시코닌에 의한 PPARγ의 활성 조절 기전에 대하여 분석을 수행하였다. PPARγ의 전사활성은 리간드가 PPARγ의 LBD에 결합하고 공동 활성 인자를 끌어옴으로 인해 PPARγ 표적유전자의 프로모터부위의 후성유전학적 변화하면서 시작된다. 알려진 프로모터 부위의 후성유전학적 변화는 히스톤메틸화가 알려져 있다. 활성 촉진 히스톤 표지 인자인 Histone 3 lysine 4 tri-methylation (H3K4me3),H3K4me2의 수준이 높으면 프로모터가 활성화되어 있음을 알려준다. 반대로 활성 억제 연관 표지인자인 H3K27me3,H3K9me3의 수준이 높으면 프로모터 활성이 억제되어 있음을 알 수 있다. 시코닌이 처리된 조건에서 PPARγ 표적유전자의 프로모터 위의 H3K4me3와 H3K27me3수준을 ChIP assay를 수행하여 분석하였다. 실험결과 시코닌이 처리된 경우 PPARγ 표적유전자의 프로모터위에서 H3K4me3의 수준이 감소하였고, H3K27me3의 수준은 증가하였다(도 8). 이는 시코닌에 의해 PPARγ 표적유전자의 발현이 감소되었음을 알려주며, 그 원인이 PPARγ의 전사활성이 시코닌과의 직접결합에 의해 억제되어 있음을 보여준다.

Claims

화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 비만의 치료 또는 예방용 약학 조성물:
[화학식 1]

(식 중, R은 다음 1 내지 18 중 어느 하나의 치환기임
).
화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 PPAR-γ 결합용 조성물:
[화학식 1]

(식 중, R은 다음 1 내지 18 중 어느 하나의 치환기임
).
청구항 2에 있어서, 상기 결합은 시험관 내(in vitro)에서 이루어지는 PPAR-γ 결합용 조성물.
화학식 1로 표시되는 화합물을 시료에 처리하는 단계를 포함하는 PPAR-γ 활성 조절 방법:
[화학식 1]

(식 중, R은 다음 1 내지 18 중 어느 하나의 치환기임
).
청구항 4에 있어서, 상기 활성 조절은 PPAR-γ의 활성 촉진 또는 활성 억제인 PPAR-γ 활성 조절 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 시료는 지방 세포(adipose cell), 지방 조직 유래 줄기세포(adipose derived stem cells, ADSCs) 및 지방전구 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 세포인 PPAR-γ 활성 조절 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 시험관 내에서(in vitro) 상기 시료에 처리하는, PPAR-γ 활성 조절 방법.