KR20240046180A - 바이러스 백신 - Google Patents

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KR20240046180A
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브라이언 리치티
캐롤리나 일코우
저우 씽
미르나 돌로비치
피오나 스마일
카일 스티븐슨
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맥마스터 유니버시티
오타와 하스피털 리서치 인스티튜트
턴스톤 바이오로직스 인코포레이티드
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Abstract

바이러스 표면당단백질 성분, 바이러스 핵단백질 성분, 및 바이러스 RNA 중합효소 성분을 인코딩하는 3가 전이유전자가 제공된다. 또한, 바이러스 감염을 예방하기 위하여 포유동물을 예방접종하는 방법과 함께 3가 전이유전자를 포함하는 백신이 제공된다.

Description

바이러스 백신
본 발명은 전반적으로 바이러스 백신 및 백신 접종 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 양성 가닥 RNA 바이러스와 같은 RNA 바이러스에 대한 백신 및 백신 접종 방법에 관한 것이다.
양극성 RNA (+ssRNA) 바이러스는 종래의 바이러스 속(屬)의 3분의 1 이상을 구성한다. 이들의 유전체는 전사 및 복제에 필요한 단백질들을 발현하기 위해 직접적으로 번역될 수 있는 mRNA 가닥과 유사하다. 이러한 유형의 바이러스들은 침입 및 복제와 같은 바이러스 감염의 모든 단계에서 숙주 인자를 사용한다. 아마도 더 중요한 것은, +ssRNA 바이러스가 숙주 인자를 도용(appropriate)함으로써 유전자 발현과 숙주 방어를 조절할 수 있다는 것이다.
양극성 RNA 바이러스는, C형 간염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 및 MERS, SARS 및 SARS-CoV-2 코로나바이러스와 같은 병원체뿐만 아니라, 보통감기를 야기하는 코로나바이러스 및 리노 바이러스와 같은 임상적으로 덜 심각한 병원체가 포함된다.
코로나바이러스 감염증 2019 (COVID-19)는, 2019년 12월 말 중국 우한에서 처음 나타난 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 의해 발생한 인간 질병으로 분류된다. 두 달 뒤인 2020년 3월, 세계보건기구(WHO)는 이번 발병을 팬더믹으로 규정하였다. 2021년 1월 10일 기준, WHO에 보고된 전세계적으로 확인된 사례 총 88,120,981건 중 1,914,378명이 이 질병으로 사망했다. 이러한 숫자들이 빠른 속도로 증가함에 따라, 국제 의료 및 과학계는 이 질병의 보건비 및 경제적 영향을 최소화해야 하는 전례 없는 도전에 직면해 있다.
이러한 노력의 핵심은, 감염 확산을 최소화하고, 특히, SARS-CoV-2, 그 변종 및 관련 바이러스 감염에 의한 중증 질환 및 사망 발생률을 줄이기 위한 효과적인 예방 치료법을 제공하는 것이다. 소수의 백신들이 개발되어 현재 사용 중에 있다. 여기에는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 인코딩하는 mRNA 및 아데노바이러스 기반 백신들이 모두 포함된다. 이러한 백신들은 상대적으로 높은 수준의 효능을 나타내는 것으로 알려져 있지만, 특정 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 생산을 기반으로 하기 때문에, SARS-CoV-2 변종에 대한 효능은 불분명하며, 따라서, 다른 관련 코로나바이러스에 대한 효능도 의심된다.
따라서, 양극성 RNA 바이러스에 대해 보편적으로 사용될 폭넓은 효능을 지닌 신규한 백신을 개발하는 것이 바람직할 것이다.
3개의 바이러스 항원, 표면당단백질 성분, 핵단백질 성분, 및 RNA 중합효소 성분을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 신규한 3가 백신이 개발되었다.
이에 따라, 본 발명의 일 측면에서, 바이러스 표면당단백질 성분, 바이러스 핵단백질 성분, 및 바이러스 RNA 중합효소 성분을 인코딩하는 3가 전이유전자가 제공될 뿐만 아니라, 3가 전이유전자를 포함하는 백신, 및 상기 백신을 이용하여 포유동물에 백신을 접종하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, i) 세포외 발현을 위해 표면당단백질을 소포체에 앵커링하는 기능을 수행하고 세포외소포체를 표적하는 막횡단 도메인에 결합한 바이러스 표면당단백질 및 신호펩티드를 포함하는 제1 바이러스 표면당단백질 성분; 및 ii) 바이러스 RNA 및 바이러스 RNA 중합효소 성분과 관련되거나 복합체를 형성하는 바이러스 핵단백질 성분을 포함하는 제2 단백질;을 인코딩하되, 상기 제1 표면당단백질 성분 및 상기 제2 단백질은 자가 절단 펩티드를 통해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는 3가 전이 유전자가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질 성분, 핵단백질 성분, 및 RNA 중합효소 성분을 인코딩하는 3가 전이유전자를 포함하는 코로나바이러스 백신이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에서, 단일 가닥 RNA 바이러스와 같은 바이러스에 의한 감염에 대항하는 포유동물의 백신 접종 방법으로서, 단일 가닥 RNA 바이러스로부터 유래된 표면당단백질 성분, 바이러스 핵단백질 성분, 및 바이러스 RNA 중합효소 성분을 인코딩하는 3가 전이유전자를 포함하는 백신을 통해 포유동물을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에서, E1/E3 결실 복제불능 아데노바이러스 벡터, 네뷸라이저(nebulizer)와 결합된 아데노바이러스 벡터 백신을 포함하는 키트, 및 바이러스 감염에 대항하는 포유동물의 백신 접종 방법으로서 네뷸라이저를 통해 아데노바이러스 벡터 백신을 포유동물에 투여하는 방법이 제공된다.
본 발명의 이러한 실시예 및 다른 실시예들은 다음 도면들을 참조로 하여 본원의 상세한 설명과 구체적인 실시예들에 기술되어 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신에 혼입하기 위한 전이유전자의 모식도를 나타낸 것이다;
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현된 전이유전자의 아미노산 서열을 도시한 것이다;
도 2는, A) 도 1의 전이유전자를 포함하는, 침팬지 아데노바이러스 벡터(ChAd) 및 사람 아데노바이러스 벡터(huAd)가 형질도입된 사람 세포에서의 발현; 및 B) 도 1의 전이유전자를 포함하는 2개의 상이한 아데노바이러스 벡터가 가변적인 MOI에서 형질도입된 사람 세포에서의 발현을 도시한 것이다;
도 3에서, A)는 백신 접종 및 SARS-CoV2 바이러스 챌린지 프로토콜을 도시한 것이고; B)는 치료된 마우스 및 치료되지 않은 마우스에서의 SARs-CoV2 감염 후 체중 감소를 그래프로서 도시한 것이며, C)는 치료된 마우스 및 치료되지 않은 마우스에서의 SARS-CoV2 감염 후 생존을 그래프로서 도시한 것이다;
도 4에서, A)는 도 1의 전이유전자를 포함하는 백신을 통해 백신 접종된 마우스에서의 전체 스파이크 단백질 및 스파이크의 수용체-결합 도메인(RBD)을 포함하는 스파이크 성분에 대한 항체의 생성량을 그래프로서 도시한 것이고; B)는 백신을 사용하여 시험관 내(in vitro) SARS-CoV2의 혈청중화(Serum neutralization)를 도시한 것이다;
도 5는, 도 1의 전이유전자를 포함하는, A) ChAd 및 B) huAd 중 어느 하나의 백신 접종이 전이유전자에 의해 발현된 항원 각각에 대한 T 세포 반응 유도를 도시한 것이다;
도 6은 2A 단백질들의 아미노산 서열을 도시한 것이다;
도 7은 SARS-CoV2의 변종 균주에 감염된 마우스를 도 2의 ChAd 벡터로 치료하는 실험 도식(A) 및 실험 결과(B-J)를 도시한 것이다;
도 8은 에어로젠 솔로 마이크로펌프 네뷸라이저(Aerogen Solo Micropump Nebulizer)에서 0.9N 식염수의 서로 다른 충진량에서 건조될 때까지 분무하는 시간을 그래프로서 도시한 것이다. 0.9N 식염수의 다양한 충진량(0.2, 0.5, 1.0, 2.0ml)을 완전히 에어로졸화하는 시간은, 에어로젠 제어 장치(Aerogen Control Unit)를 통해 벤치(bench)에서 에어로젠 솔로를 지속적으로 작동시킴으로써 결정된다. 세 개의 서로 다른 에어로젠 솔로 네뷸라이저(A/B/C) 각각이 테스트되었으며, 4가지의 유체 용량(fluid volumes)에서 건조될 때까지의 시간을 측정하였다.
도 9는 남성 피험자 및 여성 피험자 사이의 방출된 약의 용량(emitted dose, ED)을 그래프로서 비교한 것이다. ED는, 제어 장치, 및 트레이서(tracer)로서의 살부타몰 황산염이 포함된 에어로젠 솔로 네뷸라이저를 사용함으로써 결정되었다. 데이터는 남성 4명과 여성 4명의 입으로부터 회수된 살부타몰(%)을 나타낸다.
도 10은 살부타몰 vs. 백신을 포함한 살부타몰의 에어로졸 액적의 공기역학적 입자 크기 분포(Aerodynamic Particle Size Distributions, APSD)를 그래프로서 도시한 것이다. APSD는 차세대 임팩터(Next Generation Impactor)를 사용함으로써 결정되었다. 데이터는, NGI 단계별, 살부타몰의 평균량의 분포(대조군) 및 백신이 포함된 살부타몰의 평균량의 분포로 도시된다. 각 NGI 단계에서 수집된 살부타몰의 양은 자외선 분광법에 의해 결정된다.
도 11은 에어로졸화된 백신에서의 바이러스 입자의 생존 가능성(viability)을 그래프로서 도시한 것이다. 에어로넵® 마이크로펌프 네뷸라이저(Aeroneb® Micropump nebulizer)에 의해 생성된 에어로졸 액적에 존재하는 생존가능 AdHu5Ag85A 백신의 추정량은, 바이러스 플라크 형성 단위(plaque forming unit, PFU) 분석을 통해 결정되었다. 데이터는, 분무 직전의 백신 샘플과 버퍼에 수집된 에어로졸에서의 PFU의 평균값으로 표현되며, 두 개의 독립적인 실험을 나타낸 것이다.
도 12는 재조합된 복제 결함 ChAd68 벡터의 구조를 개략적으로 도시한 것으로서, A) ChAd68 셔틀 플라스미드, 및 유전체 BAC로의 DNA 조립에 사용되는 절편들(인접한 절편들의 정합(matching) 돌출부는 정합 패턴에 의해 묘사됨); 및 B) HEK293 세포로의 공동 형질감염을 위한 유전체 BAC 및 선형화된 ChAd68 셔틀 플라스미드(두 구조 사이의 ~2.5kb 중첩 영역에서의 상동 재조합은, E1이 전이유전자 카세트로 대체되고 E3 부위의 일부가 결실된 전장ChAd68 벡터를 생성함);를 포함한다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 HCMV 프로모터를 포함하는 침팬지 아데노바이러스 혈청형 68 E1/E3 결실 유전체의 DNA 서열을 도시한 것이다. 이때, 도 13a 내지 도 13n에 기재된 서열은 DNA 서열은 서열의 길이상 쪼개서 도시한 것이고, 도 13a의 끝부분이 도 13b의 앞부분에 이어지는 것과 같이 순차적으로 해석되어야 한다;
도 14는, A) 본 발명의 일 실시예에 따른 아데노바이러스 백신을 이용한 백신 접종 프로토콜을 나타낸 개략도; B) 백신 접종 후, 생성된 RBD 혈청 항체 및 스파이크 수치; C) 혈청 항체를 이용한 바이러스 중화 결과; D) 백신 접종 후, 폐 내 RBD-특이적 B 세포 수치; 및 D) 백신 접종 후, 폐의 CD8+ T 세포 수치를 도시한 것이다;
도 15는, A) 본 발명의 일 실시예에 따른 아데노바이러스 백신을 이용한 백신 접종 프로토콜 및 SARS-CoV-2(베타)의 후속 감염을 나타낸 개략도; B) 감염 후, 체중 감소(%)된 동물 vs 대조군; C) 감염 후, 폐의 바이러스 부담(viral burden); 및 D) 감염 후, 뇌의 바이러스 부담을 도시한 것이다;
도 16은, A) 본 발명의 일 실시예에 따른 아데노바이러스 백신을 이용한 백신 접종 프로토콜 및 SARS-CoV-2(델타)의 후속 감염을 나타낸 개략도; B) 감염 후, 체중 감소(%)된 동물 vs 대조군; 및 C) 감염 후, 폐의 바이러스 부담을 도시한 것이다;
도 17은, A) 본 발명의 일 실시예에 따른 아데노바이러스 백신을 이용한 백신 접종 프로토콜 및 SARS-CoV-2(오미크론)의 후속 감염을 나타낸 개략도; B) 감염 후, 체중 감소(%)된 동물 vs 대조군; 및 C) 감염 후, 폐의 바이러스 부담을 도시한 것이다.
일 측면에서, 3가 전이유전자를 포함하는 백신이 제공된다. 전이유전자는 바이러스 표면당단백질 성분, 바이러스 핵단백질 성분 및 바이러스 RNA 중합효소 성분을 인코딩한다. 일 실시예에서, 백신은, RNA 바이러스에 의한 감염(가령, 양성 단일 가닥 RNA 바이러스 감염)을 포함하는 바이러스 감염을 예방하는데 유용하다.
양성 단일 가닥 (+ss)RNA 바이러스는, mRNA에 대응하는 RNA 유전체를 포함하는 바이러스이며, 바이러스 단백질을 발현시키기 위해 직접 번역될 수 있다. 이러한 바이러스들은 약 30개의 바이러스과(특히, 코로나바이러스과, 피코르나바이러스과, 및 플라비바이러스과)를 포함하는 니도비랄레스(Nidovirales), 티모비랄레스(Tymovirales) 및 피코르나비랄레스(Picornavirales)의 3개 목(目)으로 분류된다. 모든 +ssRNA 바이러스는, 여러 단백질 중에서 바이러스 감염성 역할을 하는 표면당단백질, 바이러스의 RNA 유전체와 결합하는 핵단백질, 및 RNA-의존성 RNA 중합효소를 인코딩한다.
전이유전자는 바이러스 감염성 역할을 하는 바이러스 표면당단백질 성분을 인코딩한다. 즉, 표면당단백질은 감염될 숙주 세포에 결합하고 융합한다. 전이유전자 내에 통합된 표면당단백질 성분은, +ssRNA 바이러스와 같은 표적 바이러스의 표면당단백질로부터 유래되며, 백신에 의해 표적된 바이러스에 따라 달라진다. 가령, 코로나바이러스의 경우 표면당단백질은 스파이크 (S) 당단백질이고, C형 간염 바이러스의 경우 표면당단백질은 E1 및/또는 E2 단백질이며, 플라비바이러스의 경우 표면당단백질은 E 단백질이다. 본 발명의 전이유전자 내에 포함시키기 위해, 표적 바이러스(제1 표적 바이러스)의 전장(full-length) 표면당단백질을 인코딩하는 핵산, 또는 그것의 면역원성 부분 또는 절편이 포함된다. 표면당단백질의 면역원성 부분은 면역원성 반응을 유발하는 부분(가령, 항원을 포함하는 부분)이다. 일 실시예에서, 당단백질 성분은, 당단백질의 세포외 부분, 그것의 수용체 결합 도메인(가령, 숙주 세포에 결합하는 도메인), 이들 중 어느 하나의 면역원성 절편, 또는 이들 부위의 전체 또는 일부의 조합을 인코딩한다.
또한, 당해 기술 분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 전이유전자는 일반적으로 당단백질 성분의 선도 서열 또는 N-말단 신호를 인코딩하는 핵산을 포함할 것이다. 선도 서열은 일반적으로 약 12-40개의 아미노산을 포함하며, 일단 번역이 되면, 분비(secretion)를 위해 당단백질을 전위시키는 기능을 한다. 신호펩티드는, 가령, 생성될 당단백질의 천연 신호펩티드, 이종(異種) 신호펩티드, 또는 천연 및 이종 신호펩티드의 하이브리드일 수 있다. 수많은 신호펩티드가, 쥐의 면역글로불린 신호펩티드(IgSP, EMBL 접근번호 No. M13331) 및 기타 면역글로불린의 선도 서열, 조직 플라즈미노겐 활성화인자(tPA), 인슐린, 수포성구내염바이러스당단백질(VSVG), IL-2, 알부민, 및 카이모트립신을 포함하는, 그러나 이에 한정하지 않는, 분비 단백질들의 생산에 사용된다. 또한, 하이브리드 선도 서열(가령, 조직 플라즈미노겐 활성화인자 펩티드에 융합된 면역글로불린 신호펩티드를 포함하는 선도 서열)도 개발되었다.
전이유전자의 표면당단백질 성분을 인코딩하는 핵산은, 세포외 발현을 위해 당단백질을 수송하는 기능을 가지는 막횡단(TM) 도메인을 인코딩하는 핵산에 결합된다. 여기서, "결합되다"라는 표현은 TM이 세포외 발현을 위해 당단백질을 효과적으로 수송하도록 표면당단백질이 TM에 부착된다는 것을 시사하기 위해 사용된다. 따라서, TM은 숙주 면역 반응에 부정적인 영향을 미치지 않으면서도 세포외 발현을 위해 당단백질을 수송하고 앵커링하는데 충분한 임의의 도메인일 수 있다. 가령, TM은, 선택된 당단백질 성분에 고유한 TM, 이종 막횡단 도메인, 또는 기능적으로 동등한 그것의 변이체일 수 있다.
대안적으로, TM은, 가령, 엑소좀, 마이크로소포(microvesicle), 매크로소포(macrovesicle), 온코좀(oncozome), 소포(vesicle) 등과 같은 세포외소포체(EV)에 당단백질 성분을 테더링(tethering)하거나 앵커링할 수 있는 펩티드일 수 있으며, 이는 혈청학적 반응을 향상시켜 항체 유도를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 이러한 EV-유도 막횡단 도메인은 바이러스(가령, VSVG)로부터 유래하거나 세포(가령, CD63 및 Lamp2b)로부터 유래할 수 있다. 막 스패닝 도메인(Membrane spanning domains)은, 단일 통과이거나, 4회(4중 통과 또는 테트라스패닌)와 같이 여러 번 막을 통과할 수 있다. 마찬가지로, "EV-유도 테트라스패닌"은 EV 막들로 수송되는 테트라스패닌의 하위 집합을 의미한다. 테트라스패닌은 10개의 다세포 진핵생물 모두에서 발견되는 막단백질 계열이며, 막횡단 4 슈퍼패밀리(transmembrane 4 superfamily, TM4SF) 단백질이라고도 불린다. 이들은, 4개의 막횡단 알파-나선과, 2개의 세포외 도메인, 하나의 짧은 세포외 도메인 또는 루프, 및 하나의 긴 세포외 도메인/루프를 가지고 있다. 한편, 여러 단백질 계열이 4개의 막횡단 알파-나선을 가지지만, 테트라스패닌은, EC2 도메인에 4개 이상의 시스테인 잔기를 포함하고 고도의 15개의 보존 'CCG' 모티프 중 2개가 포함된, 보존 아미노산 서열로 정의된다. 단일 통과 도메인 및 테트라스패닌 도메인을 포함하는 EV 막들의 구체적이고 다양한 단백질들의 예가 표 1에 제시된다.
표 1: EV-유도 막횡단 도메인을 포함하는 단백질들의 예
또한, 전이유전자는 바이러스 핵단백질 성분(즉, 바이러스 RNA와 복합체를 형성하거나, 그렇지 않다면 바이러스 RNA와 상호작용하거나, 또는 바이러스 RNA와 관련된 단백질)을 인코딩한다. 핵단백질 또는 뉴클레오캡시드 단백질은 백신에 의해 표적된 바이러스에 따라 달라진다. 가령, 코로나바이러스의 경우, 핵단백질(N)은 중앙 RNA-결합 부위에 의해 분리된 N-말단 도메인 및 C-말단 도메인(NTD/CTD)을 포함하며, 각 도메인은 고도로 보존된다. C형 간염 바이러스 및 플라비바이러스의 경우, 핵단백질은 C(캡시드) 단백질이다. 전이유전자에 포함시키기 위해, 핵단백질 성분은, 동일한 바이러스의 당단백질 성분으로부터 유래(이에 따라, 당단백질 성분에 의해 표적되는 동일한 바이러스인 제1 표적 바이러스를 표적하도록 선택됨)할 수 있거나, 상이한 제2 바이러스의 당단백질 성분으로부터 유래(이에 따라, 제1 표적 바이러스의 변종, 또는 제1 표적 바이러스의 동종 바이러스과 또는 이종 바이러스과의 바이러스를 포함한 제2 바이러스를 표적하도록 선택됨)할 수 있다. 핵단백질 성분은, 선택된 전장 핵단백질을 인코딩하는 핵산, 또는 그것의 면역원성 절편(가령, 사람 T세포 에피토프(epitopes)를 포함하는 부위)을 포함한다.
RNA 중합효소 성분은, +ssRNA 바이러스에 의해 보존된(가령, +ssRNA 바이러스과 내에 보존된) 바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRp)로부터 유래된다. 따라서, +ssRNA 바이러스에 의해 보존된 RdRp 부위를 인코딩하는 핵산을 RNA 중합효소 성분으로서 선택하는 것이 바람직하다. 보존부위는, 다수의 분리주의 서열정렬을 포함하여, 당해 기술 분야의 통상의 기술을 이용하여 쉽게 식별된다.
전이유전자의 표면당단백질 성분은 자가 절단 펩티드(가령, 리보솜 스키핑(Ribosomal skipping)을 유도함으로써 펩티드 결합의 형성을 방지하고, 단일 3가 전이유전자로부터 2개의 별개 단백질의 발현을 야기하는 펩티드임)를 통해 전이유전자의 핵단백질 성분에 연결될 수 있다. 이는, 핵단백질 성분 및 중합효소 성분이 세포 내에서 발현되는 동안, 표면당단백질의 세포외 발현을 촉진한다. 자가 절단 펩티드는 일례로서, P2A(돼지 테스코바이러스-1), E2A(말 비염 A 바이러스), F2A(구제역 바이러스 18), 및 T2A(토세아 아시그나 바이러스 2A)와 같은 2A 펩티드들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 자가 절단 펩티드의 서열은 도 6에 도시되어 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 천연 서열과 다른, 그러나 2A 펩티드의 자가 절단 기능을 유지하는, 2A 펩티드 서열을 기반으로 한 서열들도 본 발명의 전이유전자로서 사용될 수 있다. 2A 펩티드는 효율성을 향상시키기 위해 2A 펩티드의 N-말단에 선택적 링커(optional linker)인 "GSG"(Gly-Ser-Gly)를 포함할 수 있다.
+ssRNA 바이러스 중에서, 코로나바이러스가 중요하다. 코로나바이러스는 나선대칭의 뉴클레오캡시드 및 표면으로부터 돌출된 곤봉 모양의 스파이크를 가지는 외피보유 RNA 바이러스이다. 코로나바이러스의 유전체의 크기는 약 26~32킬로베이스에 이르며, 이는 가장 큰 RNA 바이러스 중 하나이다. 코로나바이러스는, 알파코로나바이러스, 베타코로나바이러스, 감마코로나바이러스, 및 델타코로나바이러스의 4개 속으로 구성되며, 이 중 알파코로나바이러스와 베타코로나바이러스가 포유동물을 감염시킨다. 코로나바이러스(CoV)에는, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, 및 HCoV-OC43, 뿐만 아니라 SARS-CoV와 같은 보통감기 바이러스가 포함된다. "SARS-CoV"라는 용어는 중증급성호흡기증후군을 일으키는 코로나바이러스를 지칭한다. 예로서, SARS-CoV1, SARS-CoV2 및 MERS-CoV가 있다.
SARS-CoV-2는, 5'-UTP, RNA-의존성 RNA 중합효소와 같은 16개의 비구조단백질을 인코딩하는 2개의 ORFs, 및 스파이크 단백질(S), 외피 단백질(E), 막단백질(M) 및 뉴클레오캡시드 단백질(N)을 포함하는 구조단백질을 인코딩하는 부위를 포함하는 30킬로베이스 이하의 외피보유 RNA 바이러스이다. 본 발명에서 사용된 SARS-CoV-2는, 유전체 서열이 본래의 SARS-CoV-2와 다른 변종 SARS-CoV-2를 포함하고, 코딩 및 논코딩 부위 중 어느 하나 또는 둘 모두의 돌연변이를 포함하는, 모든 SARS-CoV-2를 포함하는 것으로 해석된다. 일 실시예에서, SARS-CoV-2는 참조 SARS-CoV-2 서열(NCBI NC_045512)과 본질적으로 일치하는 유전체 서열(스파이크 (S) 단백질을 인코딩하는 리보뉴클레오티드 위치 21563..25384를 포괄하는 부위인 29903 뉴클레오티드 서열, 핵단백질(N)을 인코딩하는 28274..29533을 포괄하는 부위인 29903 뉴클레오티드 서열, 및 중합효소(POL)를 인코딩하는 266..21555를 포함하는 부위인 29903 뉴클레오티드 서열)을 갖는다.
코로나바이러스 스파이크 단백질은, N-말단에 위치한 신호펩티드, S1 서브유닛, 및 S2 서브유닛을 포함하며, 마지막 두 부위는 각각 수용체 결합과 막 융합을 담당한다. S1 서브유닛에는, N-말단 도메인 및 수용체 결합 도메인(RBD)이 존재하고, 융합 펩티드(FP), 헵타펩티드 반복 서열 1(HR1), 헵타펩티드 반복 서열 2(HR2), 막횡단(TM) 도메인, 및 세포질 도메인은 S2 서브유닛을 구성한다.
일 실시예에서, 본 발명의 전이유전자는, 표면당단백질 성분으로서, 전장 스파이크 단백질 또는 그것의 면역원성 부분으로부터 선택된 코로나바이러스 스파이크 성분을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 가령, 스파이크 성분은, 전장 스파이크 단백질, S1 서브유닛(즉, S1 단독의 RBD 또는 N-말단 도메인의 일부), 또는 그것의 면역원성 절편을 포함할 수 있다. 스파이크 성분은 백신에 의해 표적된 바이러스를 기준으로 선택된다. 일 실시예에서, 스파이크 성분은, SARS-CoV1, SARS-CoV2를 포함하는 SARS-CoV, 또는 이들 중 어느 하나의 변종(가령, SARS-CoV2 베타 변종, SARS-CoV2 델타 변종 및 SARS-CoV-2 오미크론 변종)으로부터 유래된다. 일 실시예에서, 스파이크 성분은 도 1b에 도시된 아미노산 서열을 가지는 S1 서브유닛이다.
전이유전자의 스파이크 단백질 성분은 세포외 발현을 위해 스파이크 단백질을 수송하기 위한 막횡단(TM) 도메인에 결합된다. TM은 숙주 면역 반응에 부정적인 영향을 미치지 않으면서도 세포외 발현을 위해 스파이크 단백질을 수송하고 앵커링하는데 충분한 임의의 도메인일 수 있다. 가령, TM은, 천연 코로나바이러스 스파이크 단백질 TM, 또는 기능적으로 동등한 그것의 변종일 수 있다. 대안적으로, 전술한 바와 같이, TM은, 엑소좀, 마이크로소포, 매크로소포, 온코좀, 소포 등과 같은 세포외소포체(EV)에 스파이크 성분을 테더링하거나 앵커링할 수 있는 펩티드일 수 있다.
전이유전자의 코로나바이러스 핵단백질 성분은, 전장 핵단백질을 인코딩하는 핵산, 또는 그것의 면역원성 절편(가령, 컴퓨터 시뮬레이션 상(in silico)에서 식별될 수 있거나 감염된 개체의 분석을 통해 실증적으로 결정될 수 있는 사람 T 세포 에피토프를 포함하는 부위)을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 핵단백질 성분은, SARS-CoV의 성분, 또는 그것의 변종의 성분이다. 일 실시예에서, 핵단백질 성분은 도 1b에 도시된 아미노산 서열을 가진다.
전이유전자의 코로나바이러스 RNA 중합효소 성분은, 전장 중합효소를 인코딩하는 핵산, 또는 그것의 면역원성 절편(가령, 사람 T 세포 에피토프를 포함하는 부위)을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, RNA 중합효소 성분은, 코로나 바이러스들(특히나 박쥐-유래 코로나바이러스) 중 고도로 보존된 중합효소의 부위이다. 중합효소 성분은, SARS-CoV1 또는 SARS-CoV2와 같은 SARS-CoV, 또는 그것의 변종으로부터 유래된다. 일 실시예에서, 중합효소 성분은 도 1b에 도시된 아미노산 서열을 가진다.
전술한 바와 같이, 전이유전자의 스파이크 성분은 자가 절단 펩티드를 통해 전이유전자의 핵단백질 성분에 결합된다.
전이유전자는 잘 확립된 방법들을 통해 조립되었으며, 핵산 기반 백신(가령, mRNA 또는 DNA 백신) 또는 바이러스 벡터 백신에 사용하기 위하여 조립될 수 있다.
DNA 백신에 사용하기 위해, 당단백질 성분(가령, 코로나바이러스 스파이크 단백질 성분, 핵단백질 성분 및 RNA 중합효소 성분)에 대한 전이유전자 코딩 부위는, 합성될 수 있거나 가령 상업적으로 획득될 수 있으며, 또한, 전술한 바와 같이, 스파이크 단백질 성분에 대한 코딩 부위와 핵단백질/중합효소 성분 사이에 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 DNA와 연결된다. 백신 조성(vaccine construct)은 전이유전자의 발현을 조절하기 위한 적절한 프로모터뿐만 아니라 전사 정지 서열(가령, 말단에 poly (A) 추가 서열)도 포함될 것이다. 백신 조성에 포함되기에 적합한 프로모터의 예시로서, CMV, EF1a, CAG, PGK1, SV40, RSV, TRE, U6, UAS, Ubc, 사람 베타액틴, 및 CAG가 포함되지만, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 상기 조성은, ORF의 업스트림 또는 다운스트림에 위치할 때, 프로모터 활성을 향상시키기 위해, 인핸서 요소 및/또는 전사의 트랜스작용인자(transactivators)를 포함할 수 있다.
그런 다음, DNA 전이유전자 조성은 일반적으로 투여에 맞게 조정된다. 전이유전자 조성은, 직선형 분자, 공유결합폐선형구조(covalently-closed linear construct) 또는 미니서클(mini-circle)로서 투여를 위해 제형화될 수 있다. 대안적으로, 전이유전자 조성은 당해 기술 분야의 공지된 기술을 통해 플라스미드 또는 코스미드(cosmid)와 같은 벡터에 삽입된 후 투여를 위해 제형화될 수 있다. 생성된 DNA 백신은 투여를 위해 제형화된다. 백신은, 가령, 생분해 고분자 미세입자(가령, 키토산, 폴리 락티드-코-글리코리드(polylacticcoglycolides), 폴리에틸렌이민, 아민기로 관능화된 폴리메타크릴레이트, 양이온 폴리(β-아미노 에스테르), 폴록사머(poloxamers), 및 폴리비닐피롤리돈 폴리머) 또는 리포솜과 같은 백신의 면역원성을 향상시키도록 조정된 전달 시스템 내에 포함될 수 있다. 또한, 백신은 면역원성을 향상시키기 위해 보조제(가령, 알루미늄 함유 화합물 및 스쿠알렌(squalene)과 같은 무기 화합물, 파라핀과 같은 오일, 톡소이드와 같은 박테리아 생성물, 식물 사포닌, IL-1, IL-2 또는 IL-12와 같은 사이토카인, 사이토신 포스포구아닌(CpG) 모티프 함유 보조제, 또는 프로인트 보조제와 같은 복합 면역증강제)와 결합될 수 있다.
DNA 전이유전자 조성은, mRNA 백신에 사용하기 위해 언급된 바와 같이 제조되고, mRNA는, 당해 기술 분야의 공지된 방법을 통해 언급된 바와 같이 제조된 cDNA 주형(대표적으로 플라스미드 DNA(pDNA))의 시험관 내 전사에 의해, 그것으로부터 합성된다. cDNA 주형의 전사는 박테리오파지 RNA 중합효소와 같은 RNA 중합효소를 사용하여 진행된다. 안정성과 효율적인 번역을 위해, 생성된 mRNA 가닥은, 5'캡 및 3'폴리(A) 꼬리뿐만 아니라 코딩 부위 측면에 있는 5' 및 3' 비번역 부위(UTRs)를 포함할 것이다. 이후, mRNA 백신은 투여용으로 제형화된다. 이와 관련하여, mRNA는, 분해를 방지하고 흡수를 향상시키며 번역을 촉진하는 물질과 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 보조제의 예에는, 양이온성 폴리펩티드(가령, 프로타민), 나노에멀젼, 캐리어 펩티드, 리포솜, 및 면역 활성화 단백질(가령, CD70, CD40L, TLRs)를 포함하지만, 이에 한정하지는 않는다.
또한, 바이러스 벡터 백신은, DNA 바이러스 벡터 및 RNA 바이러스 벡터 모두를 포함하는 본원의 전이유전자 조성을 투여하는데 사용될 수 있다.
DNA 바이러스 벡터 백신은, 가령, 바이러스 프로모터의 제어 하에, 본원의 DNA 전이유전자 조성을 발현적으로 통합되도록 조정된다. 백신으로 사용하기에 적합한 DNA 바이러스의 일례로, 백시니아 바이러스 및 변형된 백시니아 바이러스와 같은 폭스바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 단순포진 바이러스 및 거대세포바이러스를 포함하나, 이에 한정하지는 않으며, 복제가능 및 복제결핍, 또는 복제불능 모두를 포함하는 이들의 다양한 혈청형을 포함한다.
일 실시예에서, 복제불능 아데노바이러스는 본 발명의 전이유전자 조성을 전달하는데 사용하기 위해 준비된다. 전이유전자는 아데노바이러스에서 결실된 E1/E3 부위에 삽입된다.
또한, RNA 바이러스 벡터 백신은 본 발명의 전이유전자 조성의 적절한 전사체를 발현적으로 통합되도록 조정된다(가령, 양성 가닥 또는 음성 가닥). 전이유전자를 전달하기 위한 백신으로써 사용하기에 적합한 RNA 바이러스의 예는, 수포성구내염바이러스, MoMLV와 같은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 센다이바이러스, 홍역-유래 백신, 뉴캐슬병바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus)와 같은 알파바이러스, 플라비바이러스, 또는 RNA 바이러스를 기반으로 하는(즉, 알파바이러스, 플라비바이러스 등으로부터 유래된) RNA 레플리콘(replicon)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
본원에 상술히 기술된 바와 같은 3가 전이유전자를 포함하는 본원의 백신은, +ssRNA 바이러스(가령, 코로나바이러스)와 같은 RNA 바이러스에 의한 감염과 같은 바이러스 감염에 대항하는 포유동물의 백신 접종 방법에서 사용된다. 백신은, 치료상으로 유효한 양(즉, 포유동물의 면역 반응을 일으키기에 충분한 양, 일반적으로 프라이밍 용량(priming dose)에 이은 부스팅 용량(boosting dose))으로 포유동물에게 투여된다. 당해 기술 분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 면역 반응을 일으키는데 필요한 양은, 가령, 백신 내의 특정 전이유전자/항원, 백신을 전달하는데 사용되는 벡터, 및 치료될 포유동물의 종, 나이, 크기 등을 포함하는 여러 요인들에 따라 달라질 것이다. 이와 관련하여, 가령, 프라이밍 용량으로서 아데노바이러스 벡터 약 106 내지 108 pfu 범위의 투여량을 마우스에 투여하고, 약 2-16주 후, 바람직하게는 약 4-12주 이내에 부스팅 용량으로서 약 106 내지 108 pfu 범위의 투여량을 마우스에 투여하는 것이 면역 반응을 발생시키기에 충분하다. 해당 용량은 일반적으로 사람에게 투여하여 면역 반응을 일으키기에 충분할 것이다.
본 발명의 백신은, 코로나바이러스 감염과 같은 바이러스 감염을 예방하기 위해 가령, 정맥 내 또는 근육 내, 비강 내 또는 흡입과 같은 비경구 투여를 포함하되, 이에 국한되지 않는 여러 투여 경로 중 하나를 통해 포유동물에 투여된다. 핵산 기반 백신의 경우, 전기천공법(electroporation) 또는 유전자총(gene gun)기술을 사용하여 투여하는 등 다른 기술들이 활용될 수 있다. 동일하거나 다른 유형일 수 있는 프라임 및 부스팅 백신(가령, 프라임 및 부스팅 백신 모두가 핵산 기반 백신일 수 있거나, 모두가 바이러스 벡터 백신일 수 있거나, 프라임 백신이 핵산 기반 백신이고 부스팅 백신이 바이러스 벡터 백신일 수 있거나, 프라임 백신이 바이러스 벡터 백신이고 부스팅 백신이 핵산 기반 백터일 수 있음)은 동일하거나 다른 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당해 기술 분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 상기 백신 및 임의의 보조제는, 식염수 또는 기타 적절한 버퍼와 같은 적절한 캐리어에 투여된다. 본 발명에서의 "포유동물"이라는 용어는 사람과 사람이 아닌 포유동물 모두를 지칭하기 위해 사용된다.
본 발명의 일 측면에서, 본원에 기술된 3가 전이유전자를 포함하는 본원의 백신은, 코로나바이러스 감염과 같은 +ssRNA 호흡기 감염을 치료하기에 적합하며, 비강 내 투여 또는 호흡점막을 직접 표적으로 하는 흡입에 유리하도록 제형화된다. 바람직하게는, 백신은, 식염수 또는 기타 적절한 버퍼에 포함된 바이러스 벡터 백신으로서 제공되며, 입으로 또는 비강스프레이(nasal spray)를 통해 흡입되도록 형성된 액체 에어로졸로 분무된다. 일 실시예에서, 백신은, 가령, huAd 또는 ChAd인 아데노바이러스 벡터 백신이다. 다른 실시예에서, 백신은 그 투여를 보조하기 위한 네뷸라이저와 결합된 키트 형태로 제공될 수 있다.
가령, 비강 내 투여 또는 흡입에 의한 투여 방법을 사용할 경우, 백신은 호흡점막에 효율적으로 전달되고 코로나바이러스와 같은 바이러스에 의한 호흡기 감염의 표적 장기인 폐 안에서 면역기억을 생성한다. 이러한 장점은 효과적인 예방을 달성하기 위해 더 낮은 용량의 백신을 사용할 수 있게 한다. 또한, 비강 내 투여 또는 흡입에 의한 투여 방법은, 많은 사람들에게 달갑지 않은 바늘 사용에 의한 백신 투여를 피할 수 있게 해줄 뿐만 아니라, 생물학적으로 유해한 날카로운 물질들의 생산을 방지한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 가령, 네뷸라이저를 사용한, 비강 내 투여 또는 흡입에 의해 투여되는 아데노바이러스 벡터 백신을 일반적으로 전달하는 방법이 제공된다. 이 방법은, 다른 전달 경로들에 비해 상당히 적은 투여량으로 백신을 폐에 효과적으로 전달하고, 다른 투여 방법들의 단점들을 회피할 수 있는 것으로 알려져 있다.
바이러스 표면당단백질, 바이러스 핵단백질 및 바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소 성분을 발현하는 3가 전이유전자를 포함하는 본 발명의 백신은 폭넓은 효능을 지닌 백신으로서 제공된다. 이는, 가령, 제1 표적 바이러스를 표적으로 삼는 스파이크 단백질과 같은 바이러스 당단백질을 기반으로 한, 특정 제1 표적 바이러스(가령, ++ssRNA 바이러스와 같은 RNA 바이러스, 가령, 코로나 바이러스)에 대한 면역 반응 생성의 이로운 결과를 야기하지만, 핵단백질 성분 및 중합효소 성분의 존재를 고려해보았을 때, 제2 표적 바이러스(제1 표적 바이러스의 변종과 같은 제1 표적 바이러스의 연관 바이러스, 또는 +ssRNA 바이러스와 같은 다른 RNA 바이러스)에 대해서는 효과적인 면역 반응을 촉진하도록 설계된다. 이와 관련하여, SARS-CoV2 변종의 핵단백질 성분 및 중합효소 성분은 고도로 보존되어 있다는 점을 주목해야 한다. 따라서, SARS-CoV2 균주를 표적으로 하는 당단백질 성분뿐만 아니라, SARS-CoV2 균주를 표적으로 하는 핵단백질 성분 및 중합효소 성분을 포함하는, 본 발명에 따른 3가 전이유전자는 표적 균주뿐만 아니라 그것의 변종에 대해서도 효과적일 것이다. 따라서, 상기 백신은, SARS-CoV와 같은 표적 코로나바이러스뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 발생될 수 있는 변종 코로나바이러스에 대한 예방까지도 추가적으로 제공하도록 설계된다.
본 발명의 실시예들은, 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는, 다음의 구체적인 실시예들을 참조로 하여 설명된다.
예시
예시 1 - 3가 전이유전자
도 1a에 도시된 바와 같이, 3가 전이유전자는 확립된 방법들을 통해 준비되었다. 전이유전자는, 사람 tPA 신호서열/프로펩티드(aa 1-32), SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 S1 부위(aa 47-716), 자가 절단 펩티드보다 앞선 VSV G의 막횡단 도메인(aa 443-511), 돼지 테스코바이러스의 P2A, GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO: 1)을 포함하는 서열, SARS-CoV-2 중합효소의 고도로 보존된 부분(aa 4673-4742)에 융합된 전장 SARS-CoV-2 핵단백질(aa 1-419)을 포함한다. 발현 카세트(expression cassette)는, 약 86kDa의 막결합 스파이크 S1 항원뿐만 아니라 약 56kDa의 세포내 핵단백질/POL 융합 단백질을 생성하였으며, 그 아미노산 서열은 도 1b에 도시되어 있다.
당해 기술 분야에 잘 확립된 프로토콜을 사용하여, 전이유전자를 복제불능 사람 아데노바이러스 벡터인 huAd5, 및 침팬지 아데노바이러스 벡터인 ChAd에 삽입하였다.
예시 2 - 복제불능 ChAd 벡터의 준비
복제불능 침팬지 아데노바이러스 68(ChAd68) 벡터는, Abbink et al. (Journal of virology, Mar 2018, 92(6), e01924-17)에 기재된 바와 같이, 다른 아데노바이러스 벡터에 대한 이전의 개발된 접근법을 기반으로 하는 2개의 플라스미드 시스템에 의해 제조되었다. 셔틀 플라스미드는, E1이 결실되고 전이유전자 발현 카세트로 대체된, pIX 서열 및 pIVa2 서열을 통한 좌측 역말단 반복서열(inverted terminal repeats)을 포함한다. 상기 카세트는, 사람 거대세포 바이러스(HCMV) 프로모터, 전이유전자 코딩 서열의 편리한 스와핑(swapping)을 위한 제한효소 부위, 및 유인원바이러스 40(SV40) 아데닐산중합반응 신호(polyadenylation signal)를 포함한다. E3이 부분적으로 결실된 pIX의 업스트림에서 오른쪽 ITR까지를 포함하는 나머지 유전체 부분을 박테리아 인공 염색체(BAC)에 클로닝하였다. 셔틀 플라스미드와 유전체 BAC 사이의 약 2.5 kb의 중첩 영역은, 2개의 조성이 HEK293과 같은 E1-상보성 세포주(E1-complementing cell line)에 공동 형질감염될 때, E1 결실 및 부분 E3 결실 대신 전이유전자 카세트를 사용하여, 전체 ChAd68 유전체를 생성하는 상동 재조합을 가능하게 한다. 셔틀 플라스미드 및 유전체 BAC의 신속한 클로닝을 촉진하기 위해, Abbink et al.(2018)에 기술된 바와 같이 DNA 조립이 사용되었다. 이 방법은, ~20-60개의 뉴클레오티드 중첩을 포함하는 복수 개의 DNA 절편들을, 제한 소화(restriction digest)의 조건 없이, 단일 반응으로 인접한 절편들과 결합할 수 있도록 한다. 도 12는 ChAd 벡터를 제조하는데 사용되는 방법을 개략적으로 도시한 것이다.
DNA 조립을 사용하여 셔틀 플라스미드를 조성하기 위해, PCR을 통해 4개의 DNA 절편들(프라이머가, 인접한 절편 사이에 필요한 중첩 서열들을 제공하도록 설계됨)을 생성하였다. 의도하지 않은 돌연변이의 위험을 줄이기 위해 퓨전 핫 스타트 II 하이 피델리티(Phusion hot start II high fidelity) DNA 중합효소(Thermo Fisher)가 사용되었다. 플라스미드 백본(backbone)절편은 pUC57 기반 플라스미드로부터 획득되었다. E1 대신, 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP) 전이유전자 카세트를 포함하는 절편은, 합성 DNA 주형(synthetic DNA template)을 사용하여 PCR 증폭되었다. 나머지 2개의 절편들은 야생형 ChAd68(ATCC VR-594TM)에서 추출한 유전체 DNA로부터 증폭되었다. PCR 생성물은, 아가로스 전기영동 겔에서 추출되었으며, NEBuilder HiFi DNA 조립 2x 마스터 믹스(New England BioLab)에 의해 셔틀 벡터에 조립됨으로써 절편의 효율적이고 원활한 오류 없는 결찰을 가능하도록 한다. 그런 다음, 조립된 구성물을, NEB 10-beta chemically competent Escherichia coli(New England BioLab)으로 형질전환시키고, 접합부에서 제한 소화 및 PCR에 의해, 성공적인 조립을 위해 콜로니를 순차적으로 스크리닝 하였다. 마지막으로, 선별된 클론들은 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)을 통해 의도하지 않은 돌연변이가 없음이 확인되었다.
유전체 BAC는, NEBuilder HiFi DNA 조립을 사용한 유사한 방식으로 생성되었으며, 더 큰 삽입물을 수용하기 위해 일부 변형이 있었다. 조립 반응은, 제한효소 소화에 의해 제조된 BAC 백본 절편, 및 ChAd68 유전체 DNA에서 증폭된 5개의 ~5.3-7.5 kb의 PCR 절편들로 구성된다. 4개의 코딩 서열(CR1-알파1, gk19k, CR1-베타1, 및 CR1-감마1)을 파괴하는 E3 부위의 1,388개의 뉴클레오티드 결실은, 결실될 서열 바로 옆에 위치하는 2개의 유전체 절편을 서로 결합함으로써 달성된다. 조립된 생성물은 TransforMax EPI300 electrocompetent E.coli(Lucigen)으로 형질전환되었다. 제한 소화 및 PCR을 통해 콜로니를 선별한 후, 선택된 클론들의 서열을 차세대 염기서열분석법(next generation sequencing)을 통해 확인하였다. 아데노바이러스 벡터의 서열인 ChAd68은 도 13에 제공된다.
복제불능 huAd5 벡터는 유사하게 제조되었다.
실시예 1에 설명된 전이유전자(즉, 3가 SARS-CoV2 전이유전자)와 같은, 전이유전자는, PaCI 또는 EcoRI 및 ClaI 또는 XbaI의 코딩 서열의 5'말단 및 3'말단 각각에 위치하는 부위를 사용하여, ChAd68 셔틀 플라스미드에 쉽게 서브클로닝된다. 그런 다음, 관심 유전자(gene of interest) 및 유전체 BAC를 포함하는 셔틀 플라스미드는, 백본 내에서 제한 소화에 의해 선형화되고, 정제되며, HEK293 세포(상기 셔틀 플라스미드가 재조합되어 전이유전자를 포함하는 원하는 ChAd68벡터가 생성되는 곳)에 공동 형질감염된다.
예시 3
사람 A549 세포를 복제불능 ChAd 또는 3가 SARS-CoV2 전이유전자를 포함한 huAd5 백신 벡터로 형질도입하고, 전체 세포 용해물(whole cell lysates)을 수집하여 이를 웨스턴 블롯하였다. S1/VSVG 융합, N/P 융합, 또는 세포 GADPH에 특이적인 항체를 사용하여 블롯을 탐침(probe)하였다. 개별 S1/VSVG 및 NP 융합 단백질은 도 2의 A에 도시된 바와 같이 형질도입된 세포에 의해 발현되었다.
사람 A549 세포는, 3가 SARS-CoV2 전이유전자를 모두 포함하는 두 개의 서로 다른 복제불능 ChAd 클론(W 또는 T)을 통해 다양한 MOI에서 형질도입되었으며, 전체 세포 용해물은 수집되어 웨스턴 블롯되었다. S1/VSVG 융합, N/P 융합, 또는 세포 GADPH에 특이적인 항체를 사용하여 블롯을 탐침하였다. 개별 S1/VSVG 및 NP 융합 단백질은 도 2의 B에 도시된 바와 같이 형질도입된 세포에 의해 발현되었다.
예시 4
BALB/c 마우스는, ChAd 또는 huAd5 백신 벡터 중 하나 또는 프라임-부스트 요법(Ad5-ChAd, 또는 ChAd-Ad5)을 통해 백신 접종되었고, 도 3의 A에 도시된 프로토콜을 이용하여 3가 SARS-CoV2 전이유전자를 발현시킨 후 바이러스(SARS-CoV-2) 챌린지를 진행하였다. 이때, 투여된 백신 벡터의 용량은 5e7 PFU이었다.
감염 후 약 4일, 초기 체중의 약 90%로 감소한 ChAd-Ad5 치료군을 제외하고, 모든 치료군은 감염 후 8일간 초기 체중의 적어도 95% 이상을 유지하였다.
도 3의 C에 도시된 바와 같이, Ad5 치료군의 생존율은 100%였고, ChAd-Ad5 군에서는 약 80%로 다소 낮았다.
예시 5
BALB/c 마우스는, 3가 SARS-CoV2 전이유전자를 발현하는 ChAd 백신 벡터, 또는 3가 SARS-CoV2 전이유전자를 발현하는 huAd5 백신 벡터를 사용하여, 개시된 바와 같이 백신 접종되었다. 스파이크- 또는 RBD-특이항체는 백신 접종 2, 4, 8주 후 ELISA에 의해 검출되었다(도 4의 A). SARS-CoV2 바이러스의 혈청중화는 시험관 내에서 수행되었다. 결과는 도 4의 B에 도시된 바와 같다.
예시 6
BALB/c 마우스는, 3가 SARS-CoV2 전이유전자(Tri:ChAd)를 발현하는 ChAd 백신 벡터, 또는 3가 SARS-CoV2 전이유전자를 발현하는 huAd5 백신 벡터를 사용하여, 비강 내(흡입) 경로를 통해 백신 접종되었다. 4주 후, 기관지폐포세척(bronchoalveolar lavage, BAL)을 통해 폐로부터 면역 세포를 수집하였고, 3개의 SARS-CoV2 Ags(S1, N 및 POL)를 포함하는 중첩 펩티드 라이브러리(overlapping peptide libraries)와 함께 자극에 의한 특정 T 세포 반응을 평가하였다. 두 벡터 모두, 도 5의 A/B에 도시된 바와 같이, 백신을 접종한 마우스의 폐에 존재하는, 세 가지 항원 각각에 특이적인 CD8+T 세포를 유도하였다.
예시 7 - SARS-CoV2 변종에 대한 3가 전이유전자 백신 접종의 효과
동물들(K18-hACE2 전이유전자 마우스, 그룹 당 N=10)은, 1×107 PFU Tri:ChAddml 단일 투여 용량, 또는 당량의 빈 벡터(ChAd:EV)로 비강 내 면역화되었다. 면역화 4주 후, 동물들은, SARS-CoV-2의 조상균(Wuhan)인 B.1.1.7, 또는 B.1.351의 1×105 PFU로 비강 내 감염되었다. 폐 및 뇌의 바이러스역가를 위해 동물들의 코호트(N=5)는 감염 4일 후 희생되었다(도 7의 A 참조). 나머지 마우스들에 대한 체중 감소 여부 및 생존 여부를 관찰하였다.
도 7은 SARS-CoV-2의 조상균에 의한 비강 내 감염 후 체중 감소(B) 및 생존(C)을 도시한 것이다. 동물들은, 인도적 종료시점(human endpoint)인 20% 체중 감소 또는 신경학적 후유증(neurological sequala)에 도달할 때까지, 또는 실험 종료시점(experimental endpoint)인 감염 후 14일까지, 관찰되었다. 도시된 바와 같이, 전이유전자 벡터를 이용한 백신 접종은, 실험 기간 동안, 체중 감소를 막고 생존을 유지하는데 효과적이었다. 전체 폐 균질액을 사용한 플라크 분석(Plaque assay)을 통해 감염 후 4일에 측정된 폐 바이러스 역가는, 전이유전자 백신을 접종한 동물들에서 본질적으로 바이러스 부담이 없음을 보여준다.
또한, SARS-CoV2 변종 B.1.1.7 및 SARS-CoV2 변종 B.1.351에 감염된 후 백신을 접종한 마우스의 체중 감소 및 생존을 관찰하였다. 유사한 결과(체중 감소 데이터는 도 7의 E/G, 및 생존 데이터는 도 7의 F/H를 참조)가 획득되었으며, 이는 3가 전이유전자 백신 접종이 SARS-CoV2 변종에 대해서도 효과적임을 나타낸다. B.1.1.7 및 B.1.351에 감염된 동물들의 폐 바이러스 역가는, 전체 폐 균질액을 사용한 플라크 분석을 통해 측정되었다(도 7의 I). B.1.1.7 및 B.1.351에 감염된 동물들의 뇌 바이러스 역가는, 뇌 균질액을 사용한 플라크 분석을 통해 측정되었다(도 7의 J). 두 가지 모두 백신을 접종한 동물들에게서 본질적으로 바이러스 부담이 없음을 보여준다.
예 8
생후 6~8주된 암컷 BALB/c 마우스는, Tri:ChAd(1×107 PFU)의 단일 투여 용량으로 근육 내(i.m.) 또는 비강 내(i.n.) 면역화되었으며, 면역화 8주 후 희생되었다.
항-스파이크 또는 항-RBD 결합 항체의 존재를 ELISA를 통해 평가하기 위해 근육 내 또는 비강 내 면역화된 동물들의 혈청이 사용되었다. 항체 수치는 종료시점 역가(endpoint titers)로 표시된다. 스파이크 및 RBD 단백질은 SARS-CoV-2의 우한-후-1(Wuhan-Hu-1) 균주를 기반으로 합성되었다(그룹 당 n=5 마리). 도 14의 B에 도시된 바와 같이, 호흡기 점막 백신 접종(i.n.)은 증가된 수치의 혈청항체를 생성한다.
그런 다음, SARS-CoV-2의 우한-후-1 균주에 대항하는 근육 내 또는 비강 내 면역화된 동물들의 혈청중화항체는, VERO-E6 기반의 살아있는 바이러스의 중화 분석(neutralizing assay)에 사용되었다. 중화는, 미감염 대조군 웰(well) 또는 감염된 대조군 웰(그룹 당 n=6 마리)에 대한 중화 %로 표시된다. 도 14의 C에 도시된 바와 같이, 비강 내 면역화된 동물들의 항체는, 생성된 항체의 증가 수치를 고려하였을 때, 더 효과적인 중화를 나타내었다.
RBD-특이적 클래스전환 IgG1+ B세포의 절대 수(absolute number)는, 근육 내 또는 비강 내 면역화된 동물들 폐의 RBD 사량체(tetramer)를 사용하여 유세포분석(그룹 당 n=3 마리)을 통해 정량화되었다. 또한, 상주 기억 CD8+ T 세포(CD44, CD103, CD69, CD49a의 공동발현에 의해 정의됨)의 절대 수는, 근육 내 또는 비강 내 면역화된 동물들 폐의 유세포분석(그룹당 n=3 동물)을 통해 정량화되었다. 도 14의 D/E 각각에 도시된 바와 같이, 비강 내 면역화된 동물들의 폐에 존재하는 B 세포 수치 및 T 세포 수치는 근육 내 면역화된 동물들보다 더 높았다.
따라서, 호흡기 점막 백신 접종은 강력하고 지속적인 적응 면역을 유도한다.
예 9
생후 6~8주된 암컷 반접합성(hemizygous) K18-hACE2 마우스(6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J, Strain #:034860, RRID:IMSR_JAX:034860, Jackson Labs)는, Tri:ChAd(1×107 PFU) 단일 투여 용량으로 비강 내(i.n.) 면역화되었으며, SARS-CoV-2 베타 B.1.351 변종(1×105 PFU)에 의해 치명적인 수준으로 감염되었다. 동물들의 하위 집합은 감염 4일 후 폐 및 뇌 바이러스의 역가를 계산하기 위해 희생되었다. 동물들의 나머지 하위 집합은 체중 감소의 관찰을 위하여 총 14일 동안 관찰되었다.
체중 감소는, 대조군(PBS) 및 비강 내 Tri:ChAd 백신 접종된 동물들(그룹 당 n=5 마리)의 SARS-CoV-2 베타 B.1.351 변종에 의한 비강 내 감염 후 결정되었다. 도 15의 B에 도시된 바와 같이, 백신이 접종된 동물들은 미접종된 대조군 동물들에 비해 체중 감소가 거의 또는 전혀 발생하지 않았다.
대조군(PBS), 또는 비강 내 Tri:ChAD 백신 접종된 동물들의 SARS-CoV-2 베타 B.1.351 변종에 의한 감염 4일 후의 폐 및 뇌 바이러스 역가 계수는, VERO-E6 기반 분석을 이용하고 세포변성효과의 존재를 평가함으로써 결정되었다(그룹 당 n=5 마리). 도 15의 C/D에 도시된 바와 같이, 백신이 접종된 동물들의 폐 및 뇌에서 바이러스 부담이 거의 또는 전혀 없음을 알 수 있다.
따라서, Tri:ChAd와 같은 아데노바이러스 3가 전이유전자는 면역 회피성 SARS-CoV-2 변종(베타 변종)에 의한 치명적인 감염을 예방하는데 효과적이다.
예 10
생후 6~8주된 암컷 반접합성 K18-hACE2 마우스는, Tri:ChAd(1×107 PFU) 단일 투여 용량으로 비강 내(i.n.) 면역화되었으며, SARS-CoV-2 델타 B.1.672 변종(1×105)에 의해 감염되었다. 동물들의 하위 집합은 감염 4일 후 폐 및 뇌 바이러스의 역가를 계산하기 위해 희생되었다. 동물들의 나머지 하위 집합은 체중 감소의 관찰을 위하여 총 14일 동안 관찰되었다.
체중 감소는, 대조군(PBS) 및 비강 내 Tri:ChAd 백신 접종된 동물들(그룹당 n=5 마리)의 SARS-CoV-2 델타 B.1.672에 의한 비강 내 감염 후 결정되었다. 도 16의 B에 도시된 바와 같이, 백신이 접종된 동물들은 미접종된 대조군 동물들에 비해 훨씬 적은 체중 감소를 나타냈고, 감염 후 약 5-6일 내에 정상 체중을 회복하였다.
대조군(PBS), 또는 비강 내 Tri:ChAD 백신 접종된 동물들의 SARS-CoV-2 델타 B.1.672에 의한 감염 4일 후의 폐 바이러스 역가 계수는, VERO-E6 기반 분석을 이용하고 세포변성효과의 존재를 평가함으로써 결정되었다(그룹 당 n=5 마리). 도 16의 C에 도시된 바와 같이, 백신이 접종된 동물들의 폐에서는 바이러스 부담이 거의 또는 전혀 없음을 알 수 있다.
따라서, Tri:ChAd와 같은 아데노바이러스 3가 전이유전자는 면역 회피성 SARS-CoV-2 변종(델타 변종)에 의한 치명적인 감염을 예방하는데 효과적이다.
예 11
생후 6~8주된 암컷 반접합성 K18-hACE2 마우스는, Tri:ChAd(1×107 PFU) 단일 투여 용량으로 비강 내(i.n.) 면역화되었으며, SARS-CoV-2 오미크론 BA.1 변종(1×105)에 의해 감염되었다. 동물들의 하위 집합은 감염 4일 후 폐 및 뇌 바이러스의 역가를 계산하기 위해 희생되었다. 동물들의 나머지 하위 집합은 체중 감소의 관찰을 위하여 총 14일 동안 관찰되었다.
체중 감소는, 대조군(PBS) 및 비강 내 Tri:ChAD 백신 접종된 동물들(그룹당 n=5 마리)의 SARS-CoV-2 오미크론 BA.1에 의한 비강 내 감염 후 결정되었다. 도 17의 B에 도시된 바와 같이, 백신이 접종된 동물들은 미접종된 대조군 동물들에 비해 미미한 체중 감소를 나타냈다.
대조군(PBS), 또는 비강 내 Tri:ChAD 백신 접종된 동물들의 SARS-CoV-2 오미크론 BA.1에 의한 감염 4일 후의 폐 바이러스 역가 계수는, VERO-E6 기반 분석을 이용하고 세포변성효과의 존재를 평가함으로써 결정되었다(그룹 당 n=5 마리). 도 17의 C에 도시된 바와 같이, 백신이 접종된 동물들의 폐에서는 바이러스 부담이 거의 또는 전혀 없음을 알 수 있다.
따라서, Tri:ChAd와 같은 아데노바이러스 3가 전이유전자는 면역 회피성 SARS-CoV-2 변종(오미크론 변종)에 의한 감염을 예방하는데 효과적이다.
예 12
사람의 효과적인 호흡기 점막 면역화를 위해, 에어로졸을 통해 흡입된 아데노바이러스 벡터 백신을 폐로 전달하기 위한 에어로넵® 솔로 분무 시스템(AeroNeb® Solo nebulizing system)의 적합성이 연구되었다.
방법 - AdHu5Ag85A를 포함하는 에어로넵® 솔로의 에어로졸 성능은 표준 절차를 통해 결정되었다. 충진량(Fill volume, FV), 전달 시간, 입에서 사용 가능한 표준 필터에서 수집된 백신 에어로졸의 방출된 약의 용량, 및 15Lpm에서 작동되는 NGI 캐스케이드 임팩터(cascade impactor)를 통한 에어로졸 액적 크기 특성이 측정되었다. NGI 및 필터 상의 백신 존재 여부는 PCR을 통해 확인되었다. 살부타몰 황산염(salbutamol sulphate)은 백신 입자를 포함하는 식염수 액적의 트레이서 역할을 한다. 폐에서의 백신 액적의 위치적 침적(regional deposition)은 운반체(살부타몰) 에어로졸의 입자 크기 메트릭스로부터 추정되었다. 입에서 사용 가능한 백신 용량의 표시는 ED(방출된 약의 용량)로부터 예측된다. 폐에 침적될 것으로 예상되는 (에어로졸을 함유한) 백신의 양은, 입자 크기 통계와 함께 ED를 사용하여 계산된다. 에어로졸화된 백신의 생존 가능성(viability)은 플라크 형성 분석을 통해 결정되었다.
PBS 또는 0.9N 식염수 내의 살부타몰 황산염에 대한 표준 곡선(standard curves)은 각 실험일 마다 결정되었다. 샘플들을 매칭되는 석영 큐벳(quartz cuvettes)에 넣고 λ=276nm(Genesys 10S, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에서 자외/가시선 분광법으로 판독하였다. 0.9N 식염수의 다양한 유체량(0.2, 0.5, 1.0, 2.0ml)을 완전히 에어로졸화하는 시간은, 에어로젠 제어 장치(Aerogen Control Unit)를 사용하여 벤치(bench)에서 에어로젠 솔로(Aerogen Solo)를 지속적으로 작동함으로써 결정된다. 상기 제어 장치는, 네뷸라이저의 출구부로부터, 에어로졸이 더 이상 보이지 않게 되자마자 턴-오프되고, 시간이 기록되었다. 세 개의 서로 다른 에어로젠 솔로 네뷸라이저 각각에 대해 4가지의 유체 용량을 건조하는 시간을 측정하는 테스트가 수행되었다. 선택된 용량은, 측정의 재현성 및, 향후 임상 시험에서 백신을 흡입하는 피험자가 감당 가능할 것으로 간주되는 측정 시간을 기준으로 결정하였다. 선택된 용량은 모든 후속 실험에서 사용되었다.
방출된 약의 용량(ED)의 결정 - 대조군(PBS)의 살부타몰 황산염(SS)은, 입으로 전달되는 백신 에어로졸의 양을 측정하기 위한, 운반 에어로졸(carrier aerosol)로서 사용되었다. SS는 AdHu5Ag85A 백신(McMaster Immunology Research Centre의 Robert E.F. Vector Lab에서 제조됨)과 혼합되고, 0.9N 멸균 식염수에 희석되었다. 해당 용액의 0.5ml 용량을, 에어로넵 솔로 마이크로펌프 네뷸라이저에 적재하고, 건조될 때까지 에어로졸화하였다. ED를 측정하기 위해 네 가지의 서로 다른 실험 설정이 사용되었다: i) 에어로젠 제어 장치를 사용하여 네뷸라이저를 지속적으로 작동시키는 것; ii) 15L/min의 일정한 유량에서 작동되는, Copley Dosage Unit Sampling Apparatus(DUSA)(Copley Scientific, UK)를 사용한 절대 필터(absolute filter)에서 약물을 수집하는 것; iii) 호흡 패턴 설정이 15bpm, I/E 비율 1:1, Vt = 500ml인 Copley Breath Simulator(BS1000, Copley Scientific, UK)를 사용한 다음, 에어로젠 네뷸라이저를 건조될 때까지 '호흡'하는 것; 및 iv) 시험관 내/생체 외(Ex Vivo)에서 8명의 건강한 지원자(남성 4명, 여성 4명)가, 입에 위치하는 절대 필터를 통해, 에어로젠 솔로에서만 살부타몰 에어로졸을 흡입하는 것. 모든 방법에서, 살부타몰 황산염은 PALL 또는 MSP 필터로부터 회수되었으며, SS 수치는 λ=276nm에서 자외선 분광법을 통해 검출되었다. 또한, 각 실험 실행에 대해서, 에어로졸화에서 건조까지의 시간도 기록되었다.
공기역학적 입자 크기 분포(APSD) - APSD는, 15L/min의 일정한 보정 유량으로 작동하는(TSI Flowmeter 4000 시리즈) 차세대 임팩터(NGI, MSP Corp, MN)를 통해 측정되었다. 15 Lpm의 NGI 단계에서의 유효 차단 직경(effective cutoff diameters, ECDs)은 14.1-0.98μm 범위이다. NGI의 표준 주입구(inlet)는, NGI와 에어로젠 솔로 네뷸라이저 회로부를 연결하는데 사용된다. 네뷸라이저는 에어로젠 제어 장치를 통해 작동되며, 에어로졸은 NGI에서 건조될 때까지 수집된다. 그런 다음, NGI를 분리하고, 컵의 약물을 실험실 SOP에 따라 처리하였다. 식염수에 포함된 살부타몰 황산염으로 대조군 크기를 획득하였다; 그런 다음 살부타몰 황산염에 백신을 추가하고, 크기 조정을 반복하여 에어로졸의 수율 및 입자 크기 분포에 변화가 있는지 확인하였다. 식염수 내 살부타몰 황산염은 λ=276nm에서 자외선 분광법에 의해 NGI단계에서 검출되었다; qPCR 분석은, NGI단계의 컵 및, 마지막 단계에서 필터에 침적되는 백신의 양을 결정하는데 사용되었다. 폐의 위치적 분포(regional distribution)를 추정하기 위해, 다음과 같은 APSD 통계가 결정되었다: 질량 중위 공기역학적 직경(Mass Median Aerodynamic Diameter(MMAD), 기하 표준편차(Geometric Standard Deviation, GSD), 및 호흡분율(Respirable Fractions, RF - %<5.39μm, RF - %<2.08-5.39μm, %<2.08 μm).
폐에 침적된 살부타몰의 호흡 가능용량(Respirable Dose, RD)은, ED 측정값과 NGI APSD: RD = ED x %RF를 통해 획득된 호흡분율을 통해 추정되었다. 이러한 계산은 폐로 흡입된 백신의 위치적 분포를 추정하는데 사용된다.
NGI 및 필터에서 아데노바이러스 정량을 위한 qPCR - 테스트 샘플들은 2 mL의 easyMag 용해 버퍼(bioMrieux, St. Laurant, QC)에 제공되었으며, 추출될 때까지 -80°C에서 보관되었다. 상기 샘플들은 오프보드 용해법(off-board lysis approach)을 사용한 easyMag에 의해 추출되었으며, 50 uL의 최종 부피로 용출되었다. 그런 다음, 추출된 샘플의 5 마이크로리터 또는 10분의 1은, Qiagen QuantiTect Probe Kit, 프라이머, 및 컨센서스 프로브(consensus probe)를 사용한 RotorGene Q(Qiagen, Toronto, ON)에서 정량 실시간 아데노바이러스 PCR을 통해 테스트되었다. 분석은, 아데노바이러스 헥손 유전자의 103bp 보존부위를 표적으로 하고, 45회의 증폭 주기를 가지며, 5 × 103 및 5 × 108 복제수/ml 사이의 선형 동적 범위를 갖는다.
에어로졸 액적에서 바이러스 입자의 생존 가능성을 결정하기 위한 바이러스 플라크 형성 분석 - 바이러스 플라크 형성 단위(PFU) 전날에, 293개의 셀은 T150 플라스크에서 60 mm 배양 접시로 분할되어 5 ml의 MEM F-11(10% FBS, 1% P/S, 1% HEPES) 배양 배지에서 80% 컨플루언스(confluence)된 상태가 되었다. PFU 분석을 수행하기 위해, 0.5 ml 액체 백신을 연속적으로 4회(20, 20, 20, 및 60초) 분무하고, 에어로졸은, 10 ml의 PBS++(0.01% CaCl2 및 0.01% MgCl2이 포함된 1xPBS)가 포함된, 밀봉된 50-ml 팔콘 튜브(Falcon tubes)에 수집되었다. 수집된 에어로졸의 연속 희석(serial dilutions) 바이러스 샘플들은 PBS++ 버퍼를 포함하는 24개의 웰 플레이트(well plates)에 준비되었다. 양성대조군으로서, 샘플은, 분무 전 네뷸라이저 저장부로부터 직접적으로 수집되어, 105, 5x105, 및 106 배로 희석되었다. 2분 이내에 수집된 연속 에어로졸 샘플들은 각각 102, 103 and 104 배로 희석되었다. 293개 셀의 60 mm 접시로부터 배양 배지를 제거한 후, 세포를 연속 희석된 샘플/접시 200ul에 감염시켰다. 각 샘플은 이중 플레이트(duplicate dishes)에 준비되었다. 그런 다음, 세포를 37oC 5% CO2 인큐베이터에서 45분간 배양하였다. 배양하는 동안, MEMF11-아가로스 오버레이는, 2 x MEMF 11 배지(10% FBS, 2% L-글루타민, 및 2% P/S 및 HEPES)를 44oC에서 가온하고, 1% 아가로스를 전자레인지에서 녹인 다음 아가로스를 44oC 수조에서 냉각하며, 동량의 1% 아가로스를 MEMF11 배지(10 ml/접시)와 혼합함으로써 준비되었다. 접시에 담긴 한천(Agar)은 생물안전캐비넷(Biosafety cabinet) 내부에서 실온에서 고형화되었다. 그런 다음, 접시를 37oC 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였고, 바이러스 플라크는 5일, 7일, 및 10일에 카운트되었다.
결과 - 0.5ml의 충진량(FV)은 식염수에 백신을 완전히 전달하는데 적합한 용량이었다. 피험자들은 평상 호흡(tidal breathing)을 통해 약 2분만에 0.5ml의 백신을 흡입하였다. 입에서 사용할 수 있는 백신의 ED는 네뷸라이저에 적재된 용량의 약 50%이었다. 백신이 포함된 살부타몰 에어로졸의 미세 입자 분율(fine particle fraction)은, 에어로졸의 85%가 직경이 5.39μm 미만인 액적에 포함되어 있는 것으로 나타났다. 따라서, 입에서 사용이 가능하며 이후 폐에 침적되는 에어로졸의 양은 42.5%였다. 네뷸라이저에 의해 생성된 에어로졸 액적에서 생존 가능한 백신의 추정 비율은 17.4%였다. 따라서, 우리의 연구는 이와 같이 생성된 백신 에어로졸이 후두(larynx) 아래의 사람 호흡 기도에 효율적으로 침적될 수 있음을 나타낸다.
최적의 샘플 적재량 및 분무 시간 - 우리는 먼저, 에어로젠 제어 장치를 사용하여, 에어로젠 솔로가 식염수(0.2-2.0 ml 0.9N)의 유체량을 완전히 에어로졸화하는데 걸리는 시간을 결정하였으며, 용량 각각을 3개의 네뷸라이저에서 3회 테스트하였다. 다른 용량들과 비교하였을 때, 0.50 ml의 충진량(FV)은 67.8±3.7초 만에 네뷸라이저 저장부에 모든 식염수를 전달하였으며(도 8), 이는 피험자가 회로부(circuit)에서 편안하게 호흡을 유지하는데 무리한 시간이 아닌 것으로 여겨진다. 0.50 ml를 완전히 에어로졸화하는 시간은 재현성이 높았다(CV=5.44%)(도 8). 따라서, 에어로젠 솔로 네뷸라이저를 사용한 모든 후속 시험관 내 측정에서는 0.5 ml의 충진량이 선택되었다.
건강한 사람의 에어로졸 흡입 시간 - 피험자의 에어로졸 흡입 시간을 결정하기 위해 우리는 먼저, Dose Unit Sampling Apparatus(DUSA)를 통한 151lpm의 일정 유속을 사용함으로써, 그리고 에어로젠 제어 장치를 사용함으로써 결정된 0.5 ml 용량의 분무 시간과, 에어로젠 솔로 네뷸라이저에 연결된 Vt 500ml, 15 bpm의 호흡 시뮬레이터를 사용함으로써 결정된 분무 시간을 비교하였다. 151pm의 일정 유속을 사용하는 DUSA, 및 에어로젠 전달 시스템에 소속된 호흡 시뮬레이터 각각의 0.5 ml 식염수 분무 시간은, 각각 71.5±7.12초 및 70.5±2.60초로 서로 유사하였다(표 2).
표 2. 에어로젠 솔로 마이크로펌프 네뷸라이저를 사용한 4가지 조건 하에서의 0.5ml 식염수 분무 시간(t)
인간의 평상 호흡의 변화는, 0.5 ml 부피의 에어로젠 솔로 네뷸라이저를 사용한 에어로졸 흡입의 완료에 필요한 시간에 영향을 미칠 수 있으므로, 흡입 시간을 결정하기 위해 우리는 총 8명의 건강한 피험자(남성 4명, 여성 4명)를 모집하였다. 이를 위해, 에어로졸화된 0.5 ml 식염수의 흡입 완료 시간은, 에어로젠 솔로 네뷸라이저 및 필터를 포함한 제어 장치를 사용하고, 이를 피험자의 코에 고정한 상태에서 결정되었다. 평상 호흡을 사용하여 에어로젠 솔로를 완전히 비우는 시간은, 일정 유속 하에서 네뷸라이저를 작동하는 것에 비해 약 70초 증가한 149.3 ± 8.0초(표 2)였다.
방출되는 약의 용량 - 분무 중, 그리고 시스템 내에서 물질의 손실이 있을 것으로 예상되기 때문에, 입에서 사용할 수 있는 초기 적재 백신의 비율을 결정하는 것이 중요하였다. 이는, AdHu5Ag85A 백신의 부재 또는 존재 하에서, 0.5 ml 적재 버퍼 내 트레이서 살부타몰 황산염, 및 위에서 언급한 DUSA, 호흡 시뮬레이터 또는 피험자를 사용함으로써 결정되었다. 백신이 없는 경우, 입에 위치하는 필터로부터 회수된 살부타몰의 평균량은 DUSA 및 호흡 시뮬레이터에서 각각 41.8% 및 44.7%였다(표 3). 8명의 피험자로부터는 평균 64%였으며(표 3a), 남녀간 방출되는 약의 용량 비율에서는 유의미한 차이가 관찰되지는 않았다(도 9). 살부타몰 위에 백신을 추가하였을 때 방출되는 약의 용량은 DUSA 및 호흡 시뮬레이터에서 각각 54.50% 및 48.8%였다(표 3b). 따라서, 우리는 사람의 입에서 사용할 수 있는 백신 에어로졸의 방출되는 약의 용량이 네뷸라이저에 적재된 것의 -50%임을 확인하였다.
표 3: 에어로젠 솔로의 살부타몰 황산염(3a) 또는 백신을 포함하는 살부타몰 황산염(3b)의 '비움(Empty)'까지의 분무 시간 및 방출되는 약의 용량.
표 3a: 에어로젠 솔로의 살부타몰 황산염의 분무 시간 & 방출되는 약의 용량 - 0.5ml에서 625μg
표 3b: 에어로젠 솔로의 백신을 포함하는 살부타몰 황산염의 분무 시간 & 방출되는 약의 용량 - 0.5ml에서 600 μg
p=0.551, 양측 P값, BS vs DUSA, 백신 없음; 2p=0.0142, 양측 P값, DUSA vs BS, 백신 있음; 3p=0.396, 양측 P값, BS 백신 없음 vs 백신 있음; 4p=0.0284, 양측 P값, DUSA 백신 없음 vs 백신 있음; 5p<0.001, 양측 P값, BS vs IV/EV, 백신 없음.
에어로졸 액적 크기 분포 - 에어로졸 액정의 공기역학적 입자 크기 분포(APSD)를 결정하기 위해, 우리는 15L/min의 일정한 보정 유량으로 작동하는 차세대 임팩터를 사용하였다. 먼저, 에어로젠 솔로 네뷸라이저로부터 생성된 살부타몰 황산염 에어로졸의 APSD를 대조군으로서 측정한 다음, 네뷸라이저의 살부타몰 황산염에 백신을 첨가하여 APSD를 측정하였다. 전반적으로, 입자 크기 통계는 백신이 첨가되거나 첨가되지 않은 살부타몰 에어로졸에 대해 동일하였으며(p>0.099, 표 4), 에어로젠 솔로 네뷸라이저에 의해 생성된 에어로졸의 크기 특성은 호흡 가능한 범위 내에 있음을 발견하였다. 에어로졸의 85% 호흡분율(respirable fraction,RF)에는 크기가 5.39μm 미만인 액적이 포함되어 있는 것으로 확인되었으며(표 4; 도 10), 이는 후두 아래에서의 높은 침적을 보장한다. 에어로졸의 나머지 15%는 구인두(입과 목)에 침적된 것으로 추정된다(표 4). 방출된 약의 용량(ED)에 (RF)%<5.39μm를 적용하면, 입에서 사용 가능한, 그리고 그 후 폐에 침적된, 에어로졸화 백신의 추정치는 42.5%(0.85 x 0.50 = 0.425)로 계산된다.
표 4. 차세대 임팩터(NGI)를 사용한 공기역학적 입자 크기 분포(APSD) 메트릭스.
MMAD(Mass Median Aerodynamic Diameter): 질량 중위 공기역학적 직경; GSD(Geometric Standard Deviation): 기하 표준편차. 살부타몰 황산염에 백신을 추가하였을 때 APSD 메트릭스(SS)와 APSD 메트릭스(SS+V) 사이의 NSD, p>0.099.
에어로졸 내 바이러스 입자의 생존 가능성 - 본 연구에서 사용된 에어로졸 솔로 바이브레이팅 메쉬 네뷸라이저(Aerogen Solo Vibrating Mesh nebulizer)는 고주파(22)로 진동하는 압전 오리피스 플레이트(piezoelectric orifice plate)가 있는 설계로 작동하기 때문에, 분무 과정은 바이러스 벡터 백신의 생존 가능성을 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 우리는 바이러스 플라크 형성 단위(PFU) 분석을 사용하여 버퍼에 수집된 에어로졸화된 백신 액적에서 바이러스 입자의 생존 가능성을 결정하고, 이를 분무 전 네뷸라이저 저장부 내의 샘플과 비교하였다. 분무 전에는, 적재된 액체 백신 샘플에 평균적으로 총 32.75 x 106 FPU가 존재하였으나, 수집된 에어로졸 샘플 모두에는 평균적으로 5.7 x 106 FPU가 존재하였다(도 11). 이는, 분무 후 바이러스 입자의 생존율이 약 18%임을 나타낸다.
결론 - 에어로졸 면역 접종은 비경구 경로에 비해 몇 가지 이점이 있다. 면역학적으로, 이는 병원체 특이적 조직 상재 적응 면역 반응(pathogen-specific tissue-resident adaptive immune responses)을 이끌어내는 우수한 능력 외에도 광범위한 호흡기 병원체에 대한 훈련된 선천 면역을 위해 기도대식세포의 장기적인 선천 면역 기억을 유도할 수 있다(16, 23). 우리의 연구는 흡입을 통해 사람에게 적용 가능한 에어로졸화된 AdHu5 벡터 백신을 생성하기 위해 에어로넵® 솔로 마이크로펌프 네뷸라이저를 사용하는 방법을 완전히 특성화하였다. 우리는 백신 충진량, 평상 호흡 시 전달 시간, 입으로 방출되는 약의 용량, 에어로졸 입자 크기, 및 백신 생존 가능성을 확립하였다. 이러한 기술적 매개변수는, 초기 적재된 백신 42%는 입에서 사용이 가능하고, (에어로졸 액적의 85%는 직경 5.39 미만이기에) 사람의 후두 아래의 호흡기도(respiratory airways)에 침적될 수 있으며, 에어로졸화된 백신의 약 20%가 생존 가능하거나 전염성이 있다는 연구 결과를 나타낸다. 따라서, 우리의 데이터는, 사람의 효과적인 호흡점막 면역화를 위해, 에어로졸 흡입을 통해 아데노바이러스 벡터 백신을 폐에 전달하기 위한 에어로넵® 솔로 분무 시스템의 적합성을 뒷받침한다.
전달 장치의 선택, 충진량 및 전달 시간, 방출되는 약의 용량, 입자 크기, 및 백신 생존 가능성을 고려하는 것은 인체 적용을 위한 에어로졸 백신 전달 전략을 개발할 때 중요하다. 이러한 고려 사항들은, 안정성, 백신 적재량, 생체활성(bioactive) 백신의 호흡기로의 효율적인 전달, 및 백신 투여자 간의 일관성을 좌우하기 때문에 임상 에어로졸 백신 개발에 매우 중요하다. 그러나, 이러한 기술적 매개변수는, 장치, 백신의 종류 및 제형, 표적 숙주에 따라 크게 달라질 수 있다. 이러한 이유로, 홍역 또는 MVA 백신을 평가하는 임상 연구의 정보나 AD 백신을 테스트하는 영장류(인간 제외)연구의 정보는, AD 백신을 사용한 인간에게 직접적으로 적용될 수 없다. 이와 관련하여, 우리의 연구는 위에서 언급한 잘 특성화된 기술적 매개변수에 따라 바이러스 기반 백신이 인간 호흡기에 전달된 최초 사례를 나타낸다.
요약하자면, 우리는 에어로졸 흡입을 통해 인간 호흡기에 재조합 AdHu5 벡터 백신을 효과적으로 전달하기 위한 상업적으로 이용가능한 단일 환자용 네뷸라이저 시스템에 사용될 중요한 기술적 매개변수 세트를 성공적으로 정의하였다. 이 기술은 현재 맥마스터 대학교(McMaster University)에서 진행 중인 페이즈 1b 에어로졸 TB 백신 시험에 사용되고 있다.

Claims (35)

  1. 바이러스 백신에 사용하기 위한 3가 전이유전자로서,
    i) 세포외 발현을 위해 표면당단백질을 앵커링하는 기능을 수행하는 막횡단 도메인에 결합한 바이러스 표면당단백질 및 신호펩티드를 포함하는 바이러스 표면당단백질 성분;ii) 바이러스 RNA와 관련되거나 복합체를 형성하는 바이러스 핵단백질 성분; 및
    iii) 바이러스 RNA 중합효소 성분;
    을 인코딩하는 3가 전이유전자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 막횡단 도메인은 바이러스 막횡단 도메인인 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 막횡단 도메인은 세포외소포체를 표적하는 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 막횡단 도메인은, CD63, CD9, CD81, CD82, LAMP2B, CdaA, VSVG, 후닌 바이러스 당단백질, 라싸열 바이러스 당단백질, LCMV 당단백질, SARS-CoV-2 당단백질, 타미아미(Tamiami) 바이러스 당단백질, 구아나리토(Guanarito) 바이러스 당단백질, 마추포(Machupo) 바이러스 당단백질, 사비아(Sabia) 바이러스 당단백질, 및 파라나(Parana) 바이러스 당단백질을 포함하는 그룹에서 선택된 단백질로부터 유래한 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 표면당단백질 성분은 제1 바이러스로부터 유래하고, 상기 막횡단 도메인은 제2 바이러스로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 RNA 중합효소 성분은, 바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRp), 또는 그것의 보존부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 표면당단백질 성분은, 자가 절단 펩티드를 통해 RNA 중합효소 성분 및 상기 핵단백질 성분과 연결되는 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 펩티드는 2A 펩티드인 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 표면당단백질 성분, 상기 핵단백질 성분, 및 상기 RNA 중합효소 성분은 양성 단일가닥 RNA 바이러스로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 양성 단일가닥 RNA 바이러스는 코로나바이러스인 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 표면당단백질 성분은, 스파이크 단백질, 또는 그것의 면역원성 절편(fragment)을 포함하는 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 표면당단백질 성분은 상기 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵단백질 성분은, 코로나바이러스 핵단백질, 또는 그것의 면역원성 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 3가 전이유전자를 포함하는 백신.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 백신은, DNA 백신, mRNA 백신 또는 바이러스 벡터 백신인 것을 특징으로 하는 백신.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 백신은, 폭스바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 단순포진바이러스, 또는 거대세포바이러스의 바이러스 벡터를 포함하는 DNA 바이러스 벡터 백신인 것을 특징으로 하는 백신.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 백신은, 수포성구내염바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 센다이바이러스, 홍역-유래 백신, 뉴캐슬병바이러스, 알파바이러스, 또는 플라비바이러스의 바이러스 벡터를 포함하는 RNA 바이러스 벡터 백신인 것을 특징으로 하는 백신.
  18. E1/E3 결실 복제불능 아데노바이러스 벡터.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 복제불능 아데노바이러스 벡터는 전이유전자를 포함하며, 상기 전이유전자는 상기 E1/E3 결실 내에 삽입되는 것을 특징으로 하는 복제불능 아데노바이러스 벡터.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 전이유전자는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 3가 전이유전자인 것을 특징으로 하는 복제불능 아데노바이러스 벡터.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 서열 SEQ ID NO: 7을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제불능 아데노바이러스 벡터.
  22. 바이러스 감염에 대항하는 포유동물의 백신 접종 방법으로서,
    제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 백신 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 벡터로 상기 포유동물을 치료하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 네뷸라이저(nebulizer)와 결합된 아데노바이러스 벡터 백신을 포함하는 키트.
  24. 네뷸라이저와 결합된, 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 백신 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 벡터를 포함하는 키트.
  25. 바이러스 감염에 대항하는 포유동물의 백신 접종 방법으로서,
    네뷸라이저를 통해 아데노바이러스 벡터 백신을 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 백신은 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 전이유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 양성 단일 가닥 RNA 바이러스에 대항하는 효과적인 백신을 사용하기 위한 3가 전이유전자로서,
    i) 세포외 발현을 위해 표면당단백질을 소포체에 앵커링하는 기능을 수행하고 세포외소포체를 표적하는 막횡단 도메인에 결합한 바이러스 표면당단백질 및 신호펩티드를 포함하는 제1 바이러스 표면당단백질 성분; 및
    ii) 바이러스 RNA 및 바이러스 RNA 중합효소 성분과 관련되거나 복합체를 형성하는 바이러스 핵단백질 성분을 포함하는 제2 단백질;을 인코딩하되,
    상기 제1 당단백질 성분 및 상기 제2 단백질은 자가 절단 펩티드를 통해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는 3가 전이 유전자.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 RNA 바이러스는 코로나바이러스인 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 코로나바이러스는 SARS-CoV2인 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 표면당단백질 성분은 스파이크 당단백질의 상기 수용체 결합 도메인이고, 상기 막횡단 도메인은 이종(異種) 바이러스 막횡단 도메인인 것을 특징으로 하는 전이유전자.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 정의된 3가 전이유전자를 포함하는 백신.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 백신은, DNA 백신, mRNA 백신 또는 바이러스 벡터 백신인 것을 특징으로 하는 백신.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 백신은 DNA 바이러스 벡터 백신인 것을 특징으로 하는 백신.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 백신은 아데노바이러스 백신인 것을 특징으로 하는 백신.
  35. 바이러스 감염에 대항하는 포유동물의 백신 접종 방법으로서,
    제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 정의된 백신을 통해 상기 포유동물을 치료하는 것을 특징으로 하는 방법.
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