KR20240044353A - 핵산 응집체를 이용한 분자 연산 가속화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산 응집체를 이용한 분자 연산 가속화 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 클라이언트 결합부를 갖는 복수의 핵산 스캐폴드를 용액 상에서 상호 결합시켜 핵산 응집체를 제조하고 이 핵산 응집체 내에 분자 연산 요소들이 고농도로 존재하도록 함으로써 분자 연산 요소들 사이의 핵산 가닥 치환 반응이 보다 높은 확률로 일어날 수 있도록 설계된, 핵산 응집체를 이용한 분자 연산 가속화 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 응집체를 이용한 분자 연산 가속화 방법 {METHOD FOR ACCELERATING MOLECULAR COMPUTATION USING NUCLEIC ACID BASED SYNTHETIC CONDENSATES}
본 발명은 핵산 기반 분자 연산 가속화 방법에 관한 것이다.
DNA는 4종의 염기(A, T, C 및 G)를 서열화하여 생물의 유전 정보를 저장하는 생체 물질이다. 염기들은 Watson-Crick Pairing에 의해 결합되는 특성이 있어서 DNA 서열을 설계하여 특정 형상을 갖는 나노 구조체를 제조할 수 있다.
세포 내에서 생체 분자들의 상 분리 현상이 관찰된다. 세포는 상 분리를 통해 특정 생체 분자들을 응축하고 세포 반응을 촉진하는 물질을 형성시킨다. 세포 내 응집체에는 핵 소체, 핵 반점 및 세포질 스트레스 과립과 같이 막이 없는 소기관뿐만 아니라 전사, 시냅스 및 신호 클러스터와 같은 최근 설명된 구조체들도 포함된다. 이들 각 응집체는 주로 그 특정 조성을 조절하여 고유의 세포 기능을 수행한다.
DNA는 일종의 빌딩 블록이다. DNA는 분자간 상호작용의 열역학적 안정성과 특이성을 선형적인 서열에 정밀하게 정의할 수 있는 장점이 있다. DNA 가닥들을 자기 조립시켜 3차원 구조체를 제조할 수 있다. DNA 가닥 치환 반응(DNA strand displacement reaction)을 통해 분자 연산을 수행할 수 있다.
핵산 기반 분자 연산은 고도의 병렬성을 기반으로 동시에 여러 개의 연산을 수행할 수 있는 장점이 있으나 개별 연산 처리 속도가 느리다는 단점이 있다. 연산 속도가 늦으면 연산이 고도화될수록 전체 연산 회로의 성능을 제한하게 되어 문제가 된다. 따라서 핵산 분자 연산의 가속화 방법이 요구되고 있다.
한국 공개특허 제10-2022-0017409호
본 발명은 핵산 응집체(Nucleic Acid Condensate)를 이용한 분자 연산 가속화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 핵산 스캐폴드에 의해 유도된 상 분리 현상에 기반한 분자 연산 가속화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 분자 연산 요소들의 핵산 가닥 치환 반응이 핵산 응집체 내에서 일어나는 연산 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 복수의 핵산 스캐폴드를 용액 상에서 상호 결합시켜 핵산 응집체를 제조하는 단계; 및 분자 연산 요소들의 핵산 가닥 치환 반응이 핵산 응집체 내에서 일어나도록 하는 단계를 포함하는 분자 연산 가속화 방법.
2. 위 1에 있어서, 핵산 스캐폴드는 클라이언트 결합부를 포함하고, 분자 연산 요소들은 클라이언트 결합부의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 스캐폴드 결합부를 포함하는, 분자 연산 가속화 방법.
3. 위 1에 있어서, 용액은 핵산 응집체에 의해 핵산 스캐폴드의 조밀상(dense phase)과 핵산 스캐폴드의 희석상(dilute phase)으로 상 분리되는, 분자 연산 가속화 방법.
4. 위 1에 있어서, 분자 연산 요소들을 핵산 응집체 내로 유입시키는 단계를 더 포함하는, 분자 연산 가속화 방법.
5. 위 1에 있어서, 핵산 응집체는 핵산 스캐폴드의 점착 말단부(sticky end)의 적어도 일부가 상보적으로 결합되어 형성되는 것인, 분자 연산 가속화 방법.
6. 위 1에 있어서, 상보적으로 결합하는 핵산 가닥들을 용액에 넣고 교반하여 핵산 스캐폴드를 제조하는 단계를 더 포함하는, 분자 연산 가속화 방법.
7. 위 1에 있어서, 분자 연산 요소들은 입력 핵산 분자 및 리포터 핵산 분자인, 분자 연산 가속화 방법.
8. 위 1에 있어서, 분자 연산 요소들은 입력 핵산 분자, 게이트 핵산 분자 및 리포터 핵산 분자인, 분자 연산 가속화 방법.
9. 위 1에 있어서, 핵산 스캐폴드와 분자 연산 요소들의 결합력(ΔG)은 0.5 내지 30 Kcal/mol인, 분자 연산 가속화 방법.
10. 위 1에 있어서, 분자 연산 요소들의 핵산 가닥 치환 반응이 핵산 응집체의 외부에서 일어나도록 하는 단계를 더 포함하는, 분자 연산 가속화 방법.
11. 위 1에 있어서, 용액은 용매 및 염(salt)을 포함하는 것인, 분자 연산 가속화 방법.
12. 위 1에 있어서, 분자 연산 요소들이 핵산 응집체 내로 유인됨으로써 핵산 응집체에 의해 분자 연산 요소들의 농도 구배가 유도되는, 분자 연산 가속화 방법.
13. 위 1 내지 12 중 어느 하나의 분자 연산 가속화 방법을 사용하는 컴퓨팅 장치로서, 분자 연산 요소들을 입력받는 입력부; 분자 연산 요소들의 핵산 가닥 치환 반응에 의하여 연산을 수행하는 연산부; 및 연산부에서 수행된 연산 결과를 핵산 분자의 형태로서 출력하는 출력부를 포함하는 컴퓨팅 장치.
본 발명의 분자 연산 가속화 방법은 분자 연산 속도를 획기적으로 향상시킬 수 있다.
본 발명의 분자 연산 가속화 방법은 DNA 데이터 저장 기술과의 연계를 통해 DNA 병렬 컴퓨터 분야에 활용될 수 있다.
본 발명의 분자 연산 가속화 방법은 클라이언트가 고농도로 존재하는 핵산 응집체 내에서 클라이언트 매개된 핵산 가닥 치환 반응이 집중적으로 이루어질 수 있도록 한다.
본 발명의 분자 연산 가속화 방법은 클라이언트와 상보적으로 결합할 수 있는 다양한 물질들을 분자 연산 요소로 사용할 수 있다.
본 발명의 분자 연산 가속화 방법은 상 분리를 유도할 수 있는 다양한 구조의 핵산 스캐폴드를 활용할 수 있다.
본 발명의 분자 연산 가속화 방법은 핵산 스캐폴드와 클라이언트의 결합 강도를 조절함으로써 분자 연산 속도를 손쉽게 향상시킬 수 있다.
본 발명의 분자 연산 가속화 방법은 분자 연산 요소 및 클라이언트의 농도, 핵산 가닥 치환 반응 조건 등을 조정함으로써 분자 연산 속도를 손쉽게 향상시킬 수 있다.
도 1은 핵산 스캐폴드 제작 과정의 일 실시예이다.
도 2는 본 발명 실험에서 사용한 핵산 스캐폴드의 종류와 구성을 나타낸 모식도이다.
도 3은 Y-스캐폴드의 조립에 따른 Y-코어의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 분석에 관한 것이다.
도 4는 핵산 응집체의 프로그래밍 가능한 조직 및 기능을 나타낸 것이다.
도 5는 핵산 스캐폴드의 상 분리 거동에 관한 것이다. (A) 여러 온도에서 5 μM 핵산 스캐폴드 용액의 형광 이미지, (B) 핵산 스캐폴드의 농도 변화와 그에 상응하는 핵산 스캐폴드 용액의 형광 이미지, (C) (상단) 서로 다른 온도에서 스캐폴드 응집체에 대한 FRAP 실험의 예시 이미지, (하단) 스캐폴드에 대한 형광 회복 곡선(오차 막대는 표준편차를 뜻함, N=4). (D) (왼쪽) 서로 다른 NaCl 농도에서 스캐폴드 용액의 형광 이미지, (오른쪽) 다른 염 농도에서 스캐폴드의 상 분리 다이어그램(N=3). (E) 다른 염 농도에서 응집체 내 스캐폴드의 형광 회복 곡선(N=3), (F) (상단) 200 mM NaCl 조건 하에서 응집체 융합의 형광 이미지, (하단) 융합 응집체 종횡비의 시간에 따른 변화 그래프, (G) 200 mM NaCl 조건 하에서 핵산 응집체에 대한 모양 이완 시간 대 길이 척도 스케일 바, 50 μm(B), 20 μm(A, C, D), 10 μm(F).
도 6은 형광 강도와 핵산 스캐폴드의 농도 사이의 보정에 관한 것이다.
도 7은 스캐폴드의 상 경계가 다양한 스캐폴드 농도에 대해 유사하게 유지되는 것을 나타낸 것이다.
도 8은 스캐폴드의 상 경계 정량화에 대한 염료 라벨링의 효과에 관한 것이다(N=5).
도 9는 다른 NaCl 농도에서 점착 말단 사이의 추산된 결합 확률에 관한 것이다.
도 10은 다양한 NaCl 농도에서 시간에 따른 응집체 융합의 형광 이미지이다. 스케일 바는 20μm이다.
도 11은 핵산 응집체의 응축 및 용해 제어에 관한 것이다. (A) 스캐폴드의 동적 응축 및 용해의 개략도, (B) 어셈블러의 농도가 다른 동적 응축 실험의 시간 경과 이미지, (C) (B)에서 어셈블러 채널 이미지의 표준 편차의 시간적 변화 그래프, (D) 용해제 농도가 서로 다를 때의 응집체 용해 측면도의 시간 경과 이미지, (E) 응집체의 유효 반경 및 응집체 부피(inset)의 시간적 변화, (F) 서로 다른 농도의 스캐폴드 및 용해제로 측정된 유효 응집체 반경의 시간적 변화. (G) 다양한 농도의 스캐폴드 및 용해제로 얻은 응집체 용해 속도이다. 스케일 바는 20 μm(B), 5 μm(D)이다.
도 12는 Y-스캐폴드의 응집에 필요한 어셈블러 개수에 관한 것이다. 스케일 바는 10 μm이다.
도 13은 고농도의 용해제를 사용하여 응집체 용해 과정을 시간 경과에 따라 3D로 재구성한 것이다.
도 14는 순간 응집체 용해율 대 응집체 유효 반경 에 관한 것이다(N=5).
도 15는 핵산 응집체로의 용해제 상호 침투의 특성에 관한 것이다. (A) (상단) 용액에 용해제를 첨가한 후 응집체의 형광 이미지, 스케일 바는 10 μm이다. (하단) 스캐폴드 및 용해제 채널의 형광 밝기 프로파일은 이미지의 흰색 점선 화살표를 따라 얻었다. (B) 응집체 및 희석 상 용해제의 정규화된 형광 강도이다. 두 용해제 신호는 희석 상의 최대값으로 정규화되었다(N=15).
도 16은 용해제 매개 핵산 가닥 치환 반응의 반응속도에 관한 것이다. (A) 역학 특성화에 사용되는 구성의 개략도, (B) 용해제의 농도가 다른 샘플의 정규화된 형광 강도를 나타낸다.
도 17은 응집체 용해 중 점착 말단 손실의 역학적 모니터링에 관한 것이다. (A) 용해 과정 중 응집체의 형광 이미지, (B) 스캐폴드 및 용해제의 다른 농도에서 측정된 희석상 및 응집체의 형광 강도의 시간적 변화이다(N=6).
도 18은 응집체 용해율과 희석 상 스캐폴드를 포함하는 점착 말단 감소 사이의 상관관계에 관한 것이다.
도 19는 선택적 파티셔닝을 통한 DNA 응집체의 클라이언트 조성 제어에 관한 것이다. (A) 클라이언트 결합부 매개 조성 제어의 개략도, (B) 클라이언트 투입 전후 시간 경과에 따른 스캐폴드 응집체의 파티셔닝 이미지, (C) (B)에서 응집체 내 클라이언트의 형광 강도의 시간적 변화, (D) 클라이언트를 투입 10분 후 응집체의 각 성분의 형광 강도, (E) 스캐폴드와 클라이언트 간 결합 세기에 따른 스캐폴드 및 클라이언트의 형광 세기 변화 이미지이다. (F) 측정된 클라이언트 분배 계수는 DINAMelt에서 계산된 클라이언트의 혼성화 자유 에너지 변화에 대해 표시되었다(N=30). (G) 평형 결합 모델의 개념도, (H) 스캐폴드에 대한 결합 부위가 다른 클라이언트의 FRAP 복구 곡선(N=3), (I) 두 가지 다른 유형의 파티셔닝 방법의 개략도인데, 위는 클라이언트 결합부를 매개로 한 파티셔닝에 대한 개략도이며, 아래는 점착부를 매개로 한 파티셔닝에 대한 개략도이다. (J) (I)에 표시된 두 개의 서로 다른 유형의 클라이언트 파티셔닝 방법에 따른 응집체의 시간 경과 이미지이다. 스케일 바는 50 μm(E), 20 μm(B 및 J)이다.
도 20은 단일 가닥 DNA 클라이언트의 파티셔닝에 관한 것이다. (A) 혼성화의 자유 에너지 변화에 따른 다양한 ssDNA 클라이언트의 분배 계수 (N=30), (B) 스캐폴드에 대한 결합 강도가 다른 단일 가닥 클라이언트의 FRAP 복구 곡선(N=3)이다.
도 21은 스캐폴드 포화 농도의 클라이언트 매개 조절에 관한 것이다.
도 22는 응집체 매개 가닥 치환 반응의 정량 분석에 관한 것이다. (A) 이 그림에 사용된 이중 캐스케이드 DNA 가닥 치환 반응의 개략도, (B) (왼쪽) 플레이트 판독기로 측정한 다른 입력 또는 스캐폴드를 사용하여 (A)에 표시된 반응의 역학, 'T'와 'F'는 각각 참과 거짓 시퀀스를 나타냈다. (C) 응집체 매개 가닥 치환 반응의 형광 이미지, (D) (C)의 반복 실험 이미징 데이터에서 얻은 희석(dilute phase) 및 응집 상(dense phase)에서의 반응 역학 비교(샘플 당 3개의 ROI, 3개의 독립적으로 준비된 샘플), (E) 스캐폴드가 없는 조건(no scaffold)과 스캐폴드가 있는 조건 중 희석 상(dilute phase)에서의 가닥 치환 반응의 역학 비교, (F) 응집체 매개 가닥 치환 반응의 결과가 연산 구성 요소들의 농도 배분에 의한 것인지 조사하기 위한 실험의 개략도, (G) 표시된 클라이언트 농도에서 (F)에서 설계된 실험 결과(N=3), (H) 클라이언트-스캐폴드 쌍이 서로 다른 결합 강도를 가지는 상황에서의 시간에 따른 형광 세기 변화 그래프(N=3), (I) 서로 다른 결합 강도의 스캐폴드-클라이언트 쌍으로 수행된 응집체 매개 반응의 시간 경과 이미지이다. 스케일 바는 20 μm(C 및 I)이다.
도 23은 스캐폴드가 없는 조건에서 연산 요소들의 농도가 변화함에 따른 이중 캐스케이드 DNA 가닥 치환 반응 속도에 관한 것이다. 멀티플레이트 리더기(A) 및 공초점 현미경(B)으로 측정한 이중 캐스케이드 DNA 치환 반응의 형광 출력이다.
도 24는 응집체 매개 이중 캐스케이드 DNA 가닥 치환 반응에 대한 대조 실험에 관한 것이다. (CICT) 올바른 입력 및 올바른 클라이언트 결합부, (CIFT) 올바른 입력 및 잘못된 클라이언트 결합부, (FICT) 잘못된 투입(input) 및 올바른 클라이언트 결합부이다.
도 25는 반응 구성 요소들의 스캐폴드 결합 영역의 길이 또는 서열을 변경해도 스캐폴드가 없을 때 반응 속도에 최소한의 영향을 미치는 것에 관한 것이다(N=3).
도 26은 다양한 형태의 스캐폴드에서의 응집체 형성을 관찰한 공초점 현미경 형광 이미지이다. (A) 점착 말단부 개수가 서로 다른 스캐폴드 응집체의 공초점 형광 현미경 이미지. (B) 타쿠미 DNA 응집체의 공초점 형광 현미경 이미지. (C) 스캐폴드 + 링커 DNA 응집체의 공초점 형광 현미경 이미지. 모든 스캐폴드의 농도는 3 μM이다.
도 27은 다양한 형태의 스캐폴드에서의 이중 캐스케이드 DNA 가닥 치환 반응의 가속 효과를 멀티 플레이트 리더기로 측정한 결과를 나타낸 것이다. (A) 점착 말단부 개수가 서로 다른 스캐폴드 응집체의 연산 반응 형광 측정 결과이다. 스캐폴드의 농도는 1.5 μM이며, 각 연산 요소들의 농도는 100 nM이다. (B) 타쿠미 DNA 응집체의 연산 반응 형광 측정 결과이다. 스캐폴드의 농도는 3 μM이며, 각 연산 요소들의 농도는 100 nM이다. (C) 스캐폴드 + 링커 DNA 응집체의 연산 반응 형광 측정 결과이다. 스캐폴드 및 링커의 농도는 1.5 μM이며, 각 연산 요소들의 농도는 100 nM이다.
도 28은 DNA 구조체와 연산 요소 간 결합 세기 변화에 따른 이중 캐스케이드 DNA 가닥 치환의 가속 효과 변화를 나타낸 것이다. (A) 타쿠미 DNA 구조체와 연산 요소 간 결합 세기 조정에 따른 이중 캐스케이드 DNA 치환 반응의 형광 측정 결과 변화를 나타낸 것이다. 멀티 플레이트 리더기를 이용해 측정하였으며 타쿠미 DNA의 농도는 3 μM, 각 연산 요소들의 농도는 100 nM이다. (B) 스캐폴드 + 링커 DNA 구조체와 연산 요소 간 결합 세기 조정에 따른 이중 캐스케이드 DNA 치환 반응의 형광 측정 결과 변화를 나타낸 것이다. 멀티 플레이트 리더기를 이용해 측정하였으며 스캐폴드와 링커 DNA의 농도는 각 1.5 μM, 각 연산 요소들의 농도는 100 nM이다.
도 29는 핵산 응집체 매개 분자 연산에 관한 것이다. (A) 다른 입력에 대한 이중 OR 게이트 및 진리표의 개략도, (B) 스캐폴드가 없는 상황에서 서로 다른 입력에 대한 이중 OR 게이트의 형광 역학 데이터, (C) 응집체의 존재 하에서 서로 다른 입력에 대한 이중 OR 게이트의 형광 역학 데이터, (D) (B) 및 (C)의 각 논리 게이트 작업에 대한 완료까지의 반감기 비교, (E) 역학적 게이팅(kinetic gating) 메커니즘의 개략도, (F 내지 H) (H)에 명시된 4가지 다른 조건에 대한 역학적 게이팅의 형광 역학 데이터(N=3)이다.
도 30은 도 29E 내지 26H에 사용된 병렬 반응 캐스케이드에 관한 것이다. 역학 게이팅 실험에 사용된 3개의 병렬 반응 캐스케이드의 개략도이다.
도 31은 2개의 비혼화성(immiscible) 스캐폴드 응집체에서 병렬 이중 캐스케이드 반응에 관한 것이다. (A) 비혼화성 스캐폴드 응집체에서 병렬 이중 캐스케이드 반응에 대한 데모의 개략도, (B) (A)에 표시된 병렬 반응의 시간 경과 이미지로서 (상단) 스캐폴드 채널, (하단) 리포터(reporter) 채널이고, (C) 다른 시점에서 (B)의 응집체에 걸친 두 리포터의 분배 계수의 라인 프로파일이다. 스케일 바는 20 μm(B)이다.
본 발명은 핵산 응집체를 이용한 분자 연산 가속화 방법을 제공한다.
본 발명에서 정의하는 핵산 응집체란 핵산 구조체 간 자가 결합을 통해 3차원 부피 확장을 이룬 집합체를 의미한다.
본 발명의 분자 연산 가속화 방법은 클라이언트 결합부를 갖는 복수의 핵산 스캐폴드를 용액 상에서 상호 결합시켜 핵산 응집체를 제조하고 이 핵산 응집체 내에 분자 연산 요소들이 고농도로 존재하도록 함으로써 분자 연산 요소들 사이의 핵산 가닥 치환 반응이 보다 높은 확률로 일어날 수 있도록 설계된 것이다.
본 발명은 복수의 핵산 스캐폴드를 용액 상에서 상호 결합시켜 핵산 응집체를 제조하는 단계; 및 분자 연산 요소들의 핵산 가닥 치환 반응이 핵산 응집체 내에서 일어나도록 하는 단계를 포함하는 분자 연산 가속화 방법을 제공한다.
이하 본 발명의 분자 연산 가속화 방법의 각 단계를 상세히 설명한다.
(S1) 핵산 스캐폴드의 제조
핵산 스캐폴드는 DNA, RNA 등의 핵산으로 이루어진 3차원 구조체를 의미한다. 핵산 스캐폴드는 용액 상에서 상호 결합되어 핵산 응집체를 형성하되, 특정 클라이언트 결합부위를 포함하면 되고 특정 구조를 갖는 것으로 한정되지 않는다.
따라서 핵산 스캐폴드의 구조는 다양할 수 있다.
예컨대 핵산 스캐폴드는 단일 가닥의 핵산으로 이루어지고, 클라이언트 결합부, 코어 결합부 및 점착 말단부를 갖는 어셈블러; 및 서로 다른 3종 이상의 핵산이 상보적으로 결합되어 형성되고, 이중 가닥의 핵산으로 이루어진 스템부 및 단일 가닥의 핵산으로 이루어진 어셈블러 결합부를 갖는 코어;를 포함하고, 어셈블러는 코어 결합부의 단일 가닥의 핵산과 어셈블러 결합부의 단일 가닥의 핵산의 상보적 결합에 의해 코어에 결합되는 스캐폴드일 수 있다.
또 타쿠미 DNA의 형태와 같이 단일 가닥의 핵산으로 이루어지고, 클라이언트 결합부, 1형 점착 말단부, 코어 및 2형 점착 말단부를 갖는 어셈블러; 및 1형 점착 말단부, 코어 및 2형 점착 말단부를 갖는 어셈블러;를 포함하는 총 2종의 핵산이 코어 부위끼리 상보적으로 결합되어 형성되는 스캐폴드일 수 있다.
또한 스캐폴드 + 링커 DNA의 형태와 같이 Y자 형태의 스캐폴드 및 스캐폴드 간 결합을 매개하는 링커 DNA를 혼합한 형태일 수 있다. 이 때 링커 DNA는 단일 가닥의 핵산으로 이루어지고 스캐폴드 결합부과 링커 코어를 갖는 링커 상단 가닥; 및 스캐폴드 결합부과 링커 코어를 갖는 링커 하단 가닥을 포함하는 총 2종의 핵산이 코어 부위끼리 상보적으로 결합되어 형성된다.
핵산 스캐폴드(100)는 어셈블러(10)와 코어(20)가 결합되어 형성될 수 있다(도 1). 어셈블러(10)는 5’에서 3’방향으로 클라이언트 결합부(11), 코어 결합부(12) 및 점착 말단부(13)의 순으로 배열된 단일 가닥의 핵산이다. 어셈블러(10)는 1종 또는 2종 이상의 단일 가닥의 핵산일 수 있는데 도 1에서는 코어 결합부(12)가 상이한 3종의 어셈블러(10)를 도시한다.
2종 이상의 어셈블러는 필요에 따라 각 클라이언트 결합부가 서로 상이한 서열로 구성될 수 있다. 2종 이상의 어셈블러는 필요에 따라 각 점착 말단부가 자기 조립이 가능한 서로 상이한 서열로 구성될 수 있다.
클라이언트 결합부는 클라이언트(분자 연산 요소 포함)와 결합한다. 분자 연산 요소는 핵산 가닥 치환 반응을 수행할 수 있는 핵산 서열이다. 분자 연산 요소는 클라이언트 결합부의 적어도 일부와 상보적으로 결합한다.
클라이언트 결합부의 개수, 염기 서열 길이나 G/C 염기의 비율이 증가하면 클라이언트(분자 연산 요소 포함)와의 결합력이 증가될 수 있다.
코어 결합부는 어셈블러 중 코어와 결합하는 부분이다. 코어 결합부는 어셈블러와 적어도 일부가 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 갖는다.
코어 결합부가 후술하는 어셈블러 결합부에 상보적으로 결합됨으로써 어셈블러는 클라이언트 결합부가 코어의 내부로, 점착 말단부가 코어의 외부로 향하도록 코어에 결합된다.
코어 결합부는 복수의 어셈블러가 스캐폴드에 포함되는 경우 서로 동일 또는 상이한 서열을 가질 수 있다. 코어 결합부의 서열을 조절하여 어셈블러의 결합 위치(예컨대 코어의 어떤 암(arm)에 결합시킬 것인지)를 정할 수 있다.
점착 말단부는 스캐폴드-스캐폴드 상호 작용에 관여한다.
스캐폴드의 점착 말단부는 다른 스캐폴드의 점착 말단부와 상보적으로 결합함으로써 스캐폴드가 자기 조립된 핵산 응집체를 형성한다.
점착 말단부의 염기의 길이와 G/C 비율에 따라 스캐폴드 간의 결합력을 조절할 수 있다. 예컨대 점착 말단부의 염기 길이가 길게 하거나 G/C의 비율을 높여서 스캐폴드 간의 결합력을 키울 수 있다.
코어는 이중 가닥의 핵산으로 이루어진 스템부 및 단일 가닥의 핵산으로 이루어진 어셈블러 결합부를 가질 수 있다.
코어는 서로 다른 3종 이상의 핵산이 상보적으로 결합되어 형성된다. 예컨대 코어는 서로 다른 3종, 4종, 5종 또는 6종의 핵산이 상보적으로 결합되어 형성될 수 있다.
도 2와 같이 서로 다른 3종의 핵산이 상보적으로 결합되어 형성되면 3-암(arm) 구조의 코어가 형성되고, 서로 다른 4종의 핵산이 상보적으로 결합되어 형성되면 4-암(arm) 구조의 코어가 형성되며, 서로 다른 5종의 핵산이 상보적으로 결합되어 형성되면 5-암(arm) 구조의 코어가 형성되며, 서로 다른 6종의 핵산이 상보적으로 결합되어 형성되면 6-암(arm) 구조의 코어가 형성된다.
코어 중 이중 가닥으로 이루어진 부분이 스템부이고 단일 가닥으로 이루어진 부분이 어셈블러 결합부이다.
예컨대 도 1과 같이 코어(20)는 5’말단부 쪽에 형성된 단일 가닥의 어셈블러 결합부(22)와 골격을 형성하는 이중 가닥의 스템부(21)를 구비하며 스템부의 중심에 상보적으로 결합되지 않는 중심부(23)를 갖는다.
예컨대 스템부의 중심에 상보적으로 결합되지 않는 중심부는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 2개의 핵산일 수 있다.
예컨대 코어는 다음 S1 내지 S3의 3종의 핵산이 상보적으로 결합되어 형성될 수 있다: S1: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 1)-(N)n-(스템 서열 2)-3’, S2: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 3)-(N)n-(스템 서열 1에 상보적인 서열)-3’ 및 S3: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 2에 상보적인 서열)-(N)n-(스템 서열 3에 상보적인 서열)-3’(식 중, N은 A, T, G 또는 C이고 n은 1 내지 10의 자연수임).
또한 예컨대 코어는 다음 X1 내지 X4의 4종의 핵산이 상보적으로 결합되어 형성될 수 있다: X1: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 4)-(N)n-(스템 서열 5)-3’, X2: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 6)-(N)n-(스템 서열 4에 상보적인 서열)-3’, X3: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 7)-(N)n-(스템 서열 6에 상보적인 서열)-3’ 및 X4: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 5에 상보적인 서열)-(N)n-(상기 스템 서열 7에 상보적인 서열)-3’(식 중, N은 A, T, G 또는 C이고 n은 1 내지 10의 자연수임).
또한 예컨대 코어는 다음 Y1 내지 Y5의 5종의 핵산이 상보적으로 결합되어 형성될 수 있다: Y1: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 8)-(N)n-(스템 서열 9)-3’, Y2: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 10)-(N)n-(스템 서열 8에 상보적인 서열)-3’, Y3: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 11)-(N)n-(스템 서열 10에 상보적인 서열)-3’, Y4: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 12)-(N)n-(스템 서열 11에 상보적인 서열)-3’ 및 Y5: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 9에 상보적인 서열)-(N)n-(스템 서열 12에 상보적인 서열)-3’(식 중, N은 A, T, G 또는 C이고 n은 1 내지 10의 자연수임).
또한 예컨대 코어는 다음 Z1 내지 Z6의 6종의 핵산이 상보적으로 결합되어 형성될 수 있다: Z1: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 13)-(N)n-(스템 서열 14)-3’, Z2: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 15)-(N)n-(스템 서열 13에 상보적인 서열)-3’, Z3: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 16)-(N)n-(스템 서열 15에 상보적인 서열)-3’, Z4: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 17)-(N)n-(스템 서열 16에 상보적인 서열)-3’, Z5: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 18에 상보적인 서열)-(N)n-(스템 서열 17에 상보적인 서열)-3’ 및 Z6: 5’-(어셈블러 결합부 서열)-(스템 서열 14에 상보적인 서열)-(N)n-(스템 서열 18에 상보적인 서열)-3’(식 중, N은 A, T, G 또는 C이고 n은 1 내지 10의 자연수임).
본 발명의 핵산 스캐폴드는 짧은 사슬의 핵산이다. 스캐폴드의 길이는 특정의 것으로 한정되지 않는다.
일 실시예에서 어셈블러는 12 내지 200개의 핵산이다. 어셈블러는 예컨대 12 내지 200개, 12 내지 180개, 12 내지 160개, 12 내지 140개, 12 내지 120개, 12 내지 100개, 12 내지 90개, 12 내지 80개, 12 내지 70개, 12 내지 60개, 12 내지 50개, 12 내지 40개 또는 12 내지 30개일 수 있다.
일 실시예에서 어셈블러 중 클라이언트 결합부는 4 내지 24개의 핵산이다. 클라이언트 결합부는 예컨대 4 내지 8개, 4 내지 10개, 4 내지 12개, 4 내지 14개, 6 내지 10개, 6 내지 12개 또는 6 내지 14개이다.
일 실시예에서 어셈블러 중 점착 말단부는 4 내지 24개의 핵산이다. 코어 결합부는 예컨대 4 내지 8개, 4 내지 10개, 4 내지 12개, 4 내지 14개, 6 내지 10개, 6 내지 12개 또는 6 내지 14개이다.
일 실시예에서 코어를 구성하는 서로 다른 3종 이상의 핵산은 각각 예컨대 30 내지 200개, 30 내지 180개, 30 내지 160개 또는 30 내지 140개, 30 내지 120개, 30 내지 100개, 30 내지 90개, 30 내지 80개, 30 내지 70개, 30 내지 60개, 30 내지 50개 또는 30 내지 40개의 핵산이다.
어셈블러의 코어 결합부가 코어의 어셈블러 결합부에 전체 또는 일부가 상보적으로 결합함으로써 본 발명의 핵산 스캐폴드가 형성될 수 있다.
(S2) 핵산 응집체의 제조
핵산 스캐폴드는 용액 상에서 상호 결합될 수 있다. 핵산 스캐폴드는 주변 환경의 온도나 염 변화, 클라이언트, 어셈블러 또는 코어의 농도 변화, 또는 핵산 스캐폴드를 구성하는 염기의 길이나 서열 변화 등으로 상호 결합 정도가 조절될 수 있다.
핵산 스캐폴드는 상호 결합되어 핵산 응집체를 형성할 수 있다. 핵산 스캐폴드의 상호 결합에 의해 용액은 상 분리(phase separation)된다. 본 발명에서 상 분리는 2개의 상이 완전히 또는 실질적으로 분리되어 존재하는 경우뿐만 아니라 2개의 상의 경계를 기준으로 핵산 스캐폴드의 농도 차이가 존재하는 경우를 포함한다.
상 분리된 용액 중 핵산 스캐폴드가 상대적으로 고농도로 존재하는 상을 조밀 상(dense phase)이라고 하고 핵산 스캐폴드가 상대적으로 저농도로 존재하는 상을 희석 상(dilute phase)이라고 한다. 일 실시예에서 핵산 응집체는 핵산 스캐폴드가 상 분리를 통해 조밀 상을 이룬 상태를 의미한다.
핵산 스캐폴드가 일정 농도로 포함된 용액은 핵산 스캐폴드의 농도, 온도, 염의 농도 등을 조절하여 조밀 상과 희석 상이 생기도록 할 수 있다. 제1스캐폴드, 제2 스캐폴드, … 및 제n 스캐폴드(n은 자연수)의 점착 말단부가 상보적으로 결합하여 핵산 응집체를 형성할 수 있다.
본 발명의 핵산 응집체는 특정 형태나 크기를 갖는 것을 의미하지 않는다. 핵산 응집체의 크기는 핵산 스캐폴드의 농도에 따라 예컨대 수백 나노미터부터 수백 마이크로미터까지 다양할 수 있다. 복수의 핵산 응집체는 서로 만나 더 큰 응집체를 형성할 수 있다.
핵산 응집체는 액적(droplet), 젤, 소규모 결합체 등의 형상일 수 있다.
핵산 응집체는 내부의 다수의 클라이언트 결합부를 통해 클라이언트(분자 연산 요소)를 포집하여 농축시킬 수 있다. 핵산 응집체는 상 분리 반응을 이용하여 포집 정도를 조절할 수 있다.
용액의 점탄성 등의 물성은 조밀 상과 희석 상의 비율에 따라 조절될 수 있다.
용매는 물, 알코올 등의 극성 용액일 수 있다. 용매에는 염 등이 포함될 수 있다. 예컨대 100 내지 500 mM의 NaCl이 포함될 수 있다.
핵산 응집체는 용액 내에서 자유롭게 이동 가능하며 유동성을 유지할 수 있다. 복수개의 핵산 응집체가 응집되어 더 큰 하나의 핵산 응집체를 이룰 수 있고 하나의 핵산 응집체가 복수개의 작은 핵산 응집체로 분할될 수 있다.
핵산 응집체는 클라이언트의 포집, 수송, 배치 또는 센싱 역할을 담당할 수 있다.
(S3) 분자 연산 요소의 첨가
분자 연산 요소는 분자 연산 반응을 수행하는 물질을 말한다. 분자 연산 요소는 핵산 내에 소정의 정보를 포함하고 있다.
분자 연산 요소는 DNA, RNA, PNA 등의 핵산을 포함한다. 분자 연산 요소는 단일 또는 이중 가닥의 핵산일 수 있다.
분자 연산 요소는 핵산 가닥 치환 반응을 수행하기 위한 서열이다. 분자 연산 요소는 스캐폴드 결합부에 의해 핵산 응집체 내에 고농도로 존재한다. 스캐폴드 결합부는 핵산 스캐폴드의 클라이언트 결합부의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 서열이다.
스캐폴드 결합부는 분자 연산 요소가 단일 가닥의 핵산인 경우 그 단일 가닥의 핵산의 일 말단에 결합될 수 있다. 또한 스캐폴드 결합부는 분자 연산 요소가 이중 가닥의 핵산인 경우 이중 가닥 중 어느 한 가닥의 말단에 결합될 수 있다.
일 실시예에서 클라이언트는 분자 연산 소요에 스캐폴드 결합부가 연결된 핵산 서열을 의미한다.
분자 연산 요소는 링커를 통해 클라이언트 결합부에 결합될 수도 있다. 링커는 예컨대 핵산; 또는 압타머, PNA 등 클라이언트 결합부에 결합할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 구조체일 수 있다.
핵산 응집체 내의 분자 연산 요소의 포집 농도는 조절될 수 있다. 분자 연산 요소의 포집 농도는 핵산 스캐폴드 내 클라이언트 결합부의 개수, 클라이언트 결합부의 염기 서열 길이, 클라이언트 결합부의 G/C 염기의 비율 등에 따라 조절될 수 있다.
예컨대 클라이언트 결합부의 개수가 많아지면 분자 연산 요소의 포집 농도가 높아질 수 있다. 예컨대 클라이언트 결합부에 상보적으로 결합하는 스캐폴드 결합부의 핵산의 길이가 길어지면 분자 연산 요소의 포집 농도가 높아질 수 있다. 예컨대 분자 연산 요소가 클라이언트 결합부와 결합될 때 G/C 염기의 비율이 높으면 분자 연산 요소의 포집 농도가 높아질 수 있다.
분자 연산 요소는 핵산 응집체 형성 후에 첨가될 수도 있고 용액 상에 존재하다가 핵산 응집체 형성 후 핵산 응집체 내부로 유입될 수도 있다.
(S4) 핵산 가닥 치환 반응
분자 연산 요소들은 결합력의 차이에 따라 핵산 가닥 치환 반응을 수행한다. 핵산 스캐폴드가 고농도로 존재하는 곳에는 클라이언트 결합부가 많이 존재하기 때문에 분자 연산 요소들의 밀도도 높다. 따라서 핵산 응집체 내에서는 분자 연산 요소들의 핵산 가닥 치환 반응 속도가 증가된다.
입력 핵산 분자는 연산을 개시할 수 있는 핵산 분자를 의미한다.
게이트 핵산 분자는 연산 논리 회로를 직접적으로 구성하는 핵산 분자를 의미한다.
리포터 핵산 분자는 출력 신호를 통해 연산의 종결을 확인할 수 있는 핵산 분자를 의미한다.
Fuel 핵산 분자는 직접적으로 논리 회로를 구성하지는 않지만, 연산의 촉매제로 작용할 수 있는 핵산 분자를 의미한다.
Threshold 핵산 분자는 특정 농도를 기준으로 그 이상 혹은 미만의 입력 신호만 후속 연산 과정으로 통과 혹은 차단시킴으로써 투입된 아날로그 신호를 디지털 신호로 변환시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다.
일 실시예에서 분자 연산 요소들은 입력 핵산 분자 및 리포터 핵산 분자일 수 있다. 예컨대 이중 가닥 중 한 가닥에 짧은 단일 가닥이 연장된 불완전한 형태의 이중 가닥 리포터 핵산 분자의 경우 리포터 핵산 분자의 길이가 긴 가닥과 완전히 상보적인 단일 가닥 핵산 분자 입력된다면 리포터 핵산 분자의 다른 가닥은 단일 가닥이 된다. 이와 같이 반응 전에 비해 반응 후 결합에 참여하는 염기쌍의 수가 늘어나기 때문에 일어나는 반응인데, 이런 반응을 핵산 가닥 치환 반응이라고 한다. 분자 연산 요소들은 이런 핵산 가닥 치환 반응을 통해 정보를 전달하고 연산을 수행한다.
일 실시예에서 분자 연산 요소들은 입력 핵산 분자, 게이트 핵산 분자 및 리포터 핵산 분자이다. 도 22A와 같이, 입력 핵산 분자가 게이트 핵산 분자의 t’-a-t’가닥에 상보적으로 결합하면 게이트 핵산 분자의 sb-a-t-b 가닥이 리포터 핵산 분자의 b’-t’가닥에 상보적으로 결합하게 된다. 리포터 핵산 분자의 말단에 형광 분자(F) 및 소광제(Q)를 달아 형광 신호 생성량을 측정하면 핵산 가닥 치환 반응을 확인할 수 있다.
일 실시예에서 분자 연산 요소들은 입력 핵산 분자, Threshold 핵산 분자, 게이트 핵산 분자, Fuel 핵산 분자 및 리포터 핵산 분자이다. 해당 실시예는 아날로그 입력을 디지털 연산으로 처리하기 위한 연산 방법이다.
입력 핵산 분자와 Threshold 핵산 분자 간 결합 에너지의 크기는 입력 핵산 분자와 게이트 핵산 분자 간 결합 에너지의 크기보다 커서 입력 핵산 분자와 Threshold 핵산 분자 간 반응 속도가 입력 핵산 분자와 게이트 핵산 분자 간 반응 속도보다 빠르다. 따라서 Threshold 핵산 분자를 특정 농도로 설정한다면 해당 농도 이상 혹은 미만의 입력 신호를 후속 연산 과정으로 통과 혹은 차단할 수 있다. 이를 Thresholding이라고 한다. 이후 Thresholding에서 통과된 입력 신호는 게이트 핵산 분자와 반응하고 이에 따라 게이트 핵산 분자 중 한 가닥(상단 가닥)이 떨어져 나가 리포터 핵산 분자와 반응함으로써 연산 결과를 측정할 수 있다. 반응이 진행됨에 따라 점점 더 높은 농도의 입력 핵산 분자가 게이트 핵산 분자의 나머지 한 가닥(하단 가닥)과 결합이 되므로 반응 진행 속도는 지체될 수밖에 없다. 이 때 Fuel 핵산 분자는 입력 핵산 분자를 게이트 핵산 분자의 하단 가닥으로부터 지속적으로 분리시킴으로써 반응의 촉매제로 작용할 수 있다.
본 발명의 핵산 응집체(예컨대 도 22C의 구 형상)는 그 내부에 클라이언트(분자 연산 요소)를 농축시킴으로써 클라이언트들 사이의 핵산 가닥 치환 반응에 의해 이루어지는 분자 연산을 가속화할 수 있다.
핵산 스캐폴드와 클라이언트(분자 연산 요소)는 핵산 응집체 내부에 더 많이 존재하지만 핵산 응집체 외부(예컨대 도 22C의 구 형상 바깥 부분)에도 존재할 수 있다. 핵산 응집체의 외부에 존재하는 핵산 스캐폴드에 의해 핵산 응집체 외부에서의 분자 연산이 가속화될 수 있다(예컨대 도 22E). 용액은 핵산 응집체에 의해 2개의 상이 존재하는데 핵산 응집체 외부에서 일어나는 분자 연산 가속화도 용액의 반응속도 관점에서 중요한 기여를 할 수 있다.
분자 연산 속도는 핵산 스캐폴드와 분자 연산 요소들 사이의 결합력(ΔG)을 조절하여 가속시킬 수 있다. 결합력은 상보적 결합에 참여하는 핵산의 개수, 결합에 참여하는 핵산들 중 구아닌(G) 및 시토신(C)의 비율 등을 달리하여 조절할 수 있다. 결합력을 조절하여 분자 연산 요소들이 핵산 스캐폴드의 클라이언트 결합부와 반복적으로 결합 및 분리되도록 할 수 있고 이에 따라 분자 연산 속도가 빨라질 수 있다.
결합력은 분자 연산 요소들의 반복적 결합 및 분리가 유도될 수 있다면 특정 범위의 것으로 한정되지 않는다. 예컨대 결합력은 0.5 Kcal/mol 이상, 1 Kcal/mol 이상, 1.5 Kcal/mol 이상, 2 Kcal/mol 이상, 2.5 Kcal/mol 이상, 3 Kcal/mol 이상, 3.5 Kcal/mol 이상, 4 Kcal/mol 이상, 4.5 Kcal/mol 이상, 5 Kcal/mol 이상, 5.5 Kcal/mol 이상, 6 Kcal/mol 이상, 6.5 Kcal/mol 이상, 7 Kcal/mol 이상, 7.5 Kcal/mol 이상, 8 Kcal/mol 이상, 8.5 Kcal/mol 이상, 9 Kcal/mol 이상, 9.5 Kcal/mol 이상 또는 10 Kcal/mol 이상일 수 있다.
또한 예컨대 결합력은 30 Kcal/mol 이하, 29.5 Kcal/mol 이하, 29 Kcal/mol 이하, 28.5 Kcal/mol 이하, 28 Kcal/mol 이하, 27.5 Kcal/mol 이하, 27 Kcal/mol 이하, 26.5 Kcal/mol 이하, 26 Kcal/mol 이하, 25.5 Kcal/mol 이하, 25 Kcal/mol 이하, 24.5 Kcal/mol 이하, 24 Kcal/mol 이하, 23.5 Kcal/mol 이하, 23 Kcal/mol 이하, 22.5 Kcal/mol 이하, 22 Kcal/mol 이하, 21.5 Kcal/mol 이하, 21 Kcal/mol 이하, 20.5 Kcal/mol 이하, 20 Kcal/mol 이하, 19.5 Kcal/mol 이하, 19 Kcal/mol 이하, 18.5 Kcal/mol 이하, 18 Kcal/mol 이하, 17.5 Kcal/mol 이하, 17 Kcal/mol 이하, 16.5 Kcal/mol 이하, 16 Kcal/mol 이하, 15.5 Kcal/mol 이하 또는 15 Kcal/mol 이하일 수 있다.
핵산 응집체는 핵산 가닥 치환 반응으로 이루어진 논리 게이트 연산을 가속화 할 수 있다. 핵산 응집체는 DNA 데이터 저장기술과의 연계를 통해 DNA 병렬 컴퓨터 분야에 적용이 가능하다.
핵산 응집체를 제어하여 캐스케이드 반응을 수행할 수 있다.
핵산 응집체를 제어하여 논리 게이트 연산을 수행할 수 있다.
본 발명의 분자 연산 가속화 방법은 컴퓨팅 장치에 의해 실행될 수 있다. 컴퓨팅 장치는 입력부, 연산부 및 출력부를 포함할 수 있다.
입력부에서는 분자 연산 요소들을 입력받는다. 분자 연산 요소들은 위에서 기설명한 입력 핵산 분자, 게이트 핵산 분자 및 리포터 핵산 분자를 포함한다. 입력부를 통하여 입력되는 분자 연산 요소들은 핵산 분자를 포함하는 용액 형태로 입력될 수 있다.
연산부는 입력 핵산 분자, 게이트 핵산 분자 및 리포터 핵산 분자와 같은 분자 연산 요소들의 핵산 가닥 치환 반응에 의하여 연산을 수행한다. 구체적인 연산 수행 방법은 위에서 기설명한 내용과 동일하므로 생략하기로 한다.
출력부는 연산부에서 수행된 연산 결과를 핵산 분자의 형태로서 출력한다.
이상 본 발명의 분자 연산 가속화 방법을 사용하는 컴퓨팅 장치에 대해서 간략하게 설명하였으나, 본 발명의 컴퓨팅 장치의 입력부를 통하여 소프트웨어인 명령 분자 세트(명령 DNA 세트)가 입력될 수 있고, 해당 명령 분자 세트가 본 발명의 컴퓨팅 장치의 연산부에서 분자 연산 요소들과의 핵산 가닥 치환 반응에 의하여 연산을 수행함으로써 다양한 논리 컴퓨팅 작업을 실행할 수 있다.
이하, 실시예로 본 발명을 보다 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
NUPACK 소프트웨어로 핵산 스캐폴드 제조를 위한 DNA 시퀀스를 설계했다. DNA 올리고뉴클레오티드는 Bionics and Bioneer Corporation에서 구입했다.
제조예 1: 핵산 스캐폴드 1의 제조
코어에 해당하는 서열번호 1 내지 3의 올리고뉴클레오티드와, 어셈블러에 해당하는 서열번호 4 내지 6의 올리고뉴클레오티드를 30℃에서 NaCl 농도가 350mM이 되도록 밀리포어 초순수에 용해시킨 후 혼합하고 볼텍싱했다. 혼합 용액은 열순환기(Eppendorf)로 95℃에서 5분간 가열하고 25℃까지 분당 1℃씩 냉각시켜 변성 및 어닐링하여 핵산 스캐폴드 1을 제조하였다.
제조예 2: 핵산 스캐폴드 2의 제조
코어에 해당하는 서열번호 7 내지 9의 올리고뉴클레오티드와, 어셈블러에 해당하는 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드를 30℃에서 NaCl 농도가 350mM이 되도록 밀리포어 초순수에 용해시킨 후 혼합하고 볼텍싱했다. 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드는 코어를 구성하는 각 올리고뉴클레오티드의 농도의 3배를 혼합하였다. 혼합 용액은 열순환기(Eppendorf)로 95℃에서 5분간 가열하고 25℃까지 분당 1℃씩 냉각시켜 변성 및 어닐링하여 핵산 스캐폴드 2를 제조하였다.
제조예 3: 핵산 스캐폴드 3의 제조
코어에 해당하는 서열번호 11 내지 13의 올리고뉴클레오티드와, 어셈블러에 해당하는 서열번호 14 내지 16의 올리고뉴클레오티드를 30℃에서 NaCl 농도가 350mM이 되도록 밀리포어 초순수에 용해시킨 후 혼합하고 볼텍싱했다. 혼합 용액은 열순환기(Eppendorf)로 95℃에서 5분간 가열하고 25℃까지 분당 1℃씩 냉각시켜 변성 및 어닐링하여 핵산 스캐폴드 3을 제조하였다.
제조예 4 내지 13: 핵산 스캐폴드 4 내지 13의 제조
표 1의 조합으로 핵산 스캐폴드 4 내지 13을 각각 제조하였다. ‘어셈블러 유사서열’인 서열번호 26 및 27의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드에서 클라이언트 결합부를 제외한 서열이다.
각 제조예의 서열을 넣고 30℃에서 NaCl 농도가 350mM이 되도록 밀리포어 초순수에 용해시킨 후 혼합하고 볼텍싱했다. 혼합 용액은 열순환기(Eppendorf)로 95℃에서 5분간 가열하고 25℃까지 분당 1℃씩 냉각시켜 변성 및 어닐링하여 핵산 스캐폴드 4 내지 13을 각각 제조하였다.
제조예 코어 어셈블러 어셈블러 유사서열
4 서열번호 1 내지 3 서열번호 17 서열번호 26 및 27
5 서열번호 1 내지 3 서열번호 18 서열번호 26 및 27
6 서열번호 1 내지 3 서열번호 19 서열번호 26 및 27
7 서열번호 1 내지 3 서열번호 20 서열번호 26 및 27
8 서열번호 1 내지 3 서열번호 6 서열번호 26 및 27
9 서열번호 1 내지 3 서열번호 21 서열번호 26 및 27
10 서열번호 1 내지 3 서열번호 22 서열번호 26 및 27
11 서열번호 1 내지 3 서열번호 23 서열번호 26 및 27
12 서열번호 1 내지 3 서열번호 24 서열번호 26 및 27
13 서열번호 1 내지 3 서열번호 25 서열번호 26 및 27
제조예 14 내지 16: 핵산 스캐폴드 14 내지 16의 제조
표 2의 조합으로 핵산 스캐폴드 14 내지 16을 각각 제조하였다.
각 제조예의 서열을 넣고 30℃에서 NaCl 농도가 350mM이 되도록 밀리포어 초순수에 용해시킨 후 혼합하고 볼텍싱했다. 혼합 용액은 열순환기(Eppendorf)로 95℃에서 5분간 가열하고 25℃까지 분당 1℃씩 냉각시켜 변성 및 어닐링하여 핵산 스캐폴드 14 내지 16을 각각 제조하였다.
제조예 코어 어셈블러
14 서열번호 135 내지 138 서열번호 139 내지 142
15 서열번호 143 내지 147 서열번호 148 내지 152
16 서열번호 153 내지 158 서열번호 159 내지 164
제조예 17 내지 20: 핵산 스캐폴드(타쿠미 DNA) 17 내지 20의 제조
표 3의 조합으로 핵산 스캐폴드 17 내지 20을 각각 제조하였다.
각 제조예의 서열을 넣고 30℃에서 NaCl 농도가 350mM이 되도록 밀리포어 초순수에 용해시킨 후 혼합하고 볼텍싱했다. 혼합 용액은 열순환기(Eppendorf)로 95℃에서 5분간 가열하고 25℃까지 분당 1℃씩 냉각시켜 변성 및 어닐링하여 핵산 스캐폴드 17 내지 20을 각각 제조하였다.
제조예 타쿠미 DNA
17 서열번호 165 및 169
18 서열번호 166 및 169
19 서열번호 167 및 169
20 서열번호 168 및 169
제조예 21 내지 24: 핵산 스캐폴드(링커 DNA) 21 내지 24의 제조
표 4의 조합으로 핵산 스캐폴드 21 내지 24를 각각 제조하였다.
각 제조예의 서열을 넣고 30℃에서 NaCl 농도가 350mM이 되도록 밀리포어 초순수에 용해시킨 후 혼합하고 볼텍싱했다. 혼합 용액은 열순환기(Eppendorf)로 95℃에서 5분간 가열하고 25℃까지 분당 1℃씩 냉각시켜 변성 및 어닐링하여 핵산 스캐폴드 21 내지 24을 각각 제조하였다.
제조예 코어 어셈블러 링커
21 서열번호 170 내지 172 서열번호 173, 174, 175 서열번호 179 및 180
22 서열번호 170 내지 172 서열번호 173, 174, 176 서열번호 179 및 180
23 서열번호 170 내지 172 서열번호 173, 174, 177 서열번호 179 및 180
24 서열번호 170 내지 172 서열번호 173, 174, 178 서열번호 179 및 180
비교제조예 1 : 클라이언트 결합부가 없는 스캐폴드 A의 제조
코어에 해당하는 서열번호 1 내지 3의 올리고뉴클레오티드와 서열번호 26 내지 28의 올리고뉴클레오티드를 30℃에서 NaCl 농도가 350mM이 되도록 밀리포어 초순수에 용해시킨 후 혼합하고 볼텍싱했다. 혼합 용액은 열순환기(Eppendorf)로 95℃에서 5분간 가열하고 25℃까지 분당 1℃씩 냉각시켜 변성 및 어닐링하여 스캐폴드 A를 제조하였다.
비교제조예 2 : 점착 말단부가 없는 스캐폴드 B의 제조
코어에 해당하는 서열번호 1 내지 3의 올리고뉴클레오티드와 서열번호 29 내지 31의 올리고뉴클레오티드를 30℃에서 NaCl 농도가 350mM이 되도록 밀리포어 초순수에 용해시킨 후 혼합하고 볼텍싱했다. 혼합 용액은 열순환기(Eppendorf)로 95℃에서 5분간 가열하고 25℃까지 분당 1℃씩 냉각시켜 변성 및 어닐링하여 스캐폴드 B를 제조하였다.
비교제조예 3: 어셈블러가 없는 스캐폴드 C의 제조
코어에 해당하는 서열번호 1 내지 3의 올리고뉴클레오티드를 30℃에서 NaCl 농도가 350mM이 되도록 밀리포어 초순수에 용해시킨 후 혼합하고 볼텍싱했다. 혼합 용액은 열순환기(Eppendorf)로 95℃에서 5분간 가열하고 25℃까지 분당 1℃씩 냉각시켜 변성 및 어닐링하여 스캐폴드 C를 제조하였다. 스캐폴드 C의 제조를 확인하기 위해 50μM NaCl이 포함된 20mM Tris HCl 완충액 사용한 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 분석 결과는 도 3과 같다.
1 mm 두께의 폴리아크릴아미드 겔은 6 mL 19:1 40% 아크릴아미드/비스 아크릴아미드 용액, 400 μL 50x 트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 완충액, 13.6μL 밀리포어 초순수, 120 μL 10 %(w/v) 과황산 암모늄 및 12 μL 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)을 혼합하여 제조되었다. 경화된 PAGE 겔을 1x TAE 버퍼로 채워진 Mini-Protean Tetra Cell(Biorad)에 장착했다. 모든 테스트 샘플은 겔 로딩 염료 퍼플(B7024S, New England BioLabs)과 혼합되었고, 각 샘플의 1 μL가 겔에 로딩되었다. 100 V에서 70분간 겔을 구동시킨 후 SYBR Gold 용액으로 10분간 염색하였다. 모든 PAGE 겔 이미지는 Gel Doc XR+ 겔 문서화 시스템(Bio-rad)에 의해 시각화되었다.
제조예 25 : 핵산 응집체 1의 제조
30 ℃ 및 NaCl 350 mM 조건에서 밀리포어 초순수 용액에 제조예 1의 스캐폴드 농도를 5 μM로 하여 핵산 응집체를 제조하였다(도 4A).
제조예 26 내지 28 : 핵산 응집체 2 내지 4의 제조
30 ℃ 및 NaCl 350 mM 조건에서 밀리포어 초순수 용액에 제조예 1의 스캐폴드 농도를 3 μM, 30μM, 50 μM로 하여 각각 핵산 응집체를 제조하였다(도 4B).
제조예 29 내지 31 : 핵산 응집체 5 내지 7의 제조
30 ℃ 및 NaCl 200 mM, 350 mM, 500 mM 조건에서 밀리포어 초순수 용액에 제조예 1의 스캐폴드 농도를 5 μM로 하여 각각 핵산 응집체를 제조하였다(도 4D 및 도 4E).
제조예 32 : 핵산 응집체 8의 제조
30 ℃ 및 NaCl 350 mM 조건에서 밀리포어 초순수 용액에 비교예 3의 Y-코어 10 μM와 어셈블러(서열번호 10) 30 μM로 혼합하여 핵산 응집체를 제조하였다(도 11B).
제조예 33 내지 38 : 핵산 응집체 9 내지 14의 제조
30 ℃ 및 NaCl 350 mM 조건에서 밀리포어 초순수 용액에 제조예 9, 14, 15, 16, 18 및 22의 스캐폴드 농도를 3μM로 하여 핵산 응집체를 제조하였다(도 26).
제조예 39 : 핵산 응집체 15의 제조
30 ℃ 및 NaCl 350 mM 조건에서 밀리포어 초순수 용액에 제조예 3의 스캐폴드 농도를 5μM로 하여 핵산 응집체를 제조하였다(도 31).
실시예 1 : 핵산 응집체의 제조 및 기능
핵산 응집체는 클라이언트를 포집할 수 있다(도 5A). 핵산 스캐폴드는 자기 조립 특성을 나타내는 상 분리를 위한 도구이다. 핵산 스캐폴드는 응집체 형성에 필요하며 스캐폴드 사이의 분자간 상호작용의 강도는 상 분리 과정을 조절하기 위한 생물학적 조절의 타겟이 된다.
클라이언트는 자체적으로 상 분리를 유도할 수 없지만 구성을 변경하여 응집체의 기능을 정의하는 데 기여할 수 있다. 클라이언트와 스캐폴드 간의 특정 분자 상호 작용은 클라이언트를 응집체로 파티셔닝한다.
DNA 가닥 간의 분자간 상호 작용 가능성을 활용하여 DNA 기반 스캐폴드와 클라이언트를 설계하였다(도 5B 및 도 5C). 스캐폴드는 자기 조립 및 클라이언트 결합의 속성을 가지고 있다. 자기 조립을 구현하기 위해 특성화된 Y형 스캐폴드(Y형 DNA 나노구조)를 만들었다.
Y-스캐폴드는 각 끝에 위치한 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 점착 회귀성 서열(sticky palindromic sequence)(5'-GAGCTC-3')이 있는 3개의 팔을 가지고 있다. 클라이언트 결합을 위해 Y-스캐폴드를 수정하여 각 이중가닥의 중간에 짧은 ssDNA 돌출부를 추가했다. 클라이언트를 위한 결합부 역할을 하는 것 외에도 이 시스템의 클라이언트 결합부는 응축 제어를 위한 핸들 역할도 한다. 특히, 클라이언트 결합부와 점착 말단부의 끝은 모두 어셈블러라고 하는 단일 올리고뉴클레오티드의 일부다(도 5B). 클라이언트 결합부 매개 DNA 가닥 치환 반응(toehold-mediated DNA strand displacement reaction)을 사용하여 Y-코어에서 어셈블러를 방출하여 응집체의 용해를 유도할 수 있다.
이 기능은 DNA 기반 합성 응집체의 응축 및 용해에 대한 신호 의존적 제어를 가능하게 한다. 위 시스템의 클라이언트는 Y-스캐폴드의 클라이언트 결합부에 상보적인 ssDNA 영역을 표시하는 모든 DNA 요소일 수 있다. 본 실험에서는 주로 최대 50개의 뉴클레오티드 길이의 ssDNA 또는 dsDNA를 클라이언트로 사용했다. DNA 기반 응집체의 설계에서 점착 말단부와 클라이언트 결합부의 서열을 독립적으로 선택할 수 있으므로 응집체의 상 분리 거동과 그 구성을 동시에 제어할 수 있다는 점이다.
실시예 2 : 핵산 응집체의 조정 가능한 상 분리 거동 및 재료 특성
제조예 1의 핵산 스캐폴드 1을 이용하여 핵산 스캐폴드의 상 분리 거동을 특성화하였다(도 4). 온도 제어 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 핵산 스캐폴드의 거동을 이미지화 하였다.
이하 실시예에서의 모든 이미징 실험은 4-레이저 유닛(405 nm, 488 nm, 561 nm 및 640 nm)이 있는 Nikon 공초점 A1 현미경을 사용하여 수행되었다. 고도의 온도 제어가 필요한 실험을 위해, Linkam PE100 스테이지 히터의 양면 접착 테이프로 커버글라스로 샌드위치된 유리 슬라이드로 만든 이미징 채널에서 샘플을 이미지화했다. 다른 모든 실험에서 샘플은 최대 40℃의 온도로 설정할 수 있는 현미경 스테이지 인큐베이터에 놓인 96웰 플레이트에서 관찰되었다. 모든 FRAP 실험은 Nikon A1 공초점 현미경의 ROI(관심 영역) 자극 기능을 사용하여 수행되었다. 비교를 위해 자극 ROI의 크기는 동일하게 설정되었다. 회복(recovery)기 동안 매1시간 동안 20초마다 도 4C 및 4E의 결과를 획득하였다. 도 19H 및 도 20B의 이미지는 10분 동안 10초마다 획득하였다. 회복 곡선을 얻기 위해 ROI 내의 형광 강도를 통합하고 표백 후 형광 강도로 정규화하였다. 회복 곡선을 2D 무한 모델에 맞춰 특유의 확산 시간 척도를 얻었다.
핵산 스캐폴드 1의 자기 조립은 점착 회귀성 서열의 일시적인 혼성화에 의해 매개되기 때문에 온도가 스캐폴드 간 응축 현상에 강하게 영향을 줄 것으로 예상하였다. 실제로 핵산 응집체의 형성은 온도에 크게 의존하였다. 60 ℃에서는 가시적인 구조가 존재하지 않지만 30℃에서는 주변 공간보다 훨씬 높은 스캐폴드 농도를 가진 마이크론 규모의 응집체가 관찰되었다(도 4A).
응집체 형성의 농도 의존성을 테스트하기 위해 다양한 스캐폴드 농도에서 스캐폴드 샘플을 이미지화하였다. 300 nM의 낮은 스캐폴드 농도에서는 가시적인 응집체가 관찰되지 않았다. 스캐폴드 농도가 증가함에 따라 응집체의 부피 분율이 점차 증가하였다(도 4B). 그러나 스캐폴드 농도가 증가하여도 희석 및 응축 상의 농도는 유사하게 유지되었다(도 6 및 도 7). 이것은 세포 내 응집체에서 스캐폴드로 작용하는 많은 단백질로 구성된 용액에서 널리 관찰되는 이원상 분리 거동과 일치한다. 스캐폴드 농도가 충분히 높은 경우 많은 양의 응축 상이 형성되며, 미세 원심분리 튜브의 바닥에 가라앉아 육안으로도 확인할 수 있었다(도 4B).
다음으로 광 표백 (FRAP) 분석 후 형광 회복을 사용하여 응집체의 재료 특성을 조사하였다(도 4C). 40 ℃에서 FRAP 실험은 상당한 회복을 보여주며, 이는 스캐폴드의 이동성 증가로 응집체가 액체와 같은 특성을 가짐을 나타낸다. 그러나 온도를 4 ℃로 낮추면 회복이 크게 억제되었다. 따라서 온도는 응집체의 물리적 특성을 조정하는 데 중요한 매개변수이며 온도를 낮추면 분자 역학이 감소된 겔 상태가 형성된다.
공존 영역 이상의 농도 범위에서, 유체와 같은 상태에서 고체와 같은 상태로의 전환은 침투 전환(percolation transition)을 통해 온도가 강하함에 따라 발생한다. 실제로 응집 상의 침투 전환를 수반하는 상 분리는 분자간 상호작용의 시간 척도가 응집 상의 점탄성 특성을 지배하는 결합 중합체의 일반적인 특성이다.
DNA 가닥 사이의 혼성화 강도도 염 농도에 매우 민감하기 때문에, 다양한 염 농도에서 스캐폴드의 상 분리 거동을 조사하였다. 그 결과, 스캐폴드의 위상 다이어그램, 즉 바이노달(binodal)이 염 농도의 변화에 의해 크게 영향을 받는다는 것을 발견했다(도 4D, 5μM 핵산 스캐폴드 사용). NaCl 농도가 증가하면 공존영역이 크게 확장되었다. Cy5 염료로 표지된 스캐폴드의 분율(fraction)을 변경해도 응축 상의 농도에 대한 측정값이 변경되지는 않았다(도 8). 이는 형광 표지가 위상 다이어그램 특성화에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 도 8에 따르면 350 mM의 NaCl 농도에서 응축 상의 스캐폴드 농도는 194 ± 30 μM, 즉 12.7 ± 2.0 mg/ml이었다. 참고로 시험관 내 단백질 응집체는 일반적으로 약 100 내지 400 mg/ml으로 훨씬 더 높은 농도를 나타내므로 저농도 특성은 본원의 핵산 스캐폴드의 고유한 특성이다.
핵산 스캐폴드 위상 다이어그램에서 관찰된 염 의존적 변화는 주로 핵산 스캐폴드의 점착 말단 사이의 결합 확률에 대한 염 농도의 영향에 기인할 수 있다. 예컨대 결합 확률 0.5에 도달하기 위해서, 즉 핵산 스캐폴드 사이의 결합에 관여하는 점착성 말단의 절반에 대한 조건 또는 평균 장에서 3가 입자의 침투에 대한 조건에 도달하기 위해 필요한 스캐폴드의 농도는 150 및 500 mM NaCl의 경우 각각 최대 230μM, 및 최대 80 μM으로 다양한 것으로 측정되었다(도 9). 온도 조절과 유사하게 염 농도의 변화도 응집체의 재료 특성에 큰 영향을 미친다는 것을 발견했다. FRAP 분석에서 형광 회복 속도는 염 농도가 증가함에 따라 점진적으로 느려지며(도 4E), 이는 각각 NaCl 200, 350 및 500 mM에 대해 D
Figure pat00003
0.013, 0.004 및 0.002 μm2/s의 겉보기 확산 계수로 해석된다. 스캐폴드의 감소된 분자 이동성은 핵산 응집체의 형태 이완 속도에 영향을 미친다. 서로 접촉할 때 표면 장력은 생체 분자 응집체 형태를 구형 형태로 다시 완화시킨다. 더 낮은 염 농도에서 핵산 응집체가 NaCl 200 mM에서 최대 0.36 분/μm의 역 모세관 속도와 함께 훨씬 더 빠른 형태 이완을 나타내는 것을 관찰했다(도 4F, 도 4G 및 도 10).
본 실험에서 핵산 스캐폴드의 상 분리 다이어그램을 측정하기 위해 다양한 NaCl 농도의 다양한 버퍼 조건에 대해 5 μM 핵산 스캐폴드 샘플을 준비하였다. 핵산 스캐폴드의 10%는 Cy5로 표지되었다. 희석 상 및 조밀 상의 형광 강도는 z-stack 이미지에서 측정되었다. 작은 크기의 물체와 관련된 형광 강도의 잠재적인 과소평가를 방지하기 위해 회절 제한 공초점 부피보다 몇 배 더 큰 핵산 응집체만 포함시켰다. 형광 강도를 핵산 스캐폴드의 농도로 변환하기 위해 핵산 스캐폴드 응축 없이 샘플을 사용하여 구경 측정 과정을 수행하였다.
이상과 같이 본원의 핵산 스캐폴드는 상 분리, 온도 및 염 농도와 같은 환경 매개변수로 조정할 수 있는 다양한 재료 특성을 나타냈다.
실시예 3 : 핵산 응집체의 응축 및 용해 제어
(1) 핵산 응집체의 융합 역학 측정방법
핵산 응집체의 융합 역학을 측정하기 위해 5 μM 스캐폴드 용액을 200 및 500 mM NaCl 완충액에 준비했다. 유리 바닥 96 웰 플레이트의 이미징 셀 표면은 2% 계면활성제(HFE 7500의 008-FluoroSurfactant, RAN Biotech)가 포함된 5 μL의 불소화 오일로 전처리된 후 다른 염도의 스캐폴드 용액 100 μL를 추가하였다. 응집체의 융합 역학은 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 15초마다 이미지화되었다. 각 이미지에 대해 응집체 종횡비(Aspect Ration; AR)를 다음 식을 맞추어 얻었다.
[수학식 1]
여기서 와 는 ImageJ를 사용하여 측정되었다. 형상 완화 시간 τ는 다음 식을 맞추어 얻었다.
[수학식 2]
기하평균은 다음 식으로 융합 응집체의 특징적인 길이 척도를 정의하였다.
[수학식 3]
τ대 의 플롯(plot)은 역 모세관 속도를 결정하기 위해 다음 식의 형식의 선에 맞춰졌다.
[수학식 4]
(2) 핵산 응집체의 용해 역학 측정방법
핵산 응집체의 부피는 3분마다 촬영한 z-stack 이미지에서 측정되었다. 각 z-슬라이스에 대해 형광 강도를 기준으로 임계값을 통해 응집체의 단면적을 측정했다. 응집체 부피를 계산하기 위해 식별된 모든 단면적의 합에 z-슬라이스 사이의 거리를 곱했다. 응집체의 유효 반경 은 부피 에서 구했다. 응집체 용해율은 용해 과정에서 유효 반경 데이터의 시간 자취에 대한 선형 기울기로부터 얻어졌다. 이 계산에서 각 응축 시간 추적에 대해 최소 8개의 데이터 값(24 분)이 사용되었다. 응집체 용해가 끝나갈 무렵 DNA 응집체와 이미징 챔버 표면의 접촉각이 90° 이하로 가까워지며 응집체와 이상적인 구체의 형태적 차이가 결과적으로 나타났다. 따라서 상기 체제에 진입한 후의 유효반경 데이터는 용해 속도 계산에서 제외하였다.
(3) 실험 결과
제조예 2의 핵산 스캐폴드를 사용하여 핵산 응집체의 응축 및 용해에 대한 제어 가능성을 실험했다(도 11A). 다가(multivalent)의 거대분자 간의 분자 연결성은 액체 응집체의 안정성에 영향을 미치는 핵심 매개변수이다. 코어 대비 점착 말단을 포함하는 어셈블러의 몰비가 응집체 형성에 중요하다는 것을 발견했다(도 12). 코어와 어셈블러의 등몰 혼합물의 경우 응축이 관찰되지 않은 반면, 3배 초과 어셈블러의 혼합물에서 강한 응축이 발생하였다. 2배 초과 어셈블러가 있는 샘플은 때때로 작은 점(tiny puncta)으로 보였다(도 12). 이것은 코어와 어셈블러 사이의 혼성화 평형 결과를 반영하여 소량의 3가 핵산 스캐폴드를 생성하였다. 핵산 응집체가 코어를 포함하는 샘플로 어셈블러를 흘려보내 동적으로 유도될 때 두 성분이 풍부한 DNA 응집체가 다시 화학량론 의존 방식으로 이미징 챔버의 바닥으로 점진적인 침전이 되는 것을 관찰하였다(도 11B).
응집체 형성을 위해 최소 3가를 요구하는데 각 스캐폴드에서 단 하나의 점착 말단을 제거하는 것이 다른 스캐폴드와 상호 작용하는 능력을 상당히 감소시키고 궁극적으로 응집체 용해로 이어질 수 있음을 시사하였다. 이 아이디어를 테스트하기 위해 시퀀스가 어셈블러와 완전히 상보적인 용해제 가닥이 있는 경우의 응집체 안정성을 조사하였다.
용해제(서열번호 33)는 핵산 스캐폴드의 클라이언트 결합부 영역에 결합한 다음 가닥 치환(branch migration)을 거쳐 결국 핵산 스캐폴드에서 어셈블러를 대체할 수 있도록 설계하였다. 실제로, 사전 조립된 핵산 응집체를 포함하는 챔버에 용해제를 추가하면 개별 응집체가 점진적으로 용해되었다(도 11D). 2.5 μM 용해제와 비교하여 응집체는 10 μM의 높은 용해제 농도에서 더 빨리 용해되었다. 20 μM의 용해제에서 응집체는 액포가 빈번히 형성되면서 15 분 이내에 완전히 용해되었다(도 13). 유사한 액포 형성 거동이 다른 생체 분자 액체에서도 관찰되었다. 특히, 인 응집체 부피 V로 정의되는 응집체의 유효 반경 가 시간이 지남에 따라 선형적으로 감소한다는 것을 관찰하였다(도 11E). 핵산 응집체의 용해율, 즉 응집체의 반경 변화율은 반경과 무관하며(도 14), 이 작업에 사용된 실험 조건에서 용해제 매개 응집체 용해가 표면적 제한 과정임을 나타낸다. 순간 응집체 용해율 는 인접 시점에서 응집체 반경 을 사용하여 계산하여 응집체 반경에 대해 표시했다.
응집체의 용해 메커니즘을 더 조사하기 위해 스캐폴드와 용해제의 농도를 체계적으로 변화시키면서 응집체의 용해 속도를 측정하였다(도 11F, 도 11G 및 도 14). 그 결과 다양한 스캐폴드 농도가 응집체 용해에 최소한의 영향을 나타내지만 용해제 농도가 용해 속도의 주요 결정 요인임을 발견하였다. 이는 스캐폴드의 스캐폴드가 풍부한 응집 상과 스캐폴드가 부족한 희석 상으로의 이원 상 분리에 기인할 수 있다. 용해제가 이 이원 상 시스템에 추가되면 용액에서 자유롭게 떠다니는 희석상의 스캐폴드에 빠르게 작용한다. 상호 침투 및 가닥 치환 반응 속도에 따라 응집-응축 상 내에 위치한 스캐폴드는 다양한 수준의 점착성 말단 손실을 경험할 것이다. 따라서 먼저 용해 반응 동안 DNA 응집체로 용해제의 상호 침투 속도를 특성화하였다. 용해제를 첨가한 직후(<1 분), 응집 상과 희석 상 사이에 용해제의 형광 강도 차이가 관찰되지 않았으며(도 15, 5 μM의 스캐폴드와 용해제 사용), 이는 용해제의 상호 침투가 응집체 용해의 시간 척도에 비해 상대적으로 빠른 과정임을 시사하였다(실험 조건에서 일반적으로 수십 분).
그런 다음, 용해제에 의해 매개되는 가닥 치환 반응의 속도를 측정하였다. 이를 위해 염료 라벨(Cy5)이 붙은 코어와 소광제 라벨(BHQ-2)이 붙은 어셈블러 가닥으로 구성된 스캐폴드를 사용하였다(도 16A). 용해제에 의해 매개된 가닥 치환 반응은 코어에서 어셈블러를 제거하여 형광 소광을 유발하였다. 300 내지 600 nM의 용해제와 300 nM의 핵산 스캐폴드를 사용하여 핵산 스캐폴드에서 점착 말단 제거의 역학을 정량화하였다(도 16B). 참고로 제조예 1의 핵산 스캐폴드를 이용한 실험에서는 이 스캐폴드 농도에서는 응축이 유도되지 않았다(도 4D).
용해제 매개 가닥 치환 반응은 k = 3.7 ± 0.2 × 104M-1s-1의 속도 상수를 갖는 간단한 이분자 반응으로 설명할 수 있다( 적용). 일반적으로 용해 실험에 사용되는 용해제의 농도 범위(2.5 내지 10 μM)에서 획득한 속도 상수를 기반으로 한 추정은 스캐폴드에서 점착 말단의 제거가 거의 즉시(< 1분) 발생할 것임을 시사한다. 이 예측이 유효한지 테스트하고 점착 말단 제거가 각 상에서 차등적으로 진행되는지 여부를 조사하기 위해 응집체의 용해 동안 용해제 매개 가닥 치환 반응을 공초점 현미경으로 모니터링하였다. 예상대로 희석 상에서 형광의 증가는 용해제를 첨가한 후 3분 이내에 즉시 포화된다는 것을 발견했다(도 17, 3.5 μM 스캐폴드와 5 μM 용해제 사용). 또한, 용해제 농도를 높이면 형광 포화 수준이 증가 하여 스캐폴드에서 점착성 말단 손실의 정도가 더 높음을 나타냈다. DNA 응집체 내에서, 포화 수준에서 이와 유사한 경향이 관찰되지만 느린 속도로 발생했다. 용해제의 빠른 상호 침투와 일치하게, DNA 응집체 내의 형광 신호는 용해 중에 균일하게 분포되었다(도 17A). 따라서 용해제 상호 침투 및 어셈블러를 제거하는 가닥 치환 반응 모두의 시간 척도는 응집체 용해 자체보다 훨씬 빨랐다.
종합적으로, 이러한 증거는 희석 상에서 스캐폴드를 포함하는 점착 말단의 고갈이 용해제 매개 용해 과정의 주요 구동 메커니즘임을 시사하였다. 평형 상태에서 상이 공존하는 경우, 희석 상의 용질 농도는 포화 농도 근처에서 유지되었다. 희석 상의 용질이 고갈되는 비평형 조건에서, 응집 상의 부피 분율은 고정된 수준으로 유지될 수 없지만 시간이 지남에 따라 감소하였다. 응집체 용해 속도와 희석 상 스캐폴드를 포함하는 점착 말단의 감소 사이에 관찰된 강한 상관관계는 이러한 견해를 뒷받침할 수 있다(도 18).
실시예 4 : 핵산 응집체의 조성 제어
(1) 클라이언트 파티셔닝(partitioning) 모델링 설계방법
클라이언트를 DNA 응집체로 파티셔닝하는 것은 평형 결합의 결과로써 모델링되었다. 클라이언트 파티셔닝 실험은 단일 클라이언트 결합부가 있는 스캐폴드가 사용되었다. 평형 결합 모델에서, 각 상의 총 스캐폴드 농도는 실험적으로 측정된 상 경계를 사용하여 할당되었다. 다상 연계 형식(polyphasic linkage formalism)에 기술 된 스캐폴드 포화 농도에서 클라이언트의 조절 효과를 고려할 때, 희석 상, 에서의 총 스캐폴드 농도는 [수학식 5]로 표현된다.
[수학식 5]
여기서 및 [C]는 각각 클라이언트가 없을 때의 핵산 스캐폴드 농도와 유리된 클라이언트의 농도이다. 는 클라이언트와 스캐폴드의 결합 상수를 나타낸다. 각 상에 대해 클라이언트 C와 스캐폴드 S 사이의 결합 평형은 다음과 같이 주어진다.
[수학식 6]
스캐폴드에 대한 클라이언트의 결합은 스캐폴드의 점착 말단 영역에서 혼성화에 의해 매개된다. 따라서, 희석상의 경우 결합 상수는 다음과 같이 주어진다.
[수학식 7]
여기서 ΔG는 혼성화의 자유 에너지 차이이고 은 기준 농도이다(=1M). 각 클라이언트에 대한 혼성화 자유 에너지는 웹 기반 소프트웨어 DINAMelt를 사용하여 측정되었다. 응집 상에서, DNA 스캐폴드의 조밀한 네트워크 내 클라이언트와 관련된 자유 에너지 비용(cost)이 있다고 가정했다. 실험에 사용된 클라이언트는 크기가 비슷하기 때문에(20 내지 50 nts) 모든 클라이언트에 대한 시퀀스 독립적인 자유 에너지 비용을 설명하기 위해 단일 값을 사용했다().
두개의 상(two phases)은 동일한 자유 클라이언트 농도를 통해 연결되었다. 지렛대 규칙에 따라 총 스캐폴드 농도는 응집 상의 부피 분율인 와 관련이 있다.
[수학식 8]
유사한 보존 법칙이 클라이언트에도 적용된다. 친화도 비율 α가 주어지면 위의 방정식 시스템은 모든 분자 종류의 농도를 산출하기 위해 사용될 수 있다. 클라이언트의 파티션 계수(partition coefficient)는 다음과 같이 표현된다.
[수학식 9]
MATLAB 최소 제곱법을 사용하여, 실험 데이터는 친화도 비율 α를 유일한 자유-적합(free-fitting) 매개변수로 사용하여 위에서 설명한 모델에 적용되었다.
본 실험에 사용된 클라이언트 서열은 서열번호 44 내지 55에 기재하였다. 단, 도 19I 및 도 19J에 해당하는 실험의 경우 서열번호 50 및 56 내지 69를 사용하였다.
스캐폴드 간의 결합 확률 추정
스캐폴드 사이의 결합 확률은 아래에 설명한 절차에 따라 추정되었다. 점착 말단 사이의 개별 결합은 혼성화 반응과 관련된 자유 에너지 차이인 ΔG에 의해 구동된다. 따라서 결합 확률, 즉 형성된 결합의 분율은 다음과 같다.
[수학식 10]
여기서 f와 c는 각각 스캐폴드의 결합가와 몰 농도이다. Δ는 혼성화 반응의 자유 에너지, 와 연관되며, 여기서 은 볼츠만 상수이다. 이 연구에 사용된 점착 말단 시퀀스와 염 농도에 대한 자유 에너지 차이 ΔG는 웹 기반 소프트웨어 DINAMelt에서 얻었다.
(2) 실험 결과
본 발명의 핵산 응집체에서 핵산 스캐폴드는 응집체 조립 및 구성을 제어하는 이중 기능적 역할을 하는 클라이언트 결합부를 갖고 있으며 상보적인 서열을 가진 클라이언트가 결합할 수 있다(도 5B, 도 5C 및 도 19A). 클라이언트 내 클라이언트 결합부에 상보적인 서열은 서열번호 34 내지 43에 기재하였다. 클라이언트 결합부의 상보적인 서열 영역이 없는 DNA를 관중(spectator)이라고 정의한다. 따라서 스캐폴드는 클라이언트와 관중의 혼합에서 응집체 내부로 클라이언트만을 선택적으로 풍부하게 하도록 설계되었다.
먼저 클라이언트가 스캐폴드 응집체로 확산되는 시간 척도를 조사하였다. 클라이언트와 관중의 혼합물이 사전 조립된 응집체가 있는 챔버로 함께 흐를 때 시간이 지남에 따라 관중이 일부 제외되는 동안 클라이언트가 응집체로 농축되는 것을 관찰하였다(도 19B 내지 도 19D). 클라이언트의 농도 구배는 응집체 내에서 주변을 따라 높고 중앙에서 낮게 나타나며 시간이 지남에 따라 감소하여 클라이언트의 균일한 분포를 생성하였다(도 19B, 제조예 8의 핵산 스캐폴드 사용). 15분 정도 후 핵산 응집체의 클라이언트 농도는 정상 상태 값에 도달하였다(도 19C).
클라이언트의 응집체 내로의 클라이언트 결합부 매개 유입을 확립한 후, 클라이언트 결합부 시퀀스를 체계적으로 변화시키고(제조예 5 내지 13 사용), dsDNA 클라이언트가 응집체 내부로 농축되는 양을 정량화하려고 했다. 농축 정도를 특성화하기 위해 분배 계수(PCs)를 계산하였다. 이 계수는 희석 상의 클라이언트 또는 스캐폴드 농도 대 응집체의 비율로 정의된다. 본 실험으로 클라이언트 파티셔닝이 클라이언트 결합부에 사용되는 특정 시퀀스에 의해 크게 영향을 받았다(도 19E, 각 샘플에 100nM 클라이언트를 12시간 동안 3μM의 스캐폴드와 배양). 파티셔닝은 클라이언트 결합부의 길이나 G/C 뉴클레오티드의 비율이 증가함에 따라 증가했다. 클라이언트 파티셔닝에 대한 통찰력을 더 얻기 위해 웹 기반 분석 도구 DINAMelt(표 5)를 사용하여 클라이언트 혼성화와 관련된 자유 에너지 변화를 계산하였다. 제조예 4 내지 13을 사용한 실험으로 혼성화의 자유 에너지 변화가 클라이언트 파티셔닝에 대한 강력한 결정 요인임을 발견했다(도 19F). Δ G는 최소 -6 kcal/mol에서 클라이언트 파티셔닝이 증가하는 것을 관찰하기 시작하여 궁극적으로 최대 -10 kcal/mol에서 포화되었다. ssDNA 클라이언트에서도 전반적으로 유사한 파티셔닝 현상이 관찰되지만 포화시 파티셔닝 수준이 더 높았다(최대 PC는 ds- 및 ssDNA 클라이언트의 경우 각각 최대 55 및 최대 100)(도 20A, 100nM 클라이언트와 3μM 스캐폴드 혼합하여 사용).
클라이언트 결합부 서열 -ΔG(Kcal/mol)
6 nt GC 0% (서열번호 25) 2.8
6 nt GC 33% (서열번호 24) 4.8
6 nt GC 50% (서열번호 23) 6.2
8 nt GC 0% (서열번호 22) 4.3
8 nt GC 25% (서열번호 21) 7.5
8 nt GC 50% (서열번호 6) 9.2
10 nt GC 0% (서열번호 20) 6.2
10 nt GC 30% (서열번호 19) 10.4
10 nt GC 50% (서열번호 18) 12.2
12 nt GC 50% (서열번호 17) 15.1
클라이언트와 스캐폴드 간의 평형 결합을 기반으로 클라이언트 파티셔닝의 동작을 모델링하였다. 이 모델은 DNA 시스템을 자유 클라이언트를 공유하는 두 개의 구획으로 설명하면서 두 개의 구획의 분자 종 사이에 평형 결합을 허용하였다(도 19G). 모델은 클라이언트 파티셔닝 데이터의 몇 가지 주요 기능을 성공적으로 포착하였다(도 19F). 1) 혼성화가 강해짐에 따라 파티셔닝이 급격히 증가; 2) 충분히 높은 혼성화 강도 이상의 파티셔닝의 포화; 3) ds- 및 ssDNA 클라이언트 간의 파티셔닝 포화 수준의 차이(도 19F 및 도 20A). 실험 데이터에 맞추기 위해 응집 상의 결합 상수와 희석 상의 결합 상수의 비율인 단일 자유 매개변수만 사용한다는 점에 주목해야 한다(ds- 및 ssDNA 각각의 경우 Kden/Kdil=0.32±0.01및 0.53 ± 0.01, Ki는 희석 또는 응집 상에서 스캐폴드에 대한 클라이언트의 결합 상수). 희석 상과 응집 상 사이의 결합 상수의 차이는 응집 상의 스캐폴드 네트워크에 DNA 클라이언트를 배치하는 추가 에너지 비용에 기인할 수 있으며, 이는 DNA 가닥의 움직임과 구성을 제한할 가능성이 있다. 이 아이디어는 또한 ssDNA 클라이언트가 dsDNA 클라이언트보다 유연하고 포화 상태에서 더 높은 파티셔닝을 나타낸다는 관찰과 일치한다(도 19F 및 도 20A).
다상 연결 형식주의에 기초하여, 두개의 공존 상에서 스캐폴드에 대한 클라이언트의 결합 상수의 차이는 스캐폴드의 포화 농도의 변화로 나타났다. 1차 결합 다항식을 가정하면 클라이언트가 있는 스캐폴드의 포화 농도()는 로 표현된다. 여기서 와 [C]는 각각 클라언트가 없는 스캐폴드, 및 클라이언트가 있는 경우의 포화 농도이다. 클라이언트 파티셔닝 실험(100 nM)에 사용된 농도의 경우, 스캐폴드 포화 농도의 클라이언트 매개 변화는 최소화될 것으로 예상되었다(도 21, 제조예 5, 9 및 11 사용). 그러나 더 높은 클라이언트 농도에서 클라이언트는 조절 리간드처럼 행동할 수 있었다. 실험은 3 μM 스캐폴드에 다양한 농도의 ssDNA 클라이언트를 첨가한 후 혼합 용액 4000g을 4시간 동안 원심분리하는 방식으로 진행하였다. 원심분리 용액의 상층액에 있는 스캐폴드 농도는 각 조건에서의 스캐폴드의 포화농도로 측정되었다. 측정된 모든 포화 농도는 클라이언트가 없을 때의 평균 포화 농도로 정규화되었다. 평형 결합 모델과 결합 상수의 추정된 비율(ds- 및 ssDNA 클라이언트의 경우 각각 Kden/Kdil=0.32±0.01 및 0.53±0.01)을 사용하여 자유 클라이언트의 농도 [C]는 총 클라이언트 농도가 변화함에 따라 계산되었다. 그런 다음, 스캐폴드 포화 농도의 변화 정도는 로부터 계산되었다. 실험에서 DNA 응축 시스템에서 스캐폴드의 포화 농도에 대한 클라이언트의 조절 효과를 관찰하였고, 클라이언트 농도가 더 높거나 클라이언트와 스캐폴드 사이의 결합 친화도가 더 강할수록 더 강한 효과가 관찰되었다(도 21). 이러한 결과는 상기 모델 예측 및 이전의 이론적 연구와 일치하며, DNA 기반 시스템을 사용하여 응집체 구성을 합리적으로 설계할 수 있음을 추가로 확인할 수 있었다. 파티셔닝에 대한 결합 강도의 영향은 DNA 응집체 내에서 클라이언트의 확산 이동성 또한 사용된 클라이언트 결합부의 특성에 크게 의존함을 나타내었다. 응집체 내 클라이언트의 이동성을 조사하기 위해 다양한 클라이언트에 대해 일련의 FRAP 측정을 수행하였다. 클라이언트 확산 속도와 혼성화의 자유 에너지 사이에 강한 상관 관계를 다시 발견하였다(도 19H, 제조예 4, 8, 9 및 11 사용). 혼성화화 자유 에너지가 -6.2 에서 -15.1 kcal/mol로 변화하는 동안 클라이언트의 확산 계수에서 100배 이상의 변화가 관찰되었다. 따라서 클라이언트에서 동족 바인딩 시퀀스와 함께 스캐폴드에 의해 표시되는 클라이언트 결합부는 내부 클라이언트 역학뿐만 아니라 응집체 구성을 나타내었다.
본 발명의 DNA 응집체 시스템은 별도의 서열 모티브를 사용하여 응축 및 구성에 대한 직교 제어를 위해 설계되었다. 선행 연구에서 사용된 클라이언트는 일반적으로 스캐폴드에 대한 결합 위치를 다른 스캐폴드와 공유했다. 이 경우 클라이언트와 스캐폴드 사이의 직접적인 경쟁이 예상되며 이는 응집체의 안정성에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 실제로, 스캐폴드와 동일한 점착성 말단을 가진 클라이언트가 스캐폴드와 유사한 농도로 추가될 때, 본 실험에서 사용된 직교 클라이언트와 대조적으로 응집체가 현저한 수준의 용해를 겪는다는 것을 관찰했다(도 19I 및 도 19J, 15μM 클라이언트가 3μM 스캐폴드 용액에 추가됨). 종합하면, DNA 응집체의 구성이 응집체의 전체 보전성을 유지하면서 클라이언트 결합부 매개 클라이언트 파티셔닝을 사용하여 정확하게 정의될 수 있음을 보여주었다.
실시예 5 : 핵산 응집체 기반 핵산 가닥 치환 반응의 가속화
(1) DNA 가닥 치환 반응 실험방법
핵산 가닥 치환 반응의 모든 시퀀스는 시소 컴파일러(seesaw complier)를 사용하여 설계되었다. 용액 상의 반응은 하이브리드 다중 모드 마이크로플레이트 리더기(Synergy H1M, Biotek)를 사용하여 측정되었다. 핵산 응집체의 가닥 치환 반응의 경우, 입력(input) 가닥을 제외한 모든 반응 성분은 입력 가닥을 첨가하기 전에 일반적으로 1시간 동안 응집체 용액과 함께 미리 인큐베이션했다. 100 nM의 개별 반응 구성 요소들이 1.5 μM 스캐폴드와 함께 사용되었다. 반응은 30 ℃에서 350 mM NaCl 완충액 조건 하에서 수행되었다.
(2) DNA 가닥 치환 반응의 정규화 방법
달리 명시되지 않는 한, 멀티플레이트 판독기 또는 공초점 현미경으로 측정된 DNA 가닥 치환 반응의 모든 원시 데이터는 다음과 같이 정규화되었다. 반응 중 원시 형광 강도 데이터는 입력 가닥을 추가하기 전에 각 샘플의 평균 강도에서 뺀 다음 비교 중인 반응에서 최대 5개 데이터 값의 평균 강도 값으로 나누었다.
(3) 실험 결과
본 발명의 핵산 응집체가 특정 구성 요소의 농축을 기반으로 설계된 기능을 수행할 수 있는지 여부를 실험했다. 핵산 응집체는 특정 클라이언트를 농축시킬 수 있기 때문에 핵산 응집체가 정의된 클라이언트 세트를 유입시켜 DNA 가닥 치환 반응을 촉진할 수 있다고 예상하였다. 첫 번째 캐스케이드의 단일 가닥 출력이 다운스트림 반응에 대한 입력으로 작용하는 이중 캐스케이드 DNA 가닥 치환 반응을 설계하였다(도 22A, 서열번호 60 내지 65). 각 캐스케이드 구성 요소는 스캐폴드의 클라이언트 결합부에 대한 결합 서열을 갖고 있으며, 반응 진행은 캐스케이드의 끝에서 소광제(BHQ-1) 표지된 가닥이 리포터 가닥에서 치환될 때 생성되는 형광(FAM)을 통해 모니터링할 수 있다.
먼저 스캐폴드가 없을 때, 설계된 반응 캐스케이드가 입력 의존 방식으로 기능한다는 것을 확인하였다(도 23). 제조예 9 및 비교제조예 1 및 2를 사용한 실험을 통해 핵산 응집체가 있는 상태에서 동일한 반응을 반복하면 반응이 크게 가속화되는 것을 관찰할 수 있었다(도 22B). 1분에 걸친 초기 반응 속도의 관점에서, 응집체 매개 반응 캐스케이드의 경우 반응 속도의 최대 7배 향상이 관찰되었다. 대조 실험은 반응 가속이 응집체로 파티셔닝된 클라이언트가 있는 경우에만 발생함을 보여주었다. 스캐폴드에서 점착 말단이나 클라이언트 결합부를 제거하면 가속 효과가 사라졌다(도 22B). 공존하는 이원 상 내에서 반응 진행 상황을 추가로 조사하기 위해 공초점 현미경을 사용하여 동일한 캐스케이드 반응을 모니터링하였다. 입력 가닥을 추가하면 조밀한 응집체 상 내에서 리포터 형광의 급격한 증가가 관찰되는 반면, 잘못된 클라이언트 결합부 서열을 가진 대조군 샘플에서는 형광 증가가 관찰되지 않았다(도 22C 및 도 24). 반경 15 내지 21 μm 범위의 응집체의 경우, 응집체 내에서 측정된 반응 속도는 각각 희석상 또는 스캐폴드가 없는 조건에서의 반응과 비교하여 최대 26배 또는 49배 더 빠르며(도 22D), DNA 응집체는 클라이언트에게 특정 클라이언트 결합 서열을 풍부하게 하여 가닥 치환 반응을 크게 가속화할 수 있는 것을 확인하였다.
희석 상에서도 초기 반응 속도가 스캐폴드가 없는 샘플보다 1.9배 더 높다는 것을 발견했다(도 22E). 이 결과는 질량 작용(mass action)의 법칙과 모순되는 것으로 보였다. 희석 상의 반응 성분 농도는 낮은 최종 반응 생성물에 반영된 바와 같이 응집체로 파티셔닝되기 때문에 스캐폴드가 없는 조건보다 낮았다(도 22E). 이 효과를 자세히 조사하기 위해 먼저 각 반응 성분에 대한 파티셔닝 정도를 측정한 다음(표 6), 응집 상 또는 희석 상의 동일한 반응 성분 농도에서 스캐폴드가 없을 때 반응 속도를 정량화였다(도 22F, ‘SC’는 클라이언트 결합부, ‘CL’은 클라이언트를 나타냄). 응집체 등가 조건의 경우, 응집체와 유사한 정도의 반응 가속이 관찰되었으며, 이는 질량 작용, 즉 반응 성분 농도의 증가만으로도 가속 효과를 충분히 설명할 수 있음을 나타냈다(도 22G, 100nM의 클라이언트 농도에서 스캐폴드가 없는 초기 반응 속도로 정규화시킴). 대조적으로, DNA 응집체 시스템의 희석 상의 반응 속도를 스캐폴드가 없는 동일한 농도의 반응 성분에 의해 생성된 반응 속도와 비교할 때, 전자의 조건은 사용된 전체 클라이언트에 따라 2.4 내지 5.2배 더 빠른 속도를 나타냈다(도 22G). 따라서 희석 상의 반응은 질량 작용에 의해 예상되는 것보다 더 큰 속도로 진행되었다. 이러한 거동은 스캐폴딩을 통해 반응 성분 간의 결합에 영향을 미칠 수 있는, 과포화 용액에도 존재할 수 있는 작은 용질 클러스터 집단으로 인한 것일 수 있다는 것으로 해석된다. 다가의 단백질 응집체에서 SUMOylation 반응에 대해서도 유사한 행동과 메커니즘이 관찰되었다(도 22B 내지 도 22G의 결과를 나타낸 실험에서는 모두 제조예 9를 사용하였다).
반응요소 측정된 파티셔닝계수 클라이언트(반응 요소)의 농도(nM)
50 nM 100 nM 200 nM
조밀 상 희석 상 조밀 상 희석 상 조밀 상 희석 상
Input 10.09 470 47 940 3 1,880 86
Gate 22.60 962 43 1,925 5 3,850 70
Reporter 25.02 1,048 42 2,097 3 4,193 68
위와 같은 응집체 매개 이중 가닥 캐스케이드 반응의 가속 효과는 Y자 형태의 스캐폴드 이외에 다양한 형태의 스캐폴드에서도 나타났다. 우선 특정 농도 이상의 다양한 형태의 스캐폴드에서 현미경으로 관찰할 수 있을 정도로 큰 응집체가 형성됨을 확인함으로써, 스캐폴드들이 부피 확장성을 가짐을 확인하였다. (도 26A 내지 도 26C) 이후 스캐폴드가 없는 상황에 비해 다양한 형태의 스캐폴드(제조예 9, 14, 15, 16, 18 및 22)가 매개하는 상황에서 연산 가속화가 발생함을 확인하였다. (도 27A 내지 도 27C)
그런 다음 응집체 매개 반응 속도에 대한 스캐폴드와 클라이언트 사이의 결합 강도의 영향을 조사했다. DNA 응집체 시스템에서 핵산 스캐폴드와 클라이언트 사이의 결합은 핵산 스캐폴드의 클라이언트 결합부와 클라이언트의 동족 결합 영역 사이의 혼성화에 의해 매개되었다. 먼저 스캐폴드가 없을 때 스캐폴드 결합 영역을 변경하면 가닥 치환 반응에 최소한의 영향을 미친다는 것을 확인하였다(도 25, 스캐폴드 결합 영역을 제외하고 반응 성분은 동일한 서열을 공유하고, 반응은 표시된 클라이언트 등몰 농도에서 수행되었으며 스캐폴드는 사용되지 않음). 이 연구에서 특성화한 바와 같이 결합 강도를 높이면 응집체 시스템에 두 가지 다른 영향이 발생할 수 있다: 반응 성분의 농도 증가와 응집체 내 이동성 감소이다. 이러한 기능은 반대 방식으로 반응 속도에 영향을 미쳤다. 클라이언트 파티셔닝을 증가시키면 반응 속도가 향상될 수 있지만 느린 분자 역학은 반응에 부정적인 영향을 미쳤다. 이 두 가지 거동의 상대적 기여도를 조사하기 위해 다섯 가지 유형의 클라이언트 결합부와 그 결합 쌍으로 구성된 응집체 시스템의 반응 속도를 측정하였다(도 22H, 제조예 4, 5, 8, 9 및 11 사용). 그 결과 클라이언트와 스캐폴드 사이에 최적의 결합 강도가 있음을 발견했다. ΔG가 -9.2 kcal/mol일 때 반응이 가장 빠르게 실행되었다. 가장 강력한 결합 쌍인 12-nt GC 50%(제조예 4)일 때 반응 속도는 최대 속도의 절반으로 떨어졌다. DNA 응집체의 반응 진행을 직접 영상화하면 약한 결합 쌍에서의 균일한 분포(도 22C, 제조예 9 사용)와 달리 강한 결합 쌍의 샘플에서 리포터 형광 신호에서 가파르고 지속적인 농도 구배의 형성이 나타났다(도 22I, 제조예 5 사용).
연산 가속화를 위한 클라이언트와 스캐폴드 사이의 최적 결합 강도는 다양한 스캐폴드 형태에서 폭넓게 존재함을 확인하였다(도 28A 내지 도 28B, 제조예 17 내지 24). 그러나 스캐폴드의 형태에 따라 최대 가속 효과를 얻기 위한 최적 결합 강도는 다소 차이가 있을 수 있음을 확인하였다. 타쿠미 DNA 구조체의 경우 8-nt GC 25%(제조예 18)에서, 링커 DNA 구조체의 경우 8-nt GC 25%(제조예 22)와 8-nt GC 50%(제조예 23)에서 유사한 정도의 가속 효과가 발생함을 확인할 수 있었다. 이는 Y자 형태의 N=3 스캐폴드와 약간의 차이를 확인할 수 있는 결과이다.
본 실험을 통해 반응 성분과 스캐폴드 사이의 강한 결합이 실제로 분자 확산을 억제하고 전체 반응의 역학을 늦출 수 있음을 확인시켜주었다.
실시예 6 : 핵산 응집체 기반 논리 게이트 연산
응집체 매개 반응의 성능과 메커니즘을 특성화한 후 응집체 플랫폼을 적용하여 DNA 기반 논리 게이트를 가속화할 수 있는지 제조예 8을 사용하여 테스트하였다. 이를 위해 먼저 총 12개의 DNA 반응 성분(서열번호 66 내지 84, 각 성분은 X1, X2, X3, (Gate1-t + Gate1-b), (Threshold1-t + Threshold1-b), (Gate2-t + Gate2-b), Fuel1, (Gate3-t + Gate3-b), (Threshold2-t + Threshold2-b), (Gate4-t + Gate4-b), Fuel2, (Reporter-t_OR + Reporter-b_OR)이다)로 구성된 이중(two-layer) OR 게이트를 사용하였다(도 29A). 응집체와 결합할 때 회로 연산이 크게 가속화됨을 알 수 있었다. 입력 유형에 따라 반응 속도가 12배에서 22배까지 증가하였다(도 29B 내지 도 29D). 도 29C의 경우 응집체 조립을 위해 추가된 1.5μM 스캐폴드를 제외하고 모든 조건은 도 29B와 동일했다. 이렇게 입증된 응집체의 반응 가속화는 다양한 DNA 회로에서 매우 유용하다. 원하는 반응 성분에 스캐폴드 결합 서열을 간단히 추가함으로써 선택적 반응 가속화를 달성할 수 있다.
분자 계산에 대한 DNA 응집체 시스템의 적용 가능성을 추가로 입증하기 위해, 반응 역학의 응집체 매개 조절을 기반으로 하는 게이팅 메커니즘을 설계하였다(도 29E). 역학적 게이팅(kinetic gating)에서, 회로 작동의 출력은 응집체와 결합할 특정 반응 경로를 결정하는 셀렉터(selector) 가닥에 따라 달라진다. 선택한 경로의 반응 가속은 다른 반응 요소에 공급되어 게이팅 효과를 얻을 수 있다. 역학적 게이팅에 대한 개념 증명으로, 먼저 오는 캐스케이드에 대해 독점적으로 기능하는 게이트 가닥을 공유하는 두 개의 병렬 반응 캐스케이드를 사용하였다. 따라서 하나의 캐스케이드를 응집체에 연결하면 다른 캐스케이드가 작동하기 전에 공유 게이트가 고갈될 수 있으므로 역학 기반 게이팅 작업이 가능하다. 3개의 병렬 반응 캐스케이드를 사용하여 역학적 게이팅의 성능을 테스트하였다(도 30). 반응 캐스케이드 A(서열번호 85 내지 97)와 B(서열번호 95, 98 내지 109)는 중간 게이트(게이트 3, 서열번호 95)를 공유하므로 제한된 양의 게이트 3이 존재할 때 이 두 캐스케이드 간의 경쟁이 발생할 수 있다. 따라서 2개의 캐스케이드는 중간 게이트를 공유하여 역학 게이팅에 참여하고 나머지 캐스케이드(반응 캐스케이드 C, 서열번호 110 내지 121)는 방관자(bystander)로 사용되었다. 실험 결과 역학적 게이팅이 설계된 대로 성공적으로 작동하여 사용된 셀렉터 가닥(서열번호 122 및 123) 유형에 따라 회로 출력의 명확한 차이를 표시함을 관찰했다(도 29F 내지 도 29H). 셀렉터를 매개로 하여 특정 반응 캐스케이드를 응집체와 커플링하자, 해당 반응은 역학적 게이팅에 관여하는 다른 캐스케이드를 억제함과 동시에 급격하게 가속화되었다. 반대로 방관자 반응 캐스케이드는 스캐폴드 또는 셀렉터의 존재 여부에 관계없이 교란되지 않은 상태로 유지되었다.
마지막으로, 응집체의 기능을 확장하기 위해, DNA 액적(droplet)의 비혼화성을 이용하였다. 응축과 조성 제어 사이에 본 시스템에 존재하는 직교성을 결합하면 서로 다른 조성을 가진 여러 개의 비혼화성 응집체를 형성할 수 있다. 따라서 본 핵산 응집체는 살아있는 세포에 공존 하는 다양한 기능적 생체 분자 응집체와 유사한 방식으로 다상 반응 시스템을 구성하는 데 사용할 수 있다. 이 기능을 가장 간단한 형식으로 시연하기 위해, 두 가지 다른 세트의 스캐폴드(제조예 1 및 제조예 3)와 클라이언트를 준비하여 각 핵산 응집체가 한 세트의 반응 구성 요소만 유입하도록 하였다. 입력 가닥의 추가는 동족의 반응 성분에서 각 응집체에 대한 형광 증가를 가져오며, 이는 반응의 특이성이 응집체에도 부여될 수 있음을 나타냈다(도 31, 500nM의 입력 가닥이 500nM의 게이트 및 리포터 가닥이 미리 로드된 5μM의 스캐폴드와 함께 추가됨, 제조예 1과 반응하는 이중 캐스케이드 1의 서열번호는 77 및 124 내지 128, 제조예 3과 반응하는 이중 캐스케이드 2의 서열번호는 129 내지 134). 핵산 응집체는 특정 구성 요소를 선택적으로 유입시키고 이들 간의 화학 반응을 촉진하는 프로그래밍 가능한 비혼화성 상을 나타냈다.

Claims (13)

  1. 복수의 핵산 스캐폴드를 용액 상에서 상호 결합시켜 핵산 응집체를 제조하는 단계; 및 분자 연산 요소들의 핵산 가닥 치환 반응이 상기 핵산 응집체 내에서 일어나도록 하는 단계를 포함하는 분자 연산 가속화 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 스캐폴드는 클라이언트 결합부를 포함하고, 상기 분자 연산 요소들은 상기 클라이언트 결합부의 적어도 일부에 상보적으로 결합하는 스캐폴드 결합부를 포함하는, 분자 연산 가속화 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 용액은 상기 핵산 응집체에 의해 상기 핵산 스캐폴드의 조밀상과 상기 핵산 스캐폴드의 희석상으로 상 분리되는, 분자 연산 가속화 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 분자 연산 요소들을 상기 핵산 응집체 내로 유입시키는 단계를 더 포함하는, 분자 연산 가속화 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 응집체는 상기 핵산 스캐폴드의 점착 말단부의 적어도 일부가 상보적으로 결합되어 형성되는 것인, 분자 연산 가속화 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상보적으로 결합하는 핵산 가닥들을 상기 용액에 넣고 교반하여 상기 핵산 스캐폴드를 제조하는 단계를 더 포함하는, 분자 연산 가속화 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 분자 연산 요소들은 입력 핵산 분자 및 리포터 핵산 분자인, 분자 연산 가속화 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 분자 연산 요소들은 입력 핵산 분자, 게이트 핵산 분자 및 리포터 핵산 분자인, 분자 연산 가속화 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 스캐폴드와 상기 분자 연산 요소들의 결합력(ΔG)은 0.5 내지 30 Kcal/mol인, 분자 연산 가속화 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 분자 연산 요소들의 핵산 가닥 치환 반응이 상기 핵산 응집체의 외부에서 일어나도록 하는 단계를 더 포함하는, 분자 연산 가속화 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 용액은 용매 및 염(salt)을 포함하는 것인, 분자 연산 가속화 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 분자 연산 요소들이 상기 핵산 응집체 내로 유인됨으로써 상기 핵산 응집체에 의해 상기 분자 연산 요소들의 농도 구배가 유도되는, 분자 연산 가속화 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 분자 연산 가속화 방법을 사용하는 컴퓨팅 장치로서,
    상기 분자 연산 요소들을 입력받는 입력부;
    상기 분자 연산 요소들의 핵산 가닥 치환 반응에 의하여 연산을 수행하는 연산부; 및
    상기 연산부에서 수행된 연산 결과를 핵산 분자의 형태로서 출력하는 출력부를 포함하는 컴퓨팅 장치.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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