KR20240040414A - 로티고틴 수성현탁 주사용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
로티고틴 수성현탁 주사용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 로티고틴의 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 운반 입자의 종류가 투여 부위에서의 약물 용해도, 약물 입자의 응집, 생물학적 반응에 현저한 영향을 미친다는 결론을 바탕으로 수성현탁 입자 기반의 결정 현탁액은 유성현탁 입자와 비교하여, 더 낮은 초기 약물 노출 정도를 제공하였고, 투여 부위에서의 약물 용해도가 낮으며, 약물응집체가 형성이 되어 표면적이 감소함으로써 상기 로티고틴을 포함하는 수성현탁 조성물은 주사 부위에 secondary depot를 형성하여 약동학적 프로파일을 연장시켜, 4주 이상 지속되는 약동학적 프로파일을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 로티고틴의 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 로티고틴을 약물 나노 결정 현탁액 기반 장기 지속성 주사제 시스템에 적용하기 위하여, 상기 로티고틴을 비드밀(bead mill) 방식으로 로티고틴 수성 현탁액을 제조하는 것에 관한 것이다.
로티고틴(rotigotine), (-)-5, 6, 7, 8-테트라하이드로-6-[프로필-[2-(2-티에닐)에틸]아미노]-1나프탈레놀린은 도파민 작용제(non-ergoline dopamine agonist)로서 파킨슨병(Parkinson’s disease)과 흔들다리증후군(restless legs syndrome)의 치료에 사용된다.
로티고틴의 투여는 주로 경피 약물전달 시스템(TDS)을 통하여 이루어져 왔다. 그 일예로는 탄화수소 수지를 포함하는 스티렌계 점착제 및 지방산으로 구성된 로티고틴 함유 점착제층, 지지층 및 박리층을 포함하는 경피흡수제제 및 접착제 매트릭스가 핫 멜트형 접착제를 함유하며, 그 중에서 작용물질 로티고틴이 분산되어 있거나, 부분적으로 또는 완전히 용해되어 있는 경피흡수제제 등이 있다. 그런데 도파민 연관 질환자들의 부주의로 부착된 경피흡수제제가 떨어지거나 떼어내기 쉬워서 의도된 로티고틴의 혈장 농도를 유지하기 어려운 경우가 종종 발생하였다. 이에 로티고틴의 주사형 제제의 개발 필요성이 대두되고 있다.
본 발명의 목적은 로티고틴의 수성현탁 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 로티코틴의 수성현탁 조성물을 근육내 또는 피하에 주사 투여시 장기 지속가능하고 동시에 경피 패치제의 반복 적용으로 인한 부작용과 파킨슨병 환자의 낮은 복약 순응도를 획기적으로 개선하기 위한 장기지속성을 갖는 주사투여용 로티고틴 수성현탁 제제 제조방법 및 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분산화제 및 항산화제를 수용매에 용해시키는 제1단계; 및 상기 제조한 수용매에 로티고틴 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 적가한 후, 분쇄시키는 제2단계;를 포함하는, 로티고틴 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 로티고틴의 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 조성물과 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 제제를 제공한다.
본 발명은 로티고틴의 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 조성물은 약물 나노 결정 현탁액(Nanocrystalline suspension, NS) 기반 장기 지속성 주사용 조성물로, 근육내 또는 피하 투여시 단일 투여만으로도 혈중 농도가 Cmax를 도달한 후에도 수 주 이상 지속되고, 약물응집체와 섬유질 매트릭스의 장벽 역할로 약물의 용해와 혈류로의 이행을 지연시켜 장기간의 약동학적 프로파일(pharmacokinetic profile; PK profile)을 제공하여 만성 질환 환자의 투여 간격을 연장하는 효과가 있다.
도 1은 입자 크기 조절에 있어, Na. CMC의 농도와 밀링 속도가 미치는 영향을 분석한 그래프이다.
도 2는 입자 크기 조절에 있어, 밀링 속도와 밀링 시간이 미치는 영향을 분석한 그래프이다.
도 3은 RG-AS, RG-OS 입자를 각각 Cryo-Field emission transmission electron microscopic(Cryo-TEM)으로 관찰한 이미지이다.
도 4는 입자의 결정성을 확인하기 위한, 시차 주사 열량분석 평가 (Differential scanning calorimetry, DSC) 평가 결과이다.
도 5는 입자의 결정성을 확인하기 위한 X선 회절 분석 평가 (X-ray diffraction, XRD) 평가 결과이다.
도 6은 rotational rheometer를 사용하여 측정한 RG-AS와 RG-OS의 겉보기 점도이다.
도 7은 로티고틴 약물 현탁액의 in vitro dissolution 평가 결과이다.
도 8은 로티고틴을 rat에 피하 투여한 후 로티고틴 concentration-time profile을 나타낸 그래프이다.
도 9은 rat의 등 피하 조직에 0.5시간 4일 후 RG-AS, RG-OS를 피하 주사로 투여하고 0.5시간 및 4일 후 관찰한 이미지이다.
도 2는 입자 크기 조절에 있어, 밀링 속도와 밀링 시간이 미치는 영향을 분석한 그래프이다.
도 3은 RG-AS, RG-OS 입자를 각각 Cryo-Field emission transmission electron microscopic(Cryo-TEM)으로 관찰한 이미지이다.
도 4는 입자의 결정성을 확인하기 위한, 시차 주사 열량분석 평가 (Differential scanning calorimetry, DSC) 평가 결과이다.
도 5는 입자의 결정성을 확인하기 위한 X선 회절 분석 평가 (X-ray diffraction, XRD) 평가 결과이다.
도 6은 rotational rheometer를 사용하여 측정한 RG-AS와 RG-OS의 겉보기 점도이다.
도 7은 로티고틴 약물 현탁액의 in vitro dissolution 평가 결과이다.
도 8은 로티고틴을 rat에 피하 투여한 후 로티고틴 concentration-time profile을 나타낸 그래프이다.
도 9은 rat의 등 피하 조직에 0.5시간 4일 후 RG-AS, RG-OS를 피하 주사로 투여하고 0.5시간 및 4일 후 관찰한 이미지이다.
본 발명은 분산화제 및 항산화제를 수용매에 용해시키는 제1단계; 및 상기 제조한 수용매에 로티고틴 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 혼합한 후, 분쇄시키는 제2단계;를 포함하는, 로티고틴 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 분산화제는 Na. CMC, Tween 80, Kolliphor RH 40 및 Kolliphor EL로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 Na. CMC의 농도는 0.5 mg/mL 내지 2 mg/mL일 수 있다.
상기 항산화제는 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfite), 아황산나트륨(sodium sulfite), 아황산수소나트륨(sodium bisulfite), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 시스테인(cysteine) 및 토코페롤(tocopherol)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 제2단계의 분쇄시키는 단계는 수성현탁 입자와 혼합된 로티고틴 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 나노 단위로 분쇄시키는 습식 분쇄일 수 있다.
수성현탁 입자와 혼합된 로티고틴 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 나노 단위로 분쇄시킬 수 있는 대표적인 방법은 습식 분쇄이다. 통상적인 습식 분쇄기술은 거친 약물 성분의 액체 현탁액을 분산 분쇄기(dispersion mill)와 같이 약물 성분의 크기를 감소시키기 위한 기계적 수단에 적용시키는 것을 포함한다. 분산 분쇄기의 한가지 예는 비드밀(bead mill)과 같은 매체 분쇄기(media mill)이다. 습식 비드분쇄는 분쇄되지 않은 거친 약물 성분의 현탁액을 제조하는 것을 수반한다. 그 후에 이 분산액은 모터 구동된 패들 및 다량의 분쇄비드(grinding bead)를 함유 하는 분쇄기 챔버(mill chamber)를 통해서 인출시켜 미분된 현탁액을 생성시킨다. 스크린을 사용하여 분쇄기 챔버 내에 비드를 보유시키면서 각각의 분쇄기 챔버의 외부로 생성물이 통과하도록 한다. 인라인 믹서(inline mixer)를 공정 라인에서 사용하여 분쇄된/분쇄되지 않은 응집체를 파괴시킬 수 있다.
대부분의 습식 비드 분쇄는 하나의 분쇄기 챔버를 통한 재순환 방법을 사용하여 수행하며, 여기에서는 하나의 비드 크기를 사용하여 필요한 크기 감소에 도달한다. 이것은 페인트, 잉크 및 세라믹 처리를 위해 확립된 방법이며, 여기에서는 고정된 양의 에너지 [kW/시간]를 습식 분쇄공정 중에 생성물에 공급하여 표적 입자크기를 얻는다. 습식 분쇄에 사용되는 분쇄기는 통상적으로 강인한 세라믹 또는 스테인레스 스틸, 예를 들어 텅스텐 카바이드를 이용하여 분쇄기 챔버 및 교반패들을 형성시키고, 통상적으로 사용되는 분쇄 매체(grinding media)에는 다이아몬드의 경도에 근접한 경도를 갖는 새로 개발된 이트륨 안정화된 산화지르코늄 비드, 또는 폴리스티렌 또는 다른 유사한 폴리머를 기본으로 하는 훨씬 더 연질의 분쇄 매체가 포함된다.
바람직하게는, 상기 제2단계의 분쇄시키는 단계는 비드밀(bead mill) 방식으로, 500∼1500 rpm, 30분∼2시간 동안 진행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 로티고틴의 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 로티고틴 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 100 중량부에 대하여 1∼10 중량부의 분산화제를 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1∼5 중량부로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 분산화제의 농도가 높아질수록 상기 조성물 입자의 크기는 작아지는 양상을 보이며, 이는 밀링된 입자를 분산화제가 감싸며 입자가 응집하는 것을 억제하기 때문일 수 있다.
바람직하게는, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염,
인산염, 질산염, 구연산염, 초산염, 젖산염, 주석산염, 말레산염, 글루콘산염, 숙신산염, 포름산염, 트리플루오로아세트산염, 옥살산염, 푸마르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염, 캠퍼술폰산염, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 칼슘염 및 마그네슘염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 조성물의 평균 입자 직경은 300∼500 nm의 크기로 조절될 수 있다. 상기 조성물의 입자 직경이 상기 명시한 범위보다 작으면 약물이 신속하고 빠르게 용출되어 지속적인 유효 혈중농도를 유지하기 어려우며 상기 명시한 범위보다 크면 현탁제제의 점도가 증가하여 주사투여하는데 어려움이 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물과 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 제제를 제공한다. 상기 부형제 또는 담체는 해당 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 물질이면 특별하게 한정되지 않는다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 제제의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들어 당류, 착향제, 감미제, 산미제, 보존제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
이때, 상기 제제는 경구 투여에 적합한 제제일 수 있으며, 환자의 복약 순응도를 증가시킬 수 있다.
상기 제제는 펠렛, 산제, 과립제, 건조시럽게, 정제 및 캡슐제로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예> 로티고틴을 포함하는 수성현탁 조성물(RG-AS)의 제조
시약 및 재료준비
로티고틴은 Ferrer(Barcelona, Spain)에서 구입하였다. Na. CMC, PEG 4000, soybean oil, corn oil, peanut oil, potassium phosphate dibasic, triethylamine은 Sigma chemical(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfite)은 대정화금에서 구입하였다. Polysorbate 80, castor oil, cottonseed oil은 Croda Korea로부터 제공받았다. Poloxamer 188, Kolliphor HS 15, Kolliphor RH 40, Kolliphor EL, PVP K17은 BASF co. (Ludwigshafen, Germany)로부터 제공받았다. Miglyol 810N, Miglyol 812N은 IOI Oleo GmbH (Witten, Germany)로부터 제공받았다. Captex 355, Captex 8000은 ABITEC corp.(Columbus, OH, USA)로부터 제공받았다. Methanol은 HPLC 등급을 사용하였고, J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다.
로티고틴을 포함하는 수성현탁 조성물(RG-AS)의 제조
하기 표 1에 기술된 분산화제 5 mg (0.5 w/v%)을 인산염완충용액(PBS)(15 mM, 280 mOsm, pH 7.0) 1 mL에 용해시키고, 2 mL 밀링 튜브(milling tube)에 담은 후, 로티고틴 100 mg, 지르코니아 비드 1 g을 가해주었다. 약 3초간 강하게 vortexing하여 섞어준 후, ZentriMix 380R (Andreas Hettich GmbH und Co KG, Tuttlingen, Germany)로 1,500 rpm, -10℃ 조건에서 1시간 30분 동안 밀링하여 각 제제를 제조하고, 적합한 분산화제를 선정하였다.
| Stabilizer | Appearance | Particle size(nm) | Homogeneity |
| Na. CMC | Flowable, Homogeneous | 374.8 ± 1.7 | 0.206 ± 0.015 |
| Tween 80 | Flowable, Homogeneous | 414.7 ± 3.4 | 0.319 ± 0.017 |
| Poloxamer 188 | Viscous, Homogeneous | 1099.0 ± 303.6 | 0.334 ± 0.279 |
| Kolliphor HS 15 | Viscous, Heterogeneous | 3021.0 ± 222.0 | 0.407 ± 0.035 |
| Kolliphor RH 40 | Flowable, Homogeneous | 447.5 ± 5.7 | 0.236 ± 0.082 |
| Kolliphor EL | Flowable, Homogeneous | 424.4 ± 4.5 | 0.295 ± 0.027 |
| PEG 4000 | Viscous, Heterogeneous | 7148.0 ± 715.5 | 0.564 ± 0.121 |
| PVP K17 | Viscous, Heterogeneous | 3198.0 ± 130.8 | 0.265 ± 0.076 |
| a) The concentration of RG and stabilizer in aqueous vehicle were fixed to 100 mg/mL and 5 mg/mL, respectively, with milling speed of 1,500 rpm for 1.5 h. b) Data are expressed as mean ± SD (n=3). c) Indicates the mean hydrodynamic size determined using dynamic light scattering measurement technology (Zetasizer Nano® Instruments). d) Polydispersity index, Calculated by dividing the square of the standard deviation by the mean particle diameter. |
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로티고틴의 농도는 100 mg/mL, Milling은 1,500 rpm의 조건으로 1시간 30분 동안 진행하였고, 흐름성과 분산성을 육안으로 평가한 결과, Poloxamer 188, kolliphor HS 15, PEG 4000, PVP K17을 사용하여 만든 제제는 전혀 흐르지 않고 점성이 높아 투여하기에 적합하지 않다고 판단하였다. 또한, kolliphor HS 15, PEG 4000, PVP K17을 사용하여 만든 제제는 입자가 고르게 분산이 되지 않고 쉽게 침전이 되어 RG-AS의 제조에 적합하지 않다고 판단하였다.
반면, Na. CMC, Tween 80, kolliphor RH 40, kolliphor EL을 사용하여 만든 제제는 흐름성이 좋았고, 균질하게 분산되는 것으로 판단하였다. 입자의 크기는 4 가지 분산화제를 사용한 입자 크기는 각각 374.8 ± 1.68, 414.7 ± 3.39, 447.5 ± 5.69, 424.4 ± 4.49로 모두 비슷한 크기로 만들어졌고, 균질성을 비교하였을 때, 각각 0.206 ± 0.015, 0.319 ± 0.017, 0.236 ± 0.082, 0.295 ± 0.027로 Na. CMC가 가장 균질하게 제조가 되는 것으로 판단되어, Na. CMC를 RG-AS 제조를 위한 분산화제로 선택하였다.
Na. CMC 1 mg(0.1 w/v%), 항산화제로 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfite) 0.5 mg(0.05 w/v%)을 인산염완충용액(15 mM, 280 mOsm, pH 7.0) 1 mL에 용해시켜 수성현탁 입자를 제조하였다. 제조한 수성현탁 입자 1 mL을 2 mL 밀링 튜브에 담은 후 로티고틴 파우더 100 mg, 지르코니아 비드 1 g을 가해주었다 . 약 3 초간 강하게 vortexing하여 섞어준 후, ZentriMix 380R (Andreas Hettich GmbH und Co KG, Tuttlingen, Germany)을 이용하여 500 rpm, -10℃ 조건에서 30 분 동안 밀링해주었다. 만들어진 제제는 지르코니아 비드와 분리하여 4 mL scintillation vial에 담아 실온 보관하였다.
RG-AS 제조를 위해 입자 크기 조절 분석이 필요하였고, 입자 크기 조절을 위한 변수는 분산화제의 농도와 밀링 속도였으며, 이를 도 1에 나타내었다. 전체적으로 분산화제의 농도가 높아질수록 입자 크기는 감소하는 양상을 보였고, 밀링 속도에 따라 다양하게 입자 크기가 조절되는 것을 확인하였다. 분산화제의 농도가 높은 경우에는 밀링 속도가 강해질수록 입자 크기가 작아지는 양상을 보이는데, 이는 밀링된 입자를 분산화제가 감싸며 입자가 응집하는 것을 억제하기 때문으로 판단하였다. 분산화제의 농도가 낮은 경우에는 밀링 속도가 강해질수록 입자 크기가 커지는 양상을 보이는데, 이는 입자가 힘을 강하게 받아서 입자 크기가 작아졌지만, 이로 인해 비표면적이 커져 입자 간의 반데르발스 인력을 억제할 만큼의 분산화제가 없었기 때문에 입자 크기가 커졌을 것이라고 판단하였다.
최종적으로, 비교적 균질하면서도, syringeability와 injectability를 고려하여 3 μm 보다 작은 조건에서, RG-OS 제제와 입자 크기를 유사하게 맞추기 위해 Na. CMC의 농도는 0.1%, 밀링 속도는 500 rpm의 조건으로 RG-AS 제제를 제조하기로 결정하였다.
<비교예> 로티고틴을 포함하는 유성현탁제 조성물(RG-OS)의 제조
하기 표 2에 기술된 injectable oil류 1 mL을 2 mL 밀링 튜브에 담은 후, 로티고틴 100 mg, 지르코니아 비드 1 g을 가해주었다. 약 1 시간 가량 강하게 vortexing하여 섞어준 후, ZentriMix 380R (Andreas Hettich GmbH und Co KG, Tuttlingen, Germany)로 2,000 rpm, -10℃ 조건에서 1시간 30 분 동안 밀링하여 각 제제를 제조하고, 적합한 injectable oil을 선정하였다.
로티고틴은 logP 값이 4.7인 지용성 약물로, 약물현탁액을 만들기 위해서 oil에 대한 용해도가 가장 중요한 평가 항목으로 생각되었다. Miglyol 810N, Miglyol 812N, Captex 355, Captex 8000의 medium-chain triglycerides (MCT) oil들은 2,000 rpm의 조건에서 1시간 30분 동안 밀링하였을 때, 비교적 잘 흐르며 균질한 성상을 보였으나, 용해도가 각각 44.01 ± 0.41, 45.89 ± 1.01, 48.40 ± 0.09, 48.60 ± 0.11 mg/mL로 다른 oil들에 비해 비교적 로티고틴의 용해도가 높아 RG-OS의 제조에는 적합하지 않다고 판단하였다. Castor oil을 사용하여 같은 조건으로 밀링하였을 때, 균질한 성상을 보였으나, 점도가 매우 높아 투여하기엔 적합하지 않다고 판단하였다. Cottonseed oil, soybean oil, corn oil, sesame oil, peanut oil의 식물유들을 사용하여 같은 조건으로 milling하였을 때, 전부 균질한 성상을 보이고, 점성이 있는 것으로 판단하였으나, 이는 26 gauge 1 mL BD syringe에 충전 및 투여가 가능하여, 투여가 가능한 점도로 판단하였다. 용해도가 각각 21.22 ± 0.23, 22.36 ± 0.23, 22.94 ± 0.02, 19.63 ± 0.04, 20.80 ± 0.14로 sesame oil을 사용하였을 때에 가장 용해도가 낮아, sesame oil을 RG-OS 제조를 위한 oil 입자로 선정하였다.
Sesame oil 1 mL을 2 mL 밀링 튜브에 담은 후, 로티고틴 파우더 100 mg, 지르코니아 비드 1 g을 가해주었다. 약 1 시간 가량 강하게 vortexing하여 섞어준 후 ZentriMix 380R (Andreas Hettich GmbH und Co KG, Tuttingen, Germany)을 이용하여 2,000 rpm, -10℃ 조건에서 1시간 30분 동안 밀링해주었다. 만들어진 제제들은 지르코니아 비드와 분리하여 4 mL scintillation vial에 담아 실온 보관하였다.
| Vehicle | Appearance | Particle size(nm) | Fraction solubility(mg/mL) |
| Castor oil | Very viscous, Homogeneous | 945.39 ± 19.24 | 27.20 ± 2.82 |
| Cottonseed oil | Viscous, Homogeneous | 831.02 ± 21.24 | 21.22 ± 0.23 |
| Soybean oil | Viscous, Homogeneous | 896.58 ± 44.58 | 22.36 ± 0.23 |
| Corn oil | Viscous, Homogeneous | 835.49 ± 38.36 | 22.94 ± 0.02 |
| Sesame oil | Viscous, Homogeneous | 878.27 ± 28.14 | 19.63 ± 0.04 |
| Peanut oil | Viscous, Homogeneous | 835.74 ± 16.19 | 20.80 ± 0.14 |
| Miglyol 810N | Flowable, Homogeneous | 724.25 ± 9.78 | 44.01 ± 0.41 |
| Miglyol 812N | Flowable, Homogeneous | 696.26 ± 32.45 | 45.89 ± 1.01 |
| Captex 355 | Flowable, Homogeneous | 714.66 ± 9.29 | 48.40 ± 0.09 |
| Captex 8000 | Flowable, Homogeneous | 3234.51 ± 576.40 | 48.60 ± 0.11 |
| a) The concentration of RG was set to 100 mg/mL, with milling speed of 2,000 rpm for 1.5 h. b) Data are expressed as mean ± SD (n=3) c) Measured by randomly selecting 100 particles from the light microscope images. |
|||
RG-OS 제조를 위해 입자 크기 조절 분석이 필요하였고, 입자 크기 조절을 위한 변수는 밀링 속도와 밀링 시간이었고, 이를 도 2에 나타내었다. 전체적으로 밀링 속도가 강해질수록, 밀링 시간이 길수록 입자 크기가 작아지는 양상을 보였고, 비교적 균질하면서도, syringeability와 injectability를 고려하여 3 μm 보다 작은 조건에서, RG-AS 제제와 입자 크기를 유사하게 맞추기 위해 밀링 속도는 2,000 rpm, 밀링 시간은 1시간 30분으로 RG-OS를 제조하기로 결정하였다.
<실험예 1> 제조 후 형태학적 및 물리화학적 특성 평가
하기 실험예들에서 각 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 Student’s t-test를 사용하여 분석하였고, p＜0.05에서 유의한 것으로 간주하였다.
1-1. 로티고틴의 함량 평가
로티고틴의 함량 분석은 Shimadzu HPLC(LC-20AD, SIL-20AC, SPD-20A, CBM-20A, CTO-20AC)에 C18 column (4.6 mm X 150 mm, 5 μm, Phenomenex)를 사용하여 isocratic분석하였다. 이동상은 Phosphate buffer(10 mM, pH 5.5, 0.2 v/v% triethylamine) : Methanol = 3 : 7 (v:v) 비율로 제조하였다. 컬럼 오븐의 온도는 40℃, 유속은 1.0 mL/min으로 하였고, 분석 파장은 225 nm에서 확인하였다.
1-1-1. 로티고틴 수성현탁제 조성물(RG-AS)의 현탁량 및 용해량 평가
RG-AS에 현탁 및 용해된 RG의 함량은 상기 1-1의 함량 평가 방법을 통해 분석하였다. RG-AS의 RG 총량을 평가하기 위해 제제 1 mL을 메탄올 9 mL로 희석하고 13,000 rpm으로 10 분동안 원심 분리하였다. 상층액을 이동상으로 100 배 희석하
여 분석하였다. 수성현탁 입자에 용해된 로티고틴의 양을 평가하기 위해 제제 1 mL을 13,000 rpm으로 10분 동안 원심 분리한 후, 상층액을 이동상으로 2 배 희석하여 분석하였다. RG-AS에서 로티고틴의 현탁량은 로티고틴 총량에서 용해된 로티고틴의 양을 뺀 값으로 추정하였다.
1-1-2. 로티고틴 유성현탁제 조성물(RG-OS)의 현탁량 및 용해량 평가
RG-OS에 현탁 및 용해된 로티고틴의 함량은 상기 1-1의 함량 평가 방법을 통해 분석하였다. RG-OS의 로티고틴 총량을 평가하기 위해 제제 1 mL을 Hexane : 2-propanol = 9 : 1 (v:v) 용액 9 mL로 희석한 후 이동상으로 10배 희석하였다. 10 분간 vortexer를 이용하여 강하게 혼합한 후 13,000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 걷어내고 하층액을 이동상으로 10배 희석하여 분석하였다. 유성현탁 입자에 용해된 로티고틴의 양을 평가하기 위해 제제 1 mL을 13,000 rpm으로 10분동안 원심 분리하였다. 상층액을 50 μL를 Hexane : 2-propanol = 9 : 1 (v:v) 용액 950 μL로 희석한 후 10분간 vortexer를 이용하여 강하게 혼합하였다. 혼합된 용액을 13,000 rpm으로 10 분간 원심 분리한 후 상층액을 걷어내고 하층액을 이동상으로 10배 희석하여 분석하였다. RG-OS에서 로티고틴의 현탁량은 로티고틴 총량에서 용해된 로티고틴의 양을 뺀 값으로 추정하였다.
1-2. RG drug suspensions의 현탁 입자 크기 및 zeta potential
RG-AS의 현탁 입자 크기와 zeta potential은 Zetasizer(Nano®, Malvern Instrument, Worcestershire, UK)로 25℃에서 분석하였다. 현탁 입자 크기 측정을 위해 RG-AS를 D.W.로 80배 희석하여 disposable cuvette cell에 약 800 μL를 채우고 분석하였다. 현탁 입자의 zeta potential 측정을 위해 RG-AS를 D.W.로 80 배 희석하여 capillary cell에 채우고 분석하였다. 현탁 입자 크기 측정과 zeta potential 모두 샘플 당 3 회씩 분석하였다.
RG-OS의 현탁 입자 크기는 광학현미경 (Eclipse 80i, NIKON, Tokyo, Japan)을 이용하여 직접 측정하였다. 별도의 전처리 없이 제제 2 μL를 slide glass에 적가한 후 접안 렌즈 (CFI 10x/22)와 대물 렌즈 (Plan Apo 40x/0.95 DIC M/N2)를 이용하여 400 배율의 이미지를 디지털 카메라(DS-Ri1)를 통해 얻었다. 무작위적으로 입자 100개를 선정하고 장축의 길이를 측정하였다. 제제당 3 번씩 측정하여 평균과 편차를 계산하였다.
RG-AS는 로티고틴의 농도가 100.93 mg/mL, 용해량은 0.07 mg/mL로 로티고틴 입자 대부분이 현탁이 되어 있는 것으로 판단하였다. RG-OS는 로티고틴의 농도가 100.76 mg/mL, 용해량은 19.63 mg/mL로, RG-AS와 비교하였을 때, 용해량이 비교적 높지만, 전체적으론 80% 이상이 현탁되어 있는 약물 현탁액으로 판단하였다.
RG-OS의 평균 입자 크기는 878.3 nm, 편차는 384.5 nm, RG-AS의 평균 입자 크기는 853.7 nm, 편차는 0.14 nm로 평가되었다. RG-AS와 RG-OS의 입도는 Student’s t-test를 통해 통계적 유의성을 평가하였고, 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p≥0.05).
1-3. 로티고틴 결정(RG crystal) 형태학적 특성 평가
수성현탁 입자, 유성현탁 입자에 분산시킨 약물 입자의 형태학적 특성은 Cryo-Field emission transmission electron microscope (Cryo-TEM, Glacios, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)로 각각 평가하였다. 샘플 제작을 위해 Vitrobot (Mark IV, FEI, 196 Hillsboro, OR, USA)을 사용하였으며, Cu grid에 RG-AS, RG-OS를 약 2 μL 적가한 후, blotting 과정을 통해 샘플을 얇게 하였다. 그 다음 샘플을 액체 질소를 사용하여 냉각하였다. 냉각된 샘플을 고정대에 고정하고 200 kV의 가속전압에서 관찰하였다.
RG-AS, RG-OS의 형태학적 특성은 Cryo-TEM으로 관찰하여 도 3에 나타내었다. 도 3A를 참고하면, RG-AS는 불규칙적인 직사각형의 형태를 가지는 것을 알 수 있고, 도 3B를 참고하면, RG-OS 또한 불규칙적인 직사각형의 형태를 가지는 것을 알 수 있다. 따라서, RG-OS와 RG-AS의 현탁 약물 입자의 형태는 유사한 것으로 판단하였다.
1-4. 시차 주사 열량분석 평가 (Differential scanning calorimetry, DSC)
수성현탁 입자 및 유성현탁 입자에 분산시킨 로티고틴 입자의 열적 거동을 평가하기 위하여 Differential scanning calorimeter(DSC, Thermo plus EVO2, Rigaku, Japan)을 사용하였다. 로티고틴 powder, 수성현탁 입자, 유성현탁 입자도 함께 평가하였으며, 별도의 전처리 없이 평가하였다. 수성현탁 입자와 유성현탁 입자에 분산되어 있는 로티고틴 입자를 분석하기 위해 RG-AS와 RG-OS 제제를 13,000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하여 로티고틴 입자를 침전시켰다. 침전된 로티고틴 입자를 스테인리스 접시에 옮긴 후, 후드에서 24시간 정도 건조하여 로티고틴 입자를 수득하였다. 각각의 샘플 약 2 mg을 Tzero™ 팬과 뚜껑으로 밀봉하고, 0℃에서 200℃까지 10℃/min의 속도로 점진적으로 가열하여 평가하였다.
도 4는 입자의 결정성을 확인하기 위한, DSC 평가 결과이다. 도 4를 참고하면, 로티고틴 원재료는 99 ℃에서 흡열성 피크가 나타났다. RG-AS도 마찬가지로 99 ℃에서 피크가 나타났고, RG-OS는 85 ℃에서 피크가 넓게 나타났다.
1-5. X선 회절 분석 평가 (X-ray diffraction, XRD)
수성현탁 입자 및 유성현탁 입자에 분산시킨 로티고틴 입자의 결정성을 평가하기 위하여 X-ray diffractometer (Ultima IV, Rigaku, Japan)을 사용하였다. 로티고틴 powder, 수성현탁 입자, 유성현탁 입자도 함께 평가하였으며, 별도의 전처리 없이 평가하였다. 수성현탁 입자와 유성현탁 입자에 분산되어 있는 로티고틴 입자를 분석하기 위해 RG-AS와 RG-OS 제제를 13,000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하여 로티고틴 입자를 침전시켰다. 침전된 로티고틴 입자를 스테인리스 접시에 옮긴 후, 후드에서 24시간 정도 건조하여 로티고틴 입자를 수득하였다. 각각의 샘플은 접시에 넘치지 않게 담아 분석하였다. Diffraction pattern은 0.02˚ 의 step size, 2 s/step scanning speed 조건으로 5˚ 에서 40˚ 범위에서 평가하였다.
도 5는 입자의 결정성을 확인하기 위한 XRD 평가 결과이다. 도 5를 참고하면, 로티고틴 원재료는 12˚, 13.5˚, 17˚, 17.6˚, 18.9˚, 20.3˚, 21.8˚, 22.7˚에서 뚜렷한 피크가 관찰되었다. 수성현탁 입자, 유성현탁 입자에서는 어떠한 피크도 관찰되지 않았다. 로티고틴 원재료와 로티고틴 약물 현탁액에 현탁이 되어 있는 약물 입자는 모두 결정형을 가지며, 비드밀(bead-milling) 방식을 진행하여도 결정성은 유지됨을 확인하였다.
1-6. 점도 평가 (Viscosity)
로티고틴 약물 현탁액의 겉보기 점도를 평가하기 위하여 Rotational rheometer (ARES-G2, TA instrument Ltd., DE, USA)를 사용하였다. 약 2 g의로티고틴 약물 현탁액을 40 mm의 하판에 적가하고, 위아래의 판 간격을 1 mm로 하였다. 온도는 25 ℃ 조건에서 진행하였고, 하판이 회전하면서 torque를 측정하였다. 전단 속도는 10∼1000 s-1에서 평가하였다. 각 측정마다의 허용오차는 5%로 설정하였다.
RG-AS와 RG-OS의 겉보기 점도는 rotational rheometer를 사용하여 측정하였고, 이를 도 6에 나타내었다. 도 6을 참고하면, Shear rate 10 s-1에서의 점도는 각각 73.85, 338.43 centipoise(cP), shear rate 100 s-1에서의 점도는 각각 6.91, 150.98 centipoise(cP), shear rate 1000 s-1에서의 점도는 각각 3.77, 105.68 centipoise(cP)로 측정되었다. 두 제제 모두 shear rate가 증가할수록 점도가 낮아져 유사소성 유체로 판단하였다. RG-AS와 RG-AS 모두 shear rate가 증가하여도 점도가 낮아지기 때문에 injectability 면에서 허용 가능하다고 판단하였다. 점도 측정 결과를 바탕으로 26 gauge 1 mL BD syringe로 충전 및 투여하였을 때, 어려움없이 진행 가능하였다.
| Parameters | RG-AS | RG-OS |
| RG conc.(mg/mL) a) | 100.93 ± 0.09 | 100.76 ± 0.53 |
| suspended(mg/mL) | 100.86 ± 0.09 | 81.13 ± 0.53 |
| Dissoved(mg/mL) | 0.07 ± 0.00 | 19.63 ± 0.04 |
| Particle size(nm) a) | 853.7 ± 19.9 b) | 878.3 ± 28.1 c) |
| Homogeneity a) | 0.14 ± 0.02 d) | 384.45 ± 67.95 c) |
| Zeta potential(mV) | -39.97 ± 1.46 a) | N.D. e) |
| Viscosity(cP) a,f) | 73.85 | 338.43 |
| a) Data are expressed as mean ± SD (n=3) b) Indicates the mean hydrodynamic size determined using dynamic light scattering measurement technology (Zetasizer Nano® Instruments). c) Measured by randomly selecting 100 particles from the light microscope images. d) Polydispersity index, Calculated by dividing the square of the standard deviation by the mean particle diameter. e) Not determined. f) Determined at 25℃ with shear rate of 10 s-1. |
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<실험예 2> 로티고틴 약물 현탁액의
in vitro
dissolution 평가
RG-OS, RG-AS에서 로티고틴 입자의 용출은 dialysis tube method를 이용하여 진행되었다. 용출 용매로 인산염완충용액(pH 7.4) : 2-propanol = 60 : 40 (v:v) 용액을 사용하였으며 로티고틴 20 mg을 포함한 약 200 μL의 약물 현탁액과 용출 용매 800 μL를 dialysis membrane이 포함된 Float-A-Lyzer® (50 kDa MWCO, Spectrum Lab, CA, USA)에 적가하였다. 제제가 탑재된 Float-A-Lyzer®를 용출 용매 199 mL이 담긴 비커에 위치시키고 37 ± 0.5℃에서 250 rpm의 교반 조건으로 용출 평가를 진행하였다. 정해진 시점에 용출 용매 1 mL을 취하여 13,000 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 상층액 500 μL를 HPLC 이동상으로 2배 희석하여 3.1.의 HPLC 분석 방법으로 평가하였다. 하층액 500 μL는 예열된 용출 용매 500 μL와 잘 혼화시킨 후 다시 비커에 적가하였다.
도 7은 로티고틴 약물 현탁액의 in vitro dissolution 평가 결과이다. 도 7을 참고하면, RG-AS는 24 시간 동안 52%의 약물이 방출되었고, 48시간 동안은 약물이 90% 이상이 방출되었다. RG-OS는 RG-AS에 비해 용출이 약간 천천히 진행되었는데, 24 시간 동안 42%의 약물이 방출되었고, 48 시간 동안 69%, 72 시간 동안 82%, 그리고 96 시간이 지난 시점에서 90% 이상이 방출되었다.
<실험예 3> 로티고틴 약물 현탁액의
in vivo
약동학적(pharmacokinetics; PK) 평가
RG-OS와 RG-AS의 시간에 따른 혈중 농도를 평가하였다. 6주령의 수컷 Sprague-Dawley rats (250 ± 20 g)을 통해 실험이 진행되었으며, PK 평가를 위해 두 집단(RG-OS, RG-AS)으로 분리하였다(n=5). rats은 상온, 상대 습도 50 ± 5% 조건에서 사료와 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 사육하였다.
3일간의 순화기간 후, rats의 back scruff SC 부위에 로티고틴으로서 75 mg/kg의 제제를 26 gauge의 1 mL BD syringe를 통해 투여하였다. 정해진 시점에 heparin (20 IU/mL) 처리된 26 gauge의 1 mL BD syringe를 통해 경정맥에서 혈액 샘플을 얻었으며, 채취한 혈액은 13,000 rpm의 조건으로 10 분간 원심 분리하여 혈장 샘플만을 얻었다. 채취한 혈장 샘플은 분석 전까지 -80℃ 조건의 deep freezer에서 보관하였다.
혈중 로티고틴의 농도는 Shimadzu LCMS 8060에 Waters Atlantis HILIC Silica column (2.1 X 150 mm, 3μm)를 사용하여 분석하였다. 이동상 A는 D.W. (2 mM ammonium formate, 0.1% formic acid), 이동상 B는 acetonitrile (0.1% formic acid)를 15 : 85 (v:v) 비율로 사용하였다. 컬럼 오븐의 온도는 40℃, 유속은 0.25 mL/min, 분석 시간은 8분, 샘플 주입량은 5 μL로 하였다. 질량분석기는 Electrospray ionization (ESI)가 사용되었고, RG의 정량을 위해 mass scan mode는 multiple reaction monitoring (MRM)를 사용하였으며, 양이온 모드에서 관찰하였다. 기기 조건은 Interface temperature : 150℃, DL temperature : 250℃, heating block temperature : 200℃으로 하였다.
곡선하 면적 (AUC0-21days), 최고 혈중 농도 (Cmax), 최고 혈중 농도 까지의 도달 시간 (Tmax), 혈중 반감기 (T1/2)로 나타낼 수 있는 PK 파라미터는 BA Calc 2007 약동학 분석프로그램 (식약처, 오송)의 선형 사다리꼴 규칙을 사용하여 추정하였다.
로티고틴을 피하 투여 후의 로티고틴 concentration-time profile을 도 8에, 약동학적 파라미터를 하기 표 4에 나타내었다. RG-AS와 RG-OS는 각각 0.28, 0.43 day에 최고 혈중 농도 (Cmax)에 도달하였다. 최고 혈중 농도까지 도달한 시간 (Tmax)는 두 제제가 유사하였지만, 최고 혈중 농도는 RG-AS, RG-OS 각각 61.51, 103.43 ng/mL로 1.7배의 차이를 보였고, RG-AS는 Cmax에 도달한 이후, 완만하게 혈중 농도가 감소하였지만, RG-OS는 급격하게 감소하였다. 4 일차에 RG-AS, RG-OS의 혈중 농도는 각각 4.39, 0.59 ng/mL로 큰 차이를 보였다. 4일 이후에 RG-OS의 로티고틴의 혈중 농도는 below limit of quantitation (BLOQ)로서 정량이 불가능하여, 방출이 끝난 것으로 판단하였다.
반면, RG-AS는 4일 이후에도 로티고틴이 혈중에서 지속적으로 검출이 되었고, 21 일차에 0.52 ng/mL 농도로 검출이 되었다. 21일 이후에 RG-AS의 로티고틴의 혈중 농도는 below limit of quantitation(BLOQ)로서, 정량이 불가능하여, 방출이 끝난 것으로 판단하였다. RG-AS, RG-OS의 Cmax로부터 절반의 농도까지 도달하는 데에 걸리는 시간(T1/2)은 각각 0.76, 0.54 days였다. 약물의 총 노출 정도를 나타내는 parameter인 area under the curve (AUC)는 RG-AS, RG-OS 각각 95.09, 104.27 ng·day/mL로 큰 차이를 보이지 않았다.
| Formulation | RG-AS | RG-OS |
| AUC(0-21days)(ng·day/mL) | 95.09 ± 6.41 | 104.27 ± 28.02 |
| Cmax(ng/mL) | 61.51 ± 12.10 | 103.43 ± 22.69* |
| Tmax(day) | 0.28 ± 0.13 | 0.43 ± 0.15 |
| T1/2(day) a) | 0.76 ± 0.28 | 0.54 ± 0.18 |
| a) Time required for the plasma concentration of RG to decrease to half of the Cmax. Notes: Data are expressed as mean ± SD (n=5). Significant different from RG-AS (* p<0.05) by student’s t-test. |
||
<실험예 4> 투여 부위에서의 로티고틴 약물 현탁액의 거동 평가
6주령의 수컷 Sprague-Dawley rats(250 ± 20 g)을 통해 실험이 진행되었으며, rats은 상온, 상대 습도 50 ± 5% 조건에서 사료와 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 사육하였다.
RG-AS와 RG-OS의 투여 부위에서의 거동을 평가하기 위하여 각각의 제제를 trypan blue (0.02 w/v%), Sudan Ⅲ (0.1 w/v%)로 염색하였다. RG로서 7.5 mg을 포함한 각각의 염색한 제제를 back scruff SC 부위에 26 gauge 1 mL BD syringe를 통해 투여하였고, 투여 후 30분, 4일차에 조직을 적출하였다. 적출된 조직을 10 v/v% neutral buffered formalin에서 4℃, 48 시간 조건으로 고정하였다. 고정이 끝난 조직을 1x phosphate buffered saline 용액으로 washing한 후, 1x 인산염완충용액(30 w/v% Sucrose)에 4℃, 48 시간 조건으로 조직을 잠기게 하였다. 그 다음, 조직의 물기를 제거한 후, cryomold에서 OCT compounds 안에 조직을 잠기게 하였다. CRYOSTAT cryocut microtome (CM3050S, Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 조직이 담겨있는 cryomold를 -28℃ 조건으로 동결시켜 OCT block을 제조하였고, 25 μm의 두께로 잘라 나가며 조직 내 약물의 거동을 육안으로 관찰하여 도 9에 나타내었다.
도 9를 참고하면, RG-AS는 투여 후 30 분에 약물 응집체가 관찰되었고, 넓게 퍼지지 않고 투여 부위에 뭉쳐 있는 것으로 확인되었다. 반면에, RG-OS는 30분 차에 뚜렷한 약물 응집체가 관찰되지 않았고, RG-AS에 비해 넓게 퍼져 있으며, 주변의 혈관을 따라 제제가 이행되어 있는 것으로 확인되었다. 또한, 4일 차에 RG-AS는 약물 응집체와 fibrous matrix가 관찰되었다. 반면, RG-OS는 4일 차에 oil vehicle만 잔존하여 있고, 약물 입자가 보이지 않았으며, fibrous matrix가 보이지 않았다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
Claims (11)
- 분산화제 및 항산화제를 수용매에 용해시키는 제1단계; 및
상기 제조한 수용매에 로티고틴 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 적가한 후, 분쇄시키는 제2단계;를 포함하는, 로티고틴 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물의 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 분산화제는 Na. CMC, Tween 80, Kolliphor RH 40 및 Kolliphor EL로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 로티고틴의 수성현탁 주사용 조성물의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 Na. CMC의 농도는 0.5 mg/mL 내지 2 mg/mL인 것을 특징으로 하는, 로티고틴의 수성현탁 주사용 조성물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항산화제는 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfite), 아황산나트륨(sodium sulfite), 아황산수소나트륨(sodium bisulfite), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 시스테인(cysteine) 및 토코페롤(tocopherol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 로티고틴의 수성현탁 주사용 조성물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2단계에서 분쇄시키는 단계는 비드밀(bead mill) 방식으로 500∼1500 rpm, 30분∼2시간 동안 진행되는 것을 특징으로 하는, 로티고틴의 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물의 제조방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 로티고틴의 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 조성물은 로티고틴 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 100 중량부에 대하여 1∼10 중량부의 분산화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 로티고틴의 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 조성물의 평균 입자 직경은 300∼500 nm인 것을 특징으로 하는 로티고틴의 장기지속성 수성현탁 주사용 조성물.
- 제6항에 따른 조성물과 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 제제.
- 제9항에 있어서, 상기 제제는 경구 투여에 적합한 제제.
- 제9항에 있어서, 상기 제제는 펠렛, 산제, 과립제, 건조시럽제, 정제 및 캡슐제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 제제.
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-
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