KR20240040111A - 선택적 관용화 - 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생성하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이식 전에 투여시 이식조직(transplant)의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키는 상기 기술된 방법에 의해 얻어진 환자-특이적 관용성 수지상 세포(patient-specific tolerogenic dendritic cells)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 염증성 질환 예를 들어 이식편대숙주 질환(graft-versus-host disease)을 감소시키거나 또는 예방하는 데 사용하기 위한 환자-특이적 관용성 수지상 세포에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 방법은 이식편대숙주 질환을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 관용성 수지상 세포는 또한 자가면역 질환의 치료에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 관용성 수지상 세포(tolerogenic dendritic cells)를 선택적으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 관용성 수지상 세포를 생성함으로써 이식 전에 이식조직(transplant)의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 기술된 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포를 포함하는 관용성 수지상 세포에 관한 것이다. 상기 관용성 수지상 세포는 이식 전에 투여시 이식조직의 면역원성을 감소시킨다. 본 발명은 또한 염증성 질환 예를 들어 이식편대숙주 질환(graft-versus-host disease) 및/또는 자가면역 질환(autoimmune diseases)의 감소 또는 예방에 사용하기 위한 관용성 수지상 세포에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 관용성 수지상 세포는 이식편대숙주 질환을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
유전적으로 구별되는 한 사람(공여자(donor))으로부터 다른 사람(수용자(recipient))으로의 장기, 조직 또는 세포의 이식은 여러 질환에 대한 확정적인 치료법으로 남아 있지만 장기 및 공여자 이용가능성에 의해 제한된다. 적합한 공여자는 주조직 적합성 항원(major histocompatibility antigens; MHC) 또는 HLA 항원으로 알려진 세포-표면 항원(cellsurface antigens)의 동일 또는 거의 동일한 프로파일을 갖는 개체이다. 그러나, 동일한 개체의 이식조직(자가유래 이식조직(autologous transplant) 또는 자가이식편(autograft))은 항상 이용가능하지는 않으며, 다른 개체의 이식(동종이계 이식조직(allogeneic transplant) 또는 동종 이식편(allograft))의 광범위한 적용은 MHC 또는 HLA 항원의 차이에 의해 제한된다. HLA 항원 각각의 다수의 대안적 형태(대립유전자)가 있으며, 밀접하게 HLA-매칭된 무관한 두 개체의 가능성은 매우 적다. 유전적으로 구별되는 하나의 개체로부터 다른 개체로의 장기 또는 조직의 이식 후의 유해 반응은 심각하게 위험할 수 있다. 일차적인 유해 반응은 이식된 장기 또는 조직의 면역학적 거부반응(rejection)이다. 이는 이식조직(transplant)을 공격하는 수용자(장기, 피부 등)의 면역 체계에 의해 야기될 수 있다. 또한, 상기 이식조직은 수용자를 공격할 수도 있다(GvHD). 거부반응을 예방 또는 제한하기 위해, 환자는 통상적으로 면역억제 약물들의 조합물을 투여 받는다. 이들 약물은 일반적으로 전세계적으로 면역억제성(immunosuppressive)이어서, 중증 감염에 대한 수용자의 감수성을 크게 증가시킨다. 이러한 부작용은 이식된 조직의 거부반응을 보다 선택적으로 억제할 수 있는 치료법의 탐색을 고무하는 반면, 나머지 면역 체계는 온전하고 다른 중요한 장기를 침범하지 못하게 한다. 이식된 장기의 거부반응을 역전시키는 하나의 접근법으로 체외 광성분 채취술(Extracorporeal Photopheresis; ECP), 8-MOP와 같은 DNA-가교제(DNA-crosslinking agent)로 혈액을 처리하는 방법, 및 UV 광을 적용시켜 왔다. 이식편대숙주 질환(graft versus host disease; GvHD)의 치료에서 ECP의 긍정적인 효과를 설명할 수 있는 한 가지 가능한 메커니즘은 혈액 샘플에 포함된 단핵구가 8-MOP과 UV 광의 조합에 노출되면 면역-억제성 수지상 세포로 분화하게 되는 것이다. 이러한 면역-억제성 수지상 세포는 면역 관용(immune tolerance)을 촉진하는 것으로 추정된다. 그러나, 적합한 공여자의 풀(pool)을 증가시키고, 치료를 진행하고/하거나 자가면역 질환, 특히 이식편대숙주 질환을 예방하기 위해 동종이계 이식조직의 선택적 관용화를 개선하고, ECP 및 ECP 유사 과정의 면역억제 효과를 뒷받침할 수 있는 메커니즘을 추가로 해독하는 것은 큰 가치가 될 것이다.
본 발명의 하나의 목적은 관용성 수지상 세포(tolerogenic dendritic cells)를 선택적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 다른 목적은 항원 특이적 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 이식 전에 이식조직의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키는 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생체외 관용성 수지상 세포를 포함하는 관용성 수지상 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GvHD을 예방하거나 또는 감소시키는 데 사용하기 위한 관용성 수지상 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 장기 이식조직(organ transplants), 예를 들어 피부의 거부반응(rejection)을 예방 또는 감소시키는 데 사용하기 위한 관용성 수지상 세포를 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 GvHD를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 관용성 수지상 세포를 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
하기 설명으로부터 명백해지는 바와 같은 이들 및 다른 목적은 독립 청구항의 주제에 의해 해결된다. 본 발명의 바람직한 구현예 중 일부는 종속 청구항의 주제를 형성한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 하기 설명으로부터 취해질 수 있다.
하기에서 예시적으로 설명되는 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들) 또는 제한(들)의 부재 시에도 적절하게 실시될 수 있다.
본 발명은 하기의 특정 구현예 및 특정 도면을 참조로 하여 설명되지만, 본 발명은 이에 제한되지 않고 청구항에 의해서만 제한된다.
본 발명은 이하에 제시된 데이터 및 임상 시험에 어느 정도 기반을 두고 있으며, 이는 세포사멸성 수지상 세포(apoptotic dendritic cell)가 건강한 수지상 세포에 의해 흡수될 경우, 상기 세포사멸성 수지상 세포는 동종이계 이식조직에 대해 장래 이식조직 수용자(recipient)의 면역 체계를 관용할 수 있다는 통찰로 이어진다. 놀랍게도, 본 발명자들은 상기 세포사멸성 수지상 세포가 공여자(donor) 또는 장래 수용자(recipient)로부터 유래될 수 있음을 발견하였다. 또한, 세포사멸성 수지상 세포가 공여자로부터 유래되는 경우, 상기 공여자는 장래 수용자에 대해 HLA 매칭되거나 미스매칭될 수 있다.
바람직하게는, ECP 유래 과정에서 본 발명의 맥락에서 건강한 수지상 세포는 시험관 내에서 생산된다. 본 발명자들은 단핵구(monocytes) 및 혈소판을 함유하는 백혈구가 플레이트(plate)를 통과할 때 효율적으로 수지상 세포를 생성될 수 있음을 관찰하였다. 그러나, 혈액 샘플은 적어도 단핵구를 함유하여야 한다. 단핵구는 전단 응력(shear stress)의 적용시 건강한 수지상 세포로 성숙되는 것으로 밝혀졌다. 혈소판이 존재하는 경우, 성숙 과정(maturation process)이 개선될 수 있다. 중요하게는, 고가의 사이토카인 칵테일을 부가할 필요 없이 상기 방법을 이용하여 단핵구가 건강한 수지상 세포로 성숙될 수 있다. 상기 과정은 생체 내에서 일어나는 것으로 추정되는 측면 중의 일부를 모방한 것으로 보이며(문헌 [Han 등, 2020, "Platelet P-selectin initiates cross-presentation and dendritic cell differentiation in blood monocytes", Science Advances] 참조), 하기에서는 플레이트에 의해 생성된 수지상 세포는 "생리학적 수지상 세포(physiological dendritic cells; phDC)"라고 한다.
따라서, 이식조직 공여자(transplant donor) 또는 장래 수용자로부터 유래된 세포사멸성 수지상 세포는 상기 장래 수용자로부터 phDC에 항원 공급원(antigen source)을 제공함으로써 효율적인 관용성 면역 반응을 개시한다고 가정한다. 본 발명은 phDC와 직접 접촉하는 세포사멸성 수지상 세포를 가져옴으로써 이 과정을 용이하게 하고 향상시킨다. 직접 인큐베이션(direct incubation)은 선택적으로 생산된 관용성 수지상 세포의 투여시 동종이계 이식조직(allogeneic transplant)에 대한 장래 수용자의 관용화를 향상시켜서 염증성 병태 예를 들어 GvHD를 감소시키거나 제거할 수 있게 한다. 본 발명의 phDC는 사이토카인 칵테일에 노출시키는 것과 같은 다른 방법으로 생산된 수지상 세포보다 효율적이다. 더욱이, phDC는 표준화되고 재현가능한 방식으로 생산될 수 있으므로, 강력한 관용성 수지상 세포를 생성하는 과정을 더 잘 제어할 수 있다. 또한, phDC는 자가면역 질환의 치료에 사용될 수 있다.
상기 관용성 수지상 세포의 선택적 생성은 제 1, 제 2, 및 제 3 측면과 같이 하기에서 기술되는 다른 방식으로 활용될 수 있다.
제 1
측면: 공여자 수지상 세포가
세포사멸성으로
되도록 하는 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법
제 1 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 공여자로부터 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 수용자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 공여자 수지상 세포를 단계 c)로부터의 생리학적 수용자 수지상 세포와 혼합하는 단계.
한 구현예에서, 상기 방법은 이식 전에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법은 이식 이전에 이식조직 또는 그의 일부의 면역원성을 선택적으로 감소시키기 위한 것이다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 동시에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 순차적으로 수행된다. 따라서, 상기 수용자로부터의 phDC는 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다. 한 구현예에서, 상기 수용자로부터의 phDC는 상기 방법 동안 임의의 시점에 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다.
한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 공여자로부터 얻어진다.
한 구현예에서, 단계 c)의 수지상 세포는 수용자로부터 얻어진다.
원칙적으로, 공여자로부터 수지상 세포가 얻어진 후 공여자 수지상 세포는 생존 가능하거나 생존 가능하지 않을 수 있다. 공여자 수지상 세포는 예를 들어 세포사멸성으로 될 수 있고, 단계 c)로부터 생리학적 수용자 수지상 세포와 혼합될 때까지 동결 저장될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 공여자는 동종이계(allogeneic)이다. 한 구현예에서, 상기 공여자는 하플로-공여자(haplo-donor)이다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 공여자로부터 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 수용자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 공여자 수지상 세포를 단계 c)로부터의 생리학적 수용자 수지상 세포와 혼합하는 단계, 및
d1) 단계 d)의 혼합물을 공동-인큐베이션하는 단계.
한 구현예에서, 상기 혼합물을 공-배양하는 단계 d1)은 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행된다.
한 구현예에서, 세포사멸성 공여자 수지상 세포를 상기 수용자로부터의 생리학적 수지상 세포를 혼합하는 단계 d)는 상기 수용자 내에서 일어난다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계는 동시에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계는 순차적으로 수행된다. 따라서, 상기 수용자로부터의 phDC는 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다.
상기 방법의 단계 b)에서, 방법 단계 a)에서 공여자로부터 얻어지는 수지상 세포는 세포사멸성 제제에 노출된다. 한 구현예에서, 상기 세포사멸성 제제는 프소랄렌(psoralens) 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트(riboflavin-phosphate) 및 UVA 및/또는 아미노레불린산(aminolevulinic acid) 및 광(light)을 포함한다. 특히 바람직한 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌(amotosalen)이다. 가장 바람직한 프소랄렌은 8-MOP이다. 세포사멸성 제제는 8-MOP와 UVA의 조합물이다.
바람직하게는, 구현예는 본질적으로 상기 공여자의 모든 수지상 세포가 상기 세포사멸성 제제와 접촉하도록 선택되어야 한다. 8-MOP/UVA의 경우, 본질적으로 상기 공여자의 모든 수지상 세포는 8-MOP와 접촉하여 UVA 광에 노출되어야 한다. 통상적인 8-MOP 및 UVA의 투여량은 100 ng/mL 내지 300 ng/mL의 8-MOP 농도와 조합하여 1 J/cm2 내지 3 J/cm2 UVA이다.
바람직한 구현예에서, UVA의 투여량은 3 J/cm2 이하, 2 J/cm2 이하, 또는 1 J/cm2 이하이다. 다른 바람직한 구현예에서, 8-MOP의 투여량은 300 ng/mL, 250 ng/mL, 200 ng/mL 또는 100 ng/mL 이하이다. 특히 바람직한 구현예에서, 8-MOP의 투여량은 200 ng/mL이고, UVA의 투여량은 1 J/cm2이다.
본 발명의 맥락에서, 수지상 세포는 특히 체외 광성분 채취술(ECP) 유래 과정을 이용하여 단핵구의 플레이트-통과에 의해서 얻어질 수 있다.
단핵구의 체외 활성화 및 그로부터의 수지상 세포의 생성 방법 및 장치는 WO2014/106629 A1, WO2014/106631 A1, WO2016/001405 A1, 및 WO2017/005700 A1에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. ECP는 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 유래된 단핵구를 기계적 응력(예를 들어 전단력) 및 혈장 성분(예를 들어 혈소판) 또는 그의 유도체 또는 모방체(mimics)에 노출시키고, 그에 의해서 단핵구를 활성화시켜서 본원에서 phDC로도 지칭되는 건강한 생리학적 수지상 세포로 분화시키는 공정을 기재하고 있다. 단핵구의 phDC로의 분화를 포함하는 ECP 및 ECP 유래 공정은 대규모 ECP 장치, 예를 들어 임상 ECP 장치(예를 들어 THERAKOS®CELLEX® 장치), 또는 최소화된 ECP 장치, 예를 들어 WO2017/005700 A1에 기재된 바와 같은 트랜스면역화 플레이트; 또는 플라스틱 백(예를 들어 혈액, 혈액 성분, 세포 요법 등을 위한 플라스틱 백)에서 수행될 수 있다.
본 발명자들은, phDC가 정밀한 시험관내 실험실 조건 하에서 더 큰 재현성 및 제어성을 가지면서 생리학적으로 (사이토카인과 같은 약품의 필요 없이) 생성되기 때문에, 상기 방법에 의해 얻어진 phDC가 사이토카인과 같은 다른 다른 방법에 의해 얻어진 DC와 비교하여 유리하다는 것을 발견하였다.
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 수용자의 phDC는 혈액 샘플 또는 그의 분획을 장치의 유동 챔버에 통과시킴으로써 혈액 샘플에 함유된 단핵구를 전단력에 적용시킴으로써 얻어진다. 바람직하게는, 혈소판은 수용자의 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 유래되거나 별도로 제공될 수 있는 유동 챔버에 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 혈장 성분은 수용자의 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 유래되거나 별도로 제공될 수 있는 유동 챔버에 존재할 수 있다. 그러나, phDC의 생성은 혈소판 및/또는 혈장 성분의 부재 하에도 작용한다.
수용자의 단핵구는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 얻어질 수 있다. 혈액 샘플의 분획은 예를 들어 백혈구 및 혈소판을 포함하는 버피 코트(buffy coat)일 수 있다. 대안적으로, 상기 혈액 샘플의 분획은 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)일 수 있다. PBMC는 예를 들어 피콜-하이포크 구배(Ficoll-Hypaque gradient)(Isolymph, CTL Scientific)에 의한 원심분리를 이용하여 혈액 샘플로부터 단리될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 혈액 샘플의 분획은 정제된 또는 농축된 단핵구 제제일 수 있다. 단핵구는 예를 들어 플라스틱 부착물 중 1개, 2개 또는 3개 모두; CD14 자성 비드 양성 선택(예를 들어 Miltenyi Biotec); 및 단핵구 단리 키트 II(Miltenyi Biotec)를 사용하여 PBMC로부터 농축될 수 있다.
임의의 적합한 부피의 혈액이 사용될 수 있다. 혈액 샘플(예를 들어 분획이 유래되는 혈액 샘플)은 약 1 μL 내지 약 500 mL, 예를 들어 약 1 μL 내지 약 10 mL, 약 1 μL 내지 약 5 mL, 약 1 μL 내지 약 1 mL, 약 1 μL 내지 약 750 μL, 약 1 μL 내지 약 500 μL, 약 1 μL 내지 약 250 μL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 30 mL 내지 약 350 mL, 약 40 mL 내지 약 300 mL, 약 50 mL 내지 약 200 mL, 또는 약 50 mL 내지 약 100 mL일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 혈액 샘플 또는 그의 분획 또는 추가의 혈액 샘플 또는 그의 분획은 약 100 mL 이하(예를 들어 약 50 mL 내지 약 100 mL)이다.
일부 구현예에서, 상기 ECP 장치는 최소화된 ECP 장치, 예를 들어 트랜스면역(TI) 플레이트이다. 일부 구현예에서, 상기 ECP 장치는 플라스틱 백이다. 당업자는 phDC를 포함하는 수지상 세포를 단핵구와 구별하는 방법, 예를 들어 유전자 발현을 평가하는 방법을 잘 알고 있다.
과학적 이론에 구속되지 않으면서, 본 발명자들은 본 발명의 현저한 효과가 손상된 염색성 DC에 기인하는 것으로 추정되며, 특히 상기 수용자의 생리학적 DC에 항원을 그리고 상기 수용자의 면역 체계에 관용성 신호를 제공하는, 프소랄렌(psoralen)와 UVA(PUVA), 특히 8-MOP와 UVA의 조합물과 같은 세포사멸성 제제에 의해 손상된다. phDC가 동종이계인 PUVA-처리된 세포사멸성 DC로부터 이러한 관용성 신호를 받은 경우, 상기 phDC는 (수신된 관용성 신호에 더하여) 동종이계 PUVA-처리된 세포사멸성 DC로부터 항원을 그들의 표면에 표시할 수 있으며 그에 의해서 항원-특이적 관용성 반응을 유발할 수 있다. 이와 유사하게, 상기 항원의 공급원은 면역 세포 예를 들어 단핵구 또는 림프구로부터 유래될 수도 있다. 따라서, 항원 특이적 관용성 반응을 일으키기 위하여 면역 세포 예를 들어 단핵구 또는 림프구를 세포사멸시키고 phDC와 조합할 수 있다. 그러나, 손상된 DC 또는 단핵구와 같은 관련 전구세포가 바람직하다.
한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 공여자의 체외 혈액 샘플로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 공여자로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어진다. 따라서, 상기 공여자의 수지상 세포는 phDC일 수도 있다. 수용자와 관련하여 위에서 기술된 체외 혈액 샘플 및 PBMC의 제공에 관한 모든 구현예는 또한 공여자에게 적용된다.
한 구현예에서, 상기 수용자 및 공여자는 포유동물이다. 포유동물은 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 돼지, 개, 고양이, 말 및 설치류를 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 상기 수용자 및 공여자는 인간이다.
한 구현예에서, 상기 이식조직은 신장 이식조직, 췌장 이식조직, 간 이식조직, 심장 이식조직, 폐 이식조직, 장 이식조직, 피부 이식조직, 골수 이식조직 또는 줄기 세포 이식조직이다.
한 구현예에서, 상기 줄기 세포 이식조직은 조혈 줄기 세포 이식조직이다.
상기 모든 구현예는 시험관 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 조혈 줄기 세포 이식과 관련된 면역 결함의 치료를 위한 다른 치료법과 함께 적용될 수 있다.
제 1 측면의 하기 구현예에 있어서, 제 1 측면에 관한 상기 모든 구현예가 준용된다:
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 공여자로부터 얻어진 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
b) 단계 a)의 세포사멸성 공여자 수지상 세포를 수용자로부터 얻어진 생리학적 수지상 세포를 혼합하는 단계.
상기 구현예에서, 상기 구현예에 대해 추가로 기술되는 단계 d1)에 상응하는 공동-인큐베이션이 수행될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 동시에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 순차적으로 수행된다. 따라서, 상기 수용자로부터 얻어진 phDC는 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다. 한 구현예에서, 상기 수용자로부터의 phDC는 상기 방법 동안 세포사멸성 제제에 임의의 시점에도 노출되지 않는다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 공여자로부터 면역 세포, 바람직하게는 림프구를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 면역 세포, 바람직하게는 림프구를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 수용자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 면역 세포, 바람직하게는 세포사멸성 림프구를 단계 c)로부터의 생리학적 수용자 수지상 세포와 혼합하는 단계.
제 1 측면의 모든 구현예는 상기 구현예에 준용하여 적용된다(즉, 공여자로부터 얻어진 수지상 세포는 공여자로부터 얻어진 면역 세포, 바람직하게는 림프구로 대체됨).
상기 방법은 또한 수지상 세포 관련된 세포 예를 들어 세포사멸성으로 되는 단핵구에 기초하여 실시될 수 있다. 따라서, 또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 공여자로부터 단핵구를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 단핵구를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 수용자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 단핵구를 단계 c)로부터의 생리학적 수용자 수지상 세포와 혼합하는 단계.
제 1 측면의 모든 구현예는 상기 구현예에 준용하여 적용된다(즉, 공여자로부터 얻어진 수지상 세포는 공여자로부터 얻어진 단핵구에 의해 대체됨).
제 2
측면: 상보적
하플로
-공여자 수지상 세포(complimentary
haplo
-donor dendritic cells)가
세포사멸성으로
되도록 하는 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법
제 2 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 수용자의 하플로-공여자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포와 혼합하는 단계.
한 구현예에서, 상기 방법은 이식 전에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법은 이식 이전에 이식조직 또는 그의 일부에서 면역원성을 선택적으로 감소시키기 위한 것이다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 동시에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 순차적으로 수행된다. 따라서, 상기 수용자의 하플로-공여자로부터의 phDC는 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다. 한 구현예에서, 상기 수용자의 하플로-공여자로부터의 phDC는 상기 방법의 임의의 시점에 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다.
한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 얻어진다.
한 구현예에서, 단계 c)의 수지상 세포는 수용자의 하플로-공여자로부터 얻어진다.
원칙적으로, 상보적 하플로-공여자로부터 수지상 세포가 얻어진 후 상기 수지상 세포는 생존 가능하거나 생존 가능하지 않을 수 있다. 상보적 하플로-공여자 수지상 세포는 예를 들어 세포사멸성으로 될 수 있고, 단계 c)로부터 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포와 혼합될 때까지 동결 저장될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 수용자의 하플로-공여자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포와 혼합하는 단계, 및
d1) 단계 d)의 혼합물을 공동-인큐베이션하는 단계.
한 구현예에서, 상기 혼합물을 공-배양하는 단계 d1)은 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행된다.
한 구현예에서, 단계 b)의 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 수지상 세포를 상기 수용자로부터의 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포를 혼합하는 단계 d)는 상기 하플로-공여자 내에서 일어난다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계는 동시에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계는 순차적으로 수행된다. 따라서, 상기 수용자의 하플로-공여자로부터의 phDC는 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 수용자의 하플로-공여자로부터의 phDC는 상기 방법의 임의의 시점에서 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다.
상기 방법의 단계 b)에서, 방법 단계 a)에서 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 얻어지는 수지상 세포는 세포사멸성 제제에 노출된다. 한 구현예에서, 상기 세포사멸성 제제는 프소랄렌(psoralens) 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트(riboflavin-phosphate) 및 UVA 및/또는 아미노레불린산(aminolevulinic acid) 및 광(light)을 포함한다. 특히 바람직한 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌이다. 가장 바람직한 프소랄렌은 8-MOP이다. 세포사멸성 제제는 8-MOP와 UVA의 조합물이다.
바람직하게는, 구현예는 본질적으로 상기 수용자의 상보적 하플로-공여자의 모든 수지상 세포가 상기 세포사멸성 제제와 접촉하도록 선택되어야 한다. 8-MOP/UVA의 경우, 본질적으로 상기 수용자의 상보적 하플로-공여자의 모든 수지상 세포는 8-MOP와 접촉하여 UVA 광에 노출되어야 한다. 통상적인 8-MOP 및 UVA의 투여량은 100 ng/mL 내지 300 ng/mL의 8-MOP 농도와 조합하여 1 J/cm2 내지 3 J/cm2 UVA이다.
바람직한 구현예에서, UVA의 투여량은 3 J/cm2 이하, 2 J/cm2 이하, 또는 1 J/cm2 이하이다. 다른 바람직한 구현예에서, 8-MOP의 투여량은 300 ng/mL, 250 ng/mL, 200 ng/mL 또는 100 ng/mL 이하이다. 바람직한 구현예에서, 8-MOP의 투여량은 200 ng/mL이고, UVA의 투여량은 1 J/cm2이다.
제 1 측면과 관련하여 기술된 바와 같이, 본 발명의 맥락에서 수지상 세포는 특히 체외 광성분 채취술(ECP) 유래 과정을 이용하여 단핵구의 플레이트-통과에 의해 얻어져서, 단핵구를 활성화시켜 건강한 phDC로 분화시킬 수 있다. 제 1 측면에서 기술된 phDC의 생성과 관련된 모든 구현예는 제 2 측면에서의 phDC의 생성에도 적용된다.
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 하플로-공여자의 phDC는 혈액 샘플 또는 그의 분획을 장치의 유동 챔버에 통과시킴으로써 혈액 샘플에 함유된 단핵구를 전단력에 적용시킴으로써 얻어진다. 바람직하게는, 혈소판은 하플로-공여자의 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 유래되거나 별도로 제공될 수 있는 유동 챔버에 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 혈장 성분은 하플로-공여자의 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 유래되거나 별도로 제공될 수 있는 유동 챔버에 존재할 수 있다. 그러나, phDC의 생성은 혈소판 및/또는 혈장 성분의 부재 하에도 작용한다.
하플로-공여자의 단핵구는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 얻어질 수 있다. 혈액 샘플의 분획은 예를 들어 백혈구 및 혈소판을 포함하는 버피 코트(buffy coat)일 수 있다. 대안적으로, 상기 혈액 샘플의 분획은 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)일 수 있다. PBMC는 예를 들어 피콜-하이포크 구배(Ficoll-Hypaque gradient)(Isolymph, CTL Scientific)에 의한 원심분리를 이용하여 혈액 샘플로부터 단리될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 혈액 샘플의 분획은 정제된 또는 농축된 단핵구 제제일 수 있다. 단핵구는 예를 들어 플라스틱 부착물 중 1개, 2개 또는 3개 모두; CD14 자성 비드 양성 선택(예를 들어 Miltenyi Biotec); 및 단핵구 단리 키트 II(Miltenyi Biotec)를 사용하여 PBMC로부터 농축될 수 있다.
임의의 적합한 부피의 혈액이 사용될 수 있다. 혈액 샘플(예를 들어 분획이 유래되는 혈액 샘플)은 약 1 μL 내지 약 500 mL, 예를 들어 약 1 μL 내지 약 10 mL, 약 1 μL 내지 약 5 mL, 약 1 μL 내지 약 1 mL, 약 1 μL 내지 약 750 μL, 약 1 μL 내지 약 500 μL, 약 1 μL 내지 약 250 μL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 30 mL 내지 약 350 mL, 약 40 mL 내지 약 300 mL, 약 50 mL 내지 약 200 mL, 또는 약 50 mL 내지 약 100 mL일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 혈액 샘플 또는 그의 분획 또는 추가의 혈액 샘플 또는 그의 분획은 약 100 mL 이하(예를 들어 약 50 mL 내지 약 100 mL)이다.
일부 구현예에서, 상기 ECP 장치는 최소화된 ECP 장치, 예를 들어 트랜스면역(TI) 플레이트이다. 일부 구현예에서, 상기 ECP 장치는 플라스틱 백이다. 당업자는 phDC를 포함하는 수지상 세포를 단핵구와 구별하는 방법, 예를 들어 유전자 발현을 평가하는 방법을 잘 알고 있다.
과학적 이론에 구속되지 않으면서, 본 발명자들은 본 발명의 현저한 효과가 손상된 염색성 DC에 기인하는 것으로 추정되며, 특히 상기 하플로-공여자의 생리학적 DC에 항원을 그리고 상기 하플로-공여자의 면역 체계에 관용성 신호를 제공하는, 프소랄렌(psoralen)와 UVA(PUVA), 특히 8-MOP와 UVA의 조합물과 같은 세포사멸성 제제에 의해 손상된다. phDC가 상보적 하플로-공여자로부터의 PUVA-처리된 세포사멸성 DC로부터 이러한 관용성 신호를 받은 경우, 상기 phDC는 (관용성 신호를 받은 것 외에) PUVA-처리된 세포사멸성 DC로부터 항원을 그들의 표면에 표시하고 그에 의해서 하플로-공여자에서 항원-특이적 관용성 반응을 유발할 수 있다. 염증성 질환 예를 들어 GvHD는 수용자에게서 감소 또는 제거되어 제 2 측면에서 기술된 바와 같이 처리된 하플로-공여자로부터 이식조직을 받을 것이다. 이와 유사하게, 상기 항원의 공급원은 면역 세포 예를 들어 림프구 또는 단핵구로부터 유래될 수도 있다. 따라서, 항원 특이적 관용성 반응을 일으키기 위하여 면역 세포 예를 들어 림프구 또는 단핵구를 세포사멸시키고 하플로-공여자 phDC와 조합할 수 있다. 그러나, 손상된 DC 또는 단핵구와 같은 관련 전구세포가 바람직하다.
한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 수용자의 상보적 하플로-공여자의 체외 혈액 샘플로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어진다. 따라서, 상기 수용자의 상보적 하플로-공여자의 수지상 세포는 phDC일 수도 있다.
한 구현예에서, 상보적 하플로-공여자 및 하플로-공여자는 포유동물이다. 포유동물은 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 돼지, 개, 고양이, 말 및 설치류를 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 상기 상보적 하플로-공여자 및 하플로-공여자는 인간이다.
한 구현예에서, 상기 이식조직은 신장 이식조직, 췌장 이식조직, 간 이식조직, 심장 이식조직, 폐 이식조직, 장 이식조직, 피부 이식조직, 골수 이식조직 또는 줄기 세포 이식조직이다.
한 구현예에서, 상기 줄기 세포 이식조직은 조혈 줄기 세포 이식조직이다.
제 2 측면의 하기 구현예에 있어서, 제 1 및 제 2측면에 관한 상기 모든 구현예가 준용된다:
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 얻어진 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계; 및
b) 단계 a)의 세포사멸성 수용자의 상보적 하플로-공여자 수지상 세포를 상기 수용자의 하플로-공여자로부터 얻어진 생리학적 수지상 세포를 혼합하는 단계.
모든 방법 단계들은 시험관 내에서 수행될 수 있는 것으로 이해될 필요가 있다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 동시에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 순차적으로 수행된다. 따라서, 상기 수용자의 하플로-공여자로부터 얻어진 phDC는 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다. 한 구현예에서, 상기 수용자의 하플로-공여자로부터 얻어진 phDC는 상기 방법의 세포사멸성 제제에 임의의 시점에도 노출되지 않는다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 면역 세포, 바람직하게는 림프구를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 면역 세포, 바람직하게는 림프구를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 수용자의 하플로-공여자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 면역 세포, 바람직하게는 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 림프구를 단계 c)의 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포와 혼합하는 단계.
제 1 측면의 모든 구현예는 상기 구현예에 준용하여 적용된다(즉, 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 얻어진 수지상 세포는 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 얻어진 면역 세포, 바람직하게는 림프구로 대체됨).
상기 방법은 또한 수지상 세포 관련된 세포 예를 들어 세포사멸성으로 되는 단핵구에 기초하여 실시될 수 있다. 따라서, 또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 단핵구를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 단핵구를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 수용자의 하플로-공여자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 단핵구를 단계 c)의 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포와 혼합하는 단계.
제 1 측면의 모든 구현예는 상기 구현예에 준용하여 적용된다(즉, 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 얻어진 수지상 세포는 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 얻어진 단핵구에 의해 대체됨).
제 3
측면: 수용자 수지상 세포가
세포사멸성으로
되도록 하는 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법
제 3 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 수용자로부터 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 수용자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계.
한 구현예에서, 상기 방법은 이식 전에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법은 이식 이전에 이식조직 또는 그의 일부에서 면역원성을 선택적으로 감소시키기 위한 것이다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 동시에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 순차적으로 수행된다. 따라서, 상기 수용자(단계 c))로부터의 phDC는 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다. 한 구현예에서, 단계 c)의 상기 수용자로부터의 phDC는 상기 방법의 임의의 시점에 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다.
한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 수용자로부터 얻어진다.
한 구현예에서, 단계 c)의 수지상 세포는 상기 수용자로부터 얻어진다.
원칙적으로, 상기 공여자(단계 a))로부터 수지상 세포가 얻어진 후 상기 수지상 세포는 생존 가능하거나 생존 가능하지 않을 수 있다. 상기 수지상 세포는 예를 들어 세포사멸성으로 될 수 있고, 단계 c)로부터 생리학적 수용자 수지상 세포와 조합될 때까지 동결 저장될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 수용자로부터 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 수용자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계, 및
d1) 단계 d)의 혼합물을 공동-인큐베이션하는 단계.
한 구현예에서, 상기 혼합물을 공-배양하는 단계 d1)은 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행된다.
한 구현예에서, 세포사멸성 수용자 수지상 세포를 상기 수용자로부터의 생리학적 수지상 세포를 혼합하는 단계 d)는 상기 수용자 내에서 일어난다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계는 동시에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계는 순차적으로 수행된다. 따라서, 상기 수용자(단계 c))로부터의 phDC는 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다. 한 구현예에서, 단계 c)의 수용자로부터의 phDC는 상기 방법의 임의의 시점에서 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다.
상기 방법의 단계 b)에서, 방법 단계 a)에서 수용자로부터 얻어지는 수지상 세포는 세포사멸성 제제에 노출된다. 한 구현예에서, 상기 세포사멸성 제제는 프소랄렌(psoralens) 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트(riboflavin-phosphate) 및 UVA 및/또는 아미노레불린산(aminolevulinic acid) 및 광(light)을 포함한다. 특히 바람직한 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌이다. 가장 바람직한 프소랄렌은 8-MOP이다. 세포사멸성 제제는 8-MOP와 UVA의 조합물이다.
바람직하게는, 구현예는 본질적으로 상기 수용자의 모든 수지상 세포가 상기 세포사멸성 제제와 접촉하도록 선택되어야 한다. 8-MOP/UVA의 경우, 본질적으로 상기 수용자의 모든 수지상 세포는 8-MOP와 접촉하여 UVA 광에 노출되어야 한다. 통상적인 8-MOP 및 UVA의 투여량은 100 ng/mL 내지 300 ng/mL의 8-MOP 농도와 조합하여 1 J/cm2 내지 3 J/cm2 UVA이다.
바람직한 구현예에서, UVA의 투여량은 3 J/cm2 이하, 2 J/cm2 이하, 또는 1 J/cm2 이하이다. 다른 바람직한 구현예에서, 8-MOP의 투여량은 300 ng/mL, 250 ng/mL, 200 ng/mL 또는 100 ng/mL 이하이다. 바람직한 구현예에서, 8-MOP의 투여량은 200 ng/mL이고, UVA의 투여량은 1 J/cm2이다.
제 1 및 제 2 측면과 관련하여 기술된 바와 같이, 본 발명의 맥락에서 수지상 세포는 특히 체외 광성분 채취술(ECP) 유래 과정을 이용하여 단핵구의 플레이트-통과에 의해 얻어져서, 단핵구를 활성화시켜 건강한 phDC로 분화시킬 수 있다. 제 1 측면에서 기술된 phDC의 생성과 관련된 모든 구현예는 제 3 측면에 대한 phDC의 생성에도 적용된다.
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 수용자의 phDC는 혈액 샘플 또는 그의 분획을 장치의 유동 챔버에 통과시킴으로써 혈액 샘플에 함유된 단핵구를 전단력에 적용시킴으로써 얻어진다. 바람직하게는, 혈소판은 수용자의 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 유래되거나 별도로 제공될 수 있는 유동 챔버에 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 혈장 성분은 수용자의 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 유래되거나 별도로 제공될 수 있는 유동 챔버에 존재할 수 있다. 그러나, phDC의 생성은 혈소판 및/또는 혈장 성분의 부재 하에도 작용한다.
수용자의 단핵구는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 얻어질 수 있다. 혈액 샘플의 분획은 예를 들어 백혈구 및 혈소판을 포함하는 버피 코트(buffy coat)일 수 있다. 대안적으로, 상기 혈액 샘플의 분획은 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)일 수 있다. PBMC는 예를 들어 피콜-하이포크 구배(Ficoll-Hypaque gradient)(Isolymph, CTL Scientific)에 의한 원심분리를 이용하여 혈액 샘플로부터 단리될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 혈액 샘플의 분획은 정제된 또는 농축된 단핵구 제제일 수 있다. 단핵구는 예를 들어 플라스틱 부착물 중 1개, 2개 또는 3개 모두; CD14 자성 비드 양성 선택(예를 들어 Miltenyi Biotec); 및 단핵구 단리 키트 II(Miltenyi Biotec)를 사용하여 PBMC로부터 농축될 수 있다.
임의의 적합한 부피의 혈액이 사용될 수 있다. 혈액 샘플(예를 들어 분획이 유래되는 혈액 샘플)은 약 1 μL 내지 약 500 mL, 예를 들어 약 1 μL 내지 약 10 mL, 약 1 μL 내지 약 5 mL, 약 1 μL 내지 약 1 mL, 약 1 μL 내지 약 750 μL, 약 1 μL 내지 약 500 μL, 약 1 μL 내지 약 250 μL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 30 mL 내지 약 350 mL, 약 40 mL 내지 약 300 mL, 약 50 mL 내지 약 200 mL, 또는 약 50 mL 내지 약 100 mL일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 혈액 샘플 또는 그의 분획 또는 추가의 혈액 샘플 또는 그의 분획은 약 100 mL 이하(예를 들어 약 50 mL 내지 약 100 mL)이다.
일부 구현예에서, 상기 ECP 장치는 최소화된 ECP 장치, 예를 들어 트랜스면역(TI) 플레이트이다. 일부 구현예에서, 상기 ECP 장치는 플라스틱 백이다. 당업자는 phDC를 포함하는 수지상 세포를 단핵구와 구별하는 방법, 예를 들어 유전자 발현을 평가하는 방법을 잘 알고 있다.
과학적 이론에 구속되지 않으면서, 본 발명자들은 본 발명의 현저한 효과가 손상된 염색성 DC에 기인하는 것으로 추정되며, 특히 상기 수용자의 생리학적 DC에 항원을 그리고 상기 수용자의 면역 체계에 관용성 신호를 제공하는, 프소랄렌(psoralen)와 UVA(PUVA)의 조합물에 의해 손상된다. phDC가 PUVA-처리된 세포사멸성 자가유래(autologous) DC로부터 이러한 관용성 신호를 받은 경우, 상기 phDC는 (수신된 관용성 신호에 더하여) 자가유래 PUVA-처리된 세포사멸성 DC로부터 항원을 그들의 표면에 표시할 수 있으며 그에 의해서 항원-특이적 관용성 반응을 유발한다. 이와 유사하게, 상기 항원의 공급원은 면역 세포 예를 들어 단핵구 또는 림프구로부터 유래될 수도 있다. 따라서, 항원 특이적 관용성 반응을 일으키기 위하여 면역 세포 예를 들어 단핵구 또는 림프구를 세포사멸시키고 phDC와 조합할 수 있다. 그러나, 손상된 DC 또는 단핵구와 같은 관련 전구세포가 바람직하다.
한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 수용자의 체외 혈액 샘플로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 수용자로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어졌다. 한 구현예에서, 상기 수용자는 포유동물이다. 포유동물은 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 돼지, 개, 고양이, 말 및 설치류를 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 상기 수용자는 인간이다.
한 구현예에서, 상기 이식조직은 신장 이식조직, 췌장 이식조직, 간 이식조직, 심장 이식조직, 폐 이식조직, 장 이식조직, 골수 이식조직 또는 줄기 세포 이식조직이다. 한 구현예에서, 상기 줄기 세포 이식조직은 조혈 줄기 세포 이식조직이다.
상기 모든 구현예는 시험관 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 조혈 줄기 세포 이식과 관련된 면역 결함의 치료를 위한 다른 치료법과 함께 적용될 수 있다.
제 3 측면의 하기 구현예에 있어서, 제 3 측면에 관한 상기 모든 구현예가 준용된다:
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 수용자로부터 얻어진 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
b) 단계 a)의 세포사멸성 수용자 수지상 세포를 상기 수용자로부터 얻어진 생리학적 수지상 세포를 혼합하는 단계.
상기 구현예에서, 상기 구현예에 대해 추가로 기술되는 단계 d1)에 상응하는 공동-인큐베이션이 수행될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 동시에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 순차적으로 수행된다. 따라서, 상기 수용자(단계 b))로부터의 phDC는 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다. 한 구현예에서, 단계 b)의 수용자로부터 얻어진 phDC는 상기 방법 동안 세포사멸성 제제에 임의의 시점에도 노출되지 않는다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 수용자로부터 면역 세포, 바람직하게는 림프구를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 면역 세포, 바람직하게는 림프구를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 수용자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 면역 세포, 바람직하게는 세포사멸성 림프구를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계.
제 3 측면의 모든 구현예는 상기 구현예에 준용하여 적용된다(즉, 수용자로부터 얻어진 수지상 세포는 수용자로부터 얻어진 면역 세포, 바람직하게는 림프구로 대체됨).
상기 방법은 또한 수지상 세포 관련된 세포 예를 들어 세포사멸성으로 되는 단핵구에 기초하여 실시될 수 있다. 따라서, 또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 수용자로부터 단핵구를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 단핵구를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 수용자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 단핵구를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계.
제 1 측면의 모든 구현예는 상기 구현예에 준용하여 적용된다(즉, 수용자로부터 얻어진 수지상 세포는 수용자로부터 얻어진 단핵구에 의해 대체됨).
제 4
측면:
제 1
측면에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포
제 4 측면에서, 본 발명은 제 1 측면(전술한 바와 같은 모든 구현예를 포함함)에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수용자 수지상 세포에 관한 것이다.
한 구현예에서, 제 1 측면에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수용자 수지상 세포는 공여자로부터의 장래 이식조직의 면역원성을 감소시킨다.
제 5
측면:
제 2
측면에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포
제 5 측면에서, 본 발명은 제 2 측면(전술한 바와 같은 모든 구현예를 포함함)에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 하플로-공여자 수지상 세포에 관한 것이다.
한 구현예에서, 제 2 측면에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 하플로-공여자 수지상 세포는 하플로-공여자로부터의 장래 이식조직의 면역원성을 감소시킨다.
제 6
측면:
제 3
측면에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포
제 6 측면에서, 본 발명은 제 3 측면(전술한 바와 같은 모든 구현예를 포함함)에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수용자 수지상 세포에 관한 것이다.
한 구현예에서, 제 3 측면에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수용자 수지상 세포는 장래 이식조직의 면역원성을 감소시킨다.
제 7
측면:
이식편대숙주
질환을 예방하거나 또는 감소시키는 방법에 사용하기 위한
제 4
측면에 따른 관용성 수지상 세포
제 7 측면에서, 본 발명은, 이식편대숙주 질환을 예방하거나 또는 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 제 4 측면(전술한 바와 같은 제 1 및 제 4 측면의 구현예를 모두 포함함)에 따른 관용성 수지상 세포에 관한 것이다.
한 구현예에서, 제 1 측면의 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포는 이식조직을 필요로 하는 동종이계 또는 홑배수동종(haploidentical) 수용자의 치료에 사용하기 위한 것이다. 이식 전에 일어나는 이러한 치료 후에는, GvHD 발병 위험, 발병하는 경우 GvHD의 중증도는 이식 전에 관용성 수지상 세포를 투여하지 않은 경우에 비해 현저히 감소된다.
제 8
측면:
이식편대숙주
질환을 예방하거나 또는 감소시키는 방법에 사용하기 위한
제 5
측면에 따른 관용성 수지상 세포
제 8 측면에서, 본 발명은, 이식편대숙주 질환을 예방하거나 또는 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 제 5 측면(전술한 바와 같은 제 2 및 제 5 측면의 구현예를 모두 포함함)에 따른 관용성 수지상 세포에 관한 것이다.
한 구현예에서, 제 2 측면의 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포는 이식조직을 필요로 하는 홑배수동종(haploidentical) 수용자의 치료에 사용하기 위한 것이다. 이식 전에 일어나는 이러한 치료 후에는, GvHD 발병 위험, 발병하는 경우 GvHD의 중증도는 이식 전에 관용성 수지상 세포를 투여하지 않은 경우에 비해 현저히 감소된다.
제 9
측면:
이식편대숙주
질환을 예방하거나 또는 감소시키는 방법에 사용하기 위한
제 6
측면에 따른 관용성 수지상 세포
제 9 측면에서, 본 발명은, 이식편대숙주 질환을 예방하거나 또는 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 제 6 측면(전술한 바와 같은 제 3 및 제 6 측면의 구현예를 모두 포함함)에 따른 관용성 수지상 세포에 관한 것이다.
한 구현예에서, 제 3 측면의 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포는 이식조직을 필요로 하는 동종이계 또는 홑배수동종(haploidentical) 수용자의 치료에 사용하기 위한 것이다. 이식 전에 일어나는 이러한 치료 후에는, GvHD 발병 위험, 발병하는 경우 GvHD의 중증도는 이식 전에 관용성 수용자 수지상 세포를 투여하지 않은 경우에 비해 현저히 감소된다.
제 10
측면: 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법
제 10 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 대상체로부터 얻어진 제 1 샘플의 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 대상체로부터 얻어진 제 2 샘플의 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 수지상 세포와 혼합하는 단계.
한 구현예에서, 상기 방법은 관용성 수지상 세포의 선택적 생산에 관한 것이다.
한 구현예에서, 상기 세포사멸성 수지상 세포를 상기 수지상 세포와 혼합하는 단계 d)는 상기 대상체 내에서 일어난다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 동시에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계들은 순차적으로 수행된다. 따라서, 단계 c)의 DC는 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다. 한 구현예에서, 단계 c)의 DC는 상기 방법 동안 임의의 시점에 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 대상체로부터 얻어진 제 1 샘플의 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 대상체로부터 얻어진 제 2 샘플의 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 수지상 세포와 혼합하는 단계, 및
d1) 단계 d)의 혼합물을 공동-인큐베이션하는 단계.
한 구현예에서, 수지상 세포의 두 샘플(단계 a) 및 c))은 동일한 대상체로부터 얻어진다. 한 구현예에서, 상기 혼합물을 공-배양하는 단계 d1)은 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계는 동시에 수행된다.
한 구현예에서, 상기 방법 단계는 순차적으로 수행된다. 따라서, 단계 c)의 DC는 세포사멸성 제제에 노출되지 않는다.
상기 방법의 단계 b)에서, 방법 단계 a)에서 대상체로부터 얻어지는 수지상 세포는 세포사멸성 제제에 노출된다. 한 구현예에서, 상기 세포사멸성 제제는 프소랄렌(psoralens) 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트(riboflavin-phosphate) 및 UVA 및/또는 아미노레불린산(aminolevulinic acid) 및 광(light)을 포함한다. 특히 바람직한 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌이다. 가장 바람직한 프소랄렌은 8-MOP이다. 세포사멸성 제제는 8-MOP와 UVA의 조합물이다.
바람직하게는, 구현예는 본질적으로 상기 대상체의 모든 수지상 세포가 상기 세포사멸성 제제와 접촉하도록 선택되어야 한다. 8-MOP/UVA의 경우, 본질적으로 상기 대상체의 모든 수지상 세포는 8-MOP와 접촉하여 UVA 광에 노출되어야 한다. 통상적인 8-MOP 및 UVA의 투여량은 100 ng/mL 내지 300 ng/mL의 8-MOP 농도와 조합하여 1 J/cm2 내지 3 J/cm2 UVA이다.
바람직한 구현예에서, UVA의 투여량은 3 J/cm2 이하, 2 J/cm2 이하, 또는 1 J/cm2 이하이다. 다른 바람직한 구현예에서, 8-MOP의 투여량은 300 ng/mL, 250 ng/mL, 200 ng/mL 또는 100 ng/mL 이하이다. 바람직한 구현예에서, 8-MOP의 투여량은 200 ng/mL이고, UVA의 투여량은 1 J/cm2이다.
제 1 및 제 2 측면과 관련하여 기술된 바와 같이, 본 발명의 맥락에서, 즉 또한 제 10 측면과 관련하여 수지상 세포는 특히 체외 광성분 채취술(ECP) 유래 과정을 이용하여 단핵구의 플레이트-통과에 의해 얻어져서, 단핵구를 활성화시켜 건강한 phDC로 분화시킬 수 있다. 제 1 측면에서 기술된 phDC의 생성과 관련된 모든 구현예는 제 2 측면에서의 phDC의 생성에도 적용된다.
한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어졌다. 한 구현예에서, 단계 c)의 수지상 세포는 상기 대상체로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어진다. 따라서, 단계 a) 및/또는 단계 c)의 수지상 세포는 생리학적 DC로 지칭될 수 있다. 제 1 측면에 대해 기술된 phDC의 생성과 관련된 모든 구현예는 또한 제 10 측면에 대한 phDC의 생성에 적용된다. 한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체로부터 얻어진 체외 혈액 샘플로부터 얻어졌다. 한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체로부터 얻어진 체외 혈액 샘플로부터 얻어졌고, 단계 c)의 수지상 세포는 상기 대상체로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어졌다.
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 상기 대상체의 phDC는 혈액 샘플 또는 그의 분획을 장치의 유동 챔버에 통과시킴으로써 혈액 샘플에 함유된 단핵구를 전단력에 적용시킴으로써 얻어진다. 바람직하게는, 혈소판은 상기 대상체의 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 유래되거나 별도로 제공될 수 있는 유동 챔버에 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 혈장 성분은 상기 대상체의 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 유래되거나 별도로 제공될 수 있는 유동 챔버에 존재할 수 있다. 그러나, phDC의 생성은 혈소판 및/또는 혈장 성분의 부재 하에도 작용한다.
대상체의 단핵구는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 혈액 샘플 또는 그의 분획으로부터 얻어질 수 있다. 혈액 샘플의 분획은 예를 들어 백혈구 및 혈소판을 포함하는 버피 코트(buffy coat)일 수 있다. 대안적으로, 상기 혈액 샘플의 분획은 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)일 수 있다. PBMC는 예를 들어 피콜-하이포크 구배(Ficoll-Hypaque gradient)(Isolymph, CTL Scientific)에 의한 원심분리를 이용하여 혈액 샘플로부터 단리될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 혈액 샘플의 분획은 정제된 또는 농축된 단핵구 제제일 수 있다. 단핵구는 예를 들어 플라스틱 부착물 중 1개, 2개 또는 3개 모두; CD14 자성 비드 양성 선택(예를 들어 Miltenyi Biotec); 및 단핵구 단리 키트 II(Miltenyi Biotec)를 사용하여 PBMC로부터 농축될 수 있다.
임의의 적합한 부피의 혈액이 사용될 수 있다. 혈액 샘플(예를 들어 분획이 유래되는 혈액 샘플)은 약 1 μL 내지 약 500 mL, 예를 들어 약 1 μL 내지 약 10 mL, 약 1 μL 내지 약 5 mL, 약 1 μL 내지 약 1 mL, 약 1 μL 내지 약 750 μL, 약 1 μL 내지 약 500 μL, 약 1 μL 내지 약 250 μL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 30 mL 내지 약 350 mL, 약 40 mL 내지 약 300 mL, 약 50 mL 내지 약 200 mL, 또는 약 50 mL 내지 약 100 mL일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 혈액 샘플 또는 그의 분획 또는 추가의 혈액 샘플 또는 그의 분획은 약 100 mL 이하(예를 들어 약 50 mL 내지 약 100 mL)이다.
일부 구현예에서, 상기 ECP 장치는 최소화된 ECP 장치, 예를 들어 트랜스면역(TI) 플레이트이다. 일부 구현예에서, 상기 ECP 장치는 플라스틱 백이다. 당업자는 phDC를 포함하는 수지상 세포를 단핵구와 구별하는 방법, 예를 들어 유전자 발현을 평가하는 방법을 잘 알고 있다.
과학적 이론에 구속되지 않으면서, 본 발명자들은 본 발명의 현저한 효과가 상기 대상체로부터 손상된 염색성 DC에 기인하는 것으로 추정되며, 특히 상기 대상체의 생리학적 DC에 항원을 그리고 상기 대상체의 면역 체계에 관용성 신호를 제공하는, 프소랄렌(psoralen)와 UVA(PUVA)의 조합물에 의해 손상된다. phDC가 PUVA-처리된 세포사멸성 DC로부터 이러한 관용성 신호를 받은 경우, 상기 phDC는 (수신된 관용성 신호에 더하여) 자가유래(autologous) PUVA-처리된 세포사멸성 DC로부터 항원을, 특히 자가항원(autoantigens)을 그들의 표면에 표시할 수 있으며 그에 의해서 항원-특이적 관용성 반응을 유발할 수 있다. 이와 유사하게, 상기 항원의 공급원은 면역 세포 예를 들어 림프구로부터 유래될 수도 있다. 따라서, 항원 특이적 관용성 반응을 일으키기 위하여 면역 세포 예를 들어 단핵구 또는 림프구를 세포사멸시키고 상기 대상체의 phDC와 조합할 수 있다.
한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체의 체외 혈액 샘플로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어진다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계(전술한 바와 같은 모든 구현예는 또한 하기 구현예에 준용하여 적용됨)를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 대상체로부터 얻어진 제 1 샘플의 수지상 세포를 제공하는 단계;
a1) 상기 수지상 세포를 항원 분자와 함께 인큐베이션하는 단계;
b) 단계 a1)의 인큐베이션된 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 대상체로부터 얻어진 제 2 샘플의 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 수지상 세포와 혼합하는 단계.
한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어졌다. 한 구현예에서, 단계 c)의 수지상 세포는 상기 대상체로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어졌다. 한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체의 체외 혈액 샘플로부터 얻어졌다. 한 구현예에서, 단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체의 체외 혈액 샘플로부터 얻어졌으며, 단계 c)의 수지상 세포는 상기 대상체의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어졌다.
한 구현예에서, 상기 항원 분자는 자가항원이다. 한 구현예에서, 상기 자가항원은 하나 이상의 자가면역 장애와 관련된다. 한 구현예에서, 상기 항원성 분자는 천연 공급원으로부터 유래되거나, 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 생성된다. 한 구현예에서, 상기 항원 분자는 세포로부터 유래된다.
하기 표 A는 자가면역 질환과 관련된 예시적 자가항원의 목록, 및 관용성 phDC를 이용한 자가면역 질환의 개선을 평가하는데 사용될 수 있는 예시적 동물 모델 시스템을 보여준다(또한 실험 7 및 8 참조).
표 A: 예시적인
자가항원
, 관련된 자가면역 질환 및 동물 모델의 목록
한 구현예에서, 상기 자가항원은, Rh 혈액형 항원, 혈소판 인테그린 GpIIb:IIIa, 기저막 콜라겐 IV형의 비콜라겐성 도메인, 표피 카데린, 연쇄상구균 세포벽 항원, 간성 C형 항원을 갖거나 갖지 않는 류마티스 인자 IgG 복합체, 췌장 β-세포 항원, 미엘린 염기성 단백질, 단백지방질 단백질, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 데스모글레인 3, 글루탐산 탈탄산효소, 아세틸콜린 수용체, 카복시펩티다제 H, 크로모그라닌 A, 글루타메이트 탈탄산효소, 이모겐-38, 인슐린, 인슐린종 항원-2 및 2β, 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질(islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit related protein; IGRP), 프로인슐린, α-에놀라아제, 아쿠아포린-4, β-아레스틴, S100-β, 시트룰린화 단백질, 콜라겐 II, 열 충격 단백질, 인간 연골 당단백질 39, La 항원, 뉴클레오솜 히스톤 및 리보핵단백질(snRNP), 인지질-β-2 당단백질 I 복합체, 폴리(ADP-리보스) 중합효소, U-1 소형 리보핵단백질 복합체의 Sm 항원, 췌장 섬세포 항원, 세포질 링커 단백질-170(CLIP-170), 쇼그렌 증후군 항원 A(SS-A/Ro), 쇼그렌 증후군 항원 B(SS-B/La), 쇼그렌 루푸스 항원(SL) 및 피부경화증 항원 70(Scl-70)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 자가항원은 미엘린 염기성 단백질 및 콜라겐으로부터 선택된다.
한 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 예를 들어 인간, 인간이 아닌 영장류, 돼지, 개, 고양이, 말 및 설치류를 포함하지만, 이로써 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.
상기 실시 구현예들은 모두 시험관 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 자가면역 질환의 치료를 위한 다른 요법과 함께 적용될 수 있다. 예를 들어 상기 자가면역 질환은 상기 표 A에 기재된 임의의 자가면역 질환일 수 있다. 다른 자가면역 질환은 당업계에 알려져 있다.
제 11
측면:
제 10
측면에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포
제 11 측면에서, 본 발명은 제 10 측면에 따른 방법(상기 기재된 모든 구현예를 포함)에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포에 관한 것이다.
제 12
측면:
제 11
측면에 따른 자가면역 질환의 치료를 위한 관용성 수지상 세포
제 12 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 제 11 측면(상기 기재된 제 10 및 제 11 측면의 모든 구현예를 포함)에 따른 관용성 수지상 세포에 관한 것이다.
자가면역 질환의 치료에 있어서, 상기 관용성 수지상 세포의 투여는 일부 개선 효과, 예를 들어 삶의 질 개선, 질환 증상의 중증도 감소, 자가면역 세포수의 감소, 연장된 생존 등을 결과할 것으로 생각된다. 유익한 효과의 지표는 당업계에 잘 알려져 있으며, 특정 용도에 대한 적절한 지표는 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
이러한 치료에 따르면, 자가면역 질환 또는 이와 관련된 증상의 중증도는 관용성 수지상 세포를 투여하지 않은 경우에 비해 현저히 감소된다.
한 구현예에서, 상기 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 근위축성 측삭 경화증; 심상성 천포창, 건선, 중증 근무력증, 갑상선염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혈소판 감소성 자반증, 한랭글로불린혈증(cryoglobulinemia), 자가면역 용혈성 빈혈, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 애디슨병(Addison's disease), 셀리악병(celiac disease), 만성 피로 증후군, 대장염, 크론병(Crohn's disease), 섬유근육통, 갑상선기능항진증/그레이브스병(Graves disease), 갑상선기능저하증/하시모토병(Hashimoto's disease), 자궁내막증, 악성 빈혈, 굿파스쳐 증후군(Goodpasture syndrome), 베게너병(Wegener's disease) 및 류마티스열(rheumatic fever)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
또 다른 구체예에서, 본원에서 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역을 치료하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 본원에 기재된 관용성 수지상 세포 중의 임의의 것을 유효량으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에서 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역을 치료하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 유효량의 관용성 수지상 세포를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, 상기 관용성 수지상 세포는 상기 대상체로부터 얻어진 세포사멸성 수지상 세포로부터의 물질을 포함하는 생리학적 수지상 세포, 자가항원, 그의 단편, 또는 그들의 조합물을 포함한다.
상기 선행 방법들 중의 임의의 것에서, 상기 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 근위축성 측삭 경화증; 심상성 천포창, 건선, 중증 근무력증, 갑상선염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혈소판 감소성 자반증, 한랭글로불린혈증(cryoglobulinemia), 자가면역 용혈성 빈혈, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 애디슨병, 셀리악병, 만성 피로 증후군, 대장염, 크론병, 섬유근육통, 갑상선기능항진증/그레이브스병, 갑상선기능저하증/하시모토병, 자궁내막증, 악성 빈혈, 굿파스쳐 증후군, 베게너병 및 류마티스열을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 선행 방법들 중의 임의의 것에서, 상기 자가항원은, Rh 혈액형 항원, 혈소판 인테그린 GpIIb:IIIa, 기저막 콜라겐 IV형의 비콜라겐성 도메인, 표피 카데린, 연쇄상구균 세포벽 항원, 간성 C형 항원을 갖거나 갖지 않는 류마티스 인자 IgG 복합체, 췌장 β-세포 항원, 미엘린 염기성 단백질, 단백지방질 단백질, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 데스모글레인 3, 글루탐산 탈탄산효소, 아세틸콜린 수용체, 카복시펩티다제 H, 크로모그라닌 A, 글루타메이트 탈탄산효소, 이모겐-38, 인슐린, 인슐린종 항원-2 및 2β, 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질(IGRP), 프로인슐린, α-에놀라아제, 아쿠아포린-4, β-아레스틴, S100-β, 시트룰린화 단백질, 콜라겐 II, 열 충격 단백질, 인간 연골 당단백질 39, La 항원, 뉴클레오솜 히스톤 및 리보핵단백질(snRNP), 인지질-β-2 당단백질 I 복합체, 폴리(ADP-리보스) 중합효소, U-1 소형 리보핵단백질 복합체의 Sm 항원, 췌장 섬세포 항원, 세포질 링커 단백질-170(CLIP-170), 쇼그렌 증후군 항원 A(SS-A/Ro), 쇼그렌 증후군 항원 B(SS-B/La), 쇼그렌 루푸스 항원(SL) 및 피부경화증 항원 70(Scl-70)을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
제 13
측면:
생체외
관용성 수지상 세포
제 13 측면에서, 본 발명은 대상체로부터 얻어진 세포사멸성 수지상 세포로부터 유래된 물질을 포함하는 생체외 관용성 수지상 세포에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 얻어진 세포사멸성 수지상 세포로부터의 물질은 폴리펩티드, 핵산, 소기관(organelles) 또는 그의 일부, 또는 임의의 다른 세포 내용물을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 생체외 관용성 수지상 세포는 자가항원 또는 그의 단편을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 자가항원(예를 들어 표 A)을 비롯한 임의의 적합한 자가항원이 포함될 수 있다. 폴리펩티드 항원에 있어서, 상기 단편은 임의의 적절한 크기, 예를 들어 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 아미노산일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 생체외 관용성 수지상 세포는 하나의 유형의 자가항원 또는 그의 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 생체외 관용성 수지상 세포는 2, 3, 4, 5, 10개 이상의 상이한 자가항원 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 자가항원은, Rh 혈액형 항원, 혈소판 인테그린 GpIIb:IIIa, 기저막 콜라겐 IV형의 비콜라겐성 도메인, 표피 카데린, 연쇄상구균 세포벽 항원, 간성 C형 항원을 갖거나 갖지 않는 류마티스 인자 IgG 복합체, 췌장 β-세포 항원, 미엘린 염기성 단백질, 단백지방질 단백질, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 데스모글레인 3, 글루탐산 탈탄산효소, 아세틸콜린 수용체, 카복시펩티다제 H, 크로모그라닌 A, 글루타메이트 탈탄산효소, 이모겐-38, 인슐린, 인슐린종 항원-2 및 2β, 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질(IGRP), 프로인슐린, α-에놀라아제, 아쿠아포린-4, β-아레스틴, S100-β, 시트룰린화 단백질, 콜라겐 II, 열 충격 단백질, 인간 연골 당단백질 39, La 항원, 뉴클레오솜 히스톤 및 리보핵단백질(snRNP), 인지질-β-2 당단백질 I 복합체, 폴리(ADP-리보스) 중합효소, U-1 소형 리보핵단백질 복합체의 Sm 항원, 췌장 섬세포 항원, 세포질 링커 단백질-170(CLIP-170), 쇼그렌 증후군 항원 A(SS-A/Ro), 쇼그렌 증후군 항원 B(SS-B/La), 쇼그렌 루푸스 항원(SL) 및 피부경화증 항원 70(Scl-70)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 자가항원은 미엘린 염기성 단백질 및 콜라겐으로부터 선택된다.
상기 대상체는 본원에 개시된 임의의 자가면역 질환(예를 들어 표 A)을 포함하는 자가면역 질환을 앓고 있을 수 있다.
제 14
측면:
대상체로부터
얻어진 수지상 세포의 샘플을 포함하는 조성물
제 14 측면에서, 본 발명은 (a) 대상체로부터 얻어진 수지상 세포의 샘플; (b) 세포사멸성 제제; 및 (c) 자가항원 또는 그의 단편;을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 본원에 개시된 임의의 세포사멸성 제제를 포함하는 임의의 적합한 세포사멸성 제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포사멸성 제제는 프소랄렌, 리보플라빈-포스페이트, 5-아미노레불린산, 또는 그들의 조합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포사멸성 제제는 프소랄렌이다. 일부 구현예에서, 상기 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 프소랄렌은 8-MOP이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 자가항원 또는 그의 단편을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 자가항원(예를 들어 표 A)을 비롯한 임의의 적합한 자가항원이 포함될 수 있다. 폴리펩티드 항원에 있어서, 상기 단편은 임의의 적절한 크기, 예를 들어 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 아미노산일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 하나의 유형의 자가항원 또는 그의 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 2, 3, 4, 5, 10개 이상의 상이한 자가항원 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 자가항원은, Rh 혈액형 항원, 혈소판 인테그린 GpIIb:IIIa, 기저막 콜라겐 IV형의 비콜라겐성 도메인, 표피 카데린, 연쇄상구균 세포벽 항원, 간성 C형 항원을 갖거나 갖지 않는 류마티스 인자 IgG 복합체, 췌장 β-세포 항원, 미엘린 염기성 단백질, 단백지방질 단백질, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 데스모글레인 3, 글루탐산 탈탄산효소, 아세틸콜린 수용체, 카복시펩티다제 H, 크로모그라닌 A, 글루타메이트 탈탄산효소, 이모겐-38, 인슐린, 인슐린종 항원-2 및 2β, 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질(IGRP), 프로인슐린, α-에놀라아제, 아쿠아포린-4, β-아레스틴, S100-β, 시트룰린화 단백질, 콜라겐 II, 열 충격 단백질, 인간 연골 당단백질 39, La 항원, 뉴클레오솜 히스톤 및 리보핵단백질(snRNP), 인지질-β-2 당단백질 I 복합체, 폴리(ADP-리보스) 중합효소, U-1 소형 리보핵단백질 복합체의 Sm 항원, 췌장 섬세포 항원, 세포질 링커 단백질-170(CLIP-170), 쇼그렌 증후군 항원 A(SS-A/Ro), 쇼그렌 증후군 항원 B(SS-B/La), 쇼그렌 루푸스 항원(SL) 및 피부경화증 항원 70(Scl-70)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 자가항원은 미엘린 염기성 단백질 및 콜라겐으로부터 선택된다.
상기 수지상 세포는 본원에 개시된 임의의 자가면역 질환(예를 들어 표 A)을 포함하는 자가면역 질환을 앓고 있는 대상체로부터 얻어질 수 있다.
도 1은 ECP 백혈병 홑배수동종 시험의 개략적인 설계를 도시한 것이다.
도 2는 ECP 백혈병 홑배수동종 시험의 개략적인 설계를 도시한 것이다.
도 3은 Balb/C→B6 전체 미스매치(full mismatch) GVHD 시스템의 개략적인 설계를 도시한 것으로; 또한 그 결과가 도시되어 있다.
도 4는 이식편의 생체외 UVA 치료(PUVA)는 전체 MHC 미스매치 모델에서 GVHD를 개선하는 것을 도시한 것이다. 마우스는 이식 전 -4일차 또는 이식 0일차에 2×105 MC38 종양 세포를 s.c.로 주사하였다. 마우스는 -1일차에 950 cGy로 치사선량을 조사하였다. 0일차에 Balb/c→B6 이식을 진행하였다. 이들은 10×106개의 조작되지 않은(unmanipulated) 비장 세포와 함께, 또는 알로-자극 이식편(allo-stimulated graft)에 생체외 PUVA 처리 후에 동종이계 T 세포가 5×106개의 고갈된 골수(BM) 세포의 i.v. 주사를 맞았다. 대조군으로서, 마우스의 군은 종양 접종(inoculation) 후 동형(syngeneic) BM 및 비장 세포를 받았다. (A, 패널 1-3) 모든 군의 평균 체중, GvHD 등급 및 생존율에 대한 통합 데이터. (B) 평균 종양 부피.
도 5는 심장이식 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존율 곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 대상체 특징을 나타낸 것이다.
도 7은 GVHD 등급 및 단계를 나타낸 것이다.
도 8은 급성 GVHD의 누적 발생률을 나타낸 것이다. 미관련된 공여자 분석은 5/6의 HLA-매칭된 관련된 공여자를 갖는 1명의 환자를 포함한다.
도 9는 광범위한 만성 GVHD의 누적 발병률을 나타낸 것이다.
도 10은 총괄 생존율을 나타낸 것이다. 미관련된 공여자 분석은 5/6 HLA-매칭된 관련된 공여자를 갖는 1명의 환자를 포함한다.
도 11은 이식조직-관련된 사망자의 누적 발생률을 나타낸 것이다. 미관련된 공여자 분석은 5/6 HLA-매칭된 관련된 공여자를 갖는 1명의 환자를 포함한다.
도 12는 이력 대조군의 선정 기준을 나타낸 것이다.
도 13은 연구 및 이력 대조군 대상체의 특징을 나타낸 것이다.
도 14는 다변량 분석에서 이식 결과의 상대적 위험 및 95% 농도 구간(대조군은 기준으로 사용되며 상대적 위험이 1.0으로 할당됨)을 나타낸 것이다.
도 15는 II-IV급성 GVHD의 누적 발생률을 나타낸 것이다.
도 16은 조정된 무병-생존 확률을 나타낸 것이다.
도 17은 조정된 생존 확률을 나타낸 것이다.
도 18은 신선한 PBMC 단독 대 8-MOP/UVA 손상된 동형 PBMC(PUVA syn PBMC) 또는 8-MOP/UVA 손상된 동종이계 PBMC(PUVA allo PBMC)와 함께 인큐베이션된 phDC의 PD-L1 발현을 나타낸 것이다.
도 19는 한 공여자로부터의 CFSE 표지 반응자 T 세포(T 세포)는 동일한 공여자(syn 배양) 또는 미관련된 공여자(MLR)로부터의 감마선 조사된 자극기(gamma-irradiated stimulator) PBMC로 공동-인큐베이션된 것을 나타낸 것이다. MLR 반응을 억제하기 위해, 일부 배양(cultures)은 동형 8-MOP/UVA-처리된 PBMC 및 동형 TI 플레이트-통과된 phDC(MLR + PUVA syn. PBMC + phDC)로 추가로 보충되었다. 반응자 CD8 및 CD4 T 세포의 증식은 유세포 분석(FACS)(A, B)에 의한 CFSE 희석을 측정하여 분석되었다. 반응자 CD8 및 CD4 T 세포의 활성화 상태는 활성화된 T 세포를 검출하기 위해 CD44 및 PD1 발현을 사용하여 FACS에 의해 추가적으로 평가되었다(C, D). N = 분석된 혈액 공여자 수; p-값 = 웰치 보정(Welch's correction)을 갖는 언페어드(unpaired) t 시험.
도 2는 ECP 백혈병 홑배수동종 시험의 개략적인 설계를 도시한 것이다.
도 3은 Balb/C→B6 전체 미스매치(full mismatch) GVHD 시스템의 개략적인 설계를 도시한 것으로; 또한 그 결과가 도시되어 있다.
도 4는 이식편의 생체외 UVA 치료(PUVA)는 전체 MHC 미스매치 모델에서 GVHD를 개선하는 것을 도시한 것이다. 마우스는 이식 전 -4일차 또는 이식 0일차에 2×105 MC38 종양 세포를 s.c.로 주사하였다. 마우스는 -1일차에 950 cGy로 치사선량을 조사하였다. 0일차에 Balb/c→B6 이식을 진행하였다. 이들은 10×106개의 조작되지 않은(unmanipulated) 비장 세포와 함께, 또는 알로-자극 이식편(allo-stimulated graft)에 생체외 PUVA 처리 후에 동종이계 T 세포가 5×106개의 고갈된 골수(BM) 세포의 i.v. 주사를 맞았다. 대조군으로서, 마우스의 군은 종양 접종(inoculation) 후 동형(syngeneic) BM 및 비장 세포를 받았다. (A, 패널 1-3) 모든 군의 평균 체중, GvHD 등급 및 생존율에 대한 통합 데이터. (B) 평균 종양 부피.
도 5는 심장이식 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존율 곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 대상체 특징을 나타낸 것이다.
도 7은 GVHD 등급 및 단계를 나타낸 것이다.
도 8은 급성 GVHD의 누적 발생률을 나타낸 것이다. 미관련된 공여자 분석은 5/6의 HLA-매칭된 관련된 공여자를 갖는 1명의 환자를 포함한다.
도 9는 광범위한 만성 GVHD의 누적 발병률을 나타낸 것이다.
도 10은 총괄 생존율을 나타낸 것이다. 미관련된 공여자 분석은 5/6 HLA-매칭된 관련된 공여자를 갖는 1명의 환자를 포함한다.
도 11은 이식조직-관련된 사망자의 누적 발생률을 나타낸 것이다. 미관련된 공여자 분석은 5/6 HLA-매칭된 관련된 공여자를 갖는 1명의 환자를 포함한다.
도 12는 이력 대조군의 선정 기준을 나타낸 것이다.
도 13은 연구 및 이력 대조군 대상체의 특징을 나타낸 것이다.
도 14는 다변량 분석에서 이식 결과의 상대적 위험 및 95% 농도 구간(대조군은 기준으로 사용되며 상대적 위험이 1.0으로 할당됨)을 나타낸 것이다.
도 15는 II-IV급성 GVHD의 누적 발생률을 나타낸 것이다.
도 16은 조정된 무병-생존 확률을 나타낸 것이다.
도 17은 조정된 생존 확률을 나타낸 것이다.
도 18은 신선한 PBMC 단독 대 8-MOP/UVA 손상된 동형 PBMC(PUVA syn PBMC) 또는 8-MOP/UVA 손상된 동종이계 PBMC(PUVA allo PBMC)와 함께 인큐베이션된 phDC의 PD-L1 발현을 나타낸 것이다.
도 19는 한 공여자로부터의 CFSE 표지 반응자 T 세포(T 세포)는 동일한 공여자(syn 배양) 또는 미관련된 공여자(MLR)로부터의 감마선 조사된 자극기(gamma-irradiated stimulator) PBMC로 공동-인큐베이션된 것을 나타낸 것이다. MLR 반응을 억제하기 위해, 일부 배양(cultures)은 동형 8-MOP/UVA-처리된 PBMC 및 동형 TI 플레이트-통과된 phDC(MLR + PUVA syn. PBMC + phDC)로 추가로 보충되었다. 반응자 CD8 및 CD4 T 세포의 증식은 유세포 분석(FACS)(A, B)에 의한 CFSE 희석을 측정하여 분석되었다. 반응자 CD8 및 CD4 T 세포의 활성화 상태는 활성화된 T 세포를 검출하기 위해 CD44 및 PD1 발현을 사용하여 FACS에 의해 추가적으로 평가되었다(C, D). N = 분석된 혈액 공여자 수; p-값 = 웰치 보정(Welch's correction)을 갖는 언페어드(unpaired) t 시험.
하기에서 일반적 정의가 제공된다.
용어 "포함하는"이 본 발명의 설명 및 청구 범위에서 사용되는 경우, 다른 구성요소를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, "구성된"이라는 용어는 "포함하는"이라는 용어의 바람직한 구현예로 간주된다. 이하, 하나의 군이 적어도 특정 몇 개의 실시예를 포함하도록 정의되는 경우, 이는 또한 바람직하게는 이들 실시예로만 이루어진 군을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "얻어진(obtained)"은 용어 "얻어질 수 있는(obtainable)"의 바람직한 실시예로 간주된다. 예를 들어, 항체가 특정 공급원으로부터 수득될 수 있다고 정의되는 경우, 이것은 또한 상기 공급원으로부터 수득된 항체를 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
부정관사와 정관사가 단순명사(예를 들어 "a", "an"또는 "the") 를 지칭하기 위해 사용되어진 경우, 여기서 특별히 명기된 사항이 없는 한, 해당 명사의 복수형을 포함한다. 본 발명의 맥락에서 "약" 또는 "대략"이라는 용어는 해당 기술 분야의 통상의 기술자가 의심되는 특징에 기술적 효과를 보장하기 위해 이해하는 정확도의 정도를 뜻한다. 상기 용어는 전형적으로 ±20%, 바람직하게는 ±15%, 보다 바람직하게는 ±10%, 및 더욱 더 바람직하게는 ± 5 %의 지시된 수치로부터의 편차를 나타낸다.
또한, 발명의 설명이나 청구범위에서 "제 1", "제 2", "제 3"또는 "(a)", "(b)", "(c)", "(d)"또는 “(i)”, “(ii)”, “(iii)”, “(iv)” 등은 유사한 구성 요소들을 구별하기 위해 사용되어지며, 이는 반드시 순차적 또는 연대순으로 기술되어질 필요가 있는 것은 아니다. 그렇게 사용 된 용어는 적절한 상황하에 순서 교환이 가능하고 본 명세서에 설명하는 실시예에서 본 명세서에 기재되거나 도시된 것 이외의 다른 순서로도 작용할 수 있다.
"제 1", "제 2", "제 3"또는 "(a)", "(b)", "(c)", "(d)"또는 “(i)”, “(ii)”, “(iii)”, “(iv)” 등의 용어가 방법 또는 사용 또는 분석의 단계와 관련하여 사용되는 경우, 달리 명시하지 않는 한, 단계간에 시간 또는 시간 간격의 일관성은 없다. 즉, 상기 또는 아래에 기재된 명세서에 달리 명시되지 않는 한, 여러 단계가 동시에 또는 그러한 단계들 사이의 초, 분, 시간, 일, 주, 월 또는 년의 시간 간격을 뜻할 수 있다.
기술 용어는 통상 뜻하는 의미로 사용된다. 특정 의미가 특정 용어로 전달되는 경우. 용어의 정의가 사용되는 문단에서 용어의 정의가 주어질 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "이식조직"은 포유동물 개체("공여자")로부터 제거된 세포의 임의의 샘플을 지칭하며, 동일한("자가유래(autologous)") 또는 상이한("동종이계(allogeneic)") 포유동물 개체("수용자")로 전체 또는 일부가 재도입되기에 적합하다. 상기 이식조직은 신선하게 얻어질 수 있거나, 배양 또는 동결될 수 있으나, 멸균을 유지하고 생존을 촉진하기에 적합한 조건 하에서 유지되었다. 상기 용어 이식조직은 용어 이식편(graft)과 상호 교환 가능하게 사용된다.
본 발명의 방법은 밀접하게 클래스 I 및 클래스 II HLA 항원의 전부 또는 거의 전부를 공유하는, HLA-매칭된(matched) 개체; HLA 항원의 절반을 공유하는 형제 등의 반수체성의 개체, 또는 홑배수동종(haploidentical), 예를 들어 그들의 HLA 항원의 절반을 공유하는 형제자매들(siblings); 또는 관련되지 않고, 따라서 빈약하게 HLA-매칭된 개체로 실시될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 "하플로-공여자(haplo-donor)"는 장래 수용자의 한 유전적 부모를 의미하며, "상보적 하플로-공여자"는 다른 유전적 부모를 의미한다. 따라서 장래 수용자는 아동(child)이다. 즉, 어머니가 하플로 공여자인 경우, 아버지는 아이의 상보적 하플로-공여자(장래 수용자)이며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 제 1 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 수용자 및 공여자는 관련이 없다. 제 2 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 하플로-공여자 및 상보적 하플로-공여자는 각각 장래 수용자의 HLA 항원의 절반을 갖는다.
개체 사이의 HLA 동일성 정도는 중합효소 연쇄반응, 혼합된 림프구 반응(mixed lymphocyte reactions; MLR) 및 혈청학적 측정치(serological measurements)를 포함한 당업계에 공지된 방법으로 용이하게 입증될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 동물에 주사 또는 흡수되는 조성물을 포함하여 동물에서 항체 또는 T 세포 반응의 생성을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질을 의미한다. 항원은 이종 면역원에 의해 유도된 것을 비롯하여 특정 체액성(humoral) 또는 세포성 면역의 생성물과 반응한다. 상기 용어는 "면역원" 또는 "항원성 분자"와 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어 "항원"은 관련된 항원성 에피토프를 모두 포함한다. 상기 용어 "항원", "항원성 분자" 또는 "면역원"은 여전히 항원으로 작용할 수 있는 단편을 포함한다. "에피토프" 또는 "항원성 결정인자"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 의미한다. 일례로, 상기 수용자 항원은 말초 혈액 백혈구(단핵구 또는 단핵구 유래 세포 포함)의 판 통과로부터 얻어진 수지상 세포 등의 수지상 세포 유래 항원을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성"은 인간 또는 동물의 체내에서 물질, 세포 또는 그의 일부, 예를 들어 항원이 면역 반응을 일으키는 능력을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "자가항원"은 자가면역 질환과 관련이 있어 자가항원에 특이적인 활성화 T 세포의 존재가 질환의 발병 또는 진행과 관련되도록 당업자가 고려한 숙주항원(또는 미생물 초항원(microbial superantigen))을 의미한다.
자가항원은 정의된 자가면역 표적 항원, 예를 들어 다발성 경화증에서 미엘린 염기성 단백질(MBP) MBP 84-102 또는 MBP 143-168로 확인된 표적 항원; 췌장 섬세포 항원(pancreatic islet cell antigens); 포도막염에서, S 항원; 또는 류마티스 관절염에서, II형 또는 다른 유형의 콜라겐; SLE에서, 세포질 링커 단백질-170(CLIP-170); 쇼그렌 증후군 항원 A(SS-A/Ro), 쇼그렌 증후군 항원 B(SS-B/La), 쇼그렌 루푸스 항원(SL); 경피증 항원 70(Scl-70); 그레이브 질환(Grave's disease)에서, 갑상선 수용체; 중증 근무력증(Myasthena gravis)에서, 아세틸콜린 수용체일 수 있다. 본 발명의 자가항원은 자가면역과 관련이 있는 것으로 알려진 MHC 분자, 예를 들어 몇몇 통상적인 자가면역 질환, 예를 들어 유형 1 당뇨병, 류마티스 관절염 및 다발성 경화증에 대한 감수성을 부여하는 HLA-DQ 및 -DR 분자, 또는 반응성 관절염 및 강직성 척추염에 대한 감수성을 부여하는 것으로 알려진 HLA-B27 분자로부터 용출된 펩티드 혼합물도 포함한다. 본 발명의 자가항원은 자가면역 질환과 관련이 있는 WIC 분자와 결합할 것으로 예측되는 합성된 펩티드일 수도 있다. 아직 개별 자가항원이 특성화되어 있지 않은 다른 자가면역 질환의 경우, 본 발명의 방법을 실시하기에 적합한 자가항원은 영향을 받은 조직의 세포 또는 세포 추출물(예를 들어 류마티스 관절염용 활막 세포(synovial cells), 건선에 대한 피부 병변 등)일 수 있다. 상기 용어 자가항원은 또한 자가항원으로 작용하는 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 세포"는 조혈 기원이 되어 면역 반응에 역할을 하는 세포를 광범위하게 의미한다. 면역 세포는 림프구, 예를 들어 B 세포 및 T 세포; 백혈구; 자연살해세포; 골수 세포(myeloid cells), 예를 들어 단핵구, 수지상 세포, 대식세포, 호산구, 비만세포, 호염기구, 과립구를 포함한다.
본원에서 "DC"로도 지칭되는 "수지상 세포"는 항원성 물질(antigenic material)을 처리하여 면역 체계의 다른 세포, 가장 주목하게는 T 세포에 제시하는 항원-제시 면역 세포이다. DC는 항원을 포획 및 처리하는 기능을 한다. DC가 항원을 엔도사이토즈(endocytose)하는 경우, 그들은 항원을 DC 표면에 표시되는 더 작은 조각, 일반적으로 펩티드로 처리하고, 여기서 그들은 MHC 분자를 통해 예를 들어 항원 특이적 T 세포에 제시된다. 항원을 흡수한 후, DC는 림프절로 이동한다. 성숙하는 동안, DC는 톨-유사 수용체(Toll-like receptor; TLR)를 통한 신호전달을 포함한 다양한 신호에 의해 촉진되어 동족 이펙터 T 세포(Teff)가 활성화되어 증식되도록 유도하는 공-자극 신호를 발현하고, 그에 의해서 항원에 대한 T 세포 매개 면역 반응을 개시할 수 있다. 대안으로, DC는 공-자극 신호를 제공하지 않고(또는 공-억제 신호를 제공하면서) 항원-특이적 T 세포에 항원을 제시할 수 있으므로, Teff는 적절하게 활성화되지 않는다. 이러한 제시는 예를 들어 항원을 인식하는 T 세포의 사멸 또는 무력화를 초래할 수 있거나, 조절 T 세포(Treg)의 생성 및/또는 증폭을 유도할 수 있다. 상기 용어 "수지상 세포"는 분화된 수지상 세포, 미성숙, 성숙 수지상 세포를 포함한다. 이러한 세포는 특정 세포 표면 마커(예를 들어 CD11c, MHC 클래스 II, 및 적어도 낮은 수준의 CD80 및 CD86), CD11b, CD304(BDCA4))의 발현을 특징으로 할 수 있다. 일부 구현예에서, DC는 CD8, CD103, CD1d 등을 발현한다. 다른 DC는 리니지 마커(lineage marker) 예를 들어 CD3, CD14, CD19, CD56 등의 부재에 의해 동정될 수 있다. 또한, 수지상 세포는 동종반응 및 혼합 림프구 반응(MLR)을 자극하는 능력을 기능적으로 특징으로 할 수 있다.
"관용성 DC"는 예를 들어 특이적 항원에 대한 이펙터 T 세포 반응을 감소시키고, 항원-특이적 조절 T 세포의 수를 증가시키는 등에 의해서 면역 반응을 억제하거나 또는 관용성 면역 반응, 예를 들어 항원-특이적 T 세포-매개된 면역 반응을 일으킬 수 있는 수지상 세포를 지칭한다. 관용성 DC는 생체외 및/또는 생체내에서 항원 특이적 관용성 면역 반응 유도에 의해 특징지어질 수 있다. 이러한 유도는 유도된 관용성 수지상 세포에 의해 제시된 하나 이상의 관심 항원에 대한 관용성 면역 반응의 유도를 지칭한다. 관용성 수지상 세포는, i) 생체외 및/또는 생체내에서 나이브 T 세포를 Foxp3+ T 조절 세포로 전환(예를 들어 나이브 T 세포에서 FoxP3의 발현을 유도)할 수 있는 것; ii) 생체외 및/또는 생체내에서 이펙터 T 세포를 제거할 수 있는 것; iii) 생체외에서 적어도 하나의 TLR 작용제로 자극시(및 일부 구현예에서, 이러한 자극에 반응하여 공자극 분자의 발현을 증가) 관용성 유전자 표현형을 유지하는 것; iv) 생체외에서 적어도 하나의 TLR 작용제로 자극시 산소 소비율(oxygen consumption rate)을 일시적으로 증가시키지 않는 것; v) 발현 마커 PDL1의 발현을 증가시키는 것 및/또는 vi) 발현 마커 GILZ의 발현을 증가시킬 수 있는 것의 특성들 중의 적어도 하나에 의해 특징지워질 수 있는 관용성 유전자 표현형을 갖는다. 항목 v) 및 vi)은 단핵구 또는 PBMC와 비교하여 평가할 수 있다.
"관용성 면역 반응"은 항원 또는 이러한 항원을 발현하는 세포, 조직, 기관 등에 특이적인 면역 억제를 유도할 수 있는 임의의 면역 반응을 의미한다. 이러한 면역 반응은 항원 또는 이러한 항원을 발현하는 세포, 조직, 기관 등에 특이적인 바람직하지 않은 면역 반응의 임의의 감소, 지연 또는 억제를 포함한다. 이러한 면역 반응은 또한 항원 또는 이러한 항원을 발현하는 세포, 조직, 기관 등에 특이적인 원하는 면역 반응에서의 임의의 자극, 생성, 유도, 촉진 또는 점증(recruitment)을 포함한다. 따라서, 관용성 면역 반응은 항원 반응성 세포에 의해 매개될 수 있는 항원에 대한 바람직하지 않은 면역 반응의 부재 또는 감소뿐만 아니라 억제 세포의 존재 또는 촉진을 포함한다. 본원에서 제공되는 바와 같은 관용성 면역 반응은 면역학적 관용성을 포함한다. "관용성 면역 반응을 발생시킨다"는 것은 항원 또는 그러한 항원을 발현하는 세포, 조직, 기관 등에 특이적인 임의의 상기 면역 반응의 발생을 의미한다.
관용성 면역 반응은 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 B 세포 증식 및/또는 활성의 임의의 감소, 지연 또는 억제를 포함한다. 또한 관용성 면역 반응은 항원-특이적 항체 생산의 감소를 포함한다. 또한 관용성 면역 반응은 조절 세포, 예를 들어 CD4+ Treg 세포, CD8+ Treg 세포, Breg 세포 등의 자극, 유도, 생성 또는 점증을 유도하는 임의의 반응을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 관용성 면역 반응은 조절 세포의 생성, 유도, 자극 또는 점증에 의해 특징지워지는 조절 표현형으로의 전환을 초래하는 것이다.
관용성 면역 반응은 또한 CD4+ Treg 세포 및/또는 CD8+ Treg 세포의 자극, 생성 또는 점증을 유도하는 임의의 반응을 포함한다. CD4+ Treg 세포는 전사 인자 FoxP3을 발현하여 염증 반응 및 자가면역성 염증 질환(자가면역 질환에서 인간 조절 T 세포. 문헌 [Cvetanovich G L, Hafler D A. Curr Opin Immunol. 2010 December; 22(6):753-60]. 조절성 T 세포 및 자가면역성. 문헌 [Vila J, Isaacs J D, Anderson A E. Curr Opin Hematol. 2009 July; 16(4):274-9])을 억제할 수 있다. 이러한 세포는 또한 T 세포가 B 세포에 도움을 주는 것을 억제하고 자가 및 외래 항원에 대한 관용성을 유도한다(FoxP3+ 조절성 T 세포 활성화 및 증폭을 기반으로 한 알레르기 및 자가면역에 대한 치료적 접근법. 문헌 [Miyara M, Wing K, Sakaguchi S. J Allergy Clin Immunol. 2009 April; 123(4):749-55]). CD4+ Treg 세포는 APC 상에 클래스 II 단백질이 제시될 때 항원을 인식한다. 클래스 I에 의해 제시된 항원을 인식하는 CD8+ Treg 세포는 또한 T-세포가 B-세포에 도움을 주는 것을 억제하고 자가 및 외래 항원에 대한 관용성을 유도하는 항원-특이적 억제의 활성화를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 관용성 수지상 세포는 효과적으로 양 유형의 반응(CD4+ Treg 및 CD8+ Treg)을 초래할 수 있다. 다른 구현예에서, FoxP3은 다른 면역 세포, 예를 들어 대식세포, iNKT 세포 등에서 유도될 수 있으며, 본원에 제공된 관용성 수지상 세포는 이러한 반응 중 하나 이상을 초래할 수도 있다.
또한 관용성 면역 반응은 제한되지는 않지만 조절 사이토카인, 예를 들어 Treg 사이토카인의 유도; 억제 사이토카인의 유도; 염증성 사이토카인(예를 들어 IL-4, IL-1b, IL-5, TNF-α, IL-6, GM-CSF, IFN-γ, IL-2, IL-9, IL-12, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, M-CSF, C 반응성 단백질, 급성기 단백질(acute phase protein)), 케모카인(예를 들어 CCL-2, CXCL8, MCP-1, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MIG, ITAC 또는 IP-10)의 억제, 항염증성 사이토카인(예를 들어 IL-4, IL-13, IL-10 등), 프로테아제(예를 들어 MMP-3, MMP-9), 류코트리엔(예를 들어 CysLT-1, CysLT-2), 프로스타글란딘(예를 들어 PGE2) 또는 히스타민의 생성; Th17, Th1 또는 Th2 면역 반응에 대한 분극의 억제; 이펙터 세포-특이적 사이토카인: Th17(예를 들어 IL-17, IL-25), Th1(IFN-γ), Th2(예를 들어 IL-4, IL-13)의 억제; Th1-, Th2- 또는 Th17-특이적 전사 인자의 억제; 이펙터 T 세포의 증식 억제; 이펙터 T 세포의 세포사멸 유도; 관용성 수지상 세포-특이적 유전자의 유도; FoxP3 발현의 유도; IgE 유도 또는 IgE-매개된 면역 반응의 억제; 항체 반응(예를 들어 항원-특이적 항체 생성)의 억제; T 헬퍼 세포 반응의 억제; TGF-β 및/또는 IL-10의 생성; 자가항체의 이펙터 기능의 억제(예를 들어 세포들, 세포 또는 조직 손상 또는 보체 활성화의 고갈 억제); 등을 포함한다.
상기 중 어느 하나는 하나 이상의 동물 모델에서 생체 내 측정되거나 시험관 내 측정될 수 있다. 당업자는 이러한 생체내 또는 시험관내 측정에 익숙하다. 바람직하지 않은 면역 반응 또는 관용성 면역 반응은 예를 들어 면역 세포 수 및/또는 기능을 평가하는 방법, 사량체 분석, ELISPOT, 사이토카인 발현의 유세포-기반 분석(flow cytometry-based analysis), 사이토카인 분비, 사이토카인 발현 프로파일링, 유전자 발현 프로파일링, 단백질 발현 프로파일링, 세포 표면 마커 분석, 면역 세포 수용체 유전자 사용의 PCR-기반 검출(문헌 [T. Clay 등, "Assays for Monitoring Cellular Immune Response to Active Immunotherapy of Cancer" Clinical Cancer Research 7:1127-1135 (2001)] 참조) 등을 이용하여 모니터링될 수 있다. 바람직하지 않은 면역 반응 또는 관용성 면역 반응은 예를 들어 혈장 또는 혈청에서의 단백질 수준을 평가하는 방법, T 세포 또는 B 세포 증식 및 기능 분석 등을 이용하여 모니터링될 수도 있다. 일부 구현예에서, 관용성 면역 반응은 FoxP3의 유도를 평가하여 모니터링될 수 있다.
바람직하게는, 관용성 면역 반응은 본원에 기재된 질환, 장애 또는 병태, 특히 GvHD의 발달, 진행 또는 병리의 억제를 유도한다. 일부 구현예에서, 바람직하지 않은 면역 반응의 감소 또는 관용성 면역 반응의 발생은 임상 종점, 임상 효능, 임상 증상, 질환 바이오마커 및/또는 임상 점수를 결정하여 평가할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "동물" 또는 "포유동물"은 인간을 포함한 모든 포유동물을 포괄한다. 바람직하게는, 본 발명의 포유동물은 인간 대상체이다.
본원에서 사용되는 용어 "노출"은 즉각적인 근접 또는 직접적인 접촉의 상태 또는 조건을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "조혈-세포 이식"(HCT)은 환자의 조혈계를 재구성하는 세포(조혈 줄기 세포((hematopoietic stem cells); 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitor cells)라고도 함)의 주입을 수반하는 과정인 혈액 및 골수 이식(BMT)을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "자가면역 질환" 또는 "자가면역 증후군"은 면역 체계가 건강한 신체 조직의 자기 성분을 오인하여 공격하고 파괴할 때 발생하는 병태를 의미한다. 자가면역 질환은 하나 이상의 장기 또는 조직 유형에 영향을 미칠 수 있다. 자가면역 질환에 의해 흔히 영향을 받는 장기 및 조직은 혈관, 결합 조직, 내분비선 예를 들어 갑상선 또는 췌장, 관절, 근육, 적혈구, 및 피부를 포함한다.
세포사멸성 제제에 노출시키는 본 발명의 임의이 방법 단계에서, 상기 세포사멸성 제제는 프소랄렌 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트 및 UVA 및/또는 아미노레불린산 및 광을 포함한다. 특히 바람직한 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌이다. 하기 양은 오리엔테이션(orientation)을 위한 것이다. 당업자는 세포사멸성으로 만드는 효과를 달성하는 적용될 농도 및 투여량을 용이하게 찾을 수 있다. 리보플라빈-포스페이트의 농도는 1 μM 내지 100 μM일 수 있다. 아모토살렌의 농도는 50 μM 내지 500 μM일 수 있다. 상기 리보플라빈 또는 아모토살렌에 수반되는 광의 투여량은 1 J/cm2 내지 10 J/cm2일 수 있다. 상응하는 광은 UVA 또는 청색광일 수 있다. 8-MOP의 농도는 0.2 μM 내지 2.5 μM(또는 43 ng/mL 내지 540 ng/mL)일 수 있다. 수반되는 광의 투여량은 0.5 J/cm2 내지 5 J/cm2일 수 있다. 빛의 투여량은 UVA 또는 청색광일 수 있다.
본 발명의 방법 또는 상기 방법의 구체적인 단계는 백 예를 들어 플라스틱 백에서 실시될 수 있다. 플라스틱 재료가 고려되는 경우, 폴리올레핀, 폴리에틸렌, 플루오로중합체(fluoropolymer), 폴리비닐클로라이드, 에틸렌-비닐아세테이트 공중합체, 에틸렌 비닐알코올, 폴리비닐리덴플루오라이드, 또는 의료용으로 승인된 기타 플라스틱 필름을 기반으로 한 플라스틱 필름으로 만든 백을 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 한 구현예에서, 상기 백은 에틸렌-비닐아세테이트 공중합체로 제조될 수 있다. 상기 백은 시료 또는 세포 혼합물에 가시광선 또는 자외선을 조사할 수 있도록 투명도를 제공하는 재료로 제조될 수 있다.
이하, 본 발명은 일부 구체적인 실시예를 통하여 설명되지만, 이는 예시적인 것일 뿐, 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다.
실험
실험 1 -
phDC의
생산
모든 연구는 건강한 인간 지원자들이 기증한 혈액으로 수행하였다. 말초 혈액은 1:100 5,000 U/mL 헤파린(McKesson Packaging Services)에 수집하였고, 혈소판 함유 PBMC는 제조사의 프로토콜에 따라 Isolymph(CTL Scientific Supply Corp)를 이용하여 밀도구배 원심분리에 의해 단리하였다. 자가유래 혈장(혈소판도 포함)을 수집하여 보관하였다. 세척된 PBMC 및 혈소판을 자가유래 혈장에서 재현탁하고 트랜스면역(Tsransimunization; TI) 챔버 또는 임상 ECP 플레이트에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
TI 챔버에서, 세포는 0.09 mL/min의 속도로 시린지 펌프를 이용하여 통과시켰다. 플레이트 통과 후 세포를 수집하였고, TI 챔버는 100% FBS로 0.49 mL/min로 세척하면서 챔버로부터 임의의 부착 세포를 탈착시키는 것을 돕도록 플레이트 표면을 플릭킹(flicking) 또는 탭핑(tapping)함으로써 물리적 교란(perturbing)시켰다.
임상 ECP 플레이트에서 세포는 24 mL/min의 유속으로 통과시킨 후, 플레이트 표면을 플릭킹 또는 탭핑함으로써 물리적으로 교란시켜서 인간 AB 혈청(Lonza BioWhittaker)으로 100 mL/min로 세척하여 부착 세포를 탈착시키는 것을 돕는다. TI 챔버 또는 ECP 플레이트를 통과한 PBMC를 수집하여 세척하고 15% 인간 AB 혈청(Lonza BioWhittaker), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% L-글루타민(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 보충된 페놀-레드(Gibco, Carlsbad, CA) 부재의 RPMI에서 표준 조건 하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날 생리학적 수지상 세포를 수확하였다(스크래칭에 의한 임의의 부착된 세포의 수확을 포함함).
실험 2:
ECP
백혈병
홑배수동종
이식 시험 - 개략적인 설계 및 예상된 결과
1. 모친(mother)(장래의 공여자)은 부친(father)의 ECP-처리된 혈액 주입을 통해 부계 항원에 관용성으로 된다.
2. 모친이 부계 항원(부친 세포에 대한 MLR 반응 감소, 부친 HLA 유형에 대한 항체 없음)에 대해 실제로 관용성으로 되는지에 관한 체크가 수행된다.
3. 치료받은 산모로부터 백혈병 아동으로의 골수를 이식한다.
4. 아동의 골수 생작(bone marrow engraftment)을 평가한다.
5. 시험 종말점(trial endpoints)을 평가한다 - 골수 생작, GvHD 발생률 및 중증도, 암 재발률.
상기 처리는 도 1에 도시된다.
상기 치료법을 적용하는 경우, 아동은 이식조직이 예비-관용성화되므로 GvHD를 발생시키지 않거나 GvHD 증상을 감소시킨다.
실험 3:
ECP
백혈병
홑배수동종
이식 시험 - 개략적인 설계 및 예상된 결과
1. 일배체형 골수 이식 또는 면역-제거(immune-ablative) 전처리 전에, 수용자는 관용성 ECP로 치료 받는다(전체 매칭된 이식조직에 대한 Francine Foss의 시험 설계에 따름, 실험 1 참조).
2. 이식이 수행되지만, 이식 후 사이클로포스파미드 투여량(PTCy)의 감소가 있다.
3. 골수 생작을 평가한다.
4. 시험 종말점을 평가한다 - 골수 생작, GvHD 발생률 및 중증도, 암 재발률.
상기 처리는 도 2에 도시된다.
상기 치료법을 적용하는 경우, 항종양 면역을 보존하기 위해 PTCy의 감소가 가능하다. PTCy는 완전히 생략되고 ECP로 대체될 수 있다.
실험 4:
PUVA
처리된 수지상 세포에 의한
GvHD
예방
물질 및 방법
1. -4일차에, 장래 이식편 수용자 마우스(C57BL/6, H2b MHC 일배체형)는 C57BL/6 종양(MC38 대장암)으로 피하 접종된다.
2. -1일차에, 장래 이식편 수용자(종양 보유자)는 자신의 면역 체계를 제거하는 치사선량(950 cGy)의 감마선을 조사받는다.
3. 이식 당일(0일차)에, 이식을 위한 조직이 준비된다.
a. 무이식 대조군(no-graft control)에서, 조사된 C57BL/6 마우스는 어떠한 이식도 받지 않는다.
b. 동형 대조군에서, 원래의 C57BL/6 면역 체계는 C57BL/6 골수 및 비장 세포를 되돌려 줌으로써 재구성된다.
c. 동종이계 대조군 이식편에서, 수용자는 Balb/c 공여자 마우스(H2d MHC 일배체형)로부터의 전체 미스매칭된 골수 및 비장 세포로 재구성된다.
d. 동종이계 PUVA 이식편에서, Balb/c 골수 및 비장 세포(수지상 세포 포함)는 치사선량으로 조사된 C57BL/6 비장 세포와 함께 5시간 동안 인큐베이션된 다음, 매우 낮은 투여량의 PUVA(200 ng/mL 8-MOP, 0.1 J/cm2 UVA)으로 페트리 접시에서 처리된다.
4. 준비된 조직은 방사선 조사된 종양-보유 수용체에 이식된다.
5. 이어서 수용자는 골수 생작(생존, 나중에 혈액 분석으로 확인됨), GvHD 및 종양 성장에 대해 모니터링된다.
● 방사선 조사되었지만, 이식을 받지 않은 마우스는 14일차에 균일하게 죽는다.
● 동형 대조군 마우스는 잘 이식되고, GvHD(예상대로 이식이 완전히 매칭되므로)가 발생하지 않으며, 큰 종양이 성장한다.
● 동종이계 대조군 마우스는 잘 이식되고, 25일차까지 균일하게 치명적인 심각한 GvHD가 발생하며(이식은 전체 미스매치인 것으로 예상됨), 종양 성장은 비교적 느리고 치사가 빠르기 때문에 평가하기가 어렵다.
● 동종이계 PUVA 마우스는 잘 이식되고, GvHD의 징후를 보이지 않으며(47일차), 종양이 성장할지라도 성장률은 동형 대조군 마우스의 ~50%, 즉 GvT 효과에 의해 부분적으로 제어되는 것으로 나타낸다.
그 결과는 하기 표 1 뿐만 아니라 도 3 및 도 4에도 도시된다. 도 3은 또한 위에서 설명한 방법을 개략적으로 도시한다.
결과
표 1: 상이한 처리군의 결과
본 발명자들은 놀랍게도 저 투여량의 8-MOP/UVA로 치료된 이식조직, 즉 본 발명의 방법에 따르는 것은 GvHD를 예방한다는 것을 발견하였다. 이론적 근거는 염색하는 수지상 세포를 수집한 건강한 수지상 세포가 수용자의 이식편에 대한 관용성을 제공한다는 것이다.
실험 5: 심장 이식 생존에 관한 체외 광성분 채취술(ECP)로 처리한 공여자 비장 세포의 이식 전 주입 효과
공여자 마우스는 BALB/c(H-2d), 수컷, 8주령 내지 14주령이었다. 수용자 마우스는 C57BL/c, 수컷, 10주령 내지 14주령(n=24)이었다. 공여자 마우스 비장 세포를 수집하고 2개 군으로 나누었다. 군 1의 공여자 세포는 유동 챔버("도 5의 미처리")에서 전단력을 적용시켰다. 군 2의 공여자 세포는 유동 챔버에서 전단력과 ECP(도 5의 "ECP")를 받았다. 10마리의 공여자 마우스는 미처리 공여자 세포를 투여 받았고 14마리의 공여자 마우스는 ECP 처리된 공여자 세포를 투여 받았다.
수용자 마우스에 주입하기 전 공여자 세포를 처리한 결과는 다음과 같았다:
유동 챔버에 혈소판-풍부-혈장(platelet-rich-plasma; PRP) 분획 0.4 mL를 37℃에서 60분 동안 도입하여 PRP를 코팅하였다.
공여자 비장 세포를 13.33 mL 중의 4억개의 세포의 농도의 60 mL 주사기를 사용하여 유동 챔버에 주입하였다.
ECP는 1억개의 세포(200ng/mL) 당 PBS 20mL 중의 200 μL의 양으로 유동 챔버에 8-MOP를 첨가하여 수행하였다. 세포를 200초 동안 ~20~22 mW/cm2로 UVA에 노출시켰다. 수용자 마우스는 수용자 마우스 1마리당 약 5천만개의 세포로 처리된 도너 세포를 투여받았다.
심장 이식은 공여자 세포를 수용자 마우스에 주입한 후 7일 만에 실시하였다. 결과는 도 5에서 수술 후 경과 일수에 대한 생존율로 보고된다. 도 5에서 알 수 있듯이, 미처리 공여자 세포를 투여받은 수용자 마우스(즉, 군 1, 전단력만 받은 공여자 세포)는 수술 후 9일경에 사망한 반면, ECP 공여자 세포를 투여받은 수용자 마우스(즉, 군 2, 전단력만 받은 공여자 세포, ECP)는 수술 후 29일까지 생존하였다. 따라서 동종이계 이식조직은 ECP 처리된 공여자 세포, 예를 들어 이식 전 ECP 처리된 비장 세포(건강한 수지상 세포를 침범한 비장 세포)를 투여받은 경우 수용자에게 상당히 잘 관용된다. ECP 처리된 공여자 세포를 갖는 수용자의 예비-처리가 장기간 동종 이식편(allograft) 생존 및 공여자 특이적 관용성을 초래한다고 결론지을 수 있다.
실험 6: 표준 골수 절제 컨디셔닝(standard myeloablative conditioning) 및 동종이계 조혈 줄기 세포 이식을 경험한 환자의 급성 GVHD 예방을 위한 체외 광성분 채취술
물질 및 방법
대상체
연구와 동의서 형식은 모든 참여 현장의 기관 심사회 또는 동등한 기관에 의해 승인되었다. 모든 대상체는 연구 치료를 시작하기 전에 승인된 동의서를 서명하였다. 적격성 기준에는 혈액 악성종양, 및 골수 절제 준비 요법과 동종이계 HCT로 치료하는 것을 배제하지 않는 장기 기능이 있는 18-60세 대상체가 포함됐다. 치료 옵션이 동종이계 골수 또는 PBSC 이식이 될 혈액 악성 종양 진단을 받은 경우 대상체는 연구에 적격이었다. 대상체들은 질환에 차도가 있는지 아니면 질환의 첫 번째 또는 두 번째 재발 이후에 등록할 수 있다. 대상체는 적어도 40kg의 체중을 가져야 하고, 혈소판 수가 20,000/cmm 이상이며, 프소랄렌 또는 시트레이트 제품에 대한 민감성은 알려져 있지 않았다. 대상체는 HLA-A, B, 및 DR 유전자좌 모두에서 혈청학적으로 또는 분자적으로 매칭되거나 HLA-A 또는 -B 유전자좌 하나에서 미스매치되지만 HLA-DR 유전자좌에서 분자적으로 매칭되거나 HLA-A, -B, 및 DR 유전자좌에서 분자적으로 매칭되는 관련없는 공여자를 가져야 했다. 2002년 10월부터 2004년 1월까지 등록이 이루어졌기 때문에 HLA-C 매칭은 일상적으로 수행되지 않았다. GVHD 대상체에 대한 예비 요법 및 예방은 CY(연속 2일 동안 하루 60 mg/kg) 및 TBI(10-13.5 Gy는 분별 투여량으로 3일 또는 4일에 걸쳐 전달달되었음)를 받았다. GVHD 예방은 D-1에 시작할 때 CSP 3-5 mg/kg IV이었고 200 내지 600 ng/mL의 트로프 수준(trough levels)을 유지하도록 조정하였다. CSP는 CSP에 대한 재발 또는 불관용성을 가진 대상체를 제외하고 임상적으로 용인되고 D 100보다 빨리 테이퍼링되지 않을 때 경구 투여로 변경되었다. 매칭 관련된 공여자로부터 HCT를 투여 받은 대상체는 1일차 10 mg/m2 IV, 3일차, 6일차, 및 11일차 5 mg/m2 MTX를 투여 받은 반면, 미스매칭된 관련 공여자 또는 매칭된 비관련 공여자는 1일차에 15 mg/m2 MTX, 3일차, 6일차, 및 11일차에 10 mg/m2 MTX를 투여 받았다. MTX의 투약은 급성 GVHD에 대한 균일한 예방을 제공하기 위해 조사자 간의 협약을 기반으로 하였다. 각 연구 현장의 기관 지침에 따라 지지적 치료와 예방적 항균 치료를 실시하였다.
체외
광성분
채취술
ECP는 앞서 기술한 바와 같이 UVAR XTS 기계(Therakos, Exton, PA, USA)를 사용하여 수행되었다(Miller 등, 2004). 일반적으로, 버피 코트 수집이 완료된 후 ECP 회로의 재순환백에 주입된 메톡살렌 용액(UVADEX Therakos)을 이용하기 전에, 그러나 광활성화 과정 전에 각각의 처리에 대해 적어도 1500 mL의 버피 코트 혈액 수집을 실시하였다. 광활성화의 완료 후에, 처리된 버피 코트를 대상체에게 다시 주입하였다. 환자는 준비 요법을 시작하기 전 4일 이내에 2일 연속 ECP를 받았다.
GVHD
및 부작용 등급
부작용의 등급화는 확립된 기준(부작용에 대한 일반적인 용어 기준, 버전 3.0, 2003.12.12.)에 따라 수행하였다. 개정된 시애틀-글루크스버그 기준(Seattle-Glucksberg criteria)을 급성 GVHD의 스테이징(staging)에 사용하였고(Glucksberg 등, 1974), 제한적이고 광범위한 만성 GVHD의 진단 기준은 문헌(Schulman 등, 1980)에 기재된 바와 같았다. 급성 및 만성 GVHD의 진단의 균일성을 보장하기 위해 조사자들은 시험 시작 전에 진단 기준에 대해 훈련받았다. 조사자들 각각은 급성 또는 만성 GVHD의 존재 여부를 결정하기 위해 자신의 연구 현장에서 적절한 진단 방법을 채택하였다.
통계
연구 분석. 1차 분석은 이식 후 처음 100일에 등급 II-IV 급성 GVHD의 발생률이었으며, 급성 GVHD의 발생 없이 경쟁 사망 위험을 수용하기 위한 현장 사망 발생률 함수를 이용하여 계산하였다. 유사하게, 경쟁 사망 위험을 수용하기 위해 만성 GVHD, 이식 관련 사망률(TRM) 및 재발에 대한 발생률을 계산하는데 누적 발생률 방법이 사용되었다. 전체 생존률(OS) 및 무질환 생존률(DFS)의 확률은 95% 신뢰구간을 갖는 카플란-마이어 생성물 한도 추정치를 이용하여 설명하였다. 치료 실패(사망 또는 재발)는 DFS 평가에서 사용된 사건이었다. 사건에 대한 시간 중앙값 등의 기술 통계도 계산하였다.
병력 대조군(historical controls)과의 비교. 병력 통제는 CIBMTR에 의해 유지된 데이터베이스를 이용하여 확인하였다. CIBMTR은 위스콘신 의과대학(Medical College of Wisconsin)의 국제 골수 이식 등록부(International Bone Marrow Transplant Registry; IBMTR) 및 전세계 450개 이상의 이식 센터로 구성된 자발적 작업 그룹을 포함하는 네셔널 골수 기증자 프로그램(National Marrow Donor Program)의 연구 계열사이며, 연속적인 동종이계 및 자가유래 HCT에 대한 세부 데이터를 조정 통계 센터에 제공한다. 참여 센터는 모든 이식을 연속적으로 보고해야 하며 현장 감사(on-site audits)에 의해 규정 준수 여부가 모니터링된다. 데이터베이스의 모든 환자는 종으로 추적되며 연간 평가가 포함된다. 오류의 전산 체크, 제출된 데이터에 대한 의사의 검토, 참여 센터에 대한 현장 감사를 통해 데이터 품질을 보장한다. 이 기간 동안 CIBMTR에 의해 수행된 관찰 연구는 기관 검토 위원회(Institutional Review Board) 및 위스콘신 의과 대학의 개인 정보 보호 책임자에 의해 결정된 HIPAA 규정을 준수하고 사전 동의를 포기하는 방식으로 수행되었다. CIBMTR은 등록 및 연구의 두 가지 수준에서 데이터를 수집한다. 등록 데이터에는 질환 유형, 연령, 성별, 이식 전 질환 단계 및 화학 요법 반응성, 진단 날짜, 이식 유형(골수 및/또는 혈액-유래된 줄기 세포), 고-투여량 조절 요법, 이식 후 질환 진행 및 생존, 새로운 악성 종양의 발생 및 사망 원인이 포함된다. 등록 환자의 진행(progression) 또는 사망에 관한 자료 요청은 6개월 간격으로 이루어지며, 참여하는 모든 CIBMTR 사이트는 등록 자료를 제공한다. 연구 데이터는 대표성을 보장하고 구체적인 질환, 이식 전 및 이식 후 임상 정보를 포함하도록 가중 무작위 방식을 사용하여 선택된 등록 환자의 하위 집합에 대해 수집된다. 이 연구에 대한 병력 대조군은 리서치 데이터베이스에서 도출되었다. ECP 연구 대상체는 2002년에서 2004년 사이에 이식받았다. CIBMTR 대조군은 1997년에서 2004년 사이에 이식 받은 대상체에 대한 이러한 연구의 적격 기준을 적용하여 선택되었다. 대조군에 대한 더 오랜 시간 프레임은 합리적인 통계적 파워를 갖는 조정된 비교를 위해 적절한 수의 대상체를 확보하는데 사용되었다. 추적 기간의 차이를 조정하기 위해 연구 및 대조군 대상체 둘 다의 결과 데이터를 1년으로 센서링(censoring)되었다. 연구 대상체 및 대조군 둘 다 다른 기간에 이식됨에 따라 이식 연도(1997-1999 대 2000-2004)가 대조군 결과에 대한 잠재적 영향을 조사하였다. 1997-1999년에 이식 받은 대조군 대상체와 2000-2004년에 이식 받은 대조군의 1년치 결과에는 차이가 없었다. 다변량 콕스 회귀 분석을 이용하여 연구 대상체와 대조군을 비교하였다. 비례성에 대한 시험은 시간-의존성 공변량(time-dependent covariate)을 추가하여 수행되었다. 이들 시험은 비례성 가정이 유효하다는 것을 나타낸다. 단계적 백워드 방법(stepwise backward method)을 사용하여 결과값(outcomes)과 관련된 유의한 공변량(covariates)(ECP 사용 제외)을 식별하였다. 모델 구축에서 고려된 변수는 연령, 성별, 인종, 기증자 관계, HLA-매칭, 이식 유형, 질환 유형, 이식 시 질환 상태 및 CMV 혈청학적 상태였다. 치료 효과(ECP)는 모형 구축의 모든 단계에 포함되었다. ECP 치료와 다른 유의한 공변량 사이의 잠재적 상호작용에 대한 시험에서는 유의한 상호작용이 나타나지 않았다. 전체 및 DFS의 1년 조정 확률은 최종 Cox 모델에서 추정되었으며, 받은 치료에 따라 계층화되고 각 예후 인자에 대한 통합 표본 비율 값으로 가중치가 부여되었다. 이러한 조정된 확률은 유사한 예후 인자를 가진 모집단에서 발생할 수 있는 결과를 추정한다.
결과
대상체
및 공여자 특징
ECP 연구에 66명의 대상체를 등록하였다. 9곳의 연구 센터에 각각 1명 내지 16명의 대상체(연구 센터당 평균 7명의 대상체)가 등록하였다. 그러나 3명의 대상체가 ECP로 연구 치료를 받지 못하였고; 1명의 환자는 연구 동의를 하였고, 1명의 환자는 이식이 지연되었으며, 하나의 센터는 ECP 기기에 기계적 문제가 있었다. 1명의 대상체는 ECP를 받았지만 질환의 빠른 진행으로 인해 이식 받지 못했다. 연구 완료 후 62명의 대상체가 수정된 치료-의도-모집단 데이터 세트(intent-to-treat population dataset)에서 평가 가능한 것으로 간주되었다. 이 중 2명의 대상체는 ECP 기구(instrument)의 후속적인 기계적 문제로 인해 준비 요법을 시작하기 전에 단 한 번의 ECP 치료를 받았다. 대상체, 질환, 공여자 특성 및 질환 상태 정보는 도 6에 요약되어 있다.
생작
(
engraftment
)
1명의 대상체는 생작하지 않았고 28일차에 호흡 부전(respiratory failure)(원인 불명)으로 사망하였다. 다른 모든 대상체는 만족스러운 호중구 및 혈소판 회복을 보였고 늦은 이식 실패(late graft failures)는 없었다. 호중구 수 4500/mL를 달성하기 위한 중앙값(범위) 시간은 골수 이식을 받은 대상체의 경우 21일(14-39일), 말초 혈액 이식을 받은 대상체의 경우 14일(13-28일)이었다.
GVHD
등급 II-IV 급성 GVHD는 관련된 공여자 HCT 수용자 30명 중 9명(30%), 관련 공여자 HCT 수용자 32명 중 13명(41%) 또는 1명의 HLA 항원 미스매칭된 관련된 공여자 HCT 수용자를 포함하여 62명(36%)이 발생하였다(도 7). 피부는 단계 2 이상의 피부 관여(skin involvement)를 가진 대상체의 38%가 가장 빈번하고 심각하게 장기에 관여하는 반면, 위장관 또는 간은 각각 단계 2 이상의 관여를 가진 대상체의 16%와 13%가 발생하였다(도 7). 등급 II-IV 급성 GVHD의 100일 누적 발생률은 35%(95% CI, 23-48%)였다(도 8). 40명(66%)의 환자는 급성 GVHD를 증명한 생검(biopsy)을 받았다. 100일 전 초기 만성 GVHD 또는 100일 후 후기 급성 GVHD를 가진 환자는 없었다. 1차 진단까지의 중앙값 시간과 II-IV 등급 급성 GVHD의 최대 등급은 모두 35일로, 1차 진단의 경우 18-52일, 최대 등급의 경우 22-96일이었다. 만성 GVHD에 대해서는 53명의 대상체가 평가할 수 있었다. 100일 전 7명의 환자(급성 GVHD 3명, 특발성 폐렴 1명, 다기관 시스템 실패 3명)가 사망하였고, 2명의 환자는 만성 GVHD 발생 여부를 판단하기 위해서는 불충분한 자료를 수집하였다. 만성 GVHD는 53명의 대상체 중 21명(40%)(제한적: 8명(15%); 포괄적: 13명(25%))에서 발생하였다. 제한적 만성 GVHD 및 포괄적 만성 GVHD의 1년 누적 발생률은 38%(95% CI, 21-47%)였다(도 9).
독성
연구 중 발생한 가장 빈번한 심각한 유해 사례는 열 8명(13%), 열성 호중구감소증 4명(7%), 및 다기관 시스템 실패 3명(5%)이었다. ECP에 직접적으로 기인한 유해 사례는 ECP를 겪으면서 저혈압을 경험한 2명의 대상체를 포함하였다. CMV 재활성화는 17명(27%)이 발생하였고, 기관지 내시경 검사에서 폐조직에 CMV 질환이 있는 2명의 대상체가 기록하였다. 2명(3%)의 대상체는 연구 참여 시 전신 진균 감염이 있었고, 이식 후 19일, 이식 후 9개월이 발생하였다.
생존
생존 환자의 중앙값 추적은 62명 중 48명(77%)이 생존하는 371일(범위, 366-643일)이었다. 100일차 및 이식 후 1년 생존율의 카플란 마이어 추정치는 각각 89%(95% CI, 78-97%) 및 77%(95% CI, 64-86%)이었다. 관련된 공여자 HCT 수용자 및 관련되지 않은 공여자 HCT 수용자에 대한 OS의 1년 확률은 각각 89%(95% CI, 70-96%) 및 66%(95% CI, 46-80%)이었다(도 10). DFS의 1년 확률은 모든 환자에 대해 69%(95% CI, 64~86%), 관련된 공여자 HCT 후 79%(95% CI, 59~90%), 및 관련되지 않은 공여자 HCT 후 60%(95% CI, 40~75%)이었다. 7명(11%)의 환자에서 재발이 발생하였다. 14명(23%)의 대상체가 사망하였다; 관련된 공여자 이식 후 3명, 및 관련되지 않은 공여자 이식 후 11명. 사망 원인은 재발(1명), 급성 GVHD(3명), 만성 GVHD(1명), 감염(4명), 다발성 기관계 부전(3명), 및 특발성 폐렴(2)이었다. TRM의 1년 누적 발생률은 21%(95% CI, 11~31%)이었고; 관련된 및 관련되지 않은 공여자 이식 후의 누적 발생률은 각각 10%(95% CI, 1~20%) 및 31%(95% CI, 18~50%)(도 11)이었다.
CIBMTR
대조군과 비교한
ECP
연구
대상체
CIBMTR 데이터베이스를 이용하여 연구 대상체와 유사한 특성을 가진 병력 대조군을 조사하였다. 대조군 대상체는 도 12에 정의된 적격성 기준을 충족하도록 하였다. 총 347명의 대조군 대상체를 동정하였다. 이들의 특성은 도 13의 연구 대상체와 비교하였다. ECP 치료 대상체는 40세 이상, 백인(Caucasian), 및 관련되지 않은 공여자를 갖는 대조군일 가능성이 더 높았다. 기저 질환의 분포도 유의하게 다르다. 이러한 차이의 잠재적 영향은 다변량 분석(multivariate analyses)에서 고려하였다. 다변량 분석 결과 병력 대조군과 비교하여 ECP 치료 대상에서 등급 II-IV 급성 GVHD(상대적 위험 RR, 0.61; 95% CI, 0.38~0.97)(P=0.04) 발생률이 유의하게 낮은 것으로 나타났다(도 14). 이러한 낮은 비율은 발생률의 절대적 감소보다는 ECP 치료 대상체에서의 급성 GVHD 발병의 실질적 지연으로 인한 것이다(도 15). 급성 GVHD II-IV등급의 누적 발생률은 연구 환자에서 36%(95% CI, 25~48%), 병력 대조군 코호트에서 39%(95% CI, 33~44%)(도 15)이었다. 또한, 병력 대조군과 비교하여 ECP 치료 대상체에서 TRM이 적었으나, 이는 통계적으로 유의하지 않았다(RR, 0.55; 95% CI, 0.29~1.04)(P=0.065). 군들 사이에 간정맥-폐쇄성 질환(veno-occlusive disease) 또는 간질성 폐렴에 차이가 없었다. 그러나 기회 감염(opportunistic infections)은 대조군 환자의 85명(24%) 및 연구 환자의 5명(8%)(P=0.008)에서 발생하였다. DFS 및 OS의 조정된 확률은 병력 대조군보다 ECP 치료 대상체에서 유의하게 높았다(도 16 및 17). 1년에 조정된 DFS 비율은 ECP 치료 대상체에서 74%(95% CI, 62~82%), 병력 대조군 코호트에서 63%(95% CI, 58%~67%)(치료 부전 재발 또는 사망, 0.60; 95% CI 및 0.36~0.99)(P=0.045)이었다. 1년에 조정된 OS 비율은 ECP 치료 대상체에서 83%(95% CI, 72-90%), 병력 대조군에서 67%(95% CI, 62-71%)(사망률의 RR, 0.44; 95% CI, 0.24-0.80)(P=0.07)이었다.
논의
이러한 단일 단계 II 연구의 결과를 관점에서 볼 수 있도록 ECP 연구 대상과 비교할 수 있는 적합한 병력 대조군을 식별하기 위해 연구 완료 시 CIBMTR과의 협력이 수행되었다. 본 연구에서 환자의 적격성 기준을 이용하여 대조군이 선택되었다. 그러나 도 13에 도시된 바와 같이 군들 사이의 특성 분포에는 어느 정도 차이가 있었으며, ECP 연구 대상체가 나이가 많을 가능성이 더 높고 관련되지 않은 공여자 이식편을 받을 가능성이 더 높으며, 이 두 가지는 모두 GVHD의 위험 증가와 관련이 있었다. 이러한 병력 대조군에 유리한 핵심 인구통계학적 차이가 존재함에도 불구하고, 급성 GVHD는 ECP 치료 코호트에서 더 서서히 발생하였다. 예후 인자의 차이를 조정한 다변량 분석 결과, 급성 GVHD 발병 시 유의한 지연과 함께 군들 사이의 급성 GVHD(등급 II-IV) 비율의 유의한 차이가 나타났다(도 15). 급성 GVHD의 절대 발생률은 ECP로는 낮지 않았지만, 다변량 분석 결과 병력 대조군 코호트에 비해 ECP 연구 코호트에서 TRM이 적고, 치료 실패(재발 및 TRM)이 적으며, 전체 및 DFS가 더 높은 경향이 나타났다. 병력 대조군에 비해 ECP 치료 환자의 기회 감염이 유의하게 적은 것을 제외하고는 군들 사이의 요법-관련된 독성은 유사하였다. 늦은 급성 GVHD의 발병은 준비 요법 및 이식 과정에서 더 많은 회복 및 더 높은 수준의 면역 재구성을 허용하여 이러한 환자가 코르티코스테로이드의 부작용을 더 잘 견딜 수 있고 장기 손상이 적으며 감염을 극복할 수 있기 때문에 그 자체로 유익할 수 있다. 재발 평가의 추적 시간이 짧았지만, 재발률이 두 군 사이에 유의하게 다르지 않으므로 ECP는 동종-면역-매개된 이식편대 악성종양 효과(allo-immune-mediated graft-versus-malignancy effect)를 억제하는 것으로 보이지 않았다.
실험 7: 관용성
phDC를
이용한 자가면역 질환의 개선
본 실시예에서는 동물 모델을 사용하여 관용성성 phDC를 사용한 자가면역 질환의 개선을 평가하는 것이다.
자가면역 질환에 대해 다수의 수용되는 동물 모델이 이용가능하며, 대표적인 동물 모델은 상기 표 A에 기재되어 있다. 필요한 경우, 자가면역 질환은 관용성 phDC 또는 대조군으로 치료하기 전에 유도된다. 동물 모델에 대한 당해 임상 기준에 따라 동물을 조사하고 점수를 매긴다. 일부 실시예에서, 동물은 다음과 같이 4개의 치료군으로 나뉜다:
a) 미처리 동물
b) 자가항원을 제시하는 건강한 phDC로 처리된 동물
c) 자가항원을 제시하는 8-MOP/UVA 손상된 세포사멸성 phDC로 처리된 동물
d) 자가항원을 포함하는 8-MOP/UVA 손상 세포사멸성 phDC를 내재화한 건강한 phDC로 처리된 동물
상기 처리군의 phDC는 다음과 같이 생성될 수 있다:
b) 자가항원을 제시하는 건강한 phDC
건강한 동형 동물로부터 단핵구를 얻고, TI 플레이트를 통과시킨 후(Ventura 등 J Vis Exp . 2019 May 17; 147), 자가항원과 함께 밤새 인큐베이션하여 항원 흡수를 확보한다.
c) 자가항원을 제시하는 8-MOP/UVA 손상된 세포사멸성 phDC:
건강한 동형 동물로부터 단핵구를 얻고 위와 같이 TI 플레이트를 통과시킨 후 세포 손상을 유도하기에 충분한 투여량으로 8-MOP 및 UVA에 노출시키고 자가항원과 함께 밤새 인큐베이션한다.
d) 자가항원을 함유하는 내재화된 8-MOP/UVA 손상된 세포사멸성 phDC를 갖는 건강한 phDC:
군 c)로부터의 세포를 동일한 수의 신선한 단핵구와 혼합하고 위와 같이 TI 플레이트를 통과시킨 후 밤새 공동-인큐베이션하여 건강한 phDC에 의한 8-MOP/UVA 손상된 phDC의 자가항원의 흡수를 보장한다.
전술한 바와 같이 생성된 phDC는 동물 모델에 대해 적절한 시간 간격 하에 적절한 투여량(예를 들어 적어도 1×106개의 세포/동물)으로 적절한 군의 마우스에, 전형적으로 적어도 3회 정맥내 투여된다.
특정 모델에 적합한 기간 동안 자가면역 질환에 대해 동물을 모니터링한다(예를 들어 매일). 또한, 실험 중 다른 시점에서 동물을 희생시킬 수 있다:
(i) 질병 유도 전, 즉 건강한 동물;
(ii) 질병 유도 후, 치료하지 않고, 즉 면역화된 동물;
(iii) 2차 및 3차 백신 접종 사이에, 즉 중간 시점;
(iv) 실험 종료시, 즉 종말점(end point)
즉 안락사 후, 동물의 시료(예를 들어 비장, 서혜부 및 겨드랑이 림프절)를 수집하여 단세포 현탁액으로 해리하고, 면역화 및 치료에 대한 면역 반응을 평가하는데 사용한다. 표준 면역 반응 분석은 세포 표면 또는 세포내 유세포 분석에 의한 면역 세포 표현형 분석, 염증성 또는 항염증성 사이토카인 분비 분석(예를 들어 ELISA, Luminex, ELISpot), 자가항원 재자극에 반응한 T 세포 증식(예를 들어 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE) 희석)을 포함한다.
예시적인 결과는 다음을 포함할 것이다:
a) 미처리 동물:
- 모델에서 예상되는 것과 일치하는 진행성 질환.
b) 자가항원을 제시하는 건강한 phDC로 처리된 동물:
- 건강한 phDC의 추가적인 면역화 효과로 인해 모델에서 예상되는 것보다 더 심각할 수 있는 진행성 질환.
c) 자가항원을 제시하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC로 처리된 동물:
- 주사된 동물에서 건강한 DC에 의해 흡수된 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC의 일부 관용성 효과로 인해 상기 모델에서 예상되는 것보다 덜 심각할 수 있는 진행성 질환.
d) 자가항원을 함유하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC를 갖는 건강한 phDC로 처리된 동물:
- 자가항원을 보유하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC를 흡수하였고, 따라서 조절될 수 있고 질환을 감소시키는 건강한 phDC의 관용성 효과로 인해 질환을 유의하게 감소시킨다.
실험 8: 관용성
phDC를
이용한 다발성 경화증(MS)을 포함하는 자가면역 질환의 개선
본 실시예에서, 마우스 모델을 이용하여 관용성 phDC가 자가면역 질환 예를 들어 MS를 개선하는지 평가한다.
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 인간의 임상 질환에 대한 많은 유사성을 갖는 인간의 MS의 폭넓게 수용되는 마우스 모델이다. 뮤린(murine) EAE 모델은 진행성 마비, CNS 염증, 탈수초(demyelination)에 의해 특징지워지며, CD8+ 세포 및 B 세포도 역할을 하지만 주로 미엘린-특이적 CD4+ T 세포에 의해 매개된다. 따라서, EAE 마우스는 자가면역 질환 환경에서 수지상 세포에 의한 내성 유도를 모델링하는 데 사용될 수 있다.
1. EAE는 당업계에 공지의 표준 프로토콜에 따라, 완전 프로인트 보조제(Complete Freund's adjuvant; CFA) 에멀젼에서 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein; MOG) 펩티드 MOG35-55 또는 MOG1-125를 사용한 면역화 후, PBS에 백일해 독소(PTX)의 투여에 의해 11-13주령 암컷 C57BL/6 마우스에서 유도된다.
2. EAE는 면역 후 8 내지 18일에 발병할 것으로 예상된다. 질병 유발 후, 모든 동물을 웰빙에 대해 매일 검사하고 다음과 같은 표준 EAE 임상 기준에 따라 점수를 매긴다: 0, 무증상; 0.5, 꼬리의 원위 절반에서의 색조(tone)의 상실; 1, 꼬리 전체에서의 색조의 상실; 1.5, 뒷다리 약화; 2, 뒷다리 마비; 2.5, 뒷다리 편마비(paraplegia); 3, 앞다리 약화; 4, 사지 불완전 마비(quadriparesis); 4.5, 중증 사지 불완전 마비; 5, 사지 마비(quadriplegia); 6, 사망. 치료는 첫째날 평균 임상 점수가 1.0을 넘어서 시작되어 대부분의 마우스에서 임상적으로 관련된 질병이 발병한다.
3. 마우스는 다음과 같이 적어도 10마리의 각각의 동물로 4개 처리군으로 나뉜다:
a) 미처리 마우스
b) MOG 항원을 제시하는 건강한 phDC로 처리된 마우스
c) MOG 항원을 제시하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC로 처리된 마우스
d) MOG 항원을 함유하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC를 내재화한 건강한 phDC로 처리된 마우스
4. 상기 처리군의 phDC는 다음과 같이 생성된다:
b) MOG 항원을 제시하는 건강한 phDC:
건강한 동형 마우스로부터 단핵구를 얻고, TI 플레이트를 통과시키고(Ventura 등 J Vis Exp 2019 May 17; 147), 항원 흡수를 보장하도록 MOG 항원과 밤새 인큐베이션한다.
c) MOG 항원을 제시하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC:
건강한 동형 마우스로부터 단핵구를 얻고 위와 같이 TI 플레이트를 통과시킨 후, 세포 손상을 유도하기에 충분한 투여량으로 8-MOP 및 UVA에 노출시키고 MOG 항원과 밤새 인큐베이션한다.
d) 8-MOP/UVA 손상된 세포사멸성 phDC를 MOG 항원을 내재화한 건강한 phDC:
군 c)로부터의 세포를 동일한 수의 신선한 단핵구와 혼합하고, 위와 같이 TI 플레이트를 통과시키고, 밤새 공동-인큐베이션하여 건강한 phDC에 의해 MOG 항원을 함유하는 8-MOP/UVA 손상된 phDC의 흡수를 보장하도록 밤새 인큐베이션한다.
5. 전술한 바와 같이 생성된 phDC(항목 4 참조)는 적절한 군(항목 3 참조)에서 적어도 1×106개의 세포/마우스의 투여량으로 예를 들어 다음과 같이 적어도 3회 정맥내 투여된다:
- 첫째날 평균 임상 점수는 1.0을 초과하여, 대부분의 마우스에서 임상적으로 관련된 질환이 발병한 것을 반영하고(예를 들어 면역화 후 13일),
- 제 1 치료 투여량 후 4일(예를 들어 면역화 후 17일),
- 제 2 치료 투여량 후 4일(예를 들어 면역화 후 21일).
6. 면역화 후 적어도 4주까지 매일 EAE 임상 점수에 대해 마우스를 모니터링한다.
7. 추가로, 마우스는 실험 중 상이한 시점에서 희생될 수 있다:
(i) EAE 유도 전, 즉 건강한 마우스;
(ii) EAE 유도 후, 그러나 치료 없이, 즉 면역화된 마우스;
(iii) 2차 및 3차 백신 접종 사이, 즉 중간 시점;
(iv) 실험의 종료시, 즉 종말점.
안락사 후, 비장 및 서혜부(inguinal) 및 겨드랑이(axillary) 림프절이 수득되고, 단일 세포 현탁액으로 해리되며, 면역화 및 치료에 대한 면역 반응을 평가하기 위해 사용된다. 표준 면역 반응 분석은 세포 표면 또는 세포내 유세포 분석에 의한 면역 세포 표현형 분석, 염증성 또는 항염증성 사이토카인 분비 분석(예를 들어 ELISA, Luminex, ELISpot), 및 MOG 펩티드 재자극에 반응한 T 세포 증식(예를 들어 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE) 희석)을 포함한다.
척추 또한 안락사에서 얻어지고, 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하고 조직학(histology) 및 면역조직화학(immunohistochemistry)에 의한 질병의 추가 평가에 사용된다. 전형적인 조직학적 분석에는 염증성 병소 수, 세포사멸성 세포 수, 탈수초화 정도(골수 염기성 단백질의 면역조직화학)가 포함된다.
예시적 결과는 하기를 포함할 것이다:
a) 미처리 마우스:
- 본 모델에서 예상되는 것과 일치하는 진행성 EAE 질환.
- 면역학적 검사에서, MOG 항원에 반응하는 염증성 면역 세포의 검출.
- 조직학적 검사에서, 상기 모델과 일치하는 축삭 손상 및 염증성 손상의 징후.
b) MOG 항원을 제시하는 건강한 phDC로 처리된 마우스:
- 건강한 phDC의 추가적인 면역화 효과로 인해 이 모델에서 예상되는 것보다 더 심각할 수 있는 진행성 EAE 질환.
- 면역학적 검사에서, MOG 항원에 반응성인 염증성 면역 세포의 증가된 검출.
- 조직학적 검사에서, 더 심각한 축삭 손상 및 염증성 손상의 징후.
c) MOG 항원을 제시하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC로 처리된 마우스:
- 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC가 주사된 마우스에서 건강한 DC에 의해 흡수되는 일부 관용성 효과로 인해 이 모델에서 예상되는 것보다 덜 심각할 수 있는 진행성 EAE 질환.
- 면역학적 검사에서, MOG 항원에 반응성인 염증성 면역 세포의 다소 감소된 검출.
- 조직학적 검사에서, 덜 심각한 축삭 손상 및 염증성 손상의 징후.
d) MOG 항원을 함유하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC를 내재화한 건강한 phDC로 처리된 마우스:
- MOG 항원을 보유하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC를 흡수하고, 따라서 EAE 질환을 조절하고 감소시킬 수 있는, 건강한 phDC의 관용성 효과로 인해, 유의하게 감소된 EAE 질환.
- 면역학적 검사에서, Treg와 같은 관용성 면역 세포의 검출, 및 MOG 항원에 대한 염증성 면역 세포의 유의한 감소.
- 조직학적 검사에서, 유의하게 감소된 축삭 손상 및 염증성 손상.
실험 9 : 관용성
phDC를
이용한 다른 자가면역 질환의 개선
본 실시예에서, 적절한 동물 모델(예를 들어 상기 표 A에 기재된 동물 모델)을 사용하여 관용성 phDC가 자가면역 질환을 개선하는지 여부를 평가한다.
예를 들어 비비만 당뇨병(nonobese diabetic; NOD) 마우스는 인슐린-의존성 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus; IDDM)에 대한 당업계에서 인정되는 모델이다. 본 실시예에서는 실험 7 및 8에서 설명한 것과 유사한 접근법을 이용하여 NOD 마우스를 평가하였다.
NOD 마우스에 대한 관련 임상 기준에 따라 동물을 조사하고 점수를 매긴다. 일부 실시예에서, 동물은 다음과 같이 4개 처리군으로 나뉜다:
a) 미처리 동물
b) 자가항원(예를 들어 췌장 β-세포 항원)을 제시하는 건강한 phDC로 처리된 동물
c) 자가항원(예를 들어 췌장 β-세포 항원)을 제시하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC로 처리된 동물
d) 자가항원(예를 들어 췌장 β-세포 항원)을 함유하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC를 내재화한 phDC로 처리된 동물
상기 처리군에 대한 phDC는 다음과 같이 생성될 수 있다:
b) 자가항원(예를 들어 췌장 β-세포 항원)을 제시하는 건강한 phDC:
건강한 동형 동물로부터 단핵구를 얻고, 문헌 [Ventura 등 J Vis Exp . 2019 May 17; 147]에서 기술한 바와 같이 TI 플레이트를 통과시킨 후, 항원 흡수를 보장하도록 자가항원과 밤새 인큐베이션한다.
c) 자가항원(예를 들어 췌장 β-세포 항원)을 제시하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC:
건강한 동형 동물로부터 단핵구를 얻고 위와 같이 TI 플레이트를 통과시킨 후, 세포 손상을 유도하기에 충분한 투여량으로 8-MOP 및 UVA에 노출시키고 자가항원(예를 들어 췌장 β-세포 항원)과 밤새 인큐베이션한다.
d) 자가항원(예를 들어 췌장 β-세포 항원)을 함유하는 8-MOP/UVA 손상된 세포사멸성 phDC를 내재화한 건강한 phDC:
군 c)로부터의 세포는 동일한 수의 신선한 단핵구와 혼합하여 위와 같이 TI 플레이트를 통과시킨 후, 건강한 phDC에 의한 자가항원(예를 들어 췌장 β-세포 항원)을 함유하는 8-MOP/UVA 손상된 phDC의 흡수를 보장하도록 밤새 공동-인큐베이션한다.
전술한 바와 같이 생성된 phDC는 동물 모델에 대해 적절한 시간 간격 하에 적절한 투여량(예를 들어 적어도 1×106개의 세포/동물)으로 적절한 군, 전형적으로 적어도 3회 마우스에 정맥내 투여된다.
당뇨병 표현형에 대해 동물을 모니터링한다. 추가로, 동물들은 실험 중 상이한 시점에서 희생될 수 있다:
(i) 질환 유도 전, 즉 건강한 동물;
(ii) 질환 유도 후, 그러나 치료 없이, 즉 면역화된 동물;
(iii) 2차 및 3차 백신접종 사이, 즉 중간 시점;
(iv) 실험 종료시, 종말점.
즉, 안락사 후, 동물(예를 들어 비장 및 서혜부 및 겨드랑이 림프절)로부터 샘플을 수득하고, 단일 세포 현탁액으로 해리하고, 면역화 및 치료에 대한 면역 반응을 평가하는데 사용된다. 표준 면역 반응 검정은 세포 표면 또는 세포내 유세포 분석에 의한 면역 세포 표현형 분석, 염증성 또는 항염증성 사이토카인 분비 검정(예를 들어 ELISA, Luminex, ELISpot), 및 자가항원 재자극에 반응한 T 세포 증식(예를 들어 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE) 희석)을 포함한다.
예시적인 결과는 하기를 포함할 것이다:
a) 미처리 동물:
- NOD 모델에서 예상되는 것과 일치하는 진행성 질환.
b) 자가항원을 제시하는 건강한 phDC로 처리된 동물:
- 건강한 phDC의 추가적인 면역 효과로 인해 NOD 모델에서 예상되는 것보다 더 심각할 수 있는 진행성 질환.
c) 자가항원을 제시하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC로 처리된 동물:
- 주사된 동물에서 건강한 DC에 의해 흡수되는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC의 일부 관용성 효과로 인해 NOD 모델에서 예상되는 것보다 덜 심각할 수 있는 진행성 질환.
d) 자가항원을 함유하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC를 내재화한 건강한 phDC로 처리된 동물:
- 자가항원을 보유하는 8-MOP/UVA-손상된 세포사멸성 phDC의 관용성 효과로 인해 유의하게 감소된 질환.
다른 자가면역 질환은 전술한 바와 유사한 접근법을 사용하여 평가할 수 있다.
실험 10: 관용성
phDC를
사용한 자가면역 질환의 치료
자가면역 질환을 앓고 있는 인간 환자를 본원에서 기술한 바와 같이 관용성 phDC를 사용하여 치료한다.
예를 들어 수지상 세포의 샘플은 자가면역 질환(예를 들어 MS)을 앓고 있는 환자로부터 얻어진다. 수지상 세포는 세포사멸성 제제(예를 들어 프소랄렌과 UVA(PUVA), 특히 8-MOP와 UVA의 조합물)에 노출된다. 일부 실시예에서, 자가항원은 또한 세포사멸성 제제에 노출되는 수지상 세포에 첨가된다. 예를 들어 MS의 경우, 임의의 적절한 자가항원, 예를 들어 표 A에 기재된 MBP 및/또는 MOG를 첨가할 수 있다. 세포는 세포가 세포사멸성을 겪도록 하는 조건 하에 및 시간 동안 세포사멸성 제제에 노출된다.
이어서, 생성된 세포사멸성 수지상 세포는 본원에 기재된 바와 같이 생성된 생리학적 수지상 세포와 혼합되고, 대상체에게 투여하기 전에, 예를 들어 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 공동-인큐베이션될 수 있다. 대안적으로, 상기 조합물은 공동-인큐베이션 없이 대상체에게 직접 투여될 수 있다. phDC를 사용한 치료는 자가면역 질환을 개선시킬 것으로 예상된다.
실험 11:
PUVA
손상된
PBMC와
인큐베이션된
인간
phDC에서
증가된
PD-L1 발현
건강한 지원자의 혈액에서 TI 플레이트를 사용하여 인간 phDC를 생성하고 동일한 수의 8-MOP/UVA 처리된 동형 PBMC(PUVA syn PBMC) 또는 동종이계 PBMC(PUVA allo PBMC)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. PD-L1 발현(평균 형광강도, MFI, 생존, CD14+ phDC 분획으로 보고됨)은 18 시간에 유세포 분석법으로 측정하였으며, 동종이계 또는 동형 PUVA 처리된 PBMC와 함께 공동-인큐베이션 후, 전구체 단핵구보다 건강한 phDC에서 유의하게 높은 수준으로 발현되는 것으로 나타났다(도 18). N = 분석된 혈액 공여자의 수; p-값 = 웰치 보정을 갖는 언페어드(unpaired) t 시험.
실험 12:
MLR
분석에서 반응자 T 세포의
감소된
PD1 발현
MLR(혼합된 림프구 반응) 분석은 건강한 지원자의 혈액을 사용하여 설정되었다. 간단히 말하면, 한 공여자(T 세포)로부터의 2×105개의 정제된 CFSE 표지 반응자 T 세포를 동일한 공여자(동종 배양물) 또는 무관한 공여자(MLR)의 4×105개의 감마선-조사된(3000 rad) 자극자 PBMC와 함께 공동-인큐베이션하였다. MLR 반응을 억제하기 위하여, 일부 배양물에 1×105개의 동형 8-MOP/UVA 처리된 PBMC 및 1×105개의 동형 TI 플레이트 통과 phDC(MLR+PUVA syn. PBMC+phDC)를 추가로 보충하였다. 배양 5일 후, 반응자 CD8 및 CD4 T 세포의 증식을 유세포 분석법(FACS)(A, B)에 의한 CFSE 희석을 측정하여 분석하였다. 활성화된 T 세포(C, D)를 검출하기 위해 CD44 및 PD1 발현을 이용하여 반응자 CD8 및 CD4 T 세포의 활성화 상태를 FACS로 추가로 평가하였다. CD8 및 CD4 T 세포 모두에 대하여 건강한 phDC 및 PUVA 처리된 PBMC의 첨가는 증식 및 활성화를 유의하게 억제하였다(도 19). N = 분석된 혈액 공여자의 수; p-값 = 웰치 보정을 갖는 언페어드 t 시험.
또한, 본 발명은 하기 구현예에 관한 것이다.
1. 관용성 수지상 세포(tolerogenic dendritic cells)를 선택적으로 생산하는 방법으로서,
상기 방법은:
a) 공여자(donor)로부터 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제(apoptotic agents)에 노출시키는 단계;
c) 수용자(recipient)로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 공여자 수지상 세포를 단계 c)로부터의 생리학적 수용자 수지상 세포와 혼합하는 단계;
를 포함하는, 방법.
2. 구현예 1에 있어서,
단계 d) 후에, 단계 b)의 세포사멸성 공여자 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수용자 수지상 세포와 공동-인큐베이션하는 단계가 수행되는, 방법.
3. 구현예 2에 있어서,
상기 공동-인큐베이션하는 단계는 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행되는, 방법.
4. 구현예 1에 있어서,
상기 세포사멸성 공여자 수지상 세포를 상기 수용자로부터의 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계 d)는 상기 수용자 내에서 일어나는, 방법.
5. 구현예 1에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 공여자의 체외 혈액 샘플로부터 유래되는, 방법.
6. 구현예 1에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 공여자로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어지는, 방법.
7. 구현예 1에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 제제는 프소랄렌(psoralens) 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트 및 UVA, 및/또는 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid) 및 광(light)을 포함하는, 방법.
8. 구현예 7에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌(amotosalen)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
9. 구현예 8에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP인, 방법.
10. 구현예 1에 있어서,
단계 c)의 생리학적 수지상 세포는 상기 수용자로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해서 얻어지는, 방법.
11. 구현예 1 내지 10 중의 어느 하나에 있어서,
상기 공여자 및/또는 수용자는 포유동물, 바람직하게는 인간인, 방법.
12. 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법으로서,
상기 방법은:
a) 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 수지상 세포(recipient`s complimentary haplo-donor)를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포와 혼합하는 단계;
를 포함하는, 방법.
13. 구현예 12에 있어서,
단계 d) 후에, 단계 b)의 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포와 공동-인큐베이션하는 단계가 수행되는, 방법.
14. 구현예 13에 있어서,
상기 공동-인큐베이션하는 단계는 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행되는, 방법.
15. 구현예 12에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포와 혼합하는 단계 d)는 상기 상보적 하플로-공여자 내에서 일어나는, 방법.
16. 구현예 12에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 수용자의 상보적 하플로-공여자의 체외 혈액 샘플로부터 유래되는, 방법.
17. 구현예 12에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어지는, 방법.
18. 구현예 12에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 제제는 프소랄렌 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트 및 UVA, 및/또는 5-아미노레불린산 및 광을 포함하는, 방법.
19. 구현예 18에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
20. 구현예 19에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP인, 방법.
21. 구현예 12에 있어서,
단계 c)의 생리학적 수지상 세포는 상기 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해서 얻어지는, 방법.
22. 구현예 12 내지 21 중의 어느 하나에 있어서,
상기 상보적 하플로-공여자, 상기 하플로-공여자 및/또는 상기 수용자는 포유동물, 바람직하게는 인간인, 방법.
23. 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법으로서,
상기 방법은:
a) 수용자로부터 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 수용자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계;
를 포함하는, 방법.
24. 구현예 23에 있어서,
단계 d) 후에, 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 공동-인큐베이션하는 단계가 수행되는, 방법.
25. 구현예 24에 있어서,
상기 공동-인큐베이션하는 단계는 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행되는, 방법.
26. 구현예 23에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계 c)는 상기 수용자 내에서 일어나는, 방법.
27. 구현예 23에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 수용자의 체외 혈액 샘플로부터 유래되는, 방법.
28. 구현예 23에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 수용자로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어지는, 방법.
29. 구현예 23에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 제제는 프소랄렌 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트 및 UVA, 및/또는 5-아미노레불린산 및 광을 포함하는, 방법.
30. 구현예 29에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
31. 구현예 30에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP인, 방법.
32. 구현예 23에 있어서,
단계 c)의 생리학적 수지상 세포는 상기 수용자로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해서 얻어지는, 방법.
33. 구현예 23 내지 32 중의 어느 하나에 있어서,
상기 공여자 및 수용자는 포유동물, 바람직하게는 인간인, 방법.
34. 구현예 1 내지 33 중의 어느 하나에 있어서,
상기 이식조직은 기관 또는 줄기 세포 이식조직인, 방법.
35. 구현예 1 내지 11 중의 어느 하나에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포.
36. 구현예 12 내지 22 중의 어느 하나에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포.
37. 구현예 23 내지 34 중의 어느 하나에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포.
38. 구현예 35 내지 37 중의 어느 하나에 있어서,
이식편대 숙주 질환(graft versus host disease)을 예방하거나 또는 감소시키는 방법에서 사용하기 위한 관용성 수지상 세포.
39. 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법으로서,
상기 방법은:
a) 대상체로부터 얻어진 제 1 샘플의 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 대상체로부터 얻어진 제 2 샘플의 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계;
를 포함하는, 방법.
40. 구현예 39에 있어서,
단계 d) 후에, 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 공동-인큐베이션하는 단계가 수행되는, 방법.
41. 구현예 40에 있어서,
상기 공동-인큐베이션하는 단계는 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행되는, 방법.
42. 구현예 39에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계 c)는 상기 대상체 내에서 일어나는, 방법.
43. 구현예 39 내지 42 중의 어느 하나에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체의 체외 혈액 샘플로부터 유래되는, 방법.
44. 구현예 43에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어지는, 방법.
45. 구현예 39 내지 44 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법은 수지상 세포를 항원 분자와 인큐베이션하는 단계 a1)을 더 포함하는, 방법.
46. 구현예 45에 있어서,
상기 항원 분자는 자가항원(autoantigen)인, 방법.
47. 구현예 45 또는 46에 있어서,
상기 항원 분자는 천연 공급원(natural source)으로부터 유래되거나, 화학적으로 합성되거나 또는 재조합으로 생산되는, 방법.
48. 구현예 45 또는 46에 있어서,
상기 항원 분자는 세포로부터 유래되는, 방법.
49. 구현예 46에 있어서,
상기 자가항원은, Rh 혈액형 항원, 혈소판 인테그린 GpIIb:IIIa, 기저막 콜라겐 IV형의 비콜라겐성 도메인, 표피 카데린, 연쇄상구균 세포벽 항원, 간성 C형 항원을 갖거나 갖지 않는 류마티스 인자 IgG 복합체, 췌장 β-세포 항원, 미엘린 염기성 단백질, 단백지방질 단백질, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 데스모글레인 3, 글루탐산 탈탄산효소, 아세틸콜린 수용체, 카복시펩티다제 H, 크로모그라닌 A, 글루타메이트 탈탄산효소, 이모겐-38, 인슐린, 인슐린종 항원-2 및 2β, 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질(islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit related protein; IGRP), 프로인슐린, α-에놀라아제, 아쿠아포린-4, β-아레스틴, S100-β, 시트룰린화 단백질, 콜라겐 II, 열 충격 단백질, 인간 연골 당단백질 39, La 항원, 뉴클레오솜 히스톤 및 리보핵단백질(snRNP), 인지질-β-2 당단백질 I 복합체, 폴리(ADP-리보스) 중합효소, U-1 소형 리보핵단백질 복합체의 Sm 항원, 췌장 섬세포 항원, 세포질 링커 단백질-170(CLIP-170), 쇼그렌 증후군 항원 A(SS-A/Ro), 쇼그렌 증후군 항원 B(SS-B/La), 쇼그렌 루푸스 항원(SL) 및 피부경화증 항원 70(Scl-70)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
50. 구현예 39 내지 49 중의 어느 하나에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 제제는 프소랄렌 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트 및 UVA, 및/또는 5-아미노레불린산 및 광을 포함하는, 방법.
51. 구현예 50에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
52. 구현예 50에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP인, 방법.
53. 구현예 39 내지 52 중의 어느 하나에 있어서,
단계 c)의 생리학적 수지상 세포는 상기 대상체로부터의 PBMC의 플레이트 통과에 의해서 얻어지는, 방법.
54. 구현예 39 내지 53 중의 어느 하나에 있어서,
상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간인, 방법.
55. 구현예 39 내지 54 중의 어느 하나에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포.
56. 구현예 55에 있어서,
자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 관용성 수지상 세포.
57. 구현예 56에 있어서,
상기 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 근위축성 측삭 경화증, 심상성 천포창, 건선, 중증 근무력증, 갑상선염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혈소판 감소성 자반증, 한랭글로불린혈증(cryoglobulinemia), 자가면역 용혈성 빈혈, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 애디슨병(Addison's disease), 셀리악병(celiac disease), 만성 피로 증후군, 대장염, 크론병(Crohn's disease), 섬유근육통, 갑상선기능항진증, 그레이브스병(Graves disease), 갑상선기능저하증, 하시모토병(Hashimoto's disease), 자궁내막증, 악성 빈혈, 굿파스쳐 증후군(Goodpasture syndrome), 베게너병(Wegener's disease) 및 류마티스열(rheumatic fever)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 관용성 수지상 세포.
58. 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역을 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 구현예 55의 관용성 수지상 세포를 유효량으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
59. 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역을 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 유효량의 관용성 수지상 세포를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, 상기 관용성 수지상 세포는 상기 대상체로부터 얻어진 세포사멸성 수지상 세포로부터의 물질을 포함하는 생리학적 수지상 세포, 자가항원, 그의 단편, 또는 그들의 조합물을 포함하는, 방법.
60. 구현예 58 또는 59에 있어서,
상기 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 근위축성 측삭 경화증, 심상성 천포창, 건선, 중증 근무력증, 갑상선염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혈소판 감소성 자반증, 한랭글로불린혈증(cryoglobulinemia), 자가면역 용혈성 빈혈, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 애디슨병, 셀리악병, 만성 피로 증후군, 대장염, 크론병, 섬유근육통, 갑상선기능항진증, 그레이브스병, 갑상선기능저하증, 하시모토병, 자궁내막증, 악성 빈혈, 굿파스쳐 증후군, 베게너병 및 류마티스열을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
61. 구현예 59 또는 60에 있어서,
상기 자가항원은, Rh 혈액형 항원, 혈소판 인테그린 GpIIb:IIIa, 기저막 콜라겐 IV형의 비콜라겐성 도메인, 표피 카데린, 연쇄상구균 세포벽 항원, 간성 C형 항원을 갖거나 갖지 않는 류마티스 인자 IgG 복합체, 췌장 β-세포 항원, 미엘린 염기성 단백질, 단백지방질 단백질, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 데스모글레인 3, 글루탐산 탈탄산효소, 아세틸콜린 수용체, 카복시펩티다제 H, 크로모그라닌 A, 글루타메이트 탈탄산효소, 이모겐-38, 인슐린, 인슐린종 항원-2 및 2β, 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질(IGRP), 프로인슐린, α-에놀라아제, 아쿠아포린-4, β-아레스틴, S100-β, 시트룰린화 단백질, 콜라겐 II, 열 충격 단백질, 인간 연골 당단백질 39, La 항원, 뉴클레오솜 히스톤 및 리보핵단백질(snRNP), 인지질-β-2 당단백질 I 복합체, 폴리(ADP-리보스) 중합효소, U-1 소형 리보핵단백질 복합체의 Sm 항원, 췌장 섬세포 항원, 세포질 링커 단백질-170(CLIP-170), 쇼그렌 증후군 항원 A(SS-A/Ro), 쇼그렌 증후군 항원 B(SS-B/La), 쇼그렌 루푸스 항원(SL) 및 피부경화증 항원 70(Scl-70)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
62. 대상체로부터 얻어진 세포사멸성 수지상 세포로부터의 물질을 포함하는 생체외 관용성 수지상 세포.
63. 구현예 62에 있어서,
자가항원 또는 그의 단편을 더 포함하는, 생체외 관용성 수지상 세포.
64. 조성물로서,
(a) 대상체로부터 얻어진 수지상 세포의 샘플;
(b) 세포사멸성 제제; 및
(c) 자가항원 또는 그의 단편;
을 포함하는, 조성물.
65. 구현예 64에 있어서,
상기 세포사멸성 제제는 프소랄렌, 리보플라빈-포스페이트 또는 5-아미노레불린산을 포함하는, 조성물.
66. 구현예 65에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌을 포함하는 군으로부터 선택되는, 조성물.
67. 구현예 66에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP인, 조성물.
68. 구현예 62 내지 67 중의 어느 하나에 있어서,
상기 자가항원은, Rh 혈액형 항원, 혈소판 인테그린 GpIIb:IIIa, 기저막 콜라겐 IV형의 비콜라겐성 도메인, 표피 카데린, 연쇄상구균 세포벽 항원, 간성 C형 항원을 갖거나 갖지 않는 류마티스 인자 IgG 복합체, 췌장 β-세포 항원, 미엘린 염기성 단백질, 단백지방질 단백질, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 데스모글레인 3, 글루탐산 탈탄산효소, 아세틸콜린 수용체, 카복시펩티다제 H, 크로모그라닌 A, 글루타메이트 탈탄산효소, 이모겐-38, 인슐린, 인슐린종 항원-2 및 2β, 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질(IGRP), 프로인슐린, α-에놀라아제, 아쿠아포린-4, β-아레스틴, S100-β, 시트룰린화 단백질, 콜라겐 II, 열 충격 단백질, 인간 연골 당단백질 39, La 항원, 뉴클레오솜 히스톤 및 리보핵단백질(snRNP), 인지질-β-2 당단백질 I 복합체, 폴리(ADP-리보스) 중합효소, U-1 소형 리보핵단백질 복합체의 Sm 항원, 췌장 섬세포 항원, 세포질 링커 단백질-170(CLIP-170), 쇼그렌 증후군 항원 A(SS-A/Ro), 쇼그렌 증후군 항원 B(SS-B/La), 쇼그렌 루푸스 항원(SL) 및 피부경화증 항원 70(Scl-70)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 생체외 관용성 수지상 세포 또는 조성물.
Claims (67)
- 관용성 수지상 세포(tolerogenic dendritic cells)를 선택적으로 생산하는 방법으로서,
상기 방법은:
a) 공여자(donor)로부터 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제(apoptotic agents)에 노출시키는 단계;
c) 수용자(recipient)로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 공여자 수지상 세포를 단계 c)로부터의 생리학적 수용자 수지상 세포와 혼합하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 1 항에 있어서,
단계 d) 후에, 단계 b)의 세포사멸성 공여자 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수용자 수지상 세포와 공동-인큐베이션하는(co-incubating) 단계가 수행되는, 방법. - 제 2 항에 있어서,
상기 공동-인큐베이션하는 단계는 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행되는, 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 세포사멸성 공여자 수지상 세포를 상기 수용자로부터의 상기 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계 d)는 상기 수용자 내에서 일어나는, 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 공여자의 체외 혈액 샘플로부터 유래되는, 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 공여자로부터 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어지는, 방법. - 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 제제는 프소랄렌(psoralens) 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트 및 UVA, 및/또는 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid) 및 광(light)을 포함하는, 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌(amotosalen)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법. - 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP인, 방법. - 제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 c)의 생리학적 수지상 세포는 상기 수용자로부터 PBMC의 플레이트 통과에 의해서 얻어지는, 방법. - 제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 공여자 및/또는 수용자는 포유동물, 바람직하게는 인간인, 방법. - 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법으로서,
상기 방법은:
a) 수용자의 상보적 하플로-공여자(haplo-donor)로부터 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포와 혼합하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 12 항에 있어서,
단계 d) 후에, 단계 b)의 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포와 공동-인큐베이션하는 단계가 수행되는, 방법. - 제 13 항에 있어서,
상기 공동-인큐베이션하는 단계는 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행되는, 방법. - 제 12 항에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 상보적 하플로-공여자 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 하플로-공여자 수지상 세포와 혼합하는 단계 d)는 상기 하플로-공여자 내에서 일어나는, 방법. - 제 12 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 수용자의 상보적 하플로-공여자의 체외 혈액 샘플로부터 유래되는, 방법. - 제 12 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 수용자의 상보적 하플로-공여자로부터 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어지는, 방법. - 제 12 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 제제는 프소랄렌 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트 및 UVA, 및/또는 5-아미노레불린산 및 광을 포함하는, 방법. - 제 18 항에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법. - 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP인, 방법. - 제 12 항 내지 제 20 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 c)의 생리학적 수지상 세포는 상기 수용자의 하플로-공여자로부터 PBMC의 플레이트 통과에 의해서 얻어지는, 방법. - 제 12 항 내지 제 21 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 상보적 하플로-공여자, 상기 하플로-공여자 및/또는 상기 수용자는 포유동물, 바람직하게는 인간인, 방법. - 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법으로서,
상기 방법은:
a) 수용자로부터 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 수용자로부터 생리학적 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 23 항에 있어서,
단계 d) 후에, 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 공동-인큐베이션하는 단계가 수행되는, 방법. - 제 24 항에 있어서,
상기 공동-인큐베이션하는 단계는 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행되는, 방법. - 제 23 항에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 혼합하는 단계 c)는 상기 수용자 내에서 일어나는, 방법. - 제 23 항 내지 제 26 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 수용자의 체외 혈액 샘플로부터 유래되는, 방법. - 제 23 항 내지 제 27 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 수용자로부터 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어지는, 방법. - 제 23 항 내지 제 28 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 제제는 프소랄렌 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트 및 UVA, 및/또는 5-아미노레불린산 및 광을 포함하는, 방법. - 제 29 항에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법. - 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP인, 방법. - 제 23 항 내지 제 31 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 c)의 생리학적 수지상 세포는 상기 수용자로부터 PBMC의 플레이트 통과에 의해서 얻어지는, 방법. - 제 23 항 내지 제 32 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 공여자 및 수용자는 포유동물, 바람직하게는 인간인, 방법. - 제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포.
- 제 12 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포.
- 제 23 항 내지 제 33 항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포.
- 제 34 항 내지 제 36 항 중의 어느 한 항에 있어서,
이식편대 숙주 질환(graft versus host disease)을 예방하거나 또는 감소시키는 방법에서 사용하기 위한, 관용성 수지상 세포. - 관용성 수지상 세포를 선택적으로 생산하는 방법으로서,
상기 방법은:
a) 대상체로부터 얻어진 제 1 샘플의 수지상 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)의 수지상 세포를 세포사멸성 제제에 노출시키는 단계;
c) 상기 대상체로부터 얻어진 제 2 샘플의 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
d) 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 수지상 세포와 혼합하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 38 항에 있어서,
단계 d) 후에, 단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 생리학적 수지상 세포와 공동-인큐베이션하는 단계가 수행되는, 방법. - 제 39 항에 있어서,
상기 공동-인큐베이션하는 단계는 적어도 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 또는 6 시간 동안 수행되는, 방법. - 제 38 항 내지 제 40 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 수지상 세포를 단계 c)의 수지상 세포와 혼합하는 단계 c)는 상기 대상체 내에서 일어나는, 방법. - 제 38 항 내지 제 41 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체의 체외 혈액 샘플로부터 유래되는, 방법. - 제 38 항 내지 제 42 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 a)의 수지상 세포는 상기 대상체로부터 PBMC의 플레이트 통과에 의해 얻어지는, 방법. - 제 38 항 내지 제 43 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 상기 수지상 세포를 항원 분자와 인큐베이션하는 단계 a1)을 더 포함하는, 방법. - 제 44 항에 있어서,
상기 항원 분자는 자가항원(autoantigen)인, 방법. - 제 44 항 또는 제 45 항에 있어서,
상기 항원 분자는 천연 공급원(natural source)으로부터 유래되거나, 화학적으로 합성되거나 또는 재조합으로 생산되는, 방법. - 제 44 항 또는 제 45 항에 있어서,
상기 항원 분자는 세포로부터 유래되는, 방법. - 제 45 항에 있어서,
상기 자가항원은, Rh 혈액형 항원, 혈소판 인테그린 GpIIb:IIIa, 기저막 콜라겐 IV형의 비콜라겐성 도메인, 표피 카데린, 연쇄상구균 세포벽 항원, 간성 C형 항원을 갖거나 갖지 않는 류마티스 인자 IgG 복합체, 췌장 β-세포 항원, 미엘린 염기성 단백질, 단백지방질 단백질, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 데스모글레인 3, 글루탐산 탈탄산효소, 아세틸콜린 수용체, 카복시펩티다제 H, 크로모그라닌 A, 글루타메이트 탈탄산효소, 이모겐-38, 인슐린, 인슐린종 항원-2 및 2β, 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질(islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit related protein; IGRP), 프로인슐린, α-에놀라아제, 아쿠아포린-4, β-아레스틴, S100-β, 시트룰린화 단백질, 콜라겐 II, 열 충격 단백질, 인간 연골 당단백질 39, La 항원, 뉴클레오솜 히스톤 및 리보핵단백질(snRNP), 인지질-β-2 당단백질 I 복합체, 폴리(ADP-리보스) 중합효소, U-1 소형 리보핵단백질 복합체의 Sm 항원, 췌장 섬세포 항원, 세포질 링커 단백질-170(CLIP-170), 쇼그렌 증후군 항원 A(SS-A/Ro), 쇼그렌 증후군 항원 B(SS-B/La), 쇼그렌 루푸스 항원(SL) 및 피부경화증 항원 70(Scl-70)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법. - 제 38 항 내지 제 48 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 b)의 세포사멸성 제제는 프소랄렌 및 UVA, 리보플라빈-포스페이트 및 UVA, 및/또는 5-아미노레불린산 및 광을 포함하는, 방법. - 제 49 항에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법. - 제 49 항 또는 제 50 항에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP인, 방법. - 제 38 항 내지 제 51 항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계 c)의 수지상 세포는 상기 대상체로부터 PBMC의 플레이트 통과에 의해서 얻어지는, 방법. - 제 38 항 내지 제 52 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간인, 방법. - 제 38 항 내지 제 53 항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 관용성 수지상 세포.
- 제 54 항에 있어서,
자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 관용성 수지상 세포. - 제 55 항에 있어서,
상기 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 근위축성 측삭 경화증, 심상성 천포창, 건선, 중증 근무력증, 갑상선염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혈소판 감소성 자반증, 한랭글로불린혈증(cryoglobulinemia), 자가면역 용혈성 빈혈, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 애디슨병(Addison's disease), 셀리악병(celiac disease), 만성 피로 증후군, 대장염, 크론병(Crohn's disease), 섬유근육통, 갑상선기능항진증, 그레이브스병(Graves disease), 갑상선기능저하증, 하시모토병(Hashimoto's disease), 자궁내막증, 악성 빈혈, 굿파스쳐 증후군(Goodpasture syndrome), 베게너병(Wegener's disease) 및 류마티스열(rheumatic fever)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 관용성 수지상 세포. - 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역을 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 유효량의 제 54 항의 관용성 수지상 세포를 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법. - 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역을 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 유효량의 관용성 수지상 세포를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, 상기 관용성 수지상 세포는 상기 대상체로부터 얻어진 세포사멸성 수지상 세포로부터의 물질을 포함하는 생리학적 수지상 세포, 자가항원, 그의 단편, 또는 그들의 조합물을 포함하는, 방법. - 제 57 항 또는 제 58 항에 있어서,
상기 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 근위축성 측삭 경화증, 심상성 천포창, 건선, 중증 근무력증, 갑상선염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혈소판 감소성 자반증, 한랭글로불린혈증(cryoglobulinemia), 자가면역 용혈성 빈혈, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 애디슨병, 셀리악병, 만성 피로 증후군, 대장염, 크론병, 섬유근육통, 갑상선기능항진증, 그레이브스병, 갑상선기능저하증, 하시모토병, 자궁내막증, 악성 빈혈, 굿파스쳐 증후군, 베게너병 및 류마티스열을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법. - 제 58 항 또는 제 69 항에 있어서,
상기 자가항원은, Rh 혈액형 항원, 혈소판 인테그린 GpIIb:IIIa, 기저막 콜라겐 IV형의 비콜라겐성 도메인, 표피 카데린, 연쇄상구균 세포벽 항원, 간성 C형 항원을 갖거나 갖지 않는 류마티스 인자 IgG 복합체, 췌장 β-세포 항원, 미엘린 염기성 단백질, 단백지방질 단백질, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 데스모글레인 3, 글루탐산 탈탄산효소, 아세틸콜린 수용체, 카복시펩티다제 H, 크로모그라닌 A, 글루타메이트 탈탄산효소, 이모겐-38, 인슐린, 인슐린종 항원-2 및 2β, 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질(IGRP), 프로인슐린, α-에놀라아제, 아쿠아포린-4, β-아레스틴, S100-β, 시트룰린화 단백질, 콜라겐 II, 열 충격 단백질, 인간 연골 당단백질 39, La 항원, 뉴클레오솜 히스톤 및 리보핵단백질(snRNP), 인지질-β-2 당단백질 I 복합체, 폴리(ADP-리보스) 중합효소, U-1 소형 리보핵단백질 복합체의 Sm 항원, 췌장 섬세포 항원, 세포질 링커 단백질-170(CLIP-170), 쇼그렌 증후군 항원 A(SS-A/Ro), 쇼그렌 증후군 항원 B(SS-B/La), 쇼그렌 루푸스 항원(SL) 및 피부경화증 항원 70(Scl-70)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법. - 대상체로부터 얻어진 세포사멸성 수지상 세포로부터의 물질을 포함하는 생체외 관용성 수지상 세포.
- 제 61 항에 있어서,
자가항원 또는 그의 단편을 더 포함하는, 생체외 관용성 수지상 세포. - 조성물로서,
(a) 대상체로부터 얻어진 수지상 세포의 샘플;
(b) 세포사멸성 제제; 및
(c) 자가항원 또는 그의 단편;
을 포함하는, 조성물. - 제 63 항에 있어서,
상기 세포사멸성 제제는 프소랄렌, 리보플라빈-포스페이트 또는 5-아미노레불린산을 포함하는, 조성물. - 제 64 항에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP 및 아모토살렌을 포함하는 군으로부터 선택되는, 조성물. - 제 65 항에 있어서,
상기 프소랄렌은 8-MOP인, 조성물. - 제 61 항 내지 제 66 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 자가항원은, Rh 혈액형 항원, 혈소판 인테그린 GpIIb:IIIa, 기저막 콜라겐 IV형의 비콜라겐성 도메인, 표피 카데린, 연쇄상구균 세포벽 항원, 간성 C형 항원을 갖거나 갖지 않는 류마티스 인자 IgG 복합체, 췌장 β-세포 항원, 미엘린 염기성 단백질, 단백지방질 단백질, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 데스모글레인 3, 글루탐산 탈탄산효소, 아세틸콜린 수용체, 카복시펩티다제 H, 크로모그라닌 A, 글루타메이트 탈탄산효소, 이모겐-38, 인슐린, 인슐린종 항원-2 및 2β, 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질(IGRP), 프로인슐린, α-에놀라아제, 아쿠아포린-4, β-아레스틴, S100-β, 시트룰린화 단백질, 콜라겐 II, 열 충격 단백질, 인간 연골 당단백질 39, La 항원, 뉴클레오솜 히스톤 및 리보핵단백질(snRNP), 인지질-β-2 당단백질 I 복합체, 폴리(ADP-리보스) 중합효소, U-1 소형 리보핵단백질 복합체의 Sm 항원, 췌장 섬세포 항원, 세포질 링커 단백질-170(CLIP-170), 쇼그렌 증후군 항원 A(SS-A/Ro), 쇼그렌 증후군 항원 B(SS-B/La), 쇼그렌 루푸스 항원(SL) 및 피부경화증 항원 70(Scl-70)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 생체외 관용성 수지상 세포 또는 조성물.
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