KR20240038758A - 펩타이드 태그 및 당해 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산 - Google Patents

펩타이드 태그 및 당해 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산 Download PDF

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Abstract

본 개시는, 펩타이드 태그 및 당해 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 세포 내에 있어서의 단백질의 응집성을 저감할 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는 구체적으로는, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, (b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산인, 펩타이드 태그일 수 있다.

Description

펩타이드 태그 및 당해 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산
본 개시는, 펩타이드 태그 및 당해 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
세포 내에서 기능하는 항체 즉 인트라보디(세포내 항체)는, 고등 생물의 세포 내에서 항원(표적 분자)을 인식하여 결합함으로써 세포의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 이들 항원은, 세포내 항체에 결합하는 것에 의해 비활화될 수 있는 중요한 세포내 치료 표적으로도 될 수 있다. 또한, 연구 수법으로서, 세포내 항체의 사용은 세포의 내부에서 항체에 결합하는 것에 의해 직접 단백질의 기능을 특이적으로 저해하기 위한 수단으로서 주목 받고 있다.
세포내 항체의 경우, 우선 표준적인 방법으로 항원을 인식하는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 작성한 후, 그 cDNA로부터 1본쇄 항체(single chain Fv: scFv)를 코딩하는 DNA를 포함하는 세포내 발현 벡터를 구축하여, 중쇄(VH)와 경쇄(VL)의 복합체를 세포내 항체로 하는 것이 일반적이다. 최근에는, 인간 B 세포로부터 단리된 항체로부터, 인간 scFv를 제시하는 파지 라이브러리가 제작되고 있고, 세포내 항원에 결합하는 scFv의 단리에 사용되는 경우가 있다.
항체는 통상, 혈액 등의 체내의 세포외 공간을 순회하여 세포외 항원을 인식하여 기능하는 것이고, 세포외 환경에서의 작용이 전제이다. 따라서, 항체가 세포질에서 발현되는 경우, 발현 레벨의 저하 및 항체 도메인의 반감기의 제한에 이르는 폴딩 및 안정성의 문제가 생길 수 있다. 세포질 내에 있어서의 세포내 항체의 안정성의 문제는, 세포질 내에 있어서의 세포내 항체의 응집체 형성으로 이어질 수 있다. 응집체의 형성은, 세포내 항체의 산생량의 저하, 및 정상 기능의 발현의 저해 등으로 이어질 수 있다. 세포내 항체 이외의 단백질에 있어서도 마찬가지이다. 세포내 항체는, 특히 응집하기 쉬운 특징을 갖지만, 세포내 항체 이외의 단백질에 있어서도, 세포질에서 산생시킬 때에 세포질 내에 있어서 응집체를 형성할 수 있다.
이에 반해서, 산성 아미노산을 45% 이상 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 태그가, 세포내 항체의 안정성을 개선함이 나타나 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1). 특허문헌 1 및 비특허문헌 1에서는, 산성 아미노산을 45% 이상 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 태그의 유효성을 제안함에 있어서, 펩타이드 태그의 설계 지침으로서, 세포질의 pH 환경보다도 엔도솜의 세포질측 표면의 pH 환경을 기준으로 하여 전하치와 pI치가 충분히 낮아지도록 펩타이드 태그를 설계하는 것의 중요성이 지적되어 있다. 비특허문헌 3에서는, 항체의 중쇄 가변 영역에 대해서 HRAS의 막 국재화 시그널을 부가하고 있다.
WO2019/004213
Kabayama et al., 2020, Nature Communication, 11, 336 Shubhada et al., 2012, Biochemical genetics, Vol. 50, No. 7-8, pp. 625-41. Tanaka et al., 2007, EMBO Journal, 26: 3250-3259
본 개시는, 펩타이드 태그 및 당해 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 세포 내에 있어서의 단백질의 응집성을 저감할 수 있다.
본 발명자들은, 다양한 아미노산 서열의 펩타이드 태그에 대해 예의 연구한 바, 세포 내에 있어서의 단백질의 응집성에 대해서 경감 효과를 갖는 펩타이드 태그를 발견했다.
본 개시에 의하면 이하의 발명이 제공된다.
[1] 펩타이드, 예를 들어, 600아미노산 길이 이하, 예를 들어, 10∼200아미노산 길이(예를 들어, 10∼90아미노산 길이)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로서,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이며,
바람직하게는, 상기 펩타이드를 연결한 단백질의 세포 내에 있어서의 응집성을 저하시킬 수 있는,
펩타이드{여기에서, 바람직하게는, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 또는 15% 이상이 N 또는 P이다}.
[2] (c) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 보다 바람직하게는 15% 이하, 더 바람직하게는 10% 이하가, M, T, W, C, I, V, 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산인, 상기 [1]에 기재된 펩타이드.
[3] (d) A 또는 G가 각각, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 펩타이드.
[4] 상기 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드로서,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 미만이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이며,
(c) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이하가, M, T, W, C, I, V, 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
(d) A 또는 G가 각각, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만인,
펩타이드.
[5] 서열 번호 2∼11 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
[6] 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드를 코딩하는 핵산.
[7] 제어 서열과 작동 가능하게 연결된 상기 [6]에 기재된 핵산과, 당해 핵산과 인프레임으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 단백질 발현 벡터.
[8] 목적 단백질이, 항체 또는 항체의 항원 결합성 단편인, 상기 [7]에 기재된 단백질 발현 벡터.
[9] 항체의 항원 결합성 단편이, 단쇄 Fv(scFv)인, 상기 [8]에 기재된 단백질 발현 벡터.
[10] 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드와 목적 단백질의 융합 단백질.
[11] 목적 단백질이, 항체 또는 항체의 항원 결합성 단편인, 상기 [10]에 기재된 융합 단백질.
[12] 항체의 항원 결합성 단편이, 단쇄 Fv(scFv)인, 상기 [11]에 기재된 융합 단백질.
[13] 제어 서열과 작동 가능하게 연결된 상기 [6]에 기재된 핵산과, 당해 핵산과 인프레임으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 단백질 산생 세포.
[14] 600아미노산 길이 이하, 예를 들어, 10∼200아미노산 길이(예를 들어, 10∼90아미노산 길이)의 아미노산 서열을 선택 또는 동정하는 방법으로서,
아미노산 서열(군)(10∼200아미노산 길이(예를 들어, 10∼90아미노산 길이)의 아미노산 서열(군)을 포함할 수 있다)로부터,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산인,
아미노산 서열(군)을 취득하는 것과,
선택 또는 동정된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 태그와 참조 단백질의 융합 단백질을 포유동물 세포 내(바람직하게는 인간 세포 내)에 있어서 발현시켰을 때에, 세포 내에 있어서 융합 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율을 저하시키는(예를 들어, 소정의 값 이하로 하는) 펩타이드 태그의 아미노산 서열을 선택 또는 동정하는 것과,
당해 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 태그 또는 당해 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산을 얻는 것
을 포함하는,
방법.
[15] 취득되는 아미노산 서열군이, 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드인, 상기 [14]에 기재된 방법.
[16] 취득되는 아미노산 서열군이, 인간 게놈의 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 군인, 상기 [14] 또는 [15]에 기재된 방법.
[17] 취득되는 아미노산 서열이, 네오안티젠을 포함하는, 상기 [14]∼[16] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[18] 이하 (a)∼(h)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상을 만족시키고, 또한, 상기 펩타이드를 연결한 단백질의 세포 내에 있어서의 응집성을 저하시킬 수 있는, 펩타이드.
[19] 이하 (A)∼(AE), 및 (AF)∼(AU)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 펩타이드를 연결한 단백질의 세포 내에 있어서의 응집성을 저하시킬 수 있는 펩타이드.
[20] 상기 [18]에 기재된 펩타이드를 코딩하는 핵산.
[21] 제어 서열과 작동 가능하게 연결된 상기 [20]에 기재된 핵산과, 당해 핵산과 인프레임으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 단백질 발현 벡터.
[22] 상기 [18]에 기재된 펩타이드와 목적 단백질의 융합 단백질.
[23] 목적 단백질이, 항체 또는 항체의 항원 결합성 단편인, 상기 [22]에 기재된 융합 단백질.
[24] 항체의 항원 결합성 단편이, 단쇄 Fv(scFv)인, 상기 [23]에 기재된 융합 단백질.
[25] 상기 [19]에 기재된 펩타이드를 코딩하는 핵산.
[26] 제어 서열과 작동 가능하게 연결된 상기 [25]에 기재된 핵산과, 당해 핵산과 인프레임으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 단백질 발현 벡터.
[27] 상기 [25]에 기재된 펩타이드와 목적 단백질의 융합 단백질.
[28] 목적 단백질이, 항체 또는 항체의 항원 결합성 단편인, 상기 [26]에 기재된 융합 단백질.
[29] 항체의 항원 결합성 단편이, 단쇄 Fv(scFv)인, 상기 [27]에 기재된 융합 단백질.
[30] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 아미노산 서열(군)이, 상기 [18]에 기재된 펩타이드를 포함하는, 방법.
[31] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 아미노산 서열(군)이, 상기 [19]에 기재된 펩타이드를 포함하는, 방법.
[32] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 소정의 값이 30% 이하의 값인, 방법.
[33] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 소정의 값이 20 이하의 값인, 방법.
[34] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 소정의 값이 15% 이하의 값인, 방법.
[35] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 소정의 값이 10% 이하의 값인, 방법.
[36] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 소정의 값이 5% 이하의 값인, 방법.
[37] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (A)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (A)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[38] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (B)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (B)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[39] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (C)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (C)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[40] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (D)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (D)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[41] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (E)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (E)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[42] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (F)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (F)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[43] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (G)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (G)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[44] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (H)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (H)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[45] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (I)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (I)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[46] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (J)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (J)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[47] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (K)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (K)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[48] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (L)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (K)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[49] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (M)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (M)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[50] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (N)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (N)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[51] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (O)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (O)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[52] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (P)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (P)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[53] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (Q)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (Q)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[54] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (R)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (R)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[55] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (S)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (S)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[56] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (T)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (T)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[57] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (U)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (U)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[58] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (V)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (V)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[59] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (W)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (W)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[60] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (X)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (X)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[61] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (Y)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (Y)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[62] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (Z)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (Z)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[63] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AA)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AA)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[64] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AB)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AB)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[65] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AC)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AC)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[66] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AD)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AD)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AE)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AE)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67A] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AF)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AF)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67B] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AG)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AG)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67C] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AH)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AH)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67D] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AI)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AI)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67E] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AJ)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AJ)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67F] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AK)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AK)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67G] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AL)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AL)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67H] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AM)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AM)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67I] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AN)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AN)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67J] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AO)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AO)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67K] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AP)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AP)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67L] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AQ)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AQ)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67M] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AR)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AR)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67N] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AS)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AS)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67O] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AT)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AT)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[67P] 상기 [14]에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 아미노산 서열군이, 하기 (AU)에 기재된 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는, 취득되는 아미노산 서열은, 하기 (AU)에 기재된 조건을 추가로 만족시키는, 방법.
[68] 상기 [37]∼[67] 및 [67A]∼[67N] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 소정의 값이 15% 이하의 값인, 방법.
[69] 상기 [37]∼[67] 및 [67A]∼[67N] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 소정의 값이 10% 이하의 값인, 방법.
[70] 상기 [37]∼[67] 및 [67A]∼[67N] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 참조 단백질이 scFv이며, 소정의 값이 5% 이하의 값인, 방법.
[71] 상기 [37]∼[70] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 30%를 초과하는 값인, 방법.
[72] 상기 [37]∼[70] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 30∼40%의 범위의 값인, 방법.
[73] 상기 [37]∼[70] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 40∼50%의 범위의 값인, 방법.
[74] 상기 [37]∼[70] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 50∼60%의 범위의 값인, 방법.
[75] 상기 [37]∼[70] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 60∼70%의 범위의 값인, 방법.
[76] 상기 [37]∼[70] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 70∼80%의 범위의 값인, 방법.
[77] 상기 [37]∼[70] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 80∼90%의 범위의 값인, 방법.
[78] 상기 [37]∼[70] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 90∼95%의 범위의 값인, 방법.
[79] 상기 [37]∼[70] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 95∼99%의 범위의 값인, 방법.
[80] 상기 [37]∼[70] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 99∼99.9%의 범위의 값인, 방법.
[81] 상기 [37]∼[70] 중 어느 하나에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 99.9∼100%의 범위의 값인, 방법.
[82] 상기 [69]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 30%를 초과하는 값인, 방법.
[83] 상기 [69]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 30∼40%의 범위의 값인, 방법.
[84] 상기 [69]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 40∼50%의 범위의 값인, 방법.
[85] 상기 [69]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 50∼60%의 범위의 값인, 방법.
[86] 상기 [69]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 60∼70%의 범위의 값인, 방법.
[87] 상기 [69]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 70∼80%의 범위의 값인, 방법.
[88] 상기 [69]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 80∼90%의 범위의 값인, 방법.
[89] 상기 [69]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 90∼95%의 범위의 값인, 방법.
[91] 상기 [69]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 99∼99.9%의 범위의 값인, 방법.
[92] 상기 [69]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 99.9∼100%의 범위의 값인, 방법.
[93] 상기 [70]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 30%를 초과하는 값인, 방법.
[94] 상기 [70]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 30∼40%의 범위의 값인, 방법.
[95] 상기 [70]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 40∼50%의 범위의 값인, 방법.
[96] 상기 [70]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 50∼60%의 범위의 값인, 방법.
[97] 상기 [70]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 60∼70%의 범위의 값인, 방법.
[98] 상기 [70]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 70∼80%의 범위의 값인, 방법.
[99] 상기 [70]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 80∼90%의 범위의 값인, 방법.
[100] 상기 [70]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 90∼95%의 범위의 값인, 방법.
[101] 상기 [70]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 95∼99%의 범위의 값인, 방법.
[102] 상기 [70]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 99∼99.9%의 범위의 값인, 방법.
[103] 상기 [70]에 기재된 방법으로서, 세포 내에 있어서 참조 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이, 99.9∼100%의 범위의 값인, 방법.
[104] 펩타이드 태그가, 적어도 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 scFv의 응집성을 저하시킬 수 있는, 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드.
[105] 펩타이드 태그가, 적어도 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 scFv의 응집성을 저하시킬 수 있는, 상기 [6]에 기재된 핵산.
[106] 펩타이드 태그가, 적어도 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 scFv의 응집성을 저하시킬 수 있는, 상기 [7]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 단백질 발현 벡터.
[107] 단백질 발현 벡터가, 바이러스 벡터인, 상기 [7]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 단백질 발현 벡터.
[108] 바이러스 벡터가, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 및 수포성 구염 바이러스 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 [107]에 기재된 단백질 발현 벡터.
[109] 핵산이, mRNA인, 상기 [6]에 기재된 핵산.
[110] 핵산이, 5＇말단 Cap 구조와 3＇UTR에 폴리A쇄를 갖는, 상기 [109]에 기재된 핵산.
[111] 핵산이, U로서 슈도유리딘을 포함하는, 상기 [109] 또는 [110]에 기재된 핵산.
[112] 상기 [109]∼[111] 중 어느 하나에 기재된 핵산을 포함하는, 나노입자.
[113] 지질 나노입자인, 상기 [112]에 기재된 나노입자.
[114] 참조 단백질이, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는, 상기 [14]∼[17] 및 [30]∼[103] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[115] 세포가 진핵세포인, 상기 어느 하나에 기재된 방법, 펩타이드, 융합 단백질, 핵산, 또는 벡터.
[116] 세포가 인간 세포인, 상기 어느 하나에 기재된 방법, 펩타이드, 융합 단백질, 핵산, 또는 벡터.
[117] 펩타이드 태그가, 목적 단백질의 자유로운 국재를 방해하지 않는, 상기 어느 하나에 기재된 방법, 펩타이드, 융합 단백질, 핵산, 또는 벡터.
본 개시의 펩타이드 태그는, 태그화된 단백질의 세포 내에 있어서의 안정화를 야기할 수 있다. 따라서, 본 개시의 펩타이드 태그는, 보다 생체 적합성이 높은 펩타이드 태그일 수 있다.
[도 1] 도 1은, 단쇄 Fv(scFv)의 세포 내에서의 응집성에 대한 펩타이드 태그 Tag4-1에 의한 효과를 나타낸다.
[도 2a] 도 2a는, 아밀로이드인 α-시누클레인의 세포내 축적 모델의 제작 스킴을 나타낸다.
[도 2b] 도 2b는, 본 개시의 펩타이드 태그의 하나인 Tag18-1을 갖는 scFv-E6-CMA 펩타이드 융합 단백질의 세포내 발현에 의한 세포내 시누클레인 피브릴에의 영향을 나타내는 형광 현미경 상이다.
[도 2c] 도 2c는, 본 개시의 펩타이드 태그의 하나인 Tag4-8 또는 Tag18-1을 갖는 scFv-E6-CMA 펩타이드 융합 단백질의 세포내 발현에 의한, 시누클레인 피브릴의 제거 효과를 나타낸다.
[도 3a] 도 3a는, 본 개시의 펩타이드 태그의 하나인 Tag18-1을 갖는 scFv-C2 자체를 세포 내에서 발현시켜, 그 세포내 국재를 나타내는 형광 현미경 상이다.
[도 3b] 도 3b는, 본 개시의 펩타이드 태그의 하나인 Tag18-1을 갖는 scFv-C2의 안정화 작용을 나타낸다.
본 발명에서는, 「대상」은, 척추동물이며, 예를 들어, 조류 또는 포유동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 당나귀, 개, 및 고양이, 및 원숭이, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄, 보노보, 인간 등의 영장류, 특히, 인간을 들 수 있다. 본 명세서에서는, 대상은 전술한 바와 같이 인간을 포함하는 의미로 이용되고, 인간을 배제하는 경우에는, 용어 「비인간」을 이용한다.
본 명세서에서는, 「항체」란, 면역글로불린을 의미하고, 다이설파이드 결합으로 안정화된 2개의 중쇄(H쇄)와 2개의 경쇄(L쇄)가 회합한 구조를 취하는 단백질을 말한다. 중쇄는, 중쇄 가변 영역 VH, 중쇄 정상 영역 CH1, CH2, CH3, 및 CH1과 CH2의 사이에 위치하는 힌지 영역으로 이루어지고, 경쇄는, 경쇄 가변 영역 VL(VL은 Vκ 또는 Vλ일 수 있다)과 경쇄 정상 영역 CL로 이루어진다. 이 중에서, VH와 VL로 이루어지는 가변 영역 단편(Fv)이, 항원 결합에 직접 관여하여, 항체에 다양성을 주는 영역이다. 또한, VL, CL, VH, CH1로 이루어지는 항원 결합 영역을 Fab 영역이라고 부르고, 힌지 영역, CH2, CH3으로 이루어지는 영역을 Fc 영역이라고 부른다.
가변 영역 중, 직접 항원과 접촉하는 영역은 특히 변화가 크고, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region: CDR)이라고 불린다. CDR 이외의 비교적 변이가 적은 부분을 프레임워크(framework region: FR)라고 부른다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역에는, 각각 3개의 CDR이 존재하고, 각각 N말단측으로부터 순차로, 중쇄 CDR1∼3 및 경쇄 CDR1∼3이라고 불린다. 각각의 CDR은, 프레임워크 영역 중에 짜 넣어져 있다. 항체의 중쇄 가변 영역은, N말단측으로부터 C말단측을 향하여, 중쇄 프레임워크 영역 1, 중쇄 CDR1, 중쇄 프레임워크 영역 2, 중쇄 CDR2, 중쇄 프레임워크 영역 3, 중쇄 CDR3, 및 중쇄 프레임워크 영역 4를 이 순번으로 갖는다. 항체의 경쇄 가변 영역은, N말단측으로부터 C말단측을 향하여, 경쇄 프레임워크 영역 1, 경쇄 CDR1, 경쇄 프레임워크 영역 2, 경쇄 CDR2, 경쇄 프레임워크 영역 3, 경쇄 CDR3, 및 경쇄 프레임워크 영역 4를 이 순번으로 갖는다. 항체는, 재조합 단백질(재조합 항체)이어도 되고, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포) 등의 동물 세포에 산생시킬 수 있다. 항체의 유래는, 특별히 한정되지 않지만 예를 들어, 비인간 동물의 항체, 비인간 포유동물의 항체(예를 들어, 마우스 항체, 래트 항체, 낙타 항체), 및 인간 항체를 들 수 있다. 또한, 항체는, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 완전 인간화 항체여도 된다. 항체는, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체여도 되고, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 「키메라 항체」란, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 상이한 종의 중쇄 정상 영역 및 경쇄 정상 영역이 각각 연결된 항체이다. 인간화 항체는, 비인간 유래의 항체에 특징적인 아미노산 서열로, 인간 항체의 대응하는 위치를 치환한 항체를 의미하고, 예를 들어, 마우스 또는 래트를 면역하여 제작한 항체의 중쇄 CDR1∼3 및 경쇄 CDR1∼3을 갖고, 중쇄 및 경쇄의 각각 4개의 프레임워크 영역(FR)을 포함하는 그 외의 모든 영역이 인간 항체에서 유래하는 것을 들 수 있다. 이러한 항체는, CDR 이식 항체로 불리는 경우도 있다. 「인간화 항체」는, 인간 키메라 항체를 포함하는 경우도 있다. 「인간 키메라 항체」는, 비인간 유래의 항체에 있어서, 비인간 유래의 항체의 정상 영역이 인간의 항체의 정상 영역으로 치환되어 있는 항체이다. 항체는, 단리된 항체, 또는 정제된 항체일 수 있다. 항체는, 예를 들어, IgG일 수 있다.
면역글로불린쇄의 가변 영역은, 3개의 초가변 영역(보다 빈번하게는, 「상보성 결정 영역」 또는 CDR이라고 칭해진다.)에 의해 연결된, 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)을 포함하는 동일한 전체 구조를 일반적으로 나타낸다. 상기 각 중쇄/경쇄 쌍의 2개의 쇄로부터 얻어진 CDR은, 표적 단백질(예를 들어, PCSK9) 상의 특이적 에피토프와 특이적으로 결합하는 구조를 형성하기 위해서, 프레임워크 영역에 의해 전형적으로 병렬된다. N말단으로부터 C말단으로, 천연에 존재하는 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 어느 것도, 이들 요소의 이하의 순서와 통례 합치한다. FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 이들 각 도메인 중의 위치를 차지하는 아미노산에 번호를 할당하기 위해서, 부번 시스템이 고안되어 있다. 이 부번 시스템은, 「Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD)」 또는 「Chothia ＆ Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al.,1989, Nature 342: 878-883」에 있어서 정의되어 있다.
본 명세서에서는, 항체는, 항체의 항원 결합성 단편을 포함한다. 본 명세서에서는, 단편화되어 있지 않은 항체를 전장(全長) 항체라고 하는 경우가 있다. 전장 항체는, 시그널 서열을 제외한 항체의 전장을 포함할 수 있다.
본 명세서에서는, 「항원 결합성 단편」이란, 항원에 대한 결합성이 유지된 항체의 일부를 의미한다. 항원 결합성 단편은, 본 개시의 항체의 중쇄 가변 영역 혹은 경쇄 가변 영역 또는 그 양쪽을 포함할 수 있다. 항원 결합성 단편은, 키메라화 또는 인간화되어 있어도 된다. 항원 결합성 단편으로서는, 예를 들어, Fab, Fab＇, F(ab＇)2, Fv를 들 수 있다. 또한, 항체 결합성 단편에는, 재조합에 의해 생산된 결합체 또는 기능적 등가물(예를 들어, scFv(단쇄 Fv), 다이아보디, scDb, 탠덤 scFv, 류신 지퍼형, sc(Fv)2(단쇄(Fv)2) 등)의 형태를 갖는, 그 외의 항체의 일부)를 포함하고 있어도 된다. 이와 같은 항체의 항원 결합성 단편은, 특별히 한정되지 않지만 예를 들어, 항체를 효소로 처리하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체를 파파인으로 소화하면, Fab를 얻을 수 있다. 혹은, 항체를 펩신으로 소화하면, F(ab＇)2를 얻을 수 있고, 이것을 추가로 환원하면 Fab＇를 얻을 수 있다. 본 명세서에서는 이와 같은 항체의 항원 결합성 단편을 이용할 수 있다. scFv에 있어서는, VL 및 VH가 인공의 폴리펩티드 링커로 연결되어, 원래의 항체와 동일한 항원 특이성이 유지될 수 있다. VL 및 VH는, N말단측으로부터 VH 및 VL 또는 VL 및 VH의 순번으로 연결될 수 있다. 링커는, 10∼25아미노산 정도의 길이를 가질 수 있다. 링커는, 글리신을 풍부하게 포함하고 있어도 되고, 수용성을 높일 목적으로 세린이나 트레오닌 등의 아미노산을 포함하고 있어도 된다.
본 명세서에서는, 「세포내 항체」(intrabody)란, 세포 내(예를 들어, 세포질 내, 또는 핵 내)에 있어서 발현시킨 항체이다. 항체가 세포 외로 분비되어 기능하는데 반해, 세포내 항체는, 세포 내에서 발현하여, 기능하도록 설계되는 점에서 상이할 수 있다. 세포내 항체는, 세포내 단백질의 기능에 영향을 줄 수 있어, 세포질, 핵, 또는 분비 경로에 있어서, 그들의 기능을 저해할 수 있다. 암 유전자 산물은 세포내 항체의 표적일 수 있다(Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., 및 Cattaneo, A.(1993년), Biochem Biophys Res Commun, 제197권, 422∼7페이지; Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N., 및 Cattaneo, A.(1994년), Biotechnology(NY), 제12권, 396∼9페이지; Cochet, O. 등(1998년), Cancer Res, 제58권, 1170∼6페이지). 세포내 항체는, 단백질 기능을 저해하는 것을 목적으로 하여 단백질에 대해서 직접적으로 결합한다. 결합은, 단백질의 기능을 직접 저해하는 경우도 있지만, 단백질의 다른 단백질과의 결합을 저해하는 경우도 있다.
세포내 항체로서는, 다양한 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않지만 바람직하게는, scFv, 탠덤 scFv, VHH 항체(나노보디), 미니보디, 및 다이아보디가 이용될 수 있다. scFv는, 전형적으로는, 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 단편으로서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은, 링커를 개재시켜 연결되어 있다. 탠덤 scFv는, 전형적으로는, 2개의 상이한 항원 특이성을 갖는 scFv를 갖는 항체 단편으로서, 이들이 링커를 개재시켜 연결되어 있다. 다이아보디는, 전형적으로는, scFv의 2량체이다. 다이아보디는, 2가의 단(單)특이성 다이아보디와, 이중 특이성 다이아보디로 대별된다. 미니보디는, 전형적으로는, 2량체화 도메인과 scFv의 융합 단백질의 2개가, 2량체화 도메인을 개재시켜 2량체화되어 이루어진다. VHH 항체는, 중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인으로 이루어지는 항체 단편이다. VHH 항체는, 전형적으로는, 낙타과의 동물(예를 들어, 낙타, 라마, 알파카 등)에서 유래하는 중쇄 항체의 중쇄 가변 도메인이다. 통상의 항체는 세포 외에 발현시키기 때문에 세포 외에서밖에 기능시킬 수 없는 데 반해, 세포내 항체는, 세포 내에 있어서 항체 기능을 발휘시킬 수 있는 점에서 우수하다. 세포 내에 있어서의 표적 단백질의 활성화, 및 불활성화, 및 단백질간 상호작용의 중화나 차단 등의 다양한 용도에 세포내 항체를 이용할 수 있다. scFv는, 세포 내에 발현시키면 응집성을 나타내는 경향을 갖는다. 따라서, 이와 같은 경우에, 본 개시의 펩타이드 태그를 세포내 항체에 연결시켜 융합 단백질을 얻어 그 응집성을 저하시키는 것은 유용하다. 단백질의 응집성을 줄이는 것에 의해, 단백질이 가져야 할 기능을 세포 내에 있어서 발휘시킬 수 있다.
본 명세서에서는, 「펩타이드 태그」란, 목적 단백질에 융합시키는 것에 의해, 목적 단백질을 표지하거나, 또는 목적 단백질의 생화학적 성질을 변경하는 것이다. 펩타이드 태그로서는, 예를 들어, FLAG 태그, 3×FLAG 태그, Myc 태그, HA 태그, T7, 6×His 태그, PA 태그, S 태그, E 태그, VSV-G, Glu-Glu, Strep-tagII, HSV 태그, Chitin Binding Domain(CBD) 태그, Calmodulin Binding Peptide(CBP) 태그, V5 태그, GST 태그, 말토스 결합 단백질(MBP) 태그, 티오레독신(Trx) 태그, 및 mini-AID 태그 등의 다양한 태그를 들 수 있다. 각각, 태그에 대한 친화성을 이용하여 목적 단백질을 어피니티 정제하거나, 태그에 대한 항체를 제작하여, 목적 단백질을 검출하거나 하는 것에 이용할 수 있다. 태그를 인식하는 항체는, 일반적으로 태그 항체라고 불리고, 태그 항체의 에피토프가 되는 태그 서열을 에피토프 태그라고 한다. 태그는, 일반적으로는 수 아미노산 내지 수십 아미노산 길이의 폴리펩티드쇄를 가질 수 있다.
본 명세서에서는, 「목적 단백질」이란, 세포 내에서 발현시키는 단백질이다. 목적 단백질은, 응집성 단백질이어도 비응집성 단백질이어도 된다. 어느 경우에도 본 개시의 펩타이드 태그를 부가하는 것에 의해, 보다 안정성을 늘려, 응집 형성에 대해서 로버스트(robust)가 되기 때문이다. 단, 본 개시의 펩타이드 태그는, 응집성 단백질에 대해서 부가했을 경우에도, 그 세포 내에서의 응집성을 저하시킬 수 있기 때문에, 목적 단백질은, 바람직하게는 응집성 단백질일 수 있다. 목적 단백질이 분비성 단백질인 경우여도, 분비성 단백질이 세포 외에 분비되기 전에 세포 내에서 응집을 형성하는 경우가 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 분비성 단백질, 바람직하게는, 응집성의 분비성 단백질에 대해서도 유리하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서는, 「응집성 단백질」이란, 세포 내에 있어서 응집(특히 불용성의 응집괴)을 형성하는 단백질을 말한다. 본 명세서에서는, 「응집성」이란, 응집을 형성하는 성질을 의미하고, 「비응집성」이란, 응집을 형성하지 않는 성질을 의미한다. 응집성의 감약화는 비응집성의 촉진일 수 있고, 응집성의 촉진은 비응집성의 감약화일 수 있다. 본 명세서에서는, 「비응집성」은 「안정성」과 상호 호환적으로 이용된다. 응집은, 예를 들어, 면역 세포 염색(IC)에 의해 현미경하에서 휘점으로서 관찰될 수 있다. 응집률은, 예를 들어, 단백질 강제 발현 세포 중의 응집을 나타내는 세포의 비율에 의해 계산될 수 있다. 이와 같이 계산되는 응집률의 저하는, 응집에 의한 영향을 받지 않는 단백질 강제 발현 세포의 증가를 의미하고, 생리학적인 바람직함의 지표일 수 있다. 응집성의 저하(예를 들어, 응집률의 저하)와 가용성의 증대는 상이한 지표이다. 가용성의 증대는, 수용액 중에서 이용 가능한 단백질 농도가 높아지는 것을 의미하지만, 응집괴의 수나 응집괴를 갖는 세포의 비율에 직결되는 것은 아니다. 따라서, 가용성의 증대는 응집성의 저하(예를 들어, 응집률의 저하)를 반드시 의미하지는 않는다.
본 명세서에서는, 아미노산 서열은, 1문자 표기에 의해 표시된다. 즉, A는 알라닌을 나타내고, R은 아르기닌을 나타내고, N은 아스파라긴을 나타내고, D는 아스파라긴산을 나타내고, C는 시스테인을 나타내고, Q는 글루타민을 나타내고, E는 글루타민산을 나타내고, G는 글리신을 나타내고, H는 히스티딘을 나타내고, I는 아이소류신을 나타내고, L은 류신을 나타내고, K는 리신을 나타내고, M은 메티오닌을 나타내고, F는 페닐알라닌을 나타내고, P는 프롤린을 나타내고, S는 세린을 나타내고, T는 트레오닌을 나타내고, W는 트립토판을 나타내고, Y는 티로신을 나타내고, 또한, V는 발린을 나타낸다. 아미노산은, 통상은 상기에서 열거된 20종류의 L-아미노산이다.
본 명세서에서는, 「제어 서열」은, 그것에 작동 가능하게 연결된 유전자를 구동하여, 당해 유전자로부터 RNA를 전사하는 활성을 갖는 서열을 말한다. 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터이다. 프로모터는, 예를 들어, 클래스 I 프로모터(rRNA 전구체의 전사에 이용될 수 있다), 클래스 II 프로모터(코어 프로모터와 상류 프로모터 엘리먼트로 구성되어, mRNA의 전사에 이용될 수 있다), 및 클래스 III 프로모터(I형, II형, 및 III형으로 추가로 대별된다)를 들 수 있다.
본 발명에 의하면, 응집성 단백질의 응집 경향을 저하시키는 펩타이드 태그가 제공된다. 본 발명에 의하면, 제어 서열에 작동 가능하게 연결되고, 당해 펩타이드 태그를 코딩하는 유전자를 포함하는 단백질 발현 벡터가 제공된다. 본 발명에 의하면, 당해 펩타이드 태그와 융합한 목적 단백질이 제공된다. 본 발명에 의하면, 제어 서열에 작동 가능하게 연결되고, 당해 펩타이드 태그와 융합한 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 단백질 발현 벡터가 제공된다. 목적 단백질은, 어느 태양에서는, 세포내 단백질일 수 있다. 목적 단백질은, 어느 태양에서는, 세포내 항체일 수 있다. 목적 단백질은, 어느 태양에서는, scFv일 수 있다.
이하, 본 개시의 응집성 단백질의 응집 경향을 저하시키는 펩타이드 태그에 대해 상술한다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 진핵세포 내, 특히 인간 세포 내에 있어서 목적 단백질의 응집 경향을 저하시킬 수 있다. 의약 용도 등을 검토하는 경우, 인간 세포 내에서의 목적 단백질의 응집 경향을 저하시키는 것은 유익할 수 있다.
본 개시의 펩타이드 태그의 길이는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 600아미노산 이하, 500아미노산 이하, 400아미노산 이하, 300아미노산 이하, 200아미노산 이하, 예를 들어, 5 아미노산 내지 100아미노산, 예를 들어, 10아미노산 내지 90아미노산, 20아미노산 내지 80아미노산, 30아미노산 내지 70아미노산, 40아미노산 내지 60아미노산, 10아미노산 내지 50아미노산, 10아미노산 내지 40아미노산, 10아미노산 내지 30아미노산의 길이를 가질 수 있다. 이 태양에 있어서, 본 개시의 펩타이드 태그의 길이의 하한치는, 5아미노산 이상, 10아미노산 이상, 15아미노산 이상, 20아미노산 이상, 30아미노산 이상, 40아미노산 이상, 50아미노산 이상, 60아미노산 이상, 70아미노산 이상, 또는 80아미노산 이상일 수 있고 및/또는, 상한치는, 100아미노산 이하, 90아미노산 이하, 80아미노산 이하, 70아미노산 이하, 60아미노산 이하, 50아미노산 이하, 40아미노산 이하, 30아미노산 이하, 또는 20아미노산 이하일 수 있다.
(a) 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 비율의 산성 아미노산(요소 1의 아미노산)을 포함할 수 있다.
본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 이상이 산성 아미노산일 수 있다.
본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있다. 어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 보다 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 더 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 보다 더 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 더욱 더 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 35% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 특히 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있다. 산성 아미노산은, D 또는 E이다. 또한 예를 들어, 본 개시의 펩타이드 태그에 있어서의 산성 아미노산 함유율을 44% 이하, 43.5% 이하, 43% 이하, 42.5% 이하, 42% 이하, 41.5% 이하, 41% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 또는 20% 이하로 할 수 있다. 이것에 의해, 어느 태양에서는, 펩타이드 태그의 높은 산성 아미노산의 비율에 기초하여 양전하를 갖는 세포 내의 분자 등과 예기치 못한 상호작용을 초래할 리스크를 저하시킬 수 있다.
(b) 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 비율의 염기성 아미노산(요소 2의 아미노산)을 포함할 수 있다.
본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 25% 이하, 20% 이하, 보다 바람직하게는, 15% 이하의 염기성 아미노산을 가질 수 있고, 더 바람직하게는 10% 이하의 염기성 아미노산을 가질 수 있고, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 염기성 아미노산을 가질 수 있고, 특히 바람직하게는, 3% 미만, 2% 미만 혹은 1% 미만의 염기성 아미노산을 가질 수 있다. 가장 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열 중에 염기성 아미노산을 포함하지 않는다. 염기성 아미노산은, K, R, 또는 H이다.
(c) 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 비율의 요소 3의 아미노산을 포함할 수 있다.
요소 3의 아미노산이란, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A일 수 있다.
본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상, 바람직하게는, 20% 이상, 보다 바람직하게는, 30% 이상, 40% 이상이, 요소 3의 아미노산일 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 50% 이상, 60% 이상, 또는 70% 이상이, 요소 3의 아미노산일 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 80% 이하, 보다 바람직하게는, 70% 이하, 더 바람직하게는, 60% 이하가, 요소 3의 아미노산일 수 있다. 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 또는 20% 이하가, 요소 3의 아미노산일 수 있다. 어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하, 30% 이상 70% 이하, 30% 이상 60% 이하, 30% 이상 50% 이하, 30% 이상 40% 이하, 40% 이상 70% 이하, 40% 이상 60% 이하, 40% 이상 50% 이하, 50% 이하 이상 70% 이하, 50% 이상 60% 이하, 60% 이상 80% 이하, 또는 60% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산일 수 있다.
특히 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 또는 20% 이상(바람직하게는 21% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상)이, N 및 P의 어느 것이다. 또한, 예를 들어, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하가 N 및 P의 어느 것일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상 20% 이하가 N 및 P의 어느 것일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 55% 이상 90% 이하가 N 및 P의 어느 것일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 초과 20% 이하가 N 및 P의 어느 것일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 초과 30% 이하가 N 및 P의 어느 것일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 초과 40% 이하가 N 및 P의 어느 것일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 초과 50% 이하가 N 및 P의 어느 것일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 50% 초과 60% 이하가 N 및 P의 어느 것일 수 있다.
예를 들어, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 또는 20% 이상(바람직하게는 21% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상)이, N이다. 또한, 예를 들어, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하가 N일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상 20% 이하가 N일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 55% 이상 90% 이하가 N일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 초과 20% 이하가 N일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 초과 30% 이하가 N일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 초과 40% 이하가 N일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 초과 50% 이하가 N일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 50% 초과 60% 이하가 N일 수 있다.
예를 들어, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 또는 20% 이상(바람직하게는 21% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상)이, P이다. 또한, 예를 들어, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하가 P일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 55% 이상 90% 이하가 P일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상 20% 이하가 P일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 초과 20% 이하가 P일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 초과 30% 이하가 P일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 초과 40% 이하가 P일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 초과 50% 이하가 P일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 50% 초과 60% 이하가 P일 수 있다.
또한, 특히 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 또는 20% 이하가, F 또는 Y이다. 특히 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 또는 20% 이하가, F 및/또는 Y이다. 특히 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 또는 20% 이하가, F 및 Y이다. 특히 바람직한 태양에서는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 또는 20% 이상이, N 및 P의 어느 것이고, 또한, 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 또는 20% 이하가, F 및/또는 Y이다.
(d) 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 비율의 요소 4의 아미노산을 포함할 수 있다.
요소 4의 아미노산이란, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 및 요소 3의 아미노산의 어느 것도 아닌 아미노산일 수 있다. 요소 4의 아미노산은, 예를 들어, M, T, W, C, I, V, 및 L일 수 있다.
본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하가 요소 4의 아미노산일 수 있다. 어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는 요소 4의 아미노산을 포함하지 않는다.
(e) 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하가 G일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, G를 포함하지 않는다.
(f) 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하가 A일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, A를 포함하지 않는다.
(g) 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하가 G이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하가 A일 수 있다.
(h) 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, S를 포함할 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는 S를 포함하지 않는다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상의 S를 포함할 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하의 S를 포함할 수 있다.
(A) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산일 수 있다.
(B) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다.
(C) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G일 수 있다.
(D) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G일 수 있다.
(E) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산일 수 있다.
(F) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다.
(G) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G일 수 있다.
(H) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G일 수 있다.
(I) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산일 수 있다.
(J) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다.
(K) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G일 수 있다.
(L) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G일 수 있다.
(M) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산일 수 있다.
(N) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다.
(O) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G일 수 있다.
(P) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G일 수 있다.
(Q) 상기의 펩타이드 태그에 있어서, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 보다 바람직하게는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 더욱 더 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 35% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 특히 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있다.
(R) 상기의 펩타이드 태그에 있어서, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 염기성 아미노산이다. 보다 바람직하게는 5% 이하의 염기성 아미노산을 가질 수 있고, 특히 바람직하게는, 3% 미만, 2% 미만 혹은 1% 미만의 염기성 아미노산을 가질 수 있다. 혹은, 상기의 펩타이드 태그는, 어느 바람직한 태양에서는, 염기성 아미노산을 포함하지 않는다.
(S) 상기의 펩타이드 태그에 있어서, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 60% 이하가 요소 3의 아미노산이다.
(T) 상기의 펩타이드 태그에 있어서, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하가 요소 4의 아미노산일 수 있다. 어느 바람직한 태양에 있어서, 상기의 펩타이드 태그는, 요소 4의 아미노산을 포함하지 않는다.
(U) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 염기성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다. 이 태양에 있어서, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 보다 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 더 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 보다 더 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 더욱 더 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 35% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있고, 특히 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있다.
(V) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이하가 염기성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다. 이 태양에 있어서, 바람직하게는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만이 염기성 아미노산일 수 있고, 혹은, 염기성 아미노산을 포함하지 않는다.
(W) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 염기성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다. 이 태양에 있어서, 바람직하게는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 60% 이하가 요소 3의 아미노산일 수 있다.
(X) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 염기성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다. 이 태양에 있어서, 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하가 요소 4의 아미노산일 수 있다. 어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는 요소 4의 아미노산을 포함하지 않는다.
(Y) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 염기성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다. 이 태양에 있어서, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 보다 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 35% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이며, 더 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이다.
(Z) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 염기성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다. 이 태양에 있어서, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 60% 이하가 요소 3의 아미노산이다.
(AA) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 염기성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 80% 이하(바람직하게는 30% 이상 70% 이하)가 요소 3의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이하가 요소 4의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다. 이 태양에 있어서, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 15% 이하가 요소 4의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 요소 4의 아미노산이며, 또는 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이하가 요소 4의 아미노산이다.
(AB) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 염기성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하가 요소 4의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다. 이 태양에 있어서, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 60% 이하가 요소 3의 아미노산이다. 이 태양에 있어서, 보다 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 35% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 더 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있다. 이 태양에 있어서, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 60% 이하가 요소 3의 아미노산이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 35% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이며, 더 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 60% 이하가 요소 3의 아미노산이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 40% 이상 45% 미만이 산성 아미노산일 수 있다.
(AC) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 염기성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이하가 요소 4의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다. 이 태양에 있어서, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하가 G일 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, G를 포함하지 않는다.
(AD) 본 개시의 펩타이드 태그는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 35% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 염기성 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 이하가 요소 3의 아미노산이고, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 요소 4의 아미노산이며, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 G이고, 또한, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 A일 수 있다.
(AE) 본 개시의 펩타이드 태그는, 예를 들어, 서열 번호 2∼11 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
(AF) 본 개시의 펩타이드 태그는, 예를 들어, 표 1∼11, 표 12-1, 표 12-2, 표 13-1, 표 13-2, 표 14-1, 및 표 14-2에 기재된 아미노산 서열의 어느 것을 가질 수 있다.
(AG) 본 개시의 펩타이드 태그는, 상기 (AE) 및 (AF)의 어느 하나의 아미노산 서열의 임의의 아미노산(예를 들어, 요소 1, 요소 2, 요소 3, 또는 요소 4의 아미노산, 예를 들어, 요소 2, 요소 3, 또는 요소 4의 아미노산)의 N 및 P로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산의 부가, 및 삽입, 및 상기 아미노에의 치환(예를 들어, 1개 내지 30% 정도의 아미노산의 치환, 예를 들어, 1 내지 20개, 10개, 또는 수 개의 아미노산에의 치환)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상을 갖고 있어도 된다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 상기 (AF) 및 (AG)의 어느 하나의 아미노산 서열의 임의의 아미노산(예를 들어, 요소 1, 요소 2, 요소 3, 또는 요소 4의 아미노산, 예를 들어, 요소 2, 요소 3, 또는 요소 4의 아미노산)의 S의 부가, 및 삽입, 및 상기 아미노산에의 치환(예를 들어, 1개 내지 30% 정도의 아미노산의 치환, 예를 들어, 1 내지 20개, 10개, 또는 수 개의 아미노산에의 치환)을 갖고 있어도 된다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 상기 (AF) 및 (AG)의 어느 하나의 아미노산 서열의 임의의 아미노산(예를 들어, 요소 1, 요소 2, 요소 3, 또는 요소 4의 아미노산, 예를 들어, 요소 2, 요소 3(특히 F 및/또는 Y, 요소 4의 아미노산, A 또는 G)의 결실을 갖고 있어도 된다.
(AH) 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 또는 20% 이상이 N 혹은 P, 또는 N 및 P의 어느 것일 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, , 20% 이상, 21% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상이 P일 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 바람직하게는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상이 N일 수 있다.
(AI) 본 개시의 펩타이드 태그에서는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 이상이 산성 아미노산이고, 또한, 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상이 N 또는 P일 수 있다. 이 태양에서는, 그 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만(바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 0%)이 G이며, 10% 미만(바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 0%)이 A이고, 및/또는 10% 미만(바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 0%)이 F 및 Y일 수 있다.
(AJ) 본 개시의 펩타이드 태그에서는,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 미만이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 또한, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 60% 이하가 S이고,
(c) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가, M, T, W, C, I, V, 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 또한
(d) A 및 G가 각각, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만일 수 있다. 이 태양에 있어서, 아미노산 서열은, 10∼200아미노산 길이(예를 들어, 10∼90아미노산 길이)를 가질 수 있다.
(AK) 본 개시의 펩타이드 태그에서는,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 미만이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 60% 이하가 S이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상이 N 또는 P이고,
(c) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가, M, T, W, C, I, V, 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 또한
(d) A 및 G가 각각, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만일 수 있다. 이 태양에 있어서, 아미노산 서열은, 10∼200아미노산 길이(예를 들어, 10∼90아미노산 길이)를 가질 수 있다.
(AL) 본 개시의 펩타이드 태그에서는,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 미만이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 60% 이하가 S이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 F 및/또는 Y이고,
(c) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가, M, T, W, C, I, V, 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 또한
(d) A 및 G가 각각, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만일 수 있다. 이 태양에 있어서, 아미노산 서열은, 10∼200아미노산 길이(예를 들어, 10∼90아미노산 길이)를 가질 수 있다.
(AM) 본 개시의 펩타이드 태그에서는,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 미만이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 60% 이하가 S이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상이 N 또는 P이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 F 및/또는 Y이고,
(c) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가, M, T, W, C, I, V, 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 또한
(d) A 및 G가 각각, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만일 수 있다. 이 태양에 있어서, 아미노산 서열은, 10∼200아미노산 길이(예를 들어, 10∼90아미노산 길이)를 가질 수 있다.
(AN) 본 개시의 펩타이드 태그에서는,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 65% 미만이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 60% 이하가 S이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 F 및/또는 Y이고,
(c) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가, M, T, W, C, I, V, 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 또한
(d) A 및 G가 각각, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만일 수 있다. 이 태양에 있어서, 아미노산 서열은, 10∼200아미노산 길이(예를 들어, 10∼90아미노산 길이)를 가질 수 있다.
(AN) 본 개시의 펩타이드 태그에서는,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 65% 미만이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 60% 이하가 S이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상이 N 또는 P이고,
(c) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가, M, T, W, C, I, V, 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 또한
(d) A 및 G가 각각, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만일 수 있다. 이 태양에 있어서, 아미노산 서열은, 10∼200아미노산 길이(예를 들어, 10∼90아미노산 길이)를 가질 수 있다.
(AO) 본 개시의 펩타이드 태그에서는,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 65% 미만이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 60% 이하가 S이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상이 N 또는 P이고, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가 F 및/또는 Y이고,
(c) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이하가, M, T, W, C, I, V, 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고, 또한
(d) A 및 G가 각각, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만일 수 있다. 이 태양에 있어서, 아미노산 서열은, 10∼200아미노산 길이(예를 들어, 10∼90아미노산 길이)를 가질 수 있다.
(AP) 본 개시의 펩타이드 태그에서는,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b1) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 55% 이상 90% 미만이 N 및 P의 어느 것이고, 또한
아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 나머지가 그 외의 아미노산일 수 있다. 이 태양에서는, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이하(바람직하게는 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 또는 0%)가, 산성 아미노산, N 및 P의 어느 것도 아니다.
(AQ) 본 개시의 펩타이드 태그에서는,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 45% 이상이 산성 아미노산이고,
(b1) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 21% 이상이 N이고, 및/또는 7% 이상이 P이고,
아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이하(바람직하게는 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 또는 0%)가 그 외의 아미노산일 수 있다.
(AR) 상기 (AK)∼(AQ)에 있어서, 바람직하게는 요소 4는 0%일 수 있다.
(AS) 상기 (AK)∼(AQ)에 있어서, A 또는 G는 0%일 수 있다. 상기 (AK)∼(AO)에 있어서, 바람직하게는, A 및 G는 0%이다.
(AT) 상기 (AK)∼(AQ)에 있어서, 바람직하게는, 요소 4는 0%이고, 또한, A 및 G는 0%이다.
(AU) 상기 (AR)∼(AT)에 있어서, 바람직하게는, 요소 2는 0%이다.
상기 (a)에 있어서, 바람직하게는, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 보다 바람직하게는, 15% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 더 바람직하게는, 20% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 보다 더 바람직하게는, 25% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 특히 바람직하게는, 30% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고, 이들 예에 있어서, 산성 아미노산 함유율의 상한은, 예를 들어, 45% 미만, 40% 이하, 또는 35% 이하일 수 있다.
본 개시의 펩타이드 태그는, 단백질(예를 들어, 세포내 응집성 단백질)에 부여할 수 있다. 따라서, 본 개시에 의하면, 본 개시의 펩타이드 태그와 세포내 응집성 단백질의 융합 단백질이 제공된다. 본 개시의 펩타이드 태그는 또한, 세포내 비응집성 단백질에 부여해도 된다. 태그 부여에 의해, 비응집성 단백질의 비응집성에 관한 강인성이 증가할 수 있다. 단백질은, 예를 들어, 세포내 항체일 수 있다. 세포내 항체는, 항체의 항원 결합성 단편일 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 세포내 항체와 분해 유도 서열의 융합 단백질에 부여해도 된다. 이것에 의해, 세포내 항체가 결합하는 표적의 선택적인 분해를 유도할 수 있다. 세포내 항체로서는, 상기와 같은 항체 단편을 들 수 있다. 또한, 세포내 항체로서는, α-시누클레인, LRRK2, 타우(Tau), β-아밀로이드, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), C9orf72, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1), TAR DNA 결합 단백질 43(TDP43), Fused in Sarcoma(FUS) 및 프리온 단백질, 및 그의 병리학적 형태에 결합하는 항체를 들 수 있다. 세포내 항체로서는, 단백질간 상호작용(PPI)을 저해하는 항체를 들 수 있다. 세포내 항체로서는, 표적으로 결합하는 분해 유도 서열과의 융합 단백질의 형태의 것을 들 수 있다. 세포내 항체로서는, 예를 들어, Molecular Tharapy, 29(2): 859-872, 2021에 기재된 세포내 항체(예를 들어, CP13 iB, PHF1 iB, 및 Tau5 iB) 및 이들 세포내 항체의 모든 CDR 서열을 갖는 세포내 항체를 들 수 있다. iB는 인트라보디의 약어이며, 즉 세포내 항체를 의미한다. 본 개시에서는, 예를 들어, 이들 세포내 항체와 본 개시의 펩타이드 태그의 융합 단백질이 제공된다. 세포내 항체는, 바람직하게는, 분해 유도 서열을 추가로 갖고 있어도 된다. 또한, 세포내 항체로서는, 예를 들어, Molecular Tharapy, 30(4): 1484-1499, 2022에 기재된 세포내 항체(예를 들어, VHH E4-1 및 VHHZ70) 및 이들 세포내 항체의 모든 CDR 서열을 갖는 세포내 항체를 들 수 있다. 세포내 항체는, 바람직하게는, 분해 유도 서열을 추가로 갖고 있어도 된다. 세포내 항체로서는, 예를 들어, J. Biol. Chem., 295(31): 10662-10676, 2020에 기재된 세포내 항체(예를 들어, M204-scFv) 및 이 세포내 항체의 모든 CDR 서열을 갖는 세포내 항체를 들 수 있다. 세포내 항체는, 바람직하게는, 분해 유도 서열을 추가로 갖고 있어도 된다. 세포내 항체로서는, 예를 들어, WO2018/231254에 기재된 세포내 항체(예를 들어, BIIB092 항체), WO2016/207245에 기재된 세포내 항체, WO2018/011073에 기재된 세포내 항체(예를 들어, C10-2), WO2015/114538에 기재된 세포내 항체(예를 들어, VHH tau A2, VHH tau A2-SH, VHH tau A2var-SH), WO2014/059442에 기재된 세포내 항체(예를 들어, F9T, D11C, D4G, G12C, H2A, 및 H7T), JP2020/515233(예를 들어, 1E4, 9B11, 3A9, 10F10, 11F11, AC8, AE8, AA9, DG5, AD2, AD7, DG11, DG8, DA9) 및 이 세포내 항체의 모든 CDR 서열을 갖는 세포내 항체를 들 수 있다. 세포내 항체는, 바람직하게는, 분해 유도 서열을 추가로 갖고 있어도 된다. 세포내 항체로서는 또한, WO2019177138에 기재된 이상 TDP-43을 분해 제거할 수 있는 세포내 항체(예를 들어, 서열 번호 21∼24) 및 이 세포내 항체의 모든 CDR 서열을 갖는 세포내 항체를 들 수 있다. 세포내 항체는, 바람직하게는, 분해 유도 서열을 추가로 갖고 있어도 된다. 이와 같이, tau에 결합하는 세포내 항체(예를 들어, scFv 또는 VHH), α-시누클레인에 결합하는 세포내 항체(예를 들어, scFv 또는 VHH), 및 그 외 세포 내에서 세포 독성을 일으키는 아밀로이드에 대한 세포내 항체(예를 들어, scFv 또는 VHH)는 바람직하고, 태그와 연결되어, 태그와의 융합 단백질로 될 수 있다.
어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, CAAX 모티프(예를 들어, 서열 번호 58: KLNPPDESGPGCMSCKCVLS)를 갖지 않는다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드는, 막 국재화 시그널을 갖지 않는다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 목적 단백질을 세포내에 발현시키는 관점에서, 세포외에의 분비를 위한 시그널 펩타이드 서열을 갖지 않는다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 목적 단백질의 세포 외에의 분비를 촉진하는 관점에서, 세포 외에의 분비를 위한 시그널 서열을 갖고 있어도 된다. 분비성 단백질이 응집성인 경우에, 시그널 서열을 그 서열 중에 포함하는 본 개시의 펩타이드 태그, 또는 시그널 서열과 탠덤으로 연결한 본 개시의 펩타이드 태그는 유리할 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 핵 이행 시그널을 포함할 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 세포질에의 단백질의 국재를 방해하는 서열을 갖지 않는다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 목적 단백질의 세포 내에서의 자유로운 분포를 촉진한다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 목적 단백질의 세포 내에 있어서의 본래의 결합 상대와의 결합 및 결합 상대와의 공(共)국재를 촉진할 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 목적 단백질의 세포 내에서의 분포에 펩타이드 태그 고유의 제약을 주는 서열(또는 자유로운 분포를 방해하는 서열)을 가질 수 있지만, 바람직하게는, 그와 같은 서열을 갖지 않을 수 있다.
어떠한 태양에 있어서도, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 서열을 포함하지 않는다(Enzymol. 326, 362-367(2000)): S-tag: KETAAAKFERQHMDS(서열 번호 14). 어느 태양에 있어서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 요소 2는 10% 이하이고, 및/또는 A는 10% 이하인 서열을 가질 수 있다.
어떠한 태양에 있어서도, 본 개시의 펩타이드 태그는, KLNPPDESGPGCMSCKCVLS(서열 번호 15)를 갖지 않는다(Tanaka et al., 2007, EMBO Journal, 26: 3250-3259). 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 당해 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖지 않는다.
어떠한 태양에 있어서도, 본 개시의 펩타이드 태그는, EFGGAPEFPKPSTPPGSSGL(서열 번호 16) 및 당해 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖지 않는다(Paolo et al., 2003, Clinical Cancer Research, 9: 2837-2848). 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 당해 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖지 않는다.
어떠한 태양에 있어서도, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 어느 서열도 갖지 않는다(Arimori et al., 2017, Structures, 25: 1611-1622):
hMst1: DYEFLKSWTVEDLQKRLLALDPMMEQEIEEIRQKYQSKRQPILDAIEAK(서열 번호 17);
hMST2: DFDFLKNLSLEELQMRLKALDPMMEREIEELRQRYTAKRQPILDAMDAK(서열 번호 18);
hRaf1: GEVNWDAFSMPELHNFLRILQREEEEHLRQILQKYSYSRQKIQEALHAS(서열 번호 19);
hRaf5: GEVEWDAFSIPELQNFLTILEKEEQDKIQQVQKKYDKFRQKLEEALRES(서열 번호 20);
hSAV1: HILKWELFQLADLDTYQGMLKLLFMKELEQIVKMYEAYRQALLTELENR(서열 번호 21). 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이들 서열의 어느 것과도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖지 않는다.
어떠한 태양에 있어서도, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 어느 것도 갖지 않는다(Zhang et al., 2004, Protein Expression and Purification, 36(2): 207-216):
T7C: LEDPFQSGVMLGVASTVAASPEEASVTSTEETLTPAQEAARTRAANKARKEAELAAATAEQ(서열 번호 22);
T7B: LEDPEEASVTSTEETLTPAQEAARTRAANKARKEAELAAATAEQ(서열 번호 23);
T7B1: LEDPEEASVTSTEETLTPAQEAARTRPPNKARKEAELAAATAEQ(서열 번호 24);
T7B2: LEDPEEASVTSTEETLTPAQEAARTRGGNKARKEAELAAATAEQ(서열 번호 25);
T7B3: LEDPEEASVTSTEETLTPAQEAARTRAANKARKEAELTAEQ(서열 번호 26);
T7B4: LEDPEEASVTSTEETLTPAQEAARTRAANKARKEAELEAETAEQ(서열 번호 27);
T7B5: LEDPEEASVTSTEETLTPAQEAARTRAAAKARKEAELAAATAEQ(서열 번호 28);
T7B6: LEDPEEASVTSTEETLTPAQEAARTRKARKEAELAAATAEQ(서열 번호 29);
T7B7: LEDPEEASVTSTEETLTPAQEAARTRAANKARKEAELAA(서열 번호 30);
T7B8: LEDPEEASVTSTEETLTPAQEAARTRAANKARKEAELAAA(서열 번호 31);
T7B9: LEDPEEASVTSTEETLTPAQEAAETEAANKARKEAELEAETAEQ(서열 번호 32);
T7B10: LEDPTPAQEAARTRAANKARKEAELAAATAEQ(서열 번호 33);
T7A: LEDPAANKARKEAELAAATAEQ(서열 번호 34);
T7A1: LEDPERNKERKEAELAAATAEQ(서열 번호 35);
T7A2: LEDPERNKERKEAELEAATAEQ(서열 번호 36);
T7A3: LEDPERNKERKEAELEAETAEQ(서열 번호 37);
T3: LEDPAVWEAGKVVAKGVGTADITATTSNGLIASCKVIVNAATS(서열 번호 38);
T3A: LEDPAVWEAGKVVAKGVGTADITATTSNGLIASSEEADNAATS(서열 번호 39). 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이들 서열의 어느 것과도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖지 않는다.
어떠한 태양에 있어서도, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 어느 것도 갖지 않는다(일본 특허공개 2015-97519호):
Zif628: ERPYACPVESCDRRFSRSDELTRHIRIHTGQKPFQCRICMRNFSRSDHLTTHIRTHTGEKPFACDICGRKFARSDERKRHTKIHLRQKD(서열 번호 40);
HinR: GRPRAITKHEQEQISRLLEKGHPRQQLAIIFGIGVSTLYRYFPASSIKKRMN(서열 번호 41); 및
TrpR: MAQQSPYSAAMAEQRHXXQEWLRFVDLLKNAYQNXXDLHLPLLNLMLTPDERXXEALGTRVRIVEELLRGEMSQRELKNELGAGIATITRGSNSLKAAPVELRQWLEEVLLKSD(서열 번호 42).
어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 비인간 생물 내에서 발견되는 천연의 서열일 수 있다. 어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 비천연의 서열 또는 그 일부일 수 있다. 어느 태양에 있어서도, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 어느 것도 아니다(WO2010/034183):
NE-1: TKENPRSNQEESYDDNES(서열 번호 43);
NE-8: TKENPRTNQEESYDDNES(서열 번호 44);
NE-9: TKENPRSNQDESYDDNES(서열 번호 45);
NE-10: TKENPRSNQPPSYDDNES(서열 번호 46).
어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 어느 것도 아니다(WO2011/034605):
ACID. P1: GGSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQGAT(서열 번호 50).
어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 어느 것도 아니다(WO2009/023270):
rPEG＿K288-GFP: (GEGEGGGEG)32(서열 번호 51).
어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 어느 것도 아니다(WO2020/059228):
Hero7: MTRGNQRELARQKNMKKQSDSVKGKRRDDGLSAAARKQRDSEIMQQKQKKANEKKEEPK(서열 번호 1038);
Hero9: MSGPNGDLGMPVEAGAEGEEDGFGEAEYAAINSMLDQINSCLDHLEEKNDHLHARLQELLESNRQTRLEFQQQLGEAPSDASP(서열 번호 1039);
Hero11: MAQGQRKFQAHKPAKSKTAAAASEKNRGPRKGGRVIAPKKARVVQQQKLKKNLEVGIRKKIEHDVVMKASSSLPKKLALLKAPAKKKGAAAATSSKTPS(서열 번호 1040).
또한, 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 어느 것도 아니다(Protein Engineering, Design ＆ Selection, 26(8): 490-501, 2013):
PAS＃1: ASPAAPAPASPAAPAPSAPAA(서열 번호 52);
1P2: ASAAAPAAASAAASAPSAAAA(서열 번호 53);
PAS＃5: AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPAA(서열 번호 54);
및 이들의 반복 서열(예를 들어, 반복 횟수는 200±20회, 400±40회, 또는 600±60회 등).
또한, 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 어느 것도 아니다(Protein Engineering, Design ＆ Selection, 17(11): 779-786, 2004):
Z(W): VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(서열 번호 55);
Z(a1): VDNKFNKEQQNAEYEIEHLPNLNEEQENAFIQSLEDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(서열 번호 56);
Z(a2): VDNKFNKEEEEAEEEIEHLPNLNEEQEEAFIESLEDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(서열 번호 57)
어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 서열 번호 43∼46, 및 47∼58에 기재된 어느 아미노산 서열로부터도 1 이상, 바람직하게는 2 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실, 부가 및 삭제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 변이를 갖고 있어도 된다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 서열 번호 44∼47, 및 47∼58에 기재된 어느 아미노산 서열로부터 90% 미만, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 또는 10% 이하의 서열 동일성을 가질 수 있다.
어떠한 태양에 있어서도, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 서열을 포함하지 않는다(Protein Science (2019) 28, 823-836):
PA12-tag: GVAMPGAEDDVV(서열 번호 47);
PA14-tag: EGGVAMPGAEDDVV(서열 번호 48). 또한, 어떠한 태양에 있어서도, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하의 서열을 포함하지 않는다:
DYKDDDDVEAEESDNVDSADAEEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVYPGQVGYPGQVGYPGQV(서열 번호 49).
어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 서열 번호 14∼48, 및 49∼58의 어느 것과도 90% 미만, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하 또는 10% 이하의 서열 동일성을 갖는다.
어느 태양에 있어서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 이하, (i)∼(iii)의 어느 1, 2, 또는 모두를 만족시키는 서열을 가질 수 있다: (i) 요소 2는 10% 이하이다, (ii) A는 10% 이하이다, 및, (iii) G는 10% 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, A를 연속하여 5 이상 포함하는 서열을 갖지 않는다. 어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, Q를 연속하여 5 이상 포함하는 서열을 갖지 않는다. 어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, S를 연속하여 5 이상 포함하는 서열을 갖지 않는다. 어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, N을 연속하여 5 이상 포함하는 서열을 갖지 않는다. 어느 바람직한 태양에서는, 펩타이드 태그의 아미노산 서열 중의 특정의 단일의 아미노산의 함유율이, 50%를 초과하지 않거나, 40%를 초과하지 않거나, 35%를 초과하지 않거나, 30%를 초과하지 않거나, 25%를 초과하지 않거나, 또는 20%를 초과하지 않는다. 어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, WO2022/092132의 표 1에 기재된 3∼8 아미노산 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함하지 않거나, 당해 아미노산 서열이 연속한 반복(예를 들어, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 또는 10 이상이 연속한 반복)을 포함하지 않는다.
예를 들어, 본 개시의 펩타이드 태그는, 세포내 항체에 대해서는, 응집 형성을 억제하고, 항체의 세포 내에서의 균일한 분포를 촉진하고, 및/또는, 응집 형성을 억제하여, 세포내 항체의 세포 내에 있어서의 항원과의 결합 및 항원과의 공국 재를 촉진할 수 있다. 어느 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 세포내 항체의 세포 내에 있어서의 분포에 펩타이드 태그 고유의 제약을 주는 서열(또는 자유로운 분포를 방해하는 서열)을 갖지 않을 수 있고, 및/또는, 세포내 항체의 세포 내에 있어서의 항원과의 결합 및 항원과의 공국재를 갖지 않을 수 있다.
본 개시의 펩타이드 태그는 모두, 태그화된 단백질의 응집 경향을 완화, 저해 혹은 개선하거나; 비응집성을 증가, 촉진, 혹은 개선하거나; 또는 안정성을 증강, 촉진, 또는 향상시킬 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 세포내 항체의 세포 내에 있어서의 분포에 펩타이드 태그 고유의 제약을 주는 서열(또는 자유로운 분포를 방해하는 서열)을 갖지 않을 수 있고, 및/또는, 세포내 항체의 세포 내에 있어서의 항원과의 결합 및 항원과의 공국재를 갖지 않을 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는 또한, 목적 단백질이 단백질이 항체의 항원 결합성 단편인 경우에는, 당해 단백질이 항원에 결합하는 것에 의해 세포질 중에서 항원과 공국재하는 것을 촉진할 수 있다.
본 개시의 펩타이드 태그는, 예를 들어, 생물이 갖는 유전자가 코딩하는 유전자 산물 또는 그 단편일 수 있고, 여기에서, 비인간 생물(예를 들어, 미생물, 예를 들어, 세균, 조류(藻類), 혹은 진균, 동물, 예를 들어, 포유동물, 조류, 혹은 어류, 또는 식물)이 갖는 유전자가 코딩하는 유전자 산물 또는 그 단편일 수 있다. 혹은, 어느 바람직한 태양에서는, 본 개시의 펩타이드 태그는, 인간이 갖는 유전자가 코딩하는 유전자 산물 또는 그 단편일 수 있다.
본 개시의 펩타이드 태그는, 응집성 단백질에 융합시키는 것에 의해 당해 응집성 단백질의 응집 경향을 완화, 저해 혹은 개선하거나, 또는 응집성 단백질의 비응집성을 증가, 촉진, 혹은 개선할 수 있다. 단백질의 응집은, 그 단백질을 발현한 세포에 대해서 악영향을 미칠 수 있을 뿐만 아니라, 응집에 의해 단백질의 산생량이나 기능성에 악영향을 미칠 수 있다. 따라서, 응집 경향을 완화, 저해, 또는 개선하는 것은, 응집에 의한 세포에의 영향을 저감하여, 단백질의 산생량이나 기능성에 대한 영향을 저감하는 것으로 이어질 수 있다. 이것에 의해, 세포 내에서 발현시킨 응집성 단백질의 발현량의 개선 및/또는 기능성의 향상의 점에서 유익할 수 있고, 따라서, 응집성 단백질의 인비보에서의 강제 발현에 있어서 유용할 수 있다.
따라서, 본 개시의 펩타이드 태그는, 응집성 단백질과 융합시켜도 된다. 응집성 단백질은, 예를 들어, 세포 내에 발현시켰을 때에 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 세포에 있어서 응집을 형성하는 단백질일 수 있다. 응집성 단백질은, 예를 들어, 세포 내에 발현시켰을 때에 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 또는 50% 이하의 세포에 있어서 응집을 형성하는 응집성 단백질이어도 된다. 융합은, 예를 들어, 응집성 단백질의 N말단 및/또는 C말단(바람직하게는, N말단과 C말단의 양쪽)에 대해서 이루어질 수 있다. 융합은, 예를 들어, 본 개시의 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산과 응집성 단백질을 코딩하는 핵산을 인프레임으로(코돈의 읽기 프레임이 정합하도록) 연결하는 것에 의해 달성될 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 비응집성 단백질과 융합시켜도 된다. 이것에 의해, 비응집성 단백질의 비응집성을 더 높일 수 있다. 비응집성 단백질은, 예를 들어, 세포 내에 발현시켰을 때에 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 세포에 있어서 응집을 형성하는 단백질 또는 응집을 형성하지 않는 단백질이어도 된다.
본 개시의 펩타이드 태그는, 단백질에 융합시키는 것에 의해 당해 단백질의 세포내 환경하에서의 안정성을 증강, 촉진, 또는 향상시킬 수 있다. 세포내 환경하에서의 단백질의 안정화는, 응집성 단백질에 있어서도 비응집성 단백질에 있어서도 유익하다.
어느 태양에서는, 목적 단백질은, 제2 펩타이드 태그를 연결하고 있어도 된다. 제2 펩타이드 태그는, 예를 들어, 검출 목적 또는 정제 목적으로 목적 단백질에 부가될 수 있다. 이 경우, 본 개시의 펩타이드 태그는, 목적 단백질과 제2 펩타이드 태그의 융합 단백질에 대해서, 응집 경향을 완화, 저해 혹은 개선하거나; 비응집성을 증가, 촉진, 혹은 개선하거나; 또는 안정성을 증강, 촉진, 또는 향상시키는 것에 이용할 수 있다. 제2 펩타이드 태그로서는, 통상의 펩타이드 태그, 예를 들어, HA 태그를 사용할 수 있다.
응집성 단백질로서는, 특별히 한정되지 않지만 예를 들어, 항체의 항원 결합성 단편일 수 있다. 응집성 단백질로서는, 바람직하게는, 단쇄 Fv(scFv) 또는 VHH 항체일 수 있다. scFv는, 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 링커(바람직하게는 플렉시블 링커)를 개재시켜 연결된 융합 단백질이다. 예를 들어, 세포 내에는, undraggable한 치료 표적이 존재한다. 이것은, 예를 들어, 치료 표적에 저분자 화합물이 결합하는 부위가 발견되지 않는 경우에 현저하다. 항체는, 저분자 화합물과는 완전히 상이한 원리로 표적에 대해서 강한 결합 친화성으로 결합할 수 있어, 저분자 화합물에서는 undraggable이라고 여겨져 온 치료 표적에 대해서 유효하게 작용할 수 있다. 그렇지만, 항체는 통상은 세포 외에 분비되어, 세포 외에서 기능하는 것이다. 따라서, 세포 내에 분비성 단백질(세포 외에 분비되는 단백질)을 발현시키기 위해서는, 세포 내에 분비성 단백질(세포내 항체)이 발현하도록 유전자를 설계할 수 있다. 예를 들어, 분비성 단백질(세포내 항체)을 발현시키기 위해서는, 단백질이 갖는 시그널 서열의 파괴, 바람직하게는 제거 등을 실시할 수 있다. 특히 scFv는 세포 내에 있어서 응집성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 개시의 태그는, 응집성 단백질, 특히 분비성 단백질, 특히 항체의 항원 결합성 단편, 바람직하게는 scFv에 대해서 융합시킬 수 있다. 또한, 분비성 단백질은, 세포 내에 있어서는 응집성을 나타내는 경우가 있다. 이와 같은 분비성 단백질의 분비 전의 세포 내에 있어서의 안정화에 있어서 본 개시의 태그는 유효할 수 있다.
항체, 또는 항체의 항원 결합성 단편은, 그 항원에 대해서 예를 들어, 10-5M 이하, 10-6M 이하, 10-7M 이하, 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-10M 이하, 10-11M 이하, 또는 10-12M 이하의 결합 친화성(KD)을 가질 수 있다. 결합성의 시험 및 결합 친화성의 시험은, 예를 들어, 완충된 생리 식염수 중에 있어서 실시할 수 있다.
항원으로서는, 세포내 항원, 예를 들어, 세포내 단백질을 들 수 있다. 세포내 단백질로서는, 세포질 내의 단백질(예를 들어, 세포 내 소포 외의 세포질의 단백질), 핵 내의 단백질(이 경우, 펩타이드 태그 또는 융합 단백질에는 핵 이행 시그널을 포함해도 된다), 핵 내의 전사 인자, 전사 인자에 결합하는 단백질, 게놈 DNA에 결합하는 단백질, 게놈 DNA에 결합하는 단백질에 결합하는 단백질, 크로마틴의 구성 단백질, 크로마틴에 결합하는 단백질, 세포 내의 세포 골격, 세포 내의 세포 골격에 결합하는 단백질을 들 수 있다. 세포내 단백질로서는 또한, 특별히 한정되지 않지만 예를 들어, 암 드라이버 유전자의 유전자 산물, 활성화된 시그널 캐스케이드 중의 단백질(특히, 암 세포나 면역 관련 질환을 갖는 환자에 있어서의 활성화 면역 세포에 있어서), 및 암 억제 유전자의 유전자 산물(특히, 이것을 음으로 제어하는 결합 파트너에 의한 제어하의)을 들 수 있다. 어느 태양에서는, 항원은 Kras일 수 있다.
단백질의 세포 내에의 도입은, 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 융합 단백질(펩타이드 태그와 목적 단백질의 융합 단백질)을 코딩하는 핵산을 포함하는 단백질 발현 벡터를 세포에 도입하는 것에 의해 달성할 수 있다. 단백질 발현 벡터는, 단백질 산생 세포 내 또는 포유동물 세포 내에 도입되어, 당해 세포 내에 있어서 융합 단백질을 발현할 수 있다.
제어 서열은, mRNA의 전사를 할 수 있는 프로모터일 수 있고, 예를 들어, pol II계 프로모터를 각종 사용할 수 있다. pol II계 프로모터로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 CMV 프로모터, EF1 프로모터(EF1α 프로모터), SV40 프로모터, MSCV 프로모터, hTERT 프로모터, β 액틴 프로모터, CAG 프로모터, 및 CBh 프로모터 등을 들 수 있다. 프로모터로서는 또한, T7 프로모터, T3 프로모터, 및 SP6 프로모터 등의 박테리오파지 유래의 RNA 폴리메라제를 구동하는 프로모터, 및 U6 프로모터 등의 pol III계 프로모터를 이용할 수도 있고, 환상 DNA에 대해서는 바람직하게는 T7 프로모터일 수 있고, 직쇄상 DNA에 대해서는 바람직하게는 SP6 프로모터일 수 있다. 프로모터는, 바이러스의 프로모터여도 된다. 프로모터는 또한, 유도성 프로모터여도 된다. 유도성 프로모터는, 프로모터를 구동하는 유도 인자의 존재하에서만, 당해 프로모터에 기능적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도할 수 있는 프로모터이다. 유도성 프로모터로서는, 히트쇼크 프로모터 등의 가열에 의해 유전자 발현을 유도하는 프로모터를 들 수 있다. 또한, 유도성 프로모터에는, 프로모터를 구동하는 유도 인자가 약제인 프로모터를 들 수 있다. 이와 같은 약제 유도성 프로모터로서는, 예를 들어, Cumate 오퍼레이터 서열, λ 오퍼레이터 서열(예를 들어, 12×λOp), 테트라사이클린계 유도성 프로모터 등을 들 수 있다. 테트라사이클린계 유도성 프로모터로서는, 예를 들어, 테트라사이클린 혹은 그 유도체(예를 들어, 독시사이클린), 또는 리버스 테트라사이클린 제어성 트랜스 활성화 인자(rtTA)의 존재하에서 유전자 발현을 구동하는 프로모터를 들 수 있다. 테트라사이클린계 유도성 프로모터로서는, 예를 들어, TRE3G 프로모터를 들 수 있다.
단백질 발현 벡터는, 특별히 한정되지 않지만, 바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터로서는, 특별히 한정되지 않지만 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 및 수포성 구염 바이러스 벡터를 들 수 있다. 이들 벡터는, 세포에의 감염성을 변경하는 관점에서, 슈도타입이어도 된다. 이들 벡터는, 약독화주에서 유래하고 있어도 된다. 이와 같은 벡터는, 주지 기술에 의해 적절히 조제될 수 있다.
단백질 발현 벡터의 제작의 간편성의 관점에서, 단백질 발현 벡터는, 제어 서열과 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 본 개시의 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산을 포함하고, 당해 핵산의 하류에 목적 단백질을 코딩하는 핵산의 클로닝 부위를 갖고 있어도 된다. 클로닝 부위는, 당해 벡터 내에 유니크하게 존재하는 제한 효소 절단 부위를 가져, 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 단편을 도입하는 것에 적합하다. 펩타이드 태그와 목적 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자는, 펩타이드 태그를 코딩하는 유전자와 인프레임으로 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 연결시키는 것에 의해 얻어진다. 따라서, 본 개시에서는, 제어 서열과 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 본 개시의 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산을 포함하는 단백질 발현 벡터가 제공된다. 이 벡터는, 어느 바람직한 태양에서는, 당해 핵산의 하류에 목적 단백질을 코딩하는 핵산의 클로닝 부위를 갖는다. 또한, 본 개시에서는, 본 개시에서는, 제어 서열과 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 본 개시의 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산과 당해 핵산과 인프레임으로 연결된 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 단백질 발현 벡터가 제공된다. 이와 같이 하여, 펩타이드 태그와 목적 단백질의 융합 단백질을 세포 내에 발현시킬 수 있다.
본 개시에 의하면, 본 개시의 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산을 포함하는 메신저 RNA(mRNA)가 제공된다. mRNA는, 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 목적 단백질을 코딩하는 핵산은, 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산에 인프레임으로 연결되어 있다. 어느 태양에서는, mRNA에서는, 적어도 1 이상의 유리딘이 슈도유리딘으로 변경되어 있어도 된다. 슈도유리딘은, 1-메틸슈도유리딘일 수 있다. mRNA는 cDNA로부터 전사된 것이어도 되고, 즉, 인트론을 갖지 않아도 된다. 또한, mRNA에는, 5＇말단에 Cap 구조를 갖고 있어도 된다(Furuichi Y ＆ Miura K. Nature. 1975; 253(5490): 374-5). Cap 구조는, Cap 아날로그를 이용한 Anti-Reverse Cap Analogues(ARCA)법에 의해 Cap0 구조를 mRNA에 부가할 수 있다(Stepinski J et al. RNA. 2001 Oct; 7(10): 1486-95). 2＇-O메틸트랜스페라제 처리를 추가로 실시하는 것에 의해, mRNA의 Cap0 구조를 Cap1 구조로 변환할 수 있다. 이들은, 통상적 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들어, 시판되는 키트, 예를 들어, ScriptCap m7G Capping System, 및 ScriptCap 2＇-O-Methyltransferase Kit, 또는 T7 mScript Standard mRNA Production System(AR Brown CO., LTD)에 의해서도 실시할 수 있다. mRNA는, 폴리A쇄를 가질 수 있다. 폴리A쇄의 부가는, 통상적 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들어, A-Plus Poly(A) Polymerase Tailing Kit(AR Brown CO., LTD)에 의해 행할 수 있다. 따라서, 어느 태양에서는, mRNA는, 5＇말단에 Cap 구조를 갖고, 3＇말단에 폴리A를 가지며, 바람직하게는 유리딘의 적어도 일부가 슈도유리딘(바람직하게는, 1-메틸슈도유리딘)인 mRNA일 수 있다. mRNA는, 단리된 mRNA 또는 합성된 mRNA일 수 있다.
mRNA는, 나노입자, 예를 들어, 지질 나노입자(LNP)에 내포시킬 수 있다. 이것에 의해, 생체 내에서의 mRNA의 분해를 막음과 함께, 세포 내에 mRNA를 송달하는 효율이 향상된다. 따라서, 어느 태양에서는, mRNA는, 5＇말단에 Cap 구조를 갖고, 3＇말단에 폴리A를 가지며, 바람직하게는 유리딘의 적어도 일부가 슈도유리딘(바람직하게는, 1-메틸슈도유리딘)인 mRNA일 수 있다. 이와 같은 mRNA를 내포하는 지질 나노입자가 또한 제공된다. 지질 나노입자는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, US9364435B, US8822668B, US8802644B, 및 US8058069B2에 기재된 지질 나노입자를 이용할 수 있다. 혹은, mRNA는, 폴리이온 컴플렉스 미셀, 또는 폴리이온 컴플렉스형 폴리머솜에 내포해도 된다(Miyata et al., Chem. Soc. Rev., 2012, 41, 2562-2574). 나노입자는, 1μm 미만의 직경(예를 들어, 유체 역학계)을 갖는 입자이다.
따라서, 본 개시에 의하면, 본 개시의 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산을 적어도 포함하는 mRNA를 포함하는 나노소포(예를 들어, 지질 나노소포 및 폴리이온 컴플렉스형 폴리머솜)가 제공된다. mRNA는, 상기 펩타이드 태그와 목적 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
본 개시에 의하면, 단백질의 응집 경향을 완화, 저해 혹은 개선하는 방법으로서, 당해 단백질에 본 개시의 응집 경향을 완화, 저해 혹은 개선하는 펩타이드 태그를 융합시키는 것을 포함하는, 방법이 제공된다. 이 태양에서는, 단백질은, 응집성 단백질일 수 있다. 응집 경향은, 세포내 환경하에 있어서의 응집 경향일 수 있다. 융합은, 통상은, 단백질의 N말단 및/또는 C말단에 대해서 이루어진다. 방법은, 인비트로의 방법일 수 있다.
본 개시에 의하면 또한, 단백질의 비응집성을 증가, 촉진, 혹은 개선하는 방법으로서, 당해 단백질에 본 개시의 응집 경향을 완화, 저해 혹은 개선하는 펩타이드 태그를 융합시키는 것을 포함하는, 방법이 제공된다. 이 태양에서는, 단백질은, 응집성 단백질일 수 있다. 비응집성은, 세포내 환경하에 있어서의 비응집성일 수 있다. 방법은, 인비트로의 방법일 수 있다.
본 개시에 의하면 또한, 단백질의 안정성을 증강, 촉진, 또는 향상시키는 방법으로서, 당해 단백질에 본 개시의 응집 경향을 완화, 저해 혹은 개선하는 펩타이드 태그를 융합시키는 것을 포함하는, 방법이 제공된다. 이 태양에서는, 단백질은, 응집성 단백질일 수 있다. 이 태양에서는, 단백질은 비응집성 단백질일 수 있다. 안정성은, 세포내 환경하에 있어서의 안정성일 수 있다. 방법은, 인비트로의 방법일 수 있다.
본 개시에 의하면, 단백질의 응집 경향을 완화, 저해 혹은 개선을 위한 본 개시의 펩타이드 태그의 사용이 제공된다. 본 개시에 의하면 또한, 단백질의 비응집성을 증가, 촉진, 혹은 개선을 위한 본 개시의 펩타이드 태그의 사용이 제공된다. 본 개시에 의하면 또한, 단백질의 안정성을 증강, 촉진, 또는 향상을 위한 본 개시의 펩타이드 태그의 사용이 제공된다. 사용은, 인비트로의 사용일 수 있다.
본 개시의 펩타이드 태그가, 어느 정도의 강도로, 단백질의 응집 경향을 완화, 저해 혹은 개선하거나; 비응집성을 증가, 촉진, 혹은 개선하거나; 또는 안정성을 증강, 촉진, 또는 향상시킬 수 있는지는, 인비트로의 어세이에 의해 시험할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 scFv 등의 응집성 단백질을 코딩하는 유전자의 N말단 또는 C말단에 본 개시의 펩타이드 태그를 코딩하는 유전자를 융합시키고, 세포 내에 도입하여, 세포 내에서, 본 개시의 펩타이드 태그를 융합한 응집성 단백질을 발현시킬 수 있다. 응집성 단백질에 대한 항체로 응집성 단백질에 의해 형성되는 응집체를 관찰하여, 당해 응집성 단백질을 발현하는 세포에 대한 응집체를 갖는 세포의 비율(%)을 산출할 수 있다. 이 비율에 의해 단백질의 응집 경향이나 비응집 경향, 안정성에 대한 본 개시의 펩타이드 태그의 영향을 평가할 수 있다.
본 개시에 의하면, 본 개시의 펩타이드 태그를 포함하는, 조성물이 제공될 수 있다. 본 개시의 펩타이드 태그는, 목적 단백질과 반응 용액 중에서, 예를 들어 클릭 반응에 의해 연결될 수 있다. 클릭 반응은, 휘스겐 반응일 수 있다. 펩타이드 태그 및 목적 단백질은, 한쪽이 알킨에 의해 수식되고, 다른 쪽이 아자이드 화합물에 의해 수식되며, 이것에 의해 1,2,3-트라이아졸환을 형성하여, 이들의 연결이 달성된다.
본 개시에 의하면, 본 개시의 펩타이드 태그와 목적 단백질의 융합 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 목적 단백질은, 어느 태양에서는, 응집성 단백질일 수 있다. 목적 단백질은, 어느 태양에서는, 항체의 항원 결합성 단편일 수 있다. 목적 단백질은, 어느 태양에서는, scFv일 수 있다.
본 개시에 의하면, 본 개시의 펩타이드 태그와 목적 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 mRNA, 및 당해 mRNA를 포함하는 조성물이 제공된다. 본 개시에 의하면, 본 개시의 펩타이드 태그와 목적 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 mRNA를 포함하는 소포 및 당해 소포를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 개시에 의하면, 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 본 개시의 펩타이드 태그와 목적 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 단백질 발현 벡터 및 당해 단백질 발현 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.
어느 태양에서는, 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 및/또는, 첨가제를 추가로 갖고 있어도 된다. 조성물은, 어느 태양에서는, 의약 조성물일 수 있다.
본 개시의 모든 태양에 있어서, 본 개시의 펩타이드 태그를 연결한 융합 단백질은, 비천연의 단백질일 수 있다.
본 개시의 모든 태양에 있어서, 펩타이드 및 단백질은 각각, 재조합 펩타이드 및 단백질일 수 있다.
본 개시의 모든 태양에 있어서, 본 개시의 펩타이드 태그는, 적어도 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 scFv에 대해, 단백질의 응집 경향을 완화, 저해 혹은 개선하거나; 비응집성을 증가, 촉진, 혹은 개선하거나; 또는 안정성을 증강, 촉진, 또는 향상시킬 수 있다.
펩타이드, 단백질, 및 핵산은, 단리, 농축 또는 정제되어 있을 수 있다. 단리란, 계의 적어도 1 이상의 다른 성분을 어느 성분으로부터 분리하는 것을 의미한다. 정제란, 계의 적어도 1 이상의 다른 성분의 농도에 대해서, 어느 성분의 상대적 농도를 높이는 것을 말한다. 농축이란, 어느 성분의 농도를 높이는 것을 말한다.
본 개시의 어느 측면에서는,
아미노산 서열(또는 당해 아미노산 서열을 코딩하는 핵산)을 취득(또는 선택 혹은 동정)하는 방법으로서,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산인,
아미노산 서열을 취득하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다.
본 개시의 어느 측면에서는,
아미노산 서열(또는 당해 아미노산 서열을 코딩하는 핵산)을 취득(또는 선택 혹은 동정)하는 방법으로서,
상기 (A)∼(AE) 및 (AF)∼(AU)의 어느 하나의 조건 또는, 이들 조건의 조합의 어느 것을 만족시키는 아미노산 서열을 취득하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다.
본 개시의 어느 측면에서는, 상기 취득하는 방법은,
선택 또는 동정된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 참조 단백질(참조 단백질)의 융합 단백질을 포유동물 세포 내(바람직하게는 인간 세포 내)에 있어서 발현시켰을 때에, 세포 내에 있어서 융합 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율(응집률)을 저하시키는(소정의 값 이하로 한다) 펩타이드 태그의 아미노산 서열을 선택 또는 동정하는 것
을 추가로 포함하고 있어도 된다.
본 개시의 어느 측면에서는, 상기 취득하는 방법은,
당해 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 당해 펩타이드를 코딩하는 핵산을 얻는 것을 추가로 포함하고 있어도 된다.
상기 취득하는 방법에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 10∼200아미노산 길이(예를 들어, 10∼90아미노산 길이)일 수 있다.
본 개시의 어느 측면에서는,
10∼200아미노산 길이(10∼90아미노산 길이)의 아미노산 서열(또는 당해 아미노산 서열을 코딩하는 핵산)을 취득(또는 선택 혹은 동정)하는 방법으로서,
(a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산인,
아미노산 서열을 취득하는 것과,
선택 또는 동정된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 참조 단백질(참조 단백질)의 융합 단백질을 포유동물 세포 내(바람직하게는 인간 세포 내)에 있어서 발현시켰을 때에, 세포 내에 있어서 융합 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율(응집률)을 저하시키는(소정의 값 이하로 하는) 펩타이드 태그의 아미노산 서열을 선택 또는 동정하는 것과,
당해 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 당해 펩타이드를 코딩하는 핵산을 얻는 것
을 포함하는,
방법
이 제공된다. 이 방법에서는, 저하의 정도를 크게 하는 것, 또는 소정의 값을 작게 하는 것에 의해, 안정화 작용을 갖는 펩타이드 중에서, 특히 우수한 안정화 작용을 나타내는 펩타이드를 선택할 수 있다. 어느 태양에서는, 본 방법은, 선택 또는 동정된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 참조 단백질(참조 단백질)의 융합 단백질을 포유동물 세포 내(바람직하게는 인간 세포 내)에 있어서 발현시키는 것을 추가로 포함하고 있어도 된다. 본 방법에서는, 선택 또는 동정된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 얻는 것을 추가로 포함하고 있어도 된다. 소정의 값은, 당해 응집성 단백질을 발현하는 세포에 대한 응집체를 갖는 세포의 비율(%)에 기초하는 수치일 수 있다. 예를 들어, 소정의 값은, 30% 이하의 값, 20% 이하의 값, 15% 이하의 값, 10% 이하의 값, 5% 이하의 값, 3% 이하의 값, 2% 이하의 값, 혹은 1% 이하의 값, 또는 0%로 할 수 있다. 소정의 값은 또한, 0%∼10%의 범위의 값, 10%∼20%의 범위의 값, 20∼30%의 범위의 값으로 할 수 있다. 보다 효과가 높은 펩타이드를 취득하고 싶은 경우에는, 소정의 값을 작게 하면 바람직하다. 이 태양에 의하면, 예를 들어, 본 개시의 상기 펩타이드 태그(예를 들어, 상기 (A)∼(Z), (AA)∼(AE), 및 (AF)∼(AU)의 어느 하나의 펩타이드 태그) 중에서, 보다 강력한 효과를 나타내는 펩타이드 태그를 선택할 수 있다.
참조 단백질은, 예를 들어, 세포 내에 있어서 융합 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율이 30%를 초과하는, 40%∼50% 이하, 50%∼60%, 60%∼70%, 70%∼80%, 80%∼90%, 90%∼95%, 95%∼99%, 99%∼99.9%, 또는 99.9% 이상인 단백질(응집성 단백질, 예를 들어, scFv)로 할 수 있다. 참조 단백질은, 특별한 기능성이나 항원에 대한 결합성을 가질 필요가 없고, 단지 응집률의 저감의 평가의 목적으로 이용되는 것이기 때문에, 그 CDR 서열은 임의의 서열이어도 된다. 가령 CDR의 아미노산 서열에 의해 scFv의 응집률이 변동해도 된다. 변동된 응집률을 갖는 scFv에 대해서, 응집률을 소정의 값 이하로 하는 펩타이드 태그의 아미노산 서열을 탐색할 수 있다. 어느 바람직한 태양에서는, 참조 단백질은, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다.
어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (B)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (D)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (E)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (F)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (G)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (H)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (I)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (I)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (J)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (K)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (L)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (M)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (N)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (O)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (P)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (Q)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (R)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (S)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (T)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (U)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (V)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (W)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (X)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (Y)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (Z)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AA)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AB)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AC)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AD)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AE)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AF)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AG)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AH)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AI)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AJ)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AK)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AL)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AM)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AN)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AO)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AP)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AQ)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AR)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AS)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AT)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (AU)에 규정되는 조건을 추가로 만족시킨다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 상기 (A)∼(Z), (AA)∼(AE), 및 (AF)∼(AU)에 기재된 어느 하나 이상의 조건을 만족시킨다.
어느 태양은, 취득되는 아미노산 서열은, 아미노산 서열군으로부터 선택될 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (A)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (B)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (C)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (D)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (E)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (F)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (G)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (H)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (I)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (J)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (K)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (L)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (M)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (N)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (O)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (P)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (Q)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (R)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (S)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (T)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (U)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (V)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (W)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (X)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (Y)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (Z)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AA)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AB)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AC)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AD)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AE)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AF)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AG)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AH)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AI)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AJ)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AK)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AL)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AM)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AN)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AO)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AP)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AQ)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AR)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AS)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AT)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 태양에서는, 아미노산 서열군은 상기 (AU)에 규정되는 아미노산 서열의 군일 수 있거나, 당해 군을 포함할 수 있다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 낮다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 1% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 2% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 3% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 4% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 6∼10%이며, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 5% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 7∼10%이며, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 6% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 8∼10%이며, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 7% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 9∼10%이며, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 8% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 참조 단백질의 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가, 0.9 이하, 0.8 이하, 0.7 이하, 0.6 이하, 0. 이하, 0.4 이하, 0.3 이하, 0.2 이하, 또는 0.1 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.9 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.8 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.7 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.6 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.5 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.4 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.3 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.2 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5∼10%이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.1 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5% 미만이며, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 낮다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5% 미만이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.9 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5% 미만이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.8 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5% 미만이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.7 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5% 미만이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.6 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5% 미만이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.5 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5% 미만이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.4 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5% 미만이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.3 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5% 미만이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.2 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 5% 미만이며, 당해 응집률에 대한 융합 단백질의 응집률의 비가 0.1 이하의 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 10%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 10% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 20%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 10% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 20%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 20% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 30%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 10% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 30%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 20% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 30%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 30% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 40%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 10% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 40%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 20% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 40%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 30% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 40%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 40% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 50%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 10% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 50%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 20% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 50%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 30% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 50%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 40% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 50%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 50% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 60%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 10% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 60%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 20% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 60%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 30% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 60%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 40% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 60%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 50% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 60%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 60% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 70%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 10% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 70%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 20% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 70%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 30% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 70%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 40% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 70%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 50% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 70%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 60% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 70%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 70% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 80%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 10% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 80%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 20% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 80%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 30% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 80%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 40% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 80%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 50% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 80%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 60% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 80%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 70% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 80%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 80% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 90%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 10% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 90%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 20% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 90%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 30% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 90%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 40% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 90%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 50% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 90%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 60% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 90%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 70% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 90%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 80% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
어느 바람직한 태양에서는, 상기 참조 단백질의 응집률이 90%를 초과하고, 당해 응집률보다도 융합 단백질의 응집률이 90% 이상 낮은 소정의 값 이하이다.
얻어진 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산은, 목적 단백질을 코딩하는 핵산과 인프레임으로 연결하여, 펩타이드 태그와 목적 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 얻을 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 핵산으로부터는, 융합 단백질을 발현시킬 수 있다. 제어 서열에 작동 가능하게 연결한 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 단백질 발현 벡터를 조제해도 된다.
본 개시의 어느 측면에서는, 상기 방법은, 10∼200아미노산(예를 들어, 10∼90아미노산) 길이의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 태그가 태그화된 단백질에 대해서 소정의 강도 이상의 응집성의 개선 효과를 갖는지 여부를 결정하는 것에 이용할 수 있다. 즉, 본 개시의 어느 측면에서는,
10∼90아미노산 길이의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 태그가 태그화된 단백질에 대해서 소정의 강도 이상의 응집성의 개선 효과를 갖는지 여부를 결정하는 방법으로서,
(α) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
(β) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산인,
아미노산 서열을 취득하는 것과,
선택 또는 동정된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 참조 단백질의 융합 단백질을 포유동물 세포 내(바람직하게는 인간 세포 내)에 있어서 발현시켰을 때에, 세포 내에 있어서 융합 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율(응집률)이 저하되는(또는 소정의 값 이하인) 펩타이드 태그의 아미노산 서열이, 응집성(예를 들어, 소정의 강도 이상의 응집성)의 개선 효과를 갖는다고 결정하는 것을 포함하는,
방법
이 제공된다. 어느 태양에서는, 본 방법은, 선택 또는 동정된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 참조 단백질의 융합 단백질을 포유동물 세포 내(바람직하게는 인간 세포 내)에 있어서 발현시키는 것을 추가로 포함하고 있어도 된다. 어느 태양은, 취득되는 아미노산 서열은, 아미노산 서열군으로부터 선택될 수 있다. 아미노산군의 상세는 전술한 바와 같다. 어느 태양에서는, 취득되는 아미노산 서열은, 추가적인 1 이상의 조건을 만족시킨다. 당해 조건은 전술한 바와 같다. 어느 태양에서는, 참조 단백질의 응집률과 소정의 값은 전술한 바와 같다.
어느 태양에서는, 상기의 10∼200아미노산(예를 들어, 10∼90아미노산) 길이의 아미노산 서열을 선택 또는 동정하는 방법에서는, 10∼200아미노산(예를 들어, 10∼90아미노산) 길이의 아미노산 서열군이, 인간 게놈의 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 군일 수 있다. 어느 태양에서는, 10∼90아미노산 길이의 아미노산 서열군이, 비인간 생물의 게놈의 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 군일 수 있다.
어느 태양에서는, 10∼200아미노산(예를 들어, 10∼90아미노산) 길이의 아미노산 서열이, 네오안티젠일 수 있다. 네오안티젠은, 암 세포의 독자적인 유전자 변이에 의해 새롭게 생긴 변이 항원으로서 발견되었다. 네오안티젠은, 비암 세포에 있어서는 발현하지 않는다. 네오안티젠을 포함하는 펩타이드를 투여하는 것에 의해, 네오안티젠에 대한 면역을 유도하면, 암 특이적으로 면역을 유도할 수 있다고 기대되고 있다. 네오안티젠은, 암 세포마다 상이할 수 있다. 네오안티젠은, 예를 들어, 당해 네오안티젠을 갖는 세포의 세포 내에 발현시키는 목적 단백질에 대해서 태그 붙이기하는 것에 이용할 수 있고, 원래 발현하고 있는 펩타이드이므로 세포에 대해서 악영향이 없거나, 조금 밖에 악영향을 미치지 않는다고 생각되기 때문에, 이용 가능하다. 네오안티젠은, 천연에 생기는 변이체일 수 있다. 네오안티젠은, 예를 들어, 그 야생형의 서열에 대해서, 부가, 삽입, 결실, 및 치환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 변이를 갖고 있다. 예를 들어, 인간의 네오안티젠은, 전형적으로는, 인간의 야생형의 서열에 대해서, 부가, 삽입, 결실, 및 치환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상(예를 들어, 1∼10, 예를 들어, 1∼수 개, 1∼5, 1∼4, 1∼3, 2, 또는 1)의 변이를 갖고 있다. 인간의 네오안티젠은, 예를 들어, 인간의 야생형 서열과 80% 이상의 동일성, 85% 이상의 동일성, 90% 이상의 동일성, 또는 95% 이상의 동일성을 가질 수 있다.
어느 태양에서 바람직하게는, 참조 단백질은, scFv이다. 어느 태양에서는, scFv는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 펩타이드 태그의 아미노산 서열을 개변하는 방법으로서,
융합 단백질 제작용의 펩타이드 태그(본 명세서에 개시된 어느 펩타이드 태그여도 된다)를 준비하는 것과,
펩타이드 태그의 요소 2, 3 또는 4의 1 이상(바람직하게는 복수)의 아미노산(바람직하게는, 요소 2, 요소 4, A, G, Y, 및 F의 어느 것)을 P 및 N의 어느 것으로 치환하는 것에 의해, 개변된 아미노산 서열을 얻는 것
을 포함하는 방법이 제공된다. 본 측면의 방법은,
선택 또는 동정된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 참조 단백질의 융합 단백질을 포유동물 세포 내(바람직하게는 인간 세포 내)에 있어서 발현시켰을 때에, 세포 내에 있어서 융합 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율(응집률)이 저하되는(또는 소정의 값 이하인) 펩타이드 태그의 아미노산 서열이, 응집성(예를 들어, 소정의 강도 이상의 응집성)의 개선 효과를 갖는다고 결정하는 것을 추가로 포함하고 있어도 된다. 이와 같이 하는 것에 의해, 특히 응집 저하 작용의 강한 개변이 가능해진다.
실시예
실시예 1
[방법]
· 유전자 발현 벡터의 구축
펩타이드 태그와 응집성 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자 단편의 제작은 유로핀제노믹스 또는 벡터빌더 재팬에 의해 행해졌다. 합성된 유전자 단편은, pEF-BOS 벡터(Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Res. 1990 Sep 11; 18(17): 5322.)에 클로닝되었다. 응집성 단백질로서는, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질(구체적으로는 scFv)을 이용했다. 이 응집성 단백질은, 세포 내에 발현시키면 세포질 내에서 응집한다. 이용된 태그 서열과 그 서열 번호는 이하 표 1과 같았다.
Figure pct00001
구체적인 아미노산의 함유 비율은 이하와 같다.
Figure pct00002
표 2에 있어서,
요소 1은, D 및 E이고,
요소 2는, H, K 및 R이고,
요소 3은, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A이고,
요소 4는, 그 이외의 아미노산이다.
펩타이드 태그는, 항체 단편의 N말단에 융합시켰다. 펩타이드 태그와 융합시킨 항체 단편에는, 검출을 위해서, 서열 번호 13의 HA 태그를 항체 단편의 C말단에 연결시켰다.
· 세포내 항체의 세포내 응집률의 측정
(세포 배양)
인간 자궁경부류 상피암 유래의 HeLa 세포를 준비했다. HeLa 세포는 국립연구개발법인 의약기반·건강·영양연구소, JCRB 세포 뱅크로부터 구입하여(JCRB9004), 10% FBS를 포함하는 DMEM(D-MEM 후지필름 와코 쥰야쿠 4548995066251)에서 배양했다.
(트랜스펙션)
폴리-L-리신(Sigma-Aldrich P1399 Poly-L-lysine hydrobromide mol. Wt. 150000-300000)을 코팅한 35mm-유리 바닥 티슈(IWAKI 3911-035, glass hole, 내경 12mm)에 HeLa 세포 4×105개를 살포하고, 24시간 후에 Lipofectamine 3000(Invitrogen, L3000-008)으로 제조원의 사용 방법에 기초하여 HeLa 세포에 상기 항체 단편 유전자를 도입하여, 세포 내에 태그화 항체 단편을 발현시켰다. 트랜스펙션 24시간 후에 배양액을 제거하고, 세포를 4% PFA로 고정했다. 고정 20분 후에 PBS(-)로 세포를 세정하고, 그 후, 면역 염색에 의해, 세포 내에 발현한 항체(이하, 간단히 「세포내 항체」라고 한다.)를 관찰하여, 그 응집률을 측정했다.
(면역 염색)
면역 염색은 표준적인 방법으로 행했다. 세포를 2분간, 0.3% Triton X-100/PBS(-)로 처리를 하고, 블로킹 용액(1% BSA, 0.1% Triton X-100/PBS(-))에서 1시간, 실온에서 보온했다. 블로킹 용액으로 희석한 항HA 항체(rabbit anti-HA antibody: Sigma-Aldrich H6908)에서 세포를 2시간, 실온에서 보온하고, 세포를 블로킹 용액으로 세정 후에, 블로킹 용액으로 희석한 Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG(H＋L)(Invitrogen A11034)에서 세포를 2시간, 실온에서 보온했다. 블로킹 용액으로 세포를 세정 후, 핵 염색 프로브(NucBlue Fixed cell stain ReadyProbes, Invitrogen R37606)에서 15분, 실온에서 보온하고, PBS(-)로 세정하고, 형광 화상을 취득할 때까지 4℃에서 보관했다.
(형광 화상의 취득)
형광 화상은 키엔스 BZ-X700 또는 BZ-X800을 이용하여 40배의 대물 렌즈를 이용하여 행했다. 1디시당 세포 200개 이상을 포함하는 화상을 취득하고, 세포내 항체가 응집하고 있는 세포(세포내 항체 응집 세포)의 수를 카운트했다. 세포내 항체를 발현하는 전체 세포수로 세포내 항체 응집 세포의 수를 노멀라이즈함으로써, 세포내 항체의 세포내 응집률을 정량화했다.
[결과]
표 1에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 항체의 항원 결합성 단편(구체적으로는 scFv)에 융합시키고, 얻어진 융합 단백질을 HeLa 세포의 세포질 내에 있어서 발현시켰다. 각 펩타이드 태그의 아미노산 비율은, 표 2에 나타났다. 또한, 형광 화상으로부터 구해진 세포내 응집률은, 표 2에 나타나는 바와 같았다. 표 2에서는, Myc 태그를 부여한 분자가 대조로서 이용되고, 각 펩타이드 태그의 효과는, Myc 태그와의 응집률의 차에 의해 평가했다.
표 2에 나타나는 바와 같이,
· 요소 3의 비율은, 40∼75%의 범위에서, 응집률이 저하되는 경향이 인정되고;
· 요소 4의 비율은, 작을수록 응집률이 저하되는 경향이 인정되고;
· 알라닌(A)의 비율이 10%를 초과하면 응집률이 증대되는 경향이 인정되고;
· 글리신(G)의 비율이 10%를 초과하면 응집률이 증대되는 경향이 인정되고;
· 요소 1의 비율이 클수록 세포내 응집률은 저하되는 경향이 인정되었다.
세린(S)은, 존재하지 않아도 되지만(Tag-4-1 참조), 대량으로 존재해도 응집률의 저하에 악영향을 가져오는 경우가 없었다(Tag-1-1∼Tag-1-3 참조).
어느 경우에도, 산성 아미노산 함유율이 45% 미만인 펩타이드 태그는, 세포내 단백질 등에의 비특이적 흡착(특히, 펩타이드 태그의 음전하에 의한 비특이적 흡착)은 인정되지 않았다. 목적 단백질의 자유로운 세포내 국재에 태그 고유의 제한을 가하지 않는 관점에서, 본 개시의 펩타이드 태그의 유용성이 시사되었다.
또한, Myc 태그(대조)와 Tag-4-1을 비교하면, 요소 4를 감소시키고, 요소 3을 증가시키는 것은, 펩타이드 태그의 응집률의 저하 작용에 강하게 기여하고 있음을 이해할 수 있다. 마찬가지로, Tag-1-2과 Tag-1-1의 비교로부터도, 요소 4를 감소시키고, 요소 3을 증가시키는 것은, 펩타이드 태그의 응집률의 저하 작용에 기여하고 있음을 이해할 수 있다.
특히, 요소 1의 비율이 20% 이상 45% 미만이고, 요소 2는 10% 이하이고, 요소 3이 40∼75%이고, 요소 4의 비율이 10% 이하이고, 알라닌의 비율이 10% 이하이고, 또한, 글리신의 비율이 10% 이하인 경우에, 바람직하게 응집률이 저하되었다.
응집성 단백질과 태그(Tag4-1)의 융합 단백질을 발현하는 HeLa 세포를 형광 현미경하에서 관찰했다. 음성 대조로서, Tag4-1 태그 없음의 응집성 단백질을 발현하는 HeLa 세포를 형광 현미경하에서 관찰했다. 결과는, 도 1에 나타나는 바와 같았다. 도 1에 나타나는 바와 같이, Tag4-1로 태그화하면(Tag-4-1과 융합하면) 응집성 단백질은 세포질 내에 균일하게 분포하는 데 반해, Tag4-1 태그 없음의 응집성 단백질은, 대부분의 세포의 세포질 내에 응집체를 형성했다.
실시예 2: 태그에의 아미노산의 부가 실험
태그 중의 아미노산 함유율과 태그 부여한 단백질의 응집률에 대해 더 분석을 진행시켰다. Tag4-1 또는 Tag11-1에 대해서 세린(S)을 랜덤으로 삽입 또는 부가하고, 얻어진 개변 태그의 단백질 응집률에 대한 효과를 조사했다. 태그가 상이한 것 이외에는, 상기 실시예에 기재되는 바와 같이 실험을 행했다. 결과는 표 3에 기재되는 바와 같았다. 표 3에서는, 부가 또는 삽입된 아미노산에 밑줄을 부여했다.
Figure pct00003
표 3에 나타나는 결과, 태그 중에 있어서의 S의 증가는, 태그 부가된 펩타이드의 응집률에 큰 영향을 주지 않았다. 태그 중의 산성 아미노산의 증가는, 태그 부가된 펩타이드의 응집률의 저하에 큰 영향을 줌이 알려져 있지만(US2020/0157210 A), 이에 반해서, 본 실시예에 의하면 산성 아미노산의 비율의 저하에 의해서도, 응집률이 크게 저하되지 않았다.
마찬가지로, 세린 이외의 아미노산 함유율을 변경하여, 태그 부가된 펩타이드의 응집률에 대한 영향을 확인했다. 표 4∼8에서는, 부가 또는 삽입된 아미노산에 밑줄을 부여했다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
상기와 같이, 특정 아미노산 10개 또는 20개의 랜덤한 부가 또는 삽입에 의해 얻어진 태그의 단백질 응집률에의 영향을 확인하면, F 및 Y의 부가 또는 삽입은, 태그 부여한 단백질의 응집률을 악화시키는 경향을 나타냈다. 또한, 그 외의 아미노산의 부가 또는 삽입은, D 및 E 함유율의 감소에도 불구하고, 태그 부여한 단백질의 응집률에의 악영향은 한정적이었다.
실시예 3: 태그 중 아미노산의 치환에 의한 아미노산 함유율 변동의 단백질의 응집률에의 효과
N, P, S, Q, F, 및 Y를 각각, 다른 아미노산으로 치환하는 것에 의해, 이들 아미노산 중에서 단백질 응집률에 효과를 발휘하는 아미노산을 특정하는 것을 시도했다. 표 9 및 10에서는, 치환된 아미노산에 밑줄을 부여했다.
Figure pct00009
Figure pct00010
표 9 및 10으로부터, 태그 중에 P 또는 N의 함유율이 높은 경우에, 태그가 부여된 단백질의 응집률의 저하 작용은 가장 크고, 그 다음에, S 및 Q의 함유율, 추가로, F 및 Y의 함유율의 순서로 응집률의 저하 작용을 발휘했다. 산성 아미노산 함유율이 약 51%인 45Tag1에 관해서 요소 3을 모두 P로 치환하여 제작한 45Tag1-m1 펩타이드 태그는 P에의 아미노산 치환에 의해 그 응집 억제 작용을 크게 향상시켰다. 이와 같이, P 및 N의 추가에 의한 응집률의 저하 작용의 증대는 산성 아미노산 함유율에는 따르지 않음이 분명해졌다. 또한, 이 결과로부터는, 그 구성 아미노산의 대부분이 산성 아미노산과 N 또는 P로 하는 것도 가능함도 나타났다.
실시예 4: 서열의 셔플
Tag4-8의 아미노산 서열을 랜덤으로 셔플한 2개의 태그: Tag4-8(Scr1) 및 Tag4-8(Scr2)을 합성하여, 상기와 마찬가지로 scFv에 대한 응집률의 저하 작용을 시험했다. 결과는, 표 11에 나타나는 바와 같았다.
Figure pct00011
표 11에 나타나는 바와 같이, Tag4-8, Tag4-8(Scr1) 및 Tag4-8(Scr2)은, 동등한 응집률의 저하 작용을 발휘했다. 각 아미노산의 함유 비율이나 길이를 바꾸지 않고 아미노산의 나열 순서만을 바꾸어도 응집률 저하 작용에 영향은 인정되지 않았다.
실시예 5: 인간 유래 펩타이드의 태그 이용
인간 프로테옴 데이터베이스(Proteome ID: UP000005640)로부터 특정의 아미노산 함유 비율을 갖는 펩타이드를 전체 추출하고, 랜덤으로 펩타이드를 선택하여 태그로서 이용하여, 태그 부여된 단백질에 대한 응집률의 저하 작용을 검토했다.
추출 조건 1:
길이 20∼70 아미노산
그룹 [D, E] 함유율 [30] 이상
그룹 [D, E] 함유율 [45] 미만
그룹 [H, K, R] 함유율 [5] 이하
그룹 [C, T, V, L, I, W, M] 함유율 [5] 이하
그룹 [G] 함유율 [10] 미만
그룹 [A] 함유율 [10] 미만
그룹 [F, Y] 함유율 [5] 이하
그룹 [N] 함유율 [15] 이상
※ 상기 추출 조건에 있어서, 함유율의 단위는 %이다. 아미노산은 1문자 표기에 의해 표시되어 있다.
Figure pct00012
표 12에서는, 추출된 태그의 아미노산 서열의 N함유 비율은 15% 이상이며, 그 외의 아미노산 함유 비율은, 추출 조건 1에 기재된 바와 같다. 응집 억제 작용이 구체적인 아미노산 서열에 의존하지 않는 것을 확인하기 위해서, 추출 조건 1에 의해 추출된 태그로부터 랜덤으로 태그를 선택했다. 몇몇 태그에 관해서는, 동일 단백질의 다른 개소로부터 동 추출 조건을 만족시키는 아미노산 서열을 추가적으로 선택했다. 선택된 아미노산 서열을 갖는 태그를 부가한 scFv의 응집률을 시험한 바, 표 12에 나타나는 바와 같은 결과를 얻었다. 표 12에 나타나는 바와 같이, 태그를 부여한 scFv의 응집률은 전체적으로 낮았다. 따라서, 펩타이드 태그의 응집 억제 작용은, 그 아미노산 함유 비율에 크게 의존하고, 구체적인 아미노산 서열 그 자체에는 약하게 밖에 의존하지 않음이 분명하다.
한편, 추출 조건 1에서 추출할 수 있는 인간 유래 아미노산 서열은 이하와 같았다.
[표 12-2]
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
추출 조건 2:
길이 20∼70 아미노산
그룹 [D, E] 함유율 [30] 이상
그룹 [D, E] 함유율 [45] 미만
그룹 [P] 함유율 [10] 이상
그룹 [H, K, R] 함유율 [5] 이하
그룹 [G] 함유율 [10] 미만
그룹 [A] 함유율 [10] 미만
그룹 [C, T, V, L, I, M, W] 함유율 [0]
그룹 [F, Y] 함유율 [0]
※ 상기 추출 조건에 있어서, 함유율의 단위는 %이다. 아미노산은 1문자 표기에 의해 표시되어 있다.
Figure pct00017
표 13에서는, 추출된 태그의 아미노산 서열의 P 함유 비율은 15% 이상이며, 그 외의 아미노산 함유 비율은, 추출 조건 2에 기재된 바와 같다. 응집 억제 작용이 구체적인 아미노산 서열에 의존하지 않음을 확인하기 위해서, 추출 조건 2에 의해 추출된 태그로부터 랜덤으로 태그를 선택했다. 몇몇 태그에 관해서는, 동일 단백질의 다른 개소로부터 동 추출 조건을 만족시키는 아미노산 서열을 추가적으로 선택했다. 선택된 아미노산 서열을 갖는 태그를 부가한 scFv의 응집률을 시험한 바, 표 13에 나타나는 바와 같은 결과를 얻었다. 표 13에 나타나는 바와 같이, 태그를 부여한 scFv의 응집률은 전체적으로 낮았다.
한편, 추출 조건 2에서 추출할 수 있는 인간 유래 아미노산 서열은 이하와 같았다.
[표 13-2]
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
추출 조건 3:
길이 20∼70
그룹 [D, E] 함유율 [45] 이상
그룹 [G] 함유율 [10] 미만
그룹 [A] 함유율 [10] 미만
그룹 [F, Y] 함유율 [0]
그룹 [C, M, L, I, W, T, V] 함유율 [0]
그룹 [P] 함유율 [15] 이상
Figure pct00021
Figure pct00022
표 14에서는, 추출된 태그의 아미노산 서열의 산성 아미노산 비율은 45% 이상이고, P 함유 비율은 15% 이상이며, 그 외의 아미노산 함유 비율은, 추출 조건 3에 기재된 바와 같다. 응집 억제 작용이 구체적인 아미노산 서열에 의존하지 않음을 확인하기 위해서, 추출 조건 3에 의해 추출된 태그로부터 랜덤으로 태그를 선택했다. 몇몇 태그에 관해서는, 동일 단백질의 다른 개소로부터 동 추출 조건을 만족시키는 아미노산 서열을 추가적으로 선택했다. 선택된 아미노산 서열을 갖는 태그를 부가한 scFv의 응집률을 시험한 바, 표 14에 나타나는 바와 같은 결과를 얻었다. 표 14에 나타나는 바와 같이, 태그를 부여한 scFv의 응집률은 전체적으로 낮았다. 표 14-1로부터는, 산성 아미노산의 함유율이 높은 펩타이드 태그에 대해서도, G, A, F, Y, C, M, L, I, W, T, 및 V의 함유율을 낮게 하여, P의 함유율을 높게 하는 전략은 기능함을 이해할 수 있었다.
한편, 추출 조건 3에서 추출할 수 있는 인간 유래 아미노산 서열은 이하와 같았다.
[표 14-2]
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
이상의 실시예에 의해 나타나는 바와 같이, 펩타이드 태그의 단백질 응집률 저하 작용은, 구체적인 아미노산 서열에의 의존성은 낮고, 또한, 유래하는 단백질에의 의존성도 낮고, 아미노산 함유율에의 의존성이 높았다.
실시예 6: 다양한 단백질에 대한 부가와 응집 억제 작용
상기 실시예에서는, scFv로서 Y13-259를 이용했다. 본 실시예에서는, VHH 항체(중쇄 항체의 중쇄 가변 도메인)를 이용한다. VHH 항체로서는, Ras에 결합하는 iDab＃6을 이용했다. 태그로서는, Tag4-8을 이용했다. 그 외의 조건은, 실시예 1과 동일했다. 결과, 태그를 갖지 않는 VHH 항체의 응집률은, 57.89%였던 것에 반해, Tag4-8을 C말단에 갖는 VHH 항체의 응집률은, 8.77%로, 태그 부여에 의해, 강한 응집 억제 작용이 나타났다.
또한, 세포로서 신경아세포종 세포주인 SHSY5Y(인간 도파민양 세포)를 이용하고, scFv로서 scFv-6E(6E)를 이용하고, 태그로서 Tag4-8 또는 Tag18-1을 C말단 및 N말단에 부가하면, Tag4-8 부가 scFv의 응집률은 0.96%이고, Tag18-1 부가 scFv의 응집률은 1.14%로, 태그 부여는, 낮은 응집률에 기여하고 있음이 나타났다.
더욱이, VHH 항체로서 A형 보툴리누스균 독소에 결합하는 D4(서열 번호 1032: QVQLQQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVLCISSSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADDLRCGSNWSSYFRGSWGQGTQVTVSS)를 이용하고, 태그로서 Tag4-8을 상기 VHH 항체의 C말단에 부가하면, Tag4-8 부가 D4의 응집률은 7.8%이고, 태그를 갖지 않는 D4의 응집률은, 81.5%이다. 이 결과로부터, 태그 부여는, VHH 항체의 응집률의 저하에 기여하고 있음이 나타났다.
실시예 7: 세포내 항체의 안정화에 의한 작용 강화(아밀로이드 축적에 대한 항체 작용의 증강 효과)
신경 세포 내에 아밀로이드가 축적되는 것에 의해 중추 신경 질환이 생길 수 있음이 알려져 있다. 신경 세포에 세포 외로부터 인간 α-시누클레인 피브릴을 도입하면, 세포 내의 정상 구조를 갖는 시누클레인을 말려들게 하여, 시누클레인 피브릴이 형성된다. 세포 내에 GFP 태그 부가 시누클레인을 발현시켜 두면, 도입된 인간 α-시누클레인 피브릴과 하나로 되어 시누클레인 피브릴을 형성하고, 형성된 시누클레인 피브릴은, GFP에 의한 형광으로 관찰할 수 있다. 본 실시예에서는, SHSY-5Y 세포에 GFP 태그 부가 시누클레인을 발현시키고, α-시누클레인 피브릴(코스모바이오, SYNO3)을 세포 외로부터 SHSY-5Y 세포 내에 도입했다. 본 실시예에서는, 이 시누클레인 피브릴을 감소시키는 항체의 능력을 시험했다. 구체적으로는, 항체로서는, 섬유화한 시누클레인에 결합하는 scFv-6E(서열 번호 1033: AEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSYIASGGDTTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGASAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSNDPYTFGQGTKVEIKR)를 이용했다. scFv-6E는, 시누클레인의 모노머나 올리고머에 대해서는 유의한 결합성을 나타내지 않는 항체이며, 이와 같은 시누클레인 피브릴 선택적 또는 특이적인 항체는, 시누클레인 피브릴을 선택적으로 제거하는 데에는 적합하다. scFv-6E에 대해서, 응집률 저하 작용을 갖는 태그(Tag4-8 또는 Tag18-1) 및 분해 유도 서열(CMA(서열 번호 1034): MARVKKDQAEPLHRKFERQPPG)을 부가했다. 상기 단백질의 발현 플라스미드 벡터는, X-tremGENE9에 의해, 시누클레인 피브릴은, Multifectam(Merck)에 의해 세포 내에 도입했다. 항체는, HA 태그 또는 myc 태그가 부여되어, 항HA 태그 항체로 검출되었다. 시누클레인 피브릴은, 항인산화 α시누클레인 항체로 검출되었다. 이들 항체는, Alexa 555 표지 항체 및 Alexa 633 표지 항체로 특이적으로 검출되었다. 형광 염색된 세포를 키엔스 BZ-X800으로 관찰했다.
태그는, N말 및 C말에 부가했다. N말 및 C말에 Tag4-8을 부가한 것의 응집률은, SHSY-5Y 세포에 있어서 0.96%이고, N말 및 C말에 Tag18-1을 부가한 것의 응집률은, SHSY-5Y 세포에 있어서 1.14%로, 태그 부가하지 않는 scFv-E6의 응집률이 HeLa 세포에서 41.6%인 것을 고려하면 양호한 응집 억제를 나타냈다고 생각된다.
scFv는 시누클레인 피브릴과 결합하면, 분해 유도 서열 때문에 시누클레인 피브릴을 리소좀에 표적화하여, 시누클레인 피브릴을 분해하고, 결과로서, 세포 내의 시누클레인 피브릴의 양이 감소한다고 기대된다. 태그에 의해 scFv의 응집률을 저하시키는 것에 의해, 기능적인 scFv의 세포내량이 증가하고, 이것에 의해, 시누클레인 피브릴의 감소량이 증대되는지를 평가했다.
시누클레인 피브릴을 형성한 세포 내에 상기 항체를 발현시켜, 시누클레인 피브릴 양성 세포수를 측정했다. 항체가 발현한 세포와 발현하지 않았던 세포에서, 시누클레인 피브릴의 양성률을 비교했다. 결과는, 항체 양성 세포 중의 시누클레인 피브릴 양성 세포 비율/항체 음성 세포 중의 시누클레인 피브릴 양성 세포 비율(P/N)에 의해 구했다.
도 2에 나타나는 바와 같이, 태그 첨부의 scFv-E6을 도입한 세포에서는, 인산화 시누클레인이 소실되었다. 또한, P/N은, 도 3에 나타나는 바와 같았다. 도 3에 나타나는 바와 같이, Tag4-8을 부가한 scFv-E6도, Tag18-1을 부가한 scFv-E6도, 시누클레인 양성 세포율을 크게 저하시켰다.
실시예 8: 세포내 항체의 안정화에 의한 작용 강화(CFTR를 기능 회복시키는 항체의 작용의 증강 효과)
낭포성 섬유증 막 컨덕턴스 제어 인자(CFTR; UniProtKB/Swiss-Prot: P13569.3)은, 전신의 상피 막 세포에 발현하는 음이온 채널이며, 그의 이상은 낭포성 섬유증을 초래한다. CFTR의 F508 결손 변이(CFTRΔF508)는, CFTR의 가장 일반적인 변이라고 알려지고, 3개의 뉴클레오타이드의 결실에 의해 508번째의 페닐알라닌이 결실되어 있다. 그 결과, CFTRΔF508은, 정상적으로 폴딩되지 않고, 응집체를 형성하는 강한 경향을 나타내, 막 상에의 이행량이 야생형보다도 적다고 여겨지고 있다. scFv-C2(서열 번호 1035: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMRLGLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRGDVPPTFGQGTKVEIKAAA)는, CFTR의 NBD1 도메인에 결합하여, NBD1의 응집체 형성을 억제할 수 있다(Lovato et al., Protein Engineering, Design and Selection, 20(12): 607∼614, 2007). CFTRΔF508의 막에의 이행량을 증대시키는 효과를 발휘한다. 본 실시예에서는, scFv-C2에 대해서 태그(Tag18-1)를 부가하여 HeLa 세포 내에서의 NBD1 도메인의 변이체 ΔF508의 응집을 억제할 수 있는지를 평가했다. HeLa 세포에 이들 단백질을 발현하는 플라스미드 벡터를 Lipo3000(상표)에 의해 도입했다. 항체는, myc 태그가 부여되어, 토끼 항myc 태그 항체로 검출되고, NBD1은, His 태그가 부여되어, 마우스 항His 태그 항체로 검출되었다. 마우스 항His 태그 항체는, Alexa 633 표지 항마우스 IgG 항체에 의해 검출되고, 토끼 항myc 태그 항체는, Alexa 488 표지 항토끼 IgG 항체에 의해 검출되었다. 형광 염색된 세포를 키엔스 BZ-X800으로 관찰했다.
우선, HeLa 세포 중에서 scFv-C2의 응집률은 82%였다. 이에 반해서 N말단에 Tag18-1을 갖는 scFv-C2의 응집률은 31%이며, N말단과 C말단에 Tag18-1을 갖는 scFv-C2의 응집률은 4.6%였다(도 3A 및 도 3B 참조). 야생형 NBD1 도메인의 응집률은, scFv-C2 발현 세포 내에서 74%이며, NBD1의ΔF508 변이체의 응집률은, scFv-C2 발현 세포 내에서 85%인데 반해, N말단과 C말단에 각각 Tag18-1을 갖는 scFv-C2 발현 세포 내에서는, 야생형 NBD1 도메인의 응집률은 32%이고, NBD1의 ΔF508 변이체의 응집률 43%였다. 이것으로부터, scFv-C2에 태그를 부가하는 것에 의해, scFv-C2 자체의 응집 형성을 억제하고, 이것에 의해, NBD1에 의한 응집체 형성을 억제할 수 있었다. NBD1의 응집의 억제는, NBD1의 세포막 발현량의 향상에 기여한다고 예상된다.
실시예 9: 기존 태그에 대한 아미노산 치환의 효과
상기 실시예로부터 본 개시의 펩타이드 태그가 가져야 할 조건을 지향하는 아미노산 치환, 특히, P 또는 N으로의 아미노산 치환이, 태그의 응집률 저하 작용을 증대시킴을 분명히 했다. 본 실시예에서는, PEST 서열의 일부의 아미노산을 N으로 치환하여, 치환 전후의 태그를 각각 갖는 scFv(Y14-259)의 응집률을 조사했다.
Figure pct00027
각각 세포 내에 발현시켜, 실시예 1과 마찬가지로 scFv의 응집률을 평가한 바, 치환 전의 태그를 갖는 scFv의 응집률은 50.3%였지만, 이것에 반해서, 치환 후의 태그를 가지는 scFv의 응집률은 18.0%였다. 이와 같이, 본 개시의 펩타이드 태그가 가져야 할 조건을 지향하는 아미노산 치환, 특히, P 또는 N으로의 아미노산 치환은, 태그의 단백질 응집 억제 효과를 높이는 것이 됨이 분명해졌다.
이상과 같이, 세포 내에서는 항체를 포함하는 다양한 단백질은 응집을 형성하고, 이것에 의해 그 기능을 부분적으로 또는 전체적으로 해칠 수 있다. 응집체 형성을 억제하는 단백질 태그는, 이들 단백질의 응집 형성을 억제하고, 이것에 의해, 단백질에 본래 발휘해야 할 작용을 발휘시킬 수 있다. 산성 아미노산 비율이 상대적으로 낮은 태그는, 산성 아미노산 비율이 높은 태그가 이용되기 어려운 장면에서 유익할 수 있다.

Claims (17)

  1. 펩타이드로서,
    (a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
    (b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이며,
    상기 펩타이드를 연결한 단백질의 세포 내에 있어서의 응집성을 저하시킬 수 있는,
    펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (c) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 보다 바람직하게는 15% 이하, 더 바람직하게는 10% 이하가, M, T, W, C, I, V, 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산인, 펩타이드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    (d) A 또는 G가 각각, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만인, 펩타이드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
    (b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 30% 이상 70% 미만이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
    (c) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이하가, M, T, W, C, I, V, 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
    (d) A 또는 G가 각각, 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 10% 미만인,
    펩타이드.
  5. 서열 번호 2∼11 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드를 코딩하는 핵산.
  7. 제어 서열과 작동 가능하게 연결된 제 6 항에 기재된 핵산과, 당해 핵산과 인프레임으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 단백질 발현 벡터.
  8. 제 7 항에 있어서,
    목적 단백질이, 항체 또는 항체의 항원 결합성 단편인, 단백질 발현 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서,
    항체의 항원 결합성 단편이, 단쇄 Fv(scFv)인, 단백질 발현 벡터.
  10. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드와 목적 단백질의 융합 단백질.
  11. 제 10 항에 있어서,
    목적 단백질이, 항체 또는 항체의 항원 결합성 단편인, 융합 단백질.
  12. 제 11 항에 있어서,
    항체의 항원 결합성 단편이, 단쇄 Fv(scFv)인, 융합 단백질.
  13. 제어 서열과 작동 가능하게 연결된 제 6 항에 기재된 핵산과, 당해 핵산과 인프레임으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 단백질 산생 세포.
  14. 아미노산 서열을 선택 또는 동정하는 방법으로서,
    (a) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 5% 이상 45% 미만이 산성 아미노산이고,
    (b) 아미노산 서열을 구성하는 아미노산의 20% 이상이, F, P, Y, G, S, Q, N, 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산인,
    아미노산 서열을 취득하는 것과,
    선택 또는 동정된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 태그와 참조 단백질의 융합 단백질을 포유동물 세포 내(바람직하게는 인간 세포 내)에 있어서 발현시켰을 때에, 세포 내에 있어서 융합 단백질이 응집체를 형성하는 세포의 비율을 저하시키거나, 또는 소정의 값 이하로 하는 펩타이드 태그의 아미노산 서열을 선택 또는 동정하는 것과,
    당해 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 태그 또는 당해 펩타이드 태그를 코딩하는 핵산을 얻는 것
    을 포함하는,
    방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    취득되는 아미노산 서열이, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 펩타이드인, 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    취득되는 아미노산 서열이, 인간 게놈의 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 군인, 방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    취득되는 아미노산 서열이, 네오안티젠을 포함하는, 방법.
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