KR20240035822A - Methods for controlling the degree of galactosylation of proteins in mammalian production cells - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포유동물 생산 세포에서 적어도 하나의 miRNA의 수준을 조절함으로써 재조합적으로 발현된 관심 단백질의 글리코실화 정도를 조절하는 것에 관한 것이다.The present invention relates to controlling the degree of glycosylation of a recombinantly expressed protein of interest by controlling the level of at least one miRNA in mammalian production cells.
Description
본 발명은 포유동물 생산 세포(producer cell)에서 적어도 하나의 miRNA의 수준을 조절함으로써 재조합적으로 발현된 관심 단백질의 글리코실화 정도를 조절하는 것에 관한 것이다.The present invention relates to controlling the degree of glycosylation of a recombinantly expressed protein of interest by controlling the level of at least one miRNA in a mammalian producer cell.
1987년 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현된 최초의 단백질인 재조합 인간 플라스미노겐 활성제가 승인된 이후 포유동물 생산 세포의 생산성을 10 g/L 이상으로 높이기 위해 세포주 개발, 배지 최적화 및 배양 기술과 관련된 생명공학 생산이 엄청나게 향상되었다. 오늘날 세포주 개발의 주요 초점은 생산성의 추가 증가를 달성하는 것에 국한되지 않고 원하는 번역 후 변형을 갖는 재조합적으로 생산된 관심 단백질을 얻는 것과 같은 제품 품질에도 있다. 포유동물 세포가 복잡한 단백질을 적절하게 접는 능력, 다량체 단백질 및 단백질 복합체를 정확하게 조립하는 능력, 특히 번역 후 표적 단백질을 변형하는 능력은 원핵생물 발현 시스템의 사용에 비해 주요 이점으로 간주된다. 펩티드와 단백질의 전형적인 번역 후 변형은 하이드록실화, 글리코실화, 포스포릴화, 아세틸화, 지질화 및 이황화 결합 형성을 포함한다. 재조합 단백질의 글리코실화는 특히 재조합 단백질이 인간 대상체에게 투여되도록 예정된 경우 매우 중요하다. 이는 인간 단백질의 50% 이상이 글리코실화된다는 사실에 비추어 볼 때 특히 분명해진다(Walsh et al., Post-translational modications in the context of therapeutic proteins. Nat. Biotechnol., 2006, 24, 1241-1252). 가장 빈번하게 발생하는 두 가지 유형의 글리코실화는 N-연결 및 O-연결 글리코실화이다. N-연결 글리코실화는 글리칸과 아스파라긴(Asn) 잔기의 아미드 기 사이에 공유 결합의 형성을 특징으로 한다. O-연결된 글리코실화 단백질에서 글리칸은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기의 하이드록실기에 연결된다. 글리코실화의 유형과 정도는 생물학적 활성, 기능, 순환계로부터의 제거 및 결정적으로 면역원성에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.Since the approval of recombinant human plasminogen activator, the first protein expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells, in 1987, cell line development, media optimization, and culture technology have been developed to increase the productivity of mammalian production cells above 10 g/L. Related biotechnology production has improved tremendously. The main focus of cell line development today is not limited to achieving further increases in productivity, but also on product quality, such as obtaining recombinantly produced proteins of interest with desired post-translational modifications. The ability of mammalian cells to properly fold complex proteins, to accurately assemble multimeric proteins and protein complexes, and especially to modify target proteins post-translationally, is considered a major advantage over the use of prokaryotic expression systems. Typical post-translational modifications of peptides and proteins include hydroxylation, glycosylation, phosphorylation, acetylation, lipidation, and disulfide bond formation. Glycosylation of recombinant proteins is very important, especially if the recombinant protein is intended to be administered to human subjects. This becomes especially clear in light of the fact that more than 50% of human proteins are glycosylated (Walsh et al., Post-translational modications in the context of therapeutic proteins. Nat. Biotechnol., 2006, 24, 1241-1252). The two most frequently occurring types of glycosylation are N-linked and O-linked glycosylation. N-linked glycosylation is characterized by the formation of a covalent bond between the glycan and the amide group of an asparagine (Asn) residue. In O-linked glycosylated proteins, the glycan is linked to the hydroxyl group of a serine (Ser) or threonine (Thr) residue. The type and degree of glycosylation are known to have a significant impact on biological activity, function, clearance from the circulation and, crucially, immunogenicity.
바이오시밀러의 생명공학적 생산을 위한 세포주의 개발 과정에서, 품질 매개변수가 오리지널 제품(originator)의 품질 매개변수와 일치하는 것이 중요하다. 이는 예를 들어 항체의 재조합 생산과 관련된다(도 1 참조). 단클론 항체는 항체의 Fc 부분에 있는 L-아스파라긴 잔기에서 자연적으로 글리코실화된다. 글리칸 구조는 무엇보다도 말단 갈락토실화(G1; G1'; G2)에 의해 정의된다(도 2 참조). 따라서 특히 면역원성 및 세포독성과 관련하여, 오리지널 제품의 글리칸 프로필과 최대한 일치하는 재조합으로 생산된 바이오시밀러의 갈락토실화 정도를 얻는 것이 바람직하다. 오리지널 제품이 재조합으로 생산된 바이오시밀러보다 갈락토실화 정도가 더 높은 경우, 배양 배지에 갈락토오스를 첨가하면 바이오시밀러의 갈락토실화 정도를 높일 수 있다. 그러나 반대의 경우, 즉 바이오시밀러가 오리지널 제품보다 더 높은 갈락토실화 정도를 보이는 경우, 현재로서는 갈락토실화 정도를 줄일 수 있는 가능성은 없다.During the development of cell lines for biotechnological production of biosimilars, it is important that the quality parameters match those of the originator. This concerns, for example, the recombinant production of antibodies (see Figure 1). Monoclonal antibodies are naturally glycosylated at the L-asparagine residue in the F c portion of the antibody. The glycan structure is defined, among other things, by terminal galactosylation (G1; G1'; G2) (see Figure 2). Therefore, it is desirable to obtain a degree of galactosylation of the recombinantly produced biosimilar that matches as closely as possible the glycan profile of the original product, especially with regard to immunogenicity and cytotoxicity. If the original product has a higher degree of galactosylation than the recombinantly produced biosimilar, the degree of galactosylation of the biosimilar can be increased by adding galactose to the culture medium. However, in the opposite case, that is, if the biosimilar shows a higher degree of galactosylation than the original product, there is currently no possibility to reduce the degree of galactosylation.
따라서, 재조합적으로 생산된 표적 단백질의 번역 후 글리코실화 정도를 조절하는 방법, 특히 포유동물 세포에서 글리코-조작된 재조합 표적 단백질을 생산하는 방법이 절실히 필요하다.Therefore, there is an urgent need for methods to control the degree of post-translational glycosylation of recombinantly produced target proteins, especially methods for producing glyco-engineered recombinant target proteins in mammalian cells.
본 발명의 근본적인 문제는 독립항의 대상에 의해, 특히 포유동물 생산 세포에서 포유동물에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 조절함으로써 해결된다.The fundamental problem of the present invention is solved by the subject matter of the independent claim, in particular by regulating the level of at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by a mammal in mammalian production cells.
본 발명은 특히 다음 단계를 포함하는 관심 단백질의 생산 방법에 관한 것이다:The invention relates in particular to a method for producing a protein of interest comprising the following steps:
a) 포유동물 생산 세포를 제공하는 단계,a) providing mammalian production cells,
b) 단계 a)에서 제공된 포유동물 생산 세포에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준을 조절하는 단계,b) regulating, in the mammalian production cell provided in step a), the level of at least one miRNA selected from the group of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cell,
c) 관심 단백질의 생산에 적합한 조건 하에서 단계 b)의 적어도 하나의 miRNA의 수준이 조절된 포유동물 생산 세포를 배양하여 원하는 정도의 갈락토실화를 갖는 관심 단백질을 얻는 단계.c) culturing the mammalian production cell in which the level of at least one miRNA of step b) has been regulated under conditions suitable for production of the protein of interest to obtain the protein of interest with the desired degree of galactosylation.
따라서, 본 발명에 따른 방법에서는 포유동물 생산 세포가 단계 a)에서 제공된다. 이어서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준이 조절되고, 특히 증가되거나 감소된다. 적어도 하나의 miRNA의 수준이 조절된, 특히 적어도 하나의 miRNA의 수준이 증가 또는 감소된 포유동물 생산 세포를 이후 관심 단백질의 생산에 적합한 조건 하에서 배양하여 원하는 정도의 갈락토실화를 갖는 관심 단백질을 얻는다. 따라서 이 방법은 유리하게는 특정 정도의 갈락토실화, 바람직하게는 말단 N-연결 글리칸 구조의 특정 정도의 갈락토실화를 갖는 관심 단백질의 재조합 생산을 허용한다. 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 수준을 적절하게 조절함으로써 적어도 하나의 miRNA 수준이 각각 조절되지 않은 포유동물 생산 세포로부터 얻은 관심 단백질의 말단 N-연결 글리칸 구조의 글리코실화 정도, 바람직하게는 갈락토실화 정도와 비교하여 관심 단백질에서 말단 N-연결 글리칸 구조의 글리코실화 정도, 바람직하게는 갈락토실화 정도를 변경, 즉 증가 또는 감소시키는 것이 가능하다. 이러한 방식으로, 예를 들어 재조합적으로 생산된 바이오시밀러의 갈락토실화 정도, 바람직하게는 말단 N-연결 글리칸 구조의 갈락토실화 정도를 자연 발생 오리지널 제품의 갈락토실화 정도, 바람직하게는 말단 N-연결 글리칸 구조의 갈락토실화 정도까지 조정하는 것이 가능하다. 이는 오리지널 제품의 것에 비할만한 갈락토실화 정도, 특히 말단 N-연결 글리칸 구조의 갈락토실화 정도를 갖는 바이오시밀러를 생산하는 클론을 식별하기 위해 분석해야 하는 클론의 수를 상당히 감소시키기 때문에 세포주 개발 과정에서 스크리닝 노력을 엄청나게 줄여준다. 따라서, 본 발명은 당업계에 공지된 방법보다 특정 정도의 갈락토실화를 갖는 관심 단백질을 생산하는 더 빠르고 더 경제적인 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명에 따른 방법은 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA 수준의 조절 없이는 포유동물 생산 세포에서 전혀 도달할 수 없는 상대적으로 낮은 갈락토실화 정도를 갖는 바이오시밀러와 같은 관심 단백질의 생산을 허용한다.Accordingly, in the method according to the invention mammalian producing cells are provided in step a). The level of at least one miRNA selected from the group of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cell is then regulated, in particular increased or decreased. Mammalian production cells in which the level of at least one miRNA has been regulated, particularly in which the level of at least one miRNA has been increased or decreased, are then cultured under conditions suitable for the production of the protein of interest to obtain the protein of interest with the desired degree of galactosylation. . This method therefore advantageously allows the recombinant production of proteins of interest with a certain degree of galactosylation, preferably of the terminal N-linked glycan structures. obtained from a mammalian production cell of interest in which the level of at least one miRNA is each dysregulated by appropriately regulating the level of at least one miRNA selected from the group of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cell. altering the degree of glycosylation, preferably the degree of galactosylation, of the terminal N-linked glycan structures in the protein of interest compared to the degree of glycosylation, preferably galactosylation, of the terminal N-linked glycan structures of the protein, i.e. It is possible to increase or decrease it. In this way, for example, the degree of galactosylation of a recombinantly produced biosimilar, preferably the degree of galactosylation of the terminal N-linked glycan structure, can be compared to the degree of galactosylation of the naturally occurring original product, preferably It is possible to adjust the degree of galactosylation of the terminal N-linked glycan structures. This significantly reduces the number of clones that need to be analyzed to identify clones that produce biosimilars with a degree of galactosylation comparable to that of the original product, particularly the degree of galactosylation of the terminal N-linked glycan structures. It drastically reduces screening efforts during the development process. Accordingly, the present invention provides a faster and more economical method of producing a protein of interest with a certain degree of galactosylation than methods known in the art. Moreover, the method according to the invention allows for relatively low galactosylation levels, which are completely unattainable in mammalian production cells without modulation of the level of at least one miRNA, which can alter the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cells. Allows production of the protein of interest as a biosimilar with a reduced degree of misfire.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 관심 단백질의 생산 방법은 단계 c)에서 생산된 관심 단백질을 회수하는 추가 단계 d)를 포함한다.In a preferred embodiment of the invention, the method for producing a protein of interest comprises an additional step d) of recovering the protein of interest produced in step c).
단계 d)에서 관심 단백질의 회수는 여러 성분을 포함하는 조성물, 예컨대 배양 배지로부터 단백질의 단리를 포함한다.Recovery of the protein of interest in step d) involves isolation of the protein from a composition comprising several components, such as a culture medium.
단계 c)에서 생산된 관심 단백질을 회수하는 단계는 바람직하게는 원심분리, 특히 차등 원심분리 및/또는 밀도 구배 원심분리, 크로마토그래피 방법, 특히 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 전기영동 방법, 여과 방법 및/또는 추출 방법으로부터 선택된 하나 이상의 단리 기술을 포함한다.The step of recovering the protein of interest produced in step c) is preferably centrifugation, in particular differential centrifugation and/or density gradient centrifugation, chromatographic methods, in particular gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography. and/or one or more isolation techniques selected from high performance liquid chromatography (HPLC), electrophoretic methods, filtration methods, and/or extraction methods.
특히 바람직하게는, 상기 단계 c)에서 생산된 관심 단백질을 회수하는 단계는 관심 단백질의 농축 및 정제 단계를 포함한다.Particularly preferably, the step of recovering the protein of interest produced in step c) includes the steps of concentrating and purifying the protein of interest.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단계 c)에서 생산된 관심 단백질을 회수하는 단계, 특히 관심 단백질의 농축 및 정제는 적어도 2가지 단리 기술, 바람직하게는 적어도 3가지 단리 기술을 포함한다.In a preferred embodiment of the invention, the step of recovering the protein of interest produced in step c), especially the concentration and purification of the protein of interest, comprises at least two isolation techniques, preferably at least three isolation techniques.
추가의 바람직한 실시양태에서, 단계 b)에서의 조절은 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA 수준의 증가 또는 감소이다.In a further preferred embodiment, the modulation in step b) is an increase or decrease in the level of at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cell.
바람직하게는, 단계 b)에서의 조절은 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA 수준의 증가이다.Preferably, the modulation in step b) is an increase in the level of at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cell.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 b)에서의 조절은 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA 수준의 감소이다.In another preferred embodiment of the invention, the modulation in step b) is a reduction in the level of at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cell.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단계 c)에서 얻은 관심 단백질은 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준 조절없이 포유동물 생산 세포에서 생산된 관심 단백질에 비해 감소된 갈락토실화 정도, 특히 말단 N-연결 갈락토실화 정도를 갖는다. 바람직하게는, 관심 단백질의 갈락토실화 정도, 특히 말단 N-연결 갈락토실화 정도는 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준 조절없이 포유동물 생산 세포에서 생산된 관심 단백질에 비해 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 6%, 바람직하게는 적어도 7%, 바람직하게는 적어도 8%, 바람직하게는 적어도 9%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30% 감소된다.In a preferred embodiment of the invention, the protein of interest obtained in step c) is produced by mammalian production cells without modulating the level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest. It has a reduced degree of galactosylation, especially terminal N-linked galactosylation, compared to the protein of interest produced in animal production cells. Preferably, the degree of galactosylation of the protein of interest, especially the degree of terminal N-linked galactosylation, is determined by at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by a mammalian production cell. at least 5%, preferably at least 6%, preferably at least 7%, preferably at least 8%, preferably at least 9%, compared to the protein of interest produced in mammalian production cells without modulating the level of the miRNA. is reduced by at least 10%, preferably by at least 15%, preferably by at least 20%, preferably by at least 25%, preferably by at least 30%.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 c)에서 얻은 관심 단백질은 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준 조절없이 포유동물 생산 세포에서 생산된 관심 단백질에 비해 증가된 갈락토실화 정도, 특히 말단 N-연결 갈락토실화 정도를 갖는다. 바람직하게는, 관심 단백질의 갈락토실화 정도, 특히 말단 N-연결 갈락토실화 정도는 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준 조절없이 포유동물 생산 세포에서 생산된 관심 단백질에 비해 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 6%, 바람직하게는 적어도 7%, 바람직하게는 적어도 8%, 바람직하게는 적어도 9%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30% 증가한다.In another preferred embodiment of the invention, the protein of interest obtained in step c) modulates the level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by a mammalian production cell. It has an increased degree of galactosylation, particularly terminal N-linked galactosylation, compared to the protein of interest produced in mammalian production cells without it. Preferably, the degree of galactosylation of the protein of interest, especially the degree of terminal N-linked galactosylation, is determined by at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by a mammalian production cell. at least 5%, preferably at least 6%, preferably at least 7%, preferably at least 8%, preferably at least 9%, compared to the protein of interest produced in mammalian production cells without modulating the level of the miRNA. is increased by at least 10%, preferably by at least 15%, preferably by at least 20%, preferably by at least 25%, preferably by at least 30%.
특히 바람직하게는, 단계 b)에서의 조절은 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA 수준의 증가이고, 바람직하게는 단계 c)에서 얻은 관심 단백질의 갈락토실화 정도, 특히 말단 N-연결 갈락토실화 정도는 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준 조절없이 포유동물 생산 세포에서 생산된 관심 단백질에 비해 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 6%, 바람직하게는 적어도 7%, 바람직하게는 적어도 8%, 바람직하게는 적어도 9%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30% 감소된다.Particularly preferably, the modulation in step b) is an increase in the level of at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cell, preferably the protein of interest obtained in step c). The degree of galactosylation, particularly the degree of terminal N-linked galactosylation, can be determined without modulating the level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of a protein of interest produced by a mammalian production cell. at least 5%, preferably at least 6%, preferably at least 7%, preferably at least 8%, preferably at least 9%, preferably at least 10%, relative to the protein of interest produced in animal production cells. Preferably it is reduced by at least 15%, preferably by at least 20%, preferably by at least 25%, preferably by at least 30%.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 b)에서의 조절은 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA 수준의 증가이며, 바람직하게는 단계 c)에서 얻은 관심 단백질의 갈락토실화 정도, 특히 말단 N-연결 갈락토실화 정도는 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준 조절없이 포유동물 생산 세포에서 생산된 관심 단백질에 비해 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 6%, 바람직하게는 적어도 7%, 바람직하게는 적어도 8%, 바람직하게는 적어도 9%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30% 증가한다.In another preferred embodiment of the invention, the modulation in step b) is an increase in the level of at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cell, preferably in step c ), the degree of galactosylation of the protein of interest, particularly the degree of terminal N-linked galactosylation, obtained from at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by a mammalian production cell. at least 5%, preferably at least 6%, preferably at least 7%, preferably at least 8%, preferably at least 9%, compared to the protein of interest produced in mammalian production cells without level adjustment. It increases by at least 10%, preferably by at least 15%, preferably by at least 20%, preferably by at least 25%, preferably by at least 30%.
바람직한 실시양태에서, 단계 b)에서의 조절은 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA 수준의 감소이고, 바람직하게는 단계 c)에서 얻은 관심 단백질의 갈락토실화 정도, 특히 말단 N-연결 갈락토실화 정도는 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준 조절없이 포유동물 생산 세포에서 생산된 관심 단백질에 비해 바람직하게는 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 6%, 바람직하게는 적어도 7%, 바람직하게는 적어도 8%, 바람직하게는 적어도 9%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30% 감소된다.In a preferred embodiment, the modulation in step b) is a reduction in the level of at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cell, preferably the protein of interest obtained in step c). The degree of galactosylation, particularly the degree of terminal N-linked galactosylation, can be determined without modulating the level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of a protein of interest produced by a mammalian production cell. Preferably at least 5%, preferably at least 6%, preferably at least 7%, preferably at least 8%, preferably at least 9%, preferably at least 10% compared to the protein of interest produced in animal production cells. %, preferably at least 15%, preferably at least 20%, preferably at least 25%, preferably at least 30%.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 단계 b)에서의 조절은 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA 수준의 감소이고, 바람직하게는 단계 c)에서 얻은 관심 단백질의 갈락토실화 정도, 특히 말단 N-연결 갈락토실화 정도는 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준 조절없이 포유동물 생산 세포에서 생산된 관심 단백질에 비해 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 6%, 바람직하게는 적어도 7%, 바람직하게는 적어도 8%, 바람직하게는 적어도 9%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30% 증가한다.In a particularly preferred embodiment of the invention, the modulation in step b) is a reduction in the level of at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cell, preferably in step c) The degree of galactosylation, particularly the degree of terminal N-linked galactosylation, of the protein of interest obtained from at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by a mammalian production cell. at least 5%, preferably at least 6%, preferably at least 7%, preferably at least 8%, preferably at least 9%, preferably at least compared to the protein of interest produced in mammalian production cells without level adjustment. 10%, preferably at least 15%, preferably at least 20%, preferably at least 25%, preferably at least 30%.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 관심 단백질, 특히 단계 c)에서 얻은 원하는 갈락토실화 정도를 갖는 관심 단백질은 항체 또는 이의 단편이다.In a preferred embodiment of the invention, the protein of interest, especially the protein of interest with the desired degree of galactosylation obtained in step c), is an antibody or fragment thereof.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 갈락토실화 정도는 말단 갈락토실화 정도, 특히 말단 N-연결 갈락토실화 정도 또는 말단 O-연결 갈락토실화 정도, 바람직하게는 말단 N-연결 갈락토실화 정도이다.In a further preferred embodiment of the invention, the degree of galactosylation is the degree of terminal galactosylation, especially the degree of terminal N-linked galactosylation or the degree of terminal O-linked galactosylation, preferably terminal N-linked galactosylation. That's about it.
본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는, 관심 단백질을 발현할 수 있는 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포(protein production engineered mammalian producer cell)의 제조 방법에 관한 것이다:The present invention also relates to a method for preparing a protein production engineered mammalian producer cell capable of expressing a protein of interest, comprising the following steps:
x) 포유동물 생산 세포를 제공하는 단계,x) providing mammalian production cells,
y) 단계 x)에서 제공된 포유동물 생산 세포에서 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준을 조절하여 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포를 얻는 단계,y) manipulating protein production in the mammalian production cell provided in step x) by modulating the level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by the mammalian production cell. obtaining production cells,
z) 단계 y)에서 생산된 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포를 회수하는 단계.z) recovering the protein producing engineered mammalian production cells produced in step y).
관심 단백질을 발현할 수 있는 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포의 제조 방법에 의해, 변경된 갈락토실화 정도, 특히 증가되거나 감소된 갈락토실화 정도를 갖는 관심 단백질을 생산하도록 조작된 포유동물 생산 세포가 획득된다. 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포는 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 조절된 수준을 갖는 것을 특징으로 한다. 적어도 하나의 miRNA의 수준이 조절됨으로써, 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포는 유리하게는 적어도 miRNA의 수준 조절 없이 얻어지는 갈락토실화 정도와 다른 갈락토실화 정도를 갖는 관심 단백질을 제공한다.Method for producing a protein production engineered mammalian production cell capable of expressing a protein of interest, thereby obtaining a mammalian production cell engineered to produce a protein of interest having an altered degree of galactosylation, in particular an increased or decreased degree of galactosylation. do. The mammalian production cell engineered for protein production produced by the method according to the invention exhibits regulated levels of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of proteins produced by the mammalian production cell. It is characterized by having. By modulating the level of at least one miRNA, the mammalian production cell engineered for protein production advantageously provides the protein of interest with a degree of galactosylation that is different from the degree of galactosylation that would be obtained without modulating the level of at least one miRNA.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단계 y)에서 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 수준의 조절은 적어도 하나의 miRNA의 수준이 조절되지 않은 포유동물 생산 세포에서의 적어도 하나의 miRNA 수준과 비교하여 적어도 하나의 miRNA의 수준의 증가, 특히 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3배, 바람직하게는 적어도 4배, 바람직하게는 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 6배, 바람직하게는 적어도 7배, 바람직하게는 적어도 8배, 바람직하게는 적어도 9배, 바람직하게는 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 15배, 바람직하게는 적어도 20배, 바람직하게는 적어도 25배 증가이다.In a preferred embodiment of the invention, in step y) the modulation of the level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell is achieved by controlling the level of at least one miRNA. An increase in the level of at least one miRNA compared to the level of the at least one miRNA in a mammalian production cell in which the level is not regulated, especially at least 2-fold, preferably at least 3-fold, preferably at least 4-fold, preferably at least 5 times, preferably at least 6 times, preferably at least 7 times, preferably at least 8 times, preferably at least 9 times, preferably at least 10 times, preferably at least 15 times, preferably at least A 20-fold, preferably at least 25-fold increase.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 y)에서 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 수준의 조절은 적어도 하나의 miRNA의 수준이 조절되지 않은 포유동물 생산 세포에서의 적어도 하나의 miRNA 수준과 비교하여 적어도 하나의 miRNA의 수준의 감소, 특히 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3배, 바람직하게는 적어도 4배, 바람직하게는 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 6배, 바람직하게는 적어도 7배, 바람직하게는 적어도 8배, 바람직하게는 적어도 9배, 바람직하게는 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 15배, 바람직하게는 적어도 20배, 바람직하게는 적어도 25배 감소이다.In another preferred embodiment of the invention, in step y) the regulation of the level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein produced by the mammalian production cell is carried out by at least one A reduction in the level of at least one miRNA compared to the level of at least one miRNA in a mammalian production cell in which the level of the miRNA is dysregulated, especially at least 2-fold, preferably at least 3-fold, preferably at least 4-fold, preferably Preferably at least 5 times, preferably at least 6 times, preferably at least 7 times, preferably at least 8 times, preferably at least 9 times, preferably at least 10 times, preferably at least 15 times, preferably is reduced by at least 20 times, preferably by at least 25 times.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법의 단계 b) 또는 y)에서 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 2개의 miRNA, 바람직하게는 적어도 3개의 miRNA, 바람직하게는 적어도 4개의 miRNA의 수준이 조절되며, 바람직하게는 감소되고, 바람직하게는 증가된다.In a particularly preferred embodiment of the invention, at least 2, preferably at least 3, miRNAs are capable of altering the degree of galactosylation of the protein produced by the mammalian production cell in step b) or y) of the method according to the invention. The level of the canine miRNA, preferably at least four miRNAs, is regulated, preferably decreased, preferably increased.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA, 바람직하게는 적어도 2개의 miRNA, 바람직하게는 적어도 3개의 miRNA의 수준이 증가되고, 본 발명에 따른 방법의 단계 b) 또는 y)에서 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA, 바람직하게는 적어도 2개의 miRNA, 바람직하게는 적어도 3개의 miRNA의 수준이 감소된다.In another preferred embodiment, the level of at least one miRNA, preferably at least two miRNAs, preferably at least three miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein produced by the mammalian production cell is increased and , at least one miRNA, preferably at least 2 miRNAs, preferably at least 3, capable of altering the degree of galactosylation of the protein produced by the mammalian production cell in step b) or y) of the method according to the invention. Levels of canine miRNAs are reduced.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, miRNA는 성숙 miRNA, 전구체 miRNA 또는 1차 miRNA이다. 바람직하게는, miRNA는 합성 분자, 특히 합성 전구체 miRNA이다.In a particularly preferred embodiment of the invention, the miRNA is a mature miRNA, a precursor miRNA or a primary miRNA. Preferably, the miRNA is a synthetic molecule, especially a synthetic precursor miRNA.
바람직하게는, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA이다.Preferably, the at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell is from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. These are the selected miRNAs.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열 번호 1로 이루어진다.In a particularly preferred embodiment of the invention, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and preferably consists of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 특히 이로 이루어진다.In a further preferred embodiment of the invention, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell has a nucleotide sequence that is at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 85% identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. comprises a nucleotide sequence having at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, preferably at least 99% sequence identity, especially This is achieved.
바람직하게는, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열 번호 2로 이루어진다.Preferably, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and preferably consists of SEQ ID NO: 2.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 특히 이로 이루어진다.In another preferred embodiment of the invention, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell has a nucleotide sequence that is at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 85% identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. comprising a nucleotide sequence having at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, preferably at least 99% sequence identity, and in particular It comes true.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열 번호 3으로 이루어진다. 바람직하게는, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 miR-30c 또는 이의 동족체이다.In a further preferred embodiment of the invention, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO:3, and preferably consists of SEQ ID NO:3. Preferably, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of proteins produced by mammalian production cells is miR-30c or a homolog thereof.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 특히 이로 이루어진다.In a preferred embodiment of the invention, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell has a nucleotide sequence that is at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. It comprises and especially consists of a nucleotide sequence having 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, preferably at least 99% sequence identity. .
바람직하게는, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열 번호 4로 이루어진다. 바람직하게는, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 miR-30e 또는 이의 동족체이다.Preferably, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and preferably consists of SEQ ID NO: 4. Preferably, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of proteins produced by mammalian production cells is miR-30e or a homolog thereof.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 특히 이로 이루어진다.In a particularly preferred embodiment of the invention, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell is at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 80%, preferably at least 85%, identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO:4. comprising a nucleotide sequence having at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, preferably at least 99% sequence identity, and in particular It comes true.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 서열 번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열 번호 5로 이루어진다. 바람직하게는, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 miR-16 또는 이의 동족체이다.In another preferred embodiment of the present invention, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, and preferably consists of SEQ ID NO: 5. Preferably, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of proteins produced by mammalian production cells is miR-16 or a homolog thereof.
바람직하게는, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA는 서열 번호 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 특히 이로 이루어진다.Preferably, the miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell has a nucleotide sequence of at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 90%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 90% apart from the nucleotide sequence of SEQ ID NO:5. Preferably it comprises and especially consists of a nucleotide sequence having at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, preferably at least 99% sequence identity.
바람직하게는, 적어도 하나의 miRNA의 수준은 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 글리코실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 트랜스제닉(transgenic) 뉴클레오티드 서열로 포유동물 생산 세포를 형질감염시킴으로써(transfecting) 조절된다.Preferably, the level of the at least one miRNA is determined by the mammalian production cell with at least one transgenic nucleotide sequence encoding at least one miRNA that is capable of altering the degree of glycosylation of the protein produced by the mammalian production cell. It is controlled by transfecting.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 miRNA의 수준은 단계 b) 또는 y)에서 포유동물 생산 세포를 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 글리코실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA로 형질감염시킴으로써 조절된다.In a preferred embodiment of the invention, the level of at least one miRNA is increased by transfecting the mammalian production cell in step b) or y) with at least one miRNA capable of altering the degree of glycosylation of the protein produced by the mammalian production cell. Controlled by infection.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 miRNA의 수준은 단계 b) 또는 y)에서 포유동물 생산 세포를 적어도 하나의 miRNA의 과발현을 허용하는 적어도 하나의 조절 요소의 제어 하에 적어도 하나의 miRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 적어도 하나의 벡터로 형질감염시킴으로써 조절되며, 여기서 적어도 하나의 miRNA는 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있다.In another preferred embodiment of the invention, the level of the at least one miRNA is controlled in step b) or y) by the mammalian producing cell under the control of at least one regulatory element that allows overexpression of the at least one miRNA. wherein the at least one miRNA is capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell.
본 발명의 특정 실시양태에서, 적어도 miRNA의 과발현을 허용하는 적어도 하나의 조절 요소의 제어 하에 적어도 하나의 miRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 적어도 하나의 벡터는 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염되고, 바람직하게는 일시적으로 형질감염되고, 바람직하게는 안정적으로 형질감염된다.In certain embodiments of the invention, at least one vector containing a nucleotide sequence encoding at least one miRNA is transiently or stably transfected, preferably under the control of at least one regulatory element allowing overexpression of the miRNA. Preferably it is transiently transfected, preferably it is stably transfected.
포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 글리코실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA, 적어도 하나의 miRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 트랜스제닉 뉴클레오티드 서열, 특히 적어도 하나의 miRNA의 과발현을 허용하는 적어도 하나의 조절 요소의 제어 하에 적어도 하나의 miRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 관심 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 포유동물 생산 세포를 형질감염시키는 것은 리포좀 기반 방법, 전기천공법을 사용한 형질감염 또는 인산칼슘 매개 형질감염과 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 형질감염 방법으로 매개될 수 있다.at least one miRNA capable of altering the degree of glycosylation of a protein produced by a mammalian production cell, at least one transgenic nucleotide sequence encoding at least one miRNA, in particular at least one allowing overexpression of the at least one miRNA Transfection of mammalian production cells with a nucleotide sequence encoding at least one miRNA and/or a nucleotide sequence encoding a protein of interest under the control of regulatory elements can be achieved by liposome-based methods, transfection using electroporation, or calcium phosphate-mediated transfection. Transfection may be mediated by any suitable transfection method known in the art, such as infection.
바람직하게는, 적어도 하나의 miRNA의 과발현을 허용하는 조절 요소는 프로모터이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 miRNA의 과발현을 허용하는 조절 요소는 유도성 프로모터이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 miRNA의 과발현을 허용하는 조절 요소는 온도 유도성 프로모터이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 miRNA의 과발현을 허용하는 조절 요소는 구성적 프로모터이다.Preferably, the regulatory element allowing overexpression of at least one miRNA is a promoter. In a preferred embodiment of the invention, the regulatory element allowing overexpression of at least one miRNA is an inducible promoter. In a particularly preferred embodiment, the regulatory element allowing overexpression of at least one miRNA is a temperature inducible promoter. In another preferred embodiment of the invention, the regulatory element allowing overexpression of at least one miRNA is a constitutive promoter.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포는 단계 a) 또는 x) 이전에 또는 단계 b) 또는 y) 동안 관심 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질감염된다. 바람직하게는, 포유동물 생산 세포는 단계 a) 또는 x) 이전에 관심 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질감염된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포는 단계 b) 또는 y) 동안 관심 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질감염된다. 특히 바람직하게는, 포유동물 생산 세포, 특히 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포는 단계 b) 또는 y) 후에 관심 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질감염된다.In a preferred embodiment of the invention, the mammalian production cell is transfected with a nucleotide sequence encoding the protein of interest before step a) or x) or during step b) or y). Preferably, the mammalian production cell is transfected with a nucleotide sequence encoding the protein of interest prior to step a) or x). In another preferred embodiment, the mammalian production cell is transfected during step b) or y) with a nucleotide sequence encoding the protein of interest. Particularly preferably, mammalian production cells, in particular mammalian production cells engineered for protein production, are transfected after step b) or y) with a nucleotide sequence encoding the protein of interest.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포는 CHO 세포, BHK 세포 또는 HEK293 세포이다. 특히 바람직하게는 포유동물 생산 세포는 CHO 세포이다. 바람직하게는, CHO-세포는 CHO-DUXB11 세포, CHO-DG44 세포 및 CHO-K1 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.In a preferred embodiment of the invention, the mammalian producing cells are CHO cells, BHK cells or HEK293 cells. Particularly preferably the mammalian producing cells are CHO cells. Preferably, the CHO-cells are selected from the group consisting of CHO-DUXB11 cells, CHO-DG44 cells and CHO-K1 cells.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포는 증가된 비생산율(specific production rate) 또는 생존 세포 농도의 증가된 시간 적분 또는 둘 다를 나타내는 세포이다. 바람직하게는, 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포는 증가된 비생산율을 나타내는 세포이다. 바람직하게는, 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포는 생존 세포 농도의 증가된 시간 적분을 나타내는 세포이다. 특히 바람직하게는, 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포는 증가된 비생산율 및 생존 세포 농도의 증가된 시간 적분을 나타내는 세포이다.In a further preferred embodiment of the invention, the mammalian production cells engineered for protein production are cells that exhibit an increased specific production rate or an increased time integral of viable cell concentration or both. Preferably, the mammalian production cells engineered for protein production are cells that exhibit an increased specific production rate. Preferably, the mammalian production cells engineered for protein production are cells that exhibit increased time integration of viable cell concentration. Particularly preferably, the mammalian production cells engineered for protein production are cells that exhibit an increased specific production rate and an increased time integral of viable cell concentration.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 관심 단백질의 생산 방법에 의해 얻을 수 있는, 바람직하게는 얻은 단백질에 관한 것이다.The invention also relates to a protein obtainable, preferably obtained, by the method for producing the protein of interest according to the invention.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 관심 단백질의 생산 방법에 의해 얻을 수 있는, 바람직하게는 얻은 단백질은 포유동물 생산 세포에서 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA 수준의 조절 없이 획득된 관심 단백질의 갈락토실화 정도, 바람직하게는 말단 N-연결 갈락토실화 정도와 다른 갈락토실화 정도, 바람직하게는 말단 N-연결 갈락토실화를 가진다.According to the present invention, the protein obtainable by the method for producing a protein of interest according to the present invention, preferably the obtained protein, has a level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation in mammalian production cells. A degree of galactosylation, preferably a terminal N-linked galactosylation, that is different from the degree of galactosylation of the protein of interest, preferably a terminal N-linked galactosylation, obtained without adjustment of .
본 발명은 또한 본 발명에 따른 관심 단백질을 발현할 수 있는 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는, 바람직하게는 얻은 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포에 관한 것이다.The present invention also relates to protein production engineered mammalian production cells obtainable by the method for producing protein production engineered mammalian production cells capable of expressing the protein of interest according to the invention, preferably obtained.
본 발명은 추가로 적어도 하나의 miRNA를 인코딩하는 적어도 하나의 트랜스제닉 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포에 관한 것으로, 상기 트랜스제닉 뉴클레오티드 서열은 상기 적어도 하나의 miRNA의 과발현을 허용하는 적어도 하나의 조절 요소의 제어 하에 해당 세포의 게놈에 일시적으로 또는 안정적으로 통합되고, 여기서 적어도 하나의 miRNA는 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있다.The invention further relates to a mammalian production cell engineered for protein production comprising at least one transgenic nucleotide sequence encoding at least one miRNA, wherein the transgenic nucleotide sequence allows for overexpression of at least one miRNA. Temporarily or stably integrated into the genome of a given cell under the control of a regulatory element, where at least one miRNA is capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell.
본 발명에 따른 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포는 유리하게는 포유동물 생산 세포에서 갈락토실화의 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 수준의 조절 없이 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도, 바람직하게는 말단 N-연결 갈락토실화의 정도와 다른 갈락토실화 정도, 바람직하게는 말단 N-연결 갈락토실화 정도를 갖는 관심 단백질의 생산을 허용한다.The mammalian production cell engineered for protein production according to the invention advantageously is engineered for protein production without modulating the level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation in the mammalian production cell. Production of a protein of interest having a degree of galactosylation, preferably a degree of terminal N-linked galactosylation, that is different from the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the cell, preferably the degree of terminal N-linked galactosylation. Allowed.
본 발명은 또한 적어도 하나의 포유동물 생산 세포, 적어도 하나의 miRNA의 과발현을 허용하는 적어도 하나의 조절 요소의 제어 하에 적어도 하나의 miRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 적어도 하나의 벡터 및 적어도 하나의 벡터로 적어도 하나의 세포를 형질감염시키기 위한 수단을 포함하는, 포유동물 생산 세포에서 관심 단백질을 생산하기 위한 키트를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 miRNA는 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있다.The invention also provides at least one mammalian production cell, at least one vector containing a nucleotide sequence encoding at least one miRNA under the control of at least one regulatory element allowing overexpression of the at least one miRNA, and at least one vector A kit for producing a protein of interest in a mammalian production cell, comprising means for transfecting at least one cell with a kit, wherein the at least one miRNA undergoes galactosylation of the protein produced by the mammalian production cell. The degree can be changed.
본 발명은 또한 적어도 하나의 완충 용액, 적어도 하나의 RNAse 억제제, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA, 및 적어도 하나의 miRNA로 포유동물 생산 세포를 형질감염시키기 위한 수단을 포함하는, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화, 특히 말단 갈락토실화, 바람직하게는 말단 N-연결 갈락토실화의 정도를 조절하기 위한 키트에 관한 것이다.The invention also provides a method for producing a mammalian production cell with at least one buffer solution, at least one RNAse inhibitor, at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by the mammalian production cell, and at least one miRNA. It relates to a kit for controlling the degree of galactosylation, particularly terminal galactosylation, preferably terminal N-linked galactosylation, of a protein produced by a mammalian production cell, comprising means for transfection.
바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 특히 이로 이루어진 miRNA 분자이다.In a preferred embodiment, the at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5. and at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, preferably A miRNA molecule comprising, and in particular consisting of, a nucleotide sequence with at least 99% sequence homology.
특히 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA 분자이다.In a particularly preferred embodiment, the at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell consists of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. It is a miRNA molecule selected from the group.
바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA는 동결건조된다. 바람직하게는, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA는 가용화되고, 특히 완충 용액에 용해된다.In a preferred embodiment, at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell is lyophilized. Preferably, at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell is solubilized, especially dissolved in a buffered solution.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 적어도 하나의 miRNA의 과발현을 허용하는 적어도 하나의 조절 요소의 제어 하에 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 적어도 하나의 벡터 및 포유동물 생산 세포를 적어도 하나의 벡터로 형질감염시키기 위한 수단을 포함하는, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화, 특히 말단 갈락토실화, 바람직하게는 말단 N-연결 갈락토실화의 정도를 조절하기 위한 키트에 관한 것이다.In another aspect, the invention also provides at least one miRNA encoding at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell under the control of at least one regulatory element allowing overexpression of the at least one miRNA. galactosylation, especially terminal galactosylation, of a protein produced by a mammalian production cell, comprising at least one vector containing a nucleotide sequence and means for transfecting the mammalian production cell with the at least one vector; Preferably it relates to a kit for controlling the degree of terminal N-linked galactosylation.
바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 특히 이로 이루어진 miRNA 분자이다.In a preferred embodiment, the at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5. and at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, preferably A miRNA molecule comprising, or especially consisting of, a nucleotide sequence with at least 99% sequence identity.
특히 바람직한 실시양태에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 적어도 하나의 miRNA는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA 분자이다.In a particularly preferred embodiment, the at least one miRNA capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell consists of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. It is a miRNA molecule selected from the group.
본 발명은 또한 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 특히 이로 이루어진 miRNA 분자, 바람직하게는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 따른 서열을 포함하는 miRNA 분자, 특히 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 따른 서열로 이루어진 miRNA 분자이다.The present invention also provides a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably A miRNA molecule comprising or in particular consisting of a nucleotide sequence having at least 97%, preferably at least 98%, preferably at least 99% sequence identity, preferably a miRNA comprising a sequence according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 A molecule, in particular a miRNA molecule consisting of a sequence according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
본 발명은 또한 단백질의 갈락토실화, 특히 말단 갈락토실화, 바람직하게는 말단 N-연결 갈락토실화의 정도를 조절하기 위한 miRNA 분자의 용도, 특히 단백질의 갈락토실화, 특히 말단 갈락토실화, 바람직하게는 말단 N-연결 갈락토실화의 정도를 조절하기 위한, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 특히 이로 이루어진 miRNA 분자, 바람직하게는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA 분자의 용도에 관한 것이다.The invention also relates to the use of miRNA molecules for regulating the degree of galactosylation of proteins, in particular terminal galactosylation, preferably terminal N-linked galactosylation, in particular galactosylation of proteins, especially terminal galactosylation, preferably at least 80%, preferably at least 85%, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, to control the degree of terminal N-linked galactosylation. , preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, preferably at least 99% sequence identity. or, in particular, it relates to the use of a miRNA molecule consisting thereof, preferably a miRNA molecule selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 miRNA는 동결건조된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 miRNA는 가용화되고, 특히 완충 용액 중에 제공된다.In a particularly preferred embodiment of the invention, the at least one miRNA is lyophilized. In a further preferred embodiment, the at least one miRNA is solubilized and especially provided in a buffered solution.
본 발명의 맥락에서 사용된 표현 "갈락토실화 정도"는 갈락토실화의 정량적인 정도를 의미한다. 따라서, 관심 단백질의 "갈락토실화 정도의 증가"는 포유동물 생산 세포에서 생산되는 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준 조절 시 관심 단백질이 적어도 갈락토실화된다는 것을 의미할 수 있다. 이 표현은 또한 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준의 조절 시 관심 단백질의 글리칸 구조가 이러한 수준의 조절이 없을 때보다 그 글리칸 구조에 더 많은 갈락토스 단위를 포함한다는 것을 의미할 수 있다. 따라서, "갈락토실화 정도를 변경하는"이라는 표현은 본 발명의 맥락에서 관심 단백질을 발현하는 포유동물 생산 세포에서 적어도 하나의 miRNA의 조절이 일어나지 않은 상황에 대해 관심 단백질의 정량적인 갈락토실화 정도의 변화를 지칭하기 위해 사용된다.The expression “degree of galactosylation” used in the context of the present invention means the quantitative degree of galactosylation. Accordingly, an “increase in the degree of galactosylation” of a protein of interest means that upon modulating the level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced in a mammalian production cell, the protein of interest increases at least This may mean that it is galactosylated. This expression also means that upon modulation of the level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by a mammalian production cell, the glycan structure of the protein of interest will be free of this level of modulation. This may mean that the glycan structure contains more galactose units than before. Accordingly, the expression "altering the degree of galactosylation" in the context of the present invention refers to the quantitative degree of galactosylation of a protein of interest in the absence of regulation of at least one miRNA in a mammalian production cell expressing the protein of interest. It is used to refer to changes in .
본 발명의 맥락에서 표현 "적어도 하나의 miRNA의 수준을 조절하는" 및 이에 상응하는 문법 형태는 인공적으로 유발된, 특히 유도된 적어도 하나의 miRNA의 세포내 농도의 변화, 특히 적어도 하나의 miRNA의 세포내 농도의 증가 또는 감소를 기술한다. 조절은 예를 들어 포유동물 생산 세포에서 적어도 하나의 miRNA의 표적화된 상향 조절, 특히 적어도 하나의 miRNA의 과발현, 또는 적어도 하나의 miRNA의 표적화된 하향 조절일 수 있다. 적어도 하나의 miRNA의 표적 상향 조절 또는 하향 조절은 적어도 하나의 miRNA의 유도성 또는 구성적 과발현 또는 적어도 하나의 miRNA의 녹다운 또는 녹아웃에 의한 바와 같이 당업계의 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다.In the context of the present invention the expression "modulating the level of at least one miRNA" and the corresponding grammatical forms mean artificially induced, in particular induced, changes in the intracellular concentration of at least one miRNA, in particular the cellular Describes an increase or decrease in my concentration. The regulation may be, for example, targeted up-regulation of at least one miRNA, in particular overexpression of at least one miRNA, or targeted down-regulation of at least one miRNA, in a mammalian production cell. Targeted up-regulation or down-regulation of at least one miRNA can be accomplished by any suitable means in the art, such as by inducible or constitutive overexpression of at least one miRNA or knockdown or knockout of at least one miRNA.
본 발명에 있어서, "관심 단백질의 생산에 적합한 조건"이라는 표현은 표적 단백질의 발현을 유지, 유도 또는 향상시키는 온도, 압력, 시간, 빛, 배양 배지의 조성 및 유도인자/억제인자의 존재 또는 부재와 같은 조건을 의미한다. 각각의 단백질의 효율적인 발현을 달성하는데 필요한 특정 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 특히 발현 시스템으로 사용되는 포유동물 생산 세포 및 적합한 발현 카세트, 특히 이의 프로모터에 따라 달라진다.In the present invention, the expression "conditions suitable for the production of the protein of interest" refers to temperature, pressure, time, light, composition of the culture medium, and the presence or absence of inducers/inhibitors that maintain, induce or enhance the expression of the target protein. means the same conditions as The specific conditions necessary to achieve efficient expression of each protein are known to those skilled in the art and depend in particular on the mammalian production cell used as the expression system and the suitable expression cassette, especially its promoter.
본 발명의 맥락에서, 용어 "과발현"은 핵산 분자, 특히 miRNA 및/또는 관심 단백질을 인코딩하는 유전자의 증가된 양의 인공 발현을 지칭한다. 여기에는 유도성 프로모터을 사용하여 조절될 수 있는 핵산 분자, 특히 miRNA 및/또는 관심 단백질을 인코딩하는 유전자의 유도성 과발현 및 구성적 프로모터를 사용한 핵산 분자, 특히 miRNA 및/또는 관심 단백질을 인코딩하는 유전자의 지속적인 과발현이 포함된다.In the context of the present invention, the term “overexpression” refers to the artificial expression of increased amounts of nucleic acid molecules, especially miRNAs and/or genes encoding proteins of interest. This includes inducible overexpression of a nucleic acid molecule, particularly a miRNA and/or a gene encoding a protein of interest, that can be regulated using an inducible promoter, and inducible overexpression of a nucleic acid molecule, especially a miRNA and/or a gene encoding a protein of interest, using a constitutive promoter. Sustained overexpression is involved.
"하향 조절"이라는 용어는 핵산 분자, 특히 miRNA 및/또는 관심 단백질을 인코딩하는 유전자 수준의 인공적 감소를 지칭한다.The term “downregulation” refers to an artificial reduction in the level of nucleic acid molecules, especially miRNAs and/or genes encoding proteins of interest.
본 발명의 맥락에서, 용어 "a"는 "하나" 또는 "하나 이상"의 의미를 포함하도록 의도된다.In the context of the present invention, the term “a” is intended to include the meaning of “one” or “one or more”.
본 발명의 맥락에서, 용어 "포함하는"은 바람직하게는 "함유하는" 또는 "포함한"의 의미를 가지며, 이는 추가 요소의 존재를 배제하지 않고 구체적으로 식별된 요소를 포함하는 것을 의미한다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 용어 "포함하는"은 또한 "본질적으로 이루어진", 및 추가의 바람직한 실시양태에서는 "이루어진"의 의미를 갖는 것으로 이해된다.In the context of the present invention, the term "comprising" preferably has the meaning of "containing" or "comprising", which means including the specifically identified elements without excluding the presence of further elements. However, in a preferred embodiment the term “comprising” is also understood to have the meaning “consisting essentially of”, and in a further preferred embodiment “consisting of”.
본원에서 "및/또는"이라는 용어는 목록 내에서 연결된 개별 요소의 임의의 조합을 표현하기 위해 사용되었다. 단지 설명의 목적으로, 표현 "A, B 및/또는 C"는 A 단독, B 단독, C 단독, (A 및 B), (B 및 C), (A 및 C) 및 (A, B 및 C)를 의미할 수 있다.The term “and/or” is used herein to express any combination of individual elements linked within a list. For purposes of illustration only, the expression “A, B and/or C” refers to A alone, B alone, C alone, (A and B), (B and C), (A and C), and (A, B and C) ) can mean.
본 발명의 추가의 바람직한 실시예는 종속항의 대상이다.Further preferred embodiments of the invention are the subject of the dependent claims.
본 발명은 다음의 도면과 실시예를 통해 추가로 설명된다.The invention is further explained through the following drawings and examples.
도 1은 다양한 치료 항체(오리지널 제품)와 그의 바이오시밀러의 갈락토실화를 비교한 것이다.
도 2는 단클론 항체의 말단 N-연결 글리칸의 다양한 글리코실화 패턴을 나타낸다.
도 3은 miRNA 모방체(서열 번호 1 내지 5 및 그들 각각의 안티센스 가닥)가 miRNA 모방체로 일시적 형질감염 후 아달리무맙을 발현하는 CHO DG44 세포의 생산성 및 갈락토실화 정도에 미치는 효과를 나타낸다. 항-IgG miR은 기술적 대조군으로 형질감염되었다. 음성 대조군, 항-IgG miR의 경우 n = 3, 기타 모든 miRNA의 경우 n = 2, 통계 분석을 위해 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p< 0.0001로 일원 분산 분석을 수행하였고, 오차는 표준 편차를 나타낸다.Figure 1 compares galactosylation of various therapeutic antibodies (original product) and its biosimilar.
Figure 2 shows various glycosylation patterns of terminal N-linked glycans of monoclonal antibodies.
Figure 3 is The effects of miRNA mimics (SEQ ID NOs: 1 to 5 and their respective antisense strands) on the productivity and degree of galactosylation of CHO DG44 cells expressing adalimumab after transient transfection with the miRNA mimics are shown. Anti-IgG miR was transfected as a technical control. Negative control, n = 3 for anti-IgG miR, n = 2 for all other miRNAs, for statistical analysis * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < One-way analysis of variance was performed with 0.0001, and errors represent standard deviation.
실시예:Examples:
일시적 miRNA 모방 형질감염 시 갈락토실화 감소Reduced galactosylation upon transient miRNA mimic transfection.
생산성 및 N-글리코실화에 대한 miRNA 매개 효과를 평가하기 위해, 5개의 서로 다른 miRNA의 모방체(각각의 안티센스 가닥을 포함하는 서열 번호 1 내지 5)를 아달리무맙 생산 CHO DG44 세포에 100 nM 농도로 일시적으로 형질감염시켰다. 5개의 miRNA 모방체를 사용한 형질감염은 CHO DG44 세포의 생산성을 유의하게 감소시키지 않았지만 갈락토실화 정도를 유의하게 감소시킨 것을 관찰할 수 있었다(도 3 참조).To evaluate miRNA-mediated effects on productivity and N-glycosylation, mimics of five different miRNAs (SEQ ID NOs. 1 to 5, including the respective antisense strand) were incubated at a concentration of 100 nM in adalimumab-producing CHO DG44 cells. were transiently transfected. Transfection using five miRNA mimics did not significantly reduce the productivity of CHO DG44 cells, but it was observed that the degree of galactosylation was significantly reduced (see Figure 3).
서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 miRNA 모방체를 사용한 CHO DG44 세포의 형질감염은 말단 갈락토스 글리칸을 갖는 재조합적으로 생산된 아달리무맙의 부분을 40%(음성 대조군)에서 37%로 감소시켰다. 서열 번호 2 또는 서열 번호 5의 miRNA 모방체를 사용한 CHO DG44 세포의 형질감염은 말단 갈락토스 글리칸을 갖는 재조합적으로 생산된 아달리무맙 부분을 40%(음성 대조군)에서 36%로 감소시켰다.Transfection of CHO DG44 cells with the miRNA mimics of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4 reduced the fraction of recombinantly produced adalimumab with terminal galactose glycans from 40% (negative control) to 37%. reduced to . Transfection of CHO DG44 cells with the miRNA mimic of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 reduced the recombinantly produced adalimumab portion with terminal galactose glycans from 40% (negative control) to 36%.
번호number
갈락토실화galactosylation
%)%)
형질감염 후 After transfection
갈락토실화 (%)Galactosylation (%)
변화change
(%)(%)
Claims (23)
a) 포유동물 생산 세포(mammalian producer cell)를 제공하는 단계,
b) 단계 a)에서 제공된 포유동물 생산 세포에서, 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준을 조절하는 단계,
c) 관심 단백질의 생산에 적합한 조건 하에서 단계 b)의 적어도 하나의 miRNA의 수준이 조절된 포유동물 생산 세포를 배양하여 원하는 정도의 갈락토실화를 갖는 관심 단백질을 얻는 단계.Method for producing a protein of interest comprising the following steps:
a) providing mammalian producer cells,
b) regulating, in the mammalian production cell provided in step a), the level of at least one miRNA selected from the group of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of the protein of interest produced by the mammalian production cell,
c) culturing the mammalian production cell in which the level of at least one miRNA of step b) has been regulated under conditions suitable for production of the protein of interest to obtain the protein of interest with the desired degree of galactosylation.
x) 포유동물 생산 세포를 제공하는 단계,
y) 단계 x)에서 제공된 포유동물 생산 세포에서 포유동물 생산 세포에 의해 생산된 단백질의 갈락토실화 정도를 변경할 수 있는 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준을 조절하여 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포를 얻는 단계,
z) 단계 y)에서 생산된 단백질 생산 조작화 포유동물 생산 세포를 회수하는 단계.Method for preparing a protein production engineered mammalian producer cell capable of expressing a protein of interest comprising the following process steps:
x) providing mammalian production cells,
y) manipulating protein production in the mammalian production cell provided in step x) by modulating the level of at least one miRNA selected from the group consisting of miRNAs capable of altering the degree of galactosylation of a protein produced by the mammalian production cell. obtaining production cells,
z) recovering the protein producing engineered mammalian production cells produced in step y).
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