KR20240034233A - 일차 NK 세포에서의 발현을 위한 키메라 항원 수용체 mRNA 분자의 생성 - Google Patents

일차 NK 세포에서의 발현을 위한 키메라 항원 수용체 mRNA 분자의 생성 Download PDF

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KR20240034233A
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Abstract

본 발명은 신규한 키메라 항원(CAR) mRNA 분자, 이 분자를 생성하는 방법 및 이 분자를 사용하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

일차 NK 세포에서의 발현을 위한 키메라 항원 수용체 mRNA 분자의 생성
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 7월 21일자로 출원된 미국 가출원 제63/224,100호에 대한 35 U.S.C. §119(e) 하에서의 우선권의 이득을 주장한다. 미국 가출원 제63/224,100호의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록에 대한 언급
본 출원은 EFS-Web에 의해 텍스트 파일로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 파일명이 "8774-19-PCT"인 XML 파일은 바이트 크기가 154000바이트이고 2021년 7월 11일자로 기록되었다. 상기 XML 파일에 포함된 정보는 37 CFR § 1.52(e)(5)에 따라 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
배경기술
자연 살해(NK로 약칭) 세포는 선천성 면역계의 핵심 매개자이다. NK 세포는 사전 감작 또는 HLA 매칭을 필요로 하지 않고서 비정상 세포(예컨대 암세포 또는 바이러스 감염 세포)를 신속하게 발견하고 파괴할 수 있다. 암을 치료하기 위해 면역 세포(NK 세포 포함)를 사용하는 것은 최근 몇 년간 새로운 추세이다. 이 새로운 치료법은 전통적인 수술, 화학요법 및 방사선요법에 대해 난치성인 종양 치료에 유망할 것으로 예상된다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 세포외 수용체 영역이 세포내 신호전달 영역에 융합된 것으로 구성된 조작된 단백질이다. 일반적으로 이러한 영역들은 서로 다른 단백질로부터 유래되지만, 이들은 또한 드노보(de novo)로 설계될 수 있다. CAR 발현 T 세포는 단쇄 가변 단편(scFV)이 세포내 신호전달 도메인, 일반적으로 CD3의 제타 사슬(CD3ζ)에 융합된 것을 활용하였다. 추가 개발에는 T 세포 활성화를 향상시키기 위해 CD28 및 CD137과 같은 이차 공동자극 신호가 포함되었다. CAR 구축물은 또한 NK 세포에 적용되었으며, 가장 특히는 CD19+ B 세포 종양의 치료를 위한 NK-92 CD19-CAR 발현의 사용에서 적용되었는데, 상기 종양은 T 세포 CD19-CAR로도 치료받았다.
본 발명자들은 많은 CAR 분자가 NK 세포주에서 발현될 수 있지만 일차 NK 세포에서는 DNA 또는 RNA로 발현될 수 없음을 알아냈다. 대부분의 CAR 기술은 DNA 분자를 세포 내로 전달하기 위해 바이러스 벡터를 사용한다. 바이러스 DNA는 핵으로 들어가고 숙주 게놈에 통합될 수 있으며, 이때 전사 활성 부위를 선호한다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 NK 세포에서의 CAR RNA 분자의 고발현을 위한 특정 도메인과 안정화 요소의 신규한 조합을 결정하였다.
T7 프로모터, 스페이서 서열, 신호 펩티드, 항원 결합 도메인, 힌지 영역, 막관통(TM) 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본원에 개시되며; 여기서, 신호 펩티드는 분화 클러스터 64(CD64) 및/또는 IgG 중쇄 가변 유전자(IgGHv) 신호 펩티드를 포함하고; 항원 결합 도메인은 분화 클러스터 19(CD19), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7 상동체 4(B7H4), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV) 스파이크 및 분화 클러스터 30 알파(CD30α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합한다.
일 양태에서, 신호 펩티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2를 포함한다.
일 양태에서, CD19에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 4에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함한다.
또 다른 양태에서, BCMA에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함한다.
또 다른 양태에서, B7H4에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 7에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함한다.
일 양태에서, SARS-CoV-2 스파이크에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 8에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함한다.
일 양태에서, CD30α 스파이크에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 57에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함한다.
일 양태에서, 힌지 영역은 서열 번호 9를 갖는 분화 클러스터 28(CD28) 힌지 영역이다.
일 양태에서, TM 도메인은 서열 번호 10을 갖는 CD28 TM 도메인이다.
일 양태에서, 공동자극 도메인은 서열 번호 11을 갖는 CD28 사이토졸 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호 12를 갖는 분화 클러스터 3 제타(CD3ζ) 사이토졸 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, CAR은 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22 및 서열 번호 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 개시된 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 핵산 구축물이 또한 본원에 개시되며, 여기서, CAR의 항원 결합 도메인은 분화 클러스터 19(CD19), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7 상동체 4(B7H4), SARS-CoV-2 스파이크 및 CD30α로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합한다. 일 양태에서, 핵산 구축물은 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31 서열 번호 32 및 서열 번호 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
본원에 개시된 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 발현 벡터가 또한 본원에 개시되며, 여기서, CAR의 항원 결합 도메인은 B 세포 성숙 항원(BCMA), B7 상동체 4(B7H4), SARS-CoV-2 스파이크 및 CD30α로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합한다. 일 양태에서, 발현 벡터는 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
T7 프로모터, 스페이서 서열, 신호 펩티드 서열 부분, 항원 결합 도메인 서열 부분, 힌지 영역 서열 부분, 막관통(TM) 도메인 서열 부분 및 세포내 도메인 서열 부분의 하나 이상의 핵산을 포함하는 RNA 분자로 변형된 일차 자연 살해(NK) 세포가 본원에 추가로 개시되며; 여기서, 신호 펩티드 서열은 분화 클러스터 64(CD64) 및/또는 IgG 중쇄 가변 유전자(IgGHv)를 코딩하는 서열을 포함하고; 항원 결합 도메인은 분화 클러스터 19(CD19), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7 상동체 4(B7H4), SARS-CoV-2 스파이크 및 분화 클러스터 30 알파(CD30α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합하는 항원 결합 부분을 코딩하는 서열을 포함하고; 핵산 서열들은 단일 폴리뉴클레오티드로서 서로 작동가능하게 연결되어 있다.
변형된 일차 NK 세포의 일 양태에서, 세포내 도메인 서열 부분은 서열 번호 11을 갖는 CD28 사이토졸 도메인 및/또는 서열 번호 12를 갖는 분화 클러스터 3 제타(CD3ζ) 사이토졸 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 변형된 일차 NK 세포는 3'-UTR을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 변형된 일차 NK 세포는 폴리-A 서열 부분을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 재조합 핵산 구축물로 일차 NK 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 변형된 일차 CAR-NK 세포를 생성하는 방법이 또한 본원에 개시된다.
암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 면역요법 방법이 또한 본원에 개시되며, 이 방법은 대상체에게 본원에 개시된 바와 같은 유전자 변형 NK 세포를 포함하는 제약 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 암은 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성(과립구) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성 적혈구 증가증(polycythemia vera), 림프종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨병, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄 질환, 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는 고형 종양: 육종 및 암종, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프혈관육종, 림프혈관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선암종, 피지선암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암(hepatoma), 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모 세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모 세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모 세포종 및 망막모 세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
암 치료에 사용하기 위한, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 NK 세포가 또한 본원에 개시된다. 일 양태에서, 암은 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성(과립구) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성 적혈구 증가증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨병, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는 고형 종양: 육종 및 암종, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프혈관육종, 림프혈관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선암종, 피지선암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모 세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모 세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모 세포종 및 망막모 세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
의약으로 사용하기 위한 본원에 개시된 변형된 NK 세포가 또한 본원에 개시된다.
본원에 개시된 바와 같은 유전자 변형 NK 세포 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물이 본원에 추가로 개시된다.
도 1은 ACE2 CAR 분자를 생성하기 위한 구축물(pNKW97)의 개략도이다. ACE2 단백질의 세포외 도메인은 150 bp 길이의 폴리A 테일 및 CD64 신호 펩티드를 포함하는 CAR 분자를 생성하는 데 사용되었다. 서열 번호 3을 갖는 스페이서 서열이 이 구축물에 사용되었다.
도 2a, 도 2b, 도 2c 및 도 2d는 사이토카인 풍부화된 자연 살해(CENK) 세포에서의 NKW97-150A(XL53-ACE2-세포외 도메인)의 발현을 보여준다. CENK 세포를 전기천공법을 사용하여 pNKW97 RNA로 형질감염시켰다. 하룻밤 회복한 후 유세포 분석법 및 콘쥬게이션된 ACE2 항체를 사용하여 ACE2 발현을 검출하였다. ACE2 항체의 특이성을 확인하기 위해 이소타입 대조군을 사용하였다. 도시된 바와 같이, 이 구축물에 대해 발현 및 세포 생존성 둘 모두 매우 우수하다.
도 3은 pNKW97의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 4는 B7H4 항원을 표적화하는 CAR 분자를 생성하기 위한 2개의 구축물(pNKW92~93)의 개략도이다. 신호 펩티드(CD64 또는 IgGHv)가 다양한 모노-펩티드 B7H4 CAR의 2가지 버전이 설계되었다. 서열 번호 3을 갖는 스페이서 서열이 pNKW92 구축물에 사용되었고; 서열 번호 60을 갖는 스페이서 서열이 pNKW93 구축물에 사용되었다.
도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 도 5e 및 도 5f는 CENK 세포에서의 CD64 또는 IgGHv B7H4 VH-VL 105A(NKW92, NKW93) CAR 분자의 발현을 보여준다. CENK 세포를 pNKW92 또는 pNKW93 mRNA를 사용하여 전기천공하였다. 24시간 후, B7H4 CAR 발현은 플로우(flow) 및 비오티닐화 B7H4, 이어서 스트렙타비딘-APC를 사용하여 검출되었다. 두 구축물 모두 B7H4 CAR의 우수한 발현을 보여준다.
도 6은 pNKW92의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 7은 pNKW93의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 8a 및 도 8b는 BCMA 항원을 표적화하는 CAR 분자를 생성하기 위한 4가지 구축물(pNKW88~91)의 개략도이다. 신호 펩티드(CD64 또는 IgGHv)와 가변 중쇄 및 경쇄의 순서가 다양한 모노-펩티드 BCMA CAR의 4가지 버전이 설계되었다. 서열 번호 3을 갖는 스페이서 서열이 pNKW89 및 pNKW91 구축물에 사용되었고; 서열 번호 60을 갖는 스페이서 서열이 pNKW88 및 pNKW90 구축물에 사용되었다.
도 9a, 도 9b, 도 9c, 도 9d 및 도 9e는 CENK 세포에서의 BCMA CAR mRNA의 발현을 보여준다. 신호 펩티드(CD64 또는 IgGHv)와 가변 중쇄 및 경쇄의 순서가 다양한 모노-시스트로닉 BCMA CAR의 4가지 버전이 설계되었다. CENK 세포를 각 구축물로부터의 mRNA를 사용하여 전기천공하였다. CAR BCMA 발현은 비오티닐화 BCMA, 이어서 APC-콘쥬게이션 스트렙타비딘 분자를 사용하여 전기천공 24시간 후에 검출되었다. 도시된 바와 같이, 4가지 구축물 모두 높은 수준의 BCMA CAR을 보여준다.
도 10은 SUP-B15 BCMA 표적 및 SUP-B15 모 세포에 대한 CD64-BCMA VL-VH 150A(NKW89) CAR-형질감염 CENK 세포의 세포독성을 보여준다. CENK 세포를 pNKW89로부터의 mRNA를 사용하여 전기천공하였다. 24시간 후 Calcein AM 분석을 사용하여 SUP-B15 BCMA 표적 및 대조 SUP-B15 모 세포에 대한 CENK 형질감염 세포의 세포독성을 테스트하였다. 도시된 바와 같이, NKW89-형질감염 세포는 SUP-B15 BCMA에 대해 특이적 세포독성 활성을 나타내며, 이때 SUP-B15 모 세포에 대해서는 활성이 없다. 비형질감염 대조 CENK 세포는 SUP-B15 BCMA 또는 모 세포에 대한 세포독성 활성을 나타내지 않는다.
도 11은 pNKW88의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 12는 pNKW89의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 13은 pNKW90의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 14는 pNKW91의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 15a, 도 15b 및 도 15c는 트리-펩티드 CD19 CAR mRNA를 이용한 PB-NK 세포의 전기천공의 결과를 보여준다. CD19 CAR을 안정적으로 발현하는 안정한 세포주를 CD19 CAR 검출을 위한 양성 대조군으로 사용하였다. GFP 및 PDL1 CAR mRNA 둘 모두 전기천공을 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 도시된 바와 같이, 트리-펩티드 CAR은 PB-NK 세포에서 전기천공 후 RNA 분자로 발현되지 않을 수 있다.
도 16a, 도 16b, 도 16c 및 도 16d는 트리-펩티드 CD19 CAR mRNA를 사용하여 전기천공된 줄기 기억 T 세포(Tscm 세포)의 결과를 보여준다. Tscm 세포를 3가지 다른 전기천공 프로토콜(E1~E3(전기 펄스 증가))을 사용하여 트리-펩티드 CD19 CAR mRNA를 사용하여 전기천공하였다. 도시된 바와 같이, 트리-펩티드 CAR은 전기천공 후 RNA 분자로서 기억 T 세포 내로 발현되지 않을 수 있다.
도 17은 CD19 항원을 표적화하는 CAR 분자를 생성하기 위한 2가지의 구축물(pNKW87~59)의 개략도이다. CD19 CAR mRNA 분자의 일차 NK 세포(본원에서 PB-NK 세포로도 지칭됨) 및 줄기 기억 T 세포(Tscm 세포) 내로의 발현을 개선하기 위해 CD64 또는 IgGHv 신호 펩티드를 포함하는 모노-펩티드 CD19 구축물을 설계하였다. mRNA 안정성을 향상시키기 위해 150개 뉴클레오티드 길이의 폴리 A 테일을 각 분자의 말단에 부가하였다. 서열 번호 3을 갖는 스페이서 서열이 이들 구축물에 사용되었다.
도 18a, 도 18b, 도 18c, 도 18d, 도 18e 및 도 18f는 PB-NK 세포에서의 CD19 CAR 분자의 발현을 보여준다. 일차 NK 세포에서 CD19 CAR mRNA 분자의 발현을 향상시키기 위해 CD64(pNKW87) 또는 IgGHv(pNKW59) 신호 펩티드를 포함하는 모노-펩티드 CD19 구축물을 설계하였다. 주형 DNA는 PB-NK 세포의 전기천공에 사용되는 시험관 내 전사 mRNA 분자를 생성하는 데 사용되었다. 도시된 바와 같이, 두 구축물 모두 전기천공한지 24시간 후에 94%를 넘는 CD19 CAR 발현을 나타낸다.
도 19a~도 19b는 mRNA 전기천공 후 CD-19-양성, SUP-B15 모 표적 세포주에 대한 CD19 CAR 형질감염 PB-NK 세포의 세포독성 활성을 보여준다. CD19 CAR 형질감염 PB-NK 세포의 세포독성 활성은 CD19 양성(SUP-B15 모 세포주) 및 CD19 음성(SUP-B15 변이체) 세포주를 사용하여 전기천공한지 24시간 후에 결정되었다. 도시된 바와 같이, CD64(pNKW87) 또는 IgGHv(pNKW59) 신호 펩티드를 포함하는 두 구축물 모두 CD19-양성 세포주에 대한 특이적 세포독성을 나타낸다.
도 20a~도 20b는 mRNA 형질감염 후 기억(PB-NK CIML) 및 대조(PB-NK) 세포에서의 CD19 CAR 분자의 세포독성 활성을 보여준다. CD19 CAR 형질감염된 기억(PB-NK CIML) 또는 대조(PB-NK) 세포의 세포독성 활성은 CD19 양성(SUP-B15 모 세포주) 및 CD19 음성(SUP-B15 변이체) 세포주를 사용하여 전기천공한지 24시간 후에 결정되었다. 도시된 바와 같이, CD19-CAR 형질감염된 PB-NK CIML 세포는 CD19-CAR 형질감염된 대조 PB-NK 세포에 비견되는 세포독성 활성을 나타낸다. 이는 CIML 세포를 CD19 양성 종양 세포의 특이적 표적화 쪽으로 유도하는 것을 더욱 증강시킬 것이다.
도 21a, 도 21b, 도 21c, 도 21d 및 도 21e는 활성화된 T 세포를 CD19 CAR 구축물로 전기천공한지 24~72시간 후 CD19 CAR 발현을 모니터링한 결과를 보여준다. 일차 림프구에서 CD19 CAR mRNA 분자의 발현을 향상시키기 위해, CD64(pNKW87 - 도 21b 및 도 21c) 또는 IgGH(pNKW59 - 도 21d 및 도 21e) 신호 펩티드를 포함하는 모노-펩티드 CD19 구축물을 설계하였다. 주형 DNA는 일차 세포의 전기천공에 추가로 사용되는 시험관 내 전사 mRNA 분자의 주형으로서의 역할을 하였다.
도 22a, 도 22b, 도 22c, 도 22d 및 도 22e는 CD19 CAR 구축물을 사용하여 Tscm 세포를 전기천공한지 24~72시간 후 CD19 발현을 모니터링한 결과를 보여준다. 기억 T 세포에서의 CD19 CAR mRNA 분자의 발현을 향상시키기 위해, CD64(pNKW87 - 도 22b 및 도 22c) 또는 IgGHv(pNKW59 - 도 22d 및 도 22e) 신호 펩티드를 포함하는 모노-시스트로닉 CD19 구축물을 설계하였다. 주형 DNA는 Tscm 세포의 전기천공에 추가로 사용되는 시험관 내 전사 mRNA 분자의 주형으로서의 역할을 하였다. 도시된 바와 같이, 두 구축물 모두 전기천공 후 72시간 후에도 높은 수준의 CD19 CAR 발현을 나타낸다.
도 23은 pNKW59의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 24는 pNKW87의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 25는 CD30 알파(CD30α) 항원을 표적화하는 CAR 분자를 생성하기 위한 구축물(pNKW95)의 개략도이다. CD64 신호 펩티드와 150 bp 길이의 폴리A 테일을 포함하는 모노-시스트로닉 CD30α CAR을 설계하였다. 서열 번호 3을 갖는 스페이서 서열이 구축물에 사용되었다.
도 26a, 도 26b, 도 26c, 도 26d, 도 26e 및 도 26f는 CENK 세포에서의 알파-CD30 CD64-VL-VH CAR(NKW95-150A)의 발현을 보여준다. CENK 세포를 전기천공법을 사용하여 pXL46(짧은 폴리 A) 또는 pNKW95 RNA(150A)로 형질감염시켰다. 하룻밤 회복한 후, CD30α CAR 발현을 유세포 분석법 및 비오티닐화된 CD30, 이어서 스트렙타비딘-APC를 사용하여 검출하였다. pNKW95 구축물은 모 pXL46에 비해 더 많은 발현을 보여준다.
도 27은 pNKW95의 플라스미드 지도를 보여준다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 일반적으로, 화학, 분자 생물학, 세포 및 암 생물학, 면역학, 미생물학, 약리학, 및 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 이의 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것들이다.
본 출원에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 공개된 특허 출원은 본원에 참고로 구체적으로 포함된다. 상충되는 경우, 특정한 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.
본원에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 일차 NK 세포에서의 키메라 항원 mRNA 분자의 고발현을 위한 특정 도메인과 안정화 요소의 신규한 조합을 결정하였다. 구체적으로, 본원에 개시된 바와 같이, 신규 조합은 적어도 하나의 공동자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하고 신호 펩티드, 항원 결합 도메인, 힌지, 막관통(TM)을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 또한 CAR은 NK 세포에서 시험관 내 전사 RNA의 최적 발현을 위해 3' 비번역 영역(UTR)에 변형이 있다. 본 발명자들에 의한 초기 결과는 NK 세포주에서 쉽게 발현된 많은 CAR 분자가 시험관 내 전사 및 전기천공 후 일차 NK 세포 내로의 최소 발현 또는 무발현을 나타냄을 보여주었다. 대부분의 CAR 기술은 DNA 분자를 세포 내로 전달하기 위해 바이러스 벡터를 사용한다. 바이러스 DNA는 핵으로 들어가고 숙주 게놈에 통합될 수 있으며, 이때 전사 활성 부위를 선호한다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 게놈에 통합되지 않는 mRNA 분자를 사용하여 바이러스 유전자 전달의 발암 가능성과 관련된 위험을 피하는 대안적인 접근법을 활용하였다. 안전성 외에도, (DNA와 비교하여) 본원에 개시된 바와 같은 CAR mRNA 분자의 사용의 또 다른 장점으로는 mRNA가 사이토졸 내로 진입 시 빠르게 번역되기 때문에 발생하는 더 빠른 반응이 있다. mRNA의 하나의 단점은 이것이 쉽게 분해된다는 점이지만, 본 발명자들은 각 CAR 분자의 5' 말단에 안정화 요소를 도입함으로써 본원에 개시된 mRNA 구축물의 반감기를 연장시켜 이러한 단점을 해결하였다. 추가로, 본원에 제공된 도면 및 실시예에서 입증된 바와 같이, 발명자들은 또한 기억 NK 및 T 세포에서 CAR mRNA의 성공적인 발현을 보여주었다.
본원에 기술된 CAR 분자는 CD19, BCMA 및 CD30을 포함하지만 이에 한정되지 않는 암 표면 마커뿐만 아니라 B7H4를 포함하지만 이에 한정되지 않는 체크포인트 억제제 또는 이의 리간드도 표적화한다. DNA 주형 벡터는 암 환자에서의 면역요법을 목적으로 본원에 개시된 일차 NK 세포에 전달되는 mRNA 분자의 시험관 내 합성을 위한 주형으로서의 역할을 한다. 시험관 내 전사는 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라아제를 사용하여 T7 프로모터와 같은 프로모터에서 개시될 수 있다. T7 프로모터는 스페이서 서열(서열 번호 3 또는 서열 번호 60)의 상류에 있으며, 이는 번역 개시에 필요한 코작(Kozak) 서열(서열 번호 45)을 포함한다. CD64 또는 IgGHv 단백질로부터의 짧은 신호 펩티드(15개 아미노산)는 CAR 단백질의 N 말단을 표시한다. 신호 펩티드는 사이토졸로부터 소포체로 초기 폴리펩티드 사슬을 전달하는 사이토졸 내의 신호 인식 펩티드(SRP)에 의해 인식된다. CAR 결합 부위는 가변 경쇄 및 중쇄 도메인의 이종이량체이다. 상기 두 도메인은 20개 아미노산(aa)의 링커를 통해 서로 연결된다. 분자의 힌지와 TM 도메인은 CD28 단백질로부터 유래된다. 힌지 영역은 결합 도메인에 가동 범위 및 유연성을 제공하는 반면, TM 영역/도메인은 올바른 막 삽입을 허용한다. 세포내 도메인은 적어도 하나의 공동자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 공동자극 도메인은 CD28의 세포질 도메인을 포함하는 반면, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 도메인을 포함한다. 공동자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 형질감염된 세포의 세포독성 활성을 향상시키는 세포내 신호전달 경로에 관여한다. 본원에 개시된 구축물의 3' UTR은 무스 무스쿨루스(Mus Musculus) 헤모글로빈 알파 유전자의 3' UTR로부터의 94 bp 서열이며, 이어서 150 bp 폴리 A 스트레치가 RNA 분자에 안정성을 부여한다. 3' UTR 영역에 대한 대안이 CAR 구축물에 사용될 수 있다. 이것은 인간 베타 글로빈으로부터의 3' UTR 또는 NK 세포에서 고도로 발현되는 유전자로부터의 3' UTR을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. NK 세포에서 고도로 발현되는 유전자의 예는 NKp46, NKp30, NKp44와 같은 천연 세포독성 수용체(NCR); 또는 NKG2D 및 2B4와 같은 c-렉틴 유사 활성화 면역수용체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 3' UTR(및 그 대안)이 CAR 구축물에 도입될 수 있으며 mRNA CAR 분자의 안정성을 향상시킬 수 있다.
본원에 개시된 구축물은 특정 암 표면 마커, 체크포인트 억제제 및/또는 이들의 리간드에 대해 높은 결합 친화도를 갖는다는 점에서 신규하다. 추가로, 본 구축물은 표적 세포에 대한 세포독성 활성을 향상시키는 CD28 및 CD3ζ의 세포질 도메인으로 이루어진다. 또한, 본 구축물은 mRNA 기반이므로 구축물이 숙주 게놈에 통합되는 것과 관련하여 우려가 없다.
신호 펩티드는 CD64 및/또는 IgGHv 신호 펩티드를 포함한다. 일 양태에서, 신호 펩티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2를 포함한다.
항원 결합 도메인은 CD19, BCMA, B7H4, SARS-CoV-2 스파이크 및 CD30α로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합한다.
일 양태에서, CD19에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 4에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함한다.
또 다른 양태에서, BCMA에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함한다.
또 다른 양태에서, B7H4에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 7에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함한다.
일 양태에서, SARS-CoV-2 스파이크에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 8에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함한다.
일 양태에서, CD30α에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 57에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함한다.
일 양태에서, 힌지 영역은 서열 번호 9를 갖는 CD28 힌지 영역이다.
일 양태에서, TM 도메인은 서열 번호 10을 갖는 CD28 TM 도메인이다.
일 양태에서, 공동자극 도메인은 서열 번호 11을 갖는 CD28 세포질 도메인을 포함한다. 또 다른 양태에서, 공동자극인자 도메인은 2B4, 4-1BB(CD137 또는 TNFRS9로도 지칭됨) 및/또는 OX40을 포함한다. 더욱이, 추가 공동자극 도메인이 구축물에 부가될 수 있다. 구축물 내 공동자극 도메인의 순서/위치를 교환/변경하는 것도 고려된다.
일 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호 12를 갖는 CD3ζ 세포질 도메인을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같이, CAR은 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22 및 서열 번호 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시 형태는 본원에 개시된 CAR을 코딩하는 핵산 구축물이며, 여기서, CAR은 적어도 하나의 공동자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고; 신호 펩티드, 항원 결합 도메인, 힌지 영역 및 TM 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하며; 신호 펩티드는 CD64 및/또는 IgGHv 신호 펩티드를 포함하고; 항원 결합 도메인은 CD19, BCMA, B7H4, SARS-CoV-2 스파이크 및 CD30α와, 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합한다. 일 양태에서, 핵산 구축물은 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31 서열 번호 32 및 서열 번호 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, SARS-CoV-2-항원은 SARS-CoV-2 단백질 및 이의 변이체를 지칭한다. SARS-CoV-2 항원으로 사용되거나 SARS-CoV-2 항원을 생성하는 데 사용될 수 있는 적합한 SARS-CoV-2 단백질의 예는 주요 프로테아제(MPRO, Chain A 3C-유사 프로테이나아제 또는 3C-유사 프로테이나아제로도 공지됨), SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(N 단백질), SARS-CoV-2 막 단백질(M 단백질), SARS-CoV-2 외피 단백질(E 단백질), 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(S 단백질)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 개시된 또 다른 실시 형태는 본원에 개시된 바와 같은 CAR을 코딩하는 발현 벡터이고, 여기서, CAR은 신호 펩티드, 항원 결합 도메인, 힌지 영역 및 TM 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 및 적어도 하나의 공동자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하고; 신호 펩티드는 CD64 및/또는 IgGHv 신호 펩티드를 포함하고; 항원 결합 도메인은 CD19, BCMA, B7H4, SARS-CoV-2 스파이크 및 CD30α로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합한다. 일 양태에서, 발현 벡터는 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본원에 개시된 추가 실시 형태는 본원에 개시된 바와 같은 CAR을 발현하는 변형된 일차 NK 세포이고, 여기서, CAR은 신호 펩티드, 항원 결합 도메인, 힌지 영역 및 TM 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 및 적어도 하나의 공동자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하고; 신호 펩티드는 CD64 및/또는 IgGHv 신호 펩티드를 포함하고; 항원 결합 도메인은 CD19, BCMA, B7H4, SARS-CoV-2 스파이크 및 CD30α로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합한다.
본원에 개시된 또 다른 실시 형태는 본원에 개시된 바와 같은 발현 벡터로부터 전사된 CAR mRNA 분자를 도입하는 단계를 포함하는 유전자 변형 NK 세포의 제조 방법이다.
RNA CAR 분자의 활성을 향상시킬 수 있는 동일한 구축물에 다른 사이토카인 유전자를 부가하는 것도 가능하다(바이- 또는 트리-펩티드로서). 이러한 사이토카인 유전자에는 IL-15가 포함된다.
CAR 분자의 활성을 향상시키기 위해 NKG2D와 같은 활성화 NK 수용체로부터의 도메인을 본원에 개시된 CAR 분자에 도입하는 것도 고려된다. NKG2D는 C형 렉틴 유사 수용체의 NKG2 패밀리에 속하는 막관통 단백질이다.
본원에 개시된 추가 실시 형태는 암의 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하기 위한 면역요법 방법이다. 이 방법은 대상체에게 본원에 개시된 바와 같은 유전자 변형 NK 세포 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시 형태는 암 치료를 위한 본원에 개시된 바와 같은 유전자 변형 NK 세포 및 제약상 허용가능한 담체의 용도이다.
또 다른 실시 형태는 본원에 개시된 바와 같은 변형된 NK 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이다.
본 명세서 전반에 걸쳐, "포함하다" 또는 변이형, 예컨대 "포함하고 있다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수(또는 구성요소) 또는 정수(또는 구성요소)의 군의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수(또는 구성요소) 또는 정수(또는 구성요소)의 군의 배제를 의미하지는 않는다.
단수형("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 명백하게 언급되지 않는 한 복수형을 포함한다.
"포함하는"은 "포함하지만 이에 한정되지 않는"을 의미한다. "포함하는"과 "포함하지만 이에 한정되지 않는"은 상호교환가능하게 사용된다.
"제약상 허용가능한 담체"는 본원에 기술된 조성물과 함께 환자에게 투여될 수 있고 조성물 내의 활성제의 약리학적 활성을 파괴하지 않는 비독성 담체를 지칭한다. "부형제"는 제약적 활성 성분이 아닌 제형 또는 조성물 내의 첨가제를 지칭한다.
"제약적 유효량"은 환자를 치료하는 데 효과적인 양, 예를 들어 질환(암을 포함하지만 이에 한정되지 않음)을 앓고 있는 환자의 전반적인 건강에 유익한 및/또는 바람직한 변화를 가져오는 양을 지칭한다. 치료는 세포 사멸, 새로운 세포의 성장 방지, 환자의 생명 기능 개선, 환자의 웰빙 개선, 통증 감소, 식욕 개선, 환자 체중 개선 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. "제약적 유효량"은 환자의 임상 증상을 개선하는 데 필요한 양을 지칭하기도 한다.
"펩티드" 및 "폴리펩티드"는 아미노산 잔기로부터 구축된 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 동의어로 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산 잔기"는 임의의 자연 발생 아미노산(L 또는 D 형태), 자연 비발생 아미노산, 또는 아미노산 모방체(예컨대 펩티드 단량체)를 지칭한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 비교 창에서 최대 대응에 대해 비교되고 정렬되는 경우, 동일한 특정 백분율의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖거나 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위한 아미노산 또는 핵산 서열 동일성의 정도는 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]에 기술된 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이 알고리즘은 질의 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 식별함으로써 고 스코어링 서열 쌍(HSPS)을 식별하는데, 이는 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬되는 경우 일부 양수 임계점 스코어 T와 매칭되하거나 이를 만족한다. T는 이웃 단어 스코어 임계값으로 지칭된다(문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]). 초기 이웃 단어 히트(hit)는 이를 포함하는 더 긴 HSP를 찾기 위해 검색을 시작하기 위한 시드(seed)로서의 역할을 한다. 그 후 단어 히트는 누적 정렬 스코어가 증가할 수 있는 한 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 매개변수 M(매칭 잔기 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 >0) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 페널티 스코어, 항상 <0)을 사용하여 뉴클레오티드 서열에 대한 누적 스코어를 계산한다. 아미노산 서열의 경우 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 다음과 같은 경우 각 방향의 단어 히트 확장이 중단된다: 누적 정렬 스코어가 최대 달성 값으로부터 수량 X만큼 떨어지는 경우; 하나 이상의 네거티브-스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 스코어가 0 이하가 되는 경우; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달하는 경우. 아미노산 서열의 동일성 %를 결정함에 있어서 BLASTP 설정은 다음과 같다: 단어 길이(W), 3; 기대치(E), 10; 및 BLOSUM62 스코어 매트릭스. 핵산 서열 분석에 있어서 BLASTN 프로그램 설정은 다음과 같다: 단어 길이(W), 11; 기대치(E), 10; M=5; N=-4; 및 두 가닥의 비교. TBLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열 데이터베이스를 쿼리하기 위해 단백질 서열 사용)은 단어 길이(W) 3, 기대치(E) 10 및 BLOSUM 62 스코어링 매트릭스를 사용한다. (문헌[Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조).
서열 동일성 %를 계산하는 것 외에도, BLAST 알고리즘은 두 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석도 수행한다(예를 들어 문헌[Karlin & Altschul (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-87] 참조). 최소 합계 확률(P(N))은 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매칭이 우연히 발생할 확률을 나타낸다. 예를 들어, 테스트 핵산과 기준 핵산을 비교할 때 최소 확률 합계가 약 0.01 미만인 경우 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
폴리펩티드의 "길이"는 폴리펩티드가 함유할 수 있는 임의의 비펩티드 링커 및/또는 변형을 제외하고 폴리펩티드를 구성하는, 말단과 말단이 연결된 아미노산 잔기의 수이다.
소수성 아미노산 잔기는 주로 비극성의 화학적 특성을 갖는 작용기("측쇄")를 특징으로 한다. 이러한 소수성 아미노산 잔기는 자연 발생(L 또는 D 형태) 또는 자연 비발생일 수 있다. 대안적으로, 소수성 아미노산 잔기는 주로 비극성의 화학적 특성을 갖는 측쇄를 특징으로 하는 아미노산 모방체일 수 있다. 반대로, 친수성 아미노산 잔기는 주로 극성(하전 또는 비하전)의 화학적 특성을 갖는 측쇄를 특징으로 한다. 이러한 친수성 아미노산 잔기는 자연 발생(L 또는 D 형태) 또는 자연 비발생일 수 있다. 대안적으로, 친수성 아미노산 잔기는 주로 극성(하전 또는 비하전)의 화학적 특성을 갖는 측쇄를 특징으로 하는 아미노산 모방체일 수 있다. 적합한 자연 비발생 아미노산 잔기 및 아미노산 모방체는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Liang et al. (2013) PLoS ONE 8(7):e67844]을 참조한다.
대부분의 아미노산 잔기는 소수성 또는 친수성으로 간주될 수 있지만, 일부는 상황에 따라 소수성 또는 친수성으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 글리신, 프롤린 및 시스테인의 상대적으로 약한 비극성 특성으로 인해 이들 각각은 때때로 친수성 아미노산 잔기로 기능할 수 있다. 반대로, 히스티딘 및 아르기닌의 부피가 크고 약간 소수성인 측쇄는 이들 각각이 때때로 소수성 아미노산 잔기로 기능할 수 있게 한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 개시된 각 실시 형태는 단독으로 또는 본원의 하나 이상의 다른 실시 형태와 조합되어 사용될 수 있다.
"형질감염"은 외래 핵산을 진핵 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다. 형질감염은 전기천공, 중합체(나노입자), 인산칼슘-DNA 공침전, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 폴리브렌 매개 형질감염, 미세주입, 리포솜 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 및 유전자총(biolistics)을 포함한 당업계에 공지된 다양한 수단에 의해 성취될 수 있다.
"안정적인 형질감염" 또는 "안정적으로 형질감염된"은 외래 핵산, DNA가 형질감염된 세포의 게놈 내로 도입 및 통합되는 것을 지칭한다.
변이체라는 용어는 기준 서열(예를 들어 SARS-CoV-2 단백질 서열)과 유사하지만 동일하지는 않은 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 단편을 지칭하며, 여기서, 변이체 단백질의 활성은 유의하게 변경되지 않는다. 서열의 이러한 변이는 자연적으로 발생하는 변이일 수 있거나 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 조작될 수 있다. 적합한 변이의 예는 아미노산의 결실, 삽입, 치환 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
아미노산은 물리적 특성을 기준으로 군으로 분류될 수 있다. 이러한 군의 예는 하전 아미노산, 비하전 아미노산, 극성 비하전 아미노산 및 소수성 아미노산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직한 변이체는 아미노산이 동일한 군의 아미노산으로 치환된 변이체이다. 이러한 치환은 보존적 치환으로 지칭된다.
자연 발생 잔기는 공통 측쇄 특성을 기준으로 클래스로 분류될 수 있다.
1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr;
3) 산성: Asp, Glu;
4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
개체에서 암의 증상을 치료 또는 개선하고/하거나 암 또는 종양을 치료하기 위한 방법 및 용도도 제공된다. 본 방법 및/또는 용도는 대상체에게 다음을 투여하는 것을 포함한다: 치료적 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 변형된 NK 세포 또는 본원에 개시된 바와 같은 변형된 NK 세포를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여. 투여는 암을 치료하거나, 대상체에서 종양의 크기를 감소시키거나, 대상체에서 암 전이를 감소시키기 위해 고려된다. 일 실시 형태는 암 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 변형된 NK 세포이다. 또 다른 실시 형태는 의약으로 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 변형된 NK 세포이다.
용어 "암"은 백혈병, 암종 및 육종을 포함하여 포유 동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물 또는 악성 종양을 지칭한다. 예시적인 암은 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 두경부암, 간암, 신장암, 폐암, 비소세포 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암 및 수모 세포종을 포함한다. 추가의 예는 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모 세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판 증가증, 원발성 마크로글로불린혈증, 원발성 뇌종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 유암종, 비뇨기 방광암, 전암성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모 세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신피질암, 내분비 및 외분비 췌장의 신생물, 및 전립선암을 포함한다.
용어 "전이", "전이성" 및 "전이성 암"은 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 하나의 기관 또는 다른 비인접 기관 또는 신체 부위로부터의 증식성 질환 또는 장애, 예를 들어 암의 확산을 지칭한다. 암은 기원 부위, 예를 들어 유방에서 발생하며, 상기 부위는 원발성 종양, 예를 들어 원발성 유방암으로 지칭된다. 원발성 종양 또는 기원 부위의 일부 암세포는 국소 영역에서의 주변 정상 조직에 침투하여 침윤하는 능력 및/또는 림프계 또는 림프계를 통해 체내의 다른 부위 및 조직으로 순환하는 혈관계의 벽에 침투하는 능력을 획득한다. 원발성 종양의 암세포로부터 형성된 두 번째의 임상적으로 검출가능한 종양은 전이성 또는 이차성 종양으로 지칭된다. 암세포가 전이되면 전이성 종양 및 그 세포는 원래의 종양의 것과 유사한 것으로 추정된다. 따라서 폐암이 유방으로 전이되면 유방의 그 부위의 이차 종양은 비정상적인 유방 세포가 아닌 비정상적인 폐세포로 이루어진다. 유방의 이차 종양은 전이성 폐암으로 지칭된다. 따라서, 전이성 암이라는 어구는 대상체가 원발성 종양을 갖고 있거나 가졌었고 하나 이상의 이차 종양을 갖는 질환을 지칭한다. 비전이성 암 또는 전이성이 아닌 암을 가진 대상체라는 어구는 대상체가 원발성 종양을 가지고 있지만 하나 이상의 이차 종양이 없는 질환을 지칭한다. 예를 들어, 전이성 폐암은 원발성 폐종양이 있거나 이의 병력이 있고 두 번째 위치 또는 여러 위치, 예를 들어 유방에 하나 이상의 이차 종양이 있는 대상체에서의 질환을 지칭한다.
대상체, 환자, 개체 등의 용어는 한정하고자 하는 것이 아니며, 일반적으로 상호교환될 수 있다. 즉, 환자로 기술된 개체는 반드시 주어진 질환을 가지고 있는 것은 아니며, 단지 의학적 조언을 구하는 것일 수 있다. 전체적으로 사용되는 바와 같이, 대상체는 척추 동물, 더 구체적으로 포유 동물(예를 들어, 인간, 말, 고양이, 개, 소, 돼지, 양, 염소, 마우스, 토끼, 쥐 및 기니피그), 조류, 파충류, 양서류, 어류 및 임의의 기타 동물일 수 있다. 이 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서 남성이든 여성이든 성인 및 신생아 대상체를 커버하고자 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 환자, 개체 및 대상체는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 이러한 용어는 한정하고자 하는 것이 아니다. 즉, 환자로 기술된 개체는 반드시 주어진 질환을 가지고 있는 것은 아니며, 단지 의학적 조언을 구하는 것일 수 있다. 환자 또는 대상체라는 용어는 인간 및 수의학적 대상체를 포함한다.
본원에서 "치료적" 및 "예방적"에 대한 언급은 가장 넓은 맥락에서 고려되어야 한다. "치료적"은 포유동물이 완전히 회복될 때까지 치료받는다는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 이와 유사하게, "예방적"은 대상체가 결국 질환 상태에 걸리지 않을 것이라는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 용어 "예방"은 특정 병태의 발병의 심각도를 감소시키는 것으로 간주될 수 있다. 치료는 또한 기존 병태의 중증도 또는 급성 발작 빈도를 감소시킬 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "치료하다", "치료하는" 및 유사한 용어는 질환 또는 병태의 증상을 안정화 및/또는 감소시키는 것을 의미한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 질환 또는 병태의 발생을 예방하거나, 의학적 병태 또는 질환을 치유할 수 있는데, 이는 치료와는 별개이다.
본원에 기술된 치료용 조성물의 투여 경로 및 투여 빈도와, 투여량은 개인마다, 그리고 질환마다 다를 것이며, 표준 기술을 사용하여 용이하게 확립될 수 있다. 일반적으로, 제약 조성물은 주사(예를 들어, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하)에 의해, 비강내로(예를 들어 흡인에 의해), 알약 형태(예를 들어 삼키기, 질 또는 직장 전달을 위한 좌약)로 투여될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 비경구 투여에 적합하다. 이들 조성물은 예를 들어 복강내, 정맥내, 또는 경막내, 두개내, 피내, 근육내, 안구내, 경막내, 뇌내, 비강내, 경점막 투여되거나, 주입에 의해 투여되거나, 경구, 직장 투여되거나, IV 점적, 패치 및 임플란트를 통해 투여되거나, 비경구 투여되거나, 정위적으로 투여되거나, 피하, 국소, 비강, 경구, 설하, 안구내(이식형 저장소에 의해)(나노입자 기반 전달 시스템, 마이크로니들 패치, 미소구체, 비드, 삼투압 펌프 또는 기계적 펌프 및/또는 기타 기계적 수단 사용) 투여될 수 있다. 선택적으로, NK 세포는 비경구적으로 투여된다. 선택적으로, NK 세포는 정맥내로 투여된다. 선택적으로, NK 세포는 종양 주위로 투여된다. 당업자는 본 발명의 조성물을 투여하는 방법이 치료할 환자의 연령, 체중, 및 신체 상태, 및 치료할 질환 또는 병태와 같은 요인에 따라 달라짐을 이해할 것이다. 따라서 숙련된 작업자는 사례별로 환자에게 최적인 투여 방법을 선택할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 변형된 NK 세포는 절대적 세포수에 의해 대상체에게 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 대상체에는 약 1000개의 세포/주사 내지 최대 약 100억개의 세포/주사, 예컨대 주사당 약, 적어도 약, 또는 최대 약 1Х1010, 1Х109, 1Х108, 1Х107, 5Х107, 1Х106, 5Х106, 1Х105, 5Х105, 1Х104, 5Х104, 1Х103, 5Х103개(등)의 NK 세포, 또는 임의의 두 숫자 사이의 임의의 범위(종점 포함)가 투여될 수 있다. 선택적으로, 1Х108 내지 1Х1010개의 세포가 대상체에게 투여된다. 선택적으로, 세포는 1주 이상 동안 매주 1회 이상 투여된다. 선택적으로, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 또는 그 이상 동안 매주 1회 또는 2회 투여된다.
또 다른 실시 형태에서, 총 용량은 또한 m2의 신체 표면적에 의해 계산될 수 있다. 대상체에는 약 1000개의 세포/주사/m2 내지 최대 약 100억개의 세포/주사/m2, 예컨대 주사당 약, 적어도 약 또는 최대 약 1Х1010/m2, 1Х109/m2, 1Х108/m2, 1Х107/m2, 5Х107/m2, 1Х106/m2, 5Х106/m2, 1Х105/m2, 5Х105/m2, 1Х104/m2, 5Х104/m2, 1Х103/m2, 5Х103/m2(등)의 NK 세포, 또는 임의의 두 숫자 사이의 임의의 범위(종점 포함)가 투여될 수 있다. 선택적으로, 1Х103 내지 1Х1010/m2의 NK 세포가 대상체에게 투여된다. 선택적으로 2Х109/m2의 NK 세포가 대상체에게 투여된다.
일부 실시 형태에서, NK 세포는 NK 세포 및 배지, 예컨대 인간 혈청 또는 이의 등가물을 포함하는 조성물로 투여된다. 배지는 인간 혈청 알부민 및/또는 인간 혈장을 포함할 수 있다. 선택적으로, 배지는 약 1% 내지 약 15%의 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 선택적으로, 배지는 약 1% 내지 약 10%의 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 선택적으로, 배지는 약 1% 내지 약 5%의 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 선택적으로, 배지는 약 2.5%의 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 선택적으로, 혈청은 인간 AB 혈청이다. 선택적으로, 인간 혈청 대신에 인간 치료제에 사용하기 위한 것으로 허용가능한 혈청 대체물이 사용된다. 이러한 혈청 대체물은 당업계에 공지되어 있을 수 있다. 선택적으로, NK 세포는 NK 세포 및 세포 생존력을 지원하는 등장성 액체 용액을 포함하는 조성물로 투여된다. 선택적으로, NK 세포는 냉동보존된 샘플로부터 재구성된 조성물로 투여된다.
본원에 제공된 방법 및 용도에 따르면, 대상체에는 본원에 제공된 하나 이상의 제제의 유효량 또는 치료적 유효량이 투여된다. 유효량, 치료적 유효량 및 유효 투여량이라는 용어는 상호교환가능하게 사용된다. 용어 유효량은 원하는 생리적 반응(예를 들어, 염증 감소)을 생성하는 데 필요한 임의의 양으로 정의된다. 제제를 투여하기 위한 유효량 및 일정은 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 투여를 위한 투여량 범위는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상이 영향을 받는(예를 들어, 감소되거나 지연되는) 원하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 범위이다. 투여량은 원하지 않는 교차 반응, 아나필락시스 반응 등과 같은 실질적인 유해한 부작용을 유발할 정도로 커서는 안된다. 일반적으로 투여량은 연령, 상태, 성별, 질환 유형, 질환 또는 장애의 정도, 투여 경로 또는 다른 약물이 요법에 포함되는지 여부에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 금기 사항이 있는 경우 개별 의사에 의해 투여량이 조정될 수 있다. 투여량은 달라질 수 있으며, 하루 또는 며칠 동안 매일 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 주어진 부류의 의약품에 대한 적절한 투여량에 대한 지침은 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 주어진 파라미터에 있어서 유효량은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% 또는 적어도 100%의 증가 또는 감소를 나타낼 것이다. 효능은 또한 "~배" 증가 또는 감소로 표현될 수 있다. 예를 들어, 치료적 유효량은 대조군에 비해 적어도 1.2배, 1.5배, 2배, 5배 또는 그 이상의 효과를 가질 수 있다. 정확한 용량 및 제형은 치료 목적에 따라 다르며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(예를 들어, 문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)]; 문헌[Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)]; 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Gennaro, Editor (2012)], 및 문헌[Pickar, Dosage Calculations (1999)] 참조).
주사용으로 적합한 조성물에는 멸균 주사용 용액의 즉석 제조를 위한 멸균 산제 및 멸균 수성 용액(수용성인 경우)이 포함된다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 이루어질 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요한 경우 위에 열거된 다양한 기타 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입시킨 후, 예를 들어 필터 멸균 또는 기타 적절한 수단에 의한 멸균을 통해 제조된다. 분산액은 기본 분산 매질과 위에 열거된 것으로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분+임의의 원하는 추가 성분의 산제를 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술을 포함한다.
활성 성분이 적절하게 보호되는 경우, 활성 성분은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있거나, 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입될 수 있거나, 정제로 압착될 수 있다. 치료적 경구 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있으며, 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭서제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
임의의 전술한 방법 및 용도와 함께, 조성물은 또 다른 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 각각의 경우에, 조성물은 다른 약물의 투여 전에, 이와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 본원에 기술된 방법에 따르면, 하나 초과의 화합물 또는 조성물이 하나 이상의 다른 화합물, 예컨대 공지된 화학요법제, 항바이러스 화합물 또는 분자와, 항생제, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 폐렴 치료용의 공지된 약물, 진통제(예컨대 리도카인 또는 파라세토아몰), 항염증제(예컨대 베타메타손, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 아세트아미노펜, 이부프로펜, 나프록센 등) 및/또는 기타 적합한 약물과 함께 공동투여될 수 있다. 제공된 방법은 추가로 방사선 요법, 수술, 호르몬 요법 및/또는 면역요법과 같은 다른 종양 치료법과 조합될 수 있다. 따라서, 제공된 방법은 대상체에게 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 추가 치료제는 진통제, 마취제, 소생제, 코르티코스테로이드, 항콜린제, 항콜린에스테라아제, 항경련제, 항신생물제, 알로스테릭 억제제, 아나볼릭 스테로이드, 항류마티스제, 정신요법제, 신경 차단제, 항염증제, 항기생충제, 항생제, 항응고제, 항진균제, 항히스타민제, 항무스카린제, 항마이코박테리아제, 항원생동물제, 항바이러스제, 도파민제(dopaminergics), 혈액 제제, 면역 제제, 무스카린제(muscarinics), 프로테아제 억제제, 비타민, 성장 인자 및 호르몬을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 제제 및 투여량의 선택은 치료되는 주어진 질환에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 선택적으로, 추가 치료제는 옥트레오티드 아세테이트, 인터페론, 펨브롤리주맙, 글루코피라노실 지질 A, 카보플라틴, 에토포시드 또는 이들의 임의의 조합이다.
일 양태에서, 조성물은 N-803("ALT-803"으로도 지칭됨)과 함께 투여될 수 있다. 일 양태에서, N-803은 본원에 개시된 바와 같은 펩티드(들)를 포함하는 제약 조성물과 함께 또는 이와는 별개로 투여될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 추가의 치료적 엔티티는 바이러스 암 백신, 박테리아 암 백신, 효모 암 백신, 항체, 줄기 세포 이식 및 종양 표적화 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
선택적으로, 추가 치료제는 화학요법제이다. 화학요법 치료 요법은 하나의 화학요법제 또는 화학요법제들의 조합을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 화학요법제는 알킬화제, 안트라사이클린, 탁산, 에포틸론, 히스톤 데아세틸라아제 억제제, 토포이소머라아제 I 억제제, 토포이소머라아제 II 억제제, 키나아제 억제제, 단클론항체, 뉴클레오티드 유사체 및 전구체 유사체, 펩티드항생제, 백금-기반 화합물, 레티노이드, 및 빈카 알칼로이드 및 유도체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 선택적으로, 화학요법제는 카보플라틴이다.
"공동투여하다"는 동일한 제형으로 동시 투여하거나, 동일하거나 상이한 경로를 통해 2가지 상이한 제형으로 동시 투여하거나, 동일하거나 다른 경로에 의해 순차적으로 투여함을 전달한다. "순차적" 투여는 상기 2가지 이상의 개별 화합물의 투여 사이의 수 초, 수 분, 수 시간 또는 수 일의 시간 차이를 전달한다.
N-803은 인터루킨-15(IL-15) 초작용제 복합체이다. 전임상 연구에서 IL-15는 잘 확립된 종양에 대해 효력있는 항종양 활성을 나타낸다. 또한, N-803은 치료용 항체의 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 활성과 항-PD-1, 항-PD-L1, 및 항-CTLA 항체와 같은 체크포인트 억제제의 항종양 활성을 상승적으로 향상시킬 수 있다(문헌[Rhode et al., Cancer Immunol Res., 2016]).
N-803의 유용한 농도는 해당 대상체에 적합한 농도이다. 당업자는 서로 다른 개인이 서로 다른 N-803의 총량을 필요로 할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시 형태에서, N-803의 양은 제약적 유효량이다. 숙련된 작업자는 예를 들어 대상체의 연령, 체중 및 신체 상태와 같은 요인에 기초하여 대상체를 치료하는 데 필요한 조성물 중 N-803의 양을 결정할 수 있을 것이다. N-803의 제약적 유효량은 체중 1 kg당 약 1 pg의 화합물 내지 체중 1 kg당 약 20 μg/kg의 화합물; 또는 약 0.1 μg/kg 내지 20 μg/kg; 또는 체중 1 kg당 약 1 μg 내지 내지 체중 1 kg당 약 1 mg의 화합물, 또는 체중 1 kg당 약 1 mg 내지 체중 1 kg당 약 5000 mg; 또는 체중 1 kg당 약 5 mg 내지 체중 1 kg당 약 4000 mg 또는 체중 1 kg당 약 10 mg 내지 체중 1 kg당 약 3000 mg; 또는 체중 1 kg당 약 50 mg 내지 체중 1 kg당 약 2000 mg; 또는 체중 1 kg당 약 100 mg 내지 체중 1 kg당 약 1000 mg; 또는 체중 1 kg당 약 150 mg 내지 체중 1 g당 약 500 mg일 수 있다. 바람직하게는 100 pk/kg 내지 20 μg/kg이다. 다른 실시 형태에서, 이 용량은 체중 1 kg당 약 0.1, .5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000 mg일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 용량은 체중 1 kg당 약 5 mg의 화합물 내지 체중 1 kg당 약 20 mg의 화합물의 범위일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 용량은 체중 1 kg당 약 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 mg일 수 있다.
조성물들 또는 제제들의 조합물들은 동시에(예를 들어, 혼합물로서), 개별적으로 일제히(예를 들어, 별개의 정맥내 라인을 통해) 또는 순차적으로(예를 들어, 하나의 제제가 먼저 투여된 후 제2 제제가 투여됨) 투여될 수 있다. 따라서, 용어 조합은 둘 이상의 제제 또는 조성물을 동시 투여하거나, 일제히 투여하거나 또는 순차적으로 투여하는 것을 지칭하기 위해 사용된다. 치료 과정은 대상체의 특정 특성과 선택한 치료 유형에 따라 개체별로 최상으로 결정된다. 본원에 개시된 것과 같은 치료는 매일, 매일 2회, 격주, 매월 또는 치료적으로 유효한 임의의 적용가능한 기준으로 대상체에게 투여될 수 있다. 치료는 단독으로 또는 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 임의의 다른 치료와 조합하여 투여될 수 있다. 추가 치료는 첫 번째 치료와 동시에, 다른 시점에, 또는 전적으로 상이한 치료 일정으로 투여될 수 있다(예를 들어, 첫 번째 치료는 매일일 수 있는 반면 추가 치료는 매주임).
일부 실시 형태에서, 조성물에 하나 이상의 부형제를 포함시키는 것이 유익할 수 있다. 당업자는 임의의 하나의 부형제의 선택이 임의의 다른 부형제의 선택에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 특정 부형제를 선택하면 하나 이상의 추가 부형제 사용이 배제될 수 있으며, 그 이유는 부형제들의 조합이 바람직하지 않은 효과를 생성할 수 있기 때문이다. 당업자는, 존재한다면 어떤 부형제를 본원에 개시된 제형 또는 조성물에 포함시킬지를 경험적으로 결정할 수 있을 것이다. 부형제는 공용매, 가용화제, 완충제, pH 조절제, 증량제, 계면활성제, 캡슐화제, 장성 조절제, 안정화제, 보호제 및 점도 조절제를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 것이 유익할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 가용화제를 포함하는 것이 유익할 수 있다. 가용화제는 본원에 개시된 펩티드 또는 부형제를 포함한, 제형 또는 조성물의 임의의 성분의 용해도를 증가시키는 데 유용할 수 있다. 본원에 기술된 가용화제는 완전한 목록을 구성하고자 하는 것이 아니고 단지 사용될 수 있는 예시적인 가용화제로서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 가용화제는 에틸 알코올, tert-부틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 및 이들의 임의의 제약상 허용가능한 염 및/또는 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
pH는 조성물에 바람직한 특성을 제공하는 임의의 pH일 수 있다. 바람직한 특성에는 예를 들어 펩티드 안정성, 다른 pH의 조성물과 비교하여 증가된 펩티드 보유, 및 향상된 여과 효율이 포함될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 장성 조절제를 포함하는 것이 유익할 수 있다. 액체 조성물의 장성은 예를 들어 비경구 투여에 의해 환자에게 조성물을 투여할 때 중요한 고려사항이다. 따라서 장성 조절제는 투여에 적합한 조성물을 만드는 데 도움을 주기 위해 사용될 수 있다. 장성 조절제는 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본원에 기술된 장성 조절제는 완전한 목록을 구성하고자 하는 것이 아니고 단지 사용될 수 있는 예시적인 장성 조절제로서 제공된다. 장성 조절제는 이온성 또는 비이온성일 수 있으며 무기 염, 아미노산, 탄수화물, 당, 당 알코올 및 탄수화물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예시적인 무기염에는 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨 및 황산칼륨이 포함될 수 있다. 예시적인 아미노산으로는 글리신이 있다. 예시적인 당에는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 글루코스, 수크로스, 락토스 및 만니톨과 같은 당 알코올이 포함될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 안정화제를 포함하는 것이 유익할 수 있다. 안정화제는 본 발명의 조성물 중 펩티드의 안정성을 증가시키는 데 도움을 준다.
일부 실시 형태에서, 보호제를 포함하는 것이 유익할 수 있다. 보호제는 바람직하지 않은 조건(예를 들어, 동결, 동결건조 또는 산화로 인한 불안정성)으로부터 제약적 활성 성분(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 펩티드)을 보호하는 제제이다. 보호제는 예를 들어 동결보호제, 동결건조 보호제 및 항산화제를 포함할 수 있다. 동결보호제는 제형이 빙점 미만의 온도에 노출되는 경우 제약적 활성 성분(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 펩티드)의 효력 손실을 방지하는 데 유용하다. 예를 들어, 정맥내(IV) 투여를 위해 희석하기 전에 제형이 동결될 수 있도록 재구성 동결건조 제형에 동결보호제가 포함될 수 있다. 동결보호제는 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본원에 기술된 동결방지제는 완전한 목록을 구성하고자 하는 것이 아니고 단지 사용될 수 있는 예시적인 동결방지제로서 제공된다. 동결방지제는 용매, 계면활성제, 캡슐화제, 안정화제, 점도 조절제 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 동결방지제는 예를 들어 이당류(예를 들어 수크로스, 락토스, 말토스 및 트레할로스), 폴리올(예를 들어 글리세롤, 만니톨, 소르비톨 및 둘시톨), 글리콜(예를 들어 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜)을 포함할 수 있다.
동결건조보호제는 동결건조 제형 또는 조성물의 성분을 안정화시키는 데 유용하다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 펩티드는 재구성 전에 동결건조보호제와 함께 동결건조될 수 있다. 동결건조보호제는 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본원에 기술된 동결건조보호제는 완전한 목록을 구성하고자 하는 것이 아니고 단지 사용될 수 있는 예시적인 동결건조보호제로서 제공된다. 동결건조보호제는 용매, 계면활성제, 캡슐화제, 안정화제, 점도 조절제 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예시적인 동결건조보호제는 예를 들어 당 및 폴리올일 수 있고, 트레할로스, 수크로스, 덱스트란 및 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린은 동결건조보호제의 비제한적 예이다.
항산화제는 조성물 성분의 산화를 방지하는 데 유용하다. 산화는 완제 의약품의 응집 또는 완제 의약품의 순도 또는 이의 효력에 대한 다른 해로운 영향으로 이어질 수 있다. 항산화제는 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본원에 기술된 항산화제는 완전한 목록을 구성하고자 하는 것이 아니고 단지 사용될 수 있는 예시적인 항산화제로서 제공된다. 항산화제는 예를 들어 아스코르브산나트륨, 시트레이트, 티올, 메타중아황산염 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이, 본원에 기술된 것의 변형, 변경 및 다른 구현이 당업자에게 떠오를 것이다. 따라서, 이어지는 청구범위는 이전의 예시적인 설명에만 한정되는 것이 아니다.
본원에 기술된 실시 형태 각각은 개별적으로 조합되거나 본 발명의 하나 이상의 다른 실시 형태와 조합될 수 있다.
당업자는 단지 일상적인 실험, 본원에 기술된 화합물, 조성물 및 이의 사용 방법에 대한 수많은 등가물을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본원에 개시된 조성물 및 방법의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용 및 이의 관련 도면은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 당업자에게 실시 형태를 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시된 것이며, 본 발명자가 자신의 발명으로 간주하는 것의 범위를 한정하고자 하는 것도 아니고, 아래의 실험이 수행된 모든 실험 또는 유일한 실험임을 나타내고자 하는 것도 아니다. 사용된 수치(예를 들어 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오차 및 편차를 고려해야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 단위이다. 표준 약어가 사용된다.
실시예 1: 본 실시예는 본원에 개시된 RNA 구축물의 생성을 설명한다. 본원에 개시된 CAR 구축물을 코딩하는 벡터를 PCR 단편 또는 유전자 블록의 Gibson 조립에 의해 생성하였다. 150-폴리A 테일을 조작된 제한효소 부위를 사용하여 각 CAR 분자의 3' 말단에 삽입하였다. DNA 벡터를 완전히 서열결정하고 폴리 A 테일의 길이를 결정하였다. 다음으로 CAR DNA를 SapI로 선형화하고, 절단된 DNA를 추가로 정제하였다. T7 폴리머라아제를 사용하여 RNA를 정제된 DNA 주형으로부터 전사시켰다. 다음으로 RNA를 염화리튬을 사용하여 침전시키고 전기영동을 실시하여 크기 및 순도를 결정하였다.
[표 1]
[표 2]
[표 3]
[표 4]
[표 5]
[표 6]
[표 7]
[표 8]
[표 9]
[표 10]
실시예 2: 본 실시예는 ACE pNKW97을 이용한 결과를 보여준다(도 1, 도 2a~도 2d). ACE2 단백질의 세포외 도메인을 CD28의 힌지, TM 및 공동자극 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인 및 150p-A를 포함하는 벡터에 클로닝하였다(도 1). 구축물을 SapI로 절단하고, 선형화된 DNA를 mRNA 생성용 주형으로 사용하였다. PBNK 세포를 pNKW97 mRNA를 사용하여 전기천공하였다. 하룻밤 회복한 후, 유세포 분석법 및 콘쥬게이션된 항-ACE2 항체를 사용하여 ACE2 발현을 검출하였다. 이소타입 대조 항체를 사용하여 ACE2 항체의 특이성을 확인하였다 (도 2a, 도 2c). 비형질감염 대조군(도 2b)은 CENK 세포에서 ACE2의 내인성 발현이 없음을 보여준다. 그러나 전기천공된 CENK 세포는 >90%의 ACE2 CAR 발현을 보여준다(도 2d). ACE2 CAR을 코딩하는 벡터는 도 3에 예시되어 있다.
실시예 3: 본 실시예는 pNKW92-93을 사용한 결과를 보여준다(도 4, 도 5a~도 5f). CD64 또는 IgGH 신호 펩티드 뒤에 오는 B7H4 항원을 표적화하는 CAR 분자를 도 4에 예시된 바와 같이 설계하였다. CAR DNA를 SapI로 선형화하였으며 이는 mRNA의 시험관 내 전사를 위한 주형으로서의 역할을 하였다. 다음으로 CENK 세포를 mRNA를 사용하여 전기천공하였다. 하룻밤 회복한 후, B7H4 CAR의 발현을 유세포 분석법 및 비오티닐화된 B7H4, 이어서 스트렙타비딘-APC를 사용하여 검출하였다. 검출 시약의 특이성에 대한 대조군으로서, 각 샘플에 대해 스트렙타비딘-APC 단독 염색을 사용하였다. 도 5a 및 도 5b에 예시된 바와 같이, 비형질감염 대조군은 B7H4 CAR을 발현하지 않았다. 반면에, pNKW92(CD64 신호 펩티드) 및 pNKW93(IgGHv 신호 펩티드)(각각 도 5c, 도 5d 및 도 5e, 도 5f) 둘 모두 B7H4 CAR의 높은 발현을 보여주었다. B7H4 CAR을 코딩하는 벡터는 도 6 및 도 7에 예시되어 있다.
실시예 4: 본 실시예는 pNKW88-91을 사용한 결과를 보여준다(도 8a, 도 8b, 도 9a~도 9e, 도 10~도 14). BCMA 항원을 표적화하는 4가지의 CAR 분자를 도 8a 및 도 8b에 예시된 바와 같이 설계하였다. CAR DNA를 SapI로 선형화하였으며 이는 mRNA의 시험관 내 전사를 위한 주형으로서의 역할을 하였다. 다음으로, CENK 세포를 mRNA를 사용하여 전기천공하였다. 하룻밤 회복한 후, BCMA CAR의 발현을 유세포 분석법 및 비오티닐화된 BCMA, 이어서 스트렙타비딘-APC를 사용하여 검출하였다. 검출 시약의 특이성에 대한 대조군으로서 각 샘플에 대해 스트렙타비딘-APC 단독 염색을 사용하였다. 도 9a에 도시된 바와 같이, 비형질감염 대조군은 BCMA CAR을 발현하지 않았다. 반면에, 4가지의 상이한 구축물 모두(도 9b~도 9e)는 BCMA CAR의 높은 수준을 보여주었다. BCMA를 안정적으로 발현하는 SUP-B15 세포주에 대한 세포독성 활성에 대해 상기 구축물들을 테스트하였다(데이터는 모든 구축물에 대해 예시되지 않음). 도 10에서, 하나의 CAR 구축물(pNKW89)은 BCMA 발현 표적 세포주를 특이적으로 용해시키는 것으로 나타난 반면 BCMA 음성 모 세포주에 대해서는 세포독성 활성을 갖지 않았다. 비형질감염 대조군은 모 SUP-B15 또는 BCMA 발현 SUP-B15 세포주에 대해 세포독성이 없다. BCMA CAR을 코딩하는 벡터가 도 11~도 14에 예시되어 있다.
실시예 5: 본 실시예는 모노-펩티드 CD19 CAR 개발의 근거를 보여준다. 안정한 CD19-CAR NK92 세포주의 제조에 이전에 사용되었던 트리-펩티드 CD19 CAR을 사용하여 PB-NK 세포의 전기천공을 위한 mRNA를 생성하였다. 전기천공으로부터 하룻밤 회복한 후, 유세포 분석법 및 비오티닐화된 항 CAR(F(ab')2), 이어서 스트렙타비딘-APC를 사용하여 CD19 CAR을 검출하였다. 검출 시약의 특이성에 대한 대조군으로서, 각 샘플에 대해 스트렙타비딘-APC 단독 염색을 사용하였다. 도 15a에 도시된 바와 같이, 양성 대조 세포주가 CD19 CAR의 높은 발현을 나타냈을 때, 비형질감염 음성 대조군은 CD19 CAR을 발현하지 않았다. 전기천공 프로토콜을 평가하기 위해 2가지의 상이한 RNA 주형들(GFP 및 PDL1)을 사용하였으며 이들 둘 모두는 전기천공한지 24시간 후 상응하는 코딩된 단백질의 높은 발현을 보여주었다(도 15b). 트리-펩티드 CD19 CAR mRNA를 PB-NK 세포에서 발현시킬 수 없었다(도 15c). CD19 CAR 발현의 결여가 PB-NK 세포 특이적이 아님을 보장하기 위해, 전기 펄스 증가를 이용하여 3가지 상이한 프로토콜들을 사용하여 기억 T 세포(Tscm)를 상기 CD19 CAR mRNA를 사용하여 전기천공하였다. 비형질감염 음성 대조군(도 16a) 및 형질감염 Tscm 세포(도 16b~도 16d) 모두 CD19 CAR을 발현하지 않는다. 다음 단계는 일차 NK 세포에서 mRNA 발현에 최적화된 도메인을 포함하는 모노-펩티드 CD19 CAR을 설계하는 것이었다. CD19 항원을 표적화하는 2가지의 CAR 분자(그들의 신호 펩티드가 다름)를 도 17에 예시된 바와 같이 설계하였다. CAR DNA를 SapI로 선형화하였고, 이는 mRNA의 시험관 내 전사를 위한 주형으로서의 역할을 하였다. 다음으로, PB-NK 세포를 CAR mRNA를 사용하여 전기천공하였다. 하룻밤 회복한 후, 유세포 분석법 및 비오티닐화 CD19, 이어서 스트렙타비딘-APC를 사용하여 CD19 CAR을 검출하였다. 검출 시약의 특이성에 대한 대조군으로서 각 샘플에 대해 스트렙타비딘-APC 단독 염색을 사용하였다. 도 18a~도 18b에 예시된 바와 같이, 비형질감염 대조군은 CD19 CAR을 발현하지 않는다. 반면에, 두 구축물 모두로 형질감염된 PB-NK 세포(도 18c, 도 18d 및 도 18e, 도 18f)는 CD19 CAR의 높은 수준을 보여주었다. CAR 분자는 CD19 항원을 발현하는 SUP-B15 세포주(모 세포주)에 대해 세포독성 활성을 나타냈고, 상기 세포주의 CD19-음성 변이체에 대해서는 활성을 나타내지 않았다(도 19a 및 도 19b). 기억 NK 세포(CIML)의 사용은 종양 미세환경에서 NK 세포의 생존성 및 활성을 연장하는 데 유망하다. PB-NK 세포에 사이토카인 처리(IL12/IL18/N-803)를 16시간 동안 실시하였다. 사이토카인을 제거하고 대조군과 CIML 세포 둘 모두를 pNKW87 mRNA를 사용하여 전기천공하였다. 도 20a~도 20b에 예시된 바와 같이, 형질감염된 세포는 기억(도 20a) 및 대조(도 20b) PBNK 세포 둘 모두에서 CD19-양성 표적 세포에 대해서만 세포독성 활성을 나타낸다. 다음으로 모노-펩티드 CD19 CAR을 활성화된 T 세포(Tscm에 대한 대조군) 및 Tscm 세포에서 테스트하였다. 이 실험을 위해 CD19 CAR 발현의 안정성도 72시간에 걸쳐 테스트하였다. 도 21b 및 도 21c(pNKW87) 및 도 21d 및 도 21e(pNKW59)에 예시된 바와 같이, CD19 CAR 수준은 활성화된 T 세포를 전기천공한지 72시간 후에도 높게 유지된다. 비형질감염 음성 대조군(도 21a)은 CD19 CAR 발현이 없음을 보여준다. 상기 CAR RNA 분자를 사용한 Tscm 세포의 전기천공을 사용하여 유사한 안정성 연구를 수행하였다(도 22b 및 도 22c와 도 22d 및 22e: 각각 pNKW87 및 pNKW59). 결과는 형질감염한지 72시간 후에도 형질감염된 Tscm 세포에서 CD19 CAR mRNA의 높은 안정성을 보여준다. 비형질감염 음성 대조군(도 22a)은 CD19 CAR 발현이 없음을 보여준다. CD19 CAR을 코딩하는 벡터는 도 23 및 도 24에 예시되어 있다.
실시예 6: 본 실시예는 CD30 pNKW95를 이용한 결과를 보여준다(도 25, 도 26a~도 26f 및 도 27). CD30α 항원을 표적화하는 CAR 분자를 CD28의 힌지, TM 및 공동자극 도메인과, CD3ζ 신호전달 도메인 및 150p-A를 포함하는 벡터로 설계하였다(도 25). 벡터를 SapI로 분해하고, 선형화된 DNA를 mRNA 생성용 주형으로 사용하였다. CENK 세포를 pNKW95 mRNA를 사용하여 전기천공하였다. 하룻밤 회복한 후, CD30 발현을 유세포 분석법 및 비오티닐화 CD30, 이어서 스트렙타비딘-APC를 사용하여 검출하였다. 스트렙타비딘-APC 염색 단독을 사용하여 검출 방법의 특이성을 확인하였다. 비형질감염 대조군(도 26a, 도 26b)은 CENK 세포에서 CD30의 내인성 발현이 없음을 보여준다. pNKW95가 유래된 원래의 플라스미드(pXL46)를 비교를 위해 사용하였다. pXL46에는 긴 폴리 A 테일이 없으므로 시험관 내 전사 중에 폴리 A 테일(50개 미만의 뉴클레오티드)을 부가하였다. 도 26e, 도 26f에서, pNK95는 원래의 구축물(pXL46: 도 26c, 도 26d)과 비교하여 더 높은 CD30 CAR 발현을 나타낸다. CD30 CAR을 코딩하는 벡터가 도 27에 예시되어 있다.

Claims (27)

  1. 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    상기 CAR은 T7 프로모터, 스페이서 서열, 신호 펩티드, 항원 결합 도메인, 힌지 영역, 막관통(TM) 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하고;
    상기 신호 펩티드는 분화 클러스터 64(CD64) 및/또는 IgG 중쇄 가변 유전자(IgGHv) 신호 펩티드를 포함하며;
    상기 항원 결합 도메인은 분화 클러스터 19(CD19), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7 상동체 4(B7H4), SARS-CoV-2 스파이크 및 분화 클러스터 30 알파(CD30α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합하는, CAR.
  2. 제1항에 있어서, 신호 펩티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2를 포함하는, CAR.
  3. 제1항에 있어서, CD19에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 4에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함하는, CAR.
  4. 제1항에 있어서, BCMA에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함하는, CAR.
  5. 제1항에 있어서, B7H4에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 7에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함하는, CAR.
  6. 제1항에 있어서, SARS-CoV-2 스파이크에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 8에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함하는, CAR.
  7. 제1항에 있어서, CD30α에 결합하는 항원 결합 도메인은 서열 번호 57에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 포함하는, CAR.
  8. 제1항에 있어서, 힌지 영역은 서열 번호 9를 갖는 분화 클러스터 28(CD28) 힌지 영역인, CAR.
  9. 제1항에 있어서, TM 도메인은 서열 번호 10을 갖는 CD28 TM 도메인인, CAR.
  10. 제1항에 있어서, 세포내 도메인은 서열 번호 11을 갖는 CD28 세포질 도메인을 포함하는 공동자극 도메인을 포함하는, CAR.
  11. 제1항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호 12를 갖는 분화 클러스터 3 제타(CD3ζ) 세포질 도메인을 포함하는, CAR.
  12. 제1항에 있어서, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22 및 서열 번호 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 최대 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  13. 제1항의 CAR을 코딩하는 핵산 구축물.
  14. 제13항에 있어서, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31 서열 번호 32 및 서열 번호 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 구축물.
  15. 제1항의 CAR을 코딩하는 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 및 서열 번호 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는, 발현 벡터.
  17. 변형된 일차 자연 살해(NK) 세포로서, 상기 변형된 일차 NK 세포는 T7 프로모터, 스페이서 서열, 신호 펩티드 서열 부분, 항원 결합 도메인 서열 부분, 힌지 영역 서열 부분, 막관통(TM) 도메인 서열 부분 및 세포내 도메인 서열 부분의 하나 이상의 핵산을 포함하는 RNA 분자로 변형되고;
    상기 신호 펩티드 서열은 분화 클러스터 64(CD64) 및/또는 IgG 중쇄 가변 유전자(IgGHv)를 코딩하는 서열을 포함하며;
    상기 항원 결합 도메인은 분화 클러스터 19(CD19), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7 상동체 4(B7H4), SARS-CoV-2 스파이크 및 분화 클러스터 30 알파(CD30α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합하는 항원 결합 부분을 코딩하는 서열을 포함하고;
    상기 핵산 서열들은 단일 폴리뉴클레오티드로서 서로 작동가능하게 연결된, 변형된 일차 NK 세포.
  18. 제17항에 있어서, 세포내 도메인 서열 부분은 서열 번호 11을 갖는 CD28 세포질 도메인 및/또는 서열 번호 12를 갖는 분화 클러스터 3 제타(CD3ζ) 세포질 도메인을 포함하는, 변형된 일차 NK 세포.
  19. 제17항에 있어서, 3' 비번역 영역(3'-UTR)을 추가로 포함하는, 변형된 일차 NK 세포.
  20. 제17항에 있어서, 폴리-A 서열 부분을 추가로 포함하는, 변형된 일차 NK 세포.
  21. 변형된 일차 CAR-NK 세포의 제조 방법으로서, 일차 NK 세포를 제13항의 재조합 핵산 구축물로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 면역요법 방법으로서, 대상체에게 제17항의 유전자 변형 NK 세포를 포함하는 제약 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 암은 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성(과립구) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성 적혈구 증가증(polycythemia vera), 림프종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨병, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄 질환, 육종 및 암종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 고형 종양(섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프혈관육종, 림프혈관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선암종, 피지선암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암(hepatoma), 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모 세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모 세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모 세포종 및 망막모 세포종 등)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  24. 제17항에 있어서, 암 치료에 사용하기 위한, 변형된 NK 세포.
  25. 제24항에 있어서, 암은 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성(과립구) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성 적혈구 증가증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨병, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 육종 및 암종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 고형 종양(섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프혈관육종, 림프혈관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선암종, 피지선암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모 세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모 세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모 세포종 및 망막모 세포종 등)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 NK 세포.
  26. 제17항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한, 변형된 NK 세포.
  27. 제17항의 변형된 NK 세포 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
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