KR20240032990A - 형질감염 효율이 향상된 메신저 rna 생산을 위한 효소 기반 시스템 - Google Patents

형질감염 효율이 향상된 메신저 rna 생산을 위한 효소 기반 시스템 Download PDF

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KR20240032990A
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브렛 모리모토
카이반 니아지
애니 신
리즈 게이서트
필립 티 류
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이뮤니티바이오, 인크.
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Abstract

메신저 RNA(mRNA)의 시험관내 전사(IVT)에 사용되는 단백질의 생산 방법으로서, 단백질은 mRNA가 그로부터 합성적으로 유래되고, 이어서 세포를 형질감염시키고 인코딩된 단백질을 생산하는 효율에 의해 순도 및 효능에 대해 평가되는, 방법.

Description

형질감염 효율이 향상된 메신저 RNA 생산을 위한 효소 기반 시스템
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은, 2021 년 9 월 16 일에 출원된 미국 가특허출원 번호 63/244,990에 대한 35 U.S.C. §119(e) 하의 우선권 이익을 주장한다. 미국 가특허출원 번호 63/244,990의 전체 개시내용은 본원에 참조로서 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 ST.26 XML 파일 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. "PAT005268_Sequence_Listing.xml"로 명명된 파일은 61000 바이트 크기를 갖고, 2022 년 9 월 12 일에 생성되었다. ST.26 XML 파일에 포함된 정보는 37 CFR §1.52(e)(5)에 의해 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
분야
본 개시내용은 신규하고 비용 효과적인 효소 생산 방법을 사용하는 시험관내 전사(IVT)를 통한 합성 메신저 RNA(mRNA) 생산에 관한 것이다.
COVID-19 팬데믹과 싸우는 것에서의 메신저 RNA-기반 백신의 최근 성공은 RNA 치료제의 효능을 입증하고 효율적인 mRNA 생산 방법에 대한 필요성을 강조했다. mRNA 생산 조건의 최적화는 mRNA 합성에 관여하는 핵심 단백질의 더 나은 수율, 증가된 mRNA 순도, 및 mRNA 양 및 품질을 평가하기 위한 개선된 분석 방법을 목표로 할 것이다. mRNA 합성에 최적화된 단백질은 mRNA 생산 효율 증가뿐만 아니라, 상업적으로 이용 가능한 단백질 자체의 비용 둘 모두로 인해 도움이 될 것이다. 임의의 전략의 핵심 요소에는 IVT에 사용되는 핵심 단백질의 재조합 발현을 위한 최적화된 플라스미드 작제물, 최적화된 단백질 생산 조건, 및 최적화된 단백질 정제 프로토콜이 포함될 것이다. 문헌[Hornblower & al. (2015) "Minding your caps and tailsㅡconsiderations for functional mRNA synthesis" New England Biolabs White Paper]은 mRNA에 대한 예시적인 시험관내 합성 계획을 기술한다. 치료 mRNA 합성에 사용하기 위한 임상 제조 등급 효소의 최적화된 생산 방법에 대한 필요가 여전히 존재한다.
mRNA의 시험관내 전사에서의 장치, 시스템 및 방법이 본원에 개시되며, 여기서 공정은 인간 질병 치료를 위한 임상적 관련 제제의 효과적이고 저렴한 로트 생산에 최적화되어 있다. 본원에 기재된 방법은 시험관내 전사(IVT)에 관여하는 핵심 단백질의 생산 개선에 관한 것이다. 개선에는 박테리아의 단백질 생산에 사용되는 발현 벡터 서열의 최적화가 포함된다. 방법에는 시간 및 온도를 비롯한 최적화된 생산 조건이 추가로 포함된다. 마지막으로, 방법에는 mRNA 품질 평가 수단이 포함되며, 여기서 mRNA 형질감염 및 인코딩된 단백질의 발현은 IVT 공정에 사용되는 단백질 성분의 품질에 대해 평가된다.
구현예에서, 최적화된 박테리아 발현 벡터는 발현 벡터 내로 개별적으로 클로닝되는 3 개의 IVT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 양태에서, 제1 DNA 서열, 또는 삽입물은 제1 박테리아 발현 벡터 내로 클로닝되며, 제1 삽입물은 T7 RNA 폴리머라제에 대한 유전자 서열을 포함한다. 삽입물은 폴리머라제 서열의 업스트림에 아라비노스 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 양태에서, 삽입물은 SEQ ID NO: 19로 구성된다. 양태에서, T7 RNA 폴리머라제에 대한 코돈 최적화된 유전자 서열은 SEQ ID NO: 22이다.
또다른 양태에서, 제2 유전자 서열은 제2 박테리아 발현 벡터 내로 클로닝되며, 삽입물은 우두 바이러스(Vaccinia Virus) 캡핑 효소(VVCE)의 D1 및 D12 서브유닛에 대한 유전자 서열을 포함한다. 삽입물은 D1 및 D12 서브유닛 상 업스트림에 아라비노스 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 삽입물은 아라비노스 프로모터의 바로 다운스트림에 리보솜 결합 부위(RBS)를 추가로 포함한다. 양태에서, 삽입물은 SEQ ID NO: 20으로 구성된다. 양태에서, VVCE의 D1 서브유닛에 대한 코돈 최적화된 유전자 서열은 SEQ ID NO: 23이다. 양태에서, VVCE의 D12 서브유닛에 대한 코돈 최적화된 유전자 서열은 SEQ ID NO: 24이다.
또다른 양태에서, 제3 삽입물은 제3 박테리아 발현 벡터 내로 클로닝되며, 삽입물은 폴리(A) 폴리머라제에 대한 유전자 서열을 포함한다. 삽입물은 폴리(A) 폴리머라제 서열의 업스트림에 아라비노스 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 양태에서, 삽입물은 SEQ ID NO: 21로 구성된다. 양태에서, 폴리(A) 폴리머라제에 대한 유전자 서열은 SEQ ID NO: 25이다.
또다른 양태에서, 박테리아는 단백질 발현 및 후속 정제를 위한 발현 벡터를 함유한다. 일부 경우에, 단백질 성장 및 정제를 위한 조건은 발현 플라스미드 내로 클로닝된 삽입물로의 변형에 의해 가능하게 되었다. 이러한 변형에는 단백질-인코딩 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 아라비노스 프로모터를 배치하는 것이 포함된다. 또다른 변형에는, D1 서브유닛의 업스트림에 하나의 프로모터 그리고 D12 서브유닛의 업스트림에 제2 프로모터로, VVCE의 업스트림에 2 개의 아라비노스 프로모터를 배치하는 것이 포함된다. 추가 변형에는 His 태그를 인코딩하는 핵산 서열 추가가 포함되며, 여기서 중합체성 히스티딘은 단백질 서열 인-프레임으로 인코딩되고 N 또는 C 말단에 배치되며, 이로써 단백질이 발효 후 컬럼 정제될 수 있다. 추가 변형에는 담배 식각 바이러스(Tobacco Etch Virus) 프로테아제 서열의 추가가 포함되며, 이로써 His 태그 서열은 단백질 정제 이후에 단백질분해로 제거될 수 있다.
양태에서, 정제된 단백질은 시험관내 전사 반응에 순차적으로 첨가된다. 먼저, 정제된 T7 RNA 폴리머라제가 관심 mRNA 전사체를 인코딩하는 선형화된 플라스미드 DNA를 포함하는 반응에 첨가된다. 이로써 T7 RNA 폴리머라제의 작용을 통해 선형화된 DNA로부터 RNA가 전사된다. 제2 반응은 제1 반응으로부터의 RNA 전사체, S-아데노실 메티오닌, 및 정제된 VVCE를 포함한다. 이로써 RNA 전사체는 N-말단에서 캡핑되어 캡 0 mRNA를 생성한다. 제3 반응은 VVCE 반응으로부터의 캡핑된 mRNA, 정제된 폴리(A) 폴리머라제, 및 ATP를 포함하며, 이로써 폴리-아데닐화된 꼬리가 캡핑된 mRNA 전사체의 3' 말단에 추가된다.
첨부 도면과 함께 바람직한 구현예에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 다양한 목적, 특징, 양태 및 이점이 보다 명백해질 것이며, 도면에서 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
도 1은 mRNA의 구조적 특징을 도시한다. 문헌[Vaccines(2020) 5:11]으로부터의 도면. mRNA 발현 성능을 좌우하는 중대한 품질 속성이 도시되어 있다. 관심 유전자의 효율적인 발현을 좌우하는 다섯 가지 중대한 품질 속성이 확인된다. 이들 속성 중 세 가지는 효소의 사용을 요구한다: 전사(T7 RNA 폴리머라제); 캡핑(구아닐일트랜스퍼라제); 및 폴리(A) 꼬리 첨가(폴리(A) 폴리머라제). 현재로서는, IVT를 위해 이들 세 가지 핵심 효소가 구입되어야 한다.
도 2: T7 폴리머라제 발현 작제물. T7 프로모팅 시스템으로부터의 누출(leaky) 발현은 독성 단백질 효과를 유발하여 유전자 서열에서의 돌연변이로 이어졌다. 엄격하게 조절되는 프로모터로의 전환은 제안된 유전자 클로닝을 가능하게 했다.
도 3a, 도 3b 및 도 3c: T7 프로모터를 아라비노스 프로모터로 교체하는 것은 BL21 DE3 클리어 콜라이(Clear Coli)에서의 성장 및 단백질 발현을 가능하게 한다. 최적화된 성장 조건이 도시된다. 도 3a는 사용된 발현 작제물을 도시한다. T7 프로모팅 시스템으로부터의 누출 발현은 독성 단백질 효과를 유발하여 유전자 서열에서의 돌연변이로 이어졌다. 엄격하게 조절되는 프로모터로의 전환은 제안된 유전자 클로닝을 가능하게 했다 도 3b는 4 시간 발효에서의 단백질 겔 결과를 도시한다. 도 3c는 밤새(O/N) 발효에서의 단백질 겔 결과를 도시한다. 각각의 쿠마시(Coomassie) 염색된 단백질 겔에서: 레인 0 단백질 사다리; 레인 1 세포 펠렛; 레인 2 상청액; 레인 3 플로우-쓰로우(flow through); 레인 4 세척; 레인 5 세척 2; 레인 6 이미다졸 세척; 레인 7 용리 1; 레인 8 용리 2; 레인 9 용리 3; 레인 10 용리 4, 레인 11 용리 5; 레인 12 용리 6; 레인 13 용리 7.
도 4a 및 도 4b: T7 프로모터 뒤에서 발현될 때의 불량한 VVCE 가용성의 입증. 도 4a는 사용된 발현 작제물을 도시한다. BL21 DE3 클리어 콜라이에서의 단백질 발현. 단백질 겔에 도시된 결과(도 4b). 쿠마시 염색된 단백질 겔에서: 레인 0 단백질 사다리; 레인 1 세포 펠렛; 레인 2 상청액; 레인 3 플로우-쓰로우; 레인 4 세척; 레인 5 이미다졸 세척; 레인 6 용리 1; 레인 7 용리 2; 레인 8 용리 3; 레인 9 용리 4, 레인 10 용리 5. T7 프로모터 뒤에서 발현될 때 효소의 가용성이 저해되었다.
도 5a 및 도 5b: T7 프로모터가 아라비노스 프로모터로 교체될 때 VVCE D1 및 D12 서브유닛의 개선된 가용성. 도 5a는 사용된 발현 작제물을 도시한다. BL21 DE3 클리어 콜라이에서의 단백질 발현(도 5c). 쿠마시 염색된 단백질 겔에서: 레인 0 단백질 사다리; 레인 1 세포 펠렛; 레인 2 상청액; 레인 3 플로우-쓰로우; 레인 4 세척 1; 레인 5 세척 2; 레인 6 이미다졸 세척; 레인 7 용리 1; 레인 8 용리 2; 레인 9 용리 3; 레인 10 용리 4, 레인 11 용리 5. T7 프로모터 뒤에서 발현될 때 효소의 가용성이 저해되었다. 엄격하게 조절되는 프로모터로의 전환 및 발현 속도를 늦추는 것은(18℃) 가용성을 개선시켰다.
도 6a 및 도 6b: 아라비노스 프로모터의 추가는 BL21 DE3 클리어 콜라이에서의 성장 및 불용성 폴리(A) 폴리머라제의 발현을 가능하게 한다. 도 6a는 사용된 발현 작제물을 도시한다. 쿠마시 염색된 단백질 겔에서(도 6b): 레인 0 단백질 사다리; 레인 1 세포 펠렛; 레인 2 상청액; 레인 3 플로우-쓰로우; 레인 4 세척 1; 레인 5 세척 2; 레인 6 이미다졸 세척; 레인 7 용리 1; 레인 8 용리 2; 레인 9 용리 3; 레인 10 용리 4, 레인 11 용리 5. 과발현된 단백질은 약 43 kD이다. 단백질 발현은 가용성이 없는 절두된 효소를 생산했다.
도 7a 및 도 7b: UUG 시작 코돈을 갖는 폴리(A) 폴리머라제 유전자는 적절한 크기 및 양호한 가용성을 갖는 단백질의 발현을 가능하게 했다. BL21 DE3 클리어 콜라이에서의 발현. 도 7a는 사용된 발현 작제물을 도시한다. 도 7b 아닛(anit)-His를 사용한 웨스턴 블롯. 레인 0 단백질 사다리; 레인 1 세포 펠렛; 레인 2 상청액; 레인 3 플로우-쓰로우; 레인 4 세척 1; 레인 5 세척 2; 레인 6 이미다졸 세척; 레인 7 용리 1; 레인 8 용리 2; 레인 9 용리 3. 단백질 발현은 가용성이 없는 절두된 효소를 생산했다. 비통상적 시작 코돈 및 전사 조절 서열의 추가는 효소의 적절한 발현을 가능하게 했다.
도 8: 형질감염 준비된 mRNA 생산 작업흐름.
도 9a, 도 9b, 도 9c, 도 9d, 도 9e, 및 도 9f: 유세포분석 히스토그램 분석. 개선된, 클리어 콜라이-발현된 시험관내 전사 효소 대 상업적 시험관내 전사 효소의 성능 비교. IVT GFP-mRNA로 형질감염된 293T 세포에서의 GFP 발현 검출이 도표로 나타난다. 나타난 도표는 3 회 반복의 대표값이다.
도 10a 및 도 10b: 개선된, 클리어 콜라이-발현된 시험관내 전사 효소 대 상업적 시험관내 전사 효소의 성능 비교. 다양한 효소를 사용하여 생산된 IVT GFP-mRNA의 형질감염 결과. 도 10a는 평균 GFP 양성 백분율을 도시한다. 도 10b는 평균적 기하 평균 형광 강도를 도시한다. 각각의 그래프에서, RNA 샘플은 다음과 같다: (1) 형질감염되지 않은 293t; (2) 변형 없는 시험관내 전사체; (3) 5' 캡을 갖는 시험관내 전사체; (4) 꼬리를 갖고 캡핑되지 않은 하이스크라이브(HiScribe) 전사체; (5) ARCA로 캡핑된 하이스크라이브 전사체; (6) NEB VVCE로 캡핑된 하이스크라이브 전사체; (7) 내부 자체(in house) 효소로 생산된 mRNA 전사체(화살표).
개시된 성분, 조성물, 시스템, 키트, 및 방법은 무-세포 메신저 RNA(mRNA) 합성을 수행하기 위해 활용될 수 있다. 시험관내 전사(IVT)를 사용한 무-세포 mRNA 합성은 형질감염된 박테리아 세포의 용해물로부터 제조된 촉매 단백질 세트를 이용한다. 정제된 단백질은 IVT 반응의 필수 성분을 포함한다. 본원에 기재된 방법을 포함하여, 무-세포 mRNA 합성에 적합한 단백질을 제조하기 위한 다양한 방법이 존재한다.
본원에 식별된 모든 특허 및 공개 출원은 마치 각각의 개별 특허 또는 출원이 참조로서 포함된다고 명확하고 개별적으로 표시된 것과 같은 정도로 참조로서 포함된다. 포함된 참고문헌에서의 용어의 정의 또는 사용이 본원에 제공된 해당 용어의 정의와 일치하지 않거나 반대되는 경우, 본원에 제공된 해당 용어의 정의가 적용되고 참고문헌에서의 해당 용어의 정의는 적용되지 않는다.
정의
일부 구현예에서, 일정 구현예를 기술하고 청구하는 데 사용되는, 성분의 양, 농도, 반응 조건 등과 같은 특성을 표현하는 숫자는 일부 경우에 용어 "약"으로 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 서면 기재 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치적 파라미터는 구체적인 구현예에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 일부 구현예에서, 수치적 파라미터는 보고된 유효숫자의 개수를 고려하고 일반적인 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다. 일부 구현예의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치 값은 실시 가능한만큼 정확하게 보고된다. 일부 구현예에 제시된 수치 값은 그들 각각의 테스트 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 기인되는 일정 오차를 포함할 수 있다.
문맥상 반대로 지시되지 않는 한, 본원에 제시된 모든 범위는 그들의 종점을 포함하는 것으로 해석되어야 하며 개방형 범위는 상업적으로 현실적인 값 만을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게, 모든 값 목록은 문맥상 반대로 표시되지 않는 한 중간 값을 포함하는 것으로 고려되어야 한다.
본원의 설명 및 다음의 청구범위 전반에 걸쳐 사용된, 단수형("a", "an", 및 "the")의 의미는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다. 또한, 본원의 설명에서 사용된, "~에(서)"("in")의 의미는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 "~내에(서)"("in") 및 "~ 상에(서)"("on")을 포함한다.
본원에서 값의 범위 열거는 단지 범위 내에 속하는 각각의 별개 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법으로서의 역할을하는 것으로 의도된다. 본원에 달리 표시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 그것이 본원에 개별적으로 열거된 것처럼 명세서 내에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 표시되거나 문맥상 명확하게 달리 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원의 일정 구현예와 관련하여 제공된 모든 예, 또는 예를 들 때 쓰는 언어(예를 들어, "와 같은")의 사용은 단지 설명하는 것으로 의도되며 청구된 발명의 범위에 제한을 두지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 청구된 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지-않은 요소를 가리키는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 대안적 요소 또는 구현예의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 발견되는 다른 요소와의 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 편의 및/또는 특허성의 이유로 그룹의 하나 이상의 구성원이 그룹에 포함되거나, 그룹으로부터 삭제될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 삭제가 발생하는 경우, 명세서는 본원에서 수정된 그룹을 포함하여 첨부된 청구범위에서 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹에 대한 서면 기재를 충족하는 것으로 간주된다.
발현 벡터
본원에 기재된 하나 이상의 mRNA를 인코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터가 제공된다. 본원에 사용된, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 일 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 효용이 있는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 개시된 방법 및 조성물은, 동등한 기능을 수행하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.
메신저 RNA
mRNA 형질감염된 세포에서 발현된 단백질의 발현 수준에 의해 결정된 바와 같이, mRNA 생산 공정에서 상업적으로 구입한 효소 T7 RNA 폴리머라제, VVCE, 및 폴리(A) 폴리머라제가 내부 자체 생산된 효소로 교체되었을 때 놀랍게도 mRNA 품질이 증가한다. 효소 생산은 플라스미드 발현 벡터를 이용한 박테리아의 형질감염을 수반하며 여기서 관심 단백질을 인코딩하는 유전자는 형질감염된 유전자의 발현을 추진하는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 도 1은 mRNA의 주요 속성을 도시한다.
프로모터 서열은 박테리아에서 단백질 발현을 추진하는 데 적합한 임의의 프로모터일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 프로모터는 아라비노스 프로모터이다. 플라스미드 발현 벡터 내로 삽입되는 유전자 서열의 추가 조작에는 단백질을 식별하고/하거나 정제할 수 있는 태그의 사용이 포함된다. 바람직한 구현예에서, 관심 단백질을 인코딩하는 유전자는 단백질의 5' 또는 3' 말단에서 인-프레임으로 중합체성 히스티딘(His) 태그를 인코딩하는 서열에 연결된다. His 태그는 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제 인식 서열에 의해 관심 유전자로부터 분리될 수 있으며, 이로써 TEV가 단백질에 첨가되어 His 태그를 절단해낼 수 있다.
T7 RNA 폴리머라제의 발현을 추진하는 아라비노스 프로모터로 T7 프로모터를 교체하는 것(도 2 및 도 3a 내지 도 3c)은 BL21 DE3 클리어 콜라이 세포의 성장을 가능하게 하고, 그 안에서 이종 단백질 발현을 추진하는 것으로 나타났다. 발효 시간을 4 시간에서 밤새(18 시간)로 증가시키는 것 역시 단백질 발현을 증가시켰다. VVCE의 D1 및 D12 서브유닛 발현을 추진하는 T7 프로모터를 아라비노스 프로모터로 유사하게 교체하는 것은 서브유닛의 발현을 가능하게 했다(도 4a 및 도 4b 및 도 5a 및 도 5b). 18℃에서 단백질 발현을 수행하는 것 역시 단백질 발현을 개선시켰다.
IVT 단백질의 생산을 위한 서열은 단백질 인코딩 서열에 대안적 시작 코돈을 추가함으로써 추가로 변형될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 대안적 시작 코돈은 폴리(A) 폴리머라제의 N-말단에 연결된다. 폴리(A) 폴리머라제의 이러한 비통상적 UUG 시작 코돈은 문헌[Cao & Sarkar(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 89, pp. 10380-10384, November 1992)]에서 처음 상정되었다. UUG 시작 코돈을 포함하는 N-말단 서열(SEQ ID NO: 21)은 SEQ ID NO: 25의 야생형 단백질 서열에 대해 아미노산 위치 11의 라이신 바로 업스트림에 인-프레임으로 인코딩된다.
IVT 단백질 생산을 위한 발현 플라스미드 삽입 서열은 신규 프로모터 서열을 사용함으로써 추가로 변형될 수 있다. 놀랍게도, 아라비노스 프로모터는 VVCE의 가용성, 및 그에 따라 이.콜라이(E.coli)에서 발현되는 VVCE의 수율을 유의미하게 향상시킨다. 또한 놀랍게도, T7 RNA 폴리머라제 및 폴리(A) 폴리머라제의 업스트림에 T7 프로모터를 사용함에 따라 표준 기술에 의해 박테리아에서 성공적으로 증식할 수 있는 클론 발현 플라스미드를 생성할 수 없게 되었기 때문에, T7 RNA 폴리머라제 및 폴리(A) 폴리머라제 유전자를 발현 벡터 내로 클로닝하는 것 자체가 두 단백질 모두의 시작 코돈 업스트림에 아라비노스 프로모터를 배치함으로써 가능했다.
단백질 수율과 관련하여 T7 RNA 폴리머라제의 생산이 최적화되는 방법이 본원에 개시되어 있다. 발현 플라스미드를 BL21 DE3 클리어 콜라이 내로 형질감염시킨 후, 발효 온도를 18℃까지 감소시켰고 시간을 18 시간까지 연장시켰다. 도 7은 이들 발효 조건을 적용했을 때 가용성 T7 RNA 폴리머라제 수율의 증가를 도시한다.
본원에 기재된 하나 이상의 mRNA를 인코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터가 제공된다. 본원에 사용된, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 일 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 효용이 있는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 개시된 방법 및 조성물은, 동등한 기능을 수행하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.
박테리아에서 T7 RNA 폴리머라제, VVCE, 및 폴리(A) 폴리머라제의 생산을 최적화하고, 표준 방법에 의해 단백질을 정제하고 특징확인한 후, 단백질을 순차적인 일련의 반응에 적용함으로써 관심 유전자를 함유하는 선형화된 플라스미드 DNA가 전사되고 캡핑되고, 폴리-아데노신 꼬리가 추가된다. DNA가 삽입된 플라스미드는 바이러스, 원핵생물, 또는 진핵생물에서의 증식에 적절할 수 있다.
주형 DNA는 전형적으로 슈퍼코일 플라스미드 DNA로서 증식되고 저장된다. 플라스미드 DNA는 하나 이상의 제한 효소의 작용을 통해 선형화됨으로써, 관심 유전자가 제거되거나, 원형 플라스미드 DNA로부터 절제된다. 전형적으로 고유한 제한 부위는 관심 유전자의 5' 및 3' 말단에 일어난다. 제한 부위는 동일 또는 상이할 수 있다. 관심 유전자 내의 제한 부위를 인식하지 않는다면 어떠한 제한 효소라도 사용될 수 있다. 이후 선형화된 DNA는 컬럼 정제를 통해 단리되지만, 에탄올이나 이소프로판올 침전과 같은 기타 표준 방법이 사용될 수 있다. 이후 유전자 서열을 포함하는 정제된 선형화된 DNA는 크기 결정을 통해 단리되고 분광 광도법으로 정량화된다. 이후 1 μG 주형 DNA가 뉴클레오티드 트리포스페이트(ATP, CTP, GTP, 및 UTP) 및 정제된 T7 RNA 폴리머라제를 포함하는 반응에 첨가된다. 반응은 열 순환기에서 37℃에서 밤새 진행된다. 이후 RNA 전사체가 컬럼 정제되고 분광광도법을 통해 정량화된다.
RNA 전사체를 캡 0 RNA로 전환하는 것은 3 개의 순차적인 효소 단계를 필요로 한다: RNA 트리포스파타제 활성(TPase)에 의한 5' 말단 g-포스페이트 제거, RNA 구아닐일트랜스퍼라제 활성(GTase)에 의한 GMP 그룹의 생성된 디포스페이트 5' 말단으로의 전달 및 구아닌-N7메틸트랜스퍼라제 활성(MTase)에 의한 구아노신 캡의 N7 아민 변형. 우두 바이러스 캡핑 효소는 D1 및 D12 서브유닛으로 구성되며, 3 개의 효소 단계 모두는 D1 서브유닛에 의해 수행된다. 이후 정제되고 정량화된 RNA 전사체(10 μg)는 GTP, s-아데노실 메티오닌, 및 정제된 VVCE를 포함하는 반응에 첨가된다. 이후 반응은 37℃에서 1 시간 동안 진행된다. 캡핑된 RNA는 이후 컬럼 정제되고 분광광도법으로 정량화된다.
폴리아데닐화는 mRNA 전사체에 폴리(A) 꼬리를 추가하는 것이다. 폴리(A) 꼬리는 mRNA의 핵 탈출, 번역 및 안정성에 중요하다. mRNA의 시험관내 생산에서 마지막 단계는 캡핑된 전사체에 폴리(A) 꼬리를 추가하는 것이다. ATP 및 정제된 폴리(A) 폴리머라제를 포함하는 반응에 캡핑된 mRNA(10 μg) 전사체가 첨가되고, 반응은 37℃에서 1 시간 동안 진행된다. 캡핑된, 폴리아데닐화된 mRNA 전사체는 이후 컬럼 정제되고 분광광도법으로 정량화된다. 정제된 mRNA는 즉시 사용하거나 -80℃ 이하에서 동결되어야 한다.
mRNA 작업흐름의 개요는 도 8에 도시되어 있다. 이에 의해 유래된 mRNA는 세포(시험관내 형질감염) 또는 조직(생체내 형질감염)으로의 전달을 위해 제형화될 수 있다. 임의의 적합한 제형이 사용될 수 있다. 예시적인 나노입자 제형이 US 16/622,908에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 도 9a 내지 도 9f에 제시된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 mRNA 인코딩된 단백질의 전달 및 발현을 평가하며, 여기서 HEK293 세포가 형질감염되고 유세포분석을 통해 평가된다. 도 10a 및 도 10b는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(NEW ENGLAND BIOLABS)®로부터 구매 가능한 VVCE 단백질을 사용하여 캡핑된 상업적으로 이용 가능한 RNA 전사체에 비해 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 mRNA의 개선된 단백질 수율을 도시된다.
개시된 기술은 IVT 핵심 단백질 T7 RNA 폴리머라제, 우두 바이러스 캡핑 효소, 및 폴리(A) 폴리머라제의 증가된 생산뿐만 아니라 이에 의해 생산된 mRNA 전사체로부터 유래된 단백질 생성물의 증가된 수율을 포함하는 많은 유리한 기술적 효과를 제공한다는 것을 인식해야 한다.
실시예
아라비노스 프로모터 삽입물의 제조. 아라비노스 프로모터를 증폭하는 데 사용되는 PCR을 위한 주형으로서 pBAD-DEST49 DNA 플라스미드를 사용하였다. SEQ ID NO: 1(정방향) 및 SEQ ID NO: 2(역방향) 프라이머를 사용하여 아라비노스 프로모터를 증폭시켰다. 증폭 믹스는 다음을 포함했다(반응 당): 5 x 프라임스타(PRIMESTAR)® GXL 폴리머라제 완충액 10 μL; 4 μL DNTP; 10 μM 정방향 프라이머 1 μL; 10 μM 역방향 프라이머 1 μL; pBAD-DEST49 50 ng; 프라임스타® GXL 폴리머라제 1 μL; 및 최종 부피 50 μL가 될 때까지 밀리-큐(MILLI-Q)® 물. 아라비노스 삽입물의 증폭을 위해 다음 조건을 사용하였다: 2 분 동안 98℃; 20 초 동안 98℃(x 30 사이클); 15 초 동안 55℃(x 30 사이클); 90 초 동안 68℃(x 30 사이클); 및 1 분 동안 68℃. PCR 산물은 키아퀵(QIAQUICK)® PCR 스핀 컬럼을 사용하여 정제하였다.
그런 다음 정제된 PCR 산물을 프라이머 SEQ ID NO: 3 및 4를 사용하는 또다른 PCR에 사용했다. 증폭 혼합물은 다음을 포함했다(반응 당): 5 x 프라임스타® GXL 폴리머라제 완충액 10 μL; 4 μL DNTP; 10 μM 정방향 프라이머 1 μL; 10 μM 역방향 프라이머 1 μL; pBAD-DEST49 50 ng; 프라임스타 ® GXL 폴리머라제 1 μL; 최종 부피 50 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물. 아라비노스 삽입물의 증폭을 위해 다음 조건을 사용하였다: 2 분 동안 98℃; 20 초 동안 98℃(x 30 사이클); 15 초 동안 60℃(x 30 사이클); 90 초 동안 68℃(x 30 사이클); 및 1 분 동안 68℃. 그런 다음 깁슨 어셈블리(Gibson assembly) 핸들을 갖는 아라비노스 프로모터 삽입물을 겔 추출하고 키아젠(QIAGEN)® 겔 추출 키트를 사용하여 정제했다.
BglIII 제한 분해(Digest) 프로토콜. 뉴 잉글랜드 바이오랩스®에서 구입한 BglIII 제한 효소를 사용하여 pET22b 락토스 유도 발현 시스템을 분해하였다. pET22b 및 BglIII 제한 분해에 대해 다음과 같이 2 개의 개별 반응을 완료하였다(반응 당): 완충액 3.1 10 μL; 3 μL BglIII 제한 효소; 46 μL pET22b DNA; 밀리-큐® 물 41 μL. 그런 다음 각각의 반응을 열 순환기에서 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 500 μL의 완충액 PB를 각각의 반응에 첨가했다. 완충액 PB 및 제한 분해 혼합물을 키아젠®에서 구입한 2 개의 개별 미니 프렙(mini prep) 컬럼에 첨가했다. 컬럼을 15000 x g로 1 분 동안 회전시키고 플로우-쓰로우를 버렸다. 각각의 컬럼에 에탄올 함유 완충액 PE 1 mL를 첨가했다. 컬럼을 다시 15000 x g로 1 분 동안 회전시키고 플로우-쓰로우를 버렸다. 컬럼을 15000 x g로 2 분 동안 회전 건조시켰다. 그런 다음 컬럼을 새로운 미세원심분리 튜브로 옮겼다. 50 μL의 밀리-큐® 물을 각각의 컬럼에 첨가하고 15000 x g로 2 분 동안 회전시켰다.
Xba1 제한 분해 프로토콜. 정제 및 분해된 물질 50 μL를 다음 프로토콜(반응 당)을 이용하는 Xba1 사용 분해에 사용하였다: 컷스마트(CUTSMART)® 완충액 9 μL; Xba1 3 μL; BglIII 분해된 물질 50 μL; 및 밀리-큐® 물 28 μL. 반응물을 열 순환기에서 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 안타크틱(Antarctic) 포스파타제를 첨가했다(10 μL/반응 안타크틱 포스파타제 완충액 & 2 μL/반응 안타크틱 포스파타제). 그런 다음 반응 혼합물을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 분해된 벡터를 키아젠 ® 겔 추출 정제 키트를 사용하여 겔 추출 및 정제하였다.
깁슨 어셈블리® 프로토콜. 분해 및 정제된 벡터 100 ng을 반응을 위해 준비하였다. 증폭 및 정제된 프로모터 70 ng도 반응을 위해 준비하였다. 각각의 반응은 깁슨 어셈블리®에 사용되는 총 DNA 0.1 pmol만 함유했다. 벡터 DNA와 삽입물 DNA를 최종 부피 10 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물과 혼합했다. 그런 다음 2 x NEB HIFI 어셈블리 마스터 믹스(뉴 잉글랜드 바이오랩스®에서 구함) 10 μL를 반응 혼합물에 첨가했다. 그런 다음 준비된 깁슨 어셈블리® 반응물을 열 순환기에서 50℃에서 15 분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 기간 후, 이어서 NEB5α 초수용 세포를 사용하여 반응 혼합물 8 μL를 형질전환했다. pET22b 발현 플라스미드 내로 클로닝된 아라비노스 프로모터를 갖는 형질전환된 세포를 사용하여 플라스미드 DNA를 증폭시킨 다음 키아젠® 맥시 프렙(Maxi Prep) 정제 시스템을 사용하여 회수했다.
T7 RNA 폴리머라제 발현 시스템의 생성을 위한 pBM100의 클로닝. 깁슨 핸들뿐만 아니라 포함된 6x His 태그를 갖는 RNA 폴리머라제를 SEQ ID NO: 5 및 6을 프라이머로 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 반응 혼합물은 다음을 포함했다(반응 당): 5 x 프라임스타® GXL 폴리머라제 완충액 10 μL; 4 μL DNTP; 10 μM 정방향 프라이머 1 μL; 10 μM 역방향 프라이머 1 μL; RNA 폴리머라제 DNA 50 ng; 및 프라임스타® GXL 폴리머라제 1 μL. RNA 폴리머라제 삽입물을 증폭하기 위한 PCR은 다음과 같이 완료하였다: 2 분 동안 98℃; 20초 동안 98℃(x 30 사이클); 15 초 동안 60℃(x 30 사이클); 120 초 동안 68℃(x 30 사이클); 및 1 분 동안 68℃. 그런 다음 완료된 PCR을 키아퀵® PCR 스핀 컬럼을 사용하여 정제하였다. 다음 효소를 사용하는 이중 제한 분해에 20 μg의 pBM98을 사용하였다: 다음의 반응 레시피(반응 당)를 사용하는 Nde1 및 Nco1-HF: 컷스마트® 완충액 90 μL; Nco1-HF 1 μL; Nde1 1 μL; RNA 폴리머라제 DNA 20 μg; 및 최종 부피 90 μL가 될 때까지 물. 그런 다음 제한 분해물을 열 순환기에서 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 안타크틱 포스파타제를 첨가했다(10 μL/반응 안타크틱 포스파타제 완충액 및 2 μL/반응 안타크틱 포스파타제). 그런 다음 반응 혼합물을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 분해된 벡터를 키아젠® 겔 추출 정제 키트를 사용하여 겔 추출 및 정제하였다.
깁슨 어셈블리® 반응을 위해 분해 및 정제된 벡터 100 ng을 준비했다. 반응을 위해 증폭 및 정제된 RNA 폴리머라제 삽입물 126 ng도 준비했다. 각각의 깁슨 어셈블리® 반응에는 0.1 pmol 이하의 총 DNA를 사용하였다. 벡터 DNA 및 삽입물 DNA를 최종 부피 10 μ가 될 때까지 밀리-큐® 물과 혼합했다. 그런 다음 2 x NEB HIFI 어셈블리 마스터 믹스(뉴 잉글랜드 바이오랩스®에서 구함) 10 μL를 각각의 반응 혼합물에 첨가했다. 준비된 깁슨 어셈블리® 반응물을 열 순환기에서 50℃에서 15 분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 기간 후, 이어서 NEB5α 초수용 세포를 사용하여 반응 혼합물 8 μL를 형질전환했다. 아라비노스 프로모팅되는 발현 플라스미드 내로 클로닝된 T7 RNA 폴리머라제를 갖는 형질전환된 세포를 사용하여 플라스미드 DNA를 증폭시킨 다음 키아젠® 미니 프렙 정제 시스템을 사용하여 회수했다.
이중 아라비노스 프로모팅 발현 플라스미드의 생성. 우두 바이러스 캡핑 효소 D1, 및 D12 서브유닛의 클로닝을 위해 이중 발현 아라비노스 프로모팅 시스템을 생성하였다. 다음 프로토콜(반응 당)을 사용하여 Xba1로 pET-듀엣(Duet) 정제된 플라스미드를 분해하였다: 컷스마트® 완충액 9 μL; Xba1 3 μL; 10 μg pET-듀엣 플라스미드; 최종 부피 90 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물. 반응물을 열 순환기에서 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 안타크틱 포스파타제를 첨가했다(10 μL/반응 안타크틱 포스파타제 완충액 & 2 μL/반응 안타크틱 포스파타제). 그런 다음 반응 혼합물을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.
그런 다음 키아젠® 겔 추출 정제 키트를 사용하여 분해된 벡터를 겔 추출하고 정제했다. 그런 다음 SEQ ID NO: 1 및 2를 프라이머로 사용하고, 다음의 반응 혼합물(반응 당)을 사용하여 아라비노스 프로모터 삽입물을 pBM98로부터 증폭시켰다: 5 x 프라임스타® GXL 폴리머라제 완충액 10 μL; 4 μL DNTP; 10 μM 정방향 프라이머 1 μL; 10 μM 역방향 프라이머 1 μL; pBM98 50 ng; 프라임스타® GXL 폴리머라제 1 μL; 및 최종 부피 50 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물. 아라비노스 삽입물의 증폭을 위해 다음 조건을 사용하였다: 2 분 동안 98℃; 20 초 동안 98℃(x 30 사이클); 15 초 동안 55℃(x 30 사이클); 90 초 동안 68℃(x 30 사이클); 및 1 분 동안 68℃. PCR 산물을 키아퀵® PCR 스핀 컬럼을 사용하여 정제하였다.
그런 다음 SEQ ID NO: 7 및 8을 프라이머로서 사용하는 또다른 PCR에 정제된 PCR 산물을 사용하였다. 이 PCR 산물은 아라비노스 프로모팅 시스템을 갖는 다중 클로닝 부위 #1을 생성하기 위해 깁슨 어셈블리®에 사용하였다. 깁슨 어셈블리® 반응을 위해 분해 및 정제된 벡터 100 ng을 준비했다. 반응을 위해 증폭 및 정제된 프로모터 70 ng도 준비했다. 깁슨 어셈블리®에는 0.1 pmol 이하의 총 DNA를 사용하였다. 벡터 DNA 및 삽입물 DNA를 최종 부피 10 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물과 혼합했다. 그런 다음 2 x NEB HIFI 어셈블리 마스터 믹스(뉴 잉글랜드 바이오랩스®에서 구함) 10 μL를 반응 혼합물에 첨가했다. 그런 다음 준비된 깁슨 어셈블리® 반응물을 열 순환기에서 50℃에서 15 분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 기간 후, 이어서 NEB5α 초수용 세포를 사용하여 반응 혼합물 8 μL를 형질전환했다. pET-듀엣 이중 발현 플라스미드 내로 클로닝된 아라비노스 프로모터를 갖는 형질전환된 세포를 사용하여 플라스미드 DNA를 증폭시킨 다음 키아젠® 미디(Midi) 프렙 정제 시스템을 사용하여 회수했다. 생성된 플라스미드는 MCS1에는 아라비노스 프로모터 존재 및 MCS2에는 T7 프로모터 존재를 표시하기 위해 pBM122로 표지하였다.
그런 다음 새롭게 작제된 플라스미드를 사용하여 다운스트림 T7 프로모터를 또다른 아라비노스 프로모팅 삽입물로 교체하였다. 다음 반응 믹스(반응 당)와 함께 효소 Bsrg1-HF 및 Nde1을 사용하여 준비된 플라스미드 상에서 이중 제한 분해를 완료시켰다: 컷스마트® 완충액 9 μL; Bsrg1-HF 1.5 μL; Nde1 1.5 μL; pBM122 30 μg; 및 최종 부피 90 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물.
제한 분해물을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 안타크틱 포스파타제를 첨가했다(10 μL/반응 안타크틱 포스파타제 완충액 & 2 μL/반응 안타크틱 포스파타제). 그런 다음 반응 혼합물을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 분해된 벡터를 키아젠® 겔 추출 정제 키트를 사용하여 겔 추출 및 정제하였다. 아라비노스 프로모터는 SEQ ID NO: 1 및 2를 프라이머로서 사용하여 제조하였다. 다음의 프로토콜(반응 당)을 사용하여 PCR을 완료했다: 5 x 프라임스타® GXL 폴리머라제 완충액 10 μL; 4 μL DNTP; 10 μM 정방향 프라이머 1 μL; 10 μM 역방향 프라이머 1 μL; pBM98 50 ng; 프라임스타® GXL 폴리머라제 1 μL; 및 최종 부피 50 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물. 아라비노스 삽입물의 증폭을 위해 다음 조건을 사용하였다: 2 분 동안 98℃; 20 초 동안 98℃(x 30 사이클); 15 초 동안 55℃(x 30 사이클); 90 초 동안 68℃(x 30 사이클); 및 1 분 동안 68℃. PCR 산물은 키아퀵® PCR 스핀 컬럼을 사용하여 정제하였다.
그런 다음 프라이머 SEQ ID NO: 9 및 10을 사용하는 또다른 PCR 증폭에 정제된 PCR 산물을 사용하였다. 각각의 PCR 반응은 다음을 포함했다: 5 x 프라임스타® GXL 폴리머라제 완충액 10 μL; 4 μL DNTP; 10 μM 정방향 프라이머 1 μL; 10 μM 역방향 프라이머 1 μL; 제조된 PCR 산물 50 ng; 프라임스타® GXL 폴리머라제 1 μL; 및 최종 부피 50 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물. 아라비노스 삽입물의 증폭을 위해 다음 조건을 사용하였다: 2 분 동안 98℃; 20 초 동안 98℃(x 30 사이클); 15 초 동안 60℃(x 30 사이클); 90 초 동안 68℃(x 30 사이클); 및 1 분 동안 68℃. PCR 산물은 키아퀵® PCR 스핀 컬럼을 사용하여 정제하였다.
그런 다음 다음을 포함하는(반응 당) 반응 혼합물에서, SEQ ID NO: 9 및 10을 프라이머로 사용하는 또다른 PCR에 정제된 PCR 산물을 사용하였다: 5 x 프라임스타® GXL 폴리머라제 완충액 10 μL; 4 μL DNTP; 10 μM 정방향 프라이머 1 μL; 10 μM 역방향 프라이머 1 μL; 제조된 PCR 산물 50 ng; 프라임스타® GXL 폴리머라제 1 μL; 및 최종 부피 50 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물. 아라비노스 삽입물의 증폭을 위해 다음 조건을 사용하였다: 2 분 동안 98℃; 20 초 동안 98℃(x 30 사이클); 15 초 동안 60℃(x 30 사이클); 90 초 동안 68℃(x 30 사이클); 및 1 분 동안 68℃. PCR 산물은 키아퀵® PCR 스핀 컬럼을 사용하여 정제하였다.
깁슨 어셈블리® 반응을 위해 분해 및 정제된 벡터 100 ng을 준비했다. 반응을 위해 증폭 및 정제된 프로모터 58 ng도 준비했다. 깁슨 어셈블리®에는 0.1 pmol 이하의 총 DNA를 사용하였다. 벡터 DNA 및 삽입물 DNA를 최종 부피 10 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물과 혼합했다. 그런 다음 2 x NEB HIFI 어셈블리 마스터 믹스(뉴 잉글랜드 바이오랩스®에서 구함) 10 μL를 반응 혼합물에 첨가했다. 그런 다음 준비된 깁슨 어셈블리® 반응물을 열 순환기에서 50℃에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 기간 후, 이어서 NEB5α 초수용 세포를 사용하여 반응 혼합물 8 μL를 형질전환했다.
pET-듀엣 이중 발현 플라스미드 내로 클로닝된 아라비노스 프로모터를 갖는 형질전환된 세포를 사용하여 플라스미드 DNA를 증폭시킨 다음 키아젠® 맥시 프렙 정제 시스템을 사용하여 회수했다. 생성된 플라스미드는 pBM123으로 표지하여 클로닝에 사용하였다.
이중 아라비노스 프로모팅 발현 시스템에서의 우두 바이러스 캡핑 효소, pBM127의 클로닝. 다음의 반응 혼합물(반응 당)에서 SEQ ID NO: 11 및 12 프라이머를 사용하여 아라비노스 프로모팅 시스템의 제2 다중 클로닝 부위 내로 클로닝할 목적으로 D12 서브유닛을 증폭시켰다: 5 x 프라임스타® GXL 폴리머라제 완충액 10 μL ; 4 μL DNTP; 10 μM 정방향 프라이머 1 μL; 10 μM 역방향 프라이머 1 μL; D12 서브유닛 주형 50 ng; 프라임스타® GXL 폴리머라제 1 μL; 및 최종 부피 50 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물. D12 깁슨 어셈블리® 삽입물의 증폭을 위해 다음 조건을 사용하였다: 2 분 동안 98℃; 20 초 동안 98℃(x 30 사이클); 15 초 동안 55℃(x 30 사이클); 90 초 동안 68℃(x 30 사이클); 15 초 동안 55℃(x 30 사이클); 120 초 동안 68℃(x 30 사이클); 및 1 분 동안 68℃. PCR 산물은 키아퀵® PCR 스핀 컬럼을 사용하여 정제하였다.
다음의 반응 혼합물(반응 당)을 사용하여 Nco1-HF 제한 효소를 사용하여 10 μg의 pBM125 플라스미드를 분해했다: 컷스마트® 완충액 9 μL; Nco1-HF 2 μL; pBM125 10 μg; 및 최종 부피 90 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물. 열 순환기에서 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션을 완료했다. 그런 다음 안타크틱 포스파타제를 첨가했다(10 μL/반응 안타크틱 포스파타제 완충액 및 2 μL/반응 안타크틱 포스파타제). 그런 다음 반응 혼합물을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 키아젠® 겔 추출 정제 키트를 사용하여 분해된 벡터를 겔 추출 및 정제하였다.
깁슨 어셈블리® 반응을 위해 분해 및 정제된 벡터 100 ng을 준비했다. 반응을 위해 증폭 및 정제된 서브유닛 125 ng도 준비했다. 깁슨 어셈블리에는 0.1 pmol 이하의 총 DNA를 사용하였다. 벡터 DNA 및 삽입물 DNA를 최종 부피 10 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물과 혼합했다. 그런 다음 2 x NEB HIFI 어셈블리 마스터 믹스(뉴 잉글랜드 바이오랩스®에서 구함) 10 μL를 반응 혼합물에 첨가했다. 그런 다음 준비된 깁슨 어셈블리® 반응물을 열 순환기에서 50℃에서 15 분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 기간 후, 이어서 NEB5α 초수용 세포를 사용하여 반응 혼합물 8 μL를 형질전환했다. 클로닝된 D12 서브유닛을 갖는 형질전환된 세포를 사용하여 플라스미드 DNA를 증폭시킨 다음 키아젠® 미니 프렙 정제 시스템을 사용하여 회수했다. 생성된 DNA는 pBM127로 표지하였으며 단백질 발현을 위한 클리어콜라이(CLEARCOLI)TM 수용 세포로의 형질전환에 사용했다.
이. 콜라이 폴리(A) 폴리머라제 발현 시스템의 생성을 위한 pBM135의 클로닝. 프라이머로서 SEQ ID NO: 15 및 16을 사용하여 PCR 반응 혼합물을 다음과 같이 제조하였다(반응 당 부피): 5 x 프라임스타® GXL 폴리머라제 완충액 10 μL; 4 μL DNTP; 10 μM 정방향 프라이머 1 μL; 10 μM 역방향 프라이머 1 μL; 폴리(A) 폴리머라제 DNA 50 ng; 프라임스타® GXL 폴리머라제 1 μL. 폴리(A) 폴리머라제 삽입물을 증폭하기 위한 PCR은 다음과 같이 완료하였다: 2 분 동안 98℃; 20 초 동안 98℃(x 30 사이클); 15 초 동안 55℃(x 30 사이클); 90 초 동안 68℃(x 30 사이클); 및 1 분 동안 68℃. 그런 다음 키아퀵® PCR 스핀 컬럼을 사용하여 완료된 PCR을 정제하였다.
그런 다음 프라이머로서 SEQ ID NO: 17 및 18을 사용하는 또다른 PCR에 정제된 PCR 산물을 사용하였다. PCR 반응은 다음과 같이 준비하였다(반응 당): 5 x 프라임스타® GXL 폴리머라제 완충액 10 μL; 4 μL DNTP; 10 μM 정방향 프라이머 1 μL; 10 μM 역방향 프라이머 1 μL; 제조된 PCR 산물 50 ng; 프라임스타® GXL 폴리머라제 1 μL; 및 최종 부피 50 μL가 될 때까지 밀-큐(MILL-Q)® 물. 폴리(A) 폴리머라제 삽입물의 증폭을 위해 다음 조건을 사용하였다: 2 분 동안 98℃; 20 초 동안 98℃(x 30 사이클); 15 초 동안 55℃(x 30 사이클); 60 초 동안 68℃(x 30 사이클); 1 분 동안 68℃. 키아퀵® PCR 스핀 컬럼을 사용하여 PCR 산물을 정제하였다.
다음의 반응 레시피(반응 당)를 사용하여 효소: Nde1 및 Nco1-HF를 사용하는 이중 제한 분해에 20 μg의 pBM98을 사용하였다: 컷스마트® 완충액 90 μL; Nco1-HF 1 μL; Nde1 1 μL; pBM98 20 μg; 및 최종 부피 90 μL가 될 때까지 물. 제한 분해물을 열 순환기에서 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 안타크틱 포스파타제를 첨가했다(10 μL/반응 안타크틱 포스파타제 완충액 & 2 μL/반응 안타크틱 포스파타제). 그런 다음 반응 혼합물을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 키아젠® 겔 추출 정제 키트를 사용하여 분해된 벡터를 겔 추출 및 정제하였다.
깁슨 어셈블리® 반응을 위해 분해 및 정제된 벡터 100 ng을 준비했다. 반응을 위해 증폭 및 정제된 폴리(A) 폴리머라제 삽입물 63 ng도 준비했다. 깁슨 어셈블리®에는 0.1 pmol 이하의 총 DNA를 사용하였다. 벡터 DNA 및 삽입물 DNA를 최종 부피 10 μL가 될 때까지 밀리-큐® 물과 혼합했다. 그런 다음 2 x NEB HIFI 어셈블리 마스터 믹스(뉴 잉글랜드 바이오랩스®에서 구함) 10 μL를 반응 혼합물에 첨가했다. 그런 다음 준비된 깁슨 어셈블리® 반응물을 열 순환기에서 50℃에서 15 분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 기간 후, 이어서 NEB5α 초수용 세포를 사용하여 반응 혼합물 8 μL를 형질전환했다.
아라비노스 프로모팅 발현 플라스미드 내로 클로닝된 이. 콜라이 폴리(A) 폴리머라제를 갖는 형질전환된 세포를 사용하여 플라스미드 DNA를 증폭시킨 다음 키아젠® 미니 프렙 정제 시스템을 사용하여 회수했다.
선형화된 DNA로부터 RNA 전사체 생성. 이 절차는 추가의 다운스트림 변형을 위하여 원하는 관심 유전자를 인코딩하는 시험관내 RNA 전사체 생성 반응 준비에 사용된다. 공정에 사용되는 장비 목록에는 다음이 포함된다: 96 웰 열 순환기; 10 x 전사 완충액; 마이크로피펫; NTP(100 mM); 8-스트립 PCR 튜브; 무기 피로포스파타제; RN아제 저해제(쥐); Not1-HF 효소; 내부 자체 정제된 T7 RNA 폴리머라제; 및 키아젠® PCR 정제 키트.
시험관내 전사(IVT) 주형을 제조하기 위해, 제한 분해를 준비하는 pRNI-GFP 분취량을 얻는다. 다음 레시피(반응 당 부피)를 사용하여 준비되는 3 개의 IVT 반응마다 10 μg의 주형 DNA를 분해했다: 컷스마트® 완충액 5 μL; Not1-HF 제한 효소 2 μL; pRNI-GFP 10 μg; 최종 부피 100 μL가 될 때까지 뉴클레아제 없는 물. 위의 내용물을 다음으로 라벨링된 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에 첨가한다: 이름: "pRNI-GFP 분해." 37℃ 인큐베이터에서 2 시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 분해된 DNA를 제거하고 500 μL의 완충액 PB를 첨가했다. 완충액 PB와 분해된 DNA의 혼합물을 보라색 키아젠® PCR 정제 컬럼으로 옮겼다. 컬럼을 테이블톱 원심분리기에서 최대 속도로 1 분 동안 회전시켰고 플로우-쓰로우는 버렸다. 750 μL의 완충액 PE를 컬럼으로 직접 보낸 후, 원심분리기에서 최대 속도로 1 분 동안 회전시켰다. 다시, 플로우-쓰로우는 버렸다. 그런 다음 컬럼을 최대 속도로 3 분 동안 회전 건조시켰다. 1.5 mL 미세원심분리기 튜브는 다음으로 라벨링했다: "분해된 pRNI-GFP". 컬럼을 새롭게 라벨링한 미세원심분리 튜브 내로 보냈다. 40 μL의 뉴클레아제 없는 물을 막에 직접 두었다. 37℃에서 2 분 인큐베이션 후, 컬럼을 원심분리기에서 최대 속도로 2 분 동안 회전시켰다. 제조사의 지침에 따라 분광광도계를 사용하여 용리 분획을 분석했다.
IVT 반응을 준비하기 위해, PCR 튜브를 다음으로 라벨링한다: 이름: "IVT 반응". 다음의 튜브를 수득했고 항시 얼음 위에 보관했다: 내부 자체 정제된 T7 RNA 폴리머라제 바이알; 무기 피로포스파타제 바이알; RN아제 저해제(쥐) 바이알; "pRNI-GFP 분해" 튜브. 다음의 시약을 실온에서 해동하였다: 10 x 반응 완충액; ATP; CTP; UTP; 및 GTP. 다음의 시약을 라벨링된 PCR 튜브에 다음의 순서로 첨가한다: RN아제 없는 물(≤20 μL); 10 x 반응 완충액(2 μL); 100 mM ATP(2 μL); 100 mM CTP(2 μL); 100 mM GTP(2 μL); 100 mM UTP(2 μL); 주형 DNA(1 μg); T7 RNA 폴리머라제 믹스(2 μL); RN아제 저해제(1 μL); 무기 피로포스파타제(2 μL). 하나의 반응의 최종 부피는 20 μL이어야 한다. 준비된 PCR 튜브를 짧게 원심분리한 후, 37℃에서의 열 순환기에서 밤새 인큐베이션했다.
IVT RNA 전사체의 정제. 밤새 인큐베이션 후, 튜브를 열 순환기에서 제거하고 필터가 쓰인 p200 마이크로피펫을 사용하여 100 μL의 완충액 PB를 반응에 첨가했다. 밤새 인큐베이션 후 반응 용기가 흐려지는 것은 공정 중 전형적으로 이 시점에서이다. 완충액 PB를 추가할 때 반투명한 고체가 존재할 것이며 이는 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합해야 한다.
혼합물을 보라색 키아젠® PCR 정제 컬럼의 막에 직접 첨가했다. 컬럼을 1 분 동안 최대 속도로 회전시켰고, 플로우-쓰로우를 버렸다. 750 μL의 완충액 PE를 각각의 컬럼에 첨가하고 최대 속도로 1 분 동안 회전시켰다. 플로우-쓰로우는 버렸다. 컬럼을 3 분 동안 최대 속도로 회전 건조시켰다. 새로운 1.5 mL 미세원심분리기 튜브를 다음으로 라벨링하였다: "시험관내 전사체". 컬럼을 라벨링된 미세원심분리기 튜브로 옮기고 35 μL의 RN아제 없는 물을 막에 직접 첨가했다. 컬럼을 2 분 동안 최대 속도로 회전시켰다. 그런 다음 제조사의 지침에 따라 분광광도계로 용리된 RNA 전사체를 분석했다. 분광광도계 분석 후, 정제된 RNA 전사체는 얼음 위에 보관해야 한다.
캡핑 반응이 정제 후 바로 완료될 수 없는 경우, 임의의 RNA 전사체는 -80℃에서 보관해야 한다. 최상의 결과를 위해 동결된 RNA를 1 주일 초과 동안 보관해서는 안 된다.
캡핑된 RNA 전사체의 생성. 다음의 성분을 작업 시작 전 -20℃에서 보관했으며 반응 모임 중에는 얼음 위에 보관했다: 10 x 캡핑 완충액, 32 mM S-아데노실 메티오닌(SAM), 10 mM 구아노신 트리포스페이트(GTP), RN아제 저해제(쥐), 내부 자체 정제된 우두 바이러스 캡핑 효소(VVCE). 미세원심분리기 튜브는 다음으로 라벨링했다: "2 mM SAM". SAM은 RN아제 없는 물 30 μL 및 32 mM 모액 2 μL를 라벨링된 미세원심분리기 튜브 내로 첨가함으로써 1:16으로 희석시켰다. 가장 높은 캡핑 효율을 위해 반응 직전에 SAM을 희석하는 것이 가장 좋다. 2 개의 새로운 PCR 스트립 튜브를 다음으로 라벨링했다: "VVCE 캡핑 반응". 수집된 정제된 RNA를 사용하여 10 μg의 RNA를 각각의 라벨링된 튜브에 첨가했다. 각각의 튜브에 대해 최종 부피 14 μL가 될 때까지 RN아제 없는 물을 첨가했다. RNA와 물 혼합물을 열 순환기에서 65℃에서 5 분 동안 변성시켰다. 변성-직후, RNA를 얼음 위에 5 분 동안 두었다. 시약은 다음의 순서로(반응 당 부피) 각각의 반응에 첨가했다: 10 x 캡핑 완충액 2 μL; 10 mM GTP 1 μL; 2 mM SAM 1 μL; VVCE 1 μL; 및 RN아제 저해제 1 μL. 피펫을 사용하여 내용물을 부드럽게 혼합하고 스핀다운했다. 반응물을 열 순환기에서 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션했다.
37℃ 인큐베이션 후, 열 순환기에서 튜브를 제거하고 필터가 쓰인 p200 마이크로피펫을 사용하여 100 μL의 완충액 PB를 각각의 반응에 첨가했다. 각각의 반응 튜브의 내용물을 보라색 키아젠® PCR 정제 컬럼의 막 위로 조심스럽게 옮겼다. 컬럼을 1 분 동안 최대 속도로 원심분리하고, 플로우-쓰로우를 버렸다. 750 μL의 완충액 PE를 각각의 컬럼에 첨가하고 최대 속도로 1 분 동안 회전시켰다. 플로우-쓰로우를 버린 후, 최대 속도로 3 분 동안 회전시켜 컬럼을 건조시켰다. 2 개의 새로운 1.5 mL 미세원심분리기 튜브를 다음으로 라벨링했다: "캡핑된 RNA 전사체". 컬럼을 라벨링된 미세원심분리 튜브 내에 두고 35 μL의 RN아제 없는 물을 막에 직접 첨가하고 2 분 동안 인큐베이션했다. 컬럼을 최대 속도로 2 분 동안 회전시켜 생성물을 수집했다. 제조사의 지침에 따라 분광광도계를 사용하여 준비된 RNA 전사체를 분석했다. SPEC 후, 정제된 RNA 전사체를 얼음 위에 보관하고 꼬리 첨가 반응으로 직접 옮겼다. 꼬리 첨가 반응이 정제 후 바로 완료될 수 없는 경우, 임의의 RNA 전사체는 당분간 -80℃에서 보관해야 한다(최상의 결과를 위해 1 주일 이하).
폴리-아데닐화된 mRNA의 생산. 다음의 성분을 작업 시작 전 -20℃에서 보관했으며 반응 모임 중에는 얼음 위에 보관했다: 10 x 꼬리 첨가 완충액; 10 mM 아데노신 트리포스페이트(ATP); RN아제 저해제(쥐); 및 내부 자체 정제된 폴리(a) 폴리머라제. 2 개의 새로운 PCR 스트립 튜브를 다음으로 라벨링하였다: "폴리(A) 폴리머라제 꼬리 첨가 반응". 수집된 정제된 RNA를 사용하여 10 μg의 RNA를 각각의 라벨링된 튜브에 첨가했다. 각각의 튜브에 대해 최종 부피 14 μL가 될 때까지 RN아제 없는 물을 첨가했다. 시약은 다음의 순서로 각각의 반응에 첨가했다: 10 x 꼬리 첨가 완충액 2 μL; 10 mM ATP 2 μL; 폴리(A) 폴리머라제 1 μL; 및 RN아제 저해제 1 μL. 피펫을 사용하여 내용물을 부드럽게 혼합하고 스핀다운했다. 반응물을 열 순환기에서 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션했다.
인큐베이션 기간 후, 열 순환기에서 튜브를 제거하고 필터가 쓰인 p200 마이크로피펫을 사용하여 각각의 반응에 100 μL의 완충액 PB를 첨가했다. 혼합물을 보라색 키아젠® PCR 정제 컬럼의 막에 직접 첨가했다. 컬럼을 1 분 동안 최대 속도로 원심분리하고, 플로우-쓰로우를 버렸다. 750 μL의 완충액 PE를 컬럼에 첨가한 후, 최대 속도로 1 분 동안 회전시켰다. 플로우-쓰로우를을 버린 후, 컬럼을 최대 속도로 3 분 동안 회전 건조시켰다. 컬럼을 새로운 1.5 mL 미세원심분리기 튜브 내에 두고 35 μL의 RN아제 없는 물을 막에 직접 첨가했다. 컬럼을 2 분 동안 그대로 있도록 한 후, 2 분 동안 최대 속도로 회전시켰다. 그런 다음 준비된 RNA 전사체를 제조사의 지침에 따라 분광광도계를 사용하여 분석했다. SPEC 후, 정제된 RNA 전사체를 얼음 위에 보관하고 형질 감염 반응으로 직접 진행시켜야 한다. 정제 후 바로 형질감염이 완료될 수 없는 경우, 임의의 RNA 전사체를 -80℃에 보관해야 한다.
다음의 논의는 많은 예시 구현예를 제공한다. 각각의 구현예는 발명의 요소의 단일 조합을 나타내지만, 본 발명의 주제(subject matter)는 개시된 요소의 모든 가능한 조합을 포함하는 것으로 고려된다. 따라서, 일 구현예가 요소 A, B, 및 C를 포함하고, 제2 구현예가 요소 B 및 D를 포함하는 경우, 본 발명의 주제는, 명백하게 개시되지 않았다 하더라도, A, B, C, 또는 D의 다른 나머지 조합을 포함하는 것으로 또한 고려된다.
본원에 사용된, 그리고 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 용어 "에 연결된"은 직접 연결(서로 연결된 두 요소가 서로 접촉하는 것) 및 간접 연결(적어도 하나의 추가 요소가 두 요소 사이에 위치하는 것) 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "에 연결된" 및 "와 연결된"은 동의어로 사용된다.
이미 기술된 것 외에 많은 추가의 변형이 본원에서의 개념을 벗어나지 않고 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 개시내용은 첨부된 청구범위의 사상에서를 제외하고는 제한되지 않아야 한다. 더욱이, 명세서와 청구범위 둘 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 구체적으로, 용어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하는(comprising)"은 비-배타적인 방식으로 요소, 성분, 또는 단계를 언급하는 것으로 해석되어야 하며, 이는 언급된 요소, 성분, 또는 단계가 명시적으로 언급되지 않은 다른 요소, 성분, 또는 단계와 함께 존재, 또는 활용, 또는 조합될 수 있음을 나타낸다. 명세서 또는 청구범위가 A, B, C…및 N으로 구성된 군으로부터 선택되는 것 중 적어도 하나를 언급하는 경우, 본문은 A + N, 또는 B + N 등이 아닌, 군으로부터 하나의 요소만을 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. mRNA의 시험관내 합성을 위한 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
    아라비노스 프로모터 및 T7 RNA 폴리머라제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 플라스미드 벡터로 복수의 제1 수용 박테리아 세포를 형질감염시키는 단계;
    적어도 하나의 아라비노스 프로모터 및 우두 바이러스(vaccinia virus) 캡핑 효소(VVCE)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 플라스미드 벡터로복수의 제2 수용 박테리아 세포를 형질감염시키는 단계;
    아라비노스 프로모터, UUG 시작 코돈, 및 폴리아데노신(폴리(A)) 폴리머라제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3 플라스미드 벡터로 복수의 제3 수용 박테리아 세포를 형질감염시키는 단계;
    복수의 제1 수용 박테리아 세포로부터 T7 RNA 폴리머라제를 발현시키고 정제하는 단계;
    복수의 제2 수용 박테리아 세포로부터 VVCE를 발현시키고 정제하는 단계;
    복수의 제3 수용 박테리아 세포로부터 폴리(A) 폴리머라제를 발현시키고 정제하는 단계;
    RNA 전사체를 생산하기 위해 정제된 T7 RNA 폴리머라제를 포함하는 제1 조성물에 선형화된 플라스미드 DNA를 첨가하는 단계;
    캡핑된 RNA 전사체를 생산하기 위해 정제된 VVCE를 포함하는 제2 조성물에 RNA 전사체를 첨가하는 단계;
    폴리아데닐화되고 캡핑된 mRNA 전사체를 생산하기 위해 정제된 폴리(A) 폴리머라제를 포함하는 제3 조성물에 캡핑된 RNA 전사체를 첨가하는 단계; 및
    제3 조성물로부터 mRNA를 정제하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 제1 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 19와 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제1 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 19와 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 제1 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 19와 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제1 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 19를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제2 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 20과 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제2 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 20과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 제2 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 20과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 제2 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 20을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 제3 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 21과 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 제3 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 21과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 제3 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 21과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제3 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 21을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 박테리아 수용 세포는 클리어 콜라이(Clear Coli) BL21(DE3) 수용 세포인, 방법.
  15. 제1항에 있어서, VVCE는 18℃에서 발현되는, 방법.
  16. 제6항에 있어서, VVCE는 18 시간의 발효 기간에 걸쳐 발현되는, 방법.
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