KR20240027587A - 나노입자 분산액을 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에서 제시되는 개시는 나노입자, 예를 들어, 리포솜의 분산액을 생산하는 방법으로서, 유기 스트림을 수성 스트림과 상승된 압력에서 정면으로 충돌시킴을 포함하는 방법을 제공한다.
Description
본원에서 제시된 개시는 증가된 압력에서 유기 스트림을 수성 스트림과 정면 충돌시키는 것을 포함하는 방법에 의해 지질 담체, 예를 들어 리포솜 또는 지질 나노입자의 분산액을 생산하는 방법을 제공한다.
제약 및 생명공학 산업에서는 백신 접종 및 유전자 치료를 포함한 다양한 질병 적용을 위해 활성 제약 성분, 특히 핵산을 안전하고 성공적으로 전달할 수 있는 기술에 대한 필요성이 점점 더 시급해지고 있다. 현재, 이러한 필요성은 SARS-CoV-2 백신 공급의 용량 제약과 인간에서의 아데노바이러스 기술 적용에 대한 일부 우려에서 볼 수 있듯이 충분히 충족되지 않고 있다.
지질 담체, 예컨대, 지질 나노입자(LNP) 및 관련 기술은 활성 제약 성분을 전달하는 검증되고 효율적이며 안전한 방법을 제공한다. LNP에 대한 주요 문제 중 하나는 이들의 충분한 양의 제조와 상용화에 요구되는 배치 재현성 표준(batch reproducibility standard)이다. 여러 전략이 LNP에서 활성 제약 성분을 전달하기 위해 존재하며, 그 중에, 제트 충돌 기술(jet impinging technology)이 핵산-기반 백신 생산에 성공적으로 적용되고 있지만 이의 효율성과 유용성은 최적화되지 않고 있다.
용어 "리포솜"과 "지질 나노입자"(LNP)은 때때로 상호 교환적으로 사용지지만, 전자는 일반적으로 인지질로 구성되고 적어도 하나의 지질 이중층을 포함하는 구형 소포를 의미하는 반면에, LNP의 구조는 덜 정렬될 수 있다. LNP는 "다양한 유전자 페이로드(genetic payload)의 안정적이고 효율적인 캡슐화에 매우 적합한 내부 수성 존재가 낮거나 최소한인 보다 복잡한 내부 지질 구조를 갖춘 차세대 리포솜"으로 설명되었다. 추가로, 예를 들어, 리포플렉스(lipoplex), 리포폴리플렉스(lipopolyplex), 다중층 리포솜(multilamellar liposome) 또는 고체 지질 나노입자와 같은 다른 지질 담체 또는 지질 나노입자 구조가 있다.
리포솜은 적어도 인지질 이중층으로 둘러싸인 수성 코어로 구성된 30 nm에서 수 마이크로미터 범위의 입자 크기를 갖는 나노 크기의 소포 구조(vesicular structure)로 정의된다. 이들의 크기 및 소수성 및 친수성 특성(생체 적합성 외에도)으로 인해서, 리포솜은 약물 전달을 위한 유망한 시스템이다. 리포솜에서, 수용성 약물은 수성 코어에 캡슐화될 수 있는 반면에, 지질 이중층은 수불용성 약물을 포집하는 역할을 한다. 리포솜 특성은 지질 조성, 표면 전하, 크기 및 제조 방법에 따라 상당히 다르다. 더욱이, 이중층 성분의 선택은 '강성' 또는 '유동성'과 이중층의 전하를 결정한다.
난용성 활성 제약 성분의 경구 생체 이용률은 활성 제약 성분의 입자 크기를 감소시킴으로써 증가될 수 있는 것으로 알려져 있다. 더욱이, 난용성 활성 약제의 나노크기화 및/또는 캡슐화 뿐만 아니라, 예를 들어, 비경구 투여를 위한 수용성 활성 약제의 캡슐화를 위한 나노기술의 적용은, 예를 들어, 생체 이용률의 증가, 부작용의 감소, 누출 접합부를 통한 향상된 침투에 의한 종양 부위에 대한 수동적 표적화 등의 측면에서 이점을 보여주었다.
약제학적 제품을 설계할 때에, 입자 크기를 자유롭게 설정할 수 있는 것이 유리한데, 그 이유는 수동적인 약물 타겟팅이 가능해지기 때문이다. 더욱이, 특히 비경구 투여 시의 약제학적 제품은 멸균되어야 한다. 따라서, 비경구 제품의 경우에, 멸균 여과가 가능한 작은 입자 크기가 유용하다. 다른 유형의 멸균(예, 고압멸균)은 리포솜을 파괴할 가능성이 매우 높고, 그에 따라서, 사용되지 않는다.
다양한 기술이 지질 담체 시스템의 생산을 위해서 사용된다.
용매/비용매 침전 방법은 나노입자, 특히 지질-기반 나노입자의 생산에 유용한 것으로 밝혀졌다. 용매/비용매 침전은 물질이 용매에 용해되어 액체 제트로서 비용매를 함유하는 두 번째 액체 제트와 충돌하여 용해된 물질이 침전되는 것을 의미한다. 마이크로제트 반응기 기술(microjet reactor technology)은 용매/비용매 침전 방법에 의한 나노입자 합성을 위한 자동화된 연속 접근 방식을 위해서 사용된다. 이는 용매와 비용매의 난류 혼합 영역을 생성하고, 그에 따라서, 나노미터 범위의 입자의 침전에 특히 적합하다.
EP 2395978 B1은 EP 1 165 224 B1에 따른 마이크로젯 반응기를 사용하여 표면-활성 분자의 존재 하에 용매/비용매 침전을 기재하고 있다. 그러한 마이크로제트 반응기는 서로 반대편에 위치한 적어도 2개의 노즐(핀-홀)을 가지며, 각각은 반응기 하우징으로 둘러싸인 반응기 챔버내의 공통 충돌 지점에서 액체 매질을 분사하기 위한 관련 펌프 및 공급 라인을 갖고 있다. 또 다른 개구부가 반응기 하우징에 제공되며, 이를 통해서, 가스, 증발 액체, 냉각 액체 또는 냉각 가스가 반응기 챔버 내 가스 대기를 유지하거나 냉각하기 위해 통과할 수 있다. 추가 개구부가 생성된 생성물과 과잉 가스를 반응기 챔버로부터 제거하기 위해서 제공된다. 따라서, 가스, 증발 액체 또는 냉각 가스가 반응기 내부의 가스 대기를 유지시키거나 생성되는 생성물을 냉각시키기 위해서 개구부를 통해서 반응기 챔버 내로 도입되고, 생성되는 생성물 및 과량의 가스는 가스 입구 측의 과압 또는 생성물과 가스 출구 측의 저압에 의해 이러한 개구부를 통해서 반응기 챔버로부터 제거된다. 용매/비용매 침전이 이러한 마이크로젯 반응기에서 수행되면, 침전된 입자의 분산액이 얻어진다.
특히, 지질 나노입자의 상업적 적용, 예를 들어, 치료적 접근 또는 백신 접종의 경우에, 쉽게 규모가 확장될 수 있는 강력한 생산 방법을 제공하고 요망되는 제품의 빠른 생산을 제공하는 것이 매우 중요하다. 추가로, 생산 공정이 제품 개발의 과정 동안 및 확장 동안에 나타날 수 있는 다양한 필요 및 요건에 대해서 조정될 수 있는 것이 또한 중요하다. 지질 나노입자는 치료학적 적용, 예컨대, 백신 접종 및 유전자 치료와 관련될 수 있는 핵산 또는 핵산 구성물에 적합한 담체 또는 전달 비히클일 수 있으므로, 생산 공정이 또한 이들 유형의 활성 성분 및 분자를 처리하는 데 적합해야 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 다양한 종류의 제품에 대한 적응 측면에서 유연할 뿐만 아니라 요망되는 제품을 강력하고 빠르며 신뢰 가능하게 생산하는 지질-기반 나노입자의 생산 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 공정 개발에 활용이 가능한 지질-기반 나노입자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 추가 목적은 선행 기술의 제트 충돌 반응기의 하나 이상의 단점 또는 한계를 극복할 수 있는 충돌 반응기의 사용을 기반으로 하는 상기 입자의 생산을 위한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 본 발명의 하기 설명, 실시예 및 청구범위에 기초하여 명백해질 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 양친매성 지질을 포함하는 나노입자의 분산액을 생산하는 방법으로, a) 유기 용매 및 적어도 양친매성 지질을 포함하는 제1 스트림을 제공하는 단계; b) 수성 용매를 포함하는 제2 스트림을 제공하는 단계; c) 제1 스트림을 상승된 압력 하에 제1 노즐을 통해서 펌핑시키고 제2 스트림을 상승된 압력 하에 제2 노즐을 통해서 반응 챔버 내로 펌핑시키는 단계로서, 제1 노즐이 제2 노즐로부터 약 180°의 각도로 위치되는 단계; d) 제1 스트림과 제2 스트림을 방응 챔버에서 정면으로 충돌시키는 단계로서, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비가 약 1:1.5 내지 약 1:4.5 미만의 범위에 있는, 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본원에서는, 본 발명의 제1 양태의 방법에 의해서 생산된 나노입자 분산액이 개시된다.
추가의 양태에서, 본원에서는, 본 발명의 제1 양태의 방법에 의해서 생산된 나노입자 분산액을 포함하는 약제학적 조성물이 개시된다.
도 1a 및 도 1b는 상업용 미세유체 혼합기(도 1a) 또는 본 발명의 방법, 즉 제트 충돌 기술(시스템 B)(도 1b)을 사용하여 제조된 실시예 1의 리포솜의 입자 크기 및 PDI에 대한 SPC/콜레스테롤 비율의 효과를 나타낸다. 3:1(33mol% 콜레스테롤, ID1, ID3, ID5 및 ID7) 및 2:1(50mol% 콜레스테롤, ID2, ID4, ID6, ID8)의 SPC/콜레스테롤 중량비를 시험하였다. 데이터는 동적 광산란(DLS)을 사용하여 획득되었다(n=1).
도 2는 제트 충돌 기술(시스템 B)에 의해서 관찰된 바와 같이 실시예 1에서 제조된 리포솜의 입자 크기 및 PDI에 대한 반응기 노즐 크기의 효과를 나타낸다. 적용된 노즐 크기는 제1 개구부(유기 스트림)의 경우의 100 ㎛, 제2 개구부(수성 스트림)(ID3, ID4)의 경우의 200 ㎛; 및 200 ㎛(제1 개구부) 및 300 ㎛(제2 개구부)(ID9, ID10)를 사용하였다. 데이터는 동적 광산란을 사용하여 획득되었다(n=1).
도 3a 내지 3d는 실시예 1에서 제조된 리포좀의 입자 크기 및 PDI에 대한 유량비(FRR) 및 전체 유량(TFR)의 영향을 나타낸다. 도 3a는 상업용 미세유체 혼합기에 대한 FRR의 효과를 나타내는 반면에, 도 3b에서는, 본 발명에 따른 제트 충돌 시스템(시스템 B)을 사용하였다. 도 3c는 상업용 미세유체 혼합기에 대한 TFR의 효과를 나타내는 반면에, 도 3d에서는, 본 발명에 따른 제트 충돌 시스템(시스템 B)을 사용하였다. 데이터를 동적 광산란을 사용하여 획득하였다(n=1).
도 4a 및 4c는, https://www.precisionnanosystems.com/docs/default-source/pni-files/app-notes/pni-app-bt-013.pdf?sfvrsn=aa668324_0; 문헌[Brown A., Thomas A., Shell Ip, Heuck G., Ramsay E., Liposomes, published by Precision NanoSystems Inc. 2018; retrieved 05.05.2021]를 참조로 하여, 상업용 미세유체 혼합기를 사용하여 얻은 리포솜의 입자 크기 및 PDI 특성화를 도시하고 있다. 도 4b 및 4d는 본 발명에 따른 제트 충돌 방법(시스템 B)을 사용하여 제조된 실시예 2(n=1)에 기재된 바와 같은 제형 2의 리포솜에 대한 입자 크기 및 PDI를 나타낸다. 도 4b에서, 유량비(FRR)의 영향이 나타내어져 있다(TFR은 90 ml/min이었다). 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 및 4.0의 x-축에 대한 나타낸 유량은 1:1, 1:1.5, 1:2.0, 1:3.0 및 1:4의 유량(제1/유기 스트림:제2/수성 스트림)을 의미한다. 도 4a 및 도 4b는 제1 유기 용매 스트림의 유량에 대한 수성 제2 스트림의 유량 증가가 입자 크기 감소 및 PDI 증가 경향을 유도한다는 것을 나타내고 있다. 도 4d는 제트 충돌 방법을 사용하여 제조된 리포솜에서의 TFR(유기 스트림:수성 스트림의 FRR은 1:2이었음)의 효과를 나타내고 있으며, 여기서, 입자 크기는 30ml/min 내지 300ml/min 범위의 TFR에 걸쳐 안정적으로 유지되었다. 도 4c는 미세 유체 시스템에서 TFR 증가 효과가 입자 크기에 영향을 미치는 것으로 나타나는 것을 비교하여 나타내고 있다.
도 5a 내지 도 5f는 두 가지 상이한 리포솜 지질 제형으로부터 실시예 2에 따라서 제조된 리포솜에 대한 FRR 및 TFR 효과를 나타내고 있다. TFR은 FRR 비교에대한 90 ml/min이었고, FRR은 TFR 비교에 대한 1:2(유기:수성)이었다. 도 5a 및 도 5b는 실시예 2에서 기재된 바와 같은 제형 1(n=3)의 리포솜에 대한 입자 크기 및 PDI에 대한 FRR(도 5a) 및 TFR(도 5b)의 효과를 나타낸다. 도 5c 및 도 5d는 실시예 2에 기재된 바와 같은 제형 2(n=1)의 리포솜에 대한 입자 크기 및 PDI에 대한 FRR(도 5c) 및 TFR(도 5d)의 효과를 나타낸다. 도 5e 및 도 5f는 각각 TFR 및 FRR를 기반으로 한 제형 1의 페길화된 리포솜(PEGylated liposome)의 1-주일 물리적인 안정성을 나타낸다(좌측 막대: t = 0, 우측 막대: 입자 크기 직경(nm)에 대해서 t = 1 주일; 원: t= 0, 삼각형: PDI에 대해서 t= 1 주일). 데이터는 동적 광산란을 이용하여 획득되었고, 평균 ± SD(n=3)로서 나타내어져 있다. 도 5g 및 도 5h는 각각 TFR 및 FRR를 기반으로 한 제형 2(n=1)의 페길화된 리포솜의 1-주일 물리적인 안정성을 나타낸다(좌측 막대: t = 0, 우측 막대: 입자 크기 직경(nm)에 대해서 t = 1 주일; 원: t= 0, 삼각형: PDI에 대해서 t= 1 주일). 데이터는 동적 광산란을 이용하여 획득되었다.
도 6a 및 도 6b는 상이한 TFR 조건에서 얻은 리포솜 샘플의 Cryo-TEM 이미지를 도시하고 있다. 도 6a는 샘플 제조에 사용되는 탄소 그리드에 주로 붙어 있는 수백 개의 작은 단일층 리포솜뿐만 아니라 큰 이중층 및 다소포성 입자(PDI: 0.17, TFR: 30 ml/min)를 도시하고 있다. 도 6b는 탄소 그리드(PDI: 0.165, TFR: 90 ml/min)에 붙어 있는 작은 단일층 소포의 주요 입자 분획 외에 작은 단일층 및 이중층 리포솜의 혼합을 도시하고 있다.
도 7은 본 발명의 방법(시스템 B)에 의해 얻은 실시예 3의 입자에 대한 Cryo-TEM 분석의 결과를 도시하고 있다.
도 8은 반응기 노즐 크기와 입자 크기(Z-평균, nm) 사이의 상관관계를 도시하고 있다. 반응기는 직경( ㎛)으로의 노즐의 크기에 따라 라벨링되어 있다. 예를 들어, 반응기 400/200은 제2 (수성) 스트림이 펌핑되는 직경 400 ㎛의 (제2) 노즐 개구부와 제1 (유기) 스트림이 펌핑되는 직경 200 ㎛의 (제1) 노즐 개구부를 갖는다.
도 9는 상이한 전체 유량(TFR)에서 로그 압력("Log Druck 절대 [bar]", x-축)과 입자 크기(Z-평균 [nm], y-축) 사이의 상관관계를 도시하고 있다(원: 50 ml/min; 별표: 180 ml/min; 삼각형: 312.5 ml/min). 파라미터 추정 절편 = 80.556; 기울기 = -3.2365.
도 10은 유량비(FRR)와 다분산도 지수(PDI; y-축) 사이의 상관관계를 도시하고 있다. 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 및 4로서 x-축 상에 표시된 유량비(FRR)는 각각 1:1.5, 1:2, 1:2.5; 1:3, 1:3.5 및 1:4의 유량비(제1/유기 스트림:제2/수성 스트림)을 의미한다. 점선은 95% 신뢰 구간(CI) 밴드를 나타낸다.
도 11은 실시예 5에 기술된 바와 같은 시스템 B에서 순환된 Fluc mRNA(APExbio)의 겔 전기영동을 도시하고 있다. 샘플을 이하 시점 후에 채취하여 좌측으로부터 우측으로 별도의 레인에서 분석하였다: L(사다리), t=0; 시작 전, 프라임 후, 2초, 5초, 10초, 20초, 30초, 1분, 2분, 3분, 4분 및 빈 레인(empty lane). 시작 t=0과 4분(장비를 통한 약 120회 계대에 해당)을 비교하면 유의미한 mRNA 분해가 관찰되지 않는다.
도 12는 형질감염당 10μg mRNA(EE% 검정에 따름)를 사용하여 실시예 6에 기재된 시험관내 형질감염 분석의 결과를 도시하고 있다. 모든 데이터 n=6, 비-파라미터, Kruskal-Wallis 포스트 AVG+/-SD, ** p<0.01. 높은 형질감염 속도가 각각 제트 충돌과 미세유체 혼합에 의해 생성된 두 테스트 그룹 FLuc-mRNA 부하 LNP에 대해 관찰되었다.
도 13은 실시예 6에 기재된 생체내 형질감염 분석의 결과를 그래프로 도시하고 있으며, 시간 경과에 따른(투여 후) 전체 신체에 대한 생체내 유전자 전달 정량화를 나타내고 있다. 도면에 도시된 바와 같이, FLuc 발현은 투여 후 6시간에 최고인 것으로 관찰되었으며, 그 이후에는 두 시험된 그룹 모두에서 유사하게 감소했다.
도 14는, 실제 축척이 아닌, 본 개시의 일 구체예에 따른 제트 충돌 반응기(1)를 도시하고 있다. 챔버 벽(3)의 내부 표면(2)에 의해 정의된 반응 챔버(6)는 두 개의 유체 입구(4)와 유체 출구(7)를 제외하고는 실질적으로 구형이다. 유체 입구(4)들은 반응 챔버(6)의 제1 중심 축(x)에서 반대 위치에 배열되고 서로를 향해 있다. 유체 입구(4)의 각각은 본 구체예에서 평면 오리피스 노즐인 노즐(5)을 포함한다. 유체 출구(7)는 제1 중심축(x)에 수직인 제2 중심축(y)에 위치한다. 두 노즐(4) 사이의 거리(d)는 구형 반응 챔버(6)의 직경과 실질적으로 동일하다.
도 15는 본 개시의 일 구체예에 따른 유체 입구 커넥터(10)를 도시하고 있다. 커넥터(10)는 상류 단부(11), 하류 단부(12)의 하류 위치에서 노즐(13)을 유지하는 하류 단부(12), 및 유체를 상류 단부(11)로부터 하류 단부(12)로 전달하기 위한 유체 도관(14)을 갖는다. 유체 입구 커넥터(10)는 본 발명에 따른 제트 충돌 반응기(미도시)를 위한 유체 입구를 제공하고 그러한 반응기의 벽에 가역적으로 삽입 가능하도록 설계된다. 수치는 비례하지 않는다.
도 16은, 또한 실제 축적으로 도시되지 않은, 본 개시의 또 다른 구체예에 따른 유체 입구 커넥터(20)를 도시하고 있다. 이러한 커넥터(20)는, 유체 입구를 제공하는 것과 같이, 본 발명에 따른 제트 충돌 반응기(미도시)의 벽에 가역적으로 삽입 가능하도록 설계된다. 이는 상류 단부(21), 하류 단부(22)의 하류 위치에서 노즐(23)을 유지하는 하류 단부(22), 및 유체를 상류 단부(21)로부터 하류 단부 (22)로 전달하기 위한 유체 도관(24)을 갖는다.
도 2는 제트 충돌 기술(시스템 B)에 의해서 관찰된 바와 같이 실시예 1에서 제조된 리포솜의 입자 크기 및 PDI에 대한 반응기 노즐 크기의 효과를 나타낸다. 적용된 노즐 크기는 제1 개구부(유기 스트림)의 경우의 100 ㎛, 제2 개구부(수성 스트림)(ID3, ID4)의 경우의 200 ㎛; 및 200 ㎛(제1 개구부) 및 300 ㎛(제2 개구부)(ID9, ID10)를 사용하였다. 데이터는 동적 광산란을 사용하여 획득되었다(n=1).
도 3a 내지 3d는 실시예 1에서 제조된 리포좀의 입자 크기 및 PDI에 대한 유량비(FRR) 및 전체 유량(TFR)의 영향을 나타낸다. 도 3a는 상업용 미세유체 혼합기에 대한 FRR의 효과를 나타내는 반면에, 도 3b에서는, 본 발명에 따른 제트 충돌 시스템(시스템 B)을 사용하였다. 도 3c는 상업용 미세유체 혼합기에 대한 TFR의 효과를 나타내는 반면에, 도 3d에서는, 본 발명에 따른 제트 충돌 시스템(시스템 B)을 사용하였다. 데이터를 동적 광산란을 사용하여 획득하였다(n=1).
도 4a 및 4c는, https://www.precisionnanosystems.com/docs/default-source/pni-files/app-notes/pni-app-bt-013.pdf?sfvrsn=aa668324_0; 문헌[Brown A., Thomas A., Shell Ip, Heuck G., Ramsay E., Liposomes, published by Precision NanoSystems Inc. 2018; retrieved 05.05.2021]를 참조로 하여, 상업용 미세유체 혼합기를 사용하여 얻은 리포솜의 입자 크기 및 PDI 특성화를 도시하고 있다. 도 4b 및 4d는 본 발명에 따른 제트 충돌 방법(시스템 B)을 사용하여 제조된 실시예 2(n=1)에 기재된 바와 같은 제형 2의 리포솜에 대한 입자 크기 및 PDI를 나타낸다. 도 4b에서, 유량비(FRR)의 영향이 나타내어져 있다(TFR은 90 ml/min이었다). 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 및 4.0의 x-축에 대한 나타낸 유량은 1:1, 1:1.5, 1:2.0, 1:3.0 및 1:4의 유량(제1/유기 스트림:제2/수성 스트림)을 의미한다. 도 4a 및 도 4b는 제1 유기 용매 스트림의 유량에 대한 수성 제2 스트림의 유량 증가가 입자 크기 감소 및 PDI 증가 경향을 유도한다는 것을 나타내고 있다. 도 4d는 제트 충돌 방법을 사용하여 제조된 리포솜에서의 TFR(유기 스트림:수성 스트림의 FRR은 1:2이었음)의 효과를 나타내고 있으며, 여기서, 입자 크기는 30ml/min 내지 300ml/min 범위의 TFR에 걸쳐 안정적으로 유지되었다. 도 4c는 미세 유체 시스템에서 TFR 증가 효과가 입자 크기에 영향을 미치는 것으로 나타나는 것을 비교하여 나타내고 있다.
도 5a 내지 도 5f는 두 가지 상이한 리포솜 지질 제형으로부터 실시예 2에 따라서 제조된 리포솜에 대한 FRR 및 TFR 효과를 나타내고 있다. TFR은 FRR 비교에대한 90 ml/min이었고, FRR은 TFR 비교에 대한 1:2(유기:수성)이었다. 도 5a 및 도 5b는 실시예 2에서 기재된 바와 같은 제형 1(n=3)의 리포솜에 대한 입자 크기 및 PDI에 대한 FRR(도 5a) 및 TFR(도 5b)의 효과를 나타낸다. 도 5c 및 도 5d는 실시예 2에 기재된 바와 같은 제형 2(n=1)의 리포솜에 대한 입자 크기 및 PDI에 대한 FRR(도 5c) 및 TFR(도 5d)의 효과를 나타낸다. 도 5e 및 도 5f는 각각 TFR 및 FRR를 기반으로 한 제형 1의 페길화된 리포솜(PEGylated liposome)의 1-주일 물리적인 안정성을 나타낸다(좌측 막대: t = 0, 우측 막대: 입자 크기 직경(nm)에 대해서 t = 1 주일; 원: t= 0, 삼각형: PDI에 대해서 t= 1 주일). 데이터는 동적 광산란을 이용하여 획득되었고, 평균 ± SD(n=3)로서 나타내어져 있다. 도 5g 및 도 5h는 각각 TFR 및 FRR를 기반으로 한 제형 2(n=1)의 페길화된 리포솜의 1-주일 물리적인 안정성을 나타낸다(좌측 막대: t = 0, 우측 막대: 입자 크기 직경(nm)에 대해서 t = 1 주일; 원: t= 0, 삼각형: PDI에 대해서 t= 1 주일). 데이터는 동적 광산란을 이용하여 획득되었다.
도 6a 및 도 6b는 상이한 TFR 조건에서 얻은 리포솜 샘플의 Cryo-TEM 이미지를 도시하고 있다. 도 6a는 샘플 제조에 사용되는 탄소 그리드에 주로 붙어 있는 수백 개의 작은 단일층 리포솜뿐만 아니라 큰 이중층 및 다소포성 입자(PDI: 0.17, TFR: 30 ml/min)를 도시하고 있다. 도 6b는 탄소 그리드(PDI: 0.165, TFR: 90 ml/min)에 붙어 있는 작은 단일층 소포의 주요 입자 분획 외에 작은 단일층 및 이중층 리포솜의 혼합을 도시하고 있다.
도 7은 본 발명의 방법(시스템 B)에 의해 얻은 실시예 3의 입자에 대한 Cryo-TEM 분석의 결과를 도시하고 있다.
도 8은 반응기 노즐 크기와 입자 크기(Z-평균, nm) 사이의 상관관계를 도시하고 있다. 반응기는 직경( ㎛)으로의 노즐의 크기에 따라 라벨링되어 있다. 예를 들어, 반응기 400/200은 제2 (수성) 스트림이 펌핑되는 직경 400 ㎛의 (제2) 노즐 개구부와 제1 (유기) 스트림이 펌핑되는 직경 200 ㎛의 (제1) 노즐 개구부를 갖는다.
도 9는 상이한 전체 유량(TFR)에서 로그 압력("Log Druck 절대 [bar]", x-축)과 입자 크기(Z-평균 [nm], y-축) 사이의 상관관계를 도시하고 있다(원: 50 ml/min; 별표: 180 ml/min; 삼각형: 312.5 ml/min). 파라미터 추정 절편 = 80.556; 기울기 = -3.2365.
도 10은 유량비(FRR)와 다분산도 지수(PDI; y-축) 사이의 상관관계를 도시하고 있다. 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 및 4로서 x-축 상에 표시된 유량비(FRR)는 각각 1:1.5, 1:2, 1:2.5; 1:3, 1:3.5 및 1:4의 유량비(제1/유기 스트림:제2/수성 스트림)을 의미한다. 점선은 95% 신뢰 구간(CI) 밴드를 나타낸다.
도 11은 실시예 5에 기술된 바와 같은 시스템 B에서 순환된 Fluc mRNA(APExbio)의 겔 전기영동을 도시하고 있다. 샘플을 이하 시점 후에 채취하여 좌측으로부터 우측으로 별도의 레인에서 분석하였다: L(사다리), t=0; 시작 전, 프라임 후, 2초, 5초, 10초, 20초, 30초, 1분, 2분, 3분, 4분 및 빈 레인(empty lane). 시작 t=0과 4분(장비를 통한 약 120회 계대에 해당)을 비교하면 유의미한 mRNA 분해가 관찰되지 않는다.
도 12는 형질감염당 10μg mRNA(EE% 검정에 따름)를 사용하여 실시예 6에 기재된 시험관내 형질감염 분석의 결과를 도시하고 있다. 모든 데이터 n=6, 비-파라미터, Kruskal-Wallis 포스트 AVG+/-SD, ** p<0.01. 높은 형질감염 속도가 각각 제트 충돌과 미세유체 혼합에 의해 생성된 두 테스트 그룹 FLuc-mRNA 부하 LNP에 대해 관찰되었다.
도 13은 실시예 6에 기재된 생체내 형질감염 분석의 결과를 그래프로 도시하고 있으며, 시간 경과에 따른(투여 후) 전체 신체에 대한 생체내 유전자 전달 정량화를 나타내고 있다. 도면에 도시된 바와 같이, FLuc 발현은 투여 후 6시간에 최고인 것으로 관찰되었으며, 그 이후에는 두 시험된 그룹 모두에서 유사하게 감소했다.
도 14는, 실제 축척이 아닌, 본 개시의 일 구체예에 따른 제트 충돌 반응기(1)를 도시하고 있다. 챔버 벽(3)의 내부 표면(2)에 의해 정의된 반응 챔버(6)는 두 개의 유체 입구(4)와 유체 출구(7)를 제외하고는 실질적으로 구형이다. 유체 입구(4)들은 반응 챔버(6)의 제1 중심 축(x)에서 반대 위치에 배열되고 서로를 향해 있다. 유체 입구(4)의 각각은 본 구체예에서 평면 오리피스 노즐인 노즐(5)을 포함한다. 유체 출구(7)는 제1 중심축(x)에 수직인 제2 중심축(y)에 위치한다. 두 노즐(4) 사이의 거리(d)는 구형 반응 챔버(6)의 직경과 실질적으로 동일하다.
도 15는 본 개시의 일 구체예에 따른 유체 입구 커넥터(10)를 도시하고 있다. 커넥터(10)는 상류 단부(11), 하류 단부(12)의 하류 위치에서 노즐(13)을 유지하는 하류 단부(12), 및 유체를 상류 단부(11)로부터 하류 단부(12)로 전달하기 위한 유체 도관(14)을 갖는다. 유체 입구 커넥터(10)는 본 발명에 따른 제트 충돌 반응기(미도시)를 위한 유체 입구를 제공하고 그러한 반응기의 벽에 가역적으로 삽입 가능하도록 설계된다. 수치는 비례하지 않는다.
도 16은, 또한 실제 축적으로 도시되지 않은, 본 개시의 또 다른 구체예에 따른 유체 입구 커넥터(20)를 도시하고 있다. 이러한 커넥터(20)는, 유체 입구를 제공하는 것과 같이, 본 발명에 따른 제트 충돌 반응기(미도시)의 벽에 가역적으로 삽입 가능하도록 설계된다. 이는 상류 단부(21), 하류 단부(22)의 하류 위치에서 노즐(23)을 유지하는 하류 단부(22), 및 유체를 상류 단부(21)로부터 하류 단부 (22)로 전달하기 위한 유체 도관(24)을 갖는다.
제1 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 양친매성 지질을 포함하는 나노입자의 분산액을 생산하는 방법으로서, a) 유기 용매 및 양친매성 지질을 포함하는 제1 스트림을 제공하는 단계; b) 수성 용매를 포함하는 제2 스트림을 제공하는 단계; c) 제1 스트림을 상승된 압력 하에 제1 노즐을 통해서 펌핑시키고 제2 스트림을 상승된 압력 하에 제2 노즐을 통해서 반응 챔버 내로 펌핑시키는 단계로서, 제1 노즐이 제2 노즐로부터 약 180°의 각도로 위치되는 단계; d) 제1 스트림과 제2 스트림을 방응 챔버에서 정면으로 충돌시키는 단계로서, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비가 1:1.5 내지 약 1:4.5의 범위에 있는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 주제는 본 개시의 일부를 형성하는 이하 상세한 설명을 참조함으로써 더 쉽게 이해될 수 있다. 본 개시는 본원에 기재되고/되거나 도시된 특정 제품, 방법, 조건 또는 파라미터에 제한되지 않으며, 본원에서 사용된 용어는 단지 예시로서 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며, 청구된 개시를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본 기술분야에서의 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥에 의해서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다.
본 개시에서, 단수형은 복수의 참조를 포함하고, 특정 수치 값에 대한 참조는, 문맥이 명백히 달리 나타내지 않는 한, 적어도 그 특정 값을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "복수"는 하나 초과를 의미한다. 값이 선행사 "약"을 사용하여 근사치로 표현되는 경우, 특정 값이 또 다른 구체예를 형성하는 것으로 이해된다. 모든 범위는 포함적이고 조합 가능하다. 일부 구체예에서, 용어 "약"은 표시된 수 또는 수들의 범위로부터 0.0001-10% 사이의 편차를 의미한다. 일부 구체예에서, 용어 "약"은 표시된 수 또는 수들의 범위로부터 최대 25%의 편차를 의미한다. 용어 "포함한다"는 나열된 모든 요소를 포함한다는 의미이지만, 명명되지 않은 추가 요소도 포함할 수 있으며, 그것은 모든 동일한 특성과 의미를 갖는 용어 "포괄한다" 또는 "함유한다"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "로 이루어진"은 언급된 요소 또는 단계로 구성되는 것을 의미하며, 그것은 모두 동일한 특성 및 의미를 갖는 용어 "구성된"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
나노입자의 분산액
본원에서 사용된 용어 "분산액"은 양친매성 지질을 포함하는 나노입자가 수성 액체와 같은 또 다른 물질의 연속상에 분산되는 시스템을 의미한다. 일부 구체예에서, 분산액은 콜로이드 용액, 콜로이드 또는 현탁액을 포함한다.
통상의 기술자는 초미세 입자로도 일컬어지는 "나노입자"가 일반적으로 약 1000 nm보다 작은 물질의 입자로 정의된다는 것을 이해할 것이다. 본원에 개시된 것들과 같은 나노입자 분산액에서, 나노입자의 입자 크기에는 차이가 있고, 그에 따라서, 나노입자의 "평균 입자 크기" 뿐만 아니라 "다분산 지수" 또는 "PDI"를 참조하는 것이 유용하다. 본원에서 나노입자의 크기를 기재하기 위해 사용된 용어 "평균 입자 크기"는 z-평균 직경을 의미한다. 본 문서 전체에 걸쳐서, z-평균 직경은 동적 광산란으로 측정됩니다. 동적 광산란(DLS)은 현탁액 중의 작은 입자의 크기 분포 프로파일을 결정하는 데 사용되는 것으로 일반적으로 알려진 물리학에서의 기술이다. 측정을 위해서, Malvern Panalytical Ltd으로부터의 Zetasizer 장치, 예를 들어, Malvern Zetasizer Advance Range 또는 Zetasizer AT 또는 Zetasizer ZS 또는 ZS90, 또는 Wyatt Technology Corporation으로부터의 DLS 기술과 같은 다른 적합한 장치가 사용될 수 있거나, Unchained Labs으로부터의 Stunner와 같은 장치가 또한 사용될 수 있다. 평균 입자 크기를 결정하기 위해서, Malvern Zetasizer Nano ZS 또는 Unchained Labs Stunner가 측정 동안에 25℃의 일정한 온도에서 사용될 수 있다. 다분산 지수(PDI)와 함께 z-평균 직경은 바람직하게는 ISO22412:2008에 정의된 바와 같이 DLS 측정된 세기 자기상관 함수(DLS measured intensity autocorrelation function)의 누적 분석으로부터 계산된다. PDI는 0에서 1까지 크기가 조정된 입자 크기 분포의 폭의 무차원 추정치이다. Malvern Instruments에 따르면, PDI ≤ 0.4인 샘플은 단분산인 것으로 여겨진다.
일부 구체예에서, 분산액의 나노입자는 1 내지 500 nm, 5 내지 400 nm, 10 내지 200 nm, 또는 20 내지 100 nm, 또는 30 내지 90 nm, 또는 40 내지 80 nm의 범위의 평균 입자 크기를 갖는다. 일부 구체예에서, 나노입자는 100 nm 미만, 또는 90 nm 미만, 또는 80 nm 미만, 또는 70 nm 미만의 평균 입자 크기를 포함한다. 일부 구체예에서, 나노입자는 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 또는 90 내지 100 nm의 범위의 평균 입자 크기를 포함한다. 일부 구체예에서, 나노입자는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 nm의 평균 입자 크기를 포함한다.
일부 구체예에서, 분산액의 나노입자는 0.4 미만, 또는 0.3 미만, 또는 0.25 미만, 또는 0.2 미만, 또는 0.1 미만의 다분산도 지수(PDI)를 갖는다. 일부 구체예에서, 나노입자의 PDI는 0.01 내지 0.05, 또는 0.05 내지 0.1, 또는 0.1 내지 0.15, 또는 0.15 내지 0.2, 또는 0.2 내지 0.25, 또는 0.25 내지 0.3의 범위에 있다.
지질 나노입자 조성물
본 발명의 방법에 의해 생성된 나노입자는 적어도 하나의 양친매성 지질을 포함하는 나노입자이다. 달리 설명하면, 생성된 나노입자는 지질-기반 나노입자, 또는 지질 나노입자이다. 지질 나노입자의 예는, 일부의 경우에, 수성 내부를 최소로 함유하거나 전혀 함유하지 않는, 복잡한 내부 구조를 갖는 나노입자 뿐만 아니라 리포솜과 같은 보다 구조화된 나노입자를 포함할 수 있으며, 이러한 용어는 전형적으로는 적어도 하나의 지질 이중층 및 임의로 수성-기반 내부 상을 포함하는 나노입자를 지칭하는 데 사용된다. 그러나, 용어 "리포솜"과 "지질 나노입자"(때때로 LNP로 약칭됨)는 또한 종종 상호 교환적으로 사용된다. 다른 표현이 리포플렉스(lipoplex), 리포폴리플렉스(lipopolyplex), 단일층 리포솜 또는 다중층 리포솜과 같은 특정 유형의 지질 나노입자에 대해 종종 사용된다.
일 구체예에서, 본 개시에 따른 방법은 지질 나노입자, 리포솜, 리포플렉스 또는 리포폴리플렉스, 및 이들의 조합으로부터 선택된 나노입자의 분산액을 생성시킨다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질-기반 나노입자는 단일층 리포솜(단일 이중층을 가짐), 다중층 리포솜, 다중 소포성 리포솜, 단일 이중층 리포솜, 이중 이중층 리포솜, 지질 나노입자, 리포플렉스 및 리포폴리플렉스의 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질-기반 나노입자는 위에 나열된 지질 나노입자 유형의 어떠한 조합이다.
통상의 기술자는 다수의 지질 나노입자가 현재 임상 목적으로 사용되고 있거나 임상 개발 단계에 있음을 이해할 것이다. 이들 나노입자 중 어떠한 것은 유기 및/또는 수성 용매 스트림에서 그들 성분의 전부 또는 일부의 충돌에 의해서 본원에 개시된 방법에 의해 생성될 수 있다.
일부 구체예에서, 지질 나노입자는 포스파티딜콜린, HSPC(수소화된 대두 포스파티딜콜린), 페길화된 지질, 예를 들어, PEG(폴리에틸렌 글리콜) 폴리머에 컨주게이션된 지질, DSPE (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), DSPC(디스테아로일포스파티딜콜린), DOPC(디올레오일포스파티딜콜린), DPPG (디팔미토일포스파티딜글리세롤), EPC (에그 포스파티딜콜린: egg phosphatidylcholine), DOPS(디올레오일포스파티딜세린), POPC(팔미토일올레오일포스파티딜콜린), SM(스핑고미엘린), MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)에 컨주게이션된 지질, DMPC(디미리스토일 포스파티딜콜린), DOTAP, DMPG(디미리스토일 포스파티딜글리세롤), DSPG(디스테아로일포스파티딜글리세롤), DEPC(디에루코일포스파티딜콜린), DOPE(디올레오일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)에 공유 결합된, 즉, 컨주게이션된 지질, mPEG-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 지질 컨주게이트(mPEG-distearoyl phosphatidylethanolamine lipid conjugate), mPEG에 공유 결합된 인지질, 카르디올리핀(cardiolipin), DSPE-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000], 또는 이들의 어떠한 조합물의 군으로부터 선택된 양친매성 지질을 포함한다.
일부 구체예에서, 지질 나노입자는 DPPC 및 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자은 HSPC:콜레스테롤:PEG 2000-DSPE를 56:39:5의 몰 비율로 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 DSPC 및 콜레스테롤을 2:1의 몰 비율로 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 DOPC, DPPG, 콜레스테롤 및 트리올레인(Triolein)을 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 EPC 및 콜레스테롤을 55:45의 몰 비율로 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 DOPS 및 POPC를 3:7의 몰 비율로 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 SM 및 콜레스테롤을 60:40의 몰 비율로 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 DSPC, MPEG-2000, 및 DSPE를 3:2:0.015의 몰 비율로 포함한다.
일부 구체예에서, 지질 나노입자는 DMPC 및 DMPG를 7:3의 몰 비율로 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 HSPC, DSPG, 콜레스테롤, 및 활성 성분(예, 암포테리신 B: Amphotericin B)을 2:0.8:1:0.4의 몰 비율로 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 콜레스테릴 설페이트 및 암포테리신 B를 1:1의 몰 비율로 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 DMPC 및 EPG를 1:8의 몰 비율로 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 DOPC, DPPG, 콜레스테롤 및 트리올레인을 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 DEPC, DPPG, 콜레스테롤 및 트리카프릴린을 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 DOPC 및 DOPE를 75:25의 몰 비율로 포함한다.
일부 구체예에서, 지질 나노입자는 (4-하이드록시부틸)아잔디일)비스(헥산-6,1-디일)비스(2-헥실데카노에이트), 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세타미드, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 및 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 SM-102, 폴리에틸렌 글리콜 [PEG], 2000-디미리스토일 글리세롤[DMG], 콜레스테롤, 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린[DSPC]을 포함한다.
통상의 기술자는 용어 "양친매성 지질"이 친수성 및 친지성 특성을 포함하는 어떠한 지질을 포함하며 이들 양친매성 지질 중 어떠한 것이 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구체예에서, 양친매성 지질은 지방산, 글리세로지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 글리세로인지질, 인지질, 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린(SPC), 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 스핑고리피드(sphingolipid), 스테롤(sterol), 콜레스테롤, 프레놀(prenol), 카로테노이드(carotenoid), 레티놀(retinol), 레티날(retinal), 레티노산(retinoic acid), 베타-카로텐, 토코페롤, 사카로리피드(saccharolipid), LIPOID S100, 페길화된 지질, 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG), 및 이들 지질의 조합물의 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예 중 하나에서, 양친매성 지질은 인지질이거나, 이를 포함한다.
일부 구체예에서, 양친매성 지질은 양이온성 지질, 음이온성 지질, 또는 중성 지질, 즉, 약 pH 3 내지 pH 9에서, 특히, 약 pH 5 내지 pH 8의 범위의 pH에서 각각 순수한 양 전하, 순수한 음 전하, 또는 순수한 중성 전하를 띠는 지질을 포함한다. 일부 구체예에서, 양친매성 지질은 페길화된 지질, 즉, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머와 컨주게이션된 지질을 포함한다. 일 구체예에서, 나노입자는 적어도 하나의 양이온성 지질, 즉, 약 pH 3-pH 9에서 순수한 양 전자를 띠는 지질을 포함한다. 양이온성 지질은 모노양이온성 또는 폴리양이온성일 수 있다. 어떠한 양이온성 양친매성 분자, 예를 들어, 적어도 하나의 친수성 및 친지성 모이어티를 포함하는 분자는 본 발명의 의미 내의 양이온성 지질이다. 일 구체예에서, 양이온성 지질은 이온화 가능한 지질이다. 일 구체예에서, 적어도 하나의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTMA) 또는 이의 유사체 또는 유도체 및/또는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 적어도 하나의 양이온성 지질은, 예를 들어, 핵산과 같은 음으로 하전된 활성 약제학적 성분과 복합화되는 때에, 양전하를 내놓는다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 양친매성 지질, 예컨대, 인지질 및 콜레스테롤을 포함한다. 적어도 하나의 양친매성 지질을 포함하는 나노입자를 생성시키기 위한 본 개시에 따른 방법은 유기 용매 및 적어도 하나의 상기 양친매성 지질을 포함하는 제1 스트림을 제공하는 단계를 포함한다. 따라서, 제1 스트림은 유기 용매 및 적어도 하나의 양친매성 지질, 예컨대, 본원에서 기재된 양친매성 지질 중 어느 하나, 또는 본원에서 기재된 바와 같은 양친매성 지질의 부류 또는 종의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 스트림은 유기 용매 및 양친매성 지질들의 조합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 제1 스트림은 유기 용매, 및 양이온성 지질, 인지질, 콜레스테롤, 및 페길화된 지질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제1 스트림은 용액, 즉, 지질(들)이 유기 용매, 예컨대, 에탄올에 가용화되거나 완전히 용해되는 액체 용액이다. 한 가지 특이적 구체예에서, 제1 스트림은 에탄올, 이온화 가능한 양이온성 지질, 예컨대, 아미노 지질(예, DLin-KC2-DMA, 또는 DLin-MC3-DMA), 콜레스테롤, 인지질 및 페길화된 지질(예, DMG-PEG)을 포함한다. 일부 구체예에서, 양이온성, 또는 이온화 가능한 양이온성 지질의 양은 유기 스트림 또는 용매 중의 지질의 전체 조성물에 대해서 적어도 50 mol %이다.
일부 구체예에서, 제1 스트림은 에탄올, 및 지질 PEG2000-C-DMG(1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000), N,N-디메틸-2,2-디-(9Z,12Z)-9,12-옥타데카디엔-1-일-1,3-디옥솔란-4-에탄아민(DLin-KC2-DMA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 및 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 스트림은 유기 용매로서의 에탄올, 및 지질 DMG-PEG(1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 및 콜레스테롤을 포함한다.
다른 구체예에서, 제1 스트림 또는 제2 스트림은 추가로 적어도 하나의 추가의 양친매성 지질을 포함한다. 본원에서 이해되는 바와 같이, 적어도 하나의 추가의 양친매성 지질은, 적어도 하나의 양친매성 지질 외에, 제2, 제3, 또는 제4 등의 양친매성 지질을 의미한다. 바람직하게는, 유기 용매 스트림은 하나 이상의 양친매성 지질을 포함한다. 추가의 양친매성 지질은 페길화된 지질, 콜레스테롤, 이온화 가능한 양이온성 지질, 및 인지질(DSPC와 같은)의 군으로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, 제1 스트림 또는 제2 스트림은 페길화된 지질을 0.1 mol% 내지 2 mol%의 범위의 농도로 포함한다. 한 가지 특이적 구체예에서, 제1 스트림은 유기 용매 및 0.1 mol% 내지 2 mol%의 범위의 농도의 페길화된 지질을 포함한다.
일부 구체예에서, 개시된 방법에 따라서 제조된 나노입자는 추가로 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함한다. 헬퍼 지질은 중성 또는 음이온성 지질일 수 있다. 일부 구체예에서, 헬퍼 지질은 중성 지질, 예컨대, 인지질을 포함한다. 일부 구체예에서, 헬퍼 지질은 중성 지질의 유사체를 포함한다. 일부 구체예에서, 헬퍼 지질은 완전한 합성 지질을 포함한다. 일부 구체예에서, 헬퍼 지질은 중성 지질과는 유사성이 없는 지질-유사 분자를 포함한다. 헬퍼 지질은 지질 나노입자의 안정성에 기여하고 전달 효율성에 기여한다. 특이적 구체예에서, 헬퍼 지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 페길화 지질, 지방산 및 콜레스테릴 헤미석시네이트(CHEMS), 또는 이들 화합물의 유사체 또는 유도체로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 나노입자는 양이온성 지질 및 중성 또는 음이온성 지질로부터 선택된 헬퍼 지질을 포함한다. 일부 구체예에서, 나노입자 분산액 또는 나노입자는 단일 이중층 리포솜을 포함한다. 일부 구체예에서, 나노입자 분산액 또는 나노입자는 이중 이중층 리포솜을 포함한다. 일부 구체예에서, 나노입자의 분산액은 하나 초과의 유형의 리포솜을 포함한다. 일부 구체예에서, 양친매성 지질을 포함하는 나노입자 분산액 또는 나노입자는 단일층 리포솜을 포함한다. 통상의 기술자는 단일층 리포솜이 수성 용액을 둘러싸는 단일의 인지질 이중층 구체를 갖는 소포를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 일부 구체예에서, 나노입자는 다중층 리포솜을 포함한다. 다중층 리포솜은 "양파" 구조를 갖는 소포, 즉, 하나 하나 겹쳐진 일련의 여러 개의 단일층 소포들을 포함하여, 물 층에 의해서 분리된 동심 인지질 구체들의 다중층 구조를 생성시킨다.
일부 구체예에서, 개시된 방법에 따라서 생성된 나노입자 분산액은 핵산을 포함하는 지질 나노입자의 분산액이다. 일부 구체예에서, 나노입자 분산액 또는 나노입자는 리포플렉스를 포함한다. 통상의 기술자는, 때로는 리포폴리플렉스로도 일컬어지는, 리포플렉스가 지질 소포에 의해서 캡슐화된 핵산을 포함하는 복합체를 의미한다는 것을 이해할 것이다. 리포폴리플렉스는 전형적으로는 또한, 핵산 및 지질성 성분 외에, 폴리머를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지질성 소포는 리포솜, 핵산을 포함하는 수성 코어를 갖는 이중층화된 구조일 수 있다. 일부 구체예에서, 리포플렉스는 지질과 핵산 사이의 비한정된 복합체를 포함한다. 일부 구체예에서, 리포플렉스는 양으로 하전된 지질성 소포와 음으로 하전된 핵산 사이의 정전기적 상호작용에 의해서 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시에 따른 나노입자 분산액 또는 나노입자는 통상의 리포솜, pH-민감성 리포솜, 양이온성 리포솜, 장기 순환 리포솜(long circulating liposome), 또는 면역-리포솜(immuno-liposome)을 포함한다.
활성 약제학적 성분(API)
일부 구체예에서, 나노입자는 활성 약제학적 성분(API)을 포함한다. 일부 구체예에서, 특히, API가 핵산을 나타내지 않는 작은 분자인 경우에, API는 제1 스트림의 유기 용매에 용해되거나 가용화된다. 일부 구체예에서, API는 제2 스트림의 수성 용매에 용해되거나 가용화된다. 달리 설명하면, 본 발명의 방법의 단계 a) 하에 제공된 제1 스트림은 추가로 API를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법의 단계 b) 하에 제공된 제2 스트림은 API를 포함할 수 있다. 특이적 구체예에서, 나노입자는 단계 a) 및/또는 단계 b) 하에 제공될 수 있는 적어도 두 개의 상이한 API를 포함한다. 이들 구체예는 상이한 용해도 정도를 갖는 활성 성분을 통합시킬 때에 유연성을 제공한다.
일부 구체예에서, API는 소수성 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, API는 친수성 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, API는 양친매성 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, API는 작은 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, API는 핵산, 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 구체예에서, API는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터(예, 아데노-바이러스 연관된 벡터) 또는 플라스미드를 위한 유전 물질이거나 이를 포함하는 핵산 분자일 수 있다. 일부 구체예에서, API는 DNA 분자 또는 이의 유도체, 예를 들어, 플라스미드 DNA를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, API는 RNA 분자 또는 이의 유도체를 포함한다. 특이적 구체예에서, RNA 분자는 mRNA, miRNA, pre-miRNA, saRNA, shRNA, siRNA, 리보자임, 및 안티센스 RNA의 군으로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, 핵산은 항원-코딩(antigen-coding), 예컨대, 항원-코팅 DNA 또는 mRNA이다. 일부 구체예에서, API는 폴리펩티드 또는 이의 유도체를 포함한다.
통상의 기술자는 다수의 API가 시장에서 또는 개발 중에 이용 가능하며 이들 API 중 어떠한 것이 본원에서 개시된 방법에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구체예에서, API는 지도부딘(Zidovudine), 암포테리신 B, 젠타마이신(Gentamycin), 폴리믹신 B(Polymixin B), 독소루비신(Doxorubicin), 케타코나졸(Ketaconazole), 아세타졸아미드(Acetazolamide), N-메틸-N-D-프룩토실 암포테리신 B 메틸 에스테르(MFAME), 페로스 설페이트(Ferrous sulphate), 하이드록시진(Hydroxyzine), 토포테칸 HCl(Topotecan HCl), 다우노루비신(Daunorubicin), 사이테라빈(Cytarabine)/Ara-C, 미파무르티드(Mifamurtide), 빈크리스틴(Vincristine), 이리노테칸(Irinotecan), 암포테리신 B, 베르테포르핀(Verteporphin), 모르핀 설페이트(Morphine sulfate), 부피바카인(Bupivacaine), 불활성화된 간염 A 바이러스(Inactivated hepatitis A virus)(균주 RGSB), 인플루엔자 바이러스 균주 A 및 B의 불활성화된 헤마글루티닌(Inactivated hemaglutinine of Influenza virus strains A and B), 아미카신(Amikacin), 테세모티드(Tecemotide), T4 엔도누클레아제 V(T4 endonuclease V), 프로스타글란딘 E-1(Prostaglandin E-1)(PGE-1), 시스플라틴(Cisplatin), 백금 유사체 시스-(트랜스-R,R-1,2-디아미노사이클로헥산) 비스(네오데카노에이토)백금(II)(Platinum analogue cis-(trans-R,R-1,2-diaminocyclohexane) bis (neodecanoato) platinum (II)), 반합성 독소루비신 유사체 아나마이신(Semi-synthetic doxorubicin analogue annamycin), 루르토테칸(Lurtotecan), 강력한 ㅌ토포이소머라제 I 억제제(Potent topoisomerase I inhibitor), 이리노테칸의 활성 대사물, 파클리탁셀(Paclitaxel), 올-트랜스 레티노산(All-trans retinoic acid), 미토잔트론(Mitoxantrone), 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 성장 인자 수용체 결합된 단백질 2(Antisense oligodeoxynucleotide growth factor receptor bound protein 2)(Grb-2), 비노렐빈 타르트레이트(Vinorelbine tartrate), 토포테칸(Topotecan), PLK1 siRNA, PKN3 siRNA, CEBPA siRNA, 도세탁셀(Docetaxel), p53 유전자, 또는 비노렐빈(Vinorelbine), 또는 이들의 조합물로부터 선택되지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 활성 성분은 항원을 인코딩하는 RNA, 예컨대, 예를 들어, 코로나바이러스 항원을 인코딩하는 RNA 또는 mRNA이다. 일부 구체예에서, API는 BNT162b2 RNA(BioNTech)를 포함한다. 일부 구체예에서, 활성 성분은 mRNA-1273 (Moderna)을 포함한다. 일부 구체예에서, API는 ChAdOx1-SARS-COV-2(AstraZeneca)를 포함ㅎ나다. 언급된 바와 같이, 본 개시에 따른 방법은 수성 용매를 포함하는 제2 스트림을 제공하는 단계를 포함한다. 수성 용매는 완충 시스템, 완충된 수성 용매, 예를 들어, PBS, 아세테이트 완충액, 시트레이트 완충액, 또는 TRIS 완충액일 수 있다. 임의로, 수성 용매는 다른 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 수성 용매는 동결보호제(cryoprotectant), 예컨대, 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 글루코오스, 프룩토오스, 프롤린, 소르비돌, 글리신 베타인, 폴리에틸렌 글리콜, 전분 및 덱스트란을 포함할 수 있다. 수성 용매는, 일부 구체예에서, API에 대한 비-용매일 수 있고, 이때, API는 제1 스트림에 제공된다.
충돌 제트 반응기
언급된 바와 같이, 본 발명의 방법은 제트 충돌로도 일컬어지는 두 스트림의 정면 충돌을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 스트림은 유체 물질, 예컨대, 액체의 스트림을 의미한다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 나노입자는 충돌 제트 반응기에서 생성된다. 그러한 반응기의 예는 EP1165224호, EP 1352682호, 및 US2017/0361299호에 개시되어 있다. 마이크로제트 반응기(microjet reactor)가 충돌 제트 반응기의 예이다. 추가로, 제트 충돌에 의한 용매/비용매 침전 방법이 본 기술분야에서 기재되어 있으며, 예를 들어, EP2395978호에 개시되어 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 충돌 제트 반응기는 유기 용매를 포함하는 제1 스트림 및 수성 용매를 포함하는 제2 스트림이 공급되는 반응기를 포함한다. 각각의 스트림은 노즐을 통해서 상승된 압력으로 강제된다. 노즐은 직경 5-900 ㎛의 범위의 개구부를 가질 수 있다. 또한, 약 20 ㎛ 내지 약 800 ㎛ 범위의 직경이 바람직하다. 본원에서 또한 핀홀들로 일컬어지는 노즐들은 서로 반대로 위치된다. 즉, 이들의 핀홀은 약 180°의 각도로 서로를 가리키도록 배열된다. 따라서, 주입된 스트림은 반응기의 혼합 챔버 내에서 정면으로, 즉, 약 180°에서 그리고 고속으로 충돌하고, 이는 나노입자 현탁액을 생성하는 집중적인 난류 혼합물을 생성시킨다. 이들 노즐, 또는 핀홀은 반응기 챔버 내에서 충돌하는 고압 제트를 생성시켜서 감소되거나 짧은 혼합시간을 가능하게 한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 방법에 따르면, 유기 용매 및 양친매성 지질을 포함하는 제1 스트림은 상승된 압력 하에 제1 노즐을 통해 펌핑된다. 수성 용매를 포함하는 제2 스트림은 제2 노즐을 통해 상승된 압력 하에 펌핑된다. 상승된 압력은 통상의 기술자에게 알려진 바와 같이 제1 및 제2 펌프에 의해 제공된다. 본원에서에 사용된 용어 "상승된 압력"은 고압 또는 상승된 유체역학적 압력과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 대기압보다 높은 어떠한 압력을 의미한다.
제1 스트림과 제2 스트림은 두 스트림이 정면으로 충돌하는 반응 챔버로 펌핑된다. 본원에서 동시에 사용되는 반응 챔버 또는 반응기 챔버는 두 스트림이 고도의 난류 혼합 구역을 형성하기 위한 공동을 제공한다.
제1 스트림과 제2 스트림이 충돌하는 동안에, 스트림은 충돌하는 액체 제트로 간주될 수 있다. 일부 구체예에서, 생산 동안에 사용되는 충돌 제트에 대한 유체역학적 압력은 이론적 기초로 계산되고/되거나 압력계를 사용하여 모니터링된다.
제1 스트림과 제2 스트림의 충돌 스트림에 대한 유체역학적 압력 계산은 방정식 1에 의해서 계산될 수 있다:
방정식 1:
상기 식에서,
p = 스트림 중의 압력([bar] 또는 [kPa], 여기에서, 1 bar는 100 kPa임)
ρ = 스트림의 조성(모든 구성요소)의 밀도([kg/m³])
Q = 스트림의 유량([m³/s])
r = 핀홀의 반경([m]).
스트림 속도 v[m/s]는 방정식 2에 따라서 계산될 수 있다:
방정식 2:
일부 구체예에서, 유량은 충돌 제트 반응기(예, 마이크로제트 반응기)로 가는 공급 라인에 유량계를 구현하여 측정되어서, 흐름이 또한 공정 동안에 확인될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시는 적어도 하나의 양친매성 지질을 포함하는 나노입자의 분산액을 생산하는 방법을 제공하고 있으며, 여기에서, 상기 방법은, a) 유기 용매 및 양친매성 지질을 포함하는 제1 스트림을 제공하는 단계; b) 수성 용매를 포함하는 제2 스트림을 제공하는 단계; c) 제1 스트림을 상승된 압력 하에 제1 노즐을 통해서 펌핑시키고 제2 스트림을 상승된 압력 하에 제2 노즐을 통해서 반응 챔버 내로 펌핑시키는 단계로서, 제1 노즐이 제2 노즐로부터 약 180°의 각도로 위치되는 단계; d) 제1 스트림과 제2 스트림을 방응 챔버에서 정면으로 충돌시키는 단계를 포함하고; 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비가 1:1.5 내지 1:4.5의 범위에 있고; 상기 방법은 상기 제1 및 제2 노즐과 반응 챔버를 포함하는 충돌 제트 반응기의 사용 또는 제공을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시는 적어도 하나의 양친매성 지질을 포함하는 나노입자의 분산액을 생산하는 방법을 제공하며, 여기에서, 상기 방법은,
제1 노즐 및 제2 노즐, 및 반응 챔버를 포함하는 제트 충돌 반응기를 제공하는 단계로서, 제1 노즐이 제2 노즐로부터 약 180 °의 각도로 위치되는, 단계;
a) 유기 용매 및 양친매성 지질을 포함하는 제1 스트림을 제공하는 단계;
b) 수성 용매를 포함하는 제2 스트림을 제공하는 단계;
c) 반응 챔버 내로 제1 스트림을 상승된 압력 하에 제1 노즐을 통해서 펌핑하고 제2 스트림을 상승된 압력 하에 제2 노즐을 통해서 펌핑하는 단계;
d) 반응 챔버에서 제1 스트림과 제2 스트림을 정면으로(약 180°의 각도로) 충돌시키는 단계를 포함하고;
여기에서, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비는 1:1.5 내지 1:4.5의 범위에 있다.
일부 구체예에서, 본 개시에 따른 방법에서 제공되는 충돌 제트 반응기는 서로 반대로(서로 약 180°의 각도로) 위치된 적어도 두 개의 노즐(핀홀)을 갖는다. 각각의 제1 및 제2 노즐은 공급 라인과 연결될 수 있고, 여기에서, 임의로 각각의 공급 라인은 상승된 압력에서 본원에서 기재된 구체예들 또는 구체예들의 조합에 따른 제1 스트림 및 제2 스트림을 각각의 노즐에 제공하도록 배열된 펌프와 연관되어 있다. 이들 스트림은, 임의로 반응기 하우징에 의해 둘러싸일 수 있는, 반응기 챔버의 공통 충돌 지점에서 충돌할 수 있다. 임의의 구체예에서, 또 다른 개구부가 반응기 하우징에 제공되고, 이를 통해서, 임의로 가스, 증발 액체, 냉각 액체 또는 냉각 가스가 통과하여 반응기 챔버 내의 가스 대기를 유지시키거나 냉각시킨다. 추가 구체예에서, 이러한 개구부는 존재하지 않는다. 추가의 개구부가 생성된 생성물 및 임의로 과잉 가스를 반응기 챔버로부터 제거하기 위해 제공된다. 가스, 증발 액체 또는 냉각 가스가 반응기 내의 가스 대기를 유지시키거나 생성된 생성물을 냉각시키기 위해서 개구부를 통해서 반응기 챔버 내로 도입되는 구체예에서, 생성된 생성물 및 과잉 가스는 가스 입구 측의 과압에 의해서 또는 생성물 및 가스 출구 측의 저압에 의해서 이러한 개구부를 통해 반응기 챔버로부터 제거될 수 있다. 용매/비용매 침전의 사용은, 본원에 기재된 구체예 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 따라 기재된 바와 같이, 침전된 지질-기반 나노입자의 분산액을 얻기 위해 충돌 제트 반응기에서 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되거나 제공되는 제트 충돌 반응기는, 아래에 더 자세히 설명되는 바와 같이, 실질적으로 회전 타원체의 전체 모양을 갖는 반응 챔버 벽의 내부 표면에 의해 정의되는 반응 챔버를 포함한다. 반응 챔버는 추가로 그것이 (a) 제1 및 제2 유체 입구로서, 제1 및 제2 유체 입구가 서로 가리키도록 반응 챔버의 제1 중심 축의 반대 위치에 배열되고, 제1 및 제2 유체 입구의 각각이 노즐을 포함도록 구성되는, 제1 및 제2 유체 입구; 및 (b) 제3 위치에 배열된 유체 출구로서, 제3 위치가 상기 챔버의 제2 중심 축에 위치되고, 제2 중심 축이 제1 중심 축에 수직이도록 구성되는, 제3 위치에 배열된 유체 출구를 포함하는 것을 특징으로 한다. 더욱이, 제1 유체 입구의 노즐과 제2 유체 입구의 노즐 사이의 거리는 제1 중심 축을 따라 이어진 반응 챔버의 직경과 동일하거나 작다.
통상의 제트 반응기에 비한 실질적인 개선은, 특히, 반응 챔버의 실질적으로 회전 타원체의 전체 모양 및 특히 유체 입구 노즐들 사이의 상대적으로 짧은 거리에 의해 반영되는 작은 크기를 기반으로 하여, 그러한 반응기에 의해서 달성될 수 있다. 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 회전 타원체의 전체 모양은 내부 각도, 가장자리 또는 모서리 및 관련된 불용 부피 영역(dead volume zone)을 갖는 본 기술분야에서 공지된 불규칙한 성형 반응 챔버의 불리한 효과 중 일부를 제거하는 것으로 여겨진다. 유체 입구 노즐들 사이의 작은 크기 및 최소화된 거리는 챔버 내에서 유체의 난류 혼합을 강화하고, 노즐에 의해서 챔버 내로 주입되는 두 유체의 정면 충돌을 달성하는 것과 같이 동일한 축 상의 노즐들의 적절한 정렬을 촉진하는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용되는 용어, 실질적으로 회전 타원체의 전체 모양은 챔버 벽의 내부 표면에 의해서 정의되는 반응 챔버의 적어도 더 큰 부분이 구체의 모양을 갖거나 구체와 유사함을 의미한다. 예를 들어, 구형은 그 단면의 일부가 타원이도록 성형될 수 있다. 일 구체예에서, 입구 또는 출구 개구부를 보유하거나 정의하는 부분을 제외한, 반응 챔버 또는 챔버 벽의 내부 표면의 모든 부분은 실질적으로 회전 타원체이거나 심지어 구형이다.
노즐 또는 입구 개구부의 직경에 비해 직경이 전형적으로 상대적으로 큰 출구 개구부가 반응 챔버의 달리 구형 모양으로부터의 편차로서 이해되는 경우에, 반응 챔버의 모양은 구형 돔으로도 일컬어지는 구형 캡(spherical cap)으로도 기재될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 그러한 구형 캡은 제1 중심 축을 따라(즉, 그에 두 유체가 위치됨) 높이, 베이시스(basis) 및 반경을 가지며, 여기에서, 높이는 상기 반경보다 더 크고, 베이시스는 유체 출구에 의해서 정의된다. 달리 설명하면, 반응 챔버에 의해서 형성된 구형 돔은 상응하는 반구보다 부피가 더 크고, 이는 또한 출구 개구부가 반응 챔버의 최대 직경보다 작음을 의미한다. 특이적 구체예에서, 돔의 높이는 반경의 약 110% 내지 약 170%의 범위에 있다. 예를 들어, 높이는 반경의 약 120% 내지 약 160%, 예컨대, 반경의 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 또는 약 160%일 수 있다.
본 개시에 따른 방법에 따라서 사용될 수 있는 반응기의 또 다른 바람직한 특징은 노즐의 배열과 관련이 있다. 언급된 바와 같이, 제1 및 제2 유체 입구의 각각은 노즐을 포함하고, 반응기의 조립된 상태에서, 제1 유체 입구의 노즐과 제2 유체 입구의 노즐 사이의 거리는 제1 중심 축을 따라 이어진 반응 챔버의 직경과 동일하거나 그보다 작다. 이는 후퇴된 노즐을 갖는 본 기술분야에서 공지된 일부 제트 반응기와는 대조적이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 노즐 - 보다 정확하게는 이들의 하류 단부 - 은 후퇴되지도 않고, 이들은 반응 챔버 내로 돌출되지도 않지만, 반응 챔버 벽의 내부 표면과 실질적으로 정렬된다.
상기 설명된 선호 사항에 따라 배열되는 경우, 반응 챔버에는 노즐들 사이의 작은 거리에 또한 상응하는 다소 작은 내부 부피가 제공되는 것이 추가로 바람직하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 제1 노즐과 제2 노즐 사이의 거리는 하류 단부(즉, 반응 챔버의 중심을 가리키는 노즐의 단부) 사이의 거리로 이해되어야 한다. 바람직한 반응 챔버 부피는 약 0.5mL 미만이고, 노즐들 사이의 바람직한 거리는 약 7mm 미만이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 반응 챔버는 약 0.25mL 이하의 부피를 가지며, 제1 유체 입구의 노즐과 제2 유체 입구의 노즐 사이의 거리는 5mm 이하이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 반응 챔버의 부피는 약 0.2 mL 이하, 예를 들어 약 0.15 mL이고, 두 노즐 사이의 거리는 약 4 mm 이하이다. 더 작은 치수도 유용할 수 있다. 명확하게 하기 위해, 반응 챔버의 부피에 대한 이러한 우선 순위를 제공할 목적으로, 각각의 값은 반응 챔버가 출구 개구부와 관계없이 실질적으로 구형 모양을 갖는다는 가정 하에 계산되었다는 점에 유의해야 한다. 달리 설명하면, 출구 개구부는 그것이 유리되는 구체보다 부피가 작은 구형 캡의 베이스를 형성하는 것으로 해석되지 않았다. 출구 개구부가 반응 챔버의 부피를 나타내는 구형 세그먼트의 베이스를 형성하도록 평면인 것으로 이해되어야 하는 경우에, 출구 개구부의 치수를 고려하여, 상기 제공된 mL 단위 값이 적절하게 조정되어야 한다.
일 구체예에서, 반응 챔버에는 다른 입구 또는 출구 개구부가 없다. 달리 설명하면, 제1 및 제2 유체 입구와 유체 출구는 챔버 벽에 제공되는 반응 챔버의 유일한 개구부를 나타낸다. 이는 또한 반응 챔버에 도입될 가스를 위한 입구 또는 탈기 목적을 위한 출구와 같은 하나 이상의 추가 입구를 나타낼 수 있는 제트 충돌 반응기의 다른 구체예와도 대조된다. 충돌 과정을 부정적으로 방해하고 제어되지 않은 침전을 초래하거나 그러한 추가 개구부에 오염이 축적될 수 있는 추가 입구 또는 출구를 갖지 않는 것이 유리할 수 있다. 그러한 반응기는 제1 유체 스트림과 제2 유체 스트림의 상호 작용 및 혼합에 대한 더 나은 제어, 향상된 세정성 및 증가된 배치 간 일관성(batch-to-batch consistency)이라는 이점을 가져올 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폐쇄 메커니즘에 의해서 불활성화되는 하나 이상의 추가의 입구 또는 출구를 구비한 반응 챔버를 갖는 반응기는 또한 반응 챔버가 두 개의 필수적으로 요구되는 제1 및 제2 유체를 위한 입구 개구부 및 반응 챔버 내의 제1 및 제2 유체 스트림의 혼합(및/또는 반응)으로부터 생성되는 유체를 위한 출구 개구부를 넘는 추가의 입구 또는 출구 개구부를 갖지 않는 반응기로 이해되어야 한다.
제트 충돌 반응기의 기본적인 개념에 따라서, 일부 구체예에서, 반응기는 바람직하게는, 두 유체가 서로 충돌하거나 정면으로 충돌하는 방식으로, 제1 유체(즉, 유기 용매와 양친매성 지질을 포함하는 제1 스트림) 및 제2 유체(즉, 수성 용매를 포함하는 제2 스트림)을 반응 챔버 내로 유도하는 것과 같이 구성되고/거나 배열되어야 한다. 이는 특히 두 개의 유체 입구에 포함되는 노즐의 정밀한 위치 지정 및 방향과 관련이 있다. 바람직한 구체예에서, 그에 따라서, 제트 충돌 반응기는 제1 및 제2 유체 입구의 노즐이 제1 및 제2 유체 스트림을 제1 중심 축을 따라 챔버의 중심을 향해 지향시키도록 그리고 제1 유체 스트림과 제2 유체 스트림이 약 180°의 각도로 충돌할 수 있도록 배열되는 것을 특징으로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 약 180° 각도에서의 충돌은 정면 충돌이라고도 일컬어질 수 있다. 이러한 문맥에서, 표현 "약"은 제1 액체 스트림과 제2 액체 스트림의 충돌이 혼합 영역에서 빠르고 고도로 난류가 심한 유체 흐름이 발생하여 철저한 혼합이 극히 짧은 시간 내에, 예를 들어, 전형적으로는, 밀리초 내에 이루어지도록 실제 각도가 180°에 충분히 가까운 것을 의미한다.
일부 구체예에서, 제트 충돌 반응기는 교환 가능한 노즐을 갖추고 있다. 이는 동일한 반응기를 사용하여 공정 파라미터를 빠르게 스크리닝할 수 있으므로 제품 및 공정 개발 노력을 가속화할 것이다. 이는 전형적으로 제거 불가능하거나 교체 불가능한 노즐, 즉, 비파괴적인 방식으로 반응기로부터 분리될 수 없는 방식으로 접착, 용접, 크림핑(crimping) 또는 열피팅(thermofitting)된 노즐을 거져서 특정 공정 파라미터의 테스트, 특히, 상이한 노즐 직경의 테스트가 각각의 일련의 실험 내에서 여러 반응기의 사용을 필요로 하게 되는 선행 기술 반응기와는 다르다. 본원에서 사용된 바와 같이, 노즐 직경은 노즐 직경은 노즐 개구부의 내부 직경으로 이해되어야 하며, 이는 또한 노즐이 평면 오리피스 노즐(plain orifice nozzle)인 경우의 핀홀 크기 또는 직경으로도 일컬어질 수 있다. 달리 설명하면, 본 구체예는 반응기의 다양성을 실질적으로 증가시킨다.
일 구체예에서, 제1 및 제2 유체 입구의 각각은 상류 단부, 제1 또는 제2 유체 입구의 노즐을 고정하는 하류 단부, 및 상류 단부로부터 하류 단부로 유체를 전달하기 위한 유체 도관을 갖는 유체 입구 커넥터(fluid inlet connector)에 의해 제공되며; 여기에서, 각각의 유체 입구 커넥터의 하류 단부는 제1 및 제2 유체 입구를 제공하는 것과 같이 챔버 벽 내로 가역적으로 삽입 가능하다. 본 구체예에 따르면, 노즐은 노즐을 고정하는 가역적으로 삽입 가능한 입구 커넥터가 제공된다는 점에서 교환 가능하다. 노즐은 교환 가능한 커넥터에 단단히 부착되어 있을 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 입구 커넥터(또는 유체 입구 커넥터)는 상류 단부와 하류 단부, 및 상류 단부와 하류 단부 사이에 유체 연결을 제공하도록 구성된 내부 유체 도관을 갖는 어떠한 부품일 수 있다.
교환 가능한 유체 입구 커넥터(및 그에 따른 교환 가능한 노즐)를 갖춘 이러한 반응기 구성의 장점은 반응기가 더 나은 세척성과 감소된 사이클 시간을 나타낸다는 것이다. 쉽게 교체될 수 있는 교환 가능한 노즐 또는 유체 입구 커넥터를 갖는 반응기의 추가 장점은 하나의 동일한 반응기 챔버를 사용하여 상이한 노즐 직경으로 작업할 수 있는 가능성을 포함하여 반응기의 다양성을 실질적으로 증가시킨다.
일 구체예에서, 유체 입구 커넥터는 분리 가능한 압축 피팅에 의해 챔버 벽에 부착된다. 예를 들어, 제1 및/또는 제2 유체 입구를 제공하는 유체 입구 커넥터는 단일 페룰 피팅(single ferrule fitting) 또는 이중 페룰 피팅에 의해 챔버 벽에 부착된다. 고압 하에서 누출을 방지할 수 있는 다른 타이트한 피팅이 또한 이들이 분리 가능한 범위로 유용하다.
한 가지 바람직한 구체예에서, 반응기는 (i) 유체 입구 커넥터의 상류 단부와 유체 도관의 상류 부분을 포함하는 상류 세그먼트; 및 (ii) 노즐과 함께 유체 입구 커넥터의 하류 단부 및 유체 도관의 하류 부분을 포함하는 하류 세그먼트를 갖는 유체 입구 커넥터를 포함하고, 여기에서, 유체 도관의 상류 부분의 직경은 유체 도관의 하류 부분의 직경보다 크다. 이러한 맥락에서, 직경은 내부 직경으로 이해되어야 한다.
하류 부분은 상류 부분의 직경보다 실질적으로 작은 직경을 갖는 모세관으로 형성되거나 모세관에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 하류 부분의 직경은 상류 부분 직경의 절반보다 크지 않다. 또 다른 실시예에서, 하류 부분의 직경은 상류 부분 직경의 약 40% 이하이다. 임의로, 상류 부분은 하류 부분보다 실질적으로 더 길 수 있다. 예를 들어, 상류 부분의 길이 대 하류 부분의 길이의 비율은 5:1 또는 그 초과, 또는 심지어 8:1 또는 그 초과일 수 있다.
한 가지 특정의 구체예에서, 유체 입구 커넥터의 하류 단부는 외부적으로 원뿔-모양이고, 챔버 벽은 또한 원뿔-모양이고 유체 입구 커넥터의 하류 단부를 수용할 수 있는 것과 같은 크기를 갖는 상응하는 빈 공간(void)를 나타낸다. 이러한 구성을 사용하는 것은 유체 입구 커넥터를 반응기로 삽입하고 동시에 상기 기재된 바와 같은 제1 중심 축에 대한 각각 노즐의 적절한 정렬을 용이하게 한다. 바람직하게는, 반응기는, 이들의 노즐의 직경이 상이할 수 있다는 점을 제외하고는, 기본적으로 동일한 전체 구성을 갖는 두 개의 유체 입구 커넥터를 갖추고 있다. 본원에서 기재된 유체 입구 커넥터는 본 개시의 양태를 나타낸다.
노즐은 적절한 압력을 사용하여 유체 스트림의 형태로 반응 챔버 내로 제1 유체와 제2 유체를 주입할 수 있는 어떠한 유형 또는 기하학적 구조일 수 있다.
바람직한 구체예 중 하나에서, 제1 및/또는 제2 유체 입구의 노즐은 일반 오리피스 노즐(plain-orifice nozzle)이다. 본 구체예의 경우, 두 노즐 모두가 일반-오리피스 노즐인 것이 추가로 바람직하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 일반-오리피스 노즐은 본질적으로 단순한(즉, 실질적으로 원통형인) 관통홀의 모양을 갖는 단순한 오리피스를 특징으로 하는 노즐이며, 이는 그것의 작은 치수로 인해 핀홀로도 일컬어질 수 있다. 대안적으로, 노즐은 또한, 선택된 모양이 각각의 작동 압력에서 반응 챔버 내의 제2 유체 스트림과 정면으로 충돌할 수 있는 유체 스트림의 생성을 초래하는 한, 성형된-오리피스 노즐로서 제공될 수 있다.
일반-오리피스 노즐이 사용되는 경우에, 그러한 노즐은 특정의 경질 재료, 예컨대, 사파이어, 루비, 다이아몬드, 세라믹, 유리(예컨대, 보로실리케이트 유리) 또는 스틸로 제조된 부품으로서 제공될 수 있다. 스틸의 경우에, 카바이드-형성 원소, 예컨대, 텅스텐, 몰리브덴, 크롬, 바나듐, 및 코발트를 함유하는 합금 스틸인 고속도강(high-speed steel: HSS)와 같은 높은 경도 및 낮은 마모성을 갖는 스틸 품질이 이용되며, 여기에서, 합금 원소의 전체 양은 전형적으로 약 10 내지 25 중량%의 범위에 있거나, 텅스텐과 코발트가 주요 합금 원소인, 경질 합금으로도 일컬어지는 텅스텐강과 같은 높은 경도 및 낮은 마모성을 갖는 스틸 품질이 이용되는 것이 바람직하다.
사파이어, 루비 또는 다이아몬드 노즐이 사용되는 경우에, 이러한 노즐은 미리 제작되어 유체 입구 커넥터의 하류 부분의 하류 말단에 삽입되고, 크림핑에 의해서 부착될 수 있다. 사전 제작 방법에 따라 달라지는 노즐의 공차가 고려되어야 한다. 스틸 노즐이 사용되는 경우에, 전체 유체 입구 커넥터 또는 적어도 각각의 강철 품질의 하류 부분을 준비한 다음 필요한 오리피스를 삽입하는 것이 유용하다. 이러한 방식으로, 제1 중심축과의 노즐의 정렬이 더욱 향상될 수 있다.
노즐의 직경, 즉, 노즐 오리피스의 직경은 전형적으로는 약 1mm 미만의 범위에 있다. 약학 분야에서, 특히, 새로운 화학 물질의 나노입자 형태, 새로운 생물학적 약물, 진보된 치료법을 위한 고도로 전문화된 콜로이드 운반체 시스템 등의 개발에서의 공정 개발은 종종 매우 값비싼 물질의 사용을 수반함에 따라서, 공정 개발에 사용되는 액체의 양은 최소화되어야 한다. 이는 특히 직경이 0.5mm 이하인 오리피스를 갖는 노즐과 같은 훨씬 더 작은 노즐을 사용하여 가장 잘 달성된다.
따라서, 상기 기재된 바와 같은 제트 충돌 반응기는 제1 유체 입구의 노즐이 제1 오리피스 직경을 갖고, 제2 유체 입구의 노즐이 제2 오리피스 직경을 갖는 것과 제1 오리피스 직경 및/또는 제2 오리피스 직경은 20 ㎛ 내지 500 ㎛ 범위에 있는 것을 특징으로 하는 것이 본 발명의 바람직한 구체예 중 하나이다. 바람직하게는, 제1 오리피스 직경과 제2 오리피스 직경 둘 모두는 20 ㎛ 내지 500 ㎛ 범위, 또는 약 50 ㎛ 내지 500 ㎛ 범위에 있다. 또한, 오리피스 직경 중 적어도 하나가 각각 약 500 ㎛, 약 400 ㎛, 약 300 ㎛, 약 200 ㎛, 약 100 ㎛, 약 50 ㎛ 또는 약 20 ㎛인 반응기 구성도 바람직하다. 예를 들어, 20 ㎛ 미만의 더 작은 직경이 고려될 수 있다.
일부 구체예에서, 제1 및 제2 노즐(즉, 노즐 오리피스 또는 개구부)의 직경은 약 300 ㎛, 약 200 ㎛, 약 100 ㎛로 동일합니다. 본 개시에서 사용된 반응기의 더욱 바람직한 구체예에서, 반응기는 크기가 다른 2개의 노즐을 갖는다. 달리 설명하면, 이러한 추가 바람직한 구체예에 따르면, 오리피스 직경 중 하나가 다른 오리피스 직경보다 크다. 그러한 비대칭 노즐 구성은 다양한 면에서 유리할 수 있다: 예를 들어, 그것은 가공 목적에는 필요하지만 최종 제품에는 바람직하지 않은 용매의 도입을 최소화하는 데 사용될 수 있다. 또한, 그것은 유량이 다르지만 유사한 운동 에너지를 갖는 두 가지 액체 스트림의 생성에 사용될 수 있는데, 그 이유는 그들이 노즐을 통해 그들이 충돌하는 반응 챔버로 주입되기 때문이다.
일 구체예에서, 제2 노즐(즉, 오리피스)의 직경은 제1 노즐의 직경보다 20% 이상 더 크다. 추가의 구체예에서, 제1 오리피스 직경에 대한 제2 오리피스 직경의 비는 약 1.2 내지 약 5이다. 예를 들어, 첫 번째 값은 제2 오리피스의 대략적인 직경을 나타내고 두 번째 값은 제1 오리피스의 대략적인 직경을 나타내는, 이하 노즐 쌍이 사용될 수 있다: 100 ㎛ 및 50 ㎛; 200 ㎛ 및 100 ㎛; 200 ㎛ 및 50 ㎛; 300 ㎛ 및 200 ㎛; 300 ㎛ 및 100 ㎛; 300 ㎛ 및 50 ㎛; 400 ㎛ 및 300 ㎛; 400 ㎛ 및 200 ㎛; 400 ㎛ 및 100 ㎛; 400 ㎛ 및 50 ㎛; 500 ㎛ 및 400 ㎛; 500 ㎛ 및 300 ㎛; 500 ㎛ 및 200 ㎛; 500 ㎛ 및 100 ㎛; 500 ㎛ 및 50 ㎛. 다시 설명하면, 이들 쌍은 비제한적인 예이며, 특정 제품이나 공정에 따라 다른 오리피스 직경 조합도 유용할 수 있다.
더욱이, 발명자들은, 특히 작은 노즐이 사용될 때에, 반응기 구성에서 특정한 치수 관계를 관찰하는 것이 유용하다는 것을 발견하였다. 이미 언급한 바와 같이, 일반적으로 말하면, 반응 챔버는 작은 것이 바람직하다. 또한, 일부 공정에서는 노즐 오리피스 직경의 100배 이하인 반응 챔버 직경을 갖는 반응기를 제공하거나, 상이한 크기의 노즐이 사용되는 경우에는, 더 큰 노즐의 오리피스 직경의 약 100배 이하인 챔버 직경을 갖는 반응기를 제공하는 것이 유용하다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, 더 큰 노즐이 100 ㎛의 오리피스 직경을 갖는 경우에, 이러한 특정 구체예에 따르면, 반응 챔버의 직경이 약 10 mm 또는 그 미만인 것이 바람직하다.
관련 구체예에서, 제2 오리피스 직경에 대한 제1 중심 축을 따른 반응 챔버의 직경의 비율은 6 내지 60 범위에 있다. 예를 들어, 제2 오리피스의 직경이 약 200㎛인 경우에, 이러한 특정 구체예에 따르면, 제1 중심 축을 따른 반응 챔버의 직경은 약 1.2mm 내지 약 12mm의 범위에 있을 것이다. 그러나, 더 큰 노즐을 갖춘 반응기는 다른 치수 고려 사항이 필요할 수 있다.
추가의 관련 구체예에 따르면, 유체 출구의 직경에 대한 제1 중심 축을 따른 반응 챔버의 직경의 비율은 약 1.2 내지 약 3의 범위에 있다. 예를 들어, 이러한 특정 구체예에 따르면, 약 3mm의 직경을 갖는 반응 챔버는 약 1mm 내지 약 2.5mm의 출구 직경을 가질 것이다.
출구 직경을 선택할 때에, 노즐 오리피스 직경도 고려해야 한다. 예를 들어, 반응 챔버의 압력이 난류와 두 유체의 빠른 혼합을 지원할 만큼 충분히 높은 것을 보장하기 위해서, 100㎛ 미만과 같은 작은 노즐 크기(즉, 오리피스)는 1mm 미만과 같은 작은 유체 출구 직경과 조합되어야 한다. 예를 들어, 오리피스가 50㎛의 오리피스를 구비한 두 개의 노즐을 사용하는 경우에, 0.5mm의 유체 출구 직경이 사용될 수 있다. 상기 제공된 개시 및 지침을 기반으로 하여, 치수 인자의 추가적인 변형이 또한 특정 제품 또는 공정 요구사항을 수용하기에 유용할 수 있다는 것이 통상의 기술자에게는 분명할 것이다.
반응기의 재료, 특히, 챔버 벽의 재료와 관련하여, 충분히 단단하고 내마모성이 있는 다양한 유형의 재료가 사용될 수 있다. 구체예 중 일부의 경우에, 반응 챔버 벽(3)은 금속, 유리, 유리-세라믹, 세라믹 및 열가소성 폴리머로부터 선택된 재료로 제조된다. 유용한 금속의 예는 스테인리스 스틸이다. 바람직한 구체예 중 하나에서, 본 발명의 반응기는 스테인레스 스틸로 제조된 반응 챔버 벽을 포함한다. 반응기를 제조하는 데 사용되는 제품 유형에 따라, 카바이드 및 코팅된 합금도 사용될 수 있다. 더욱이, 챔버 벽의 내부 표면은 매끄러운 마감을 나타내는 것이 또한 바람직하다. 매끄러운 마감은 표면 거칠기를 나타내는 낮은 Ra 값을 특징으로 할 수 있다. Ra 값은, 표면 프로파일을 따라 표면을 측정할 때, 모든 값의 양으로부터의 산술 평균 거칠기 값을 나타낸다. 바람직한 구체예 중 하나에 따르면, 반응 챔버 벽의 내부 표면은 0.8 Ra 이하의 표면 거칠기를 나타내며, 여기에서, Ra는 ISO 4287:1997에 따라 측정된다.
대안적인 구체예에서, 본 개시의 방법에 따라서 제공되는 제트 충돌 반응기는 열가소성 폴리머, 또는 열가소성 폴리머를 포함하는 재료, 예컨대, 열가소성 폴리머들의 온합물 또는 열가소성 폴리머와 첨가제, 예컨대, 착색제, 항산화제, 정전기 방지제 및 유리 섬유 등의 혼합물로 제조된 반응 챔버 벽을 포함한다. 열가소성 폴리머 또는 열가소성 폴리머를 기반으로 하는 재료로 제조된 반응 챔버 벽의 이점은 반응기가 잠재적으로 매우 비용 효과적인 제조 방법인 사출 성형에 의해 제조될 수 있다는 것이다. 잠재적으로 적합한 열가소성 폴리머의 예는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리아미드, 폴리카르보네이트(PC), 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리스티롤(PS), 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS), 폴리옥시메틸렌(POM), 폴리페닐설폰(PPSF 또는 PPSU), 및 폴리에테르이미드(PEI)를 포함한다. 구체예 중 하나에서, 열가소성 폴리머는 PTFE 및 PEEK로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 제트 충돌 반응기는 (i) 열가소성 폴리머로 제조되거나 이를 포함하는 반응 챔버 벽 및 (ii) 금속, 유리, 유리-세라믹, 및 세라믹으로부터 선택된 재료로 제조된 유체 입구 노즐(즉, 제1 및 제2 유체 입구의 노즐)을 포함한다. 이러한 구체예의 특별한 이점은 그것이 높은 경도와 강도를 갖는 노즐과 조합되면서 반응기의 본체, 즉, 반응 챔버 벽을 사출 성형에 의해 비용 효율적으로 제조할 수 있다는 것이다. 이러한 구체예에서, 유체 입구 노즐은 반응 챔버 벽에 대해 교환 가능하거나 교환 불가능한 방식으로 배열될 수 있다. 교환 가능하도록 설계되면, 이는 제트 충돌 반응기가 다재다능하고 다양한 제품 및 공정에 높은 수준의 유연성으로 사용될 수 있다는 이점을 생성시킨다. 다른 한편으로, 교환 불가능하도록 설계되면, 이는 노즐이 미리 제작된 다음 사출 성형 공정을 위해 또는 그 도중에 각각의 모울드에 삽입될 수 있고, 그에 의해서, 반응기의 본체, 즉, 적어도 반응 챔버가 생성되는 매우 비용 효과적인 제조의 이점을 가져온다. 용융된 열가소성 폴리머가 모울드에 주입될 수 있는 온도와 같은 방법에 관한 추가 세부사항은 선택된 재료, 즉 열가소성 폴리머의 성질에 죄우되며 일반적으로는 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 공지되어 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 상세히 기재된 반응기의 사용을 기반으로 하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 두 유체를 혼합하는 방법으로서, (i) 상기 기재된 바와 같은 제트 충돌 반응기를 제공하는 단계; (ii) 제1 유체 스트림을 제1 유체 입구를 통해 반응 챔버 내로 유도하는 단계; (iii) 약 180°의 각도로 제1 유체 스트림과 충돌하도록 하는 것과 같이 제2 유체 스트림을 제2 유체 입구를 통해 반응 챔버 내로 유도하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유체는, 그것이 전단 응력을 받을 때, 지속적으로 흐르거나 변형되는 액체 또는 기체 물질이다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 혼합된 두 유체는 액체 물질, 예컨대, 액체 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 및 가장 바람직하게는 액체 용액이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 반응기에서의 두 유체의 혼합은 임의로 단순한 혼합을 넘어 다른 물리적 또는 화학적 변화, 예컨대, 침전, 유화, 착화, 자가-조립(self-assembly) 또는 심지어 화학 반응을 추가로 포함하지만; 이러한 모든 임의의 공정은 본 발명에 따른 제트 충돌 반응기의 사용에 의해서 달성되는 두 액체의 혼합에 의해 촉발된다.
제트 충돌 조건 하에서 반응기를 작동시키는 것은 전형적으로는 상기 기재된 바와 같은 적절한 노즐 크기를 선택하는 것을 포함하고, 두 유체가 이상적으로 정면으로 충돌하는 반응 챔버의 중심을 향해서, 두 유체가 반응 챔버 내로 노즐을 통해서 주입되게 하는 압력 또는 유량으로 두 유체 스트림을 공급하는 것을 포함한다.
반응기가, 제1 및 제2 유체 입구를 제공하기 위해서 챔버 벽에 가역적으로 삽입 가능한, 교환 가능한 유체 입구 커넥터를 갖도록 구성되는 경우에, 제트 충돌 반응기를 제공하는 방법 단계는 (i) 제1 노즐을 갖는 제1 유체 입구 커넥터 및 제2 노즐을 갖는 제2 유체 입구 커넥터를 선택하는 서브 단계; 및 (ii) 제1 및 제2 유체 입구를 갖는 제트 충돌 반응기 제공하기 위해서 챔버 벽 내로 제1 유체 입구 커넥터 및 제2 유체 입구 커넥터를 삽입하는 서브 단계를 포함할 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 오리피스 직경은 제1 노즐과 제2 노즐 사이에서 상이할 수 있다.
방법의 바람직한 구체예 중 하나에서, 제1 유체 스트림은 유기 용매 및 적어도 하나의 양친매성 지질을 포함하고, 제2 유체 스트림은 수성 용매이며, 이는 적어도 하나 이상의 양친매성 지질에 대한 비-용매 또는 항용매(antisolvent)로서 작용하여 반응 챔버 내의 두 스트림의 충돌 및 혼합이 양친매성 지질을 포함하는 나노입자(예, 지질 나노입자 또는 리포솜)의 침전 또는 자기-조립을 유도하게 할 수 있다. 바람직한 구체예 중 하나에서, 제1 및 제2 유체 스트림은 약 0.1 내지 약 120bar 범위의 압력에서 각각의 유체 입구 노즐을 통해서 강제된다. 이러한 문맥에서, 그리고, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 압력은 게이지 압력, 즉, 측정할 각각의 유체와 유체 연결되어 있는 압력 게이지에서 전형적으로 얻은 주변(대기) 압력에 대한 과압 또는 압력 차이로 표현된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 제1 및 제2 유체 스트림은 약 1 내지 약 40 bar 범위의 압력에서 각각의 유체 입구 노즐을 통해 강제된다.
추가의 바람직한 구체예에서, 제1 및 제2 유체 스트림의 각각은 약 1 내지 1000 mL/분 범위의 유량으로 반응 챔버 내로 유도된다. 이러한 문맥에서, 달리 지시하지 않는 한, 유량은 각각의 개별 스트림에 대해 제공된다. 다른 바람직한 유량 범위는 각각 약 2 내지 1000 mL/분, 5 내지 1000 mL/분, 약 5 내지 약 500 mL/분 및 약 10 내지 약 300 mL/분이다.
압력에 관한 선호 사항과 같이, 바람직한 유량도 일반적으로 적용 가능하고 그에 따라서 서로 조합할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 달리 설명하면, 또한, 제1 유체와 제2 유체가 약 0.1 내지 약 120bar 범위, 특히 약 1 내지 약 40 bar의 범위의 압력에서 약 10 내지 300 mL/분 범위의 유량으로 반응 챔버 내로 각각의 노즐을 통해서 유도되는 방법의 구체예가 옵션이거나 심지어 선호된다.
상기 기재된 바와 같이, 제트 충돌 반응기의 바람직한 구체예 중 하나에 따르면, 두 개의 노즐은 핀홀 크기가 다를 수 있다. 즉, 제1 노즐의 오리피스가 제2 노즐의 오리피스보다 크거나 작을 수 있다. 관련 구체예에서, 본 발명의 방법은 두 개의 상이한 노즐을 구비한 반응기를 사용하여 수행된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제2 유체 스트림이라고도 일컬어지는 제2 스트림의 유량은 제1 (유체) 스트림의 유량보다 클 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 방법은 (i) 제2 노즐의 오리피스가 제1 노즐의 오리피스보다 크고/거나; (ii) 제2 유체 스트림의 유량이 제1 유체 스트림의 유량보다 큰 것을 특징으로 하고; 여기에서, 제2 유체 스트림과 제1 유체 스트림의 압력은, 반응 챔버에 들어갈 때, 제1 유체 스트림과 제2 유체 스트림이 실질적으로 동일한 운동 에너지를 갖도록 조정된다.
이러한 문맥에서, 운동 에너지는 임의로 이하 방정식에 따라서 계산될 수 있다:
상기 식에서, m은 부피 단위당 스트림의 질량이고, v는 스트림의 속도이다.
유사하거나 심지어 실질적으로 동일한 운동 에너지를 갖는 두 유체 스트림을 사용하여 작업할 때의 이점은 회전 타원체(즉, 대칭) 반응 챔버의 충돌 지점이 챔버 중심에 있거나 그에 가깝다는 것이다. 따라서, 충돌 공정을 더 잘 제어하고 공정에 대해 알려지지 않았거나 심지어 바람직하지 않은 다양한 효과를 미칠 수 있는 제어되지 않은 충돌 지점의 영향을 배제하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 유체 스트림의 운동 에너지는 반응 챔버의 중심에서 또는 그 근처에서 스트림의 충돌을 야기할 만큼 충분히 유사하다.
나노입자 현탁액을 생산하기 위한 방법
예상치 못하게, 특정 조건 하에서, 파라미터, 예컨대, 유량비, 스트림의 압력 및 핀홀 반경이 제트 충돌 반응기에 의해 생성된 나노입자의 특성에 영향을 미친다는 것이 본 발명에서 발견되었다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 특정 유량비(FRR)로 2개의 스트림을 충돌시키는 단계를 포함하는 방법에 의해서, 원하는 크기 및 PDI를 포함하는 나노입자의 분산액을 생산하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 일부 특정 FRR이, 예를 들어, 작은 크기와 낮은 PDI와 같이 원하는 특성의 나노입자를 생산하기에 유용하였다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 제1 스트림(유기 용매)과 제2 스트림(수성 용매) 사이의 유량비는 약 1:1.5 내지 약 1:4.5 범위에 있다. 놀랍게도, 이 비율이 적용될 때, 그러한 방법은 강력하고 안정적인 공정을 제공하고 안정적이고 우수한 품질의 입자를 재현 가능하게 생성시킨다는 것이 발견되었다. 본 발명자들은 1:6 또는 1:8과 같이 이 범위를 벗어난 유량비가 리포솜 및 LNP의 다분산 지수(PDI)에 부정적인 영향을 미친다는 것을 관찰하였다. 바람직한 구체예에서, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비는 약 1:1.5 내지 약 1:4, 또는 약 1:2 내지 약 1:4 범위에 있다. 이러한 유량비는, 도 3b 및 5a에서 볼 수 있듯이, 각각 80 nm 미만 또는 60 nm 미만과 같이 작은 평균 입자 크기를 갖는 지질-기반 나노입자를 얻기에 특히 유리하다는 것을 알 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비는 1:1.5 내지 1:3, 더욱 바람직하게는 1:1.5 내지 1:2.5, 더욱 바람직하게는 1:1.5 내지 1:2 범위에 있다. 추가 구체예에서, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비는 약 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 또는 1:4이다.
추가로, 나노입자의 분산액을 생산하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 나노입자는 요망되는 크기 및 PDI를 포함하고, 상기 방법은 특정 전체 유량(TFR)으로 2개의 스트림을 충돌시킴을 포함한다. 일반적으로, TFR은 약 0.1ml/min 내지 약 2,000ml/min 범위에 있다. 바람직한 구체예 중 하나에서, TFR은 약 1ml/분 내지 약 1,000ml/분, 또는 약 5ml/분 내지 약 800ml/분, 또는 약 10ml/분 내지 약 800ml/분, 또는 약 25ml/분 내지 약 800mL/분 또는 30ml/분 내지 약 800ml/분의 범위에서 선택된다.
본 발명의 방법에 따라 유량비를 적용할 때, 나노입자의 생산은, 예를 들어, 나노입자의 크기 및 안정성 면에서, 제1 스트림과 제2 스트림의 전체 유량에 영향을 받지 않는다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 상이한 규모 또는 출력 속도로 나노입자의 분산액을 생산하기 위한 견실한 공정이 본 발명에 의해서 제공된다.
놀랍게도, 특정 조건 하에서, 바람직한 특성, 예컨대, 작은 크기 및 낮은 PDI의 나노입자가 TFR, 예컨대, 약 200 ml/분 초과의 TFR에서도 본원에 개시된 방법에 의해 얻어질 수 있다는 것이 발견되었다. 예를 들어, 약 200ml/min 내지 약 1,000ml/min 범위의 TFR은 공정 효율성과 높은 생산성이 중요한 상황에서 유용할 수 있다. 한 가지 특정 구체예에서, TFR은 약 200 ml/분 내지 약 800 ml/분 범위에 있다. 또 다른 특이적 구체예에서, TFR은 280ml/분 내지 320ml/분, 예컨대, 약 300ml/분이다.
통상의 기술자는 전체 유량(TFR)이 시간 단위당 반응 챔버에 주입되는 전체 부피를 의미한다는 것을 이해할 것이다. 달리 설명하면, 전체 유량은 제1 스트림 및 제2 스트림의 유량의 합이다.
일부 구체예에서, 전체 유량, 즉, 제1 스트림 및 제2 스트림의 유량의 합은 약 200ml/min 미만, 또는 심지어 약 100ml/min 미만으로 낮다. 예를 들어, TFR은 약 1 ml/min 내지 200 ml/min, 또는 약 5 ml/min 내지 200 ml/min, 또는 10 ml/min 내지 200ml/min, 15 ml/min 내지 200 ml/min, 또는 약 1 ml/min 내지 약 100 ml/min, 또는 약 5 ml/min 내지 약 80 ml/min의 범위일 수 있다. 그러한 낮은 TFR은 값비싼 출발 물질이 소규모 배치에 사용되는 상황에서 유용할 수 있다.
일부 구체예에서, 전체 유량, 즉, 제1 스트림과 제2 스트림의 유량의 합은 30 ml/min 내지 320 ml/min, 바람직하게는 100 ml/min 내지 320 ml/min, 가장 바람직하게는 280 ml/min 내지 320 ml/min의 범위에 있다. 더욱 특이적 구체예에서, 전체 유량은 280 ml/min 내지 320 ml/min, 더욱 바람직하게는 290 ml/min 내지 310 ml/min의 범위에 있다. 일부 구체예에서, TFR은 약 20 ml/min 내지 약 500 ml/min, 또는 약 50 ml/min 내지 약 200 ml/min, 또는 50 ml/min 내지 100 ml/min이다.
특이적 구체예에서, 전체 유량은 100 ml/min 내지 500 ml/min의 범위에 있고, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비는 1:1.2 내지 1:2.5의 범위에 있다. 더욱 특이적 구체예에서, 전체 유량은 약 300 ml/min이고, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비 1:2이다. 이들 파라미터의 조합(유량비 및 높은 전체 유량)은 유리한 특성, 예를 들어, 60 nm 미만의 평균 크기 및 0.25 미만의 PDI를 갖는 나노입자의 생성을 유도했다.
일부 구체예에서, TFR은 약 30 ml/min, 또는 약 40 ml/min, 또는 약 50 ml/min, 또는 약 60 ml/min, 또는 약 70 ml/min, 또는 약 80 ml/min, 또는 약 90 ml/min, 또는 약 100 ml/min이다.
일부 구체예에서, TFR은 약 150 ml/min, 또는 약 200 ml/min, 또는 약 250 ml/min, 또는 약 300 ml/min, 또는 약 320 ml/min, 또는 약 350 ml/min이다.
상기 방정식 1에 의해서 나타낸 바와 같이, 스트림 압력은, 다른 것들 중에서도, 노즐 개구부의 크기에 의해서 조절될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 노즐 개구부의 크기는 직경이 100 ㎛보다 작다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 100 내지 200 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 200 내지 300 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 300 내지 400 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 400 내지 500 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 500 내지 600 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 600 내지 700 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 200 ㎛보다 더 크다.
일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 노즐 개구부의 크기는 반경이 약 100 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 약 200 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 약 300 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 약 400 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 약 500 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 약 600 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 약 700 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 약 800 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 약 900 ㎛이다. 일부 구체예에서, 노즐 개구부의 크기는 반경이 약 1000 ㎛이다.
일부 구체예에서, 제1 개구부와 제2 개구부의 반경은 동일하다. 일부 구체예에서, 제1 개구부와 제2 개구부의 반경은 상이하거나 비대칭이다. 일부 구체예에서, 상기 제2 개구부의 반경은 100 ㎛이고, 상기 제1 개구부의 반경은 100, 200, 300, 400, 또는 500 ㎛이다. 일부 구체예에서, 제2 개구부의 반경은 200 ㎛이고, 상기 제1 개구부의 반경은 100, 200, 300, 400, 또는 500 ㎛이다. 일부 구체예에서, 상기 제2 개구부의 반경은 300 ㎛이고, 상기 제1 개구부의 반경은 100, 200, 300, 400, 또는 500 ㎛이다.
일부 구체예에서, 상기 제2 개구부의 반경은 400 ㎛이고, 상기 제1 개구부의 반경은 100, 200, 300, 400, 또는 500 ㎛이다. 일부 구체예에서, 제2 개구부의 반경은 500 ㎛이고, 상기 제1 개구부의 반경은 100, 200, 300, 400, 또는 500 ㎛이다.
일부 구체예에서, 상기 제1 및 제2 개구부의 반경은 각각 300 ㎛ 및 200 ㎛이다. 일부 구체예에서, 상기 제1 및 제2 개구부의 반경은 각각 400 ㎛ 및 200 ㎛이다. 일부 구체예에서, 상기 제1 및 제2 개구부의 반경은 각각 500 ㎛ 및 200 ㎛이다.
일부 구체예에서, 제1 노즐은 제1 개구부를 포함하고, 제2 노즐은 제2 개구부를 포함하고, 제1 개구부 및 제2 개구부는 반경이 200 내지 500 ㎛의 범위에 있다.
본 개시에 따른 방법의 또 다른 구체예에서, 제1 노즐은 제1 개구부를 포함하고, 제2 노즐은 제2 개구부를 포함하고, 여기에서, 제1 개구부와 제2 개구부는 직경이 40 ㎛ 내지 800 ㎛의 범위에 있다. 일 구체예에서, 제1 노즐은 제1 개구부를 포함하고, 제2 노즐은 제2 개구부를 포함하고, 여기에서, 제1 개구부와 제2 개구부는 직경이 200 내지 500 ㎛의 범위에 있다.
일부 구체예에서, 제1 및 제2 개구부의 직경은 동일할 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 및 제2 개구부의 직경은 상이하거나 비대칭이다. 일부 구체예에서, 상기 제1 개구부의 직경은 100 ㎛이고, 상기 제2 개구부의 직경은 100, 200, 300, 400, 또는 500 ㎛이다. 일부 구체예에서, 제1 개구부의 직경은 200 ㎛이고, 상기 제2 개구부의 직경은 100, 200, 300, 400, 또는 500 ㎛이다. 일부 구체예에서, 상기 제1 개구부의 직경은 300 ㎛이고, 상기 제2 개구부의 직경은 100, 200, 300, 400, 또는 500 ㎛이다.
특이적 구체예에서, 제1 개구부의 직경은 제2 개구부의 직경과 상이하다. 일 구체예에서, 제1 또는 제2 개구부의 직경은 다른 개구부의 직경보다 적어도 약 50% 더 크다. 일 구체예에서, 제2 개구부의 직경은 제1 개구부의 직경보다 더 클 수 있다. 바람직한 구체예 중 하나에서, 제2 개구부의 직경은 제1 개구부의 직경보다 적어도 50% 더 크다. 또 다른 구체예에서, 제2 개구부의 직경은 제1 개구부의 직경보다 약 1.5배(50%) 내지 약 5배 더 크다.
일부 구체예에서, 상기 제1 및 제2 개구부의 직경은 500 ㎛이다. 상기 개시된 바와 같이, 제1 및 제2 스트림은 상승된 압력에서 제1 및 제2 노즐을 통해서 펌핑된다. 상기 압력은 유량과 스트림의 밀도로부터 그리고, 상기 방정식 1에 나타낸 바와 같이, 스트림이 분출되는 핀홀의 반경으로부터 계산될 수 있다.
통상의 기술자는 본원에서 상호 교환적으로 사용된는 용어 "상승된 압력", "높은 압력", "과압" 또는 "유체역학적 압력"은 대기압보다 높은 어떠한 압력을 위미함을 이해할 것이다. 추가로, 본원에서 사용된 바와 같이, 일부 구체예에서, 제1 및 제2 스트림의 압력은 대기압에 대한 비교로 측정된다. 따라서, 0.1 bar의 압력은 대기압보다 0.1 bar 높은 것으로 이해되어야 한다.
일부 구체예에서, 제1 및 제2 스트림의 압력은 유사하다. 일부 구체예에서, 제1 스트림의 압력은 제2 스트림의 압력보다 더 높다. 일부 구체예에서, 제1 스트림의 압력은 제2 스트림의 압력보다 낮거나 그와 동일하다.
일부 구체예에서, 제1 스트림의 압력은 약 30 bar 미만, 약 25 bar 미만, 약 12 bar 미만, 또는 약 ≤ 5 bar 미만이다. 일부 구체예에서, 제1 스트림의 압력은 약 0.0001 bar 내지 약 30 bar, 약 0.001 bar 내지 약 25 bar, 약 0.01 bar 내지 약 12 bar, 또는 약 0.01 bar 내지 약 5 bar이다.
일부 구체예에서, 제2 스트림의 압력은 약 30 bar 미만, 약 25 bar 미만, 약 12 bar 미만, 또는 약 ≤ 5 bar 미만이다. 일부 구체예에서, 제2 스트림의 압력은 약 0.0001 bar 내지 약 30 bar, 약 0.001 bar 내지 약 25 bar, 약 0.01 bar 내지 약 12 bar, 또는 약 0.01 bar 내지 약 5 bar이다.
일부 구체예에서, 상기 제1 또는 제2 스트림의 압력은 0.1 bar 미만이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 스트림의 압력은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1 bar이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 스트림의 압력은약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 bar이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 스트림의 압력은 약 10, 15, 20, 25, 또는 30 bar이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 스트림의 압력은 30 bar 초과이다.
일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 스트림의 압력은 0.1 내지 45 bar이다. 일부 구체예에서, 제1 스트림 및/또는 제2 스트립의 압력은 0.1 내지 15 bar이다.
통상의 기술자는 일부 예에서 제1 및 제2 스트림의 압력의 합으로서 본원에서 정의되는 전체 압력을 계산하고 사용하는 것이 유용하다는 것을 이해할 것이다.
유체역학적 압력과 제트 속도의 수학적 관계를 기반으로 하여, 제1 스트림과 제2 스트림의 제트 속도는 노즐 개구부 반경에 의해서 제거되거나 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 제트 속도는 70, 50, 25, 또는 10 m/s 미만이다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 스트림의 제트 속도는 상이하다.
일부 구체예에서, 제1 스트림은 유기 용매를 포함한다. 일부 구체예에서, 유기 용매는 양친매성 지질, API, 또는 이들 둘 모두를 위한 용매이다. 통상의 기술자는 많은 유기 용매가 약제학적 산업에서 사용된다는 것을 이해할 것이다. 이들 중 어떠한 것이 본원에서 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 유기 용매는 알코올, 케톤, 할로겐화된 용매, 아미드, 또는 에테르를 포함한다. 일부 구체예에서, 유기 용매는 에탄올, 에틸렌, 브로마이드, 부탄올, 아세톤, 클로로포름, 2-에틸헥사놀 메틸에틸케톤, 에틸렌 클로라이드, 이소부탄올, 메틸이소부틸케톤, 디클로로메탄, 이소프로판올, 메틸이소프로필케톤, 테트라클로로에틸렌 메탄올, 메시틸 옥사이드, 카본 테트라클로라이드, 프로판올, 트리클로로에틸렌, 프로필렌 글리콜, 1,4-디옥산 부틸 에테르, 에틸 에테르, 디메틸 포름아미드, 디이소프로필 에테르, 디메틸 설폭사이드, 테트라하이드로푸란, 3차-부틸 메틸 에테르, 하이드로카본, 방향족 하이드로카본, 사이클로헥산, 톨루엔, 헥산, 및 자일렌을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 유기 용매는 물과 혼화성이다. 일부 구체예에서, 유기 용매는 2 이상의 유기 용매의 혼합물이다. 일부 구체예에서, 유기 용매는 알코올이다. 일부 구체예에서, 유기 용매는 에탄올을 포함한다. 일부 구체예에서, 유기 용매는 아세톤을 포함한다.
일부 구체예에서, 제2 스트림은 수성 용매를 포함한다. 일부 구체예에서, 수성 용매는 양친매성 지질에 대해서, API에 대해서, 또는 이들 둘 모두에 대해서 비-용매이다. 통상의 기술자는 많은 수성 용매가 약제학적 산업에서 사용된다는 것을 이해할 것이다. 이들 중 어떠한 것이 본원에서 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 수성 용매는 포스페이트 완충제 염수(PBS) 또는 둘베코의 포스페이트-완충된 염수(Dulbecco's phosphate-buffered saline: DPBS)를 포함한다. 일부 구체예에서, 수성 용매의 pH는 어떠한 요망되는 값으로 변화된다.
추가의 양태
일부 구체예에서, 방법은 추가로 나노입자 분산액을 여과에 의해서 정제하는 단계; 나노입자 분산액를 동결 건조에 가하는 단계; 또는 교차-흐름 여과에 의해서 나노입자 분산액으로부터 유기 용매를 제거하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 나노입자 분산액은 살균 여과에 가해진다. 일부 구체예에서, 여과 재료는 셀룰로오스 아세테이트, 재생 셀룰로오스, 폴리아미드, 폴리에테르설폰(PES), 개질된 폴리에테르설폰(mPES), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 및 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)으로부터 선택된다. 통상의 기술자는 살균 여과가 생성물의 비경구 적용을 가능하게 하고 습식 가열 또는 건식 가열에 의해서 열적으로 살균될 수 없는 비경구 사용을 위한 생성물에 대한 선택 방법임을 이해할 것이다. 일부 구체예에서, 나노입자 분산액은 동결 건조에 가해진다. 동결 건조는 지질-기반 나노입자(예, 리포솜 또는 LNP) 분산액의 안정성을 증가시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 나노입자 분산액의 생산을 위해서 사용되는 유기 용매는 교차-흐름 여과 공정을 통해서 제거될 수 있다. 일 구체예에서, 지질-기반 나노입자(예, 리포솜 또는 LNP) 분산액의 생산을 위해서 사용되는 유기 용매는 교차-흐름 여과 공정을 통해서 제거된다.
추가의 양태에서, 본 발명의 제1 양태의 방법에 의해서 생성된 나노입자 분산액이 본원에서 개시된다. 일 구체예에서, 나노입자의 평균 입자 크기는, 동적 광산란에 의해서 측정되는 경우에, 20 nm 내지 100 nm, 또는 30 nm 내지 90 nm, 예컨대, 40 nm 내지 80 nm의 범위이다.
추가의 양태에서, 본 발명의 제1 양태의 방법에 의해서 생성된 나노입자 분산액을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 개시된다. 일부 구체예에서, 약제학적 조성물은 비경구 또는 경구 적용에 의도된다. 일부 구체예에서, 약제학적 조성물은 적용 전에 재구성하기 위한 동결 건조물이다. 일부 구체예에서, 약제학적 조성물은 여과 살균에 의해서 최종적으로 살균될 수 있다. 본 개시에 포함되는 추가의 구체예는 이하 번호가 매겨진 항목의 목록에 포함된다:
1. 적어도 하나의 양친매성 지질을 포함하는 나노입자의 분산액을 생산하는 방법으로서,
a) 유기 용매 및 양친매성 지질을 포함하는 제1 스트림을 제공하는 단계;
b) 수성 용매를 포함하는 제2 스트림을 제공하는 단계;
c) 제1 스트림을 상승된 압력 하에 제1 노즐을 통해서 펌핑시키고 제2 스트림을 상승된 압력 하에 제2 노즐을 통해서 반응 챔버 내로 펌핑시키는 단계로서, 제1 노즐이 제2 노즐로부터 약 180°의 각도로 위치되는 단계;
d) 제1 스트림과 제2 스트림을 방응 챔버에서 정면으로 충돌시키는 단계를 포함하고;
제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비가 1:1.5 내지 1:4.5의 범위에 있는, 방법.
2. 항목 1에 있어서, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비가 1:1.5 내지 1:4, 또는 1:2 내지 1:4.5, 또는 1:2 내지 1:4의 범위에 있거나, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비가 약 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4 또는 1:1.45인, 방법.
3. 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 전체 유량이 1 ml/min 내지 1,000 ml/min, 또는 5 ml/min 내지 800 ml/min의 범위에 있는, 방법.
4. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 하나에 있어서, 전체 유량이 100 ml/min 내지 500 ml/min의 범위에 있고, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비가 1:1.2 내지 1:2.5의 범위에 있는, 방법.
5. 항목 1 내지 항목 4 중 어느 하나에 있어서, 제1 노즐이 제1 개구부를 포함하고, 제2 노즐이 제2 개구부를 포함하고, 제1 개구부와 제2 개구부가 40 ㎛ 내지 800 ㎛의 범위의 직경을 갖는, 방법.
6. 항목 5에 있어서, 제1 또는 제2 개구부의 직경이 다른 개구부의 직경보다 적어도 약 50% 더 큰, 방법.
7. 항목 1 내지 항목 6 중 어느 하나에 있어서, 제1 스트림의 압력이 제2 스트림의 압력보다 낮거나 동일한, 방법.
8. 항목 1 내지 항목 7 중 어느 하나에 있어서, 나노입자가 단일층 리포솜, 다중층 리포솜, 단일 이중층 리포솜, 이중 이중층 리포솜, 다소포성 리포솜, 지질 나노입자, 리포플렉스, 폴리플렉스, 및 고체 지질 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
9. 항목 1 내지 항목 8 중 어느 하나에 있어서, 양친매성 지질이 지방산, 글리세로지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 글리세로인지질, 인지질, 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린(SPC), 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 스핑고지질, 스테롤, 콜레스테롤, 프레놀, 카로테노이드, 레티놀, 레티날, 레티노산, 베타-카로텐, 토코페롤, 사카로지질(saccharolipid), LIPOID S100, 페길화된 지질, 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG)의 군으로부터 선택되는, 방법.
10. 항목 1 내지 항목 9 중 어느 하나에 있어서, 제1 스트림 또는 제2 스트림이 추가로 적어도 하나의 추가의 양친매성 지질을 포함하는, 방법.
11. 항목 1 내지 항목 10 중 어느 하나에 있어서, 제1 스트림 또는 제2 스트림이 페길화된 지질을 0.1 mol% 내지 2 mol%의 범위의 농도로 포함하는, 방법.
12. 항목 1 내지 항목 11 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 제2 스트림이 추가로 활성 약제학적 성분을 포함하는, 방법.
13. 항목 12에 있어서, 활성 약제학적 성분이 작은 분자, 펩티드 및 핵산의 군으로부터 선택되는, 방법.
14. 항목 1 내지 항목 13 중 어느 하나에 있어서,
나노입자 분산액을 여과에 의해서 정제하는 단계;
나노입자 분산액을 동결 건조에 가하는 단계; 또는
교차-흐름 여과에 의해서 나노입자 분산액로부터 유기 용매를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
15. 항목 1 내지 항목 14 중 어느 하나에 따른 방법에 의해서 생성된 나노입자 분산액으로서, 나노입자의 평균 입자 크기가 바람직하게는 20 nm 내지 100 nm인, 나노입자 분산액.
실시예
이하 실시예는 본원에서 개시된 기술의 일부 구체예를 더 완전하게 설명하기 위해 제시된다. 그러나, 이들은 결코 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예는 리포솜 및 지질 나노입자(LNP)의 제조를 위해 본원에서 개시된 충돌 제트 기술의 적합성을 보여주기 위한 복잡성이 증가하는 단계적 접근 방식을 개시한다.
본원에서 개시된 실험에 사용된 장비 시스템 및 반응기의 특징은 표 1에 나열되어 있다. 시스템 A(또는 장치 A 또는 장비 A)는 반응기에 따라 유량이 0.1 ml/분 내지 60 ml/분인 배치식 또는 연속 생산을 위한 소규모 시스템으로 의도된다. 시스템 B는 최대 약 500ml/분의 더 높은 전체 유량으로 배치식 또는 연속 생산에 적합하다. 층류 혼합을 사용하는 소규모 침전 시스템으로서의 상용 미세유체 시스템(NanoAssemblr® Ignite™, Precision NanoSystems, Vancouver, Canada)가 난류 혼합-기반 제트 충돌 반응기 시스템 A 및 B와의 비교로서 사용되었다. 명확성을 위해서, 비교기 시스템(comparator system)은, 제트 충돌 반응기에서와 같이, 두 스트림이 정면으로 충돌하도록 하지 않게 한다.
표 1. 사용된 장비의 개관.
실시예 1 - 대두-포스파티딜콜린 및 콜레스테롤을 포함하는 리포솜의 생성
방법: 지질-기반 나노입자의 제조를 위한 제트 충돌 기술의 유용성을 입증하기 위해서, 대두-포스파티딜콜린(SPC) 및 콜레스테롤을 사용한 제형을 선택하였다.
상이한 유량비(FRR), 전체 유량(TFR)에서, 상이한 노즐 개구부 직경을 이용하여, 상이한 SPC/콜레스테롤 비율로, 시스템 B로서 상기 본원에서 기재된 장비를 사용하여 전체 10회의 실험을 수행하였다.
또한, 두 시스템을 비교하기 위해서, Precision NanoSystems의 Ignite 장비인 비교기 시스템에 대한 8회의 실험을 수행하였다. 샘플은 Malvern Zetasizer Nano ZS를 사용하여 동적 광산란(DLS)에 의해서 평균 입자 크기 및 다분산 지수(PDI)에 대해서 분석하였다.
에탄올 중의 대두 포스파티딜콜린(SPC)과 콜레스테롤로 이루어진 용액을 제조하여 제1(유기) 액체 스트림으로서 사용하였다. 에탄올 중 4 mg/ml의 전체 지질 농도가 사용되었다. pH 7.4의 수성 완충액(PBS)이 제2(수성) 액체 스트림을 위해서 사용되었다. 시스템 B에서 시험된 전체 유량은 50ml/min과 100min/ml이었다. 1:1 및 1:4의 제1(유기) 스트림: 제2(수성) 스트림의 유량비(FRR로 약칭)가 시험되었다. 3:1 및 2:1의 SPC:콜레스테롤 몰비가 시험되었다. 실험에 사용된 파라미터는 표 2A에 요약되어 있다. 비교 장비에 대한 실험에 사용된 파라미터는 표 2B에 요약되어 있으며 FRR 및 시험된 제형과 유사하며; 시스템 B와의 규모 차이로 인해 TFR만 상이하다.
표 2A. 시스템 B를 사용한 실험의 파라미터
표 2B. 층류 반응기 시스템를 사용한 실험의 파라미터
결과: 동적 광산란에 의해서 측정된 리포솜의 입자 크기 및 PDI 면에서의 비교 결과는 제트 충돌 반응기 시스템 B 및 상업적 층류 반응기 시스템 (NanoAssemblr® Ignite™)을 사용하여 얻었으며, 이는 비-부하된 리포솜을 얻기 위해 제트 충돌 반응기와 난류 혼합을 사용하고 파일럿-규모 장비를 사용하는 타당성을 입증하였다. 각각 시스템을 사용하여 얻은 결과는 도 1 내지 도 3에 도시되어 있다.
실시예 2 - 페길화된 리포솜의 생성
방법:
제트 충돌 반응기를 포함하는 상기 표 1에 기재된 바와 같은 장비 시스템은 페길화된 지질, 포스파티딜 콜린, 및 콜레스테롤을 포함한 페길화된 리포솜을 제조하기 위해서 사용되었다.
대두 포스파티딜콜린 (SPC), 콜레스테롤, 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG)를 각각 36.2%, 63.2%, 및 0.6%의 몰 비율로(제형 1); 및 각각 52%, 45%, 및 3%의 몰 비율로(제형 2) 포함하는, 둘 모두의 경우에 에탄올에 용해된 두 가지 유기 액체를 제조하였고, 이들 중 어느 것을 제1 스트림으로서 사용하였다. 둘 모두의 경우에, 유기 용액 중의 전체 지질 농도는 6 mg/ml이었다. PBS pH 7.4를 제2 스트림을 위한 수성 액체로서 사용하였다.
입자는 30, 90, 180, 또는 300 ml/min의 전체 유량(TFR)에서 그리고 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:3, 또는 1:4의 제1 (유기) 스트림 대 제2 (수성) 스트림(FRR)의 유량비에서 생성되었다. 모든 샘플은 200 ㎛(제1 노즐) 및 300 ㎛(제2 노즐)의 노즐 직경을 갖는 충돌 제트 반응기를 사용하여 제조되었다. 샘플을 동적 광산란(DLS)에 의해서 입자 크기 및 다분산도 지수(PDI)에 대해서 분석하였고, 선택된 샘플을 cryo-TEM애 의해서 분석하였다. 본 발명에 따라서 생성된 모든 샘플은 생성 직후 및 DLS 분석 전에 5% EtOH 함량으로 희석되었다.
결과: 균일한 크기 분포 및 낮은 PDI(< 0.2)의 리포솜을 시험된 제형 둘 모두에 대해서 얻었다.
제형 2에 의해서 얻은 리포솜의 특성을 층류를 기반으로 하는 미세유체 혼합기 시스템(참조, Brown A., Thomas A., Shell Ip, Heuck G., Ramsay E., Liposomes, published by Precision NanoSystems Inc. 2018 (https://www.precisionnanosystems.com/docs/default-source/pni-files/ app-notes/pni-app-bt-013.pdf?sfvrsn=aa668324_0 retrieved 05.05.2021)에 의해서 생성된 유사한 조성물에 의한 리포솜의 공개된 데이터와 비교하였고; 그것은 도 4a 및 도 4c에 나타내어져 있다. 공개된 데이터에 따르면, 이러한 유형의 장비와 혼합을 사용하여 제1(즉, 유기) 스트림에 비해 제2(즉, 수성 스트림)의 유량을 증가시키는 효과가 입자 크기를 감소시켰고, PDI를 증가시키는 경향을 유도하였다. 이러한 미세유체 시스템에서 TFR을 증가시키는 것은 또한 입자 크기의 감소를 유도하였다.
층류 혼합 시스템과 유사하게, 본 발명의 충돌 제트 방법을 사용할 때의 더 낮은 FRR의 효과가 또한 더 작은 입자 크기 및 더 큰 PDI 값을 향한 경향을 유도한다는 것이 관찰되었다(도 4b 참조). 그러나, 이에 비해서, 본 발명의 충돌 제트 방법을 사용할 때에, 리포솜의 입자 크기 및 PDI에 대한 TFR의 영향은 관찰되지 않았다(도 4d 참조). 입자 크기는 30ml/min 내지 300ml/min 범위의 TFR에 걸쳐 일관되게 유지되는 것으로 관찰되었다. 이는 제트 충돌, 즉, 제1 스트림과 제2 스트림의 정면 충돌에 의해 달성되는 고도의 난류 혼합 공정이 견실하고 확장 가능한 공정을 를 달성시켜서, 예를 들어, 필요에 따라 저용량 또는 고용량으로 리포솜 또는 지질 나노입자의 복수의 배치의 제조를 포함한, 다양한 생산 시나리오에 쉽게 적용할 수 있는 다재다능한 공정 기술을 제공하기에 유리할 수 있을 나타낸다.
시스템 B 장비를 사용하여 두 가지의 상이한 지질 제형으로부터 제조된 리포솜을 특성화하였다(도 5a 내지 도 5f 참조). FRR 및 TFR에 대한 질적으로 유사한 경향이 두 제형 모두에서 관찰될 수 있다. 1의 FRR에서, 더 낮은 PEG-지질 함량을 갖는 제형(제형 1)은 가장 높은 PDI(0.35)를 나타낸 반면, 더 높은 PEG-지질 농도를 갖는 제형(제형 2)의 경우 가장 낮은 PDI(0.06)를 나타냈다. 더욱이, 입자 크기에 대한 FRR(제1, 즉 유기 스트림의 유량 대 제2, 즉 수성 스트림의 유량 사이의 비율)을 감소시키는 효과는 PEG-지질 함량이 낮은 제형의 경우 더욱 두드러진다.
PEG-지질 농도가 더 높은 제형은 1주 후에 더 높은 물리적 안정성을 나타냈으며(도 5g 및 5h), 이는 PEG-지질의 안정화 효과를 강조하였다. 한계 크기와 같은 기본 입자 특성과 공정 파라미터에 대한 반응성 둘 모두가 리포솜 조성에 의해 결정된다는 결론을 내릴 수 있다. 일반적으로, 더 높은 PEG 지질 농도는 더 작고 안정적인 입자를 유도하고, 이는 공정 파라미터에 의해서 덜 영향을 받는다.
Cryo-TEM 분석은 생성된 리포솜이 주로 단일층 또는 이중층인 것으로 나타났으며(도 6a 및 도 6b), DLS 입자 크기 결과가 확인되었다. 대부분의 cryo-TEM 이미지에서는, 다양한 형태를 지닌 더 큰 입자(최대 ㎛ 범위)도 관찰되었다. 요구되는 경우, 이러한 더 큰 입자는 cryo-TEM 분석 전에 여과(예, 0.2 ㎛)에 의해서 제거될 수 있다. 결과는 더 큰 TFR 및 관련된 더 높은 전체 압력과 같은 공정 조건이 더 많은 수의 이중층 리포솜 및 더 이질적인 형태를 초래한다는 것을 나타낸다.
실시예 3 - 지질 나노입자 실험 설계
지질 나노입자(LNP)의 생성을 위한 제트 충돌 공정의 적합성을 입증하고 상기 개괄된 바와 같은 시스템 B 장비를 사용하여 LNP 생성의 공정 및 결과에 영향을 주는 중요한 공정 파라미터를 식별하기 위해서, 통계적 실험 설계(DoE) 접근법을 수행하였다. 요약하면, D-최적 설계(Design Expert v12 소프트웨어)를 갖춘 DoE에서, 공정 파라미터 TFR, FRR 및 3개의 상이한 반응기(200/300, 200/400, 500/500 ㎛ 노즐 크기)가 다양했으며, 입자 크기, PDI 및 형태에 대한 영향을 PBS를 사용한 투석 시 평가하였다. 시험 제형은 siRNA를 사용하지 않은 것을 제외하고는 Onpattro®(파티시란)의 조성을 기반으로 하였다(EtOH 중의 10 mg/mL의 전체 지질 농도를 갖는 50/38.5/10/1.5의 몰 비율의 DLin-MC3/콜레스테롤/DSPC/DMG-PEG2000).
DoE 중의 모든 20개 샘플은, DLS 및 cryo-TEM 분석으로 측정했을 때, 64 내지 106nm의 입자 크기 범위(PDI: 0.12 내지 0.25)를 갖는 비-부하된 LNP를 함유하였다(도 7의 샘플 참조). 이는 공개 평가 보고서에서 언급된 Onpattro®의 60 내지 100nm의 입자 크기 범위와 일치하였다.
이러한 결과는 제트 충돌 공정이 최대 약 300ml/분의 전체 유량으로 생성되는 높은 출력 속도에서도 위약 LNP 제형을 사용하여 고품질(비-부하된) LNP를 생성시키기에 적합하다는 것을 시사한다. 모든 샘플은 냉장 조건(+4℃)에서 1주 동안 장기간 저장 후에도 입자 크기와 PDI를 유지했으며, 이는 본 발명의 공정이 사용된 제형의 LNP 생산에 적합하다는 것을 추가로 나타낸다.
DoE는 조사된 공정 파라미터 중 3개가 입자 크기와 PDI에 영향을 미치는 것을 밝혔다(도 8, 9 및 10 참조). 통계학적 분석에 사용된 모델(Design Expert v.12는 소프트웨어)과 관련된 통계학적 검정력은 80% 초과이며 P-값 <0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다. 통계학적 분석은 이하 상관 관계가 공정 파라미터와 입자 속성 사이에 존재한다는 것을 시사한다:
a. 노즐 크기가 입자 크기에 영향을 준다: 반응기의 노즐 크기가 클수록 입자 크기가 커진다.
b. 전체 압력(TP)이 입자 크기에 영향을 준다: 전체 압력이 높을수록 입자가 작아진다.
c. FRR이 PDI에 영향을 준다: FRR이 작을수록 PDI가 더 높다
반응기 & 전체 압력(TP): 시스템 B 장비의 작동 압력 범위(0.1 내지 41.7bar)에 걸쳐서, 평균 입자 크기에 대한 TP의 영향은 중간 정도였으며, 평균 입자 크기는 최저 평균 입자 크기보다 약 60% 더 높았다. 이는 시험 제형의 비-부하된 LNP가 균일한 입자 크기(약 64 내지 106 nm), 안정한 PDI(0.12 내지 0.25) 및 균질한 형태와 같은 주요 특성을 유지하면서 매우 광범위한 압력에 걸쳐서 제트 충돌에 의해 생성될 수 있음을 나타내고 있다.
유량비(FRR): 1:1.5 내지 1:4의 FRR 범위를 시험하였다. 원칙적으로, 이러한 범위 내의 모든 FRR이 적합하다. 동시에, FRR과 PDI 사이의 상관관계(P-값 = 0.0088; R2 = 0.32; 도 10)가 관찰되었다. 1:3 또는 1:2의 FRR은 적어도 시험 제형에 대해 PDI < 0.25을 갖는 LNP를 생산하는 데 특히 유용한 것을 나타낸다.
실시예 - mRNA-부하된 지질 나노입자의 제조
충돌 제트 방법에 의한 RNA-부하된 지질 나노입자의 제조를 위해 상기 표 1에 따른 파일럿-규모 장비 시스템 B를 사용하였다. 유기 용매 스트림은 유기 용매로서 EtOH에 용해된 50/38.5/10/1.5 mol% 비율의 지질 DLin-MC3/콜레스테롤/DSPC/DMG-PEG2000을 갖는 모델 지질 조성물을 포함하였다(10 mg/ml의 전체 지질 농도를 가짐). 폴리(A)(폴리아데닐산)을 모델 RNA로서 사용하였고, 50mM 시트레이트 완충액(pH 6)에 0.096mg/mL 농도로 제공하였으며, 제2(즉, 수성) 스트림을 위한 용액으로서 사용하였다.
폴리(A)-부하된 LNP는 200 ㎛의 노즐 개구부 직경(제1 노즐, 유기 액체 스트림) 및 400㎛의 노즐 개구부 직경(제2 노즐, 수성 액체 스트림)을 갖는 충돌 제트 반응기를 사용하여 생산되었다. 상이한 전체 유량(TFR)(40ml/min, 120ml/min, 280ml/min)의 적합성을 각각 1:3의 유량비(유기 스트림 대 수성 스트림)에서 조사하였다. 입자를 투석 후 DLS(Stunner, Unchained labs, USA)를 사용하여 분석하였다. 캡슐화 효율은 RiboGreenassay를 통해 결정되었다.
결과: 예상 크기 범위 내에서 폴리(A)를 캡슐화하고 낮은 PDI 및 높은 캡슐화 효율(EE%로 약칭)을 갖는 지질 나노입자가 모든 전체 유량에서 생성되어 공정의 견실성을 나타냈다.
표 3.
DLS 측정을 또한투석 전 샘플에 대해 수행하여 투석 전의 에탄올 농도에 대한 안정성 및 영향을 측정하였다. 생산 직후 10% 에탄올로 희석한 샘플 뿌만 아니라 추가 희석을 하지 않은 샘플(25% 에탄올)을 샘플 생산 후 약 3시간 후에 분석하고 냉장 온도 하에서 저장하였다.
표 4
표 4에 나타낸 바와 같이, 추가 희석 없이 3시간 동안 저장된 샘플의 입자 크기에서의 최소 변화가 관찰되었다. PDI는 에탄올 희석이 없는 샘플의 경우 더 작거나 비슷했고; 이는 일반적으로 희석 없이도 투석 전 LNP의 우수한 안정성을 시사한다.
실시예 5 - mRNA 완전성 평가
방법: 파이어플라이 루시퍼라제(FLuc) mRNA(APExBIO)의 수성 스트림은 상당한 전단력을 생성하도록 5500rpm의 높은 펌프 속도와 6-7bar의 압력에서 200/400 ㎛ 충돌 제트 반응기(200 ㎛ 노즐은 플러그로 막혀 있음)의 400 ㎛ 핀홀을 통한 시스템 B 장비의 한쪽을 통해 순환되었다. 샘플을 간격을 두고(2초 내지 4분) 채취하고 자동화된 겔 전기 영동(Bioanalyzer)을 사용하여 분석하였다. 샘플을 다음 시점 이후에 채취하여 별도의 레인에서 분석하였다: t=0 (시작 전), (프라임(prime) 후), 2 초, 5 초, 10 초, 20 초, 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분.
결과: 장비 시스템을 통해 mRNA를 순환시키는 것은 순환 시간에 관계없이 검출 가능한 mRNA 분해로 이어지지 않았다. 시스템 B 장비를 통한 한 번 완전히 통과는 약 2초가 소요된다. 따라서, 4분의 순환 시간은 높은 펌프 속도와 압력에서 노즐을 통한 약 120회 통과에 상응한다. 4분 후에도(도 11 참조), mRNA는 그 완전성을 유지했으며, 이는 본원에 개시된 방법에 따라 mRNA-부하된 지질 나노입자를 제조할 때 직면하게 되는 압력 및 전단력 조건이 mRNA에 해롭지 않음을 나타낸다.
실시예 6 - FLuc mRNA를 포함하는 지질 나노입자의 제조
파이어플라이 루시페라아제(FLuc) mRNA를 포함하는 지질 나노입자를 100 ㎛ (제1 노즐, 유기 액체 스트림) 및 200 ㎛ (제2 노즐, 수성 액체 스트림)의 노즐 개구부 직경을 갖는 벤치 규모 장비 시스템 A를 사용하여 제트 충돌 방법으로 제조하였다. 비교로서, 층류 기반 미세유체 혼합 장비(Ignite™, Precision Nanosystems)를 사용하여 입자를 또한 생성시켰다. 이러한 시스템을 사용하여 생산된 지질 나노입자의 형질감염 성능을 또한 시험하였다.
방법: 유기 용매로서 EtOH 중의 50/38.5/10/1.5 mol%의 활성 성분-비함유 Onpattro® 지질 제형 DLin-MC3/콜레스테롤/DSPC/DMG-PEG2000(10 mg/ml의 전체 지질 농도를 가짐)을 유기(즉, 제1) 스트림으로서 사용하였다. 50 mM 시트레이트 완중액(pH 4) 중의 0.09 mg/ml의 농도의 FLuc mRNA(Trilink 또는 APExBIO)를 수성 (즉, 제2) 스트림으로서 사용하였다. 1:3 (유기 스트림 대 수성 스트림)의 유량비 (FRR)가 제트 충돌 시스템에 의한 30 ml/min의 전체 유량 및 미세유체 장비에 의한 10 ml/min의 전체 유량으로 사용되었다. 입자의 입자 크기(z-평균) 및 다분산도 지수(PDI)를 Stunner instrument(Unchained Labs)를 사용한 동적 광산란(DLS)에 의해서 측정하였다. 저온-전도 전자 현미경(TEM) 샘플을 Tecnai F20 TEM에 대해서 검사하였다. 캡슐화 효율은 플루오로제닉 Quant-iTTM RiboGreenTM RNA 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정하고 정량화하였다.
시험관내 형질감염 분석을 위해서, HepG2 세포를 다양한 용량의 FLuc mRNA-부하된 지질 나노-입자와 함께 24웰 플레이트 형식으로 인큐베이션하였다. 생체 내 형질감염 분석을 또한 수행하였다: B6 알비노 마우스(그룹당 n=6)에게 60μg mRNA-부하된 지질 나노입자(2.4mg/kg)를 단일 IV(꼬리 정맥) 주사하였다. IVIS Spectrum 이미징 시스템(PerkinElmer)에서 생물발광 이미징을 투여 후 6시간, 24시간 및 48시간에 수행하였다.
결과. 충돌 방법에 따라 제조된 FLuc-mRNA-부하된 지질 나노입자는 유용한 입자 크기, PDI 및 캡슐화 효율을 갖는 것으로 확인되었다. 각각의 값은 비교기 층류 미세유체 시스템을 사용하여 얻은 나노입자에 대해 측정된 값과 유사하였다(이하 표 참조).
시스템 A를 사용하여 제조된 지질 나노입자의 샘플의 Cryo-TEM(Tecnai F20 TEM) 분석은 구형 입자를 나타냈다. Fluc mRNA의 > 97%의 높은 캡슐화 효율은 세포 분석(도 12 참조, 형질감염당 EE% 분석에 따라 10μg mRNA를 사용한 시험관내 형질감염 분석을 보여줌. 모든 데이터 n=6, 비-파라미터적(non-parametric), Kruskal-Wallis 포스트 AVG+/-SD, ** p<0.01.) 뿐만 아니라 생체내 분석(도 13 참조, 시간이 지남에 따른 전신에 대한 생체내 유전자 전달 정량화를 나타냄)에서 높은 형질감염 비율로 해석되었고, 여기에서, FLuc 발현은 둘 모두의 시험 그룹에서 투여 후 6시간에 최고조에 이르렀고 그 이후에는 감소하는 것으로 관찰되었다. 생체 내 FLuc 생물발광 이미징은 둘 모두의 시스템에 의해 생성된 지질 나노입자에 의해 Fluc mRNA의 전신 전달이 있음을 시사하였다.
실시예 7 - pDNA의 캡슐화
플라스미드 DNA(pDNA)와 같은 더 큰 핵산 생성물을 포함하거나 캡슐화하는 나노입자 분산액을 제조하기 위한 본 개시에 따른 방법의 사용을 또한 시험하였다.
방법: pDNA로 부하된 지질 나노입자를 직경이 100 ㎛(유기 스트림을 위한 제1 노즐) 및 200 ㎛(제2 노즐, 수성 스트림)의 개구부를 갖는 노즐이 장착된 충돌 제트 반응기가 있는 시스템 A 장비를 사용하여 제조하였다. 파이어플라이 루시퍼라제 pDNA(9790 bp, 0.9 mg/mL)의 원액을 추가로 포함하는 50 mM 시트레이트 완충액(pH 4)을 수성 스트림으로서 제공하였고, 두 개의 지질 제형을 제공하였고, 에탄올에 용해시키고, 각각을 유기 스트림으로서 개별적으로 사용하였다: 에탄올 중의 50/38.5/10/1.5 mol%의 비율로 지질 DLin-KC2-DMA/콜레스테롤/DOPE/DMG-PEG2000을 포함하는 제형('제형 A'; 10 mM의 전체 지질 농도), 및 에탄올 중의 50/38.5/10/1.5 mol%의 비율로 DLin-MC3-DMA/콜레스테롤/DSPC/DMG-PEG2000을 포함하는 지질 조성물('제형 B', 10 mM의 전체 지질 농도).
제형 A와 동일한 지질 조성이지만 에탄올 중 전체 지질 농도가 17.2mM인 제형 C('제형 C')를 또한 파이어플라이 루시퍼라제 mRNA(Trilink; mRNA(5-메톡시우리딘; 1929 뉴클레오티드)의 캡슐화에 사용하였다.
pDNA 또는 mRNA의 캡슐화는 30 ml/분의 전체 유량(TFR) 및 1:3(유기 스트림 대 수성 스트림)의 유량비(FRR)에서 수행되었다. 샘플을 수집 후 50 mM 시트레이트 완충액(pH 4)을 사용하여 10% 에탄올로 희석시키고, 투석하고, 여과하였다. 입자 크기와 PDI는 DLS(Stunner, unchained labs)에 의해 측정하였다. 캡슐화 효율(EE%)을 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA를 위한 dsDNA 분석 키트 및 mRNA의 RNA 분석 키트(Invitrogen)를 사용하여 측정하였다.
결과
pDNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를, 놀라울 정도로 높은 캡슐화 효율로, 본 개시에 따른 충돌 방법으로부터 얻었다. 이는 둘 모두의 지질 조성물에서 관찰되었습니다. 플라스미드 DNA를 포함하는 지질 입자는, 이들 분자의 더 큰 크기로 인해서, mRNA보다 더 큰 입자 크기를 지녔다.
CryoTem 분석에 의한 나노입자의 추가의 분석을 수행하였고, 이는 일반적으로 구형 입자가 얻어짐을 나타냈다. 추가의 생체내 분석을 시험된 제형의 생체내 효능이 관찰될 것으로 예상되는 생산된 지질 나노입자 현탁액의 형질감염 효율을 평가하기 위해 수행한다.
실시예 8 - 제트 충돌 반응기에 의한 지질 나노입자의 제조
상기 본원에 기재된 것들과 유사한 실험(비-부하된 및/또는 시험 핵산 분자로 부하된)에서의 모델 지질 나노입자를 충돌 제트 반응기를 사용하여 제조하였으며, 이러한 충돌 제트 반응기는 반응 챔버 벽(3)의 내부 표면(2)에 의해서 정의된 반응 챔버(6)를 포함하고, 그러한 반응 챔버(6)는 실질적인 회전 타원체 전체 모양을 가지며, 상기 챔버(6)는 (a) 제1 및 제2 유체 입구(4)로서, 제1 및 제2 유체 입구(4)가 서로를 가리키도록 반응 챔버(6)의 제1 중심 축(x) 상의 반대 위치에 배열되고, 제1 및 제2 유체 입구(4)의 각각이 노즐(5, 13, 23)을 포함하도록 하는, 제1 및 제2 유체 입구(4); 및 (b) 제3 위치에 배열된 유체 출구(7)로서, 상기 제3 위치가 상기 챔버(6)의 제2 중심 축(y)에 위치되며, 제2 중심 축(y)이 제1 중심 축(x)에 수직이고; 제1 유체 입구(4)의 노즐(5, 13, 23)과 제2 유체 입구의 노즐(5, 13, 23)이 본 개시의 구체예에 따라 기재된 바와 같이, 제1 중심 축(x)을 따라 반응 챔버(6)의 직경과 동일하거나 그보다 작도록 구성되는, 제3 위치에 배열된 유체 출구(7)를 포함한다. 낮은 다분산도와 일관된 입자 크기를 갖는 지질 나노입자의 분산액이 상기 기재된 바와 같은 다른 제트 충돌 장비를 사용하여 얻은 입자와 비교할 수 있는 재현 가능한 방식으로 그리고 넓은 범위의 전체 유량에 걸쳐서 얻어질 것으로 예상된다.
Claims (35)
- 적어도 하나의 양친매성 지질(amphiphilic lipid)을 포함하는 나노입자의 분산액(dispersion)을 생산하기 위한 방법으로서,
a) 유기 용매 및 양친매성 지질을 포함하는 제1 스트림(first stream)을 제공하는 단계;
b) 수성 용매를 포함하는 제2 스트림을 제공하는 단계;
c) 반응 챔버 내로 제1 스트림을 상승된 압력 하에 제1 노즐을 통해서 펌핑시키고 제2 스트림을 상승된 압력 하에 제2 노즐을 통해서 펌핑시키는 단계로서, 제1 노즐이 제2 노즐로부터 약 180°의 각도로 위치되는 단계;
d) 제1 스트림과 제2 스트림을 방응 챔버에서 정면으로 충돌시키는 단계를 포함하고;
제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비(flow rate ratio)가 1:1.5 내지 1:4.5의 범위에 있는, 방법. - 제 1항에 있어서,
제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비가 1:1.5 내지 1:4, 또는 1:2 내지 1:4.5, 또는 1:2 내지 1:4의 범위에 있거나, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비가 약 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4 또는 1:1.45인, 방법. - 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
전체 유량이 1 ml/min 내지 1,000 ml/min, 또는 5 ml/min 내지 800 ml/min의 범위에 있는, 방법. - 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
전체 유량이 100 ml/min 내지 500 ml/min의 범위에 있고, 제1 스트림과 제2 스트림 사이의 유량비가 1:1.2 내지 1:2.5의 범위 또는 1:2 내지 1:4의 범위에 있는, 방법. - 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 노즐이 제1 개구부를 포함하고, 제2 노즐이 제2 개구부를 포함하고, 제1 개구부와 제2 개구부가 40 ㎛ 내지 800 ㎛의 범위의 직경을 갖는, 방법. - 제 5항에 있어서,
제1 또는 제2 개구부의 직경이 다른 개구부의 직경보다 적어도 약 50% 더 큰, 방법. - 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 스트림의 압력이 제2 스트림의 압력보다 낮거나 그와 동일한, 방법. - 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
나노입자가 단일층 리포솜, 다중층 리포솜, 단일 이중층 리포솜, 이중 이중층 리포솜, 다소포성 리포솜, 지질 나노입자, 리포플렉스(lipoplex), 및 포폴리플렉스(lipopolyplex)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
양친매성 지질이 지방산, 글리세로지질(glycerolipid), 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 글리세로인지질, 인지질, 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린(SPC), 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 스핑고지질, 스테롤, 콜레스테롤, 프레놀(prenol), 카로테노이드, 레티놀, 레티날, 레티노산, 베타-카로텐, 토코페롤, 사카로지질(saccharolipid), LIPOID S100, 페길화된 지질(PEGylated lipid), 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG)의 군으로부터 선택되는, 방법. - 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 스트림 또는 제2 스트림이 추가로 적어도 하나의 추가의 양친매성 지질을 포함하는, 방법. - 제 10항에 있어서,
제1 스트림이 양친매성 지질 또는 지방산, 글리세로지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 글리세로인지질, 인지질, 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린(SPC), 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 스핑고지질, 스테롤, 콜레스테롤, 프레놀, 카로테노이드, 레티놀, 레티날, 레티노산, 베타-카로텐, 토코페롤, 사카로지질, LIPOID S100, 페길화된 지질, 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DMG-PEG), 및 이들의 어떠한 조합물의 군으로부터 선택된 지질의 조합물을 포함하는, 방법. - 제 11항에 있어서,
제1 스트림이 페길화된 지질, 콜레스테롤, 및 양이온성 지질, 및 인지질을 포함하는, 방법. - 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 스트림이 알코올, 케톤, 할로겐화된 용매, 아미드 또는 에테르로부터 선택된 유기 용매를 포함하고; 임의로, 용매가 알코올, 바람직하게는 에탄올인, 방법. - 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 스트림이 페길화된 지질을 0.1 mol% 내지 2 mol%의 범위의 농도로 포함하는, 방법. - 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 또는 제2 스트림이 추가로 활성 약제학적 성분을 포함하는, 방법. - 제 15항에 있어서,
활성 약제학적 성분이 작은 분자, 펩티드 및 핵산의 군으로부터 선택되는, 방법. - 제 16항에 있어서,
제2 스트림이 추가로 핵산, 바람직하게는 DNA 및 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산을 포함하고, 임의로, RNA가 mRNA, miRNA, pre-miRNA, saRNA, shRNA, siRNA, 리보자임, 및 안티센스 RNA로 이루어진 군으로부터; 추가로 임의로 항원-인코딩 DNA 및 mRNA(antigen-encoding DNA and mRNA)으로부터 선택되는, 방법. - 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
나노입자 분산액을 여과에 의해서 정제하는 단계;
나노입자 분산액을 동결 건조에 가하는 단계; 또는
교차-흐름 여과에 의해서 나노입자 분산액으로부터 유기 용매를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
나노입자의 평균 입자 크기가 20 nm 내지 100 nm인, 방법. - 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
반응 챔버, 제1 노즐 및 제2 노즐을 포함하는 제트 충돌 반응기를 제공하는 단계를 포함하는, 방법. - 제 20항에 있어서,
제1 및 제2 노즐의 각각이 공급 라인과 연결되고, 각각의 공급 라인이 임의로 각각의 노즐에 대한 상승된 압력 하에 제1 및 제2 스트림을 제공하도록 배열된 펌프와 관련되는, 방법. - 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 스트림의 압력이 독립적으로 0.1 내지 120 bar의 범위의 값으로부터, 임의로, 1 내지 40 bar의 범위로부터 선택되는, 방법. - 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
반응 챔버(6)가 반응 챔버 벽(3)의 내부 표면(2)에 의해서 정의되고, 반응 챔버(6)가 실질적인 회전 타원체 전체 모양을 가지며, 상기 챔버(6)가,
a) 제1 및 제2 유체 입구(4)로서, 제1 및 제2 유체 입구(4)가 서로를 가리키도록 반응 챔버(6)의 제1 중심 축(x) 상의 반대 위치에 배열되고, 제1 유체 입구가 제1 노즐을 포함하고, 제2 유체 입구(4)가 제2 노즐(5, 13, 23)을 포함하도록 하는, 제1 및 제2 유체 입구(4); 및
(b) 제3 위치에 배열된 유체 출구(7)로서, 상기 제3 위치가 상기 챔버(6)의 제2 중심 축(y)에 위치되며, 제2 중심 축(y)이 제1 중심 축(x)에 수직이도록 구성되는, 제3 위치에 배열된 유체 출구(7)를 포함하고; 제1 노즐(5, 13, 23)과 제2 노즐(5, 13, 23) 사이의 거리(d)가 제1 중심 축(x)을 따라 반응 챔버(6)의 직경과 동일하거나 그보다 더 작은, 방법. - 제 24항에 있어서,
제1 노즐(5, 13, 23) 및 제2 노즐(5, 13, 23)이 각각 하류 단부(12, 22)를 가지며, 각각의 노즐(5, 13, 23)의 하류 단부(12, 22)가 챔버 벽(3)의 내부 표면(2)과 실질적으로 정렬되고/거나, 노즐(5, 13, 23)이 제1 및 제2 스트림을 제1 중심 축(x)을 따라 챔버(6)의 중심을 향해서 유도하도록 그리고 제1 스트림과 제2 스트림이 약 180°의 각도로 충돌하도록 배열되는, 방법. - 제 23항 또는 제 24항에 있어서,
(i) 반응 챔버(6)가 제1 중심 축(x)을 따라서 높이, 베이시스(basis), 및 반경을 갖는 구형 캡의 전체 모양을 갖고, 높이가 상기 반경보다 더 크고, 높이가 바람직하게는 상기 반경의 110% 내지 170%이고, 베이시스가 유체 출구(7)에 의해서 정의되고/거나;
(ii) 반응 챔버 벽(3)의 내부 표면(2)의 기본적으로 모두가, 임의로 제1 및/또는 제2 유체 입구(4) 또는 유체 출구(7)의 일부인 내부 표면(2)의 부분을 제외하고는, 실질적으로 구형이고/거나;
(iii) 반응 챔버(6)가 다른 입구 또는 출구 개구부를 갖지 않는, 방법. - 제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서,
반응 챔버(6)가 0.25 mL 이하의 부피를 가지며, 제1 유체 입구(4)의 노즐(5, 13, 23)과 제2 유체 입구(4)의 노즐(5, 13, 23) 사이의 거리(d)가 5 mm 이하인, 방법. - 제 23항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 유체 입구(4)의 각각이 상류 단부(11, 21), 제1 또는 제2 유체 입구(4)의 노즐(5, 13, 23)을 고정하는 하류 단부(12, 22), 및 유체를 상류 단부로부터 하류 단부로 전달하기 위한 유체 도관(14, 24)을 갖는 유체 입구 커넥터(10, 20)에 의해서 제공되고, 각각의 유체 입구 커넥터(10, 20)의 하류 단부가 제1 및 제2 유체 입구(4)를 제공하기 위해서 챔버 벽(3) 내로 가역적으로 삽입 가능하고; 제1 및/또는 제2 유체 입구(4)를 제공하는 유체 입구 커넥터(10, 20)가 임의로 단일 페룰 피팅(single ferrule fitting) 또는 이중 페룰 피팅에 의해 챔버 벽(3)에 부착되는, 방법. - 제 27항에 있어서,
유체 입구 커넥터(10, 20)가,
- 유체 입구 커넥터(10, 20)의 상류 단부(11, 21)와 유체 도관(14, 24)의 상류 부분을 포함하는 상류 세그먼트(upstream segment); 및
- 노즐((5, 13, 23))과 함께 유체 입구 커넥터의 하류 단부(12, 22) 및 유체 도관(14, 24)의 하류 부분을 포함하는 하류 세그먼트를 갖고,
유체 도관(14, 24)의 상류 부분의 직경은 유체 도관(14, 24)의 하류 부분의 직경보다 큰, 방법. - 제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 노즐(5, 13, 23) 및/또는 제2 노즐(5, 13, 23)이 임의로 사파이어, 루비, 다이아몬드, 세라믹 또는 스틸(steel)로 제조되는 일반-오리피스 노즐(plain-orifice nozzle)(5, 13, 23)인, 방법. - 제 23항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 노즐(5, 13, 23)이 제1 오리피스 직경을 가지며, 제2 노즐(5, 13, 23)이 제2 오리피스 직경을 갖고, 제1 오리피스 직경 및/또는 제2 오리피스 직경이 20 ㎛ 내지 500 ㎛의 범위에 있고, 제2 오리피스 직경이 임의로 제1 오리피스 직경보다 더 크고, 제1 오리피스 직경에 대한 제2 오리피스 직경의 비가 임의로 1.2 내지 5인, 방법. - 제 23항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 오리피스 직경에 대한 제1 중심 축(x)을 따른 반응 챔버(6)의 직경의 비가 6 내지 60의 범위에 있는, 방법. - 제 23항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서,
유체 출구(7)의 직경에 대한 제1 중심 축(x)을 따른 반응 챔버(6)의 직경의 비가 약 1.2 내지 3의 범위에 있는, 방법. - 제 23항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서,
반응 챔버 벽(3)의 내부 표면(2)이 0.8 Ra 이하의 표면 거칠기를 나타내고, Ra가 ISO 4287:1997에 따라서 측정되는, 방법. - 제 23항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 스트림의 각각이 0.1 내지 120 bar의 범위의 압력으로, 그리고 임의로, 1 내지 40 bar의 범위의 압력으로, 각각의 노즐(5, 13, 23)을 통해서 강제되고; 임의로, 제1 및 제2 유체 스트림의 각각이 약 1 내지 1000 mL/min의 범위의 유량으로 반응 챔버(6) 내로 유도되는, 방법. - 제 23항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서,
- 제2 노즐(5, 13, 23)의 오리피스가 제1 노즐(5, 13, 23)의 오리피스보다 더 크고/거나;
- 제2 스트림의 유량이 제1 스트림의 유량보다 더 크고;
제1 스트림 및 제2 스트림의 압력이 제1 스트림과 제2 스트림이, 반응 챔버에 유입되는 때에, 실질적으로 동일한 운동 에너지를 가지도록 조절되고, 운동 에너지가 임의로 방정식 에 따라서 계산되는, 방법.
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2022
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