KR20240016288A - P53의 c135y, r175h 또는 m237i 돌연변이를 인식하는 t 세포 수용체 - Google Patents

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김상현
니콜라오스 자카라키스
스티븐 에이. 로젠버그
프랭크 제이. 3세 로워리
마리아 알. 파크허스트
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더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
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Abstract

인간 p53C135Y, 인간 p53R175H, 또는 인간 p53M237I에 대한 항원 특이성을 갖는 단리되거나 또는 정제된 T 세포 수용체(TCR)가 개시된다. 관련 폴리펩티드 및 단백질뿐만 아니라 관련 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포의 집단 및 약학적 조성물도 제공된다. 또한, 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법 및 포유동물에서 암을 치료 또는 예방하는 방법이 개시된다.

Description

P53의 C135Y, R175H 또는 M237I 돌연변이를 인식하는 T 세포 수용체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 특허 출원은 참조에 의해 그 전체가 본원에 포함된, 2021년 5월 7일에 출원된 미국 임시특허출원 63/185,805의 이익을 주장한다.
연방정부가 후원하는 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health), 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에 의한 프로젝트 번호 BC010985 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 포함
본원과 동시에 제출되고, 하기와 같이 식별된 컴퓨터-판독 가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록이 참조에 의해 그 전체로 본원에 포함된다: 2022년 4월 21일자, 명칭이 "759875_ST25.txt"인 133,457 Byte ASCII(텍스트) 파일 1개.
일부 암은 매우 제한적인 치료 옵션을 가질 수 있고, 특히 암이 전이성이고 절제가 불가능한 경우 더욱 그렇다. 예를 들어 수술, 화학요법 및 방사선 요법과 같은 치료법의 발전에도 불구하고, 췌장암, 결장직장암, 폐암, 자궁내막암, 난소암 및 전립선암과 같은 많은 암의 예후는 좋지 않을 수 있다. 따라서, 암에 대한 추가적인 치료에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다.
발명의 간략한 요약
본 발명의 일 양태은 인간 p53C135Y, 인간 p53R175H, 또는 인간 p53M237I 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖는 단리되거나 또는 정제된 T 세포 수용체(TCR)로서, 상기 TCR은: (1) 서열번호 2-4 모두; (2) 서열번호 5-7 모두; (3) 서열번호 2-7 모두; (4) 서열번호 17-19 모두; (5) 서열번호 20-22 모두; (6) 서열번호 17-22 모두; (7) 서열번호 32-34 모두; (8) 서열번호 35-37 모두; (9) 서열번호 32-37 모두; (10) 서열번호 47-49 모두; (11) 서열번호 50-52 모두; (12) 서열번호 47-52 모두; (13) 서열번호 62-64 모두; (14) 서열번호 65-67 모두; 또는 (15) 서열번호 62-67 모두의 아미노산 서열을 포함하는 것인 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명의 TCR과 관련된 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포의 집단 및 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법, 포유동물에서 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법, 및 포유동물에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 TCR을 발현하는 숙주 세포를 생산하는 방법 및 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
종양 단백질 P53("TP53" 또는 "p53"이라고도 함)은 예를 들어 세포 분열을 조절함으로써 종양 억제자(tumor suppressor)로 작용한다. p53 단백질은 세포의 핵에 위치하며 DNA와 직접 결합한다. DNA가 손상되면, p53 단백질은 DNA가 복구될지 또는 손상된 세포가 세포사멸을 겪을지 여부를 결정하는 데 관여한다. DNA가 복구될 수 있는 경우, p53은 다른 유전자를 활성화하여 손상을 수선한다. DNA가 복구될 수 없는 경우, p53 단백질은 세포가 분열하는 것을 막고, 세포에 세포사멸을 진행하라는 신호를 보낸다. p53은 돌연변이되거나 또는 손상된 DNA가 있는 세포의 분열을 막아 종양 발생을 예방하는 데 도움이 된다. WT(정상) 전장 p53은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
p53 단백질의 돌연변이는 p53 단백질의 종양 억제 기능을 감소시키거나 제거할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, p53 돌연변이는 우성 음성 방식으로 WT p53을 방해함으로써 기능-획득(gain-of-function) 돌연변이일 수 있다. 돌연변이 p53 단백질은 임의의 다양한 인간 암, 예를 들어 담관암종, 흑색종, 결장암, 직장암, 난소암, 자궁내막암, 비소세포폐암(NSCLC), 교모세포종, 자궁경부암, 두경부암, 유방암, 췌장암 또는 방광암에서 발현될 수 있다.
본 발명의 일 양태은 인간 p53C135Y, 인간 p53R175H 또는 인간 p53M237I 아미노산 서열(이하에서, "돌연변이 p53")에 대한 항원 특이성을 갖는 단리되거나 정제된 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다. 달리 명시되지 않는 한, 이하에서, "TCR"에 대한 언급은 또한, TCR의 기능적 부분(functional portion) 및 기능적 변이체(functional variant)을 의미한다. p53의 돌연변이는 전장, WT p53의 아미노산 서열(서열번호 1)을 참조하여 본원에서 정의된다. p53의 돌연변이는 특정 위치에 존재하는 아미노산 잔기, 뒤이어, 위치 번호, 해당 잔기가 논의 중인 특정 돌연변이에서 대체된 아미노산을 참조하여 본원에 기술되어 있다. p53 아미노산 서열(예를 들어, p53 펩티드)은 전장, WT p53 단백질의 전체 아미노산 잔기보다 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 위치 번호는 WT 전장 p53 단백질 (즉, 서열번호 1)을 기준으로 정의되고, p53 아미노산 서열의 특정 예에서 상응하는 잔기의 실제 위치가 다를 수 있는 것으로 이해된다. 위치가 서열번호 1에 의해 정의된 것과 같으므로, 용어 "C135Y"는 서열번호 1의 135번 위치에 존재하는 시스테인이 티로신으로 대체되었다는 것을 나타내고, "R175H"는 서열번호 1의 175번 위치에 존재하는 아르기닌이 히스티딘으로 대체되었다는 것을 나타내며, "M237I"는 서열번호 1의 237번 위치에 존재하는 메티오닌이 이소루이신으로 대체되었다는 것을 나타낸다. 예를 들어, p53 아미노산 서열의 특정 예가, 예를 들어 TCTYSPALNKMF C QLAKTCPVQLWV(서열번호 89)(서열번호 1의 연속 아미노산 잔기 123 내지 147에 상응하는 예시적인 WT p53 펩티드)인 경우, 서열번호 89에서 밑줄 친 아르기닌의 실제 위치가 13임에도 불구하고, "C135Y "는 서열번호 89에서 밑줄 친 시스테인의 티로신에 의한 치환을 의미한다. C135Y 돌연변이를 갖는 인간 p53 아미노산 서열은 이하에서 "C135Y" 또는 "p53C135Y"로 지칭된다. R175H 돌연변이를 갖는 인간 p53 아미노산 서열은 이하에서 "R175H" 또는 "p53R175H"로 지칭된다. M237I 돌연변이를 갖는 인간 p53 아미노산 서열은 이하에서 "M237I" 또는 "p53M237I"로 지칭된다. 본원에서 사용된 "돌연변이 p53(mutated p53)"은 인간 p53C135Y, 인간 p53R175H, 또는 인간 p53M237I를 의미한다.
p53에는 9종의 알려진 스플라이스 변이체(splice variant)가 있다. 본원에 기술된 p53 돌연변이는 9종의 p53 스플라이스 변이체 모두에 걸쳐 보존된다. 9종의 p53 스플라이스 변이체의 정렬이 도 5에 도시된다. 따라서, 본 발명의 TCR은 9종의 p53 스플라이스 변이체 중 하나에 의해 코딩되는 본원에 기술된 임의의 돌연변이 p53 아미노산 서열에 대해 항원 특이성을 가질 수 있다. 위치가 서열번호 1에 의해 정의된 바와 같기 때문에, p53의 특정 스플라이스 변이체의 아미노산 서열의 실제 위치는 서열번호 1의 상응하는 위치에 대해 정의되고, 서열번호 1에 의해 정의된 위치는 특정 스플라이스 변이체 중 실제 위치와 다를 수 있다. 따라서, 예를 들어, 돌연변이는 서열번호 1의 393개 아미노산 서열의 지시된 위치에 상응하는 p53의 특정 스플라이스 변이체의 아미노산 서열 중 아미노산 잔기의 대체를 의미하고, 스플라이스 변이체 중 실제 위치는 다를 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 일 양태에서, TCR은 서열번호 1에 의해 정의된, 위치 135에 돌연변이가 있는 인간 p53에 대해 항원 특이성을 갖는다. 위치 135의 p53 돌연변이는 미스센스(missense) 돌연변이일 수 있다. 따라서, 위치 135에서의 돌연변이는 위치 135에 존재하는 원형(native)(WT) 시스테인 잔기가 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기로 치환된 것일 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 인간 p53C135Y 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖는다. 예를 들어, TCR은 TCTYSPALNKMF Y QLAKTCPVQLWV(서열번호 90)의 인간 p53C135Y 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 가질 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 TCTYSPALNKMF C QLAKTCPVQLWV(서열번호 89)의 야생형 인간 p53 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, TCR은 서열번호 1에 의해 정의된, 위치 175에 돌연변이가 있는 인간 p53에 대해 항원 특이성을 갖는다. 위치 175의 p53 돌연변이는 미스센스 돌연변이일 수 있다. 따라서, 위치 175에서의 돌연변이는 위치 175에 존재하는 원형(WT) 아르기닌 잔기가 아르기닌 이외의 임의의 아미노산 잔기로 치환된 것일 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 인간 p53R175H 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖는다. 예를 들어, TCR은 HMTEVVR H C(서열번호 92)의 인간 p53R175H 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 가질 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 HMTEVVR R C(서열번호 91)의 야생형 인간 p53 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, TCR은 서열번호 1에 의해 정의된, 위치 237에 돌연변이가 있는 인간 p53에 대한 항원 특이성을 갖는다. 위치 237의 p53 돌연변이는 미스센스 돌연변이일 수 있다. 따라서, 위치 237에서의 돌연변이는 위치 237에 존재하는 원형(WT) 메티오닌 잔기가 메티오닌 이외의 임의의 아미노산 잔기로 치환된 것일 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 인간 p53M237I 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖는다. 예를 들어, TCR은 VGSDCTTIHYNY I CNSSCMGGMNRR(서열번호 94)의 인간 p53M237I 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 가질 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 VGSDCTTIHYNY M CNSSCMGGMNRR(서열번호 93)의 야생형 인간 p53 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 TCR은 HLA(human leukocyte antigen) 분자 의존적 방식으로 돌연변이 p53을 인식할 수 있다. 본원에서 사용된 "HLA 분자 의존적 방식(HLA molecule dependent manner)"은 TCR이 HLA 분자의 배경(context) 내에서 돌연변이 p53에 결합할 때 면역 반응을 유도하고, 이 HLA 분자는 TCR이 분리된 환자에 의해 발현된다 것을 의미한다. 본 발명의 TCR은 해당되는(applicable) HLA 분자에 의해 제시되는 돌연변이 p53을 인식할 수 있고, 돌연변이 p53에 더해, HLA 분자에도 결합할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 TCR은 HLA 클래스 II 분자에 의해 제시된 C135Y를 인식할 수 있다. 이와 관련하여, TCR은 HLA 클래스 II 분자의 배경 내에서 C135Y에 결합할 때 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 TCR은 HLA 클래스 II 분자에 의해 제시되는 C135Y를 인식할 수 있으며 C135Y에 더해, HLA 클래스 II 분자에도 결합할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 TCR은 HLA 클래스 II 분자에 의해 제시된 M237I를 인식할 수 있다. 이와 관련하여, TCR은 HLA 클래스 II 분자의 배경에서 M237I에 결합할 때 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 TCR은 HLA 클래스 II 분자에 의해 제시되는 M237I를 인식할 수 있으며 M237I 외에 HLA 클래스 II 분자에도 결합할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, HLA 클래스 II 분자는 HLA-DR 이종이량체(heterodimer)이다. HLA-DR 이종이량체는 α 사슬 및 β 사슬을 포함하는 세포 표면 수용체이다. HLA-DR α 사슬은 HLA-DRA 유전자에 의해 코딩된다. HLA-DR β 사슬은 HLA-DRB1 유전자, HLA-DRB3 유전자, HLA-DRB4 유전자 또는 HLA-DRB5 유전자에 의해 코딩된다. HLA-DRB1 유전자에 의해 코딩되는 분자의 예는 HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR5, HLA-DR6, HLA-DR7, HLA-DR8, HLA-DR9, HLA-DR10, HLA-DR11, HLA-DR12, HLA-DR13, HLA-DR14, HLA-DR15, HLA-DR16 및 HLA-DR17을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. HLA-DRB3 유전자는 HLA-DR52를 코딩한다. HLA-DRB4 유전자는 HLA-DR53을 코딩한다. HLA-DRB5 유전자는 HLA-DR51을 코딩한다.
일 양태에서, HLA 클래스 II 분자의 알파 사슬은 HLA-DRA1*01:01 대립유전자에 의해 발현된다. 일 양태에서, HLA 클래스 II 분자의 베타 사슬은 HLA-DRB1*07:01 대립유전자에 의해 발현된다. 본 발명의 일 양태에서, HLA 클래스 II 분자는 HLA-DRB7:HLA-DRA 이종이량체이다. 바람직한 양태에서, HLA 클래스 II 분자는 HLA-DRA1*01:01 사슬과 HLA-DRB1*07:01 사슬의 이종이량체이다. 특히 바람직한 양태에서, 돌연변이 p53은 C135Y이고 HLA 클래스 II 분자는 HLA-DRA1*01:01 사슬과 HLA-DRB1*07:01 사슬의 이종이량체이다.
일 양태에서, HLA 클래스 II 분자의 알파 사슬은 HLA-DRA1*01:01 대립유전자에 의해 발현된다. 일 양태에서, HLA 클래스 II 분자의 베타 사슬은 HLA-DRB1*01:01 대립유전자에 의해 발현된다. 본 발명의 일 양태에서, HLA 클래스 II 분자는 HLA-DRB1:HLA-DRA 이종이량체이다. 바람직한 양태에서, HLA 클래스 II 분자는 HLA-DRA1*01:01 사슬과 HLA-DRB1*01:01 사슬의 이종이량체이다. 특히 바람직한 양태에서, 돌연변이 p53은 M237I이고 HLA 클래스 II 분자는 HLA-DRA1*01:01 사슬과 HLA-DRB1*01:01 사슬의 이종이량체이다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 TCR은 HLA 클래스 I 분자에 의해 제시된 R175H를 인식할 수 있다. 이와 관련하여, TCR은 HLA 클래스 I 분자의 배경에서 R175H에 결합할 때 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 TCR은 HLA 클래스 I 분자에 의해 제시되는 R175H를 인식할 수 있으며 R175H 외에 HLA 클래스 I 분자에도 결합할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, HLA 클래스 I 분자는 HLA-A 분자이다. HLA-A 분자는 α 사슬과 β2 마이크로글로불린의 이종이량체이다. HLA-A α 사슬은 HLA-A 유전자에 의해 코딩될 수 있다. β2 마이크로글로불린은 알파 사슬의 알파1, 알파2 및 알파3 도메인에 비-공유적으로 결합하여 HLA-A 복합체를 형성한다. HLA-A 분자는 임의의 HLA-A 분자일 수 있다. 본 발명의 일 구체현예에서, HLA 클래스 I 분자는 HLA-A2 분자이다. HLA-A2 분자는 임의의 HLA-A2 분자일 수 있다. HLA-A2 분자의 예는 HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03 대립유전자, HLA-A*02:05, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07 대립 유전자, 또는 HLA-A*02:11 대립 유전자에 의해 코딩되는 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, HLA 클래스 I 분자는 HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩된다.
본 발명의 TCR은 입양 세포 전달(adoptive cell transfer)에 사용되는 세포에 의해 발현되는 경우를 포함한 많은 이점 중 하나 이상을 제공할 수 있다. 돌연변이 p53은 암세포에서 발현되며, 정상, 비암성(noncancerous) 세포에서는 발현되지 않는다. 특정 이론이나 메커니즘에 한정되지 않으면서, 본 발명의 TCR은 정상 비암성 세포의 파괴를 최소화하거나, 제거하면서 암세포의 파괴를 유리하게 표적으로 하여, 그에 의해, 예를 들어 독성을 최소화하거나 제거하는 것에 의해 독성을 감소시키는 것으로 여겨진다. 더욱이, 본 발명의 TCR은 예를 들어 화학요법, 수술 또는 방사선과 같은 다른 유형의 치료에 반응하지 않는 돌연변이 p53 양성 암을 유리하게 성공적으로 치료 또는 예방할 수 있다. 또한, 본 발명의 TCR은 돌연변이 p53에 대한 매우 강한(avid) 인식을 제공할 수 있으며, 이는 조작되지 않은(unmanipulated) 종양 세포(예를 들면, 인터페론(IFN)-γ로 처리되지 않거나, 돌연변이 p53 및 해당되는 HLA 분자 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 벡터로 형질감염되지 않거나, 또는 p53 돌연변이가 있는 p53 펩티드 또는 이들의 조합으로 펄스되지 않거나, 또는 이들의 조합을 겪지 않은 종양 세포)를 인식하는 능력을 제공할 수 있다. p53의 돌연변이는 상이한 종양 유형에 걸쳐 공통된다. 모든 종양의 거일 절반은 p53에 돌연변이를 가지며, 그의 약 절반은 미스센스 돌연변이일 것이다. R175H 돌연변이는 일반적이어서, 고형 암을 가진 모든 환자의 약 5%에 영향을 미친다. C135Y 및 M237I 돌연변이도 또한 고도로 빈발하고, 각각 전체 암 환자의 약 0.4%에 영향을 미친다. 따라서, 본 발명의 TCR은 면역요법에 의한 치료에 적격인 환자의 수를 증가시킬 수 있다.
본원에서 사용된 문구 "항원 특이성(antigenic specificity)"은 TCR이 높은 결합력(avidity)으로 돌연변이 p53에 특이적으로 결합하고 면역학적으로 인식할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, (a) 돌연변이 p53 펩티드(예를 들면, 약 0.1 ng/mL 내지 약 10,000 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.5 ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL, 500 ng/mL, 1,000 ng/mL, 5,000 ng/mL, 10,000 ng/mL 또는 전술된 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)로 펄스된(pulsed) 항원-음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포 또는 (b) 돌연변이 p53을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 도입되어 돌연변이 p53을 발현하는, 항원-음성, 해당 HLA 분자 양성 표적 세포와 공-배양시 약 1 x 104 내지 약 1 x 105개의 TCR을 발현하는 T 세포가 적어도 약 200 pg/mL 이상(예를 들면, 200 pg/mL 이상, 300 pg/mL 이상, 400 pg/mL 이상, 500 pg/mL 이상, 600 pg/mL 이상, 700 pg/mL 이상, 1000 pg/mL 이상, 5,000 pg/mL 이상, 7,000 pg/mL 이상, 10,000 pg/mL 이상, 20,000 pg/mL 이상 또는 전술된 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)의 IFN-γ를 분비하는 경우, TCR은 돌연변이 p53에 대한 "항원 특이성"을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본 발명의 TCR을 발현하는 세포는 또한 더 높은 농도의 돌연변이 p53 펩티드로 펄스된 항원 음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포와의 공-배양 시 IFN-γ를 분비할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, TCR을 발현하는 T 세포가 (a) 돌연변이 p53 펩티드로 펄스된, 항원 음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포, 또는 (b) 표적 세포가 돌연변이 p53을 발현하도록 돌연변이 p53을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 도입된, 항원-음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포와의 공-배양 시 음성 대조군에 의해 발현되는 IFN-γ의 양과 비교하여 적어도 두 배의 IFN-γ를 분비하는 경우, TCR은 돌연변이 p53에 대해 "항원 특이성"을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 음성 대조군은 예를 들어, (i) (a) 동일한 농도의 무관한(irrelevant) 펩티드(예를 들면, 돌연변이 p53 펩티드와 다른 서열을 갖는, 일부 기타 펩티드)로 펄스된, 항원 음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포, 또는 (b) 표적 세포가 무관한 펩티드를 발현하도록 무관한 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 도입된, 항원 음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포와 공-배양된, TCR을 발현하는 T 세포, 또는 (ii) (a) 동일한 농도의 돌연변이 p53 펩티드로 펄스된, 항원 음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포, 또는 (b) 표적 세포가 돌연변이 p53을 발현하도록 돌연변이 p53을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 도입된, 항원 음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포와 공-배양된, 비형질도입 T 세포(TCR을 발현하지 않는, PBMC 유래 T 세포)일 수 있다. IFN-γ 분비는 예를 들어 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 펄스된 펩티드의 농도는 본 발명의 기타 양태와 관련하여 본원에 기재된 바와 같을 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, (a) 돌연변이 p53 펩티드로 펄스된, 항원-음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포, 또는 (b) 표적 세포가 돌연변이 p53을 발현하도록 돌연변이 p53을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 도입된, 항원 음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포와 공-배양 시, IFN-γ를 발현하는 음성 대조군 T 세포의 수 대비 TCR을 발현하는 T 세포 수의 2배 이상이 IFN-γ를 분비하는 경우, TCR은 돌연변이 p53에 대해 "항원 특이성"을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 펩티드의 농도 및 음성 대조군은 본 발명의 기타 양태와 관련하여 본원에 기재된 바와 같을 수 있다. IFN-γ를 분비하는 세포의 수는 예를 들어 ELISOT (enzyme-linked immunospot) 분석과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, (a) 돌연변이 p53 펩티드로 펄스된, 항원-음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포, 또는 (b) 표적 세포가 돌연변이 p53을 발현하도록, 돌연변이 p53을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 도입된, 되어 검출된 반점의 수와 비교하여 표적 세포가 돌연변이 p53을 발현하는 항원-음성, 해당되는 HLA 분자 양성 표적 세포와 공-배양시, 동일한 표적 세포와 공배양된 음성 대조군 T 세포에 대한 ELISPOT에 의해 검출되는 스팟의 수 대비, 적어도 2배의 스팟이 TCR을 발현하는 T 세포에 대한 ELISPOT에 의해 검출되는 경우, TCR은 돌연변이 p53에 대해 "항원 특이성"을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 펩티드의 농도 및 음성 대조군은 본 발명의 기타 양태와 관련하여 본원에 기재된 바와 같을 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, TCR을 발현하는 T 세포가 돌연변이 p53을 발현하는 표적 세포에 의한 자극 후에, 예를 들어 유세포 분석법으로, 측정된 4-1BB 및 OX40 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 상향 조절하는 경우, TCR은 돌연변이 p53에 대해 "항원 특이성"을 갖는 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 일 양태은 2개의 폴리펩티드(즉, 폴리펩티드 사슬), 예를 들면, TCR의 알파(α) 사슬, TCR의 베타(β) 사슬, TCR의 감마(g) 사슬, TCR의 델타(δ) 사슬, 또는 이들의 조합을 포함하는 TCR을 제공한다. 본 발명의 TCR의 폴리펩티드는, TCR이 돌연변이 p53에 대해 항원 특이성을 갖는다면 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, TCR은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 이들 각각은 TCR의 상보성 결정 영역 (CDR)1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 α 사슬 CDR1(CDR1α), α 사슬 CDR2(CDR2α) 및 α 사슬 CDR3(CDR3α)을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 β 사슬 CDR1(CDR1β), β 사슬 CDR2(CDR2β) 및 β 사슬 CDR3(CDR3β)을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 (1) 서열번호 2-7 모두(4316-D TCR); (2) 서열번호 17-22 모두(4141 IVS TCR); (3) 서열번호 32-37 모두(4304 TCR-2); (4) 서열번호 47-52 모두(4304 TCR-4); 또는 (5) 서열번호 62-67 모두(4304 TCR-K)의 아미노산 서열을 포함한다. 이 단락에서 전술한 아미노산 서열의 5개의 집합(collection) 각각은 돌연변이 인간 p53에 대한 항원 특이성을 갖는 5개의 서로 다른 TCR 각각의 6개 CDR 영역을 제시한다. 각 집합의 6개 아미노산 서열은 각각 TCR의 CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β 및 CDR3β에 해당한다.
TCR은 서열번호 2-7, 17-22, 32-37, 47-52, 및 62-67 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 TCR은 인간 p53C135Y, 인간 p53R175H, 또는 인간 p53M237I 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖는 단리되거나 정제된 TCR로서, 상기 TCR은: (1) 서열번호 2-4 모두; (2) 서열번호 5-7 모두; (3) 서열번호 2-7 모두; (4) 서열번호 17-19 모두; (5) 서열번호 20-22 모두; (6) 서열번호 17-22 모두; (7) 서열번호 32-34 모두; (8) 서열번호 35-37 모두; (9) 서열번호 32-37 모두; (10) 서열번호 47-49 모두; (11) 서열번호 50-52 모두; (12) 서열번호 47-52 모두; (13) 서열번호 62-64 모두; (14) 서열번호 65-67 모두; 또는 (15) 서열번호 62-67 모두의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, TCR은 α 사슬 가변 영역 아미노산 서열 및 β 사슬 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 이들은 함께 위에 제시된 CDR의 집합(collection) 중 하나를 포함한다. 이와 관련하여, 상기 TCR은: (1) 서열번호 8 및 9 모두; (2) 서열번호 10 및 11 모두; (3) 서열번호 23 및 24 모두; (4) 서열번호 25 및 26 모두; (5) 서열번호 38 및 39 모두; (6) 서열번호 40 및 41 모두; (7) 서열번호 53 및 54 모두; (8) 서열번호 55 및 56 모두; (9) 서열번호 68 및 69 모두; 또는 (10) 서열번호 70 및 71 모두의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 단락의 전술한 아미노산 서열의 집합 각각은 돌연변이 인간 p53에 대한 항원 특이성을 갖는 5개의 상이한 TCR 각각의 2개의 가변 영역을 기술한다. 각 집합의 두 아미노산 서열은 각각 TCR의 α 사슬의 가변 영역 및 β 사슬의 가변 영역에 해당한다.
TCR은 예를 들어 서열번호 8, 9, 10, 11, 23, 24, 25, 26, 38, 39, 40, 41, 53, 54, 55, 56, 68, 69, 70 및 71 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 TCR은: (1) 서열번호 8; (2) 서열번호 9; (3) 서열번호 8 및 9 모두; (4) 서열번호 10; (5) 서열번호 11; (6) 서열번호 10 및 11 모두; (7) 서열번호 23; (8) 서열번호 24; (9) 서열번호 23 및 24 모두; (10) 서열번호 25; (11) 서열번호 26; (12) 서열번호 25 및 26 모두; (13) 서열번호 38; (14) 서열번호 39; (15) 서열번호 38 및 39 모두; (16) 서열번호 40; (17) 서열번호 41; (18) 서열번호 40 및 41 모두; (19) 서열번호 53; (20) 서열번호 54; (21) 서열번호 53 및 54 모두; (22) 서열번호 55; (23) 서열번호 56; (24) 서열번호 55 및 56 모두; (25) 서열번호 68; (26) 서열번호 69; (27) 서열번호 68 및 69 모두; (28) 서열번호 70; (29) 서열번호 71; 또는 (30) 서열번호 70 및 71 모두의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 TCR은 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 불변 영역은 예를 들어 인간 또는 마우스와 같은 임의의 적합한 종으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 마우스 불변 영역을 추가로 포함한다. 본원에 기술된 TCR 또는 TCR의 임의의 구성요소(예를 들어, 상보성 결정 영역(CDR), 가변 영역, 불변 영역, 알파 사슬 및/또는 베타)를 언급할 때, 본원에서 사용되는 용어 "마우스(murine)" 또는 "인간"은 각각 마우스 또는 인간으로부터 유래된 TCR (또는 그의 구성요소), 즉 마우스 T 세포 또는 인간 T 세포로부터 유래되었거나 한때 발현되었던 TCR(또는 그의 구성요소)을 의미한다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 마우스 α 사슬 불변 영역 및 마우스 β 사슬 불변 영역을 포함할 수 있다. 마우스 α 사슬 불변 영역은 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 변형된 마우스 α 사슬 불변 영역은 예를 들어, US 특허 10,174,098에 기술된 바와 같이, 예를 들어 시스테인 치환되거나, LVL 변형되거나, 또는 시스테인-치환되고 및 LVL-변형된 것일 수 있다. 마우스 β 사슬 불변 영역은 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 변형된 마우스 β 사슬 불변 영역은 예를 들어 US 특허 10,174,098에 기술된 바와 같이 시스테인-치환될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 서열번호 77 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 시스테인-치환, LVL-변형 마우스 α 사슬 불변 영역을 포함한다. 본 발명의 일 양태에서, TCR은 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 시스테인-치환된 마우스 β 사슬 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 TCR은 TCR의 α 사슬 및 TCR의 β 사슬을 포함할 수 있다. TCR의 α 사슬은 α 사슬의 가변 영역과 α 사슬의 불변 영역을 포함할 수 있다. 이 유형의 α 사슬은 TCR의 임의의 β 사슬과 쌍을 이룰 수 있다. β 사슬은 β 사슬의 가변 영역 및 β 사슬의 불변 영역을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 α 사슬 및/또는 β 사슬의 아미노산 서열은 C-말단 끝에 아미노산 서열 RAKR(서열번호 95)을 추가로 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, TCR은 (1) 서열번호 12 및 13 모두; (2) 서열번호 14 및 15 모두; (3) 서열번호 27 및 28 모두; (4) 서열번호 29 및 30 모두; (5) 서열번호 42 및 43 모두; (6) 서열번호 44 및 45 모두; (7) 서열번호 57 및 58 모두; (8) 서열번호 59 및 60 모두; (9) 서열번호 72 및 73 모두; 또는 (9) 서열번호 74 및 75 모두의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 단락의 전술한 아미노산 서열의 집합 각각은 돌연변이 인간 p53에 대한 항원 특이성을 갖는 5개의 상이한 TCR 각각의 2개의 가변 영역을 기술한다. 각 집합의 두 아미노산 서열은 각각 TCR의 α 사슬의 가변 영역 및 β 사슬의 가변 영역에 해당한다.
TCR은 서열번호 12, 13, 14, 15, 27, 28, 29, 30, 42, 43, 44, 45, 57, 58, 59, 60, 72, 73, 74, 및 75 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 TCR은: (1) 서열번호 12; (2) 서열번호 13; (3) 서열번호 12 및 13 모두; (4) 서열번호 14; (5) 서열번호 15; (6) 서열번호 14 및 15 모두; (7) 서열번호 27; (8) 서열번호 28; (9) 서열번호 27 및 28 모두; (10) 서열번호 29; (11) 서열번호 30; (12) 서열번호 29 및 30 모두; (13) 서열번호 42; (14) 서열번호 43; (15) 서열번호 42 및 43 모두; (16) 서열번호 44; (17) 서열번호 45; (18) 서열번호 44 및 45 모두; (19) 서열번호 57; (20) 서열번호 58; (21) 서열번호 57 및 58 모두; (22) 서열번호 59; (23) 서열번호 60; (24) 서열번호 59 및 60 모두; (25) 서열번호 72; (26) 서열번호 73; (27) 서열번호 72 및 73 모두; (28) 서열번호 74; (29) 서열번호 75; 또는 (30) 서열번호 74 및 75 모두의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 범위에는 본원에 기술된 본 발명의 TCR의 기능적 변이체가 포함된다. 본원에서 사용된 용어 "기능적 변이체(functional variant)"는 모(parent) TCR, 폴리펩티드 또는 단백질과 실질적인 또는 상당한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 의미하며, 기능적 변이체는 그가 변이체인 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성을 유지한다. 기능적 변이체는 예를 들어, 모 TCR이 항원 특이성을 갖거나, 모 폴리펩티드 또는 단백질이 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질과 유사한 정도로, 동일한 정도로, 또는 더 높은 정도로 특이적으로 결합하는 것인 돌연변이 p53에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질(모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질)의 변이체를 포함한다. 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여, 기능적 변이체는 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질에 대해, 아미노산 서열에서 예를 들어 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상 동일할 수 있다.
기능적 변이체는 예를 들어 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 특정 물리적 및/또는 화학적 특성을 갖는 하나의 아미노산이 동일한 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 교환되는 것인 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 또 다른 산성 아미노산(예: Asp 또는 Glu)을 치환된 산성 아미노산, 비극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예: Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val 등)을 치환한 비극성 측쇄를 갖는 아미노산, 또 다른 염기성 아미노산(Lys, Arg 등)을 치환한 염기성 아미노산, 극성 측쇄를 가진 또 다른 아미노산(Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr 등)을 치환한 극성 측쇄를 가진 아미노산, 등일 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 기능적 변이체는 적어도 하나의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우, 비보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물학적 활성을 방해하거나 억제하지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 비보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물학적 활성이 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질 대비 증가되도록 기능적 변이체의 생물학적 활성을 증진시킨다.
TCR, 폴리펩티드 또는 단백질은 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질의 다른 성분, 예를 들어 다른 아미노산이 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않도록, 본원에 기술된 특정된 아미노산 서열 또는 서열들로 필수적으로 구성될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 TCR의 기능적 부분을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 올리고펩티드를 포함하며, 하나 이상의 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산의 단일 사슬을 의미한다.
본 발명의 폴리펩티드와 관련하여, 기능적 부분은 그것이 일부인 TCR의 인접 아미노산을 포함하는 임의의 부분일 수 있으며, 단 기능적 부분은 돌연변이 p53에 특이적으로 결합한다. TCR과 관련하여 사용된 용어 "기능적 부분"은 본 발명의 TCR의 임의의 부분 또는 단편을 의미하며, 이 부분 또는 단편은 자신이 일부인 TCR(모 TCR)의 생물학적 활성을 보유한다. 기능적 부분은 예를 들어, 모 TCR과 유사한 정도, 동일한 정도, 또는 더 높은 정도로 돌연변이 p53에 특이적으로 결합하거나(예를 들어, 해당되는 HLA 분자 의존적 방식으로), 암을 검출, 치료, 또는 예방하는 능력을 보유하는 TCR의 부분을 포함한다. 모 TCR과 관련하여, 기능적 부분은 예를 들어, 모 PCR의 약 10%, 약 25%, 약 30%, 약 50%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상을 포함할 수 있다.
기능성 부분은 상기 부분의 아미노 또는 카르복시 말단, 또는 양 말단 모두에 추가적인 아미노산을 포함할 수 있으며, 이러한 추가 아미노산은 모 TCR의 아미노산 서열에서 발견되지 않는다. 바람직하게는, 추가적인 아미노산은 기능적 부분의 생물학적 기능, 예를 들어 돌연변이 p53에 특이적으로 결합하고, 및/또는 암을 검출하고, 암을 치료 또는 예방하는 능력을 갖는 것 등을 방해하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 추가적인 아미노산은 모 TCR의 생물학적 활성과 비교하여 생물학적 활성을 증진시킨다.
상기 폴리펩티드는 본 발명의 TCR의 α 사슬 및 β 사슬 중 하나 또는 둘 모두의 기능적 부분, 예를 들어, 본 발명의 TCR의 α 사슬 및/또는 β 사슬의 가변 영역(들)의 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상을 포함하는 기능적 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 폴리펩티드는: (1) 서열번호 2-7 모두; (2) 서열번호 17-22 모두; (3) 서열번호 32-37 모두; (4) 서열번호 47-52 모두; 또는 (5) 서열번호 62-67 모두의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 폴리펩티드는 (1) 서열번호 2-4 모두; (2) 서열번호 5-7 모두; (3) 서열번호 2-7 모두; (4) 서열번호 17-19 모두; (5) 서열번호 20-22 모두; (6) 서열번호 17-22 모두; (7) 서열번호 32-34 모두; (8) 서열번호 35-37 모두; (9) 서열번호 32-37 모두; (10) 서열번호 47-49 모두; (11) 서열번호 50-52 모두; (12) 서열번호 47-52 모두; (13) 서열번호 62-64 모두; (14) 서열번호 65-67 모두; 또는 (15) 서열번호 62-67 모두의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, 전술된 CDR 영역의 조합을 포함하는 본 발명의 TCR의 가변 영역을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 폴리펩티드는, 예를 들어,: (1) 서열번호 8 및 9 모두; (2) 서열번호 10 및 11 모두; (3) 서열번호 23 및 24 모두; (4) 서열번호 25 및 26 모두; (5) 서열번호 38 및 39 모두; (6) 서열번호 40 및 41 모두; (7) 서열번호 53 및 54 모두; (8) 서열번호 55 및 56 모두; (9) 서열번호 68 및 69 모두; 또는 (10) 서열번호 70 및 71 모두의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 예를 들어, 서열번호 8, 9, 10, 11, 23, 24, 25, 26, 38, 39, 40, 41, 53, 54, 55, 56, 68, 69, 70 및 71 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 폴리펩티드는: (1) 서열번호 8; (2) 서열번호 9; (3) 서열번호 8 및 9 모두; (4) 서열번호 10; (5) 서열번호 11; (6) 서열번호 10 및 11 모두; (7) 서열번호 23; (8) 서열번호 24; (9) 서열번호 23 및 24 모두; (10) 서열번호 25; (11) 서열번호 26; (12) 서열번호 25 및 26 모두; (13) 서열번호 38; (14) 서열번호 39; (15) 서열번호 38 및 39 모두; (16) 서열번호 40; (17) 서열번호 41; (18) 서열번호 40 및 41 모두; (19) 서열번호 53; (20) 서열번호 54; (21) 서열번호 53 및 54 모두; (22) 서열번호 55; (23) 서열번호 56; (24) 서열번호 55 및 56 모두; (25) 서열번호 68; (26) 서열번호 69; (27) 서열번호 68 및 69 모두; (28) 서열번호 70; (29) 서열번호 71; 또는 (30) 서열번호 70 및 71 모두의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 전술된 본 발명의 TCR의 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 폴리펩티드는 예를 들어, (i) 서열번호 77-79 중 하나 또는 (ii) 서열번호 79 및 서열번호 77과 78 중 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 TCR의 α 사슬 및 β 사슬을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 폴리펩티드는, 예를 들어, (1) 서열번호 12 및 13 모두; (2) 서열번호 14 및 15 모두; (3) 서열번호 27 및 28 모두; (4) 서열번호 29 및 30 모두; (5) 서열번호 42 및 43 모두; (6) 서열번호 44 및 45 모두; (7) 서열번호 57 및 58 모두; (8) 서열번호 59 및 60 모두; (9) 서열번호 72 및 73 모두; 또는 (10) 서열번호 74 및 75 모두의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 12, 13, 14, 15, 27, 28, 29, 30, 42, 43, 44, 45, 57, 58, 59, 60, 72, 73, 74, 및 75 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 폴리펩티드는: (1) 서열번호 12; (2) 서열번호 13; (3) 서열번호 12 및 13 모두; (4) 서열번호 14; (5) 서열번호 15; (6) 서열번호 14 및 15 모두; (7) 서열번호 27; (8) 서열번호 28; (9) 서열번호 27 및 28 모두; (10) 서열번호 29; (11) 서열번호 30; (12) 서열번호 29 및 30 모두; (13) 서열번호 42; (14) 서열번호 43; (15) 서열번호 42 및 43 모두; (16) 서열번호 44; (17) 서열번호 45; (18) 서열번호 44 및 45 모두; (19) 서열번호 57; (20) 서열번호 58; (21) 서열번호 57 및 58 모두; (22) 서열번호 59; (23) 서열번호 60; (24) 서열번호 59 및 60 모두; (25) 서열번호 72; (26) 서열번호 73; (27) 서열번호 72 및 73 모두; (28) 서열번호 74; (29) 서열번호 75; 또는 (30) 서열번호 74 및 75 모두의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 양태는 본원에 기술된 폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함하는 단백질을 추가로 제공한다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 분자를 의미한다. 일 양태에서, 본 발명의 단백질은 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있고, (1) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 2-4 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (2) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 5-7 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;(3) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 2-4 모두의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 5-7 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (4) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 17-19 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (5) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 20-22 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (6) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 17-19 모두의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 20-22 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (7) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 32-34 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (8) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 35-37 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (9) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 32-34 모두의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 35-37 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (10) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 47-49 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (11) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 50-52 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (12) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 47-49 모두의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 50-52 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (13) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 62-64 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; (14) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 65-67 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (15) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 62-64 모두의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 65-67 모두의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 단백질은 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, (1) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나; (2) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나; (3) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나; (4) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나; (5) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나; (6) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나; (7) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나; (8) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나; (9) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나; (10) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나; (11) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나; (12) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나; (13) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나; (14) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나; (15) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나; (16) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하거나; (17) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나; (18) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나; (19) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하거나; (20) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나; (21) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나; (22) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하거나; (23) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하거나; (24) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하거나; (25) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하거나; (26) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하거나; (27) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하거나; (28) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하거나; (29) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (30) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 단백질은 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, (1) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나; (2) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나; (3) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나; (4) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나고; (5) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나; (6) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나; (7) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나; (8) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나; (9) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나; (10) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나; (11) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하거나; (12) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하거나; (13) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하거나; (14) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하거나; (15) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하거나; (16) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하거나; (17) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나; (18) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나; (19) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하거나; (20) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하거나; (21) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하거나; (22) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하거나; (23) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하거나; (24) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하거나; (25) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하거나; (26) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하거나; (27) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하거나; (28) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하거나; (29) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (30) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 단백질은 TCR일 수 있다. 대안적으로, 상기 단백질의 제1 폴리펩티드 사을 및/또는 제2 폴리펩티드 사슬(들)이 다른 아미노산 서열, 예를 들어 면역글로불린 또는 그의 일부를 코딩하는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 경우, 본 발명의 단백질은 융합 단백질일 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 일 양태는 또한 하나 이상의 다른 폴리펩티드와 함께 본원에 기술된 본 발명의 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 다른 폴리펩티드는 융합 단백질의 별도의 폴리펩티드로서 존재할 수 있거나, 본원에 기술된 본 발명의 폴리펩티드 중 하나와 인 프레임으로(일렬로(in tandem)) 발현되는 폴리펩티드로서 존재할 수 있다. 상기 다른 폴리펩티드는 면역글로불린, CD3, CD4, CD8, MHC 분자, CD1 분자, 예를 들어, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 펩티드 또는 단백질성 분자 또는 그의 일부를 코딩할 수 있다.
융합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드의 하나 이상의 카피 및/또는 다른 폴리펩티드의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 다른 폴리펩티드의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 카피를 포함할 수 있다. 융합 단백질을 제조하는 적합한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 재조합 방법을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및 단백질은 α 사슬과 β 사슬을 연결하는 링커 펩티드를 포함하는 단일 단백질로서 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및 단백질은 링커 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 링커 펩티드는 숙주 세포에서 재조합 TCR, 폴리펩티드 및/또는 단백질의 발현을 유리하게 촉진할 수 있다. 링커 펩티드는 임의의 적합한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커 펩티드는 RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 80)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 링커 펩티드를 포함하는 구조체의 숙주 세포에 의한 발현시, 링커 펩티드가 절단되어 α 및 β 사슬이 분리될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, TCR, 폴리펩티드 또는 단백질은 전장 α 사슬, 전장 β 사슬, 및 α 사슬과 β 사슬 사이에 위치하는 링커 펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질은 본원에 개시된 바와 같이, 신호 펩티드를 포함하는 α 사슬 및/또는 β 사슬을 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 α 사슬 및/또는 β 사슬의 신호 펩티드의 서열은 위치 2에서 야생형 잔기를 치환한 루이신, 리신, 알라닌 또는 히스티딘 잔기를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질은 신호 펩티드가 결여된, 본원에 개시된 바와 같은 α 사슬 및/또는 β 사슬의 성숙한 버전을 포함한다.
본 발명의 단백질은 적어도 하나의 본원에 기술된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는, 재조합 항체 또는 그의 항원 결합 부분일 수 있다. 본원에서 사용되는, "재조합 항체"는 적어도 하나의 본 발명의 폴리펩티드 및 항체의 폴리펩티드 사슬, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 재조합(예를 들어, 유전적으로 조작된) 단백질을 의미한다. 항체의 폴리펩티드 또는 그의 항원 결합 부분은 중쇄, 경쇄, 중쇄 또는 경쇄의 가변 또는 불변 영역, scFv(single chain variable fragment), 또는 Fc, Fab 또는 항체의 F(ab)2' 단편 등일 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 폴리펩티드 사슬은 재조합 항체의 별도의 폴리펩티드로 존재할 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 폴리펩티드 사슬은 본 발명의 폴리펩티드와 함께 프레임 내에서(탠덤으로) 발현되는 폴리펩티드로서 존재할 수 있다. 항체의 폴리펩티드 또는 그의 항원 결합 부분은 본원에 기술된 임의의 항체 및 항체 단편을 포함한, 임의의 항체 또는 그의 항체 단편의 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 길이일 수 있고, 즉, TCR, 폴리펩티드 또는 단백질이 생물학적 활성, 예를 들어, 돌연변이 p53에 특이적으로 결합하거나; 포유동물에서 암을 검출하거나; 또는 포유동물에서 암을 치료 또는 예방하는 능력을 유지한다면 임의의 개수의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 길이가 약 50 내지 약 5000개 아미노산의 범위, 예를 들어 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 이상 아미노산일 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 올리고펩티드를 포함한다.
본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및 단백질은 하나 이상의 천연(naturally-occurring) 아미노산 대신 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 아미노시클로헥산 카르복실산, 노르루이신, α-아미노 n-데칸산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-히드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카르복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-히드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 시클로헥실알라닌, 시클로헥실글리신, 인돌린-2-카르복실산, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-리신, N',N'-디벤질-리신, 6-히드록시리신, 오르니틴, α-아미노시클로펜탄 카르복실산, α-아미노시클로헥산 카르복실산, α-아미노시클로헵탄 카르복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카르복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌 및 α-tert-부틸글리신을 포함한다.
본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및 단백질은 예를 들어 글리코실화, 아미드화, 카르복실화, 인산화, 에스테르화, N-아실화, 고리화, 예를 들어 이황화 가교를 통해 고리화되거나, 또는 산 부가 염으로 전환되고, 및/또는 선택적으로 이량체화 또는 중합되거나 접합될 수 있다.
본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및/또는 단백질은 예를 들어 신생(de novo) 합성과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 또한, 폴리펩티드 및 단백질은 표준 재조합 방법을 이용하여 본원에 기술된 핵산을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(2012)를 참조한다. 대안적으로, 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드 및/또는 단백질은 임의의 다양한 상업적 실체에 의해 합성될 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및 단백질은 합성, 재조합, 단리 및/또는 정제될 수 있다.
본 발명의 일 양태는 본원에 기술된 임의의 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본원에서 사용된 "핵산"은 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"를 포함하며, 일반적으로, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 천연, 비천연(non-natural) 또는 변경된 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 천연, 비천연, 또는 변경된 뉴클레오티드간 결합(internucleotide linkage), 예를 들면, 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 사이에서 발견되는 포스포디에스테르 대신에 포스포로아미데이트 결합 또는 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있는 DNA 또는 RNA의 중합체를 의미한다. 일 양태에서, 핵산은 상보적 DNA(cDNA)를 포함한다. 핵산은 삽입, 결실, 역전 및/또는 치환을 포함하지 않는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 본원에서 논의된 바와 같이, 일부 경우에는 핵산이 하나 이상의 삽입, 결실, 역전 및/또는 치환을 포함하는 것이 적합할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 5'에서 3'으로 제1 핵산 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리되거나 또는 정제된 핵산으로서, 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 8 및 9; 9 및 8; 10 및 11; 11 및 10; 12 및 13; 13 및 12; 14 및 15; 15 및 14; 23 및 24; 24 및 23; 25 및 26; 26 및 25; 27 및 28; 28 및 27; 29 및 30; 30 및 29; 38 및 39; 39 및 38; 40 및 41; 41 및 40; 42 및 43; 43 및 42; 44 및 45; 45 및 44; 53 및 54; 54 및 53; 55 및 56; 56 및 55; 57 및 58; 58 및 57; 59 및 60; 60 및 59; 68 및 69; 69 및 68; 70 및 71; 71 및 70; 72 및 73; 73 및 72; 74 및 75; 또는 75와 74의 아미노산 서열을 코딩한다.
본 발명의 일 양태에서, 핵산은 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이에 개재된 제3 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 상기 제3 뉴클레오티드 서열은 절단성(cleavable) 링커 펩티드를 코딩한다. 예를 들어, 절단성 링커 펩티드는 RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 80)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 핵산은 서열번호 16, 31, 46, 61 및 76으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩한다.
바람직하게는, 본 발명의 핵산은 재조합이다. 본원에 사용된, 용어 "재조합"은 (i) 천연 또는 합성 핵산 세그먼트를 살아있는 세포에서 복제할 수 있는 핵산 분자에 연결함으로써 살아있는 세포 외부에서 구축된 분자, 또는 (ii) 위의 (i)에 기술된 것들의 복제로부터 수득되는 분자를 의미한다. 본원의 목적을 위해, 복제는 인 비트로 복제 또는 인 비보 복제일 수 있다.
핵산은 당업계에 공지된 절차를 이용하여 화학적 합성 및/또는 효소적 라이게이션 반응을 기반으로 구축될 수 있다. 예를 들어, 전술된 Green and Sambrook et al.을 참조한다. 예를 들어, 핵산은 천연 뉴클레오티드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 혼성화 시 형성된 이중체의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환 뉴클레오티드)를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 핵산을 생성하는 데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록시메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-치환 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜텐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 하나 이상의 핵산은 다양한 상업적 실체에 의해 합성될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 핵산은 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 이론이나 메커니즘에 구속되지 않으면서, 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 mRNA 전사체의 번역 효율을 증가시키는 것으로 여겨진다. 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 원형(native) 코돈을 동일한 아미노산을 코딩하나, 세포 내에서 보다 용이하게 이용가능한 tRNA에 의해 번역될 수 있는 또 다른 코돈으로 치환하는 것을 포함할 수 있으며, 그에 의해 번역 효율을 증가시킨다. 뉴클레오티드 서열의 최적화는 또한 번역을 방해하는 2차 mRNA 구조를 감소시켜, 번역 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 양태는 또한 본원에 기술된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격한 조건(stringent conditions) 하에 본원에 기술된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
엄격한 조건 하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 높은 엄격성 조건 하에서 혼성화한다. "높은 엄격성 조건(high stringency condition)"은 뉴클레오티드 서열이 비특이적 혼성화보다 검출가능하게 더 강하게 검출될 수 있는 양으로 표적 서열(본원에 기술된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열)에 특이적으로 혼성화한다는 것을 의미한다. 높은 엄격성 조건은 정확한 상보적 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 서열에 일치하는 소수의 작은 영역(예: 3-10개의 염기)를 갖게 된 무작위 서열로부터 단지 소수의 산포된(scattered) 불일치를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 구별할 조건을 포함한다. 이러한 작은 상보성 영역은 14-17개 이상의 염기의 전장 상보체보다 더 쉽게 용융되고, 높은 엄격성 혼성화는 이들을 쉽게 구별할 수 있게 한다. 상대적으로 높은 엄격성 조건은 예를 들어 약 50-70℃의 온도에서 약 0.02-0.1 M NaCl 또는 등가물에 의해 제공되는 것과 같은 저염 및/또는 고온 조건을 포함한다. 이러한 높은 엄격성 조건은 뉴클레오티드 서열과 주형 또는 표적 가닥 사이의 불일치를 거의 허용하지 않으며, 본 발명의 TCR의 발현을 검출하는 데 특히 적합하다. 일반적으로 포름아미드의 양을 증가시키면 조건이 더욱 엄격해질 수 있다고 인식된다.
본 발명의 일 양태는 또한 본원에 기술된 임의의 핵산과 적어도 약 70% 이상, 예를 들어 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 이와 관련하여, 상기 핵산은 본원에 기술된 임의의 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 구성될 수 있다.
본 발명의 핵산은 재조합 발현 벡터에 통합될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 일 양태는 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 일 양태에서, 재조합 발현 벡터는 α 사슬, β 사슬 및 링커 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원의 목적을 위해, 용어 "재조합 발현 벡터"는 숙주 세포에 의한 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현을 허용하는 유전적으로 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구조체를 의미하고, 상기 구조체가 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 벡터는 상기 세포 내에서 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드가 발현되도록 하기에 충분한 조건 하에서 세포와 접촉된다. 본 발명의 벡터는 전체적으로 자연 발생적이지 않다. 그러나, 벡터의 일부는 자연 발생적일 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 합성되거나 부분적으로 천연 공급원으로부터 얻어질 수 있고, 천연, 비-천연, 또는 변경된 뉴클레오티드를 포함할 수 있는, DNA 및 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 유형의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 천연 뉴클레오티드간 결합, 비-천연 뉴클레오티드간 결합, 또는 두 유형의 결합을 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는, 비천연 또는 변경된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 결합은 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 벡터에는 플라스미드 및 바이러스와 같이 증식 및 확장, 또는 발현, 또는 둘 모두를 위해 설계된 것들이 포함된다. 벡터는 트랜스포존/트랜스포사제 계열(transposon/transposase series), pUC 계열(Fermentas Life Sciences), pBluescript 계열(Stratagene, LaJolla, CA), pET 계열(Novagen, Madison, WI), pGEX 계열( Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라) 및 pEX 계열(Clontech, Palo Alto, CA)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. λGT10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4 및 λNM1149와 같은 박테리오파지 벡터도 사용할 수 있다. 식물 발현 벡터의 예에는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)가 포함된다. 동물 발현 벡터의 예에는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)가 포함된다. 바람직하게는, 재조합 발현 벡터는 트랜스포존 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 예를 들어, 전술된 Green and Sambrook et al. 문헌에 기술된 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 환형 또는 선형인 발현 벡터의 구조체는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 기능적인 복제 시스템을 포함하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은 예를 들어 ColEl, 2μ 플라스미드, λ, SV40, 소 유두종바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
바람직하게는, 재조합 발현 벡터는 적절하게, 및 벡터가 DNA-기반인지 RNA-기반인지를 고려하여, 벡터가 도입될 숙주 세포(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물)의 유형에 특이적인 조절 서열, 예를 들면, 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함한다.
재조합 발현 벡터는 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있고, 이들은 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포의 선택을 가능하게 한다. 마커 유전자에는 살생물제(biocide) 내성, 예를 들어 항생제, 중금속 등에 대한 내성, 원영양성(prototrophy)을 제공하기 위한 영양요구성 숙주 세포에서의 보완성(complementation) 등이 포함된다. 본 발명의 발현 벡터에 적합한 마커 유전자는 예를 들어, 네오마이신/G418 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자, 히스티디놀 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 및 암피실린 내성 유전자를 포함한다.
재조합 발현 벡터는 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적이거나 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 원형(native) 또는 비-원형(non-native) 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터, 예를 들어, 강한 프로모터, 약한 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 발달 특이적(developmental-specific) 프로모터의 선택은 당업자의 통상적인 기술 내에 속한다. 유사하게, 뉴클레오티드 서열을 프로모터와 조합하는 것도 당업자의 기술 내에 속한다. 프로모터는 비-바이러스 프로모터, 예를 들어 인간 신장 인자-1α 프로모터, 또는 바이러스 프로모터, 예를 들어 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 MSCV(murine stem cell line)의 LTR(long-terminal repeat)에서 발견되는 프로모터일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 일시적 발현, 안정한 발현, 또는 둘 다를 위해 설계될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터를 항시적(constitutive) 발현 또는 유도성 발현용으로 제조할 수 있다.
또한, 재조합 발현 벡터는 자살 유전자를 포함하도록 제조될 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "자살 유전자(suicide gene)"는 자살 유전자를 발현하는 세포를 사멸시키는 유전자를 의미한다. 자살 유전자는 유전자가 발현되는 세포에 작용제, 예를 들면, 약물에 대한 민감성을 부여하고, 세포가 해당 작용제와 접촉되거나 그에 노출될 때 세포를 사멸시키는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 HSV(Herpes Simplex Virus) 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 시토신 디아미나아제(cytosine daminase), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 및 니트로리덕타아제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 다른 측면과 관련하여 본원에 기술된 임의의 핵산 또는 벡터에 의해 코딩되는 분리되거나 정제된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 기타 양태와 관련하여 본원에 기술된 임의의 핵산 또는 벡터에 의해 코딩된, 단리되거나 정제된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기술된 임의의 핵산 또는 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 재조합 발현 벡터를 포함할 수 있는 임의의 유형의 세포를 의미한다. 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 식물, 동물, 진균 또는 조류 세포일 수 있거나 원핵 세포, 예를 들어 박테리아 또는 원생동물 세포일 수 있다. 숙주 세포는 배양된 세포 또는 일차 세포, 즉 유기체, 예를 들어 인간으로부터 직접 분리된 세포일 수 있다. 숙주 세포는 부착(adherent) 세포 또는 부유(suspended) 세포, 즉 현탁 상태에서 성장하는 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 DH5α 대장균 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 원숭이 VERO 세포, COS 세포, HEK293 세포 등을 포함한다. 재조합 발현 벡터를 증폭 또는 복제하는 목적을 위해, 숙주 세포는 바람직하게는 원핵 세포, 예를 들어 DH5a 세포이다. 재조합 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 목적을 위해, 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 세포이다. 가장 바람직하게는, 숙주 세포는 인간 세포이다. 예를 들어, 숙주 세포는 인간 림프구일 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 숙주 세포는 T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 불변 자연 살해 T(invariant natural killer T:iNKT) 세포 및 자연 살해(NK) 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 숙주 세포는 임의의 세포 유형일 수 있고, 임의의 유형의 조직에서 유래할 수 있으며, 임의의 발달 단계일 수 있으나, 숙주 세포는 바람직하게는 말초 혈액 림프구(PBL) 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 더욱 바람직하게는, 숙주 세포는 T 세포이다.
본원의 목적을 위해, T 세포는 임의의 T 세포, 예를 들어 배양된 T 세포, 예를 들어 1차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주, 예를 들어 Jurkat, SupT1 등으로부터의 T 세포, 또는 포유동물로부터 수득된 T 세포일 수 있다. 포유동물로부터 수득되는 경우, T 세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 기타 조직이나 체액을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 소스로부터 수득될 수 있다. T 세포는 또한 농축되거나 정제될 수 있다. 바람직하게는, T 세포는 인간 T 세포이다. T 세포는 임의 유형의 T 세포일 수 있으며 CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 예를 들어 Th1 및 Th2 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 종양 침윤 림프구(TIL), 기억 T 세포(예를 들어, 중심 기억(central memory) T 세포 및 이펙터 기억 T 세포), 나이브(naive) T 세포 등를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 발달 단계의 T 세포일 수 있다.
또한, 본 발명의 양태는 본원에 기술된 적어도 하나의 숙주 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공한다. 세포의 집단은 본원에 기술된 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 적어도 하나의 다른 세포, 예를 들어 재조합 발현 벡터를 포함하지 않는 숙주 세포(예를 들어 T 세포), 또는 T 세포 이외의 세포, 예를 들어 B 세포, 대식세포, 호중구, 적혈구, 간세포, 내피 세포, 상피 세포, 근육 세포, 뇌 세포 등을 포함하는 이종 집단일 수 있다. 대안적으로, 세포의 집단은 실질적으로 균질한 집단일 수 있으며, 상기 집단은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 주로 포함한다(예를 들어, 그로 필수적으로 구성된다). 집단은 또한 집단의 모든 세포가 재조합 발현 벡터를 포함하는 단일 숙주 세포의 클론이어서 집단의 모든 세포가 재조합 발현 벡터를 포함하는 것인 세포의 클론 집단(clonal population)일 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 세포의 집단은 본원에 기술된 바와 같은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 클론 집단이다.
본 발명의 일 양태에서, 집단 중 세포의 수는 빠르게 확장될 수 있다. T 세포의 수의 확장은 예를 들어, US 특허 8,034,334; US 특허 8,383,099; 미국 특허 출원 공개 번호 2012/0244133; Dudley et al., J. Immunother ., 26:332-42 (2003); 및 Riddell et al., J. Immunol . Methods, 128:189-201(1990)에 기술된 바와 같이 당업계에서 알려진 다수의 방법 중 하나에 의해 달성될 수 있다. 일 양태에서, T 세포 수의 확장은 T 세포를 OKT3 항체, IL-2 및 피더(feeder) PBMC(예를 들어, 방사선 조사된 동종 PBMC)와 함께 배양함으로써 수행된다.
본 발명의 일 양태는 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 기술된 임의의 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단을 배양하여, TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 TCR, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포(그의 집단 포함)는 단리 및/또는 정제될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "단리된(isolated)"은 그의 자연적 환경으로부터 제거된 것을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "정제된(purified)"은 순도가 증가되었다는 것을 의미하고, 여기서 "순도"는 상대적인 용어이고, 반드시 절대적인 순도로 해석되는 것은 아니다. 예를 들어, 순도는 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상일 수 있거나, 또는 약 100%일 수 있다.
이하에서, 모두 "본 발명의 TCR 물질"로 총칭되는, 본 발명의 TCR, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포(이들의 집단 포함)는 약학적 제제와 같은 조성물로 제제화될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 양태는 본원에 기술된 임의의 TCR, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 발현 벡터 및 숙주 세포(그의 집단 포함) 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 TCR 물질을 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 하나 초과의 본 발명의 TCR 물질, 예를 들어 폴리펩티드 및 핵산, 또는 2개 이상의 상이한 TCR을 포함할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 또 다른 약학적 활성제 또는 약물, 예를 들면, 화학요법제, 예를 들어, 아스파라기나아제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등과 조합된 본 발명의 TCR 물질을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 담체는 약학적으로 허용되는 담체이다. 약학적 조성물과 관련하여, 담체는 고려 중인 특정한 본 발명의 TCR 물질에 대해 통상적으로 사용되는 임의의 것일 수 있다. 투여 가능한 조성물을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백하며, 예를 들어 Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press (2012)에 더 자세히 설명되어 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 사용 조건 하에서 유해한 부작용이나 독성이 없는 것이 바람직하다.
담체의 선택은 부분적으로, 본 발명의 특정 TCR 물질 및 본 발명의 TCR 물질을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물의 다양한 적합한 제형이 존재한다. 적합한 제형은 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 종양내 또는 복강내 투여를 위한 임의의 제형을 포함할 수 있다. 본 발명의 TCR 물질을 투여하기 위해 하나 초과의 경로가 사용될 수 있으며, 어떤 경우에는 특정 경로가 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 TCR 물질은 주사에 의해, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 본 발명의 TCR 물질이 본 발명의 TCR을 발현하는 숙주 세포인 경우, 주사용 세포에 대한 약학적으로 허용되는 담체는 임의의 등장성 담체, 예를 들어 생리 식염수(물 중 약 0.90% w/v의 NaCl, 물 중 약 300 mOsm/L NaCl 또는 물 리터당 약 9.0g NaCl), NORMOSOL R 전해질 용액(Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A(Baxter, Deerfield, IL), 물 중 약 5% 덱스트로오스, 또는 링거 젖산(Ringer's lactate)을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 인간 혈청 알부민으로 보충된다.
투여되는 본 발명의 TCR 물질의 양 또는 용량(예를 들어, 본 발명의 TCR 물질이 하나 이상의 세포인 경우, 세포의 수)은 합리적인 기간(time frame)에 걸쳐 개체 또는 동물에서 예를 들어 치료 또는 예방적 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 예를 들어, 본 발명의 TCR 물질의 용량은 투여시부터 약 2시간 이상, 예를 들어 12 내지 24시간 또는 그 이상의 기간 내에 암 항원(예: 돌연변이 p53)에 결합하거나 암을 검출, 치료 또는 예방하기에 충분해야 한다. 일부 양태에서, 그 기간이 훨씬 더 길어질 수도 있다. 용량은 특정한 본 발명의 TCR 물질의 효능과 치료 대상 동물(예: 인간)의 상태 및 동물(예: 인간)의 체중에 따라 결정될 것이다.
투여 용량을 결정하기 위한 많은 분석이 당해 분야에서 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명의 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 T 세포의 주어진 용량을, 각각 상이한 용량의 T 세포를 투여받는 포유동물의 그룹(set) 중 포유동물에게 투여한 후, 본 발명의 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 T 세포에 의해 표적 세포가 용해되거나 IFN-γ가 분비되는 정도를 비교하는 것을 포함하는 분석이 포유동물에게 투여할 개시 용량을 결정하는 데 사용될 수 있다. 특정 용량 투여 시 표적 세포가 용해되거나 IFN-γ가 분비되는 정도는 당업계에 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다.
본 발명의 TCR 물질의 용량은 또한 특정한 본 발명의 TCR 물질의 투여에 수반될 수 있는 유해한 부작용의 존재, 속성 및 정도에 따라 결정될 것이다. 일반적으로, 주치의는 연령, 체중, 전반적인 건강 상태, 식이, 성별, 투여할 본 발명의 TCR 물질, 투여 경로 및 치료되는 암의 중증도와 같은 다양한 인자를 고려하여, 각 개별 환자를 치료할 본 발명의 TCR 물질의 용량을 결정할 것이다. 본 발명의 TCR 물질이 세포의 집단인 것인 양태에서, 주입당 투여되는 세포의 수는 예를 들어 약 1 x 106개 내지 약 1 x 1012개 세포 또는 그 이상으로 다양할 수 있다. 특정 양태에서, 1 x 106개 미만의 세포가 투여될 수 있다.
당업자는 본 발명의 TCR 물질이 다양한 방식으로 변형될 수 있어, 변형을 통해 본 발명의 TCR 물질의 치료 또는 예방 효능이 증가된다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 TCR 물질은 화학요법제에 대한 브리지(bridge)를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 화합물을 화학요법제에 접합시키는 관행은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 브리지 및/또는 화학요법제가, 일단 본 발명의 TCR 물질에 부착되면, 본 발명의 TCR 물질의 기능, 즉 돌연변이 p53에 결합하거나 암을 검출, 치료 또는 예방하는 능력을 방해하지 않는다면, 본 발명의 TCR 물질의 기능에 필요하지 않은, 본 발명의 TCR 물질 상의 부위가 브리지 및/또는 화학요법제를 부착하기 위한 이상적인 부위라는 것을 인식한다.
본 발명의 약학적 조성물, TCR, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포 또는 세포의 집단은 암을 치료 또는 예방하는 방법에 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 본 발명의 TCR은 돌연변이 p53에 특이적으로 결합하여, TCR(또는 관련된 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질)이 세포에 의해 발현될 때 돌연변이 p53을 발현하는 표적 세포에 대한 면역 반응을 매개할 수 있는 것으로 여겨진다. 이와 관련하여, 본 발명의 양태는 포유동물에게 본원에 기술된 약학적 조성물, TCR, 폴리펩티드 또는 단백질, 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드, 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 재조합 발현 벡터, 또는 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드, 또는 단백질을 코딩하는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 세포의 집단을 포유동물에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태는 포유동물에서 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본원에 기술된 약학적 조성물, TCR, 폴리펩티드 또는 단백질, 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드, 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 재조합 발현 벡터, 또는 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 세포의 집단을 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "치료하다" 및 "예방하다" 및 그로부터 파생된 단어는 반드시 100% 또는 완전한 치료 또는 예방을 의미하는 것은 아니다. 오히려, 당업자가 잠재적인 이익 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인식하는 치료 또는 예방의 정도는 다양하다. 이러한 점에서, 본 발명의 방법은 포유동물에서 임의의 양 또는 수준의 암의 치료 또는 예방을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제공되는 치료 또는 예방은 치료 또는 예방되는 암의 하나 이상의 상태 또는 증상의 치료 또는 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료 또는 예방은 종양의 퇴행을 촉진하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 본원에서 목적을 위해, "예방"은 암의 발병, 또는 그의 증상 또는 상태의 발생을 지연시키는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, "예방"은 암, 또는 그의 증상 또는 상태의 재발을 예방하거나 지연시키는 것을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물, TCR, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 또는 세포의 집단은 포유동물에서 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이와 관련하여, 본 발명의 양태는 포유동물에게 본원에 기술된 약학적 조성물, TCR, 폴리펩티드 또는 단백질, 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드, 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 재조합 발현 벡터, 또는 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드, 또는 단백질을 코딩하는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 세포의 집단을 포유동물에서 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태는 포유동물에서 암에 대한 면역 반응의 유도에 사용하기 위한, 본원에 기술된 약학적 조성물, TCR, 폴리펩티드 또는 단백질, 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드, 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 재조합 발현 벡터, 또는 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 세포의 집단을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 포유동물로부터의 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플을 본원에 기술된 약학적 조성물, TCR, 폴리펩티드 또는 단백질, 본원에 기술된 본 발명의 TCR, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포의 집단 또는 약학적 조성물과 접촉시켜, 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 복합체의 검출은 상기 포유동물에서 암의 존재를 나타낸다.
포유동물에서 암을 검출하는 본 발명의 방법과 관련하여, 세포의 샘플은 전체 세포, 그의 용해물, 또는 전체 세포 용해물의 분획, 예를 들어 핵 또는 세포질 분획, 전체 단백질 분획, 또는 핵산 분획일 수 있다.
본 발명의 검출 방법의 목적을 위해, 접촉은 포유동물에 대해 인 비트로 또는 인 비보에서 일어날 수 있다. 바람직하게는, 접촉은 인 비트로에서 이루어진다.
또한, 복합체의 검출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 일어날 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된, 본 발명의 TCR, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 또는 세포의 집단은 예를 들어 방사성 동위원소, 형광단(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE)), 효소(예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)) 및 원소 입자(예를 들면, 금 입자)와 같은 검출가능한 표지로 표지될 수 있다.
숙주 세포 또는 세포의 집단이 투여되는 것인 본 발명의 방법의 목적을 위해, 세포는 포유동물에 대해 동종(allogeneic) 세포 또는 자가(autologous) 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 포유동물에 대해 자가 유래이다.
본 발명의 방법과 관련하여, 암은 예를 들어 급성 림프구성 암, 급성 골수성 백혈병, 폐포 횡문근육종, 골암, 뇌암, 유방암, 항문, 항문관 또는 항문직장의 암, 눈의 암, 간내 담관암, 관절암, 경부 암(cancer of the neck), 담낭암 또는 흉막암, 코, 비강 또는 중이의 암, 구강암, 질암, 외음부암, 만성림프구성백혈병, 만성골수암, 대장암, 대장직장암, 자궁내막암, 식도암, 자궁경부암, 위장관 유암종, 신경교종, 호지킨 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 간암 , 폐암, 악성 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비호지킨 림프종, 구강인두암, 난소암, 음경암, 췌장암, 복막암, 장간막암, 인두암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 연조직암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 요관암, 및 방광암 중 하나를 포함한, 임의의 암일 수 있다. 바람직한 양태에서, 암은 돌연변이 p53을 발현하는 암이다. 암은 서열번호 1에 의해 정의된, 위치 135, 175 및 237 중 하나 이상에 돌연변이가 있는 p53을 발현할 수 있다. 암은 인간 p53 돌연변이, C135Y, R175H 또는 M237I 중 하나 이상을 갖는 p53을 발현할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 암은 상피암이다. 본 발명의 일 양태에서, 암은 담관암종, 흑색종, 결장암, 직장암, 난소암, 자궁내막암, 비소세포폐암(NSCLC), 교모세포종, 자궁경부암, 두경부암, 유방암, 췌장암, 또는 방광암이다. 암은 인간 p53에 C135Y, R175H 또는 M237I 돌연변이를 포함하는 것으로 알려진 것일 수 있다.
본 발명의 방법에서 언급되는 포유동물은 임의의 포유동물일 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "포유동물"은 마우스 및 햄스터와 같은 설치(Rodentia) 목의 포유동물, 및 토끼와 같은 중치(Logomorpha) 목의 포유동물을 포함하나 그에 한정되지 않는 임의의 포유동물을 의미한다. 포유동물은 고양이과(고양이) 및 개과(개)를 포함하는 식육(Carnivora) 목에 속하는 것이 바람직하다. 포유동물은 소과(소) 및 돼지(swine)과(돼지)를 포함한 우제목(Artiodactyla) 또는 말과(말)를 포함하는 기제목(Perssodactyla)인 것이 더욱 바람직하다. 포유동물은 영장목, 세보이드(Ceboid) 또는 시모이드(Simoid)(원숭이) 또는 진원(Anthropoids) 목(인간 및 유인원)의 포유동물인 것이 가장 바람직하다. 특히 바람직한 포유동물은 인간이다.
도 1a는 종양 단편 번호 F1-F24로부터의 환자 4316 TIL을 표적 세포와 공-배양한 후 측정된 (2e4 세포당) IFN-γ 스팟의 개수를 보여주는 그래프이다. 표적 세포는 (i) p53 C135Y를 포함하는 펩티드 풀(PP)로 펄스되거나; (ii) p53 C135Y를 코딩하는 TMG(tandem minigene) RNA 또는 무관한(irrelevant) TMG로 형질감염되거나; 또는 (iii) DMSO(대조군)로 처리된 자가 유래 수지상 세포(DC)였다. PMS/이오노마이신(ionomycin)으로 처리된 TIL이 양성 대조군으로 사용되었다. 돌연변이 p53 반응성을 갖는 단편 22가 박스로 표시된다.
도 1b는 DMSO(비히클), 무관한 펩티드 KIAA1328 K386R 또는 표시된 돌연변이 p53-C135Y 펩티드로 펄스된 자가 DC와 환자 4316의 TIL의 공-배양 후, 유세포 분석법에 의해 측정된, 4-1BB 및 CD4를 발현하는 TIL의 비율을 보여준다. PMA/이오노마이신으로 처리된 TIL이 양성 대조군으로 사용되었다.
도 1c는 연속 희석된 25량체 펩티드 p53-C135Y 또는 WT p53-C135으로 펄스된 자가 미성숙 DC와 4316-D TCR로 형질도입된 PBL의 공-배양 후, 4-1BB를 발현하는 마우스 TCR 불변 영역 발현 T 세포(mTCR+)의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 2는 p53 R175H(우측 컬럼)에 대한 IVS(in vitro sensitization) 후 또는 IVS 없이(좌측 컬럼) 표적 세포와 환자 4141로부터의 TIL의 표적 세포와 공-배양 후, 유세포 분석법에 의해 측정된, OX40 및 4-1BB를 발현하는 T 세포의 비율을 보여준다. 표적 세포는 DMSO, 돌연변이 p53 R175H 펩티드, 또는 상응하는 WT p53 R175 펩티드로 펄스된 자가 DC였다. T 세포 활성화 마커인 4-1BB 및 OX40을 상향조절한 활성화된 T 세포가 굵은 윤곽으로 표시된다. ME, 최소 에피토프(minimal epitope).
도 3a는 종양 단편 번호 F1-F24로부터의 환자 4304 TIL과 표적 세포의 공-배양 후 측정된 (2e4 세포당) IFN-γ 스팟의 개수를 보여주는 그래프이다. 표적 세포는 (i) p53 M237I를 포함하는 펩티드 풀(PP)로 펄스되거나; (ii) p53 M237I를 코딩하는 TMG RNA 또는 무관한 TMG로 형질감염되거나; 또는 (iii) DMSO(대조군)로 처리된 자가 유래 수지상 세포(DC)였다. PMS/이오노마이신으로 처리된 TIL이 양성 대조군으로 사용되었다.
도 3b는 유세포 분석법에 의해 측정된, 환자 4304의 종양 분해물(tumor digest)로부터 분류된 CD39 및 CD103을 발현하는 CD4+ T 세포의 비율을 보여준다.
도 3c는 표적 세포와 이펙터 세포의 공-배양 후 측정된 (2e4 세포당) IFN-γ 스팟의 개수를 보여주는 그래프이다. 이펙터 세포는 환자 4304의 종양으로부터 분류된 CD4+CD103+CD39+(사각형), CD4+CD103-CD39+(삼각형) 또는 CD4+CD103-CD39-(원) 세포였다. 표적 세포는 (i) p53 M237I를 포함하는 PP로 펄스되거나; (ii) p53 M237I를 코딩하는 TMG RNA 또는 대조군 TMG로 형질감염되거나; 또는 (iii) DMSO(대조군)로 처리된 자가 유래 수지상 세포(DC)였다. 단독으로 배양된 TIL(TIL only)이 대조군으로 사용되었다.
도 3d-3f는 연속 희석된 25량체 펩티드 p53-M237I 또는 WT p53-M237로 펄스된 자가 미성숙 DC와 이펙터 세포의 공-배양 후 4-1BB를 발현하는, 마우스 TCR 불변 영역 발현, CD3+CD4+ T 세포(mTCR+)의 비율을 보여주는 그래프이다. 이펙터 세포는 4304 TCR-2(도 3d), 4304 TCR-4(도 3e) 또는 4304 TCR-K(도 3f)를 코딩하는 재조합 발현 벡터로 독립적으로 형질도입된 PBL이었다.
도 4a-4b는 4141 IVS TCR-형질도입 세포를 종양 세포주 SK-MEL-5(4a), SAOS2(4a), SAOS2 R175H(4a), CEM/C1(4b), TYK-nu(4b) 또는 KLE(4b)와 공-배양한 후 4-1BB 및 OX40을 발현하는, 4141 IVS TCR-형질도입 세포의 비율을 보여준다. 세포주는 p53 R175H 및 HLA-A*02:01 발현에 대해 양성(+) 또는 음성(-)으로 표시된다.
도 5a-5b는 9종의 p53 스플라이스 변이체의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. SP|P04637|P53_HUMAN(서열번호 1); SP|P04637-2|P53_HUMAN(서열번호 81); SP|P04637-3|P53_HUMAN(서열번호 82); SP|P04637-4|P53_HUMAN(서열번호 83); SP|P04637-5|P53_HUMAN(서열번호 84); SP|P04637-6|P53_HUMAN(서열번호 85); SP|P04637-7|P53_HUMAN(서열번호 86); SP|P04637-8|P53_HUMAN(서열번호 87); 및 SP|P04637-9|P53_HUMAN(서열번호 88). 정렬은 도 5a에 표시된 N-말단에서 시작하여 도 5b에 표시된 C-말단까지 계속된다.
도 6은 4316-D TCR-형질도입 세포와 표적 세포의 공-배양 후, 유세포 분석법으로 측정된, 4-1BB 및 OX40을 발현하는 4316-D TCR-형질도입 세포의 비율을 보여준다. 표적 세포는 IFN-γ의 부재(상위 행) 또는 IFN-γ의 존재(하위 행) 하에 DMSO(좌측 컬럼), WT p53(중간 컬럼) 또는 돌연변이 p53 펩티드(우측 컬럼)로 펄스된 4316 자가 환자-유래 이종이식(PDX) 종양 세포였다.
도 7a는 전임상 이종이식 마우스에 대한 생성 및 처리 프로토콜을 보여주는 도식이다. 면역이 저하된 암컷 NSG(NOD scid 감마) 마우스에 p53 R175H 돌연변이 및 HLA-A*02:01을 자연적으로 발현하는 200만 개의 TYK-nu 난소 세포를 주사했다. 2주 후, 이 마우스들을 비히클 또는 천만 개의 T 세포로 처리했다. 그 후, 후속 30일에 걸쳐 종양 성장을 평가했다.
도 7b-7c는 형질도입된 세포의 입양 세포 전달(ACT) 후 30일 동안 측정된 종양 보유 마우스의 평균 종양 크기(mm2)를 보여주는 그래프이다. 두 명의 건강한 공여자(건강한 공여자 1(7b) 및 건강한 공여자 2(7c))의 PBL을 표시된 TCR에 의해 독립적으로 형질도입시켰다. 마우스는 n이 5인 3개의 처리군, PBS 비히클(원), p53 Y220C를 표적으로 하는 무관한 TCR(삼각형)로 형질도입된 T 세포, 4141 IVS TCR(사각형)로 형질도입된 T 세포에 속했다. 이들을 4141-TCR1a2(별)로 형질도입된 T 세포로 처리한 마우스와 비교했다. 수득된 결과는 두 명의 건강한 공여자로부터 수득된 세포와 일치했다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하나, 물론 어떤 방식으로든 그 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
본 실시예는 환자 4316의 TIL에서 항-p53-C135Y 반응성의 확인을 보여준다.
대장암 환자 4316에서 절제된 종양을 24개의 단편으로 절단하고, 사이토카인 IL-2의 존재 하에 배양하여 생체 외에서(ex vivo) TIL을 증가시켰다. TIL을 표적 세포와 함께 공-배양함으로써 p53 C135Y를 포함한, 환자의 종양에서 발견된 체세포 돌연변이에 대해 단편(F1-F24로 번호가 매겨짐)을 스크리닝했다. 표적 세포는 (i) p53 C135Y를 포함하는 PP로 펄스되거나(pulsed); (ii) p53 C135Y를 코딩하는 TMG RNA 또는 무관한 TMG로 형질감염되거나; 또는 (iii) DMSO(디메틸술폭시드)(대조군)로 처리된 자가 DC였다. PMA(포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트)/이오노마이신으로 처리된 TIL이 양성 대조군으로 사용되었다. IFN-γ 생산은 ELISpot 분석으로 측정하였다. 결과가 도 1a에 도시된다. 단편 번호 F22가 p53-C135Y를 인식하는 TIL을 포함하는 것으로 확인되었다.
단편 22로부터의 TIL을 분석하고, p53-C135Y에 대한 반응성을 테스트했다. 표적 세포는 표 1에 표시된 p53-C135Y 펩티드 중 하나로 펄스된 자가 DC였다. 무관한 펩티드 KIAA1328 K386R 또는 DMSO(비히클)로 펄스된 표적 세포를 음성 대조군으로 포함시켰다. PMA/이오노마이신으로 처리된 TIL은 양성 대조군으로 사용되었다. 공-배양 후, T 세포 활성화 마커인 세포 표면 4-1BB 발현의 유세포 분석에 의해 반응성을 측정하였다. 결과가 도 1b에 도시된다. 도 1b에 도시된 바와 같이, TIL을 표 1에 표시된 3종의 p53-C135Y 펩티드 중 하나와 공-배양한 후 반응성이 관찰되었다.
실시예 2
본 실시예는 실시예 1의 반응성 TIL로부터 항-p53-C135Y TCR의 분리를 보여준다.
반응성 TIL을 재자극하고, 단일 세포 TCR(T 세포 수용체) 시퀀싱을 위해, 4-1BB 상향 조절에 의해 96 웰 플레이트로 분류했다. TCR, 즉 4316-D TCR이 발견되었다.
TCR 알파 및 베타 사슬 가변 영역의 서열은 단일 세포 TCR 시퀀싱에 의해 확인되었다. 알파 및 베타 사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 표 2에 표시된다. CDR은 밑줄로 표시된다. N-말단 신호 펩티드는 볼드 폰트로 표시된다.
실시예 3
본 실시예는 환자 4141의 TIL에서 항-p53-R175H 반응성의 확인을 보여준다.
대장암 환자 4141로부터의 TIL을 인 비트로 감작에 적용하여, 신생항원-반응성 T 세포를 농축(enrich)하고, 뒤이어 DMSO, 돌연변이 p53 R175H 펩티드 HMTEVVR H C(서열번호 92) 또는 상응하는 WT p53 R175 펩티드 HMTEVVR R C(서열번호 91)에 대해 테스트했다. T 세포 활성화 마커인 4-1BB 및 OX40을 유세포 분석법으로 측정했다. 결과가 도 2에 도시된다.
실시예 4
본 실시예는 실시예 3의 반응성 TIL로부터 항-p53-R175H TCR의 분리를 보여준다.
반응성 TIL을 재자극하고, 단일 세포 TCR 시퀀싱을 위해, 4-1BB 상향 조절에 의해 96 웰 플레이트로 분류했다. TCR, 즉 4141 IVS TCR이 발견되었다.
TCR 알파 및 베타 사슬 가변 영역의 서열은 단일 세포 TCR 시퀀싱에 의해 확인되었다. 알파 및 베타 사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 표 3에 표시된다. CDR은 밑줄로 표시된다. N-말단 신호 펩티드는 볼드 폰트로 표시된다.
실시예 5
본 실시예는 환자 4304의 TIL에서 항-p53-M237I 반응성의 확인을 보여준다.
대장암 환자 4304에서 절제된 종양을 24개의 단편으로 절단하고, 사이토카인 IL-2의 존재 하에 배양하여 생체 외에서 TIL을 증가시켰다. TIL을 표적 세포와 함께 공-배양함으로써 p53 M237I를 포함한, 환자의 종양에서 발견된 체세포 돌연변이에 대해 단편(F1-F24로 번호가 매겨짐)을 스크리닝했다. 표적 세포는 (i) p53 M237I를 포함하는 PP로 펄스되거나; (ii) p53 M237I를 코딩하는 TMG RNA 또는 무관한 TMG로 형질감염되거나; 또는 (iii) DMSO(디메틸술폭시드)(대조군)로 처리된 자가 DC였다. PMA(포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트)/이오노마이신으로 처리된 TIL이 양성 대조군으로 사용되었다. IFN-γ 생산은 ELISpot 분석으로 측정하였다. 결과가 도 3a에 도시된다. 단편 번호 F24가 p53-M237I를 인식하는 TIL을 포함하는 것으로 확인되었다.
단편 24로부터의 TIL을 분석하고, p53-M237I에 대한 반응성을 테스트했다. 표적 세포는 도 3a의 펩티드 풀을 구성하는 개별적인 돌연변이 펩티드로 독립적으로 펄스된 자가 DC였다. PMA/이오노마이신으로 처리된 TIL이 양성 대조군으로 사용되었다. 배지 단독 및 DMSO(비히클)로 펄스된 DC를 음성 대조군으로 사용했다. 공-배양 후, ELISPOT 분석에 의해 INF-감마 발현을 측정하는 것에 의해 반응성을 테스트했다. IFN-감마 양성 스팟의 수가 표 4에 표시된다. 표 4에 표시된 바와 같이, TIL과 돌연변이 p53 펩티드(p53-M237I) VGSDCTTIHYNY I CNSSCMGGMNRR(서열번호 94)의 공-배양 후에 반응성이 관찰되었다. 표 4에서 "블랭크(blank)"는 T 세포 또는 표적 세포가 없는 블랭크 웰을 나타낸다.
돌연변이 펩티드 IFN -감마 스팟의 수
ZFN469 40
MAP2K2 ~52
SCN4A ~46
PPP1R13L 15
P53 ~712
PEG3 34
DNAH17 ~86
DMSO 15
NTN1 ~33
배지 단독 1
SMAD2 23
블랭크 2
CPAMD8 15
블랭크 3
NCAN 28
PMA/이오노마이신 셀 수 없을 정도로 많음
CD4+CD103+CD39+, CD4+CD103-CD39+ 또는 CD4+CD103-CD39- 세포를 유세포 분석법에 의해 환자 4304의 종양 분해물로부터 분류했다. 이 분류(sorting)에 사용된 게이팅 방식(gating scheme)이 도 3b에 도시된다.
분류된 세포 집단을 표적 세포와 독립적으로 공-배양함으로써 분류된 집단의 세포 수를 확장시켰다. 표적 세포는 (i) p53 M237I를 포함하는 PP로 펄스되거나; (ii) p53 M237I를 코딩하는 TMG RNA 또는 TMG 대조군으로 형질감염되거나; 또는 (iii) DMSO(디메틸술폭시드)(대조군)로 처리된 자가 DC였다. TMG 대조군은 환자 4304와 동일한 돌연변이를 공유하지 않은 다른 환자에 의해 발현된 무관한 돌연변이를 코딩했다. 단독으로 배양된 TIL이 대조군으로 사용되었다. 공-배양 후, ELISPOT으로 IFN-γ 분비를 측정하여 반응성을 테스트했다. 결과가 도 3c에 도시된다. 분류된 CD4+CD103+CD39+ 또는 CD4+CD103-CD39+ 세포와 p53 M237I를 포함하는 PP로 펄스된 표적 세포의 공-배양 후 반응성이 관찰되었다.
실시예 6
본 실시예는 실시예 5의 반응성 TIL로부터 항-p53-M237I TCR의 분리를 보여준다.
반응성 TIL을 재자극하고, 단일 세포 의의해 96 웰 플레이트로 분류했다. 3종의 TCR, 즉 4304 TCR-2, 4304 TCR-4, 및 4304 TCR-K가 발견되었다.
TCR 알파 및 베타 사슬 가변 영역의 서열은 단일 세포 TCR 시퀀싱에 의해 확인되었다. 알파 및 베타 사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 표 5에 표시된다. CDR은 밑줄로 표시된다. N-말단 신호 펩티드는 볼드 폰트로 표시된다.
실시예 7
본 실시예는 실시예 2, 4 및 6의 개별적인 TCR을 코딩하는 레트로바이러스 벡터의 구축을 보여준다.
표 2, 3 및 5의 TCR의 α 및 β 사슬의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 수득하고, 코돈 최적화했다. TCRβ VDJ 영역을 마우스 TCRβ 불변 사슬에 융합시켰다. TCRα VJ 영역을 마우스 TCRα 불변 사슬에 융합시켰다. 특정 이론이나 메커니즘에 구속되지 않으면서, 인간 TCRα 및 TCRβ 사슬의 불변 영역을 상응하는 마우스 불변 영역으로 대체하면 TCR 발현 및 기능성이 향상되는 것으로 여겨진다(Cohen et al., Cancer Res., 66(17): 8878-86(2006)).
또한, 마우스 TCRα 및 TCRβ 불변 사슬을 시스테인-변형시켰다(cysteine-modified). 막관통 소수성 돌연변이를 마우스 TCRα 불변 사슬에 도입시켰다. 특정 이론이나 메커니즘에 구속되지 않으면서, 이러한 변형은 도입된 TCR 사슬의 우선적인 쌍형성(preferential pairing) 및 증진된 TCR 표면 발현 및 기능성을 가져오는 것으로 여겨진다(Cohen et al., Cancer Res., 67(8):3898-903)(2007); Haga-Friedman et al., J. Immu ., 188: 5538-5546 (2012)).
TCR 발현 카세트의 MSGV1 벡터 5'NcoI 부위로의 클로닝을 촉진하고, Kozak 서열을 도입하기 위해, TCRVα 사슬의 N-말단 신호 펩티드의 두 번째 아미노산을 히스티딘(H), 루이신(L) 또는 라이신(K)으로 변경했고, TCRVβ 사슬의 N-말단 신호 펩티드의 두 번째 아미노산을 알라닌(A)으로 변경했다.
불변 영역에 대한 이러한 변형을 포함하는, 5개 TCR 각각의 전장 α 및 β 사슬이 표 6에 표시된다. 표 6에서, CDR은 밑줄로 표시되고, 불변 영역은 이탤릭체로 표시되며, 불변 영역의 변형된 아미노산 잔기는 밑줄과 볼드체로 표시된다.
표 6의 TCR의 α 및 β 사슬을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 하기 발현 카세트 구성을 갖는 MSGV1-기반 레트로바이러스 벡터에 클로닝했다: 5'NcoI-VDJβ-mCβ-Furin/SerGly/P2A-VJα-mCα-EcoRI3'.
TCRβ 및 TCRα 사슬은 Furin Ser/Gly P2A 링커 RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 80)에 의해 분리되었다. 특정 이론이나 메커니즘에 구속되지 않으면서, 링커가 두 사슬의 비슷한 발현 효율을 제공하는 것으로 여겨진다(Szymczak et al., Nat. Biotechnol ., 22(5):589-94 (2004)).
레트로바이러스 벡터의 TCR 발현 카세트는 5'에서 3'으로, 링커에 의해 분리된 TCRβ 및 TCRα 사슬을 코딩했다. 개별적인 TCR 발현 카세트에 의해 코딩된 아미노산 서열이 표 7에 표시된다. 표 7에서, CDR은 밑줄로 표시되고, 불변 영역은 이탤릭체로 표시되며, 링커는 볼드체로 표시된다.
실시예 8
본 실시예는 실시예 7의 레트로바이러스 벡터에 의해 코딩된 4316-D TCR의 결합력(avidity)을 보여준다.
건강한 공여자 말초 혈액 림프구(PBL)를 실시예 7의 4316-D TCR 레트로바이러스 벡터로 형질도입시켰다(이펙터 세포). 표적 세포는 연속 희석된(serially diluted) 25량체 펩티드 p53-C135Y TCTYSPALNKMFYQLAKTCPVQLWV(서열번호 90) 또는 WT p53-C135 TCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWV(서열번호 89)로 펄스된 자가 미성숙 DC였습니다.
CD4 4316-D TCR의 결합력은 이펙터 세포와 표적 세포를 공-배양하여 결정했다. 4-1BB를 발현하는 마우스 TCR 불변 영역-발현 T 세포의 비율을 결정하여 반응성을 측정했다. 결과가 도 1c에 도시된다. 형질도입된 세포는 p53-C135Y를 인식했다.
실시예 9
본 실시예는 실시예 7의 레트로바이러스 벡터에 의해 코딩된 4316-D TCR이 HLA-DRB1*07:01/HLA-DRA1*01:01 이종이량체에 의해 제시된 p53-C135Y를 인식한다는 것을 보여준다.
환자 4316에 의해 발현된 MHC 클래스 II 분자는 엑솜 및 mRNA 시퀀싱을 이용하여 결정하였다. 발현된 MHC 클래스 II 분자는 표 8에 표시된다.
환자 4316에 의해 발현된 MHC 클래스 II 분자
DPA1*01:03-DPB1*02:01
DPA1*01:03-DPB1*11:01
DPA1*02:01-DPB1*02:01
DPA1*02:01-DPB1*11:01
DQA1*01:01-DQB1*02:01
DQA1*01:01-DQB1*02:02
DQA1*01:01-DQB1*05:01
DQA1*02:01-DQB1*02:01
DQA1*02:01-DQB1*02:02
DQA1*02:01-DQB1*05:01
DRA*01:01-DRB1*07:01
DRA*01:01-DRB3*01:01
DQA*01:01-DRB4*01:01
이펙터 세포는 실시예 7의 4316-D TCR 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 동종 PBL이었다. 표적 세포는 표 8에 제시된 HLA 클래스 II 이종이량체 중 하나로 독립적으로 형질감염되고, DMSO, 야생형 p53-C135 25량체 펩티드 TCTYSPALNKMF C QLAKTCPVQLWV(서열번호 89)(1 ㎍/mL), 또는 p53-C135Y 25량체 펩티드 TCTYSPALNKMF Y QLAKTCPVQLWV(서열번호 90)(1 ㎍/mL)로 펄스된 30,000개의 COS7 세포였다.
20,000개의 이펙터 세포를 표적 세포와 18시간 동안 공-배양한 후, ELISPOT 분석을 통해 IFN-감마 발현을 측정하여 반응성을 테스트했다. HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*07:01 이종이량체을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질도입되었고, p53-C135Y 25량체 로딩 표적 세포와 4316-D TCR 형질도입 세포의 공-배양 시에만 반응성이 관찰되었다. 이 데이터는 4316-D TCR이 DRB1*07:01에 의해 제한된다는 것을 보여준다.
실시예 10
본 실시예는 실시예 7의 레트로바이러스 벡터에 의해 코딩된 4141 IVS TCR의 결합력 및 특이성을 보여준다.
이펙터 세포는 실시예 7의 4141 IVS TCR 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 건강한 공여자 PBL이었다. 표적 세포는 표 9에 제시된 농도로 연속 희석된 ME p53-R175H 펩티드 HMTEVVR H C(서열번호 92) 또는 WT p53-R175 펩티드 HMTEVVR R C(서열번호 91)로 펄스된 HLA-A*02+ T2 백혈병 세포였다.
펄스된 펩티드(pulsed peptide)의 농도
10 ㎍/mL
1 ㎍/mL
100 ng/mL
10 ng/mL
1 ng/mL
100 pg/mL
10 pg/mL
4141 IVS TCR의 결합력 및 특이성은 20,000개의 이펙터 세포와 100,000개의 표적 세포를 18시간 동안 공-배양하여 결정하였다. IFN-감마 생산은 ELISPOT 분석(N = 3)으로 측정하였다. 결과는 4141 IVS TCR로 형질도입된 세포가 100 pg/mL 이상의 농도로 펄스된 ME p53-R175H 펩티드를 인식했다는 것을 보여주었다. 4141 IVS TCR로 형질도입된 세포는 WT p53-R175 펩티드를 인식하지 못했다. 이러한 데이터는 4141 IVS TCR이 돌연변이 p53 R175H에 매우 특이적이라는 것을 보여준다.
실시예 11
본 실시예는 실시예 7의 레트로바이러스 벡터에 의해 코딩된 4141 IVS TCR이 HLA-A*02:01에 의해 제시된 p53-R175H를 인식한다는 것을 보여준다.
환자 4141에 의해 발현된 MHC 클래스 I 분자는 엑솜 및 mRNA 시퀀싱을 이용하여 결정하였다. 발현된 MHC 클래스 I 분자가 표 10에 표시된다.
환자 4141에 의해 발현된 MHC 클래스 I 분자
A02:01
A23:01
B08:01
B44:03
C04:01
C07:01
HLA-ALL
이펙터 세포는 실시예 7의 4141 IVS TCR 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 건강한 공여자 PBL이었다. 표적 세포는 표 10에 표시된 HLA 클래스 I 분자 중 하나로 독립적으로 형질감염되고 DMSO, ME p53-R175H 펩티드 HMTEVVR H C(서열번호 92)(1 ㎍/mL) 또는 WT p53-R175 펩티드 HMTEVVR R C(서열번호 91)(1 ㎍/mL)로 펄스된 30,000개의 COS7 세포였다. 표 10의 HLA-ALL은 표 10에 제시된 HLA Class I 분자 6개를 모두 발현한 표적 세포를 의미하고, 양성 대조군으로 사용했다.
20,000개의 이펙터 세포를 표적 세포와 18시간 동안 공-배양한 후, ELISPOT 분석을 통해 IFN-감마 발현을 측정하여 반응성을 테스트했다. HLA-A*02:01을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질도입되었고, p53-R175H 9-량체-로딩된 표적 세포와 4141 IVS TCR로 형질도입된 세포의 공-배양 시에만 반응성이 관찰되었다. 이 데이터는 4141 IVS TCR이 HLA-A*02:01에 의해 제한된다는 것을 보여준다.
실시예 12
본 실시예는 실시예 7의 각각의 레트로바이러스 벡터에 의해 코딩된 4304 TCR-4, 4304 TCR-K 또는 4304 TCR-2의 결합력을 보여준다.
건강한 공여자 PBL을 실시예 7의 4304 TCR-4, 4304 TCR-K 또는 4304 TCR-2 레트로바이러스 벡터로 독립적으로 형질도입시켰다(이펙터 세포). 표적 세포는 연속 희석된 25량체 펩티드 p53-M237I VGSDCTTIHYNY I CNSSCMGGMNRR(서열번호 94) 또는 WT p53-M237 VGSDCTTIHYNY M CNSSCMGGMNRR(서열번호 93)로 펄스된 자가 미성숙 DC였습니다.
TCR의 결합력은 이펙터 세포를 표적 세포와 공-배양하여 결정하였다. 4-1BB를 발현하는 마우스 TCR 불변 영역 발현, CD3+CD4+ T 세포의 비율을 결정하여 반응성을 측정하였다. 결과가 도 3d 내지 3f에 도시된다. 형질도입된 세포는 p53-M237I를 인식하였다.
실시예 13
본 실시예는 실시예 7의 각각의 레트로바이러스 벡터에 의해 코딩된 4304 TCR-4, 4304 TCR-K 또는 4304 TCR-2가 HLA-DRB1*01:01/HLA-DRA1*01:01 이종이량체에 의해 제시된 p53-M237I를 인식한다는 것을 보여준다.
환자 4304에 의해 발현된 MHC 클래스 II 분자는 엑솜 및 mRNA 시퀀싱을 이용하여 결정하였다. 발현된 MHC 클래스 II 분자가 표 11에 표시된다.
환자 4304에 의해 발현된 MHC 클래스 II 분자
DRA1*01:01
DRB1*01:01		 DQA1*02:01
DQB1*02:01
DRA1*01:01
DRB1*07:01		 DQA1*02:01
DQB1*05:01
DRA1*01:01
DRB3*01:01		 DPA1*01:03
DPB1*04:02
DRA1*01:01
DRB4*01:01		 DPA1*01:03
DPB1*11:01
DQA1*01:01
DQB1*02:01		 DPA1*02:01
DPB1*04:02
DQA1*01:01
DQB1*05:01		 DPA1*02:01
DPB1*11:01
이펙터 세포는 실시예 7의 각각의 레트로바이러스 벡터에 의해 코딩된 4304 TCR-4, 4304 TCR-K 또는 4304 TCR-2로 형질도입된 건강한 공여자 PBL이었다. 표적 세포는 표 11에 표시된 HLA 클래스 II 이종이량체 중 하나로 독립적으로 형질감염되고, DMSO, p53-M237I 펩티드 VGSDCTTIHYNY I CNSSCMGGMNRR(서열번호 94)(1 ㎍/mL) 또는 WT p53-M237 펩티드 VGSDCTTIHYNY M CNSSCMGGMNRR(서열번호 93) (1 ㎍/mL)로 펄스된 30,000개의 COS7 세포였다. 단독으로 배양된 이펙터 세포와 PMA/이오노마이신으로 처리된 이펙터 세포가 대조군으로 이용되었다. DMSO로 처리되고 표 11에 제시된 모든 HLA 클래스 II 이종이량체로 형질감염된 표적 세포가 대조군으로 이용되었다. 표적 세포를 또한 표 11에 제시된 모든 HLA 클래스 II 이종이량체로 형질감염시키고 대조군으로서 WT p53-M237 펩티드로 펄스하였다.
20,000개의 이펙터 세포를 표적 세포와 18시간 동안 공-배양한 후, ELISPOT 분석을 통해 IFN-감마 발현을 측정하여 반응성을 테스트했다. 4304 TCR-4, 4304 TCR-K 또는 4304 TCR-2 형질도입 세포와 HLA-DRA1*01:01/HLA-DRB1*01:01 이종이량체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질도입된, p53-M237I 25량체가 로딩된 표적 세포의 공-배양 시에만 반응성이 관찰되었다. 이들 데이터는 4304 TCR-4, 4304 TCR-K 및 4304 TCR-2가 HLA-DRA1*01:01/HLA-DRB1*01:01 이종이량체에 의해 제한된다는 것을 보여준다.
실시예 14
본 실시예는 4141 IVS TCR이 HLA 및 p53 돌연변이 특이적 방식으로 종양 세포를 인식한다는 것을 보여준다.
실시예 7의 4141 IVS TCR 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 건강한 공여자 T 세포를 p53 R175H 또는 HLA-A*02:01 또는 둘 모두에 대해 양성인 종양 세포주의 패널과 함께 공-배양하였다. T 세포 활성화 마커인 4-1BB 및 OX40을 유세포 분석법으로 4141 IVS TCR+ CD8+ T 세포에서 측정했습니다. 결과가 도 4a-4b에 도시된다. 결과는 TCR-형질도입 세포가 p53 R175H와 HLA-A*02:01 모두에 대해 양성인 종양 세포주를 인식한다는 것을 보여주었다. TCR-형질도입 세포는 p53 R175H 또는 HLA-A*02:01에 대해 음성인 종양 세포주를 인식하지 못했다.
실시예 15
본 실시예는 p53 C135Y 반응성 4316-D TCR에 의한 자가 종양 세포 인식을 보여준다.
건강한 공여자 말초 혈액 림프구를 실시예 7의 4316-D TCR 레트로바이러스 벡터로 레트로바이러스 형질도입시켰다. 형질도입된 세포를 표적 세포와 16시간 동안 공-배양하여, 형질도입된 세포가 자가 종양 세포를 인식하는 능력을 테스트했다. 표적 세포는 IFN-γ의 부재 또는 IFN-γ의 존재 하에 DMSO, 실시예 8의 WT p53, 또는 실시예 8의 돌연변이 p53 펩티드로 펄스된 환자 4316으로부터의 자가 PDX 종양 세포였다. T 세포 활성화는 T 세포 활성화 마커인 4-1BB 및 OX40을 사용하여 유세포 분석법에 의해 측정하였다. 결과가 도 6에 도시된다. 결과는 형질도입된 T 세포가 IFN-γ 및 돌연변이 p53 펩티드로 처리된 표적 세포와 공-배양되었을 때 4-1BB 및 OX40 발현을 상향조절했다는 것을 보여준다.
실시예 16
본 실시예는 4141 IVS TCR이 전임상 이종 이식 마우스 모델에서 항종양 활성을 발휘한다는 것을 보여준다.
2명의 건강한 공여자(건강한 공여자 1 및 건강한 공여자 2)로부터의 PBL을 실시예 7의 4141 IVS TCR 레트로바이러스 벡터로 독립적으로 형질도입시켰다. 형질도입된 세포의 항종양 활성을 전임상 마우스 모델을 사용하여 4141-TCR1a2(미국 특허 출원 17/620,942에 개시됨)로 형질도입된 PBL의 항종양 활성과 비교하였다. 암컷 NSG 마우스에 p53 R175H 돌연변이와 HLA-A*02:01을 자연적으로 발현하는 200만 개의 TYK-nu 난소암 세포를 이식했다. 2주 후, 이식된 종양의 크기가 약 30 mm2에 도달했을 때, 마우스를 랜덤화하고, 비히클(PBS), p53 Y220C를 표적으로 하는 무관한 TCR로 형질도입된 천만개의 T 세포, 또는 4141 IVS TCR로 형질도입된 천만개의 T 세포로 처리했다(N=5). ACT 처리 후, 이들 마우스에게 인간 재조합 인터루킨 2(IL-2)(180,000IU)의 I.V. 주사를 매일 3회 투여했다. 이 과정이 도 7a에 도시된다. ACT 후, 30일에 걸쳐 마우스의 평균 종양 크기를 평가하고, 4141-TCR1a2로 형질도입된 세포로 처리한 마우스의 평균 종양 크기와 비교했다. 이 실험은 두 명의 건강한 공여자(건강한 공여자 1과 건강한 공여자 2)로부터의 형질도입된 PBL을 사용하여 2회 수행했다. 이들 실험의 결과가 도 7b-7c에 도시된다. 4141 IVS TCR-발현 T 세포로 처리된 마우스는 건강한 공여자 1 및 건강한 공여자 2 실험 모두에서 PBS 또는 무관한 TCR 처리된 마우스에 비해 상당히 지연된 종양 성장을 보였다. 4141 IVS TCR에 의한 처리는 4141-TCR1a2에 의한 처리에 비해 탁월한 항종양 활성을 가져왔다.
본원에 인용된 간행물, 특허출원 및 특허를 포함한 모든 참조문헌은, 각각의 참조문헌이 참조에 의해 개별적으로 및 구체적으로 표시되고, 본원에 그 전체로 기재된 것과 동일한 정도로 본원에 참조에 의해 포함된다.
본 발명을 기술하는 맥락에서(특히 하기 특허청구범위의 맥락에서) 단수를 지시하는 용어("a", "an", "the"), 및 "적어도 하나" 및 유사한 지시어의 사용은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포함하는 것으로 이해해야 한다. 하나 이상의 대상들의 목록이 뒤따르는 용어 "적어도 하나"의 사용(예를 들어, "적어도 하나의 A 및 B")은, 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 열거된 항목들로부터 선택된 하나의 항목(A 또는 B) 또는 열거된 항목들 중 2개 이상의 임의의 조합(A 및 B)을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "함유하는" 및 "포괄하는"은, 달리 언급되지 않는 한, 개방형(open-ended) 용어(즉, "포함하나, 그에 한정되지는 않는"을 의미함)로서 해석되어야 한다. 본원에서 값들의 범위의 기재는 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 단지 그 범위내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 기재하는 것의 약칭 방법으로 이용되도록 의도되며, 각각의 별개의 값은 본원에서 개별적으로 기재되는 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법들은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 모든 예, 또는 예시적 용어(예를 들어, "와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며 달리 주장되지 않는 한, 본 발명의 범위에 제한을 두는 것이 아니다. 명세서의 어떤 용어도 임의의 비-청구된 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 지시하는 것으로 이해해서는 안된다.
본 발명을 실시하기 위해 본 발명자들에게 공지된 가장 우수한 방식을 포함하여 본 발명의 바람직한 양태들이 본원에 기술되어 있다. 이러한 바람직한 양태들의 변형은 전술된 설명을 읽을 때 당해 분야에서 통상의 기술을 가진 자들에게 명백해 질 수 있다. 본 발명자들은 숙련된 기술자가 이러한 변형을 적절하게 이용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 바와 달리 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 준거법에 의해 허용되는, 본원에 첨부된 특허청구범위에 기재된 대상의 모든 변경 및 균등물을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변형에서 전술한 요소들의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES <120> T CELL RECEPTORS RECOGNIZING C135Y, R175H, OR M237I MUTATION IN P53 <130> 759875 <150> US 63/185,805 <151> 2021-05-07 <160> 97 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 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Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg 50 55 60 Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe 65 70 75 80 Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp 85 90 95 Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly 100 105 110 Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser 115 120 125 Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala 130 135 140 Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys 145 150 155 160 Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu 165 170 175 Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp 180 185 190 Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Met Leu Leu Asp Leu Arg Trp Cys Tyr 195 200 205 Phe Leu Ile Asn Ser Ser 210 <210> 89 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala 1 5 10 15 Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val 20 25 <210> 90 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Tyr Gln Leu Ala 1 5 10 15 Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val 20 25 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 His Met Thr Glu Val Val Arg His Cys 1 5 <210> 93 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 1 5 10 15 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg 20 25 <210> 94 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Ile Cys Asn Ser 1 5 10 15 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg 20 25 <210> 95 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 95 Arg Ala Lys Arg 1 <210> 96 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Asn Val Leu Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Tyr Gln Leu Ala 1 5 10 15 Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val 20 25 <210> 97 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Met Phe Tyr Gln Leu Ala 1 5 10 15 Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val 20 25

Claims (39)

  1. 인간 p53C135Y, 인간 p53R175H 또는 인간 p53M237I 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖는 단리되거나 정제된 T 세포 수용체(TCR)로서, 상기 TCR은:
    (1) 서열번호 2-4 모두;
    (2) 서열번호 5-7 모두;
    (3) 서열번호 2-7 모두;
    (4) 서열번호 17-19 모두;
    (5) 서열번호 20-22 모두;
    (6) 서열번호 17-22 모두;
    (7) 서열번호 32-34 모두;
    (8) 서열번호 35-37 모두;
    (9) 서열번호 32-37 모두;
    (10) 서열번호 47-49 모두;
    (11) 서열번호 50-52 모두;
    (12) 서열번호 47-52 모두;
    (13) 서열번호 62-64 모두;
    (14) 서열번호 65-67 모두; 또는
    (15) 서열번호 62-67 모두의 아미노산 서열을 포함하는 것인 T 세포 수용체(TCR).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 TCR은:
    (1) 서열번호 8;
    (2) 서열번호 9;
    (3) 서열번호 8 및 9 모두;
    (4) 서열번호 10;
    (5) 서열번호 11;
    (6) 서열번호 10 및 11 모두;
    (7) 서열번호 23;
    (8) 서열번호 24;
    (9) 서열번호 23 및 24 모두;
    (10) 서열번호 25;
    (11) 서열번호 26;
    (12) 서열번호 25 및 26 모두;
    (13) 서열번호 38;
    (14) 서열번호 39;
    (15) 서열번호 38 및 39 모두;
    (16) 서열번호 40;
    (17) 서열번호 41;
    (18) 서열번호 40 및 41 모두;
    (19) 서열번호 53;
    (20) 서열번호 54;
    (21) 서열번호 53 및 54 모두;
    (22) 서열번호 55;
    (23) 서열번호 56;
    (24) 서열번호 55 및 56 모두;
    (25) 서열번호 68;
    (26) 서열번호 69;
    (27) 서열번호 68 및 69 모두;
    (28) 서열번호 70;
    (29) 서열번호 71; 또는
    (30) 서열번호 70 및 71 모두의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 TCR은:
    (1) 서열번호 12;
    (2) 서열번호 13;
    (3) 서열번호 12 및 13 모두;
    (4) 서열번호 14;
    (5) 서열번호 15;
    (6) 서열번호 14 및 15 모두;
    (7) 서열번호 27;
    (8) 서열번호 28;
    (9) 서열번호 27 및 28 모두;
    (10) 서열번호 29;
    (11) 서열번호 30;
    (12) 서열번호 29 및 30 모두;
    (13) 서열번호 42;
    (14) 서열번호 43;
    (15) 서열번호 42 및 43 모두;
    (16) 서열번호 44;
    (17) 서열번호 45;
    (18) 서열번호 44 및 45 모두;
    (19) 서열번호 57;
    (20) 서열번호 58;
    (21) 서열번호 57 및 58 모두;
    (22) 서열번호 59;
    (23) 서열번호 60;
    (24) 서열번호 59 및 60 모두;
    (25) 서열번호 72;
    (26) 서열번호 73;
    (27) 서열번호 72 및 73 모두;
    (28) 서열번호 74;
    (29) 서열번호 75; 또는
    (30) 서열번호 74 및 75 모두의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 p53C135Y 아미노산 서열은 TCTYSPALNKMF Y QLAKTCPVQLWV(서열번호 90)인 것인 TCR.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR은 TCTYSPALNKMF C QLAKTCPVQLWV(서열번호 89)의 야생형 인간 p53 아미노산 서열에 대해 항원 특이성을 갖지 않는 것인 TCR.
  6. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 p53R175H 아미노산 서열은 HMTEVVR H C(서열번호 92)인 것인 TCR.
  7. 청구항 1 내지 3 및 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR은 HMTEVVR R C(서열번호 91)의 야생형 인간 p53 아미노산 서열에 대해 항원 특이성을 갖지 않는 것인 TCR.
  8. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 p53M237I 아미노산 서열이 VGSDCTTIHYNY I CNSSCMGGMNRR(서열번호 94)인 것인 TCR.
  9. 청구항 1 내지 3 및 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR은 VGSDCTTIHYNY M CNSSCMGGMNRR(서열번호 93)의 야생형 인간 p53 아미노산 서열에 대해 항원 특이성을 갖지 않는 것인 TCR.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 TCR의 기능적 부분을 포함하는 단리되거나 또는 정제된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는:
    (1) 서열번호 2-4 모두;
    (2) 서열번호 5-7 모두;
    (3) 서열번호 2-7 모두;
    (4) 서열번호 17-19 모두;
    (5) 서열번호 20-22 모두;
    (6) 서열번호 17-22 모두;
    (7) 서열번호 32-34 모두;
    (8) 서열번호 35-37 모두;
    (9) 서열번호 32-37 모두;
    (10) 서열번호 47-49 모두;
    (11) 서열번호 50-52 모두;
    (12) 서열번호 47-52 모두;
    (13) 서열번호 62-64 모두;
    (14) 서열번호 65-67 모두; 또는
    (15) 서열번호 62-67 모두의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 폴리펩티드는:
    (1) 서열번호 8;
    (2) 서열번호 9;
    (3) 서열번호 8 및 9 모두;
    (4) 서열번호 10;
    (5) 서열번호 11;
    (6) 서열번호 10 및 11 모두;
    (7) 서열번호 23;
    (8) 서열번호 24;
    (9) 서열번호 23 및 24 모두;
    (10) 서열번호 25;
    (11) 서열번호 26;
    (12) 서열번호 25 및 26 모두;
    (13) 서열번호 38;
    (14) 서열번호 39;
    (15) 서열번호 38 및 39 모두;
    (16) 서열번호 40;
    (17) 서열번호 41;
    (18) 서열번호 40 및 41 모두;
    (19) 서열번호 53;
    (20) 서열번호 54;
    (21) 서열번호 53 및 54 모두;
    (22) 서열번호 55;
    (23) 서열번호 56;
    (24) 서열번호 55 및 56 모두;
    (25) 서열번호 68;
    (26) 서열번호 69;
    (27) 서열번호 68 및 69 모두;
    (28) 서열번호 70;
    (29) 서열번호 71; 또는
    (30) 서열번호 70 및 71 모두의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 상기 폴리펩티드는:
    (1) 서열번호 12;
    (2) 서열번호 13;
    (3) 서열번호 12 및 13 모두;
    (4) 서열번호 14;
    (5) 서열번호 15;
    (6) 서열번호 14 및 15 모두;
    (7) 서열번호 27;
    (8) 서열번호 28;
    (9) 서열번호 27 및 28 모두;
    (10) 서열번호 29;
    (11) 서열번호 30;
    (12) 서열번호 29 및 30 모두;
    (13) 서열번호 42;
    (14) 서열번호 43;
    (15) 서열번호 42 및 43 모두;
    (16) 서열번호 44;
    (17) 서열번호 45;
    (18) 서열번호 44 및 45 모두;
    (19) 서열번호 57;
    (20) 서열번호 58;
    (21) 서열번호 57 및 58 모두;
    (22) 서열번호 59;
    (23) 서열번호 60;
    (24) 서열번호 59 및 60 모두;
    (25) 서열번호 72;
    (26) 서열번호 73;
    (27) 서열번호 72 및 73 모두;
    (28) 서열번호 74;
    (29) 서열번호 75; 또는
    (30) 서열번호 74 및 75 모두의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  13. 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단리되거나 또는 정제된 단백질로서,
    (1) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 2-4 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (2) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 5-7 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (3) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 2-4 모두의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 5-7 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (4) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 17-19 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (5) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 20-22 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (6) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 17-19 모두의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 20-22 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (7) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 32-34 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (8) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 35-37 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (9) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 32-34 모두의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 35-37 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (10) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 47-49 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (11) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 50-52 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (12) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 47-49 모두의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 50-52 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (13) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 62-64 모두의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (14) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 65-67 모두의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (15) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 62-64 모두의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 65-67 모두의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  14. 청구항 13에 있어서,
    (1) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (2) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (3) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (4) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (5) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (6) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (7) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (8) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (9) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (10) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (11) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (12) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (13) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (14) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (15) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (16) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (17) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (18) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (19) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (20) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (21) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (22) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (23) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (24) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (25) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (26) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (27) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (28) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (29) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (30) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  15. 청구항 13 또는 14에 있어서,
    (1) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (2) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (3) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (4) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나고;
    (5) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (6) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (7) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (8) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (9) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (10) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (11) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (12) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (13) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (14) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (15) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (16) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (17) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (18) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (19) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (20) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (21) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (22) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (23) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (24) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (25) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (26) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (27) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (28) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (29) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (30) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  16. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 TCR, 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 또는 청구항 13 내지 15 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리되거나 또는 정제된 핵산.
  17. 5'에서 3'으로, 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리되거나 또는 정제된 핵산으로서, 상기 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 8 및 9; 9 및 8; 10 및 11; 11 및 10; 12 및 13; 13 및 12; 14 및 15; 15 및 14; 23 및 24; 24 및 23; 25 및 26; 26 및 25; 27 및 28; 28 및 27; 29 및 30; 30 및 29; 38 및 39; 39 및 38; 40 및 41; 41 및 40; 42 및 43; 43 및 42; 44 및 45; 45 및 44; 53 및 54; 54 및 53; 55 및 56; 56 및 55; 57 및 58; 58 및 57; 59 및 60; 60 및 59; 68 및 69; 69 및 68; 70 및 71; 71 및 70; 72 및 73; 73 및 72; 74 및 75; 또는 75 및 74의 아미노산 서열을 코딩하는 것인 단리되거나 또는 정제된 핵산.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 제1 뉴클레오티드 서열과 상기 제2 뉴클레오티드 서열 사이에 개재된 제3 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 제3 뉴클레오티드 서열은 절단성 링커 펩티드를 코딩하는 것인 단리되거나 또는 정제된 핵산.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 절단성 링커 펩티드는 RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 80)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리되거나 또는 정제된 핵산.
  20. 청구항 19에 있어서, 서열번호 16, 31, 46, 61 및 76으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 것인 단리되거나 또는 정제된 핵산.
  21. 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  22. 청구항 21에 있어서, 트랜스포존 또는 렌티바이러스 벡터인 것인 재조합 발현 벡터.
  23. 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항의 핵산 또는 청구항 21 또는 22의 벡터에 의해 코딩되는 단리되거나 또는 정제된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질.
  24. 세포에서 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항의 핵산 또는 청구항 21 또는 22의 벡터의 발현으로부터 생성되는 단리되거나 또는 정제된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질.
  25. 인간 p53C135Y, 인간 p53R175H 또는 인간 p53M237I 아미노산 서열에 대한 항원 특이성을 갖는 TCR을 발현하는 숙주 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 벡터의 세포로의 도입을 허용하는 조건에서 세포를 청구항 21 또는 22의 벡터와 인 비트로에서 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  26. 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항의 핵산 또는 청구항 21 또는 22의 재조합 발현 벡터를 포함하는 단리되거나 또는 정제된 숙주 세포.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 세포는 인간 림프구인 것인 숙주 세포.
  28. 청구항 26에 있어서, 상기 세포는 T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 불변 자연 살해 T(iNKT) 세포 및 자연 살해(NK) 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
  29. 청구항 26 내지 28 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함하는, 단리되거나 정제된 세포의 집단.
  30. 청구항 1 내지 9, 23 또는 24 중 어느 한 항의 TCR, 청구항 10 내지 12, 23 또는 24 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 또는 청구항 13 내지 15, 23 또는 24 중 어느 한 항의 단백질을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 26 내지 28 중 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 청구항 29의 숙주 세포의 집단을 배양하여, 상기 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  31. (a) 청구항 1 내지 9, 23 또는 24 중 어느 한 항의 TCR, 청구항 10 내지 12, 23 또는 24 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 청구항 13 내지 15, 23 또는 24 중 어느 한 항의 단백질, 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항의 핵산, 청구항 21 또는 22의 재조합 발현 벡터, 청구항 26 내지 28 중 어느 한 항의 숙주 세포, 또는 청구항 29의 숙주 세포의 집단 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  32. 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 암의 세포를 포함하는 샘플을 청구항 1 내지 9, 23 또는 24 중 어느 한 항의 TCR, 청구항 10 내지 12, 23 또는 24 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 청구항 13 내지 15, 23 또는 24 중 어느 한 항의 단백질, 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항의 핵산, 청구항 21 또는 22의 재조합 발현 벡터, 청구항 26 내지 28 중 어느 한 항의 숙주 세포, 청구항 29의 숙주 세포의 집단, 또는 청구항 31의 약학적 조성물과 접촉시켜, 복합체를 형성시키는 단계; 및
    (b) 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 복합체의 검출은 상기 포유동물에서 암의 존재를 나타내는 것인 방법.
  33. 포유동물에서 암에 대한 면역 반응의 유도에서의 용도를 위한, 청구항 1 내지 9, 23 또는 24 중 어느 한 항의 TCR, 청구항 10 내지 12, 23 또는 24 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 청구항 13 내지 15, 23 또는 24 중 어느 한 항의 단백질, 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항의 핵산, 청구항 21 또는 22의 재조합 발현 벡터, 청구항 26 내지 28 중 어느 한 항의 숙주 세포, 청구항 29의 숙주 세포의 집단, 또는 청구항 31의 약학적 조성물.
  34. 포유동물에서 암의 치료 또는 예방에서의 용도를 위한, 청구항 1 내지 9, 23 또는 24 중 어느 한 항의 TCR, 청구항 10 내지 12, 23 또는 24 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 청구항 13 내지 15, 23 또는 24 중 어느 한 항의 단백질, 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항의 핵산, 청구항 21 또는 22의 재조합 발현 벡터, 청구항 26 내지 28 중 어느 한 항의 숙주 세포, 청구항 29의 숙주 세포의 집단, 또는 청구항 31의 약학적 조성물.
  35. 청구항 33 또는 34에 있어서, 상기 세포의 집단이 상기 포유동물에 대해 자가(autologous)인 것인 용도를 위한 세포의 집단.
  36. 청구항 33 또는 34에 있어서, 상기 세포의 집단이 상기 포유동물에 대해 동종인 것인 용도를 위한 세포의 집단.
  37. 청구항 32 또는 청구항 33 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 상피암인 것인 방법, 또는 용도를 위한 TCR, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포의 집단, 또는 약학적 조성물.
  38. 청구항 32 또는 청구항 33 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 담관암종, 흑색종, 결장암, 직장암, 난소암, 자궁내막암, 비소세포폐암(NSCLC), 교모세포종, 자궁경부암, 두경부암, 유방암, 췌장암 또는 방광암인 것인 방법, 또는 용도를 위한 TCR, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 또는 약학적 조성물.
  39. 청구항 32 또는 청구항 33 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 인간 p53에 C135Y, R175H 또는 M237I 돌연변이를 포함하는 것으로 알려진 것인 방법, 또는 용도를 위한 TCR, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 또는 약학적 조성물.
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