KR20240014328A - Weissella cibaria having effects of preventing or improving oral disease and the use thereof - Google Patents

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KR20240014328A KR1020220091931A KR20220091931A KR20240014328A KR 20240014328 A KR20240014328 A KR 20240014328A KR 1020220091931 A KR1020220091931 A KR 1020220091931A KR 20220091931 A KR20220091931 A KR 20220091931A KR 20240014328 A KR20240014328 A KR 20240014328A
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Abstract

본 발명은 구강질환 예방 또는 개선 효과를 가지는 웨이셀라 시바리아 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 구강 병원성 세균에 대한 항균력이 뛰어나고 구강 병원성 세균의 병인인자 발현 억제능이 뛰어나 치아우식증, 치주 질환, 구취 제거 등의 구강 질환에 뛰어난 예방 또는 개선 효과를 나타낸다.The present invention relates to Weissella sibaria strains that have the effect of preventing or improving oral diseases and their uses. The Weissella sybaria strain of the present invention has excellent antibacterial activity against oral pathogenic bacteria and an excellent ability to suppress the expression of etiological factors of oral pathogenic bacteria, showing an excellent preventive or improvement effect on oral diseases such as dental caries, periodontal disease, and bad breath removal.

Description

구강질환 예방 또는 개선 효과를 가지는 웨이셀라 시바리아 균주 및 이의 용도{WEISSELLA CIBARIA HAVING EFFECTS OF PREVENTING OR IMPROVING ORAL DISEASE AND THE USE THEREOF}Weissella cibaria strains with oral disease prevention or improvement effects and their uses {WEISSELLA CIBARIA HAVING EFFECTS OF PREVENTING OR IMPROVING ORAL DISEASE AND THE USE THEREOF}

본 발명은 구강질환 예방 또는 개선 효과를 가지는 웨이셀라 시바리아 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to Weissella sibaria strains that have the effect of preventing or improving oral diseases and their uses.

사람의 구강은 잘 균형 잡힌 700 종 이상의 정상미생물총의 서식에 의해 건강한 상태를 유지할 수 있다. 그러나 유해 미생물이 증가하고 유익한 미생물이 감소하는 등의 정상미생물총의 균형이 깨어지면 치주질환이나 치아우식증등의 구강질환이 발생한다. 충치의 원인균으로 알려진 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans, S. mutans)는 그람 양성, 조건적 혐기성 세균으로 치아우식증을 유발하는 대표적인 균이다. 특히 S. mutans 균이 생성하는 생물막(biofilm)은 항생제와 면역세포의 공격 등에 강한 저항성을 가지게 하여 그 결과 제균을 어렵게 한다. 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis, P.gingivalis)는 그람 음성, 혐기성 세균이며, 잇몸 염증의 원인이 되고 염증의 결과 치조골 파괴를 유도하여 치아손실을 유발한다. P.gingivalis 는 뼈나 잇몸을 녹이는 강력한 단백질 분해 효소인 진지페인(gingipain)을 만들고, 면역세포로 침투하는 특징을 가지고 있다. 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum, F. nucleatum)은 그람 음성, 혐기성 세균으로 부착분자(FadA adhesin)를 이용하여 플라크를 생성하고 다른 균의 부착을 도와 구내염, 충치, 치은염 및 치주염 발생에 관여할 뿐 만 아니라 전신순환의 결과 심내막염, 간농양, 비뇨기 감염 및 대장암등과도 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀지고 있다. The human oral cavity can be maintained in a healthy state by a well-balanced population of more than 700 types of normal microflora. However, when the balance of normal microflora is disrupted, such as an increase in harmful microorganisms and a decrease in beneficial microorganisms, oral diseases such as periodontal disease and dental caries occur. Streptococcus mutans ( S. mutans ), known as the causative agent of cavities, is a Gram-positive, facultative anaerobic bacterium that causes dental caries. In particular, the biofilm produced by S. mutans has strong resistance to antibiotics and immune cell attacks, making eradication difficult. Porphyromonas gingivalis (P.gingivalis ) is a Gram-negative, anaerobic bacterium that causes gum inflammation and, as a result of inflammation, induces destruction of alveolar bone, causing tooth loss. P. gingivalis produces gingipain, a powerful proteolytic enzyme that dissolves bones and gums, and has the characteristic of infiltrating immune cells. Fusobacterium nucleatum ( F. nucleatum ) is a Gram-negative, anaerobic bacterium that produces plaque using adhesion molecules (FadA adhesin) and helps the attachment of other bacteria, contributing to the development of stomatitis, tooth decay, gingivitis, and periodontitis. In addition, it has been found to be closely related to endocarditis, liver abscess, urinary infection, and colon cancer as a result of systemic circulation.

구강 질환을 치료하는 전통적 방법으로는 물리적으로 치석을 제거하는 스케일링, 항생제 사용에 의한 제균등의 방법이 있으나 항생제 내성의 문제등으로 대체 치료법이 요구되고 있다. 최근 들어 대체요법의 일환으로 유익균인 프로바이오틱스를 적용하는 방법이 대두되고 있다. 프로바이오틱스의 사용은 정상미생물총의 균형이 깨어진 구강내 미생물 균형을 되돌리는 역할을 할 수 있는 것으로 보고되고 있으며 일부 프로바이오틱스의 경우 구강병원성 세균에 대한 우수한 항균력 균에 의해 유도된 염증반응을 완화하는 항염등의 효능이 있음이 보고되어 있다. Traditional methods of treating oral diseases include scaling, which physically removes tartar, and disinfection using antibiotics, but alternative treatments are required due to problems with antibiotic resistance. Recently, the use of probiotics, beneficial bacteria, has been emerging as an alternative therapy. It has been reported that the use of probiotics can play a role in restoring the balance of oral microorganisms that have lost the balance of normal microflora, and some probiotics have excellent antibacterial properties against oral pathogenic bacteria and anti-inflammatory properties that alleviate the inflammatory response induced by bacteria. It has been reported that it is effective.

이에 착안하여, 본 발명자들은 전통 발효식품인 김치에서 분리한 프로바이오틱스인 웨이셀라 시바리아 SPM402 (이하, WC402)에 의한 구강병원성 세균에 대한 주요 기능성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Inspired by this, the present inventors completed the present invention by confirming the main functionality against oral pathogenic bacteria by Weissella cibaria SPM402 (hereinafter referred to as WC402), a probiotic isolated from kimchi, a traditional fermented food.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위한To solve the above problems

본 발명의 일 실시예는One embodiment of the present invention is

기탁번호가 KCCM 13206P인 웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria) SPM 402 균주를 제공한다. Weissella cibaria SPM 402 strain with the accession number KCCM 13206P is provided.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위한To solve the above problems

본 발명의 다른 실시예는Another embodiment of the present invention is

상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양물 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 치주 질환의 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.The above strains; its shredded material; its culture; Fermented products thereof; and extracts of the strains, lysates, cultures, or fermentations; Provided is a composition for preventing or improving periodontal disease comprising one or more of the following.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예는One embodiment of the present invention to achieve the above object is

기탁번호가 KCCM 13206P인 웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria) SPM 402 균주이다.It is a Weissella cibaria SPM 402 strain with the accession number KCCM 13206P.

이하 본 발명을 하기에 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일측면에 있어서, IL-1β 및 IL-8의 생성을 감소시키는, 균주를 제공한다.In one aspect of the present invention, a strain is provided that reduces the production of IL-1β and IL-8.

본 발명의 일측면은 구강 유해 미생물에 항균력을 갖는 웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria) 균주를 제공한다.One aspect of the present invention provides a Weissella cibaria strain that has antibacterial activity against oral harmful microorganisms.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 치주질환 예방, 개선 또는 치료 효과가 있는, 균주를 제공한다.In one aspect of the present invention, the strain provides a strain that has a periodontal disease prevention, improvement or treatment effect.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 치주질환 유발 미생물인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균력이 있는 균주를 제공한다.In one aspect of the present invention, the strain is selected from the group consisting of periodontal disease-causing microorganisms, Streptococcus mutans , Porphyromonas gingivalis , and Fusobacterium nucleatum . Strains with antibacterial activity against one or more of the selected substances are provided.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 치아우식증 예방, 개선 또는 치료 효과가 있는, 균주를 제공한다.In one aspect of the present invention, the strain provides a strain that has an effect in preventing, improving, or treating dental caries.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 치아우식증 유발 미생물인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균력이 있는, 균주를 제공한다.In one aspect of the present invention, the strain is selected from the group consisting of dental caries-causing microorganisms Streptococcus mutans , Porphyromonas gingivalis , and Fusobacterium nucleatum . Provides strains that have antibacterial activity against one or more of the selected substances.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 구취제거 또는 예방 효과가 있는, 균주를 제공한다.In one aspect of the present invention, the strain provides a strain that has a bad breath removal or prevention effect.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 구취 유발 미생물은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균력이 있는 균주를 제공한다.In one aspect of the present invention, the bad breath-causing microorganism is any selected from the group consisting of Streptococcus mutans , Porphyromonas gingivalis , and Fusobacterium nucleatum . Provides one or more strains with antibacterial activity.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria) SPM 402인, 균주를 제공한다.In one aspect of the present invention, the strain is Weissella cibaria SPM 402.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCCM 13206P인, 균주를 제공한다.In one aspect of the present invention, the strain provides a strain whose accession number is KCCM 13206P.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.Another aspect of the present invention is a strain according to any one of the above aspects of the present invention; its shredded material; its culture; Fermented products thereof; and extracts of the strains, lysates, cultures or fermentations; Provided is a microbial preparation comprising one or more of the following.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 치주 질환의 예방, 개선 또는 치료가 필요한 대상에게 치주 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention is a strain according to any one of the above aspects of the present invention; its shredded material; its culture; Fermented products thereof; and extracts of the strains, lysates, cultures or fermentations; It provides a method of preventing, improving or treating periodontal disease to a subject in need of prevention, improvement or treatment of periodontal disease, including the step of using one or more of the following.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 치아우식증의 예방, 개선 또는 치료가 필요한 대상에게 치아우식증을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention is a strain according to any one of the above aspects of the present invention; its shredded material; its culture; Fermented products thereof; and extracts of the strains, lysates, cultures or fermentations; A method for preventing, improving, or treating dental caries is provided to a subject in need of preventing, improving, or treating dental caries, including the step of using one or more of the following.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 구취 예방, 개선 또는 제거가 필요한 대상에게 구취를 예방, 개선 또는 제거하는 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention is a strain according to any one of the above aspects of the present invention; its shredded material; its culture; Fermented products thereof; and extracts of the strains, lysates, cultures or fermentations; A method for preventing, improving, or eliminating bad breath is provided to a subject in need of preventing, improving, or eliminating bad breath, including using one or more of the following.

본 발명의 또 하나의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 치주 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention is a strain according to any one of the above aspects of the present invention; its shredded material; its culture; Fermented products thereof; and extracts of the strains, lysates, cultures or fermentations; Provides a composition for preventing, improving or treating periodontal disease comprising one or more of the following.

일 구현예에서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인, 치주 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.In one embodiment, the composition provides a composition for preventing, improving or treating periodontal disease, which is a health functional food composition.

일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물, 건강기능식품 또는 의약품 조성물일 수 있다.In one embodiment, the composition may be a pharmaceutical composition, health functional food, or pharmaceutical composition.

본 발명의 또 하나의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 치아우식증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention is a strain according to any one of the above aspects of the present invention; its shredded material; its culture; Fermented products thereof; and extracts of the strains, lysates, cultures or fermentations; Provided is a composition for preventing, improving or treating dental caries comprising one or more of the following.

일 구현예에서, 상기 조성물은 아연을 더 포함하는, 치아우식증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.In one embodiment, the composition provides a composition for preventing, improving, or treating dental caries, further comprising zinc.

일 구현예에서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인, 치아우식증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.In one embodiment, the composition provides a composition for preventing, improving, or treating dental caries, which is a health functional food composition.

일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물, 건강기능식품 또는 의약품 조성물일 수 있다.In one embodiment, the composition may be a pharmaceutical composition, health functional food, or pharmaceutical composition.

본 발명의 또 하나의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 구취 제거, 개선 또는 예방용 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention is a strain according to any one of the above aspects of the present invention; its shredded material; its culture; Fermented products thereof; and extracts of the strains, lysates, cultures or fermentations; Provided is a composition for removing, improving or preventing bad breath comprising one or more of the following.

일 구현예에서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인, 구취 제거, 개선 또는 예방용 조성물을 제공한다.In one embodiment, the composition provides a composition for removing, improving or preventing bad breath, which is a health functional food composition.

일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물, 건강기능식품 또는 의약품 조성물일 수 있다.In one embodiment, the composition may be a pharmaceutical composition, health functional food, or pharmaceutical composition.

예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약학 조성물인 것일 수 있다.According to one exemplary embodiment, the composition may be a pharmaceutical composition.

본 발명의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 질환의 발병을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 상기 용어, "치료"는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.The term "prevention" of the present invention refers to any action that suppresses or delays the onset of a disease by administering the pharmaceutical composition according to the present invention, and the term "treatment" refers to any action that prevents or delays the onset of a disease by administering the pharmaceutical composition according to the present invention. It refers to any action that improves or changes the symptoms of a suspected or diseased entity.

본 발명의 약학 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석 제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent, and the carrier may include a non-naturally occurring carrier.

보다 구체적으로, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석 제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말 티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드 록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리카 프로락톤(polycaprolactone), 폴리락틱액시드(Poly Lactic Acid), 폴리-L-락틱액시 드(poly-L-lactic acid), 광물유 등을 들 수 있다.More specifically, carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate. , calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, polycaprolactone, polylactic solution. Examples include poly lactic acid, poly-L-lactic acid, and mineral oil.

상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용 액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 담체의 형태로는 각종 부정형의 담체, 마이크로 스피어, 나노파이버 등을 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to conventional methods. , the form of the carrier may include various amorphous carriers, microspheres, nanofibers, etc.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.When formulated, it can be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포 함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 19-9 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include the extract and its fractions with at least one 19-9 excipient, such as starch, calcium carbonate ( It can be prepared by mixing calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc. Additionally, in addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate and talc may also be used.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups. In addition to the commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. there is.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동 결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리 콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.Preparations for parenteral administration may include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, etc. Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.

또한, 본 발명의 용어, "개선"은 본 발명에 따른 약학 조성물을 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.In addition, the term "improvement" in the present invention means any action that reduces at least the degree of symptoms, for example, parameters related to the condition being treated by administering the pharmaceutical composition according to the present invention.

본 발명의 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학 적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 한편, 건강식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품은 건강 보조 목적의 식품을 의미하는데, 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다. The term "health functional food" in the present invention refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients with functionality useful to the human body in accordance with Act No. 6727 on Health Functional Food, and "functionality" refers to the structure of the human body. It means controlling nutrients for functions or obtaining useful effects for health purposes such as physiological effects. Meanwhile, health food refers to food that has a more active health maintenance or promotion effect compared to general food, and health supplement refers to food for health supplement purposes. In some cases, the terms health functional food, health food, and health supplement food are used. can be used interchangeably.

예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 식품 조성물인 것일 수 있다. 상기 식품 조성물은 액상 또는 고체 상태의 제형일 수 있고, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다. 본 명세서에 개시된 유효성분 외에 함유할 수 있는 액체 성분에는 특별한 제한점이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올 등이 있다. 상기의 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성향미제(예를 들어 사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 명세서에 개시된 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 일 측면에서 약 5 내지 12 g일 수 있다. 상기 식품 조성물은 일 측면에서 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그 염, 알긴산 및 그 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다.According to one exemplary embodiment, the composition may be a food composition. The food composition may be in a liquid or solid form, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, health supplements, etc., and may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, or beverages. You can. In addition to the active ingredients, the food composition of each formulation can be appropriately selected and mixed by a person skilled in the art according to the formulation or purpose of use, without difficulty, and a synergistic effect can occur when applied simultaneously with other raw materials. There are no particular restrictions on the liquid ingredients that can be contained in addition to the active ingredients disclosed in this specification, and, like regular beverages, various flavoring agents or natural carbohydrates can be included as additional ingredients. Examples of the natural carbohydrates include monosaccharides, disaccharides such as glucose and fructose, polysaccharides such as maltose and sucrose, common sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. etc. As the above flavoring agents, natural flavoring agents (thaumatin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (e.g., saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. The ratio of the natural carbohydrate may be generally about 1 to 20 g, and in one aspect about 5 to 12 g, per 100 ml of the composition disclosed herein. In one aspect, the food composition may contain various nutrients, vitamins, minerals ( electrolytes), flavoring agents such as synthetic and natural flavors, colorants and thickening agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, It may contain preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated drinks, etc.

일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 치약 또는 가글액의 형태로 제공될 수 있다.In one embodiment, the composition may be provided in the form of toothpaste or mouthwash.

일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 인간을 대상으로 사용될 수 있다.In one embodiment, the composition can be used on humans.

일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 인간 이외의 동물, 바람직하게 반려동물, 더 바람직하게 개 및 고양이의 구취제거를 위해 사용될 수 있다.In one embodiment, the composition can be used to remove bad breath in animals other than humans, preferably companion animals, and more preferably dogs and cats.

본 발명의 웨이셀라 시바리아 균주는 구강 병원성 세균에 대한 항균력이 뛰어나고 구강 병원성 세균의 병인인자 발현 억제능이 뛰어나 치아우식증, 치주 질환, 구취 제거 등의 구강 질환에 뛰어난 예방 또는 개선 효과를 나타낸다.The Weissella sybaria strain of the present invention has excellent antibacterial activity against oral pathogenic bacteria and an excellent ability to suppress the expression of etiological factors of oral pathogenic bacteria, showing an excellent preventive or improvement effect on oral diseases such as dental caries, periodontal disease, and bad breath removal.

한편, 본 발명에서 얻을 수 있는 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.Meanwhile, the effects that can be obtained from the present invention are not limited to the effects mentioned above, and other effects not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below. You will be able to.

도 1은 WC402의 매크로젠 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 WC402의 P.gingivalis Kgp 활성에 대한 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 WC402의 P.gingivalis Rgp 활성에 대한 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 WC402의 바이오 필름 형성 억제능을 나타낸 것이다.
도 5는 WC402에 의한 F. nucleatum의 병인인자인 fadA 유전자 발현 억제능을 나타낸 것이다.
도 6은 F. nucleatum으로 감염되고 WC402로 처리된 YD-38 인간 구강 상피 세포주에서 전염증성 사이토카인 유전자 발현의 상대적 정량화 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 F. nucleatum으로 감염된 YD-38 인간 구강 상피 세포주에서 IL-8 생성에 대한 WC 402의 효과를 나타낸 것이다.
Figure 1 shows the results of macrogen identification of WC402.
Figure 2 shows the inhibitory effect of WC402 on P. gingivalis Kgp activity.
Figure 3 shows the inhibitory effect of WC402 on P. gingivalis Rgp activity.
Figure 4 shows the biofilm formation inhibition ability of WC402.
Figure 5 shows the ability of WC402 to suppress expression of the fadA gene, a etiological factor of F. nucleatum .
Figure 6 shows the relative quantification of pro-inflammatory cytokine gene expression in the YD-38 human oral epithelial cell line infected with F. nucleatum and treated with WC402.
Figure 7 shows the effect of WC 402 on IL-8 production in YD-38 human oral epithelial cell line infected with F. nucleatum .

이하, 본 발명의 실시 예를 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 실시 예는 여러 가지 형태로 변형할 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래의 실시 예들로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail. Embodiments of the present invention can be modified in various forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following embodiments. This example is provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.

실시예 1. 균주 및 배양조건 Example 1. Strain and culture conditions

본 실험에 사용한 유산균은 시판되는 김치를 시료로 사용하여 분리하였다. 김치 10 g을 100 ml PBS 용액에 균질화한 후 PBS로 10배 계열희석후 각 희석 단계별로 0.1 ml를 MRS고체배지에 도말한 후 37℃, 24시간 배양 후 우유빛깔의 콜로니를 선택하여 계대 배양하였다. 이로부터 유래한 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SPM402 (WC402)로 균주의 동정은 마크로젠(Macrogen, 서울)에 의뢰하여 16S rRNA 시퀀싱을 통해 동정하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 선별된 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SPM402 (WC402) 균주를 한국 미생물 보존센터에 기탁하여 2022년 6월 14일자로 기탁번호 KCCM 13206P를 부여받았다.The lactic acid bacteria used in this experiment were isolated using commercially available kimchi as a sample. 10 g of kimchi was homogenized in 100 ml of PBS solution, serially diluted 10 times with PBS, and 0.1 ml of each dilution step was spread on MRS solid medium. After culturing at 37°C for 24 hours, milky colonies were selected and subcultured. . The strain derived from this, Weissella cibaria SPM402 (WC402), was identified through 16S rRNA sequencing at Macrogen (Seoul), and the results are shown in Figure 1. The selected Weissella cibaria SPM402 (WC402) strain was deposited at the Korea Microbial Conservation Center and received deposit number KCCM 13206P on June 14, 2022.

본 실험에 사용한 구강 병원성 세균 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis) KCTC 5352, 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum, F. nucleatum spp. Nucleatum) KCTC 2640, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans, S. mutans) KCTC 3065, 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei, L.casei)KCTC 2180, 프레보텔라 인터미디아 (Prevotella intermedia, P.intermedia) KCTC 15693는 생물자원센터(KCTC, 전라북도 정읍)에서 분양 받아 본 연구실에 보관하던 균주를 사용하였다. Oral pathogenic bacteria used in this experiment Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) KCTC 5352, Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum spp. Nucleatum) KCTC 2640, Streptococcus mutans ( Streptococcus mutans , S. mutans) KCTC 3065, Lactobacillus casei ( L.casei ) KCTC 2180, Prevotella intermedia ( P.intermedia ) KCTC 15693 from the Biological Resources Center (KCTC, Jeongeup, Jeollabuk-do) We used strains that had been purchased and stored in our laboratory.

유산균인 WC402는 MRS배지, P. gingivalis는 뇌심장침출(Brain Heart Infusion) (BHI, BactoTM)에 5% 농도의 말 피(horse blood)를 첨가한 배지에 37℃ 혐기배양하였고 F. nucleatum은 강화 클로스트리아 배지(Reinforced Clostridial medium) (Difco)에 37℃ 혐기배양, S. mutans BHI 배지에 37℃ 에서 캔들 자(Candle jar) 방법으로 배양하였다. WC402, a lactic acid bacterium, was cultured anaerobically at 37°C on MRS medium, P. gingivalis was cultured anaerobically on Brain Heart Infusion (BHI, Bacto TM ) medium containing 5% horse blood, and F. nucleatum was cultured anaerobically on medium. Anaerobic culture was performed at 37°C in Reinforced Clostridial medium (Difco), and cultured in S. mutans BHI medium at 37°C using the candle jar method.

실시예 2. 세포주 및 배양방법 Example 2. Cell lines and culture methods

사람 치주상피세포인 YD-38 세포주 (KCLB, KOREA)는 한국세포주 은행에서 분양 받아 RPMI1640 배지에 L-글루타민 (300 mg/ml), 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO3 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대배양하였다. YD-38 cell line (KCLB, KOREA), a human periodontal epithelial cell, was purchased from the Korea Cell Line Bank and grown in RPMI1640 medium with L-glutamine (300 mg/ml), 25mM HEPES, 25mM NaHCO3, 10% FBS, and penicillin/streptomycin. was cultured in an environment of 37°C and 5% CO2 using medium supplemented with , and subcultured at 2-day intervals.

실험예 1Experimental Example 1 . In vitro. In vitro 항균력 측정 Antibacterial activity measurement

WC402의 구강병원성 세균의 배양액에 의한 항균력을 미량희석 (microdilution)법으로 실시하였다. WC402 배양액은 50%를 최고농도로 2배 계열희석하고, 여기에 1x106 CFU/ml 농도로 P. gingivalis KCTC 5352, F. nucleatum spp. nucleatum KCTC 2640, S. mutans KCTC 3065, L.casei KCTC2180, P.intermedia KCTC15693 를 37℃, 48시간 배양 후 균의 성장을 확인하여 성장이 억제된 WC402 상등액의 농도를 최소억제농도 (Minimum Inhibitory Concentration, MIC)로 결정하고, MIC를 확인 후 해당 농도의 배양액 각 10 ㎕을 WC402 배양상등액을 함유하지 않은 배지에 접종 후 37℃, 48시간 배양 후 균의 성장을 확인할 수 없는 가장 낮은 농도를 최소살균농도(Minimum Bactericidal Concentration, MBC)로 결정하였다. 정도관리를 위해 S. mutans, P. gingivalis는 암피실린 (ampicillin), F. nucleatum은 목시플록사신(moxifloxacin)을 사용하여 항균력을 측정하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.The antibacterial activity of WC402 in culture media of oral pathogenic bacteria was tested using the microdilution method. WC402 culture medium was serially diluted 2-fold to the highest concentration of 50%, and P. gingivalis KCTC 5352, F. nucleatum spp. was added at a concentration of 1x10 6 CFU/ml. After culturing nucleatum KCTC 2640, S. mutans KCTC 3065, L.casei KCTC2180, and P.intermedia KCTC15693 at 37°C for 48 hours, the growth of the bacteria was confirmed and the concentration of the WC402 supernatant where growth was inhibited was determined at Minimum Inhibitory Concentration. MIC), and after confirming the MIC, inoculate 10 ㎕ of each culture medium without WC402 culture supernatant. After culturing at 37°C for 48 hours, the lowest concentration at which bacterial growth cannot be confirmed is the minimum sterilizing concentration. (Minimum Bactericidal Concentration, MBC) was determined. For quality control, the antibacterial activity was measured using ampicillin for S. mutans and P. gingivalis , and moxifloxacin for F. nucleatum, and the results are shown in Table 1 below.

[표 1][Table 1]

WC402 배양 상등액은 주요 구강 병원성 세균에 대한 항균효과를 보였으며 특히 P. gingivalis에 대해 배양 상등액 5% 농도에서 균주의 성장이 억제됨을 확인하여 우수한 항균효과가 있음을 알 수 있었다 (표 1)WC402 culture supernatant showed an antibacterial effect against major oral pathogenic bacteria, and in particular, it was confirmed that the growth of the strain was inhibited against P. gingivalis at a concentration of 5% of the culture supernatant, showing that it had an excellent antibacterial effect (Table 1)

실험예 2. 진지페인 효소 활성 억제능 Experimental Example 2. Ability to inhibit gingipain enzyme activity

효소액 조제Enzyme solution preparation

WC402 배양 상등액에 의한 P. gingivalis 유래 진지페인(gingipain) 효소 억제능을 형광 펩티드를 기질로 하여 측정하였다. P. gingivalis를 위에 기술한 방법으로 배양 후 세포외로 분비된 효소(cell free gingipain, CFG)액을 얻기 위해 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 0.2 ㎛ 여과지로 여과하여 사용하였다. 분비되지 않은 세포막에 붙어있는 효소액(cell associated gingipain, CAG)은 세균 배양액을 원심분리하여 수확한 균체를 인산완충용액에 600 nm에서 흡광도가 4.0이 되도록 현탁하여 사용하였다. Serine protease 효소 활성을 억제하기 위해 효소액에 0.2 mM 페닐메탄술포틸 플루오라이드(Phenylmethanesulfonyl fluoride) (PMSF, Sigma Co. St. Louis, USA)를 가한 후 소분하여 -70℃에 보관하였다. The ability of WC402 culture supernatant to inhibit P. gingivalis -derived gingipain enzyme was measured using fluorescent peptide as a substrate. After culturing P. gingivalis using the method described above, the cells were centrifuged to obtain extracellularly secreted enzyme (cell free gingipain, CFG), and the supernatant was filtered through 0.2 ㎛ filter paper. The enzyme solution (cell associated gingipain, CAG) attached to the non-secreted cell membrane was used by suspending the bacterial cells harvested by centrifuging the bacterial culture in phosphate buffer solution to an absorbance of 4.0 at 600 nm. To inhibit serine protease enzyme activity, 0.2 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF, Sigma Co. St. Louis, USA) was added to the enzyme solution, then divided into portions and stored at -70°C.

효소활성 측정Enzyme activity measurement

1 mM 시스테인을 함유하는 각 효소액 원액을 10배 희석후 20 ml를 37℃, 10분간 전배양 후 WC402의 동결건조한 배양 상등액을 여러 농도로 가하고, 형광기질 물질인 BOC-VLK-AMC (Peptide Institute. Inc., Japan) 또는 BOC-VPR-AMC (Bachem Americas Inc., Canada)를 0.2 mM농도로 가하였다. 37℃ 15분 반응 후 1.5 mM TLCK (Tosyllysine Chloromethyl Ketone) 50 ㎕를 가하여 반응을 종결하였다. 진지페인에 의해 분해된 기질 분해산물의 형광은 형광 플레이트 판독기 (fluorescence plate reader) (TecanTM) 로 (excitation at 360 nm, emission at 465 nm) 측정하였다. 양성대조군 효소 억제제로는 류펩틴 (10 μM)을 사용하고, 효소활성을 측정한 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. Each enzyme stock solution containing 1mM cysteine was diluted 10 times, and 20 ml was pre-incubated at 37°C for 10 minutes. Freeze-dried culture supernatant of WC402 was added at various concentrations, and the fluorescent substrate BOC-VLK-AMC (Peptide Institute. Inc., Japan) or BOC-VPR-AMC (Bachem Americas Inc., Canada) was added at a concentration of 0.2 mM. After reaction at 37°C for 15 minutes, 50 μl of 1.5 mM TLCK (Tosyllysine Chloromethyl Ketone) was added to terminate the reaction. The fluorescence of the substrate degradation products degraded by gingipain was measured (excitation at 360 nm, emission at 465 nm) using a fluorescence plate reader (Tecan TM ). Leupeptin (10 μM) was used as a positive control enzyme inhibitor, and the results of measuring enzyme activity are shown in Figures 2 and 3.

진지페인은 P. gingivalis가 생성하는 대표적인 단백질 분해 효소이며 이 효소는 세균에게는 영양소 공급의 역할을 하지만 사람에게는 잇몸의 붕괴등 질병 상태를 악화시키는 주요 병인인자이다. 이 효소는 아르기닌 특이 진지페인 (arginin specific gingipain) (Rgp)과 리신 특이 진지페인 (lysine specific gingipain) (Kgp)으로 구분되며 두가지 효소에 대한 억제능을 모두 확인하였다. 양성대조물질인 류펩틴 10 uM에서 Kgp 활성을 약 78%, Rgp활성을 약 90% 억제하였고, WC402배양 상등액의 동결건조물은 5mg/mL농도에서 Kgp와 Rgp 모두 78-80% 정도 억제하여 효과적인 gingipain 억제효과를 나타냄을 확인하였다Gingivalis is a representative proteolytic enzyme produced by P. gingivalis . This enzyme plays a role in supplying nutrients to bacteria, but in humans, it is a major etiological factor that worsens disease conditions such as gum decay. This enzyme is divided into arginin specific gingipain (Rgp) and lysine specific gingipain (Kgp), and the inhibitory ability for both enzymes was confirmed. Leupeptin, a positive control substance, inhibited Kgp activity by about 78% and Rgp activity by about 90% at 10 uM, and the freeze-dried product of WC402 culture supernatant inhibited both Kgp and Rgp by about 78-80% at a concentration of 5 mg/mL, making it an effective gingipain. It was confirmed that it had an inhibitory effect.

실험예 3. WC 402의 Experimental Example 3. WC 402 S. mutansS. mutans KCTC 3065의 생물막 형성 억제능 Biofilm formation inhibition ability of KCTC 3065

생물막 형성은 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용하는 방법을 변형하여 실시하였다. S. mutans KCTC 3065를 BHI 액체 배지에 5% CO2, 37℃에서 24시간 배양 후, S. mutans의 흡광도를 측정하여 균수를 조정하여 10 ㎕ (3Х107 cell)를 동결건조한 배양액을 다양한 농도로 각각 함유한 190 ㎕의 BHI 배지에 접종하고 5% CO2, 37℃ 에서 24h 배양하였다. 상등액을 제거한 뒤, 10% 포름알데히드 (Sigma Co. St. Louis, USA) 200 mL를 각 웰에 처리하고, 30분 후 제거하였다. 3차 증류수로 3회 세척 후 0.5% 크리스탈 바이올렛 (Sigma Co. St. Louis, USA) 200 ㎕을 각 웰에 처리 후 30분간 바이오 필름을 염색하였다. 3차 증류수로 3회 세척 이소프로필 알코올 200 ㎕을 각 웰에 처리 후 1시간 반응하여 크리스탈 바이올렛이 용출되도록 한 후 용출된 크리스탈 바이올렛을 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 아무것도 처리하지 않은 웰을 대조군으로, S. mutans 만 처리한 웰의 바이오필름의 흡광도 값을 100%로 환산하여 비교 계산하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. WC402 동결건조한 배양액은 1.25 mg/mL에서 54%, 5 mg/mL에서 97%의 생물막 형성을 억제하여 효과적인 생물막 억제기능을 확인하였다Biofilm formation was performed by modifying the method using crystal violet. After culturing S. mutans KCTC 3065 in BHI liquid medium for 24 hours at 37°C with 5% CO 2 , the absorbance of S. mutans was measured to adjust the number of bacteria, and 10 ㎕ (3Х107 cells) of lyophilized culture solution was used at various concentrations. It was inoculated into 190 ㎕ of BHI medium containing 5% CO 2 and cultured at 37°C for 24 h. After removing the supernatant, 200 mL of 10% formaldehyde (Sigma Co. St. Louis, USA) was added to each well and removed after 30 minutes. After washing three times with distilled water, 200 ㎕ of 0.5% crystal violet (Sigma Co. St. Louis, USA) was added to each well, and the biofilm was stained for 30 minutes. After washing three times with distilled water, each well was treated with 200 ㎕ of isopropyl alcohol and reacted for 1 hour to elute crystal violet. The absorbance of the eluted crystal violet was measured at 490 nm. At this time, the absorbance value of the biofilm of the untreated well was used as a control group and the well treated only with S. mutans was converted to 100% for comparative calculation, and the results are shown in Figure 4. WC402 freeze-dried culture medium inhibited biofilm formation by 54% at 1.25 mg/mL and 97% at 5 mg/mL, confirming its effective biofilm inhibition function.

실험예 4. WC 402에 의한 Experimental Example 4. By WC 402 F. nucleatumF. nucleatum 의 병인인자인 etiological factor of fadfad A유전자 발현 억제Inhibition of A gene expression

F. nucleatum은 위에서 상기 실시예의 방법으로 배양후 109 cfu 의 F. nucleatum을 3 ml 클로스트리디아 배지에 현탁하고 동결건조한 WC402배양액을 각각 0.5, 1 mg/mL 농도로 첨가 후 37℃, 6시간 배양하였다. 이후 원심분리하여 세포를 수확 후 GeneAll Hybrid-RTM 시약(GeneAll, Seoul, KOREA)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA 200 ng을 AccuPower CycleScript RT premix (dN12) (Bioneer, Korea)로 c-DNA로 만든 후 fadA 유전자 발현을 비교하기 위해 qRT-PCR을 실시하였다. 결과분석은 F. nucleatum 16S rRNA 유전자 발현을 기준으로 fadA 유전자 발현을 상대정량분석하는 ddCt분석하고 그 차이가 1.5배 이상인 경우를 유의적 차이로 판단하였다. 실험 결과, F. nucleatum만 배양한 경우 fadA발현을 1로 했을때 0.5 mg/mL의 WC402를 처리한 경우 유전자 발현이 약 0.67배, 1 mg/mL의 WC402를 처리한 경우 0.49배 정도로 유전자 발현이 감소하였다. (도 5) After culturing F. nucleatum by the method of the above example, 10 9 cfu of F. nucleatum was suspended in 3 ml Clostridia medium, freeze-dried WC402 culture was added at a concentration of 0.5 and 1 mg/mL, respectively, and incubated at 37°C for 6 hours. Cultured. Afterwards, the cells were harvested by centrifugation, and RNA was isolated using GeneAll Hybrid-R TM reagent (GeneAll, Seoul, KOREA). 200 ng of the isolated RNA was converted into c-DNA using AccuPower CycleScript RT premix (dN12) (Bioneer, Korea), and then qRT-PCR was performed to compare fad A gene expression. The result analysis was ddCt analysis, which performs relative quantitative analysis of fad A gene expression based on F. nucleatum 16S rRNA gene expression, and cases where the difference was 1.5 times or more were judged to be significant differences. As a result of the experiment, when only F. nucleatum was cultured, when fad A expression was set to 1, gene expression was approximately 0.67-fold when treated with 0.5 mg/mL WC402, and gene expression was approximately 0.49-fold when treated with 1 mg/mL WC402. This has decreased. (Figure 5)

실험예 5. WC 402 배양액이 치주상피세포의 IL-8 및 IL-1β mRNA 발현에 미치는 영향 Experimental Example 5. Effect of WC 402 culture medium on IL-8 and IL-1 β mRNA expression of periodontal epithelial cells

YD-38 세포를 6 웰 플레이트에 5Х105 cells/웰로 분주하여 24시간 배양 후 WC402 의 동결건조한 배양액을 0.5 mg/mL, 1 mg/mL 농도로 처리하고 30 분 후 F. nucleatum subsp. nucleatum(FN)는 YD-38 세포수 대비 100배 많은 세균을 처리하여 염증반응을 유도하였다. 6시간 배양 후 트리아졸법을 응용한 Hybrid-RTM(GeneAll, Seoul, Korea) 키트를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA 0.1 mg을 템플릿으로 하여 AccuPower CycleScript RT premix(dT20)(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성한 후 IL-1ß와 IL-8를 표적으로 정량 실시간 (Quantitative real-time) PCR (qRT-PCR)을 실시하였다. 결과 분석은 ß-액틴을 기준으로 IL-1ß와 IL-8를 상대정량분석을 하는 ddCt 분석을 실시하여 분석하였으며, 1.5배 이상의 차이를 유의적인 발현 억제로 판단하였다. YD-38 cells were distributed in a 6-well plate at 5Х10 5 cells/well and cultured for 24 hours. Then, the freeze-dried culture medium of WC402 was treated at a concentration of 0.5 mg/mL and 1 mg/mL, and after 30 minutes, F. nucleatum subsp. nucleatum (FN) induced an inflammatory response by treating 100 times more bacteria than the number of YD-38 cells. After 6 hours of incubation, RNA was isolated using the Hybrid-R TM (GeneAll, Seoul, Korea) kit using the triazole method. Using 0.1 mg of isolated RNA as a template, cDNA was synthesized using AccuPower CycleScript RT premix (dT20) (Bioneer, Daejeon, Korea), followed by quantitative real-time PCR targeting IL-1ß and IL-8. (qRT-PCR) was performed. The results were analyzed using ddCt analysis, which performs relative quantitative analysis of IL-1ß and IL-8 based on ß-actin, and a difference of more than 1.5-fold was judged to be significant expression inhibition.

ELISA를 이용한 IL-8 농도 측정 방법은 다음과 같다. F. nucleatum 처리한 YD-38 세포에서 전염증성 사이토카인 생성이 WC402 배양액에 의해 억제되는 것을 확인하고자 인간 IL-1β ELISA 키트, 인간 IL-8 ELISA 키트 (Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 다음과 같이 분석하였다. 6 웰 플레이트에 웰당 YD-38 cell 5Х105 세포를 분주하여 24시간 배양 후 WC 402 동결건조한 배양액을 0.5 mg/mL, 1 mg/mL 농도로 처리하고 30분 후 F. nuceatum을 1: 100비율로 처리하고 24시간 배양하였다. 배양 상등액을 시료로 하여 제조사에서 제공된 방법에 따라 IL-8을 정량하였고 standard IL-8을 이용하여 작성한 검량선에 각 시료의 흡광도 값을 대입하여 IL-8 농도를 계산하였다.The method for measuring IL-8 concentration using ELISA is as follows. To confirm that the production of pro-inflammatory cytokines in YD-38 cells treated with F. nucleatum was inhibited by WC402 culture medium, the human IL-1β ELISA kit and human IL-8 ELISA kit (Abcam, Cambridge, UK) were used as follows. They were analyzed together. YD-38 cell 5Х10 5 cells were distributed per well in a 6-well plate and cultured for 24 hours. Then, WC 402 freeze-dried culture medium was treated at a concentration of 0.5 mg/mL and 1 mg/mL, and after 30 minutes, F. nuceatum was added at a ratio of 1:100. Treated and cultured for 24 hours. Using the culture supernatant as a sample, IL-8 was quantified according to the method provided by the manufacturer, and the concentration of IL-8 was calculated by substituting the absorbance value of each sample into a calibration curve prepared using standard IL-8.

그 결과 F. nucleatum에 의해 발현이 14배 유도된 IL-8 mRNA양이 0.5 mg/mL의 WC402를 처리한 결과 약 8.75배, 1 mg/mL의 WC402를 처리한 결과 약 9.8배 발현이 억제되었다. 또한 동일한 조건에서 IL-1β는 약 4.52배 발현이 증가하였으나 0.5 mg/mL의 WC402를 처리한 결과 약 1.86 배, 1 mg/mL의 WC402를 처리한 결과 약 2.7 배 발현이 억제되었다. (도 6) F. nucleatum 감염 후 IL-8 의 생성량을 비교한 결과 세균만 감염시 IL-8은 3850 ± 187.5 pg/mL, WC402 0.5 mg/mL 처리시 2650 ± 112.5 pg/mL, 1 mg/mL 처리시 1624 ± 76.3 pg/mL로 유의적으로 IL-8 생성이 감소하였다. (도 7)As a result, the amount of IL-8 mRNA, the expression of which was induced 14 times by F. nucleatum, was suppressed by about 8.75 times when treated with 0.5 mg/mL of WC402, and by about 9.8 times when treated with 1 mg/mL of WC402. . Also, under the same conditions, the expression of IL-1β increased about 4.52-fold, but when treated with 0.5 mg/mL WC402, the expression was suppressed by about 1.86-fold and when treated with 1 mg/mL WC402, the expression was suppressed by about 2.7-fold. (Figure 6) As a result of comparing the amount of IL-8 produced after infection with F. nucleatum , IL-8 was 3850 ± 187.5 pg/mL when infected with only bacteria, and 2650 ± 112.5 pg/mL when treated with WC402 0.5 mg/mL, 1 mg/mL. When treated with mL, IL-8 production was significantly reduced to 1624 ± 76.3 pg/mL. (Figure 7)

이상의 상세한 설명은 본 발명을 예시하는 것이다. 또한 전술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내어 설명하는 것이며, 본 발명은 다양한 다른 조합, 변경 및 환경에서 사용할 수 있다. 즉 본 명세서에 개시된 발명의 개념의 범위, 저술한 개시 내용과 균등한 범위 및/또는 당업계의 기술 또는 지식의 범위 내에서 변경 또는 수정이 가능하다. 저술한 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 구현하기 위한 최선의 상태를 설명하는 것이며, 본 발명의 구체적인 적용 분야 및 용도에서 요구되는 다양한 변경도 가능하다. 따라서 이상의 발명의 상세한 설명은 개시된 실시 상태로 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 또한 첨부된 청구 범위는 다른 실시 상태도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.The above detailed description is illustrative of the present invention. Additionally, the foregoing is intended to illustrate preferred embodiments of the present invention, and the present invention can be used in various other combinations, modifications, and environments. That is, changes or modifications can be made within the scope of the inventive concept disclosed in this specification, a scope equivalent to the written disclosure, and/or within the scope of technology or knowledge in the art. The written examples illustrate the best state for implementing the technical idea of the present invention, and various changes required for specific application fields and uses of the present invention are also possible. Accordingly, the detailed description of the invention above is not intended to limit the invention to the disclosed embodiments. Additionally, the appended claims should be construed to include other embodiments as well.

한국미생물보존센터(KCCM)Korea Center for Microbial Conservation (KCCM) KCCM13206PKCCM13206P 2022061420220614

Claims (12)

구강질환 예방 또는 개선 효과를 가지는 기탁번호가 KCCM 13206P인 웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria) SPM 402 균주. Weissella cibaria SPM 402 strain with accession number KCCM 13206P, which has the effect of preventing or improving oral diseases. 제 1 항에 있어서,
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 구강 유해 미생물에 항균력을 갖는 것인, 균주.
According to claim 1,
Having antibacterial activity against oral harmful microorganisms, including any one or more selected from the group consisting of Streptococcus mutans , Porphyromonas gingivalis , and Fusobacterium nucleatum Phosphorus, strain.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 치주질환 예방, 개선 또는 치료 효과가 있는, 균주.
According to claim 1,
The strain is a strain that has a periodontal disease prevention, improvement or treatment effect.
제 1 항에 있어서,
IL-1β 및 IL-8의 생성을 감소시키는 항염 효과가 있는, 균주.
According to claim 1,
A strain with anti-inflammatory effects that reduces the production of IL-1β and IL-8.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 치아우식증 예방, 개선 또는 치료 효과가 있는, 균주.
According to claim 1,
The strain is a strain that has the effect of preventing, improving, or treating dental caries.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 구취 제거, 개선 또는 예방 효과가 있는, 균주.
According to claim 1,
The strain is a strain that has a bad breath removal, improvement or prevention effect.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양물 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 치주 질환의 예방 또는 개선용 조성물.The strain according to any one of claims 1 to 6; its shredded material; its culture; Fermented products thereof; and extracts of the strains, lysates, cultures, or fermentations; A composition for preventing or improving periodontal disease comprising one or more of the following. 제 7 항에 있어서,
상기 조성물은 건강기능식품인, 치주 질환의 예방 또는 개선용 조성물.
According to claim 7,
The composition is a health functional food, a composition for preventing or improving periodontal disease.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양물 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 치아우식증의 예방 또는 개선용 조성물.The strain according to any one of claims 1 to 6; its shredded material; its culture; Fermented products thereof; and extracts of the strains, lysates, cultures, or fermentations; A composition for preventing or improving dental caries comprising one or more of the following: 제 9 항에 있어서,
상기 조성물은 건강기능식품인, 치아우식증의 예방 또는 개선용 조성물.
According to clause 9,
The composition is a health functional food, a composition for preventing or improving dental caries.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양물 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 구취 제거 또는 예방용 조성물.The strain according to any one of claims 1 to 6; its shredded material; its culture; Fermented products thereof; and extracts of the strains, lysates, cultures, or fermentations; A composition for removing or preventing bad breath comprising one or more of the following. 제 11 항에 있어서,
상기 조성물은 건강기능식품인, 구취 제거, 개선 또는 예방용 조성물.
According to claim 11,
The composition is a health functional food composition for removing, improving or preventing bad breath.
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