KR20240013402A - 테리파라타이드를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료를 위한 경구용 약학적 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
테리파라타이드를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료를 위한 경구용 약학적 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 테리파라타이드 (teriparatide), 라이신 결합 데옥시콜산(L-lysine-linked deoxycholic acid), 데옥시콜산 (deoxycholic acid), 및 알킬글리코사이드 (alkylglycoside)계 계면활성제로 이루어진 이온결합 복합체를 포함하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 테리파라타이드를 포함하는 이온결합 복합체는 테리파라타이드가 미셀 구조에 통합되어 위장관에서 펩티다아제에 의한 분해를 억제함으로써 약물을 고용량으로 유지할 수 있고, 다양한 막 통과 흡수 경로로의 이용이 가능하여 약물의 투과도를 향상시킬 수 있으므로, 최종적으로는 약물인 테리파라타이드의 경구 생체이용률을 증가시킬 수 있다.
Description
본 발명은 테리파라타이드를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료를 위한 경구용 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 테리파라타이드 (teriparatide), 라이신 결합 데옥시콜산 (L-lysine-linked deoxycholic acid) 및 데옥시콜산 (deoxycholic acid) 중 하나 이상, 및 알킬글리코사이드 (alkylglycoside)계 계면활성제로 이루어진 이온결합 복합체를 포함하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
골다공증에 대한 현재의 치료법은 주로 비스포스포네이 (bisphosphonates)에 의한 골흡수 억제를 기반으로 하여 골 회전율을 감소시키고, 골흡수를 억제하여 추가 골 손실을 방지하는 것이다. 이러한 약물은 파골세포 골흡수를 방해하여 골밀도(BMD)를 증가시키고 기존 골격 미세구조를 보존할 수 있지만, 그 효과는 단기간의 골흡수 및 골절 위험의 부분적 감소에 제한된다. 이러한 치료법은 정상적인 뼈 구조를 회복할 수 없어 잠재적으로 뼈의 질 저하, 뼈 강도의 손실 및 골절 경향을 초래할 수 있다.
치료가 필요한 골다공증 환자 중 상당수는 이미 상당한 양의 뼈가 손실되었기 때문에 새로운 뼈 형성을 자극하여 뼈의 질량을 증가시킬 수 있는 치료법의 개발이 필요하다. 골다공증에서 동화 요법의 잠재적 후보인 인간 부갑상선 호르몬 (hPTH)은 재조합 hPTH(rhPTH)의 간헐적 피하 (SC) 투여가 골격에 강력한 동화 효과를 발휘하고 증가시키는 보고서를 기반으로 많은 관심을 끌었다. 골 재형성 속도는 긍정적인 재형성 균형을 초래하여 더 두꺼운 골로 이어진다. 따라서 동화 작용의 hPTH 치료는 증가된 뼈 모델링 및 리모델링을 통해 새로운 뼈 형성을 유도할 수 있으며, 항흡수 치료에 비해 몇 가지 장점이 있다.
현재 폐경기 여성과 남성의 골다공증 관리를 위해 두 가지 형태의 rhPTH가 승인된 상태이다: 테리파라타이드 (teriparatide) [TRP; 첫 번째 N-말단 34개 아미노산으로 구성된 rhPTH, rhPTH(1-34)] 및 온전한 84개 아미노산 형태의 rhPTH(1-84). 그러나 TRP는 현재 20μg 1일 1회(Forteo®) 또는 56.5μg 1일 1회(Teribone™) SC 주사제 형태로만 이용 가능한데, 이러한 투여 형태는 흡수가 지연되고 만성적 질병에 요구되는 요법에 대한 순응도가 낮아 장기간 사용하기에는 불편하다. 따라서, 더 나은 위장관(GI) 투과 및 경구 흡수를 나타내고 환자의 순응도를 증가시킬 수 있는 SC 주사 제제와 동등한 치료 가능성을 갖는 경구 TRP 제제의 개발이 필요하다. 그러나, TRP를 비롯한 대부분의 펩타이드 약물은 펩티다아제 민감도와 낮은 장 투과도로 인해 경구 생체이용률이 좋지 않다. 또한, TRP의 경구 전달은 골 동화 활성을 달성하기 위한 박동성 약동학적 (pulsatile pharmacokinetic) 프로파일의 필요성과 같은 몇 가지 과제가 있다. 따라서 약물 노출 기간은 최소 1시간 동안 TRP의 기초 수준보다 높아야 하지만 5시간을 초과하지 않아야 한다.
이러한 문제를 해결하기 위해 종래에는 투과 증진제를 사용한 제형화 및/또는 단백질 분해 효소 억제제와의 공동 투여, 리포솜, 미셀, 자가 미세유화 약물 전달 시스템, 고체 지질 나노입자 및, 고체 매트릭스 나노 또는 미세입자 내 캡슐화를 포함한 다양한 전략이 연구되었다. 또한 펩타이드를 방출하기 위해 장용성 (enteric), 점막접착성 (mucoadhesive) 또는 결장 표적화 코팅 시스템도 도입되었으며, GI의 표적 영역을 대상으로 하는 제제에 침투 증강제 및 기타 첨가제를 포함시켜 대사 저하를 최소화하고자 하는 연구도 진행된 바 있다. 그 뿐만 아니라 Guo 등은 rhPTH(1-34)의 효소적 분해 지연과 랫드에서 상대적 경구 생체이용률을 5.4%로 향상시킨 rhPTH(1-34) 유중수(w/o) 마이크로 에멀젼을 준비한 바 있으며, Emisphere Technologies, Inc.는 투과 증강제로서 N-(5-chlorosalicyloyl)-8-aminocaprylic acid (5-CNAC)을 사용하여 TRP의 경구 흡수를 개선하였는데, 이 시스템은 원숭이의 경구 생체 이용률이 2.1%로 나타났으며 경구 TRP 전달에 대한 임상 평가로 진행되었으나, 경구 TRP-5-CNAC의 개발은 항골다공증 효과와 관련하여 기대에 미치지 못하여 중단되었다.
경구 펩타이드 전달은 장내 침투 촉진제, 즉 펩티다아제뿐만 아니라 대사 저하를 제한하는 전달 접근법의 조합이 필요하다. 혁신적인 제제 전략은 상피 약물 방출을 최적화하여 약물 유입 속도와 범위를 향상시키고, GI 체류 시간을 단축하여 펩티다아제에 대한 노출을 제한하며, 침투 강화 첨가제가 흐름 촉진에 필요한 임계 농도를 달성할 수 있도록 하는 것이 중요하다. 선도적인 투과 증진제 기반 기술은 펩타이드와 담체의 비공유 복합체화에 의해 펩티다아제의 억제를 제공하는 것으로 보이며, 분해를 제한하는 가장 유망한 전략은 투과 증진제를 소수화, 구조적 변형(예: 아미노산 치환 및 N -말단 아미드화) 및 나노 캡슐화하는 것 등을 포함한다.
경구 전달 시스템의 대부분의 투과 증진제는 C10, 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid) 지방산, 아실카르니틴 (acylcarnitines), 아실화 아미노산, 알킬 폴리에톡실레이트 (alkyl polyethoxylates), 글리세릴 폴리에톡실레이트, 채널 형성 펩타이드, 담즙염 (bile salts), 글리세리드 (glycerides), 자당 에스테르 (sucrose esters), 폴리소르베이트 (polysorbates), 엔아민 (enamines) 및 살리실산염 (salicylates)을 포함하는 비교적 순한 계면활성제 기반의 세정제로서, 이러한 투과 증진제들은 tight junctions (TJ)을 열어 세포 주변으로 장 점막을 비특이적으로 교란시키거나 상피 세포막의 무결성을 변경하고 유동성을 증가시켜 세포간을 교란시기 때문에 투과 증진제의 사용을 최소화하면서도 세포 투과를 개선하기 위한 제형이 필요하다.
종래에 테리파라타이드의 투과도 및 생체이용률을 증가시키기 위한 기술들이 개발된 바 있다. 덴마크공개특허 제01643978호에는 통상의 장용성 코팅 등으로 경구 투여 후 2시간 이후 PTH가 방출되도록 하여 위장 내 약물의 분해를 최소화하여 흡수율을 향상시키고자 하였다. 그러나 PTH의 낮은 경구 생체이용률은 위장관 내 약물의 분해뿐만 아니라 약물 분자의 낮은 지질 친화도와 큰 분자량으로 장관막 투과도 자체가 낮은 것에 주로 기인하다. 따라서 일반적인 장용성 경구투여 제형으로는 PTH의 치료학적 효과를 발휘할 수 있는 충분한 경구 생체이용률을 나타내기에 부족하다. 또한, 한국공개특허 제2017-0125793호에는 치료제를 양이온성 접합체와 결합하여 코어 복합체를 제조하고, 담즙산을 음이온 중합체와 공유 결합시킨 후 상기 양이온성 접합체와 음이온성 접합체를 정전기적으로 커플링시킴으로써 위장관 내에서 담즙산 수송체를 통해 환자에 흡수되어 장간순환계로 진입할 수 있도록 하여 환자의 순응도를 향상시키고자 하였다. 그러나 상기 문헌에는 본원발명과 같이 테리파라타이드의 생체이용률을 증가시키기 위하여 알킬글리코사이드 (alkylglycoside)계 계면활성제로서 n-dodecyl-β-D-maltoside를 이용하는 구성은 개시된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 테리파라타이드 (TRP), 라이신 결합 데옥시콜산 (L-lysine-linked deoxycholic acid) 및 데옥시콜산 (deoxycholic acid) 중 하나 이상, 및 알킬글리코사이드계 계면활성제로 이루어진 이온결합 복합체의 경우, TRP의 장막 투과도 및 경구 생체이용률을 향상시킴으로써 골다공증의 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
(비특허 문헌 1) L. Wu, Evaluation of salmon calcitonin (sCT) enteric-coated capsule for enhanced absorption and GI tolerability in rats, Drug Dev Ind Pharm. 36 (2010) 362-370.
(비특허 문헌 2) H.L. Luessen, Mucoadhesive polymers in peroral peptide drug delivery. VI. Carbomer and chitosan improve the intestinal absorption of the peptide drug buserelin in vivo, Pharm Res. 13 (1996) 1668-1672.
(비특허 문헌 3) G. Fetih, Improvement of absorption enhancing effects of n-dodecyl-β-D-maltopyranoside by its colon-specific delivery using chitosan capsules, Int. J. Pharm. 293 (2005) 127-135.
(비특허 문헌 4) S. Maher, Intestinal permeation enhancers for oral peptide delivery, Adv Drug Deliv Rev. 106 (2016) 277-319.
(비특허 문헌 5) L. Guo, Preliminary evaluation of a novel oral delivery system for rhPTH1-34: in vitro and in vivo, Int. J. Pharm. 420 (2011) 172-179.
(비특허 문헌 6) A. Leone-Bay, Oral delivery of biologically active parathyroid hormone, Pharm Res. 18 (2001) 964-970.
(비특허 문헌 7) V. Agarwal, Transport studies of insulin across rat jejunum in the presence of chicken and duck ovomucoids, J Pharm Pharmacol. 53 (2001) 1131-1138.
(비특허 문헌 8) A. Foradori, Modification of the pharmacokinetics of cyclosporine A and metabolites by the concomitant use of Neoral and diltiazem or ketoconazol in stable adult kidney transplants, Transplant Proc. 30 (1998) 1685-1687.
(비특허 문헌 9) H.J. Lee, The effect of enzyme inhibitor and absorption site following [D-ala2, D-leu5] enkephalin oral administration in rats, Biopharm Drug Dispos. 23 (2002) 131-141.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 테리파라타이드의 장막 투과도 및 경구 생체이용률을 향상시킴으로써 골다공증의 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있는 테리파라타이드를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료를 위한 경구용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 있는 테리파라타이드를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료를 위한 경구용 약학적 조성물을 제조하기 위한 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 테리파라타이드 (teriparatide, TRP), 라이신 결합 데옥시콜산 (L-lysine-linked deoxycholic acid) 및 데옥시콜산 (deoxycholic acid) 중 하나 이상, 및 알킬글리코사이드 (alkylglycoside)계 계면활성제로 이루어진 이온결합 복합체를 포함하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물을 제공한다.
인간 부갑상선 호르몬 [rhPTH(1-34); 테리파라타이드(teriparatide, TRP)]은 골다공증을 관리하기 위해 사용되는 약물로서, 현재 테리파라타이드 치료제의 제형이 주사제이기 때문에 약물의 흡수 지연 및 낮은 순응도 등의 문제가 있다. 이에 본 발명자들은 테리파라타이드 치료제의 제형을 경구 제형으로 제조함으로써 환자의 순응도를 증가시키고, 경구용 제제의 약물 투과도를 향상시켜 경구 생체이용률을 증가시키고자 하였다.
본 발명에서의 용어 '이온결합 복합체'는 테리파라타이드의 산성을 띄는 아미노산에 라이신 결합 데옥시콜산이 결합하고, 염기성을 띄는 아미노산에 데옥시콜산이 결합하여 형성된 복합체의 소수성 영역이 알킬글리코사이드계 계면활성제와 상호작용함으로써 복합체가 미셀 구조에 통합된 물질을 의미한다.
테리파라타이드는 펩타이드 계열의 약물로서 펩티다아제에 대한 높은 민감도와 고분자량 및 친수성으로 인한 낮은 막 투과도는 경구 생체이용률을 저하시키는 원인이다. 따라서 테리파라타이드 사슬의 전하 완화를 통해 펩타이드의 친유성을 증가시켜 테리파라타이드의 막 수송을 향상시킴으로써 생체이용률을 개선할 수 있으며, 테리파라타이드를 미셀 구조에 통합함으로써 펩티다아제로부터의 분해를 방지하여 고용량의 약물의 투과도를 증가시킬 수 있다. 테리파라타이드의 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열에는 산성(음전하)인 아스파르트산 (Aspartic acid) 및 글루탐산 (Glutamic acid)이 총 4개 존재하고, 염기성(양전하)인 아르기닌 (Arginine), 히스티딘 (Histidine) 및 라이신 (Lysine)이 총 8개 존재한다. 따라서 본 발명에서는 상기 산성 아미노산을 양전하를 띄는 라이신 결합 데옥시콜산과 결합시키고, 상기 염기성 아미노산을 음전하를 띄는 데옥시콜산과 결합시킴으로써 테리파라타이드 사슬의 전하를 완화시켰으며, 테리파라타이드, 라이신 결합 데옥시콜산 및 데옥시콜산 (TRP/LDA/DA) 복합체를 알킬글리코사이드계 계면활성제인 β-D-말토사이드 (n-dodecyl-β-D-maltoside, DM)에 통합하여 미셀 구조를 형성하도록 함으로써 테리파라타이드를 펩티다아제로부터 보호하는 것과 더불어 막 수송을 향상시켰다.
본 발명의 경구용 약학적 조성물에 있어서, 상기 알킬글리코사이드계 계면활성제는 데실글루코사이드 (Decyl glucoside), 아라키딜글루코사이드 (Arachidyl glucoside), 부틸글루코사이드 (Butyl glucoside), C10-16 알킬글루코사이드 (C10-16 Alkyl glucoside), C12-18 알킬글루코사이드 (C12-18 Alkyl glucoside), C12-20 알킬글루코사이드 (C12-20 Alkyl glucoside), C20-22 알킬글루코사이드 (C20-22 Alkyl glucoside), 카프릴릴/카프릴글루코사이드 (Caprylyl/capryl glucoside), 카프릴릴 글루코사이드 (Caprylyl glucoside) 세테아릴글루코사이드 (Cetearyl glucoside), 코코글루코사이드 (Coco-glucoside), 에틸글루코사이드 (Ethyl glucoside), 헥사데실 D-글루코사이드 (Hexadecyl D-glucoside), 이소스테아릴글루코사이드 (Isostearyl glucoside), 라우릴글루코사이드 (Lauryl glucoside), 미리스틸글루코사이드 (Myristyl glucoside), 옥타데실 D-글루코사이드 (Octadecyl D-glucoside), 옥틸도데실 글루코사이드 (Octyldodecyl glucoside), 및 운데실글루코사이드 (Undecyl glucoside)로 구성된 군으로부터 선택되는 어떠한 알킬글리코사이드계 계면활성제도 이용 가능하나, 바람직하게는 계면활성제는 n-도데실-β-D-말토사이드 (n-dodecyl-β-D-maltoside) 및 n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드 (n-Octyl-β-D-glucopyranoside) 중 하나 이상, 더욱 바람직하게는 n-도데실-β-D-말토사이드인 것을 특징으로 한다.
종래에 약물의 투과성을 증진시키기 위해 사용된 폴리에틸렌옥사이드 (Polyoxyethylene)계 계면활성제는 폴리에틸렌옥사이드 모이어티에 포함된 에테르 결합 및 불포화 알킬 사슬이 자발적으로 산화되어 과산화물 (peroxides), 에폭시산 (epoxy acid) 및 알데하이드 (aldehyde)와 같은 화학적 반응기 (chemically reactive species) 생성으로 인해 제조 및 보관 중 펩타이드 약물 및 단백질 의약품을 분해 또는 변성시키는 문제가 빈번히 발생한다. 이에, 본 발명자들은 펩타이드 약물 및 단백질 의약품을 손상 및 변성시키지 않으면서도 약물의 투과성을 증진시킬 수 있는 계면활성제로서 알킬글리코사이드계 계면활성제를 선택하여 본 발명의 경구용 약학적 조성물로서 이용하고자 하였다.
본 발명의 경구용 약학적 조성물에 있어서, 상기 라이신 결합 데옥시콜산은 테리파라타이드 1몰에 대하여 1 내지 7몰로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 5몰로, 가장 바람직하게는 5몰로 포함할 수 있다. 라이신 결합 데옥시콜산이 1몰 미만으로 포함될 경우 테리파라타이드 1분자에 1개 미만의 라이신 결합 데옥시콜산이 결합되어 본 발명에서 구현하고자 하는 복합체의 형성이 이루어지지 않아 장관막 투과도 증진 효과가 미흡하며, 7몰을 초과할 경우 테리파라타이드의 비가역적 침전 현상이 나타날 수 있다.
본 발명의 경구용 약학적 조성물에 있어서, 상기 데옥시콜산은 테리파라타이드 1몰에 대하여 1 내지 15몰로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 15몰로, 가장 바람직하게는 7몰로 포함될 수 있다. 데옥시콜산이 1몰 미만으로 포함될 경우 테리파라타이드 1분자에 1개 미만의 데옥시콜산이 결합되어 본 발명에서 구현하고자 하는 복합체의 형성이 이루어지지 않아 장관막 투과도 증진 효과가 미흡하며, 15몰을 초과할 경우 테리파라타이드의 비가역적 침전 현상이 발생하여 약물의 함량이 낮아지는 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 경구용 약학적 조성물에 있어서, 상기 알킬글리코사이드계 계면활성제는 테리파라타이드에 대하여 1:1 내지 1:50 중량비로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1:5 내지 1:20 중량비로, 가장 바람직하게는 1:15 중량비로 포함될 수 있다. 알킬글리코사이드계 계면활성제가 1:1 중량비 미만일 경우 테리파라타이드의 투과도가 개선되기 어려우며, 1:50 초과할 경우 위장관 점막 자극 등의 부작용을 야기할 수 있다.
본 발명에서는 테리파라타이드, 라이신 결합 데옥시콜산 (L-lysine-linked deoxycholic acid) 및 데옥시콜산 (deoxycholic acid) 중 하나 이상과 알킬글리코사이드계 계면활성제의 다양한 조합 및 비율에 따른 이온결합 복합체의 투과도 개선 및 테리파라타이드의 경구 생체이용률 향상 효과를 다양한 실험을 통해 확인하였다.
구체적으로, 테리파라타이드 단독(비교예 1)과 라이신 결합 데옥시콜산 또는 데옥시콜산과 결합시킨 테리파라타이드(각각 비교예 2, 3)의 시험관 내 인공 장막 투과도를 비교하였을 때, 복합체 형성에 의한 테리파라타이드의 친유성 증가로 인해 투과도가 향상됨을 확인하였으며, 이러한 결과로부터 펩타이드 사슬의 전하 완화가 수동적 확산을 통한 테리파라타이드의 막 수송을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한, 상기 알킬글리코사이드계 계면활성제에 통합된 테리파라타이드(비교예 6, 7)는 알킬글리코사이드계 계면활성제에 통합되지 않은 경우(비교예 1)보다 투과도가 현저히 증가함을 확인하였으며, 이러한 결과로부터 알킬글리코사이드계 계면활성제에 의해 친유성이 더 향상되어 테리파라타이드의 투과를 최대로 유도할 수 있음을 알 수 있다(실험예 2 참조). 이에 따라, 본 발명자들은 테리파라타이드, 라이신 결합 데옥시콜산 및 데옥시콜산 복합체의 향상된 투과도를 위하여 알킬글리코사이드계 계면활성제를 추가로 포함하는 구성을 도출하였다.
또한, 본 발명에 따른 이온결합 복합체(실시예 1, TRP/LDA/DA-DM)는 알킬글리코사이드계 계면활성제를 포함하지 않는 복합체(실시예 5, TRP/LDA/DA)보다 더 높은 세포 흡수를 나타내는 것을 확인하였으며(실험예 3 참조), 이러한 결과를 통해 알킬글리코사이드계 계면활성제가 장벽 특성을 변화시키고, ASBT 매개 수송, clathrin/caveola 매개 endocytosis 및/또는 macropinocytosis를 포함한 추가 침투 메커니즘에 관여함으로써 약물 투과도를 향상시킬 가능성에 대하여 추가 확인하였다. 막 침투 메커니즘 중 ASBT 매개 수송에 의한 세포 침투를 확인한 결과, 본 발명에 따른 이온결합 복합체(실시예 1, TRP/LDA/DA-DM)의 세포 흡수는 ASBT 비발현 세포에 비해 ASBT 발현 세포에서 현저히 증가하였으며(실험예 3 참조), 이러한 결과는 본 발명에 따른 이온결합 복합체가 ASBT 매개 수송에 관여함으로써 약물 투과도에 대한 상승 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
또한, 본 발명에 따른 이온결합 복합체(실시예 1, TRP/LDA/DA-DM)가 ASBT 매개 수송뿐만 아니라 다양한 세포간 흡수 경로를 통해 약물 투과도를 향상시킴을 확인하기 위하여 테리파라타이드의 수송 메커니즘을 확인한 결과, 클라트린-매개엔도사이티스(clathrin-mediated endocytosis), 카볼라-매개-내세포증(caveola-mediated endocytosis), 거대음세포증(macropinocytosis) 및 ER/Golgi 경로를 이용하는 것을 확인하였으며(실험예 4 참조), 이러한 결과는 본 발명에 따른 이온결합 복합체는 다양한 경로를 통한 막 이동이 가능하므로, 약물 투과도에 대한 상승 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
추가적으로, 본 발명에 따른 이온결합 복합체(실시예 1, TRP/LDA/DA-DM)가 체내에서도 체외에서와 동일한 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 마우스에서의 약물 경구 흡수 효과를 확인하였다. 그 결과, 테리파라타이드 단독의 경구 투여와 비교하였을 때 경구 생체이용률이 현저히 증가하는 것을 확인하였으며(실험예 6), 이러한 결과는 마우스에서의 장막 투과도 및 테리파라타이드의 흡수는 테리파라타이드, 라이신 결합 데옥시콜산 및 데옥시콜산 복합체가 알킬글리코사이드계 계면활성제와의 상호작용으로 인해 미셀 구조에 통합됨으로써 이루어질 수 있음을 시사한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 테리파라타이드 용액, 데옥시콜산 용액, 라이신 결합 데옥시콜산 용액 및 알킬글리코사이드계 계면활성제 용액을 각각 준비하는 제1 단계, 상기 제1 단계에서 준비한 테리파라타이드 용액에 알킬글리코사이드계 계면활성제 용액을 혼합하는 제2단계, 상기 제2 단계에 혼합 용액에 라이신 결합 데옥시콜산 용액을 혼합하는 제3 단계, 및 상기 제3 단계에 혼합 용액에 데옥시콜산 용액을 혼합하는 제4 단계를 포함하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법의 제3 단계 및 제4 단계에서의 라이신 결합 데옥시콜산 용액과 데옥시콜산 용액을 첨가하는 순서는 반드시 라이신 결합 데옥시콜산 용액 첨가 후 데옥시콜산 용액을 첨가해야 하는 것은 아니며, 제조 과정에서 편의에 따라 두 성분의 혼합 순서의 변경이 가능하나 상대적으로 많은 몰비율로 첨가되는 성분을 나중에 첨가하도록 함으로써 테리파라타이드와 라이신 결합 데옥시콜산 및 데옥시콜산의 결합이 충분히 이루어질 수 있도록 하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 경구용 약학적 조성물의 제조방법에 있어서, 상기 테리파라타이드 용액, 데옥시콜산 용액, 라이신 결합 데옥시콜산 용액의 pH는 3 내지 8이며, 바람직하게는 pH4이다. 테리파라타이드는 pH 4의 조건에서 가장 안정함과 동시에 가장 많은 양전하와 음전하를 나타내기 때문에 라이신 결합 데옥시콜산 및 데옥시콜산의 이온결합 몰비율을 최대화할 수 있으므로 상기 pH의 범위가 가장 적합하며, 따라서 상기 pH 범위를 벗어날 경우 테리파라타이드와 데옥시콜산 및 라이신 결합 데옥시콜산의 이온 결합이 최대로 일어나기 어렵다.
본 발명의 경구용 약학적 조성물의 제조방법에 있어서, 상기 제2 단계에서 알킬글리코사이드계 계면활성제는 테리파라타이드에 대하여 1:1 내지 1:50 중량비로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1:5 내지 1:20 중량비로, 가장 바람직하게는 1:15 중량비로 포함될 수 있다. 알킬글리코사이드계 계면활성제가 1:1 중량비 미만일 경우 테리파라타이드의 투과도가 개선되기 어려우며, 1:50 초과할 경우 위장관 점막 자극 등의 부작용을 야기할 수 있다.
본 발명의 경구용 약학적 조성물의 제조방법에 있어서, 상기 제3 단계에서 라이신 결합 데옥시콜산은 테리파라타이드 1몰에 대하여 1 내지 7몰로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 5몰로, 가장 바람직하게는 5몰로 포함할 수 있다. 라이신 결합 데옥시콜산이 1몰 미만으로 포함될 경우 테리파라타이드 1분자에 1개 미만의 라이신 결합 데옥시콜산이 결합되어 본 발명에서 구현하고자 하는 복합체의 형성이 이루어지지 않아 장관막 투과도 증진 효과가 미흡하며, 7몰을 초과할 경우 테리파라타이드의 비가역적 침전 현상이 나타날 수 있다.
본 발명의 경구용 약학적 조성물의 제조방법에 있어서, 상기 제4 단계에서 데옥시콜산은 테리파라타이드 1몰에 대하여 1 내지 15몰로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 15몰로, 가장 바람직하게는 7몰로 포함될 수 있다. 데옥시콜산이 1몰 미만으로 포함될 경우 테리파라타이드 1분자에 1개 미만의 데옥시콜산이 결합되어 본 발명에서 구현하고자 하는 복합체의 형성이 이루어지지 않아 장관막 투과도 증진 효과가 미흡하며, 15몰을 초과할 경우 테리파라타이드의 비가역적 침전 현상이 발생하여 약물의 함량이 낮아지는 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 경구용 약학적 조성물의 제조방법에 있어서, 제4 단계의 혼합물에 만니톨 및 수크로오스를 첨가한 후, 분무건조, 동결건조 등의 방법을 이용한 건조 단계를 더 포함한다.
상기 제조방법에 따라 제조된 이온결합 복합체는 산제, 과립제, 펠렛, 정제 및 캡슐제로 이루어진 군으로부터 선택된 경구용 고형 제제의 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 캡슐제 형태의 본 발명의 약학 조성물은 건조한 이온결합 복합체에 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 혼합하여 얻어진 가루 또는 과립을 캡슐에 충진함으로써 제조될 수 있으며, 정제 또는 펠렛 형태의 본 발명의 약학 조성물은 건조한 이온결합 복합체에 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 혼합하여 얻어진 가루 또는 과립을 압착함으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 이온결합 복합체를 산제, 과립제, 캡슐제, 펠렛 및 정제 형태로 제조하기 위하여 사용되는 결합제로는 종래에 산제, 과립, 캡슐, 펠렛, 정제를 제조하기 위해 이용된 어떠한 결합제도 이용 가능하며, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone), 젤라틴 (gelatin), 전분 (starch), 수크로오스 (sucrose), 메틸셀룰로오스 (methyl cellulose), 에틸셀룰로오스 (ethyl cellulose) 하이드록시프로필셀룰로오스 (hydroxypropylcellulose), 하이드록시프로필알킬셀룰로오스 (hydroxypropylalkylcellulose)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 붕해제로는 종래에 과립, 캡슐, 정제를 제조하기 위해 이용된 어떠한 붕해제도 이용 가능하며, 예컨대, 가교된 폴리비닐피롤리돈 (Polyvinyl pyrrolidone), 가교된 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 (sodium carboxymethyl cellulose), 가교된 칼슘 카르복시메틸셀룰로오스 (calcium carboxymethyl cellulose), 가교된 카르복시메틸셀룰로오스 (carboxymethyl cellulose), 나트륨 전분 글리콜레이트 (sodium starch glycolate), 카르복시메틸 녹말 (carboxymethyl starch), 나트륨 카르복시메틸 녹말 (sodium carboxymethyl starch), 칼륨 메타크릴레이트-다이비닐 벤젠 공중합체 (potassium methacrylate-divinyl benene copolymer), 아밀로오스, 가교된 아밀로오스 (amylose), 녹말 유도체 (starch derivative), 미결정셀룰로오스 (microcrystalline cellulose), 셀룰로오스 유도체 (cellulose derivative), 시클로덱스트린 (cyclodextrin) 및 덱스트린 유도체 (cyclodextrin derivative)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 희석제로는 종래에 산제, 과립, 캡슐, 펠렛, 정제를 제조하기 위해 이용된 어떠한 희석제도 이용 가능하며, 예컨대, 락토오스 (lactose), 덱스트린 (dextrin), 전분 (starch), 미결정셀룰로오스 (microcrystalline cellulose), 인산수소칼슘 (calcium Hydrogen Phosphate), 무수인산수소칼슘, 탄산칼슘 (calcium carbonate), 당류 (saccharide)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 활택제는 종래에 산제, 과립, 캡슐, 펠렛, 정제를 제조하기 위해 이용된 어떠한 활택제도 이용가능하며, 예컨대, 스테아린산 (stearic acid), 스테아린산 아연 (stearic acid zinc), 스테아린산 마그네슘 (stearic acid magnesium), 스테아린산 칼슘 (Stearic acid calcium), 활석 (talc)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 경구용 약학적 조성물의 제조방법은 상기에서 제조된 과립제, 캡슐제, 정제 및 펠렛제를 장용성 물질로 코팅할 수 있으며, 과립, 캡슐, 정제, 펠렛의 표면에 코팅층을 형성시켜 경구 복용 후 위장 내 산성조건에서 약물의 방출을 억제함으로써 약물의 분해를 최소화할 수 있다.
상기 장용성 물질은 일반적으로 장용성 제제를 제조하기 위해 일반적으로 이용되는 어떠한 물질도 이용 가능하며, 예컨대, 유드라짓 (Eudragit; 메타크릴산-에틸 아크릴레이트 공중합체), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트 (hydroxypropyl methylcellulose Phthalate), 아세틸호박산 하이드록시프로필 메칠셀룰로오스 (acetylsuccinate hydroxyl propyl methylcellulose), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 (cellulose acetate phthalates), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (polyvinyl acetate phthalates), 카르복시 메틸 에틸 셀룰로오스 (carboxy methyl ethyl cellulose) 및 셸락(shellac)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 장용성 코팅층에는 가소제가 더 포함될 수 있으며, 그 밖에 색소, 항산화제, 활석, 이산화티탄, 향미제 등이 더 포함될 수 있다. 상기 가소제로서는 피마자유, 지방산, 치환된 트리글리세라이드 및 글리세라이드, 분자량이 300 내지 50,000인 폴리에틸렌글리콜 및 이의 유도체로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 사용할 수 있다. 상기 장용성 코팅층을 제조하기 위한 코팅액의 용매로서는 물 또는 유기용매가 사용될 수 있으며, 상기 유기용매로서는 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 그 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 테리파라타이드를 포함하는 이온결합 복합체는 테리파라타이드가 미셀 구조에 통합되어 위장관에서 펩티다아제에 의한 분해를 억제함으로써 약물을 고용량으로 유지할 수 있고, 다양한 막 통과 흡수 경로로의 이용이 가능하여 약물의 투과도를 향상시킬 수 있으므로, 최종적으로는 약물의 경구 생체이용률을 증가시켜 골다공증을 예방 또는 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 알킬글리코사이드계 계면활성제인 n-dodecyl-β-d-maltoside (DM) 존재 하에 deoxycholic acid (DA) 및 l-lysine-linked DA (LDA) (TRP/LDA/DA)와 정전기적으로 복합화된 teriparatide (TRP)의 고체 경구 제형의 제조를 보여주는 개략도이다.
도 2는 TRP(1:5:7)-15의 투과전자현미경 이미지이다.
도 3은 TRP와 수용액 상의 TRP 농도가 10 μM인 다양한 복합 비율(TRP:LDA:DA)로 구성된 TRP/LDA/DA-DM의 Circular dichroism (CD) 스펙트럼 분석 결과이다.
도 4는 Caco-2 세포에서 F-TRP(1:0:0), F-TRP(1:5:0), F-TRP(1:0:2)-15, F-TRP(1:5:7)-15의 세포 흡수를 보여주는 공초점 레이저 주사 현미경 이미지이다(스케일 바, 20 μm)
도 5는 Caco-2 세포를 F-TRP(1:0:0), F-TRP(1:5:0), F-TRP(1:0:2), F-TRP(1:5:2), F-TRP(1:5:2), F-TRP(1:5:7-15)로 처리한 후 1시간 동안 F-TRP의 세포 흡수를 측정한 결과이다. 각 값은 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. *** p < 0.001 compared to F-TRP(1:0:0); ## p < 0.01, ### p < 0.001 compared to F-TRP(1:5:0); $$ p < 0.01, $$$ p < 0.001 compared to F-TRP(1:0:2); @@@ p < 0.001 compared to F-TRP(1:5:2).
도 6 및 도 7은 형질주입되지 않은 MDCK 세포(도 6) 및 ASBT-형질주입된 MDCK 세포(도 7)에서 F-TRP(1:0:0), F-TRP(1:5:0), TRP(1:0:2), F-TRP(1:5:2)-15 및 F-TRP(1:5:7)-15의 세포 흡수에 대한 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지이다(스케일 바, 20 μm).
도 8은 F-TRP(1:0:0), F-TRP(1:5:0), F-TRP(1:0:2), F-TRP(1:5:2)-15, F-TRP(1:5:7)-15로 처리한 후 1시간 동안 ASBT 형질주입/비형질주입 MDCK 세포에 의한 F-TRP의 세포흡수 결과이다. 각 값은 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 compared to the uptake in ASBT-non-transfected MDCK cells treated with the same material.
도 9는 트랜스사이토시스 (transcytosis) 기전의 다양한 수송 억제제와 함께 인큐베이션한 후 Caco-2/HT29-MTX-E12 세포 단층에 걸친 TRP(1:5:7)-15의 상대 겉보기 투과도(P app ) 값이다. 각 값은 평균 ± SD를 나타낸다(n = 4). ** p < 0.01, *** p < 0.001, compared to the P app of TRP(1:5:7)-15 in the absence of all inhibitors (untreated control).
도 10은 유리 테리파라타이드[TRP(1:0:0)]; DM 상의 TRP[TRP(1:0:0)-15]; 및 TRP(1:0:0)-15와 DA 및 LDA의 복합체 [TRP(1:5:2)-15 및 (1:5:7)-15]를 UMR-106 세포와 함께 배양 후 세포 독성을 확인한 결과이다. 각 값은 평균 ± SD(n = 6)를 나타낸다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 compared to TRP (1:0:0) at a concentration equivalent to that of TRP; # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 compared to TRP (1:0:0)-15 at a concentration equivalent to that of TRP; $$ p < 0.01, $$$ p < 0.001 compared to TRP (1:5:2)-15 at a concentration equivalent to that of TRP.
도 11은 유리 테리파라타이드[TRP(1:0:0)]; DM 상의 TRP[TRP(1:0:0)-15]; 및 TRP(1:0:0)-15와 DA 및 LDA의 복합체 [TRP(1:5:2)-15 및 (1:5:7)-15]를 UMR-106 세포와 함게 배양 후 cAMP의 방출을 확인한 결과이다. 각 값은 평균 ± SD(n = 6)를 나타낸다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 compared to TRP (1:0:0) at a concentration equivalent to that of TRP; # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 compared to TRP (1:0:0)-15 at a concentration equivalent to that of TRP; $$ p < 0.01, $$$ p < 0.001 compared to TRP (1:5:2)-15 at a concentration equivalent to that of TRP.
도 12는 0.04 mg/kg TRP(TRP-SC)의 단일 피하 주사(SC), 1.6 mg/kg TRP [TRP-Oral (1.6)] 또는 1.6 mg/kg에 해당하는 TRP로서 TRP(1:5:7)-15[TRP(1:5:7)-15 (1.6)]를 마우스에 투여한 후의 테리파라타이드의 평균 혈장 농도-시간 프로파일이다. 값은 평균 ± SD를 나타낸다(각 그룹에 대해 n = 5).
도 13은 ASBT 촉진 수송 및 장 상피를 통한 TRP(1:5:7)-15의 비특이적 트랜스사이토시스를 통한 예측된 특정 세포 내 신호전달의 개략도이다.
도 14 내지 도 19는 정상 무처리 마우스[대조군(정상)], 덱사메타손(DEX) 유도 골다공증 마우스[대조군(DEX)], 또는 4주 동안 0.02mg/kg의 테리파라타이드(TRP; TRP-SC(0.02)의 1일 1회 피하(SC) 주입으로 공동 처리, 또는 4주 동안 0.4mg/kg TRP[TRP-구강(0.4)], TRP(1:5:7)-15로서 0.4 mg/kg TRP [TRP(1:5:7)-15 (0.4)] 또는 TRP(1:5:7)-15, 0.8 mg/kg TRP [TRP(1:5:7)-15 (0.8)]를 1일 1회 경구 투여한 마우스에서 적출된 대퇴골의 미세 컴퓨터 단층촬영(micro-CT)을 통해 다양한 파라미터를 측정한 결과이다. 골밀도(BMD, 도 14), 골부피분획(BV/TV, 도 15), 골격 두께(Tb.Th, 도 16), 골격 분리(Tb.Sp, 도 17), 골격수(Tb.N, 도 18) 및 구조 모델 지수(SMI, 도 19). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 compared to the control (normal); # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 compared to the control (DEX); $ p < 0.05, $$$ p < 0.001 compared to TRP-SC (0.02); @@ p < 0.01, @@@ p < 0.001 compared to TRP-Oral (0.4).
도 20 대조군(정상) 또는 덱사메타손(DEX) 유도 골다공증 마우스[대조군(DEX)] 또는 4주 동안 TRP-SC(0.02), TRP-경구(0.4), TRP(1:5:7)-15(0.4) 또는 TRP(1:5:7)-15(0.8)와 동시 처리했을 때의 마이크로 컴퓨터 단층촬영(마이크로 CT) 이미지이다.
도 21은 대조군(정상) 또는 덱사메타손(DEX) 유도 골다공증 마우스[대조군(DEX)] 또는 4주 동안 TRP-SC(0.02), TRP-경구(0.4), TRP(1:5:7)-15(0.4) 또는 TRP(1:5:7)-15(0.8)와 동시 처리했을 때의 원위 대퇴골(distal femora)의 종단면 H&E 염색 조직학적 이미지이다.
도 22 내지 도 25는 처리되지 않은 마우스[대조군(정상)] 또는 덱사메타손(DEX)[대조군(DEX)]으로 처리되거나 0.02mg/kg TRP [TRP; TRP-SC(0.02)] 또는 0.4mg/kg TRP[TRP-경구(0.4)], TRP(1:5:7)-15로서 0.4mg/kg TRP[TRP(1: 5:7)-15(0.4)] 또는 TRP(1:5:7)-15 0.8 mg/kg TRP [TRP(1:5:7)-15(0.8)]를 처리한 경우에서의 골 형성 및 혈청 흡수 마커를 분석한 결과이다(도 22, 오스테오칼신; 도 23, 프로콜라겐 I N-말단 프로-펩티드(PINP); 도24, I형 콜라겐의 C-말단 가교 텔로펩티드(CTx); 및 도 25, 처리 후 28일째의 칼슘 수준).
도 2는 TRP(1:5:7)-15의 투과전자현미경 이미지이다.
도 3은 TRP와 수용액 상의 TRP 농도가 10 μM인 다양한 복합 비율(TRP:LDA:DA)로 구성된 TRP/LDA/DA-DM의 Circular dichroism (CD) 스펙트럼 분석 결과이다.
도 4는 Caco-2 세포에서 F-TRP(1:0:0), F-TRP(1:5:0), F-TRP(1:0:2)-15, F-TRP(1:5:7)-15의 세포 흡수를 보여주는 공초점 레이저 주사 현미경 이미지이다(스케일 바, 20 μm)
도 5는 Caco-2 세포를 F-TRP(1:0:0), F-TRP(1:5:0), F-TRP(1:0:2), F-TRP(1:5:2), F-TRP(1:5:2), F-TRP(1:5:7-15)로 처리한 후 1시간 동안 F-TRP의 세포 흡수를 측정한 결과이다. 각 값은 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. *** p < 0.001 compared to F-TRP(1:0:0); ## p < 0.01, ### p < 0.001 compared to F-TRP(1:5:0); $$ p < 0.01, $$$ p < 0.001 compared to F-TRP(1:0:2); @@@ p < 0.001 compared to F-TRP(1:5:2).
도 6 및 도 7은 형질주입되지 않은 MDCK 세포(도 6) 및 ASBT-형질주입된 MDCK 세포(도 7)에서 F-TRP(1:0:0), F-TRP(1:5:0), TRP(1:0:2), F-TRP(1:5:2)-15 및 F-TRP(1:5:7)-15의 세포 흡수에 대한 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지이다(스케일 바, 20 μm).
도 8은 F-TRP(1:0:0), F-TRP(1:5:0), F-TRP(1:0:2), F-TRP(1:5:2)-15, F-TRP(1:5:7)-15로 처리한 후 1시간 동안 ASBT 형질주입/비형질주입 MDCK 세포에 의한 F-TRP의 세포흡수 결과이다. 각 값은 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 compared to the uptake in ASBT-non-transfected MDCK cells treated with the same material.
도 9는 트랜스사이토시스 (transcytosis) 기전의 다양한 수송 억제제와 함께 인큐베이션한 후 Caco-2/HT29-MTX-E12 세포 단층에 걸친 TRP(1:5:7)-15의 상대 겉보기 투과도(P app ) 값이다. 각 값은 평균 ± SD를 나타낸다(n = 4). ** p < 0.01, *** p < 0.001, compared to the P app of TRP(1:5:7)-15 in the absence of all inhibitors (untreated control).
도 10은 유리 테리파라타이드[TRP(1:0:0)]; DM 상의 TRP[TRP(1:0:0)-15]; 및 TRP(1:0:0)-15와 DA 및 LDA의 복합체 [TRP(1:5:2)-15 및 (1:5:7)-15]를 UMR-106 세포와 함께 배양 후 세포 독성을 확인한 결과이다. 각 값은 평균 ± SD(n = 6)를 나타낸다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 compared to TRP (1:0:0) at a concentration equivalent to that of TRP; # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 compared to TRP (1:0:0)-15 at a concentration equivalent to that of TRP; $$ p < 0.01, $$$ p < 0.001 compared to TRP (1:5:2)-15 at a concentration equivalent to that of TRP.
도 11은 유리 테리파라타이드[TRP(1:0:0)]; DM 상의 TRP[TRP(1:0:0)-15]; 및 TRP(1:0:0)-15와 DA 및 LDA의 복합체 [TRP(1:5:2)-15 및 (1:5:7)-15]를 UMR-106 세포와 함게 배양 후 cAMP의 방출을 확인한 결과이다. 각 값은 평균 ± SD(n = 6)를 나타낸다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 compared to TRP (1:0:0) at a concentration equivalent to that of TRP; # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 compared to TRP (1:0:0)-15 at a concentration equivalent to that of TRP; $$ p < 0.01, $$$ p < 0.001 compared to TRP (1:5:2)-15 at a concentration equivalent to that of TRP.
도 12는 0.04 mg/kg TRP(TRP-SC)의 단일 피하 주사(SC), 1.6 mg/kg TRP [TRP-Oral (1.6)] 또는 1.6 mg/kg에 해당하는 TRP로서 TRP(1:5:7)-15[TRP(1:5:7)-15 (1.6)]를 마우스에 투여한 후의 테리파라타이드의 평균 혈장 농도-시간 프로파일이다. 값은 평균 ± SD를 나타낸다(각 그룹에 대해 n = 5).
도 13은 ASBT 촉진 수송 및 장 상피를 통한 TRP(1:5:7)-15의 비특이적 트랜스사이토시스를 통한 예측된 특정 세포 내 신호전달의 개략도이다.
도 14 내지 도 19는 정상 무처리 마우스[대조군(정상)], 덱사메타손(DEX) 유도 골다공증 마우스[대조군(DEX)], 또는 4주 동안 0.02mg/kg의 테리파라타이드(TRP; TRP-SC(0.02)의 1일 1회 피하(SC) 주입으로 공동 처리, 또는 4주 동안 0.4mg/kg TRP[TRP-구강(0.4)], TRP(1:5:7)-15로서 0.4 mg/kg TRP [TRP(1:5:7)-15 (0.4)] 또는 TRP(1:5:7)-15, 0.8 mg/kg TRP [TRP(1:5:7)-15 (0.8)]를 1일 1회 경구 투여한 마우스에서 적출된 대퇴골의 미세 컴퓨터 단층촬영(micro-CT)을 통해 다양한 파라미터를 측정한 결과이다. 골밀도(BMD, 도 14), 골부피분획(BV/TV, 도 15), 골격 두께(Tb.Th, 도 16), 골격 분리(Tb.Sp, 도 17), 골격수(Tb.N, 도 18) 및 구조 모델 지수(SMI, 도 19). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 compared to the control (normal); # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 compared to the control (DEX); $ p < 0.05, $$$ p < 0.001 compared to TRP-SC (0.02); @@ p < 0.01, @@@ p < 0.001 compared to TRP-Oral (0.4).
도 20 대조군(정상) 또는 덱사메타손(DEX) 유도 골다공증 마우스[대조군(DEX)] 또는 4주 동안 TRP-SC(0.02), TRP-경구(0.4), TRP(1:5:7)-15(0.4) 또는 TRP(1:5:7)-15(0.8)와 동시 처리했을 때의 마이크로 컴퓨터 단층촬영(마이크로 CT) 이미지이다.
도 21은 대조군(정상) 또는 덱사메타손(DEX) 유도 골다공증 마우스[대조군(DEX)] 또는 4주 동안 TRP-SC(0.02), TRP-경구(0.4), TRP(1:5:7)-15(0.4) 또는 TRP(1:5:7)-15(0.8)와 동시 처리했을 때의 원위 대퇴골(distal femora)의 종단면 H&E 염색 조직학적 이미지이다.
도 22 내지 도 25는 처리되지 않은 마우스[대조군(정상)] 또는 덱사메타손(DEX)[대조군(DEX)]으로 처리되거나 0.02mg/kg TRP [TRP; TRP-SC(0.02)] 또는 0.4mg/kg TRP[TRP-경구(0.4)], TRP(1:5:7)-15로서 0.4mg/kg TRP[TRP(1: 5:7)-15(0.4)] 또는 TRP(1:5:7)-15 0.8 mg/kg TRP [TRP(1:5:7)-15(0.8)]를 처리한 경우에서의 골 형성 및 혈청 흡수 마커를 분석한 결과이다(도 22, 오스테오칼신; 도 23, 프로콜라겐 I N-말단 프로-펩티드(PINP); 도24, I형 콜라겐의 C-말단 가교 텔로펩티드(CTx); 및 도 25, 처리 후 28일째의 칼슘 수준).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
준비예 1: 재료
인간 PTH(1-34) 아세테이트(Human PTH(1-34) acetate; TRP)는 PolyPeptide Laboratories, Inc.(Torrance, CA, USA)에서 구입하였다. 데옥시콜산 (deoxycholic acid; DA), 소듐데옥시콜레이트 (sodium deoxycholate; NaDA), n-도데실-β-D-말토사이드 (n-dodecyl-β-D-maltoside; DM), 수크로오스 (sucrose), 만니톨 (mannitol), 클로르프로마진 (chlorpromazine), 메틸-β-사이클로덱스트린 (methyl-β-cyclodextrin; MBCD), 브레펠딘 A (brefeldin A), 제니스테인 (genistein), 악티노마이신 D (actinomycin D; Act D), 사이클로스포린 A (cyclosporine A; Cys A) 및 클로파지민 (clofazimine; CFZ)은 Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스)에서 구입하였다. HPLC 및 UPLC-MS/MS 분석용 용매는 Merck Group(Darmstadt, Germany) 및 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입하였다.
준비예 2: 실험 동물
Sprague-Dawley (SD) 마우스(수컷, 6-7주령, 200-250g) 및 C57LB/6 마우스(암컷, 8-9주령, 20-25g)는 G-bio(광주, 대한민국)에서 구입하였다. 윤리적 승인은 목포대학교 동물보호 및 이용위원회(대한민국 전남, 승인 번호 MNU-IACUC-2021-006 및 MNU-IACUC-2021-018)로부터 받았다. 모든 동물 실험은 국립보건원 실험동물 관리 및 사용 지침과 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 수행되었다.
실시예 및 비교예: TRP/LDA/DA-DM 이온 복합체의 제조
구강 투과 증진제인 LDA는 양전하를 띤 L-라이신과 DA를 접합시켜 합성하였다. 다음으로, 1% 아세트산을 첨가하여 pH 4.0으로 조정된 물에 TRP를 1 mg/mL의 농도로 용해시켰다. LDA 및 NaDA를 각각 2.78 mg/mL 및 2.82 mg/mL의 농도로 물(1% 아세트산을 사용하여 pH 4.0로 조정)에 각각 용해시켰다. 그 다음, 1mL의 TRP 용액(1mg/mL)을 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 및 1:5의 몰비로 LDA와 정전기적으로 복합화(TRP/LDA)한 다음, NaDA 용액을 첨가하여 TRP와 DA 사이의 정전기적 복합체를 각각 1:1, 1:2, 1:5, 1:7 및 1:14의 몰비로 형성하였다. 상기 복합체 형성 결과, TRP/DA 몰비 > 1:2에서는 TRP가 응집 및 침전되었다. 이에, 복합체 형성 전에 알킬글리코사이드계 계면활성제인 DM을 TRP:DM의 중량비가 1:1 내지 1:15가 되도록 TRP 용액에 도입하였다. DM의 부재 및 존재 하에 제조한 이온 복합체(TRP/LDA/DA-DM)를 25mg의 만니톨과 5mg의 수크로오스를 포함하는 1mL의 아세트산나트륨 완충 용액(pH 4.0)을 제형에 첨가하고 최종 혼합물을 동결건조하여 고체 분말을 얻었다. 구체적인 혼합 비율은 및 수율은 표 1에 나타내었다.
| 구성 비율 | TRP (mg) | LDA (mg) | DA (mg) | DM (mg) | Mannitol (mg) | Sucrose (mg) | Total (mg) | |
| 실시예 1 | TRP(1:5:2)-15 | 1 | 0.690 | 0.196 | 15 | 25 | 5 | 46.886 |
| 실시예 2 | TRP(1:5:7)-15 | 1 | 0.690 | 0.686 | 15 | 25 | 5 | 47.376 |
| 실시예 3 | TRP(1:5:14)-15 | 1 | 0.690 | 1.372 | 15 | 25 | 5 | 48.062 |
| 비교예 1 | TRP(1:0:0) | 1 | 25 | 5 | 31.0 | |||
| 비교예 2 | TRP(1:5:0) | 1 | 0.690 | 25 | 5 | 31.69 | ||
| 비교예 3 | TRP(1:0:1) | 1 | 0.098 | 25 | 5 | 31.098 | ||
| 비교예 4 | TRP(1:0:2) | 1 | 0.196 | 25 | 5 | 31.196 | ||
| 비교예 5 | TRP(1:5:2) | 1 | 0.690 | 0.196 | 25 | 5 | 31.886 | |
| 비교예 6 | TRP(1:0:0)-5 | 1 | 5 | 25 | 5 | 36.0 | ||
| 비교예 7 | TRP(1:0:0)-15 | 1 | 15 | 25 | 5 | 36.0 | ||
| 비교예 8 | TRP(1:5:0)-15 | 1 | 0.690 | 15 | 25 | 5 | 46.069 | |
| 비교예 9 | TRP(1:0:2)-15 | 1 | 0.196 | 15 | 25 | 5 | 46.196 | |
| 비교예 10 | TRP(1:0:7)-15 | 1 | 0.686 | 15 | 25 | 5 | 46.686 | |
| 비교예 11 | TRP(1:0:14)-15 | 1 | 1.372 | 15 | 25 | 5 | 47.372 |
상기와 같은 구성 및 비율에 따른 이온 복합체를 제조하는 과정에서 최적의 제형 비율을 도출할 수 있었다. 상세하게는 상기 이온 복합체 제조 과정에서 TRP는 1:1 ~ 1:5의 몰비로 LDA와 이온 복합체를 형성하였고, TRP 분자에 남아있는 양전하로 인해 TRP/LDA(1:5)까지 응집 또는 침전의 징후가 관찰되지 않았으며, 건조 후 약물 함량이 천연 TRP의 함량과 동일했다. 또한, TRP:DA 몰비 > 1:2에서는 용액에서 TRP가 침전되어 TRP보다 TRP(1:0:3), (1:0:4), (1:0:6), (1:0:10) 및 (1:0:14) 각각 13.6%, 22.4%, 40.3%, 59.1% 및 94.1% 낮은 약물 함량이 생성되었다. 이는 안정성의 문제를 야기할 수 있고, 생체활성을 손상시키며, TRP의 투과도와 생체 이용률을 감소시킬 수 있으므로, 침전 없이 LDA 및 DA와 결합하여 복합체화될 수 있는 TRP에 대한 LDA 및 DA의 최대 이온 복합화 몰비(TRP/LDA/DA)를 1:5:2로 추정하였다. 그 다음 본 발명자들은 산화 분해를 일으키지 않고 단백질이나 펩타이드가 응집되지 않도록 보호할 수 있는 분산제로 DM을 TRP 용액에 도입하였을 때, TRP(1:5:14)-15까지 TRP 응집이나 TRP 손실 없이 TRP가 DA와 최대한 접합하였다. 또한, 모든 TRP/LDA/DA 복합체(즉, DM이 있거나 없는)에서 동결 건조 전후의 한외 여과물(ultrafiltrate)에서 유리 DA 및 LDA가 검출되지 않았으며, 이러한 결과를 통해 LDA 및 DA가 모든 몰비에서 TRP와 복합체를 형성했음을 확인할 수 있었다.
실험예 1: RP/LDA/DA-DM의 특성 확인
이온 복합체의 형성을 확인하기 위해 TRP/LDA, TRP/DA 또는 TRP/LDA/DA를 TRP 동결건조 전후에 물을 이용하여 10-1,000μg/mL 농도로 희석하였다. 그런 다음 각 이온성 복합체 용액을 ultrafiltration spin column(Pierce Protein Concentrator, molecular weight cut-off [MWCO] = 3,000; Thermo Fisher Scientific)에 넣고 12,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 복합체가 형성되지 않은 DA 또는 LDA를 용액으로부터 분리하였다. 그 다음, 여과액 중 유리 DA는 35 ℃에서 Luna C18 컬럼(4.6 × 150mm, 5μm, 100Å)을 장착한 HPLC를 이용하여 210 nm에서 검출하였다. 이동상은 아세토니트릴, 20mM 아세트산나트륨 완충용액(pH 4.3, 아세트산으로 조정됨) 및 메탄올 혼합액(60:35:5, v/v/v)이고 분석조건은 유속 1.5mL/min이다. 여과액 중 LDA는 온도 40°C, 검출기 파장 210nm이고, 컬럼은 Luna C18 (4.6 × 250mm, 5μm, 100Å)을 이용하였다. 이동상은 0.7%(v/v) 트리에틸아민(trimethylamine) 및 0.1% 헥산술폰산 나트륨염(hexanesulfonic acid sodium salt)으로 구성된 pH 3.0 완충액으로 구성되고, 유속은 0.8mL/min이다.
TRP/LDA/DA-DM의 2차 구조의 특성화를 위해 TRP, TRP-DM, TRP/LDA/DA 및 TRP/LDA/DA-DM의 원편광 이색성 분광분석을 통해 확인하였으며, 20 ℃에서 물에 포함된 복합체 10 μM를 이용하여 확인하였다. 측정은 10mm 큐벳을 사용하여 JASCO 분광편광계(Jasco Inc., Easton, MD, USA) 180-260nm 범위에서 이루어졌다. 모든 스펙트럼은 백그라운드로 보정되었고, 평균 잔류 타원율 (residual ellipticity) 단위로 계산하였다. 이는 평균 10회 스캔 값을 나타낸다. 또한 최적화된 TRP/LDA/DA-DM[즉, TRP(1:5:7)-15]을 25 ℃에서 dynamic light scattering analyzer(Malvern Zetasizer Nano ZS90; Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 평균 입자 크기, 다분산 지수(polydispersity index; PDI) 및 제타 전위에 대해 특성화하였다. TRP/LDA/DA-DM을 탈이온수로 분산시키고 다중 산란 효과를 최소화하기 위해 1분 동안 초음파 처리하였다. 또한, TRP 제형의 형태학적 평가는 투과전자현미경 (TEM)으로 수행하였다. 희석된 분산액을 구리 그리드 (copper grid)에 놓고 여과지를 사용하여 과잉 유체를 제거한 후 2% 인텅스텐산 (phosphotungstic acid) 수용액으로 네거티브 염색을 하였다. 준비된 그리드는 고해상도 TEM (HRTEM; JEM-200; JEOL, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 결과는 표 2와 도 2, 3에 나타내었다.
그 결과, 최적의 제형[즉, TRP(1:5:7)-15]은 입자 크기가 7.64 ± 0.098 nm, PDI가 0.160 ± 0.034, 제타 전위가 -0.361 ± 0.154 mV이다(표 2). 또한, TEM에 의해 결정된 경구 제형의 형태 및 구조는 입자 크기 분석에 기초하였을 때, 직경이 10nm 미만인 균일한 나노 크기의 미셀 형태임을 확인할 수 있었다(도 2).
또한, TRP/LDA/DA-DM의 2차 구조는 DM의 존재 또는 부재 하에 천연 TRP와 LDA 및/또는 DA와의 복합체가 222 nm에서 동일한 음의 강도를 가지고, α-나선 구조를 나타냄을 확인하였다. 더욱이 DM에 의한 TRP와 LDA 및 DA의 정전기적 복합체는 천연 TRP의 2차 구조에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 3).
| Particle size (nm) | Polydispersity index (PDI) | Zeta potential (mV) | |
| DM | 7.43 ± 0.081 | 0.045 ±0.017 | -0.260 ± 0.340 |
| TRP(1:5:0)-15 (비교예 8) | 5.03 ± 0.262 | 0.222 ± 0.084 | -0.261 ± 0.341 |
| TRP(1:0:7)-15 (비교예 10) | 8.71 ± 0.173 | 0.112 ± 0.015 | -0.375 ± 0.015 |
| TRP(1:5:2)-15 (실시예 1) | 5.44 ± 0.552 | 0.188 ± 0.056 | -0.104 ± 0.170 |
| TRP(1:5:7)-15 (실시예 2) | 7.64 ± 0.098 | 0.160 ± 0.034 | -0.361 ± 0.154 |
실험예 2: TRP/LDA/DA-DM의 시험관내 장막 투과도 확인
2-1. 시험관내 인공 장막 투과도
지질 이중층을 통한 TRP/LDA/DA 또는 TRP/LDA/DA-DM의 개선된 TRP 투과는 parallel artificial membrane (PAMPA) 분석(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 통해 확인하였다. 간략하게는, 300 μL의 인산완충 생리식염수(PBS, pH 6.8)를 각 receiver plate well에 첨가하고, TRP 100μg/mL를 기준으로 PBS(pH 6.8) 중 DM의 부재 또는 존재 하에 200μL의 TRP 또는, TRP와 LDA 및/또는 DA의 정전기적 복합체를 필터 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 합친 후, 흔들지 않고 실온에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. Agilent Poroshell 120 SB-C8(4.6 × 150 mm, 2.7 μm) 분석 컬럼을 고정상으로 사용하여 210 nm에서 HPLC로 인공 막을 통해 투과된 TRP 농도(μg/mL)를 정량화하였다. 각 샘플의 분취액(30μL)은 유속이 1.0mL/min이고, 29%-45% 아세토니트릴의 선형 구배를 갖는 0.1M 과염소산나트륨(pH 2.7) 이동상에서 32분 동안 용출되었다. 결과는 표 3에 나타내었다.
| 구성 비율 |
Permeated concentration of TRP across an artificial membrane
(μg/mL) |
Apparent permeability
( P app , Х 10 -6 cm/s) |
|
| 실시예 1 | TRP(1:5:2)-15 | 46.1 ± 5.10 | 0.690 ± 0.086 |
| 실시예 2 | TRP(1:5:7)-15 | 49.1 ± 2.30 | 0.750 ± 0.091 |
| 실시예 3 | TRP(1:5:14)-15 | 44.8 ± 3.52 | 0.730 ± 0.012 |
| 비교예 1 | TRP(1:0:0) | N.D. | 0.181 ± 0.033 |
| 비교예 2 | TRP(1:5:0) | 3.679 ± 0.108 | 0.191 ± 0.022 |
| 비교예 3 | TRP(1:0:1) | N.D. | 0.180 ± 0.041 |
| 비교예 4 | TRP(1:0:2) | 4.70 ± 0.933 | 0.185 ± 0.026 |
| 비교예 5 | TRP(1:5:2) | 11.8 ± 4.48 | 0.212 ± 0.030 |
| 비교예 6 | TRP(1:0:0)-5 | 56.1 ± 4.60 | 0.379 ± 0.010 |
| 비교예 7 | TRP(1:0:0)-15 | 48.7 ± 1.60 | 0.463 ± 0.091 |
| 비교예 8 | TRP(1:5:0)-15 | 50.9 ± 2.95 | 0.493 ± 0.071 |
| 비교예 9 | TRP(1:0:2)-15 | 43.6 ± 5.20 | 0.573 ± 0.010 |
| 비교예 10 | TRP(1:0:7)-15 | 53.7 ± 6.70 | 0.620 ± 0.080 |
| 비교예 11 | TRP(1:0:14)-15 | 54.7 ± 3.50 | 0.620 ± 0.060 |
LDA 및/또는 DA 단독 또는 DM과 조합하여 복합화하거나 하지 않은 TRP의 투과 농도(μg/mL) 및 겉보기 투과도(P app ). 각 값은 평균 ± SD를 나타낸다(n = 6). TRP, 테리파라티드; DA, 데옥시콜산; LDA, L-리신 연결 DA; DM, n-도데실-β-D-말토사이드; TRP/LDA, LDA와 복합화된 TRP; TRP/DA, DA와 복합화된 TRP; TRP/LDA/DA-DM, DM 존재하에 LDA 및 DA와 복합화된 TRP; N.D., 감지되지 않음.
상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 투과 5시간 후에 PAMPA 플레이트의 수용체 웰에서 TRP(1:0:0) 또는 TRP(1:0:1)가 검출되지 않는 반면에 TRP는 LDA 또는 DA와의 1:5 또는 1:2의 몰비[즉, TRP(1:5:0) 및 TRP(1:0:2)]로 복합체 형성 후 인공막을 침투하였다. 또한 TRP(1:5:2)는 TRP(1:5:0) 및 TRP(1:0:2) 대비 각각 321%, 251%의 투과율 증가를 보여 인공막을 통한 수동 확산이 크게 개선되었음을 알 수 있다. 또한, 1:5 및 1:15 중량비로 DM에 포함된 TRP[즉, TRP(1:0:0)-5 및 TRP(1:0:0)-15]는 TRP(1:5:2)보다 각각 4.75배, 4.12배 더 큰 침투율을 나타내는 것으로부터 DM 미셀에서 TRP의 친유성 증가를 확인할 수 있었다. 그러나, TRP(1:0:0)-5와 TRP(1:0:0)-15 사이에는 TRP 투과도에는 큰 차이가 없었으며, GI액에서 발생할 수 있는 용량 또는 급속 희석을 고려하여 온전한 TRP와 미셀 상호작용을 유지하기 위해 LDA 및 DA와 TRP와의 최대 복합화를 위해 RP(1:0:0)-15를 선택하였다. 또한, DM이 TRP/LDA/DA와 통합된 TRP(1:5:0)-15, TRP(1:0:2)-15, TRP(1:0:7)-15 및 TRP(1:0:14)-15는 TRP(1:0:0)-15와 비교하여 TRP와 유사한 투과를 보였다. 이러한 결과는 pH 4.0과 달리 pH 6.8에서는 TRP의 극성이 크게 감소하여 TRP의 지질 용해도가 증가함으로써 DM 미셀과 함께 인공막을 통한 최대 투과가 이루어졌음을 보여준다.
2-2. Caco-2 및 HT-29-MTX-E12 세포 단층을 통한 시험관내 투과도
TRP, TRP/DLA/DA 및 TRP/DLA/DA-DM의 개선된 장 상피 흡수를 평가하기 위하여, Caco-2 (ATCC® HTB-37™; American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) 및 HT29-MTX-E12 (EACC 12040401; Public Health, England, Oxford, UK)를 8:2로 혼합한 세포를 1 × 105 cells/well의 밀도로 24웰 Transwell® 필터 멤브레인에 접종하였다. 상피 전기 저항(transepithelial electrical resistance; TEER) > 650 ± 100 Ω·cm2를 갖는 밀집 단층(confluent monolayer)을 얻은 후, Transwell® 시스템의 apical 및 basal 구획을 미리 데워진 Hank의 balanced salt solution(HBSS)으로 세척하고 37 ℃에서 30분 동안 유지하였다. 투과 실험을 위해 apical 챔버의 HBSS를 200 μg/mL TRP에 해당하도록 HBSS로 희석된 0.1mL의 TRP, TRP/LDA, TRP/DA, TRP-DM, TRP/LDA-DM, TRP/DA-DM 또는 TRP/LDA/DA-DM으로 교체하였다. 각 basolateral 구획을 0.6 mL의 새로운 HBSS로 교체하고 Transwell® plate는 37 ℃ ± 0.5 ℃에서 배양하였으며, 0.5, 1, 2, 3, 0.5, 1, 2, 3 4 및 5시간 후에 basolateral 구획에서 각 샘플 용액 0.2 mL를 수집한 후, 동일한 용량의 HBSS로 교체하였다. 단층에 대한 TEER 값은 실험이 끝날 때 다시 측정하였다. 그런 다음 수집된 샘플을 0.45μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인을 통해 여과하고 TRP의 투과량을 전술한 바와 같이 210nm에서 UV 검출기를 사용하는 HPLC에 의해 결정하였다. 제형에서 TRP의 겉보기 투과도(P app )는 다음 방정식을 통해산출하였다. P app = dM/dt × 1/(A × Co), 여기서 dM/dt는 시간에 대한 투과된 TRP 누적량의 기울기(μg/h)를 나타내고, A는 단층의 표면적(cm2), Co는 apical side에서 TRP의 초기 로딩 농도(μg/ ML). 결과는 표 3에 나타내었다.
표 3에서 확인할 수 있듯이, 인공막 투과도와 달리 TRP(1:5:0), TRP(1:0:1) 및 TRP(1:0:2)는 자유 TRP(1:0:0)와 비교하였을 때 거의 동일한 투과도를 보였다. 또한 TRP(1:5:2)는 TRP 대비 P app 증가율이 117%에 그쳐 ASBT 매개 수송의 효과가 없었으며, TRP의 침투는 주로 단순한 수동 확산 때문일 수 있음을 알 수 있다. 또한, 유리 TRP에 비해 TRP(1:5:2)의 상대적 소수성 증가에도 불구하고, ASBT의 여러 막 통과 영역과 강한 상호작용을 보이지 않았다. 따라서, ASBT와의 상호작용을 더욱 증가시키기 위하여 TRP를 사용한 DA의 최대 복합화를 위해 TRP(pH4)를 DM의 미셀 용액과 조합한 결과, TRP(1:0:0)-5 및 -15는 TRP(1:0:0)에 비해 TRP의 투과도가 각각 2.09배, 2.56배 증가하였으며, TRP(1:0:0)-15의 투과도는 TRP(1:5:2)보다 218% 더 컸다. 또한 투과 후 TRP 처리된 단층과 비교하여 TEER 값이 4.33배 감소하였다. 또한 TRP(1:5:7)-15는 TRP(1:0:0)-15 및 TRP(1:0:0)-15에 비해 각각 162% 및 414% 더 큰 P app 을 나타내어 TRP에 대한 ASBT 매개 수송은 TRP(1:5:7)-15의 추가적인 투과도 증가에도 관여됨을 알 수 있다.
실험예 3: Caco-2 및 ASBT 형질주입된 MDCK 세포에 의한 FITC-conjugated TRP/LDA/DA-DM의 세포 흡수 확인
TRP/DLA/DA 및 TRP/DLA/DA-DM의 향상된 세포 흡수를 확인하기 위하여, FluoroTag™ FITC 접합 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 1:1의 몰비로 TRP를 fluorescein isothiocyanate (FITC)와 컨쥬게이션시켰다. 간략하게는, 0.1M sodium carbonate-bicarbonate 완충액(1 mg/mL)에 용해된 FITC 0.54 mL를 0.1 M sodium carbonate-bicarbonate 완충액(pH 9.0) 중 TRP 용액(12 mg/mL) 0.5 mL에 적가한 다음 부드럽게 교반하면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, FITC 표지 TRP(F-TRP)를 PBS(pH 9.0) 10 mL를 포함하는 반응 용액으로 용출하여 Sephadex G-25M 컬럼을 통해 분리하였다. 수집된 F-TRP를 동결 건조하고 DM의 존재 또는 부재 하에 LDA 및/또는 DA와의 추가적인 정전기적 복합체화를 위해 상기 설명한 바와 같이 F-TRP/LDA/DA 또는 F-TRP/LDA/DA-DM을 형성하였다.
다음으로, F-TRP, F-TRP/LDA/DA 또는 F-TRP/LDA/DA-DM의 세포 흡수를 Caco-2 세포에서 정성분석 하였다. 간략하게는, Caco-2 세포를 Cell-Tak으로 코팅된 커버슬립에 5 x 104 cell/coverslip로 접종하고, 단층이 형성될 때까지 증식시켰다. TRP 20 μg/mL 농도에 해당하는 DMEM에 용해된 F-TRP(1:0:0), F-TRP(1:5:0), F-TRP(1:0:2), F-TRP(1:5:2), F-TRP(1:5:2)-15, 및 F-TRP(1:5:7)-15 용액 100 μL를 포함하는 배양액으로 교체한 후, 세포를 37°C에서 인큐베이션하였다. 1시간 후, 세포를 ice-cold PBS (pH 7.4)로 세척하고, 4% 포름알데히드를 포함하는 PBS(pH 7.4)로 고정하였다. 그런 다음, 세포의 액틴 필라멘트(actin filaments)를 팔로딘 로다민 (phalloidin-rhodamine)(100 nM)으로 염색하고, 핵을 4′,6-diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI)로 대조염색 하였다. PBS(pH 7.4)로 3회 라이징 시킨 후, confocal laser scanning microscopy(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)로 세포 흡수를 확인하였으며, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있듯이, F-TRP(1:5:2)-15는 F-TRP(1:0:0) 및 F-TRP(1:5:2)보다 유의하게 더 높은 흡수를 보였다. 또한, LDA 및 DA와 이온 복합화한 후, F-TRP(1:0:0), F-TRP(1:5:2) 대비 TRP(1:5:2)-15 및 TRP(1:5:7)-15의 투과도가 상당히 향상되었음을 알 수 있다. 또한 도 5에서 확인할 수 있듯이, Caco-2 세포를 F-TRP(1:5:0) 및 F-TRP(1:0:2)에 1시간 노출시킨 후 F-TRP(1:5:0) 및 F-TRP(1:0:2)의 세포 흡수는 각각 3.38 ± 0.111 μg/mL 및 5.81 ± 0.537 μg/mL으로, 음성(negative) F-TRP(1:0:0)보다 각각 4.28배 및 7.35배 더 높았으며, F-TRP(1:5:2)에서 F-TRP의 세포 흡수가 F-TRP(1:5:0) 및 F-TRP(1:0:2)와 비교하였을 때 각각 133% 및 35.8% 증가하였고, F-TRP(1:0:0)보다 9.99배 더 높은 흡수율을 나타내었다. 또한 Caco-2 세포를 1시간 동안 F-TRP(1:5:7)-15에 노출시키면 세포 흡수가 12.0±1.70μg/mL로 추가로 증가하였으며, 이는 F -TRP(1:5:2) 및 F-TRP(1:0:0)보다 각각 보다 1.52배 및 15.2배 더 높았다.
다음으로, TRP와 LDA 및/또는 DA의 복합체화 후 담즙산 수송체와의 상호작용을 통한 TRP/LDA/DA 또는 TRP/LDA/DA-DM의 장 투과도 향상을 인간 ASBT 유전자로 형질주입된 Mardin-Darby canine kidney (MDCK) cells (ATCC® CCL-34™)을 이용하여 확인하였다. 간략하게는, MDCK 세포를 1 × 104 cells/coverslip 밀도로 접종한 다음, Lipofectamine 2000® and P300™ (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 인간 ASBT 유전자를 형질주입 시켰다. 밀집 단층의 형성 후, 20μg/mL TRP에 해당하는 농도가 되도록 DMEM으로 희석된 100μL의 F-TRP, F-TRP/LDA/DA 또는 F-TRP/LDA/DA-DM를 세포에 처리한 후, 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ice-cold PBS (pH 7.4)로 세 번 세척한 다음, 세포를 4% formaldehyde 및 blocking buffer (0.3% Triton X-100 및 10% normal goat serum in PBS, pH 7.4)로 고정하였다. anti-human ASBT 항체(1:500)를 처리하고 밤새 인큐베이션 한 후, 10 μg/mL Alexa Fluor-546 표지 이차 항체로 1시간 동안 염색하였다. 마지막으로, 핵을 5분 동안 DAPI로 대조염색하고 세포를 mounting 용액를 사용하여 유리 슬라이드에 고정시켰다. 형광 이미지는 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 수득하였다. 결과는 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 5 및 도 6에서 확인할 수 있듯이, F-TRP(1:5:2 및 1:5:7)-15의 공초점 이미지는 비발현 세포보다 ASBT 발현 MDCK 세포에서 세포 흡수가 더 높았다. 특히 ASBT 발현 MDCK 세포에서 F-TRP(1:5:7)-15가 F-TRP(1:5:2)-15보다 높은 흡수를 보였다.
마지막으로, Caco-2 및 ASBT-비형질주입 또는 형질주입된 MDCK 세포로 F-TRP(1:5:0), F-TRP(1:0:2), F-TRP(1:5:2), F-TRP(1:5:2)-15, 및 F-TRP(1:5:7)-15의 세포흡수를 정량화하였다. 간략하게는, 1 x 105 Caco-2 또는 MDCK 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM를 포함하는 6웰 플레이트 각 웰에 접종하였다. 동시에, MDCK 세포를 상기 기재된 바와 같이 ASBT 유전자로 형질주입 시켰다. 밀집 단층을 형성한 후, 세포에 50㎍/mL TRP에 해당하는 농도의 각 F-TRP 제형을 처리한 후, 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 각 웰의 세포를 1 mL ice-cold PBS(pH 7.4)로 3회 세척하고 세포 스크리퍼를 사용하여 수확하였다. 5000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 펠렛을 재현탁하고 ice-cold PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 그런 다음 수집된 세포를 0.3mL의 HCl가 포함된 0.5%(w/v) Triton-X 100로 처리한 다음, 15분 동안 초음파 처리하여 세포막을 파괴하였다. 원심분리 후, 상청액 중의 F-TRP는 495 nm의 여기 파장 및 525 nm의 방출 파장에서 형광 검출기를 사용하여 HPLC로 정량화하였다. 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인할 수 있듯이, LDA 및/또는 DA와 복합된 TRP는 ASBT-비발현 세포로 TRP의 세포 흡수를 증가시켰다. F-TRP(1:5:2)가 F-TRP(1:0:0)보다 269% 높은 흡수율을 보였지만, ASBT-비발현 MDCK 셀에 의한 TRP/LDA 복합체의 흡수율은 유사하였다. 복합체에 DM을 첨가한 후, TRP(1:5:2)-15의 흡수는 F-TRP(1:5:2)에 비해 46.5% 증가했지만, F-TRP(1:5:7)의 흡수는 더 이상 증가하지 않았다. 반면에 ASBT-발현 세포를 통한 복합체의 흡수는 F-TRP에서 2개 이상의 DA 분자로 구성된 복합체에서 유의하게 향상되었다. F-TRP(1:5:7)-15를 ASBT-비발현 MDCK 세포에 1시간 동안 처리한 후 최대 F-TRP 농도는 2.71 ± 0.506 μg/mL로 F-TRP(1:0:0) 및 F-T-15(도 2:15) 세포보다 각각 4.59배, 1.16배 높았다. 또한 F-TRP(1:5:7)-15는 ASBT-비발현 MDCK 세포에 비해 ASBT-발현 MDCK 셀에 의한 흡수율이 234% 더 증가하였다. 즉, ASBT-발현 MDCK 세포에 의한 F-TRP(1:5:7)-15의 세포흡수율은 F-TRP(1:0:0)와 F-TRP(1:5:2)-15의 세포흡수율보다 각각 10.1배와 2.20배 높았다.
실험예 4: TRP/LDA/DA-DM의 장 수송 메커니즘의 확인
TRP/LDA/DA-DM의 투과 동안 세포간 경로의 관여를 명백히 확인 하기 위하여, 실험예 2에 기재된 바와 같이 TEER 값이 > 650Ω·cm2인 Caco-2/HT29-MTX-E12 세포 단층을 준비하였다. 단층을 각 세포 흡수 경로의 특이적 억제제를 함유하는 0.1mL의 HBSS에 사전배양하고, 특이적 억제제를 포함하지 않는 0.6mL의 HBSS를 apical 및/또는 basal chambers에 37 ℃에서 30분 동안 각각 첨가하였다. 그 다음, apical chamber의 용액은 해당하는 억제제와 함께 0.1mL의 TRP(1:5:7)-15(200 μg/mL TRP)로 교체하고, 반면에 the basolateral 구획 용액은 0.6 mL의 신선한 HBSS로 교체하였다. 세포를 37 ℃에서 배양하고, 샘플 용액 200μL의 분취량을 0.5, 1, 2, 3, 4 및 5시간에 basolateral 구획으로부터 회수하고, 동일한 부피의 HBSS로 교체하였다. Caco-2/HT29-MTX-E12 세포 단층을 통해 침투한 TRP를 상기 기재된 바와 같이 10nm 파장의 UV 검출기를 통해 HPLC로 정량화하였다. 마지막으로, P app 은 실험예 2에 설명된 방정식을 사용하여 시간 함수로 플롯된 TRP(1:5:7)-15에서 TRP의 누적 투과량의 선형 기울기로 결정되었다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
먼저, TRP(1:5:7)-15의 장내 흡수에 관여하는 다양한 세포간 흡수 경로의 역할을 확인하기 위하여 트랜스사이토시스(transcytosis)에 특이적인 다양한 생화학적 억제제가 있는 상태에서 Caco-2/HT29-MTX-E12 단층을 사용하여 TRP의 수송 메커니즘을 확인하였다. 도 9에서 확인할 수 있듯이 TRP(1:5:7)-15의 P app 에 대한 억제제의 효과를 정량화하고 억제제가 없는 대조군과 비교한 결과, 클라트린-매개엔도사이티스(clathrin-mediated endocytosis)의 저해제인 클로르프로마진(chlorpromazine)을 단층에 처리한 후, TRP(1:5:7)-15의 P app 값은 억제제가 없는 대조군에 비해 44.4% 유의하게 감소하였다. 마찬가지로, 카볼라-매개-내세포증(caveola-mediated endocytosis)의 억제제인 MBCD와 genistein(genistein)를 처리할 경우에는 억제제가 없는 대조군에 비해 TRP(1:5:7)-15의 막 수송이 각각 23.2%, 19.7% 감소되었다. 또한, 아밀로라이드(amiloride)에 의한 거대음세포증(macropinocytosis) 억제는 억제제가 없는 대조군에 비해 TRP(1:5:7)-15의 P app 을 28.7% 감소시켰다.
다음으로, TRP(1:5:7)-15의 엔도좀(endosomal) 수송 동안 ER/Golgi 경로의 관여를 확인하기 위하여, 분비성 ER/Golgi 경로를 구체적으로 억제할 수 있는 특이적이고 강력한 억제제인 브레펠딘 A(brefeldin A )의 영향을 확인하였다. 그 결과 도 9에서 확인할 수 있듯이, 브레펠딘 A 억제제가 없는 대조군에 비해 TRP(1:5:7)-15의 P app 가 56.9% 감소하는 것을 확인하였다.
추가적으로, TRP(1:5:7)-15의 세포흡수 시 ASBT-매개 운반체의 관여를 확인하기 위하여, Act D와 CFZ 각각을 단독으로 또는 ASBT의 특이적 억제제 및 이질성 유기질 운반체(OSTα/α)의 특이적 억제제를 조합하여 처리한 후, TRP(1:5:7)-15의 P app 에 미치는 영향을 억제제가 없는 대조군과 비교하였다. 그 결과 도 9에서 확인할 수 있듯이, Act D 단독으로는 억제제가 없는 대조군에 비해 TRP(1:5:7)-15의 P app 이 51.2% 감소하였다. OSTα/α의 억제제인 CFZ도 억제제가 없는 대조군에 비해 P app 이 57.1% 감소하였다. 또한, Act D 및 CFZ를 사용한 복합처리는 억제제가 없는 대조군에 비해 P app 이 51.5% 감소하였다.
마지막으로, TRP(1:5:7)-15의 장 투과 동안 P-당단백질(P-gp) 매개 유출의 관여를 확인하기 위하여, P-gp 억제제인 Cys A의 효과를 세포 단층 apical-to-basal 수송동안 조사하였다. TRP(1:5:7)-15의 P app 는 대조군과 동일하여 TRP(1:5:7)-15의 장내 수송 동안 P-gp 매개 유출이 없음을 확인하였다.
실험예 5: TRP/LDA/DA-DM의 시험관 내 세포독성 및 생물학적 활성 확인
TRP/LDA/DA-DM의 세포독성 효과는 쥐 골육종 세포주(UMR-106; ATCC® CRL-1661™)를 사용하여 확인하였다. 간략하게는, 10% (v/v) FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 100 μL의 DMEM 에서 4 x 104 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 접종하고 37 ℃에서 48시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포에 0.5, 2.5, 5, 25, 50, 250 ng/mL TRP가 되도록 저혈청 배지(1% FBS)로 연속 희석된 TRP, TRP-DM 및 TRP/LDA-DM를 처리하였다. 추가로 24시간 동안 배양한 후, WST-8[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA] 10μL를 각 웰에 첨가하고, 추가로 2시간 동안 배양하여 세포 생존율을 평가하였다. 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)(PerkinElmer Multimode Plate Reader; PerkinElmer, Wellesley, MA, USA)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 생존 세포의 백분율을 처리군과 대조군 사이에서 비교하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 확인할 수 있듯이, 모든 시험 물질의 세포 생존율은 0.5~250 ng/mL TRP에 해당하는 농도 범위에서 85% 이상이었으며, TRP(1:5:2)-15와 TRP(1:5:7)-15의 최고 농도에서도 생존율이 각각 96.3% ± 5.39%, 98.5% ± 2.37%로 유지되었다.
다음으로, TRP/LDA/DA-DM의 생물학적 활성을 평가하기 위하여 UMR-106 세포를 2 × 104 cells/well 밀도가 되도록 96-웰 플레이트에 접종하였다. 48시간 후, 세포를 0.5 mM 포스포다이에스터레이스(phosphodiesterase) 억제제, 아이소부틸메틸잔틴(isobutylmethylxanthine) (IBMX; Sigma-Aldrich)로 구성된 PBS (pH 7.4) 200 μL으로 10분 동안 세척하였다. 이어서, 세포를 TRP가 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 및 100 nM 농도에 해당하는 IBMX 0.5 mM과 함께 PBS (pH 7.4)에 용해된 TRP(1:0:0), TRP(1:0:0)-15, TRP(1:5:2)-15, 및 TRP(1:5:7)-15 100 μL에 노출시켰다. 그 다음 각 웰에서 200 μL의 상청액을 실온에서 600 x g로 10분 동안 원심분리하였다. 고리형 아데노신 일인산(cAMP) 합성에 대한 TRP/LDA/DA-DM의 효과를 평가하기 위해, 각 상청액의 cAMP 수준을 ELISA(Competitive enzyme-linked immunosorbent assay)(Thermo Fisher Scientific) 제조업체의 지침에 따라 정량화하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 확인할 수 있듯이, TRP(1:0:0) 또는 TRP(1:0:0)-15-활성화된 UMR-106 세포에 의한 cAMP의 생합성은 50 nM TRP까지 농도 의존적으로 증가하였고, 그 후 cAMP의 수준은 처리되지 않은 대조군(즉, 19.4 ± 1.09 pmoL/mL)과 비교하여 각각 498% 및 440%만큼 증가하였다. 또한 0.1~50nM의 농도 범위에서 TRP(1:5:2)-15 또는 TRP(1:5:7)-15와 비교하였을 때, cAMP 생산과 관련하여 유사한 효능을 보였다. 그러나, 100 nM TRP에 해당하는 TRP(1:5:2)-15 또는 TRP(1:5:7)-15로 처리된 세포는 100 nM TRP(1:0:0)로 처리된 세포보다 셀 용해물에서 cAMP 수치가 각각 139%, 165% 높게 나타났다, 또한 TRP(1:0:0)-15(100 nM TRP)로 처리된 것과 비교하여 cAMP 수준이 각각 1.37배 또는 1.63배 증가하였다.
실험예 6: 마우스에서의 경구 흡수 확인
마우스에서 TRP/LDA/DA-DM의 경구 흡수를 LDA 및 DA와 TRP의 정전기 복합체 및 DM을 사용한 미셀 제형의 효과를 확인함으로써 평가하였다. 밤새 금식한 후 SD 마우스에게 400μL의 TRP-Oral(1.6)(1.6mg/kg TRP가 물에 용해됨) 또는 TRP(1:5:7)-15(1.6)(1.6mg/kg TRP 에 해당)를 경구 투여하였다. 또한, 상대적 경구 생체이용률을 평가하기 위해 동물에게 200 μL의 TRP-SC(0.04)(0.04 mg/kg TRP를 생리 식염수에 용해)를 피하 주사하였다. 혈액 샘플(250μL)을 지정된 시점(0, 0.167, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6시간)에 캐뉼러가 삽입된 대퇴 정맥에서 헤파린 처리된 튜브(리튬 헤파린)에 수집하였다. 마지막으로, 플라즈마를 원심분리(2500 × g, 15 min, 4 ℃)를 통해 분리한 후, 분석 전까지 80 ℃에서 보관하였다.
각 샘플의 플라즈마 약물 농도는 UPLC-MS/MS에 의해 결정하였다. 표준 검정 곡선을 구성하기 위하여, 블랭크(blank) 플라즈마 180 μL를 튜브로 옮긴 후, 100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 및 0 (blank) ng/mL 농도의 TRP 10μL를 블랭크(blank) 플라즈마에 첨가하였다. 약물 투여 후 플라즈마 약물 농도를 측정하기 위하여, 다른 시간 지점에서 마우스 플라즈마 샘플 180 μL를 다른 튜브에 옮긴 다음, 10 μL hPTH(1-38) 수용액 (100 ng/mL) (as an internal standard [IS])을 TRP 및 블랭크 플라즈마 또는 약물이 투여된 플라즈마 샘플에 추가하였다. 그 다음, 5% 수산화암모늄(ammonium hydroxide)을 포함하는 200 μL 아세토니트릴(acetonitrile)을 첨가하여 샘플을 침전시켰다. 침전된 샘플을 1 mL의 물로 추가 희석하고 4 ℃에서 4,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 고체상 추출(SPE) 방법과 Oasis® HLB μElution 96웰 플레이트 (Waters Corporation, Milford, MA, USA)를 사용하여 추출하였다. 간략하게는 96웰 플레이트를 200μL의 메탄올로 조절한 다음 200μL의 물로 평형화하였다. 이어서, 상층액에서 4개의 350μL 분취량을 각 Oasis® HLB μElution 웰에 첨가하였다. 표준 또는 샘플을 첨가한 후, 웰을 5% 메탄올이 포함된 물 200 μL로 세척하였다. 그 다음, TRP 및 IS를 25 μL의 아세토니트릴:물:트리플루오로에탄올:트리플루오로아세트산(60:34:5:1, v/v/v/v) 혼합물 25 μL로 2회 순차적으로 용출시켰다. 50 μL의 물로 용출액을 추가로 희석한 후, ACQUITY UPLC® Peptide BEH C18 컬럼(2.1 × 50 mm, 1.7 μm, 300 Å, Waters Corporation)이 장착된 UPLC 시스템(Waters ACQUITY UPLC, Waters Corporation)에 10μL를 주입하였다. 샘플은 6 ℃의 저온에 두었고, 컬럼 온도는 분석 동안 60 ℃로 유지하였다. 이동상 A는 물 중 0.5%(v/v) 포름산으로 구성되었고 이동상 B는 아세토니트릴로 구성되었다. TRP 및 IS는 0.3mL/min의 구배 유속으로 용출되었으며, 여기서 이동상 A는 85%(초기), 85%(0.8분), 70%(1.2분), 70%(2.2분), 65%(2.7분), 10%(3.0분), 10%(4.0분), 85%(5분) 및 85%(5분)와 같다. 이온화를 위해 질량 분석기(Xevo™ TQ-S; Waters Corporation)를 전자 분무 전압, 소스 온도, 탈용매화 온도 및 탈용매화 가스 유량 3.0kV, 150°C, 500 ℃ 및 800L/h 각각으로 양이온 다중 반응 모니터링 모드로 사용하였다. 정량화는 TRP의 경우 45V cone voltage 및 13eV collision energy에서 m/z 589.40 → 656.40로, IS의 경우 20V cone voltage 및 20eV collision energy에서 m/z 744.20 → 855.50의 전이로 수행되었다. 결과는 표 4와 12 및 도 13에 나타내었다.
| Test material | TRP-SC (0.04) | TRP-Oral (1.6) | TRP(1:5:7)-15 (1.6) |
| Administration route | SC | Oral | Oral |
| TRP dose (mg/kg) | 0.04 | 1.6 | 1.6 |
| Tmax (h) | 0.50 ± 0.00 | 1.30 ± 0.27 | 2.00 ± 0.00 |
| T1/2 (h) | 0.40 ± 0.12 | 0.72 ± 0.18 | 0.54 ± 0.05 |
| Cmax (pg/mL) | 807 ± 135 | 155 ± 57.2 | 1190 ± 205 |
| AUClast (pg·h/mL) | 601 ± 120 | 135 ± 70.4 | 1750 ± 239 |
| AUCinf (pg·h/mL) | 752 ± 26.9 | 296 ± 18.9 | 1924 ± 153 |
| Relative bioavailability (%) | 100 | 0.559 ± 0.293 | 7.27 ± 0.992 |
SC 또는 경구 투여 후 TRP 혈장 농도-시간 프로파일을 나타내는 도 12에서 확인할 수 있듯이, 1.6 mg/kg의 TRP를 단독으로 경구 투여한 후 달성된 최대 혈장 농도(Cmax)는 155 ± 57.2 pg/mL이었고. 혈장 농도-시간 곡선 아래 면적(AUClast)은 135 ± 70.4 pgh/mL이었으며, SC 투여에 대한 경구 생체이용률은 0.559 ± 0.293%이었다. TRP 단독 경구 투여와 비교하여 경구 TRP(1:5:7)-15(TRP의 1.6 mg/kg에 해당)는 Cmax(1190 ± 205 pg/mL) 및 AUClast(1750 ± 239 pgh/mL)에서 각각 7.66배 및 13.0배 증가하였으며, 이러한 결과로 상대적 경구 생체이용률이 7.27 ± 0.992% 증가하였다. 최대 농도에 도달하는 시간(Tmax) 값은 유리 TRP 및 TRP(1:5:7)-15의 SC 및 경구 투여 후 각각 0.5 및 2시간이었다. 그러나, TRP(1:5:7)-15의 경구 섭취 후 최종 제거 반감기(T1/2)는 0.54h로, SC 투여(0.4h) 후와 유사하여 경구 섭취 후 TRP 흡수가 매우 지연됨을 알 수 있다. 따라서 경구 TRP(1:5:7)-15는 SC TRP 단독과 유사한 박동 작용을 나타낼 것으로 예상된다.
실험예 7: 덱사메타손 (dexamethasone)으로 유도된 마우스 골다공증 모델에서 경구용 TRP/LDA/DA-DM의 생체 내 항골다공증 효과
GC 유발 골다공증에 대한 경구 투여된 TRP/LDA/DA-DM의 동화작용 효과를 확인하기 위하여, 9주령 암컷 C57BL/6 마우스를 무작위로 6개 그룹으로 나누었다 (n = 그룹당 10): 대조군(정상) (정상 식염수 1일 1회 SC 주사); 대조군(DEX)(0.022 mg/kg DEX 1일 1회 SC 주사); TRP-SC(0.02)(0.022mg/kg DEX가 포함된 생리 식염수에 녹인 0.02mg/kg TRP 1일 1회 SC 주사); TRP-경구(0.4)(0.022mg/kg DEX의 SC 주사와 함께 물에 녹인 0.4mg/kg TRP 1일 1회 경구 투여); TRP(1:5:7)-15(0.4) (0.022 mg/kg DEX의 SC 주사와 함께 0.4 mg/kg TRP에 해당하는 TRP(1:5:7)-15의 1일 1회 경구 투여); 및 TRP(1:5:7)-15(0.8)(0.022 mg/kg DEX의 SC 주사와 함께 0.8 mg/kg TRP에 해당하는 TRP(1:5:7)-15의 1일 1회 경구 투여). 혈액 샘플은 처리 4주 후에 생화학적 분석을 위해 수집하였다.
또한, 각 그룹의 10마리 마우스의 대퇴골을 수집하여 골밀도 및 조직 형태학적 분석을 위해 4% 파라포름알데히드에 고정하였다. 왼쪽 대퇴골의 소주골 미세구조는 한국기초과학연구원(한국 광주)에 위치한 Quantum GX micro-computed tomography(micro-CT) 영상 시스템(PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA)을 사용하여 조사하였다. X선 소스 설정에는 90kV의 전압 및 88μA의 전류를 포함하며, 시야는 10mm(복셀 크기, 20μm, 스캔 시간, 4분)이다. 3차원(3D) 영상은 Quantum GX 내 기존 소프트웨어인 3D Viewer로 획득하였으며, 해상도는 4.5μm로 설정하였다. 스캔 후, Analyze 12.0 소프트웨어(AnalyzeDirect, Overland Park, KS, USA)를 사용하여 소주골의 구조적 파라미터를 분석했다.
조직학적 관찰을 위해, 포르말린으로 고정된 대퇴골을 10% 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)에서 석회화하고 단계별 에탄올 시리즈를 통과시켜 탈수시켰다. 그런 다음 파라핀 왁스에 묻히고 5μm 두께로 절단하여 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하였다. 조직학적 절편은 광학현미경(Bx41; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였고, 사진은 성장판 중앙부에 초점을 맞추어 촬영하였다.
상기 각 실험에 대한 결과를 도 14 내지 도 21에 나타내었다.
도 14에서 확인할 수 있듯이, 전체 대퇴골의 BMD는 처리되지 않은 정상 대조군에 비해 DEX 처리된 마우스에서 유의하게 감소하였다(각각 174 ± 21.0 vs. 123 ± 7.92 mg/cm3). 또한, 도 15 내지 도 19에서 확인할 수 있듯이 소주골, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp 및 SIM의 구조적 파라미터는 대조군(정상)군과 비교하여 DEX 처리된 마우스는 Tb.Th(-7.98%) 및 SMI(-21.1%)에서 유의한 변화를 나타내었으나 BV/TV, Tb.Sp 또는 Tb.N에는 차이가 없었다. 반면, DEX 처리된 마우스에 TRP-SC(0.02)를 동시에 투여할 경우, DEX 관련 대퇴골 골밀도 감소를 방지할 수 있기 때문에 DEX 그룹보다 29.4% 더 높은 BMD를 나타냈다. 특히, TRP-SC(0.02)는 대조군(DEX) 그룹보다 BV/TV, Tb.Th, Tb.N에서 각각 13.2%, 45.2%, 2.8%로 더 높은 파라미터 값을 나타냈고, Tb.Sp에서 17.4% 더 낮은 파라미터 값을 나타냈다. 또한 1일 1회 TRP(1:5:2)-15(0.4) 또는 TRP(1:5:2)-15(0.8)의 경구 투여도 BMD 감소를 크게 막아 대조군(DEX) 그룹보다 BMD가 각각 36.9%, 61.1% 높았을 뿐만 아니라 TRP(1:5:2)-15(0.4)와 TRP(1:5:2)-15(0.8) 경구 투여가 소주골 미세구조 파라미터에 대해 양성반응을 보였다. 더욱이, 대조군(DEX) 마우스 대비 Tb.Th가 각각 31.3% 및 28.4% 높았고, Tb.N이 각각 10.5%, 14.8% 더 높았으며, Tb.Sp는 각각 14.9%, 17.3% 더 낮았다. 대조적으로, 0.4 mg/kg의 유리 TRP[즉, TRP-경구(0.4)]의 일일 경구 투여는 TRP(1:5:2)-15(0.4) 마우스에서 관찰된 BMD 손실에서 유의한 개선을 나타내지 않았다.
도 20에서 확인할 수 있듯이, 대퇴골의 3D 마이크로 CT 이미지에서 소주골 파라미터의 증가를 쉽게 관찰할 수 있다. 대조군(정상) 그룹에서 관찰된 자연적 뼈 성장과는 대조적으로, DEX 유도 골다공증 마우스에서 해면골(cancellous bone) 뼈 구조의 악화가 관찰되었다. 그러나, TRP-SC(0.02), TRP(1:5:2)-15(0.4), TRP(1:5:2)-15(0.8) 그룹은 대조군(DEX) 그룹 및 TRP-Oral(04) 그룹에 비해 대퇴골 근위 영역에서 더 밀도가 높은 소주골 미세구조를 보였다.
도 21에서 확인할 수 있듯이, 정상 대조군 마우스는 DEX 처리된 마우스와 대조적으로 조밀하고 균일한 소주를 나타내었고, TRP-SC(0.02) 및 경구 TRP(1:5:2)-15(0.4 또는 0.8) 그룹은 대조군(DEX) 및 TRP-Oral(0.4) 그룹보다 구조적 보존(structural integrity)이 증가되고, 소주골 미세구조가 더 조밀한 것으로 나타났다.
실험예 8: 생화학적 분석
1일 1회 최종 처리 후, 20분 동안 2000 ×g에서 원심분리하여 마우스 전혈로부터 혈청 샘플을 수집하였다. 그 다음, 각 샘플에서 오스테오칼신(osteocalcin), procollagen I N-terminal pro-peptide (PINP), 및 C-terminal cross-linked telopeptide of type I collagen (CTx)의 혈청 수준을 제조업체의 지침에 따라 Mouse Osteocalcin ELISA kit (LifeSpan BioSciences, Inc. Seattle, WA, USA), Rat/Mouse PINP EIA kit (Immunodiagnostic Systems Holdings Ltd., Tyne & Wear, UK), 및 RatLaps™ CTx-I EIA (Immunodiagnostic Systems Holdings Ltd.) 각각을 사용하여 확인하였다. 또한, 혈청 칼슘 수준은 560 nm(Sigma-Aldrich)에서 비색 분석(colorimetric assay)을 통해 확인하였다. 결과는 도 22 내지 도 25에 나타내었다.
도 22에서 확인할 수 있듯이, DEX 처리 4주 후, 혈청 오스테오칼신 수치는 대조군(정상)군과 비교하여 유의한 변화가 없었다. 그러나 0.02 mg/kg TRP를 1일 1회 피하주사 하거나 TRP(1:5:7)-15를 4주간 경구 투여한 경우 혈청 오스테오칼신이 유의하게 증가하였다. 즉, TRP-SC(0.02)의 혈청 오스테오칼신 수치는 대조군(정상), 대조군(DEX), TRP-경구(0.4)군보다 각각 18.2%, 28.2%, 9.68% 높았고, TRP(1:5:7)-15(0.4) 및 TRP(1:5:7)-15(0.8) 그룹의 오스테오칼신 수치는 대조군(DEX) 대비 각각 34.9% 및 46.2% 증가했다.
반면에 도 23에서 확인할 수 있듯이 DEX 처리 후 혈청 PINP는 대조군(정상)군에 비해 26.0% 유의하게 감소하였다. TRP-SC(0.02)는 대조군(DEX)군에 비해 1.19배 더 높은 PINP를 나타냈고, TRP 0.4 또는 0.8 mg/kg에 해당하는 TRP(1:5:7)-15의 일일 경구 투여는 DEX 처리된 마우스에 비해서만 PINP 분비를 각각 18.6% 및 19.0% 증가시켰다. 반면 대조군(DEX) 대비 TRP-구강(0.4) 경구 투여 후 혈청 PINP가 회복되지 않음으로부터 TRP(1:5:7)-15로부터 TRP 경구 흡수가 강화됨을 확인하였다.
도 24로부터 혈청 CTx는 DEX 처리 4주 후에 유의하게 증가하여 대조군(정상) 그룹과 비교하였을 때 혈청 CTx가 48.9% 증가함으로써 심각한 골 흡수를 보여주었다. 반면에, TRP 처리군에서는 CTx 수치가 유의하게 증가하지 않았고, 경구 TRP(1:5:7)-15(0.4) 또는 TRP(1:5:7)-15(0.8)는 혈청 CTx의 감소를 25.3% 및 23.8% 더 크게 억제한 것으로부터 TRP(1:5:7)-15를 사용한 경구 치료가 골 흡수보다 골 형성을 더 많이 유도함을 확인하였다.
TRP 치료가 생쥐에서 뼈 흡수의 급격한 증가를 유발하는지 여부를 결정하기 위해 혈청 칼슘 레벨을 측정하였으며, 도 25에서 확인할 수 있듯이 DEX의 투여는 대조군(정상) 그룹과 비교하여 혈청 칼슘 수준을 유의하게 하향조절 되었다. 대조적으로, 모든 TRP 처리군은 DEX-유도된 골다공증 및 정상 대조군 마우스에 비해 유의하게 더 높은 혈청 칼슘 농도를 나타내었다. 또한, 0.02 mg/kg의 TRP를 SC 주사하거나 0.4 mg/kg TRP에 해당하는 TRP(1:5:7)-15를 경구 투여한 후 6시간째에 혈청 칼슘 수치가 대조군(정상) 대비 각각 최대 21.4% 및 25.7%로 상승하였고, 이후 대조군(정상)군과 동일한 수준으로 감소하였다. 그러나 경구 TRP(1:5:7)-15(0.8)로 처리된 마우스는 대조군(정상) 그룹보다 21.2%-42.5% 더 높은 혈청 칼슘 수준을 나타냈다. 종합해 볼 때, 이러한 관찰은 TRP(1:5:7)-15의 1일 1회 경구 투여가 주로 골 형성을 자극함으로써 DEX 유도 골다공증 마우스에서 골 회전율을 자극함을 보여준다
Claims (11)
- 테리파라타이드 (teriparatide),
라이신 결합 데옥시콜산 (L-lysine-linked deoxycholic acid) 및 데옥시콜산 (deoxycholic acid) 중 하나 이상, 및
알킬글리코사이드 (alkylglycoside)계 계면활성제로 이루어진 이온결합 복합체를 포함하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 알킬글리코사이드계 계면활성제는 n-도데실-β-D-말토사이드 (n-dodecyl-β-D-maltoside) 및 n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드 (n-Octyl-β-D-glucopyranoside) 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 라이신 결합 데옥시콜산은 테리파라타이드 1몰에 대하여 1 내지 7몰로 포함되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 데옥시콜산은 테리파라타이드 1몰에 대하여 1 내지 15몰로 포함되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 알킬글리코사이드계 계면활성제는 테리파라타이드에 대하여 1:1 내지 1:50 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물.
- 테리파라타이드 용액, 데옥시콜산 용액, 라이신 결합 데옥시콜산 용액 및 알킬글리코사이드계 계면활성제 용액을 각각 준비하는 제1 단계;
상기 제1 단계에서 준비한 테리파라타이드 용액에 알킬글리코사이드계 계면활성제 용액을 혼합하는 제2단계;
상기 제2 단계에 혼합 용액에 라이신 결합 데옥시콜산 용액을 혼합하는 제3 단계; 및
상기 제3 단계에 혼합 용액에 데옥시콜산 용액을 혼합하는 제4 단계;를 포함하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물의 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 테리파라타이드 용액, 데옥시콜산 용액, 라이신 결합 데옥시콜산 용액의 pH는 3 내지 8인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물의 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 제2 단계에서 알킬글리코사이드계 계면활성제는 테리파라타이드에 대하여 1:1 내지 1:50 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물의 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 제3 단계에서 라이신 결합 데옥시콜산은 테리파라타이드 1몰에 대하여 1 내지 7몰로 포함되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물의 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 제4 단계에서 데옥시콜산은 테리파라타이드 1몰에 대하여 1 내지 15몰로 포함되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물의 제조방법.
- 제6항에 있어서,
제4 단계의 혼합물에 만니톨 및 수크로오스를 첨가한 후, 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 경구용 약학적 조성물의 제조방법.
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