KR20240010453A - 결장직장암을 위한 휘발성 바이오마커 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이오마커, 및 결장직장암을 진단하기 위한 신규한 생물학적 마커에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 결장직장암을 검출하기 위한 에세이에서 진단적 및 예후적 마커로서의 상기 바이오마커의 용도, 및 해당 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료제로 결장직장암을 치료하는 효능을 결정하는 방법, 및 상기 에세이 및 방법을 수행하기 위한 장치에 관한 것이다. 상기 에세이는 정성적 및/또는 정량적이고, 대규모 스크리닝 및 임상 시험에 적응가능하다.
Description
본 발명은 바이오마커(biomarker), 특히, 배제하는 것은 아니지만, 결장직장암을 진단하기 위한 신규한 생물학적 마커에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 결장직장암을 검출하기 위한 에세이(assay)에서 진단적 및 예후적 마커로서의 상기 바이오마커, 또는 소위 시그니처 화합물(signature compound)의 용도, 및 해당 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료제로 결장직장암을 치료하는 효능을 결정하는 방법, 및 상기 에세이 및 방법을 수행하기 위한 장치에 관한 것이다. 상기 에세이는 정성적 및/또는 정량적이고, 대규모 스크리닝(screening) 및 임상 시험에 적응가능하다.
결장직장암(CRC)이 가장 이른 병기에서 진단될 때 CRC를 갖는 10명 중 9명 이상은 5년 이상 동안 그 질환에 대해 생존하는 것과 대조적으로, 가장 늦은 질환 병기에서 진단될 때에는 10명 중 1명 미만이 생존한다[1]. CRC에 대한 1차적인 진단의 기초로서 장 증상을 이용하는 것은 매우 불량한 양성 예측값을 갖는 것으로 나타났다[2]. 증상을 보이는 환자에서 CRC의 위험성은 상이한 조사에 의해 평가될 수 있다. 대장내시경은 최고의 표준 조사이지만, 대규모의 그 적용은 합병증을 제공하고, 그 비용-효과성은 상이한 증상의 예측값에 의존한다. 구아이악(Guaiac) 분변 잠혈 테스트는 CRC 검출에서 87-98%의 양호한 민감도를 갖지만, 가변성이 높고, 종종 불만족스러운 특이도(13-79%)를 가지며, 다수의 대변 샘플에 대한 반복 테스트를 필요로 한다. 지금까지, 분변 잠혈 테스트는 중간 테스트로서 사용하는 것이 권고되지도 이용가능하지도 않았다[3-6]. 분변 면역화학 테스트는 단일 대변 샘플을 필요로 한다. 4가지 시스템이 완전히 자동화되어 있으며, 헤모글로빈의 정량적 측정을 제공하여서, 특정 환경에 맞추어 양성도의 역치를 선택하게 한다. 그 결과, CRC에 대한 민감도 및 특이도에 관해 이용가능한 연구 데이터는 소수의 암에 기반한다. 상기 데이터는 양성도에 대한 선택된 역치에 기초하여 CRC에 대한 민감도가 85% 내지 95%의 특이도로 35% 내지 86%로 다양함을 제시한다[5,6]. 그러나, 초기 암에 대한 새로운 정량적 테스트의 민감도에 대한 데이터는 없다. 대규모 다기관 연구에서의 분변 면역화학 테스트와 비교할 때, 다중-표적 대변 DNA 테스트는 더 나은 특이도(92% 대 73%)를 보였지만, 민감도는 더 낮았다(90% 대 96%)[7].
분변-기반 테스트에 대한 대안적 접근법은 테스트의 본성과 상이한 휘발성 유기 화합물(VOC) 식별 시그니처를 갖는 하나 이상의 질환을 테스트할 가능성으로 인해 높은 순응도에 대한 잠재력을 갖는 날숨 테스트이다[8,9]. 가스 크로마토그래피 질량 분광법(GC-MS)을 이용하는 연구자는 CRC에 특이적인 호흡 VOC 프로필의 존재를 제시하였다[10]. GC-MS는 VOC 식별을 위한 좋은 기술이지만, 이것은 현실적으로 반-정량적이며, 따라서 상이한 연구 그룹에 의해 재현되기 위한 연구 소견의 능력에서 제한적이다. 아울러, 각각의 샘플에 대한 상당한 분석 시간이 있기 때문에, 이것은 그 자체로 당연히 고속 대량 분석에 적합하지 않다. 선택된 이온 유동 튜브 질량 분광법(SIFT-MS)은 정량적이라는 이점을 갖고, 실시간 분석을 허용한다[11,12].
따라서, 결장직장암을 앓는 환자를 확인하기 위한 신뢰할만한 비-침습적 마커가 필요하다. 결장직장암을 갖는 환자를 확인하기 위한 진단 방법은 환자에게 커다란 혜택일 것이며, 초기 치료와 개선된 예후의 가능성을 증가시킬 것이다.
본 발명자들은 이제 (진단적으로 및 예후적으로) 결장직장암의 지표로서의 몇 개의 바이오마커 또는 소위 시그니처 화합물을 밝혔다.
실시예에 기술된 것과 같이, 환자를 모집하였고, CRC 환자 및 비-CRC 환자(즉, 대조군)의 2개의 별개 군으로 나누었다. 상기 대조군은 정상, 양성 병리(pathology), 염증성 장 질환, 저 위험성 용종(polyp)(들), 중간 위험성 용종(들), 또는 고 위험성 용종(들)의 대장내시경 진단을 갖는 환자를 포함하였다. ReCIVA 시스템을 이용해 환자로부터 호흡을 수집하였고, GC-MS를 이용해 분석을 수행하였다. 확인된 시그니처 휘발성 유기 화합물(VOC) 중에서, 디메틸 설파이드, 페놀, 및 에스테르, 알코올, 알칸 및 비-방향족 환형 탄화수소 화합물 클래스 유래의 화합물을 포함하는 15 종은 CRC 및 비-CRC 환자 사이에서 통계적으로 유의하게 상이하였다. 본 발명자들은 VOC를 분석하면 호흡을 이용해 0.87의 ROC(receiver operating characteristic) 곡선 아래 면적, 77%의 민감도, 87%의 특이도, 및 97%의 음성 예측값으로 양성 및 음성 대조군으로부터 CRC의 존재를 강력하게 예측할 수 있음을 실증하였다. 단지 15 종의 VOC를 이용하여, CRC는 0.83의 ROC 곡선 아래 면적으로 대조군으로부터 검출될 수 있었다.
그러므로, 본 발명의 제1 측면에서, 결장직장암을 앓거나 이에 대한 소인을 갖는 대상체를 진단하거나, 대상체의 증상의 예후를 제공하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 분석하는 단계 및 상기 농도를 결장직장암을 앓지 않는 개체에서 시그니처 화합물의 농도에 대한 참조물과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서
참조물과 비교하여 (ⅰ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 (ⅱ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소는 상기 대상체가 결장직장암을 앓고 있거나, 이에 대한 소인을 갖거나, 또는 대상체의 증상의 부정적 예후를 제공함을 제시하며, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같다:
여기서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의(membered) 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다.
제2 측면에서, 치료제 또는 전문화된 식이요법(diet)을 이용해 결장직장암을 앓는 대상체의 치료 효능을 결정하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 분석하는 단계 및 상기 농도를 더 이른 시점에서 상기 대상체로부터 취한 샘플에서 시그니처 화합물의 농도에 대한 참조물과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서
(ⅰ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소, 또는 (ⅱ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가는 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적임을 제시하거나, 또는 (ⅰ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 (ⅱ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소는 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적이지 않음을 제시하고, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같다:
여기서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다.
제3 측면에서, 결장직장암을 앓거나 이에 대한 소인이 있는 대상체를 진단하거나, 대상체의 증상의 예후를 제공하기 위한 장치가 제공되며, 상기 장치는
(ⅰ) 테스트 대상체로부터의 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 결정하기 위한 수단; 및
(ⅱ) 결장직장암을 앓지 않는 개체로부터의 샘플에서 시그니처 화합물의 농도에 대한 참조물을 포함하고,
여기서, 상기 장치는 참조물과 비교하여 (ⅰ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 (ⅱ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소를 확인하여서, 상기 대상체가 결장직장암을 앓거나, 이에 대한 소인을 갖거나, 또는 대상체의 증상의 부정적 예후를 제공함을 제시하기 위해 사용되며, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같다:
여기서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다.
제4 측면에서, 본 발명은 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용해 결장직장암을 앓는 대상체의 치료 효능을 결정하기 위한 장치를 제공하며, 상기 장치는
(a) 테스트 대상체로부터의 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 결정하기 위한 수단; 및
(b) 더 이른 시점에서 대상체로부터 취한 샘플에서 시그니처 화합물의 농도에 대한 참조물을 포함하고,
여기서, 상기 장치는
(ⅰ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소, 또는 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가를 확인하여서, 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적임을 제시하거나; 또는
(ⅱ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소를 확인하여서, 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적이지 않음을 제시하기 위해 사용되며, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같다:
여기서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다.
본 발명의 제5 측면에 따르면, 결장직장암을 앓는 개체의 치료 방법이 제공되며, 상기 방법은
(ⅰ) 테스트 대상체로부터의 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 결정하는 단계; 및
(ⅱ) 테스트 대상체에게 치료제를 투여하거나 투여하였거나, 테스트 대상체에게 전문화된 식이요법를 행하는 단계;를 포함하며,
여기서, 참조물과 비교하여 (ⅰ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 (ⅱ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소는 상기 대상체가 결장직장암을 앓고 있거나, 이에 대한 소인을 갖거나, 또는 부정적 예후를 가짐을 제시하고, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같으며:
여기서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고; 및
상기 치료제 또는 전문화된 식이요법은 결장직장암의 진행을 방지, 감소 또는 지연시킨다.
제6 측면에서, 결장직장암을 앓거나 이에 대한 소인이 있는 대상체를 진단하거나, 대상체의 증상의 예후를 제공하기 위한 바이오마커로서의 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 시그니처 화합물의 용도가 제공되며, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같다:
여기서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다.
"농도를 결정하는"이란 표현은 샘플에서 반-정량적이고 피크 면적에 의해 제공되는 시그니처 화합물의 상대적인 풍부도(abundance) 또는 레벨(level)을 결정하는 것, 또는 시그니처 화합물의 실제 함량을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 실시예에 기술된 것과 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 프로필 프로피오네이트, 알릴 아세테이트, 메틸 2-부티노에이트, 1,3-디옥솔란-2-메탄올, 2,2,4-트리메틸-3-펜탄올, 시클로프로판, 3,4-디메틸-1,5-시클로옥타디엔, 또는 디메틸 설파이드의 농도에서의 증가가 결장직장암의 지표임을 실증하였다. 부가적으로, 본 발명자들은 놀랍게도 2-페녹시-에탄올, 1-운데카놀, 페놀, 또는 3-에틸-헥산의 농도에서의 감소가 결장직장암의 지표임을 보였다. 본 명세서에서 기술된 장법, 장치 및 용도는 또한 본 명세서에 기술된 시그니처 화합물의 유사체 또는 유도체의 농도, 풍부도 또는 레벨을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 에세이될 수 있는 화합물 군의 적합한 유사체 또는 유도체의 예는 알코올, 케톤, 방향족 화합물, 유기 산 및 기체(예컨대, CO, CO2, NO, NO2, H2S, SO2, 및 CH4)를 포함한다.
상기 시그니처 화합물이 C1-C12 에스테르인 구현예에서, 바람직하게는 상기 화합물은 C3-8 에스테르이고, 가장 바람직하게는 C5-6 에스테르이다.
상기 에스테르는 식 Ⅳ의 에스테르일 수 있다:
여기서, R6 및 R7은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다.
일부 구현예에서, R6 및 R7은 독립적으로 C1-4 알킬, C2-4 알케닐 또는 C2-4 알키닐이다. 보다 바람직하게는, R6 및 R7은 독립적으로 C1-3 알킬, C2-3 알케닐 또는 C2-3 알키닐이다. R6 및 R7은 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 에테닐, 프로페닐, 에티닐 또는 프로피닐일 수 있다. 가장 바람직하게는, R6은 메틸, 에틸 또는 1-프로피닐이다. 가장 바람직하게는, R7은 메틸, n-프로파닐 또는 2-프로페닐이다.
바람직한 구현예에서, 상기 C1-C12 에스테르는 프로필 프로피오네이트, 알릴 아세테이트 또는 메틸 2-부티노에이트이다.
상기 시그니처 화합물이 C3-20 시클로알칸 또는 C3-20 시클로알켄인 구현예에서, 바람직하게는 상기 화합물은 C3-15 시클로알칸 또는 C3-15 시클로알켄, 보다 바람직하게는 C3-10 시클로알칸 또는 C3-10 시클로알켄이다. 일부 구현예에서, 상기 화합물은 C3-6 시클로알칸, 보다 바람직하게는 C3-4 시클로알칸일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 화합물은 C5-10 시클로알켄, 보다 바람직하게는 C8-10 시클로알켄일 수 있다.
바람직하게는, 상기 C3-20 시클로알칸 또는 C3-20 시클로알켄은 시클로프로판, 또는 3,4-디메틸-1,5-시클로옥타디엔이다.
상기 시그니처 화합물이 C1-20 알칸, C2-20 알켄, 또는 C2-20 알킨인 구현예에서, 바람직하게는 상기 화합물은 C4-12 알칸, C4-12 알켄 또는 C4-12 알킨이고, 보다 바람직하게는 C6-10 알칸, C6-10 알켄 또는 C6-10 알킨이고, 보다 더 바람직하게는 C7-9 알칸, C7-9 알켄 또는 C7-9 알킨이고, 가장 바람직하게는 C8 알칸이다. 상기 알칸, 알켄 또는 알킨은 바람직하게는 분지쇄 알칸, 알켄 또는 알킨이다.
바람직한 구현예에서, 상기 C1-20 알칸, C2-20 알켄, 또는 C2-20 알킨은 3-에틸-헥산이다.
상기 시그니처 화합물이 식 Ⅰ의 알코올인 구현예에서,
바람직하게는 R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고; 및
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이다.
L1은 없거나, C1-3 알킬렌, C2-3 알케닐렌 또는 C2-3 알키닐렌일 수 있다. 바람직하게는, L1은 없거나, 메틸렌이다.
R1은 C3-12 시클로알킬 또는 3 내지 12 원의 헤테로사이클일 수 있다. 보다 바람직하게는, R1은 C5-6 시클로알킬 또는 5 내지 6 원의 헤테로사이클이다. 가장 바람직하게는, R1은 5 원의 헤테로사이클이다. R1은 1,3-디옥솔라닐일 수 있다.
대안적 구현예에서, L1은 없고, R1은 C3-18 알킬, C3-18 알케닐 또는 C3-18 알키닐이다. R1은 C4-15 알킬, C4-15 알케닐 또는 C4-15 알키닐일 수 있다. 보다 바람직하게는, R1은 C6-10 알킬, C6-12 알케닐 또는 C6-10 알키닐이고, 가장 바람직하게는 C7-9 알킬, C6-9 알케닐 또는 C6-9 알키닐이다. 상기 알킬, 알케닐 또는 알키닐은 바람직하게는 분지쇄 알킬, 알케닐 또는 알키닐이다. R1은 2,2,4-트리메틸-3-펜타닐일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 식 (Ⅰ)의 알코올은 1,3-디옥솔란-2-메탄올 또는 2,2,4-트리메틸-3-펜탄올이다.
상기 시그니처 화합물이 식 Ⅲ의 알코올인 구현예에서,
바람직하게는 R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다.
L2는 없거나, O일 수 있다.
L3은 없거나, C1-3 알킬렌, C2-3 알케닐렌 또는 C2-3 알키닐렌일 수 있다. 바람직하게는, L3은 없거나, 메틸렌 또는 에틸렌이다. 가장 바람직하게는, L3은 없거나, 에틸렌이다.
R4는 C6-12 아릴 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴일 수 있다. 보다 바람직하게는, R4는 페닐 또는 5 내지 6 원의 헤테로아릴이다. 가장 바람직하게는, R4는 페닐이다.
대안적 구현예에서, L2 및 L3은 없고, R3은 C3-18 알킬, C3-18 알케닐 또는 C3-18 알키닐이다. R3은 C5-17 알킬, C5-17 알케닐 또는 C5-17 알키닐일 수 있다. 보다 바람직하게는, R3은 C7-14 알킬, C7-14 알케닐 또는 C7-14 알키닐이고, 가장 바람직하게는 C10-12 알킬, C10-12 알케닐 또는 C10-12 알키닐이다. 바람직하게는, 상기 알킬, 알케닐 또는 알키닐은 직쇄 알킬, 알케닐 또는 알키닐이다. R3은 1-운데카닐일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 식 (Ⅲ)의 알코올은 2-페녹시-에탄올, 1-운데카놀 또는 페놀이다. 가장 바람직하게는, 상기 식 (Ⅲ)의 알코올은 페놀이다.
상기 시그니처 화합물이 식 (Ⅱ)의 설파이드인 구현예에서,
바람직하게는 R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다.
바람직하게는 R2 및 R3은 독립적으로 C1-3 알킬, C2-3 알케닐 또는 C2-3 알키닐이다. 가장 바람직하게는 R2 및 R3은 모두 메틸이다.
바람직한 구현예에서, 상기 설파이드는 디메틸 설파이드이다.
대안적 구현예에서, 상기 시그니처 화합물은 그 머무름 시간(retention time)에 의해 정의될 수 있다. 머무름 시간은 화합물이 크로마토그래피 컬럼에서 사용한 시간의 측정값이며, 상기 컬럼에 대한 그 휘발성 및 친화도에 의존한다. 보다 휘발성인 화합물은 더 낮은 머무름 시간을 가질 것이지만, 덜 휘발성인 화합물은 더 높은 머무름 시간을 가질 것이다.
상기 시그니처 화합물이 C1-C12 에스테르인 구현예에서, 바람직하게는 상기 화합물은 20-26분, 보다 바람직하게는 21-25분, 보다 바람직하게는 22-24분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 22.02, 22.24, 또는 23.53분의 머무름 시간을 갖는다. 대안적으로, 상기 화합물은 30-35분, 보다 바람직하게는 31-34분, 보다 바람직하게는 32-33분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 32.69분의 머무름 시간을 갖는다.
상기 시그니처 화합물이 C3-20 시클로알칸 또는 C3-20 시클로알켄인 구현예에서, 바람직하게는 상기 화합물은 2-7분, 보다 바람직하게는 3-6분, 보다 바람직하게는 4-5분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 4.75분의 머무름 시간을 갖는다. 대안적으로, 상기 화합물은 29-34분, 보다 바람직하게는 30-33분, 보다 바람직하게는 31-32분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 31.14분의 머무름 시간을 갖는다.
상기 시그니처 화합물이 식 (Ⅰ)의 알코올인 구현예에서, 바람직하게는 상기 화합물은 4-9분, 보다 바람직하게는 5-8분, 보다 바람직하게는 6-7분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 6.68분의 머무름 시간을 갖는다. 대안적으로, 상기 화합물은 29-34분, 보다 바람직하게는 30-33분, 보다 바람직하게는 31-32분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 31.71분의 머무름 시간을 갖는다.
상기 시그니처 화합물이 식 (Ⅱ)의 설파이드인 구현예에서, 바람직하게는 상기 화합물은 7-12분, 보다 바람직하게는 8-11분, 보다 바람직하게는 9-10분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 9.27분의 머무름 시간을 갖는다.
상기 시그니처 화합물이 C1-20 알칸, C2-20 알켄, 또는 C2-20 알킨인 구현예에서, 바람직하게는 상기 화합물은 19-24분, 보다 바람직하게는 20-23분, 보다 바람직하게는 21-22분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 21.26분의 머무름 시간을 갖는다. 대안적으로, 상기 화합물은 37-42분, 보다 바람직하게는 38-39분, 또는 40-41분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 38.74분, 또는 40.12분의 머무름 시간을 갖는다.
상기 시그니처 화합물이 식 (Ⅲ)의 알코올인 구현예에서, 바람직하게는 상기 화합물은 16-21분, 보다 바람직하게는 17-20분, 보다 바람직하게는 18-19분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 18.11분의 머무름 시간을 갖는다. 대안적으로, 상기 화합물은 22-27분, 보다 바람직하게는 23-26분, 보다 바람직하게는 24-25분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 24.65분의 머무름 시간을 갖는다. 대안적으로, 상기 화합물은 38-43분, 보다 바람직하게는 39-42분, 보다 바람직하게는 40-41분의 머무름 시간을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 화합물은 40.52분의 머무름 시간을 갖는다.
따라서, 가장 바람직한 구현예에서, 상기 제1 측면은 결장직장암을 앓거나 이에 대한 소인이 있는 대상체를 진단하거나, 대상체의 증상의 예후를 제공하기 위한 방법을 포함하며, 상기 방법은 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 분석하는 단계 및 상기 농도를 결장직장암을 앓지 않는 개체에서 시그니처 화합물의 농도에 대한 참조물과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 참조물과 비교하여 (ⅰ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 프로필 프로피오네이트, 알릴 아세테이트, 메틸 2-부티노에이트, 1,3-디옥솔란-2-메탄올, 2,2,4-트리메틸-3-펜탄올, 시클로프로판, 3,4-디메틸-1,5-시클로옥타디엔, 또는 디메틸 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 (ⅱ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 2-페녹시-에탄올, 1-운데카놀, 페놀, 또는 3-에틸-헥산, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소는 대상체가 결장직장암을 앓고 있거나, 이에 대한 소인을 갖거나, 또는 대상체의 증상의 부정적 예후를 제공함을 제시한다.
그 가장 바람직한 구현예에서, 상기 측면들은 앞선 문단에서 정의된 것과 동일한 시그니처 화합물의 증가 및/또는 감소를 검출하하는 것을 수반함이 인식될 것이다.
질환 진단 및 예후에 사용되는 임의의 유용한 바이오마커의 중요한 특징은 이것이 해당 질환에 대한 높은 민감도 및 특이도를 나타낸다는 것이다. 실시예에서 설명된 것과 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 테스트 대상체로부터의 날숨에서 발견되는 다수의 시그니처 화합물이 결장직장암에 대한 강력한 바이오마커로 기능하고, 따라서 상기 질환의 검출 및 예후를 위해 사용될 수 있음을 실증하였다. 게다가, 본 발명자들은 질환에 대한 바이오마커로서 이러한 시그니처 화합물을 이용하면 단순하고, 재생가능하고, 비-침습적이고, 저렴하며, 환자에 대한 불편함이 최소인 에세이를 도입할 수 있음을 보였다.
유리하게는, 본 발명의 방법 및 장치는 결장직장암을 진단하기 위한 비-침습적 수단을 제공한다. 상기 제1 측면에 따른 방법은 현재 결장직장암을 앓고 있거나 앓을 수 있는 대상체에 대하여 임상의가 최고의 치료 경로와 관련한 결정을 하는 것을 가능하게 하는데 유용하다. 상기 제1 측면의 방법은 임상의가 현재 결장직장암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 결정하는 것을 가능하게 하는데 유용하다. 게다가, 상기 제1 및 제2 측면의 방법은 결장직장암에 대한 추정적인 치료의 효능을 모니터링하는데 유용하다. 예를 들면, 치료는 수술, 또는 내시경 절제술의 존재 또는 부재시에 화학치료법, 화학방사선치료법을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
그러므로, 상기 제3 및 제4 측면에 따른 장치는 대상체의 증상의 예후를 제공하는데 유용하여서, 임상의는 상기 제1 측면에 따른 치료를 수행할 수 있다. 상기 제3 측면의 장치는 결장직장암에 대한 추정적인 치료의 효능을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 상기 방법 및 장치는 임상의에게 치료 요법을 안내하고, 이러한 치료 요법의 효능을 모니터링하는데 매우 유용하다. 임상의는 기존의 진단적 테스트와 접목해 본 발명의 장치를 이용하여 진단의 정확도를 개선할 수 있다.
상기 대상체는 수의과적 관심이 있는 임의의 동물, 예를 들어, 고양이, 개, 말 등일 수 있다. 그러나, 상기 대상체는 수컷 또는 암컷인 포유동물, 예컨대 인간인 것이 바람직하다.
바람직하게는, 샘플은 대상체로부터 취해지고, 이후 신체 샘플에서 시그니처 화합물의 농도가 측정된다.
검출되는 시그니처 화합물은 발효 프로필로 이어지는 휘발성 유기 화합물(VOC)로 알려질 수 있으며, 이것은 다양한 기술에 의해 신체 샘플에서 검출될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 화합물은 이것이 용해되는 액체 또는 반-고체 샘플 내에서 검출될 수 있다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 기체 또는 증기로부터 검출된다. 예를 들면, 상기 시그니처 화합물은 VOC이기 때문에, 이것은 샘플 또는 그의 일부로부터 나올 수 있고, 따라서 기체 또는 증기 형태로 검출될 수 있다.
상기 제3 또는 제4 측면의 장치는 테스트 대상체로부터 샘플을 수득하기 위한 샘플 추출 수단을 포함할 수 있다. 상기 샘플 추출 수단은 바늘 또는 주사기 등을 포함할 수 있다. 상기 장치는 액체, 기체 또는 반-고체일 수 있는 추출된 샘플을 수용하기 위한 샘플 수집 용기를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 샘플은 그 내부에 상기 시그니처 화합물이 존재하거나 분비되는 임의의 신체 샘플이다. 예를 들면, 상기 샘플은 소변, 대변, 모발, 땀, 타액, 혈액 또는 눈물을 포함할 수 있다. 본 발명자들은 상기 VOC가 혈액 내에서 발견되는 다른 화합물의 분해 생성물인 것으로 여긴다. 한 구현예에서, 혈액 샘플은 즉시 상기 시그니처 화합물의 레벨에 대해 에세이될 수 있다. 대안적으로, 혈액은 상기 시그니처 화합물의 농도가 결정되기 전에 저온, 예를 들면 냉장 또는 심지어 냉동으로 보관될 수 있다. 신체 샘플에서 상기 시그니처 화합물의 측정은 전혈 또는 가공된 혈액에 대해 행해질 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 샘플은 소변 샘플일 수 있다. 신체 샘플에서 상기 시그니처 화합물의 농도는 대상체로부터 취한 소변 샘플로부터 시험관내에서 측정되는 것이 바람직하다. 상기 화합물은 소변 샘플로부터 나오는 기체 또는 증기로부터 검출될 수 있다. 소변으로부터 나오는 기체상에서 상기 화합물을 검출하는 것이 바람직함이 인식될 것이다.
"신선한" 신체 샘플은 또한 대상체로부터 취해진 직후에 분석될 수 있음이 인식될 것이다. 대안적으로, 상기 샘플은 냉동 및 보존될 수 있다. 이후, 상기 샘플은 차후에 해동 및 분석될 수 있다.
그러나, 가장 바람직하게는, 상기 신체 샘플은 테스트 대상체로부터의 호흡 샘플일 수 있다. 상기 샘플은 바람직하게는 코로 들숨한 후에 입 및/또는 코를 통해 날숨을 행하여 대상체에 의해 수집될 수 있다. 바람직하게는, 상기 샘플은 대상체의 폐포 공기를 포함한다. 바람직하게는, 상기 폐포 공기는 날숨끝(end-expiratory) 호흡을 포획함으로써 사강(dead space) 공기에 대해 수집되었다. 이후, 튜브 쪽으로 호흡을 전달함으로써 호흡 백으로부터의 VOC를 바람직하게는 열 탈착 튜브 상에 사전-농축하였다.
따라서, 바람직한 구현예에서, C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도가 호흡 샘플에서 분석된다. 일부 구현예에서, 프로필 프로피오네이트, 알릴 아세테이트, 메틸 2-부티노에이트, 1,3-디옥솔란-2-메탄올, 2,2,4-트리메틸-3-펜탄올, 시클로프로판, 3,4-디메틸-1,5-시클로옥타디엔, 디메틸 설파이드, 2-페녹시-에탄올, 1-운데카놀, 페놀, 또는 3-에틸-헥산, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도가 호흡 샘플에서 분석된다. 바람직하게는, 3-에틸-헥산의 농도가 호흡 샘플에서 분석된다.
상기 제1 측면의 방법 또는 제3 측면의 장치에서 시그니처 화합물의 농도에서의 차이는 참조물과 비교하여 증가 또는 감소일 수 있다. 실시예에 기술된 것과 같이, 본 발명자들은 결장직장암을 앓는 많은 환자에서 상기 시그니처 화합물의 농도를 모니터링하였고, 이를 결장직장암을 앓지 않는 개체(즉, 참조물 또는 대조군)에서 동일한 화합물의 농도와 비교하였다. 그 결과, 결장직장암을 앓는 환자에서 상기 화합물의 농도에서 통계적으로 유의한 증가 또는 감소가 있었음을 실증하였다.
결장직장암을 앓는 환자에서 시그니처 화합물의 농도는 많은 인자들, 예를 들면 암이 얼마나 진행되었는지, 및 대상체의 연령 및 성별에 매우 의존할 것임이 인식될 것이다. 또한, 결장직장암을 앓지 않는 개체에서 시그니처 화합물의 참조물 농도는 어느 정도 변동될 수 있지만, 장기간에 걸쳐서 평균을 내면 상기 농도는 실질적으로 일정한 경향이 있음이 인식될 것이다. 게다가, 결장직장암을 앓는 한 군의 개체에서 시그니처 화합물의 농도는 결장직장암을 앓지 않는 다른 군의 개체에서 상기 화합물의 농도와 상이할 수 있음이 인식되어야 한다. 그러나, 암을 앓지 않는 개체에서 시그니처 화합물의 평균 농도를 결정하는 것이 가능하고, 이것은 시그니처 화합물의 참조물 또는 '정상' 농도로 나타낸다. 상기 정상 농도는 상기에서 논의된 참조물 값에 해당한다.
한 구현예에서, 본 발명의 방법은 바람직하게는 샘플, 예컨대 호흡 샘플 내에서 (즉, 그 내부의 다른 성분들을 참조물로 이용하여) 화합물들의 비를 결정하는 단계를 포함하고, 이후 질환에 대한 상기 마커들을 비교하여 이들이 상승 또는 감소되었는지 여부를 본다.
상기 시그니처 화합물은 바람직하게는 발효 프로필로 이어지는 휘발성 유기 화합물(VOC)이며, 이것은 다양한 기술에 의해 신체 샘플에서 또는 이로부터 검출될 수 있다. 따라서, 상기 화합물은 기체 분석기를 이용해 검출될 수 있다. 상기 시그니처 화합물을 검출하기 위한 적합한 검출기의 예는 바람직하게는 전기화학적 센서, 반도체 금속 산화물 센서, 석영 결정 미세균형 센서, 광학 염료 센서, 형광 센서, 전도성 폴리머 센서, 복합 폴리머 센서, 또는 광학 분광기를 포함한다.
본 발명자들은 상기 시그니처 화합물이 GC-MS 또는 GC-TOF를 이용해 신뢰할 만하게 검출될 수 있음을 실증하였다. 전용 센서가 검출 단계를 위해 사용될 수 있었다.
상기 참조물 값은 통계적으로 유의미한 수의 대조군 샘플(즉, 결장직장암을 앓지 않는 대상체로부터의 샘플)을 에세이함으로써 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명의 제3 또는 제4 측면의 장치에 따른 참조물 (ⅱ)는 (에세이를 위한) 대조군 샘플일 수 있다.
상기 장치는 바람직하게는 시그니처 화합물(들)에 해당하는 양성 대조군(가장 바람직하게는 용기 내에 제공됨)을 포함한다. 상기 장치는 바람직하게는 음성 대조군(바람직하게는 용기 내에 제공됨)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 장치는 참조물, 양성 대조군 및 음성 대조군을 포함할 수 있다. 상기 장치는 또한 필요시 추가적인 대조군, 예컨대 농도에 대한 참조물을 제공하기 위한 "스파이크-인(spike-in)" 대조군, 및 각각의 시그니처 화합물, 또는 그의 유사체 또는 유도체에 대한 추가적인 양성 대조군을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 참조물의 정상(즉, 대조군) 및 증가된/감소된 레벨 사이의 상기 시그니처 화합물의 농도에서의 차이가 테스트 대상체에서 결장직장암의 존재를 제시하는 생리학적 마커로 사용될 수 있음을 인식하였다. 대상체가 참조물, 대조군 값에서 해당 화합물의 '정상' 농도보다 상당히 더 높은/낮은 하나 이상의 시그니처 화합물의 증가된/감소된 농도를 갖는다면, 상기 대상체는 해당 화합물의 농도가 '정상' 농도보다 약간만 더 높은/낮은 경우보다 암, 또는 보다 진행된 증상을 가질 위험성이 더 높을 것임을 인식할 것이다.
본 발명자들은 테스트 개체에서 본 명세서에서 언급된 시그니처 화합물의 농도가 (실시예에 기술된 방법을 이용해 계산될 때) 참조물 농도보다 통계적으로 더 높았음을 주목하였다. 이것은 본 명세서에서 시그니처 화합물의 '증가된' 농도로 나타낼 수 있다.
숙련된 기술자는 통계적으로 유의미한 수의 대조군 개체에서 시그니처 화합물의 농도, 및 테스트 대상체에서 화합물의 농도를 측정하고, 이후 해당 특징을 이용해 테스트 대상체가 화합물의 농도에서 통계적으로 유의미한 증가/감소를 갖는지 여부를 결정하고, 이에 따라 대상체가 결장직장암을 앓고 있는지 여부를 추론하는 방법을 인식할 것이다.
상기 제2 측면의 방법 및 제4 측면의 장치에서, 참조물에서 대응하는 농도와 비교하여 신체 샘플에서 시그니처 화합물의 농도에서의 차이는 치료제, 및 수술적 절제술을 이용해 대상체의 결장직장암을 치료하는 효능의 지표이다. 상기 차이는 참조물 값과 비교하여 신체 샘플에서 시그니처 화합물의 농도에서의 증가 또는 감소일 수 있다. 상기 구현예에서, 참조물 샘플은 더 이른 시점에서 대상체로부터 취한 샘플이다. 상기 참조물 샘플은 치료를 시작하기 전에 대상체로부터 취해질 수 있다. 따라서, 상기 방법 및/또는 장치는 치료의 시작 후에 대상체에서 개선이 일어났는지 여부를 보여줄 수 있다.
대안적으로, 또는 부가적으로, 상기 참조물 샘플은 치료가 시작된 이후에 대상체로부터 취한 샘플을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 참조물 샘플은 치료를 시작한 이후에 상이한 시점에서 대상체로부터 취한 복수의 샘플을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 복수의 샘플은 1일 이상 간격, 또는 1주 이상 간격, 1개월 이상 간격, 또는 심지어 1년 이상 간격일 수 있다. 예를 들면, 샘플은 매주, 매월 또는 매년 적어도 1회, 2회 또는 3회 대상체로부터 취해질 수 있다. 상기 샘플은 균등하게 이격된 간격으로 또는 무작위로 이격된 간격으로 취해질 수 있다. 상기 복수의 샘플은 또한 치료를 시작하기 전에, 또는 치료가 시작된 후에 대상체로부터 취한 샘플을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 제2 측면의 방법 및 제4 측면의 장치는 개선이 진행중인지 여부를 결정할 수 있다.
신체 샘플에서 화합물의 농도가 참조물에서 대응하는 농도보다 낮은 구현예라면, 이것은 치료제가 테스트 대상체에서 암을 성공적으로 치료하고 있음을 시사할 것이다. 이것은 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물에 적용될 것이다.
반대로, 신체 샘플에서 시그니처 화합물의 농도가 참조물에서 대응하는 농도보다 높은 경우라면, 이것은 치료제가 암을 성공적으로 치료하지 않고 있음을 시사할 것이다. 이것은 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물에 적용될 것이다.
다른 측면에서, 결장직장암을 앓는 대상체를 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용해 치료하는 효능을 결정하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 분석하는 단계 및 상기 농도를 결장직장암을 앓지 않는 개체에서 시그니처 화합물의 농도에 대한 참조물과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서
(ⅰ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소, 또는 (ⅱ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가는 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적임을 제시하거나, 또는 (ⅰ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 (ⅱ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소는 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적이지 않음을 제시하고, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같다:
여기서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다.
다른 측면에서, 본 발명은 결장직장암을 앓는 대상체를 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용해 치료하는 효능을 결정하기 위한 장치를 제공하며, 상기 장치는
(a) 테스트 대상체로부터의 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 결정하기 위한 수단; 및
(b) 결장직장암을 앓지 않는 개체로부터의 샘플에서 시그니처 화합물의 농도에 대한 참조물;을 포함하고,
여기서, 상기 장치는
(ⅰ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소, 또는 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가를 확인하여서, 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적임을 제시하거나; 또는
(ⅱ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소를 확인하여서, 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적이지 않음을 제시하기 위해 사용되며, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같다:
여기서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다.
(임의의 부속하는 청구항, 요약 및 도면을 포함하여) 본 명세서에 기술된 모든 특징들 및/또는 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계들은, 이러한 특징들 및/또는 단계들의 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고는, 임의의 조합으로 임의의 상기 측면들과 조합될 수 있다.
본 발명을 보다 잘 이해하고 이에 대한 구현예가 어떻게 효과적으로 수행될 수 있는지를 보이기 위하여, 이제 예를 들어 부속하는 도면이 참조로서 기재될 것이다:
도 1은 CRC 환자(n=162) 및 비-CRC 환자(n=1270)로부터 검출된 모든 VOC를 이용하여 CRC를 예측하기 위한 ROC(receiver operating characteristic) 곡선을 보여준다. ROC 아래의 면적은 0.87이다.
도 2는 비-CRC 환자로부터 CRC 환자를 결정함에 있어서 15 종의 유의미한 VOC의 예측력을 도시하기 위한 ROC 곡선을 보여주며, 곡선 아래의 면적은 0.83이다.
도 3a 내지 도 3d는 비-CRC 대 CRC 환자의 호흡에서 4 종의 에스테르의 풍부도를 보여준다. 4 종의 에스테르인 프로필 프로피오네이트(VOC 1, 도 3a), 알릴 아세테이트(VOC 8, 도 3b), 알릴 아세테이트에 중첩하는 에스테르(VOC 9, 도 3c), 및 메틸 2-부티노에이트(VOC 12, 도 3d)는 모두 CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC를 갖는 환자의 호흡에서 더 높은 풍부도를 보였다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커(whisker)는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
도 4는 CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC를 갖는 환자에서 현저하게 더 높은 호흡에서의 디메틸 설파이드의 풍부도를 보여준다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 비-CRC 대 CRC 환자의 호흡에서 3 종의 알칸의 풍부도를 보여준다. 알칸(VOC 3, 도 5a), 알칸(VOC 11, 도 5b), 및 3-에틸-헥산(VOC 15, 도 5c)은 모두 CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC를 갖는 환자의 호흡에서 현저하게 낮은 풍부도로 존재하였다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
도 6a 내지 도 6d는 비-CRC 대 CRC 환자의 호흡에서 4 종의 알코올의 풍부도를 보여준다. 1,3-디옥솔란-2-메탄올(VOC 4, 도 6a) 및 2,2,4-트리메틸-3-펜탄올(VOC 10, 도 6c)은 CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC를 갖는 환자의 호흡에서 현저하게 더 높은 풍부도로 존재하는 것으로 나타났다. 2-페녹시-에탄올(VOC 5, 도 6b) 및 1-운데카놀(VOC 13, 도 6d)은 CRC 환자에서 더 낮은 풍부도로 존재하는 것으로 나타났다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
도 7은 페놀(VOC 14)의 풍부도로 보여주며, CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC 환자의 호흡에서 더 낮았다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 비-CRC 대 CRC 환자의 호흡에서 2 종의 비-방향족 환형 탄화수소의 풍부도를 보여준다. 시클로프로판(VOC 6, 도 8a) 및 3,4-디메틸-1,5-시클로옥타디엔(VOC 7, 도 8Bb)은 모두 CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC를 갖는 환자의 호흡에서 현저하게 더 높은 풍부도로 존재하였다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
표 1은 1444명의 환자에 대한 대장내시경에서의 진단을 보여준다.
표 2는 주된 병리 군에 의해 포함된 환자의 인구통계를 보여준다.
표 3은 TD 튜브 보관 시간(일)을 보여주며, n=1432이다.
표 4는 모든 양성 및 음성 대조군 환자(n=1270)로부터 CRC 환자(n=162)를 구별하는데 기여하는 상위 식별 특징의 목록을 보여주며, RF(Random Forest) 및 ANOVA 특징 선택에 따라 등급화하였다(각각의 방법에서 상위 25개 특징이 나열되어 있음).
표 5는 통계적 점수와 함께 CRC 바이오마커가 될 가능성이 있는 것들로 정의되는 상위 15 종의 VOC의 구현예를 보여준다.
표 6은 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 4 종의 현저한 에스테르의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
표 7은 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 디메틸 설파이드의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
표 8은 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 3 종의 현저한 알칸의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
표 9는 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 4 종의 현저한 알코올의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
표 10은 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 페놀의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
표 11은 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 2 종의 현저한 비-방향족 환형 탄화수소의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
도 1은 CRC 환자(n=162) 및 비-CRC 환자(n=1270)로부터 검출된 모든 VOC를 이용하여 CRC를 예측하기 위한 ROC(receiver operating characteristic) 곡선을 보여준다. ROC 아래의 면적은 0.87이다.
도 2는 비-CRC 환자로부터 CRC 환자를 결정함에 있어서 15 종의 유의미한 VOC의 예측력을 도시하기 위한 ROC 곡선을 보여주며, 곡선 아래의 면적은 0.83이다.
도 3a 내지 도 3d는 비-CRC 대 CRC 환자의 호흡에서 4 종의 에스테르의 풍부도를 보여준다. 4 종의 에스테르인 프로필 프로피오네이트(VOC 1, 도 3a), 알릴 아세테이트(VOC 8, 도 3b), 알릴 아세테이트에 중첩하는 에스테르(VOC 9, 도 3c), 및 메틸 2-부티노에이트(VOC 12, 도 3d)는 모두 CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC를 갖는 환자의 호흡에서 더 높은 풍부도를 보였다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커(whisker)는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
도 4는 CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC를 갖는 환자에서 현저하게 더 높은 호흡에서의 디메틸 설파이드의 풍부도를 보여준다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 비-CRC 대 CRC 환자의 호흡에서 3 종의 알칸의 풍부도를 보여준다. 알칸(VOC 3, 도 5a), 알칸(VOC 11, 도 5b), 및 3-에틸-헥산(VOC 15, 도 5c)은 모두 CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC를 갖는 환자의 호흡에서 현저하게 낮은 풍부도로 존재하였다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
도 6a 내지 도 6d는 비-CRC 대 CRC 환자의 호흡에서 4 종의 알코올의 풍부도를 보여준다. 1,3-디옥솔란-2-메탄올(VOC 4, 도 6a) 및 2,2,4-트리메틸-3-펜탄올(VOC 10, 도 6c)은 CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC를 갖는 환자의 호흡에서 현저하게 더 높은 풍부도로 존재하는 것으로 나타났다. 2-페녹시-에탄올(VOC 5, 도 6b) 및 1-운데카놀(VOC 13, 도 6d)은 CRC 환자에서 더 낮은 풍부도로 존재하는 것으로 나타났다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
도 7은 페놀(VOC 14)의 풍부도로 보여주며, CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC 환자의 호흡에서 더 낮았다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 비-CRC 대 CRC 환자의 호흡에서 2 종의 비-방향족 환형 탄화수소의 풍부도를 보여준다. 시클로프로판(VOC 6, 도 8a) 및 3,4-디메틸-1,5-시클로옥타디엔(VOC 7, 도 8Bb)은 모두 CRC가 없는 경우와 비교하여 CRC를 갖는 환자의 호흡에서 현저하게 더 높은 풍부도로 존재하였다. 중앙값은 진한 수평선으로 나타내고, 휘스커는 최소값 및 최대값을 나타내고, 박스는 사분위수 범위를 나타낸다.
표 1은 1444명의 환자에 대한 대장내시경에서의 진단을 보여준다.
표 2는 주된 병리 군에 의해 포함된 환자의 인구통계를 보여준다.
표 3은 TD 튜브 보관 시간(일)을 보여주며, n=1432이다.
표 4는 모든 양성 및 음성 대조군 환자(n=1270)로부터 CRC 환자(n=162)를 구별하는데 기여하는 상위 식별 특징의 목록을 보여주며, RF(Random Forest) 및 ANOVA 특징 선택에 따라 등급화하였다(각각의 방법에서 상위 25개 특징이 나열되어 있음).
표 5는 통계적 점수와 함께 CRC 바이오마커가 될 가능성이 있는 것들로 정의되는 상위 15 종의 VOC의 구현예를 보여준다.
표 6은 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 4 종의 현저한 에스테르의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
표 7은 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 디메틸 설파이드의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
표 8은 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 3 종의 현저한 알칸의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
표 9는 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 4 종의 현저한 알코올의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
표 10은 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 페놀의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
표 11은 CRC를 갖거나(n=162) CRC가 없는(n=1270) 환자 사이에서 TD-GC-MS에 의해 측정되는 2 종의 현저한 비-방향족 환형 탄화수소의 풍부도를 피크 면적 카운트로 측정해 보여준다.
실시예
본 발명자들은 결장직장암(CRC) 및 선종형(adenomatous) 용종의 예측을 위하여 날숨에 존재하는 휘발성 유기 화합물(VOC)의 사용을 조사하였다.
본 연구의 목적은 (ⅰ) 대장내시경으로 진단될 때 결장의 CRC, 선종형 용종, 양성 질환을 갖거나, 결장의 질환이 없는 환자의 큰 코호트(cohort)로부터 호흡 VOC를 수집 및 비교하고; (ⅱ) 미량 레벨의 VOC의 검출을 허용하는 기술을 이용하고; (ⅲ) 진단 모델을 구축함으로써 양성 질환 또는 정상 결장을 갖는 대상체와 비교하여 CRC 및 선종형 용종을 갖는 환자의 군에서 호흡 테스트의 진단 정확도를 조사하고; 및 (ⅳ) 임의의 유의미한 이온을 식별 및 생물학적으로 특징분석하는 것이었다.
재료 및 방법
윤리적 승인
결장직장 호흡 분석(COBRA) 연구는 2017년 4월 28일에 REC 승인(17EE0112), 및 2017년 5월 2일에 HRA 승인(East of England- Essex REC)을 받았다. 위치 특이적 평가가 또한 연구 후원자의 승인과 함께 모두 7 곳의 참여 병원에서 수행되었다.
영국 대장암 스크리닝 프로그램(BCSP)에 등록된 환자로부터 호흡을 샘플링하기 위하여, COBRA는 BCSP 연구 자문 위원회로부터 특별한 승인을 받았다(BCSP ID189, 2017년 1월 18일에 승인됨). 게다가, COBRA는 국립 건강 연구소(NIHR) 포트폴리오를 채용하였다. 이것은 NIHR 소속 연구 간호사에 의해 모집이 수행되게 하였다.
본 연구는 1964년 헬싱키에서 제18차 세계 의료 협회에 의해 채용되고 이후에 개정된 인간 대상체에 대한 연구에 관여하는 내과의사를 위한 권고에 따라 수행되었다.
방법론
COBRA는 2017년 6월 5일에 시작하여 3년에 걸쳐서 7 곳의 런던 병원에서 2차 진료 중인 결장직장 조사를 받는 환자의 호흡을 샘플링하기 위해 디자인된 전형적이고 비-무작위인 코호트 연구였다.
포함 기준
서면 동의서를 제공할 수 있고, 그 일상적 임상 진료의 일부로서 하부 위장 내시경(대장내시경)을 받거나, 조직학적으로 확인된 결장직장 선암종의 선택적 절제술을 받도록 스케줄된 18세 내지 90세 연령을 포함하는 참가자.
불포함 기준
서면 동의서를 제공할 능력이 없거나 이를 할 수 없는 환자, 및 18세 미만 또는 90세 초과 연령의 임의의 환자.
환자 선택 - 내시경 유닛
환자를 본 연구에 참여하도록 초대하였고, 4 곳의 참여하는 런던-기반 BCSP 내시경 센터 중 하나의 내시경 유닛에서 계획된 대장내시경을 기다렸다. BCSP 대장내시경을 기다리는 환자를 우선적으로 접촉했는데, 그 이유는 (정의에 의해 BCSP 참여자는 모두 샘플링 시점에 분변 잠혈 테스트에 양성이었음을 고려하면) 결장 용종을 가질 기회가 대략 40%로 추정되었고[13], CRC의 기회가 일반적인 개체군에서보다 높았기 때문이다. 그러나, 2주 대기(2WW) 또는 감시 대장내시경에 참여하는 환자들을 포함하는 대장내시경에 참여하는 임의의 다른 환자도 또한 적격이었다. 내시경 유닛에서 샘플링된 환자는 그날 이전에 사전-선택되지는 않았으며, 이들은 내원시에 샘플링되었고, 연구 조직자 및 호흡 샘플러 모두 이들을 샘플링하기 이전에 환자의 의료 이력 또는 기록을 보지 않았다. 모두 평소의 의료 종사자에 의해 임상적 배경에서 대장내시경을 받거나, BCSP의 일부로서 참여하였다. 모든 환자는 입으로 섭취하지 않았고, 보통의 내시경 지침에 따라 최소 6시간 동안 금식하였다. 환자는 내시경 절차 실에 들어가기 전에 앉은 자세로 다른 환자와 떨어져서 옆방에서 샘플링되다. 이것은 내시경실 자체에 존재하는 진정 약물 또는 마취용 인후 스프레이의 임의의 효과를 피하기 위해 행하였다.
환자 선택 - 기관(theatre)
현재 활성인 CRC, 특히 상피 내(in situ)(결장 내) 결장직장 선암종을 갖는 것으로 알려진 연구를 위해 환자의 부가적인 코호트에 접근하여 종양을 수술적 절제술의 계획을 세웠다. 상기 환자들은 참여하는 3 곳의 런던 병원 중 1 곳에서 확인되었다. 포함된 환자는 수술 시점에 화학치료법을 받지 않았다. 수술하는 날 아침에 환자에게 접근하여 수술 전에 호흡 샘플을 제공할 수 있는지 여부를 문의하였다. 모든 환자는 입으로 섭취하지 않았고, 보통의 기관 지침에 따라 최소 6시간 동안 금식하였다. 환자는 기관에서 분리되어 다른 환자와 떨어져서 앉은 자세로 수술 구획 내의 옆방에서 샘플링되었다. 모든 호흡 샘플은 마취 또는 수술 절차 이전에 마취실로 옮기기 전에 채취되었다.
호흡 샘플 수집
환자는 내시경으로부터 또는 기관에서 모집되었는지 여부에 무관하게 동일한 방식으로 샘플링되었다. 상기 호흡 테스트는 공개된 최적화 세팅에 따라 ReCIVA™ CE 마크의 휴대용 호흡 테스트 장치(Owlstone, Medical Ltd, Cambridge, UK)에 장착된 멸균 고무 안면마스크(일회용)를 착용하고 정상적인 반복적 호흡을 수행하는 참가자가 포함되었다[14]. 간략하게, 날숨 동안에, 내장된 펌프를 사용하여 200 ㎖/분의 유량으로 튜브 당 500 ㎖의 최종 부피를 갖는 4개의 열 탈착(TD) 튜브(Markes International, Llantrisant, UK)를 통해 마스크로부터 호흡이 유입되었다(이산화탄소 레벨 상승에 따라 촉발됨). 상기 TD 튜브는 VOC를 유지하도록 디자인된 Carbograph/Tenax 흡착상(sorbent phase)으로 포장되었다. 호흡 분획에 대한 '전체 호흡' 설정이 선택되었다. 호흡 테스트(대략 5분간 지속됨) 후, 호흡 VOC가 TD 튜브의 흡착제에 포획되어 탈착 및 빠져나올 수 없는 것을 보장하기 위하여 특정 스패너를 사용하여 각 말단에 황동 캡을 나사로 조여 TD 튜브를 밀봉하였다. 연구자들은 또한 과거 의료 이력, 체질량지수(BMI), 약물, 흡연 상태 및 마지막 식사와 같은 주요 정보를 상세히 설명하는 임상 세부 양식을 작성하였다. 이후, 캡핑된 4개의 TD 튜브 세트를 플라스틱으로 밀봉된 샘플링 백에 두고, 특유의 연구 식별자, 및 샘플링 날짜, 시간 및 위치를 라벨로 붙였다.
검체 분석
호흡 VOC는 2가지 질량 분광법 기술을 이용해 분석하였다: 양성자-전달-반응 질량 분광법(PTR-MS) 및 가스 크로마토그래피 질량 분광법(GC-MS). 각각의 환자로부터의 4개의 TD 튜브 중 3개는 PTR-MS(3개의 상이한 시약 이온 H3O+, NO+, O2 +를 이용함)를 이용하고, 1개의 TD 튜브는 GC-MS를 이용해 분석하였다. 5977A MSD(Agilent Technologies, Cheshire, UK)를 갖는 GC-MS Agilent 7890B GC를 Markes TD-100(Markes Ltd, Llantrisant UK) TD 유닛과 커플링해 사용하였다. GC-MS 분석은 50 ㎖/분의 일정한 헬륨 흐름과 콜드 트랩 시스템(U-T12ME-2S, Markes International Ltd, Llantrisant, UK)을 이용하는 2단계 탈착 방법을 이용해 수행하였다. 이후, 샘플을 200℃로 가열된 모세관에 의해 GC 시스템으로 전달하였다. 화합물 분리에 도입된 크로마토그래피 컬럼은 Zebron ZB-642 모세관 컬럼(60 m × 0.25 ㎜ ID × 1.40 ㎛ df; Phenomenex Inc, Torrance, USA)이었다.
GC-MS 데이터는 MassHunter 소프트웨어 버전 B.07 SP1(Agilent Technologies)를 이용해 추출하였고, 추가 분석은 맞춤형으로 디자인된 자체 제작 소프트웨어 MSHub를 이용해 수행하였다[15,16]. VOC 피크 확인은 NIST 질량 스펙트럼 라이브러리(National Institute of Standards and Technology 버전 2.0)를 이용해 수행하였다[17].
GC-MS는 호흡시 VOC의 분석을 위한 최고의 표준으로 간주된다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 높은 신뢰성과 양호한 VOC 식별 성능을 특징으로 하는 상기 플랫폼을 사용하기로 선택하였다. PTR-MS는 환경 연구에 사용되는 새로운 기술이다. PTR-MS는 높은 처리량과 실시간 결과에 의해 특정된다. GC-MS와 대조적으로, PTR-MS는 외부 교정 없이 화합물의 직접적인 정량화를 제공한다. 이러한 측면은 두 기술을 상호 보완적으로 사용할 수 있게 한다. GC-MS는 신뢰할만한 화합물 식별을 제공하고, PTR-MS는 높은 처리량 분석 및 정량적 결과를 제공한다. 이러한 이유로, GC-MS는 "발견" 기술로 사용되고, PTR-MS는 빠른 실시간 방법을 제공하기 위해 사용되었다. 바이오마커 식별 목적을 위하여, GC-MS 데이터만 논의될 것이다. ReCIVA® 호흡 샘플러는 4개의 호흡 샘플을 동시에 수집하는 능력을 갖고 있어서, 환자에 대한 부가적인 호흡 샘플링 시간을 추가하지 않고도 2가지 질량 분광법 플랫폼을 사용할 수 있게 한다.
데이터 분석
인구통계 및 임상 데이터
CRC 군 및 대조군 전체의 잠재적 교란 인자는 연속 변수에 대한 Mann-Witney U 테스트 및 이산 변수에 대한 χ2 이산변수를 테스트를 이용해 평가하였다. p < 0.05를 이용해 통계적 유의성을 할당하였다. 상기 통계 분석은 통계 소프트웨어 SPSS(버전 25, IBM)를 이용해 수행하였다.
호흡 VOC 데이터
TD-GC-MS 분석으로부터의 미가공(raw) 데이터를 Imperial College London에서 만든 맞춤형 스펙트럼 처리 프로그램인 MSHub를 사용해 처리하였다[15,16]. 이것은 GNPS(Global Natural Product Social Molecular Networking) 환경에서 사용하기 위한 데이터세트-기반 스펙트럼 디콘볼루션(deconvolution) 도구였다. MSHub가 미가공 데이터를 처리하는 단계는 다음과 같았다: 샘플 내/샘플 간 질량 드리프트(drift) 수정, 노이즈 필터링 및 기준선 수정, 샘플 간 피크 정렬, 피크 검출 및 통합, NMF 디콘볼루션, 이후 피크 디콘볼루션[15,16]. 이것은 번호가 매겨진 특징, 그 머무름 시간, 및 각각의 환자의 호흡 샘플에서 각각의 특징의 피크 면적 카운트로 표시되는 다수의 이온(또는 VOC)으로 이루어진 출력을 제공하였다. 모든 특징들이 모든 샘플 내에 존재하는 것은 아니었다. 게다가, 소수의 샘플에 존재하는 특정 머무름 시간에 대해 전체 피크의 매우 작은 부분을 구성하는 이온인 몇 가지 특징이 확인되었다. 전체 피크의 20% 미만을 구성하는 이온은 통계 분석에는 포함되었지만, 상이한 임상 환자군의 비교에서 가장 차별화된 특징 목록에는 고려되지 않았다. 수득된 스펙트럼으로부터의 표적 이온은 잠재적 확인을 위해 온라인 NIST 라이브러리를 이용해 일치시켰다[17]. MSHub는 GC 디컨볼루션을 위해 단층 신경 네트워크를 이용하고, 이것은 전체 데이터 세트에서 정보를 추출할 수 있게 하며(한 번에 단일 스펙트럼인 것과 대조적임), 따라서 특히 대규모 연구에 대해 성공적인 전략인 데이터 내의 모든 스펙트럼 정보를 이용한다.
통계적 분석
단변량 및 다변량 데이터 분석 기술 모두를 결과에 적용하여 (ⅰ) 군들 사이에 최고의 식별 능력을 갖는 VOC 구성성분을 식별하고; (ⅱ) 다변량 식별 분석 모델을 개발하였다.
상기 Mann-Whitney U 테스트를 이용하여 선택된 군들, 즉 CRC 군 대 비-CRC 군 사이의 측정된 VOC 레벨을 비교하거나, 종양의 샘플링 환경 또는 해부학적 위치와 같은 잠재적 교란 인자를 조사하였다. 통계적 유의성을 나타내기 위한 레벨로서 <0.05의 p 값을 취하였다.
비-파라미터성(Kruskal-Wallis) ANOVA 테스트를 이용하여 7개의 모든 포함된 연구 병리 군(대장내시경 결과에 따른 진단에 따라 그룹화됨) 사이에서 측정된 VOC 레벨(이온으로 나타낸 VOC)을 비교하였다. 이것은 임의의 7개 환자군이 군들 간의 구별에 통계적으로 유의한 VOC의 풍부도를 함유하는지 여부를 결정하기 위해 수행되었다. 통계적 유의성을 나타내기 위한 레벨로서 <0.05의 p 값을 취하였다. 상기 기초 통계 분석은 통계 소프트웨어 SPSS(버전 25, IBM)를 이용해 수행하였다[18].
금식 시간 및 종양의 T 병기와 같은 VOC 풍부도에 대한 임의의 교란 영향을 확립하기 위해 추가 조사가 필요한 임상 파라미터는 Pearson 상관 계수(금식 시간의 경우)를 이용하고, 종양 T 병기 비교의 경우에는 VOC 풍부도 경향을 플로팅함으로써 조사하였다. 이것은 SPSS(버전 25, IBM) 및 Microsoft Excel v16.43을 이용해 행하였다.
기계 학습 예측 모델
Imperial College London의 고성능 컴퓨터 시설을 이용하여 각각의 환자의 호흡 샘플에서 식별되지 않은 특징에 대한 모든 풍부도 데이터(각각의 샘플에서 1024개의 특징이 식별됨), 및 각각의 환자에 대한 광범위한 메타데이터를 처리하는 기계 학습 파이프라인을 실행하였다. 데이터는 기계 학습 파이프라인의 일부로 표준화되고, 분산은 안정화되고, 로그 변환되었다. 무작위 포레스트, 알파넷, SVM, 라쏘(lasso) 및 탄력적 기계 학습 예측 방법을 독립적으로 이용하여 병리군의 모든 조합과 순열을 비교하였다. 연령이 VOC 데이터를 교란시키는지 여부를 조사하기 위하여, 40-59세, 45-65세, 50-69세 및 70-89세 연령의 환자뿐만 아니라 모든 연령의 환자에 대해서도 함께 동일한 분석을 반복하였다. 예측 모델은 군들 간의 광범위한 임상 변수를 고려하였다. 이것은 다음의 환자 인자를 포함하였다: 연령, 금식의 시간, BMI, 인종, 성별, 흡연 상태, 주간 알코올 소비, 대장내시경/수술 절제술 전에 취한 장 준비물의 타입 및 CRC의 가족력. 다음의 샘플링 관련 인자도 또한 포함하였다: 샘플링 전에 TD 튜브를 청소한 방법(표준 TC20 컨디셔닝 유닛을 이용하거나, PTR-MS 기기 자체를 이용함), 컨디셔닝에서 호흡 샘플링까지 TD 튜브의 보관 시간, 샘플링 후 MS 분석까지의 보관 시간, 및 TD 튜브가 냉동고에 보관된 일수(해당하는 경우). 대장내시경 검사 이유, 샘플링 위치, 및 대장내시경 소견과 관련된 임의의 데이터와 같이 결과와 직접적으로 연관되는 인자는 예측 모델에서 제외하였다. 과거 의료 이력 및 약물에 대한 세부 내용은 모델에 입력되지 않았는데, 그 이유는 답변이 너무 이질적이었기 때문이다.
ROC(수신자 조작 특성) 곡선을 이용하여 결장직장 질환이 있거나 없는 사람을 분류하는 진단적 테스트의 정확도를 결정하였다. 상기 ROC 곡선은 25회 실행(분할 간 다시 섞음(re-shuffling)을 포함하는 5배 계층화된 K-배 분할의 5회 반복)을 기반으로 생성하였다. 이것은 샘플을 섞은 후, 5개 군으로 나눈 것을 의미하였다. 이후, 각각의 군을 테스트 세트로 차례로 사용하고, 나머지 4개 군은 훈련 세트로 사용하였다. 매번 훈련 세트(데이터의 80%)에 대해 특징 선택 및 모델 구축(기계 학습)을 수행한 후, 테스트 세트(데이터의 20%)에 적용하여 통계를 생성하였다. 이를 5회 반복한 후, 상이한 실행의 결과를 평균하여 ROC 곡선 및 오류 추정값을 얻었다. 상기 분석 방법을 선택했기 때문에, 데이터가 분할될 때마다 중요한 특징의 선택이 조금씩 변하였다.
임의의 해당 특징이 예측되는/유의미한 특징으로 선택된 평균 횟수를 특징 선택 점수로 표시하였다. 데이터를 분할하는 방법과 무관하게 한 특징을 차별화 특징으로 독립적으로 선택하였다면, 선택 점수가 더 높아질 것이다. 따라서, 더 높은 점수는 문제의 특징이 우연한 발견이 아니라 CRC 및 비-CRC에 대한 진정한 특징 차별화 마커가 될 가능성이 더 높음을 의미하였다.
게다가, RF(Random Forest) 방법의 경우, 각 특징이 예측 모델에 미치는 기여도를 RF 점수로 나타내었다. 예측 모델 생성에 기여하는 모든 특징에 대한 점수는 (정의에 의해) 항상 합계 1이 된다. 따라서, 가장 높은 점수를 받은 특징은 비교하는 군을 차별화하는 측면에서 가장 중요함을 나타낸다. 상기 점수는 해당 특징(지니(Gini) 중요도로도 알려짐)에 의해 발생한 기준의 표준화된 총 감소를 컴퓨터로 계산하였다[19].
결과
환자군 할당
환자들은 내원 당일의 대장내시경 소견에 따라 그룹화하였다. 양성 병리군은 다음의 경미한 비-염증 소견을 가졌다: 치질, 양성 비-염증성 항문 균열, 게실 질환 또는 양성 게실 협착. 염증성 장질환(IBD) 군은 임의의 증세의 궤양성 대장염(UC), 크론 질환, 비특정 대장염 또는 감염성 대장염으로 구성되었다. 일부 환자는 그 기록에 IBD의 이력을 가졌지만, 정상적인 생검과 함께 정상적인 대장내시경 검사를 받았다. 상기 환자는 정상군에 할당되었다. 2002년의 영국 위장병 학회 용종 감시 지침 및 2017년의 고착성 톱니형 용종에 대한 보다 최근의 지침에서 채택한 개정된 기준을 이용하여 용종을 CRC로 발전할 높은, 중간 및 낮은 위험성으로 계층화하였다[20,21].
저 위험성 용종 환자는 저등급 이형성증을 갖는 1~2개의 작은(<1 ㎝) 관형 선종, 또는 이형성증이 없이 <1 ㎝의 고착성 톱니형 용종(SSP)을 갖는 환자였다. 중간 위험성 용종 환자는 저등급 이형성증을 갖는 3-4개의 작은 관형 선종, 또는 저등급 이형성증을 갖는 >1 ㎝의 적어도 1개의 선종, 또는 이형성증이 없이 >1 ㎝의 SSP를 갖는 환자였다. 고 위험성 용종 환자는 ≥5개 선종, 또는 ≥3개 선종이고 이중에서 적어도 1개의 선종이 ≥1 ㎝이거나, 고등급 이형성증을 갖는 임의의 선종, 또는 임의의 융모 변화를 갖는 선종(세관융모성 선종을 포함함), 또는 이형성증의 증거를 갖는 임의의 SSP를 갖는 환자였다.
CRC 환자는 모두 결장직장 선암종을 갖고 있었고, 크기, 위치, 종양의 등급 및 TNM 병기는 문서화되었다. 용종증 환자는 용종증(결장절제술을 거부한 가족성 선종형 용종증(FAP), 톱니형 용종증, 린치 증후군, 연소성 용종증 또는 MUYTH 관련 용종증)이 존재한다는 기존을 받은 환자였다. 이것은 이질적인 환자군이었는데, 일부는 대장내시경을 한 날에 >100개의 용종이 존재하였고, 다른 사람들은 주로 매우 빈번한 감시 및 용종절제술로 인해 단지 1개 또는 2개의 용종만 있었고, 상당수는 이미 결장의 일부를 절제하였다. 일부는 상부 위장관 용종도 있었을 가능성이 높았다. 상기 군 내에서 대장내시경 소견에 편차가 있고 많은 용종을 갖는 환자에서 CRC를 확실하게 제외하기 어렵기 때문에, 용종증 군은 통계 분석에서 제외하였다.
대장내시경 소견
1444명의 환자는 GC-MS로 호흡 샘플을 분석하였다(진단에 대해서는 표 1을 참조). 162명(11%)은 CRC를 갖고 있었고, 631명(43.7%)은 용종을 갖고 있었다. 상기에서 설명한 바와 같이, 용종증 군은 적고 매우 이질적이므로, 후속 분석에서 제외하였다. 따라서, (달리 명시되지 않는 한) 1432명의 환자가 통계 분석에 포함되었다.
대장내시경 진단은 가장 중요한 소견에 따라 결정하였다. 진단군의 계층구조는 CRC, 용종증, 고 위험성 용종(들), 중간 위험성 용종(들), 저 위험성 용종(들), IBD, 양성 병리, 정상이었다. 이것은 환자가 IBD 및 용종을 갖는다면, 활성 IBD였는지 여부에 무관하게 적절한 용종군에 배치되었음을 의미한다. 마찬가지로, 고 위험성 용종으로 분류된 환자는 또한 게실이나 치질을 가졌을 수 있다. 활성 IBD는 호흡시 VOC를 변경할 수 있는 것으로 알려져 있으므로[22], 이는 교란인자가 될 수 있지만, 실제로는 용종과 IBD 사이에는 교차가 거의 없었고, 13명의 환자에게만 영향을 미쳤다.
인구통계
대조군(n=1270)은 CRC 군(n=162)에 대한 통계적 비교를 목적으로 조합된 모든 양성 및 음성 대조군을 포함하였다. 본 연구에서 57.8%의 모집자는 남성이었고, CRC 군 및 대조군 사이에 성별 분포에서 유의한 차이는 없었다. CRC 환자는 대조군 환자보다 나이가 유의하게 더 많았으며, 각각 66.5세 및 63세였다(p<0.001). 환자의 대부분은 영국 또는 유럽 출신의 백인이었고, 대부분은 비-흡연자였으며, 현재 알코올 섭취자였고, BMI의 중앙값은 26이었다. CRC 군 및 대조군 사이의 이러한 편차의 분포 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. CRC 군 및 대조군에 대한 금식 시간의 중앙값은 유사하였지만, 군들 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 있었고, CRC 군은 더 짧은 시간 동안 금식하였다(p<0.001). 대부분의 환자는 대장내시경 또는 기관 절차 이전에 장 준비물로 Moviprep을 사용하였다. 암 군과 대조군 사이에 장 준비물 분포에 있어서 유의한 차이가 있었는데(p<0.001), 이는 주로 사전-기관 환자의 경우 장 준비물의 범위가 더 좁았고, 37명의 CRC 환자는 호흡 테스트 전에 장 준비를 하지 않았기 때문이었다. '대장내시경/방문에 대한 이유' 및 '샘플을 위한 위치'의 결과는 CRC 군 및 대조군 사이에 통계적으로 유의하였는데, 그 이유는 CRC 환자의 상당 부분이 기관으로부터 모집되었기 때문이다.
내시경 유닛에서, 본 연구는 주로 BCSP 환자를 표적으로 하였다: BCSP 대장내시경에서 30개의 CRC가 검출되었으며, BCSP 환자로부터의 CRC 픽업률(pick up rate)은 문헌보다 낮은 4.5%를 나타내었다[13]. 이것은 2WW 환자군에서의 CRC 픽업률(96 대장내시경 중 5개 = 5.2%)보다 약간 낮은 것이었다. 다른 CRC는 감시(n=3), 긴급 증상(2WW는 아님)(n=4) 및 용종 제거군에 대한 재검사(n=1)에서 발견되었고, 일상 증상 군에서는 없었다. 나머지 암 증례(n=119)는 본 연구를 위해 미리 확인된 사전 기관에서 샘플링되었으며, 이는 풍부한 코호트를 나타낸다. 예상한 것과 같이, 용종 환자의 가장 높은 수량은 BCSP 및 용종 감시군에서 나왔다. BCSP 환자에서 용종 픽업률은 63%로 문헌보다 더 높았다(이 계산에는 대장내시경 검사에서도 용종을 가졌던 BCSP로 진단된 CRC 환자 중 17명이 포함되었음)[13].
과거 의료 이력 및 약물 사용을 또한 기록하였다. 과거에 CRC를 가졌던 환자와 CRC 군의 환자의 수에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 따라서, 이들 13명의 환자는 (일부 경우에는 장외 재발에 더하여) CRC 내강 재발을 나타내었다. CRC 군에서 통계적으로 유의하게 증가된 다른 동반질환 인자는 알려진 심장 질환의 유병률, 완하제의 사용, 최근 항생제의 사용 및 와파린(또는 기타 항응고제)의 사용이었다. 다른 동반질환 및 사용된 약물은 CRC 군 및 대조군 사이에서 비슷하였다(표 2 참조).
결장직장암 환자의 임상적 세부사항
모든 CRC 환자에 대해 암 특이적 세부사항을 기록하였다. 대부분의 CRC는 왼쪽에 있었고(62%), 절반 이상(64%)은 말기 암 T3 및 T4였으며, 대부분 N 점수가 0 내지 1이었고, 대부분 전이가 없었다. 종양 크기의 범위는 6 ㎜ 내지 130 ㎜였고, 크기의 중앙값은 38.5 ㎜(최대 종양 직경)였다. 80%는 중등도로 분화된 선암종이었다.
CRC의 진단 경로는 CRC의 병기에 영향을 미쳤다. BCSP에서 발견된 CRC는 T 병기의 측면에서 꽤 고르게 분포되어 있었지만, 초기 암의 비율은 다른 군보다 이 군에서 더 높았다(BCSP 암의 48%는 T 병기 1 또는 2였음). 이것은 기관 경로를 통해 모집된 CRC 환자와 대조되었다. 상기 환자는 증상을 보이는 경향이 있었고, 이들 중 매우 높은 비율(72%)이 T 병기 3 또는 4의 암을 가졌다. 이것은 BCSP가 증상을 보이지 않는 개체에서 대장내시경을 수행하는 것을 목표로 한다는 점에서 예상된 소견이었다. CRC로 진단된 환자에서, 그 연령은 진단받은 T 병기와 반드시 상관관계가 있는 것으로 보이지는 않았다.
샘플 처리 시간
샘플링 전 청소된 TD 튜브의 보관 시간, 및 GC-MS에 의한 분석 전 TD 튜브에서 호흡 샘플의 보관 시간은 표 3에 상세히 나타나 있다. 모든 샘플에 대하여 샘플링 전(p=0.84), 또는 샘플링 후(p=0.93) TD 튜브의 보관과 관련하여 7개 병리군 사이에서 Kruskal-Wallis 비교(IBM, SPSS 통계 버전 25)에서는 유의한 차이가 없었다. 샘플링 전에는 TD 튜브를 냉동하지 않았지만, 샘플링 후 199개의 TD 튜브는 기기 가동 중지 시간/사용 불가로 인해 분석 전에 1 내지 114일(중앙값 17일, 표준 편차 40일) 동안 냉동하였다. 냉동 튜브의 경우, CRC 군 및 대조군 사이의 샘플링 후 보관 시간에서도 유의한 차이는 없었다(p=0.23). 환자 샘플링을 위해 사용된 모든 튜브(환자 당 4개 튜브)는 항상 동시에 컨디셔닝/청소하였다.
초기 일변량 통계의 결과
호흡에서 1024개의 특징(VOC)을 확인하였고, 그 피크 면적 카운트를 MSHub 프로그램에 의해 표로 만들었다[15,16].
시작하면서, 임의의 7개 환자 군이 군들 간의 구별에 통계적으로 유의한 VOC를 많이 포함하고 있는지 여부를 결정하기 위하여 Kruskal-Wallis 테스트를 수행하였다. 291개 이온이 p<0.05로 구별하고 있는 것으로 나타났다.
CRC(n=162) 대 대조군(n=1270) 환자에 대해 Mann Witney U 분석을 수행하였다. 336개의 특징(이온)이 p<0.05로 구별되는 것으로 나타났다. Kruskal-Wallis 테스트에 의해 식별되는 것으로 나타난 특징 중 95%가 Mann Witney U 분석에서 발견된 특징과 중첩되었으며, 이는 대부분의 경우에 중요한 차이를 설명하는 암의 군임을 제시한다. 따라서, 임상 메타데이터가 또한 변수로 통합된 고급 기계 학습 예측 모델을 사용하여 군들을 심층적으로 조사하였다.
기계 학습 예측 모델의 결과 - CRC 대 비-CRC
수행된 첫 번째 기계 학습 분석은 GC-MS 데이터를 이용하여 CRC 환자(n=162)로부터 검출된 모든 VOC를 비-CRC(대조군) 환자(n=1270)로부터의 모든 VOC와 비교하였다. CRC 대 비-CRC를 예측하기 위한 가장 강력한 모델은 기계 학습 탄력 방법이었으며, 이것은 민감도 0.77(±0.02), 특이도 0.87(±0.01), 음성 예측 값 0.97(±0.00) 및 정확도 0.86(±0.01)으로 CRC 환자를 예측할 수 있었다. ROC(receiver operating curve) 아래 면적은 0.87(±0.01)이었다; 도 1 참조.
비-CRC 환자군은 양성 및 음성 대조군 모두를 포함하였다. (내시경에서 정상 결장을 갖는) 음성 대조군은 357명이었다. 내시경에서 양성 질환, IBD, 또는 저/중간/고 위험성 용종을 갖는 양성 대조군은 913명이었다.
도 1에 나타낸 ROC 곡선은 다시 섞음을 이용한 5배 계층화된 k-배 분할의 5 사이클의 교차 검증 방법의 결과에 기반해 계산되었다. 이것은 상기 ROC 곡선이 각각 약간 상이한 특징 선택 및 기계 학습 모델을 사용하는 개별 구동으로부터의 ROC 곡선의 평균이었음을 의미한다. 각각의 개별 사이클에 대한 곡선 아래 면적(AUC)이 키에 나타나 있다. 기계 학습 알고리즘에 의해 결정될 때 최대 99개 특징이 상기 ROC 곡선을 생성하는데 사용되었으며, 여기서 "특징"은 개별 이온뿐만 아니라 개별 임상 변수, 즉 군의 분리에 기여하는 임의의 성분도 나타내었다. 사용된 특징의 수는 RF 선택 점수(해당 방법에 대해 임의의 해당 특징이 선택된 평균 횟수)에 의해 실증되었으며, 여기서 점수가 1이면 문제가 되는 특징이 매번 100% 선택되었음을 의미한다.
상위 25개의 화학적 특징과 CRC 대 비-CRC에 대해 가장 높은 식별 점수를 달성한 2개의 임상 특징이 표 4에 나열되어 있다. 이들은 ROC 곡선의 생성에 가장 큰 기여를 하는 특징이었다(도 1). RF 선택 및 ANOVA를 모두 사용하여 특징의 순위를 매겼기 때문에, 선택된 방법에 따라 상위 25개 이온의 목록이 약간 상이하였다. 이것은 예상되었는데, 왜냐하면 ANOVA는 각각의 특징을 한 번에 하나씩 다루고 특징의 교차-연관성이나 임의의 다른 정보를 고려하지 않는 반면, RF는 특징의 전체 앙상블에 기반한 모델을 구축하여 특징의 상호작용을 고려할 수 있기 때문이다. 두 목록의 특징을 모두 조사하였다. 획득된 질량 스펙트럼을 NIST 데이터베이스에 의해 제안된 가능한 일치 항목과 비교하여 특징을 식별하였다[17]. 두 질량 스펙트럼이 동일한 이온 분포 및 강도를 보인다면, 이는 일치하는 것이고, 화합물은 양호한 신뢰도로 식별될 수 있다. 불완전하지만 비슷한 스펙트럼의 일치가 있는 경우, 화합물은 잠정적으로 식별되었다.
GC-MS 분석 디콘볼루션 동안, 임의의 해당 머무름 시간에서, 피크는 상이한 조각화 패턴을 갖는 두 개(또는 그 이상)의 피크로 분할될 수 있었다. 표 4에서 "피크의 백분율" 컬럼은 본래의 피크가 어떻게 이 새로운 디콘볼루션된 피크에 의해 설명되는지를 보여준다. 백분율이 낮을수록 이 피크의 기여도가 낮고, 해결률도 낮다. 값이 100%일 때, 단일 피크가 있었고, 완전히 해결되었다. 본래의 피크의 20% 미만으로 기여한 임의의 피크는 제외되었다.
두 개의 상이한 기계 학습 예측 모델(ANOVA 및 RF)로부터 얻은 25개의 상위 암-구별 이온으로 구성된 목록(표 4)으로부터 짧은 목록이 생성되었다. 상기 짧은 목록의 이온은 다음의 기준에 따라 수동으로 선택되었다: (ⅰ) 이들은 내인성으로 간주될 수 있어야 한다; (ⅱ) 이들이 CRC에 관여함을 설명할 수 있는 생리학적 역할을 가져야 한다. 3-메틸-부탄니트릴은 담배 식물에 존재하기 때문에 잠재적으로 중요한 화합물로 간주되지 않았으며[23], COBRA 데이터세트에 대한 조사를 유도하였다; Mann Witney U 테스트를 사용할 때, 상기 화합물은 비흡연자(n=781)와 비교하여 흡연자(n=185)에서 상당히 더 많이 존재하였다(p=0.00009). NIST 라이브러리를 사용하여 이 화합물을 확인한 결과, 양호한 스펙트럼 중첩이 얻어졌기 때문에 양호한 신뢰도를 보였다. 따라서, 3-메틸-부탄니트릴은 잠재적인 CRC 마커에서 제외하였다. 표 5는 추가 조사를 위한 잠재적인 VOC 바이오마커로 취하게 된 15 종의 이온이 그 통계 점수와 함께 상세히 나타나 있다. 단지 이러한 단리된 상위 15 종의 특징을 데이터세트에 적용함으로써, AUC가 0.83이고, 95% 신뢰 구간이 0.79-0.86인 ROC 곡선을 얻었다(도 2 참조).
CRC 대 결장직장 병리 없음의 분석
상기에서 수행된 것과 동일한 기계 학습 분석을 CRC 군(n=162) 대 정상/양성 결장직장 병리군 단독(n=545)에 대해 반복하였다. 상기 군은 대장내시경이 정상이거나 치질, 게실 질환 또는 IBD와 연관되지 않은 양성 항문 균열과 같은 양성 소견을 가졌다. 흥미롭게도, RF 선택을 사용한 결과 상위 25개 특징 중 23개는 상기에 기술된 더 큰 CRC 대 비-CRC 비교에 대한 상위 25개 특징과 중첩하였고, 이는 발견된 마커가 실제로 CRC-특이적이고 IBD 및 용종과 같은 다른 결장직장 병리에 의해 영향을 받지 않을 수 있음을 제시한다. 기존의 목록에 없었던 2개의 새로운 VOC는 CRC 대 비-CRC 비교에서 발견된 다른 불소화 화합물과 유사한 펜타플루오로에탄 및 2-메틸-2-프로판올이었다(표 4 참조). CRC에 대한 상위 15 종의 식별 이온 각각을 해당 화합물 군 내에서 상세히 조사하였다.
에스테르
VOC 1, 8, 9 및 12는 알릴 아세테이트, 및 메틸 2-부티노에이트와 중첩하는 유사한 에스테르인 프로필 프로피오네이트, 알릴 아세테이트로 잠정적으로 확인되었다. 얻어진 4개의 모든 에스테르는 CRC가 없는 경우(n=1270)와 비교하여 CRC를 갖는 환자(n=162)의 호흡에서 현저히 더 풍부하게 존재하였다. 양쪽 군에 대한 이온 피크 면적 카운트는 표 6에 나타나 있고, 각각의 군에서 분포의 대표적인 박스플롯은 도 3a 내지 도 3d에 설명되어 있다.
황 화합물
VOC2는 디메틸 설파이드로 확인되었고, 얻어진 질량 스펙트럼 및 NIST 데이터베이스 사이가 잘 일치하였다. 이것은 C2H6S2의 화학식 및 63의 m/z를 가졌다. 디메틸 설파이드는 CRC가 없는 경우(n=1270)와 비교하여 CRC를 갖는 환자(n=162)의 호흡에서 현저히 더 풍부하게 존재하는 것으로 나타났다. 양쪽 군에 대하여 2개 연구 군에 대해 얻어진 피크 면적 카운트는 표 7에 나타나 있고, 각각의 군에서 분포의 대표적인 박스플롯은 도 4에 설명되어 있다. 상기 박스플롯은 디메틸 설파이드의 풍부도가 CRC 환자에서 더 높지만, 일부 중첩이 있었음을 보여준다.
알칸
VOC 3, 11 및 15는 각각 2 종의 식별되지 않은 알칸 및 3-에틸-헥산으로 확인되었다. 상기 3 종의 알칸은 모두 비-CRC 환자보다 CRC 환자에서 현저히 더 낮았다. 그러나, 알칸은 (VOC 3 및 11의 질량 스펙트럼에 의해 실증되는 것과 같이) GC-MS를 이용한 질량 스펙트럼이 매우 유사하기 때문에 식별이 어려운 것으로 유명하고, 따라서 스펙트럼 단독으로는 명백한 식별을 제공하기에 충분하지 않을 수 있다. 이를 돕기 위하여, 확인을 목적으로 C8 내지 C20의 12개 직쇄 알칸(옥탄, 노난, 데칸 등)의 표준 혼합물을 GC-MS에 의해 분석하여 특정 머무름 시간을 얻었다. 머무름 시간은 휘발성 및 컬럼에 대한 친화도에 의존하며, 휘발성이 더 큰 화합물은 더 낮은 머무름 시간을 가질 것이다. 예상한 것과 같이, 알칸 표준물에 대한 머무름 시간은 분자들이 덜 휘발성인 순서로 정렬되었다. COBRA 연구에서 발견된 2 종의 식별되지 않은 알칸에 대한 머무름 시간 피크는 C13 및 C14 알칸에 대한 머무름 시간 피크 사이에 속하였다. 이것은 이들이 그 입체화학으로 인해 약간 덜 머물렀기 때문에, 이들이 분지되지 않은 C14 알칸보다 약간 더 빨리 컬럼으로부터 용출되게 하는 분지된 탄소 사슬을 갖는 C14 알칸일 가능성을 매우 높게 한다.
3 종의 알칸은 모두 CRC가 없는 경우(n=1270)와 비교하여 CRC를 갖는 환자(n=162)의 호흡에서 현저히 더 낮은 풍부도로 존재하는 것으로 나타났다. 2개 연구 군에 대해 얻어진 피크 면적 카운트는 표 8에 나타나 있고, 각각의 군에서 분포의 대표적인 박스플롯은 도 5a 내지 도 5c에 설명되어 있다.
알코올
VOC 4, 5, 10 및 13은 각각 1,3-디옥솔란-2-메탄올, 2-페녹시-에탄올, 2,2,4-트리메틸-3-펜탄올 및 1-운데카놀로 식별되었다. 이들은 모두 알코올이고, 이들 모두, 특히 VOC 4, 5 및 14의 경우에는 대응하는 NIST 라이브러리 매스 스팩트럼과 양호한 일치를 보였기 때문에, 그 잠정적 식별을 보다 확실하게 하였다.
VOC 4 및 10은 CRC가 없는 경우(n=1270)와 비교하여 CRC를 갖는 환자(n=162)의 호흡에서 현저히 더 풍부하게 존재하는 것으로 나타났다. VOC 5 및 13은 더 낮은 풍부도로 존재하는 것으로 나타났다. 2개 연구 군에 대해 얻어진 피크 면적 카운트는 표 9에 나타나 있고, 각각의 군에서 분포의 대표적인 박스플롯은 도 6a 내지 도 6d에 설명되어 있다.
페놀
VOC 14는 페놀로 식별되었다. 페놀은 대조군과 비교하여 CRC 환자에서 더 낮은 풍부도로 존재하는 것으로 나타났다. 2개 연구 군에 대해 얻어진 피크 면적 카운트는 표 10에 나타나 있고, 각각의 군에서 분포의 대표적인 박스플롯은 도 7에 설명되어 있다.
비-방향족 환형 탄화수소
VOC 6 및 7은 시클로프로판 및 3,4-디메틸-1,5-시클로옥타디엔으로 식별되었다. 시클로프로판 및 3,4-디메틸-1,5-시클로옥타디엔은 모두 CRC가 없는 경우(n=1270)와 비교하여 CRC를 갖는 환자(n=162)의 호흡에서 현저히 더 풍부하게 존재하는 것으로 나타났다. 2개 연구 군에 대해 얻어진 피크 면적 카운트는 표 11에 나타나 있고, 각각의 군에서 분포의 대표적인 박스플롯은 도 8a 및 도 8b에 설명되어 있다.
결론
상기 소견은 호흡에서의 다수의 VOC와 결장직장암의 존재 사이에 명확한 연관성이 있음을 뒷받침한다. 특히, 상기 결과는 날숨이 기관에서 대장내시경 또는 CRC 절제술을 하기 위해 병원에 내원한 1432명의 환자에서 0.87의 ROC 곡선 아래 면적, 77%의 민감도, 87%의 특이도 및 97%의 음성 예측값으로 양성 및 음성 대조군으로부터 모든 병기의 CRC의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있음을 실증한다.
표 5에서 중요한 CRC 바이오마커로 식별된 15 종의 VOC는 디메틸 설파이드, 페놀, 및 에스테르, 알코올, 알칸 및 비-방향족 환형 탄화수소 화합물 클래스로부터의 화합물을 포함하였다. 상기 15 종의 VOC는 함께 호흡을 이용하여 0.83의 ROC 곡선 아래 면적으로 양성 및 음성 대조군으로부터 CRC의 존재를 예측할 수 있었다. 따라서, 상기 결과는 결장직장암을 위한 진단적 도구로서 호흡 VOC 테스트의 유망한 잠재력을 보여주고, 대규모 다기관 시험을 위한 기초를 제공하여서, 신뢰할만하고 비-침습적인 CRC 및 용종 검출을 위한 상기 혁신적이고 매우 허용가능한 도구를 임상 실습으로 실행하기 위한 발걸음을 더 가깝게 한다.
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[표 1]
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Claims (34)
- 결장직장암을 앓거나 이에 대한 소인이 있는 대상체를 진단하거나, 대상체의 증상의 예후를 제공하기 위한 방법으로서,
상기 방법은 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 분석하는 단계 및 상기 농도를 결장직장암을 앓지 않는 개체에서 시그니처 화합물의 농도에 대한 참조물과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서
참조물과 비교하여 (ⅰ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 (ⅱ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소는 상기 대상체가 결장직장암을 앓거나, 이에 대한 소인을 갖거나, 또는 대상체의 증상의 부정적 예후를 제공함을 제시하고, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같은 방법:
상기에서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다. - 결장직장암을 앓는 대상체를 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용해 치료하는 효능을 결정하기 위한 방법으로서,
상기 방법은 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 분석하는 단계 및 상기 농도를 더 이른 시점에서 상기 대상체로부터 취한 샘플에서 시그니처 화합물의 농도에 대한 참조물과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서
(ⅰ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소, 또는 (ⅱ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가는 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적임을 제시하거나, 또는 (ⅰ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 (ⅱ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소는 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적이지 않음을 제시하고, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같은 방법:
상기에서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 시그니처 화합물은 C1-C12 에스테르, C3-8 에스테르, 또는 C5-6 에스테르인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테르는 식 Ⅳ의 에스테르인 방법:
상기에서, R6 및 R7은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이거나, 또는
R6 및 R7은 독립적으로 C1-4 알킬, C2-4 알케닐 또는 C2-4 알키닐이고, 임의적으로 R6 및 R7은 독립적으로 C1-3 알킬, C2-3 알케닐 또는 C2-3 알키닐이다. - 청구항 4에 있어서,
R6은 메틸, 에틸 또는 1-프로피닐이고; 및/또는 R7은 메틸, n-프로파닐 또는 2-프로페닐인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 C1-C12 에스테르는 프로필 프로피오네이트, 알릴 아세테이트 또는 메틸 2-부티노에이트인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시그니처 화합물은 C3-20 시클로알칸, 또는 C3-20 시클로알켄, 또는 C3-15 시클로알칸 또는 C3-15 시클로알켄, 또는 C3-10 시클로알칸 또는 C3-10 시클로알켄, 또는 C5-10 시클로알켄, 또는 C8-10 시클로알켄인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
상기 C3-20 시클로알칸 또는 C3-20 시클로알켄은 시클로프로판, 또는 3,4-디메틸-1,5-시클로옥타디엔인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시그니처 화합물은 C1-20 알칸, C2-20 알켄, 또는 C2-20 알킨이고, 바람직하게는 상기 화합물은 C4-12 알칸, C4-12 알켄 또는 C4-12 알킨, 또는 C6-10 알칸, C6-10 알켄 또는 C6-10 알킨, 또는 C7-9 알칸, C7-9 알켄 또는 C7-9 알킨, 또는 C8 알칸인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 C1-20 알칸, C2-20 알켄, 또는 C2-20 알킨은 3-에틸-헥산인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시그니처 화합물이 식 Ⅰ의 알코올일 때,
R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고; 및
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌인 방법. - 청구항 11에 있어서,
L1은 없거나, C1-3 알킬렌, C2-3 알케닐렌 또는 C2-3 알키닐렌이고, 임의적으로 L1은 없거나, 메틸렌인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
R1은 C3-12 시클로알킬 또는 3 내지 12 원의 헤테로사이클이고, 임의적으로 R1은 C5-6 시클로알킬 또는 5 내지 6 원의 헤테로사이클인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
R1은 5 원의 헤테로사이클이고, 바람직하게는 R1은 1,3-디옥솔라닐인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
L1은 없고, R1은 C3-18 알킬, C3-18 알케닐 또는 C3-18 알키닐이며, 임의적으로 R1은 C6-10 알킬, C6-12 알케닐 또는 C6-10 알키닐, 또는 C7-9 알킬, C6-9 알케닐 또는 C6-9 알키닐이고, 바람직하게는 R1은 2,2,4-트리메틸-3-펜타닐인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
상기 식 (Ⅰ)의 알코올은 1,3-디옥솔란-2-메탄올 또는 2,2,4-트리메틸-3-펜탄올인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시그니처 화합물이 식 Ⅲ의 알코올일 때,
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
L2는 없거나, O인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
L3은 없거나, C1-3 알킬렌, C2-3 알케닐렌 또는 C2-3 알키닐렌이고, 임의적으로 L3은 없거나, 메틸렌 또는 에틸렌이고, 또는 L3은 없거나, 에틸렌인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
R4는 C6-12 아릴 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고, 임의적으로 R4는 페닐 또는 5 내지 6 원의 헤테로아릴인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
L2 및 L3은 없고, R3은 C3-18 알킬, C3-18 알케닐 또는 C3-18 알키닐이거나, 또는 R3은 C5-17 알킬, C5-17 알케닐 또는 C5-17 알키닐이고, 또는 R3은 1-운데카닐인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
상기 식 (Ⅲ)의 알코올은 2-페녹시-에탄올, 1-운데카놀 또는 페놀이고, 바람직하게는 페놀인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시그니처 화합물이 식 (Ⅱ)의 설파이드일 때,
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
R2 및 R3은 독립적으로 C1-3 알킬, C2-3 알케닐 또는 C2-3 알키닐이거나, 또는 R2 및 R3은 모두 메틸인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서,
상기 설파이드는 디메틸 설파이드인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시그니처 화합물은 휘발성 유기 화합물(VOC)인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
상기 신체 샘플은 테스트 대상체로부터의 호흡 샘플인 방법. - 청구항 1 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 바람직하게는 코로 들숨한 후에 입 및/또는 코를 통해 날숨을 행하여 대상체에 의해 수집되는 방법. - 청구항 1 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시그니처 화합물은 프로필 프로피오네이트, 알릴 아세테이트, 메틸 2-부티노에이트, 1,3-디옥솔란-2-메탄올, 2,2,4-트리메틸-3-펜탄올, 시클로프로판, 3,4-디메틸-1,5-시클로옥타디엔, 디메틸 설파이드, 2-페녹시-에탄올, 1-운데카놀, 페놀, 및 3-에틸-헥산, 또는 그의 유사체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법. - 결장직장암을 앓거나 이에 대한 소인이 있는 대상체를 진단하거나, 대상체의 증상의 예후를 제공하기 위한 장치로서,
상기 장치는
(ⅰ) 테스트 대상체로부터의 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 결정하기 위한 수단; 및
(ⅱ) 결장직장암을 앓지 않는 개체로부터의 샘플에서 시그니처 화합물의 농도에 대한 참조물;을 포함하고,
상기 장치는 상기 참조물과 비교하여 (ⅰ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 (ⅱ) 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소를 확인하여서, 상기 대상체가 결장직장암을 앓거나, 이에 대한 소인을 갖거나, 또는 대상체의 증상의 부정적 예후를 제공함을 제시하기 위해 사용되며, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같은 장치:
상기에서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다. - 결장직장암을 앓는 대상체를 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용해 치료하는 효능을 결정하기 위한 장치로서,
상기 장치는
(ⅰ) 테스트 대상체로부터의 샘플에서 시그니처 화합물의 농도를 결정하기 위한 수단; 및
(ⅱ) 더 이른 시점에서 대상체로부터 취한 샘플에서 시그니처 화합물의 농도에 대한 참조물;을 포함하고,
상기 장치는
(ⅰ) 상기 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소, 또는 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소를 확인하여서, 상기 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적임을 제시하거나; 또는
(ⅱ) 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 증가, 또는 참조물과 비교하여 테스트 대상체로부터의 신체 샘플에서 C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로부터 선택되는 시그니처 화합물의 농도에서의 감소를 확인하여서, 상기 상기 치료제 또는 전문화된 식이요법을 이용한 치료 요법이 효과적이지 않음을 제시하기 위해 사용되며, 여기서 식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같은 장치:
상기에서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다. - 청구항 30 또는 청구항 31에 있어서,
상기 시그니처 화합물은 청구항 3 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 정의된 것인 장치. - 결장직장암을 앓거나 이에 대한 소인이 있는 대상체를 진단하거나, 대상체의 증상의 예후를 제공하기 위한 바이오마커로서의 C1-12 에스테르, C3-20 시클로알칸, C3-20 시클로알켄, C1-20 알칸, C2-20 알켄, C2-20 알킨, 식 (Ⅰ)의 알코올, 식 (Ⅱ)의 설파이드, 및 식 (Ⅲ)의 알코올, 또는 그의 유사체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 시그니처 화합물의 용도로서,
식 (Ⅰ), (Ⅱ) 및 (Ⅲ)은 다음과 같은 용도:
상기에서, R1은 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L1은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이고;
R4는 C1-20 알킬, C2-20 알케닐, C2-20 알키닐, C3-12 시클로알킬, C6-12 아릴, 3 내지 12 원의 헤테로사이클 또는 5 내지 12 원의 헤테로아릴이고;
L2는 없거나, O, S 또는 NR5이고;
L3은 없거나, C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌 또는 C2-6 알키닐렌이고; 및
R5는 H 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이다. - 청구항 33에 있어서,
상기 시그니처 화합물은 청구항 3 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 정의된 것인 용도.
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