KR20240007765A - 표적 핵산을 농축하는 방법, 오프-타겟을 식별하고 유전자 편집 효율성을 평가하는 방법 - Google Patents
표적 핵산을 농축하는 방법, 오프-타겟을 식별하고 유전자 편집 효율성을 평가하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 샘플에서 핵산을 농축하는 기술에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 본 발명은 복수의 단일 가닥 핵산 단편을 포함하는 샘플로부터 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하고, 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하며, 유전자 편집 효율을 평가하는 방법을 제공한다. 본 명세서에는 다른 예시적인 실시예도 설명되어 있다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021 년 05 월 16일자로 미국에 가출원된 제63/201,861호 및 2021년 11월 10일에 출원된 미국 가출원된 제63/277,782호의 우선권을 주장하며 그 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.
ZFN, 탈렌(TALEN), CRISPR(CRISPR)와 같은 게놈 표적, 프로그래밍이 가능한 뉴클레아제는 유전공학 및 정밀 유전자 치료 커뮤니티에 큰 혁신을 불러일으키고 있다. 그러나 게놈 내에서 원치 않는 편집(즉, 오프-타겟 효과)은 연구에서 예측할 수 없는 혼란스러운 결과를 초래하고 유전자 치료에서 심각한 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서 오프-타겟을 탐지하는 것은 게놈 편집의 정밀도를 확보하기 위한 필수적인 체크 포인트이다. 현재의 오프-타겟 프로파일링 방법은 생체 내 편집과 호환되지 않고, 많은 양의 샘플 입력이 필요하며, 검증하려면 많은 시간이 소요되는 등 여러 가지 단점이 있다. 또한 현재 방법의 민감도와 특이성은 결과를 통제할 수 없을 정도로 변동될 수 있다.
현재의 일부 방법은 순방향 및 역방향 프라이머를 사용하는 멀티플렉스 표적 농축을 사용한다. 이러한 방법의 단점은 타겟 서열에 인접한 알려지지 않은 서열을 농축할 수 없다는 것이다. 순방향 및 역방향 프라이머로 생성된 데이터는 시작과 끝 위치가 동일하기 때문에 분자 복합체 수 계산, 시퀀싱 오류 제어, 복제 수 및 효율성을 계산하는 데이터 분석에 상당한 어려움이 있다.
일 실시예에서, 본 명세서는 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플과 접촉시켜 결합 생성물을 생성하는 단계로서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성되는 단계 (a); 제1 표적-특이적 프라이머 및 선택적으로 제1 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 제1 PCR을 수행하여 결합 생성물을 증폭하여 제1 PCR 생성물을 형성하는 단계 (b); 및 제2 표적-특이적 프라이머 및 제2 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 생성물을 증폭하여 제2 PCR 생성물을 형성하는 단계 (c)를 포함하며, 여기서, 제2 표적-특이적 프라이머는 제1 표적-특이적 프라이머에 상대적으로 중첩된다.
일부 실시예에서, 단계 (a) 전에, 상기 방법은 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단 을 차단하는 단계; 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단을 인산화하는 단계; 또는 핵산을 아데닐화하여 단일 가닥 핵산 단편에 3'-아데노신 돌출부를 생성하는 단계 중 적어도 한 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 제1 PCR은 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 얻기 위해 제1 표적-특이적 프라이머로 결합 생성물을 선형 증폭하는 것이다. 일부 실시예에서, 상기 제1 PCR은 제1 표적-특이적 프라이머 및 제1 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머를 사용하여 표적 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 것이다. 일부 실시예에서, 상기 제1 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머와 상기 제2 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머는 동일하다. 다른 실시예에서, 상기 제1 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머와 상기 제2 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머는 상이하다.
일부 실시예에서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는, 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된 3' 열성 말단; 및/또는 랜덤 또는 퇴행성 뉴클레오티드의 3~20개의 염기를 포함하는 5' 돌출 말단를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터의 듀플렉스 일부은 단계 (a)에서 듀플렉스 형태를 유지되기에 충분한 길이를 갖는다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 듀플렉스 형태의 일부를 연결하는 헤어핀 루프를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 개별 원본 분자를 추적하기 위한 고유 분자 인덱스(UMI)로서 3~20개의 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 단편으로 구성된다.
일부 실시예에서, 단계 (c)는 시퀀싱 특이적 어댑터 쌍이 있는 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (c) 후에, 시퀀싱 프라이머 쌍을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 시퀀싱 프라이머 쌍은 각각 제2 PCR 생성물의 반대 가닥에 적어도 부분적으로 상호 보완적이다.
일부 실시예에서, 샘플은 고분자량 DNA로부터 제조된 복수의 DNA 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 단일 가닥 핵산 단편은 이중 가닥 DNA 단편의 변성으로부터 제조된다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 RNA 단편의 역전사로부터 제조된 단일 가닥cDNA 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 복수의 핵산 단편을 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 제1 PCR 및/또는 제2 PCR은 멀티플렉싱 PCR이다.
일부 실시예에서, 상기 샘플은 포유류에서 유래한 것이고, 선택적으로 상기 샘플은 인간으로부터 유래한 것이다. 일부 특별한 실시예에서, 상기 인간은 질병이 있거나 질병이 의심되는 것으로 알려진 개인이고, 선택적으로 상기 질병은 암 또는 유전적 질환이다. 일부 실시예에서, 상기 표적 핵산 중 하나 이상이 상기 암에 대한 하나 이상의 마커를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 인간은 태아이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플로부터 유래한 것이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플에서 추출된 무세포 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 순환 종양 세포로부터 추출된 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 T-세포 및 B-세포 수용체 프로파일링을 위한 혈액 샘플의 림프구에서 추출된 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 편집된 CRISPR 유전자 샘플이다. 일부 특정 실시예에서, 상기 샘플은 편집된 메가 뉴클레아제, 편집된 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 편집된 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 CAR-T, CAR-NK, TCR-T, 불멸화 세포주(예를 들어, 조작된 신경 줄기세포주 CTX) 또는 치료용 조혈 줄기세포로부터 유래한 것이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 유전자 조작 세포(생체 외 또는 생체 내)로부터 유래한 것이며, 여기서 상기 세포는 섬유아세포, 연골세포, 각질세포, 간세포, 췌장 섬 세포, 줄기세포(예를 들어, 조혈 줄기세포, 중간엽 줄기세포 또는 피부 줄기세포) 및 면역 세포(예를 들어, 종양 침윤 림프구, 바이러스 재구성 T 세포, 수지상 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 대식세포)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
다른 실시예에서, 본 명세서는 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합하는 단계 (a); 제1 표적-특이적 프라이머를 표적 서열 부근의 단일 가닥 핵산 단편에 어닐링하는 단계 (b); DNA중합 효소를 사용하여 단일 가닥 핵산 단편 위로 제1 표적-특이적 프라이머를 연장하는 단계 (c); 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 얻는 단계 (d); 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 단일 가닥으로 해리하는 단계 (e); 및 초기 프라이머 연장 듀플렉스의 단일 가닥의 일부를 제2 표적-특이적 프라이머 및 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 증폭하는 단계 (f)를 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (a) 전에 상기 방법은, 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단을 차단하는 단계; 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단을 인산화하는 단계; 또는 핵산을 아데닐화하여 단일 가닥 핵산 단편에 3-아데노신 돌출부를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는, 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된 3' 열성 단부; 및/또는 랜덤 또는 퇴행성 뉴클레오티드의 3~20개의 염기를 포함하는 5' 돌출 단부를 포함하며, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터의 듀플렉스 부분은 단계 (a)에서 듀플렉스 형태로 유지되기에 충분한 길이를 갖는다. 일부 실시예에서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 상기 듀플렉스 형태의 일부를 연결하는 헤어핀 루프를 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (f)는 시퀀싱 특정 어댑터 쌍이 있는 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 단계 (f) 후에, 시퀀싱 프라이머 쌍을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 시퀀싱 프라이머 쌍은 각각 제2 PCR 생성물의 반대 가닥에 적어도 부분적으로 상호 보완적이다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 하나 이상의 사이클 동안 단계 (b) 내지 단계 (f)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 샘플은 고분자량 DNA로부터 제조된 복수의 DNA 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 단일 가닥 핵산 단편은 이중 가닥 DNA 단편의 변성으로부터 제조된다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 RNA 단편의 역전사로부터 제조된 단일 가닥 cDNA 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 개별 원본 분자를 추적하기 위한 고유 분자 인덱스(UMI)로서 3~20개의 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 복수의 핵산 단편을 분석하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 샘플은 포유류로부터 유래하고, 선택적으로 상기 포유류는 인간이다. 일부 실시예에서, 상기 인간은 질병이 있거나 질병이 의심되는 것으로 알려진 개인이고, 선택적으로 상기 질병은 암 또는 유전적 질환이다. 일부 실시예에서, 상기 인간은 태아이다.
일부 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플에서 유래한 것이다. 다른 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플로부터 추출된 무세포 핵산을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 샘플은 순환 종양 세포로부터 추출된 핵산을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 샘플은 T-세포 및 B-세포 수용체 프로파일링을 위한 혈액 샘플의 림프구에서 추출된 핵산을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 샘플은 편집된 CRISPR 유전자 샘플이다. 일부 특별한 실시예에서, 상기 샘플은 편집된 메가 뉴클레아제, 편집된 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 편집된 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 CAR-T, CAR-NK, TCR-T, 불멸화 세포주(예를 들어, 조작된 신경 줄기세포주 CTX) 또는 치료용 조혈 줄기세포로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 유전자 조작 세포(생체 외 또는 생체 내)로부터 유래한다. 여기서, 상기 세포는 섬유아세포, 연골세포, 각질세포, 간세포, 췌장 섬 세포, 줄기세포(예를 들어, 조혈 줄기세포, 중간엽 줄기세포 또는 피부 줄기세포) 및 면역 세포(예를 들어, 종양 침윤 림프구, 바이러스 재구성 T 세포, 수지상 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 대식세포)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
다른 실시예에서, 본 명세서에 제공되는 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플에서 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 방법은, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플과 접촉시켜 결합 생성물을 생성하는 단계로서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성되는 단계 (a); 제1 표적-특이적 프라이머로 제1 PCR을 수행하여 제1 PCR 생성물을 형성함으로써 결합 생성물을 증폭하는 단계 (b); 시퀀싱 라이브러리를 형성하기 위해 시퀀싱 특이적 어댑터 프라이머 및 제1 표적 특이적 프라이머에 중첩 된 제2 표적 특이적 프라이머로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 생성물을 증폭하는 단계 (c); 시퀀싱 결과를 얻기 위해 상기 시퀀싱 라이브러리를 정량화하고 판독하는 단계 (d); 및 시퀀싱 결과를 참조 게놈에 매핑하는 단계 (e)를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 명세서에서 제공되는 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 유전자 편집 효율을 평가하는 방법은, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 상기 샘플과 접촉시켜 결합 생성물을 생성하는 단계로서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성되는 단계 (a); 제1 표적-특이적 프라이머로 제1 PCR을 수행하여 제1 PCR 생성물을 형성함으로써 결합 생성물을 증폭하는 단계로서, 제1 표적-특이적 프라이머는 바람직하게는 온-타겟, 예측된 오프-타겟 또는 알려진 오프-타겟에서 단일 가닥 핵산 단편을 어닐링하도록 구성되는 단계 (b); 시퀀싱 라이브러리를 형성하기 위해, 시퀀싱 특이적 어댑터 프라이머 및 제1 표적 특이적 프라이머에 상대적으로 중첩된 제2 표적 특이적 프라이머로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 생성물을 증폭하는 단계 (c); 상기 시퀀싱 라이브러리를 정량화하고 판독하여 시퀀싱 결과를 형성하는 단계 (d); 및 상기 시퀀싱 결과를 참조 게놈에 매핑하고 유전자 편집 효율을 평가하는 단계 (e)를 포함한다.
다른 실시예에서, 상기 예측된 오프-타겟은 E-CRISP, Cas-OFFinder 및/또는 CRISPRscan으로 구성된 소프트웨어를 기반으로 실리코에서 예측된다. 일부 실시예에서, 상기 E-CRISP는 부정합(mismatch) 컷오프가 <= 10, 9, 8, 7 또는 6이고, 상기 Cas-OFFinder는 부정합이 <= 6, 5, 4, 3 또는 2이며 벌지가 <= 3, 2 또는 1이고, 상기 CRISPRscan은 임계값이 없다. 일부 실시예에서, 단계 (e)는, 분할 판독 및 불일치 판독을 획득하여 전위를 검출하는 단계; 또는 삽입 및 삭제(indel) 빈도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 상기 분할 판독 및 불일치 판독은, 잠재적 후보 전위를 식별하는 단계; 및 온-타겟 스페이서 및 절단 빈도 결정자(CFD)에 대한 프로토스페이서 유사성을 추정하는 단계에 의해 얻어진다. 일부 특정 실시예에서, 상기 인델 빈도는, 매핑된 결과를 GATK-리얼라이너에 의해 정렬하여 정렬된 결과를 형성하는 단계 (a); 상기 정렬된 결과를 대응하는 스페이서 영역에 걸치지 않도록 필터링하는 단계 (b); 절단 부위의 상류 또는 하류 약 5-bp 주변에서 발생하는 삽입 및 삭제를 예측하는 단계 (c); 및 음성 대조군의 상응하는 값에 의해 제거된 상기 샘플의 인델 값에 의해 신뢰할 수 있는 인델 빈도를 결정하는 단계 (d)에 의해 얻어진다.
다른 실시예에서, 본 명세서에 제공되는 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 방법은, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플과 접촉시켜 결합 생성물을 생성하는 단계로서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성되는 단계 (a); 상기 제1 표적-특이적 프라이머 세트로 제1 PCR을 통해 결합 생성물을 증폭하는 단계로서, 상기 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 온-타겟 및 하나 이상의 예측 및/또는 공지된 오프-타겟의 단일 가닥 핵산 단편 5'을 어닐링하도록 구성되는 단계 (b); 제2 표적-특이적 프라이머 세트 및 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 제2 PCR을 통해 상기 제1 PCR 생성물을 증폭하여 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계로서, 상기 제2 표적-특이적 프라이머 세트의 각각은 상기 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 대응하는 프라이머에 대해 중첩되는 단계 (c); 및 오프-타겟을 식별하기 위해 상기 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계 (d)를 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (b)에서 상기 예측된 오프-타겟은 컴퓨터로 예측된 오프-타겟이다. 일부 실시예에서, 상기 컴퓨터로 예측된 오프-타겟은 E-CRISP, Cas-OFFinder 또는 CRISPRscan을 포함하는 소프트웨어에 기초하여 예측된 상부 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10개의 오프-타겟이다. 일부 특정 실시예에서, 상기 E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 10, 9, 8, 7, 또는 6이고, 상기Cas-OFFinder는 부정합이 <= 6, 5, 4, 3, 또는 2이며 벌지가 <= 3, 2, 또는 1이고, 상기 CRISPRscan은 임계값이 없다.
일부 실시예에서, 상기 방법은, 분할 판독 및 불일치 판독을 획득하여 전위를 검출하는 단계; 또는 삽입 및 삭제(인델) 빈도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 상기 분할 판독 및 불일치 판독은, 잠재적 후보 전위를 식별하는 단계; 및 온-타겟 스페이서 및 절단 빈도 결정자(CFD)에 대한 프로토스페이서 유사성을 추정하는 단계에 의해 얻어진다. 일부 특정 실시예에서, 상기 인델 빈도는, 매핑된 결과를 GATK-리얼라이너에 의해 정렬하여 정렬된 결과를 형성하고; 상기 정렬된 결과를 해당 스페이서 영역에 걸치지 않도록 필터링하며; 절단 부위의 상류 또는 하류에서 5-bp 주위에서 발생하는 삽입 및 삭제를 예측하고; 및 음성 대조군의 상응하는 값에 의해 제거된 상기 샘플의 인델 값에 의해 신뢰할 수 있는 인델 빈도를 결정하는 것을 통해 얻어진다.
일부 실시예에서, 단계 (a) 전에 상기 방법은, 상기 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단을 차단하는 단계; 상기 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단을 인산화하는 단계; 또는 상기 핵산을 아데닐화하여 상기 단일 가닥 핵산 단편에 3'-아데노신 돌출부를 생성하는 단계 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는, 상기 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된 3' 열성 단부; 및/또는 랜덤 또는 퇴행성 뉴클레오티드의 3~20개의 염기를 포함하는 5' 돌출 단부를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터의 듀플렉스 부분은 단계 (a)에서 듀플렉스 형태로 유지되기에 충분한 길이를 갖는다. 일부 특정 실시예에서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 듀플렉스 형태의 일부를 연결하는 헤어핀 루프를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 개별 원본 분자를 추적하기 위한 고유 분자 인덱스(UMI)로서 3~20개의 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (c)는 시퀀싱 특이적 어댑터 쌍이 있는 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 단계 (c) 후에, 시퀀싱 프라이머 쌍을 사용하여 상기 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 추가 포함하며, 상기 시퀀싱 프라이머 쌍은 각각 상기 제2 PCR 생성물의 반대 가닥에 적어도 부분적으로 상호 보완적이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 고분자량 DNA로부터 제조된 복수의 DNA 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 단일 가닥 핵산 단편은 이중 가닥 DNA 단편의 변성으로부터 제조된다.
일부 실시예에서, 상기 샘플은 RNA 단편의 역전사로부터 제조된 단일 가닥 cDNA 단편을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 복수의 핵산 단편을 분석하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 샘플은 포유류로부터 유래하고, 선택적으로 상기 포유류는 인간이다. 일부 특정 실시예에서, 상기 인간은 질병이 있거나 질병이 의심되는 것으로 알려진 개인이고, 선택적으로 상기 질병은 암 또는 유전적 질환이다. 일부 실시예에서, 상기 표적 핵산 중 하나 이상이 상기 암에 대한 하나 이상의 마커를 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 상기 인간은 태아이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플로부터 유래된 것이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플로부터 추출된 무세포 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 순환 종양 세포로부터 추출된 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 T-세포 및 B-세포 수용체 프로파일링을 위한 혈액 샘플의 림프구로부터 추출된 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 편집된 CRISPR 유전자 샘플이다. 일부 특정 실시예에서, 샘플은 편집된 메가 뉴클레아제, 편집된 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 편집된 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다. 일부 실시예에서, 샘플은 CAR-T, CAR-NK, TCR-T, 불멸화 세포주(예를 들어, 조작된 신경 줄기세포주 CTX) 또는 치료용 조혈 줄기세포로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 샘플은 유전자 조작 세포(생체 외 또는 생체 내)로부터 유래하며, 여기서, 세포는 섬유아세포, 연골세포, 각질세포, 간세포, 췌장 섬 세포, 줄기세포(예를 들어, 조혈 줄기세포, 중간엽 줄기세포 또는 피부 줄기세포) 및 면역 세포(예를 들어, 종양 침윤 림프구, 바이러스 재구성 T 세포, 수지상 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 대식세포)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 특허 또는 출원 파일에는 색상으로 그려진 도면이 하나 이상 포함되어 있다. 색상 도면이 포함된 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 사무소에서 제공한다.
도 1a는 예시적인 실시예에 따른 샘플로부터 표적 핵산을 증폭하기 위한 워크플로우를 설명하는 개략도이다.
도 1b는 다른 예시적인 실시예에 따른 샘플로부터 표적 핵산을 증폭하기 위한 워크플로우를 설먕하는 개략도이다.
도 2a 및 도 2b는 예시적인 실시예에 따른, 본 발명에 설명된 예시적인 기술, 즉 편집-서열(EDITED-Seq)을 사용하여 CRISPR-Cas9에 의해 편집된 VEGFA 2 로커스에서의 오프-타겟 식별 및 검증을 나타내는 도면이다.
도 2c는 도 2a 및 도 2b의 동일한 예시적 실시예에 따른, 편집-서열 스코어(Escore)와 인델 빈도(%) 사이의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 2d는 도 2a 및 도 2b의 동일한 예시적 실시예에 따른, VEGFA 2 로커스에서 입력 유전체 DNA의 검출 적정도를 나타내는 도면이다.
도 2e는 도 2a 및 도 2b의 동일한 예시적 실시예에 따른, 염색체 좌표 내에서 VEGFA 2의 전위 서커스 플롯을 나타내는 도면이다.
도 3a는 도 2a-2e의 예시적인 실시예에 따른, VEGFA 2 로커스에서 오프-타겟을 검출할 때, EDITED-Seq 오프-타겟 프로파일과 GUIDE-Seq 및 DISCOVER-Seq에 대한 비교를 나타내는 벤 다이어그램이다.
도 3b는 도 3a의 동일한 예시적인 실시예에 따른, 상응하는 스코어 값, 예를 들어, 에스코어, GUIDE-Seq 카운트, DISCOVER 스코어에 기초하여 일반적으로 식별되는 35개 부위의 순위에 대한 비교를 나타내는 도면이다.
도 3c는 도 3a의 동일한 예시적 실시예에 따른, GUIDE-Seq 및 DISCOVER-Seq와 비교하여, EDITED-Seq의 식별된(참) 및 누락된(거짓) 오프-타겟의 파라날(Paranal) 분포를 나타내는 도면이다.
도 3d는 통합 게놈 뷰어에 도시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 10번 염색체에서 추가적인 오프-타겟 삽입("I"로 도시됨) 및 삭제가 EDITED-Seq에 의해 검출되었으나, DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3e는 통합 게놈 뷰어에 도시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 17번 염색체에서 추가적인 오프-타겟 삽입("I"로 도시됨) 및 삭제가 EDITED-Seq에 의해 검출되었으나, DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3f는 통합 게놈 뷰어에 도시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 22번 염색체에서 추가적인 오프-타겟 삽입("I"로 도시됨) 및 삭제가 EDITED-Seq에 의해 검출되었으나, DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3g는 통합 게놈 뷰어에 표시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 11번 염색체에서 추가적인 오프-타겟 삽입("I"로 표시됨) 및 삭제가 EDITED-Seq에 의해 검출되었지만 DISOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3h는 통합 게놈 뷰어에 도시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 12번 염색체에서 추가적인 오프-타겟 삽입("I"로 도시됨) 및 삭제가 EDITED-Seq에 의해 검출되었으나, DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3i는 통합 게놈 뷰어에 표시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 7번 염색체에서 추가적인 전위가 EDITED-Seq에 의해 검출되었지만, DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3j는 VEGFA 2의 온-타겟 부위에 대한 하나의 프라이머 세트에 의해 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3k는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 1개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3l는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 2개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3m는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 3개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3n는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 4개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3o는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 5개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3p는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 6개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3q는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 7개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3r는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 8개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3s는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 9개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3t는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 10개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3u는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 11개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3v는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 12개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3w는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 13개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3x는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 14개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3y는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 15개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3z는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 16개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3aa는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 17개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3ab는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 18개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3ac는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 19개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3ad는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 20개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 4a는 예시적인 실시예에 따른, CRISPR- Cas9에 의한 iPSC 편집의 워크플로우를 나타내는 개략도이다.
도 4b는 예시적인 실시예에 따른, CRISPR- Cas9에 의한 초기 T-세포 편집의 워크플로우를 나타내는 개략도이다.
도 4c는 도 4a의 동일한 예시적 실시예에 따른, GAPDH 및 HBB 부위에서 iPSC의 오프-타겟을 나타내는 차트이다.
도 4d는 도 4b의 동일한 실시예에 따른, TRAC 및 PD-1 부위에서 T-세포의 오프-타겟을 나타내는 차트이다.
도 5a는 예시적인 실시예에 따른, 마우스에서 수행되는 EDITED-Seq의 워크플로우를 설명하는 개략도이다.
도 5b 및 도 5c는 각각 도 5a의 동일한 일 실시예에 따른, ALB 부위에서 15일 또는 60일 후에 마우스의 오프-타겟을 나타내는 차트이다.
도 6은 렌티 CRISPR(lentiCRISPR) 벡터의 토폴로지를 예시하는 개략도이다.
도 1a는 예시적인 실시예에 따른 샘플로부터 표적 핵산을 증폭하기 위한 워크플로우를 설명하는 개략도이다.
도 1b는 다른 예시적인 실시예에 따른 샘플로부터 표적 핵산을 증폭하기 위한 워크플로우를 설먕하는 개략도이다.
도 2a 및 도 2b는 예시적인 실시예에 따른, 본 발명에 설명된 예시적인 기술, 즉 편집-서열(EDITED-Seq)을 사용하여 CRISPR-Cas9에 의해 편집된 VEGFA 2 로커스에서의 오프-타겟 식별 및 검증을 나타내는 도면이다.
도 2c는 도 2a 및 도 2b의 동일한 예시적 실시예에 따른, 편집-서열 스코어(Escore)와 인델 빈도(%) 사이의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 2d는 도 2a 및 도 2b의 동일한 예시적 실시예에 따른, VEGFA 2 로커스에서 입력 유전체 DNA의 검출 적정도를 나타내는 도면이다.
도 2e는 도 2a 및 도 2b의 동일한 예시적 실시예에 따른, 염색체 좌표 내에서 VEGFA 2의 전위 서커스 플롯을 나타내는 도면이다.
도 3a는 도 2a-2e의 예시적인 실시예에 따른, VEGFA 2 로커스에서 오프-타겟을 검출할 때, EDITED-Seq 오프-타겟 프로파일과 GUIDE-Seq 및 DISCOVER-Seq에 대한 비교를 나타내는 벤 다이어그램이다.
도 3b는 도 3a의 동일한 예시적인 실시예에 따른, 상응하는 스코어 값, 예를 들어, 에스코어, GUIDE-Seq 카운트, DISCOVER 스코어에 기초하여 일반적으로 식별되는 35개 부위의 순위에 대한 비교를 나타내는 도면이다.
도 3c는 도 3a의 동일한 예시적 실시예에 따른, GUIDE-Seq 및 DISCOVER-Seq와 비교하여, EDITED-Seq의 식별된(참) 및 누락된(거짓) 오프-타겟의 파라날(Paranal) 분포를 나타내는 도면이다.
도 3d는 통합 게놈 뷰어에 도시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 10번 염색체에서 추가적인 오프-타겟 삽입("I"로 도시됨) 및 삭제가 EDITED-Seq에 의해 검출되었으나, DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3e는 통합 게놈 뷰어에 도시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 17번 염색체에서 추가적인 오프-타겟 삽입("I"로 도시됨) 및 삭제가 EDITED-Seq에 의해 검출되었으나, DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3f는 통합 게놈 뷰어에 도시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 22번 염색체에서 추가적인 오프-타겟 삽입("I"로 도시됨) 및 삭제가 EDITED-Seq에 의해 검출되었으나, DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3g는 통합 게놈 뷰어에 표시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 11번 염색체에서 추가적인 오프-타겟 삽입("I"로 표시됨) 및 삭제가 EDITED-Seq에 의해 검출되었지만 DISOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3h는 통합 게놈 뷰어에 도시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 12번 염색체에서 추가적인 오프-타겟 삽입("I"로 도시됨) 및 삭제가 EDITED-Seq에 의해 검출되었으나, DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3i는 통합 게놈 뷰어에 표시된 딥 앰플리콘 시퀀싱의 예시적인 결과로서, 7번 염색체에서 추가적인 전위가 EDITED-Seq에 의해 검출되었지만, DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq에 의해 검출되지 않았음을 나타내는 도이다.
도 3j는 VEGFA 2의 온-타겟 부위에 대한 하나의 프라이머 세트에 의해 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3k는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 1개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3l는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 2개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3m는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 3개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3n는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 4개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3o는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 5개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3p는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 6개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3q는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 7개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3r는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 8개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3s는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 9개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3t는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 10개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3u는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 11개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3v는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 12개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3w는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 13개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3x는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 14개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3y는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 15개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3z는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 16개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3aa는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 17개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3ab는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 18개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3ac는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 19개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 3ad는 VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9에서 실리콘 내에서 예측된 20개의 오프-타겟 부위에서 검출된 전위 이벤트를 나타내는 크리코스 플롯이다.
도 4a는 예시적인 실시예에 따른, CRISPR- Cas9에 의한 iPSC 편집의 워크플로우를 나타내는 개략도이다.
도 4b는 예시적인 실시예에 따른, CRISPR- Cas9에 의한 초기 T-세포 편집의 워크플로우를 나타내는 개략도이다.
도 4c는 도 4a의 동일한 예시적 실시예에 따른, GAPDH 및 HBB 부위에서 iPSC의 오프-타겟을 나타내는 차트이다.
도 4d는 도 4b의 동일한 실시예에 따른, TRAC 및 PD-1 부위에서 T-세포의 오프-타겟을 나타내는 차트이다.
도 5a는 예시적인 실시예에 따른, 마우스에서 수행되는 EDITED-Seq의 워크플로우를 설명하는 개략도이다.
도 5b 및 도 5c는 각각 도 5a의 동일한 일 실시예에 따른, ALB 부위에서 15일 또는 60일 후에 마우스의 오프-타겟을 나타내는 차트이다.
도 6은 렌티 CRISPR(lentiCRISPR) 벡터의 토폴로지를 예시하는 개략도이다.
개요
본 명세서에 설명된 양태는 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하거나 식별하는 방법이다. 일부 양태에서, 이 방법은 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하거나 식별하는 감도를 증가시킨다. 일부 양태에서, 방법은 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하거나 식별하는 특이성을 증가시킨다. 일부 양태에서, 방법은 적어도 하나의 어댑터를 적어도 하나의 표적 핵산에 결합하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 방법은 적어도 하나의 PCR을 수행하여 적어도 하나의 PCR 생성물을 얻는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 방법은 제1 PCR을 수행하여 제1 PCR 생성물을 얻은 다음, 제2 PCR을 수행하여 제2 PCR 생성물을 얻는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 어댑터는 적어도 하나의 표적 핵산 또는 PCR 생성물에 결합된다.
일부 실시예에서, 방법은 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플에 접촉시켜 결합 생성물을 생성함으로써 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 방법은 제 1 PCR에 의해 제1 PCR 생성물을 증폭하여 제1 PCR 생성물을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 제2 표적 -특이적 프라이머 및 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 제2 PCR을 통해 1 PCR 생성물을 증폭하여 제2 PCR 생성물을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 제1 표적-특이적 프라이머에 중첩된다. 일부 실시예에서, 방법은 복수의 단일 가닥 핵산 단편을 포함하는 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합시켜 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하는 단계; 제1 표적-특이적 프라이머를 표적 서열 부근의 단일 가닥 핵산 단편에 어닐링하는 단계; DNA중합 효소를 사용하여 단일 가닥 핵산 단편 위로 제1 표적-특이적 프라이머를 연장하는 단계; 초기 프라이머 확장 듀플렉스를 얻는 단계; 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 단일 가닥으로 해리하는 단계; 및 제2 표적-특이적 프라이머 및 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 초기 프라이머 연장 듀플렉스의 단일 가닥의 일부를 증폭하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플과 접촉시켜 결합 생성물을 형성함으로써 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 단계로서, 여기서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성되는 단계; 제1 표적-특이적 프라이머로 제1 PCR을 수행하여 결합 생성물을 증폭하여 제1 PCR 생성물을 형성하는 단계; 시퀀싱 라이브러리를 형성하기 위해 시퀀싱 특이적 어댑터 프라이머 및 제1 표적-특이적 프라이머에 상대적으로 중첩된 제2 표적-특이적 프라이머로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 생성물을 증폭하는 단계; 시퀀싱 라이브러리를 정량화하고 판독하여 시퀀싱 결과를 얻는 단계; 및 시퀀싱 결과를 참조 게놈에 매핑하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플에 접촉시켜 결합 생성물을 생성함으로써 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 유전자 편집 효율을 평가하는 단계로서, 여기서 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 -가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성되는 단계; 제1 표적-특이적 프라이머로 제1 PCR를 수행하여 제1 결합 생성물을 증폭하여 제1 PCR 생성물을 형성하는 단계; 시퀀싱 라이브러리를 형성하기 위해 시퀀싱 특이적 어댑터 프라이머 및 제1 표적-특이적 프라이머에 상대적으로 중첩된 제2 표적-특이적 프라이머로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 생성물을 증폭하는 단계; 시퀀싱 라이브러리를 정량화하고 판독하여 시퀀싱 결과를 형성하는 단계; 및 시퀀싱 결과를 참조 게놈에 매핑하고 유전자 편집 효율을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 유전자 편집 효율 평가는 전위 또는 인델 빈도를 평가하는 데 적용될 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 설명된 방법은 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플과 접촉시켜 결합 생성물을 생성함으로써 적어도 하나의 표적 핵산을 포함하는 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 단계로서, 여기서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성되는 단계; 제1 표적-특이적 프라이머 세트로 제1 PCR을 통해 결합 생성물을 증폭하는 단계로서, 여기서 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 온-타겟 및 하나 이상의 예측 및/또는 공지된 오프-타겟의 단일 -가닥 핵산 단편 5'을 어닐링하도록 구성되는 단계; 제2 표적-특이적 프라이머 세트 및 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 생성물을 증폭하여 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계로서, 여기서 제2 표적-특이적 프라이머 세트 각각은 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 대응하는 프라이머에 중첩되는 단계; 및 오프-타겟을 식별하기 위해 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 오프-타겟을 식별하기 위한 계산 예측과 결합될 수 있다.
농축
특정 실시예에서, 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플에 접촉시켜 결합 생성물을 생성하는 단계로서, 여기서 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된다. 일부 실시예에서, 방법은 제1 표적-특이적 프라이머로 제1 PCR을 통해 결합 생성물을 증폭하여 제1 PCR 생성물을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 제2 표적-특이적 프라이머 및 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 생성물을 증폭하여 제2 PCR 생성물을 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 제2 표적-특이적 프라이머는 제1 표적 -특이적 프라이머에 중첩된 것이다. 일부 실시예에서, 샘플은 고분자량 DNA (예를 들어, 유전체 DNA)로부터 제조된 복수의 DNA 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 효소 기반 처리에 의해 제조된다. 다른 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 단파장, 고주파 음향 에너지에 노출됨으로써 제조된다. 다른 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 100℃ 내지 105℃에서 DNA를 가열함으로써 제조된다. 다른 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 원심 전단에 의해 제조된다. 다른 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 수력학 전단력(hydrodynamic shear forces)에 의해 제조된다. 일부 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 초음파 처리에 노출됨으로써 제조된다. 일부 특정 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 Bioruptor® Pico 또는 Diagenode One에 의해 제조된다. 다른 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 하이드로포어의 형성에 의해 생성된 난류에 의해 제조된다. 일부 특정 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 Megaruptor®, Nebulizer® 및/또는 Covaris®에 의해 제조된다. 일부 실시예에서, 복수의 DNA 단편의 준비는 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분석 및 확인된다. 일부 실시예에서, 복수의 DNA 단편의 준비는 Fragment Analyzer™에 의해 분석 및 확인된다. 일부 실시예에서, 복수의 DNA 단편의 준비는 LabChip® GX Touch™ 핵산 분석기에 의해 분석 및 확인된다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 50bp 내지 약 5000bp이다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 50bp 내지 약 200bp, 약 50bp 내지 약 300bp, 약 50bp 내지 약400bp, 약 50bp 내지 약 500bp, 약 50bp 내지 약 600bp, 약 50bp 내지 약 700bp, 약 50bp 내지 약 800bp, 약 50bp 내지 약 900bp, 약 50bp 내지 약 500bp 길이, 약 50bp 내지 약 2000bp 길이, 약 50bp 내지 약 3000bp, 약 50bp 내지 약 4000bp 또는 약 50bp 내지 약 5000bp이다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 100bp 내지 약 200bp, 약 100bp 내지 약 300bp, 약 100bp 내지 약 400bp, 약 100bp 내지 약 500bp, 약 100bp 내지 약 600bp, 약 100bp 내지 약 700bp, 약 100bp 내지 약 800bp, 약 100bp 내지 약 900bp, 약 100bp 내지 약 1000bp, 약 100bp 내지 약 2000bp, 약 100bp 내지 약 3000bp, 약 100bp 내지 약 4000bp 또는 약 100bp 내지 약 5000bp이다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 300bp 내지 약400bp, 약 300bp 내지 약 500bp, 약 300bp 내지 약 600bp, 약 300bp 내지 약 700bp, 약 300bp 내지 약 800bp, 약 300bp 내지 약 900bp, 약 300bp 내지 약 l000bp, 약 300bp 내지 약 2000bp, 약 300bp 내지 약 3000bp, 약 300bp 내지 약 4000bp 또는 약 300bp 내지 약 5000bp이다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 600bp 내지 약 700bp, 약 600bp 내지 약 800bp, 약 600bp 내지 약 900bp, 약 600bp 내지 약 l000bp, 약 600bp 내지 약 2000bp, 약 600bp 내지 약 3000bp, 약 600bp 내지 약 4000bp 또는 약 600bp 내지 약 5000bp이다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 1000bp 내지 약 2000bp, 약 1000bp 내지 약 3000bp, 약 1000bp 내지 약 4000bp 또는 약 1000bp 내지 약5000bp이다.
일부 실시예에서, 복수의 단일 가닥 핵산 단편은 이중 가닥 DNA 단편의 변성으로부터 제조된다. 일부 특정 실시예에서, 이중 -가닥 DNA 단편은 95℃에서 1, 5, 10, 20 또는 30분 동안 가열된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 95℃에서 1, 5, 10, 20 또는 30분 동안 가열된 후 1분 동안 얼음 위에 놓인다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 유리 비드(Disruptor Beads™; Scientific Industries, Bohemia, NY, USA)로 1, 5, 10, 20 또는 30분 동안 2,500 rpm에서 Disruptor Genie 비드-비터(Scientific Industries)를 사용하여 파괴한 다음, 3,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 침전시킨다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 10W에서 30, 60, 90, 120, 150, 200, 250 또는 300초 동안 직접 초음파 처리된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 10 W, 22.4 kHz에서 1, 5, 10, 20 또는 30분 동안 간접 초음파 처리된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 튜브에 첨가하고 40 kHz에서 1, 5, 10, 20 또는 30분 동안 초음파 수조의 물에 침지된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 연속 피펫팅을 통해 0.01, 0.1 또는 1 mol/L NaOH에서 균질화되고 상온에서 1, 2, 5, 10, 20 또는 30분 동안 배양된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 25% 및 50% 포름아미드 용액에서 피펫으로 부드럽게 균질화되고 실온에서 배양된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 25%, 50%, 및 60% DMSO 용액에서 피펫으로 부드럽게 균질화되고 실온에서 배양된다. 일부 실시예에서, 복수의 단일 -가닥 핵산 단편의 준비는 260 nm에서 DNA 단편의 흡광도를 측정함으로써 확인된다.
일부 실시예에서, 방법은 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단을 차단하는 단계; 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단을 인산화하는 단계; 또는 핵산을 아데닐화하여 단일 -가닥 핵산 단편에 3'-아데노신 돌출부를 생성하는 단계 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥이다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 이중 가닥이다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는, 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된 3' 열성 말단; 및 랜덤 또는 퇴행성 뉴클레오티드의 3~20개의 염기를 포함하는 5' 돌출 말단을 포함한다. 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터의 듀플렉스 부분은 듀플렉스 형태를 유지하기에 충분한 길이를 갖는다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 듀플렉스 형태의 일부를 연결하는 헤어핀 루프를 포함한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 Y 모양을 포함한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 바코드를 포함한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 개별 원본 분자를 추적하기 위한 고유 분자 인덱스(UMI)로서 3~20개의 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 단편을 포함한다.
일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합된다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단에 결합된다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단 및 3' 말단에 결합된다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 리가제를 통해 결합된다. 본 명세서에 설명된 샘플이 표적 유전자 편집 샘플인 경우, 본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머의 표적은 미리 결정된다. 일부 실시예에서, 표적은 CRISPR 유전자를 편집하는 온-타겟 부위를 포함한다. 다른 실시예에서, 표적은 CRISPR 유전자를 편집하는 예측된 오프-타겟 부위를 포함한다. 다른 실시예에서, 표적은 자발적인 이중 가닥 중단점을 포함한다.
본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 전산적으로 예측된다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 E-CRISP에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 Cas-OFFinder에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CRISPRscan에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CRISPRitz에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CRISPOR에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CRISPR Design 웹 사이트(http://crispr.mit.edu)에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 Ecrisp에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 Crispr2vec에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 Hsu-Zhang 스코어에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CHOPCHOP에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CFD에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CRISTA에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 Elevation에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 DeepCrispr에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 DeepSpCas9에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CALITAS에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 심층 컨볼루션 신경망 또는 심층 피드포워드 신경망을 갖는 알고리즘에 의해 예측된다. 일부 실시예에서, 전술한 예측 알고리즘 중 하나 이상에서 설정되는 컷오프는 시드 내부 및/또는 외부에서 부정합이 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 이하이다. 일부 실시예에서, 전술한 예측 알고리즘 중 하나 이상에서 설정되는 컷오프는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 내부 및/또는 외부에서 부정합이 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 이하이다. 다른 실시예에서, 전술한 예측 알고리즘 중 하나 이상의 컷오프는 시드 내부 및/또는 외부에서 벌지(DNA 벌지로 삽입 또는 RNA 벌지로 삭제)가 각각 4, 3, 2 또는 1 이하로 설정된다. 다른 실시예에서, 전술한 예측 알고리즘 중 하나 이상의 컷오프는 PAM 내부 및/또는 외부에서 벌지(DNA 벌지로 삽입 또는 RNA 벌지로 삭제)가 각각 4, 3, 2, 또는 1 이하로 설정된다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 자발적 이중 가닥의 중단점은 게놈 취약 부위이다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 자발적 이중 가닥의 중단점은 Chr 1: 89231183 및 Chr 1: 109838221로 구성된다.
본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머는 본 명세서에 설명된 표적의 부근에 위치하도록 설계된다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머는 본 명세서에 설명된 표적의 하류에 있는 모든 가닥의 DNA 단편과 역방향으로 상호 보완적이다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 약 5bp 내지 약 l000bp에 위치한다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 약 5bp 내지 약 500bp에 위치한다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적의 하류에서 약 5bp 내지 약 l0bp, 약 l0bp 내지 약 30bp, 약 30bp 내지 약 50bp, 약 50bp 내지 약 70bp, 약 70bp 내지 약 90bp 또는 약 90bp 내지 약 l00bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적의 하류에서 약 l00bp 내지 약 120bp, 약 120bp 내지 약 140bp, 약 140bp 내지 약 160bp, 약 160bp 내지 약 180bp, 약 180bp 내지 약 200bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적의 하류에서 약 200bp 내지 약 220bp, 약 220bp 내지 약 240bp, 약 240bp 내지 약 260bp, 약 260bp 내지 약 280bp, 약 280bp 내지 약 300bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적의 하류에서 약 300bp 내지 약 400bp, 약 400bp 내지 약 500bp, 약 500bp 내지 약 600bp, 약 600bp 내지 약 700bp, 약 700bp 내지 약 800bp, 약 800bp 내지 약 900bp, 약 900bp 내지 약 l00bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 적어도 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000bp에 위치한다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 제2 표적-특이적 프라이머는 본 명세서에 설명된 표적의 부근에 위치하도록 설계된다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 제2 표적-특이적 프라이머는 본 명세서에 설명된 표적의 하류에 있는 DNA 단편의 모든 가닥에 역방향으로 상호 보완적이다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 약 3bp 내지 약 l000bp에 위치한다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 약 3bp 내지 약 300bp에 위치한다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적의 하류에서 약 3bp 내지 약 l0bp, l0bp 내지 약 30bp, 약 30bp 내지 약 50bp, 약 50bp 내지 약 70bp, 약 70bp 내지 약 90bp 또는 약 90bp 내지 약 l00bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적의 하류에서 약 l00bp 내지 약 120bp, 약 120bp 내지 약 140bp, 약 140bp 내지 약 160bp, 약 160bp 내지 약 180bp, 약 180bp 내지 약 200bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적의 하류에서 약 200bp 내지 약 220bp, 약 220bp 내지 약 240bp, 약 240bp 내지 약 260bp, 약 260bp 내지 약 280bp, 약 280bp 내지 약 300bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적의 하류에서 약 300bp 내지 약 400bp, 약 400bp 내지 약 500bp, 약 500bp 내지 약 600bp, 약 600bp 내지 약 700bp, 약 700bp 내지 약 800bp, 약 800bp 내지 약 900bp, 약 900bp 내지 약 l00bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적의 하류에서 적어도 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000bp에 위치한다.
본 명세서에 설명된 제2 표적-특이적 프라이머는 본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머의 부근에 위치하도록 설계된다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 제2 표적-특이적 프라이머는 본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머의 하류에 있는 모든 가닥의 DNA 단편에 역방향으로 상호 보완적이다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 약3bp 내지 약l000bp 하류에 위치한다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머의 하류에서 약 3bp 내지 약 300bp에 위치한다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머의 하류에서 약 l0bp 내지 약 30bp, 약 30bp 내지 약 50bp, 약 50bp 내지 약 70bp, 약 70bp 내지 약 90bp 또는 약 90bp 내지 약 l00bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머의 하류에서 약 l00bp 내지 약 120bp, 약 120bp 내지 약 140bp, 약 140bp 내지 약 160bp, 약 160bp 내지 약 180bp, 약 180bp 내지 약 200bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머의 하류에서 약 200bp 내지 약 220bp, 약 220bp 내지 약 240bp, 약 240bp 내지 약 260bp, 약 260bp 내지 약 280bp, 약 280bp 내지 약 300bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머의 하류에서 약 300bp 내지 약 400bp, 약 400bp 내지 약 500bp, 약 500bp 내지 약 600bp, 약 600bp 내지 약 700bp, 약 700bp 내지 약 800bp, 약 800bp 내지 약 900bp, 약 900bp 내지 약 l00bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머의 하류에서 적어도 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000bp에 위치한다.
프라이머 설계
제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 16-32bp이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 16bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 17bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 18bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 19bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 20bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 21bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 22bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 23bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 24bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 25bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 26bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 27bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 28bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 29bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 30bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 31bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 길이가 32bp이다.
제1 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 40% 내지 약 60%이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 40%이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 45%이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 50%이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 55%이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 60%이다.
제1 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 55℃ 내지 약 72℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 55℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 56℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 57℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 58℃이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 59℃이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 60℃이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 65℃이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 70℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 71℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 72℃이다.
제1 표적-특이적 프라이머의 서열은 임의의 이차 구조가 최소화되도록 결정된다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 헤어핀 구조를 형성하지 않는다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 제1 표적-특이적 프라이머의 두 분자 사이에 이량체를 형성하지 않는다.
제1 표적-특이적 프라이머의 3' 말단에 있는 마지막 5개의 염기는 너무 많은 G 또는 C 염기를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머의 3' 말단에 있는 마지막 5개의 염기는 G 또는 C 염기를 포함하지 않는다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머의 3' 말단에 있는 마지막 5개의 염기는 단 하나의 G 또는 C 염기를 포함한다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머의 3' 말단에 있는 마지막 5개의 염기는 두 개의 G 또는/및 C 염기만을 포함한다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머의 3' 말단에 있는 마지막 5개의 염기는 세 개의 G 또는/및 C 염기만을 포함한다.
제1 표적-특이적 프라이머의 서열은 하나의 염기 또는 디뉴클레오티드 반복이 제한된 반복으로 구성된다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머의 서열은 하나의 염기 또는 디뉴클레오티드 반복의 반복을 포함하지 않는다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머의 서열은 하나의 염기의 하나 이상의 반복을 포함하지만 디뉴클레오티드 반복은 포함하지 않으며, 여기서 하나의 염기의 하나 이상의 반복은 동일한 염기가 단지 두 번, 단지 세 번 또는 단지 네 번만 나타나는 반복이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머의 서열은 하나의 염기의 반복을 포함하지 않고 하나 이상의 디뉴클레오티드 반복을 포함하며, 여기서 하나 이상의 디뉴클레오티드 반복은 동일한 디뉴클레오티드가 단지 두 번, 단지 세 번 또는 단지 네 번만 나타나는 반복이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머의 서열은 하나의 염기 및 하나 이상의 디뉴클레오티드의 하나 이상의 반복을 포함하며, 여기서 하나의 염기의 하나 이상의 반복은 동일한 염기가 단지 두 번, 단지 세 번 또는 단지 네 번만 나타나는 반복이고, 여기서 하나 이상의 디뉴클레오티드 반복은 동일한 디뉴클레오티드가 단지 두 번, 단지 세 번 또는 단지 네 번만 나타나는 반복이다.
제1 표적-특이적 프라이머의 서열은 SNP-함유 게놈 데이터베스를 포함하는Primer-BLAST를 사용하여 추가적인(비특이적) PCR 앰플리콘을 생성하지 않도록 설계된다. 일부 실시예에서, 상부 비특이적 PCR 앰플리콘은 제1 표적-특이적 프라이머와의 부정합이 적어도 4 개이다. 다른 실시예에서, 상부 비-특이적 PCR 앰플리콘은 제1 표적-특이적 프라이머와의 부정합이 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개이다.
제1 표적-특이적 프라이머는 이용 가능한 알고리즘에 의해 자동으로 설계될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 IDT에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 유로핀(Eurofin) 유전체학에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 Primer-BLAST에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 Primer 3에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 NetPrimer에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 PerlPrimer에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머는 Primer Premier에 의해 설계된다.
일부 실시예에서, 제1 PCR은 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 얻기 위해결합 생성물을 선형 증폭한다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 초기 프라이머 연장 듀플렉스의 중첩 증폭을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 예시적인 실시예에서, 제1 PCR은 제1 표적-특이적 프라이머 및 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머를 사용하여 표적 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 것이다. 일부 실시예에서, 제1 PCR은 제1 표적-특이적 프라이머를 단일-가닥 핵산 단편으로 어닐링하는 단계를 포함한다. 어닐링 온도는 제1 표적-특이적 프라이머의 용융 온도에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, 어닐링 온도는 약 55℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 58℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 60℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 58℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 65℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 70℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 75℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 78℃이다. 일부 실시예에서, 어닐링은 약 0.5분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 1분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 1.5분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 2분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 3분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 4분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 5분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 6분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 7분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 8분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 9분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 10분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 11분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 12분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 13분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 14분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 15분 동안 지속된다.
일부 실시예에서, 제1 PCR은 연장 단계를 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 20초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 30초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 40초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 50초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 60초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 70초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 80초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 90초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 100초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 110초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 120초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 3분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 4분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 5분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 6분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 7분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 8분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 9분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 10분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 11분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 12분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 13분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 14분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 15분 동안 지속된다.
제1 PCR은 샘플 사이에서 표적을 여러 번 검색할 수 있도록 전술한 PCR 단계(어닐링, 연장 및 변성)를 복수 사이클 포함한다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 3이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 4이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 5이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 10이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 15이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 20이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 25이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 30이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 35이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 40이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 45이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 50이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 55이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 65이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 70이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 75이다.
일부 실시예에서, 방법은 적어도 하나의 제2 표적 특이적 프라이머를 사용하여 제2 PCR(예를 들어, 중첩 PCR)을 수행하는 것을 포함한다. 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 16-32bp이다. 일부 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 16bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 17bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 18bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 19bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 20bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 21bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 22bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 23bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 24bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 25bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 26bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 27bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 28bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 29bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 30bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 31bp이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 길이가 32bp이다.
제2 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 40% 내지 약 60%이다. 일부 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 40%이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 45%이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 50%이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 55%이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 GC 함량이 약 60%이다.
제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 55℃ 내지 약 80℃이다. 일부 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 55℃이다. 일부 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 56℃이다. 일부 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 57℃이다. 일부 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 58℃이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 59℃이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 60℃이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 65℃이다. 다른 실시예에서, 제2 표적 -특이적 프라이머는 용융 온도가 약 70℃이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 75℃이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 76℃이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 77℃이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 78℃이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 79℃이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 용융 온도가 약 80℃이다.
제2 표적-특이적 프라이머의 서열은 임의의 2차 구조가 최소화되도록 결정된다. 일부 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 헤어핀 구조를 형성하지 않는다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 제2 표적-특이적 프라이머의 두 분자 사이에 이량체를 형성하지 않는다.
제2 표적-특이적 프라이머의 3' 말단에 있는 마지막 5개 염기는 너무 많은 G 또는 C 염기를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머의 3' 말단에 있는 마지막 5개 염기는 G 또는 C 염기를 포함하지 않는다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머의 3' 말단에 있는 마지막 5개 염기는 단 하나의 G 또는 C 염기로만 구성된다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머의 3' 말단에 있는 마지막 5개 염기는 2개의 G 또는/및 C 염기만을 포함한다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머의 3' 말단에 있는 마지막 5개 염기는 3개의 G 또는/및 C 염기만을 포함한다.
제2 표적-특이적 프라이머의 서열은 하나의 염기 또는 디뉴클레오티드 반복이 제한된 반복을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머의 서열은 하나의 염기 또는 디뉴클레오티드 반복의 반복을 포함하지 않는다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머의 서열은 하나의 염기의 하나 이상의 반복을 포함하지만 디뉴클레오티드 반복은 포함하지 않으며, 여기서 하나의 염기의 하나 이상의 반복은 동일한 염기가 단지 두 번, 단지 세 번 또는 단지 네 번만 나타나는 반복이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머의 서열은 하나의 염기의 반복을 포함하지 않고 하나 이상의 디뉴클레오티드 반복을 포함하며, 여기서 하나 이상의 디뉴클레오티드 반복은 동일한 디뉴클레오티드가 단지 두 번, 단지 세 번 또는 단지 네 번만 나타나는 반복이다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머의 서열은 하나의 염기 및 하나 이상의 디뉴클레오티드 반복의 하나 이상의 반복을 포함한다. 여기서, 하나의 염기의 하나 이상의 반복은 동일한 염기가 단지 두 번, 단지 세 번 또는 단지 네 번만 나타나는 반복이고, 여기서 하나 이상의 디뉴클레오티드 반복은 동일한 디뉴클레오티드가 단지 두 번, 단지 3 번 또는 단지 4 번만 나타나는 반복이다.
제2 표적-특이적 프라이머의 서열은 SNP-함유 게놈 데이터베스를 포함하는프라이머Primer-BLAST를 사용하여 추가적인(비특이적) PCR 앰플리콘을 생성하지 않도록 설계된다. 일부 실시예에서, 상부 비특이적 PCR 앰플리콘은 제2 표적-특이적 프라이머와의 부정합이 적어도 4 개이다. 다른 실시예에서, 상부 비-특이적PCR 앰플리콘은 제2 표적-특이적 프라이머와의 부정합이 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개이다.
제2 표적-특이적 프라이머는 이용 가능한 알고리즘에 의해 자동으로 설계될 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 IDT에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 유로핀(Eurofin) 유전체학에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 Primer-BLAST에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 Primer 3에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 NetPrimer에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 PerlPrimer에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머는 PrimerPremier에 의해 설계된다.
일부 실시예에서, 제2 PCR은 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 얻기 위해결합 생성물을 선형 증폭한다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 초기 프라이머 연장 듀플렉스의 중첩 증폭을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 예시적인 실시예에서, 제2 PCR은 제2 표적-특이적 프라이머 및 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머를 사용하여 표적 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 것이다. 일부 실시예에서, 제2 PCR은 제2 표적-특이적 프라이머를 단일-가닥 핵산 단편으로 어닐링하는 단계를 포함한다. 어닐링 온도는 제2 표적-특이적 프라이머의 용융 온도에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, 어닐링 온도는 약 55℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 58℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 60℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 58℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 65℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 70℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 75℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 78℃이다. 일부 실시예에서, 어닐링은 약 0.5분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 1분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 1.5분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 2분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 3분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 4분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 5분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 6분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 7분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 8분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 9분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 10분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 11분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 12분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 13분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 14분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 15분 동안 지속된다.
일부 실시예에서, 제2 PCR은 연장 단계를 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 20초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 30초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 40초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 50초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 60초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 70초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 80초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 90초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 100초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 110초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 120초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 3분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 4분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 5분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 6분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 7분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 8분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 9분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 10분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 11분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 12분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 13분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 14분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 15분 동안 지속된다.
제2 PCR은 샘플 사이에서 표적을 여러 번 검색할 수 있도록 전술한 PCR 단계(어닐링, 연장 및 변성)를 복수 사이클 포함한다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 3이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 4이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 5이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 10이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 15이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 20이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 25이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 30이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 35이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 40이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 45이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 50이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 55이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 65이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 70이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 75이다.
일부 실시예에서, 방법은 제 1 프라이머 또는 제 2 프라이머, 또는 본 명세서에 설명된 임의의 다른 추가 프라이머를 갖는 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 시퀀싱 특정 어댑터 쌍이 있는 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 시퀀싱 프라이머 쌍을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 포함하며, 여기서, 시퀀싱 프라이머 쌍은 각각 제 2 PCR 생성물의 반대 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상호 보완적이다. 일부 실시예에서, 샘플은 RNA 단편의 역전사로부터 제조된 단일 가닥 cDNA 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 복수의 핵산 단편을 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 PCR 및/또는 제2 PCR은 멀티플렉싱 PCR이다. 일부 실시예에서, 샘플은 포유류(예를 들어, 인간)로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 인간은 질병(예를 들어, 암 또는 유전적 질환)이 있거나 질병이 의심되는 것으로 알려진 개인이다. 일부 실시예에서, 표적 서열 중 하나 이상은 암에 대한 하나 이상의 마커를 포함한다. 다른 양태에서, 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하는 방법이 제공되며, 이 방법은 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 제1 표적 특이적 프라이머를 표적 서열 부근의 단일 가닥 핵산 단편에 어닐링하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 DNA 중합효소를 사용하여 단일 가닥 핵산 단편 위로 제 1 표적 특이적 프라이머를 연장하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 획득하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 단일 가닥으로 해리하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 하나 이상의 사이클을 반복하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 초기 프라이머 연장 듀플렉스의 단일 가닥의 일부를 제2 표적-특이적 프라이머 및 어댑터 프라이머로 증폭하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 방법은 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단을 차단하는 단계; 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단을 인산화하는 단계; 또는 핵산을 아데닐화하여 단일 -가닥 핵산 단편에 3'-아데노신 돌출부를 생성하는 단계 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는, 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된 3' 열성 말단; 및 랜덤 또는 퇴행성 뉴클레오티드의 3~20개의 염기를 포함하는 5' 돌출 말단을 포함한다. 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터의 듀플렉스 부분은 듀플렉스 형태를 유지하기에 충분한 길이를 갖는다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 듀플렉스 형태의 일부를 연결하는 헤어핀 루프를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 시퀀싱 특정 어댑터 쌍을 갖는 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 시퀀싱 프라이머 쌍을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 포함하며, 여기서, 시퀀싱 프라이머 쌍은 각각 제 2 PCR 생성물의 반대 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상호 보완적이다. 일부 실시예에서, 샘플은 고분자량 DNA(예를 들어, 유전체 DNA)로부터 제조된 복수의 DNA 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 복수의 단일 가닥 핵산 단편은 이중 가닥 DNA 단편의 변성으로부터 제조된다. 일부 실시예에서, 샘플은 RNA 단편의 역전사로부터 제조된 단일 가닥 cDNA 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머는 표적 서열을 기하급수적으로 증폭하기 위해 첨가된다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 개별 원본 분자를 추적하기 위한 고유 분자 인덱스(UMI)로서 3~20개의 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 복수의 핵산 단편을 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 제 1 PCR 및/또는 제 2 PCR은 멀티플렉싱 PCR이다.
일부 실시예에서, 샘플은 포유류(예를 들어, 인간)로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 인간은 질병(예를 들어, 암 또는 유전적 질환)이 있거나 질병이 의심되는 것으로 알려진 개인이다. 일부 실시예에서, 상기 표적 핵산 중 하나 이상이 상기 암에 대한 하나 이상의 마커를 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 상기 인간은 태아이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플로부터 유래된 것이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플로부터 추출된 무세포 핵산이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 순환 종양 세포로부터 추출된 핵산이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 T-세포 및 B-세포 수용체 프로파일링을 위한 혈액 샘플의 림프구로부터 추출된 핵산이다. 일부 실시예에서, 상기 샘플은 편집된 CRISPR 유전자 샘플이다. 일부 특정 실시예에서, 샘플은 편집된 메가 뉴클레아제, 편집된 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 편집된 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다. 일부 실시예에서, 샘플은 CAR-T, CAR-NK, TCR-T, 불멸화 세포주(예를 들어, 조작된 신경 줄기세포주 CTX) 또는 치료용 조혈 줄기세포로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 샘플은 유전자 조작 세포(생체 외 또는 생체 내)로부터 유래하며, 여기서, 세포는 섬유아세포, 연골세포, 각질세포, 간세포, 췌장 섬 세포, 줄기세포(예를 들어, 조혈 줄기세포, 중간엽 줄기세포 또는 피부 줄기세포) 및 면역 세포(예를 들어, 종양 침윤 림프구, 바이러스 재구성 T 세포, 수지상 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 대식세포)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
다른 양태에서, 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 방법이 제공되며, 이 방법은 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플에 결합하여 결합 생성물을 생성하는 단계를 포함한다. 여기서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제1 표적-특이적 프라이머로 제1 PCR을 수행하여 제1 PCR 생성물을 형성함으로써 결합 생성물을 증폭하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 시퀀싱 라이브러리를 형성하기 위해, 시퀀싱 특이적 어댑터 프라이머 및 제1 표적 특이적 프라이머에 상대적으로 중첩된 제2 표적 특이적 프라이머로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 생성물을 증폭하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 시퀀싱 결과를 얻기 위해 시퀀싱 라이브러리를 정량화하고 판독하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 시퀀싱 결과를 참조 게놈에 매핑하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 유전자 편집 효율을 평가하는 방법이 제공하며, 상기 방법은 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플에 결합하여 결합 생성물을 생성하는 단계를 포함한다. 여기서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제1 표적-특이적 프라이머로 제1 PCR을 수행함으로써 제1 결합 생성물을 증폭하여 제1 PCR 생성물을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 시퀀싱 라이브러리를 형성하기 위해, 시퀀싱 특이적 어댑터 프라이머 및 제1 표적 특이적 프라이머에 상대적으로 중첩된 제2 표적 특이적 프라이머로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 산물을 증폭하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 시퀀싱 라이브러리를 정량화하고 판독하여 시퀀싱 결과를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 시퀀싱 결과를 참조 게놈에 매핑하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 오프-타겟 부위에서의 유전자 편집 효율이 결정되도록 전산적으로 예측된 오프-타겟을 검증하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 예측된 오프-타겟은 소프트웨어(예를 들어, E-CRISP, Cas-OFFinder 및/또는 CRISPRscan)에 기초하여 실리코에서 예측된다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 10이다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 9이다. 일부 실시예에서, E- CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 8이다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 7이다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 6이다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 5이다. 일부 실시예에서, Cas- OFFinder는 부정합이 <= 6이다. 일부 실시예에서, Cas-OFFinder는 부정합이 <= 5이다. 일부 실시예에서, Cas-OFFinder는 부정합이 <= 4이다. 일부 실시예에서, Cas- OFFinder는 부정합이 <= 3이다. 일부 실시예에서, Cas-OFFinder는 부정합이 <= 2이다. 일부 실시예에서, Cas-OFFinder는 벌지가 <= 3이다. 일부 실시예에서, Cas-OFFinder는 벌지가 <= 2이다. 일부 실시예에서, Cas-OFFinder는 벌지가 <= 1이다. 일부 실시예에서, CRISPRscan은 임계값이 없다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가<= 7이고, Cas-OFFinder는 부정합이 <= 4이며 벌지가 <= 2이고, CRISPRscan은 임계값이 없다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 분할 판독 및 불일치 판독을 획득하여 전위를 검출하는 단계; 및/또는 삽입 및 삭제(인델) 빈도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 분할 판독 및 불일치 판독은, 잠재적 후보 전위를 식별하고; 및 온-타겟 스페이서 및 절단 빈도 결정자(CFD)에 대한 프로토스페이서 유사성을 추정함으로써 얻어진다. 일부 실시예에서, 인델 빈도는, GATK-리얼라이너에 의해 매핑된 결과를 정렬하여 정렬된 결과를 형성하고; 정렬된 결과를 해당 스페이서 영역에 걸치지 않도록 필터링하며; 절단 부위의 상류 또는 하류에서 5-bp 주변에서 발생하는 삽입 및 삭제를 예측하고; 및 음성 대조군의 상응하는 값에 의해 제거된 샘플의 인델 값에 의해 신뢰할 수 있는 인델 빈도를 결정하는 것에 의해 얻어진다.
일부 실시예에서, 유전자 편집 뉴클레아제는, CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12, CRISPR 베이스 편집기, CRISPR 프라임 편집기, 트랜스포존 기반 유전자 편집기 및 라이터, 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 메가 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)와 같은 유형을 포함하지만, 다른 유형이 배제되는 것은 아니다.
오프-타겟 식별
다른 양태에서, 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플에 접촉시켜 결합 생성물을 생성하는 단계를 포함한다. 여기서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제1 표적-특이적 프라이머 세트로 제1 PCR을 수행하여 결합 생성물을 증폭하는 단계를 포함하며, 여기서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 온-타겟 및 하나 이상의 예측 및/또는 공지된 오프-타겟의 단일 가닥 핵산 단편 5'을 어닐링하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 시퀀싱 라이브러리를 형성하기 위해 제2 표적 특이적 프라이머 세트 및 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 제2 PCR을 수행하여 제1 PCR 생성물을 증폭하는 단계를 포함한다. 여기서, 제2 표적-특이적 프라이머 세트의 각각은 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 대응하는 프라이머에 중첩된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 오프-타겟을 식별하기 위해 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (b)에서 예측된 오프-타겟은 전산적으로 예측된 오프-타겟이다.
일부 실시예에서, 전산적으로 예측된 오프-타겟은 E-CRISP, Cas- OFFinder 또는 CRISPRscan을 포함하는 소프트웨어에 기초하여 예측된 상부 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10개의 오프-타겟이다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 10이다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 9이다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 8이다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 7이다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 6이다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 5이다. 일부 실시예에서, Cas- OFFinder는 부정합이 <= 6이다. 일부 실시예에서, Cas- OFFinder는 부정합이 <= 5이다. 일부 실시예에서, Cas- OFFinder는 부정합이 <= 4이다. 일부 실시예에서, Cas- OFFinder는 부정합이 <= 3이다. 일부 실시예에서, Cas- OFFinder는 부정합이 <= 2이다. 일부 실시예에서, Cas-OFFinder는 벌지가 <= 3이다. 일부 실시예에서, Cas-OFFinder는 벌지가 <= 2이다. 일부 실시예에서, Cas-OFFinder는 벌지가 <= 1이다. 일부 실시예에서, CRISPRscan은 임계값이 없다. 일부 실시예에서, E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 7이고, Cas-OFFinder는 부정합이 <= 4이며 벌지가 <= 2이고, CRISPRscan은 임계값이 없다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 분할 판독 및 불일치 판독을 획득하여 전위를 검출하는 단계; 또는 삽입 및 삭제(인델) 빈도를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 분할 판독 및 불일치 판독은, 잠재적 후보 전위를 식별하고; 및 온-타겟 스페이서 및 절단 빈도 결정자(CFD)에 대한 프로토스페이서 유사성을 추정함으로써 얻을 수 있다. 일부 실시예에서, 인델 빈도는 GATK-리얼라이너에 의해 매핑된 결과를 정렬하여 정렬된 결과를 형성함으로써 얻어진다. 일부 실시예에서, 인델 빈도는 해당 스페이서 영역에 걸쳐 있지 않은 정렬된 결과를 필터링하고; 절단 부위의 상류 또는 하류 약 5-bp 주변에서 발생하는 삽입 및 삭제를 예측함으로써 얻어진다. 일부 실시예에서, 인델 빈도는 음성 대조군의 상응하는 값에 의해 제거된 샘플의 인델 값에 의해 신뢰할 수 있는 인델 빈도를 결정함으로써 얻어진다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단을 차단하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단을 인산화하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 단일 가닥 핵산 단편에 3'-아데노신 돌출부를 생성하기 위해 핵산을 아데닐화하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된 3' 열성 말단을 포함한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 랜덤 또는 퇴행성 뉴클레오티드의 3개 내지 20개의 염기를 포함하는 5' 돌출 말단을 포함하며, 여기서 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터의 듀플렉스 부분은 듀플렉스 형태로 유지되기에 충분한 길이를 갖는다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 듀플렉스 형태의 일부를 연결하는 헤어핀 루프를 포함한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 개별 원본 분자를 추적하기 위한 고유 분자 인덱스(UMI)로서 3개 내지 20개의 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 시퀀싱 특정 어댑터 쌍이 있는 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 시퀀싱 프라이머 쌍을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 포함하며, 여기서 시퀀싱 프라이머 쌍은 각각 제2 PCR 생성물의 반대 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상호 보완적이다.
핵산 단편
일부 실시예에서, 샘플은 고분자량 DNA(예를 들어, 유전체 DNA)로부터 제조된 복수의 DNA 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 효소 기반 처리에 의해 제조된다. 다른 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 단파장, 고주파 음향 에너지에 노출됨으로써 제조된다. 다른 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 원심 전단에 의해 제조된다. 다른 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 100℃ 내지 105℃에서 DNA를 가열함으로써 제조된다. 다른 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 수력학 전단력에 의해 제조된다. 일부 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 초음파 처리에 노출됨으로써 제조된다. 일부 특정 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 Bioruptor® Pico 또는 Diagenode One에 의해 제조된다. 다른 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 하이드로포어의 형성에 의해 생성된 난류에 의해 제조된다. 일부 특정 실시예에서, 복수의 DNA 단편은 Megaruptor®, Nebulizer® 및/또는 Covaris®에 의해 제조된다. 일부 실시예에서, 복수의 DNA 단편의 준비는 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분석되고 확인된다. 일부 실시예에서, 복수의 DNA 단편의 준비는 단편 분석기(Fragment Analyzer™)에 의해 분석되고 확인된다. 일부 실시예에서, 복수의 DNA 단편의 준비는 LabChip® GX Touch™ 핵산 분석기에 의해 분석되고 확인된다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 50bp 내지 약 5000bp이다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 50bp 내지 약 200bp, 약 50bp 내지 약 300bp, 약 50bp 내지 약 400bp, 약 50bp 내지 약 500bp, 약 50bp 내지 약 600bp, 약 50bp 내지 약 700bp, 약 50bp 내지 약 800bp, 약 50bp 내지 약 900bp, 약 50bp 내지 약 500bp, 약 50bp 내지 약 2000bp, 약 50bp 내지 약 3000bp, 약 50bp 내지 약 4000bp 또는 약 50bp 내지 약 5000bp이다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 100bp 내지 약 200bp, 약 100bp 내지 약 300bp, 약 100bp 내지 약 400bp, 약 100bp 내지 약 500bp, 약 100bp 내지 약 600bp, 약 100bp 내지 약 700bp, 약 100bp 내지 약 800bp, 약 100bp 내지 약 900bp, 약 100bp 내지 약 l000bp, 약 100bp 내지 약 2000bp, 약 100bp 내지 약 3000bp, 약 100bp 내지 약 4000bp 또는 약 100bp 내지 약 5000bp이다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 300bp 내지 약 400bp, 약 300bp 내지 약 500bp, 약 300bp 내지 약 600bp, 약 300bp 내지 약 700bp, 약 300bp 내지 약 800bp, 약 300bp 내지 약 900bp, 약 300bp 내지 약 l000bp, 약 300bp 내지 약 2000bp, 약 300bp 내지 약 3000bp, 약 300bp 내지 약 4000bp 또는 약 300bp 내지 약 5000bp이다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 600bp 내지 약 700bp, 약 600bp 내지 약 800bp, 약 600bp 내지 약 900bp, 약 600bp 내지 약 l000bp, 약 600bp 내지 약 2000bp, 약 600bp 내지 약 3000bp, 약 600bp 내지 약 4000bp 또는 약 600bp 내지 약 5000bp이다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 복수의 DNA 단편은 길이가 약 1000bp 내지 약 2000bp, 약 1000bp 내지 약 3000bp, 약 1000bp 내지 약 4000bp 또는 약 1000bp 내지 약 5000이다.
일부 실시예에서, 복수의 단일 가닥 핵산 단편은 이중 가닥 DNA 단편의 변성으로부터 제조된다. 일부 특정 실시예에서, 이중 -가닥 DNA 단편은 95℃에서 1, 5, 10, 20 또는 30분 동안 가열된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 95℃에서 1, 5, 10, 20 또는 30분 동안 가열된 후, 1분 동안 얼음 위에 놓인다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 유리 비드(Disruptor Beads™; Scientific Industries, Bohemia, NY, USA)로 1, 5, 10, 20 또는 30분 동안 2,500 rpm에서 Disruptor Genie 비드 비터(Scientific Industries)를 사용하여 파괴된 다음, 비드를 침전시키기 위해 3,000 rpm에서 30초 동안 원심분리 한다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 10W에서 30, 60, 90, 120, 150, 200, 250 또는 300초 동안 직접 초음파 처리된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 10 W, 22.4 kHz에서 1, 5, 10, 20 또는 30분 동안 간접 초음파 처리된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 튜브에 배치되고 40 kHz에서 1, 5, 10, 20 또는 30분 동안 초음파 수조의 물에 침지된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 연속적인 피펫팅을 통해 0.01, 0.1 또는 1 mol/L NaOH에서 균질화되고 주변 온도에서 1, 2, 5, 10, 20 또는 30분 동안 배양된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 25% 및 50% 포름아미드 용액에서 피펫으로 부드럽게 균질화되고 실온에서 배양된다. 다른 특정 실시예에서, 이중 가닥 DNA 단편은 25%, 50%, 및 60% DMSO 용액에서 피펫으로 부드럽게 균질화되고 실온에서 배양된다. 일부 실시예에서, 복수의 단일- 가닥 핵산 단편의 제조는 260 nm에서 DNA 단편의 흡광도를 측정함으로써 확인된다.
일부 실시예에서, 단계 (a) 전에, 상기 방법은 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단을 차단하는 단계 (i); 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단을 인산화하는 단계 (ii); 또는 핵산을 아데닐화하여 단일 가닥 핵산 단편에 3'-아데노신 돌출부를 생성하는 단계 (iii) 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥이다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 이중 가닥이다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는, 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된 3' 열성 단부; 및 랜덤 또는 퇴행성 뉴클레오티드의 3~20개의 염기를 포함하는 5' 돌출 말단을 포함한다. 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터의 듀플렉스 부분은 단계 (a)에서 이중 형태로 유지되기에 충분한 길이를 갖는다.
일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 듀플렉스 형태의 일부를 연결하는 헤어핀 루프를 포함한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 Y 모양으로 구성된다.
일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 바코드를 포함한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 개별 원본 분자를 추적하기 위한 고유 분자 인덱스(UMI)로서 3 내지 20개의 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 단편을 포함한다.
일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합된다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단에 결합된다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단 및 3' 말단에 결합된다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 리가제를 통해 결합된다.
본 명세서에 설명된 샘플이 표적 유전자 편집 샘플인 경우, 본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 표적은 미리 결정된다. 일부 실시예에서, 표적은 CRISPR 유전자 편집의 온-타겟 부위를 포함한다. 다른 실시예에서, 표적은 CRISPR 유전자 편집의 하나 이상의 예측된 오프-타겟 부위를 포함한다. 다른 실시예에서, 표적은 CRISPR 유전자 편집의 하나 이상의 예측된 오프-타겟 부위를 포함한다. 다른 실시예에서, 표적은 하나 이상의 자발적인 이중 가닥 중단점을 포함한다. 다른 실시예에서, 표적은 위에서 설명한 부위의 일부 또는 전부의 조합을 포함한다.
계산 예측
본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 전산적으로 예측된다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 E-CRISP에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 Cas-OFFinder에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CRISPRscan에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CRISPRitz에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CRISPOR에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CRISPR CRISPR Design 웹사이트(http://crispr.mit.edu)에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 Ecrisp에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 Crispr2vec에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 Hsu-Zhang 스코어에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CHOPCHOP에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CFD에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CRISTA에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 Elevation에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 DeepCrispr에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 DeepSpCas9에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 CALITAS에 의해 예측된다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 예측된 오프-타겟 부위는 심층 컨볼루션 신경망 또는 심층 피드포워드 신경망이 있는 알고리즘에 의해 예측된다.
일부 실시예에서, 상기 설명된 예측 알고리즘 중 하나 이상에서 설정되는 컷오프는 시드 내부 및/또는 외부에서 부정합이 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 이하이다. 상기 설명된 예측 알고리즘 중 하나 이상에서 설정되는 컷오프는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 내부 및/또는 외부에서 부정합이 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 이하이다. 다른 실시예에서, 상기 설명된 예측 알고리즘 중 하나 이상에서 컷오프는 시드 내부 및/또는 외부에서 벌지(DNA 벌지로서 삽입 또는 RNA 벌지로 삭제)가 각각 4, 3, 2 또는 1 이하로 설정된다. 다른 실시예에서, 상기 설명된 예측 알고리즘 중 하나 이상에서 컷오프는 PAM 내부 및/또는 외부에서 벌지(DNA 벌지로서 삽입 또는 RNA 벌지로 삭제)가 각각 4, 3, 2 또는 1 이하로 설정된다.
본 명세서에 설명된 하나 이상의 선택된 알고리즘에서 적절한 컷오프를 설정한 후, 일부 실시예에서, 약 100개의 예측된 오프-타겟이 제1 표적 특이적 프라이머 세트를 설계하기 위해 선택된다. 다른 실시예에서, 약 상부 90개의 예측된 오프-타겟이 제1 표적-특이적 프라이머 세트를 설계하기 위해 선택된다. 다른 실시예에서, 약 상부 80개의 예측된 오프-타겟이 제1 표적-특이적 프라이머 세트를 설계하기 위해 선택된다. 다른 실시예에서, 약 상부 70개의 예측된 오프-타겟이 제1 표적-특이적 프라이머 세트를 설계하기 위해 선택된다. 다른 실시예에서, 약 상부 60개의 예측된 오프-타겟이 제1 표적-특이적 프라이머 세트를 설계하기 위해 선택된다. 다른 실시예에서, 약 상부 50, 40, 30, 20 또는 10개의 예측된 오프-타겟이 제1 표적-특이적 프라이머 세트를 설계하기 위해 선택된다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 자발적 이중 가닥 중단점은 게놈 취약 부위이다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 자발적 이중 가닥 중단점은 Chr 1: 89231183, Chr 1: 109838221을 포함한다.
본 명세서에 설명된 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 본 명세서에 설명된 표적의 부근에 위치하도록 설계된다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 제1 표적 -특이적 프라이머 세트는 각각은 센스 또는 안티센스 가닥 상에서 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에 있는 DNA 단편에 역방향으로 상호 보완적이다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 약 5bp 내지 약 l000bp에 위치한다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 약 5bp 내지 약 500bp에 위치한다. 일부 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 약 5bp 내지 약 l0bp, 약 l0bp 내지 약 30bp, 약 30bp 내지 약 50bp, 약 50bp 내지 약 70bp, 약 70bp 내지 약 90bp 또는 약 90bp 내지 약 l00bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 약 l00bp 내지 약 120bp, 약 120bp 내지 약 140bp, 약 140bp 내지 약 160bp, 약 160bp 내지 약 180bp, 약 180bp 내지 약 200bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 약 200bp 내지 약 220bp, 약 220bp 내지 약 240bp, 약 240bp 내지 약 260bp, 약 260bp 내지 약 280bp, 약 280bp 내지 약 300bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 약 300bp 내지 약 400bp, 약 400bp 내지 약 500bp, 약 500bp 내지 약 600bp, 약 600bp 내지 약 700bp, 약 700bp 내지 약 800bp, 약 800bp 내지 약 900bp, 약 900bp 내지 약 l00bp에 위치한다. 다른 특정 실시예에서, 본 명세서에 설명된 DNA 단편은 본 명세서에 설명된 표적 중 하나의 하류에서 적어도 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000bp에 위치한다.
제1 표적 특이적 프라이머 세트는 길이가 비교적 균일하다. 일부 실시예에서, 제1 표적 특이적 프라이머 세트는 길이는 약 13-16bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적 특이적 프라이머 세트는 길이는 약 l6-19bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적 특이적 프라이머 세트는 길이는 약 19-22bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적 특이적 프라이머 세트는 길이는 약 22-25bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적 특이적 프라이머 세트는 길이는 약 25-28bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적 특이적 프라이머 세트는 길이는 약 28-31bp이다. 다른 실시예에서, 제1 표적 특이적 프라이머 세트는 길이는 약 31-34bp이다.
제1 표적-특이적 프라이머 세트는 GC 함량이 비교적 균일하며 약 40% 내지 약 60%이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 GC 함량이 비교적 균일하며 약 40%이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 GC 함량이 비교적 균일하며 약 45%이다. 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 GC 함량이 비교적 균일하며 약 50%이다. 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 GC 함량이 비교적 균일하며 약 55%이다. 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 GC 함량이 비교적 균일하며 약 60%이다.
제1 표적-특이적 프라이머 세트는 용융 온도가 비교적 균일하며 약 55℃ 내지 약 80℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 용융 온도가 비교적 균일하며 약 55℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 용융 온도가 비교적 균일하며 약 56℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 용융 온도가 비교적 균일하며 약 57℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 용융 온도가 비교적 균일하며 약 58℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 용융 온도가 비교적 균일하며 약 60℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 용융 온도가 비교적 균일하며 약 65℃이다.일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 용융 온도가 비교적 균일하며 약 70℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 용융 온도가 비교적 균일하며 약 75℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 용융 온도가 비교적 균일하며 약 78℃이다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 용융 온도가 비교적 균일하며 약 80℃이다.
제1 표적-특이적 프라이머 세트의 서열은 이차 구조가 최소화되도록 결정된다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 헤어핀 구조를 형성하지 않는다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 동일한 표적-특이적 프라이머의 두 분자 사이에 이량체를 형성하지 않는다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 상이한 표적-특이적 프라이머 사이에 이량체를 형성하지 않는다.
제1 표적-특이적 프라이머 세트의 3' 말단에 있는 마지막 5개 염기는 너무 많은 G 또는 C 염기를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 3' 말단에 있는 마지막 5개 염기는 G 또는 C 염기를 포함하지 않는다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 3' 말단에 있는 마지막 5개 염기는 하나의 G 또는 C 염기만을 포함한다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 3' 말단에 있는 마지막 5개 염기는 2개의 G 또는/및 C 염기만을 포함한다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 3' 말단에 있는 마지막 5개 염기는 3개의 G 또는/및 C 염기만을 포함한다.
제1 표적-특이적 프라이머 세트의 서열은 하나의 염기 또는 디뉴클레오티드 반복이 제한된 반복을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 서열은 하나의 염기 또는 디뉴클레오티드 반복의 반복을 포함하지 않는다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 서열은 하나의 염기의 하나 이상의 반복을 포함하지만 디뉴클레오티드 반복은 포함하지 않는다. 여기서, 하나의 염기의 하나 이상의 반복은 동일한 염기가 단지 두 번, 단지 세 번 또는 단지 네 번만 나타나는 반복이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 서열은 하나의 염기의 반복이 없고 하나 이상의 디뉴클레오티드 반복을 포함한다. 여기서, 하나 이상의 디뉴클레오티드 반복은 동일한 디뉴클레오티드가 단지 두 번, 단지 세 번 또는 단지 네 번만 나타나는 반복이다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 서열은 하나의 염기 및 하나 이상의 디뉴클레오티드 반복의 하나 이상의 반복을 포함한다. 여기서, 하나의 염기의 하나 이상의 반복은 동일한 염기가 단지 두 번, 단지 세 번 또는 단지 네 번만 나타나는 반복이다. 또한, 여기서 하나 이상의 디뉴클레오티드 반복은 동일한 디뉴클레오티드가 단지 두 번, 단지 세 번 또는 단지 네 번만 나타나는 반복이다.
제1 표적-특이적 프라이머 세트의 서열은, SNP-함유 게놈 데이터베이스를 포함하는 프라이머-블래스트(Primer-BLAST)를 사용하여 추가(비특이적) PCR 앰플리콘을 생성하지 않도록 설계된다. 일부 실시예에서, 상부 비특이적 PCR 앰플리콘은 제1 표적 특이적 프라이머 세트와의 부정합이 적어도 4개이다. 다른 실시예에서, 상부 비특이적 PCR 앰클리콘은 제1 표적-특이적 프라이머 세트와의 부정합이 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개이다.
제1 표적-특이적 프라이머 세트는 이용 가능한 알고리즘에 의해 자동으로 설계될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 NGS- 프라이머플렉스(PrimerPlex)에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 프라이머플렉스(PrimerPlex)에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 MPD에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 MPprimer에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 PRIMEval에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 오픈프라임R(openPrimeR)에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 Visual OMP에 의해 설계된다. 다른 실시예에서, 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 Oli2go에 의해 설계된다.
일부 실시예에서, 제 1 PCR은 제 1 표적-특이적 프라이머 세트를 단일 가닥 핵산 단편에 어닐링하는 단계를 포함한다. 어닐링 온도는 제1 표적-특이적 프라이머 세트 중 가장 낮은 용융 온도에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, 어닐링 온도는 약 55℃이다. 일부 실시예에서, 어닐링 온도는 약 56℃이다. 일부 실시예에서, 어닐링 온도는 약 57℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 58℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 60℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 65℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 70℃이다. 다른 실시예에서, 어닐링 온도는 약 75℃이다. 일부 실시예에서, 어닐링은 약 0.5분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 1분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 1.5분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 2분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 3분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 4분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 5분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 6분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 7분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 8분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 9분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 10분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 11분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 12분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 13분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 14분 동안 지속된다. 다른 실시예에서, 어닐링은 약 15분 동안 지속된다.
일부 실시예에서, 제 1 PCR은 연장 단계를 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 20초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 30초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 40초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 50초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 60초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 70초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 80초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 90초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 100초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 110초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 120초 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 3분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 4분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 5분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 6분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 7분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 8분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 9분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 10분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 11분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 12분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 13분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 14분 동안 지속된다. 일부 특정 실시예에서, 연장은 약 15분 동안 지속된다.
제1 PCR은 샘플 사이에서 표적을 여러 번 검색할 수 있도록 전술한 PCR(어닐링, 연장 및 변성)를 복수 사이클 수행하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 3이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 4이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 5이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 10이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 15이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 20이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 25이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 30이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 35이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 40이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 45이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 50이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 55이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 65이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 70이다. 일부 실시예에서, 사이클 수는 적어도 75이다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 CRISPR-Cas9에 의해 편집된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 CRISPR-Cas12에 의해 편집된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 CRISPR-Cas9 또는 CRISPR-Cas12 이외의 CRISPR-Cas 시스템에 의해 편집된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 CRISPR 베이스 편집기에 의해 편집된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 CRISPR 프라임 편집기에 의해 편집된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 트랜스포존 기반 유전자 편집기에 의해 편집된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)에 의해 편집된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)에 의해 편집된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 메가뉴클레아제에 의해 편집된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 바이러스-벡터 전달의 랜덤 삽입 부위를 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 트랜스포존의 랜덤 삽입 부위를 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 공여체 DNA의 삽입 부위를 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 B형 간염 바이러스 및 인유두종 바이러스와 같은 바이러스의 삽입 부위를 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 공지된 서열에 인접한 서열을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용되는 바와 같이, "포함하는"(또는 "포함하다" 및 "포함하고" 등 임의의 관련 형태), "함유하는"(또는 "함유하다" 또는 "함유하고" 등 임의의 관련 형태), "포괄하는"(또는 "포괄하다" 또는 "포괄하고" 등 임의의 관련 형태) 용어는 다음 요소를 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미한다. "포함하는"(또는 "포함하다" 및 "포함하고" 등 임의의 관련 형태), "함유하는"(또는 "함유하다" 또는 "함유하고" 등 임의의 관련 형태), "포괄하는"(또는 "포괄하다" 또는 "포괄하고" 등 임의의 관련 형태) 용어가 사용되는 모든 실시예에 대해, 본 발명/출원은 또한 "포함하다", "함유하다" 또는 "포괄하다"라는 용어가 "본질적으로 구성하는" 또는 "구성하는"으로 대체되는 대체 실시예를 포함함을 이해해야 한다. "포함하는" 또는 "본질적으로 포함하는"을 사용하는 이러한 대체 실시예는 "포함하는", "함유하는" 또는 "포괄하는" 실시예의 좁은 의미의 실시예로 이해된다.
예를 들어, "~할 것이다", "~하지 않을 것이다", "~하여야 한다", "~해서는 안 된다", "~해야 한다", "~해서는 안 된다", "먼저", "처음에", "다음에", "이후에", "전에", "후에", "마지막으로" 및 "최종적으로"와 같은 절대적 또는 순차적 용어의 사용은 본 명세서에 개시된 실시예의 범위를 제한하려는 것이 아니라 예시적 의미로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 달리 명시되지 않는 한, 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 "포함하다", "포함하는", "갖는", "가진", "와 함께" 또는 이들의 변형된 용어가 사용되는 범위 내에서, 이러한 용어는 "포함하는"이라는 용어와 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 "적어도 하나", "하나 이상" 및 "및/또는"이라는 문구는 접속사 및 분리사로 모두 사용할 수 있는 개방형 표현이다. 예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나", "A, B 또는 C 중 적어도 하나", "A, B 및 C 중 하나 이상", "A, B 또는 C 중 하나 이상" 및 "A, B 및/또는 C"의 각 표현은 단독 A, 단독 B, 단독 C, A 및 B와 함께, A 및 C와 함께, B 및 C와 함께 또는 A, B 및 C와 함께를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "또는"은 "및", "또는" 또는 "및/또는"을 지칭할 수 있으며, 배타적으로 또는 포괄적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, "A 또는 B"라는 용어는 "A 또는 B", "A이지만 B는 아닌", "B이지만 A는 아닌" 및 "A 및 B"를 지칭할 수 있다. 어떤 경우에는, 문맥이 특정 의미를 지시할 수 있다.
본 명세서에 설명된 모든 시스템, 방법, 소프트웨어 및 플랫폼은 모듈화되어 있다. 따라서, "제1" 및 "제2"와 같은 용어는 반드시 우선순위, 중요도 또는 행위의 순서를 의미하는 것은 아니다.
숫자 또는 수치 범위를 지칭할 때 "약"이라는 용어는 언급된 숫자 또는 수치 범위가 실험적 변동성(또는 통계적 실험 오차) 내의 근사치이며, 숫자 또는 수치 범위는 예를 들어, 명시된 숫자 또는 수치 범위의 1%에서 15%까지 다양할 수 있다는 것을 의미한다. 예에서 "약"이라는 용어는 명시된 숫자 또는 값의 ±10%를 의미한다.
"증가된", "증가하는" 또는 "증가하다"라는 용어는 본 명세서에서 일반적으로 통계적으로 유의미한 양의 증가를 의미하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, "증가된" 또는 "증가하다"라는 용어는 기준 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 최대 100% 증가 또는 기준 수준, 표준 또는 대조군과 비교하여 10~100% 사이의 증가를 의미한다. "증가하다"의 다른 예로는, 기준 수준과 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 이상의 증가를 포함한다.
본 명세서에서 "감소된", "감소되는" 또는 "감소되다"라는 용어는 일반적으로 통계적으로 유의미한 양의 감소를 의미하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, "감소된" 또는 "감소되다"는 기준 수준과 비교하여 적어도 10%의 감소, 예를 들어 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 최대 100%의 감소(예를 들어, 기준 수준과 비교하여 없는 수준 또는 검출할 수 없는 수준) 또는 기준 수준과 비교하여 10-100% 사이의 감소를 의미할 수 있다. 마커 또는 증상의 맥락에서 이러한 용어는 해당 수준이 통계적으로 유의미하게 감소하는 것을 의미한다. 예를 들어, 감소는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 이상이 될 수 있으며, 특정 질병이 없는 개인에게 정상적인 범위 내로 인정되는 수준까지 감소하는 것이 바람직하다.
명확성을 위해, "에 의해 특징된" 또는 "을 특징으로 하는"(위에서 설명한 바와 같이 이들의 관련 형태와 함께)은 그 뒤에 따르는 용어 목록이 개방형인지 폐쇄형인지 여부에 대한 성질을 제한하거나 변경하지 않는다. 예를 들어, "A, B, C를 포함하며, D, E 및 F을 특징으로 하는 조성물"에 대한 청구항에서, 요소 D, E 및 F는 여전히 개방형 용어이며, 청구항 앞부분에 "포함하는"이라는 단어의 사용으로 인해 청구항은 다른 요소를 포함하도록 의도된다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 문맥에서 달리 명시되지 않는 한, 단수 형태는 복수 형태도 포함하도록 의도된다. 명세서에서 범위가 언급되는 경우, 범위는 범위 내의 각 개별 지점을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 1-7은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 7을 의미한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 당업계에서 통상적인 허용오차 범위 내에 있고 명시된 값의 ±10%를 넘지 않는 것으로 이해된다. 예를 들어, 약 50은 45에서 55까지의 그 사이에 있는 모든 값을 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 특정 값에 대한 "약"이라는 문구는 특정 값도 포함하며, 예를 들어, 약 50은 50을 포함한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "농축"은 샘플로부터의 모든 분자 중에서 관심 있는 분자 표적의 비율을 증가시키는 것을 의미한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "핵산 단편"은 핵산이 더 짧은 조각으로 단편화되었음을 의미한다. 특정 실시예에서, 핵산은 길이가 약 50bp 내지 l000bp로 정점에 이르는 전형적인 크기로 단편화된다. 특정 실시예에서, 핵산은 약 20 내지 50bp, 51 내지 100bp, 101 내지 300bp, 301 내지 500 및 501 내지 1000bp로 정점에 이르는 전형적인 크기로 단편화된다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "고분자량 DNA"는 더 짧은 조각으로 단편화되지 않은 DNA를 지칭한다. 특정 실시예에서, 고분자량 DNA는 약 300bp 이상일 수 있다. 특정 실시예에서, 고분자량 DNA는 약 500bp 이상일 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "인델"은 유기체의 게놈에서 염기의 삽입 또는 삭제를 의미한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, "오프-타겟 게놈 편집"은 CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12 및 기타 CRISPR-Cas 시스템, CRISPR 염기 편집기, CRISPR 프라임 편집기, 트랜스포존 기반 유전자 편집기 및 라이터, 전사 활성화 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제 및 아연 핑거 핵산(ZFN) 등의 공학적인 뉴클레아제 기술을 사용하여 발생할 수 있는 의도치 않은 유전자 변형을 의미한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "오프-타겟" 또는 "오프-타겟"은 오프-타겟 게놈 편집에 의해 유전적 변형을 받는 주어진 게놈 또는 사용자 정의 서열 집합의 하나 이상의 부위를 지칭한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "온-타겟 게놈 편집"은 CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12 및 기타 CRISPR-Cas 시스템, CRISPR 베이스 편집기, CRISPR 프라임 편집기, 트랜스포존 기반 유전자 편집기 및 라이터, 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제 및 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 등의 공학적인 뉴클레아제 기술을 사용함으로써 발생할 수 있는 의도되거나 예상되는 유전자 변형을 지칭한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "범용 올리고뉴클레오티드 어댑터"는 두 가닥(상부 가닥 및 하부 가닥)으로 구성되고, 제1 결합 가능한 5' 돌출 말단 및 제2 결합 불가능한 말단을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터의 상부 가닥은 5' 듀플렉스 부분을 포함하고, 하부 가닥은 쌍이 없는 5' 부분, 3' 듀플렉스 부분 및 제1 및 제2 시퀀싱 프라이머와 동일한 핵산 서열을 포함한다. 어댑터의 듀플렉스 부분은 실질적으로 상호 보완적일 수 있으며, 듀플렉스 부분은 결합 온도에서 듀플렉스 형태로 유지되기에 충분한 길이를 갖는다. 특정 실시예에서, 상부 가닥과 하부 가닥은 서로 연결되어 헤어핀 루프를 형성한다. "충분하다"라는 용어는 듀플렉스 부분의 염기 수가 충분히 길어 그 사이의 결합이 결합 온도에서 듀플렉스 형태를 유지할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "게놈 편집", 또는 "게놈 공학", 또는 "유전자 편집"은 살아있는 유기체의 게놈에 DNA를 삽입, 삭제, 변형 또는 대체되는 유전공학의 일종이다. 예를 들어, 게놈 편집은 특정 위치에 삽입하는 것을 표적으로 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, "CRISPR(클러스터, 규칙적으로 간격을 두고 짧은 팔린드로믹 반복) 유전자 편집"은 분자 생물학 분야의 유전공학 기술로, 살아있는 유기체의 게놈을 조작된 Cas(클러스터, 규칙적으로 간격을 두고 짧은 팔린드로믹 반복-관련 단백질) 뉴클레아제에 의해 변형될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "GUIDE-Seq(게놈 전체, 시퀀싱에 의해 활성화된 DSB의 편향되지 않은 식별)"은 살아있는 세포에서 CRISPR/Cas 뉴클레아제 및 기타 RNA 유도 뉴클레아제에 의해 야기된 DNA의 오프-타겟 게놈 편집 이벤트를 시험관 및 세포 기반에서 편향되지 않은 검출을 허용하는 분자 생물학 기술이다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "DISCOVER-Seq(현장 Cas 오프-타겟의 발견 및 시퀀싱에 의한 검증)"은 세포 및 조직에서 편향되지 않은 CRISPR-Cas 오프-타겟 식별을 가능하게 하는 분자생물학 기술이다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "EDITED-Seq(시퀀싱에 의한 편집 이벤트 검출)"은 본 발명에 설명된 바와 같이, 오프-타겟의 검출 및/또는 평가를 허용하는 분자생물학 기술이다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "고정 중합효소 연쇄반응" 또는 "고정 PCR"은 적어도 하나의 고정 프라이머를 사용하여 핵산 단편의 적어도 하나의 말단으로부터 연장되는 PCR을 지칭한다. 특정 실시예에서, 고정 PCR은 고정 프라이머를 사용하여 핵산 단편의 단일 단부로부터 연장되는 PCR일 수 있다. 특정 실시예에서, 고정 PCR은 두개의 고정 프라이머를 사용하여 핵산 단편의 양단으로부터 연장되는 PCR일 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머"는 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 서열의 일부에 어닐링할 수 있는 프라이머를 지칭한다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 헤어핀 구조와 같은 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "중첩", "중첩 증폭" 또는 "중첩 PCR"은 예기치 않은 프라이머 결합 부위의 증폭으로 인한 생성물의 비특이적 결합을 감소시키는 중합효소 연쇄 반응을 의미한다. 중첩 PCR은 적어도 두 개의 프라이머 세트로 구성되며, 제2 PCR이 제1 PCR 생성물 내에서 이차 표적을 증폭하는 적어도 두 개의 연속적인 PCR 실행에 사용된다. 이러한 배열은 제1 PCR에서 적은 수의 실행에 대한 증폭을 허용하여 비특이적 생성물을 제한한다. 제2 중첩 프라이머 세트는 제1 PCR에서 의도한 생성물을 증폭할 수 있다. 적어도 하나의 표적 핵산은 제1 프라이머 세트를 사용하여 제1 PCR을 거친다. 그런 다음, 제 1 PCR로부터의 PCR 생성물은 제 2 프라이머 세트와 함께 제 2 PCR에 의해 증폭될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "고유 분자 인덱스"는 핵산을 식별하기 위한 핵산 라이브러리 준비 중에 적어도 하나의 표적 핵산 또는 본 명세서에 설명된 임의의 핵산 단편에 첨가되는 핵산 서열을 지칭한다. 고유 분자 인덱스는 본 명세서에 설명된 PCR의 임의의 라운드(예를 들어, PCR의 제1 라운드, PCR의 제2 라운드 등) 전에 첨가될 수 있고, 증폭에 의해 도입된 오류 및 정량적 편향을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예가 본 명세서에 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시예는 단지 예시로서만 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 본 명세서 내에 제공되는 특정 실시예에 의해 제한되는 것을 의도하는 것은 아니다. 본 발명은 전술한 명세서를 참조하여 설명되었지만, 본 명세서에 기재된 실시예의 설명 및 도면은 제한적인 의미로 해석되어서는 안 된다. 당업자에게는 본 발명을 벗어나지 않는 범위 내에서 수많은 변형, 변경 및 대체가 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명의 모든 양태는 다양한 조건 및 변수에 따라 달라지는 본 명세서에 기재된 특정 실시예, 구성 또는 상대적 비율에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에 설명된 본 발명의 실시예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시함에 있어서 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서 본 발명은 이러한 대체, 수정, 변형 또는 균등물도 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 이러한 청구범위와 이에 대응하는 청구범위 내의 방법 및 구조가 이에 커퍼되는 것을 의도한다.
실시예
본 명세서에 제공되는 실시예는 본 발명의 특정 실시예를 보다 상세하게 설명하는 예이다. 본 명세서에 제공되는 실시예는 단지 예시적인 목적에 불과하며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1 - 예시적인 워크플로우
도 1a는 샘플로부터 표적 핵산을 증폭하기 위한 예시적인 방법(100)의 워크플로우를 나타낸다. 이 예에서, 샘플은 표적 핵산 서열을 포함하는 단일 가닥 핵산 단편(1002)을 포함한다. 예를 들어, 샘플은 포유류(예를 들어, 인간)에서 유래한 것이다. 예를 들어, 인간은 태아이다. 예를 들어, 인간은 질병(예를 들어, 암 또는 유전적 질환)이 있거나 질병이 의심되는 것으로 알려진 개인이다. 예를 들어, 표적 서열 중 하나 이상이 질병(예를 들어, 암)에 대한 하나 이상의 마커를 포함한다. 예를 들어, 샘플은 혈액 샘플에서 유래한다. 예를 들어, 샘플은 혈액 샘플에서 추출된 무세포 핵산이다. 예를 들어, 샘플은 순환 종양 세포에서 추출된 핵산이다. 예를 들어, 샘플 내의 단일 가닥 핵산(1002)은 이중 가닥 DNA 단편의 변성으로부터 제조된 단일 가닥 DNA 단편이다. 예를 들어, 샘플 내의 단일 가닥 핵산(1002)은 RNA 단편의 역전사로부터 제조된 단일 가닥 cDNA 단편이다. 예를 들어, 샘플은 T-세포 및 B-세포 수용체 프로파일링을 위해 혈액 샘플의 림프구에서 추출된 핵산이다. 예를 들어, 샘플은 편집된 CRISPR 유전자 샘플이다. 예를 들어, 샘플은 편집된 메가뉴클레아제, 편집된 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 또는 편집된 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다. 예를 들어, 샘플은 CAR-T, CAR-NK, TCR-T, 불멸화 세포주(예를 들어, 조작된 신경 줄기세포주 CTX) 또는 치료용 조혈 줄기세포에서 추출된 것이다. 예를 들어, 샘플은 유전자 조작 세포(생체 외 또는 생체 내)에서 유래하며, 여기서 세포는 섬유아세포, 연골세포, 각질세포, 간세포, 췌장 섬세포, 줄기세포(예를 들어, 조혈 줄기세포, 중간 엽 줄기세포 또는 피부 줄기세포) 및 면역 세포(예를 들어, 종양 침윤 림프구, 바이러스 재구성 T 세포, 수지상 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 대식세포)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
여전히 도 1a를 참조하면, 120에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터(또는 범용 어댑터)(1202)는 5' 말단에서 단일 가닥 핵산 단편(1002)과 결합하여 결합 생성물(1204)을 형성한다. 이 예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터(1202)는 단일 가닥 핵산 단편(1002)의 5' 말단에 결합되도록 구성된 3' 열성 단부를 갖는 상부 가닥(1202A) 및 랜덤 또는 퇴행성 뉴클레오티드의 복수의 수 염기, 예를 들어 3 내지 20개의 염기를 포함하는 5' 돌출 단부를 갖는 하부 가닥(1202B)을 포함한다. 이 예에서, 랜덤 뉴클레오티드의 염기 수는 4개이다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터(1202)의 상부 가닥(1202A)은 5' 듀플렉스 부분을 포함하고, 하부 가닥(1202B)은 3' 듀플렉스 부분을 포함한다. 어댑터의 듀플렉스 부분은 실질적으로 상호 보완적일 수 있고, 듀플렉스 부분은 결합 온도에서 듀플렉스 형태를 유지하기에 충분한 길이를 갖는다. 일부 실시예에서, 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터(1202)는 개별 원본 분자를 추적하기 위한 고유 분자 인덱스(UMI)로서 듀플렉스 부분 또는 상부 가닥(1202A)의 5' 말단에 통합된 3~20개의 랜덤 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 140에서, 결합 생성물(1204)은 이어서 제1 표적-특이적 프라이머(1402)를 사용한 제1 PCR에 의해 증폭되어 제1 PCR 생성물(1404)을 형성한다. 이 예에서, 제 1 PCR은 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 얻기 위한 결합 생성물의 선형 증폭이다. 예를 들어, 제1 PCR은, 표적 서열 부근의 단일 가닥 핵산 단편(1002)에 제1 표적 특이적 프라이머(1402)를 어닐링하는 단계 (1), DNA 중합효소를 사용하여 제1 표적 특이적 프라이머(1402)를 단일 가닥 핵산 단편(1002) 위에 연장하는 단계 (2), 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 획득하는 단계 (3) 및 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 단일 가닥으로 해리하는 단계 (4)를 포함한다. 예를 들어, 제1 PCR은 하나 이상의 사이클에서 단계 (1)-(4)를 더 반복할 수 있다. 다른 예시적인 실시예에서, 140의 제1 PCR은 제1 표적-특이적 프라이머(1402) 및 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머를 사용하여 표적 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 것이다. 예를 들어, 제1 PCR 생성물은 후속 단계 전에 제1 표적-특이적 프라이머(1402)를 제거하기 위해 선택적으로 세척된다. 160에서, 제1 PCR 생성물(1404)은 제1 표적-특이적 프라이머(1402) 및 시퀀싱 어댑터 역방향 프라이머(1606)(일부 실시예에서 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머라고도 함)에 상대적으로 중첩된 제2 표적-특이적 프라이머(1602)를 사용한 제2 PCR에 의해 증폭된다. 제 2 표적 특이적 프라이머(1602) 및 시퀀싱 어댑터 역 프라이머(1606)는 제 2 PCR 생성물(1608)을 형성하기 위해 제 1 PCR 생성물(1404)의 증폭에 사용된다. 예를 들어, 제 1 PCR은 선형 PCR이다. 예를 들어, 제 1 PCR은 유전자 특이적 프라이머(GSP) PCR이다. 예를 들어, 제 1 PCR 및/또는 제 2 PCR은 멀티플렉싱 PCR이다. 예를 들어, 160은 초기 프라이머 연장 듀플렉스의 중첩 증폭을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다. 선택적으로, 시퀀싱 어댑터 포워드 프라이머(1604)가 제공되어, 제 2 PCR 생성물(1608)을 시퀀싱 라이브러리로 사용할 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱 어댑터 프라이머(1604)는 1604와 동일한 시퀀싱 프라이머를 사용하여 복수의 1602가 브리지 및 시퀀싱될 수 있도록 제공된다. 예를 들어, 시퀀싱 어댑터 포워드 프라이머(1604) 및 시퀀싱 어댑터 리버스 프라이머(1606)는 일루미나 시퀀싱 프라이머이다. 예를 들어, 시퀀싱 어댑터 포워드 프라이머(1604)는 제공되지 않는다. 예를 들어, 시퀀싱 라이브러리는 제2 PCR 생성물(1608)의 반대 가닥에 각각 적어도 부분적으로 상호 보완적인 시퀀싱 프라이머 쌍(도시되지 않음)과 함께 후속 시퀀싱을 위해 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머(1602)는 시퀀싱 어댑터 포워드 프라이머(1604)의 서열을 포함한다.
이제 도 1b를 참조하면, 샘플로부터 표적 핵산을 증폭하기 위한 대체 예시 방법(100')의 워크플로우를 나타낸다. 명확성을 위해, 이 예의 추가 단계 또는 대체 단계 중 하나 이상의 단계를 방법(100)(도 1a)의 해당 단계에 각각 추가하거나 대체할 수 있다. 이 예에서, 핵산의 출발 물질은 표적 DNA 서열을 포함하는 이중 가닥 DNA(101)이다. 예를 들어, 샘플은 게놈 DNA와 같은 고분자량 DNA로부터 제조된 복수의 DNA 단편을 포함한다. 추가 110'에서, 이중 가닥 DNA(101)는 단편화되고 변성되어 단일 가닥 DNA 단편(1002')을 형성한다. 선택적 112'에서, 단일 가닥 DNA 단편(1002')의 3' 말단은 선택적으로 차단되어 3' 말단이 차단된 단일 가닥 DNA 단편(1122')을 형성할 수 있다. 선택적 114'에서, 단일 가닥 DNA 단편(1002' 또는 1122')의 5' 말단은 선택적으로 인산화되어 5' 말단이 인산화된 단일 가닥 DNA 단편(1142')을 형성할 수 있다. 그런 다음, 5' 말단 인산화 단일 가닥 DNA 단편(1142')은 후속 120'(또는 120)을 위해 준비된다. 선택적으로, 전술된 바와 같이, 단일 가닥 핵산 단편은 결합 120' 전에 단일 가닥 핵산 단편에 3'-아데노신 오버행을 생성하기 위해 추가로 아데닐화될 수 있다. 대안 120'에서, 듀플렉스 형태의 일부를 연결하는 헤어핀 루프를 포함하는 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터(1202')(도 1b의 상자에 도시된 바와 같이)는 5' 말단에서 5' 말단 인산화 단일 가닥 DNA 단편(1142')에 결합하여 결합 생성물(1204')을 형성하기 위해 사용된다. 예를 들어, 결합을 위한 단일 가닥 DNA 단편은 단일 가닥 DNA 단편(1002') 또는 3' 말단이 차단된 단일 가닥 DNA 단편(1122')일 수 있다. 대안 140'에서, 결합 생성물(1204')은 이어서 제1 표적 특이적 프라이머(1402') 및 제1 범용 어댑터 특이적 프라이머(1406')를 사용하는 제1 PCR에 의해 증폭되어 제1 PCR 생성물(1404')을 형성한다. 160'에서, 제1 PCR 생성물(1404')은 제2 표적 특이적 프라이머(1602') 및 시퀀싱 어댑터 역 프라이머(1606')(일부 실시예에서 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머라고도 함)를 사용하는 제2 PCR에 의해 증폭되어, 시퀀싱 어댑터 프라이머 서열이 있는 표적 DNA 서열을 포함하는 이중 가닥 DNA 생성물인 시퀀싱 라이브러리(1608')를 형성한다. 제2 표적-특이적 프라이머(1602')는 제1 표적-특이적 프라이머(1402')에 상대적으로 중첩된다. 선택적으로, 시퀀싱 어댑터 포워드 프라이머(1604')가 제공된다. 다른 예시적인 실시예에서, 제2 표적-특이적 프라이머(1602')는 시퀀싱 어댑터 포워드 프라이머(1604')의 서열을 포함한다.
실시예 2. 플라스미드 구성
파링 프로토스페이서 올리고(Paring protospacer oligos)를 어닐링하여 렌티(lenti) CRISPR 벡터(Addgene #42230)의 두 BsmI 절단 부위 사이에 삽입하였다. 렌티 CRISPR 벡터의 토폴로지는 도 6에 도시되어 있다. 각 벡터의 염기서열 진위 여부는 Sanger 시퀀싱을 통해 확인하였다. 파링 프로토스페이서 올리고의 서열은 아래 표 1에 표시되었다.
| 프라이머 명칭/ID | 서열 | 사용법/비고 |
| sgVEGFA4-F | caccgGACCCCCTCCACCCCGCCTC | sgRNA 클로닝 |
| sgVEGFA4-R | aaacGAGGCGGGGTGGAGGGGGTCc | sgRNA 클로닝 |
| sgHBB-F | caccgCTTGCCCCACAGGGCAGTAA | sgRNA 클로닝 |
| sgHBB-R | aaacTTACTGCCCTGTGGGGCAAGc | sgRNA 클로닝 |
| sgPD1-F | caccgGGGCGGTGCTACAACTGGGC | sgRNA 클로닝 |
| sgPD1-R | aaacGCCCAGTTGTAGCACCGCCCc | sgRNA 클로닝 |
| sgTRAC-F | caccgCTTCAAGAGCAACAGTGCTG | sgRNA 클로닝 |
| sgTRAC-R | aaacCAGCACTGTTGCTCTTGAAGc | sgRNA클로닝 |
| sgALB-F | caccgGGTGTAAAATCAACACCCTA | sgRNA클로닝 |
| sgALB-R | aaacTAGGGTGTTGATTTTACACCc | sgRNA클로닝 |
| sgALB-F | caccgGGTGTAAAATCAACACCCTA | sgRNA클로닝 |
| sgALB-R | aaacTAGGGTGTTGATTTTACACCc | sgRNA클로닝 |
| sgGAPDH-F | caccgAGCCCCAGCAAGAGCACAAG | sgRNA클로닝 |
| sgGAPDH-R | aaacCTTGTGCTCTTGCTGGGGCTc | sgRNA클로닝 |
| 일루미나. Y어댑터. 프라이머 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | 일루미나 어댑터 |
| 일루미나.i7.어댑터. 프라이머 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC | 일루미나 어댑터 |
실시예 3. 오프-타겟 예측 및 고정 멀티플렉스 프라이머 설계
잠재적 오프-타겟은 처음에 세 가지 전문 도구인 E-CRISP, Cas-OFFinder 및 CRISPRscan을 기반으로 실리코에서 예측되었다. 다음 컷오프는 각각 E-CRISP의 경우 부정합이 <= 7이고, Cas-OFFinder의 경우 부정합이 <= 4이고 벌지가 <= 2이며, CRISPRsan의 경우 임계값이 없다. 위양성 및 계산 편향(computational bias)을 줄이기 위해 적어도 두 가지 방법으로 발견한 부위를 추가 프라이머 설계에 적용하는 조합적 전략을 사용하였다.
실시예 4. 세포 배양 및 형질전환
K562 세포를 15 mL의 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지를 포함하는 플라스크에 접종하였다(RPMI 1640; Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬), 10%의 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS, Thermo Fisher Scientific)을 보충하고, 37℃에서 5%의 이산화탄소(CO2) 내에서 배양하였다. 20~24시간 동안 배양하여 70~90%의 합류를 얻은 후, 네온 형질전환을 위해 세포를 채취하였다. 네온 형질전환은 제조업체의 지침에 따라 네온 형질전환 플랫폼(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행하였다. 간단히 말해서, 테스트당 2Х106개의 세포를 전해질 버퍼에 5μg의 렌티CRSIPR-sgRNA 플라스미드와 혼합하여 최종 부피를 100μL까지 현탁시켰다. 그런 다음 세포/DNA 혼합물을 전압 = 1600V, 폭 = 10ms, 숫자 = 3의 파라미터로 네온 머신으로 펄싱하였다. 일반적으로 72시간 동안 세포를 계속 배양한 후 DNA와 mRNA를 추출하였다. GUIDE-Seq의 경우, 200 pmol의 어닐링된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드(dsODN)를 원하는 플라스미드와 혼합한 후 위에서 설명한 네온 형질전환 과정과 동일하게 진행하였다.
HEK293 또는 NIH 3T3 세포를 12웰 플레이트에 1.5Х105 세포/웰의 밀도로 접종하고, 둘베코(Dulbecco)의 수정된 이글(Eagle's) 배지(DMEM; Life Technologies)에서 37℃, 5% CO2 내에서 배양한 후, 10%의 FBS, 1%의 페니실린 및 1%의 스트렙토마이신을 보충하였다. 24시간 동안 배양한 후 제조업체의 지침에 따라 리포펙트민3000(Lipofectmin3000, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 형질전환을 실시하였다. 간단히 말해서, 1pg의 렌티CRSIPR-sgRNA 벡터, 2μL의 P3000 및 2.5μL의 리포펙트민3000을 FBS가 없는 DMEM과 부드럽게 혼합하여 최종 100μL의 부피로 교반하고 실온에서 15분간 배양한 후 배지에 첨가하였다. 세포는 DNA 추출을 위해 형질전환 후 72시간 후에 추출하였다. GUIDE-Seq 실험을 위해, 어닐링된 10 pmol의 dsODN을 Lipofectmin3000과 혼합하여 공동 배양한 후 위와 동일한 프로토콜로 진행하였다.
실시예 5. DNA 및 총 RNA 추출
제조업체의 지침에 따라 AllPrep DNA/RNA 키트(QIAGEN, 독일 힐덴)를 사용하여 총 DNA와 RNA를 개별적으로 추출하였다. 간단히 말해서, 세포/조직을 버퍼 RLT Plus(107개 미만의 세포 또는 30mg 조직에 대해 테스트당 350μL)로 용해시켰다. 용해된 혼합물을 AllPrep DNA 컬럼으로 여과한 후 컬럼에 결합된 유전체 DNA를 세척 및 용출하였다. 컬럼에서 흘러나온 용출물은 AllPrep RNA 컬럼을 통해 mRNA 추출하는 RNA 오리진으로 사용하였다. 추출된 DNA/RNA는 해당 DNA/RNA 큐비트 분석(Qubit Assay) 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정량화했으며, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 6. 1차 세포 및 iPSC에서의 게놈 편집
도 4a는 일 예시적인 실시예에 따른, CRISPR- Cas9에 의한 iPSC 편집의 예시적인 방법 410의 워크플로우를 나타낸다. 섬유아세포에 대한 배양을 유지하고, 배양이 iPSC로 구분되도록 하였다. 그런 다음, 제조업체의 지침에 따라 Amaxa 핵융합(미국 뉴저지 주 앨렌데일 소재 론자)을 사용하여 iPSC를 형질전환하였다. 간단히 말해, 먼저 TrypLE을 사용하여 세포를 단일 세포로 해리하였다. 각 형질전환에 대해 5Х106 세포를 미리 예열된 100 μL의 핵융합 시약(82 μL 용액-1 및 18 μL 용액-B)과 혼합한 다음, 10μg DNA(6μg Cas9 + 4μg sgRNA)를 현탁액에 첨가하고 전기 천공하였다. 전기 천공된 iPSC를 비활성화된 MEF 공급기에서 배양하고 4~5일 동안 매일 신선한 배지로 교체한 다음 DNA 분리를 위해 수확하였다. 세포는 형질전환한 후 지정된 날짜에 수확하였다.
도 4b는 일 예시적인 실시예에 따른 CRISPR- Cas9에 의한 T-세포 편집의 예시적인 방법(420)의 워크플로우를 나타낸다. 본 예시적 실시예에서, T-세포는 앞에서 iPSC에 대해 설명한 것과 유사하게 형질전환되었다(도 4a).
실시예 7. 마우스에서의 게놈 편집
도 5a는 일 예시적인 실시예에 따른, 마우스에서 수행된 EDITED-Seq의 예시적인 방법(510)의 워크플로우를 나타낸다. 총 107-108개의 TU AAV8 바이러스(511)를 5-7초 내에 꼬리 정맥을 통해 9-11주령 수컷 C57BL/6 마우스(512)(실험 전 체중 측정)에 주입하였다. 마우스(희생 전 체중 측정)를 15일, 30일 및 60일 후에 심장 천자로 안락사시켰다. EDTA 코팅 모세관 튜브에 혈액을 채취하여 얼음 위에 최대 2시간 동안 보관한 후 4℃에서 20분간 10,000rpm으로 원심분리하여 추출하였다. 간 기관(513)을 해부하여 액체 질소로 급속 냉동한 후 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 그라운드 조직을 버퍼 RLT Plus(20mg 조직당 350μL)로 용해시키고 제조업체의 지침에 따라 AllPrep DNA/RNA 키트(Qiagen)로 추출하였다. DNA와 RNA는 EDITED-Seq, 암플리콘-NGS 및 qRT-PCR을 수행할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 8. EDITED-Seq 파이프라인
게놈 DNA 및 고정된 단일 말단 멀티플렉스 프라이머는 실시예 1에 설명된 바와 같이 실시예 방법 100 또는 100' 에 따라 2 라운드 유전자 특이적 프라이머(GSP) PCR, 하나의 고정된 PCR 및 하나의 중첩 고정된 플러스 인덱싱 PCR을 통해 EDITED-Seq 라이브러리를 생성하기 위한 입력으로 사용되었다. 간단히 설명하면, 표시된 양의 DNA를 300-500bp에서 정점에 이르는 일반적인 크기로 단편화한 다음 단일 가닥 어댑터를 사용하여 이러한 DNA 단편의 3- 말단을 차단하였다. 인덱싱된 단일 가닥 어댑터를 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(T4 PNK; 뉴잉글랜드 바이오랩스, 미국 매사추세츠주 입스위치)로 인산화한 후 5-말단에 결합하여 결합 효율성을 개선한 다음, 모든 잠재적 오프-타겟을 포착하기 위해 1차 선형 GSP PCR을 수행하였다. 제2 라운드 중첩 GSP PCR은 제1 라운드에서 프라이머를 세척한 후 수행하였다. 최종 시퀀싱 라이브러리는 겔 전기영동으로 확인하고 일루미나 시퀀싱 프라이머를 사용하여 정량적 PCR(qPCR)로 정량화한 후, Next-Seq/MiSeq(일루미나, 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 정량화하였다.
실시예 9. 유전자 전위 검출 및 잠재적 오프-타깃 편집
적격 판독은 버로우즈-휠러 정렬 도구(BWA mem)(버전 0.7.17-r1188)를 사용하여 인간 게놈(GRCh38)에 매핑하였다. 전위는 하나의 판독이 다른 유전자좌로 분할되거나(분할 판독), 하나의 고정된 판독의 짝이 새로운 유전자좌에 매핑될 때(불일치 판독) 관찰될 수 있다. 분할/불일치 판독을 식별하기 위해 Breakmer(버전 0.0.7, 매개변수: trl_sr_thresh 1, rearr_sr_thresh 1 및 discread_only_thresh 1)를 사용하여 잠재적인 후보 전위를 프로파일링한 다음, 온-타겟 스페이서와의 프로토스페이서 유사성 및 절단 빈도 결정자(CFD)를 추정하였다. CFD가 0.01 이상인 오프-타겟 후보를 각 해당 유전자좌의 분할/불일치 판독 방향과 음성 대조군에 따라 추가로 필터링하여 잘못된 증폭 및 핫스팟 DSB 부위에 의한 비특이적 융합을 최소화하였다.
인델 빈도 측정을 위해, 매핑된 판독은 GATK-재조정기(버전 3.8.0)에 의해 다시 정렬된 다음, 해당 스페이서 영역에 걸쳐 있지 않은 판독을 필터링하였다. 그런 다음 결과 판독은 사용자 지정 스크립트를 사용하여 절단 부위의 상/하류에서 5-bp 주변에서 발생하는 삽입 및 삭제를 추정하였다. 신뢰할 수 있는 인델 빈도는 음성 대조군의 해당 값에 의한 제거와 함께 처리 샘플의 인델 값으로 결정되었다.
실시예 10. EDITED-Seq 전략
본 예시적인 실시예에서, 시퀀싱(EDITED-Seq)에 의한 편집 이벤트 검출 방법은 실시예 8 및 9에 설명된 절차에 따라 수행하여, 공지된 또는in-silico예측된 오프-타겟 부위를 신규로 검출하고 동시에 검증할 수 있다.
일부 실시예에서, 온-타겟뿐만 아니라 매우 잠재적인 오프-타겟을 시드로 사용함으로써, 새로운 CRISPR-편집된 오프-타겟 부위는 CRISPR 편집에 의해 유도되는 이중 가닥 단절 사이의 융합으로 인해 표적 프라이머를 사용하는 선형 증폭을 통해 광범위하게 연결될 수 있다. 고정된 중합효소 연쇄 반응은 오프-타겟 프로파일링을 시작하기 전에 예비 실험 과정 없이 모든 잠재적인 편집된 오프-타겟을 포착하고 또한 검증하기 위해 구현되었다.
본 예시적인 실시예에서, EDITED-Seq은 실시예 8 및 9에 따라 K562 세포의 VEGFA 2에 대해 수행되었다. 본 예시적인 실시예에서 EDITED-Seq에 사용된 VEGFA 2용 고정 프라이머의 서열은 아래 표 2에 표시되어 있다.
| 제1 PCR 프라이머 명칭 | 서열 | 제2 PCR 프라이머 명칭 | 서열 |
| ABLIM1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCAACTGCCATATGCCCTGGGT | ABLIM1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCCTGGGTCTCTGAAGAAGCT |
| ABLIM1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCGGCGGGTGGGTCACAAA | ABLIM1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCGGGTGGGTCACAAAATAAAATGT |
| ACLY_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCACAGGACAGGGTCAGCGT | ACLY_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACAGGACAGGGTCAGCGTTTAAGA |
| ACLY_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGCCCCTACAATACTATCTTGACCCT | ACLY_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGTTTGCTGGCCCTGGTTTAGA |
| ATL3-NC_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGAGAGACAGGGTCTTGCTGTTG | ATL3-NC_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCAGTACAGTGATGGGACCGT |
| B4GALNT4_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCAACTTGGTGGGGGTAGAGTG | B4GALNT4_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTTAGGGGGCCAGCAGTG |
| CALY_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCACGCAGACGCCCCCAT | CALY_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAGACGCCCCCATCAAGCC |
| CALY_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCCTGGAGTTAAGGGTGTCTCC | CALY_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGAGTTAAGGGTGTCTCCGAGGTG |
| CDC42SE1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCCAGGAGCGTGGATGACTAC | CDC42SE1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCGCGCACCCCTTTCCCA |
| CDC42SE1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCAGGTGAGGCCGTGCAG | CDC42SE1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTGAGGCCGTGCAGTTGGTC |
| CDKN2C-NC_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGAGTTATGTGGTCCCCTCTAGGAA | CDKN2C-NC_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGCCTCTTGAACATGCCGAAATGTA |
| CDKN2C-NC_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCGTCGTCTCCTGGAGCTC | CDKN2C-NC_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCGTCTCCTGGAGCTCTGGACAC |
| Chr4-NC_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGATGGCATCAAAATGTGTGTCCAGT | Chr4-NC_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCACCTGTGGCTGATAGTGACGTCT |
| Chr4-NC_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGAGGTGGCTTCACTTAGGAGGTC | Chr4-NC_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGTCTGGGGAGCGGAGTCC |
| Chr6-NC_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCAAGGCTGACACCAGGTG | Chr6-NC_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCGCCTCCACCCCCAAGG |
| Chr6-NC_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGCTGGGATCTGGGGAGAGAG | Chr6-NC_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGATCTGGGGAGAGAGGTGACC |
| CLYBL_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAATCATCAGGTGCAAGGCAAGACTG | CLYBL_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGTATGTATGCAAAGCCCCGTCACG |
| CLYBL_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCTGACTGGAGTTCCCTTCACCA | CLYBL_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTGGAGTTCCCTTCACCATTTCAA |
| CRB2_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGAGGAGCCTGGACAGACGAAG | CRB2_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGGACAGACGAAGGCAGCA |
| CRB2_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCTGCCAGAAGCCTGTAGAGAT | CRB2_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCTGTAGAGATCAAGGCTGCTC |
| CXXC5_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCTCGGGGGTGATTAGTTGC | CXXC5_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCGGGGGTGATTAGTTGCTTTTTGTT |
| CXXC5_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCCGTGGCCCGACACCTA | CXXC5_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCGACACCTACCGGCTCTCC |
| DOLK-NC_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTAAGAAGGGCCCCTTGATGAGGTC | DOLK-NC_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTCCTGGTGCTGTTCAGCCCATCTT |
| DOLK-NC_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGGAGAGGTGGGTCAACTTTGG | DOLK-NC_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTGGGTCAACTTTGGCAGGGT |
| ELL-NC_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGAGGGTGGGCGTGGCTATGTA | ELL-NC_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTGGGCGTGGCTATGTAAACGGA |
| ELL-NC_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCATGAAGCTGGACTGCACCATCG | ELL-NC_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGGACTGCACCATCGCTCAGG |
| EXD3_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGGGGAGGGGCGAAGGTC | EXD3_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGGGAGTCTCAGGCCCGTGAG |
| EXD3_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCGGGTCCTGCGTCCCTT | EXD3_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCCTGCGTCCCTTCCCCTGA |
| FAM83H_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCGCAGCCTCCAGATGCA | FAM83H_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCACCGGCAGCCACCTGT |
| FAM83H_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTGAGGCTCTTATCAAACAACTGCCA | FAM83H_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAACTGCCACTACTCCCGTCCTCAG |
| FBXO2_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCGAGTCCCGGCGCTGTCC | FBXO2_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGTCCGCGTCTGTGTCGGT |
| FBXO2_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTCCTCGGTCCGCTGAG | FBXO2_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCGGGCCTCGAGCAGAC |
| FMN1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCAATCTCTGACTTGGACAGCTGCA | FMN1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTGGACAGCTGCAGTACTCCCT |
| FMN1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCGATGATGGCCTATGGGTTGAAAA | FMN1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTGCGGTGGAGAAAGGCAAG |
| FSTL4_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGTGCTTCTTCCAAGCTGCGT | FSTL4_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCGTCTCTTTGGACCCGTACTTGC |
| FSTL4_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGTGATTTTCCTGGCTTTAGCGCTA | FSTL4_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTGGCTTTAGCGCTATACGTTTGA |
| HDLBP_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCTACAACCAAGCCCATTTGTCCA | HDLBP_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATTTGTCCAGGAACCCCTAGCC |
| HDLBP_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCCTCTCTACCATTTGTGCTGA | HDLBP_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCATTTGTGCTGATCTGTGGGTATC |
| HMX1-NC_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTGCCAGGGTTGCATGGG | HMX1-NC_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGGGTTGCATGGGAACTTCCTCTG |
| HMX1-NC_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTTGTCCCCACCCTCGTCACTC | HMX1-NC_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCACCCTCGTCACTCTCTGACC |
| IL27RA_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGCAGGGACCCGGCGACA | IL27RA_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGGCGACACTGGGGAATG |
| IL27RA_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGAAGGGAGGCGCTAGGCA | IL27RA_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCGGGCTCCGTGCAAAC |
| INPPL1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCTGGGCCTGCACGCTCA | INPPL1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGCCCCCTGGAGCTGCA |
| INPPL1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGACAGCCACCCTGCTCCAC | INPPL1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCACCCTGCTCCACACACCT |
| IUQB-NC_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTAGCAACGGCCCTGGCA | IUQB-NC_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACGGCCCTGGCACCACCT |
| IUQB-NC_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCTACCCTGCCGCGCTCCT | IUQB-NC_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGCCGCGCTCCTCCTTCC |
| JAKMIP3_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGCACCTCATTGGGGACGT | JAKMIP3_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTCATTGGGGACGTCTGTTGTGAAA |
| JAKMIP3_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGCTCTGAACCGAGGCCTTG | JAKMIP3_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTCCCCAGTTACGGAGACAAATCT |
| KCNQ1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCAGGGCCCCAGAGAGGT | KCNQ1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCCCCAGAGAGGTGAGGTCACTATA |
| KCNQ1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCAGCGACGCCACTCTTTATCT | KCNQ1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTACCCCGTGCCTCAGCT |
| KLHL23_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCGCGCTGACAGCTGTTGC | KLHL23_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAGGTTGTTTATCTGGGCCTCT |
| KLHL23_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGAGTTTCATGCTCAGTCCCTGCA | KLHL23_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAGGACACAGCACAGGTAAGGGA |
| LAMA3_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGGGCTCTGGGGTGACTCC | LAMA3_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGGGGTGACTCCAAGGCTTTTCG |
| LAMA3_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTCCCTACTCAACCCCGAGCCCTCCT | LAMA3_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCCGAGCCCTCCTCTCTTG |
| LINC00415_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCGCCAGACCAGCTCCGA | LINC00415_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCTCCGACTCCGCTCGCT |
| LINC00415_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTCCTTGCCCGGGGTAGG | LINC00415_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTGCCCGGGGTAGGAAAGTGA |
| LINC01258_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTTCTCATCCTTGTATCAGCTGCCTT | LINC01258_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTATCAGCTGCCTTCTCATCACAAGA |
| LINC01258_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGGAGAGTGCCATTCTCAGCCTAA | LINC01258_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGCCATTCTCAGCCTAAAAGGTAGA |
| LUC7L2_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGTGGATCACGCAGTCGGA | LUC7L2_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACGCAGTCGGAGGCCATCC |
| MIR3681-NC_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCATGAGCACACCCACCACCA | MIR3681-NC_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCACACCCACCACCACTCCTA |
| MIR3681-NC_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCCTTGTCCCACATCACAGCA | MIR3681-NC_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTGTCCCACATCACAGCAAACTCT |
| MIR4647-NC_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCGCCTGGGACTACTTCTCGTTTGAAA | MIR4647-NC_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGGGCTGCGGAAGGATCC |
| MIR4647-NC_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCCCAACGTGGCCTCAG | MIR4647-NC_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAACGTGGCCTCAGCTGCTC |
| MOB3B_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCACAGCTGTCCAAACGAGGCT | MOB3B_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACGAGGCTGGCTCCCCACT |
| MOB3B_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGATGCAACTGAGGGCTCCTTA | MOB3B_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCCTTAGAAAGTCATGCCCCAGGAG |
| MSI2_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGAAGGTCGCTGGGAAGCC | MSI2_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGCTGGGAGGGGATTGGC |
| MSI2_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGCCCAGCCTCCCTGCAG | MSI2_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCTCCCTGCAGGATGATTGGC |
| MTMR1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCTCCTCTGTGTGACATGCC | MTMR1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATGCCACAGATGACTATTGCACACCT |
| MTMR1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACCAACCAGCTAACACTGCTATGCA | MTMR1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCTCAGGGGCCGCTGCA |
| NC-Chr12_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACTCAGGTGTGCTGGCACTGAT | NC-Chr12_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTGGCACTGATCTGTGGTCCCA |
| NC-Chr12_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACATACAACCAGTTCACCCAGTTAC | NC-Chr12_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAACCAGTTCACCCAGTTACAGTAGAC |
| NFIX_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGTGTGTGTTTGCTGTTACCGCTTA | NFIX_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCGCTTAAATTAACCCTGAGTGACG |
| NFIX_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTGGAGCGAAGGCCTGGAG | NFIX_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTAGCGTGCGGCCCGAGCT |
| NoName1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTACTGATGGGGGTGAGCTCCA | NoName1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGTGAGCTCCAACTCTG |
| NoName1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGTGTCTCTGCTTTCTGTTGGCA | NoName1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATGTATCTGGCATTACAGCTGAGCAG |
| NoName10_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCTTCAAGCAGCCCACCTTCTG | NoName10_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGCCACTGCACCGACTTCA |
| NoName10_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACTCCCGCCGGTTCCAAG | NoName10_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGTTCCAAGTTATCGGAGTGAGCCA |
| NoName11_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCAAAGCACAGGTGGGGACT | NoName11_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTCATAGCCTGGGGGTAAATGTT |
| NoName11_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCAGCTGCTTGGGCTCCGTTG | NoName11_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCTTGGGCTCCGTTGCAATCC |
| NoName12_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCCAGGCCACAGGAAACC | NoName12_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAACCAGGGGAGAGGGCCATAGAG |
| NoName12_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCTAGGGTGGCTGTGACTCAG | NoName12_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTGTGACTCAGAGCCATGGC |
| NoName13_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTCTGGCTTCCCATGGGTGAG | NoName13_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTTCCCATGGGTGAGTCCTGT |
| NoName13_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTCCCTGAGAAGAGCTGAACATAGC | NoName13_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAAGAGCTGAACATAGCCAGGCAATT |
| NoName14_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCAACCCTTCCCATGACTGAGGTG | NoName14_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGACTGAGGTGGATGAACCCCTAAGC |
| NoName14_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCAACCCCCTGCAGCTG | NoName14_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAACCCCCTGCAGCTGCTCACAA |
| NoName15_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCAAAATCCCAAGGGCATTGTTC | NoName15_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAATCCCAAGGGCATTGTTCACATAA |
| NoName15_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCATTGTGTCTTCTTGGTACCCTTTTT | NoName15_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCCTTTTTGAAAATTAGTTGCCCAT |
| NoName16_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGATCACACGAGGCAGAGGGAA | NoName16_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAGGCAGAGGGAACTACAGGTGCA |
| NoName16_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCAATCTCACCTCCTCCCTCTC | NoName16_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTCCCTCTCCTACCAACTTCATCC |
| NoName2_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCCAAACACAGAAAGGCC | NoName2_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAAACACAGAAAGGCCATTTATTGT |
| NoName2_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGTGAGCCATGATCGTGCACTC | NoName2_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCATGATCGTGCACTCTAGCCT |
| NoName3_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACTACATTGGAGGAGTGTGTACC | NoName3_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGAGTGTGTACCATTTAAGGATGTG |
| NoName4_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTCTGCTTTCCCCTCCCACCT | NoName4_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCACCTGGCCCTGCAAGA |
| NoName4_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTGCCCTGTTGGATAACCCTTCT | NoName4_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTCTGCCCCTGGACAGATTCTATAG |
| NoName5_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTTGGAAAGGGATGCTCTGAATACCT | NoName5_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGCCCTGCTGCACTATGATCAA |
| NoName5_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCTGCACTTTCTCCCGGACAA | NoName5_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGCCAGCTTCATGACCTGAAACC |
| NoName6_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGTTGTTAAGGCTGTTGGCATCTGT | NoName6_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCACCTGGCTGCACCAC |
| NoName6_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGGAAAACACGGTTGCATCCTGA | NoName6_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCCTGAATGCTCGTTGAGTGGATG |
| NoName7_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCACCAGCTCTTCGGCCAAG | NoName7_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCCAAGCCCATGTAGTACTGCAG |
| NoName7_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCCGTGTGTTTGACTCCCTCAAC | NoName7_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCTCAACTACTTGCCCAACATGC |
| NoName8_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGCGGTGTCAGCAAAGCTAGG | NoName8_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGTGTCAGCAAAGCTAGGTAAGGAG |
| NoName8_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCACCGATGAGGCATGGG | NoName8_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGATGAGGCATGGGTTATGAAGTA |
| NoName9_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGTGCTGCCTCCCCCTCTGGTA | NoName9_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCCTCTGGTATGCCCCCTCAT |
| NoName9_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGAGTGACTGGATGCTGGGTT | NoName9_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGACTGGATGCTGGGTTGTGGAAA |
| nr-HERPUD1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGAGAGGGGCCTGGAAGATTCTC | nr-HERPUD1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTCTCCCCCGAGGCCTCAGAA |
| nr-HERPUD1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGGTAGACTTGACATAAGCACCA | nr-HERPUD1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTTGACATAAGCACCATACTTCGG |
| PAPD7_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAAGAAAAGGGGCTGCTGGGT | PAPD7_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGCTGCTGGGTAGGACCTG |
| PAPD7_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGACGTGATTCGAGTTCCTGGCA | PAPD7_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGTGATTCGAGTTCCTGGCAATGCTA |
| PAX6_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGGTCTGGGGTCCTGAAATGAC | PAX6_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTCCTGAAATGACCCCCAAGG |
| PAX6_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCACTAGATCCTGTCACAATTCCC | PAX6_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGCAGCCTATTGTCTCCTGGT |
| PLPPR1-NC_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGTGCTCCCGCTCCCATGAG | PLPPR1-NC_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCACGCCGTGGCCGAACA |
| PLPPR1-NC_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGCACAAGAACCTGCTGTCTAAACTT | PLPPR1-NC_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAACTTCCATACCAGCAGCAGTTCC |
| PRR19_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACGACGGCCGCACAGTGG | PRR19_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGCTCGGGCCGCTGACT |
| PRR19_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCGCCCACTCTCGACTCTT | PRR19_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGCCCACTCTCGACTCTTCAGGTAG |
| SAMD11_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCAGGACTCCCCAGGTGCT | SAMD11_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTCCCCAGGTGCTGAAGAGACG |
| SAMD11_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTCTAGCCCGAAAAGCCAAGCT | SAMD11_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAGGGGGTCCGAGTGCA |
| SBF1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTCTGCCAGATGCTGCTCGT | SBF1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCTGCTCGTTGCCTGGCA |
| SBF1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCTGTTGCAGGTCCAGAGGACAC | SBF1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACTTGAGGTGGACGTCAGTTTCTGG |
| SLC22A1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGAAGACGTGGGTTCTGGCAGA | SLC22A1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGGGTTCTGGCAGAAGTTCCTATGT |
| SLC22A1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCCCGTCCCCTCTGCCA | SLC22A1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCCTCTGCCACCCCCAT |
| SPNS3_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGCCTGTGTCCGGAGCTGT | SPNS3_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGTGTCCGGAGCTGTTTCTGC |
| SPNS3_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTACCGGGGCAAGACAGC | SPNS3_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGGCTGGAAAGGCAACCC |
| SRPK2_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGGTGACAACTACCACTCTAGAATTT | SRPK2_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCACTCTAGAATTTGGCAAGATGT |
| TBATA_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGTCCTAAAACCCCTGCTTGGATTT | TBATA_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTTCTCCACCTAGGTGTGCTCTCTC |
| TBATA_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGCGGAACACAGGAGCTAGTCT | TBATA_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAACACAGGAGCTAGTCTGGGAAGA |
| TRIM42_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCAGTAGCTCCCCAACGTTACTGT | TRIM42_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGTTACTGTGCATTGAAGTCACCTGA |
| TRIM42_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTGTCTCCCAAAATCAGGCCTGT | TRIM42_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCTGTTCTTGCACCTGGATTCTTAC |
| TSKU_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTTTGTGCGCCCTGCCCTT | TSKU_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCGCCCTGCCCTTCGGATAA |
| TSKU_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGGGAGGAGGGTGTTTACGG | TSKU_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACGGTTATCTTTGCGACTTAGGCTCA |
| UTP14A_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGGCAGTGCAGGCGTTATAAACT | UTP14A_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCGTTATAAACTCCCCGAATCTTGGA |
| UTP14A_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCACTTTCCCTGGGGCTTGCTTA | UTP14A_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCCTGGGGCTTGCTTAGTAAAGTAG |
| UTP4_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGAAGGGGCGTGGGAAGCG | UTP4_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGTGGCCGGCCCAGGGT |
| UTP4_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCGCAGACAGAGCAAGCGCGTT | UTP4_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCGGGCCGGGGCGTCTGA |
| VEGFA_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCCCCAGCTACCACCTCCTC | VEGFA_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGCGGCGGACAGTGGAC |
| VEGFA_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCGCGGACCACGGCTCCTC | VEGFA_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGAAGCGAGAACAGCCCAGAAGTT |
이제 도 2a 및 도 2b를 참조하면, 차트 210 및 210'는 각각 CRISPR-Cas9에 의해 편집된 VEGFA 2 로커스에서 EDITED-Seq을 사용하여 오프-타겟 식별 및 검증을 나타낸다. 차트 210 및 210'에 표시된 바와 같이, 분할 융합 검출에 의해 밝혀진 바와 같이, in silico예측 오프-타겟에 의해 포착된 오프-타겟의 일부 (94 개 중 64 개)가 있었다. 또한, 융합 이벤트가 발견된 부위의 대다수(92%)에서도 EDITED-Seq에 의해 검출된 인델이 있었기 때문에 검증되었다.
이제 도 2c를 참조하면, 다이어그램 220은 도 2a 및 도 2b의 동일한 실시예에 따른 EDITED-Seq 스코어(Escore)와 인델 빈도(%) 사이의 상관관계를 나타낸다. EDITED-Seq 스코어(Escore)는 동일한 시퀀싱 데이터에서 동시에 추정된 인델 빈도와 강한 상관관계를 나타냈다. 도 2e는 염색체 좌표 내에서 VEGFA 2의 전위 서커스 플롯 370을 나타내며, 약 48 %의 부위가 하나 이상의 융합 파트너와 연결되었음을 나타낸다. 이제 도 2를 참조하면, 도 2a 및 도 2b의 동일한 실시예에 따라, 다이어그램 230은 VEGFA 2 로커스에서 입력 유전체 DNA의 검출 적정법을 나타낸다. EDITED-Seq은 오프-타겟 수와 총 전위 파트너를 검출하는 포화 상태에 도달하기 위해 약 30,000~70,000개의 총 입력 세포가 필요하다. 이러한 결과는 EDITED-Seq이 인간 게놈에서 Cas 유도 DSB 간의 전위를 포착하여 현장에서 편집된 후 오프-타겟을 쉽고 민감하게 검출할 수 있음을 나타낸다.
실시예 11. EDITED-Seq과 DISCOVER-Seq 및 GUIDE-Seq의 비교
이제 도 3a를 참조하면, 본 예시적인 실시예에서 EDITED-Seq의 성능과 DISCOVER- Seq 및 GUIDE-Seq의 성능을 비교하였다. 벤 다이어그램(310)에 도시된 바와 같이, VEFGA 2 로커스에서 오프-타겟을 검출할 때 세 가지 방법(EDITED-Seq, GUIDE-Seq 및 DISCOVER-Seq)을 비교한 벤 다이어그램(310)이 도시되어 있다. 그 결과 EDITED-Seq, DISCOVER-Seq, GUIDE-Seq을 통해 각각 94개, 90개, 57개의 오프-타겟이 VEFGA 2 로커스에서 검출되어 EDITED-Seq이 더 많은 오프-타겟을 식별할 수 있음을 나타낸다. EDITED-Seq에 의해 확인된 GUIDE-Seq 또는 DISCOVER-Seq의 부위는 약 45.6%와 61.4%였다(도 3a). 반면, EDITED-Seq의 절반 이상(약 56.4%)의 사이트가 GUIDE-Seq 또는 DISCOVER-Seq에서 확인되지 않은 것으로 나타나, EDITED-Seq은 놀랍게도 한 번도 확인되지 않은 대부분의 고유한 오프-타겟을 식별할 수 있음을 알 수 있다. 따라서 EDITED-Seq은 가장 많은 고유한 오프-타겟을 보여 주었으며, 여기서 92.3%가 NGS 앰플리콘으로 확인되었다. EDITED-Seq에 의해 확인되지 않은 오프-타겟은 검출될 가능성이 거의 없거나 인델 빈도가 0.001% 미만인 것이었다(도 2a 및 도 2b).
이제 도 3b를 참조하면, 다이어그램 320은 도 3a의 동일한 예시적 실시예에 따른, EDITED-Seq, GUIDE-Seq 및 DISCOVER-Seq의 해당 스코어 값(예를 들어, 에스코어(Escore))에 기초하여 일반적으로 식별된 35개 부위의 순위 비교를 나타내었다. 여러 방법에서 일관된 순위를 보이는 최고 스코어를 받은 여러 사이트 외에, 대부분의 EDITED-Seq은 각각 DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq의 데이터 세트에서 동일한 수준에 있지 않았다.
이제 도 3c를 참조하면, 다이아그램 330은 도 3a의 동일한 예시적 실시예에 따른, GUIDE-Seq 및 DISCOVER-Seq에 비해, EDITED-Seq의 확인된(즉, 참) 및 누락된(즉, 거짓) 오프-타겟의 파라널 분포를 나타낸다. 앰플리콘 NGS로 발견한 인델이 있는 부위 중 전위에서 검출되지 않은 부위는 거의 없었다. EDITED- Seq은 앰플리콘 NGS(위음성)에 의해 검증된 실제 부위 수를 가장 적게 놓쳤다. GUIDE-Seq이 발견한 일부 높은 순위의 부위에서는 전위가 거의 발견되지 않았다. 이는 프로토스페이서 서열 컨텍스트가 두 DSB 말단 사이의 재조합을 촉발할 수 있다고 추정된다. 그 결과, 실제 오프-타겟에 대한 EDITED-Seq의 거짓 오프-타겟의 상대적 비율은 DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq의 동일한 비율보다 현저히 낮은 것으로 나타났다. EDITED-Seq은 거짓 오프-타겟의 비율이 현저히 낮기 때문에, DISCOVER-Seq 및 GUIDE-Seq에 비해 더 정확한 방법이다.
또한, DISCOVER-seq 및 GUIDE-seq에서 놓쳤지만 EDITED-seq에서 확인된 표적은 딥 앰플리콘 시퀀싱을 통해 확인되었다. 통합 게놈 뷰어의 6개의 예시적인 뷰어(Integrated Genome Viewer)는 낮은 수준의 삽입 및 삭제(도 3e 내지 도 3h 참조) 또는 전위(도 3i 참조)를 나타낸다.
또한, 전위에 대한 상세한 분석이 수행되었다. VEGFA 2 로커스를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9의 온-타겟 부위에 대해 단 하나의 프라이머 세트만을 사용하여 8개의 오프-타겟 부위를 확인하였다(도 3j 참조). 간단히 설명하면, 도 3j에서 붉은색으로 표시되고 6번 염색체에 위치한 온-타겟 부위 VEGFA 2는 8개의 오프-타겟 부위와 전위를 형성하는 것으로 나타났다.
또한, 인실리코 예측 오프-타겟 부위에서 파생된 프라이머의 수를 증가하는 것을 이용하여 온-타겟과 오프-타겟 사이, 오프-타겟과 오프-타겟 사이 전위를 통해 점점 더 많은 수의 새로운 오프-타겟 부위를 검출하였다. 구체적으로, VEGFA2를 표적으로 하고 EDITED-seq을 사용했을 때 게놈 전체 오프-타겟 부위에 대한 포괄적인 식별을 도 3k 내지 도 3ad에 나타내었다. 데이터 분석에서 1~20개의 오프-타겟 부위(실리콘 내 예측에서)에 대한 숫자를 증가시켰을 때, 식별된 총 표적 부위의 수는 각각 23, 36, 43, 52, 54, 58, 61, 66, 68, 79, 81, 91, 93, 101, 107, 110, 113, 119, 122, 125 및 132개 로 나타났다.
실시예 12. EDITED-Seq을 사용한 iPSC 및 일차 세포에서의 오프-타겟 프로파일링
EDITED-Seq이 다양한 종류의 세포에서 다용도로 작용할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 기능적으로 중요한 4개의 유전자 좌위, 즉 GAPDH, HBB, PD1 및 TRAC에 대해 각각 iPSC(실시예 6에 따라) 및 일차 세포(실시예 7에 따라)에서 유전자 편집을 수행하였다. 본 예시적인 실시예에서 EDITED-Seq에 사용되는 GAPDH, HBB, PD1 및 TRAC에 대한 고정 프라이머의 서열은 아래 표 3-6에 각각 표시되었다.
| 제1 PCR 프라이머 명칭 | 서열 | 제2 PCR 프라이머 명칭 | 서열 |
| NoName1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTTGGCATGACCCAGGTCCATAC | NoName1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTCCATACCAGGGCTGACC |
| NoName1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAAGAGTCTGGGTGAATCAGCAGTC | NoName1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTCAGGCAGGCGAGGAACA |
| NoName10_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGGGGCCAGCAGCAAGGT | NoName10_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGTGAAGAATTTCATGCTGGCACAT |
| NoName11_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGAGTCAGGAGGCAGAGATCCTC | NoName11_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAAGACCCAGCGACCGACTCC |
| NoName12_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAAATCCCGTTGGCCCTCCTG | NoName12_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCCTGCTCAGCTGGCTCATGTC |
| NoName12_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGGGCGTTGTGGGTCTGA | NoName12_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTAAAGATCCTCCGGCCACCATGTG |
| NoName13_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTAGGCCCCTCCCCTCT | NoName13_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCCCTCCCCTCTTCAAGG |
| NoName13_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCAGGTGGTCTCCTCCGACT | NoName13_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCAACAGCAACACCCACTCTTCC |
| NoName14_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGGGGAGATGCTCAGTGTGGT | NoName14_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGTGGTGGGGGCTGAGC |
| NoName14_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGAGCACAAGGTCGTCTCCTCT | NoName14_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCTGACTTTGACAGTGACACCCATT |
| NoName15_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGGCAGATGAATAAGGCTCACTCCT | NoName15_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTCACTCCTTCTCTTGTAGGTACT |
| NoName15_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCCCTACAGAGATAAACAGACGCACA | NoName15_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAGAGAGAGTAAGGTCAGGCATGTGG |
| NoName16_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCAGTTCTTTGGGTCCTCATCACAGT | NoName16_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCATCACAGTTAATGTTGCAGCGGAA |
| NoName16_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCAACATACAGATGGGGTGGGA | NoName16_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTGGAGCTGTGGGGGCAA |
| NoName17_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGATGCTTAGCTTCCGTTGGGTT | NoName17_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTTAGCTTCCGTTGGGTTGATGAGG |
| NoName17_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTGGGCACGGTGGACAGC | NoName17_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACGGTGGACAGCAGTGCA |
| NoName18_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTCTTCAAGTGGTCTGCATGGAA | NoName18_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCATGGAAACTGTGAGGAGGGGAGT |
| NoName18_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGTGGTCTCCTCCGATTTCAACA | NoName18_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTGACACCCCCTCCTCCA |
| NoName19_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTTGCGGGGAGGGGAGATTCT | NoName19_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGGAACTGGACACGTCAGGGA |
| NoName19_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCTACCTCACCGCCAATGTTT | NoName19_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTTTGGTGGGCGTATAAGCAGTTT |
| NoName2_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGAGGAGGGGAGAGTCTCAGTGTT | NoName2_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGGGAGAGTCTCAGTGTTGTGGAG |
| NoName2_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACTTTAACAGCATCACCCACTCTTCC | NoName2_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTACAGCAACAGGGTAGTAGACC |
| NoName20_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTTTCCTGTATTGCTTTTGCCTTGAGC | NoName20_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCCTTGAGCTTCTTACCCCAGTGAG |
| NoName20_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGAGCCTGGACCACTAAGTCAC | NoName20_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTCCAACCAAGGTACCTGTATTGGAC |
| NoName21_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCGTGGAGGTGAGCTCATGTAG | NoName21_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCTGCTCACTGGAGAAGTTTTCCG |
| NoName21_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGGCGCTCAGTAGGTGTGC | NoName21_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCGCTCAGTAGGTGTGCAAGCAG |
| NoName22_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTGTGGGCCATCTTCAAGTTCAGTCC | NoName22_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTCATTTCTGGACCTAGGCTGATGG |
| NoName22_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAAAAACCTCCACCCTTATGAAGCCT | NoName22_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCACCCTTATGAAGCCTCCTTCTAG |
| NoName23_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCTCTGCTGTGTGCTGTCCAC | NoName23_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCCACTCACAGGGGTAGAACATGTT |
| NoName23_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCCCCTCCCTCTCCAGGA | NoName23_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGTGGGGGACTGAGTGTGAC |
| NoName24_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGATGCTGGGGCTGGCACT | NoName24_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAACAGGGTGGTGGAACTCATGT |
| NoName24_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACTGTGTCCAGGGGAGATTCTCA | NoName24_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGTGTGGTAAGGGACTGAGTGCGT |
| NoName25_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACTTACGCTTAGGTGTGATTTGCGAA | NoName25_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACACATTGCTGCCATGATCTGTCGTA |
| NoName26_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCAGGCAAGGCTGAATGGAAGCG | NoName26_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTGAATGGAAGCGAGTGAAGTGAGC |
| NoName26_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTGGGGAAGGGCCATTCA | NoName26_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGCCATTCACCCTTGATATCATCA |
| NoName27_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGAGACGGTGCAGGAGCTC | NoName27_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGAGCAGCGGGGAGGCT |
| NoName27_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGGACCCTCCTCACGGGATAC | NoName27_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCCAGCTTTCAGCCAGACC |
| NoName28_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGTGTGGTGGGGGACTGAGC | NoName28_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGGGGGACTGAGCATGGCA |
| NoName28_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGATGCTGGGGCTGCCATTG | NoName28_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTGCCATTGCCCTCAGT |
| NoName29_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTCCTCACCACCCCCAAGG | NoName29_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTGGGGGCACAGTCCTG |
| NoName29_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGCCAAAGTCCGCCCCAAG | NoName29_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAAAGTCCGCCCCAAGGTCAAAA |
| NoName3_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGAGGCCCCAGGAACTTTCA | NoName3_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGAGGAGAACGAGGCATGTCTTAC |
| NoName3_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTCGGGAGGTGGGTAGTGT | NoName3_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCGGGAGGTGGGTAGTGTATGGTT |
| NoName30_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGACCAGCTTGTTGAGGACCCTA | NoName30_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAGCTTGTTGAGGACCCTAAAGGCT |
| NoName30_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGAGCCTCATCAGTTGACCCCAA | NoName30_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTGACCCCAATGTCCTGCATGTACTA |
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| NoName31_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCTTTGCTGGGGTAACAGGACAC | NoName31_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGTAACAGGACACATTGGCTGGGA |
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| NoName34_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTGGAGGGTGTATGCGTGCT | NoName34_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGGTGTATGCGTGCTCTCTGA |
| NoName35_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTGGGGTTGGCGTCACCT | NoName35_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCGTCACCTTGAACGACCACTTTGT |
| NoName35_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCATTCTTCAGGGGGTCTGGCATGA | NoName35_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGGGGTCTGGCATGAAAATGTGTTA |
| NoName36_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCACCCATATGCACACCCACATATACC | NoName36_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACACCCACATATACCTGCCAAAAGA |
| NoName37_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGAAAACGCCCTACTGCCCTAGAT | NoName37_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACGCCCTACTGCCCTAGATTCTAATT |
| NoName37_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGTCCGCCCCCTTATCATCCTCTCTG | NoName37_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGGGGCTCTGGGGCTACT |
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| NoName38_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGGCTTCCCAACCTGAGGTTTTG | NoName38_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATCCCCTCTTCCCCAAGCCT |
| NoName39_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGACACAGGAGAACCCACTGAACGC | NoName39_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAACCCACTGAACGCTTCCACTTCCA |
| NoName39_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCTCCACAGTACAATGAGGCCATG | NoName39_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTACAATGAGGCCATGCAGTTTCTT |
| NoName4_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCGTGCACAGGGGACAGAAGC | NoName4_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACAGGGGACAGAAGCCATGGG |
| NoName4_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCAGGAGCTACGCCTCTG | NoName4_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTACGCCTCTGCCCCATACACG |
| NoName40_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGCTGGCATTGCTCTCAACGA | NoName40_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGCATTGCTCTCAACGACCACTT |
| NoName40_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCATGACGAGGTCAGGCTCCCTAGGC | NoName40_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCTAGGCCCCTCCGTCTTCAG |
| NoName41_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGTGGTGGACTTCGCAGACCA | NoName41_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTTCGCAGACCACATGGC |
| NoName5_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCCCAGCTTAAAACATGAGCCATTCA | NoName5_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCTCGGCTGGCCTTTACTTG |
| NoName5_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGGAGACAATGGAGATCTACCTCAGT | NoName5_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCAAAGTGAGACTAATCTAGCTGCT |
| NoName6_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCACTGGCGTCTTCAGCA | NoName6_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTTCAGCACTACGGAGAAGACTGG |
| NoName6_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCCAAGGGTGCCAAACGTTGATA | NoName6_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGCCAAACGTTGATAGTGCAGGA |
| NoName7_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCAGCGTTTCAGGAAGGGAGAGG | NoName7_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCCCTGTGCTACTGGAAGGC |
| NoName7_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGTGCCCCCATGCATGCC | NoName7_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCCCATGCATGCCTCACTCTC |
| NoName8_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCATTGCCCTCAACGACCACTTTT | NoName8_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCAACAGGGTGATGGACCTC |
| NoName9_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTTAACTCTCACAGGGCCATGTAGTG | NoName9_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGGGCCATGTAGTGTCTTAAAGCTG |
| GAPDH_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGGGGTCTACATGGCAACTGTG | GAPDH_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAGGAGGGGAGATTCAGTGTGGT |
| 제1 PCR 프라이머 명칭 | 서열 | 제2 PCR 프라이머 명칭 | 서열 |
| NoName10_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGGTGTGACTCCTTTCCCAGATCA | NoName10_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGACTCCTTTCCCAGATCAGATAGC |
| NoName10_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGAAGTCCTGGGTATGGAGGCTTTG | NoName10_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGGGTATGGAGGCTTTGGCATTC |
| NoName11_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCACTAGGCTAAGAGGTACACCGT | NoName11_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTAAGAGGTACACCGTAACAGAGA |
| NoName11_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCAGTGGCATCCCCTTTTGTCA | NoName11_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCATGTCATATGGCTAACACCGGTT |
| NoName12_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTTTGGCAGCGGTGATGAGGT | NoName12_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAGGTTTCTCATCCTGCATGACGTAT |
| NoName12_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCAAGGGTAACACCTGAGAAGGT | NoName12_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGTGGGGTAAGGGGAGCTG |
| NoName13_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGGCAGGTGTAGCTTTTTCTGTTA | NoName13_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGAACATTCTGTCATTCCAGTCAGA |
| NoName14_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCGGATTAAAGGGAAGGGCTTCG | NoName14_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGGAAGGGCTTCGAATGAGAATGCT |
| NoName14_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCCGTTACCATAAGTCAGCAGGT | NoName14_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGAAAGTCACTTCCAGCACTTGTGA |
| NoName15_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACCCAAGCGGCCCTTCCT | NoName15_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCCAGGCTTGACTTGGC |
| NoName15_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTGCACACACATTGCCCACTTACA | NoName15_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACCCCAGAACACGAGCAACT |
| NoName16_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGTGAAGTTGGACCAGCTGTCATACA | NoName16_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTTGGACCAGCTGTCATACACACAAC |
| NoName16_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGTGTGTCACATCAATTAATTTGTGC | NoName16_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTGTGCACAGGTTTAAGAAACAAATA |
| NoName17_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCTCTGCAAGTACTGACTGCCT | NoName17_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAAGTACTGACTGCCTCCCCCTT |
| NoName18_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCATGAGGGGACACCAGAGGGAA | NoName18_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGACACCAGAGGGAAGTGAGG |
| NoName18_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCCTCTGGAGTCCCATCATCAC | NoName18_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATCACCATCTGGCATCCCTTCAC |
| NoName19_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGCTGTGTCTGCTGTCCATCC | NoName19_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGTCTGCTGTCCATCCTTCACAT |
| NoName19_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCTGCTGCTGGAGAGCCAT | NoName19_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCTGGAGAGCCATCTTGAAACTAAG |
| NoName2_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGTCGAACTGCATCCCCTGGTTT | NoName2_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCAGGGCAGCCTTCCAG |
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| NoName21_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTCCTGGAGGTCTCTCTTTAATGC | NoName21_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCCCTTTTCTCACAGTGTGCA |
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| NoName24_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACGACTGTTCTCACTGAGGGGTA | NoName24_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGAGGAAAGGGTGGAGCTGA |
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| NoName25_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTTCCTTCTCCACCCAAGTAGCTA | NoName25_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATGTGCCCTCTGTGTGCCTT |
| NoName26_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTCACACTCTACCCTTGTGCTACG | NoName26_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCTACCCTTGTGCTACGCTGTCT |
| NoName27_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCAACTGGGCATGCTCTCCTAGG | NoName27_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAAGGGGCCAGAAGGTCT |
| NoName27_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTGTGTGGCCCTCAGGTGTAA | NoName27_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCCCTCAGGTGTAACTTACCCTCTC |
| NoName28_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACCACACCCGGCTCACTCT | NoName28_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCACACCCGGCTCACTCTCCAATT |
| NoName29_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGAGGTTGCAGGTTGCTGGT | NoName29_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTTGCTGGTTGCTGAGATCATGCCA |
| NoName3_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGCTGGAGTCCTGGTCCTG | NoName3_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAATCACGGGCCCTGGGA |
| NoName3_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCATGGTCACCGCCATTCACGT | NoName3_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGCCATTCACGTGGTGCTTACTG |
| NoName30_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTATCATTACCCACACCCCTGAGAC | NoName30_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCACACCCCTGAGACTGCATA |
| NoName30_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCTACCACGGTGACAGTAACATAGC | NoName30_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGTGACAGTAACATAGCCCAGGGA |
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| NoName32_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGTTCAGGGTCTGGTTCTGTGC | NoName32_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTCAGGGTCTGGTTCTGTGCACATAA |
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| NoName34_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTTTATATGTGGGGGATGGAAAAGAC | NoName34_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATGGAAAAGACAACCCATCATGGTAT |
| NoName35_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCAGTGCCTTTTCCTACTACACCACA | NoName35_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTACTACACCACACTGATGCCTCCA |
| NoName35_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCGAAGGAACCAAACGGAACTTGTGTA | NoName35_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTGGGTGGGAGCAGAGTACTCTT |
| NoName36_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAGCTCATCGAGGCACCAAACA | NoName36_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGGTGATTACAAGGCCACATCCTAC |
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| NoName37_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCCACAGTTCCAGTGCATTCG | NoName37_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCACAGTTCCAGTGCATTCGGAAGAA |
| NoName38_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGCTCCCCAGAAGAAGAAGCCT | NoName38_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTTGCAGAACCACGAGCTGA |
| NoName38_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCAAGTGGTAGGCATGGGTTAGAAGA | NoName38_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCAGCTGTGCTTCTAATGTACACCCT |
| NoName39_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCCCGGCAATCGTTTTCTAGGG | NoName39_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAATCGTTTTCTAGGGCACGACTTA |
| NoName39_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACCCCCAGGTCAGCAAGC | NoName39_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCAGCAAGCACTTGATCAGAGCATT |
| NoName4_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTGATTAGGGTGGTTCGTTTTGACGT | NoName4_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGGTTCGTTTTGACGTGTCTGTTTC |
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| NoName40_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAATGCAGAGGCCAGGACACC | NoName40_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCCAGGACACCACCATCCC |
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| NoName43_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGAGACCAGTGATTTCAGAGTGGCTAG | NoName43_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTCAGAGTGGCTAGGTGTTCACTGAT |
| NoName44_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACCCCGAACTTGGTGATGCAGTAC | NoName44_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTACGGGGAGCGGGCCGGGTT |
| NoName44_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGGTGGCTCAGAAGTGGTTCC | NoName44_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTCAGAAGTGGTTCCAGCCAAG |
| NoName45_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGTAGGTGATAGGGAAACGCCGAAA | NoName45_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGGAAACGCCGAAAGTATTTTAGGT |
| NoName45_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTCTGCAGAGCATGGAGGCAAC | NoName45_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAACTGCTCCCTGGTCTCTT |
| NoName46_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAAGTCTGAAACGCTGCTCTGCTATT | NoName46_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGTGATCCCTTCGAAGAATCTTGT |
| NoName47_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCACCATTTCCACCCAGCTTTG | NoName47_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCACCCAGCTTTGCTCAAGT |
| NoName47_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCAAGTAGCTAGGACTCAAGGCACATG | NoName47_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCACCACGGCCAGATCATTGA |
| NoName48_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGGGGGCTGATATGGGTCAACC | NoName48_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAACTGGGTTGCCATGAATCTGCTG |
| NoName5_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGCATCGAAGCTGGTGGAGAC | NoName5_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAGGGCTGAGGTGGAAAGCT |
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| NoName6_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCACGTTCCCGTCTGCTCAGTG | NoName6_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGGGTAAAGGGGACTCACTCT |
| NoName6_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGAGGTTGGACCAGCTGTCATACC | NoName6_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCTGCTTTACTGTCACACGTAGCAG |
| NoName7_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCTAGTCTTTCCAGGCCACCCT | NoName7_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCACCCTCTCCGAGCCACCT |
| NoName7_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTTGGCAAGCACTCCTCAATGGC | NoName7_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAGCTTACAGGCAGGGCTGT |
| NoName8_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCAGAGAGGAGGGGCTAAAGGG | NoName8_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGCAGGAAGGGAGAAGCAC |
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| NoName9_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCCCCAACCCAAGCTAGTCTTTC | NoName9_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCAAGCTAGTCTTTCCAGGCCACT |
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| 제1 PCR 프라이머 명칭 | 서열 | 제2 PCR 프라이머 명칭 | 서열 |
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| NoName6_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAAGGGAGCGGGGATTATGGC | NoName6_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGACCAGGGTCATGACTAGCTAAA |
| NoName6_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGATCATGCACCCCGTCCTGAC | NoName6_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCCTGACCCTGACGCTGCAC |
| NoName7_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCAGACCTGCCGTGGACCTT | NoName7_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCGTGGACCTTGGCTTCC |
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| NoName8_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCCTGGATCCCACCCTTGC | NoName8_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGTGGCACAGTGAGGGGTGT |
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| 제1 PCR 프라이머 명칭 | 서열 | 제2 PCR 프라이머 명칭 | 서열 |
| NoName1_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCAAGTAGGGCTCAGGGTCGAAGG | NoName1_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTCAGGGTCGAAGGCTCACT |
| NoName1_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCAATGGCCGCTGGGAAAAAT | NoName1_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCAAACCATCGGGGGAAAAATGACAA |
| NoName10_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTATCATTGTAGATGGGGCCGGAAA | NoName10_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTAGATGGGGCCGGAAAGTAGAAAAG |
| NoName10_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCCACTGCCACTGTAGCCT | NoName10_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCAGCTCCAAGTCCATCTGG |
| NoName12_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCAACTCCAGGGCTCAAGCAATCG | NoName12_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTACCAAGCCCCACCCT |
| NoName12_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCAGACATTTGACCACCCTATACCC | NoName12_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACCCTATACCCACCATACTCACGTT |
| NoName13_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCGCAGTAGGGAAGGGGCAACT | NoName13_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGGAAGGGGCAACTTTTCAAAATCT |
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| NoName14_m1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTGGCACCTGCAGGAAACGGT | NoName14_m2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACCTGCAGGAAACGGTTGCGTTC |
| NoName14_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCTGGGCCACCTGGTGTCG | NoName14_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTGGGCCGCCTGATCTACC |
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| NoName17_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCTTCCTCCTGCCAGGGTGCA | NoName17_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGCCAGGGTGCAAGAACT |
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| TRAC_p1 | CCCCTTAGGGATAACAGGGTAATCCCTGCGAAGGCACCAAAGC | TRAC_p2 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTGTTGTTGAAGGCGTTTGCA |
이제 도 4c 및 도 4d를 참조한다. 도 4c의 차트 411 및 차트 412는 각각 GAPDH 및 HBB 부위에서 실시예 6의 iPSC의 오프-타겟을 나타낸다. 도 4d의 차트 421 및 차트 422는 각각 TRAC 및 PD-1 부위에서 실시예 6의 T 세포 내의 오프-타겟을 나타낸다. 차트 411, 412, 421 및 422에 표시된 바와 같이, 융합 검출을 통해 오프-타겟으로 확인된 부위는 10~26개였으며, 여기서 10~40%는 인델 검출을 통해서도 확인되었다. 또한 여러 부위는 인델 빈도가 0.1% 미만으로 검증되었지만 전위는 여전히 검출할 수 있었다. 일반적으로 차트 412(도 4c)에 표시된 바와 같이, 융합 파트너가 없는 HBB 로커스를 제외하고는 온-타겟이 7~20%의 유전자 융합을 차지하였다. 이는 DSB 말단에 인접한 서열 컨텍스트가 전위 빈도에 영향을 줄 수 있음을 나타낸다.
실시예 13. 생체 내 오프-타겟 프로파일링 및 전위 역학
실시예 7에 따라 편집된 CRISPR-edited 마우스에서 오프-타겟을 스캔하기 위해 EDITED-Seq을 추가로 사용하였다. 도 5b 및 도 5c를 참조하면, 차트 520 및 530은 각각 15일 또는 60일 후 ALB 부위에서 마우스의 오프-타겟을 나타낸다.
실시예 14. 결과 요약
요약하면, 상기 결과는 EDITED-Seq이 여러 인실리코 예측 게놈 유전자좌의 고정된 멀티플렉스 농축을 사용하여 모든 유형의 오프-타겟 이벤트를 캡처할 수 있음을 나타낸다. 인간의 종양, 면역 및 유도 만능성 줄기세포와 마우스 생체 내 실험을 사용하여 본 발명에서 EDITED-Seq은 새로운(전위) 오프-타겟 부위를 식별하고 공지된 오프-타겟 부위(InDels)의 편집 효율성을 정량화할 수 있으며 별도의 세포 조작없이도 치료법 파이프 라인과 호환이 가능하다는 것을 나타내었다. 세포 유형과 게놈 맥락에 따라 전위 빈도가 다르긴 했지만, InDels에 의해 확인된 대부분의 오프-타겟 부위(약 90%)도 EDITED-Seq에 의해 전위된 형태로 나타났다. 또한, DISCOVER-Seq 또는 GUIDE-Seq과 같은 기존의 다른 방법으로는 이전에 발견되지 않았던 새로운 오프-타겟 부위가 30~60% 정도 발견되었다. 본 발명은 EDITED-Seq이 CRISPR 편집 효율성 및 오프-타겟 이벤트를 검출하고 평가하는 데 민감하고 다양한 방법이며 향후 다양한 유전적 질환에 대한 CRISPR 기반 유전자 치료에 호환될 수 있음을 입증한다.
실시예 15. 논의
Cas9에 의해 생성된 유전체 내의 DSB는 DNA 복구 경로를 활성화시킬 수 있으며, 따라서 온-타겟, 오프-타겟 및 배경: 불변, 돌연변이 (삽입/삭제 (인델) 및 염기 돌연변이) 및 염기 돌연변이) 및 변위를 포함하는 다양한 유형의 이중 가닥 단절(DSB) 사이에 세 가지 주요 종류의 밀봉된 DNA 가닥이 형성된다. 단일 프로토스페이서 RNA에 의해 유도되는 Cas9은 원칙적으로 이배체 인간 세포에서 온-타겟 유전자좌에 두 개의 DSB만을 만들 수 있다. 다른 원치 않는 절단이 없다면 유전자 융합을 검출하지 못할 가능성이 높다. 이러한 관점에서, 원하지 않는 절단 부위(즉, 오프-타겟)에서 유전자 융합 또는 염색체 배열을 관찰할 수 있다. 전술한 예시적인 실시예에서, 오프-타겟의 검출에 있어서 EDITED-Seq, DISCOVER-Seq 및 GUIDE-Seq의 성능을 비교하였다.
GUIDE-Seq은 유전체 내 CRISPR 편집 부위에 dsODN 삽입을 생성하기 위해 습식 실험실 과정에서 추가적인 이중가닥 올리고뉴클레오티드(dsODN)를 필요로 하며, 이는 생체 내 편집 상황과 호환되지 않으며 생체 외 편집 상황에서는 원하지 않는 추가 단계이다. ODN 삽입된 게놈은 실제로 뉴클레아제에 의해 생성된 편집된 자연 상태가 아닌 인공물 게놈 유도체이다.
DISCOVER-Seq은 발병 이중 가닥 절단(DSB) 복구의 핵심 포함 요소 중 하나인 MER11의 중간 상태를 스냅샷으로 촬영하여 DSB 말단에 결합하여 Cas9에 의해 생성된 게놈 전체 절단 병변을 캡처한다. 따라서 DISCOVER-Seq의 민감도와 특이도는 MER11 항체의 품질에 크게 좌우되며, 앰플리콘 차세대 시퀀싱(NGS)을 통해 검증을 수행해야 하는 경우 결과의 제어할 수 없는 변동과 시간이 많이 소요되는 절차를 의미한다.
위의 두 가지 방법과 달리, EDITED-Seq은 게놈 편집 뉴클레아제에 의해 유도되는 돌연변이 유발(예를 들어, 돌연변이 및 전위) 진행 중에 어떠한 인위적인 교란 없이 게놈 전체 현장에 편집된 오프-타겟을 검출하는 다용도 접근법이다. 유전자 전위/배열은 뉴클레아제에 의한 돌연변이 유발의 작은 부분을 차지할 뿐이므로 잠재적으로 EDITED-Seq의 민감도를 제한할 수 있다는 우려가 있을 수 있다. 두 단계는 이러한 잠재적 제한을 크게 개선할 수 있다. 비록 전위 빈도는 세포 종류와 유전체 맥락에 따라 다르지만, InDels에 의해 확인된 대부분의 오프-타겟 부위(약 90%)도 EDITED-Seq에 의해 전위의 형태로 나타났다.
DSB를 복구하는 것과 복구 후 사이에는 오프-타겟 결과에 상당한 차이가 있다. DISCOVER-Seq에 의해 확인된 일부 부위는 실제로 최종 돌연변이 유발 편집이 거의 나타나지 않았으며(도 2a 및 도 2b), 이는 구분된 오프-타겟 부위에서 편향된 DSB 복구 수준을 나타낸다. EDITED-Seq은 DSB 복구 후 서열이 변경된 오프-타겟을 직접 판독할 수 있으며, 유전자 편집 시 가장 중요한 관심사는 Cas-뉴클레아제에 의해 절단되거나 결합되는 로커스가 아니라 생검 풀에서 얼마나 많은 유전자좌와 유전체가 변경되었는지에 대한 것이므로 임상적으로 유용한 접근법이다. 이러한 관점에서 EDITED-Seq은 전체 게놈 시퀀싱과 달리 경제적이고 간단한 방식으로 CRISPR에 의해 유도된 현장 염기서열 교체의 게놈 전체에 대한 진실한 정보를 제공한다. iPSC 및 생체 내에서 EDITED-Seq의 성능은 임상 유전자 치료 바이오 제품을 위한 병행 품질 관리 단계로서 그 적용 범위를 더욱 확장한다.
따라서, 본 발명의 예시적인 실시예는 충분히 설명되었다. 비록 설명이 특정 실시예를 언급하였지만, 당업자에게는 본 발명이 이러한 특정 세부 사항의 변형으로 실시될 수 있음이 명백할 것이다. 한 도면에서 논의된 방법/단계는 다른 도면의 방법/단계에 추가되거나 다른 도면의 방법/단계와 교환될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING
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<212> DNA
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> DNA
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cttccgatct 70
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 19
ccccttaggg ataacagggt aatctgagag acagggtctt gctgttg 47
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 20
ccccttaggg ataacagggt aatcccaact tggtgggggt agagtg 46
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 21
ccccttaggg ataacagggt aatctcacgc agacgccccc at 42
<210> 22
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 22
ccccttaggg ataacagggt aatcagcctg gagttaaggg tgtctcc 47
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 23
ccccttaggg ataacagggt aatcccccag gagcgtggat gactac 46
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 24
ccccttaggg ataacagggt aatcgcaggt gaggccgtgc ag 42
<210> 25
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 25
ccccttaggg ataacagggt aatctgagtt atgtggtccc ctctaggaa 49
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 26
ccccttaggg ataacagggt aatcagcgtc gtctcctgga gctc 44
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 27
ccccttaggg ataacagggt aatctgatgg catcaaaatg tgtgtccagt 50
<210> 28
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 28
ccccttaggg ataacagggt aatcggaggt ggcttcactt aggaggtc 48
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 29
ccccttaggg ataacagggt aatcagcaag gctgacacca ggtg 44
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 30
ccccttaggg ataacagggt aatcggctgg gatctgggga gagag 45
<210> 31
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 31
ccccttaggg ataacagggt aatcaatcat caggtgcaag gcaagactg 49
<210> 32
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 32
ccccttaggg ataacagggt aatctctgac tggagttccc ttcacca 47
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 33
ccccttaggg ataacagggt aatcgaggag cctggacaga cgaag 45
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 34
ccccttaggg ataacagggt aatcgctgcc agaagcctgt agagat 46
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 35
ccccttaggg ataacagggt aatcagctcg ggggtgatta gttgc 45
<210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 36
ccccttaggg ataacagggt aatcgccgtg gcccgacacc ta 42
<210> 37
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 37
ccccttaggg ataacagggt aatctaagaa gggccccttg atgaggtc 48
<210> 38
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 38
ccccttaggg ataacagggt aatcgggaga ggtgggtcaa ctttgg 46
<210> 39
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 39
ccccttaggg ataacagggt aatcgagggt gggcgtggct atgta 45
<210> 40
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 40
ccccttaggg ataacagggt aatcatgaag ctggactgca ccatcg 46
<210> 41
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 41
ccccttaggg ataacagggt aatctgggga ggggcgaagg tc 42
<210> 42
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 42
ccccttaggg ataacagggt aatcccgggt cctgcgtccc tt 42
<210> 43
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 43
ccccttaggg ataacagggt aatcccgcag cctccagatg ca 42
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 44
ccccttaggg ataacagggt aatcctgagg ctcttatcaa acaactgcca 50
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 45
ccccttaggg ataacagggt aatccgagtc ccggcgctgt cc 42
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 46
ccccttaggg ataacagggt aatccctcct cggtccgctg ag 42
<210> 47
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 47
ccccttaggg ataacagggt aatccaatct ctgacttgga cagctgca 48
<210> 48
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 48
ccccttaggg ataacagggt aatctcgatg atggcctatg ggttgaaaa 49
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 49
ccccttaggg ataacagggt aatctgtgct tcttccaagc tgcgt 45
<210> 50
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 50
ccccttaggg ataacagggt aatctgtgat tttcctggct ttagcgcta 49
<210> 51
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 51
ccccttaggg ataacagggt aatctctaca accaagccca tttgtcca 48
<210> 52
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 52
ccccttaggg ataacagggt aatcagcctc tctaccattt gtgctga 47
<210> 53
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 53
ccccttaggg ataacagggt aatccctgcc agggttgcat ggg 43
<210> 54
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 54
ccccttaggg ataacagggt aatcttgtcc ccaccctcgt cactc 45
<210> 55
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 55
ccccttaggg ataacagggt aatcggcagg gacccggcga ca 42
<210> 56
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 56
ccccttaggg ataacagggt aatcggaagg gaggcgctag gca 43
<210> 57
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 57
ccccttaggg ataacagggt aatcgctggg cctgcacgct ca 42
<210> 58
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 58
ccccttaggg ataacagggt aatcgacagc caccctgctc cac 43
<210> 59
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 59
ccccttaggg ataacagggt aatccctagc aacggccctg gca 43
<210> 60
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 60
ccccttaggg ataacagggt aatcccctac cctgccgcgc tcct 44
<210> 61
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 61
ccccttaggg ataacagggt aatcggcacc tcattgggga cgt 43
<210> 62
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 62
ccccttaggg ataacagggt aatctgctct gaaccgaggc cttg 44
<210> 63
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 63
ccccttaggg ataacagggt aatcgcaggg ccccagagag gt 42
<210> 64
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 64
ccccttaggg ataacagggt aatcgcagcg acgccactct ttatct 46
<210> 65
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 65
ccccttaggg ataacagggt aatccgcgct gacagctgtt gc 42
<210> 66
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 66
ccccttaggg ataacagggt aatctgagtt tcatgctcag tccctgca 48
<210> 67
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 67
ccccttaggg ataacagggt aatcagggct ctggggtgac tcc 43
<210> 68
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 68
ccccttaggg ataacagggt aatcctccct actcaacccc gagccctcct 50
<210> 69
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 69
ccccttaggg ataacagggt aatcgcgcca gaccagctcc ga 42
<210> 70
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 70
ccccttaggg ataacagggt aatcctcctt gcccggggta gg 42
<210> 71
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 71
ccccttaggg ataacagggt aatccttctc atccttgtat cagctgcctt 50
<210> 72
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 72
ccccttaggg ataacagggt aatcgggaga gtgccattct cagcctaa 48
<210> 73
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 73
ccccttaggg ataacagggt aatcggtgga tcacgcagtc gga 43
<210> 74
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 74
ccccttaggg ataacagggt aatccatgag cacacccacc acca 44
<210> 75
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 75
ccccttaggg ataacagggt aatcgccttg tcccacatca cagca 45
<210> 76
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 76
ccccttaggg ataacagggt aatccgcctg ggactacttc tcgtttgaaa 50
<210> 77
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 77
ccccttaggg ataacagggt aatcccccca acgtggcctc ag 42
<210> 78
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 78
ccccttaggg ataacagggt aatccacagc tgtccaaacg aggct 45
<210> 79
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 79
ccccttaggg ataacagggt aatcggatgc aactgagggc tcctta 46
<210> 80
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 80
ccccttaggg ataacagggt aatcggaagg tcgctgggaa gcc 43
<210> 81
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 81
ccccttaggg ataacagggt aatctgccca gcctccctgc ag 42
<210> 82
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 82
ccccttaggg ataacagggt aatcagctcc tctgtgtgac atgcc 45
<210> 83
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 83
ccccttaggg ataacagggt aatcaccaac cagctaacac tgctatgca 49
<210> 84
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 84
ccccttaggg ataacagggt aatcactcag gtgtgctggc actgat 46
<210> 85
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 85
ccccttaggg ataacagggt aatcacatac aaccagttca cccagttac 49
<210> 86
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 86
ccccttaggg ataacagggt aatcggtgtg tgtttgctgt taccgctta 49
<210> 87
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 87
ccccttaggg ataacagggt aatccctgga gcgaaggcct ggag 44
<210> 88
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 88
ccccttaggg ataacagggt aatctactga tgggggtgag ctcca 45
<210> 89
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 89
ccccttaggg ataacagggt aatctgtgtc tctgctttct gttggca 47
<210> 90
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 90
ccccttaggg ataacagggt aatctcttca agcagcccac cttctg 46
<210> 91
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 91
ccccttaggg ataacagggt aatcactccc gccggttcca ag 42
<210> 92
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 92
ccccttaggg ataacagggt aatcccaaag cacaggtggg gact 44
<210> 93
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 93
ccccttaggg ataacagggt aatccagctg cttgggctcc gttg 44
<210> 94
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 94
ccccttaggg ataacagggt aatcccccag gccacaggaa acc 43
<210> 95
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 95
ccccttaggg ataacagggt aatcgctagg gtggctgtga ctcag 45
<210> 96
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 96
ccccttaggg ataacagggt aatccctctg gcttcccatg ggtgag 46
<210> 97
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 97
ccccttaggg ataacagggt aatcctccct gagaagagct gaacatagc 49
<210> 98
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 98
ccccttaggg ataacagggt aatctcaacc cttcccatga ctgaggtg 48
<210> 99
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 99
ccccttaggg ataacagggt aatccccaac cccctgcagc tg 42
<210> 100
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 100
ccccttaggg ataacagggt aatctcaaaa tcccaagggc attgttc 47
<210> 101
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 101
ccccttaggg ataacagggt aatccattgt gtcttcttgg tacccttttt 50
<210> 102
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 102
ccccttaggg ataacagggt aatcagatca cacgaggcag agggaa 46
<210> 103
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 103
ccccttaggg ataacagggt aatcgcaatc tcacctcctc cctctc 46
<210> 104
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 104
ccccttaggg ataacagggt aatcagccaa acacagaaag gcc 43
<210> 105
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 105
ccccttaggg ataacagggt aatcgtgagc catgatcgtg cactc 45
<210> 106
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 106
ccccttaggg ataacagggt aatcactaca ttggaggagt gtgtacc 47
<210> 107
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 107
ccccttaggg ataacagggt aatcctctgc tttcccctcc cacct 45
<210> 108
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 108
ccccttaggg ataacagggt aatcctgccc tgttggataa cccttct 47
<210> 109
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 109
ccccttaggg ataacagggt aatccttgga aagggatgct ctgaatacct 50
<210> 110
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 110
ccccttaggg ataacagggt aatcagctgc actttctccc ggacaa 46
<210> 111
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 111
ccccttaggg ataacagggt aatctgttgt taaggctgtt ggcatctgt 49
<210> 112
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 112
ccccttaggg ataacagggt aatcaggaaa acacggttgc atcctga 47
<210> 113
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 113
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<210> 114
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 114
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<210> 115
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 115
ccccttaggg ataacagggt aatcggcggt gtcagcaaag ctagg 45
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 116
ccccttaggg ataacagggt aatcagcacc gatgaggcat ggg 43
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 117
ccccttaggg ataacagggt aatcgtgctg cctccccctc tggta 45
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 118
ccccttaggg ataacagggt aatcggagtg actggatgct gggtt 45
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 119
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 120
ccccttaggg ataacagggt aatcgggtag acttgacata agcacca 47
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 121
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 123
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 123
ccccttaggg ataacagggt aatcgggtct ggggtcctga aatgac 46
<210> 124
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 124
ccccttaggg ataacagggt aatccccact agatcctgtc acaattccc 49
<210> 125
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 125
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatctgcaca agaacctgct gtctaaactt 50
<210> 127
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ccccttaggg ataacagggt aatcacgacg gccgcacagt gg 42
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 128
ccccttaggg ataacagggt aatccccgcc cactctcgac tctt 44
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 129
ccccttaggg ataacagggt aatcccagga ctccccaggt gct 43
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<213> Artificial Sequence
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ccccttaggg ataacagggt aatcctctag cccgaaaagc caagct 46
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<213> Artificial Sequence
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ccccttaggg ataacagggt aatccccccg tcccctctgc ca 42
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 136
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<213> Artificial Sequence
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<400> 137
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<400> 138
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<213> Artificial Sequence
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ccccttaggg ataacagggt aatccacttt ccctggggct tgctta 46
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ccccttaggg ataacagggt aatcccgcag acagagcaag cgcgtt 46
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ccccttaggg ataacagggt aatcgcccca gctaccacct cctc 44
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccctg ggtctctgaa gaagct 56
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggcggg tgggtcacaa aataaaatgt 60
<210> 152
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacagga cagggtcagc gtttaaga 58
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagttt gctggccctg gtttaga 57
<210> 154
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgcagt acagtgatgg gaccgt 56
<210> 155
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccttag ggggccagca gtg 53
<210> 156
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcagac gcccccatca agcc 54
<210> 157
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<210> 158
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcgcgc acccctttcc ca 52
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 160
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 163
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<210> 167
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 169
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 170
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 171
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccgac acctaccggc tctcc 55
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 172
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtcct ggtgctgttc agcccatctt 60
<210> 173
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 173
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtggg tcaactttgg cagggt 56
<210> 174
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 174
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtggg cgtggctatg taaacgga 58
<210> 175
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 175
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctggac tgcaccatcg ctcagg 56
<210> 176
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 176
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaggga gtctcaggcc cgtgag 56
<210> 177
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 177
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<210> 178
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 178
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaccg gcagccacct gt 52
<210> 179
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 179
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<210> 180
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<213> Artificial Sequence
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<400> 180
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<210> 181
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<213> Artificial Sequence
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<210> 182
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<213> Artificial Sequence
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttgga cagctgcagt actccct 57
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 183
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtgcg gtggagaaag gcaag 55
<210> 184
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 184
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcgtct ctttggaccc gtacttgc 58
<210> 185
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 185
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<210> 186
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 186
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcatttg tccaggaacc cctagcc 57
<210> 187
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 187
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaccatt tgtgctgatc tgtgggtatc 60
<210> 188
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 188
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagggt tgcatgggaa cttcctctg 59
<210> 189
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 189
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccacc ctcgtcactc tctgacc 57
<210> 190
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 190
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccggcg acactgggga atg 53
<210> 191
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 191
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccggg ctccgtgcaa ac 52
<210> 192
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 192
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggccc cctggagctg ca 52
<210> 193
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 193
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaccc tgctccacac acct 54
<210> 194
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 194
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacggcc ctggcaccac ct 52
<210> 195
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 195
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgccg cgctcctcct tcc 53
<210> 196
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 196
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctcat tggggacgtc tgttgtgaaa 60
<210> 197
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 197
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtccc cagttacgga gacaaatct 59
<210> 198
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 198
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggcccc agagaggtga ggtcactata 60
<210> 199
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 199
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtacc ccgtgcctca gct 53
<210> 200
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 200
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaggt tgtttatctg ggcctct 57
<210> 201
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 201
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcagga cacagcacag gtaaggga 58
<210> 202
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 202
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgggg tgactccaag gcttttcg 58
<210> 203
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 203
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccccga gccctcctct cttg 54
<210> 204
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 204
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagctcc gactccgctc gct 53
<210> 205
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 205
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttgccc ggggtaggaa agtga 55
<210> 206
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 206
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtatca gctgccttct catcacaaga 60
<210> 207
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 207
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgcca ttctcagcct aaaaggtaga 60
<210> 208
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 208
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacgcag tcggaggcca tcc 53
<210> 209
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 209
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcaca cccaccacca ctccta 56
<210> 210
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 210
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttgtc ccacatcaca gcaaactct 59
<210> 211
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 211
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcggggc tgcggaagga tcc 53
<210> 212
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 212
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaacgt ggcctcagct gctc 54
<210> 213
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 213
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacgagg ctggctcccc act 53
<210> 214
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 214
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctcctt agaaagtcat gccccaggag 60
<210> 215
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 215
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggctg ggaggggatt ggc 53
<210> 216
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 216
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcctcc ctgcaggatg attggc 56
<210> 217
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 217
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatgcca cagatgacta ttgcacacct 60
<210> 218
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 218
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacctca ggggccgctg ca 52
<210> 219
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 219
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctggc actgatctgt ggtccca 57
<210> 220
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 220
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaccag ttcacccagt tacagtagac 60
<210> 221
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 221
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaccgct taaattaacc ctgagtgacg 60
<210> 222
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 222
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttagcgt gcggcccgag ct 52
<210> 223
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 223
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggggt gagctccaac tctg 54
<210> 224
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 224
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatgtat ctggcattac agctgagcag 60
<210> 225
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 225
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagcca ctgcaccgac ttca 54
<210> 226
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 226
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcggttc caagttatcg gagtgagcca 60
<210> 227
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 227
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggactc atagcctggg ggtaaatgtt 60
<210> 228
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 228
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgcttg ggctccgttg caatcc 56
<210> 229
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 229
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaacca ggggagaggg ccatagag 58
<210> 230
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 230
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctgtg actcagagcc atggc 55
<210> 231
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 231
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggcttc ccatgggtga gtcctgt 57
<210> 232
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 232
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaagag ctgaacatag ccaggcaatt 60
<210> 233
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 233
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgactg aggtggatga acccctaagc 60
<210> 234
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 234
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaacccc ctgcagctgc tcacaa 56
<210> 235
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 235
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaatcc caagggcatt gttcacataa 60
<210> 236
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 236
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaccctt tttgaaaatt agttgcccat 60
<210> 237
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 237
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaggca gagggaacta caggtgca 58
<210> 238
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 238
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctccc tctcctacca acttcatcc 59
<210> 239
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 239
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaaac acagaaaggc catttattgt 60
<210> 240
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 240
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccatga tcgtgcactc tagcct 56
<210> 241
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 241
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggagt gtgtaccatt taaggatgtg 60
<210> 242
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 242
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccacc tggccctgca aga 53
<210> 243
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 243
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttctctg cccctggaca gattctatag 60
<210> 244
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 244
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggccc tgctgcacta tgatcaa 57
<210> 245
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 245
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggcca gcttcatgac ctgaaacc 58
<210> 246
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 246
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgcacc tggctgcacc ac 52
<210> 247
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 247
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcatcct gaatgctcgt tgagtggatg 60
<210> 248
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 248
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggccaa gcccatgtag tactgcag 58
<210> 249
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 249
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccctca actacttgcc caacatgc 58
<210> 250
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 250
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcggtgt cagcaaagct aggtaaggag 60
<210> 251
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 251
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccgatg aggcatgggt tatgaagta 59
<210> 252
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 252
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccctc tggtatgccc cctcat 56
<210> 253
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 253
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgactg gatgctgggt tgtggaaa 58
<210> 254
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 254
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttctcc cccgaggcct cagaa 55
<210> 255
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 255
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgacttg acataagcac catacttcgg 60
<210> 256
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 256
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggctg ctgggtagga cctg 54
<210> 257
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 257
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgtgat tcgagttcct ggcaatgcta 60
<210> 258
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 258
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtcct gaaatgaccc ccaagg 56
<210> 259
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 259
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgcagc ctattgtctc ctggt 55
<210> 260
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 260
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcacgc cgtggccgaa ca 52
<210> 261
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 261
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaacttc cataccagca gcagttcc 58
<210> 262
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 262
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccgctc gggccgctga ct 52
<210> 263
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 263
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgccca ctctcgactc ttcaggtag 59
<210> 264
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 264
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctactccc caggtgctga agagacg 57
<210> 265
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 265
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaggg ggtccgagtg ca 52
<210> 266
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 266
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgctgc tcgttgcctg gca 53
<210> 267
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 267
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacttg aggtggacgt cagtttctgg 60
<210> 268
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 268
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgggt tctggcagaa gttcctatgt 60
<210> 269
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 269
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccctc tgccaccccc at 52
<210> 270
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 270
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctgtg tccggagctg tttctgc 57
<210> 271
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 271
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctggc tggaaaggca accc 54
<210> 272
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 272
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaccact ctagaatttg gcaagatgt 59
<210> 273
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 273
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatttct ccacctaggt gtgctctctc 60
<210> 274
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 274
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaacac aggagctagt ctgggaaga 59
<210> 275
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 275
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgttac tgtgcattga agtcacctga 60
<210> 276
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 276
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcctgt tcttgcacct ggattcttac 60
<210> 277
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 277
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcgccc tgcccttcgg ataa 54
<210> 278
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 278
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacggtt atctttgcga cttaggctca 60
<210> 279
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 279
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcgtta taaactcccc gaatcttgga 60
<210> 280
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 280
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccctg gggcttgctt agtaaagtag 60
<210> 281
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 281
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggtgg ccggcccagg gt 52
<210> 282
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 282
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcgggc cggggcgtct ga 52
<210> 283
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 283
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcggcgg cggacagtgg ac 52
<210> 284
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 284
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccgaag cgagaacagc ccagaagtt 59
<210> 285
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 285
ccccttaggg ataacagggt aatcttggca tgacccaggt ccatac 46
<210> 286
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 286
ccccttaggg ataacagggt aatcaagagt ctgggtgaat cagcagtc 48
<210> 287
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 287
ccccttaggg ataacagggt aatcaggggc cagcagcaag gt 42
<210> 288
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 288
ccccttaggg ataacagggt aatctgagtc aggaggcaga gatcctc 47
<210> 289
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 289
ccccttaggg ataacagggt aatcaaatcc cgttggccct cctg 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 290
ccccttaggg ataacagggt aatcggggcg ttgtgggtct ga 42
<210> 291
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 291
ccccttaggg ataacagggt aatccctagg cccctcccct ct 42
<210> 292
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 292
ccccttaggg ataacagggt aatcccaggt ggtctcctcc gact 44
<210> 293
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 293
ccccttaggg ataacagggt aatcagggga gatgctcagt gtggt 45
<210> 294
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 294
ccccttaggg ataacagggt aatctgagca caaggtcgtc tcctct 46
<210> 295
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 295
ccccttaggg ataacagggt aatctggcag atgaataagg ctcactcct 49
<210> 296
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 296
ccccttaggg ataacagggt aatctcccta cagagataaa cagacgcaca 50
<210> 297
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 297
ccccttaggg ataacagggt aatccagttc tttgggtcct catcacagt 49
<210> 298
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 298
ccccttaggg ataacagggt aatcagcaac atacagatgg ggtggga 47
<210> 299
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 299
ccccttaggg ataacagggt aatcggatgc ttagcttccg ttgggtt 47
<210> 300
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 300
ccccttaggg ataacagggt aatcctgggc acggtggaca gc 42
<210> 301
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 301
ccccttaggg ataacagggt aatccctctt caagtggtct gcatggaa 48
<210> 302
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 302
ccccttaggg ataacagggt aatcggtggt ctcctccgat ttcaaca 47
<210> 303
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 303
ccccttaggg ataacagggt aatcttgcgg ggaggggaga ttct 44
<210> 304
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 304
ccccttaggg ataacagggt aatcccctac ctcaccgcca atgttt 46
<210> 305
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 305
ccccttaggg ataacagggt aatcgaggag gggagagtct cagtgtt 47
<210> 306
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 306
ccccttaggg ataacagggt aatcacttta acagcatcac ccactcttcc 50
<210> 307
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 307
ccccttaggg ataacagggt aatctttcct gtattgcttt tgccttgagc 50
<210> 308
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 308
ccccttaggg ataacagggt aatcggagcc tggaccacta agtcac 46
<210> 309
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 309
ccccttaggg ataacagggt aatcgcgtgg aggtgagctc atgtag 46
<210> 310
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 310
ccccttaggg ataacagggt aatcgggcgc tcagtaggtg tgc 43
<210> 311
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 311
ccccttaggg ataacagggt aatcctgtgg gccatcttca agttcagtcc 50
<210> 312
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 312
ccccttaggg ataacagggt aatcaaaaac ctccaccctt atgaagcct 49
<210> 313
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 313
ccccttaggg ataacagggt aatctctctg ctgtgtgctg tccac 45
<210> 314
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 314
ccccttaggg ataacagggt aatcagcccc tccctctcca gga 43
<210> 315
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 315
ccccttaggg ataacagggt aatcgatgct ggggctggca ct 42
<210> 316
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 316
ccccttaggg ataacagggt aatcactgtg tccaggggag attctca 47
<210> 317
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 317
ccccttaggg ataacagggt aatcacttac gcttaggtgt gatttgcgaa 50
<210> 318
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 318
ccccttaggg ataacagggt aatccaggca aggctgaatg gaagcg 46
<210> 319
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 319
ccccttaggg ataacagggt aatccctggg gaagggccat tca 43
<210> 320
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 320
ccccttaggg ataacagggt aatcggagac ggtgcaggag ctc 43
<210> 321
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 321
ccccttaggg ataacagggt aatcaggacc ctcctcacgg gatac 45
<210> 322
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 322
ccccttaggg ataacagggt aatcgtgtgg tgggggactg agc 43
<210> 323
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 323
ccccttaggg ataacagggt aatcgatgct ggggctgcca ttg 43
<210> 324
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 324
ccccttaggg ataacagggt aatcctcctc accaccccca agg 43
<210> 325
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 325
ccccttaggg ataacagggt aatcggccaa agtccgcccc aag 43
<210> 326
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 326
ccccttaggg ataacagggt aatcggaggc cccaggaact ttca 44
<210> 327
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 327
ccccttaggg ataacagggt aatccctcgg gaggtgggta gtgt 44
<210> 328
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 328
ccccttaggg ataacagggt aatcggacca gcttgttgag gacccta 47
<210> 329
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 329
ccccttaggg ataacagggt aatcgagcct catcagttga ccccaa 46
<210> 330
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 330
ccccttaggg ataacagggt aatcggggtg cagcctggag aga 43
<210> 331
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 331
ccccttaggg ataacagggt aatcagcttt gctggggtaa caggacac 48
<210> 332
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 332
ccccttaggg ataacagggt aatcgaaact atgaaactac caggagaagt 50
<210> 333
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 333
ccccttaggg ataacagggt aatcgttcaa agcatcatct gtgaatcaa 49
<210> 334
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 334
ccccttaggg ataacagggt aatctctgag gccagcaaaa ccttga 46
<210> 335
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 335
ccccttaggg ataacagggt aatcactgac acctggaggc ctga 44
<210> 336
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 336
ccccttaggg ataacagggt aatcctggag ggtgtatgcg tgct 44
<210> 337
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 337
ccccttaggg ataacagggt aatcctgggg ttggcgtcac ct 42
<210> 338
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 338
ccccttaggg ataacagggt aatcattctt cagggggtct ggcatga 47
<210> 339
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 339
ccccttaggg ataacagggt aatccaccca tatgcacacc cacatatacc 50
<210> 340
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 340
ccccttaggg ataacagggt aatcgaaaac gccctactgc cctagat 47
<210> 341
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 341
ccccttaggg ataacagggt aatcagtccg cccccttatc atcctctctg 50
<210> 342
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 342
ccccttaggg ataacagggt aatcccaacg tggacatgag gatgcat 47
<210> 343
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 343
ccccttaggg ataacagggt aatctggctt cccaacctga ggttttg 47
<210> 344
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 344
ccccttaggg ataacagggt aatcgacaca ggagaaccca ctgaacgc 48
<210> 345
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 345
ccccttaggg ataacagggt aatctctcca cagtacaatg aggccatg 48
<210> 346
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 346
ccccttaggg ataacagggt aatccgtgca caggggacag aagc 44
<210> 347
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 347
ccccttaggg ataacagggt aatccccagg agctacgcct ctg 43
<210> 348
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 348
ccccttaggg ataacagggt aatcggctgg cattgctctc aacga 45
<210> 349
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 349
ccccttaggg ataacagggt aatccatgac gaggtcaggc tccctaggc 49
<210> 350
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 350
ccccttaggg ataacagggt aatcgtggtg gacttcgcag acca 44
<210> 351
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 351
ccccttaggg ataacagggt aatcgcccag cttaaaacat gagccattca 50
<210> 352
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 352
ccccttaggg ataacagggt aatcgggaga caatggagat ctacctcagt 50
<210> 353
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 353
ccccttaggg ataacagggt aatccccact ggcgtcttca gca 43
<210> 354
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 354
ccccttaggg ataacagggt aatcgccaag ggtgccaaac gttgata 47
<210> 355
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 355
ccccttaggg ataacagggt aatccagcgt ttcaggaagg gagagg 46
<210> 356
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 356
ccccttaggg ataacagggt aatctgtgcc cccatgcatg cc 42
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 357
ccccttaggg ataacagggt aatcgcattg ccctcaacga ccactttt 48
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 358
ccccttaggg ataacagggt aatccttaac tctcacaggg ccatgtagtg 50
<210> 359
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 359
ccccttaggg ataacagggt aatcaggggt ctacatggca actgtg 46
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 360
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtcca taccagggct gacc 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtcag gcaggcgagg aaca 54
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 362
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggtga agaatttcat gctggcacat 60
<210> 363
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 363
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaagac ccagcgaccg actcc 55
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctcctg ctcagctggc tcatgtc 57
<210> 365
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttaaa gatcctccgg ccaccatgtg 60
<210> 366
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 366
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcccct cccctcttca agg 53
<210> 367
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcaaca gcaacaccca ctcttcc 57
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgtgg tgggggctga gc 52
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 369
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctctga ctttgacagt gacacccatt 60
<210> 370
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 370
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggctca ctccttctct tgtaggtact 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgagaga gagtaaggtc aggcatgtgg 60
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcatca cagttaatgt tgcagcggaa 60
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctgga gctgtggggg caa 53
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 374
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcttag cttccgttgg gttgatgagg 60
<210> 375
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 375
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacggt ggacagcagt gca 53
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcatgg aaactgtgag gaggggagt 59
<210> 377
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 377
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtgac accccctcct cca 53
<210> 378
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 378
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagggaa ctggacacgt caggga 56
<210> 379
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 379
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctactttg gtgggcgtat aagcagttt 59
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 380
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagggga gagtctcagt gttgtggag 59
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggctac agcaacaggg tagtagacc 59
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 382
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgcctt gagcttctta ccccagtgag 60
<210> 383
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttccaa ccaaggtacc tgtattggac 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccctgc tcactggaga agttttccg 59
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 385
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcgctc agtaggtgtg caagcag 57
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttctcat ttctggacct aggctgatgg 60
<210> 387
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccacc cttatgaagc ctccttctag 60
<210> 388
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtccac tcacaggggt agaacatgtt 60
<210> 389
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggtgg gggactgagt gtgac 55
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaaca gggtggtgga actcatgt 58
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagtgt ggtaagggac tgagtgcgt 59
<210> 392
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacacat tgctgccatg atctgtcgta 60
<210> 393
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctgaa tggaagcgag tgaagtgagc 60
<210> 394
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggcca ttcacccttg atatcatca 59
<210> 395
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgagc agcggggagg ct 52
<210> 396
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 396
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacccag ctttcagcca gacc 54
<210> 397
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 397
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgggg gactgagcat ggca 54
<210> 398
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 398
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggctgc cattgccctc agt 53
<210> 399
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 399
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<210> 400
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 400
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaaag tccgccccaa ggtcaaaa 58
<210> 401
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 401
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggagga gaacgaggca tgtcttac 58
<210> 402
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 402
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctcggg aggtgggtag tgtatggtt 59
<210> 403
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 403
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccagct tgttgaggac cctaaaggct 60
<210> 404
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 404
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttgacc ccaatgtcct gcatgtacta 60
<210> 405
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 405
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgagaga gctgggttgg ctgacaga 58
<210> 406
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 406
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggtaa caggacacat tggctggga 59
<210> 407
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 407
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccagga gaagtttcca gtggga 56
<210> 408
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 408
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcatc atctgtgaat caaaagtttt 60
<210> 409
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 409
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggccag caaaaccttg acatgtaaac 60
<210> 410
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 410
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacctgg aggcctgact tgcag 55
<210> 411
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 411
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagggtg tatgcgtgct ctctga 56
<210> 412
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 412
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcgtca ccttgaacga ccactttgt 59
<210> 413
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 413
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggggg tctggcatga aaatgtgtta 60
<210> 414
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 414
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacacc cacatatacc tgccaaaaga 60
<210> 415
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 415
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacgccc tactgcccta gattctaatt 60
<210> 416
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 416
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttggggg ctctggggct act 53
<210> 417
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 417
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacgtgg acatgaggat gcattaaagg 60
<210> 418
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 418
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatcccc tcttccccaa gcct 54
<210> 419
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 419
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaaccc actgaacgct tccacttcca 60
<210> 420
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 420
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtaca atgaggccat gcagtttctt 60
<210> 421
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 421
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacaggg gacagaagcc atggg 55
<210> 422
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 422
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctacgc ctctgcccca tacacg 56
<210> 423
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 423
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttggcat tgctctcaac gaccactt 58
<210> 424
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 424
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccctag gcccctccgt cttcag 56
<210> 425
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 425
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggactt cgcagaccac atggc 55
<210> 426
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 426
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcctcg gctggccttt acttg 55
<210> 427
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 427
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggcaaa gtgagactaa tctagctgct 60
<210> 428
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 428
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcttca gcactacgga gaagactgg 59
<210> 429
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 429
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgcca aacgttgata gtgcagga 58
<210> 430
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 430
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgccct gtgctactgg aaggc 55
<210> 431
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 431
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccccca tgcatgcctc actctc 56
<210> 432
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 432
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcaac agggtgatgg acctc 55
<210> 433
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 433
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagggc catgtagtgt cttaaagctg 60
<210> 434
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 434
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaggag gggagattca gtgtggt 57
<210> 435
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 435
ccccttaggg ataacagggt aatcaggtgt gactcctttc ccagatca 48
<210> 436
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 436
ccccttaggg ataacagggt aatcagaagt cctgggtatg gaggctttg 49
<210> 437
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 437
ccccttaggg ataacagggt aatcccacta ggctaagagg tacaccgt 48
<210> 438
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 438
ccccttaggg ataacagggt aatcccagtg gcatcccctt ttgtca 46
<210> 439
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 439
ccccttaggg ataacagggt aatctttggc agcggtgatg aggt 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 440
ccccttaggg ataacagggt aatcgcaagg gtaacacctg agaaggt 47
<210> 441
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 441
ccccttaggg ataacagggt aatctggcag gtgtagcttt ttctgtta 48
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<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 442
ccccttaggg ataacagggt aatcgcggat taaagggaag ggcttcg 47
<210> 443
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 443
ccccttaggg ataacagggt aatcgccgtt accataagtc agcaggt 47
<210> 444
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 444
ccccttaggg ataacagggt aatcacccaa gcggcccttc ct 42
<210> 445
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 445
ccccttaggg ataacagggt aatcctgcac acacattgcc cacttaca 48
<210> 446
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 446
ccccttaggg ataacagggt aatcgtgaag ttggaccagc tgtcataca 49
<210> 447
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 447
ccccttaggg ataacagggt aatctgtgtg tcacatcaat taatttgtgc 50
<210> 448
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 448
ccccttaggg ataacagggt aatcgctctg caagtactga ctgcct 46
<210> 449
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 449
ccccttaggg ataacagggt aatcatgagg ggacaccaga gggaa 45
<210> 450
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 450
ccccttaggg ataacagggt aatcccctct ggagtcccat catcac 46
<210> 451
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 451
ccccttaggg ataacagggt aatctgctgt gtctgctgtc catcc 45
<210> 452
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 452
ccccttaggg ataacagggt aatcgctgct gctggagagc cat 43
<210> 453
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<212> DNA
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 453
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<210> 454
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 454
ccccttaggg ataacagggt aatcgttccg ctacgtcagt tgcca 45
<210> 455
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 455
ccccttaggg ataacagggt aatcggaatg gccacccttc cct 43
<210> 456
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 456
ccccttaggg ataacagggt aatccctcct ggaggtctct ctttaatgc 49
<210> 457
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 457
ccccttaggg ataacagggt aatcgtcatt ctgctgggtg acaatg 46
<210> 458
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 458
ccccttaggg ataacagggt aatctcacac agtggttaag accctttgg 49
<210> 459
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 459
ccccttaggg ataacagggt aatcgtgggc tagaagctaa gaagatcagc 50
<210> 460
<211> 49
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 460
ccccttaggg ataacagggt aatcagtacg atgctgcttc acatggaac 49
<210> 461
<211> 47
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 461
ccccttaggg ataacagggt aatcacgact gttctcactg aggggta 47
<210> 462
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 462
ccccttaggg ataacagggt aatcgggaga cttaccagct tcccgta 47
<210> 463
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 463
ccccttaggg ataacagggt aatctaaggc agtgtgttgg gtgct 45
<210> 464
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 464
ccccttaggg ataacagggt aatcccttcc ttctccaccc aagtagcta 49
<210> 465
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 465
ccccttaggg ataacagggt aatcctcaca ctctaccctt gtgctacg 48
<210> 466
<211> 46
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 466
ccccttaggg ataacagggt aatccaactg ggcatgctct cctagg 46
<210> 467
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 467
ccccttaggg ataacagggt aatcctgtgt ggccctcagg tgtaa 45
<210> 468
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 468
ccccttaggg ataacagggt aatcaccaca cccggctcac tct 43
<210> 469
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 469
ccccttaggg ataacagggt aatcggaggt tgcaggttgc tggt 44
<210> 470
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 470
ccccttaggg ataacagggt aatcggctgg agtcctggtc ctg 43
<210> 471
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 471
ccccttaggg ataacagggt aatcatggtc accgccattc acgt 44
<210> 472
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 472
ccccttaggg ataacagggt aatcctatca ttacccacac ccctgagac 49
<210> 473
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 473
ccccttaggg ataacagggt aatcagctac cacggtgaca gtaacatagc 50
<210> 474
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 474
ccccttaggg ataacagggt aatcagctgc cagcccacaa gaa 43
<210> 475
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 475
ccccttaggg ataacagggt aatcgggaga cagggtatcc aggct 45
<210> 476
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 476
ccccttaggg ataacagggt aatcagttca gggtctggtt ctgtgc 46
<210> 477
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 477
ccccttaggg ataacagggt aatccggcat tcttcccggc aatga 45
<210> 478
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 478
ccccttaggg ataacagggt aatctgactc tcagcacctt gacactcc 48
<210> 479
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 479
ccccttaggg ataacagggt aatcctttat atgtggggga tggaaaagac 50
<210> 480
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 480
ccccttaggg ataacagggt aatccagtgc cttttcctac tacaccaca 49
<210> 481
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 481
ccccttaggg ataacagggt aatccgaagg aaccaaacgg aacttgtgta 50
<210> 482
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 482
ccccttaggg ataacagggt aatcagctca tcgaggcacc aaaca 45
<210> 483
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 483
ccccttaggg ataacagggt aatcatttgt cctggaaccc atactgcat 49
<210> 484
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 484
ccccttaggg ataacagggt aatctgaaag catcaactct gggagcatg 49
<210> 485
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 485
ccccttaggg ataacagggt aatcgccaca gttccagtgc attcg 45
<210> 486
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 486
ccccttaggg ataacagggt aatcggctcc ccagaagaag aagcct 46
<210> 487
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 487
ccccttaggg ataacagggt aatcgcaagt ggtaggcatg ggttagaaga 50
<210> 488
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 488
ccccttaggg ataacagggt aatcgcccgg caatcgtttt ctaggg 46
<210> 489
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 489
ccccttaggg ataacagggt aatcaccccc aggtcagcaa gc 42
<210> 490
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 490
ccccttaggg ataacagggt aatcctgatt agggtggttc gttttgacgt 50
<210> 491
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 491
ccccttaggg ataacagggt aatcgcacga ccgcggcaga gt 42
<210> 492
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 492
ccccttaggg ataacagggt aatcagctgc ttcccaggcc ttg 43
<210> 493
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 493
ccccttaggg ataacagggt aatcaatgca gaggccagga cacc 44
<210> 494
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 494
ccccttaggg ataacagggt aatctcatgt tgtggttgga agtgtggat 49
<210> 495
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 495
ccccttaggg ataacagggt aatctggctg gaagatggac ggaga 45
<210> 496
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 496
ccccttaggg ataacagggt aatccaccag gccactcacc caatt 45
<210> 497
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 497
ccccttaggg ataacagggt aatcgagacc agtgatttca gagtggctag 50
<210> 498
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 498
ccccttaggg ataacagggt aatcaccccg aacttggtga tgcagtac 48
<210> 499
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 499
ccccttaggg ataacagggt aatcgggtgg ctcagaagtg gttcc 45
<210> 500
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 500
ccccttaggg ataacagggt aatcgtaggt gatagggaaa cgccgaaa 48
<210> 501
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 501
ccccttaggg ataacagggt aatctctgca gagcatggag gcaac 45
<210> 502
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 502
ccccttaggg ataacagggt aatcaagtct gaaacgctgc tctgctatt 49
<210> 503
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 503
ccccttaggg ataacagggt aatcgcacca tttccaccca gctttg 46
<210> 504
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 504
ccccttaggg ataacagggt aatccaagta gctaggactc aaggcacatg 50
<210> 505
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 505
ccccttaggg ataacagggt aatcgggggc tgatatgggt caacc 45
<210> 506
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 506
ccccttaggg ataacagggt aatctgcatc gaagctggtg gagac 45
<210> 507
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 507
ccccttaggg ataacagggt aatcccagac cctgactcat ggacacacc 49
<210> 508
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 508
ccccttaggg ataacagggt aatcacgttc ccgtctgctc agtg 44
<210> 509
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 509
ccccttaggg ataacagggt aatcgaggtt ggaccagctg tcatacc 47
<210> 510
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 510
ccccttaggg ataacagggt aatcgctagt ctttccaggc caccct 46
<210> 511
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 511
ccccttaggg ataacagggt aatcttggca agcactcctc aatggc 46
<210> 512
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 512
ccccttaggg ataacagggt aatcgcagag aggaggggct aaaggg 46
<210> 513
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 513
ccccttaggg ataacagggt aatcctccca tccatacccc cacct 45
<210> 514
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 514
ccccttaggg ataacagggt aatcgcccca acccaagcta gtctttc 47
<210> 515
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 515
ccccttaggg ataacagggt aatccctttc ccgttctcca cccaa 45
<210> 516
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 516
ccccttaggg ataacagggt aatcagcagt atgtccaact cccaaattg 49
<210> 517
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 517
ccccttaggg ataacagggt aatcacacag gttttctcct ctcagccta 49
<210> 518
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 518
ccccttaggg ataacagggt aatcaacctg gctccttcgc ttcc 44
<210> 519
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 519
ccccttaggg ataacagggt aatcctctgt ctccacatgc ccagtt 46
<210> 520
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 520
ccccttaggg ataacagggt aatcccaggg ctgggcataa aagtcag 47
<210> 521
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 521
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgact cctttcccag atcagatagc 60
<210> 522
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 522
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctggg tatggaggct ttggcattc 59
<210> 523
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 523
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggctaa gaggtacacc gtaacagaga 60
<210> 524
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 524
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcatg tcatatggct aacaccggtt 60
<210> 525
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 525
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaggtt tctcatcctg catgacgtat 60
<210> 526
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 526
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgtgg ggtaagggga gctg 54
<210> 527
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 527
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagaaca ttctgtcatt ccagtcaga 59
<210> 528
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 528
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagggaa gggcttcgaa tgagaatgct 60
<210> 529
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 529
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagaaa gtcacttcca gcacttgtga 60
<210> 530
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 530
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcctcc aggcttgact tggc 54
<210> 531
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 531
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacccc agaacacgag caact 55
<210> 532
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 532
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgttgga ccagctgtca tacacacaac 60
<210> 533
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 533
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttgtgc acaggtttaa gaaacaaata 60
<210> 534
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 534
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaagt actgactgcc tccccctt 58
<210> 535
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 535
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggaca ccagagggaa gtgagg 56
<210> 536
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 536
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatcacc atctggcatc ccttcac 57
<210> 537
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 537
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgtct gctgtccatc cttcacat 58
<210> 538
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 538
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgctgg agagccatct tgaaactaag 60
<210> 539
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 539
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccagg gcagccttcc ag 52
<210> 540
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 540
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgtcag ttgccacttc tgtatcca 58
<210> 541
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 541
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaccctt ccctccttat cagaaattgc 60
<210> 542
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 542
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcccct tttctcacag tgtgca 56
<210> 543
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 543
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcattct gctgggtgac aatgaaatat 60
<210> 544
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 544
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtggtt aagacccttt ggcatgagag 60
<210> 545
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 545
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagaagc taagaagatc agccagcag 59
<210> 546
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 546
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcacat ggaacccagc aggaatc 57
<210> 547
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 547
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggagg aaagggtgga gctga 55
<210> 548
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 548
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaccagc ttcccgtatc tccct 55
<210> 549
<211> 59
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 549
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctgtt gcagaaggga tagtcagag 59
<210> 550
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 550
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatgtgc cctctgtgtg cctt 54
<210> 551
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 551
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctctac ccttgtgcta cgctgtct 58
<210> 552
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 552
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaagg ggccagaagg tct 53
<210> 553
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 553
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggccct caggtgtaac ttaccctctc 60
<210> 554
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 554
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccacac ccggctcact ctccaatt 58
<210> 555
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 555
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgttgct ggttgctgag atcatgcca 59
<210> 556
<211> 53
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 556
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaatc acgggccctg gga 53
<210> 557
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 557
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccgcca ttcacgtggt gcttactg 58
<210> 558
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 558
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccaca cccctgagac tgcata 56
<210> 559
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 559
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcggtga cagtaacata gcccaggga 59
<210> 560
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 560
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaaatg gggcccttag tcctacaatg 60
<210> 561
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 561
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgagaca gggtatccag gctgcataca 60
<210> 562
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 562
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttcagg gtctggttct gtgcacataa 60
<210> 563
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 563
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggcatt cttcccggca atgaaatcct 60
<210> 564
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 564
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagcac cttgacactc cagatgaact 60
<210> 565
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 565
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatggaa aagacaaccc atcatggtat 60
<210> 566
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 566
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctact acaccacact gatgcctcca 60
<210> 567
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 567
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttctggg tgggagcaga gtactctt 58
<210> 568
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 568
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtggtg attacaaggc cacatcctac 60
<210> 569
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 569
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctgga acccatactg cattaggaag 60
<210> 570
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 570
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcatg aaaaaggctg atgagtggga 60
<210> 571
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 571
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccacag ttccagtgca ttcggaagaa 60
<210> 572
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 572
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcttgc agaaccacga gctga 55
<210> 573
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 573
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcagct gtgcttctaa tgtacaccct 60
<210> 574
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 574
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaatc gttttctagg gcacgactta 60
<210> 575
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 575
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtcagc aagcacttga tcagagcatt 60
<210> 576
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 576
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtggtt cgttttgacg tgtctgtttc 60
<210> 577
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 577
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacgac cgcggcagag ttatcag 57
<210> 578
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 578
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccagg ccttggcaat gagtttagg 59
<210> 579
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 579
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggccag gacaccacca tccc 54
<210> 580
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 580
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgtggt tggaagtgtg gattactggt 60
<210> 581
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 581
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttggacg gagagtggat cacagatgag 60
<210> 582
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 582
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaggc cactcaccca atttgacatg 60
<210> 583
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 583
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttcaga gtggctaggt gttcactgat 60
<210> 584
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 584
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttacggg gagcgggccg ggtt 54
<210> 585
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 585
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctcag aagtggttcc agccaag 57
<210> 586
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 586
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagggaa acgccgaaag tattttaggt 60
<210> 587
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 587
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaact gctccctggt ctctt 55
<210> 588
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 588
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctgtg atcccttcga agaatcttgt 60
<210> 589
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 589
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccacc cagctttgct caagt 55
<210> 590
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 590
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccacca cggccagatc attga 55
<210> 591
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 591
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaactgg gttgccatga atctgctg 58
<210> 592
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 592
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaggg ctgaggtgga aagct 55
<210> 593
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 593
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgacaca ccctccccca tctggca 57
<210> 594
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 594
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttggggt aaaggggact cactct 56
<210> 595
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 595
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagctgc tttactgtca cacgtagcag 60
<210> 596
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 596
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaccc tctccgagcc acct 54
<210> 597
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 597
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccagct tacaggcagg gctgt 55
<210> 598
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 598
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggggca ggaagggaga agcac 55
<210> 599
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 599
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccacc cccaacctga gaagac 56
<210> 600
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 600
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccaag ctagtctttc caggccact 59
<210> 601
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 601
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccgttc tccacccaat agctatgg 58
<210> 602
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 602
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccaac tcccaaattg aaagcacagc 60
<210> 603
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 603
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttccct tccctagacc tgcct 55
<210> 604
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 604
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggctcc ttcgcttcca tctgatcagg 60
<210> 605
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 605
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtctcc acatgcccag tttctattgg 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 606
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttcact agcaacctca aacagacacc 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 607
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 608
ccccttaggg ataacagggt aatcaggagg cagggacgtg aaac 44
<210> 609
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 609
ccccttaggg ataacagggt aatcaggtga ctccctggct ttgc 44
<210> 610
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 610
ccccttaggg ataacagggt aatctgatct gaggggcttg gcaga 45
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 611
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 612
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 613
ccccttaggg ataacagggt aatccagctg gggcgacata gtga 44
<210> 614
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 614
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<210> 615
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 615
ccccttaggg ataacagggt aatcggggag ggacaggttg tgag 44
<210> 616
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 616
ccccttaggg ataacagggt aatctgaatc accaactgcc aaacacgtg 49
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 617
ccccttaggg ataacagggt aatcggcccc cagtgaatca ccaattg 47
<210> 618
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 618
ccccttaggg ataacagggt aatcgcagaa tcaagccaga gcatgc 46
<210> 619
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 619
ccccttaggg ataacagggt aatcagaggt gagggcgagc taga 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 620
ccccttaggg ataacagggt aatctgccag tgatctttcc tttccctctg 50
<210> 621
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 621
ccccttaggg ataacagggt aatccaacag tcggtgtcct gatggt 46
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 622
ccccttaggg ataacagggt aatctcctgt gccatgacct tcacac 46
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 623
ccccttaggg ataacagggt aatcatgggg aggcggcagt ga 42
<210> 624
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 624
ccccttaggg ataacagggt aatcggggct gggcagtcac tc 42
<210> 625
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 625
ccccttaggg ataacagggt aatcccagac tgcgggtatg agagg 45
<210> 626
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 626
ccccttaggg ataacagggt aatcggctcc gacgctccac ag 42
<210> 627
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 627
ccccttaggg ataacagggt aatcccccta gcggcccagg ct 42
<210> 628
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 630
ccccttaggg ataacagggt aatcaggttc ttgcttagag gcatgatgac 50
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcgcccat gctgttctta tagcggta 48
<210> 632
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 632
ccccttaggg ataacagggt aatctgtgca tactcagcta ctgtgctcta 50
<210> 633
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 633
ccccttaggg ataacagggt aatctgcaga tgatctggct gatggac 47
<210> 634
<211> 48
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 634
ccccttaggg ataacagggt aatcccagat tccctgctca gcaaagta 48
<210> 635
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 635
ccccttaggg ataacagggt aatccaacca ctgtgtaata agccgcttgt 50
<210> 636
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 636
ccccttaggg ataacagggt aatcgctaaa cttggcactg gctttcac 48
<210> 637
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 637
ccccttaggg ataacagggt aatcaaaccc cacacaccac acgtat 46
<210> 638
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 638
ccccttaggg ataacagggt aatcggggct cctgagggtg ga 42
<210> 639
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 639
ccccttaggg ataacagggt aatctgtctg cagtcacctg tccac 45
<210> 640
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 640
ccccttaggg ataacagggt aatccactcc caggcgctcg agtt 44
<210> 641
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 641
ccccttaggg ataacagggt aatcggacaa acacccaccc aggt 44
<210> 642
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 642
ccccttaggg ataacagggt aatctttaac cttcttagta gccagggaat 50
<210> 643
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 643
ccccttaggg ataacagggt aatctgcaca tattccacgt gggcata 47
<210> 644
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 644
ccccttaggg ataacagggt aatcccacag acatcagagc agacaca 47
<210> 645
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 645
ccccttaggg ataacagggt aatcacacct ggtgagggca actg 44
<210> 646
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 646
ccccttaggg ataacagggt aatcgaggcc aggtcctaca ttgagc 46
<210> 647
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 647
ccccttaggg ataacagggt aatctctttc tgtcagaggc aatggt 46
<210> 648
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 648
ccccttaggg ataacagggt aatcccctgt ctgccacctg ttgtc 45
<210> 649
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 649
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<210> 650
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 651
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 651
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<210> 652
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 652
ccccttaggg ataacagggt aatcttggac ctcccctgcg tga 43
<210> 653
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcactatg tggactgtgg gactctatga 50
<210> 654
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 654
ccccttaggg ataacagggt aatctttcaa aggggaatgt actaccgt 48
<210> 655
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 655
ccccttaggg ataacagggt aatcggcctg caaccccgct ac 42
<210> 656
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcgctagg ccctggagat gctac 45
<210> 657
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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ccccttaggg ataacagggt aatcagtcca gcgtttgaat cagatcatgg 50
<210> 658
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 658
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<210> 659
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 659
ccccttaggg ataacagggt aatcggattg cagggtatcc acgtctaaat 50
<210> 660
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcgtgtgt ctcacgtggt gggt 44
<210> 661
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 661
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<210> 662
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 662
ccccttaggg ataacagggt aatcagcaag gcgtggctgg tg 42
<210> 663
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatctccagt gccctatcag agtaattcct 50
<210> 664
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 664
ccccttaggg ataacagggt aatcgaggat gtaagtagcg cttgtgaaca 50
<210> 665
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ccccttaggg ataacagggt aatctggaga cagcgtaagt gtccct 46
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 667
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<213> Artificial Sequence
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<400> 667
ccccttaggg ataacagggt aatcggcctt aaaaattgct gcgcagt 47
<210> 668
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<400> 668
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 670
ccccttaggg ataacagggt aatcgcttcc ttagcctgag gtcactaaaa 50
<210> 671
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 671
ccccttaggg ataacagggt aatcaatcca acctaataag cacaggcact 50
<210> 672
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 672
ccccttaggg ataacagggt aatctcctag gcttctttcc tctccca 47
<210> 673
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 673
ccccttaggg ataacagggt aatcggggcc actgagactc ctct 44
<210> 674
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 674
ccccttaggg ataacagggt aatcaccttt ggaacgatgg gggtatttt 49
<210> 675
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 675
ccccttaggg ataacagggt aatcctggag catcgacgag ggtga 45
<210> 676
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 676
ccccttaggg ataacagggt aatcggagca tcgacgaggg tgag 44
<210> 677
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 677
ccccttaggg ataacagggt aatcgcctgc attcattcgt ccacaatac 49
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<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 678
ccccttaggg ataacagggt aatcagatgc tgagagttta ccccctctac 50
<210> 679
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 679
ccccttaggg ataacagggt aatctttttc tccccaaacg tgagaaga 48
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 680
ccccttaggg ataacagggt aatcactgtt ggggtgacta actgt 45
<210> 681
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 681
ccccttaggg ataacagggt aatcttgcta acagtggtga gttgtaata 49
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 682
ccccttaggg ataacagggt aatcagttcc tgatccggct ctgga 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 683
ccccttaggg ataacagggt aatccgagag gctccaggac catgact 47
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 684
ccccttaggg ataacagggt aatcgggctg gcggggtggg aa 42
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 685
ccccttaggg ataacagggt aatcgtgctg gctgaattaa taggaggca 49
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 686
ccccttaggg ataacagggt aatccaaggt ctttcaactt gggccagat 49
<210> 687
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 687
ccccttaggg ataacagggt aatcccttgg gtcctgtcct ggca 44
<210> 688
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 688
ccccttaggg ataacagggt aatccggggt tcactggccc aga 43
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 689
ccccttaggg ataacagggt aatcaaggga gcggggatta tggc 44
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 690
ccccttaggg ataacagggt aatcgatcat gcaccccgtc ctgac 45
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatccagacc tgccgtggac ctt 43
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcagccgg cgctaagagc ag 42
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<213> Artificial Sequence
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ccccttaggg ataacagggt aatcgcctgg atcccaccct tgc 43
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcctggtc ccgccgcagc ct 42
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<211> 48
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcgccctg gctatttgca aactgcat 48
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcacagag atgcagatag ccaggttaga 50
<210> 697
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcgggtgg aaggtccctc cag 43
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 698
ccccttaggg ataacagggt aatcagtgga gaaggcggca ctc 43
<210> 699
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 699
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagtca ccacactggg taactcct 58
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 700
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgaaa cgctggggtg caatttc 57
<210> 701
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 701
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcctct tcccccaagc tggctt 56
<210> 702
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggcaga gaggcacccc aa 52
<210> 703
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgtctg gtccagtcag ccttgc 56
<210> 704
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgggtg tgtgggtgac aagcg 55
<210> 705
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggggag ttaatgtaag ggaggcaaca 60
<210> 706
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgagccc accactcagc ttt 53
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<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 707
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgggct tggagttaag gggccta 57
<210> 708
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 708
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaact gccaaacacg tgaatgaggt 60
<210> 709
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 709
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatgagg tcatctgagg ccatccc 57
<210> 710
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagccag agcatgccaa gca 53
<210> 711
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgagct agagtagaag gtgccccat 59
<210> 712
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 712
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctctg atgtgtcgat gccagcctt 59
<210> 713
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 713
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtcgg tgtcctgatg gtagaaaac 59
<210> 714
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 714
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagccag tgatgaaagg tgcctcaa 58
<210> 715
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 715
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcaca ggagagggcc tctg 54
<210> 716
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 716
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccccc agctcccaaa tcaatcaa 58
<210> 717
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 717
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggcagc ctttcctttt cacagatg 58
<210> 718
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 718
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccgacg ctccacagcc tgtc 54
<210> 719
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 719
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcggccc aggctcggac tg 52
<210> 720
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 720
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggctc tagcagtccc agtaataagt 60
<210> 721
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 721
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatgcta cacatacttc accttaaggg 60
<210> 722
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 722
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaactg tggagactga ctggct 56
<210> 723
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 723
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggagc catacctgag aaggaga 57
<210> 724
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 724
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgagct tgaggatctg tcaggcaa 58
<210> 725
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 725
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatgatc tggctgatgg accaaacatc 60
<210> 726
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 726
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacagcg gctgttgctc ttcc 54
<210> 727
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 727
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccgctt gtacaacggt ctttcctcaa 60
<210> 728
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 728
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatttgc agcttcctct acacttcctg 60
<210> 729
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 729
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacacc acacacgtca cagaaacc 58
<210> 730
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 730
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagaagg ggtgggaggc caa 53
<210> 731
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 731
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcacct gtccactcac agcac 55
<210> 732
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 732
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcgctc gagttacagg gccact 56
<210> 733
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 733
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggtga tgtgatcttc ctgcttgctc 60
<210> 734
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 734
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcatt acacaacccc tagaaagtc 59
<210> 735
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 735
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcactgt gtcatattgc ctgcatgtct 60
<210> 736
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 736
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccccca gccctagtcc aca 53
<210> 737
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 737
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgagg gcaactgaca aaagcaatt 59
<210> 738
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 738
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggccag gtcctacatt gagcaatcat 60
<210> 739
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 739
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggcaat ggtgtccact ttgga 55
<210> 740
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 740
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctgtc tgccacctgt tgtcattaac 60
<210> 741
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 741
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctctt ctcaatccca gtgcctactc 60
<210> 742
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 742
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgaca gcaatgactc actccccttg 60
<210> 743
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 743
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgaatc aggaggggct atgtagttct 60
<210> 744
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 744
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacctcc cctgcgtgaa actgttcta 59
<210> 745
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 745
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttggact gtgggactct atgaatgtgg 60
<210> 746
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 746
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagggga atgtactacc gtcacttt 58
<210> 747
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 747
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgcaac cccgctactt cctcct 56
<210> 748
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 748
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaggga tcaggccagg taaaaca 57
<210> 749
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 749
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcatgga agatggctct agaggaagct 60
<210> 750
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 750
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgggca ctgagagcac catcatgg 58
<210> 751
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 751
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatgcat gaaggccagc acaatggg 58
<210> 752
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 752
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacgtg gtgggtgatt tttattccag 60
<210> 753
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 753
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggggc tgcctgtgtg tta 53
<210> 754
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 754
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcatggg caagagcatg ctggta 56
<210> 755
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 755
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcatagc ttctttgctg gccgacca 58
<210> 756
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 756
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacagc cccaggtcct ttgcg 55
<210> 757
<211> 54
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 757
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtgtc cctgtcctca cgct 54
<210> 758
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 758
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcactgc ctagagccta tattgcaaag 60
<210> 759
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 759
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttaaa aattgctgcg cagtggctgt 60
<210> 760
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 760
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctcaa gacaggccaa ggacttagaa 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 761
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctgct cccttcccct ccac 54
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 762
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaggtc actaaaaatg gccagtctgc 60
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctactgag tgctggcatc aggattc 57
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccagta gcctgtagtc agaaagagtg 60
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 765
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctcctc ttaggacaac cgaccatcct 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 766
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacctct tgtttctcaa aacgctgtcg 60
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcatcga cgagggtgag cgcatg 56
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcgacg agggtgagcg catg 54
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccccct ctacctccca cctt 54
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgactaa ctgtcatggt tttcccacg 59
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaacagt ggtgagttgt aatactagct 60
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcgctg cacggcctcc ac 52
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggtgg gaagggaggg tcag 54
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaatagg aggcacatct catccattgc 60
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgagcac tgcaggacgt tcagca 56
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgctat gagctgcccc tgggt 55
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttcact ggcccagagc tgtgc 55
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggacc agggtcatga ctagctaaa 59
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<213> Artificial Sequence
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtcctg accctgacgc tgcac 55
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccgtg gaccttggct tcc 53
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggcgct aagagcagct gacc 54
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgtgg cacagtgagg ggtgt 55
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccgccg cagcctcgca ga 52
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 787
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatgctg tcccagttct ctcaccact 59
<210> 788
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggcagg gataggtgag cttcaaa 57
<210> 789
<211> 53
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccctgg ctctgggaca cct 53
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctactctg gtggggctgc tcca 54
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 793
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcctatca ttgtagatgg ggccggaaa 49
<210> 794
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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ccccttaggg ataacagggt aatccaactc cagggctcaa gcaatcg 47
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcgcagac atttgaccac cctataccc 49
<210> 797
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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ccccttaggg ataacagggt aatcgcagta gggaaggggc aact 44
<210> 798
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 798
ccccttaggg ataacagggt aatcgtcttt ctctggcacc aagcttttg 49
<210> 799
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<210> 800
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 800
ccccttaggg ataacagggt aatcctgggc cacctggtgt cg 42
<210> 801
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 801
ccccttaggg ataacagggt aatcccttgg gccagtcact gca 43
<210> 802
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 802
ccccttaggg ataacagggt aatctgacca catgtccacc gttcag 46
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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ccccttaggg ataacagggt aatcagcttg ggaggctggt actactg 47
<210> 804
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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ccccttaggg ataacagggt aatccccaga cactgcttcc ctggta 46
<210> 805
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 805
ccccttaggg ataacagggt aatcttcctc ctgccagggt gca 43
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<210> 807
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ccccttaggg ataacagggt aatcacataa gcgaaggatc aggagagt 48
<210> 810
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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ccccttaggg ataacagggt aatctctaga gaacatccgg caatgcc 47
<210> 811
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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oligonucleotide
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ccccttaggg ataacagggt aatcccttag gccaaacatc cttgaccata 50
<210> 812
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<213> Artificial Sequence
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<210> 813
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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ccccttaggg ataacagggt aatccctgaa aaacggatga gacttcag 48
<210> 814
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 814
ccccttaggg ataacagggt aatcattgtg cttcagatcc cgtgacat 48
<210> 815
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 815
ccccttaggg ataacagggt aatcgtgggg acttgctgct ggt 43
<210> 816
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 816
ccccttaggg ataacagggt aatcagctct gctacattca ggtaacat 48
<210> 817
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 817
ccccttaggg ataacagggt aatctccctc tttagcatcg ccaaatcc 48
<210> 818
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 818
ccccttaggg ataacagggt aatcttggtg gccacaactt aggtgaga 48
<210> 819
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 819
ccccttaggg ataacagggt aatccccagg tgttgctcat cagttcctct 50
<210> 820
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 820
ccccttaggg ataacagggt aatcatcact ttctcaaggg acatgccat 49
<210> 821
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 821
ccccttaggg ataacagggt aatcgtctca caactcccag tcttgcttta 50
<210> 822
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 822
ccccttaggg ataacagggt aatcaactgg gctcgttggt taccct 46
<210> 823
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 823
ccccttaggg ataacagggt aatctttggt ttggttgctt tgcagactac 50
<210> 824
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 824
ccccttaggg ataacagggt aatccttttc tgctgtcacc ctcaaggat 49
<210> 825
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 825
ccccttaggg ataacagggt aatcgagtga atgcatgatt gtgtgaccga 50
<210> 826
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 826
ccccttaggg ataacagggt aatctgctag tgtcgaggtt tgca 44
<210> 827
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 827
ccccttaggg ataacagggt aatcgtggag aaagtgctaa acaagaaaa 49
<210> 828
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 828
ccccttaggg ataacagggt aatcctccag agtctatgct caactgaa 48
<210> 829
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 829
ccccttaggg ataacagggt aatcatggcc ataagttgaa atttgcgt 48
<210> 830
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 830
ccccttaggg ataacagggt aatcgggacc tcaggtgctg ctt 43
<210> 831
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 831
ccccttaggg ataacagggt aatctgattc aatcttacat gcgacagcct 50
<210> 832
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 832
ccccttaggg ataacagggt aatcagagaa gcctgtcagg accat 45
<210> 833
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 833
ccccttaggg ataacagggt aatctcaccg tctacttctc ttgtgtg 47
<210> 834
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 834
ccccttaggg ataacagggt aatcccacat gcaaatgaac gacactgac 49
<210> 835
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 835
ccccttaggg ataacagggt aatcgcagca atttggtccc ccatgg 46
<210> 836
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 836
ccccttaggg ataacagggt aatctcagac cgtgactcag tatgttg 47
<210> 837
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 837
ccccttaggg ataacagggt aatcaggccc ctgtctctac catcc 45
<210> 838
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 838
ccccttaggg ataacagggt aatcgtggag aaggcagcct cccaa 45
<210> 839
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 839
ccccttaggg ataacagggt aatctgcctg gagtggtgtc tggt 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 840
ccccttaggg ataacagggt aatcacagac ctcagagccc agtcc 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 841
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 842
ccccttaggg ataacagggt aatccccctg tttttacctc aaccttaggg 50
<210> 843
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 843
ccccttaggg ataacagggt aatctcactg ctgcccccac aag 43
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 844
ccccttaggg ataacagggt aatcggccag gccggagtca gg 42
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 845
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 846
ccccttaggg ataacagggt aatctggaac tgtgggcata agcatatgtc 50
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 847
ccccttaggg ataacagggt aatcacaggt ttcaggcgga gtgga 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 848
ccccttaggg ataacagggt aatcaggagg aattaaccct gtgaacatcg 50
<210> 849
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 849
ccccttaggg ataacagggt aatctttcac aagaacggta ctggccaat 49
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 850
ccccttaggg ataacagggt aatcataaga ggtgaactag caagcagagc 50
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcagagtg taagctcacc ctacagtct 49
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcgaggta gggttcttcg tgttggc 47
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatccctaag tggagttgac ctgtacaagg 50
<210> 855
<211> 49
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatccttcag ccactccctt atgaggtag 49
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<210> 860
<211> 47
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<213> Artificial Sequence
<220>
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ccccttaggg ataacagggt aatctccttc cacggagttc actgagt 47
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<220>
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ccccttaggg ataacagggt aatcagcttt ggcccctagg attctg 46
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcctctgg gtgcggggga act 43
<210> 863
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ccccttaggg ataacagggt aatctccagt gatctagtaa ctccgtggt 49
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcatggtc caaggtcagc tggcggaca 49
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 866
ccccttaggg ataacagggt aatcaggacc caccacggat tcct 44
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcactgcc tcctccttag tcgat 45
<210> 868
<211> 48
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 868
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcttctgg aaattcgtcg aaggatggtc 50
<210> 871
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcagctgt gctcttccgt ttcagtg 47
<210> 872
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcccacga ggcgtattca tctgcat 47
<210> 873
<211> 49
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatcaatgga accacactac atcaagtta 49
<210> 874
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<213> Artificial Sequence
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ccccttaggg ataacagggt aatccctgac cctgccgtgt accag 45
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ccccttaggg ataacagggt aatccctgcg aaggcaccaa agc 43
<210> 876
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 876
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggctca gggtcgaagg ctcact 56
<210> 877
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcaaac catcggggga aaaatgacaa 60
<210> 878
<211> 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtagat ggggccggaa agtagaaaag 60
<210> 879
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 879
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccagc tccaagtcca tctgg 55
<210> 880
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctacc aagccccacc ct 52
<210> 881
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaccct atacccacca tactcacgtt 60
<210> 882
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 882
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagggaa ggggcaactt ttcaaaatct 60
<210> 883
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 883
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcacca agcttttgtg atgctccaac 60
<210> 884
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 884
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacctg caggaaacgg ttgcgttc 58
<210> 885
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctggg ccgcctgatc tacc 54
<210> 886
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 886
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccagt cactgcagct ctct 54
<210> 887
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 887
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacatgt ccaccgttca gacacagc 58
<210> 888
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 888
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggagg ctggtactac tgggcatc 58
<210> 889
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 889
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagacac tgcttccctg gtaatggac 59
<210> 890
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 890
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctgcc agggtgcaag aact 54
<210> 891
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 891
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccatga atgttgtggc gcattttcat 60
<210> 892
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 892
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgctgt gggctccttt gctt 54
<210> 893
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 893
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaaagg acctacatgt ggctccaatt 60
<210> 894
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 894
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcgaag gatcaggaga gtactattag 60
<210> 895
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 895
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggggt gggagagtgc tact 54
<210> 896
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 896
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgtatg ttggttatgc gggaagagac 60
<210> 897
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 897
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttggatt tccaaagaga agccctagtc 60
<210> 898
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 898
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacggat gagacttcag tgagtac 57
<210> 899
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 899
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgcttc agatcccgtg acatcagtgt 60
<210> 900
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 900
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtggg gacttgctgc tggtatctac 60
<210> 901
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 901
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctaca ttcaggtaac atgtttctgc 60
<210> 902
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 902
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccaaa tcctcccagg tgca 54
<210> 903
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 903
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggccac aacttaggtg agagtgacga 60
<210> 904
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 904
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctctg aactaagtgg gagtttggc 59
<210> 905
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 905
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgccat ttctctaatc aaggggtgtg 60
<210> 906
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 906
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcccag tcttgcttta tactgtgcct 60
<210> 907
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 907
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgggc tcgttggtta ccctattcct 60
<210> 908
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 908
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaggag ctaccagggc ccta 54
<210> 909
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 909
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacctca tcatttctca ggcgaaagg 59
<210> 910
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 910
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcatga ttgtgtgacc gaatgcctca 60
<210> 911
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 911
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtttg caccatagaa agctgag 57
<210> 912
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 912
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtaaa ccagaactat ctttctctcc 60
<210> 913
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 913
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaactt gaaatgctta cagccagaat 60
<210> 914
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 914
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccataa gttgaaattt gcgtttcggt 60
<210> 915
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 915
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctcag gtgctgcttc ctcaa 55
<210> 916
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 916
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcatgcg acagcctgat ccgtttct 58
<210> 917
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 917
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcctgt caggaccata caaatcttac 60
<210> 918
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 918
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttctct tgtgtgatcc agagttgaca 60
<210> 919
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 919
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaacgac actgacagaa aacactcacg 60
<210> 920
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 920
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcaat ttggtccccc atggagagac 60
<210> 921
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 921
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaaact tgactgttca ttgggttcaa 60
<210> 922
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 922
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccctg tctctaccat cctagacacc 60
<210> 923
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 923
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagaagg cagcctccca aagcact 57
<210> 924
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 924
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcctgg agtggtgtct ggtacaatga 60
<210> 925
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 925
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtccct ggccttaaag aaatgacaga 60
<210> 926
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 926
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcctt gattactgtt cccactagc 59
<210> 927
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 927
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggctt ccttgctttg gttactgt 58
<210> 928
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 928
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcactgc tgcccccaca agcttaac 58
<210> 929
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 929
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccgga gtcaggggca tc 52
<210> 930
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 930
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatggca atccgttgga aatgtcttct 60
<210> 931
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 931
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcccata ccccactccc actact 56
<210> 932
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 932
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaggtt tcaggcggag tggaagaagt 60
<210> 933
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 933
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaccct gtgaacatcg tgattccag 59
<210> 934
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 934
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcggtac tggccaatga aattttccca 60
<210> 935
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 935
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttggct ctctggattg ttcctctaaa 60
<210> 936
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 936
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaccct acagtctatg ttccaggtca 60
<210> 937
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 937
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccagac taaggcaagc aactgtaaca 60
<210> 938
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 938
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttcgt gttggccagg tgggt 55
<210> 939
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 939
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgaagc tgagttacct gggagctc 58
<210> 940
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 940
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttacg ggaaagcaag ttgactttgc 60
<210> 941
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 941
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacaaaa caaaaccctc cggatggtct 60
<210> 942
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 942
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgctcc tgtctgcctg attacttact 60
<210> 943
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 943
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtcat gcctccaacc tgca 54
<210> 944
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 944
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttgcgt tgacttaaat gaaagtgtcc 60
<210> 945
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 945
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctactgtc gggagaaggc gtct 54
<210> 946
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 946
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgatct gtttgtgaat ggctcagaca 60
<210> 947
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 947
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctactctg ggtgcggggg aacttatttg 60
<210> 948
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 948
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccgtgg tggatttaac tcccctattg 60
<210> 949
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 949
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcatt ctgcctctga cagg 54
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 950
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccaag gtcagctggc ggaca 55
<210> 951
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 951
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacggat tcctgctgta ctggctaaag 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 952
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 953
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaacaag tgtccctggc aaatgtga 58
<210> 954
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 954
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggggc taaccattgg caattgaa 58
<210> 955
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 955
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttcgtc gaaggatggt ctctctgttg 60
<210> 956
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 956
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgtgct cttccgtttc agtgtgaaaa 60
<210> 957
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 957
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatctgc atgcatgagt cctgacttc 59
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 958
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatcaag ttacatagaa atggggaggt 60
<210> 959
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 959
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctgcc gtgtaccagc tgagagac 58
<210> 960
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 960
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctgtt gttgaaggcg tttgca 56
<210> 961
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 961
gaccccctcc accccgcctc cgg 23
<210> 962
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 962
ctacccctcc accccgcctc cgg 23
<210> 963
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 963
attccccccc accccgcctc agg 23
<210> 964
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 964
gggcccctcc accccgcctc tgg 23
<210> 965
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 965
gacccccttc accccaccta tgg 23
<210> 966
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 966
taccccccac accccgcctc tgg 23
<210> 967
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 967
gcccccaccc accccgcctc tgg 23
<210> 968
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 968
tgcccccccc accccacctc tgg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 969
acaccccccc accccgcctc agg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 970
ctcccccccc tccccgcctc ggg 23
<210> 971
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 971
tgcccctccc accccgcctc tgg 23
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 972
cgccctcccc accccgcctc cgg 23
<210> 973
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 973
agcccccccc accccgactc agg 23
<210> 974
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 974
gccccccacc accccacctc ggg 23
<210> 975
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 975
gacacacccc accccacctc agg 23
<210> 976
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 976
ggccctctcc actccacctc agg 23
<210> 977
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 977
cccccccccc cccccgcctc cgg 23
<210> 978
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 978
tcccccctca accccacctc agg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 979
ctgccccccc accccgccac tgg 23
<210> 980
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 980
tgcccccccc accccgcccc cgg 23
<210> 981
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 981
gtcctccacc accccgcctc tgg 23
<210> 982
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 982
gccacccacc accccacctc agg 23
<210> 983
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 983
tacccccccc accccgccac agg 23
<210> 984
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 984
ctccccaccc accccgcctc agg 23
<210> 985
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 985
caaccccccc accccgcttc agg 23
<210> 986
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 986
gcttccctcc accccgcatc cgg 23
<210> 987
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 987
gtcactcccc accccgcctc tgg 23
<210> 988
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 988
atccccctcc accccacccc tgg 23
<210> 989
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 989
gacccccccc accccgcccc cgg 23
<210> 990
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 990
gccaccttcc accccacctc agg 23
<210> 991
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 991
cactcccccc accccgcccc agg 23
<210> 992
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 992
gacccctccc accccgactc cgg 23
<210> 993
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 993
cccccccccc cccccgcctc agg 23
<210> 994
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 994
gcctctctgc accccgcctc agg 23
<210> 995
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 995
cccccccccc accccgcccc cgg 23
<210> 996
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 996
ctctcccccc accccgcctc tgg 23
<210> 997
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 997
ccccaccccc accccgcctc agg 23
<210> 998
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 998
gacccccccc accccacccc agg 23
<210> 999
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 999
ccaccccccc accccgcccc agg 23
<210> 1000
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1000
aggccccccc gccccgcctc agg 23
<210> 1001
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1001
cccccccccc cccccacccc cag 23
<210> 1002
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1002
gatcgactcc accccgcctc tgg 23
<210> 1003
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1003
agccaacccc accccgcctc tgg 23
<210> 1004
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1004
tccacccccc accccgcccc ggg 23
<210> 1005
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1005
caccccccgc accccgcccc agg 23
<210> 1006
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1006
cctcccccac accccgcatc cgg 23
<210> 1007
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1007
ggcagcctcc accacgcctc cgg 23
<210> 1008
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1008
catccccccc accccacccc ggg 23
<210> 1009
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1009
ccaccccccc accccgcccc tgg 23
<210> 1010
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1010
aggcccccac accccgcctc agg 23
<210> 1011
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1011
gtaccccacc accccgcccc agg 23
<210> 1012
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1012
catacccccc accccgcccc ggg 23
<210> 1013
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1013
ccgcccctcc accccgccac tgg 23
<210> 1014
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1014
agtagccccc accccgcctc ggg 23
<210> 1015
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1015
accccccccc cccccgcccc cgg 23
<210> 1016
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1016
gccccgctcc tccccgcctc cgg 23
<210> 1017
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1017
ccacccctcc accctgcttc ggg 23
<210> 1018
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1018
catttcccct accccgcccc tgg 23
<210> 1019
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1019
aacacgcccc accccgcccc agg 23
<210> 1020
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1020
gagccactgt gcccagccta ggg 23
<210> 1021
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1021
cactccccac cccccacccc cag 23
<210> 1022
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1022
ccctcccccc accccacaac agg 23
<210> 1023
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1023
gtccctttcc accctgcctc tgg 23
<210> 1024
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1024
gagctccccc accccgcccc ggg 23
<210> 1025
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1025
aacacccgcc cccccacccc cgg 23
<210> 1026
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1026
gattccctgg accacatctc tgg 23
<210> 1027
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1027
gagccaccaa acccagcctc agg 23
<210> 1028
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1028
gaatcccagg agcccgcctc gag 23
<210> 1029
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1029
ggcccccttt cccacatctc tgg 23
<210> 1030
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1030
ctcccccagc cccccacctc ccg 23
<210> 1031
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1031
cattctcgac accccgcccc cgg 23
<210> 1032
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1032
tactccttca cccccacccc agg 23
<210> 1033
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1033
cacactctca acctcacttc tag 23
<210> 1034
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1034
tccatcctca gccccacctc tcg 23
<210> 1035
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1035
aacccattcc accctgcctc agg 23
<210> 1036
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1036
gccacccccc accctgcctc cgg 23
<210> 1037
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1037
caccaggtct gccccgcatc agg 23
<210> 1038
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1038
aatcctctca cctcagcctc cgg 23
<210> 1039
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1039
gtgccactcc accccaccct ggg 23
<210> 1040
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1040
ccccccggcc cccccacccc agg 23
<210> 1041
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1041
caccccccgc cccccgcccc cgg 23
<210> 1042
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1042
ctcaccataa actccgcctc ccg 23
<210> 1043
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1043
gagccactgc acccagcctc aag 23
<210> 1044
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1044
gagccaccac aaccagcctc gag 23
<210> 1045
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1045
gtttcccttc ttcccgcccc agg 23
<210> 1046
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1046
cccccacccc cccccacccc cag 23
<210> 1047
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1047
atcctcccac accccacatc aga 23
<210> 1048
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1048
caccgcgccc agccagcttc tgg 23
<210> 1049
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1049
gagccacctc acccagccta aag 23
<210> 1050
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1050
gagccaccac acccagccta aag 23
<210> 1051
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1051
gagccactgc gcccagcccc agg 23
<210> 1052
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1052
gaaccagacc tccccatctc cag 23
<210> 1053
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1053
gagccactgc acctggcctc agg 23
<210> 1054
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1054
gcacaccacc cccccgccac cgg 23
<210> 1055
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1055
tgtgaaaact aagagagagc tccacccctc tgtgccctcc tcctgtcctg agtcggggtg 60
gggggggctg gccttggagg gggcgtcccc t 91
<210> 1056
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 1056
ggccacgtcg cccgtgtatg agatggcagc ctccaccacg cctccggcac ttcctgccgc 60
ctccatgccc agcagcatgt tgggcaagta gttgagggag 100
<210> 1057
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 1057
Ala Val Asp Gly Thr Tyr Ser Ile Ala Ala Glu Val Val Gly Gly Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ala Ala Glu Met Gly Leu Leu Met Asn Pro Leu Tyr Asn Leu
20 25 30
Ser
<210> 1058
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1058
ccacccacca ccccacctca ggcaaatgcc cagcccctgc ctcgcctcca gcctcctttc 60
cacaacccag catccagtca ctccagtc 88
<210> 1059
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1059
gccccgggtt tcaagtgatt ttcatacttc agcctcctga gtagct 46
<210> 1060
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1060
agccccagca agagcacaag agg 23
<210> 1061
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1061
atcaccccca agagcacaag ggg 23
<210> 1062
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1062
agccccagtg agagcacaag agg 23
<210> 1063
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1063
agttccagca acagcacaaa agg 23
<210> 1064
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1064
aactccagcg agagcacaag agg 23
<210> 1065
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1065
agccccagta agagcacaag agg 23
<210> 1066
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1066
aacacaagca agagcacgag agg 23
<210> 1067
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1067
agccccagca agagcacgag agg 23
<210> 1068
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1068
agcctaagaa agaacacaag agg 23
<210> 1069
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1069
agccccagct aaagcaaaag agg 23
<210> 1070
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1070
tgccccagct aaaacacaag tgg 23
<210> 1071
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1071
aaaccaaaca aggacacaag aga 23
<210> 1072
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1072
aatcccagtg agagcacaag agg 23
<210> 1073
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1073
acccctagct acagcacaag agg 23
<210> 1074
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1074
tgcagcagca agagcacagg cgg 23
<210> 1075
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1075
cacaagagca agagcacaag agg 23
<210> 1076
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1076
gctctcagca agaccacaag tgg 23
<210> 1077
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1077
tgccccaaga acaacaaaaa aag 23
<210> 1078
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1078
tgcctcagtc aaagcacagc agg 23
<210> 1079
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1079
aaaaccaaca acagtacaaa agg 23
<210> 1080
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1080
cactccagcc tgggcaaaag agg 23
<210> 1081
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1081
attctgagga agaaaacaag ggg 23
<210> 1082
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1082
tccccctacc agagcacata cag 23
<210> 1083
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1083
aggcaaatca aaaccacaat gag 23
<210> 1084
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1084
aaaacaagaa agaacaaaag aga 23
<210> 1085
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1085
cttgccccac agggcagtaa cgg 23
<210> 1086
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1086
cttggcctgc agggcagtta tgg 23
<210> 1087
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1087
tctaccccac atggcagtaa tgg 23
<210> 1088
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1088
actgagcctc agggcagtaa tgg 23
<210> 1089
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1089
cctgccccac agggcaatta tgg 23
<210> 1090
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1090
cctctcccac agggcagtaa agg 23
<210> 1091
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1091
gctgccccac agggcagcaa agg 23
<210> 1092
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1092
cctccaatac agggcagtaa agg 23
<210> 1093
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1093
cctgtcccac agggcaggaa ggg 23
<210> 1094
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1094
ctggcaccac agagcagaaa ggg 23
<210> 1095
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1095
catgctccac agagcagcaa agg 23
<210> 1096
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1096
gggctgcccc agggcagtaa tgg 23
<210> 1097
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1097
cttgctgcac aggacaataa agg 23
<210> 1098
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1098
ctcgcccctc agggcagtag tgg 23
<210> 1099
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1099
gttggccctc agggcagaaa tgg 23
<210> 1100
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1100
gaggcgccac agggcagtaa tgg 23
<210> 1101
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1101
gctgtgtcat agggcagtaa cgg 23
<210> 1102
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1102
ctttcttcac agggtagtaa tgg 23
<210> 1103
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1103
tgccccagac agggcagtaa ggg 23
<210> 1104
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1104
cttgcactac aagtcagtaa tgg 23
<210> 1105
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1105
atttcctcac agggcagaaa agg 23
<210> 1106
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1106
tcacccccac aggccagtaa agg 23
<210> 1107
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1107
gtcatgtcac agggcagtag tgg 23
<210> 1108
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1108
ggccctgccc agggcagtaa tgg 23
<210> 1109
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1109
cttaatacac agggaaggaa tgg 23
<210> 1110
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1110
cttcaagagc aacagtgctg tgg 23
<210> 1111
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1111
gagagacagc aacagtgcta tgg 23
<210> 1112
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1112
agcaaggagc aacagtgatg tgg 23
<210> 1113
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1113
agcaaacatc aacagtgctg agg 23
<210> 1114
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1114
taggaagagc aacagggctg tgg 23
<210> 1115
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1115
catgaagggc aacagagctg agg 23
<210> 1116
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1116
cactctaagc aacagtgctg ggg 23
<210> 1117
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1117
tgcgaggagc aacagtgctt ggg 23
<210> 1118
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1118
gtctctaggc aacagtgctg agg 23
<210> 1119
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1119
gggcagcagc tacagtgctg agg 23
<210> 1120
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1120
gggcggtgct acaactgggc tgg 23
<210> 1121
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1121
gggtggttct acaaccaggc tgg 23
<210> 1122
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1122
gggcggtgct acaactgggc tgg 23
<210> 1123
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1123
gggaggtgcc acatcagggc cgg 23
<210> 1124
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1124
gggcagtgat ccaactgtgc agg 23
<210> 1125
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1125
agctggggct acatctgggc tgg 23
<210> 1126
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1126
gctgggtgct acaacagggc agg 23
<210> 1127
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1127
ctgtggtgca acaactgggc tgg 23
<210> 1128
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1128
gggaggaggt acaactggga ggg 23
<210> 1129
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1129
cagtgtggct acaactgcgc agg 23
<210> 1130
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1130
ctggtcagct acaactggcc tgg 23
<210> 1131
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1131
ggtgtaaaat caacacccta agg 23
<210> 1132
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1132
gctggaaaaa aaacacccta ggg 23
<210> 1133
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1133
gaggtaaaac caacacctta agg 23
<210> 1134
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1134
tggctgaaat caacacccca ggg 23
<210> 1135
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1135
tgacaccaat caacacctta agg 23
<210> 1136
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1136
tctgatccat caacacccta tgg 23
Claims (81)
- 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하는 방법에 있어서,
상기 방법은,
범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플과 접촉시켜 결합 생성물을 생성하는 단계로서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성되는 단계 (a);
제1 표적-특이적 프라이머 및 선택적으로 제1 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 제1 PCR을 수행하여 결합 생성물을 증폭하여 제1 PCR 생성물을 형성하는 단계 (b); 및
제2 표적-특이적 프라이머 및 제2 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 생성물을 증폭하여 제2 PCR 생성물을 형성하는 단계로서, 상기 제2 표적-특이적 프라이머는 상기 제1 표적-특이적 프라이머에 상대적으로 중첩되는 단계 (c)를 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
단계 (a) 전에, 상기 방법은 상기 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단을 차단하는 단계; 상기 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단을 인산화하는 단계; 또는 핵산을 아데닐화하여 상기 단일 가닥 핵산 단편에 3'-아데노신 돌출부를 생성하는 단계 중 적어도 한 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제1 PCR은 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 얻기 위해 제1 표적-특이적 프라이머로 결합 생성물을 선형 증폭하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서,
단계 (c)는 초기 프라이머 연장 듀플렉스의 중첩 증폭을 수행하는 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제1 PCR은 상기 제1 표적-특이적 프라이머 및 상기 제1 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머를 사용하여 상기 표적 핵산을 기하급수적으로 증폭하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는, 상기 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된 3' 열성 말단; 및/또는 랜덤 또는 퇴행성 뉴클레오티드의 3~20개의 염기를 포함하는 5' 돌출 말단을 포함하고, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터의 듀플렉스 부분은 단계 (a)에서 듀플렉스 형태를 유지하기에 충분한 길이를 갖는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 듀플렉스 형태의 일부를 연결하는 헤어핀 루프를 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 개별 원본 분자를 추적하기 위한 고유 분자 인덱스(UMI)로서 3~20개의 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 단편으로 구성되는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 시퀀싱 특이적 어댑터 쌍이 있는 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 방법은 단계 (c) 후에, 시퀀싱 프라이머 쌍을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 시퀀싱 프라이머 쌍은 각각 상기 제2 PCR 생성물의 반대 가닥에 적어도 부분적으로 상호 보완적인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플은 고분자량 DNA로부터 제조된 복수의 DNA 단편을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 단일 가닥 핵산 단편은 이중 가닥 DNA 단편의 변성으로부터 제조되는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 RNA 단편의 역전사로부터 제조된 단일 가닥cDNA 단편을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 상기 복수의 핵산 단편을 분석하는 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 PCR 및/또는 상기 제2 PCR은 멀티플렉싱 PCR인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 포유류에서 유래한 것이고, 선택적으로 상기 샘플은 인간으로부터 유래한 것인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 인간은 질병이 있거나 질병이 의심되는 것으로 알려진 개인이고, 선택적으로 상기 질병 암 또는 유전적 질환인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 표적 핵산 중 하나 이상이 상기 암에 대한 하나 이상의 마커를 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 인간은 태아인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 혈액 샘플로부터 유래한 것인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 혈액 샘플에서 추출된 무세포 핵산을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 순환 종양 세포로부터 추출된 핵산을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 T-세포 및 B-세포 수용체 프로파일링을 위한 혈액 샘플의 림프구에서 추출된 핵산을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 CRISPR(CRISPR) 유전자 편집 샘플인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항에 있어서,
상기 샘플은 CRISPR 유전자 편집, 변형된 생체 외 CAR-T, CAR-NK, TCR-T 또는 치료용 조혈 줄기세포인
것을 특징으로 하는 방법.
- 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 농축하는 방법에 있어서,
상기 방법은,
범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합하는 단계 (a);
제1 표적-특이적 프라이머를 표적 서열 부근의 상기 단일 가닥 핵산 단편에 어닐링하는 단계 (b);
DNA중합 효소를 사용하여 상기 단일 가닥 핵산 단편 위로 상기 제1 표적-특이적 프라이머를 연장하는 단계 (c);
초기 프라이머 연장 듀플렉스를 얻는 단계 (d);
상기 초기 프라이머 연장 듀플렉스를 단일 가닥으로 해리하는 단계 (e); 및
상기 초기 프라이머 연장 듀플렉스의 단일 가닥의 일부를 제2 표적-특이적 프라이머 및 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 증폭하는 단계 (f)를 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항에 있어서,
단계 (a) 전에 상기 방법은,
상기 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단을 차단하는 단계; 상기 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단을 인산화하는 단계; 또는 핵산을 아데닐화하여 상기 단일 가닥 핵산 단편에 3-아데노신 돌출부를 생성하는 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 또는 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는, 상기 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된 3' 열성 단부; 및/또는 랜덤 또는 퇴행성 뉴클레오티드의 3~20개의 염기를 포함하는 5' 돌출 단부를 포함하며, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터의 듀플렉스 부분은 단계 (a)에서 듀플렉스 형태로 유지되기에 충분한 길이를 갖는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항에 있어서,
상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 듀플렉스 형태의 일부를 연결하는 헤어핀 루프를 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (f)는 시퀀싱 특정 어댑터 쌍이 있는 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제30항에 있어서,
상기 방법은 단계 (f) 후에, 시퀀싱 프라이머 쌍을 사용하여 상기 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 시퀀싱 프라이머 쌍은 각각 제2 PCR 생성물의 반대 가닥에 적어도 부분적으로 상호 보완적인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항에 있어서,
상기 방법은 하나 이상의 사이클 동안 단계 (b) 내지 단계 (f)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 고분자량 DNA로부터 제조된 복수의 DNA 단편을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
복수의 단일 가닥 핵산 단편은 이중 가닥 DNA 단편의 변성으로부터 제조되는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 RNA 단편의 역전사로부터 제조된 단일 가닥 cDNA 단편을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 개별 원본 분자를 추적하기 위한 고유 분자 인덱스(UMI)로서 3~20개의 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 단편을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 복수의 핵산 단편을 분석하는 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 포유류로부터 유래하고, 선택적으로 상기 포유류는 인간인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서,
상기 인간은 질병이 있거나 질병이 의심되는 것으로 알려진 개인이고, 선택적으로 상기 질병은 암 또는 유전적 질환인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제39항에 있어서,
상기 표적 핵산 중 하나 이상이 상기 암에 대한 하나 이상의 마커를 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제40항에 있어서,
상기 인간은 태아인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 혈액 샘플에서 유래한 것인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 혈액 샘플로부터 추출된 무세포 핵산을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 순환 종양 세포로부터 추출된 핵산을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 T-세포 및 B-세포 수용체 프로파일링을 위한 혈액 샘플의 림프구에서 추출된 핵산을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 편집된 CRISPR 유전자 샘플인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서,
상기 샘플은 상기 편집된 CRISPR 유전자 변형된 생체 외 CAR-T, CAR-NK, TCR-T 또는 치료용 조혈 줄기세포에서 추출된 샘플인
것을 특징으로 하는 방법.
- 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플에서 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 방법에 있어서,
범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플과 접촉시켜 결합 생성물을 생성하는 단계로서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성되는 단계 (a);
제1 표적-특이적 프라이머로 제1 PCR을 수행하여 제1 PCR 생성물을 형성함으로써 결합 생성물을 증폭하는 단계 (b);
시퀀싱 라이브러리를 형성하기 위해 시퀀싱 특이적 어댑터 프라이머 및 제1 표적 특이적 프라이머에 중첩된 제2 표적 특이적 프라이머로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 생성물을 증폭하는 단계 (c);
시퀀싱 결과를 얻기 위해 상기 시퀀싱 라이브러리를 정량화하고 판독하는 단계 (d); 및
시퀀싱 결과를 참조 게놈에 매핑하고 유전자 편집 오프-타겟을 평가하는 단계 (e)를 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 유전자 편집 효율을 평가하는 방법에 있어서,
범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플과 접촉시켜 결합 생성물을 생성하는 단계로서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 상기 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성되는 단계 (a);
제1 표적-특이적 프라이머로 제1 PCR을 수행하여 제1 PCR 생성물을 형성함으로써 결합 생성물을 증폭하는 단계로서, 상기 제1 표적-특이적 프라이머는 바람직하게는 온-타겟, 예측된 오프-타겟 또는 알려진 오프-타겟에서 단일 가닥 핵산 단편을 어닐링하도록 구성되는 단계 (b);
시퀀싱 라이브러리를 형성하기 위해, 시퀀싱 특이적 어댑터 프라이머 및 상기 제1 표적 특이적 프라이머에 상대적으로 중첩된 제2 표적 특이적 프라이머로 제2 PCR을 통해 제1 PCR 생성물을 증폭하는 단계 (c);
상기 시퀀싱 라이브러리를 정량화하고 판독하여 시퀀싱 결과를 형성하는 단계 (d); 및
상기 시퀀싱 결과를 참조 게놈에 매핑하고 유전자 편집 효율을 평가하는 단계 (e)를 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제49항에 있어서,
상기 예측된 오프-타겟은 E-CRISP, Cas-OFFinder 및/또는 CRISPRscan으로 구성된 소프트웨어를 기반으로 실리코에서 예측되는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제49항 또는 제50항에 있어서,
상기 E-CRISP는 부정합(mismatch) 컷오프가 <= 10, 9, 8, 7 또는 6이고, 상기 Cas-OFFinder는 부정합이 <= 6, 5, 4, 3 또는 2이며 벌지가 <= 3, 2 또는 1이고, 상기 CRISPRscan은 임계값이 없는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (e)는, 분할 판독 및 불일치 판독을 획득하여 전위를 검출하는 단계; 또는 삽입 및 삭제(indel) 빈도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제52항에 있어서,
상기 분할 판독 및 불일치 판독은, 잠재적 후보 전위를 식별하는 단계; 및 온-타겟 스페이서 및 절단 빈도 결정자(CFD)에 대한 프로토스페이서 유사성을 추정하는 단계에 의해 얻어지는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제52항에 있어서,
상기 인델 빈도는,
매핑된 결과를 GATK-리얼라이너에 의해 정렬하여 정렬된 결과를 형성하는 단계 (a);
상기 정렬된 결과를 대응하는 스페이서 영역에 걸치지 않도록 필터링하는 단계 (b);
절단 부위의 상류 또는 하류 약 5-bp 주변에서 발생하는 삽입 및 삭제를 예측하는 단계 (c); 및
음성 대조군의 상응하는 값에 의해 제거된 상기 샘플의 인델 값에 의해 신뢰할 수 있는 인델 빈도를 결정하는 단계 (d)에 의해 얻어지는
것을 특징으로 하는 방법.
- 복수의 단일 가닥 핵산 단편으로 구성된 샘플로부터 게놈 전체 유전자 편집 오프-타겟을 식별하는 방법에 있어서,
범용 올리고뉴클레오티드 어댑터를 샘플과 접촉시켜 결합 생성물을 생성하는 단계로서, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 상기 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성되는 단계 (a);
제1 표적-특이적 프라이머 세트로 제1 PCR을 통해 결합 생성물을 증폭하는 단계로서, 상기 제1 표적-특이적 프라이머 세트는 온-타겟 및 하나 이상의 예측 및/또는 공지된 오프-타겟의 단일 가닥 핵산 단편 5'을 어닐링하도록 구성되는 단계 (b);
제2 표적-특이적 프라이머 세트 및 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터 프라이머로 제2 PCR을 통해 상기 제1 PCR 생성물을 증폭하여 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계로서, 상기 제2 표적-특이적 프라이머 세트의 각각은 상기 제1 표적-특이적 프라이머 세트의 대응하는 프라이머에 대해 중첩되는 단계 (c); 및
오프-타겟을 식별하기 위해 상기 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계 (d)를 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항에 있어서,
단계 (b)에서 상기 예측된 오프-타겟은 컴퓨터로 예측된 오프-타겟인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제56항에 있어서,
상기 컴퓨터로 예측된 오프-타겟은 E-CRISP, Cas-OFFinder 또는 CRISPRscan을 포함하는 소프트웨어에 기초하여 예측된 상부 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10개의 오프-타겟인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제57항에 있어서,
상기 E-CRISP는 부정합의 컷오프가 <= 10, 9, 8, 7, 또는 6이고, 상기Cas-OFFinder는 부정합이 <= 6, 5, 4, 3, 또는 2이며 벌지가 <= 3, 2, 또는 1이고, 상기 CRISPRscan은 임계값이 없는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은, 분할 판독 및 불일치 판독을 획득하여 전위를 검출하는 단계; 또는 삽입 및 삭제(indel) 빈도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제59항에 있어서,
상기 분할 판독 및 불일치 판독은, 잠재적 후보 전위를 식별하는 단계; 및 온-타겟 스페이서 및 절단 빈도 결정자(CFD)에 대한 프로토스페이서 유사성을 추정하는 단계에 의해 얻어지는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제59항에 있어서,
상기 인델 빈도는, 매핑된 결과를 GATK-리얼라이너에 의해 정렬하여 정렬된 결과를 형성하고; 상기 정렬된 결과를 해당 스페이서 영역에 걸치지 않도록 필터링하며; 절단 부위의 상류 또는 하류에서 5-bp 주변에서 발생하는 삽입 및 삭제를 예측하고; 및 음성 대조군의 상응하는 값에 의해 제거된 상기 샘플의 인델 값에 의해 신뢰할 수 있는 인델 빈도를 결정하는 것을 통해 얻어지는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (a) 전에 상기 방법은, 상기 단일 가닥 핵산 단편의 3' 말단을 차단하는 단계; 상기 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단을 인산화하는 단계; 또는 상기 핵산을 아데닐화하여 상기 단일 가닥 핵산 단편에 3'-아데노신 돌출부를 생성하는 단계 중 적어도 하나를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는, 상기 단일 가닥 핵산 단편의 5' 말단에 결합되도록 구성된 3' 열성 단부; 및/또는 랜덤 또는 퇴행성 뉴클레오티드의 3~20개의 염기를 포함하는 5' 돌출 단부를 포함하며, 상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터의 듀플렉스 부분은 단계 (a)에서 듀플렉스 형태로 유지되기에 충분한 길이를 갖는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제63항에 있어서,
상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 듀플렉스 형태의 일부를 연결하는 헤어핀 루프를 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 범용 올리고뉴클레오티드 어댑터는 개별 원본 분자를 추적하기 위한 고유 분자 인덱스(UMI)로서 3~20개의 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 단편을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 시퀀싱 특이적 어댑터 쌍이 있는 시퀀싱 라이브러리를 형성하는 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제66항에 있어서,
상기 방법은 단계 (c) 후에, 시퀀싱 프라이머 쌍을 사용하여 상기 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계를 추가 포함하며, 상기 시퀀싱 프라이머 쌍은 각각 상기 제2 PCR 생성물의 반대 가닥에 적어도 부분적으로 상호 보완적인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 고분자량 DNA로부터 제조된 복수의 DNA 단편을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 단일 가닥 핵산 단편은 이중 가닥 DNA 단편의 변성으로부터 제조되는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 RNA 단편의 역전사로부터 제조된 단일 가닥 cDNA 단편을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 상기 복수의 핵산 단편을 분석하는 단계를 추가로 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 포유류로부터 유래하고, 선택적으로 상기 포유류는 인간인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제72항에 있어서,
상기 인간은 질병이 있거나 질병이 의심되는 것으로 알려진 개인이고, 선택적으로 상기 질병은 암 또는 유전적 질환인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제73항에 있어서,
상기 표적 핵산 중 하나 이상이 상기 암에 대한 하나 이상의 마커를 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제72항에 있어서,
상기 인간은 태아인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 혈액 샘플로부터 유래된 것인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 혈액 샘플로부터 추출된 무세포 핵산을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 순환 종양 세포로부터 추출된 핵산을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 T-세포 및 B-세포 수용체 프로파일링을 위한 혈액 샘플의 림프구로부터 추출된 핵산을 포함하는
것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 편집된 CRISPR 유전자 샘플인
것을 특징으로 하는 방법.
- 제80항에 있어서,
상기 샘플은 CRISPR 유전자 편집, 변형된 생체 외 CAR-T, CAR-NK, TCR-T 또는 치료용 조혈 줄기세포인
것을 특징으로 하는 방법.
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