KR20240003782A - 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 0.4 내지 0.8μM의 CHIR99021 하에 전분화능 줄기세포를 제1 배양하고, 2.5 내지 3.5μM의 CHIR99021 및 0.5 내지 1μM의 SAG(smoothened agonist) 하에 상기 전분화능 줄기세포를 제2 배양하여, 상기 전분화능 줄기세포를 복측 중뇌 신경 전구세포로 분화시키는 단계; 및 상기 복측 중뇌 신경 전구세포에서 NFIB(nuclear factor IB)를 과발현시키고 제3 배양하여 복측 중뇌 성상세포로 분화시키는 단계;를 포함함으로써, 줄기세포를 복측 중뇌에 위치한 세포의 특성을 갖는 성상세포로 분화 시키는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법에 관한 것이다.
성상세포(astrocyte)는 중추 신경계의 신경 교세포(neuroglia)의 일종이며, 신경 교세포 중 가장 크기가 크다. 뇌와 척수에서 다량으로 존재하며, 별(star) 모양의 형태를 가지고 있다. 성상세포는 뻗어 나온 돌기로 신경세포 및 혈관 내피세포와 상호작용을 한다. 혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier)을 구성하고 있는 내피세포(endothelial cell)의 생화학적 특성을 조절하며, 신경 조직에 영양분을 공급하고, 손상된 뇌와 척수 조직의 재생에 중요한 역할을 한다.
성상세포의 기능이 손상될 경우 자폐증(autism) 또는 정신 분열증(schizophrenia)을 초래할 수 있다. 이러한 질환의 발생은 성상세포에 의한 시냅스 가소성을 유지 못하기 때문에, 학습 능력이나 기억 능력이 상실되기 때문이라 여겨진다.
파킨슨병은 치매 다음으로 흔한 대표적인 퇴행성 뇌 질환이다. 우리 뇌 속에는 여러 가지 신경 전달 물질이 있는데 그 중에서 운동에 꼭 필요한 도파민이라는 신경전달물질이 있다. 파킨슨병은 중뇌에 위치한 흑질이라는 뇌의 특정부위에서 이러한 도파민을 분비하는 신경세포가 원인 모르게 서서히 소실되어 가는 질환으로, 서동증(운동 느림), 안정 시 떨림, 근육 강직, 자세 불안정 등의 증상이 발생한다. 파킨슨병은 주로 노년층에서 발생하는 질환으로 연령이 증가할수록 이 병에 걸릴 위험은 점점 커지게 된다. 발생 빈도는 인구 1,000 명 당 1명 내지 2명 정도로 알려져 있으며 60세 이상의 노령층에서는 약 1%, 65세 이상에서는 약 2%정도가 파킨슨병을 앓고 있다.
줄기세포(stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하며, 특정 분화 자극에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 더 이상 분열하지 않는 완전히 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
현재 줄기세포는 세포치료제로서 각광을 받고 있는데, 신경세포의 손상에 의해 유발되는 다양한 신경 질환(neurological diseases)의 세포치료제로서도 많은 연구가 이루어지고 있다. 특히 뇌신경계 질환은 다른 어느 질병보다 세포 이식치료에 가장 적절한 대상이라 여겨지는데, 이는 뇌신경계 조직이 다른 조직과는 달리 면역거부 반응이 거의 없어, 외부로부터 세포를 이식하였을 때 이식된 세포의 장기간 생존을 기대할 수 있기 때문이다.
한편, 세포치료제로서의 줄기세포의 유용성을 높이기 위해서는 줄기세포를 효율적으로 특정세포로 분화시키는 기술 및 원하는 시기에 특정세포를 공급할 수 있는 기술이 필요하다.
성상세포는 다양한 신경질환들의 원인 및 진행과 직간접적으로 연관이 되어 있다. 특히, 파킨슨병은 복측 중뇌에 존재하는 도파민 신경세포의 사멸로 인해 발생하는 것으로 알려져 있지만, 발병과 직접 연관이 있다고 알려진 많은 유전자들이 성상세포에서 특이적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 따라서 많은 연구자들이 복측 중뇌에 존재하는 성상세포가 파킨슨병 발병과 진행에 중요한 역할을 할 것이라고 지적하고 있다.
본 발명은 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 0.4 내지 0.8μM의 CHIR99021 하에 전분화능 줄기세포를 제1 배양하고, 2.5 내지 3.5μM의 CHIR99021 및 0.5 내지 1μM의 SAG(smoothened agonist) 하에 상기 전분화능 줄기세포를 제2 배양하여, 상기 전분화능 줄기세포를 복측 중뇌 신경 전구세포로 분화시키는 단계; 및
상기 복측 중뇌 신경 전구세포에서 NFIB(nuclear factor IB)를 과발현시키고 제3 배양하여 복측 중뇌 성상세포로 분화시키는 단계;를 포함하는 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 제1 및 제2 배양은 Y-27632, noggin, dorsomorphin, DMH1, LDN193189, 또는 SB431542를 포함하는 배지에서 수행되는, 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 제1 배양에서의 CHIR99021 농도는 0.5 내지 0.7μM이고, 상기 제2 배양에서의 CHIR99021 농도는 2.75 내지 3.25μM 및 SAG 농도는 0.75 내지 1μM인, 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
4. 위 1에 있어서, 상기 제1 배양은 4.5일 내지 5.5일, 제2 배양은 3.5일 내지 4.5일간 수행되는 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
5. 위 1에 있어서, 상기 NFIB의 과발현은 NFIB를 코딩하는 유전자를 상기 복측 중뇌 신경 전구세포에 도입하여 수행되는, 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
6. 위 1에 있어서, 상기 제1 배양 전에 상기 전분화능 줄기세포를 신경세포 분화 유도 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
7. 위 1에 있어서, 상기 전분화능 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포인, 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
본 발명의 방법은 줄기세포를 복측 중뇌 성상세포로 효율적으로 분화시킬 수 있다.
본 발명의 분화 방법으로 얻어진 상기 복측 중뇌 성상세포는 파킨슨병 세포치료제의 효능을 증진시키는 효과를 가진다.
본 발명의 분화 방법으로 얻어진 상기 복측 중뇌 성상세포는 도파민 신경 전구세포와 공배양 시 도파민 신경 전구세포가 도파민 신경세포로 분화하는 효율을 향상시키는 효과를 가진다.
본 발명의 분화 방법으로 얻어진 상기 복측 중뇌 성상세포는 도파민 신경세포의 사멸을 방지하는 효과를 가진다.
도 1은 hESC(human embryonic stem cell)에서 복측 중뇌(ventral midbrain) 신경 전구세포(neural precursor cell)로의 분화에 관한 자료이다. (A) 복측 중뇌 신경 전구세포에 대해 테스트된 실험 체계를 보여주는 개략도이다. L/SB: LDN193189 및 SB431542; CHIR: CHIR99021; SAG: smoothened agonist. (B 내지 G) 마커 유전자 발현에 대한 정량 분석이다. EN1: Engrailed 호메오박스 1, 중뇌 특이적 유전자; NKX6.1: NK6 호메오박스 1, 복부 마커 유전자; FOXA2: 포크헤드 박스 A2, 바닥판 마커 유전자; FOXG1: 종뇌 특이적 유전자인 포크헤드 박스 G1; GBX2: 후뇌 특이적 유전자인 낭배 뇌 호메오박스 2(Gastrulation Brain Homeobox 2); PAX6: 페어드 박스 6, 등쪽 마커 유전자. (H 내지 I) EN1 및 SRY-Box 전사 인자 2(SOX2)에 대한 면역세포화학 염색의 대표적인 이미지이다. Insets: 각 분화 조건에서 NESTIN 양성 세포의 대표적인 이미지. 스케일 바: 50 μM. (J 내지 K) 각 분화 조건에서 마커 양성 세포의 정량 분석이다. 모든 데이터는 최소 3개의 분화 배치에서 얻었고, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001 이다.
도 2는 NFIB의 과발현에 의한 신경 전구세포로부터의 성상세포(astrocyte) 유도에 관한 자료이다. (A) 각 분화 조건에서 GFAP(녹색) 및 EN1(빨간색)에 대한 면역세포화학 염색의 대표적인 이미지이다. L/SB 대조군: 이중-SMAD 억제(dual-SMAD inhibition) 단독에 의해 생성된 신경 전구세포로부터의 분화; CHIR-B + SAG: CHIR-부스팅 전략에 따라 SAG로 처리하여 생성된 신경 전구세포로부터의 분화. 스케일 바: 50 μM. (B, C) 마커 양성 세포의 정량화에 관한 그래프이다. (D 내지 F) 성상세포 마커 유전자에 대한 정량적 유전자 발현 분석이다. GFAP: 교세포 원섬유 산성 단백질; ALDH1L1: 알데히드 탈수소효소 1 패밀리 구성원 L1; IGFBP7: 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7. (G 내지 H) 복측 중뇌 마커 유전자 발현에 대한 그래프이다. (I) 글루타메이트 흡수 분석에 대한 그래프이다. (J 내지 K) 염증성 사이토카인의 칵테일에 대한 반응성에 대한 그래프이다. C3: 보체 성분 3; LCN2: 리포칼린 2; CXCL10: C-X-C 모티프 케모카인 리간드 10. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001. 3개의 독립적인 분화 배치에서 데이터를 얻었다.
도 3은 도파민(Dopaminergic, DA) 신경세포에 대한 성상세포의 분화 촉진 효과에 관한 자료이다. (A) 미세소관 관련 단백질 2(MAP2: 신경세포 마커, 녹색) 및 티로신 하이드록실라제(TH: 도파민 신경세포 마커, 빨간색)에 대한 면역염색의 대표적인 이미지이다. 스케일 바: 50 μM. (B 내지 D) 마커 양성 세포의 정량화에 대한 그래프이다. 3개의 독립적인 분화 배치에서 6개의 커버슬립으로 정량화를 수행하였다. 각 점은 하나의 커버슬립에서 측정된 마커 양성 세포의 평균값을 나타낸다. ns: 유의하지 않음; **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001.
도 4는 도파민 신경세포에 대한 성상세포의 신경 보호 효과에 관한 자료이다. (A 내지 D) TH(녹색) 및 절단된 카스파제-3(CC-3, 빨간색)에 대한 면역 염색의 대표적인 이미지이다. 스케일 바: 50 μM. (E) 마커 양성 세포의 정량화에 대한 그래프이다. 마커 양성 세포의 정량화는 3개의 독립적인 테스트 배치에서 5개의 커버슬립으로 수행되었다. 스케일 바: 50 μM. ns: 유의하지 않음; ***P<0.001 및 ****P<0.0001.
도 5는 대조군 성상세포 및 복측 중뇌 성상세포의 유전자 발현 분석에 관한 자료이다. (A) 대조군 및 복측 중뇌 성상세포 그룹에서 영역 특이적 유전자 발현을 보여주는 히트맵이다. (B, C) 전체 발현 패턴을 비교한 것이다. 복측 중뇌 성상세포의 유전자 발현을 지역별 뇌 성상세포의 유전자 발현과 비교하였다. ns: 유의하지 않음; *P<0.05. (D 내지 F) GSEA 농축 결과를 나타낸 것이다. (H 내지 I) 복측 중뇌 성상세포 및 대조군 성상세포에서 WNT 관련 유전자의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 6은 CHIR 및 SAG 처리를 위한 시간적 창(temporal windows) 최적화에 대한 자료이다. (A) 복측 중뇌 신경 전구세포를 생성하기 위한 저분자물질의 농도 및 처리 일정을 나타내는 개략도이다. 모든 실험 조건은 hESC의 신경 분화를 위한 "이중 SMAD 억제 전략"(L/SB)의 존재하에 테스트되었다. 복측화를 위해 CHIR의 존재 하 SAG의 두 가지 농도(0.5μM 및 1μM)를 테스트했다. (B 내지 D) 마커 유전자 발현의 정량 분석에 대한 그래프이다. 주어진 조건에서 마커 유전자(EN1, FOXA2 및 NKX6.1)의 발현은 이중-SMAD 억제 단독 조건(L/SB)에서의 발현에 비해 정량화되었다.
도 7은 대조군 신경 전구세포 및 복측 중뇌 신경 전구세포에서 NFIB 과발현에 의해 분화된 성상세포의 CD44 및 S100β에 대한 면역염색에 관한 자료이다. 스케일 바: 50μm. ns: 유의하지 않음.
도 8은 hESC에서 도파민 신경세포 전구체의 분화에 관한 자료이다. 스케일 바: 50 μm.
도 9는 대조군 성상세포 및 복측 중뇌 성상세포의 RNA seq 데이터 분석에 관한 자료이다. (A) 대조군 성상세포 및 복측 중뇌 성상세포의 PCA(주성분 분석)에 대한 그래프이다. (B) 중추신경계의 주요 유형의 세포와 관련된 유전자를 나타내는 정규화된 read counts의 히트맵이다: 성상세포(녹색), 신경세포(주황색) 및 희돌기교세포(파란색).
도 10은 단일 핵 또는 단일 세포 RNA-seq 데이터에 대한 전처리의 개략적인 순서도를 나타낸다.
도 2는 NFIB의 과발현에 의한 신경 전구세포로부터의 성상세포(astrocyte) 유도에 관한 자료이다. (A) 각 분화 조건에서 GFAP(녹색) 및 EN1(빨간색)에 대한 면역세포화학 염색의 대표적인 이미지이다. L/SB 대조군: 이중-SMAD 억제(dual-SMAD inhibition) 단독에 의해 생성된 신경 전구세포로부터의 분화; CHIR-B + SAG: CHIR-부스팅 전략에 따라 SAG로 처리하여 생성된 신경 전구세포로부터의 분화. 스케일 바: 50 μM. (B, C) 마커 양성 세포의 정량화에 관한 그래프이다. (D 내지 F) 성상세포 마커 유전자에 대한 정량적 유전자 발현 분석이다. GFAP: 교세포 원섬유 산성 단백질; ALDH1L1: 알데히드 탈수소효소 1 패밀리 구성원 L1; IGFBP7: 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7. (G 내지 H) 복측 중뇌 마커 유전자 발현에 대한 그래프이다. (I) 글루타메이트 흡수 분석에 대한 그래프이다. (J 내지 K) 염증성 사이토카인의 칵테일에 대한 반응성에 대한 그래프이다. C3: 보체 성분 3; LCN2: 리포칼린 2; CXCL10: C-X-C 모티프 케모카인 리간드 10. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001. 3개의 독립적인 분화 배치에서 데이터를 얻었다.
도 3은 도파민(Dopaminergic, DA) 신경세포에 대한 성상세포의 분화 촉진 효과에 관한 자료이다. (A) 미세소관 관련 단백질 2(MAP2: 신경세포 마커, 녹색) 및 티로신 하이드록실라제(TH: 도파민 신경세포 마커, 빨간색)에 대한 면역염색의 대표적인 이미지이다. 스케일 바: 50 μM. (B 내지 D) 마커 양성 세포의 정량화에 대한 그래프이다. 3개의 독립적인 분화 배치에서 6개의 커버슬립으로 정량화를 수행하였다. 각 점은 하나의 커버슬립에서 측정된 마커 양성 세포의 평균값을 나타낸다. ns: 유의하지 않음; **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001.
도 4는 도파민 신경세포에 대한 성상세포의 신경 보호 효과에 관한 자료이다. (A 내지 D) TH(녹색) 및 절단된 카스파제-3(CC-3, 빨간색)에 대한 면역 염색의 대표적인 이미지이다. 스케일 바: 50 μM. (E) 마커 양성 세포의 정량화에 대한 그래프이다. 마커 양성 세포의 정량화는 3개의 독립적인 테스트 배치에서 5개의 커버슬립으로 수행되었다. 스케일 바: 50 μM. ns: 유의하지 않음; ***P<0.001 및 ****P<0.0001.
도 5는 대조군 성상세포 및 복측 중뇌 성상세포의 유전자 발현 분석에 관한 자료이다. (A) 대조군 및 복측 중뇌 성상세포 그룹에서 영역 특이적 유전자 발현을 보여주는 히트맵이다. (B, C) 전체 발현 패턴을 비교한 것이다. 복측 중뇌 성상세포의 유전자 발현을 지역별 뇌 성상세포의 유전자 발현과 비교하였다. ns: 유의하지 않음; *P<0.05. (D 내지 F) GSEA 농축 결과를 나타낸 것이다. (H 내지 I) 복측 중뇌 성상세포 및 대조군 성상세포에서 WNT 관련 유전자의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 6은 CHIR 및 SAG 처리를 위한 시간적 창(temporal windows) 최적화에 대한 자료이다. (A) 복측 중뇌 신경 전구세포를 생성하기 위한 저분자물질의 농도 및 처리 일정을 나타내는 개략도이다. 모든 실험 조건은 hESC의 신경 분화를 위한 "이중 SMAD 억제 전략"(L/SB)의 존재하에 테스트되었다. 복측화를 위해 CHIR의 존재 하 SAG의 두 가지 농도(0.5μM 및 1μM)를 테스트했다. (B 내지 D) 마커 유전자 발현의 정량 분석에 대한 그래프이다. 주어진 조건에서 마커 유전자(EN1, FOXA2 및 NKX6.1)의 발현은 이중-SMAD 억제 단독 조건(L/SB)에서의 발현에 비해 정량화되었다.
도 7은 대조군 신경 전구세포 및 복측 중뇌 신경 전구세포에서 NFIB 과발현에 의해 분화된 성상세포의 CD44 및 S100β에 대한 면역염색에 관한 자료이다. 스케일 바: 50μm. ns: 유의하지 않음.
도 8은 hESC에서 도파민 신경세포 전구체의 분화에 관한 자료이다. 스케일 바: 50 μm.
도 9는 대조군 성상세포 및 복측 중뇌 성상세포의 RNA seq 데이터 분석에 관한 자료이다. (A) 대조군 성상세포 및 복측 중뇌 성상세포의 PCA(주성분 분석)에 대한 그래프이다. (B) 중추신경계의 주요 유형의 세포와 관련된 유전자를 나타내는 정규화된 read counts의 히트맵이다: 성상세포(녹색), 신경세포(주황색) 및 희돌기교세포(파란색).
도 10은 단일 핵 또는 단일 세포 RNA-seq 데이터에 대한 전처리의 개략적인 순서도를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 0.4 내지 0.8μM의 CHIR99021 하에 전분화능 줄기세포를 제1 배양하고, 2.5 내지 3.5μM의 CHIR99021 및 0.5 내지 1μM의 SAG(smoothened agonist) 하에 상기 전분화능 줄기세포를 제2 배양하여, 상기 전분화능 줄기세포를 복측 중뇌 신경 전구세포로 분화시키는 단계; 및 상기 복측 중뇌 신경 전구세포에서 NFIB(nuclear factor IB)를 과발현시키고 제3 배양하여 복측 중뇌 성상세포로 분화시키는 단계;를 포함한다.
전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 생체를 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 능력이 있는 미분화 줄기세포를 말한다. 전분화능 줄기세포는 세포 분열을 통해 자신과 동일한 특징을 가지는 전분화능 줄기세포를 복제하거나, 주위 환경변화나 신호 전달로 인해 특정 세포로의 분화를 시작할 수도 있다. 상기 전분화능 줄기세포는 예를 들면 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC;) 또는 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ESC;)일 수 있다.
일반적으로 복측 중뇌 신경 전구세포는 발달 중인 중뇌에서 해부학적으로 복(腹) 측에 존재하는 신경 전구세포를 의미한다.
복측 중뇌 신경 전구세포 중에 발생학적 기원과 운명이 가장 알려진 세포는 바닥판(floor plate) 세포이며, 이들은 해부학적으로 중뇌의 가장 복측 또는 아래쪽에 위치한다. 중뇌 바닥판 세포는 도파민 신경세포의 전구체로서 도파민 신경세포로 분화되는 세포이며, 마커 EN1과 FOXA2를 동시에 발현한다. 그에 비해, 중뇌 바닥판 세포의 상층부에 인접한 신경 전구세포는 도파민 신경세포로 분화하지 않으며, EN1과 NKX6.1을 높게 발현하는 대신 FOXA2는 발현하지 않는다. 이 세포들은 중뇌 조직의 신경세포와 성상세포를 포함한 교세포들로 모두 분화할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명에서 언급하는 성상세포 분화를 위한'복측 중뇌 신경 전구세포'란 바닥판 세포를 제외한 나머지 복측 중뇌에 존재하는 신경 전구세포를 의미한다.
본 발명의 방법은 상기 제1 및 제2 배양에서 사용되는 물질의 종류, 농도를 위와 같이 특이적으로 조절하여 사용함으로써, 줄기세포를 복측 중뇌의 특성을 갖는 신경 전구세포로 분화시킬 수 있다.
전분화능 줄기세포를 0.4 내지 0.8μM의 CHIR 하에 제1 배양하고, 2.5 내지 3.5μM의 CHIR 및 0.5 내지 1μM의 SAG(smoothened agonist) 하에 제2 배양하여, 상기 전분화능 줄기세포를 복측 중뇌 신경 전구세포로 분화시킨다.
상기 제1 배양에서 CHIR의 농도는 0.4 내지 0.8μM, 0.5 내지 0.7μM, 0.55μM 내지 0.65μM이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1 배양의 기간은 4.5 내지 5.5일, 4.25 내지 5.25일, 4.125 내지 5.125일이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 배양에서 CHIR의 농도는 2.5 내지 3.5μM, 2.7 내지 3.3 μM, 2.75 내지 3.25 μM, 2.8 내지 3.2 μM, 2.9 내지 3.1 μM, 2.95 내지 3.05μM이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 배양에서 SAG의 농도는 0.5 내지 1 μM, 0.6 내지 1 μM, 0.7 내지 1 μM, 0.75 내지 1 μM, 0.8 내지 1 μM, 0.85 내지 1 μM, 0.9 내지 1 μM이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 배양의 기간은 3.5 내지 4.5일, 3.75 내지 4.25일, 3.875 내지 4.125일이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
줄기세포 배양에는 상기 성분을 사용하는 것을 제외하고는 당 분야에 공지된 줄기세포 배양 배지를 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 배양 배지의 기본 배지로서는 DMEM 배지, BME 배지, α MEM 배지, 무혈청 DMEM/F12 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, 글래스고(Glasgow) MEM 배지, 개량 MEM 아연 선택(Improved MEM Zinc Option) 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, 이글(Eagle) MEM 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, 피셔(Fischer's) 배지, 맥코이(McCoy's) 배지, 윌리암스 E 배지, 또는 iPS-Brew XF 배지 등, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지라면 모두 사용할 수 있다.
줄기세포 배양 배지(제1 및 제2 배양 배지)는 세포의 생존, 성장, 줄기세포에서 신경 계통 전구세포로의 분화를 위한 물질 등을 더 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, Y-27632, noggin, dorsomorphin, DMH1, LDN193189, 또는 SB431542를 포함할 수 있다.
상기 제1 배양에 사용되는 줄기세포는 신경 계통 분화를 유도하는 배지에서 소정 기간 배양된 것일 수 있다. 배지는 당 분야에 공지된 배지에 신경 계통의 분화 유도를 위한 성분을 포함한 것일 수 있고(신경세포 분화 유도 배지), 예를 들면 Y-27632, noggin, dorsomorphin, DMH1, LDN193189, 또는 SB431542 등을 포함한 배지일 수 있다.
제1 배양 전의 배양은 예를 들면 1일 내지 3일 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제1 배양, 제2 배양의 CHIR 및 SAG의 농도는 줄기세포가 배양되는 배지에 물질을 첨가하는 방식으로 조절될 수 있다.
상기 제1 배양 및 제2 배양의 총 기간은 줄기세포의 배양이 시작된지 2일에서 11일까지 진행되는 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후 복측 중뇌 신경 전구세포에서 NFIB(nuclear factor IB)를 과발현시키고 제3 배양하여 복측 중뇌 성상세포로 분화시킨다. 이에 의해 상기 전구세포가 복측 중뇌에 위치하는 세포의 특성을 계속 유지하면서 복측 중뇌 성상세포로 분화될 수 있다. 예를 들면 EN1과 NKX6.1의 발현이 계속 높게 유지될 수 있다. 상기 제 3배양의 배지는 당 분야에 공지된 세포 배양 배지를 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 복측 신경 전구세포 배양 배지(제3 배양 배지)는 세포의 생존, 성장 및 복측 신경 전구세포를 복측 성상세포로의 분화를 위한 물질을 더 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, CNTF(ciliary neurotrophic factor), BMP4(Bone morphogenetic protein), DMEM/F12 혼합물, N-아세틸-L-시스테인, 헤파린-결합 표피 성장 인자 유사 성장 인자, 또는 디부티릴-cAMP를 포함할 수 있다.
제3 배양은 신경 전구세포가 성상세포로 충분히 분화될 수 있는 기간 동안 수행될 수 있다. 예를 들면 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상 등으로 수행될 수 있다. 그 상한은 예를 들면 8주, 7주, 6주, 5주, 4주 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 NFIB의 과발현은 상기 신경 전구세포에 NFIB 유전자를 도입하거나 또는 NFIB 단백질을 첨가하여 수행될 수 있다.
NFIB 유전자는 그 유래는 제한되지 않으며, 인간 NFIB, 마우스 NFIB 등을 제한없이 사용할 수 있다. NFIB는 그 서열이 상당히 보존되어 있어, 타종 유래의 서열이라도 동등한 수준의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
NFIB 유전자는 당 분야에 공지된 벡터 등의 전달체를 사용하여 도입될 수 있다.
도입 방법으로는 공지된 형질도입(transduction) 또는 형질전환(transfection) 방법 등을 사용할 수 있으며, 예를 들어 원심분리법, 미세주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
벡터는 다른 핵산 분자를 전이 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하며, 전이되는 핵산은 벡터 핵산 분자에 연결되거나 삽입되어 있을 수 있다. 벡터는 세포에서 자율 복제 또는 역전사를 유도하는 서열을 포함할 수 있고, 또는 숙주 세포 DNA 내로 통합시키기에 충분한 서열을 포함할 수 있다.
예를 들면, "바이러스 벡터"는 핵산을 세포 내로 전이시킬 수 있는 바이러스 기반 벡터 또는 벡터 입자를 지칭하거나, 또는 전이된 핵산 자체를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터는 주로 바이러스에서 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전자 요소를 함유한다. 또는, 레트로바이러스로부터 유래되는, 구조적 및 기능적 유전자 요소 또는 이의 일부를 함유하는 "레트로바이러스 벡터"가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 바이러스는 예를 들면 렌티바이러스(lentivirus)일 수 있다. 렌티바이러스는 복합 레트로바이러스 군 또는 속을 의미하며, 예를 들면 HIV 형 및 HIV 2형을 포함하는, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 비스나-메디(visna-maedi) 바이러스(VMV), 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하나, 상기 방법이 이에 제한되는 것은 아니다.
도파민 신경세포는 파킨슨병 환자의 두뇌에 이식되어 파킨슨병의 치료에 사용되는데, 상기 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 복측 중뇌 성상세포는 그러한 치료에 도움을 줄 수 있다.
예를 들어, 복측 중뇌 성상세포를 도파민 신경 전구세포와 공배양할 경우, 도파민 신경 전구세포의 도파민 신경세포로의 분화가 촉진된다. 즉, 복측 중뇌 성상세포는 파킨슨병 치료제의 제조에 사용될 수 있는 것이고, 상기 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법이 파킨슨병 치료제 제조 방법의 일부로서 사용될 수 있다.
도파민 신경 전구세포와의 공배양시에는 줄기세포, 신경전구세포, 신경세포 등의 배양에 사용되는 공지된 배지가 사용될 수 있다.
또한, 복측 중뇌 성상세포를 도파민 신경세포와 함께 파킨슨병 환자 또는 동물모델에 이식하는 경우 도파민 신경세포 이식의 효과가 더 증진된다. 구체적으로, 복측 중뇌 성상세포는 도파민 신경세포 특이적 독성물질인 6-OHDA(6-hydroxydopamine hydrochloride)로 인한 도파민 신경세포의 사멸을 방지하는 능력을 가지므로, 이를 도파민 신경세포와 함께 이식하는 경우, 도파민 신경세포가 보다 오래 생존할 수 있어, 파킨슨병 치료 효과를 보다 장기간 유지할 수 있다. 즉, 복측 중뇌 성상세포는 파킨슨병 치료보조제로서 사용될 수 있는 것이고, 상기 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법이 파킨슨병 치료보조제 제조 방법으로서 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
실시예 1. 재료 및 실험방법
1-1. hESC의 배양 및 분화
hESC(WA01, 일반적으로 H1이라고 칭함, WiCell, Madison, WI, USA)를 분화에 사용하였다. 상기 hESC는 StemMACSTM iPS-Brew XF 배지(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, North Rhine-Westphalia, Germany)의 Matrigel(Corning, Corning, NY, USA) 코팅된 6-well 플레이트에서 배양되었고 Y27632 (10 μM; Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA)의 처리가 동반되는 효소 처리에 의해 계대 배양되었다. 신경 전구세포 분화를 위해, 약간의 수정과 함께 이중 SMAD 억제 전략이 사용되었다. 간단히 말해서, hESC를 단일 세포로 분리하고 10μM Y-27632를 포함하는 StemMACSTM iPS-Brew XF 배지에서 3 x 105 cells/cm2의 밀도로 Matrigel 코팅 접시에 플레이팅했다. 신경 계통을 유도하기 위해 hESC를 500nM의 LDN193189(STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada)와 10μM의 SB431542(Millipore Sigma)를 포함하는 StemMACSTM iPS-Brew XF 배지에서 배양하고 처리를 11일 동안 계속하였다. 분화 동안, 세포는 중뇌로의 분화 유도를 위해 2일부터 11일까지 다양한 농도의 CHIR99021(CHIR; STEMCELL Technologies)에 노출되었다. 복측화(ventralization)를 위해 0.5 내지 1μM smoothened agonist(SAG; Millipore Sigma)를 7일에서 11일까지 배양 배지에 첨가했다. 11일에 세포(신경 전구세포로 간주)를 RNA 준비를 위해 수확하거나 Accutase(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 처리 후 Matrigel이 코팅된 12mm 커버슬립에 플레이팅하여 성상세포로의 추가 분화 또는 면역염색을 수행하였다.
1-2. 렌티바이러스의 생산
rtTA(Addgene, Watertown, MA, USA의 카탈로그 번호 20342), NFIB coding gene(mouse, 서열번호 1(DNA), 서열번호 2(단백질)), 패키징 벡터 pMDLg/pRRE, pRSV-Rev 및 envelope pMD2.G(카탈로그 번호 12251, 1225, 12259, 출처 Addgene)를 포함하는 플라스미드를 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine® 3000(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 293FT 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 후 72시간째에, 바이러스를 함유하는 배양 배지를 수거하고 Lenti-X 농축기(Takara, Nojihigashi, Kusatsu, Japan)를 사용하여 농축하였다. 적정 후, 바이러스 입자의 농축 현탁액을 분취하고 추가 사용을 위해 -80 ℃에서 동결 보관했다.
1-3. 신경 전구세포로부터 성상세포의 분화
새로 분화된 신경 전구세포(분화 11일째)를 20ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA)를 포함하는 신경 전구세포 배지(1ХN2 및 1ХB27로 보충된 DMEM/F12 배지, 모두 Thermo Fisher Scientific에서 구입) 내 밀도 3×105 cells/cm2으로 Matrigel 코팅된 6-well plate에 플레이팅하였다. 하루 후, 세포를 20ng/ml bFGF를 함유하는 신선한 신경 전구세포 배지에서, 1.0의 감염 다중도로, 바이러스 및 1㎍/ml 폴리브렌(Millipore Sigma)으로 감염시켰다. 더 높은 형질도입 효율을 달성하기 위해, 원심분리[상온에서 1시간 동안 1000 × g]를 통해 스핀 감염을 수행했다. 18시간 배양 후, 바이러스 함유 배지는 10ng/ml 섬모 신경영양 인자(CNTF), 10ng/ml 뼈형성단백질4(Bone morphogenetic protein 4, BMP4)(모두 PeproTech 제품) 및 NFIB 과발현 유도를 위해 2.5㎍/ml의 doxycycline(DOX, Millipore Sigma)를 함유하는 새로운 신경 전구세포 배지로 교체되었다. DOX가 첨가된 날을 0일로 지정하였다. 2일 차에 신경 전구세포 배지를 상업용 성상세포 배지(ScienCell, Carlsbad, CA, USA)로 교체하고 이 배지를 14일까지 사용하였다. 감염된 세포에 대한 양성 선별은 1.25μg/ml 퓨로마이신(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행되었다. 14일째에, 세포를 3Х104 cells/cm2의 밀도로 Matrigel 코팅된 6-well plate 또는 12 mm 커버슬립을 포함하는 24-transwell plate에 플레이팅한 후, 성상세포 성숙 배지[DMEM/F12 혼합물 및 1×N2, 1×B27, 5 μg/ml N-아세틸-L-시스테인, 5 μg/ml 헤파린-결합 표피 성장 인자 유사 성장 인자(PeproTech), 0.5 mg/ml 디부티릴-cAMP, 10ng/ml BMP4 및 10ng/ml CNTF이 보충된 Neurobasal 배지(1:1)]에서 추가 배양하였다.
1-4. 도파민 신경세포 전구체 또는 도파민 신경세포와 성상세포의 공동 배양
다음과 같은 과정을 통해 도파민 신경세포 전구체 혹은 도파민 신경세포를 분화하였다. hESC 콜로니를 2 mg/ml 콜라게나제 type IV(Thermo Fisher Scientific)로 처리하여 5μM dorsomorphin(Millipore Sigma) 및 5μM SB431542를 포함하는 분화 배지(DMEM/F12, 20% 녹아웃 혈청 대체, 1× 비필수 아미노산, 모두 Thermo Fisher Scientific; 및 0.1mM 2-mercaptoethanol, Millipore Sigma) 내에서 배아체를 형성하였다. 5일째에, 배아체를 Matrigel 코팅된 배양 접시에 부착하고 6일 동안 1 μM CHIR 및 0.5 μM SAG가 보충된 신경 유도 배지(DMEM/F12, 1×N2 보충제, 20μg/ml 인간 인슐린, Thermo Fisher Scientific, 및 20ng/ml bFGF)에서 신경 로제트를 형성하도록 유도했다. 그런 다음 신경 로제트를 수동으로 분리하고, 대략 90% confluency에서 20ng/ml bFGF가 보충된 도파민 신경세포 전구체 배지(DMEM/F12, 1×N2, 1×B27 보충제, 1μM CHIR 및 0.5μM SAG)의 Matrigel-코팅 접시에 플레이팅하였다. 세포는 후에 bFGF가 없는 도파민 신경세포 전구체 배지에서 확장되었고 매 2-3일마다 Accutase로 효소적으로 계대되었다. 20일째에 면역세포화학염색을 사용하여 도파민 신경세포 전구체 마커(EN1, FOXA2 및 LMX1A)의 발현 여부를 확인하여 세포를 특성화했다. FOXA2- 및 EN1-양성 세포가 80% 이상이 달성되었을 때, 그리고 이 중 세포의 40%가 LMX1A에 대해 양성일 때 이 세포를 도파민 신경세포로의 분화에 사용했다. 도파민 신경세포의 분화를 위해, 도파민 신경세포 전구체를 7.25Х104 cells/cm2의 밀도로 Matrigel 코팅된 커버슬립에 플레이팅하고, 도파민 신경세포 분화 배지(도파민 신경세포 전구체 배지에서 CHIR 및 SAG를 뺀)에서 14일 동안 분화시켰다. 도파민 신경세포와 성상세포와의 공동배양은 다음과 같은 과정으로 수행하였다. 분화 후 3주 된 성상세포를 도파민 신경세포를 포함하는 well plate 내에 삽입된 Matrigel-coated Transwells®(Corning)에 1.0 Х 105 cells/cm2의 밀도로 플레이팅했다. 2주 동안 공동 배양을 수행한 후, 도파민 신경세포를 6-히드록시도파민 염산염(6-OHDA, 10μM; Millipore Sigma)으로 16시간 동안 처리한 직후 또는 처리한 후 정량 분석을 위해 면역 세포 화학염색을 실시하여 성상세포가 신경독으로 인한 세포 사멸로부터 그들을 구제하는지 테스트했다.
1-5. RNA 분리 및 실시간 중합효소 연쇄반응
총 RNA는 제조업체의 지침에 따라 TRIzol®(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 추출되었다. PrimeScript® RT Master Mix(Takara)를 사용하여 cDNA를 합성하는 데 총 RNA의 1μg을 사용하였다. 이어서 Fast SYBR® Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 StepOnePlus® 실시간 PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)에서 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 본 연구에서 사용된 프라이머 시퀀스는 하기 표 1에 나열되어 있다.
| Gene | Forward(5' to 3') | 서열번호 | Reverse(5' to 3') | 서열번호 |
| ACT B | CACCATTGGCAATGAGCGGTTC | 3 | AGGTCCTTGCGGATGTCCACGT | 4 |
| ALDH1L1 | GCTCCATCATCTATCACCCGT | 5 | ATCTCCGTGAATGAGGGTCCA | 6 |
| C3 | AAAAGGGGCGCAACAAGTTC | 7 | GATGCCTTCCGGGTTCTCAA | 8 |
| CXCL10 | GTGGCATTCAAGGAGTACCTC | 9 | TGATGGCCTTCGATTCTGGATT | 10 |
| EN1 | GTGGTCAAAACTGACTCGCAGC | 11 | CCGCTTGTCCTCCTTCTCGTTC | 12 |
| FOXA2 | GGAGCAGCTACTATGCAGAGC | 13 | CGTGTTCATGCCGTTCATCC | 14 |
| FOXG1 | CGTTCAGCTACAACGCGCTCAT | 15 | CAGATTGTGGCGGATGGAGTTC | 16 |
| GBX2 | GCGGAGGACGGCAAAGGCTTC | 17 | GTCGTCTTCCACCTTTGACTCG | 18 |
| GFAP | AGGTCCATGTGGAGCTTGAC | 19 | GCCATTGCCTCATACTGCGT | 20 |
| IGFBP7 | ATCCCGACACCTGTCCTCAT | 21 | CCCAGCCAGTTACTTCATGCT | 22 |
| LCN2 | GAAGTGTGACTACTGGATCAGGA | 23 | ACCACTCGGACGAGGTAACT | 24 |
| NKX6.1 | ACACGAGACCCACTTTTTCCG | 25 | GCCCCGCCAAGTATTTTGTT | 26 |
| PAX6 | CTGAGGAATCAGAGAAGACAGGC | 27 | ATGGAGCCAGATGTGAAGGAGG | 28 |
1-6. 면역세포화학염색
유리 커버슬립에서 자란 세포는 상온에서 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석된 4% 파라포름알데히드로 15분간 고정하고 PBS로 세척되었다. PBS에서 0.05% Triton® X-100으로 10분간 투과한 후, 세포를 2% 소 혈청 알부민 용액 또는 5% 당나귀 혈청 용액(둘 다 PBS로 희석)을 사용하여 최소 1시간 동안 블록한 후, 하룻밤 동안 4℃에서 1차 항체(아래 참조)와 반응하였다. 이후 PBS로 3회 이상 세척하고, 상온에서 30분 동안 검체를 형광 염료(Alexa Fluor ® 488 또는 594; Thermo Fisher Scientific)와 공역된 적절한 2차 항체와 반응하였다. 커버글라스는 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 함유한 마운팅 용액(Vector Laboratories, Burlingame, 미국, CA)을 사용하여 유리 슬라이드에 장착되었다. 사진들은 디지털 카메라(DP71)가 장착된 형광 현미경(IX71)(모두 Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan)을 사용하여 촬영되었다. 본 연구에 사용된 주요 항체는 SOX1(염소, 1:200 희석, R&D 시스템, 미니애폴리스, MN, 미국), NESTIN(마우스, 1:200 희석, 밀리포어 시그마), SOX2(토끼, 1:500 희석, 밀리포어 시그마), EN1(마우스, 1:50 희석, DSHB, Iowa city, IA, USA), FOXA2 (goat, 1:100 dilution, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 미국), LMX1A(토끼, 1:5,000 희석, 밀리포어 시그마), GFAP(토끼, 1:1000 희석, 다코, Carpinteria, CA, 미국), S100β (마우스, 1:1000 희석, 밀리포어 시그마), CD44(랫드, 1:100 희석, Thermo Fisher Scientific), MAP2(마우스, 1:1000 희석, Thermo Fisher Scientific), TH(양, 1:300 희석, Pel-Freez, Rogers, AR, USA), 절단된 캐스페이즈-3(토끼, 1:400 희석, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)이다.
1-7. 성상세포의 글루탐산염 흡수능 분석
성상세포로의 분화 21일째에 Hanks Balanced Salt Solution(HBSS)(Thermo Fisher Scientific)에서 1시간 동안 세포를 사전 조건화한 후, 200 μM 글루탐산염이 함유된 HBSS에서 2시간 동안 배양하였다. 샘플의 배지는 제조업체의 지침에 따라 2시간 후에 채취한 후 색도계 글루탐산 분석 키트(영국 캠브리지, Abcam)를 사용하여 분석하였다.
1-8. 전사체 데이터의 RNA 시퀀싱 및 농축 분석
전체 RNA는 single-end 시퀀싱을 위해 E-biogen Inc. (한국, 서울)에 제출되었으며 1,000만 개의 판독을 목표로 했다. raw FASTQ 파일은 BBDuk(v38.92)을 사용한 어댑터에 대해 트리밍되었으며, 스크립트는 참조 스크립트 GENCODE v32를 기반으로 Salmon(v0.6.0)을 사용하여 정량화되었다. 매트릭스는 정렬된 파일에서 생성되었으며 추가 분석을 위해 DESeq2(v1.32.0), 엣지 R(v3.34.1), 림마(v3.48.3)로 가져와 표준 파이프라인을 사용했다. 상관도는 ggplot2(v3.3.0)를 사용하여 작성하였고, 히트맵은 pheatmap(v1.0)을 사용하여 생성하였다. 모든 FASTQ 파일과 보충 파일은 등록 코드 GSE203345에 따라 국립 생명공학 정보 유전자 발현 옴니버스 센터에 업로드되었다. 전사체 데이터의 비교를 위해, 스피어맨의 상관 계수를 계산하고 코코르(v1.1-3)를 사용한 피셔의 Z 변환을 통해 통계적으로 테스트했다. 대조군으로 쓰인 인간의 건강한 종뇌 및 중뇌 조직의 전사체 데이터는 데이터 세트 PRJNA434002, GSE140231, GSE144136, GSE157783에서 나왔다. 유전자 온톨로지(GO) 용어는 fgsea (v1.16.0)를 사용한 유전자 집합 농축 분석(GSEA) 사전 순위 분석을 통해 식별되었다.
1-9. 통계분석
실험은 최소한 세 번 수행되었으며 데이터는 평균의 평균 ± 표준 오차로 제시되었다. 통계적 평가는 두 그룹에 대한 스튜던트의 t-검정 또는 두 그룹 이상이 비교될 때 일방향 분산 분석을 사용하여 수행되었으며, 이후 Tukey의 사후 검정을 수행했다. 통계적 유의성은 P<0.05로 설정되었다.
실시예 2. 저분자물질로 WNT 및 SHH 신호를 변조하여, hESC에서
복측 중뇌 신경 전구세포 생성
바닥판 특성을 가진 세포의 생성을 최소화한 상태에서 복측화(ventralization)를 위해 이중 SMAD 억제 및 SHH 신호의 미세 조절과 함께 WNT 신호 활성화를 사용하는 전략을 시도했다.
먼저 중뇌 특성화를 위해, CHIR(WNT 신호에 대한 저분자 작용제)의 최적 농도 범위를 0.4 내지 0.8 μM으로 결정했다. 실제로 이중 SMAD 억제에 의한 신경 분화 동안 0.6 μM CHIR를 처리한 경우 중뇌 운명의 획득을 나타내는 EN1 발현을 크게 증가시켰다(도 1A, 1B 및 도 6A, 6B). 이와 동시에 복측화를 수행하기 위해, 2일째부터 1μM SAG(SHH 신호의 저분자 작용제)와 CHIR을 같이 처리하면, EN1의 발현은 현저하게 감소시키는 한편, 바닥판 마커 FOXA2의 발현을 상향조정하였다(도 6B, 6C). 이는 높은 농도에서 SHH 작용제에 대한 조기 노출이 CHIR에 의해 유도된 중뇌 특성을 희생시켜 신경 전구세포를 바닥판 운명으로 복측화시켰기 때문이라 여겨진다. 따라서, EN1의 높은 발현을 유지하면서 FOXA2의 발현을 유의하게 상향 조정하지 않는 SHH 활성화를 위한 최적의 시간적 창을 찾고자 하였다. CHIR의 처리를 유지한 상황에서 SAG의 처리 시점을 늦출수록 EN1의 발현은 CHIR만으로 유도된 수준으로 회복되며, FOXA2의 발현은 크게 감소함을 확인하였다(도 6B, 6C). 또 다른 복측 마커인 NKX6.1의 발현은 SAG 처리 시 상향 조절되었으나, SAG 처리 시점이 지연된 경우(도 6D) FOXA2만큼 현저하게 감소하지 않았다. 이는 SAG 및 CHIR와의 지연된 공동처리가 바닥판 세포보다는 복부 중뇌 전구체를 유리하게 유도하는 것을 의미한다. 그럼에도 불구하고, CHIR 단독 처리에 비해 NKX6.1 발현이 크게 증가하지 않은 점 및 FOXA2이 여전히 강하게 발현하고 있다는 점을 고려할 때 이 복측화 전략은 좀 더 보완될 필요가 있었다(도 6C, 6D).
SAG의 처리 시점을 기준으로 그 이전을 제1배양 단계, 그 이후를 제2 배양 단계로 설정하고, 제1 배양 단계에서는 원래의 CHIR의 농도를 유지한 채, 제2 배양 단계에서 CHIR의 농도를 3 μM으로 높일 경우 EN1 발현이 더욱 상향 조절을 될 수 있다는 점을 확인하였다(도 1A, 1B). 이러한 두 단계 CHIR의 처리를 통상적으로 CHIR-부스팅 전략이라고 한다. 예기치 않게, 제2 배양 단계에서 CHIR과 SAG와의 공동 처리는 FOXA2의 상당한 하향 조절과 함께 NKX6.1을 추가로 상향 조절을 유도하는 것이 확인되었다(도 1A, 1C, 1D 및 도 6B 내지 6D). 이 배양 조건은 또한 전뇌 마커 FOXG1, 후뇌 마커 GBX2 및 등쪽 마커 PAX6의 발현을 크게 감소시켰으며(도 1E 내지 1G), 이는 CHIR-부스팅 전략 하에서 SAG의 공동 처리가 신경 전구세포를 복측 중뇌 운명으로 강력하게 유도함을 시사하면서, 부분적으로는 바닥판 세포의 유도를 억제함을 의미한다. 면역 세포 화학 염색 분석 결과, CHIR-부스팅 전략 하에 SAG를 제 2배양 단계에서 처리하면 NESTIN- 또는 SOX2-양성 신경 전구세포의 수에 큰 차이가 없이, 이중 SMAD 억제에서만 볼 수 있는 것보다 상당히 많은 수의 EN1-양성 세포가 생성되었음을 확인했다(도 1H 내지 1K). 종합적으로, 이러한 결과는 hESC로부터 복측 중뇌의 유전자 발현 패턴을 갖는 신경 전구세포(이하 복측 중뇌 신경 전구세포라고 함)의 생성을 의미한다. 따라서, 이후 이 방법을 기반으로 생성된 복측 중뇌 신경 전구세포를 사용하여 복측 중뇌 성상세포를 분화하였다.
실시예 3. NFIB 과발현을 통한 복측 중뇌 신경 전구세포로부터 복측 중뇌 성상세포의 유도
DOX-유도 렌티바이러스 시스템을 사용하여 복측 중뇌 신경 전구세포에 NFIB를 도입했다. SMAD 억제만으로 생성된 신경 전구세포는 비교를 위한 대조군으로 사용되었으며, 이들은 지역화(regionalization) 특성 부여를 위한 별도의 과정을 거치지 않았다. NFIB 과발현 후 21일째에 대조군과 실험군의 대부분의 세포가 전형적인 성상세포 형태를 가진 GFAP 양성 세포로 분화되었다(전체 세포 중 > 80%) (도 2A, 2B). 또한 대부분의 세포는 또다른 성상세포의 마커들인 CD44 및 S100α(각각 99.4% ± 0.5% 및 97.1% ± 0.6%)에 대해 양성이었다(도 7). 다양한 성상세포 마커에 대한 정량적 유전자 발현 분석을 통해 두 그룹 모두에서 비슷한 효율로 성상세포가 유도됨을 확인했고(도 2D 내지 2F), 이에 따라 NFIB 매개 성상세포 분화의 재현성을 입증하였다. 더 중요한 것은, 복측 중뇌 신경 전구세포에서의 NFIB 과발현이 대조군 신경 전구세포에서 보다 상당히 많은 수의 EN1- 및 GFAP-이중 양성 세포를 생성했다는 것이다(대조군 신경 전구세포 그룹에서 0.7% ± 0.1%, 복측 중뇌 신경 전구세포 그룹에서 83.8% ± 0.6%)(도 2C). 정량적 유전자 발현 분석 결과, EN1의 경우 성상세포 유도(도 2G) 이후 발현 수준은 신경 전구세포 단계와 비교하여 약간 감소했지만, 대조군 성상세포보다 복측 중뇌 신경 전구세포에서 유래한 성상세포에서 발현이 더 높은 것으로 나타났다. NKX6.1의 발현은 신경 전구세포 단계 및 대조군 성상세포의 두 경우 모두에 비해 복측 중뇌 신경 전구세포에서 유래한 성상세포에서 더 증가하였다(도 2H). 두 종류의 신경 전구세포 그룹에서 분화한 성상세포는, 비슷한 수준으로 배양 배지로부터 글루탐산염을 섭취할 수 있었다(도 2I). 활성화 성상세포를 유도하는 것으로 밝혀진 사이토카인 칵테일(즉, TNFα, IL1β, C1q)에 의해 자극되었을 때, 두 성상세포 그룹은 C3, LCN2 및 CXCL10과 같은 활성화 상태를 나타내는 다양한 유전자(예: C3, LCN2, CXCL10)를 현저하게 상향 조절함으로써 염증성 사이토카인에 반응하고 활성화되는 능력을 입증했다. 종합하면, 본 결과는 NFIB의 과발현을 통한 분화가 복측 중뇌 신경 전구세포로부터 기능성을 갖춘 성상세포를 생성하는 데 적용될 수 있고, 분화 후에도 복측 중뇌의 지역 정체성을 크게 잃지 않는다는 것을 시사한다. 따라서 대조군 신경 전구세포에서 분화된 성상세포와 구분하기 위해 복측 중뇌 신경 전구세포에서 분화된 성상세포를 이하, 복측 중뇌 성상세포라고 하겠다.
실시예 4. 복측 중뇌 성상세포 및 대조군 성상세포의 중뇌 도파민 신경세포 지원 능력 평가
성상세포는 신경세포의 분화를 촉진하는 기능을 보유한다. 또한 신경계의 각기 다른 지역에 존재하는 성상세포는 그들 주변 지역에 존재하는 신경세포의 분화를 더 촉진하는 지역 특이성을 보인다. 본 발명을 통해 분화된 복측 중뇌 성상세포가 이러한 지역 특이성이 있는지 여부를 조사하기 위해 대조군 성상세포 및 복측 중뇌 성상세포를 hESC 유래 중뇌 도파민 신경세포 전구체와 공동 배양하고 이들의 분화 촉진 효과를 비교했다. 중뇌 도파민 신경세포 전구체는 공지된 방법으로 hESC로부터 분화되었으며, 그 다음 기본 특성(즉, EN1, FOXA2 및 LMX1A에 대한 면역 반응성)은 면역세포화학염색을 통해 사전에 확인하였다(도 8). 그 다음, 도파민 신경세포 전구체를 배양 용기에 플레이팅하고, Transwell® 인서트에 접종된 성상세포가 있는 조건, 혹은 성상세포가 없는 조건에서 도파민 신경세포로 분화하도록 유도하였다. 공동 배양 2주 후에 수행된 면역세포화학염색 분석은 예상대로 성상세포와의 공동 배양이 없는 것과 비교하여 공동 배양(대조군 성상세포 및 복측 중뇌 성상세포 모두) 존재 하에 분화할 때 훨씬 더 많은 MAP2-양성 신경세포가 분화됨을 보여주었다. 흥미롭게도 복측 중뇌 성상세포와의 공동 배양은 대조군 성상세포를 사용한 것보다 훨씬 더 많은 MAP2 양성 신경세포와 TH 및 MAP2 이중 양성 도파민 신경세포를 생성했으며(도 3A, 3C 및 3D), 이는 복측 중뇌 성상세포가 대조군 성상세포보다 중뇌 도파민 신경세포의 분화를 지원하는 더 나은 능력을 가지고 있음을 시사한다.
본 발명에서 복측 중뇌 성상세포가 대조군 성상세포보다 중뇌 도파민 신경세포에 더 나은 신경보호 효과를 제공하는지 여부를 조사했다. 이를 위해 도파민 신경세포에 특이적인 신경 독성 화합물인 6-OHDA로 도파민 신경세포를 처리했다. 성상세포 공동배양 없이 6-OHDA에 16시간 동안 노출시키면, TH-양성 세포의 절반 이상(59.7% ± 1.0%)이 절단된 카스파제 3(c-cas3)에 대한 항체로 양성으로 표지되었으며, 이는 뚜렷한 세포 사멸을 나타낸다(도 4A-B 및 E). 그러나 대조군 성상세포와의 공동 배양은 세포 사멸성 도파민 신경세포(즉, c-cas3/TH-이중 양성 세포)의 수를 공동 배양이 없는 경우(42.1% ± 6.2%) 수의 약 2/3로 감소시켰다(도 4C, 4E). 세포 사멸성 도파민 신경세포의 수는 복측 중뇌 성상세포와 공동 배양 시 훨씬 더 감소했다(TH 양성 세포 중 14.7% ± 2.5%)(도 4D, 4E). 이 결과는 공동 배양의 두 성상세포가 6-OHDA의 신경 독성으로부터 도파민 신경세포를 보호했으며 특히, 복측 중뇌 성상세포가 신경 보호 측면에서 대조군 성상세포를 능가했음을 보여준다. 두 성상세포 그룹이 지역화를 제외하고 동일한 분화 방법에 의해 생성되었다는 점을 감안할 때, 중뇌 도파민 신경세포의 분화를 촉진하고 도파민 신경세포 선택적 독소로부터 더 잘 보호하는 능력은 복측 중뇌 성상세포의 영역 특이적 특징에 기인한다는 결론에 도달한다. 종합하면, NFIB의 과발현을 통한 분화는 신경 전구세포 단계에서 획득한 복측 중뇌 특이적 유전자 발현을 유지한 채로 성상세포의 분화를 유도할 수 있고, 그 결과로 얻어진 성상세포는 실제 뇌의 복측 중뇌에 존재하는 성상세포와 유사하게 지역 특이적 기능 중 일부를 수행할 수 있음을 보여주었다.
실시예 5. 복측 중뇌 성상세포의 지역 특이적 기능을 반영할 수 있는 분자적 특성의 확인
대조군 성상세포와 복측 중뇌 성상세포 간의 기능적 차이점의 기반이 되는 분자적 근거를 탐색하기 위해 NFIB 유도 후 3주 동안 분화된 세포의 전사체를 비교했다. 먼저 전사체 데이터의 주성분 분석(Principal Component Analysis)을 수행하여 대조군 성상세포와 복측 중뇌 성상세포 간의 유사점과 차이점을 시각화했다. 그 결과, 분화된 성상세포의 전사체 프로파일은 분화 조건별로 잘 그룹화되었다(도 9A). 이후, 신경세포 또는 희돌기아교세포와 관련된 유전자를 포함하여 성상세포와 관련된 주요 유전자의 발현 패턴을 조사했다(도 9B). 성상세포 관련 유전자는 대조군 성상세포와 복측 중뇌 성상세포 모두에서 높게 발현되었으며, 이는 분화된 세포가 성상세포의 운명을 획득하였음을 나타낸다. 반면에, 두 경우 모두에서 신경세포 및 희돌기아교세포와 관련된 유전자는 상대적으로 낮은 발현을 보였다. 종합하면, 전사체 분석 결과는 상기 분화 방법이 성공적으로 우선적인 성상 세포를 생성했음을 확인했다. 대조군 성상세포와 복측 중뇌 성상세포가 매우 유사한 전사체 발현 패턴을 보임에도 불구하고, 여러 지역 특이적 유전자의 발현에서 상당한 차이가 있었다. 중뇌 마커 유전자의 발현은 대조군 성상세포보다 복측 중뇌 성상세포에서 상대적으로 더 높았으며(도 5A), 이는 앞서 제시된 초기 특성 분석 결과와 잘 일치한다. 또한, 종뇌 특이적 유전자는 대조군 성상세포에서 더 많이 발현되었으며, 이는 지역화를 위한 특별한 조치가 없는 상태에서 hESC로부터 분화된 신경계 세포가 일반적으로 앞쪽의(anterior) 특성을 갖는다는 기존의 발견과 잘 일치한다.
복측 중뇌 성상세포가 대조군 성상세포보다 실제 인간 복측 중뇌 성상세포와 더 유사한지 여부를 알아보기 위해, 그들의 전체 전사체를, 건강한 대조군 인간 1차 중뇌 성상세포 및 전두엽 피질 성상세포의 전사체와 비교하였다. 유전자 특이적 발현 수준을 비교했을 때, 복측 중뇌 성상세포는 전두엽 피질 유래 성상세포보다 실제 중뇌에서 분리된 성상세포와 더 밀접하게 관련되었고(복측 중뇌 성상세포 vs. 중뇌 성상세포의 경우 R=0.58; 복측 중뇌 성상세포 vs. 전두엽 피질 성상세포의 경우 R=0.55), 그 상관관계의 차이는 통계적으로 의미가 있었다(p-값=0.0002)(도 5B). 더 높은 상관 계수는 복측 중뇌 성상세포가 전두엽 피질 성상 세포보다 중뇌 성상 세포와 더 유사함을 나타낸다. 대조적으로, 대조군 성상세포는 중뇌 성상세포 및 전두엽 피질 성상세포와의 상관 계수 측면에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 5C)(성상세포 vs. 중뇌 성상 세포의 경우 R=0.55, 성상세포 vs 전두엽 피질 성상세포의 경우 R=0.56, p-값=0.1194).
다음으로 대조군 성상세포에 대해 복측 중뇌 성상세포와 함께 GSEA를 수행하여 기능적 차이점에 대한 분자적 근거를 얻었다. 도 5D 내지 5F에서 볼 수 있듯이, 도파민 신경세포의 발생 및 WNT 신호 전달의 음성 조절과 관련된 유전자 세트는 복측 중뇌 성상세포에서 상당히 풍부하게 관찰되었다. WNT 신호 전달의 음성 조절에 대한 유전자 세트의 빈발(頻發)은 WNT 신호가 성상세포보다 복측 중뇌 성상세포에서 덜 억제되는 것으로 해석될 수 있다. 실제로, WIF1 및 FRZB를 포함한 내인성 WNT 억제제를 인코딩하는 것들은 대조군 성상세포에 비해 복측 중뇌 성상세포에서 하향 조절되었다(도 5G 내지 5J). 이와 더불어, WNT1 및 WNT5A와 같은 WNT 단백질을 코딩하는 유전자가 상향 조절되었다. 표준 및 비표준 WNT 신호 전달 경로가 중뇌 도파민 신경세포의 분화 및 생존에 중요한 역할을 한다는 점을 감안할 때, 이 결과는 복측 중뇌 성상세포에서 증강된 WNT 신호전달이 그 성상세포가 갖는 지역 특이적 활성의 기초가 될 수 있으며 또한 중뇌 도파민 신경세포의 분화 및 생존에서 복측 중뇌 성상세포의 두드러진 지원 뒤에 분자적 단서를 제공할 수 있음을 시사할 수 있다.
Claims (7)
- 0.4 내지 0.8μM의 CHIR99021 하에 전분화능 줄기세포를 제1 배양하고, 2.5 내지 3.5μM의 CHIR99021 및 0.5 내지 1μM의 SAG(smoothened agonist) 하에 상기 전분화능 줄기세포를 제2 배양하여, 상기 전분화능 줄기세포를 복측 중뇌 신경 전구세포로 분화시키는 단계; 및
상기 복측 중뇌 신경 전구세포에서 NFIB(nuclear factor IB)를 과발현시키고 제3 배양하여 복측 중뇌 성상세포로 분화시키는 단계;를 포함하는 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제1 및 제2 배양은 Y-27632, noggin, dorsomorphin, DMH1, LDN193189, 또는 SB431542를 포함하는 배지에서 수행되는, 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제1 배양에서의 CHIR99021 농도는 0.5 내지 0.7μM이고, 상기 제2 배양에서의 CHIR99021 농도는 2.75 내지 3.25μM 및 SAG 농도는 0.75 내지 1μM인, 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제1 배양은 4.5일 내지 5.5일, 제2 배양은 3.5일 내지 4.5일간 수행되는, 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 NFIB의 과발현은 NFIB를 코딩하는 유전자를 상기 복측 중뇌 신경 전구세포에 도입하여 수행되는, 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제1 배양 전에 상기 전분화능 줄기세포를 신경세포 분화 유도 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 전분화능 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포인, 줄기세포의 복측 중뇌 성상세포로의 분화 방법.
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|---|---|---|---|---|
| KR101862548B1 (ko) | 2017-07-24 | 2018-05-30 | 연세대학교 산학협력단 | 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로의 분화 유도용 조성물 및 이를 이용하여 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로 분화시키는 방법 |
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2022
- 2022-07-01 KR KR1020220081140A patent/KR20240003782A/ko unknown
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