KR20230173406A - 세균이 감소된 집먼지 진드기의 사육 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세균이 감소된 집먼지진드기의 사육 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항생제를 특정 농도로 1회 사용하여 18주 이상 세균 및 내독소 수준을 낮게 유지하는 집먼지진드기의 사육 방법으로, 이렇게 사육된 집먼지진드기 유래 알레르겐 농도 및 역할이 변함없음을 확인함으로써 집먼지진드기 추출물의 반복 투여가 필요한 알레르기 면역 요법에 효과적으로 이용될 수 있으리라 기대된다.
Description
본 발명은 세균이 감소된 집먼지 진드기의 사육 방법에 관한 것이다.
집먼지진드기(house dust mite: HDM)는 전세계적으로 실내에서 가장 일반적으로 발견되는 흡입성 알레르겐(aeroallergen)이다. 알레르겐에 만성적이고 지속적인 노출로 인한 감작(sensitization)은 어린 연령에서부터 시작되어 평생 동안 다양한 질병을 유발한다.
집먼지진드기 (house dust mite)는 인간이 거주하는 지역에서 서식하는 절지동물에 속하는 동물이다. 집먼지진드기는 사람의 인설을 먹고 서식하며, 주로는 도시형 가옥의 침대매트리스, 카펫, 가구 등에 다량으로 존재하며, 전 세계적으로 알레르기천식과 같은 알레르기질환의 병인에 가장 중요한 알레르겐으로 알려져 있다.
집먼지진드기의 소화기관에는 여려가지 소화효소가 존재하고, 이는 집먼지진드기가 배설하는 대변을 통해 공기 중으로 퍼져서, 이를 흡입하면 아토피 소인이 있는 사람에서 과민반응의 발생하고, 이후 집먼지진드기 유래 알레르겐에 반복 노출 시 재채기, 콧물과 같은 비염증상, 혹은 천명, 호흡곤란과 같은 천식증상, 가려움증과 같은 아토피피부염증상이 유발된다. 알레르기 질환을 일으키는 중요한 집먼지진드기에는 세로무늬먼지진드기(Dermatophagoides pteronyssinus)와 큰다리먼지진드기 (Dermatophagoides farinae)가 대표적이다. 세로무늬먼지진드기 유래 알레르겐으로서 Der p1, Der p2, Der p3, Der p4, Der p6, Der p9, 및 Der p15 등이 알려져 있고, 큰다리먼지진드기 유래 알레르겐으로 Der f1, Der f2, Der f11, 및 Der f18 등이 중요하다고 알려져 있다. 국내에서 조사된 역학연구 결과를 보면, 대도시지역 실내먼지에는 세로무늬먼지진드기 보다는 큰다리먼지진드기에서 유래하는 알레르겐이 주로 존재하는 것으로 보고되었다.
일련의 연구에서 HDM에 그람 음성 세균의 존재가 밝혀졌다. 특히, HDM는 바르토넬라(Bartonella), 엔테로코커스(Enterococcus), 박테로이데스 (Bacteroides) 마이크로박테리움(Microbacterium) 등의 박테리아를 포함하는 것으로 확인되었다.
HDM의 세균 물질은 톨 유사 수용체 및 NOD(뉴클레오티드 결합 올리고머화 도메인 함유 단백질)와 같은 패턴 인식 수용체를 통해 기도 상피 세포의 타고난 면역 기능에서 알레르기성 면역 반응의 발달을 위한 방아쇠 역할을 할 수 있다.
HDM에 존재하는 세균에서 유래한 내독소인 지질다당류(LPS)는 면역조절 물질의 특성이 잘 알려져 있다.
이렇게 HDM의 공생 세균은 면역 치료제의 임상 사용에서 면역학적 부작용의 위험이 있다.
이에, 보다 통제된 알레르기 면역치료제를 개발하기 위해 집먼지진드기에 풍부하게 존재하는 세균 물질의 위험을 줄이는 사육 방법이 필요하다.
이에, 본 발명에서는 HDM 배양 중 특정 농도와 시기에 항생제 처리로 HDM의 성장을 억제하지 않으면서 HDM의 공생 박테리아 및 LPS와 같은 물질을 감소시킴을 확인함으로써, 본 발명은 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 세균이 감소된 집먼지진드기의 사육 방법을 제공하는 데 목적이 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
사료 및 항생제가 혼합된 배지에 집먼지진드기를 접종하여 사육하는 단계 (1세대);
상기 1세대 사육이 끝난 집먼지진드기를 사료가 들어있는 새로운 배지에 옮겨 사육하는 단계 (2세대); 및
상기 2세대 사육이 끝난 집먼지진드기를 사료가 들어있는 새로운 배지에 옮겨 사육하는 단계 (3세대)
를 포함하는 세균이 감소된 집먼지진드기의 사육 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 사육 방법으로 얻은 집먼지 진드기 유래 알레르겐을 포함하는 알레르기 진단용 또는 면역치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 세균이 감소된 집먼지진드기 사육 방법으로 집먼지진드기를 사육하였을 때 세균 및 내독소를 감소시킬 수 있고 이를 이용한다면 인체에 안전할 뿐만 아니라 마우스 천식 모델을 포함한 일련의 실험에서 알레르겐 농도 및 역할이 변하지 않는 것을 확인하였으므로 면역 치료에 매우 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명이 암피실린 처리 후 배양된 집먼지진드기 특성을 나타낸 결과이다 [(a) 16S rRNA gene level을 real-time PCR로 측정. (b) 내독소 (LPS) 양. (c) 조항원 전기영동 패턴. (d) 주요 알레르겐 (Der f 1) 농도 *D.f.+AMP: 본 발명의 사육 방법(항생제 처리)으로 사육한 집먼지진드기; D.f.: 항생제를 쓰지 않고 사육된 집먼지진드기].
도 2는 암피실린 처리된 집먼지진드기(D.f.+AMP) 및 암피실린 비처리 집먼지진드기(D.f.)의 기도 상피 세포(BEAS-2B)에서 염증성 사이토카인 (a) IL-6 및 (b) IL-8 분비를 나타낸 것이다 [데이터는 최소 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표시됨. PBS, 인산완충식염수. **p < 0.01, *p < 0.05].
도 3은 암피실린 처리된 집먼지진드기(D.f.+AMP) 및 암피실린 비처리 집먼지진드기(D.f.)에 대한 마우스 천식 모델에 기도 과민성 유도한 실험 결과이다 [(a) 기도저항성, (b) 폐세척액 내 호산구 수, (c) 폐조직 내 면역세포 침윤, (d) 혈청 내 집먼지진드기 특이 IgE, IgG1, IgG2a 생성].
도 2는 암피실린 처리된 집먼지진드기(D.f.+AMP) 및 암피실린 비처리 집먼지진드기(D.f.)의 기도 상피 세포(BEAS-2B)에서 염증성 사이토카인 (a) IL-6 및 (b) IL-8 분비를 나타낸 것이다 [데이터는 최소 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표시됨. PBS, 인산완충식염수. **p < 0.01, *p < 0.05].
도 3은 암피실린 처리된 집먼지진드기(D.f.+AMP) 및 암피실린 비처리 집먼지진드기(D.f.)에 대한 마우스 천식 모델에 기도 과민성 유도한 실험 결과이다 [(a) 기도저항성, (b) 폐세척액 내 호산구 수, (c) 폐조직 내 면역세포 침윤, (d) 혈청 내 집먼지진드기 특이 IgE, IgG1, IgG2a 생성].
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 세균이 감소된 진드기의 사육 방법에 관한 것이다.
일 구현예에 있어서, 본 발명은 항생제를 특정 농도로 1회 사용하여 18주 이상 세균 및 내독소 수준을 낮게 유지하는 집먼지진드기의 사육 방법을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 본 발명은, 사료 및 항생제가 혼합된 배지에 집먼지진드기를 접종하여 사육하는 단계 (1세대); 상기 1세대 사육이 끝난 집먼지진드기를 사료가 들어있는 새로운 배지에 옮겨 사육하는 단계 (2세대); 및 상기 2세대 사육이 끝난 집먼지진드기를 사료가 들어있는 새로운 배지에 옮겨 사육하는 단계 (3세대)를 포함하는 세균이 감소된 집먼지진드기의 사육 방법을 포함한다.
본 발명에서 "진드기"라 함은 집먼지 진드기를 가리킨다. 이러한 집먼지진드기의 예로는 큰다리먼지진드기(Dermatophagoides farinae), 세로무늬먼지진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 등이 있다.
상기 세균은 집먼지진드기에 공생하는 박테리아를 의미하며, 특별히 제한은 없으나, 바르토넬라(Bartonella), 엔테로코커스(Enterococcus), 박테로이데스 (Bacteroides), 마이크로박테리움(Microbacterium) 등일 수 있다.
본 발명에서, "알레르겐 (allergen)"라 함은 알레르기를 유발하는 항원, 또는 알레르기성 질환의 원인이 되는 항원을 의미하는 것일 수 있다. 알레르겐 물질을 포함하는 어떠한 종류의 물질의 섭취 또는 접촉으로 인하여 생체 내에서 항체가 만들어지면, 같은 물질의 재섭취 또는 재접촉이 일어날 경우에 항원-항체 반응이 일어날 수 있다. 구체적으로, 알레르겐은 Der f1, Der f2, Der f5, Der f11, Der f18, Der f21 등일 수 있다.
본 발명에서 "Der f"는"Dermatophagoides farinae"를 의미하고, "Der f 1"은"Der f의 그룹 1 알레르겐"을 의미하며 "Der f 2"는 "Der f의 그룹 2 알레르겐"을 의미한다.
본 발명에 기재된 용어 “조항원(crude extract)”은 사육 후 회수한 집먼지진드기의 충체의 추출물을 의미한다.
본 발명에서, "진드기의 배양체(culture of mites)" 또는 "진드기 배양체(mite culture)", "전체 진드기 배양 체 (whole mite culture)" 및 "전체 배양체(whole culture)", "Der f 진드기 배양체" 또는 "Der f 진드기의 배양체"라는 용어는, 적절한 배지에서 Der f를 성장시킨 후 얻어진 물질로서, 진드기, 진드기의 일부, 배설물 입자, 알, 진드기 배지 성분 등을 포함하는 전체 배양체를 함유하는 것이다.
본 발명에서 "진드기 배양 배지(mite culture media) 또는 배지(medium)" 또는 "진드기 배지 또는 배지들"이라는 용어는 집먼지 진드기가 자라는데 적당한 음식물(diet)을 의미한다. 구체적으로 상기 배지는 어류 사료로 시판되는 것으로, 진드기를 배양할 수 있는 배지라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 배지에는 사료가 집먼지진드기 1 중량부에 대하여 8-12 중량부로 포함할 수 있다.
또한, 진드기 사료로는 효모와 어류 사료를 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 상기 효모는 비활성 건조 효모이며, 1 : 1의 중량 비율로 혼합 사용한다.
본 발명에서, 사용된 항생제는 암피실린이 바람직하며, 상기 항생제는 집먼지진드기 1 중량부에 대하여 0.05-0.15 중량부로 사용되는 것이 바람직하다. 이때, 항생제를 상기 범위 초과하여 사용한 경우에는 진드기의 생식 및 성장에 문제가 있고, 너무 적게 사용한 경우에는 원하는 세균 감소 효과를 얻기 어렵다.
진드기의 사육은 20 내지 30 도, 상대 습도 75~85%에서 5-7주간/세대 실시하며, 3세대 총 사육 기간은 18주 이상 실시할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 사육 방법으로 얻은 집먼지 진드기 유래 알레르겐을 포함하는 알레르기 질환 진단용 조성물을 포함한다.
본 발명에서, “알레르기 질환”이란, 집먼지진드기 유래 알레르겐에 의해 발생될 수 있는 질환이면 특별히 제한은 없으나, 천식, 비염, 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 "진단 (diagnosis)"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 집먼지진드기에 대한 알레르기 진단이란, 집먼지진드기에 대한 알레르기를 가지는지 여부 또는 집먼지진드기에 대한 알레르기를 가질 가능성을 확인하거나 그를 예측하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
상기 진단용 조성물에 있어서, 집먼지진드기에 대한 알레르기를 유발하는 원인인 알레르겐에 대해, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 항원-항체 반응을 확인함으로써 집먼지진드기에 대한 알레르기를 진단할 수 있다.
상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
진단 방법은 면역분석 (항원-항체 반응) 방법에 의해 실시될 수 있다. 상기 면역분석 방법은 피부단자검사, 방사능 면역분석, 방사능 면역침전, 면역침전, 효소결합 면역 흡착분석 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석 (flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 이를 참조할 수 있다.
예를 들면, 상기 방법이 방사능 면역분석으로 실시되는 경우, 방사능 동위원소로 표지된 항체가 이용된다. 또한, 상기 방법은 상술한 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지가 결합되어 있는 항체를 이용할 수 있다. 또는 예를 들면, 상기 방법이 ELISA로 실시되는 경우, (i) 동정한 상기 단백질을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 코팅 처리된 상기 고체 기질에 첨가하는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차 항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 이차 항체에 결합된 효소는 발색 반응, 형광 반응, 발광 반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들면, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 또는 시토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차 항체에 결합된 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트, 니트로 블루 테트라졸리움, 나프톨-ASB1-포스페이트 또는 증강된 화학형광 (enhanced chemifluorescence: ECF)와 같은 발색 반응 기질이 이용되고, 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약 (10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), p-페닐렌디아민-HCl 및 피로카테콜 (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol: HYR), 테트라메틸벤지딘 (tetramethylbenzidine: TMB), 2,2'-아진-디[3-에틸벤조티아졸린 설포네이트] (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]: ABTS), o-페닐렌디아민, 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-니트로블루 테트라졸리움 (t-nitroblue tetrazolium: t-NBT) 또는 m-펜나진 메토설포네이트 (m-phenazinemethosulfate: m-PMS)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 사육 방법으로 얻은 집먼지 진드기 유래 알레르겐을 포함하는 면역치료용 조성물을 포함한다.
상기 "면역치료 (allergen immunotherapy)"란 알레르기 질환을 일으키는 원인 물질인 알레르겐을 소량부터 서서히 증량하여 일정 기간 동안 개체에 주사로 투여함으로써, 특정 알레르겐에 대한 감수성 및 과민성을 저하시키는 치료법을 의미한다. 즉, 원인 알레르겐에 대한 경감작 요법을 의미한다. 상기 면역치료는 피하 및/또는 설하에 투여되는 것일 수 있다. 이러한 면역치료는 저농도에서 시작하여 알레르겐의 양을 서서히 증가해 유지 용량 에 이르게 하는 초기 치료 (initial therapy)와 이후 3 내지 5년간 지속하는 유지 치료 (maintenance therapy) 등 두 단계로 이루어진 것, 계절 직전에 1일 내지 1주 동안 고농도의 알레르겐을 투여하는 것, 또는 수년간 저농도로 알레르겐을 투여하는 것일 수 있다. 상기 단백질, 또는 조성물을 투여하는 면역치료를 통하여, 추후 알레르겐에 노출 시에 항원-항체 반응에 의한 증상의 발현을 예방 또는 억제하는 효과를 얻을 수 있다. 즉, 상기 단백질은 집먼지진드기에 대한 알레르기의 원인 물질이므로, 이를 집먼지진드기에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 면역치료제로서 활용할 수 있다.
본 발명에서 “알레르기 질환의 치료 또는 예방”이란, 알레르기질환의 경감, 완화 및 증상의 개선을 포함하며, 또한 알레르기질환이 걸릴 가능성을 낮추는 것을 포함하는 의미이다.
상기 조성물은 약학적 조성물인 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효 성분인, 상기 알레르겐을 0.0001 내지 50 중량%로 포함하는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조되는 것일 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 하나 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 기재되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구, 국소, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 비경구 투여시 비내, 설하, 복강내 주사, 직장내 주사, 피하 주사, 정맥 주사, 근육내 주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있다.
사용되는 조성물의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 투여 방식 또는 치료 기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 배설률 및 집먼지진드기에 대한 알레르기 증상의 중증도 등에 따라 그 범위가 조절될 수 있다.
일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 약 0.001 내지 10 ㎎/㎏, 약 0.01 내지 10 ㎎/㎏, 약 0.01 내지 5㎎/㎏, 약 0.1 내지 5 ㎎/㎏, 약 0.1 내지 3 ㎎/㎏, 약 0.1 내지 1 ㎎/㎏, 약 0.5 내지 1 ㎎/㎏으로 하루 1회 내지 수회로 나누어 투여될 수 있다.
상기 "개체"는 집먼지진드기에 대한 알레르기를 가지는지 여부 또는 집먼지진드기에 대한 알레르기를 가질 가능성을 확인하거나 그를 예측하고자 하는 개체를 의미한다. 상기 개체는 척추동물인 것일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등인 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 포유동물인 것일 수 있고, 보다 구체적으로 인간 (Homo sapiens)일 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예의 의해 제한되는 것은 아니다.
<재료 및 방법>
모든 동물 연구는 연세대학교 의과대학 실험동물자원위원회(번호: 2018-0316)의 승인을 받았습니다.
진드기 사육 및 단백질 추출
불활성 건조 효모(오뚜기)를 어류 사료(참넙치 스타트1호, 천하제일사료)와 1:1의 중량 비율로 혼합하고 고압 멸균하여 사료를 준비하였다.
D. farinae는 한국 가정의 침대에서 채집되었다. 진드기는 T75 세포 배양 플라스크(70075; SPL Life Sciences, 경기도, 한국)의 고압멸균 배지에서 25℃에서 6주 동안 배양하였다.
암피실린 처리-D. farinae 그룹은 항생제, 즉 ampicillin powder(Georgia Chemical & Equipment Co., Inc., Norcross, GA, USA)의 존재 하에 25℃에서 6주간 고압멸균 배지에서 100:1 중량 비율로 배양하였다.
(T75 세포 배양 플라스크에 고압 멸균된 사료 30g과 암피실린(ampicillin) 파우더를 300mg을 넣어 섞어주었다. 준비된 플라스크에 큰다리먼지진드기 (Dermatophagoides farinae) 3g을 접종하였다. 25℃, 상대습도 80%에서 6주 동안 사육하였다 (1세대).)
1세대 배양이 끝난 집먼지진드기 3g을 고압 멸균된 사료 30g이 들어있는 새 플라스크에 옮겨 닮는다. 25℃, 상대습도 80%에서 6주 동안 사육하였다 (2세대).
2세대 배양이 끝난 집먼지진드기 3g을 고압 멸균된 사료 30g이 들어있는 새 플라스크에 옮겨 닮는다. 25℃, 상대습도 80%에서 6주 동안 사육하였다 (3세대).
암피실린 없이 계대 배양한 후, 집먼지진드기를 포화 식염수로 수확하였다. 수확된 집먼지진드기를 초음파 처리에 의한 균질액 제조에 사용하고 10,000 xg에서 30분 동안 원심분리하였다. 세균을 포함한 이물질은 멸균된 0.22μm 기공 크기의 Millex-GP 주사기 필터(EMD Millipore, Burlington, MA, USA)를 사용하여 진드기 추출물에서 제거되었다.
실시간 중합효소연쇄반응
RNA는 TRIzol 시약(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 세포에서 분리되었다.
상보적 (c)-DNA는 고용량 RNA-to-cDNA 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 총 RNA 샘플에서 역전사되었다.
정량적 역전사(RT)-중합효소 연쇄 반응(PCR)은 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 40 PCR 주기 동안 이중 가닥 DNA의 합성을 모니터링하여 수행되었다.
프라이머의 서열은 다음과 같다: 16S rRNA 정방향 프라이머(BACT1369F): 5'-CGGTGAATACGTTCYCGG-3', 16S rRNA 역방향 프라이머(PROK1492R): 5'-GGWTACCTTGTTACGACTT-3', D. farinae 신장 인자 1-α 정방향 프라이머(EF1αF): 5'-ACCCGTGAACATGCTTTGCT-3', D. farinae 신장 인자 1-α 역방향 프라이머(EF1αR): 5'-CACCATTCTCTCAAGCTCGT-3'.
상대적 mRNA 수준은 ΔΔ방법을 사용하여 정량화되었고 D farinae EF 1-α로 정규화되었다.
LPS 측정
LAL QCL-1000 Kit(Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하여 암피실린 처리-D. farinae 및 비처리-D. farinae 추출물의 LPS 농도를 측정하였다.
Der f 1 측정의 농도
진드기의 Der f 1 농도는 Der f 1 ELISA 키트(INDOOR Biotechnologies, Charlottesville, VA, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.
효소 결합 면역흡착 분석법에 의한 세포 배양 및 사이토카인 측정
인간 기관지 상피 세포(BEAS-2B, ATCC®CRL-9609™, Rockville, MD, USA)는 American Type Culture Collection에서 입수하였다. BEAS-2B 세포는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/F40 배지에서 37°C 및 5% 이산화탄소에서 유지되었다. HDM은 6well 플레이트에 1 x 106 cells/well 농도로 접종된 세포를 처리하는데 사용되었다. 세포는 암피실린 처리-D. farinae 및 비처리-D. farinae 추출물 각각에 100 μg/mL에 단일 노출 후 24시간 동안 샘플링되었다. 배지에서 생성된 사이토카인의 양은 제조사의 지침에 따라 Quantikine 인간 인터루킨(IL)-6 및 IL-8 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정되었다. 3개의 독립적인 샘플을 대조군으로 진드기 추출물 또는 인산완충식염수(PBS)에 노출시킨 후 조사하였다.
마우스 천식 모델 제작
마우스는 특정 병원균이 없는 조건과 12시간의 명암 주기 하에 수용되었다. 암컷 BALB/c 마우스(8주령)는 Orient Bio(한국 성남)에서 구입하였다. 세 그룹의 마우스: 암피실린 처리-D.farinae (D.f. + AMP, n = 5) 추출물로 감작 및 투여된 마우스, 비처리-D.f. (D.f., n = 5) 추출물로 감작 및 투여된 마우스 및 대조군 그룹(n = 5).
0일과 14일에 마우스에게 진드기 추출물을 복강내 주사하여 감작시켰다. 100 마이크로그램의 진드기 추출물(D.f. 또는 D.f. + AMP)을 2 mg의 명반에 재현탁시켰다. 24일째에, 마우스에 연속 3일(24일, 25일 및 26일) 동안 공격을 가했습니다. D.f.의 진드기 추출물 및 D.F. + AMP 그룹(30μg)을 PBS에 재현탁하고 50μL의 용액을 마우스에 비강 투여하였다. 대조군 마우스는 50 μL의 멸균 PBS를 받았다. 기도 염증 평가는 마지막 투여 후 24시간에 수행되었다.
기도 염증 평가
기도 과민성(AHR)은 Anisakis pegreffii extract induces airway inflammation with airway remodeling in a murine model system. Biomed Res Int 2021;17:2522305.에 설명한 대로 FlexiVent 시스템(Scireq Inc., Montreal, QC, Canada)을 사용하여 마지막 투여 24시간 후에 측정되었다. 헤마톡실린과 에오신을 사용한 폐 조직의 조직학적 분석과 periodic acid-Schiff 염색을 상기 문헌에 기재된 대로 수행하였다.
D. farinae 특이 면역글로불린 측정
D. farinae 특이적 면역글로불린(Ig)-G1, IgG2a 및 마우스 혈청 내 IgE 수준은 ELISA를 사용하여 측정되었다.
간단히 말해, 50 μL의 희석된 혈청을 각 웰에 첨가하고 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, 웰을 세척 완충액(PBS 중 0.05% Tween-20)으로 세척하고 적절한 항체와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다.
2차 항체는 비오틴화된 항-마우스 IgE(1:1000; 408804; BioLegend, San Diego, CA, USA), 비오틴화된 염소 항-마우스 IgG1(1:10000; NBP1-69914B; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)) 및 비오틴화된 염소 항-마우스 IgG2a(1:10000; NBP1-69915B; Novus Biologicals)을 사용하여 검출되었다.
신호는 streptavidin-peroxidase 처리 후 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine을 사용하여 발생시켰다. 광학 밀도는 VersaMax(Molecular Devices, Seoul, South Korea)를 사용하여 450 nm의 파장에서 측정하였다. 데이터는 PBS 노출 대조군의 데이터로 정규화되었다.
통계 분석
모든 결과는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표시된다. AHR의 다변수 데이터는 이원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Bonferroni의 사후 테스트를 사용하여 그룹 차이에 대해 평가되었다. 나머지 데이터는 Student's t-test 또는 ANOVA를 사용하여 분석한 다음 Bonferroni의 사후 테스트를 사용하여 분석하였다. GraphPad Prism 소프트웨어(버전 9.0; GraphPad, Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 설정되었다.
<결과>
RT-PCR은 항생제 처리가 D. farinae의 세균 유전자 수준을 감소시켰음을 확인했으며, 이는 3세대 사육(1세대당 6주 사육, 도 1a) 동안 증가하지 않았다. 박테리아 양은 암피실린 처리 후 3회 배양 후 암피실린 처리군이 처리되지 않은 그룹 보다 150배 더 낮았다(도 1a).
또한, 암피실린 처리 후 3회 배양 후 HDM 추출물의 면역학적 특성의 변화를 평가하였다. LPS 농도는 암피실린 처리-D farinae 군은 비처리-D. farinae군 대비 150,000배 이상 감소하였다 (도 1b).
도 1b에서 positive control(D. farina)로 사용된 것을 사후 멸균, 즉 필터를 이용해서 세균을 제거하는 기존 진드기 세균 처리법으로, 실험군은 암피실린 처리하여 세균을 제거하는 멸균 작업에 해당됨)
그러나 겔 전기영동의 단백질 패턴과 진드기 추출물의 알레르겐(Der f 1) 농도는 암피실린 처리-D farinae 군과 비처리-D. farinae 군 간에 차이가 없었다(도 1c, d).
IL-8 및 IL-6의 수준은 비처리-D. farinae를 가진 세포와 비교하여 암피실린 처리-D. farinae로 처리된 세포에서 유의하게 감소하였다(도 2a, b). 이는 LPS와 같은 D. farinae의 박테리아 유래 물질이 시험관 내 기도의 상피 세포에서 알레르기 관련 전염증성 사이토카인의 분비에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
다음으로, 생체 내에서 암피실린 처리-D. farinae 및 비처리-D. farinae의 알레르기성을 비교하기 위해 천식 마우스 모델을 개발하였다. 알레르기성 염증은 암피실린 처리-D. farinae 군과 비처리-D. farinae 군 모두에서 유도되었다.
암피실린 처리-D. farinae 조항원과 비처리-D. farina 조항원을 이용하여 마우스 천식 모델을 제작하였을 때, 두 군에서 모두 천식 모델이 잘 만들어졌으며, 기도저항성 (도 3a), 폐세척액 내 호산구 수 (도 3b), 폐조직 내 면역세포 침윤 (도 3c), 혈청 내 집먼지진드기 특이 IgE, IgG1, IgG2a 생성 (도 3d)에서 모두 차이가 없었음을 확인하였다.
이는 항생제를 적절한 시기에 특정 양을 처리할 경우, 집먼지진드기의 생장과 생식에 영향을 주지 않으면서 진드기 체내 세균량을 감소시킬 수 있음을 의미한다.
<토의>
본 발명자들은 초기 1회 암피실린 투여가 HDM에서 최소 18주 동안 낮은 수준의 세균을 유지하기에 충분하다는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 사육 방법으로 사육된 HDM 추출물은 암피실린 없이 사육된 HDM 추출물과 젤 전기영동 및 주요 알레르겐 농도(Der f 1)에서 동일한 단백질 패턴을 보였다(도 1).
또한, 인간의 기도 상피 세포를 항생제 처리된 HDM으로 처리했을 때 전염증성 사이토카인인 IL-6 및 IL-8의 분비가 감소하는 것을 보여주어(도 2), HDM의 박테리아가 면역 반응에 영향을 미쳤다는 증거를 제공하였다.
또한, D. farinae가 높은 세균 농도와 LPS를 가지고 있으며 세균에 대한 면역 반응 경로가 D. farinae 처리된 인간 기도 세포에서만 활성화된다는 것을 보여주었다.
LPS는 TLR4 신호 전달을 통해 흡입된 알레르겐에 대한 2형 면역 반응의 발달을 유도할 수 있다. 또한 LPS는 천식과 같은 알레르기 질환의 발병 및 중증도를 결정하는 역할을 하는 것으로 보고되었다. HDM의 LPS는 기도 상피 세포의 TLR4 트리거로 작용하고 점막 수지상세포 활성화를 통해 알레르기 염증을 유도한다.
본 실험에서 암피실린 처리된 D. farinae를 사용하여 마우스 천식 모델을 평가했을 때 알레르기성 기도 염증의 주요 특징을 관찰했을 때. 또한 HDM 특이적 IgE, IgG1 및 IgG2 수치가 증가하여 암피실린을 치료하지 않은 HDM 천식 모델과 유사하게 나타났다(도 3).
실제로, 수지 컬럼에 의해 생성된 낮은 수준의 LPS를 갖는 HDM 추출물이 마우스 모델에서 알레르기성 기도 염증의 모든 매개변수를 유발할 수 있다고 보고되었다.
또한, 암피실린 처리된 D. farinae 추출물이 처리되지 않은 D. farinae 추출물과 동일한 단백질 패턴 및 주요 알레르겐 Der f 1 농도를 가짐을 보여주었습니다(도 1c, d). Der f 1을 포함하여 암피실린으로 처리된 D. farinae의 알레르겐은 박테리아와 박테리아 물질의 농도가 상당히 감소했지만 본 실험에서 제작한 마우스 모델에서 알레르기 면역 반응을 유도하는데 알레르기 역할을 했을 수 있다.
본 발명자들은 암피실린을 사용하여 18주 이상 세균 수준을 낮게 유지하는 HDM용 배양 방법을 개발하였다. 진드기 사료에 항생제를 1회 투여하고, 항생제 농도를 여러 계대를 통해 지속적으로 희석하였다. 주요 알레르겐인 Der f 1은 본 발명에 따른 사육 방법으로 사육된 세균이 감소된 HDM 추출물에서 감소되지 않았으며 추출물은 마우스 모델에서 알레르기성을 나타냈다. 따라서 HDM 추출물의 반복 투여가 필요한 알레르기 면역 요법에 안전하게 사용할 수 있다.
Claims (10)
- 사료 및 항생제가 혼합된 배지에 집먼지진드기를 접종하여 사육하는 단계 (1세대);
상기 1세대 사육이 끝난 집먼지진드기를 사료가 들어있는 새로운 배지에 옮겨 사육하는 단계 (2세대); 및
상기 2세대 사육이 끝난 집먼지진드기를 사료가 들어있는 새로운 배지에 옮겨 사육하는 단계 (3세대)
를 포함하는 세균이 감소된 집먼지진드기의 사육 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 항생제는 암피실린인 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 배지에는 사료가 집먼지진드기 1 중량부에 대하여 8-12 중량부로 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 항생제는 집먼지진드기 1 중량부에 대하여 0.05-0.15 중량부로 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 사육은 20 내지 30 도, 상대 습도 75~85%에서 5-7주간/세대 실시하며, 총 사육 기간은 18주 이상인 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 세균은 바르토넬라(Bartonella), 엔테로코커스(Enterococcus), 박테로이데스 (Bacteroides) 및 마이크로박테리움(Microbacterium)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 집먼지진드기는 큰다리먼지진드기(Dermatophagoides farina)인 방법.
- 청구항 1의 사육 방법으로 얻은 집먼지 진드기 유래 알레르겐을 포함하는 알레르기 진단용 조성물.
- 청구항 1의 사육 방법으로 얻은 집먼지 진드기 유래 알레르겐을 포함하는 면역치료용 조성물.
- 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
상기 알레르겐은 Der f1, Der f2, Der f5, Der f11, Der f18 및 Der f21로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220074130A KR20230173406A (ko) | 2022-06-17 | 2022-06-17 | 세균이 감소된 집먼지 진드기의 사육 방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020220074130A KR20230173406A (ko) | 2022-06-17 | 2022-06-17 | 세균이 감소된 집먼지 진드기의 사육 방법 |
Publications (1)
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| KR20230173406A true KR20230173406A (ko) | 2023-12-27 |
Family
ID=89378384
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| KR (1) | KR20230173406A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011151449A1 (en) | 2010-06-03 | 2011-12-08 | Alk-Abelló A/S | Pharmaceutical product comprising mite allergen extract(s) and a method for the manufacture thereof |
-
2022
- 2022-06-17 KR KR1020220074130A patent/KR20230173406A/ko unknown
Patent Citations (1)
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