KR20230171452A - Pd-1 및 tim-3을 표적으로 하는 이중특이적 항체 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 대상체에서 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 단백질-3(TIM-3)과 포스파티딜세린(PS) 간의 맞물림을 변경하는 방법을 제공한다. 또한, TIM-3 결합 단백질을 사용하는 치료 방법이 제공되며, 여기서 TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 면역글로불린 가변(IgV) 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다.

Description

PD-1 및 TIM-3을 표적으로 하는 이중특이적 항체
1. 기술분야
본 개시내용은 일반적으로 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 단백질-3(TIM-3) 결합 단백질을 사용하는 작용 기전 및 치료 방법에 관한 것으로, 여기서 TIM-3 결합 영역은 TIM-3의 면역글로불린 가변(IgV) 도메인에 특이적으로 결합한다.
2. 배경기술
암은 계속해서, 세계적으로 주요한 건강상의 부담이 되고 있다. 면역종양학의 발전에도 불구하고, 특히 면역종양(IO) 획득 저항을 가진 환자의 경우, 효과적인 치료법에 대한 충족되지 않은 의료 수요가 계속해서 존재한다.
암에 대한 IO 치료제로서의 잠재적인 유용성에 대해 많은 분자 표적이 확인되었다. 면역종양학 치료법 영역에서 치료 잠재력에 대해 연구되고 있는 일부 분자 표적에는 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4 또는 CD152), 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1 또는 B7-H1 또는 CD274), 프로그램된 사멸-1(PD-1), OX40(CD134 또는 TNFRSF4) 및 T 세포 억제성 수용체 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3(TIM3)이 포함된다. 그러나 모든 환자가 면역 요법에 반응하는 것은 아니며 일부 환자는 시간이 지남에 따라 반응을 멈춘다. 이러한 IO 획득 저항에 대한 이유는 연구자들이 밝혀내지 못했다.
이와 같이 면역 요법, 특히 IO 획득 저항을 극복하고 현재 임상적으로 평가된 면역 요법 전략보다 환자 반응을 향상시키는 면역 요법에 대한 후보 표적을 계속 동정할 필요가 여전하다.
3. 발명의 내용
대상체에서 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 단백질-3(TIM-3)과 포스파티딜세린(PS) 간의 맞물림을 변경하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 면역글로불린 가변(IgV) 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 항체 투여가 없는 경우에 비해 대상체에서 항종양 활성을 증가시킨다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 대상체에서 항종양 활성을 증가시킨다.
또한 대상체에서 T 세포 매개 항종양 활성을 증가시키는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 대상체에서 T 세포 매개 항종양 활성은 항체 투여가 없는 경우에 비해 증가된다. 일부 양태에서, 대상체에서 T 세포 매개 항종양 활성은 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 증가된다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 항체 투여가 없는 경우에 비해 대상체에서 아폽토시스성 종양 세포의 수지상 세포 포식작용을 증가시킨다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 대상체에서 아폽토시스성 종양 세포의 수지상 세포 포식작용을 증가시킨다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 항체 투여가 없는 경우에 비해 대상체에서 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시를 증가시킨다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 대상체에서 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시를 증가시킨다.
또한 대상체에서 종양 세포의 수지상 세포 포식작용을 촉진하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다.
또한 대상체에서 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시를 증가시키는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 수지상 세포 교차 제시의 수준은 항체 투여가 없는 경우에 비해 증가된다. 일부 양태에서, 수지상 세포 교차 제시의 수준은 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 증가된다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 항체 투여가 없는 경우에 비해, 대상체에서 TIM-3 양성 T 세포에 대한 맞물림이 일어날 때 IL-2 분비를 증가시킨다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해, 대상체에서 TIM-3 양성 T 세포에 대한 맞물림이 일어날 때 IL-2 분비를 증가시킨다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 대상체에서 종양 성장의 억제를 초래한다. 일부 양태에서, 종양은 진행성 또는 전이성 고형 종양이다. 일부 양태에서, 대상체는 난소암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 방광암, 두경부암, 흑색종, 췌장암, 신장 세포 암종, 폐암, 식도암, 위암, 담도 종양, 요로상피암종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 중 하나 이상을 앓는다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, 대상체는 면역종양(IO) 획득 저항을 갖는다.
또한 IO 획득 저항을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 암은 난소암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 방광암, 두경부암, 흑색종, 췌장암, 신장 세포 암종, 폐암, 식도암, 위암, 담도 종양, 요로상피암종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 중 하나 이상이다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 양태에서, 대상체는 근치적 수술 또는 방사선으로 치료되지 않는 문서화된 III기, 또는 IV기 비소세포 폐암종(NSCLC)을 앓는다. 일부 양태에서, NSCLC는 편평 또는 비편평 NSCLC이다. 일부 양태에서, 대상체는 항-PD-1/PD-L1 요법으로 최소 3~6개월 동안 단일 요법으로 또는 화학 요법과 병용하여 초기 치료 후 방사선학적으로 문서화된 종양 진행 또는 임상적 악화를 갖고, 초기 임상적 이점, 즉 질환 안정화 또는 관해의 징후를 가졌다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, IO 획득 저항은 다음과 같이 정의된다: (i) 항 PD-1/PD-L1 단일 요법에 대한 6개월 미만의 노출 후 초기에 부분 관해 또는 완전 관해의 최적의 전반적인 반응(BOR)에 이어, 치료 중 질환이 진행되거나 항 PD-1/PD-L1 치료 중단 후 12주 이내에 질환이 진행된 경우; 또는 (ii) 항 PD-1/PD-L1 요법 단독 또는 화학요법과의 병용에 대한 6개월 이상의 노출 후 질환 안정화, 부분 관해, 또는 완전 관해의 BOR에 이어, 치료 중 질환이 진행되거나 항-PD-1/PD-L1 치료 중단 후 12주 이내에 질환이 진행된 경우.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, IO 획득 저항은 항 PD-1/PD-L1 요법 단독 또는 화학요법과의 병용에 대한 6개월 이상의 노출; 질환 안정화, 부분 관해, 또는 완전 관해의 최적의 전반적인 반응(BOR)에 이어, 치료 중 질환이 진행되거나 항-PD-1/PD-L1 치료 중단 후 12주 이내에 질환이 진행된 경우로 정의된다. 일부 양태에서, 대상체의 PD-L1 종양 비율 점수(TPS)는 1% 이상이다. 일부 양태에서, 대상체는 제1선의 환경에서 사전 전신 요법을 받지 않았다. 일부 양태에서, 사전 전신 요법은 항-PD-1/PD-L1 요법 이외의 IO 요법이다. 일부 양태에서, 대상체는 사전 신/보조 요법을 받았지만 항-PD-1/PD-L1 요법의 마지막 투여 후 적어도 12개월 동안 진행하지 않았다. 일부 양태에서, 대상체의 PD-L1 TPS는 50% 이상이다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 상보성 결정 영역(CDR): 각각 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 및 9, 또는 각각 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 에피토프는 TIM-3의 N12, L47, R52, D53, V54, N55, Y56, W57, W62, L63, N64, G65, D66, F67, R68, K69, D71, T75, 및 E77을 포함한다(서열번호 29).
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)의 제1 세트: 각각 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 및 9, 또는 각각 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; PD-1 결합 도메인은 CDR의 제2 세트: 각각 서열번호 4, 5, 6, 10, 11, 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함한다.
일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 도메인(VH), 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 가변 도메인(VL), 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 VH, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄 VL을 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 비글리코실화 Fc 영역을 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 탈글리코실화된 Fc 영역을 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 감소된 푸코실화를 갖거나 비푸코실화된 Fc 영역을 포함한다.
또한 진행성 또는 전이성 NSCLC를 앓는 대상체의 NSCLC를 치료하는 방법이 본원에 개시되며, 방법은 PD-1 결합 도메인 및 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 이중특이적 결합 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하고, 대상체는 IO 획득 저항을 갖는다.
또한 진행성 또는 전이성 종양을 앓는 대상체의 비소세포 폐 종양의 성장을 억제하는 방법이 본원에 개시되며, 방법은 PD-1 결합 도메인 및 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 이중특이적 결합 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하고, 대상체는 IO 획득 저항을 갖는다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 에피토프는 TIM-3의 N12, L47, R52, D53, V54, N55, Y56, W57, W62, L63, N64, G65, D66, F67, R68, K69, D71, T75, 및 E77을 포함한다(서열번호 29). In
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, NSCLC는 편평 또는 비편평 NSCLC이다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1a는 이소형 대조군과 비교하여, 그리고 인간(h-)TIM-3과 포스파티딜세린(PS)의 상호작용을 감소시키는 항-TIM-3 mAb(F9S)와 비교하여, O13-1 단클론 항체(mAb)(AZD7789에 대한 모 항-TIM-3 mAb)가 h-TIM-3과 포스파티딜세린의 결합을 증가시킴을 보여준다.
도 1b는 2가 mAb O13-1 결합과 비교하여, 그리고 이소형 대조군과 비교하여, AZD7789에 의한 TIM-3의 1가 맞물림이 포스파티딜세린과 TIM-3 상호작용을 증가시키기에 충분하다는 것을 보여준다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 2는 아폽토시스성 세포와의 h-TIM-3 상호작용을 감소시키는 항-PD-1(LO115), PS-차단 항-TIM-3 mAb(F9S), Duet LO115/F9S, 및 E2E와 비교하여, O13-1 단클론 항체(mAb) 및 AZD7789 mAb가 인간 TIM-3 IgV와 아폽토시스성 세포의 결합을 증가시킴을 보여준다.
도 3은 AZ 항-TIM3 클론 62GL 및 O13이 TIM3을 발현하는 Jurkat T 세포로부터 IL-2 생산을 향상시키는 유사한 효과를 매개한다는 것을 보여준다. 따라서 62GL과 O13 사이의 하나의 아미노산 차이는 이 표현형에 영향을 미치지 않는다.
도 4는 T 세포 자극 시 h-TIM-3 발현 Jurkat 세포의 IL-2 생산 증가를 유도하는 항-TIM-3 mAb O13-1의 농도 의존적 효과를 보여준다. 평가된 다른 모든 항-TIM-3 mAb는 IL-2 생산에서 농도 의존적 감소를 입증하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 5는 세포가 포스파티딜세린과의 TIM-3 상호작용을 차단하는 고농도의 항-TIM-3 mAb F9S 중에서 배양될 경우 자극 및 항-TIM-3 mAb O13-1의 첨가 후 h-TIM-3 발현 Jurkat 세포로부터 관찰된 IL-2의 증가가 제거됨을 보여준다.
도 6은 Jurkat T 세포로의 TIM3의 도입이 IL-2 생산을 향상시키며, 이는 AZ 항-TIM3(클론 O13)에 의해 추가로 증가되고, 경쟁자 유사 항-TIM3(F9S)에 의해 감소됨을 보여준다. 이 약물 효과는 포스파티딜세린에 대한 TIM3 결합에 의존하는데, 이는 결합에 중요한 잔기의 돌연변이(R111A)가 약물 효과뿐만 아니라 Jurkat T 세포로부터의 전체 IL-2 생산을 없애기 때문이다.
도 7의 A 및 B는 AZD7789 및 이의 모 항-TIM-3 mAb O13-1이 자극된 1차 인간 PBMC의 IFN-γ 분비를 향상시킴을 보여준다. 도 7의 A는 한 공여자의 세포에서 mAb 투여의 결과로서 자극된 1차 인간 PBMC의 IFN-γ 분비를 보여준다. 도 7의 B는 또 다른 공여자의 세포에서 mAb 투여의 결과로서 자극된 1차 인간 T 세포의 IFN-γ 분비를 보여준다. 테스트 항체는 설명표에 제시되어 있다. 오차 막대는 3반복구 웰의 SEM을 나타낸다.
도 8의 A 및 B는 AZD7789가 아폽토시스성 종양 세포의 수지상 세포 이페로사이토시스(efferocytosis)를 향상시킬 수 있음을 보여준다. 도 8의 A는 실시간(시간)으로 테스트 항체를 투여하거나 약물을 투여하지 않은 후 아폽토시스성 Jurkat 세포의 수지상 세포 이페로사이토시스를 보여준다. 도 8의 B는 테스트 항체 투여 후 이페로사이토시스의 배수 변화를 보여준다. 이페로사이토시스의 배수 변화는 약물 치료가 없는 군에서 결정하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 9의 A 및 B는 테스트 항체의 존재 또는 부재 하에 아폽토시스성 종양 세포와 함께 사전 인큐베이션된 수지상 세포와의 공동 배양 후 1차 인간 T 세포로부터의 T 세포 증식 백분율을 보여준다. 도 9의 A는 아폽토시스성 MART-1 발현 Jurkat 세포와 함께 사전 인큐베이션된 수지상 세포와의 공동 배양 후 MART-1 반응성 T 세포 증식 백분율을 보여준다. 도 9의 B는 아폽토시스성 CMVpp65 발현 Jurkat 세포와 함께 인큐베이션된 수지상 세포와의 공동 배양 후 CMVppp65 반응성 T 세포 증식 백분율을 보여준다.
도 10의 A 및 B는 인간 종양 반응성 T 세포의 입양 전달이 있는 인간화 마우스 모델에서 AZD7789가 항-PD-1 단독에 비해 종양 조절(도 10의 A) 및 생존(도 10의 B)을 향상시킴을 보여준다.
도 11의 A 및 B는 AZD7789로의 치료가 항-PD-1 mAb 단독 치료, 또는 2가 mAb로서 또는 이중특이적 형식의 포스파티딜세린 차단 항-TIM-3 분자와의 병용 치료와 비교하여 인간화 마우스 생체 내 모델에서 감소된 종양 성장을 초래함을 보여준다. 도 11의 A는 제1 공여자에서 테스트 항체를 투여한 후의 종양 부피를 보여준다. 도 11의 B는 또 다른 공여자에게 테스트 항체를 투여한 후의 종양 부피를 보여준다. 수평 막대는 군내 산술 평균 종양 부피를 나타낸다.
도 12의 A 내지 C는 AZD7789의 투여가 항-PD-1 치료를 진행한 마우스로부터 채취한 생체 외 자극된 종양 침윤 림프구의 IFN-γ 분비를 증가시킴을 보여준다. 도 12의 A는 인간화 마우스 모델에서 항-PD-1 항체 투여의 종양 부피 및 테스트 약물로 절제된 종양의 생체 외 자극에 대한 결과를 보여주는 연구 개략도이다. 도 12의 B는 이소형 대조군과 비교하여 항-PD-1 항체 LO115 및 AZD7789의 첨가 후 생체 외 자극된 종양 침윤 림프구의 IFN-γ 분비의 배수 변화 편집본을 보여준다. 도 12의 C는 이소형 대조군과 비교하여 항-PD-1 항체 LO115 및 AZD7789의 첨가 후 하나의 대표적인 마우스로부터 채취한 생체 외 자극된 종양 침윤 림프구의 IFN-γ 분비 증가를 보여준다.
도 13a는 인간 PC9-MART-1 종양 세포를 피하 이식한 인간화 면역결핍 마우스에서 이소형 대조군, AZD7789, 항-PD-1 LO115 항체 단독 및 항-PD-1 치료에 이은 AZD7789의 순차적 치료 후의 종양 성장 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 13b 및 도 13c는 항-PD-1 항체 치료 후 AZD7789로 순차적으로 치료하자 항-PD-1 항체만을 사용한 연속 치료와 비교하여 마우스에서 종양 성장을 지연시킬 수 있음을 보여준다. 도 13b 는 이소형 대조군 치료, 항-PD-1 항체 LO115의 연속적 치료, 및 항-PD-1 항체 치료 후 AZD7789의 순차적 치료 후의 종양 부피의 변화를 보여준다. 도 13c는 항-PD-1 항체 치료 후 AZD7789의 순차적 치료와 비교한, 항-PD-1 항체 LO115의 연속적 치료 후의 종양 부피의 배수 변화를 보여준다.
도 14는 AZD7789의 제안된 작용 기전을 보여주는 개략도이다.
도 15의 A는 Ca++와 결합된 인간 TIM-3 IgV 도메인의 리본 다이어그램이다. 도 15의 B는 Ca++와 결합된 인간 TIM-3 IgV 도메인의 표면도이다. 가닥은 대문자로 표시되고 루프(BC, CC', C'C", DE 및 FG)는 이탤릭체로 강조 표시된다. 포스파티딜세린은 루프 CC' 및 FG에 의해 정의된 도메인의 갈라진 틈새에서 결합한다.
도 16a 및 도 16b는 AZD7789와 F9S 항체의 결합을 보여주는 개략도이다. 도 16a는 포스파티딜세린 및 Ca++ 이온 결합 부위에 가까운 CC' 및 FG 루프 근처의 IgV 도메인 근처의 F9S의 결합을 보여준다. AZD7789는 IgV 베타 샌드위치의 다른 쪽에 결합한다. 도 16b는 IgV 베타 샌드위치에 결합된 항체 리본을 보여준다.
5. 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 개시가 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 소정의 용어가 먼저 정의된다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 달리 명시적으로 제공되는 경우를 제외하고, 각각의 하기 용어는 아래에 나타낸 의미를 갖는다. 추가적인 정의는 출원 전반에 걸쳐 제시된다.
5.1 용어
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 전술한 것들의 조합과 같은 표적을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 온전한 다클론 항체, 온전한 단클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 지칭되는 중쇄 불변 도메인의 독자성을 기반으로 하는, 5가지 주요 면역글로불린 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 하위 클래스(이소형)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린은 잘 알려져 있는 여러 가지 서브유닛 구조 및 3차원 입체형태를 갖는다. 항체는 네이키드(naked) 항체이거나 또는 다른 분자, 예컨대 독소, 방사성 동위원소 등에 콘쥬게이션될 수 있다.
명시적으로 언급되지 않은 경우 및 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 단일 쇄 항체뿐만 아니라 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 용어 "이중특이적 항체"는 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 에피토프는 동일한 표적 항원에 있을 수 있거나 다른 표적 항원에 있을 수 있다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부분을 지칭한다. "항원 결합 단편", "항원 결합 도메인", 또는 "항원 결합 영역"은 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 지칭한다. 이중특이적 항체의 맥락에서, "항원 결합 단편은 2개의 항원에 결합한다. 항원 결합 단편은 온전한 항체의 항원 인식 부위(예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하기에 충분한 상보성 결정 영역(CDR))를 함유할 수 있다. 항체의 항원 결합 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 및 단쇄 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 항체의 항원 결합 단편은 임의의 동물 종, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 또는 햄스터) 및 인간으로부터 유래될 수 있거나, 인공적으로 제조될 수 있다.
"단클론성" 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관련된 동종 항체 또는 항원 결합 단편 집단을 지칭한다. 이는 전형적으로 상이한 항원 결정기들에 대한 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와 대조된다. 용어 "단클론 항체" 또는 이의 항원 결합 단편은 온전한 단클론 항체와 전장 단클론 항체뿐만 아니라 항체 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄(scFv) 돌연변이체, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 더 나아가, "단클론" 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 및 트랜스제닉 동물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 수의 방식으로 생성된 이러한 항체 및 이의 항원 결합 단편을 지칭한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다가 분자이다. 본 출원 내에서 사용되는 용어 "가(valent)"는 항체 분자에서 특정 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 예를 들어 천연 항체 또는 본 발명에 따른 전장 항체는 2개의 결합 부위를 가지며 "2가"이다. 용어 "4가"는 항원 결합 단백질에 4개의 결합 부위가 있음을 나타낸다. 용어 "3가"는 항체 분자에 3개의 결합 부위가 존재함을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "이중특이적, 4가"는 적어도 하나가 제1 항원에 결합하고 적어도 하나가 제2 항원 또는 항원의 또 다른 에피토프에 결합하는 4개의 항원 결합 부위를 갖는 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상호교환적으로 사용되고, 당업계에서 통상적이다. 가변 영역은 전형적으로, 항체 간에 서열이 상이하며 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용되는, 항체의 일부, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 일부, 전형적으로 성숙한 중쇄에서 약 아미노 말단의 110 내지 120개의 아미노산 또는 110 내지 125개의 아미노산 및 성숙한 경쇄에서 약 90 내지 115개의 아미노산을 지칭한다. 서열의 가변성은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 해당 영역에 집중되지만, 가변 도메인의 더 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 임의의 특정 기전 또는 이론으로 구속됨을 바라지 않으면서, 경쇄 및 중쇄의 CDR은 항체와 항원의 상호작용 및 특이성을 주로 담당하는 것으로 여겨진다. 본 개시의 일부 양태에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 본 개시의 일부 양태에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR 및 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 본 개시의 특정 양태에서, 가변 영역은 영장류(예를 들어, 비인간 영장류) 가변 영역이다. 본 개시의 일부 양태에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR 및 영장류(예를 들어, 비인간 영장류) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
용어 "VL" 및 "VL 도메인"은 상호교환적으로 사용되어 항체의 경쇄 가변 영역을 지칭한다.
용어 "VH" 및 "VH 도메인"은 상호교환적으로 사용되어 항체의 중쇄 가변 영역을 지칭한다.
용어 "Kabat 넘버링" 및 유사한 용어는 당업계에서 인식되고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 지칭한다. 일부 양태에서, CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391] 및 [Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). Kabat 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 중쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 31 내지 35에 존재하고, 이는 선택적으로, 35(Kabat 넘버링 체계에서 35A 및 35B로서 지칭됨)(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65(CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102(CDR3) 다음에, 1 또는 2개 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 경쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56(CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97(CDR3)에 존재한다. 본 개시의 특정 양태에서, 본원에 기술된 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 체계에 따라 결정되었다.
Chothia는 대신에 구조적 루프의 위치를 지칭한다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Kabat 넘버링 관례를 이용하여 넘버링했을 때 Chothia CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 다르다(이는 Kabat 넘버링 시스템이 H35A와 H35B에 삽입물을 위치시키기 때문이다; 만일 35A와 35B가 존재하지 않는다면, 이러한 루프는 32에서 끝난다; 35A만 존재한다면, 이러한 루프는 33에서 끝난다; 35A와 35B 모두가 존재할 경우, 이러한 루프는 34에서 끝난다). AbM 초가변 영역은 Kabat CDR과 Chothia 구조적 루프 사이의 절충을 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "불변 영역" 및 "불변 도메인"은 상호교환가능하며, 당업계에서의 통상적인 의미를 갖는다. 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여되지 않지만 다양한 이펙터 기능, 예컨대 Fc 수용체와의 상호작용을 나타낼 수 있는 항체 부분, 예를 들면, 경쇄 및/또는 중쇄의 카르복실 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 더욱 보존된 아미노산 서열을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄"는, 항체와 관련하여 사용된 경우, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초한 임의의 별개의 유형, 예를 들어, 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ), 및 뮤(μ)를 지칭할 수 있으며, 이는 각각 항체의 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 클래스(IgG의 하위클래스, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함)를 형성한다. 중쇄 아미노산 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 개시의 일부 양태에서, 중쇄는 인간 중쇄이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "경쇄"는, 항체와 관련하여 사용된 경우, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초한 임의의 별개의 유형, 예를 들어, 카파(κ) 또는 람다(λ)를 지칭할 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 개시의 일부 양태에서, 경쇄는 인간 경쇄이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로그램된 사멸 1", "프로그램된 세포 사멸 1" 및 "PD-1"은 상호 교환적으로 사용된다. 완전한 PD-1 서열은 NCBI 참조 서열: NG_012110.1에서 확인될 수 있다. 인간 PD-1 단백질의 아미노산 서열은 다음과 같다:
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(서열번호 28).
프로그램된 사멸-1("PD-1")은 T 세포 조절인자의 확장된 CD28/CTLA-4 부류에 속하는 대략 31 kD의 I형 막 단백질 구성원이다(문헌[Ishida, Y. et al. (1992) Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11:3887-3895] 참조).
PD-1은 활성화 T 세포, B 세포, 및 단핵구 상에서 발현된다(Agata, Y. et al. (1996) “Expression of the PD-1 Antigen on the Surface of Stimulated Mouse T and B Lymphocytes,” Int. Immunol. 8(5):765-772; Martin-Orozco, N. et al. (2007) “Inhibitory Costimulation and Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). PD-1은 PDL-1 또는 PDL-2의 결합에 의한 활성화 후 면역계의 하향 조절을 담당하는 수용체이고(Martin-Orozco, N. et al. (2007) “Inhibitory Costimulation and Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298), 세포 사멸 유도인자로서 작용한다(Ishida, Y. et al. (1992) “Induced Expression of PD-1, A Novel Member of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death,” EMBO J. 11: 3887-3895; Subudhi, S. K. et al. (2005) “The Balance of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition,” J. Molec. Med. 83: 193-202). 이 과정은 PD-L1의 과발현을 통해 많은 종양에서 이용되어 면역 반응이 억제된다.
PD-1은 특히 흑색종 및 비소세포 폐암(NSCLC)의 치료에서의 임상 시험으로부터의 긍정적인 결과와 함께 종양학에서 면역 매개 요법에 대해 잘 입증된 표적이다. PD-1/PD-L-1 상호작용의 길항적 억제는 T 세포 활성화를 증가시켜, 숙주 면역계에 의한 종양 세포의 인식 및 제거를 향상시킨다. 감염 및 종양을 치료하고 적응 면역 반응을 증진하기 위해 항-PD-1 항체를 사용하는 것이 제안되었다(예를 들어, 미국 특허 제7,521,051호; 제7,563,869호; 제7,595,048호 참조).
프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)은 또한 T 세포 활성화를 조절하는 데 관여하는 수용체 및 리간드의 복합 시스템의 일부이다. 정상 조직에서 PD-L1은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 간엽 줄기 세포, 골수 유래 비만 세포뿐만 아니라 다양한 비조혈 세포에서 발현된다. 이의 정상적인 기능은 2개의 수용체: 프로그램된 사멸 1(PD-1 또는 CD279로도 알려짐) 및 CD80(B7-1 또는 B7.1로도 알려짐)과의 상호작용을 통해 T 세포 활성화와 내성 사이의 균형을 조절하는 것이다. PD-L1은 또한 종양에 의해 발현되며 종양이 숙주 면역계에 의한 검출 및 제거를 회피하는 것을 돕도록 여러 부위에서 작용한다. PD-L1은 높은 빈도로 광범위한 암에서 발현된다. 일부 암에서, PD-L1의 발현은 생존율의 감소 및 좋지 않은 예후와 연관되어 있었다. PD-L1과 이의 수용체 사이의 상호작용을 차단하는 항체는 PD-L1-의존성 면역억제 효과를 완화하고 시험관 내에서 항종양 T 세포의 세포독성 활성을 향상시킬 수 있다. 더발루맙(durvalumab)은 PD-1 및 CD80 수용체 모두에 대한 PD-L1의 결합을 차단할 수 있는 인간 PD-L1에 대한 인간 단클론 항체이다. 감염 및 종양을 치료하고 적응 면역 반응을 증진하기 위해 항-PD-L1 항체를 사용하는 것이 제안되었다(예를 들어, 미국 특허 제8,779,108호 및 제9,493,565호, 전체가 본원에 참조로 포함됨).
본원에서 사용되는 용어 "T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 단백질-3" 및 "TIM-3"은 상호교환적으로 사용되며, 인간 TIM-3의 변이체, 이소형, 종 상동체를 포함한다. TIM-3은 N 말단 면역글로불린(Ig) 유사 도메인, O-연결 글리코실화 및 막에 가까운 N-연결 글리코실화를 갖는 뮤신 도메인, 단일 막관통 도메인, 및 티로신 인산화 모티프(들)를 갖는 세포질 영역을 포함하는 I형 세포 표면 당단백질이다. TIM-3은 T 세포/막관통, 면역글로불린 및 뮤신(TIM) 유전자 패밀리의 구성원이다. 인간 TIM-3의 IgV 도메인의 아미노산 서열은 다음과 같다: SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIK (서열번호 29).
신호 펩티드를 포함한 인간 TIM-3 단백질의 아미노산 서열은 다음과 같다:
MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP (서열번호 30).
T 세포 억제성 수용체 TIM-3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3)은 IFN-γ 생성 CD4+ 헬퍼 1(Th1) 및 CD8+ T 세포독성 1(Tc1) T 세포에서 발현됨으로써 항종양 면역을 조절하는 역할을 한다. 이는 처음에는 Th1 및 Tc1 T 세포 반응의 지속기간 및 규모를 제한하기 위해 특이적으로 기능하는 면역 체크포인트 수용체 역할을 하는 T 세포 억제 수용체로 확인되었다. 추가의 연구에 따르면 TIM-3 경로가 PD-1 경로와 협력하여 암의 CD8+ T 세포에서 심각한 기능장애 표현형의 발달을 촉진할 수 있다고 밝혀졌다. 이는 또한 특정 암에서 조절 T 세포(Treg)에서도 발현되었다. TIM-3은 또한 마우스 비만 세포, 대식세포 및 수지상 세포(DC), NK 및 NKT 세포의 하위 집단, 및 인간 단핵구를 포함하는 선천 면역계의 세포 및 뮤린 1차 기관지 상피 세포주에서 발현된다. TIM-3은 Th1 및 Tc1 세포의 아폽토시스를 초래하는 억제 신호를 생성할 수 있고, 아폽토시스성 세포의 포식작용 및 항원의 교차 제시를 매개할 수 있다.
TIM-3의 IgV 도메인의 결정 구조는 이황화 결합에 의해 묶인 두 개의 역평행 β 시트의 존재를 보여준다. 4개의 비정규 시스테인에 의해 형성된 2개의 추가적인 이황화 결합은 IgV 도메인을 안정화하고 CC' 루프를 FG 루프 쪽으로 재배향하여, 리간드 결합에 관여하는 것으로 생각되고 다른 IgSF 구성원에서는 발견되지 않는 "틈새" 구조를 형성한다. 대신, 이 "틈새" 조립체는 TIM-1 및 TIM-4를 포함한 모든 TIM 패밀리 단백질에서 확인되는 특징적인 구조이다. 적절한 리간드에 의한 IgV 도메인의 맞물림은 TIM-3의 면역 조절 역할에 중요하고 말초 내성 유도 및 항종양 면역 억제에 중요한 것으로 밝혀졌다. TIM-3의 C'C" 루프는 베타 가닥 C' 이후 및 베타 가닥 C" 이전의 아미노산, 예를 들어 아미노산 50 내지 54를 포함한다. DE 루프는 64 내지 73의 아미노산으로 구성되는 반면 CC' 루프 및 FG 루프는 각각 아미노산 35 내지 43 및 92 내지 99를 포함한다.
TIM-3에는 갈렉틴-9, 포스파티딜세린, CEACAM1 및 HMGB1과 같은 몇 가지 알려진 리간드가 있다. 갈렉틴-9는 길고 유연한 링커로 연결된 두 개의 별개의 탄수화물 인식 도메인을 가진 S형 렉틴이며, 더 큰 폴리-N-아세틸락토사민 함유 구조에 대해 증진된 친화성을 갖는다. 갈렉틴-9는 신호 서열이 없으며 세포질에 편재되어 있다. 그러나 이는 분비될 수 있고 탄수화물 사슬을 통해 표적 세포 표면 상의 당단백질에 결합함으로써 그 기능을 발휘한다(Freeman G J et al., Immunol Rev. 2010 Can; 235(1): 172-89). 인간 및 마우스 TIM-3 모두 결합 연구, 돌연변이 유발 및 공결정 구조에 기초하여 포스파티딜세린에 대한 수용체인 것으로 나타났으며, TIM-3-발현 세포는 포스파티딜세린을 발현하는 아폽토시스성 세포와 결합 및/또는 이를 포식하는 것으로 나타났다. TIM-3과 포스파티딜세린의 상호작용은, 결합 부위가 IgV 도메인의 반대편에 있는 것으로 밝혀졌기 때문에, 갈렉틴-9와의 상호작용을 배제하지 않는다.
일부 암에서 면역억제된 주요 면역 세포 집단에서 TIM-3 경로의 관련성을 고려할 때, 이는 면역-종양학 치료를 위한 매력적인 후보자이다. 문헌[Anderson, A. C., Cancer Immunol Res., (2014) 2:393-398]; 및 [Ferris, R. L., et al., J Immunol. (2014) 193:1525-1530] 참조.
용어 "키메라" 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 아미노산 서열이 둘 이상의 종으로부터 유래된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 가진, 포유류의 한 종(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼 등)으로부터 유래된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 가변 영역에 상응하는 반면, 불변 영역은 그 종에서 면역 반응을 유발하는 것을 피하기 위해 또 다른 종(통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 서열에 상동성이다.
용어 "인간화된" 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 최소 비인간(예를 들어, 뮤린) 서열을 포함하는 특정 면역글로불린 쇄, 키메라 면역글로불린 또는 이의 단편인 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체 또는 항원 결합 단편의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린("CDR 콘쥬게이션")이다(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 특정 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비인간 종으로부터의 항체 또는 단편의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 비인간 CDR 잔기 내에서 추가적인 잔기의 치환에 의해 더 변형되어 항체 또는 이의 항원 결합 단편 특이성, 친화도 및/또는 능력을 개선하고 최적할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역을 전부, 또는 실질적으로 전부 함유하는 가변 도메인을 포함할 것이나, FR 영역의 전부, 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 적어도 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하는 데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 제5,225,539호; 문헌[Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994)], 및 문헌[Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)]에 기재되어 있다. 본 개시의 일부 양태에서, "인간화 항체"는 재표면화(resurfaced) 항체이다.
용어 "인간" 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 면역글로불린 유전자 좌위로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 의미하며, 이러한 항체 또는 항원 결합 단편은 당업계에 공지된 임의의 기법을 이용하여 생성된다. 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 이런 정의는 온전한 항체 또는 전장 항체 및 이의 단편을 포함한다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)와 이의 결합 상대(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같은 "결합 친화도"는 결합쌍의 구성원(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는, 평형해리상수(KD), 및 평형결합상수(KA)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 당업계에 공지된 다수의 방법으로 측정 및/또는 표현될 수 있다. KD는 koff/kon의 몫으로부터 계산되는 반면, KA는 koff/kon의 몫으로부터 계산된다. Kon은, 예를 들어, 항원에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합 속도 상수를 지칭하고, koff는, 예를 들어, 항원으로부터의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 해리를 지칭한다. kon 및 koff는 BIAcore® 또는 KinExA와 같이 당업자에게 공지된 기법에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 당해 분야의 용어로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된 영역을 지칭한다. 에피토프는, 예를 들어, 폴리펩티드의 인접 아미노산일 수 있거나(선형 또는 인접 에피토프), 또는 에피토프는 예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 2개 이상의 비 인접 영역으로부터 합칠 수 있다(형태적, 비선형, 불연속, 또는 비인접 에피토프). 본 개시의 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 특이적으로 결합하는 에피토프는, 예를 들면, NMR 분광학, X선 회절 결정학 연구, ELISA 분석, 질량 분광분석법(예를 들어, 액체 크로마토그래피 전기분무 질량 분광분석법)과 결합된 수소/중수소 교환, 어레이 기반의 올리고펩티드 스캐닝 분석, 및/또는 돌연변이 유발 맵핑(예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발 맵핑)으로 결정할 수 있다. X선 결정학의 경우, 결정화는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법을 이용하여 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350]; 문헌[McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23]; 문헌[Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274]; 문헌[McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303]). 항체/이의 항원 결합 단편:항원 결정은 잘 알려진 X선 회절 기술을 사용하여 연구될 수 있고, X-PLOR(Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.; 예를 들어, 문헌[Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.]; U.S. 2004/0014194 참조), 및 BUSTER(Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)와 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정제될 수 있다. 돌연변이 유발 맵핑 연구는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 기법을 비롯한 돌연변이 유발 기법의 설명에 대해서는 문헌[Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 and Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085] 참조.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는" 항체는 참조 항체와 동일한 아미노산 잔기에 결합하는 항체를 지칭한다. 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체의 능력은 수소/중수소 교환 분석(문헌[Coales et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009; 23: 639-647] 참조) 또는 x선 결정학에 의해 결정될 수 있다.
항체는 이것이 어느 정도로 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 차단하는 정도까지 해당 에피토프 또는 중첩하는 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 "경쟁적으로 억제한다" 또는 "교차 경쟁한다"고 말한다. 경쟁적 억제는 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 경쟁 ELISA 분석에 의해 결정할 수 있다. 항체는 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50% 경쟁적으로 억제하는 것으로 언급될 수 있다.
"단리된" 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태로 존재하는 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 이들이 자연에서 발견된 형태로는 더 이상 존재하지 않을 정도까지 정제된 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물을 포함한다. 본 개시의 일부 양태에서, 단리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수(즉, 오염물질이 없음), 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 98% 순수 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산에 의해 단속될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 콘쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, (예를 들어, 비자연 아미노산 등을 포함하는) 아미노산의 하나 이상의 유사체뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 변형도 함유하는 폴리펩티드도 이러한 정의 내에 포함된다. 본 개시내용의 폴리펩티드는 항체를 기반으로 하기 때문에, 본 개시의 일부 양태에서 폴리펩티드는 단쇄로서 또는 회합된 쇄로서 나타날 수 있음이 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "AZD7789"는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 항-TIM-3/PD-1 이중특이적 항체를 지칭한다. AZD7789는 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제10,457,732호에 개시되어 있다. 본원에서 논의되는 단클론 항체 O13-1 및 클론 62의 서열은 또한 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제10,457,732호에 개시되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "제약 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성이 있는 추가의 성분을 포함하지 않는 제제를 지칭한다. 이 제형은 멸균될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "투여하다", "투여하는", "투여" 등은 약물, 예를 들어, 항-TIM-3/PD-1 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 원하는 생물학적 작용 부위로 전달할 수 있게 하는 데 사용될 수 있는 방법을 지칭한다(예를 들어, 정맥 내 투여). 본원에 기재된 작용제 및 방법과 함께 사용될 수 있는 투여 기술은 예를 들어, 문헌[Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current edition, Pergamon]; 및 [Remington’s, Pharmaceutical Sciences, current edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa]에서 확인된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조합물" 또는 "조합하여 투여되는"은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 1종 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여될 수 있다는 것을 의미한다. 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동시에 또는 순차적으로 1종 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동일 또는 상이한 조성물 중 1종 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 동물일 수 있다. 본 개시의 일부 양태에서, 대상체는 포유류, 예컨대 비인간 동물(예컨대, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트, 마우스, 원숭이 또는 다른 영장류 등)이다. 본 개시의 일부 양태에서, 대상체는 게잡이 원숭이이다. 본 개시의 일부 양태에서, 대상체는 인간이다.
용어 "치료적 유효량"은 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 약물, 예를 들어, 항-TIM-3/PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양을 지칭한다. "치료하는", "치료", "치료하기 위한", "완화하는" 및 "완화하기 위한"과 같은 용어는 병리적 상태 또는 장애를 치료, 둔화, 이의 증상을 경감 및/또는 진행을 정지시키는 치료적 수단을 의미한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상체는 해당 장애가 있는 것으로 이미 진단을 받은 대상체 또는 해당 장애를 가지는 것으로 의심되는 대상체를 포함한다.
본 개시내용 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다.
본원에 "포함하는"이라는 어구와 함께 본 개시의 양태가 기재되어 있는 경우에, "~으로 구성된" 및/또는 "~으로 본질적으로 구성된"에 관해 기재된 다른 유사한 양태도 제공된다는 것이 이해된다.
구체적으로 언급되거나, 문맥상 명확하지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A", 및 "B"를 포함하고자 한 것이다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 다음의 양태 각각을 포함하고자 한 것이다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
본원에서 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 수치값 또는 수치 범위를 수식하기 위해 사용될 때, 값 또는 범위의 5% 내지 10% 초과 및 5% 내지 10% 미만의 편차가 열거된 값 또는 범위의 의도된 의미 내에 포함된다는 것을 나타낸다.
본원에 제공되는 임의의 조성물 또는 방법은 본원에 제공되는 기타 조성물 또는 방법 중 하나 이상의 임의의 것과 조합될 수 있다.
단위, 접두어, 및 기호는 이의 국제 단위 체계(SI) 허용 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수치의 경계를 포함한다. 본원에서 제공되는 제목은 개시내용의 다양한 양태를 제한하지 않으며, 전체로서 명세서에 대한 참조로 제공될 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 전체 명세서를 참조하여 보다 완전히 정의된다.
5.2 본 개시내용의 방법
일부 양태에서, 본 개시내용은 PD-1 및 TIM-3을 동시에 표적으로 하는 신규한 항암제 AZD7789의 치료 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 IO 획득 저항이 있는 환자에서 AZD7789를 사용하는 방법을 제공한다.
X선 회절 결정학 연구에 따르면, AZD7789의 TIM-3 암(arm)은 다른 임상 항-TIM-3 작용제(예컨대, 단클론 항체)와 상이한 것으로 나타났는데, TIM-3 암은 TIM-3의 면역글로불린 가변(IgV) 세포외 도메인 상의 고유한 에피토프에 결합하기 때문이다. 이 에피토프는 포스파티딜세린 결합(FG-CC' 루프) 틈새의 외부에 있으며 아미노산 N12(H-결합), L47, R52(염다리), D53(H-결합), V54, N55, Y56, W57, W62, L63)H-결합), N64(H-결합), G65, D66(H-결합), F67, R68(H-결합, 염다리), K69(H-결합, 염다리), D71, T75, E77(H-결합)으로 구성된다. 경쇄로부터의 파라토프는 CDR1의 잔기 28 내지 31, CDR2의 잔기 48 내지 53 및 CDR3의 잔기 92를 포함한다. 중쇄로부터의 파라토프는 CDR1의 잔기 30 내지 33, CDR2의 잔기 52 내지 57 및 CDR3의 잔기 100 내지 108을 포함한다.
AZD7789의 TIM-3 결합 암은 포스파티딜세린 결합과 반대쪽 부위에서 IgV 도메인에 결합하고, 이러한 루프의 잔기와의 상호작용에 직접 관여하지 않는다. 따라서 AZD7789는 TIM-3과 포스파티딜세린의 상호작용을 차단하지 않는다. 대신, AZD7789는 TIM-3과 포스파티딜세린 간의 맞물림을 증가시킨다. 이 고유한 기전은 포스파티딜 세린 차단 항-TIM3 mAb에서 관찰되는 것보다 T 세포 매개 항종양 반응을 개선한다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 단백질-3(TIM-3)과 포스파티딜세린(PS) 간의 맞물림을 변경하는 방법을 제공하며, 방법은 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다.
A. TIM-3과 PS 간의 맞물림을 변경하는 방법
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 단백질-3(TIM-3)과 포스파티딜세린(PS) 간의 맞물림을 변경하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 방법은 본원에 개시된 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 면역글로불린 가변(IgV) 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다.
본원에 개시된 대상체에서 TIM-3과 PS 간의 맞물림을 변경하는 방법의 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 대상체에서 항종양 활성을 증가시킨다. 일부 양태에서, 항종양 활성은 결합 단백질(예를 들어, 항체) 투여가 없는 경우에 비해 증가된다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 대상체에서 항종양 활성을 증가시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 T 세포 매개 항종양 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 대상체에서 T 세포 매개 항종양 활성을 증가시키는 방법은 본원에 개시된 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다.
본원에 개시된 대상체에서 T 세포 매개 항종양 활성을 증가시키는 방법의 일부 양태에서, 대상체에서 T 세포 매개 항종양 활성은 결합 단백질(예를 들어, 항체) 투여가 없는 경우에 비해 증가된다. 일부 양태에서, 대상체에서 T 세포 매개 항종양 활성은 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 증가된다.
B. 수지상 세포 이페로사이토시스 및 종양 항원의 교차 제시를 증가시키는 방법
일부 양태에서, 본 개시내용은 아폽토시스성 종양 세포의 수지상 세포 포식작용을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 TIM-3 결합 단백질의 투여는 아폽토시스성 종양 세포의 수지상 세포 이페로사이토시스를 증가시킨다. 일부 양태에서, 아폽토시스성 종양 세포의 수지상 세포 이페로사이토시스는 결합 단백질(예를 들어, 항체) 투여가 없는 경우에 비해 대상체에서 증가된다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 대상체에서 아폽토시스성 종양 세포의 수지상 세포 이페로사이토시스를 증가시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시를 증가시키는 방법을 제공한다. 교차 제시는 수지상 세포와 같은 특정 항원 제시 세포가 MHC 클래스 I 분자와 함께 세포외 항원을 흡수, 처리 및 CD8+ T 세포에 제시하는 능력이다. 이 과정의 결과인 교차 프라이밍은 나이브 세포독성 CD8+ T 세포를 활성화된 세포독성 CD8+ T 세포로 자극하는 것이다. 이 과정은 말초 조직 세포를 감염시키는 종양 및 바이러스보다는 항원 제시 세포를 쉽게 감염시키지 않는 대부분의 종양 및 바이러스에 대한 면역에 필요하다. 교차 제시는 수지상 세포의 표면에서 MHC II에 의해 일반적으로 제시되는 외인성 항원의 제시가 MHC I 경로를 통해서도 제시될 수 있도록 하기 때문에 특히 중요하다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 TIM-3 결합 단백질의 투여는 대상체에서 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시를 증가시킨다. 일부 양태에서, 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시는 결합 단백질(예를 들어, 항체) 투여가 없는 경우에 비해 증가된다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 대상체에서 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시를 증가시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 종양 세포의 수지상 세포 이페로사이토시스를 촉진하는 방법을 제공한다. 대상체에서 종양 세포의 수지상 세포 이페로사이토시스를 촉진하는 방법의 일부 양태에서, 방법은 본원에 기재된 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시를 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 대상체에서 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시를 증가시키는 방법은 본원에 기재된 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 수지상 세포 교차 제시의 수준은 결합 단백질(예를 들어, 항체) 투여가 없는 경우에 비해 증가된다. 일부 양태에서, 수지상 세포 교차 제시의 수준은 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 증가된다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, 본원에 기재된 TIM-3 결합 단백질의 투여는 대상체에서 TIM-3 양성 T 세포에 대한 맞물림이 일어날 때 IL-2 분비를 증가시킨다. 일부 양태에서, IL-2 분비는 결합 단백질(예를 들어, 항체) 투여가 없는 경우에 비해 증가된다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 대상체에서 TIM-3 양성 T 세포에 결합 시 IL-2 분비를 증가시킨다.
5.3 환자 집단
본원에 개시된 임의의 방법, 예를 들어 이중특이적 항체(예를 들어, AZD7789) 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 인간 환자에서 암(예를 들어, 편평 또는 비편평 NSCLC)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 환자는 고형 종양을 갖는다. 일부 양태에서, 환자는 진행성 또는 전이성 고형 종양을 갖는다.
일부 양태에서, 대상체는 난소암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 방광암, 두경부암, 흑색종, 췌장암, 신장 세포 암종, 폐암, 식도암, 위암, 담도 종양, 요로상피암종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 중 하나 이상을 앓는다.
또한, 면역종양(IO) 획득 저항을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 양태에서, 대상체는 근치적 수술 또는 방사선으로 치료되지 않는 문서화된 III기 암을 앓는다. 일부 양태에서, 대상체는 IV기 비소세포 폐 암종(NSCLC)을 앓는다. 일부 양태에서, NSCLC는 편평 또는 비편평 NSCLC이다.
일부 양태에서, 면역종양(IO) 획득 저항을 갖는 대상체는 항-PD-1/PD-L1 요법으로 최소 3~6개월 동안 단일 요법으로 또는 화학 요법과 병용하여 초기 치료 후 방사선학적으로 문서화된 종양 진행 또는 임상적 악화를 갖고, 초기 임상적 이점, 즉 질환 안정화 또는 관해의 징후를 가졌다.
일부 양태에서, 항-PD-1 요법은 니볼루맙(또한 OPDIVO®, 5C4, BMS-936558, MDX-1106 및 ONO-4538로 알려짐), 펨브롤리주맙(Merck; 또한 KEYTRUDA®, 람브롤리주맙 및 MK-3475로 알려짐; WO2008/156712 참조), PDR001(Novartis; WO 2015/112900 참조), MEDI-0680(AstraZeneca; AMP-514로도 알려짐; WO 2012/145493 참조), 세미플리맙(Regeneron; 또한 REGN-2810으로 알려짐; WO 2015/112800 참조), JS001(TAIZHOU JUNSHI PHARMA; 문헌[Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 70:136 (2017)] 참조), BGB-A317(Beigene; WO 2015/35606 및 US 2015/0079109 참조), INCSHR1210(Jiangsu Hengrui Medicine; SHR-1210로도 알려짐; WO 2015/085847; 문헌[Si-Yang Liu et al, J Hematol. Oncol. 70: 136 (2017)] 참조), TSR-042(Tesaro Biopharmaceutical; ANB011로도 알려짐; WO2014/179664 참조), 피딜리주맙(Medivation/CureTech; 미국 특허 제8,686,119 B2호 또는 WO 2013/014668 Al 참조); GLS-010(Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals; WBP3055로도 알려짐; 문헌[Si-Yang Liu et al, J. Hematol. Oncol. 70: 136 (2017)] 참조), AM-0001(Armo), STI-1110(Sorrento Therapeutics; WO 2014/194302 참조), AGEN2034(Agenus; WO 2017/040790 참조), MGA012(Macrogenics, WO 2017/19846 참조), 및 IBI308(Innovent; WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/132825, 및 WO 2017/133540 참조)으로부터 선택된 항체이다. 일부 양태에서 항-PD-1 요법은 PD-1 리간드 프로그램된 세포 사멸 리간드 2(PD-L2)의 세포외 도메인 및 인간 IgG의 Fc 영역으로 구성된 재조합 융합 단백질인 PD-1 길항제 AMP-224이다. AMP-224는 미국 공개 제2013/0017199호에서 논의된다. 이들 참고문헌 각각의 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 양태에서, 항-PD-L1 요법은 BMS-936559(12A4, MDX-1105로도 알려짐; 예를 들어, 미국 특허 제7,943,743호 및 WO 2013/173223 참조), 아테졸리주맙(Roche; 또한 TECENTRIQ®; MPDL3280A, RG7446으로도 알려짐, US 8,217,149 참조; 또한 문헌[Herbst et al. (2013) J Clin Oncol 3 l(suppl):3000)] 참조), 더발루맙(AstraZeneca; 또한 IMFINZI™, MEDI-4736으로도 알려짐; WO 2011/066389 참조), 아벨루맙(Pfizer; BAVENCIO®, MSB-0010718C로도 알려짐; WO 2013/079174 참조), STI-1014(Sorrento; WO2013/181634 참조), CX-072(Cytomx; WO2016/149201 참조), KN035(3D Med/Alphamab; 문헌[Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017)] 참조, LY3300054(Eli Lilly Co.; 예컨대, WO 2017/034916 참조), 및 CK-301(Checkpoint Therapeutics; 문헌[Gorelik et al., AACR:Abstract 4606(2016년 4월) 참조])로부터 선택된 항체이다. 이들 참고문헌 각각의 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시된 방법의 특정 양태에서, IO 획득 저항은 다음과 같이 정의된다:
(i) 항 PD-1/PD-L1 단일 요법에 대한 6개월 미만의 노출 후 초기에 부분 관해 또는 완전 관해의 최적의 전반적인 반응(BOR)에 이어, 치료 중 질환이 진행되거나 항 PD-1/PD-L1 치료 중단 후 12주 이내에 질환이 진행된 경우; 또는
(ii) 항 PD-1/PD-L1 요법 단독 또는 화학요법과의 병용에 대한 6개월 이상의 노출 후 질환 안정화, 부분 관해, 또는 완전 관해의 BOR에 이어, 치료 중 질환이 진행되거나 항-PD-1/PD-L1 치료 중단 후 12주 이내에 질환이 진행된 경우.
본원에 개시된 방법의 특정 양태에서, IO 획득 저항은 항 PD-1/PD-L1 요법 단독 또는 화학요법과의 병용에 대한 6개월 이상의 노출; 질환 안정화, 부분 관해, 또는 완전 관해의 최적의 전반적인 반응(BOR)에 이어, 치료 중 질환이 진행되거나 항-PD-1/PD-L1 치료 중단 후 12주 이내에 질환이 진행된 경우로 정의된다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, 대상체의 PD-L1 종양 비율 점수(TPS)는 1% 이상이다. 일부 양태에서, 대상체는 제1선의 환경에서 사전 전신 요법을 받지 않았다. 일부 양태에서, 사전 전신 요법은 항-PD-1/PD-L1 요법 이외의 IO 요법이다. 일부 양태에서, 대상체는 사전 신/보조 요법을 받았지만 항-PD-1/PD-L1 요법의 마지막 투여 후 적어도 12개월 동안 진행하지 않았다. 일부 양태에서, 대상체의 PD-L1 TPS는 50% 이상이다.
5.4 결과
본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 환자는 바람직하게는 암의 적어도 한 가지 징후의 개선을 경험한다. 일 양태에서, 개선은 측정 가능한 종양 병변의 양 및/또는 크기의 감소에 의해 측정된다. 또 다른 양태에서, 병변은 흉부 x선 또는 CT 또는 MRI 필름에서 측정될 수 있다. 또 다른 양태에서, 세포학 또는 조직학을 사용하여 치료법에 대한 반응성을 평가할 수 있다. 일부 양태에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여에 대한 종양 반응은 종양 평가의 연구자 검토에 의해 결정되고, RECIST v1.1 가이드라인에 의해 정의될 수 있다. 연구자의 재량으로 또는 기관의 관행에 따라 추가적인 종양 측정이 수행될 수 있다.
일부 양태에서, 치료되는 환자는 완전 반응(CR), 즉 모든 표적 병변의 소실을 나타낸다. 일부 양태에서, 치료되는 환자는 부분 반응(PR), 즉 기준선 합계 직경을 기준으로 하여 표적 병변의 직경 합계의 적어도 30%의 감소를 나타낸다. 일부 양태에서, 치료되는 환자는 진행성 질환(PD), 즉 연구에서 최소 합계(이것이 연구에서 최소일 경우 기준선 합계를 포함)를 기준으로 하여 표적 병변의 직경 합계의 적어도 20%의 증가를 나타낸다. 20%의 상대적 증가에 추가하여, 합계는 또한 적어도 5 mm의 절대적 증가를 나타내어야 한다. (비고: 하나 이상의 새로운 병변의 출현은 진행으로 고려될 수 있다). 일부 양태에서, 치료되는 환자는 안정적 질환(SD), 즉 연구 중 직경의 최소 합계를 기준으로 하여 PR 자격을 갖출 정도의 충분한 수축도, PD 자격을 갖출 정도의 충분한 증가도 아닌 상태를 나타낸다.
다른 양태에서, 치료되는 환자는 종양 수축 및/또는 성장률의 감소, 즉, 종양 성장의 억제를 경험한다. 일부 양태에서, 원치 않는 세포 증식은 감소되거나 억제된다. 일부 양태에서, 다음 중 하나 이상이 일어날 수 있다: 암세포 수가 감소될 수 있다; 종양 크기가 감소될 수 있다; 말초 기관으로의 암세포 침윤이 억제되거나, 지연되거나, 늦춰지거나 중단될 수 있다; 종양 전이가 늦춰지거나 억제될 수 있다; 종양 성장이 억제될 수 있다; 종양의 재발이 방지되거나 지연될 수 있다; 암과 연관된 증상 중 하나 이상이 일정 정도로 완화될 수 있다.
다른 양태에서, 본원에 제공된 임의의 방법에 따른 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여는 종양 크기의 감소, 시간 경과에 따라 나타나는 전이성 병변 수의 감소, 완전 관해, 부분 관해 또는 안정적 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치료 효과를 생성한다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 임의의 방법에 따른 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여에 대한 종양 반응을 결정하기 위해 하나 이상의 종양 생검이 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 샘플은 포르말린-고정 파라핀 포매(FFPE) 샘플이다. 일부 양태에서, 샘플은 신선한 샘플이다. 종양 샘플(예를 들어, 생검)은 면역 및 종양 미세환경과 연관된 예측 및/또는 약력학적 바이오마커를 확인하는 데 사용될 수 있다. 이러한 바이오마커는 IHC, 종양 돌연변이 분석, RNA 분석 및 단백체 분석을 포함하는 분석으로부터 결정될 수 있다. 특정 양태에서, 종양 바이오마커의 발현은 RT-PCR, 현장 혼성화, RNase 보호, RT-PCR-기반 분석, 면역조직화학, 효소 결합 면역흡착 분석, 생체내 영상화 또는 유세포분석에 의해 검출된다.
5.5 이중특이적 항체 및 이의 항원 결합 단편
대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 TIM-3 및 PD-1(예를 들어, 인간 TIM-3 및 PD-1)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있는 TIM-3 및 PD-1(예를 들어, 인간 TIM-3 및 PD-1) 항체 및 이의 항원 결합 단편은 TIM-3 및 PD-1에 특이적으로 결합하고 고유한 TIM-3 에피토프를 표적으로 하는 1가 이중특이적 인간화 면역글로불린 G1(IgG1) 단클론 항체(mAb)인 AZD7789를 포함한다.
AZD7789는 DuetMab 분자의 백본에 구축되었다. DuetMab 설계는 문헌[Mazor et al., MAbs. 7(2): 377-389, (2015 Mar-Apr 2015), 전체가 본원에 참조로 포함됨]에 기재되어 있다. "DuetMab" 설계는 2개의 별개의 중쇄의 이종이량체화를 위한 노브-인투-홀(knobs-into-holes, KIH) 기술을 포함하고, CH1-CL 계면 중 하나의 천연 이황화 결합을 조작된 이황화 결합으로 교체하여 동족 중쇄 및 경쇄 페어링의 효율성을 증가시킨다.
AZD7789는 TIM-3에 결합하는 가변 영역을 포함하는 중쇄에 노브 돌연변이를, 그리고 PD-1에 결합하는 가변 영역을 포함하는 중쇄에 홀 돌연변이를 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIM-3 및 인간 PD-1에 특이적으로 결합하고, 표 1 및 2에 제공된 바와 같은 AZD7789 항체의 CDR을 포함한다.
[표 1]
VH CDR 아미노산 서열 1
1표 1의 VH CDR은 Kabat에 따라 결정된다.
[표 2]
VL CDR 아미노산 서열 2
2표 2의 VL CDR은 Kabat에 따라 결정된다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, TIM-3 결합 단백질은 상보성 결정 영역(CDR): 각각 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함한다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, TIM-3 결합 단백질은 상보성 결정 영역(CDR): 각각 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인 상의 고유한 에피토프에 특이적으로 결합한다. TIM-3의 IgV 도메인 상의 에피토프는 TIM-3의 N12, L47, R52, D53, V54, N55, Y56, W57, W62, L63, N64, G65, D66, F67, R68, K69, D71, T75, 및 E77을 포함한다(서열번호 29).
본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, TIM-3 결합 단백질은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)의 제1 세트: 각각 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; PD-1 결합 도메인은 CDR의 제2 세트: 각각 서열번호 4, 5, 6, 10, 11, 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, TIM-3 결합 단백질은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)의 제1 세트: 각각 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; PD-1 결합 도메인은 CDR의 제2 세트: 각각 서열번호 4, 5, 6, 10, 11, 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIM-3 및 PD-1에 특이적으로 결합하고 표 3에 나열된 AZD7789 항체의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
[표 3]
VH 및 VL 아미노산 서열
본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 도메인(VH), 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 가변 도메인(VL), 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 VH, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄 VL을 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIM-3 및 PD-1에 특이적으로 결합하고 표 4에 나열된 AZD7789 항체의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 포함한다.
[표 4]
전장 중쇄 아미노산 서열
본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 TIM-3 결합 단백질은 비글리코실화 Fc 영역을 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 탈글리코실화된 Fc 영역을 포함한다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질은 감소된 푸코실화를 갖거나 비푸코실화된 Fc 영역을 포함한다.
5.6 치료 방법
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 비소세포 폐암(NSCLC)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 진행성 또는 전이성 NSCLC를 앓는 대상체에서 NSCLC를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 진행성 또는 전이성 NSCLC를 앓는 대상체의 NSCLC를 치료하는 방법은 PD-1 결합 도메인 및 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 이중특이적 결합 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하고, 대상체는 IO 획득 저항을 갖는다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 진행성 또는 전이성 종양을 앓는 대상체에서 비소세포 폐 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 진행성 또는 전이성 종양을 앓는 대상체의 비소세포 폐 종양의 성장을 억제하는 방법의 일부 양태에서, 방법은 PD-1 결합 도메인 및 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 이중특이적 결합 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하고, 대상체는 IO 획득 저항을 갖는다. 일부 양태에서, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 PD-1 결합 도메인 및 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 단백질의 TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고 에피토프는 TIM-3의 N12, L47, R52, D53, V54, N55, Y56, W57, W62, L63, N64, G65, D66, F67, R68, K69, D71, T75, 및 E77을 포함한다(서열번호 29).
일부 양태에서, NSCLC는 편평 또는 비편평 NSCLC이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 IO 획득 저항을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, IO 획득 저항을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법은 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 암은 난소암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 방광암, 두경부암, 흑색종, 췌장암, 신장 세포 암종, 폐암, 식도암, 위암, 담도 종양, 요로상피암종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 중 하나 이상이다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 양태에서, 대상체는 근치적 수술 또는 방사선으로 치료되지 않는 문서화된 III기, 또는 IV기 비소세포 폐암종(NSCLC)을 앓는다.
일부 양태에서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 대상체에서 종양 성장의 억제를 초래한다.
다음의 실시예는 예로서 제공되며, 제한하는 것이 아니다.
6. 실시예
본 부문(즉, 부문 6)의 실시예는 예로서 제공되며, 제한하는 것이 아니다.
6.1 실시예 1: TIM-3 IgV 도메인 특성화
항-TIM3 #62 단클론 항체("#62" 또는 "클론 62")의 항원 결합 단편과의 TIM-3 IgV 도메인 상호작용을 조사하였다. 클론 62는 클론 62의 친화도 성숙 변이체인 항-TIM-3 항체 O13-1의 모체이다. mAb O13-1 및 클론 62의 서열은 미국 특허 제10,457,732호에 개시되어 있으며, 이는 전체가 본원에 참조로 포함된다.
결정화, 데이터 수집 및 구조 결정
항원 결합 단편(Fab)이 있는 TIM-3 IgV 도메인의 공결정 구조를 얻기 위해, 모든 단백질을 포유동물 세포에서 발현시키고 균질하게 정제하였다. 정제된 TIM-3 IgV 도메인 및 Fab(한 번에 하나씩)를 약간 과량의 IgV 도메인에서 인큐베이션한 다음, 복합체의 크기 배제 정제를 수행하였다. 복합체의 결정화를 실온에서 수행하였다. X선 회절 데이터는 Stanford Synchrotron Radiation Lightsource(SSRL, 미국 캘리포니아주 멘로파크 소재)에서 수집하였다. 복합체의 구조는 분자 교체에 의해 해결하였다.
TIM-3의 IgV 도메인에 결합된 항-TIM3 항체 #62의 Fab의 결정 구조는 2.2 Å의 분해능에서 결정하였다. Fab의 중쇄와 경쇄 모두 항원과 상호작용하였다. Fab의 두 사슬은 815 Å2의 계면 면적을 생성하고, 경쇄가 365 Å2, 중쇄가 450 Å2에 기여하였다. 전체적으로, 상호작용에 참여하는 Fab의 두 사슬로부터의 27개 아미노산과 TIM-3의 IgV 도메인으로부터의 19개 아미노산이 있다. 일부 TIM-3 아미노산은 Fab의 두 사슬과 상호작용하였다.
IgV 도메인의 하기 아미노산은 계면에 속하고/속하거나 항-TIM3 항체 #62: Fab의 중쇄와의 상호작용에 참여한다: N12, L47, D53, V54, N55, Y56, W57, W62, L63, N64, G65, D66, F67, T75 및 E77. 이 중 아미노산 N12, L63(주쇄) 및 E77은 중쇄의 CDR 2 및 3과 수소 결합을 형성한다.
항-TIM3 항체 #62의 중쇄 Fab에서, 하기 아미노산은 계면에 속하고/속하거나 TIM-3의 IgV 도메인과의 상호작용에 참여한다: S30, S31, Y32, 및 A33(모두 중쇄의 CDR1에 속함), S52, G53, S54, G56, S57(모두 중쇄의 CDR2에 속함), S100, Y101, G102, T103, Y104, Y105, N107, 및 Y108(모두 중쇄의 CDR3에 속함).
IgV 도메인의 하기 아미노산은 계면에 속하고/속하거나 항-TIM3 항체의 경쇄에서 Fab와의 상호작용에 참여한다: R52, D53, L63, N64, G65, D66, F67, R68, K69, D71.
항-TIM3 항체 #62의 경쇄 Fab에서, 하기 아미노산은 계면에 속하고/속하거나 TIM-3의 IgV 도메인과의 상호작용에 참여한다: G28, G29, K30, 및 S31(모두 경쇄의 CDR1에 속함), Y48, Y49, D50, S51, D52, R53(모두 경쇄의 CDR2에 속함), R92(경쇄의 CDR3에 속함).
이는 항-TIM3 항체 #62의 항원 결합 단편이 포스파티딜세린 결합의 반대쪽에서 IgV 도메인에 결합한다는 것을 입증한다. 이 결합은 TIM-3의 IgV 도메인의 접힘 또는 구조에 변화를 일으키지 않는다. 이 구조의 IgV 도메인 모델은 포스파티딜세린이 결합된 것을 0.7 Å의 평균 제곱근 편차로 정렬한다. TIM-3의 IgV 도메인과 항-TIM3 항체 #62의 상호작용 계면은 78번 위치에 글리코실화된 아스파라긴을 포함하지 않으며 탄수화물 자체에 부착되지도 않는다.
6.2 실시예 2: TIM-3과 포스파티딜세린의 결합
포스파티딜세린을 멀티어레이 96웰 플레이트(Meso Scale Discovery)에 30 μg/mL로 플레이팅하고 밤새 증발되도록 두었다. 플레이트를 1% 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 약물을 10 μg/mL에서 시작하여 5배 연속 희석으로 7점 곡선으로 적정하였다. 그런 다음, SULFO-태그(Meso Scale Discovery)에 접합된 TIM-3 IgV 5 μg/mL를 플레이트에 첨가하기 전에 15분 동안 약물과 사전 인큐베이션하였다. 1.5시간의 인큐베이션 기간 후, 플레이트를 세척하고 MESO SECTOR S600 기기(Meso Scale Discovery)에서 전기화학발광 신호를 검출하였다(도 1a).
도 1a에 제공된 데이터는 AZD7789에 대한 모 항-TIM-3 mAb(즉, mAb O13-1)가 이소형 대조군과 비교하여 TIM-3과 포스파티딜세린의 결합을 증가시킴을 입증한다. 반대로, 항-TIM-3 mAb F9S의 적정은 TIM-3과 포스파티딜세린의 상호작용을 차단한다. 전반적으로, 이 데이터는 TIM-3의 상이한 에피토프에 결합하는 항체가 TIM-3과 포스파티딜세린의 상호작용을 차별적으로 조절할 수 있음을 나타낸다.
다음으로, 포스파티딜세린을 멀티어레이 96웰 플레이트(Meso Scale Discovery)에 30 μg/mL로 플레이팅하고 밤새 증발되도록 두었다. 플레이트를 1% 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 약물을 150 μg/mL에서 시작하여 4배 연속 희석으로 7점 곡선으로 적정하였다. 그런 다음, SULFO-태그(Meso Scale Discovery)에 접합된 TIM-3 IgV 1.67 μg/mL를 약물 첨가 직후 웰당 첨가하였다. 2시간의 인큐베이션 기간 후, 플레이트를 세척하고 MESO SECTOR S600 기기(Meso Scale Discovery)에서 전기화학발광 신호를 검출하였다. 처리당 2반복구 웰을 평가하였다. (도 1b).
이 데이터는 AZD7789 대 항-TIM-3 O13-1 결합에 의해 확인된 바와 같이 TIM-3의 C'CC"/DE 에피토프에서의 1가 맞물림이 이소형 대조군과 비교하여 포스파티딜세린과 TIM-3의 상호작용을 증가시키기에 충분함을 입증한다. 반대로, TIM-3의 CC'/FG에 결합하는 2개의 독립적으로 유래된 항-TIM-3 항체(mAb F9S 및 mAb 'N')는 TIM-3과 포스파티딜세린의 상호작용을 차단하였다. 전반적으로, 이 데이터는 TIM-3의 상이한 에피토프에 결합하는 항체가 TIM-3과 포스파티딜세린의 상호작용을 차별적으로 조절할 수 있고, 이 효과가 1가 및 2가 맞물림을 통해 관찰될 수 있음을 나타낸다.
6.3 실시예 3: 사멸된 A375 흑색종 세포주에 대한 TIM3 IgV 결합
A375 흑색종 세포를 24시간 동안 1 μM/mL의 스타우로스포린으로 사멸시켰다. 다음날 세포를 세척하고 웰당 20만 개의 세포를 플레이팅하였다. 약물을 5배 연속 희석으로 적정하고 45분 동안 10 μg/mL의 TIM-3 IgV와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 약물/TIM3 IgV 혼합물을 아폽토시스 A375 세포와 함께 인큐베이션하였다. 45분 후, 세포를 차가운 완충액으로 세척하고 4% PFA로 20분 동안 고정시켰다. 데이터를 BD Symphony A2에서 획득하고, flowjo를 통해 분석하였다. 그래프를 PRISM을 사용하여 생성하였다. 처리당 2반복구 웰을 평가하였다. (도 2).
도 2에 제시된 데이터는 AZD7789 및 클론 O13-1이 아폽토시스성 흑색종 세포에 대한 가용성 TIM-3 IgV의 결합을 향상시키는 반면, 항-PD-1 LO115는 그렇지 않음을 보여준다. 항-TIM-3 E2E 및 듀엣 LO115/F9S 항체는 TIM-3과 아폽토시스성 세포의 맞물림을 감소시킨다.
6.4 실시예 4: 인간 TIM-3을 발현하도록 조작된 Jurkat 세포주
인간 TIM-3을 발현하도록 Jurkat 세포주를 조작하였다(h-TIM-3 Jurkat 세포). 웰당 20만 개의 세포를 플레이팅하였다. 약물을 10 μg/mL에서 시작하여 9점 4배 연속 희석으로 적정하였다. 약물 첨가 직후, 가용성 항-CD3(2.5 μg/mL) 및 항-CD28(0.5 μg/mL)로 세포를 자극하였다. 24시간 후, 상청액을 수집하고 Meso Scale Discovery의 인간 IL-2 조직 배양 키트를 사용하여 전기화학발광 검출로 IL-2를 평가하였다. 처리당 2반복구 웰을 평가하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, AZD7789에 대한 리드 비최적화 및 리드 최적화 모 항-TIM-3 mAb(각각 항-TIM-3 항체 #62 및 O13)는 T 세포 자극 시 이소형 대조군과 비교하여 h-TIM-3 Jurkat 세포의 IL-2 생산을 증가시킨다(오차 막대는 SEM을 나타낸다). 반대로, 항-TIM-3 mAb 41 또는 F9S는 동일한 자극 조건 하에서 IL-2 생산을 감소시킨다. 전반적으로, 이 데이터는 TIM-3의 상이한 에피토프에 결합하는 항체가 인간-TIM3 Jurkat 자극 분석에서 차별적인 결과를 유발할 수 있음을 나타낸다. 리드 비최적화 클론 62와 리드 최적화 클론 13 사이의 하나의 아미노산 변화는 이 Jurkat 자극 분석에서 기능적 결과를 바꾸지 않는다.
별도의 연구에서, 웰당 20만 개의 h-TIM-3 Jurkat 세포를 플레이팅하였다. 약물을 10 mg/mL에서 시작하여 9점 3배 연속 희석으로 적정하였다. 약물 첨가 직후, 항-CD3(1 μg/mL)/항-CD28(0.5 μg/mL)로 세포를 자극하였다. 24시간 후, 상청액을 수집하고 Meso Scale Discovery의 인간 IL-2 조직 배양 키트를 사용하여 전기화학발광 검출로 IL-2를 평가하였다. (도 4). 처리당 2반복구 웰을 평가하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 비교기 항-TIM-3 항체 'N'; 'J'; 및 'L'은 특허 서열로부터 유래하였다. 항-TIM-3 항체 2E2는 상업적으로 입수 가능하다(Leaf 정제 항-인간 CD366, Biolegend).
도 4에 도시된 바와 같이, 모 항-TIM-3 mAb O13-1의 적정은 T 세포 자극 시 h-TIM-3 Jurkat 세포의 IL-2 생산을 증가시킨다. 반대로, 이 분석에서 평가된 다른 모든 항-TIM-3 mAb의 적정은 동일한 자극 조건 하에서 IL-2 생산을 감소시킨다. 전반적으로, 이 데이터는 TIM-3의 상이한 에피토프에 결합하는 항체가 인간-TIM-3 Jurkat 자극 분석에서 차별적인 결과를 유발할 수 있음을 나타낸다.
h-TIM-3 Jurkat 세포를 사용한 또 다른 연구에서, 약물은 30 μg/mL에서 시작하여 11점 3배 연속 희석으로 적정하였다. "항-TIM-3 O13-1(적정) + 항-TIM-3 F9S(일정)" 처리군의 경우, 항-TIM-3 mAb O13-1의 적정 전에 세포를 일정한 농도의 항-TIM-3 mAb F9S(10 μg/mL)와 함께 인큐베이션하였다. 약물 첨가 후, 항-CD3(1 μg/mL)/항-CD28(0.5 μg/mL)로 세포를 자극하였다. 24시간 후, 상청액을 수집하고 Meso Scale Discovery의 인간 IL-2 조직 배양 키트를 사용하여 전기화학발광 검출로 IL-2를 평가하였다(도 5).
도 5에 도시된 바와 같이, 세포가 포스파티딜세린과의 TIM-3 상호작용을 차단하는 고농도의 항-TIM-3 mAb F9S 중에서 배양될 경우 항-TIM-3 mAb O13-1의 첨가 후 자극된 h-TIM-3 Jurkat 세포로부터 IL-2의 관찰된 증가가 제거된다. 이 데이터는 항-TIM-3 mAb O13-1 유도된 IL-2 생성이 TIM-3과 포스파티딜세린의 상호작용에 의존하고, 이 상호작용의 제거가 향상된 IL-2 분비를 방지함을 시사한다.
다음으로, 모 Jurkat T 세포를 야생형을 발현하도록 유전자 조작된 2개의 Jurkat 세포주와 비교하였는데, 인간 TIM-3 R111의 돌연변이체(R111A) 버전은 포스파티딜세린에 대한 TIM-3 결합에 중요한 잔기이다. TIM-3의 R111A 돌연변이는 TIM-3에 대한 포스파티딜세린 결합을 제거한다(Gandhi et al., Scientific Reports 2018; 8:17512; Nakayama et al., Blood, 2009). 약물 첨가 후, 항-CD3(2.5 μg/mL)/항-CD28(0.5 μg/mL)로 세포를 자극하였다. 24시간 후, 상청액을 수집하고 Meso Scale Discovery의 인간 IL-2 조직 배양 키트를 사용하여 전기화학발광 검출로 IL-2를 평가하였다(도 6). 50 nM에서 처리된 3개의 독립적인 실험으로부터 데이터를 수집하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. ****, p<0.0001.
도 6에 제시된 데이터는 자극 후 TIM-3 발현 Jurkat 세포로부터의 IL-2 생산의 항-TIM-3 mAb O13-1 매개 증가에 TIM-3 발현이 포스파티딜세린에 대한 맞물림과 함께 필요함을 나타낸다.
6.5 실시예 5: 1차 인간 T 세포에서의 IFN-γ 분비
2명의 건강한 공여자로부터의 신선한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 40,000개 세포/웰로 플레이팅하였다. 약물을 100 nM에서 시작하여 4점 10배 연속 희석으로 적정하였다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주를 세포 표면에서 인간 항-CD3 OKT3 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 발현하도록 조작하였다. CHO-OKT3 세포를 조사하여(10 Gy) 아폽토시스를 유도하고 웰당 5,000개로 플레이팅하였다. 세포를 3일 동안 공동 배양하였다. 그런 다음 상청액을 수집하고 Meso Scale Discovery의 인간 IFN-γ 조직 배양 키트를 사용하여 전기화학발광 검출로 IFN-γ를 평가하였다(도 7의 A 및 B). 오차 막대는 3반복구 웰의 SEM을 나타낸다. **, p<0.01; *, p<0.05.
도 7의 A 및 B에 도시된 데이터는 AZD7789 및 이의 모 2가 항-TIM-3 mAb, O13-1이 세포 아폽토시스의 맥락에서 자극된 1차 인간 T 세포의 IFN-α 분비를 향상시킨다는 것을 나타낸다. 이는 항체 또는 이중특이적 형식의 포스파티딜세린 차단 항-TIM-3 분자에 대해서는 적용되지 않는다.
6.6 실시예 6: 아폽토시스성 종양 세포의 수지상 세포 이페로사이토시스에 대한 AZD7789의 효과
인간 수지상 세포(DC)는 6일 동안 100 ng/mL의 IL-4 및 100 ng/mL의 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 존재 하에 배양된 신선하게 단리된 단핵구로부터 생성되었다. 아폽토시스를 유도하기 위해 Jurkat 세포주를 24시간 동안 100 mM 스타우로스포린으로 처리하였다. 그런 다음 아폽토시스성 Jurkat 세포를 1 ng/mL Incucyte®pHrodo®Red 염료로 표지하였다. 아폽토시스성 세포를 테스트 약물의 존재 하에 단핵구 유래 DC와 4:1 비로 공동 배양하였다. Incucyte® S3 생세포 영상화 시스템 내부에 플레이트를 배치하였다. 24시간 동안 15분마다 영상을 촬영하였다. Incucyte® S3 2018B 소프트웨어를 사용하여 적색 형광을 측정하고 분석하였다. 데이터의 그래픽 묘사는 Windows용 GraphPad Prism 버전 8.04.02(GraphPad Software)를 사용하여 수행하였다. 도 8의 A는 Incucyte® S2 2018B 소프트웨어를 사용하여 생성된 한 실험의 대표적인 데이터의 예를 보여준다. 도 8의 B는 10개 이상의 독립적인 실험으로부터 수집된 데이터의 그래픽 표현을 보여준다. 도 8의 B에서 이페로사이토시스의 배수 변화는 약물 치료가 없는 군에서 결정하였다. ****, p < 0.0001; ***, p< 0.001; *, p < 0.05.
도 8의 A 및 B에 제시된 데이터는 AZD7789가 아폽토시스성 종양 세포의 수지상 세포 이페로사이토시스를 향상시킬 수 있음을 입증한다. 대조적으로, TIM-3의 포스파티딜세린 결합 틈새를 표적으로 하는 항체(mAb F9S)는 대조군에 비해 감소된 효과를 나타냈다.
6.7 실시예 7: 종양 항원의 DC 교차 제시에 대한 AZD7789의 효과
2종의 Jurkat 세포주를 각각 인간 MART-1 또는 CMVpp65 항원을 발현하도록 조작하였다. 이 세포주는 분석 내에서 종양 세포 역할을 하였다. 아폽토시스를 유도하기 위해, MART-1 및 CMVpp65 Jurkat 세포주를 24시간 동안 100 mM 스타우로스포린으로 처리하였다. 인간 수지상 세포(DC)는 6일 동안 100 ng/mL의 IL-4 및 100 ng/mL의 GM-CSF의 존재 하에 배양된 신선하게 단리된 단핵구로부터 생성되었다. 단핵구는 HLA-A*02 양성인 건강한 공여자 혈액에서 단리되었다. 수지상 세포를 테스트 물품의 존재 하에 아폽토시스성 MART-1 또는 CMVpp65 Jurkat 세포와 공동 배양(1:4의 비)하고 24시간 동안 인큐베이션하여 이페로사이토시스 및 항원 처리를 허용하였다. 항원 펩티드 MART-1(Leu26) - HLA-A*0201(ELAGIGILTV) 또는 항원 펩티드 CMV pp65 - HLA-A*0201(NLVPMVATV)를 사용하여 7일 동안 자극된 펩티드 및 냉동 PBMC로부터 공여자 일치 항원 특이적 T 세포를 생성하였다. MART-1 또는 CMVpp65 Jurkat 세포의 24시간 DC 이페로사이토시스 후, 배지로 웰을 2회 세척하여 남아있는 아폽토시스성 Jurkat 세포를 제거하였다. 항원 특이적 T 세포를 CellTrace 증식 염료로 표지하고 DC와 1:4 비(DC:T 세포)로 7일 동안 공동 배양하였다. 7일 후, 덱스트라머: HLA-A*0201/NLVPMVATV - 항원: pp65 또는 덱스트라머: HLA-A*0201/ELAGIGLTV - 항원 MART-1을 사용하여 T 세포를 CD3, CD8 및 항원 특이성에 대해 염색하였다. 항원 특이적 T 세포의 증식을 유세포 분석법으로 결정하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. (도 9의 A 및 B). 막대 그래프는 MART-1 Jurkat 세포 실험의 2반복구 웰과 CMVpp65 Jurkat 세포 실험의 3반복구 웰을 나타내며, 오차 막대는 SEM을 나타낸다; *, p < 0.05.
도 9의 A 및 B에 제시된 데이터는 AZD7789가 T 세포에 대한 종양 항원의 DC 교차 제시를 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 이 효과는 TIM-3(Duet LO115/F9S)의 포스파티딜세린 결합 부위를 차단하는 유사한 방식과 상이하다. 이 실시예는 AZD7789가 항원 특이적 T 세포에 대한 향상된 DC 교차 제시를 통해 항종양 반응을 개선할 수 있음을 입증한다.
6.8 실시예 8: 항-PD-1 대 AZD7789에 대한 종양 성장 억제 및 생존의 비교
면역결핍 NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스에게 연구 0일에 2 x 106개의 OE21-10xGSV3 세포(관심 바이러스 펩티드를 발현하도록 조작된 인간 식도 편평 세포 암종)를 피하 이식하였다. 7일 후, 건강한 공여자 PBMC에서 기원한 바이러스 펩티드 반응성 CD8+ T 세포를 정맥 내 투여하였다(1 x 106개/마우스). 항-PD-1 mAb LO115 또는 항-PD-1/항-TIM3 mAb AZD7789는 연구 10일부터 시작하여 복강 내 투여되었고, 마우스는 투약 사이에 2~3일 간격으로 총 4회 용량(10 mg/kg)을 투여 받았다. 종양 부피를 지속적으로 모니터링하였다. 종양 크기가 2000 mm3에 도달하면 동물을 희생시켰다. 종양 부피 그래프(도 10의 A)는 이소형 대조군, AZD7789 및 항-PD-1 mAb LO115 사이의 치료 비교를 보여주고; n=8마리/치료 및 모든 치료는 10 mg/kg으로 투여하였다. 치료군 중 마우스의 생존율이 도 10의 B에 도시되어 있다.
도 10의 A 및 B의 이러한 결과는 항원 특이적 인간화 마우스 종양 모델에서 AZD7789의 치료가 항-PD-1 또는 이소형 대조군으로 지속적으로 치료된 마우스와 비교하여 종양 성장을 지연시키고 생존율을 개선한다는 것을 입증한다. 이는 AZD7789로 치료하는 것이 항-PD-1 요법보다 더 큰 정도로 환자에게 혜택을 줄 수 있음을 시사한다.
6.9 실시예 9: 종양 성장에 대한 AZD7789 투여의 효과
48마리의 면역결핍 NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스에게 1일에 2 x 106개의 OE21-10xGSV3 세포(관심 바이러스 펩티드를 발현하도록 조작된 인간 식도 편평 세포 암종)를 피하 이식하였다. 2명의 건강한 공여자(D203517 및 D896)의 PBMC에서 기원한 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포를 7일에 정맥 내 투여하였다(1 x 106개/마우스). 마우스를 8일에 종양 부피에 따라 군당 8마리씩 6개의 상이한 치료군으로 무작위화하였다. 테스트 및 대조군 물품은 9일부터 시작하여 복강 내 투여되었고, 마우스는 총 4회 용량(각각 10 mg/kg)을 투여 받았다. 도 11의 A 및 B는 상이한 T 세포 공여자(D203517 및 D896)를 사용한 2개의 독립적인 연구에 대한 13일의 종양 부피를 도시한다. 이소형 대조군의 종양 부피와 다른 모든 약물 치료 사이의 비교가 이루어졌고, 일원 ANOVA, Tukeys 다중 비교 테스트에 의해 군간 차이를 통계적 유의성에 대해 분석하였다. 각 기호는 기준선에서 테스트 또는 대조군 물품의 세 번째 투여일(13일)까지 종양 부피의 변화 배수를 나타낸다. 수평 막대는 군내 산술 평균 종양 부피를 나타낸다. ****, p < 0.0001; ***, p< 0.001; *, p < 0.05.
도 11의 A 및 B에 도시된 데이터는 AZD7789를 사용한 치료가 항-PD-1 항체 단독으로의 치료 또는 항-PD-1 항체 및 포스파티딜세린 차단 항-TIM-3 분자의 조합을 사용한 치료와 비교하여 감소된 종양 성장을 야기함을 입증한다. 이러한 경향은 두 공여자에서 관찰되었다.
6.10 실시예 10: 인간화 마우스 종양 모델에서 이전에 항-PD-1 요법에 노출된 생체 외 자극된 종양 침윤 림프구의 IFN-γ 분비에 대한 AZD7789의 효과
면역결핍 NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스에게 연구 0일에 2 x 106개의 OE21-10xGSV3 세포(관심 바이러스 펩티드를 발현하도록 조작된 인간 식도 편평 세포 암종)를 피하 이식하였다. 7일 후, 건강한 공여자 PBMC에서 기원한 바이러스 펩티드 반응성 CD8+ T 세포를 정맥 내 투여하였다(1 x 106개/마우스). 항-PD-1 mAb LO115는 연구 10일부터 시작하여 복강 내 투여되었고, 마우스는 투약 사이에 2~3일 간격으로 총 4회 용량(10 mg/kg)을 투여 받았다. 종양 부피를 지속적으로 모니터링하였다. 종양 크기가 2000 mm3에 도달하면 동물을 희생시켰다. 종양을 단일 세포 현탁액으로 해리시켰다. 세포를 피콜 구배로 원심분리하여 생존 가능한 세포를 유지하고 웰당 0.1 x 106개로 플레이팅하였다. 테스트 및 대조군 물품(10 nM), 재조합 인간 IL-2(20 IU/mL) 및 1.5 mg/mL GILGFVFTL 펩티드로 펄스된 0.02 x 106개 T2 세포를 각각의 웰에 첨가하였다. 72시간 후, 상청액을 수집하고 Meso Scale Discovery의 인간 IFN-γ 조직 배양 키트를 사용하여 전기화학발광 검출로 IFN-γ를 평가하였다. 기재된 실험의 생체 내 및 생체 외 요소의 개략도가 도 12의 A에 도시되어 있다. 이소형 대조군에 대한 생체 외 약물 첨가로부터의 판독값을 비교하여 IFN-γ의 배수 변화를 결정하였다. 6마리의 항-PD-1 치료된 마우스로부터 취한 종양을 평가하였다. (도 12의 B). 생체 외 약물 치료로 자극된 하나의 항-PD-1에 사전 노출된 종양으로부터의 대표적인 IFN-γ 플롯이 도 12의 C에 제시되어 있다. ***, p< 0.001; **, p<0.01; *, p < 0.05.
도 12의 A 내지 C에 도시된 데이터는 AZD7789가 항-PD-1 치료에서 진행된 마우스로부터 취한 생체 외 자극된 TIL의 IFN-γ 분비를 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 이 실시예는 AZD7789가 항 PD-1 요법에 더 이상 반응하지 않는 세포의 항종양 반응을 개선할 수 있음을 입증한다.
6.11 실시예 11: 인간화 마우스 종양 모델에서 종양 성장에 대한 항-PD-1 치료 후 AZD7789의 순차적 치료
32마리의 면역결핍 NSG 마우스에게 흑색종 종양 항원인 MART-1을 발현하도록 조작된 인간 선암종 세포주인 PC9-MART-1 세포 3 x 106개를 피하 이식하였다. 14일째에 건강한 기증자 PBMC에서 유래한 MART-1 반응성 CD8+ T 세포를 정맥내 투여했습니다(5 x 106개 세포/마우스). 마우스를 종양 부피에 따라 무작위화하고 10 mg/kg의 테스트 및 대조군 물품을 15일, 17일, 20일, 다음으로 23일, 27일 및 30일에 복강 내 투여하였다. 항-PD-1로 치료된 마우스를 기준선으로부터의 종양 부피의 배수 변화에 기초하여 21일에 세 번째 투여 후 24시간에 다시 무작위화하고, 항-PD-1로 치료를 계속한 10마리의 마우스와 AZD7789로 치료를 전환한 10마리의 마우스의 2개의 코호트로 나누었다. 종양 부피 그래프(도 13a)는 이소형 대조군, AZD7789, 항-PD-1 mAb LO115 단독 및 항-PD-1에 이은 AZD7789의 순차적 치료(항-PD-1의 3회 용량, 이후 3회 용량의 AZD7789) 사이의 치료 비교를 보여준다; n=8마리/치료 및 모든 치료는 10 mg/kg으로 투여하였다. Tukey의 다중 비교 테스트를 통해 이원 ANOVA로 통계를 평가하였다. 시점 5(28일) 및 6(31일)에서 그래프 내에 표시된 통계는 항-PD-1 치료군을 항-PD-1→AZD7789 치료군과 비교한다. ****, p< 0.0001; ***, p< 0.001. 다른 모든 통계는 35일 시점, 마지막 치료 후 5일에서 군을 비교한다. ****, p< 0.0001; ***, p< 0.001 **, p<0.01; *, p < 0.05.
이러한 결과는 항원 특이적 인간화 마우스 종양 모델에서 항-PD-1 치료 후 AZD7789의 순차적 치료가 항-PD-1로 지속적으로 치료한 마우스와 비교하여 종양 성장을 지연시킬 수 있음을 입증한다. 이는 AZD7789로 치료하는 것이 더 이상 항 PD-1 요법에 반응하지 않는 환자에게 혜택을 줄 수 있음을 시사한다.
6.12 실시예 12: 인간화 마우스 종양 모델에서 종양 성장에 대한 항-PD-1 치료 후 AZD7789의 순차적 치료의 효과
면역결핍 NSG 마우스에게 1일에 2 x 106개의 OE21-10xGSV3 세포(관심 바이러스 펩티드를 발현하도록 조작된 인간 식도 편평 세포 암종)를 피하 이식하였다. 7일 후, 건강한 공여자로부터 단리된 인간 PBMC에서 기원한 바이러스 반응성 CD8+ T 세포를 정맥 내 투여하였다(1 x 106개 세포/마우스). 마우스를 8일에 종양 부피에 따라 할당된 치료군으로 무작위화하였다. 테스트 및 대조군 물품을 9일부터 시작하여 10 mg/kg으로 복강 내 투여하였다. 도 13b에서, 마우스는 9일 및 11일에 이소형 대조군 또는 항-PD-1의 2회 용량을 투여 받았고, 그 후 항-PD-1로 치료된 마우스를 기준선으로부터 종양 부피의 배수 변화에 기초하여 3개의 개별 치료군으로 무작위화하였고, 이어서 14일 및 17일에 항-PD-1(αPD-1 계속), 이소형 대조군(αPD→Iso Ctl) 또는 AZD7789(αPD1→AZD7789) 중 하나의 2회 용량을 투여하였다. 도 13b의 그래프는 순차적 치료의 2차 투여 후 24시간째인 18일에 치료군 사이의 종양 부피의 차이를 도시한다. 군간 차이를 일원 ANOVA, Tukeys 다중 비교 테스트를 통해 통계적 유의성에 대해 분석하였다. 도 13c에서, 마우스를 9일, 13일 및 16일에 3회 용량 동안 항-PD-1로 치료한 후, 16일에 후속 치료군으로 무작위화하였다. 연구는 3명의 건강한 공여자(D896, D1051, D1063)의 인간 PBMC를 활용하였다. 각 기호는 재무작위화 시점(항-PD-1 3회 투여 후; 16일부터 20일의 첫 번째 순차적 투여 후 24시간까지)부터 종양 부피의 배수 변화를 나타낸다. 치료군에 걸친 종양 부피의 배수 변화 사이의 비교를 독립 표본 t-검정에 의해 통계적 유의성에 대해 분석하였다. 수평 막대는 군내 산술 평균 배수 변화를 나타낸다. **, p < 0.01; *, p < 0.05. 치료군당 n=10마리 마우스. 모든 치료는 10 mg/kg으로 투여되었다.
이 실시예는 제2 항원 특이적 인간화 마우스 종양 모델에서 항-PD-1 치료 후 AZD7789의 순차적 치료가 항-PD-1 항체로 지속적으로 치료한 마우스와 비교하여 종양 성장을 지연시킬 수 있음을 입증한다. 이 결과는 AZD7789로 치료하는 것이 더 이상 항 PD-1 요법에 반응하지 않는 환자에게 혜택을 줄 수 있음을 시사한다.
전반적으로, 이러한 실시예는 AZD7789가 항종양 반응을 촉진하기 위해 별개의 세포 하위집합를 조절함을 입증한다(도 14).
6.13 실시예 13: 결합 에피토프의 비교 특성화
모 항체 클론 O13-1(AZD7789에 대한 모 클론) 및 F9S의 추정 결합 에피토프를 다양한 방법을 통해 특성화하고 공지된 항-TIM-3 항체와 비교하였다. 아래 표 5에 제시된 바와 같이, x선 결정학 연구 및 경쟁 결합 분석은 mAb O13-1이 TIM-3 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 결합함을 확인하였다. 대조적으로, 테스트한 다른 항-TIM-3 항체의 대부분은 주로 CC' 및 FG 루프에 결합하였다(도 15의 A 및 B; 문헌[Gandhi et al., Scientific Reports 2018; 8:17512] 참조). BC 및 CC' 루프에 결합된 하나의 테스트된 mAb(WO 2015/117002) 및 DE 루프에 결합된 하나의 mAb(WO 2016/111947).
[표 5]
a X선 결정학 연구
b 경쟁 결합 분석
c 수소-중수소 교환 실험
d 항-인간 TIM3 참조 항체 클론 2E2와 유사한 결합 또는 기능성
e TIM3과의 포스파티딜세린 상호작용 차단
f 도메인 교환; 상응하는 moTIM3 도메인으로 대체된 huTIM3의 도메인
g 알라닌 스캐닝을 통한 TIM-3에 대한 결합 상실
h 펩스캔 분석 - 칩 결합 펩티드 어레이로 준비된 TIM3 관련 펩티드 단편에 대한 결합
i 효모 표면 디스플레이 방법에 의한 에피토프 매핑
표 5에 제시된 바와 같이, 표에 정의된 방법을 사용하여 항-TIM-3 항체에 의해 결합된 인간 TIM-3 면역글로불린 가변(IgV) 도메인의 루프에 대한 결합을 특성화하였다. 각각의 참조 항체는 두 가지를 제외하고, 나열된 결합 루프들에 강력하게 결합하였다: WO 2015/117002에 개시된 다양한 항체는 BC 루프에 약하게 결합하였고, WO 2016/111947 A2에 개시된 mAb15는 DE 루프에 약하게 결합하였다. CC' 및 FG 도메인에 결합하고 포스파티딜세린을 차단한 항체(또는 유도체)는 C'C" 및 DE 루프에 결합한 항체(WO 2016/111947 A2, US 2018/0016336 A1)와 비교하여 가장 강력하게 보고된 기능적 활성을 가졌다; C'C" 및 DE 루프에 결합한 항체(WO 2016/071448)는 가장 특성화된 후속 PD1/TIM3 이중특이적 항체(WO 2017/055404)에 대해 선택되지 않았다.
또한, 도 16a 및 도 16b에 도시된 바와 같이, 2개의 자체 개발된 항체, 클론 62(AZD7789의 TIM-3 암) 및 F9S는 비경쟁적 방식으로 TIM-3의 IgV 도메인에 결합한다. F9S(도 16b에서 연회색 리본으로 표시됨)는 포스파티딜세린 및 Ca++ 이온 결합 부위에 가까운 CC' 및 FG 루프 근처의 IgV 도메인에 결합한다(도 16a). 클론 62(검은색 카툰으로 표시됨)는 IgV 베타 샌드위치의 다른 쪽에 결합한다. 클론 62 에피토프는 루프 BC, C'C", DE 및 짧은 가닥 D를 포함한다.
이 실시예는 AZD7789가 포스파티딜세린 결합과 반대쪽에 있는 TIM-3 IgV 도메인의 고유한 에피토프에 결합함을 확인한다(도 15의 A 및 B(Gandhi et al., Scientific Reports 2018; 8:17512)). 이 결합은 TIM-3의 IgV 도메인의 접힘 또는 구조에 변화를 일으키지 않으며 TIM-3과 포스파티딜세린의 상호작용을 차단하지 않는다(도 2). 대신, AZD7789는 TIM-3과 포스파티딜세린 사이의 맞물림을 증가시킨다(도 2). 이 고유한 기전은 알려진 포스파티딜세린 차단 항-TIM3 항체에서 관찰된 것보다 T 세포 매개 항종양 반응을 개선한다(도 11 내지 13).
* * *
본 발명은 본원에 기재된 특정 구현예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 기재된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 분명하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부되는 청구범위의 범위 내에 속하도록 의도된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌(예를 들어, 간행물 또는 특허 또는 특허 출원)은 각각의 개별적인 참고문헌(예를 들어, 간행물 또는 특허 또는 특허 출원)이 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
서열 표
SEQUENCE LISTING <110> ASTRAZENECA (MEDIMMUNE) <120> BISPECIFIC ANTIBODY TARGETING PD-1 AND TIM-3 <130> PDTM-200-US-PSP <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AZD 7789 TIM-3 VH CDR1 <400> 1 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AZD 7789 TIM-3 VH CDR2 <400> 2 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AZD 7789 TIM-3 VH CDR3 <400> 3 Gly Ser Tyr Gly Thr Tyr Tyr Gly Asn Tyr Phe Glu Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AZD 7789 PD-1 VH CDR1 <400> 4 Asp Tyr Gly Met His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AZD 7789 PD-1 VH CDR2 <400> 5 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AZD 7789 PD-1 VH CDR3 <400> 6 Arg Ala 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HC <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Pro Asn Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys 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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AZD 7789 PD-1 VL <400> 21 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Lys His Thr Asn Leu 20 25 30 Tyr Trp Ser Arg His Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro 50 55 60 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 85 90 95 Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AZD 7789 PD-1 LC <400> 22 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Lys His Thr Asn Leu 20 25 30 Tyr Trp Ser Arg His Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro 50 55 60 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 85 90 95 Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 23 <211> 710 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TIM-3 Heavy Chain <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Pro Asn Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Trp Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 450 455 460 Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 465 470 475 480 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp 485 490 495 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser 500 505 510 Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 515 520 525 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 530 535 540 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser 545 550 555 560 Tyr Gly Thr Tyr Tyr Gly Asn Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 565 570 575 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 580 585 590 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln 595 600 605 Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys 610 615 620 Gly Gly Asp Asn Ile Gly Gly Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys 625 630 635 640 Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro 645 650 655 Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala 660 665 670 Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 675 680 685 Cys Gln Val Leu Asp Arg Arg Ser Asp His Phe Leu Phe Gly Cys Gly 690 695 700 Thr Lys Leu Thr Val Leu 705 710 <210> 24 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TIM-3 Light Chain Variable Region <400> 24 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Lys His Thr Asn Leu 20 25 30 Tyr Trp Ser Arg His Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro 50 55 60 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 85 90 95 Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Trp Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 25 <211> 720 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TIM-3 Heavy Chain <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Pro Asn Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Trp Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 385 390 395 400 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 405 410 415 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 420 425 430 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile 435 440 445 Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 450 455 460 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 465 470 475 480 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 485 490 495 Ser Tyr Gly Thr Tyr Tyr Gly Asn Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 500 505 510 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 515 520 525 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr 530 535 540 Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr 545 550 555 560 Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Gly Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln 565 570 575 Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg 580 585 590 Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr 595 600 605 Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr 610 615 620 Tyr Cys Gln Val Leu Asp Arg Arg Ser Asp His Phe Leu Phe Gly Cys 625 630 635 640 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 645 650 655 Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 660 665 670 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 675 680 685 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 690 695 700 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 705 710 715 720 <210> 26 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TIM-3 Light Chain <400> 26 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Lys His Thr Asn Leu 20 25 30 Tyr Trp Ser Arg His Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro 50 55 60 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 85 90 95 Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Trp Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 27 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TIM3 (#62) Variable Heavy VH <400> 27 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Gly Thr Tyr Tyr Gly Asn Tyr Phe Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of human PD-1 protein <400> 28 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 29 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TIM-3 IgV domain <400> 29 Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp 20 25 30 Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg 35 40 45 Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn 50 55 60 Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr 65 70 75 80 Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile 85 90 95 Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TIM-3 protein <400> 30 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly 195 200 205 Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe 210 215 220 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile 225 230 235 240 Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 250 255 Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr 260 265 270 Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln 275 280 285 Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 290 295 300

Claims (49)

  1. 대상체에서 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 단백질-3(TIM-3)과 포스파티딜세린(PS) 간의 맞물림을 변경하는 방법으로서, TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 면역글로불린 가변(IgV) 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 항체 투여가 없는 경우에 비해 대상체에서 항종양 활성을 증가시키는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 대상체에서 항종양 활성을 증가시키는, 방법.
  4. 대상체에서 T 세포 매개 항종양 활성을 증가시키는 방법으로서, TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합하는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 대상체에서 T 세포 매개 항종양 활성은 항체 투여가 없는 경우에 비해 증가되는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 대상체에서 T 세포 매개 항종양 활성은 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 증가되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 항체 투여가 없는 경우에 비해 대상체에서 아폽토시스성 종양 세포의 수지상 세포 포식작용을 증가시키는, 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 대상체에서 아폽토시스성 종양 세포의 수지상 세포 포식작용을 증가시키는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 항체 투여가 없는 경우에 비해 대상체에서 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시를 증가시키는, 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 대상체에서 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시를 증가시키는, 방법.
  11. 대상체에서 종양 세포의 수지상 세포 포식작용을 촉진하는 방법으로서, TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합하는 것인, 방법.
  12. 대상체에서 종양 항원의 수지상 세포 교차 제시를 증가시키는 방법으로서, TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합하는 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 수지상 세포 교차 제시의 수준은 항체 투여가 없는 경우에 비해 증가되는, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 수지상 세포 교차 제시의 수준은 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해 증가되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 항체 투여가 없는 경우에 비해, 대상체에서 TIM-3 양성 T 세포에 대한 맞물림이 일어날 때 IL-2 분비를 증가시키는, 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 TIM-3의 IgV 도메인의 PS 결합 틈새(FG 및 CC' 루프)에 결합하는 TIM-3 결합 단백질의 투여에 비해, 대상체에서 TIM-3 양성 T 세포에 대한 맞물림이 일어날 때 IL-2 분비를 증가시키는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질의 투여는 대상체에서 종양 성장의 억제를 초래하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 종양은 진행성 또는 전이성 고형 종양인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 난소암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 방광암, 두경부암, 흑색종, 췌장암, 신장 세포 암종, 폐암, 식도암, 위암, 담도 종양, 요로상피암종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 중 하나 이상을 앓는 대상체인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 면역종양(IO) 획득 저항을 갖는 대상체인, 방법.
  21. IO 획득 저항을 갖는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, TIM-3 결합 도메인을 포함하는 TIM-3 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합하는 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 암은 난소암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 방광암, 두경부암, 흑색종, 췌장암, 신장 세포 암종, 폐암, 식도암, 위암, 담도 종양, 요로상피암종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 중 하나 이상인, 방법.
  23. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 근치적 수술 또는 방사선으로 치료되지 않는 문서화된 III기, 또는 IV기 비소세포 폐암종(NSCLC)을 앓는 대상체인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, NSCLC는 편평 또는 비편평 NSCLC인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항, 제45항, 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 항-PD-1/PD-L1 요법으로 최소 3~6개월 동안 단일 요법으로 또는 화학 요법과 병용하여 초기 치료 후 방사선학적으로 문서화된 종양 진행 또는 임상적 악화를 갖고, 초기 임상적 이점, 즉 질환 안정화 또는 관해의 징후를 가진 대상체인, 방법.
  27. 제20항 내지 제26항, 제45항, 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, IO 획득 저항은 다음과 같이 정의되는, 방법:
    (i) 항 PD-1/PD-L1 단일 요법에 대한 6개월 미만의 노출 후 초기에 부분 관해 또는 완전 관해의 최적의 전반적인 반응(BOR)에 이어, 치료 중 질환이 진행되거나 항 PD-1/PD-L1 치료 중단 후 12주 이내에 질환이 진행된 경우; 또는
    (ii) 항 PD-1/PD-L1 요법 단독 또는 화학요법과의 병용에 대한 6개월 이상의 노출 후 질환 안정화, 부분 관해, 또는 완전 관해의 BOR에 이어, 치료 중 질환이 진행되거나 항-PD-1/PD-L1 치료 중단 후 12주 이내에 질환이 진행된 경우.
  28. 제20항 내지 제26항, 제45항, 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, IO 획득 저항은 항 PD-1/PD-L1 요법 단독 또는 화학요법과의 병용에 대한 6개월 이상의 노출; 질환 안정화, 부분 관해, 또는 완전 관해의 최적의 전반적인 반응(BOR)에 이어, 치료 중 질환이 진행되거나 항-PD-1/PD-L1 치료 중단 후 12주 이내에 질환이 진행된 경우로 정의되는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 PD-L1 종양 비율 점수(TPS)는 1% 이상인, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 제1선의 환경에서 사전 전신 요법을 받지 않은 대상체인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 사전 전신 요법은 항-PD-1/PD-L1 요법 이외의 IO 요법인, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 대상체는 사전 신/보조 요법을 받았지만 항-PD-1/PD-L1 요법의 마지막 투여 후 적어도 12개월 동안 진행이 없었던 대상체인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 대상체의 PD-L1 TPS는 50% 이상인, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질은 상보성 결정 영역(CDR): 각각 서열번호 1, 2, 3, 7. 8, 및 9, 또는 각각 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 에피토프는 TIM-3의 N12, L47, R52, D53, V54, N55, Y56, W57, W62, L63, N64, G65, D66, F67, R68, K69, D71, T75, 및 E77을 포함하는(서열번호 29), 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 결합 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, TIM-3 결합 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)의 제1 세트: 각각 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 및 9, 또는 각각 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고; PD-1 결합 도메인은 CDR의 제2 세트: 각각 서열번호 4, 5, 6, 10, 11, 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 도메인(VH), 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 가변 도메인(VL), 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 VH, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄 VL을 포함하는, 방법.
  39. 제37항에 있어서, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, 방법.
  40. 제37항에 있어서, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, 방법.
  41. 제37항에 있어서, TIM-3 결합 단백질은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, 방법.
  42. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질은 비글리코실화 Fc 영역을 포함하는, 방법.
  43. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질은 탈글리코실화된 Fc 영역을 포함하는, 방법.
  44. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3 결합 단백질은 감소된 푸코실화를 갖거나 비푸코실화된 Fc 영역을 포함하는, 방법.
  45. 진행성 또는 전이성 NSCLC를 앓는 대상체의 NSCLC를 치료하는 방법으로서, PD-1 결합 도메인 및 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    이중특이적 결합 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하고,
    대상체는 IO 획득 저항을 갖는, 방법.
  46. 진행성 또는 전이성 종양을 앓는 대상체의 비소세포 폐 종양의 성장을 억제하는 방법으로서, PD-1 결합 도메인 및 TIM-3 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    이중특이적 결합 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하고,
    대상체는 IO 획득 저항을 갖는, 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인의 C'C" 및 DE 루프에 특이적으로 결합하는 것인, 방법.
  48. 제45항 또는 제46항에 있어서, TIM-3 결합 도메인은 TIM-3의 IgV 도메인 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 에피토프는 TIM-3의 N12, L47, R52, D53, V54, N55, Y56, W57, W62, L63, N64, G65, D66, F67, R68, K69, D71, T75, 및 E77을 포함하는(서열번호 29), 방법.
  49. 제45항 내지 제48 중 어느 한 항에 있어서, NSCLC는 편평 또는 비편평 NSCLC인, 방법.
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