KR20230168930A - 바이오센서 카트리지 및 이를 포함하는 바이오센서 장치 - Google Patents
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Abstract
바이오센서 카트리지가 개시된다. 본 발명의 일 측면에 따른 바이오센서 카트리지는 생체 물질을 검출하여 전기화학발광 신호를 생성하는 바이오센서 카트리지로서, 복수의 전극을 포함하는 전극부; 및 상기 전극부 상에 마련된 전체 공간을 신호 챔버와, 상기 신호 챔버를 둘러싸는 N개의 반응 챔버로 구획하도록 상기 전극부 상에 배치되는 구획부;를 포함하고, 상기 전극부는, 적어도 일부가 상기 반응 챔버 내에 배치되는 제1 전극; 상기 신호 챔버 내에 배치되는 제2 전극; 및 상기 반응 챔버 내의 화학 반응과 상기 신호 챔버 내에서 발생하는 상기 전기화학발광 신호를 전기적으로 연동시키도록 배치되는 N개의 연결 전극;을 포함한다.
Description
본 발명은 바이오센서 카트리지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체 물질을 검출하여 전기화학발광 신호를 생성하는 바이오센서 카트리지 및 이를 포함하는 바이오센서 장치에 관한 것이다.
체외진단 기술은 기술적으로 크게 특정 유전자를 정량/정성 분석하는 분자진단 기술, 특정 항원/단백질체를 분석하는 면역진단 기술 및 생체 단분자의 농도를 분석하는 임상화학분석 기술, 세포의 대사 과정에서 발생하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV) 분석 기술 등으로 나뉜다. 이러한 체외진단 기술은 전염병용, 당뇨병용, 종양학용, 심장학용, 자가면역질환용, 신약개발용 등 다양한 분야에서 널리 이용되고 있다.
한편, 체외진단 기술과 관련하여, 최근 질병을 보다 초기에 진단하기 위한 조기 진단과 예방적 치료 및 건강 모니터링에 대한 니즈 증가로 대형병원 중심의 진단검사에서 환자 중심, 분산형/현장형 진단검사 방식으로 패러다임이 옮겨지는 추세에 있다.
이러한 새로운 패러다임에 부응하기 위해서는 고성능화, 분산화/탈중앙화 및 소형화/현장화의 효과를 달성할 수 있는 체외진단기기의 개발이 필수적으로 요구된다.
그러나, 현재 체외진단기기는 검사 형태에 따라 고성능/대형/고가의 중앙검사실용 진단기기와 저성능/소형/저가의 현장진단기기의 두가지 형태로 양극화되어 보급되는 실정이며, 따라서 상술한 새로운 패러다임에 적용할 만한 기술적 대안을 갖추지 못하고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 고민감도의 체외진단 성능을 갖추면서도 동시에 현장 보급이 유리하도록 빠른 진단속도 및 컴팩트한 구조를 갖춘 바이오센서 카트리지 및 이를 포함하는 바이오센서 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 바이오센서 카트리지는 생체 물질을 검출하여 전기화학발광 신호를 생성하는 바이오센서 카트리지로서, 복수의 전극을 포함하는 전극부; 및 상기 전극부 상에 마련된 전체 공간을 신호 챔버와, 상기 신호 챔버를 둘러싸는 N개의 반응 챔버로 구획하도록 상기 전극부 상에 배치되는 구획부;를 포함하고, 상기 전극부는, 적어도 일부가 상기 반응 챔버 내에 배치되는 제1 전극; 상기 신호 챔버 내에 배치되는 제2 전극; 및 상기 반응 챔버 내의 화학 반응과 상기 신호 챔버 내에서 발생하는 상기 전기화학발광 신호를 전기적으로 연동시키도록 배치되는 N개의 연결 전극;을 포함하는 바이오센서 카트리지가 제공된다.
이때, 상기 연결 전극은 상기 반응 챔버에 내에 배치되는 검출부분 및 상기 신호 챔버 내에 배치되는 발광부분을 포함하여 일체로 형성될 수 있다.
이때, 상기 연결 전극의 검출부분은 상기 제1 전극과 소정 간격 이격된 상태에서 상기 제1 전극의 적어도 일부를 감싸도록 형성되고, 상기 연결 전극의 발광부분은 상기 제2 전극을 향하도록 배치되되, 단부가 뾰족한 형상을 가지도록 형성될 수 있다.
이때, 상기 연결 전극은 전체적으로 Y자 형상을 가지도록 형성될 수 있다.
이때, 상기 전극부는 원형으로 형성되고, 상기 구획부는 상기 전극부의 형상에 대응되도록 외벽이 원형을 이루도록 형성될 수 있다.
이때, 상기 구획부는, 상기 구획부의 최외측에 배치되어 상기 N개의 반응 챔버의 일측부를 형성하는 외벽; 상기 외벽의 내측에 배치되어 상기 신호 챔버를 구획하는 내벽; 및 상기 외벽의 내주면으로부터 상기 내벽의 외주면까지 연장되되, 상기 내벽의 둘레 방향을 따라 N개가 이격되어 배치되는 격벽;을 포함할 수 있다.
이때, 상기 외벽 및 내벽은 원형으로 형성되고, 상기 내벽과 외벽 사이에는 8개의 반응 챔버가 형성되도록 8개의 상기 격벽이 등간격으로 배치될 수 있다.
이때, 상기 제2 전극은 8각형 형상을 가지도록 형성될 수 있다.
이때, 상기 내벽은 상기 N개의 연결 전극을 가로지르도록 배치되며, 상기 N개의 연결 전극 중 상기 내벽이 배치되는 부분에는 절연체가 배치될 수 있다.
이때, 상기 제1 전극은 단일폐곡선 형상으로 형성되되 상기 구획부에 의해 N개의 부분으로 구분되는 지지부분을 포함할 수 있다.
이때, 상기 지지부분은 상기 제2 전극을 중심으로 하는 원 형상으로 형성될 수 있다.
이때, 상기 제1 전극은 상기 지지부분으로부터 상기 제2 전극을 향하는 방향으로 돌출되어 형성된 N개의 반응부분을 더 포함하고, 상기 N개의 반응부분은 상기 N개의 반응 챔버 내에 하나씩 배치될 수 있다.
이때, 상기 반응부분은 원 형상으로 형성되고, 상기 연결 전극의 일단부는 상기 반응부분과 소정 간격 이격된 상태에서 상기 반응부분을 감싸도록 형성될 수 있다.
이때, 상기 N개의 반응 챔버에는 각각 별개의 개체로부터 채취된 상이한 시료가 투입될 수 있다.
이때, 상기 N개의 반응 챔버에는 동일한 개체로부터 채취된 동일한 시료가 투입되되, 상기 동일한 시료에 대하여 복수의 생체 물질을 검출하기 위하여 각기 다른 검출시약이 투입될 수 있다.
이때, 상기 생체 물질은 감염성 질환 감염 여부, 대사 질환, 면역 질환, 또는 암 발병 여부를 감지하기 위한 물질을 의미하며, DNA, RNA, 단백질, 대사 물질, 세포외 소포체 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 전술한 바이오센서 카트리지; 상기 바이오센서 카트리지를 수용하도록 수용공간이 형성되는 몸체부; 상기 몸체부의 상기 수용공간 측에 배치되며 상기 바이오센서 카트리지의 상기 전극부 측으로 전압을 인가하는 전압인가부; 및 상기 바이오센서 카트리지의 제2 챔버에서 생성되는 상기 전기화학발광 신호를 촬영하는 이미지센서부;를 포함하는, 바이오센서 장치가 제공된다.
이때, 상기 바이오센서 카트리지는 일회용으로 형성될 수 있다.
이때, 상기 구획부는 일부에 외측 방향으로 돌출되어 형성된 적어도 하나의 삽입돌기를 포함하고, 상기 몸체부는 상기 삽입돌기와 대응되는 위치에 상기 삽입돌기가 삽입되어 고정되도록 적어도 하나의 삽입홈이 형성될 수 있다.
이때, 상기 반응 챔버 측으로 자력을 인가하도록 상기 몸체의 상기 수용공간 중에서 상기 반응 챔버와 대응되는 위치에 배치되는 자력인가부재를 더 포함할 수 있다.
상기의 구성에 따라, 본 발명에 실시예에 따른 바이오센서 카트리지는 구획부를 통한 공간 분리를 통해 각 챔버 별로 최적화된 반응 조건을 형성할 수 있어 고민감도의 검출 결과를 획득할 수 있다.
또한, 본 발명에 실시예에 따른 바이오센서 카트리지는 복수의 시료를 동시에 진단하는 것이 가능하도록 복수의 반응 챔버를 구비하되, 검출 결과의 확인은 일거에 가능하도록 단일한 신호 챔버 내에 복수의 발광부분을 배치시킴으로써 진단의 속도를 비약적으로 향상시킬 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지는 검출부분과 발광부분 각각 최적화된 구조의 연결 전극을 구비함으로써 검출의 민감도를 보다 향상시킬 수 있다.
그리고, 본 발명에 실시예에 따른 바이오센서 장치는 초소형화된 장비 만으로 구동이 가능하므로 의료현장에 손쉽게 보급할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 장치를 분리하여 도시한 분리사시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 장치를 개략적으로 도시한 구성도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 전면과 후면을 구분하여 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지를 상부에서 바라본 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 전극부의 일부를 부분적으로 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 전극부의 다른 예를 도시한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 연결 전극을 도시한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지에 포함된 복수의 연결 전극의 형상을 각각 달리하여 전류 밀도를 측정한 것을 도시한 도면이다.
도 9는 마그넷 비드를 이용하여 시료를 전처리하는 과정을 모식적으로 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 공간 구조 및 각 챔버별 화학 반응을 설명하기 위한 설명도이다.
도 11은 종래 기술이 적용된 바이오센서 장치의 공간 구조를 설명하기 위한 설명도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지에 대하여 전압을 인가하기 전/후의 신호 챔버를 구분하여 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 장치를 개략적으로 도시한 구성도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 전면과 후면을 구분하여 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지를 상부에서 바라본 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 전극부의 일부를 부분적으로 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 전극부의 다른 예를 도시한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 연결 전극을 도시한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지에 포함된 복수의 연결 전극의 형상을 각각 달리하여 전류 밀도를 측정한 것을 도시한 도면이다.
도 9는 마그넷 비드를 이용하여 시료를 전처리하는 과정을 모식적으로 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 공간 구조 및 각 챔버별 화학 반응을 설명하기 위한 설명도이다.
도 11은 종래 기술이 적용된 바이오센서 장치의 공간 구조를 설명하기 위한 설명도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지에 대하여 전압을 인가하기 전/후의 신호 챔버를 구분하여 도시한 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 도면에서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 붙였다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 단어와 용어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 않고, 자신의 발명을 최선의 방법으로 설명하기 위해 발명자가 용어와 개념을 정의할 수 있는 원칙에 따라 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 장치를 분리하여 도시한 분리사시도이다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 장치를 개략적으로 도시한 구성도이다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 전면과 후면을 구분하여 도시한 도면이다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지를 상부에서 바라본 도면이다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 전극부의 일부를 부분적으로 도시한 도면이다. 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 전극부의 다른 예를 도시한 도면이다. 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 연결 전극을 도시한 도면이다. 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지에 포함된 복수의 연결 전극의 형상을 각각 달리하여 전류 밀도를 측정한 것을 도시한 도면이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 장치(100)는 일례로 의학 분야 또는 연구 분야 등과 같이 생체 물질의 검출을 필요로 하는 다양한 분야에서 이용될 수 있는 장치로서, 시료에 포함된 생체 물질의 검출 여부에 따라 전기화학발광(Electrochemical Luminescence, ECL) 신호를 생성하는 장치이다.
이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 장치(100)는 서로 공간적으로 분리된 복수의 반응 챔버(26)와 단수의 신호 챔버(27)를 구비하는 바이오센서 카트리지(10)를 통해 검출의 민감도를 향상시킬 수 있으면서도 동시에 복수의 시료에 대하여 신속히 생체 물질의 포함 유무를 진단할 수 있는데, 이하 상기 바이오센서 카트리지(10)를 중심으로 설명하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지(10)는 생체 물질의 검출 대상이 되는 시료가 수용되는 부재로서, 도 1에 도시된 바와 같이 구획부(20) 및 전극부(30)를 포함할 수 있다.
먼저, 구획부(20)는 후술될 전극부(30)의 상부에 마련된 전체 공간(G)을 복수의 공간(26,27)으로 구획하기 위한 부재이다.
보다 구체적으로, 구획부(20)는 전체 공간(G)을 내측에 배치되는 신호 챔버(27)와, 외측에 배치되는 반응 챔버(26)로 구획할 수 있다.
이때, 신호 챔버(27)는 도 4에 도시된 바와 같이 전체 공간(G) 중에서 중심부에 배치되는 공간으로서 단수 개가 존재할 수 있다. 이때, 신호 챔버(27)에는 후술될 연결 전극(35)의 발광부분(37)이 배치되어 전기화학발광 신호를 관찰할 수 있는데 이에 대해서는 해당되는 부분을 통해 자세히 기술하기로 한다.
다음으로, 반응 챔버(26)는 신호 챔버(27)와 달리 복수 개가 구비될 수 있다. 이때, 복수 개의 반응 챔버(26)는 중심부의 신호 챔버(27)를 둘러싸도록 배치될 수 있다. 예를 들어, 반응 챔버(26)는 도면에 도시된 바와 같이 8개가 구비될 수 있으나, 반응 챔버(26)의 개수가 도시된 예로 한정되는 것은 아님을 밝혀 둔다. 즉, 반응 챔버(26)는 2개 이상이면 다양한 개수(예를 들면 24개)로 구비될 수 있다.
그리고, 도면에는 전극부(30)가 원형으로 형성되고, 이에 따라 전체 공간(G)이 원형의 신호 챔버(27)와 원뿔대를 펼친 형상의 반응 챔버(26)로 구획되는 것으로 도시되어 있으나, 전극부(30)는 이외에도 정방형, 장방형 등 다양한 형상을 가질 수 있으며 신호 챔버(27)와 반응 챔버(26)의 형상 또한 상술한 예로 한정되는 것은 아님을 밝혀 둔다.
한편, 반응 챔버(26)에는 시료가 수용될 수 있으며, 전극부(30)에 전압이 인가될 경우 상기 반응 챔버(26) 내에서 시료 내 생체 물질의 포함 여부에 따라 화학 반응이 형성될 수 있다. 이에 대해서도 설명의 편의상 후술되는 부분을 통해 종합적으로 기술하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 구획부(20)는 도 4에 도시된 바와 같이 외벽(21), 내벽(22) 및 격벽(23)을 포함하는 구조로 형성될 수 있다.
먼저, 외벽(21)은 구획부(20)의 최외측에 배치되어 복수 개의 반응 챔버(26)의 일측부를 형성하는 부분으로서, 일례로 도면에 도시된 바와 같이 전극부(30)와 상응하는 크기의 반경을 갖는 원형으로 형성될 수 있다.
그리고, 내벽(22)은 신호 챔버(27)를 구획하도록 구획부(20)의 내측에 배치되는 부분으로서, 예를 들면 외벽(21) 보다 작은 반경을 갖는 원형으로 형성될 수 있다.
다음으로, 격벽(23)은 외벽(21)과 내벽(22) 사이의 공간을 구획하도록 외벽(21)의 내주면으로부터 내벽(22)의 외주면까지 연장되어 형성될 수 있다. 이때, 격벽(23)은 외벽(21) 및 내벽(22)과 달리 복수 개가 배치될 수 있으며, 바람직하게는 동일한 크기의 신호 챔버(27)가 형성되도록 등간격으로 이격 배치될 수 있다.
구체적인 일례로서, 도면에 도시된 바와 같이 원형의 전극부(30)에 대응하여 외벽(21) 및 내벽(22)도 원형으로 형성되는 경우, 8개의 격벽(23)이 등간격으로 배치되어 동일한 체적을 가지는 8개의 반응 챔버(26)가 형성될 수 있다. 이처럼 외벽(21) 및 내벽(22)이 모두 원형으로 형성되는 경우, 복수 개의 반응 챔버(26)가 모두 동일한 체적 및 형상을 가질 수 있어 모든 반응 챔버(26)를 균일하게 형성할 수 있는 장점이 있다.
다만, 상술한 설명에서는 전극부(30) 및 구획부(20)가 모두 원형으로 형성되는 것을 중심으로 설명하였으나, 전극부(30) 및 구획부(20)의 형상이 이에 제한되는 것은 아니며 전술한 바와 같이 다양한 형상으로 형성될 수 있음을 다시 한번 밝혀 둔다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 구획부(20)는 예를 들면 접착제 등을 매개로 하여 전극부(30)에 접착되어 고정될 수 있다. 이를 통해 구획부(20)와 전극부(30) 사이의 기밀성을 확보하여 반응 챔버(26) 또는 신호 챔버(27)에 수용된 유체(시료 또는 시약)가 구획부(20) 하부에 형성된 미세한 유격을 통해 다른 챔버 측으로 이동되는 것을 차단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 전극부(30)는 구획부(20)의 하측에 배치되어 구획부(20)와 함께 신호 챔버(27) 및 반응 챔버(26)를 함께 형성하는 부재이다. 이때, 전극부(30)는 복수의 도전성 전극(31,34,35)을 포함함으로써 전기화학발광 신호를 유도하기 위한 전압이 인가될 수 있다.
구체적으로, 전극부(30)는 플레이트(39)와 복수의 전극(31,34,35)을 포함할 수 있다.
먼저, 플레이트(39)는 공지의 인쇄회로기판(PCB)으로 형성될 수 있다. 이때, 플레이트(39)는 소정 두께를 가지는 판상으로 형성되며 예를 들면, 도면에 도시된 바와 같이 원형으로 형성될 수 있다.
이때, 플레이트(39)의 일면 상에는 도 3(a)에 도시된 바와 같이 제1 전극(31), 제2 전극(34) 및 연결 전극(35)이 배치될 수 있다. 이때, 제1 전극(31), 제2 전극(34) 및 연결 전극(35)은 전기가 흐를 수 있도록 도전성 소재로 형성된 공지의 전극으로서 예를 들면 무전해 도금(electroless plating process) 공정을 통해 플레이트(39) 상에 패턴화된 형태로 배치될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 제1 전극(31)은 적어도 일부가 반응 챔버(26) 내에 배치되는 전극으로서, 반응 챔버(26)에서 화학 반응이 발생되도록 반응 챔버(26)에 전기적 위치 에너지를 형성하기 위한 매개체로 기능할 수 있다.
구체적인 일례로서, 제1 전극(31)은 도 4에 도시된 바와 같이 플레이트(39)의 외측부를 따라 연장되는 지지부분(32)과, 상기 지지부분(32)으로부터 후술될 제2 전극(34)을 향하는 방향으로 돌출되는 반응부분(33)을 포함할 수 있다.
이때, 지지부분(32)은 도면에 도시된 바와 같이 전극부(30)의 전체적인 형상에 대응되는 형상으로 형성되며, 원 또는 정사각형과 같은 단일 폐곡선 형상을 이루도록 형성될 수 있다.
이처럼 단일한 형태의 지지부분(32)은 구획부(20)에 의해 각각 복수의 반응 챔버(26)에 대응되는 복수의 부분으로 구분될 수 있다. 이때, 지지부분(32) 중에서 구획부(20)에 의해 구분된 각 부분은 개별 반응 챔버(26) 내에 배치될 수 있다.
이러한 지지부분(32)은 전압인가부(50)에 의해 전압이 인가될 경우, 시료를 포함한 화학 반응이 이루어질 수 있으며, 복수의 반응부분(33)이 모두 등전위를 형성하도록 상기 복수의 반응부분(33)을 전기적으로 연결할 수 있다.
다음으로, 반응부분(33)은 제1 전극(31)에 전압이 인가될 경우, 보다 활발한 화학 반응을 유도하기 위하여 제1 전극(31)의 면적을 확장하기 위한 부분으로서 지지부분(32)의 일부에 연결되되 일례로 도 5에 도시된 바와 같이 원 형상으로 이루어질 수 있다. 이때, 반응부분(33)은 반응 챔버(26)의 개수에 대응되는 개수로 형성되어 각 반응 챔버(26) 내에 하나씩 배치될 수 있다.
다만, 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이 지지부분(32)과 반응부분(33)을 포함하는 구조의 제1 전극(31)은 일례에 불과하며, 제1 전극(31)은 도 6에 도시된 바와 같이 반응부분(33) 없이 지지부분(32) 만으로 형성될 수도 있다. 이 경우, 화학 반응은 지지부분(32) 상에서 충분히 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 신호 챔버(27)의 내부에는 단일한 개수의 제2 전극(34)이 배치될 수 있다. 이때, 제2 전극(34)은 제1 전극(31)과 함께 전압인가부(50)에 의해 전압이 인가될 수 있다. 이때, 제2 전극(34)에는 제1 전극(31) 보다 낮은 전위가 형성됨으로써 제1 전극(31)과 제2 전극(34) 사이에는 예를 들면 0.4V와 같은 소정 전위차가 형성될 수 있다.
이때, 제2 전극(34)은 도 5에 도시된 바와 같이 정다각형 형상으로 형성될 수 있다. 예를 들면 구획부(20)에 의해 전체 반응 챔버(26)가 8개가 되도록 구획되는 경우, 제2 전극(34)은 8각형 형상을 가지도록 형성됨으로써 어느 일 챔버를 향하여 전기적으로 편향됨이 없이 균일성을 유지할 수 있다.
다시 도 3 내지 도 5를 참조하면, 제1 전극(31)과 제2 전극(34) 사이에는 반응 챔버(26)와 신호 챔버(27)를 전기적으로 연결시키기 위한 연결 전극(35)이 배치될 수 있다. 이를 위해 연결 전극(35)은 도면에 도시된 바와 같이 물리적으로 분리됨이 없이 전체적으로 일체화된 구조로 형성되되, 일부(36)는 반응 챔버(26)에 배치되고 다른 일부(37)는 신호 챔버(27)에 배치될 수 있다. 즉, 연결 전극(35)은 반응 챔버(26)와 신호 챔버(27)를 모두 지나도록 배치될 수 있으며, 이 경우, 구획부(20)의 내벽(22)이 연결 전극(35)을 가로지르도록 배치될 수 있다.
이러한 연결 전극(35)을 통해서 반응 챔버(26)와 신호 챔버(27)는 구획부(20)에 의해 공간적으로는 유체의 소통이 불가하도록 분리되면서도 전기적으로는 서로 연결될 수 있다. 여기서, 전기적으로 연결된다는 것의 의미는 신호 챔버(27)와 반응 챔버(26) 중 어느 한 챔버의 전기적 작용이 다른 한 챔버의 전기적 작용에 영향을 미치는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 연결 전극(35)은 제1 전극(31)와 함께 반응 챔버(26) 내에 배치되는 검출부분(36)과 제2 전극(34)과 함께 신호 챔버(27) 내에 배치되는 발광부분(37)을 포함할 수 있다. 관련하여, 제1 전극(31) 및 제2 전극(34)에 전압이 인가될 경우, 검출부분(36)에서는 화학 반응이 형성되고, 이에 따라 발광부분(37)에서는 전기화학발광 반응이 형성될 수 있는데, 이에 대해서는 후술하기로 한다.
이때, 연결 전극(35)은 반응 챔버(26)의 개수에 대응되도록 복수 개가 플레이트(39) 상에 배치될 수 있다. 그리고, 연결 전극(35)은 도면에 도시된 바와 같이 양단부가 각각 제1 전극(31) 및 제2 전극(34)과 직접적인 전하의 이동은 불가하도록 소정 간격 이격되도록 배치될 수 있다.
도 4를 참조하면, 복수 개의 연결 전극(35)이 플레이트(39) 상에 배치되는 경우, 개별 연결 전극(35)의 검출부분(36)은 각각 복수 개의 반응 챔버(26) 중 어느 하나에 배치될 수 있다. 이와 반대로 발광부분(37)은 모두 신호 챔버(27) 내에 배치될 수 있다.
한편, 연결 전극(35)의 형상과 관련된 예시적인 일례로서 도 7을 참조하면, 연결 전극(35)의 검출부분(36)은 제1 전극(31)의 반응부분(33)과 소정 간격 이격 배치되되, 반응부분(33)을 감싸도록 형성될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지(10)는 이처럼 연결 전극(35)의 검출부분(36)이 제1 전극(31)의 반응부분(33)을 감싸도록 형성됨으로써 검출부분(36)과 제1 전극(31)의 반응부분(33) 간의 전하가 이동할 수 있는 전극 면적을 증가시켜 제1 전극(31)의 반응부분(33) 에서의 화학 반응에 의해 유도되는 연결 전극(35)에서의 전하의 이동을 보다 즉각적으로 유도할 수 있다. 그 결과 반응 챔버(26)의 화학 반응과 신호 챔버(27)의 전기화학발광 반응을 보다 신속 정확하게 연동시킬 수 있다.
다시 도 7을 참조하면, 연결 전극(35)의 발광부분(37)은 다양한 형상을 가지도록 형성될 수 있다. 일례로 도면에 도시된 바와 같이 단부가 뾰족한 첨단형으로 형성되거나, 제1 전극(31)의 반응부분(33)과 유사하게 원형으로 형성되는 등 목적하는 전기화학발광 신호의 세기나 전압, 후술될 이미지센서부(70)의 민감도에 따라 다양한 형상을 가지도록 형성될 수 있다.
다만, 본 발명의 발명자는 전극부(30) 및 구획부(20)가 도 4에 도시된 바와 같이 형성될 경우,(특히 제2 전극(34)이 8각 형상을 가질 경우) 단부가 뾰족한 첨단형 구조의 발광부분(37)을 가지는 연결 전극(35)에서 가장 활발한 전기화학발광 반응이 형성되는 것을 관찰할 수 있었다.(도 8 참조)
종합하면, 연결 전극(35)은 양단부에 각각 양 갈래로 분기되는 구조의 검출부분(36)과, 일방향을 따라 연장되는 구조의 발광부분(37)을 포함하여 전체적으로 Y자 형상을 가지도록 형성될 수 있다. 그 결과 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지(10)는 검출부분(36)을 통해 반응 챔버(26)과 신호 챔버(27)의 상호 연계를 극대화하면서도 발광부분(37)에서의 전기화학발광 반응도 최적화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 도 4를 참조하면 연결 전극(35) 중에서 구획부(20)의 내벽(22)이 배치되는 부분(검출부분(36)과 발광부분(37) 사이)에는 전기가 통하지 않도록 절연체(38)가 배치될 수 있다. 이처럼 내벽(22)의 하부에 절연체(38)가 배치됨으로써 반응 챔버와 신호 챔버(27) 사이의 직접적인 전기적 연결을 차단하되, 오로지 연결 전극(35)을 통해서만 전기적으로 연결되도록 하여 검출의 신뢰성을 보다 제고할 수 있다.
도 9는 마그넷 비드를 이용하여 시료를 전처리하는 과정을 모식적으로 도시한 도면이다. 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지의 공간 구조 및 각 챔버별 화학 반응을 설명하기 위한 설명도이다. 도 11은 종래 기술이 적용된 바이오센서 장치의 공간 구조를 설명하기 위한 설명도이다. 도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지에 대하여 전압을 인가하기 전/후의 신호 챔버를 구분하여 도시한 도면이다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지(10)의 반응 챔버(26)와 신호 챔버(27)에서의 화학 반응 및 전기화학발광 반응에 대하여 구체적으로 살펴보기로 한다.
먼저, 바이오센서 카트리지(10)의 반응 챔버(26) 측으로 시료를 투입하기에 앞서 시료에 대한 전처리 공정이 진행될 수 있다. 즉, 도 9에 도시된 바와 같이 면역자기 비드(immunomagnetic beads)를 이용하여 시료에 포함된 표적을 포획한 후, 포획된 표적을 다시 프로브 항체(probe antibodies)를 통해 포도당 산화효소(GOx, glucose oxidase)와 같은 산화 효소로 추가로 표지(labeled)할 수 있다.
이어 반응 챔버(26)에는 상기 효소 표지 비드(enzyme-labeled beads)와 포도당 용액(glucose solution)을 투입하고, 신호 챔버(27)에는 루미놀과 과산화수소(luminol, H2O2)와 같은 전기화학발광 시약(ECL reagents)을 투입할 수 있다.
그 후, 전압인가부(50)에 의해 제1 전극(31) 및 제2 전극(34)을 전압을 인가하면, 반응 챔버(26)에서는 다음과 같은 화학 반응이 형성될 수 있다. (도 10 참조)
[화학식 1]
- 제1 전극(양극): Glucose + O2 → gluconic acid + H2O2 (GOx, Enzymatic reaction), H2O2 → O2 + 2H+ + 2e-
- 연결 전극의 검출부분(음극): 1/2 O2 + 2H+ + 2e- → H2O
이때, 반응 챔버(26)에서는 효소 표지 비드의 산화효소(GOx)와 포도당의 효소 반응을 통해 과산화수소가 생성되며, 생성된 과산화수소는 제1 전극(31)에서 산화된다. 그리고, 연결 전극(35)의 검출부분(36)에서는 산소와 수소가 환원된다. 이때, 반응에 참여한 전자의 수는 신호 챔버(27)에서 반응에 참여한 전자의 수와 동일하게 된다.
상술한 반응 챔버(26)에서의 화학 반응에 의해 신호 챔버(27)에서는 다음과 같은 화학 반응이 유도될 수 있다.
[화학식 2]
- 연결 전극의 발광부분(양극): Luminol + H2O2 → O2 + 2H+ + N2 + 2e- + 3-AP*, 3-AP* → 3-AP + hλ
- 제2 전극(음극): 1/2 O2 + 2H+ + 2e- → H2O
이때, 신호 챔버(27)의 발광부분(37)에서는 반응 챔버(26)에서 유도된 화학 반응으로 인한 전자의 이동을 기초로 luminol 혹은 Ru(bpy) 등의 화학 물질들이 직접적으로 발광하는 전기화학발광 반응이 유도된다. 따라서 복수의 반응 챔버(26)에서 발생하는 반응의 종류나 반응 정도에 따라 생성되는 광자(Photon)의 수가 변화하게 되며 빛의 세기가 달라지게 된다.
종합하면, 제1 전극(31)과 제2 전극(34)에 전압이 인가되면 효소 표지 비드는 반응 챔버(26)에서 산화-환원 반응(redox reaction)을 촉진함으로써 신호 챔버(27)에서 전기화학발광 반응을 발생시킨다. 이때, 신호 챔버(27)에서의 전기화학발광 반응의 강도는 표적 단백질의 농도에 비례하게 된다. 즉, 도 12에 도시된 바와 같이 전극부(30)에 전압이 인가되기 전에는 발광하지 않던 발광부분(37)이 전압이 인가된 후에는 각 반응 챔버(26)에 포함된 표적 단백질의 농도에 따라 각기 다른 강도의 전기화학발광 반응을 형성하게 된다.
이처럼 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지(10)는 구획부(20)를 통해 최초 화학 반응이 형성되는 반응 챔버(26)와 전기화학발광 반응이 형성되는 신호 챔버(27)를 공간적으로 분리시킴으로써 크로스 토크 없이 각 챔버(26,27) 별로 최적의 반응 조건에서 각 프로세스를 수행할 수 있으며, 이를 토대로 개선된 검출민감도를 달성할 수 있다.
보다 구체적으로, 산화효소(GOx)는 중성 pH에서 효과적인 효소 활성을 보이는 반면, 루미놀(luminol)과 같은 전기화학발광 시약(ECL reagents)은 pH 10 이상의 염기성 pH에서 용해도가 증가되게 되는 것과 같이, 반응 챔버(26)와 신호 챔버(27)에서의 화학 반응은 서로 최적의 pH를 달리할 수 있다. 이 점을 고려하였을 때, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지(10)는 양 챔버(26,27)에 대하여 개별적으로 최적의 반응 조건을 형성함으로써 높은 신호대배경잡음비를 달성할 수 있다.
그러나, 만약 도 11과 같이 신호 챔버와 반응 챔버가 서로 공간적으로 분리되지 않은 상태로 존재하게 될 경우, 양 반응을 모두 최적화시킬 수 있는 반응 조건을 형성하는 것은 불가하다. 즉, 이 경우 예를 들면 pH 8.5와 같이 상술한 두가지 최적 조건의 중간 값에 해당하는 반응 조건을 형성할 수밖에 없다. 따라서, 단일 챔버 구조에 의할 경우, 본 발명과 같은 높은 수준의 신호대배경잡음비를 기대할 수는 없다.
한편 상술한 전처리 과정 또는 각 챔버에 투입되는 시약은 예시적인 일례에 불과하며, 본 발명의 적용이 상술한 예시로 한정되는 것은 아님을 밝혀 둔다. 즉, 설계자는 목적하는 생체 물질에 따라 최적화된 전처리 과정 및 시약을 다양하게 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지(10)의 복수의 반응 챔버(26)에는 각기 다른 종류의 시료가 투입될 수 있다. 예를 들어 바이오센서 카트리지(10)가 8개의 반응 챔버(26)를 구비하는 경우, 8인의 각기 다른 개체로부터 채취된 8개의 시료를 각 챔버 별로 투입할 수 있다. 이처럼 서로 다른 시료가 각각의 챔버에 투입되지만, 시료에 포함된 표적 물질의 검출 결과를 알려주는 발광부분(37)은 모두 단일한 신호 챔버(27) 내에 배치된다.
이를 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지(10)는 복수의 개체에 대한 검사를 동시에 진행하면서도 결과는 단일한 신호 챔버(27)에 대한 촬영 만으로 동시에 확인이 가능하며, 소형의 기기만으로도 검출 속도를 현격히 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
이하 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 장치(100)에 대하여 살펴보기로 한다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 장치(100)는 상술한 바이오센서 카트리지(10), 몸체부(40), 전압인가부(50) 및 이미지센서부(70)를 포함할 수 있다.
먼저, 몸체부(40)는 도 1에 도시된 바와 같이 바이오센서 카트리지(10)가 장착되는 부재로서 상기 바이오센서 카트리지(10)를 안정적으로 지지할 수 있다. 이를 위해 몸체부(40)는 내측에 바이오센서 카트리지(10)가 삽입될 수 있도록 수용공간(41)이 형성될 수 있다. 또한 몸체부(40)의 수용공간(41)의 일측에는 바이오센서 카트리지(10)의 구획부(20)로부터 외측 방향으로 돌출 형성된 삽입돌기(25)가 삽입되어 고정될 수 있도록 이와 대응되는 크기의 삽입홈(42)이 형성될 수 있다.
다음으로, 몸체부(40)의 수용공간(41)에는 수용공간(41)에 장착된 바이오센서 카트리지(10)의 전극부(30) 측으로 전압을 인가하기 위한 전압인가부(50)가 배치될 수 있다. 이때, 전압인가부(50)는 공지의 노출형 전극이나 스프링 전극, 포고핀(Pogo Pin)과 같은 단자부재를 통해 전극부(30)의 배면 측에 형성된 접촉 전극(31a)과 전기적으로 연결될 수 있다.
한편, 수용공간(41) 중에서 전극부(30)의 반응 챔버(26)와 대응되는 위치에는 반응 챔버(26) 내의 마그넷 비드에 대하여 자기력을 인가하기 위한 자력인가부재(60)가 구비될 수 있다. 이때, 자력인가부재(60)는 제1 전극(31)과 인접하게 배치됨으로써 마그넷 비드가 제1 전극(31) 상에 위치하도록 인력을 가하여 제1 전극(31) 상에 위치하는 마그넷 비드의 밀도를 향상시켜 보다 활발한 화학 반응을 유도할 수 있다.
한편, 도 2에 도시된 바와 같이 바이오센서 카트리지(10)의 상측에는 신호 챔버(27)에서 생성되는 전기화학발광 신호를 촬영하기 위한 이미지센서부(70)가 배치될 수 있다. 이때, 이미지센서부(70)는 카메라, 전하결합소자(CCD), CMOS와 같은 집적회로 또는 광전 증폭관(PMT) 등 공지의 이미지센서를 포함하여 형성될 수 있다.
한편, 상술한 바이오센서 카트리지(10)는 추가 검출이 필요한 경우 즉각적이고 반복적인 교체가 가능하도록 일회용으로 형성될 수 있다. 이를 통해 검출에 소요되는 시간을 보다 획기적으로 절감할 수 있다.
살펴본 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지(10)는 구획부(20)를 통한 공간 분리를 통해 고민감도의 검출 결과를 획득할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 카트리지(10)는 복수의 시료를 동시에 진단하는 것이 가능하도록 복수의 반응 챔버(26)를 구비하되, 검출 결과의 확인은 일거에 가능하도록 단일한 신호 챔버(27) 내에 복수의 발광부분(37)을 배치시킴으로써 진단의 속도를 비약적으로 향상시킬 수 있다. 그러면서도 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 장치(100)는 종래 고가의 장비 대비 현저히 소형화된 장비 만으로 구동이 가능하여 현장에 손쉽게 보급할 수 있는 장점이 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서 장치(100)는 진단의 신속성을 요하면서도 고가의 장비를 필요로 하였으며, 현장에서 잦은 진단을 필요로 하는 패혈증 또는 COVID 19를 포함한 증증 질병의 조기 진단에 효과적으로 이용될 수 있다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시예에 의해 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.
10: 바이오센서 카트리지
20: 구획부
30: 전극부 40: 몸체부
50: 전압인가부 60: 자력인가부재
70: 이미지센서부 100: 바이오센서 장치
30: 전극부 40: 몸체부
50: 전압인가부 60: 자력인가부재
70: 이미지센서부 100: 바이오센서 장치
Claims (20)
- 생체 물질을 검출하여 전기화학발광 신호를 생성하는 바이오센서 카트리지로서,
복수의 전극을 포함하는 전극부; 및
상기 전극부 상에 마련된 전체 공간을 신호 챔버와, 상기 신호 챔버를 둘러싸는 N개의 반응 챔버로 구획하도록 상기 전극부 상에 배치되는 구획부;를 포함하고,
상기 전극부는,
적어도 일부가 상기 반응 챔버 내에 배치되는 제1 전극;
상기 신호 챔버 내에 배치되는 제2 전극; 및
상기 반응 챔버 내의 화학 반응과 상기 신호 챔버 내에서 발생하는 상기 전기화학발광 신호를 전기적으로 연동시키도록 배치되는 N개의 연결 전극;을 포함하는, 바이오센서 카트리지. - 제1 항에 있어서,
상기 연결 전극은 상기 반응 챔버에 내에 배치되는 검출부분 및 상기 신호 챔버 내에 배치되는 발광부분을 포함하여 일체로 형성되는, 바이오센서 카트리지. - 제2 항에 있어서,
상기 연결 전극의 검출부분은 상기 제1 전극과 소정 간격 이격된 상태에서 상기 제1 전극의 적어도 일부를 감싸도록 형성되고,
상기 연결 전극의 발광부분은 상기 제2 전극을 향하도록 배치되되, 단부가 뾰족한 형상을 가지도록 형성되는, 바이오센서 카트리지. - 제3 항에 있어서,
상기 연결 전극은 전체적으로 Y자 형상을 가지도록 형성되는, 바이오센서 카트리지. - 제1 항에 있어서,
상기 전극부는 원형으로 형성되고,
상기 구획부는 상기 전극부의 형상에 대응되도록 외벽이 원형을 이루도록 형성되는, 바이오센서 카트리지. - 제1 항에 있어서,
상기 구획부는,
상기 구획부의 최외측에 배치되어 상기 N개의 반응 챔버의 일측부를 형성하는 외벽;
상기 외벽의 내측에 배치되어 상기 신호 챔버를 구획하는 내벽; 및
상기 외벽의 내주면으로부터 상기 내벽의 외주면까지 연장되되, 상기 내벽의 둘레 방향을 따라 N개가 이격되어 배치되는 격벽;을 포함하는, 바이오센서 카트리지. - 제6 항에 있어서,
상기 외벽 및 내벽은 원형으로 형성되고,
상기 내벽과 외벽 사이에는 8개의 반응 챔버가 형성되도록 8개의 상기 격벽이 등간격으로 배치되는, 바이오센서 카트리지. - 제7 항에 있어서,
상기 제2 전극은 8각형 형상을 가지도록 형성되는, 바이오센서 카트리지. - 제6 항에 있어서,
상기 내벽은 상기 N개의 연결 전극을 가로지르도록 배치되며, 상기 N개의 연결 전극 중 상기 내벽이 배치되는 부분에는 절연체가 배치되는, 바이오센서 카트리지. - 제1 항에 있어서,
상기 제1 전극은 단일폐곡선 형상으로 형성되되 상기 구획부에 의해 N개의 부분으로 구분되는 지지부분을 포함하는, 바이오센서 카트리지. - 제10 항에 있어서,
상기 지지부분은 상기 제2 전극을 중심으로 하는 원 형상으로 형성되는, 바이오센서 카트리지. - 제10 항에 있어서,
상기 제1 전극은 상기 지지부분으로부터 상기 제2 전극을 향하는 방향으로 돌출되어 형성된 N개의 반응부분을 더 포함하고,
상기 N개의 반응부분은 상기 N개의 반응 챔버 내에 하나씩 배치되는, 바이오센서 카트리지. - 제12 항에 있어서,
상기 반응부분은 원 형상으로 형성되고,
상기 연결 전극의 일단부는 상기 반응부분과 소정 간격 이격된 상태에서 상기 반응부분을 감싸도록 형성되는, 바이오센서 카트리지. - 제1 항에 있어서,
상기 N개의 반응 챔버에는 각각 별개의 개체로부터 채취된 상이한 시료가 투입되는, 바이오센서 카트리지. - 제1 항에 있어서,
상기 N개의 반응 챔버에는 동일한 개체로부터 채취된 동일한 시료가 투입되되, 상기 동일한 시료에 대하여 복수의 생체 물질을 검출하기 위하여 각기 다른 검출시약이 투입되는, 바이오센서 카트리지. - 제1 항에 있어서,
상기 생체 물질은 감염성 질환 감염 여부, 대사 질환, 면역 질환, 또는 암 발병 여부를 감지하기 위한 물질을 의미하며, DNA, RNA, 단백질, 대사 물질, 세포외 소포체 중 적어도 하나인, 바이오센서 카트리지. - 제1 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 따른 바이오센서 카트리지;
상기 바이오센서 카트리지를 수용하도록 수용공간이 형성되는 몸체부;
상기 몸체부의 상기 수용공간 측에 배치되며 상기 바이오센서 카트리지의 상기 전극부 측으로 전압을 인가하는 전압인가부; 및
상기 바이오센서 카트리지의 제2 챔버에서 생성되는 상기 전기화학발광 신호를 촬영하는 이미지센서부;를 포함하는, 바이오센서 장치. - 제17 항에 있어서,
상기 바이오센서 카트리지는 일회용으로 형성되는, 바이오센서 장치. - 제17 항에 있어서,
상기 구획부는 일부에 외측 방향으로 돌출되어 형성된 적어도 하나의 삽입돌기를 포함하고,
상기 몸체부는 상기 삽입돌기와 대응되는 위치에 상기 삽입돌기가 삽입되어 고정되도록 적어도 하나의 삽입홈이 형성되는, 바이오센서 장치. - 제17 항에 있어서,
상기 반응 챔버 측으로 자력을 인가하도록 상기 몸체의 상기 수용공간 중에서 상기 반응 챔버와 대응되는 위치에 배치되는 자력인가부재를 더 포함하는, 바이오센서 장치.
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| KR1020220069300 | 2022-06-08 | ||
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