KR20230165908A - 만능 줄기세포에 특이적인 마커 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 만능 줄기 세포에 특이적인 마커를 제공한다. 특히, 본 개시내용은 만능 줄기 세포에 의해 선택적으로 발현되는 핵산 및 폴리펩티드 마커에 관한 것이며; 및 이러한 마커를 검출함으로써 하나 또는 다수의 만능 줄기 세포의 존재 및/또는 부재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
Description
서열 목록
본 출원은 그 전체가 참고로 포함되는 서열 목록을 포함한다.
본 개시내용은 일반적으로 만능 줄기 세포에 특이적인 마커에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 만능 줄기 세포에 의해 선택적으로 발현되는 핵산 및 폴리펩티드 마커에 관한 것이며; 그리고 하나 또는 복수의 이러한 마커의 존재 및/또는 부재를 검출함으로써, 하나 또는 복수의 만능 줄기 세포의 존재 및/또는 부재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
만능 줄기 세포(PSC)는 일반적으로 시험관 내에서 무제한 자가 재생 능력(즉, 미분화 상태에서 무한정 분열하는 능력)을 나타내는 것으로 인식되고 있다. 초기 배아의 세 가지 기본 생식 세포층(즉, 외배엽, 내배엽 및 중배엽)을 대표하는 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 가진다. PSC는 이러한 세 가지 배엽층으로 발달할 수 있기 때문에 성체 유기체의 모든 세포 유형을 생성할 수 있다. Thomson et al. 참조 (Science, 1998; 282: 1145-1147). 환경 조건 및/또는 세포 신호 전달 경로의 변화와 같은 특정 상황에서 PSC는 자가 재생 주기를 종료하고 3배엽에서 파생된 특수 세포 유형으로 분화된다.
처음에는 PSC가 배아(배아 줄기 세포, ESC)에서 유래되었지만, 최근에는 PSC가 리프로그래밍 인자의 발현에 의해 성체(체세포) 세포로부터 생산될 수 있는 것으로 나타났다. Takahashiet al. 참조 (셀, 2006, 126(4): 663-76). 유도성 PSC(iPSC)라고 불리는 이러한 PSC는 일반적으로 리프로그래밍 인자를 암호화하는 유전 물질을 체세포에 전달하여 생산 가능하며, 이는 체세포를 만능 상태로 되돌리도록 촉발한다. 따라서 iPSC는 ESC의 실용성을 제한하는 윤리적, 기술적 제약(예: 환자에게 맞는 줄기 세포주 생산)이 없는 PSC의 중요한 공급원이다.
iPSC와 같은 PSC는 만능으로 인해 의학 및 과학 연구, 약물 발견, 세포 치료, 재생 의학 및 조직 공학 분야에서 중요한다. PSC가 이후에 특수 세포로 분화되는 응용 분야(예: 조직 공학)에서는 분화 과정 후에도 PSC가 남아 있는지 여부를 확인할 수 있는 것이 바람직한다. 예를 들어, 세포치료제 및 조작된 조직에서 미분화 PSC의 잔류는 품질 관리 문제를 나타낸다. 왜냐하면 그러한 세포는 생체 내에서 기형종을 형성할 가능성(즉, 종양원성)을 갖고 있기 때문이다.
PSC의 존재를 검출하기 위한 확립된 기술에는 표현형 만능 분석(예: 배아체 형성, 생체 내 기형종 형성)뿐만 아니라 PSC와 관련된 분자 마커의 검출을 포함하는 분자 만능 분석이 포함되어 있다. 그러나 이 목적으로 사용되는 PSC에서 차등적으로 발현되는 많은 마커는 분화된 세포에서 어느 정도 상당한 수준의 발현을 나타내기도 한다(비록 발현 수준 및/또는 발현 패턴은 다르지만). 따라서 더 큰 파생 조직 세포 집단 내 잔류 PSC의 작은 수를 검출하는 것이 문제가 되고 어렵다.
본 개시내용은 PSC에서 독특하게 발현되는 마커 유전자의 서브세트를 제공함으로써 당해 기술분야에서의 상기 기재된 한계를 다룬다. 따라서, 이들 마커 유전자는 예를 들어, 주로 분화된 PSC-유래 세포 집단 중 소수의 잔류 미분화 PSC를 포함하는 소수의 PSC의 존재를 검출하기 위한 분자 마커로서 유용하다.
본 개시내용의 비제한적 실시양태는 다음을 포함한다.
[1] 만능 줄기세포를 검출하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 다수의 세포를 포함하는 관심 샘플을 얻는 단계;
(b) 적어도 하나의 마커 유전자의 발현을 검출하기 위해 상기 관심 샘플을 분석하는 단계이고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하며; 및
(c) 상기 적어도 하나의 마커 유전자의 발현이 상기 관심 샘플에서 검출되는 경우, 상기 관심 샘플이 만능 줄기 세포를 함유하는 것으로 결정하는 단계.
[2] [1]의 방법에 있어서, 상기 관심 샘플은 유도 만능 줄기세포를 포함하는 방법.
[3] [1]의 방법에 있어서, 상기 관심 샘플은 배아 만능 줄기 세포를 포함하는 방법.
[4] [1]의 방법에 있어서, 상기 관심 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
[5] [1]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정함으로써 상기 적어도 하나의 마커 유전자의 발현을 검출하는 방법.
[6] [1]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 것인 방법.
[7] [5]에 있어서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 액적 디지털 중합효소연쇄반응(dd-PCR), 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군에서 선택되는 기술을 포함하는 프로세스에 의해 검출되는 것인 방법.
[8] [7]에 있어서, 상기 기술은 마이크로어레이 분석 또는 차세대 서열분석을 포함하는 방법.
[9] 다음을 포함하는 만능줄기세포를 검출하는 방법:
(a) 다수의 세포를 포함하는 관심 샘플을 얻는 단계;
(b) 상기 관심 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계이고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하며;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 만능 줄기 세포를 실질적으로 포함하지 않으며; 및
(d) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준이 상기 기준 발현 수준보다 큰 경우, 상기 관심 샘플이 만능 줄기 세포를 함유하는 것으로 결정하거나, 또는
단계 (b)에서 검출된 발현 수준이 상기 기준 발현 수준 이하인 경우, 상기 관심 샘플이 만능 줄기 세포를 실질적으로 함유하지 않는 것으로 결정하는 단계.
[10] 샘플 내 만능줄기세포의 수를 정량하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 다수의 세포를 포함하는 관심 샘플을 얻는 단계;
(b) 상기 관심 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계이고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO:1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하며;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 만능 줄기 세포를 포함하고, 상기 적어도 하나의 기준 샘플 내의 실질적으로 모든 세포는 만능 줄기 세포이고; 및
(d) 단계 (c)의 비교에 기초하여 상기 관심 샘플 내 만능 줄기 세포의 양을 계산하는 단계;를 포함하는 방법.
[11] [9]의 방법에 있어서, 상기 관심 샘플은 유도만능줄기세포를 포함하는 방법.
[12] [9]의 방법에 있어서, 관심 샘플은 배아만능줄기세포를 포함하는 방법.
[13] [9]의 방법에 있어서, 상기 관심 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
[14] [9]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 적어도 하나의 마커 유전자의 발현을 검출하는 방법.
[15] [9]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 것인 방법.
[16] [14]의 방법에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 과정에 의해 검출되는 것인 방법.
[17] [10]의 방법에 있어서, 상기 관심 샘플은 유도만능줄기세포를 포함하는 방법.
[18] [10]의 방법에 있어서, 관심 샘플은 배아만능줄기세포를 포함하는 방법.
[19] [10]의 방법에 있어서, 상기 관심 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
[20] [10]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 적어도 하나의 마커 유전자의 발현을 검출하는 방법.
[21] [10]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 것인 방법.
[22] [20]의 방법에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 과정에 의해 검출되는 것인 방법.
[23] 치료제 내 잔여 iPSC를 검출하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은 다음 단계를 포함한다:
(a) iPSC로부터 생산된 치료제 샘플을 얻는 단계이고, 상기 샘플은 다수의 세포를 함유하고,
(b) 적어도 하나의 마커 유전자의 발현을 검출하기 위해 상기 샘플을 분석하는 단계이고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고; 및
(c) 상기 적어도 하나의 마커 유전자의 발현이 상기 샘플에서 검출되는 경우, 상기 치료제가 잔여 iPSC를 포함하는지 결정하는 단계.
[24] [23]의 방법에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 분석법.
[25] [23]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[26] [23]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[27] [25]의 방법에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
[28] 치료제 내 잔류 iPSC 수를 정량화하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은 다음을 포함한다:
(a) iPSC로부터 생산된 치료제 샘플을 얻는 단계이고, 상기 샘플은 다수의 세포를 함유하고,
(b) 상기 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 iPSC를 포함하고, 상기 적어도 하나의 기준 샘플 내의 실질적으로 모든 세포는 iPSC이고; 및
(d) 단계 (c)의 비교에 기초하여 상기 치료제 중 잔류 iPSC의 수를 정량화하는 단계.
[29] [28]의 방법에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 분석법.
[30] [28]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[31] [28]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[32] [30]의 방법에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
[33] 치료제 내 잔여 iPSC를 검출하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은 다음을 포함한다:
(a) iPSC로부터 생산된 치료제 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플은 다수의 세포를 함유함,
(b) 상기 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 샘플에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보성 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하는 것인 단계 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 만능 줄기 세포를 실질적으로 포함하지 않으며; 및
(d) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준이 상기 기준 발현 수준보다 높은 경우, 상기 치료제가 잔류 iPSC를 포함하는지 결정하거나, 또는
단계 (b)에서 검출된 발현 수준이 상기 기준 발현 수준 이하인 경우, 상기 치료제가 잔류 iPSC를 실질적으로 함유하지 않는다고 결정하는 단계.
[34] [33]에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 분석법.
[35] [33]에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[36] [33]에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[37] [35]에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
[38] 다양한 분화 시점에 치료제 내 잔여 iPSC 수를 정량화하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은 다음을 포함한다:
(a) 치료제의 첫 번째 샘플을 얻는 단계이고, 상기 첫 번째 샘플은 첫 번째 분화 시점에 또는 분화가 시작되기 전에 얻어지며, 상기 첫 번째 샘플은 복수의 세포를 포함하며;
(b) 서로 다른 분화 시간에 복수의 세포를 함유하는 치료제의 하나 이상의 추가 샘플을 얻는 단계;
(c) (a) 및 (b)에서 얻은 샘플에서 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 하나 이상의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열 뉴클레오티드를 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고; 및
(d) 단계 (c)의 측정에 기초하여, 다양한 분화 시간에 상기 치료제 내 iPSC의 수를 정량화하는 단계.
[39] [38]에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 분석법.
[40] [38]에 있어서, 단계 (c)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[41] [38]에 있어서, 단계 (c)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[42] [40]에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
[43] 차별화된 생성물의 순도를 결정하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은 다음을 포함한다:
(a) 분화된 생성물의 샘플을 얻는 단계이고, 상기 샘플은 다수의 세포를 함유하고;
(b) 상기 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 iPSC를 포함하고, 상기 적어도 하나의 기준 샘플 내의 실질적으로 모든 세포는 iPSC이고; 및
(d) 단계 (c)의 비교에 기초하여 상기 샘플 내 iPSC의 양을 계산하여 차별화된 생성물의 순도를 결정하는 단계.
[44] [43]에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 응집체 또는 조직의 형태인 분석법.
[45] [43]에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[46] [43]에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[47] [45]에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
[48] 차별화된 생성물의 순도를 결정하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은 다음을 포함한다:
(a) 분화된 생성물의 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플은 다수의 세포를 함유하고 있는 단계;
(b) 상기 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보성 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하는 것인 단계;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 만능 줄기 세포를 실질적으로 포함하지 않으며; 그리고
(d) 단계 (c)의 비교에 기초하여 상기 샘플 내 iPSC의 양을 계산하여 차별화된 생성물의 순도를 결정하는 단계.
[49] [48]에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 분석법.
[50] [48]에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[51] [48]에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
[52] [50]에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
[53] iPSC 집단의 분화 능력을 평가하는 방법으로서,
(a) iPSC 집단의 첫 번째 샘플을 얻는 단계로서, 상기 첫 번째 샘플은 상기 iPSC의 분화가 유도되기 전에 얻어지며, 상기 첫 번째 샘플은 복수의 세포를 포함하고;
(b) iPSC 집단의 적어도 하나의 추가 샘플을 얻는 단계로서, 상기 적어도 하나의 추가 샘플은 상기 iPSC의 분화가 유도된 후에 얻어지며, 상기 적어도 하나의 추가 샘플은 다수의 세포를 포함하며;
(c) (a) 및 (b)에서 얻은 샘플에서 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 하나 이상의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 검출된 서로 다른 샘플의 발현 수준을 서로 및/또는 참조 발현 수준과 비교하여 상기 iPSC 집단에서 iPSC의 분화 능력을 평가하는 단계.
[54] [53]의 방법에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
[55] [53]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 적어도 하나의 마커 유전자의 발현을 검출하는 방법.
[56] [53]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 것인 방법.
[57] [55]의 방법에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 과정에 의해 검출되는 것인 방법.
[58] iPSC 집단의 만능성(pluripotency)을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) iPSC 집단의 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플은 복수의 세포를 포함하는 단계;
(b) 상기 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 iPSC를 포함하고, 상기 적어도 하나의 기준 샘플 내의 실질적으로 모든 세포는 분화가 가능한 iPSC이고; 및
(d) 단계 (c)의 비교에 기초하여 상기 iPSC 집단에서 iPSC의 만능성을 평가하는 단계.
[59] [58]의 방법에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
[60] [58]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 적어도 하나의 마커 유전자의 발현을 검출하는 방법.
[61] [58]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 방법.
[62] [60]의 방법에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 과정에 의해 검출되는 것인 방법.
[63] iPSC 집단의 만능성을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) iPSC 집단의 첫 번째 샘플을 얻는 단계이고, 상기 첫 번째 샘플은 상기 iPSC의 분화가 유도되기 전에 얻어지며, 상기 첫 번째 샘플은 복수의 세포를 포함하며;
(b) iPSC 집단의 적어도 하나의 추가 샘플을 얻는 단계이고, 상기 적어도 하나의 추가 샘플은 상기 iPSC의 분화가 유도된 후에 얻어지며, 상기 적어도 하나의 추가 샘플은 다수의 세포를 포함하며;
(c) (a) 및 (b)에서 얻은 샘플에서 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 하나 이상의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고;
(d) 단계 (c)에서 검출된 다양한 샘플의 발현 수준을 서로 및/또는 기준 발현 수준과 비교하여 상기 iPSC 집단에서 iPSC 세포의 만능성을 평가하는 단계를 포함하는 방법.
[64] [63]의 방법에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포는 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
[65] [63]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 적어도 하나의 마커 유전자의 발현을 검출하는 방법.
[66] [63]의 방법에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 것인 방법.
[67] [65]의 방법에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 과정에 의해 검출되는 것인 방법.
[68] 치료제에서 잔류 iPSC를 검출하기 위한 분석 키트로서, 상기 분석 키트는 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출하는데 적합한 적어도 하나의 시약을 포함하며, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 상응하는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상보성 DNA(cDNA) 서열을 가진 전사체를 발현하는 분석 키트.
[69] [68]에 있어서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산, 프로브 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하고, 하나의 마커 유전자.
[70] 치료제에서 잔여 iPSC를 검출하기 위한 분석 시약으로서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있으며, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 상응하는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사체를 발현하고, 및
상기 시약은 핵산, 프로브, 또는 하나 이상의 프라이머를 포함한다.
[71] 치료제 내 iPSC의 수를 정량하기 위한 분석 키트로서, 상기 분석 키트는 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출하는데 적합한 적어도 하나의 시약을 포함하고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는, SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사체를 발현한다.
[72] [71]에 있어서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산, 프로브 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하고, 하나의 마커 유전자.
[73] 치료제 내 iPSC의 수를 정량하기 위한 분석 시약으로서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있으며, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열 전사물을 발현하고: 및
상기 시약은 핵산, 프로브, 또는 하나 이상의 프라이머를 포함한다.
[74] 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출하는데 적합한 적어도 하나의 시약을 포함하는, 분화된 생성물의 순도를 결정하기 위한 분석 키트로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사체를 발현한다.
[75] [74]에 있어서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산, 프로브 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하고, 하나의 마커 유전자.
[76] 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 차별화된 산물의 순도를 결정하기 위한 분석 시약으로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 가진 전사체를 발현하고,
상기 시약은 핵산, 프로브, 또는 하나 이상의 프라이머를 포함한다.
[77] iPSC 집단의 분화 능력을 평가하기 위한 분석 키트로서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출하는데 적합한 적어도 하나의 시약을 포함하는 분석 키트로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현한다.
[78] [77]에 있어서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산, 프로브 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하고, 하나의 마커 유전자.
[79] iPSC 집단의 분화 능력을 평가하기 위한 분석 시약으로서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있으며, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고,
상기 시약은 핵산, 프로브, 또는 하나 이상의 프라이머를 포함한다.
[80] iPSC 집단의 만능성을 평가하기 위한 분석 키트로서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출하는데 적합한 적어도 하나의 시약을 포함하는 분석 키트로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사체를 발현한다.
[81] [80]에 있어서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산, 프로브 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하고, 하나의 마커 유전자.
[82] iPSC 집단의 만능성을 평가하기 위한 분석 시약으로서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 가진 전사체를 발현하고,
상기 시약은 핵산, 프로브, 또는 하나 이상의 프라이머를 포함한다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 인용된 모든 특허, 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 특허, 간행물 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 전체 내용이 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 참조로 여기에 포함된다.
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[0092] 도 1은 순수 iPSC 샘플, 순수 광 수용체 전구체(PRP) 세포 샘플, 및 다양한 iPSC:PRP 비율을 함유하는 iPSC/PRP 혼합물에서 마커 유전자 LNCPRESS2, AC009446.1 및 AL117378.1의 발현 검출을 도시한다. 마커 유전자의 발현은 세포 샘플로부터 cDNA를 제조한 후 액적 디지털 PCR(dd-PCR)을 수행하여 측정했다.
[0093] 도 2는 순수 iPSC 샘플, 순수 망막 색소 상피(RPE) 세포 샘플, 및 다양한 iPSC:RPE 비율을 함유하는 iPSC/RPE 혼합물에서 마커 유전자 LNCPRESS2, AC009446.1 및 AL117378.1의 발현 검출을 도시한다. 마커 유전자의 발현은 세포 샘플로부터 cDNA를 제조한 후 액적 디지털 PCR(dd-PCR)을 수행하여 측정했다.
[0092] 도 1은 순수 iPSC 샘플, 순수 광 수용체 전구체(PRP) 세포 샘플, 및 다양한 iPSC:PRP 비율을 함유하는 iPSC/PRP 혼합물에서 마커 유전자 LNCPRESS2, AC009446.1 및 AL117378.1의 발현 검출을 도시한다. 마커 유전자의 발현은 세포 샘플로부터 cDNA를 제조한 후 액적 디지털 PCR(dd-PCR)을 수행하여 측정했다.
[0093] 도 2는 순수 iPSC 샘플, 순수 망막 색소 상피(RPE) 세포 샘플, 및 다양한 iPSC:RPE 비율을 함유하는 iPSC/RPE 혼합물에서 마커 유전자 LNCPRESS2, AC009446.1 및 AL117378.1의 발현 검출을 도시한다. 마커 유전자의 발현은 세포 샘플로부터 cDNA를 제조한 후 액적 디지털 PCR(dd-PCR)을 수행하여 측정했다.
본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 실시 양태를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "셀"에 대한 언급은 하나 이상의 셀을 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 다른 방법 및 재료가 본 발명에 유용할 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본 명세서에 기술되어 있다.
본 출원에 사용된 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 본 출원에서 상호교환적으로 사용되며 인간 및 비인간 영장류를 비롯한 기타 영장류(예: 붉은 털원숭이, 침팬지, 기타 원숭이 및 유인원 종; 소, 양, 돼지, 염소, 말 등의 농장 동물; 개, 고양이 등의 가축 포유동물; 토끼, 생쥐, 쥐 및 기니피그를 포함한 실험실 동물; 닭, 칠면조, 기타 갈리성 새, 오리 및 거위와 같은 국내, 야생 및 사냥용 새를 포함하는 새; 등등. 이 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서 이 용어에는 남성과 여성뿐만 아니라 성인, 청소년, 신생아도 포함된다. 일부 실시양태에서, 세포(예를 들어, 만능 줄기 세포, 전구 세포 또는 조직 특이적 세포를 포함하는 줄기 세포)는 대상체로부터 유래된다. 일부 실시 양태에서, 대상체는 인간이 아닌 대상체다.
본 출원에 사용된 "세포 배양"은 통제된 조건(들) 하에서 성장한 세포를 의미한다. 일차 세포 배양은 첫 번째 계대배양 전에 유기체에서 직접 채취한 세포, 조직 또는 기관의 배양이다. 세포는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 성장 배지에 배치될 때 배양에서 확장되어 더 많은 세포 집단이 생성된다. 세포가 배양에서 확장될 때 세포 증식 속도는 종종 세포 수가 두 배가 되는 데 필요한 시간, 즉 배가 시간으로 알려져 있는 양으로 측정된다.
본 출원에 사용된 "공급층"은 줄기 세포의 증식을 지원하는 데 사용될 수 있는 비증식 세포의 층을 의미한다. 피더층의 생산을 위한 프로토콜은 당업계에 공지되어 있으며, ATCC(American Type Culture Collection)에 의해 관리되는 National Stem Cell Resource 웹사이트와 같은 인터넷에서 이용 가능하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "분화"는 만능 줄기 세포 또는 다른 줄기 세포와 같은 특화되지 않은 세포가 성숙한 세포의 특징적인 특화된 구조적 및/또는 기능적 특징을 획득하는 과정을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "확장하다" 또는 "증식하다"는 세포 분열로 인해 세포 배양물 내 세포 수가 증가하는 과정을 의미할 수 있다. 본 출원의 특정 실시양태에서, 확장 또는 증식 단계 동안, 세포는 성숙한 세포를 형성하기 위해 분화되지 않지만, 분열하여 더 많은(미분화) 세포를 형성한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "배아체"는 만능 줄기 세포의 3차원 집합체를 의미한다. 이들 세포는 3개의 배엽, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 세포로 분화될 수 있다. 배아체 미세환경 내 복잡한 세포 유착 및 측분비 신호 전달을 포함하는 3차원 구조는 분화 및 형태형성을 가능하게 한다.
본 명세서에 사용된 "줄기 세포"는 자가 재생 능력, 즉 최종적으로 분화되지 않은 상태를 유지하면서 수많은 세포 분열 주기를 거치는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 줄기 세포는 전능성, 만능, 만능, 올리고능성 또는 단능성일 수 있다. 줄기 세포는 예를 들어 배아, 태아, 양수, 성체 또는 유도된 만능 줄기 세포일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "만능 줄기 세포"(PSC)는 스스로를 무한정 재생산하고 성체 유기체의 임의의 다른 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 일반적으로, 만능 줄기 세포는 면역결핍(SCID) 마우스에 이식될 때 기형종을 유도할 수 있는 줄기 세포이며; 세 가지 배엽 모두의 세포 유형으로 분화할 수 있다(예를 들어 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포 유형으로 분화할 수 있음). PSC의 특징적인 하나 이상의 마커를 발현한다. 배아줄기세포(ESC) 및 iPSC와 같은 PSC에 의해 발현되는 이러한 마커의 예에는 Oct 4, 알칼리성 포스파타제, SSEA-3 표면 항원, SSEA-4 표면 항원, nanog, TRA-1-60, TRA-1-81, SOX2 및 REX1이 포함된다. 본 개시내용의 범위 내의 PSC는 예를 들어 배아 줄기 세포(ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "유도 만능 줄기 세포"(iPSC)는 비-만능 세포, 전형적으로 체세포로부터 인공적으로 유래된 만능 줄기 세포의 유형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 체세포는 인간 체세포이다. 체세포의 예에는 진피 섬유아세포, 골수 유래 중간엽 세포, 심근 세포, 각질세포, 간 세포, 위 세포, 신경 줄기 세포, 폐 세포, 신장 세포, 비장 세포 및 췌장 세포가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 체세포의 추가적인 예에는 B 세포, 수지상 세포, 과립구, 선천성 림프 세포, 거핵구, 단핵구/대식세포, 골수 유래 억제 세포, 자연살해(NK) 세포, T 세포, 흉선 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만 이에 국한되지 않는 면역계 세포가 포함된다.
iPSC는 체세포를 리프로그래밍함으로써, 체세포에서 인자(본 출원에서는 리프로그래밍 인자로 지칭됨) 중 하나 또는 이들의 조합을 발현하거나 유도함으로써 생성될 수 있다. iPSC는 태아, 출생 후, 신생아, 청소년 또는 성인 체세포를 사용하여 생성될 수 있다. 일부 예에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 리프로그래밍하는 데 사용될 수 있는 인자에는 예를 들어 Oct4(Oct3/4), Sox2, c-Myc 및 Klf4, Nanog 및 Lin28이 포함된다. 일부 실시양태에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 리프로그래밍하기 위해 2개 이상의 리프로그래밍 인자, 3개 이상의 리프로그래밍 인자, 또는 4개 이상의 리프로그래밍 인자를 발현함으로써 체세포를 리프로그래밍할 수 있다. 세포는 예를 들어 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 센다이 바이러스 벡터를 포함하는 벡터를 사용하여 리프로그래밍 인자를 도입함으로써 리프로그래밍될 수 있다. 대안적으로, 리프로그래밍 인자를 도입하기 위한 비바이러스 기술에는 예를 들어 mRNA 형질감염, miRNA 감염/형질감염, PiggyBac, 미니서클 벡터 및 에피솜 플라스미드가 포함된다. iPSC는 예를 들어 CRISPR-Cas9 기반 기술을 사용하여 리프로그래밍 인자를 도입하거나 내인성 프로그래밍 유전자를 활성화함으로써 생성될 수도 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "배아 줄기 세포"는 배아 조직, 바람직하게는 배반포 또는 상실배의 내부 세포 덩어리로부터 유래된 배아 세포이고, 선택적으로 세포주로서 연속적으로 계대배양된 것이다. 이 용어는 바람직하게는 배아의 나머지 부분을 파괴하지 않고 배아의 하나 이상의 할구로부터 분리된 세포를 포함한다. 이 용어에는 체세포 핵 이식에 의해 생성된 세포도 포함된다. ESC는 예를 들어 정자와 난 세포의 융합, 핵 이식 또는 처녀생식에 의해 생성된 접합자, 할구 또는 배반포 단계 포유류 배아에서 생성되거나 파생될 수 있다. 인간 ESC에는 MAO1, MAO9, ACT-4, No. 3, H1, H7, H9, H14 및 ACT30 배아 줄기 세포가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 예시적인 만능 줄기 세포에는 배반포 단계 배아의 내부 세포괴(ICM)로부터 유래된 배아 줄기 세포뿐만 아니라 분열 단계 또는 상실기 배아의 하나 이상의 할구로부터 유래된 배아 줄기 세포가 포함된다. 이러한 배아줄기세포는 수정이나 체세포 핵 이식(SCNT), 처녀생식, 남성생식 등 무성생식 방법을 통해 생산된 배아 물질로부터 생성될 수 있다. PSC만으로는 모든 배외 조직(예: 생체 내 태반 또는 생체 외 영양막)에 기여할 가능성이 부족하기 때문에 자궁에 이식할 때 태아 또는 성체 동물로 발달할 수 없다.
본 출원에 사용된 용어 "야생형", "자연 발생" 및 "변형되지 않은"은 자연에 존재하는 전형적인(또는 가장 일반적인) 형태, 외관, 표현형 또는 계통을 의미하기 위해 사용된다. 예를 들어, 자연의 원천에서 발생하고 분리될 수 있는 세포, 유기체, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 거대분자 복합체, 유전자, RNA, DNA 또는 게놈의 전형적인 형태이다. 야생형 형태, 외관, 표현형 또는 계통은 의도적인 변형 이전에 원래의 부모 역할을 한다. 따라서 돌연변이체, 변이체, 조작된 형태, 재조합체 및 변형된 형태는 야생형 형태가 아니다.
"분리된"이란, 예를 들어 마커 분자를 포함하는 세포, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 분자를 언급할 때, 예를 들어 표시된 분자가 분리되어 있고 분리되어 있음을 의미한다. 분자는 자연에서 발견된다. 및/또는 동일한 유형의 다른 생물학적 거대분자가 실질적으로 부재하여 존재한다. 폴리뉴클레오티드와 관련하여 용어 "분리된"은 자연적으로 일반적으로 연관된 서열이 전체 또는 일부 없는 핵산 분자이며; 또는 자연에 존재하지만 이와 연관된 이종 서열을 갖는 서열; 또는 염색체로부터 분리된 분자.
본 출원에 사용된 용어 "정제된"은 바람직하게는 동일한 분자의, 75 중량% 이상, 보다 바람직하게는 85 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 95 중량% 이상, 가장 바람직하게는 98 중량% 이상이 존재하는 것을 의미한다.
용어 "조작된(engineered)", "유전자 조작된", "유전자 변형된", "재조합", "변형된", "비자연 발생" 및 "비천연"은 유기체의 게놈 또는 셀에 대한 인간의 의도적인 조작을 나타낸다. 이 용어는 본 출원에 정의된 게놈 편집을 포함하는 게놈 변형 방법뿐만 아니라 유전자 발현 또는 불활성화, 효소 공학, 유도 진화, 지식 기반 설계, 무작위 돌연변이 유발 방법, 유전자 셔플링, 코돈 최적화 등과 같은 기술을 포함한다. 유전 공학 방법은 해당 분야에 알려져 있다.
본 출원에 사용된 용어 "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열" 및 "올리고뉴클레오티드"는 모두 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 본 출원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 선형 형태인 경우 하나의 5' 말단 및 하나의 3' 말단을 가지며 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있는 중합체 형태의 뉴클레오티드를 의미한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA), 이들의 유사체 또는 이들의 조합일 수 있으며 임의의 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 기능을 수행할 수 있으며 다양한 2차 및 3차 구조를 가질 수 있다. 이 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체 및 염기, 당 및/또는 인산염 모이어티가 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 가진다(예: A 염기쌍과 T의 유사체). 폴리뉴클레오티드는 하나의 변형된 뉴클레오티드 또는 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 예에는 불소화 뉴클레오티드, 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체가 포함된다. 뉴클레오티드 구조는 폴리머가 조립되기 전이나 후에 변형될 수 있다. 중합 후, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 표지 성분 또는 표적 결합 성분과의 접합을 통해 추가로 변형될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비뉴클레오티드 성분을 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 합성, 자연 발생 및/또는 비-자연 발생이고 참조 폴리뉴클레오티드(예: DNA 또는 RNA)와 유사한 결합 특성을 갖는 변형된 백본 잔기 또는 결합을 포함하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예에는 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA), 잠긴 핵산(LNA™)(Exiqon, Inc.)이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. Woburn, MA) 뉴클레오시드, 글리콜 핵산, 브리지된 핵산 및 모르폴리노 구조. 펩티드-핵산(PNA)은 폴리뉴클레오티드 인산염-당 골격이 유연한 유사 펩티드 중합체로 대체된 핵산의 합성 상동체이다. 핵염기는 중합체에 연결되어 있다. PNA는 RNA와 DNA의 상보적인 서열에 높은 친화력과 특이성을 가지고 혼성화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 달리 표시되지 않는 한, 본 출원에서 통상적인 5'에서 3' 방향으로 표시된다.
본 출원에 사용된 "서열 동일성"은 일반적으로 다양한 가중치 매개변수를 갖는 알고리즘을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 제2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 비교하는 뉴클레오티드 염기 또는 아미노산의 동일성 백분율을 의미한다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 사이의 서열 동일성은 전세계 웹 사이트를 통해 이용 가능한 다양한 방법 및 컴퓨터 프로그램(예를 들어, Exonerate, BLAST, CS-BLAST, FASTA, HMMER, L-ALIGN 등)에 의한 서열 정렬을 사용하여 결정될 수 있다. GENBANK(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 및 EMBL-EBI(www.ebi.ac.uk.)를 포함하되 이에 국한되지 않는다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 서열 동일성은 일반적으로 다양한 방법 또는 컴퓨터 프로그램의 표준 디폴트 매개변수를 사용하여 계산된다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 사이의 높은 수준의 서열 동일성은 종종 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 쿼리 서열의 길이에 걸쳐 약 90% 동일성과 100% 동일성 사이, 예를 들어 약 90% 동일성 이상, 약 91% 동일성 사이이다. 이상, 약 92% 동일성 이상, 약 93% 동일성 이상, 약 94% 동일성 이상, 약 95% 동일성 이상, 약 96% 동일성 이상, 약 97% 동일성 이상, 약 98% 동일성 또는 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 질의 서열의 길이에 걸쳐 더 높거나 약 99% 이상의 동일성을 갖는다. 두 서열의 일부만이 정렬될 수 있는 두 서열의 중첩 영역에 대해서도 서열 동일성을 계산할 수 있다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 사이의 서열 동일성의 중간 정도는 종종 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 쿼리 서열의 길이에 걸쳐 약 80% 동일성 내지 약 90% 동일성, 예를 들어 약 80% 동일성 또는 그 이상이다. 약 81% 동일성 이상, 약 82% 동일성 이상, 약 83% 동일성 이상, 약 84% 동일성 이상, 약 85% 동일성 이상, 약 86% 동일성 이상, 약 87% 동일성 이상, 약 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 쿼리 서열의 길이에 걸쳐 88% 이상의 동일성, 또는 약 89% 이상의 동일성, 그러나 90% 미만.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 사이의 낮은 서열 동일성은 종종 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 쿼리 서열의 길이에 걸쳐 약 50% 동일성과 75% 동일성 사이, 예를 들어 약 50% 동일성 또는 그 이상이다. 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 쿼리 서열의 길이에 걸쳐 60% 이상의 동일성, 약 70% 이상의 동일성, 그러나 75% 미만의 동일성이다.
본 개시내용은 공지 또는 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열(예를 들어, 공지 또는 참조 마커 폴리뉴클레오티드 서열 또는 공지 또는 참조 마커 폴리펩티드와 같은)과 100% 미만의 동일성을 가질 수 있는 분자 마커와 같은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 고려한다. 시퀀스) 또는 쿼리 시퀀스.
본 명세서에 사용된 "혼성화", "혼성화하다" 또는 "혼성화"는 두 개의 상보적인 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자를 결합하여 단일 이중 가닥 분자(DNA/DNA, DNA/ RNA, RNA/RNA)는 수소 염기쌍을 통해 형성된다. 혼성화 엄격성은 일반적으로 혼성화 온도와 혼성화 완충액의 염 농도에 의해 결정된다. 예를 들어 고온 및 저염은 높은 엄격성 혼성화 조건을 제공한다. 다양한 혼성화 조건에 대한 염 농도 범위 및 온도 범위의 예는 다음과 같다: 높은 엄격성, 약 0.01M ~ 약 0.05M 염, Tm보다 5°C ~ 10°C 낮은 혼성화 온도; 중간 정도의 엄격함, 약 0.16M ~ 약 0.33M 염, 혼성화 온도는 Tm보다 20°C ~ 29°C 낮다. 낮은 엄격도, 약 0.33M ~ 약 0.82M 염, 혼성화 온도는 Tm보다 40 ºC ~ 48 ºC이다. 이중나선 핵산 서열의 Tm은 당업계에 널리 공지된 표준 방법에 의해 계산된다(예를 들어, Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York(1982); Casey, J., et al., Nucleic Acids Research 4:1539-1552(1977), Bodkin, D.K., et al., Journal of Virological Methods 10(1):45-52(1985), Wallace, R.B., et al. al., Nucleic Acids Research 9(4):879-894 (1981)). Tm을 추정하는 알고리즘 예측 도구도 널리 사용 가능하다. 혼성화를 위한 높은 엄격성 조건은 전형적으로 표적 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 주로 표적 서열과 혼성화하고 비-표적 서열에는 실질적으로 혼성화하지 않는 조건을 의미한다. 전형적으로, 혼성화 조건은 중간 정도의 엄격함, 바람직하게는 높은 엄격함을 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "상보성"은 다른 핵산 서열과 수소 결합을 형성하는 핵산 서열의 능력을 의미한다(예를 들어, 표준적인 Watson-Crick 염기쌍을 통해). 상보성 백분율은 두 번째 핵산 서열과 수소 결합을 형성할 수 있는 핵산 서열 내 잔기의 백분율을 나타낸다. 두 개의 핵산 서열이 100% 상보성을 갖는 경우, 두 서열은 완벽하게 상보적이다. 즉, 첫 번째 폴리뉴클레오티드의 모든 연속 잔기는 두 번째 폴리뉴클레오티드의 동일한 수의 연속 잔기와 수소 결합한다.
본 출원에 사용된 "결합"은 거대분자 사이(예를 들어, 단백질과 폴리뉴클레오티드 사이, 폴리뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드 사이, 또는 단백질과 단백질 사이 등)의 비공유 상호작용을 의미한다. 이러한 비공유 상호작용은 "결합" 또는 "상호작용"으로도 지칭된다(예를 들어, 제1 거대분자가 제2 거대분자와 상호작용하는 경우, 제1 거대분자는 비공유 방식으로 제2 거대분자와 결합한다). 결합 상호작용의 일부 부분은 서열 특이적일 수 있다(용어 "서열 특이적 결합", "서열 특이적 결합", "부위 특이적 결합" 및 "부위 특이적 결합"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다). 결합 상호작용은 해리 상수(Kd)로 특징지어질 수 있다. "결합 친화도"는 결합 상호작용의 강도를 의미한다. 증가된 결합 친화력은 더 낮은 Kd와 상관관계가 있다.
본 명세서에 사용된 "유전자"는 엑손 및 관련 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 유전자는 인트론 및/또는 번역되지 않은 영역(UTR)을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 서로 기능적 관계에 있는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들어, 조절 서열(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)은 조절 서열이 폴리뉴클레오티드의 전사 조절을 조절하거나 이에 기여하는 경우 유전자 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 "작동가능하게 연결"된다. 작동 가능하게 연결된 조절 요소는 일반적으로 코딩 서열과 인접해 있다. 그러나 인핸서는 프로모터와 최대 수 킬로베이스 이상 떨어져 있으면 기능할 수 있다. 따라서, 일부 조절 요소는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있지만 폴리뉴클레오티드 서열과 연속되지는 않을 수 있다. 유사하게, 번역 조절 요소는 폴리뉴클레오티드로부터의 단백질 발현 조절에 기여한다. 일부 실시 양태에서, 작동 가능하게 연결된 요소들은 서로 이종일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "발현"은 예를 들어 메신저 RNA(mRNA) 또는 다른 RNA 전사물(예를 들어, 구조 또는 스캐폴딩 RNA와 같은 비코딩 RNA)을 생성하는 DNA 주형으로부터 폴리뉴클레오티드의 전사를 의미한다. ). 이 용어는 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 더 의미한다. 전사체 및 암호화된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"로 지칭될 수 있다. 발현에는 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우 진핵 세포에서 mRNA를 스플라이싱하는 것이 포함될 수 있다.
"코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "인코딩하는" 서열은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 폴리펩티드로 전사(DNA의 경우)되고 번역(mRNA의 경우)되는 핵산 분자이다. 생체 내에서 적절한 조절 서열의 통제하에 있을 때. 코딩 서열의 경계는 5' 말단의 시작 코돈과 3' 말단의 번역 중지 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "상보적 DNA(cDNA) 서열"은 일반적으로 역전사를 통해 RNA 주형으로부터 합성된 DNA 서열을 의미하며, 첫 번째 가닥 cDNA 분자, 두 번째 가닥 cDNA 분자, 또는 첫 번째 가닥과 두 번째 가닥 cDNA를 모두 포함하는 이중 가닥 cDNA 분자이다. 주어진 RNA 주형(예를 들어 mRNA 전사물과 같은)에 대한 "상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열"은 이에 따라 RNA 주형을 역전사함으로써 생성되는 DNA 서열을 의미한다.
본 출원에 사용된 용어 "조절하다"는 특성, 활성, 기능 또는 물리적 분자의 양, 정도 또는 양의 변화를 의미한다. 유전자 발현의 "조절"에는 유전자 활성화와 유전자 억제가 모두 포함된다. 조절은 표적 유전자의 발현에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 받는 특성을 결정함으로써 분석될 수 있다. 이러한 특징에는 예를 들어 RNA 또는 단백질 수준, 단백질 활성, 생성물 수준, 유전자 발현 또는 리포터 유전자의 활성 수준의 변화가 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 예를 들어 본 개시내용의 마커 유전자의 "상이한" 또는 "변경된" 발현 수준은 측정가능하게 다른, 바람직하게는 통계적으로 유의한 차이이다(예를 들어, 발현을 평가하기 위해 사용된 분석의 표준 오차). 일부 실시양태에서, 대조군 또는 기준 샘플과 비교하여 관심 샘플에서 본 개시내용의 마커 유전자 등의 발현 수준의 차이는 예를 들어 2배 초과일 수 있고; 5배 이상의 차이; 10배 이상의 차이; 20배 이상의 차이; 50배 이상의 차이; 75배 이상의 차이; 100배 이상의 차이; 250배 이상의 차이; 500배 이상의 차이; 750배 이상의 차이; 1,000배 이상의 차이; 5,000배 이상의 차이; 10,000배 이상의 차이; 25,000배 이상의 차이; 50,000배 이상의 차이; 75,000배 이상의 차이; 100,000배 이상의 차이; 250,000배 이상의 차이; 500,000배 이상의 차이; 750,000배 이상의 차이; 1,000,000배 이상의 차이; 2,500,000배 이상의 차이; 5,000,000배 이상의 차이; 7,500,000배 이상의 차이; 10,000,000배 이상의 차이; 50,000,000배 이상의 차이; 100,000,000배 이상의 차이; 250,000,000배 이상의 차이; 500,000,000배 이상의 차이; 750,000,000배 이상의 차이; 1,000,000,000배 이상의 차이; 5,000,000,000배 이상의 차이; 또는 예를 들어 분석되는 유전자 발현에 따라 10,000,000,000배 이상의 차이가 있거나; 예를 들어 분석 기술.
본 출원에 사용된 "벡터" 및 "플라스미드"는 유전 물질을 세포에 도입하기 위한 폴리뉴클레오티드 비히클을 의미한다. 벡터는 선형이거나 원형일 수 있다. 벡터는 적합한 숙주 세포(예를 들어, 복제 원점)에서 벡터의 복제를 수행할 수 있는 복제 서열을 함유할 수 있다. 적합한 숙주의 형질전환 시, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제 및 기능할 수 있거나 숙주 게놈에 통합될 수 있다. 벡터 디자인은 무엇보다도 의도된 용도 및 벡터에 대한 숙주 세포에 따라 달라지며, 특정 용도 및 숙주 세포에 대한 본 발명의 벡터 디자인은 당업자의 기술 수준 내에 있다. 벡터의 네 가지 주요 유형은 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체이다. 종종 벡터는 복제 원점, 다중 클로닝 부위 및/또는 선택 마커를 포함한다. 발현 벡터는 발현 카세트를 포함할 수 있다. "재조합 바이러스"는 예를 들어 바이러스 게놈 또는 이의 일부에 이종 핵산 구성체를 추가하거나 삽입함으로써 유전적으로 변경된 바이러스를 의미한다.
본 출원에 사용된 "발현 카세트"는 재조합 방법 또는 합성 수단을 사용하여 생성되고, 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현을 촉진하기 위해 선택된 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성물을 의미한다. 예를 들어, 조절 서열은 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오티드의 전사, 또는 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오티드의 전사 및 번역을 촉진할 수 있다. 발현 카세트는 예를 들어 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 벡터에 존재하여 발현 벡터를 형성할 수 있다.
본 출원에 사용된 용어 "사이"는 주어진 범위의 최종 값을 포함한다(예를 들어, 약 1 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이에는 1개 뉴클레오티드 및 50개 뉴클레오티드가 포함됨).
본 출원에 사용된 용어 "아미노산"은 아미노산 유사체, 변형된 아미노산, 펩티드모방체, 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체를 포함하는 천연 및 합성(비천연) 아미노산을 의미한다.
본 출원에 사용된 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환 가능하며 아미노산의 중합체를 의미한다. 폴리펩티드의 길이는 임의일 수 있다. 이는 분지형 또는 선형일 수 있고, 비아미노산이 개재될 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 용어는 또한 예를 들어 아세틸화, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 페길화, 비오틴화, 가교 및/또는 접합(예를 들어 표지 성분 또는 리간드). 달리 명시하지 않는 한, 폴리펩티드 서열은 본 출원에서 통상적인 N-말단에서 C-말단 방향으로 표시된다. 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드는 분자생물학 분야의 일상적인 기술을 사용하여 만들어질 수 있다.
본 출원에 사용된 용어 "융합 단백질" 및 "키메라 단백질"은 단일 단백질에서 자연적으로 함께 발생하지 않는 2개 이상의 단백질, 단백질 도메인 또는 단백질 단편을 결합하여 생성된 단일 단백질을 의미한다. 융합 단백질은 에피토프 태그(들)(예를 들어, 히스티딘 태그, FLAG®(Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 태그, Myc 태그), 리포터 단백질 서열(예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 베타-갈락토시다제), , 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질, 황색 형광 단백질) 및/또는 핵산 서열 결합 도메인(예를 들어, DNA 결합 도메인 또는 RNA 결합 도메인)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "모이어티(moiety)"는 분자의 일부를 의미한다. 모이어티는 작용기일 수도 있고 여러 작용기(예: 공통 구조적 측면을 공유하는)를 갖는 분자의 일부를 설명할 수도 있다. "모이어티" 및 "작용기"라는 용어는 일반적으로 상호교환적으로 사용된다. 그러나 "작용기"는 보다 구체적으로 일부 일반적인 화학적 행동을 구성하는 분자의 일부를 의미할 수 있다. "모이어티"은 종종 구조적 설명으로 사용된다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 조작된 조직과 같은 조성물 또는 제제의 "유효량" 또는 "치료 유효량"이라는 용어는 원하는 반응을 제공하기에 충분한 양의 조성물 또는 제제를 의미한다. 그러한 반응은 문제의 특정 질병에 따라 달라진다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는, 예를 들어 하나 이상의 증상, 질병 또는 결핍을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 PSC로부터 분화된 세포 또는 조직을 생산하는 것이 바람직하다.
본 출원에 사용된 "형질전환"은 삽입에 사용된 방법에 관계없이 외인성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에 삽입되는 것을 의미한다. 예를 들어, 형질전환은 직접적인 흡수, 형질감염, 감염 등에 의해 이루어질 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 통합되지 않은 벡터, 예를 들어 에피솜으로 유지될 수 있거나, 대안적으로 숙주 게놈에 통합될 수 있다.
iPSC를 생산하는 방법
본 개시내용은 부분적으로 PSC의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 출원의 특정 실시양태에서, PSC는 주로 PSC 유래 분화 세포의 집단(들) 사이에 존재하는 잔류 미분화 PSC이다.
본 개시내용은 예를 들어 인간 체세포를 비롯한 체세포로부터 iPSC 세포의 생성을 고려한다. 체세포는 인간 또는 인간이 아닌 동물, 예를 들어 인간 및 붉은 털원숭이, 침팬지, 기타 원숭이 및 유인원 종과 같은 비인간 영장류를 포함하는 기타 영장류; 소, 양, 돼지, 염소, 말 등의 농장 동물; 개, 고양이 등의 가축 포유동물; 토끼, 생쥐, 쥐 및 기니피그를 포함한 실험실 동물; 닭, 칠면조, 기타 갈리성 새, 오리 및 거위와 같은 국내, 야생 및 사냥용 새를 포함하는 새; 기타 등등. 일부 실시 양태에서, 체세포는 각질화 상피 세포, 점막 상피 세포, 외분비선 상피 세포, 내분비 세포, 간 세포, 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 혈액 세포 및 면역계 세포, 세포 신경 세포와 신경교 세포, 색소 세포, 조혈 줄기 세포를 포함한 전구 세포를 포함한 신경계의 세포로부터 선택된다. 체세포는 완전히 분화(특수)되거나 덜 분화될 수 있다. 예를 들어 체세포줄기세포, 최종적으로 분화된 성숙세포 등 PSC가 아닌 미분화 전구세포를 사용할 수 있다. 체세포는 성체 및 태아 세포를 포함하여 모든 연령의 동물로부터 유래될 수 있다.
체세포는 포유동물 기원일 수 있다. 예를 들어 세포가 생체 내 이식을 위해 사용되는 경우 동종 세포가 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, iPSC는 대상체에 MHC-/HLA-매칭되지 않는다. 일부 실시양태에서, iPSC는 대상체에 MHC-/HLA-매칭된다. 예를 들어, iPSC가 재생 의학에 사용하기 위한 PSC 유래 세포를 생산하는 데 사용되는 경우, 체세포는 치료할 개체로부터 또는 HLA 유형과 동일하거나 실질적으로 대상체와 동일한 다른 개체로부터 체세포를 얻을 수 있다. 예를 들어, 체세포는 핵 리프로그래밍 전에 배양할 수 있거나 분리 후 배양하지 않고 리프로그래밍할 수 있다.
예를 들어, 리프로그래밍 인자를 체세포에 도입하기 위해, 예를 들어 SV40, 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus), HSV 및 EBV를 포함한 헤르페스 바이러스(herpes viruses), 신드비스 바이러스(Sindbis viruses), 알파바이러스(alphaviruses), HHV-6 및 HHV-7과 같은 인간 헤르페스바이러스 벡터(HHV) 및 레트로바이러스(retroviruses)와 같은 바이러스로부터의 벡터를 포함하는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 렌티바이러스(Lentiviruses)는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1), 인간 면역결핍 바이러스 2형(HIV-2), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 말 전염성 빈혈 바이러스( EIAV), 소 면역결핍 바이러스(BIV), 양의 비스나 바이러스(VISNA) 및 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV)를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 비분할 세포를 감염시킬 수 있으며 생체 내 및 시험관 내 유전자 전달 및 핵산 서열 발현 모두에 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 외피 단백질과 같은 바이러스 단백질을 항체와 같은 결합제 또는 특정 리간드(예를 들어 특정 세포 유형 위 또는 내부의 수용체 또는 단백질에 표적화하기 위한)에 연결함으로써 특정 세포 유형에 표적화될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터는 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 이렇게 전달된 유전 물질은 전사되어 숙주 세포 내부의 단백질로 번역될 수 있다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않는 바이러스 벡터가 사용된다.
바이러스 유전자 전달 시스템은 RNA 기반 또는 DNA 기반 바이러스 벡터일 수 있다. 에피솜 유전자 전달 시스템은 플라스미드, 엡스타인-바 바이러스(EBV) 기반 에피솜 벡터, 효모 기반 벡터, 아데노바이러스 기반 벡터, 유인원 바이러스 40(SV40) 기반 에피솜 벡터, 소 유두종일 수 있다. 예를 들어 바이러스(BPV) 기반 벡터 또는 렌티바이러스 벡터가 있다.
당업자에게 공지된 방법을 사용하여 체세포를 리프로그래밍하여 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성할 수 있다. 당업자는 유도된 만능 줄기 세포를 용이하게 생산할 수 있다(예를 들어 공개된 미국 특허 출원 번호 2009/0246875, 공개된 미국 특허 출원 번호 2010/0210014; 공개된 미국 특허 출원 번호 2012/0276636; 미국 특허 번호 8,058,065; 8,129,187; 및 미국 특허. 8,268,620호(이들 모두는 참고로 본 명세서에 포함됨).
일반적으로 유도 만능 줄기 세포를 단독으로, 조합하여 또는 전사활성화 도메인과의 융합으로 생성하는 데 사용할 수 있는 리프로그래밍 인자에는 다음 유전자 중 하나 이상이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다: Oct4 (Oct3/4, Pou5f1), Sox (e.g., Sox1, Sox2, Sox3, Sox18, or Sox15), Klf (e.g., Klf4, Klf1, Klf3, Klf2 or Klf5), Myc (e.g., c-myc, N-myc or L-myc), nanog, 또는 LIN28. 이들 유전자 및 단백질에 대한 서열의 예로서 다음의 등록 번호가 제공된다: 마우스 MyoD: M84918, NM_010866; 마우스 Oct4(POU5F1): NM_013633; 마우스 Sox2: NM_011443; 마우스 Klf4: NM_010637; 마우스 c-Myc: NM_001177352, NM_001177353, NM_001177354 마우스 Nanog: NM_028016; 마우스 Lin28: NM_145833: 인간 MyoD: NM_002478; 인간 Oct4(POU5F1): NM_002701, NM_203289, NM_001173531; 인간 Sox2: NM_003106; 인간 Klf4: NM_004235; 인간 c-Myc: NM_002467; 인간 나노그: NM_024865; 및/또는 인간 Lin28: NM_024674. 또한, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%를 갖는 서열을 포함하여, 이와 유사한 서열이 고려된다. %, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성. 일부 실시양태에서, Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog 및 Lin28 중 적어도 3개 또는 적어도 4개가 활용된다. 다른 실시 양태에서는 Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4가 활용된다.
iPSC 생산을 위한 예시적인 리프로그래밍 인자는 (1) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc(Sox2는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18로 대체될 수 있고; Klf4는 Klf1, Klf2 또는 Klf5); (2) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, SV40 대형 T 항원(SV40LT); (3) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, 인간 유두종 바이러스(HPV)16 E6; (4) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E7 (5) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (6) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, Bmi1; (7) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28; (8) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, SV40LT; (9) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, TERT, SV40LT; (10) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, SV40LT; (11) Oct3/4, Esrrb, Sox2, L-Myc(Esrrb는 Esrrg로 대체 가능); (12) Oct3/4, Klf4, Sox2; (13) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40LT; (14) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6; (15) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7; (16) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (17) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmi1; (18) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28 (19) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, SV40LT; (20) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, TERT, SV40LT; (21) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40LT; 또는 (22) Oct3/4, Esrrb, Sox2(Esrrb는 Esrrg로 대체 가능)를 포함한다.
iPSC의 제조 동안 및 제조 후에, 세포는 세포 유형에 따라 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), DMEM F12 배지, 이글 최소 필수 배지, F-12K, 배지, Iscove의 Modified Dulbecco 배지, Knockout DMEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 또한 포유동물 혈청으로 세포 배양 배지를 보충하는 것도 고려된다. 이러한 혈청의 예로는 소 태아 혈청(FBS), 소 혈청(BS), 송아지 혈청(CS), 송아지 태아 혈청(FCS), 신생아 송아지 혈청(NCS), 염소 혈청(GS), 말 혈청(HS), 인간 혈청, 닭 혈청, 돼지 혈청, 양 혈청, 토끼 혈청, 쥐 혈청(RS), 혈청 대체물 및 소 배아액을 포함한다. 예를 들어, 세포는 약 5% 내지 약 15% 이상, 예를 들어 약 20%를 포함하여 약 0.5% 내지 약 5% 이상, 약 25% 또는 약 30%의 총 혈청(예를 들어, FBS) 또는 혈청 대체 농도로 단리 및/또는 확장될 수 있다.
최적의 성장 및 확장을 위해 세포에 미량 원소를 공급하기 위해 추가 보충제를 사용할 수도 있다. 이러한 보충제에는 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 나트륨 및 이들의 조합이 포함된다. 이들 성분은 Hanks' Balanced Salt Solution, Earle's Salt Solution, 항산화 보충제, MCDB-201, 인산염 완충 식염수(PBS), N-2-히드록시에틸피페라진-N'-에탄술폰산(HEPES), 니코틴아미드, 아스코르브산 및/또는 아스코르브산-2-인산염 및 추가 아미노산과 같은 염 용액에 포함될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 이러한 아미노산에는 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-시스테인, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신, L-글리신, -히스티딘, L-이노시톨, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L- 발린을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
박테리아, 마이코플라스마 및 진균 오염을 완화하기 위해 일반적으로 항생제가 세포 배양에 사용된다. 이러한 항생제 또는 항진균 화합물에는 예를 들어 페니실린/스트렙토마이신, 암포테리신, 암피실린, 겐타마이신, 블레오마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 날리딕스산, 네오마이신, 니스타틴, 파로모마이신, 폴리믹신, 푸로마이신, 리팜피신, 스펙티노마이신이 포함될 수 있다. , 테트라사이클린, 타이로신 및 제오신을 포함할 수 있다.
선택적으로, 호르몬은 또한 세포 배양에 사용될 수 있으며 D-알도스테론, 디에틸스틸베스트롤(DES), 덱사메타손, 베타-에스트라디올, 하이드로코르티손, 인슐린, 프로락틴, 프로게스테론, 소마토스타틴/인간 성장 호르몬을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다 (HGH), 갑상선 자극 호르몬, 티록신 및 L-티로닌. 베타-메르캅토에탄올은 세포 배양 배지에 보충될 수도 있다.
세포 유형 및 분화된 세포의 운명에 따라 지질 및 지질 담체를 사용하여 세포 배양 배지를 보충할 수도 있다. 이러한 지질 및 담체에는 시클로덱스트린, 콜레스테롤, 알부민에 접합된 리놀레산, 알부민에 접합된 리놀레산 및 올레산, 비접합 리놀레산, 알부민에 접합된 리놀레산-올레산-아라키돈산, 비접합 올레산 및 알부민과 결합되어 있다. 알부민은 유사하게 지방산이 없는 제제에 사용될 수 있다.
배양 중인 세포는 현탁액으로 유지되거나 세포외 기질 성분 및 합성 또는 생체고분자와 같은 고체 지지체에 부착되어 유지될 수 있다. 고체 지지체에 대한 부착을 향상시키는 데 유용한 추가 요인에는 예를 들어 I형, II형 및 IV형 콜라겐, 콘카나발린 A, 콘드로이틴 설페이트, 피브로넥틴, 피브로넥틴 유사 중합체, 젤라틴, 라미닌, 폴리-D 및 폴리-L-라이신, 마트리겔, 트롬보스폰딘 및/또는 비트로넥틴이 포함된다.
iPSC의 배양물은 또한 iPSC가 미분화된 형태로 유지되도록 하는 세포 인자, 예를 들어 표피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 백혈병 억제 인자(LIF), 염기성 섬유아세포, 성장 인자(bFGF) 및 이들의 조합을 포함할 수 있다..
iPSC는 일반적으로 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 특징적인 형태를 나타내며 만능 인자 NANOG를 발현한다. 배아 줄기 세포 특이적 표면 항원(SSEA-3, SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81)은 완전히 리프로그램된 인간 세포를 식별하는 데에도 사용될 수 있다. 또한 기능적 수준에서 ESC 및 iPSC와 같은 PSC는 세 가지 배아 배엽 모두에서 계통으로 분화하고 생체 내(예: SCID 마우스)에서 기형종을 형성하는 능력도 보여준다.
PSC를 구별하는 방법
본 개시내용은 ESC 및 iPSC를 포함하는 PSC를 분화된(특수화된) 세포로 분화시킨 다음, 예를 들어 본 출원에 기술된 마커 유전자를 사용하여 잔여 PSC를 분화된 세포와 구별하는 것을 추가로 고려한다.
PSC는 부분적으로 또는 완전히 특화된 세포, 예를 들어 조혈 전구 세포, 적혈구, B 림프구, T 림프구, 자연 살해 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구, 대식세포 및 혈소판; 신경 전구세포; 아드레날린성 또는 도파민성 뉴런, 운동 뉴런, 말초 뉴런, 성상교세포 및 희돌기교세포, 소교세포와 같은 뉴런; 색소 상피 세포, 피부 세포 및 내이 세포; 흡수 세포, 술잔 세포, 파네스 세포 및 장내분비 세포; 간세포, 췌장 전구세포, 인슐린 생산 세포, 담관세포, 폐포 상피 세포 및 장 상피 세포; 모낭의 기저부에서 발생하고 모낭과 표피를 모두 생성하는 각질세포; 심근세포, 심장 전구세포, 심외막 세포, 골격근 세포, 골격근아세포, 혈관 내피 세포, 간세포, 골세포, 연골 세포, 신장 전구 세포 및 신장 상피 세포를 포함하는 내피 세포; 중간엽 줄기세포; 내배엽 관련 조직의 세포; 망막 색소 상피 세포; 및 광 수용체 전구체 세포, 만능 줄기 세포를 분화하는 방법은 해당 분야에 알려져 있다.
PSC를 검출하기 위한 마커
본 개시내용은 예를 들어 샘플 내 하나 또는 다수의 만능 줄기 세포의 존재 및/또는 부재를 확인하기 위해 사용될 수 있는 만능 줄기 세포에 특이적인 마커의 검출을 고려한다. 특히, 본 개시내용은 만능 줄기 세포에 의해 선택적으로 발현되는 핵산 및 폴리펩티드 마커에 관한 것이며; 및 하나 또는 복수의 이러한 마커의 존재 및/또는 부재를 검출함으로써, 하나 또는 복수의 만능 줄기 세포의 존재 및/또는 부재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현이 검출 및/또는 측정된다. 일부 실시 양태에서, 적어도 하나의 마커 유전자는 다음으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현한다: AC009446.1(SEQ ID NO: 1); AL117378.1a(SEQ ID NO: 2); AL117378.1b(SEQ ID NO: 3); AL117378.1c(SEQ ID NO: 4); 및 LNCPRESS2(SEQ ID NO: 5). 일부 실시 양태에서, 상기 마커 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 5개가 검출될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현한다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대하여, 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하는 적어도 하나의 마커 유전자의 검출이 본 출원에서 고려된다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 서열 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개가 검출될 수 있다.
본 개시내용의 마커는 개별적으로, 조합하여, 순차적으로, 동시에, 동시에 및/또는 PSC에 특이적이거나 특이적이지 않을 수 있는 다른 마커(예를 들어 또한 발현되는 마커 포함)와 함께 검출될 수 있다. PSC와 비교하여 분화된 세포에서는 양이 다르거나 발현 패턴이 다르다.
일부 실시 양태에서, SEQ ID NO: : 1-5 (및/또는 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하는 적어도 하나의 마커 유전자의 발현을 검출 및/또는 측정하는 것 외에, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 것 SEQ ID NO: 1-5로 구성됨), PSC에 특이적인 적어도 하나의 추가 마커가 검출 및/또는 측정될 수 있다.
일부 실시 양태에서, PSC에 특이적이고 검출 및/또는 측정될 수 있는 적어도 하나의 추가 마커 유전자는 다음으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보성 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현한다: AC106875.1a(SEQ ID NO: 6); AC106875.1b(SEQ ID NO: 7); AL138720.1a(SEQ ID NO: 8); AL138720.1b(SEQ ID NO: 9); AL353052.1(SEQ ID NO: 10); AL392023.1(SEQ ID NO: 11); AL591742.2(SEQ ID NO: 12); AP002856.2(SEQ ID NO: 13); C11orf86(SEQ ID NO: 14); CCDC172a(SEQ ID NO: 15); CCDC172b(SEQ ID NO: 16); CCDC172c(SEQ ID NO: 17); CCDC172d(SEQ ID NO: 18); DPPA5(SEQ ID NO: 19); FOXI2(SEQ ID NO: 20); LINC01194a(SEQ ID NO: 21); LINC01194b(SEQ ID NO: 22); LINC01194c(SEQ ID NO: 23); LINC01194d(SEQ ID NO: 24); SLC52A3a(SEQ ID NO: 25); SLC52A3b(SEQ ID NO: 26); SLC52A3c(SEQ ID NO: 27); 및 TCL1B(SEQ ID NO: 28).
일부 실시 양태에서, PSC에 특이적이고 검출 및/또는 측정될 수 있는 적어도 하나의 추가 마커 유전자는 SEQ ID NO: 6-28로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 100% 미만의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현한다. 예를 들어, SEQ ID NO: 6-28로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 91% 서열 동일성, 적어도 92% 서열 동일성, 적어도 93% 서열 동일성, 적어도 94% 서열 동일성, 적어도 95% 서열, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하는 적어도 하나의 추가 마커 유전자의 검출이 본 출원에서 고려된다.
일부 실시 양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개 , 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 또는 적어도 23개 마커 또는 이의 변이체 서열이 검출될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 위에 나열된 하나 이상의 마커의 발현은 예를 들어 조성물, 용액, 세포 응집체, 세포 현탁액 또는 조직에서 PSC의 존재를 결정하기 위해 측정된다.
특정 실시형태에서, 조성물, 용액, 세포 응집체, 세포 현탁액 또는 조직과 같은 다수의 세포에서 하나 이상의 마커의 발현은 다음과 같은 방법으로 동일한 하나 이상의 마커의 발현과 대조 또는 기준 샘플에 의해 비교된다. 대조 샘플 또는 기준 샘플은 조성물, 용액, 세포 응집체, 세포 현탁액 또는 조직과 같은 복수의 세포를 함유할 수 있다. 대조군 또는 기준 샘플은 예를 들어 ESC, iPSC 또는 둘 다(예: 양성 대조군)와 같은 복수의 PSC를 포함하는 것일 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 대조군 또는 기준 샘플은 예를 들어 특수화된 세포와 같은 다수의 비-PSC를 포함하는 것일 수 있으며; 또는 최종적으로 분화되지 않은 비PSC(예: 음성 대조군). 일부 실시양태에서, 대조 샘플 또는 기준 샘플은 PSC를 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 대조군 또는 기준 샘플은 PSC를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 대조군 또는 기준 샘플의 유일한 세포, 또는 실질적으로 유일한 세포는 PSC이다. "PSC가 실질적으로 없음"은 샘플 내 PSC의 양이 분석 조건 하의 검출 한계 이하임을 의미한다. "대조군 또는 기준 샘플에서 실질적으로 유일한 세포는 PSC이다."는 샘플 내 비-PSC의 양이 분석 조건 하에서 검출 한계 이하임을 의미한다.
일부 실시양태에서, 관심 샘플 내 본 개시내용의 하나 이상의 마커의 발현 수준은 표준화된 데이터를 사용하여 대조군 또는 참조 값과 비교된다. 정규화는 예를 들어 하나 이상의 참조 유전자 또는 유전자 산물, 예를 들어 미분화 세포와 분화 세포 사이에서 일정한 방식으로 발현되는 것으로 이해되는 유전자; 및/또는 다른 조건에서. 발현 데이터의 정규화는 또한 전체적인 유전자 발현 패턴을 기반으로 할 수도 있다. 본 명세서에서 고려되는 다른 데이터 정규화 방법은 예를 들어 GRSN(Global Rank-Invariant Set Normalization); 상호상관 정규화(Xcorr) 비모수적 변수 선택 및 근사(NVSA); 커널 밀도 가중 황토 정규화(KWDL); 커널 밀도 분위수 정규화(KDQ) IRON(반복 순위 정규화); 최소 변형 집합 정규화(LVS) 수정된 최소 변형 세트 정규화(LVSmiR) 불변성 정규화; HMM 보조 정규화(HMM); 생물학적 스케일링 정규화(BSN); 지원 벡터 회귀(SVR) 불변 집합 정규화(ISN) 스파이크인 표준; 가중 lowess 정규화(wlowess) 가중 순환 황토 정규화(wcloess); 하위 집합 분위수 정규화(SQN) 황토; 일반화된 프로크루스테스(GPA) 분석; 강력한 다중 어레이 평균(RMA); 교차 정규화(CrossNorm); 정보 교차 정규화(ICN) 글로벌 중앙값; 및 dChip을 포함한다.
예를 들어, RNA-seq와 같은 고처리량 RNA/cDNA 시퀀싱 응용 분야에서 정규화는 유전자 길이, 시퀀싱 깊이 또는 둘 다를 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, 정규화된 표현 데이터는 RPM(백만 매핑된 읽기 당 읽기), RPKM(백만 매핑된 읽기당 킬로 베이스당 읽기), TPM(백만 건당 기록) 또는 FPKM(백만 매핑된 읽기당 킬로 베이스당 조각)으로 표현될 수 있다.
마커 발현은 전사된 분자(예를 들어 mRNA) 또는 단백질의 발현을 검출하기 위한 널리 공지된 다양한 방법 중 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 이러한 방법의 비제한적인 예에는 분비된 세포 표면, 세포질 또는 핵 단백질의 검출을 위한 면역학적 방법, 단백질 정제 방법, 단백질 기능 또는 활성 분석, 핵산 혼성화 방법, 핵산 역전사 방법 및 핵산 증폭이 포함된다.
특정 실시 양태에서, 본 개시내용의 마커의 발현은 마커 유전자(들)의 메신저 RNA(mRNA) 발현 수준을 결정함으로써 측정될 수 있다. 이러한 mRNA 분자는 예를 들어 세포 함유 조성물, 세포 함유 용액, 세포 응집체, 세포 현탁액 또는 조직과 같은 생물학적 샘플로부터 분리, 유도 또는 증폭될 수 있다. 이러한 mRNA는 직접 분석될 수 있다. 또는 이에 상응하는 cDNA 분자가 합성되어 예를 들어 추가 분석에 사용된다.
조직 또는 세포로부터 RNA를 분리할 때, 조직 또는 세포가 배양물에서 제거된 후 유전자 발현의 추가 변화를 방지하는 것이 중요할 수 있다. 발현 수준의 변화는 열충격이나 지질다당류(LPS) 또는 기타 시약에 의한 활성화와 같은 교란 후에 빠르게 변화하는 것으로 알려져 있다. 또한 조직과 세포의 RNA가 빠르게 분해될 수 있다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 획득된 조직 또는 세포는 예를 들어 분석 전에 보존되거나 급속 냉동될 수 있다.
RNA는 다양한 방법, 예를 들어 구아니듐 티오시아네이트 용해 후 CsCl 원심분리에 의해 조직 또는 세포 샘플로부터 추출될 수 있다(Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299). 단일 세포로부터의 RNA는 단일 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법, 예컨대 Dulac, C. (1998) Curr. Top. Dev. Biol. 36, 245 및 Jenaet al. (1996) J. Immunol. Methods 190:199에 개시된 것으로부터 얻어질 수 있다. RNA 추출을 위한 다른 방법 및 키트는 해당 분야에 잘 알려져 있다.
분리된 RNA 샘플은 특정 종에 대해 농축될 수도 있다. 예를 들어, 폴리(A)+ RNA는 RNA 샘플에서 분리될 수 있다. 일반적으로 이러한 정제는 mRNA의 폴리-A 꼬리를 활용한다. 예를 들어, 폴리-T 올리고뉴클레오티드는 고정되어 mRNA에 대한 친화성 리간드 역할을 할 수 있다. 이러한 목적을 위한 키트는 예를 들어 MessageMaker 키트(Life Technologies, Grand Island, NY)와 같이 상업적으로 이용 가능하다.
일부 실시형태에서, RNA 집단은 예를 들어 하나 이상의 마커 서열을 포함하는 특정 서열에 대해 특이적으로 풍부해질 수 있다. 농축은 예를 들어 프라이머 특이적 cDNA 합성, 또는 cDNA 합성 및 주형 지정 시험관내 전사에 기초한 여러 라운드의 선형 증폭에 의해 수행될 수 있다(예를 들어 Wang et al. (1989) PNAS 86, 9717; Dulac et al., supra, and Jena et al., supra 참조).
특정 종 또는 서열이 풍부하거나 풍부하지 않은 분리된 RNA는 추가로 증폭될 수 있다. 예를 들어, RNA가 mRNA인 경우, 신호가 검출 가능하거나 검출이 향상되도록 RT-PCR과 같은 증폭 과정을 사용하여 mRNA를 증폭할 수 있다. 이러한 증폭 과정은 예를 들어 조직 또는 세포 샘플의 크기나 부피가 작은 경우 특히 유리한다.
다양한 증폭 및 검출 방법을 사용하여 마커 유전자의 발현 검출을 보조할 수 있다. 예를 들어, 추가 분석(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응, RT-PCR) 전에 mRNA를 cDNA로 역전사하는 것은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 본 명세서에서 활용될 수 있는 다른 공지된 증폭 방법에는 "NASBA" 또는 "3SR" 기술; Q-베타 증폭; 가닥 변위 증폭; 표적 매개 증폭; 리가아제 연쇄 반응(LCR); 자체 유지 서열 복제(SSR); 및 전사 증폭이 포함된다.
핵산 서열을 검출하고, 특성화하고/하거나 정량화하는 방법; mRNA 발현을 검출, 특성화 및/또는 정량화하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 PCR 절차, RT-PCR, 정량적 PCR 또는 RT-PCR, 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 방법, 유전자 발현의 연속 분석(SAGE), 디지털 바코드 정량 분석을 기반으로 한 혼성화, 멀티플렉스 RT-PCR, 디지털 드롭 PCR(ddPCR), qRT-PCR, qPCR, UV 분광학, DNA 시퀀싱, RNA 시퀀싱, RNAseq를 포함한 차세대 시퀀싱, QuantiGene 2.0 Single Plex와 같은 분기형 DNA 신호 증폭을 활용하는 용해물 기반 혼성화 분석 및 분기형 DNA 분석 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다..
예를 들어, DNA 서열분석 및 RNA 서열분석을 위한 핵산 서열분석 기술의 비제한적인 예에는 Maxam-Gilbert 서열분석, Sanger 서열분석(즉, 사슬 종결), 합성에 의한 서열분석(SBS), 서열분석에 의한 서열분석이 포함된다. -결찰, 파이로시퀀싱, 단일 분자 실시간 시퀀싱, MiSeq 시퀀싱, MPSS(대량 병렬 시그니처 시퀀싱), 폴로니 시퀀싱, 454 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱. 본 개시내용은 또한 차세대 서열분석 기술을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
차세대 시퀀싱 기술의 비제한적인 예에는 예를 들어 Ion Torrent, Illumina, SOLiD, 454; 대규모 병렬 시그니처 시퀀싱 고체상, 가역적 염료 터미네이터 시퀀싱; 및 DNA 나노볼 시퀀싱을 포함한다. 디지털 바코드 정량 분석에는 BeadArray(Illumina), xMAP 시스템(Luminex), nCounter(Nanostring), HTG(High Throughput Genomics) 분자, BioMark(Fluidigm) 또는 Wafergen 마이크로어레이가 포함될 수 있다. 분석에는 DASL(Illumina), RNA-Seq(Illumina), TruSeq(Illumina), SureSelect(Agilent), Bioanalyzer(Agilent) 및 TaqMan(ThermoFisher)이 포함될 수 있다.
일반적으로, PCR은 (i) 핵산 샘플 또는 라이브러리 내의 특정 유전자 또는 서열에 대한 프라이머의 서열 특이적 혼성화, (ii) 여러 라운드의 어닐링을 포함하는 후속 증폭, 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용한 신장 및 변성, (iii) 정확한 크기의 밴드에 대한 PCR 생성물 스크리닝으로 구성된 유전자 증폭방법을 설명한다. 사용된 프라이머는 중합 개시를 제공하기에 충분한 길이 및 적절한 서열의 올리고뉴클레오티드이다. 즉, 각 프라이머는 증폭될 게놈 유전자좌의 가닥에 상보적이도록 특이적으로 설계되었다. 유전자의 mRNA 수준은 역전사(RT) PCR과 정량적 RT-PCR(QRT-PCR) 또는 실시간 PCR 방법으로 확인할 수 있다. RT-PCR 및 QRT-PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예시적인 마커 유전자의 핵산 서열이 본 출원에 제시되어 있다. 따라서, 숙련된 기술자는 각각의 마커 유전자의 mRNA 수준을 결정하기 위해 개시된 서열에 기초하여 적절한 프라이머를 디자인할 수 있다.
핵산 및 리보핵산(RNA) 분자는 당업계에 잘 알려진 다수의 절차 중 임의의 것을 사용하여 샘플로부터 단리될 수 있으며, 선택된 특정 단리 절차는 특정 생물학적 샘플에 적합하다.
일부 실시 양태에서, 본 문서에 기술된 하나 이상의 시약(예를 들어, 핵산 프로브)은 검출 가능한 표지를 포함할 수 있고/있거나 (예를 들어, 화합물을 다음으로 전환시키는 반응을 촉매함으로써) 검출 가능한 신호를 생성하는 능력을 포함할 수 있다. 감지 가능한 제품). 검출 가능한 라벨은 예를 들어 광흡수 염료, 형광 염료 또는 방사성 라벨을 포함할 수 있다. 검출 가능한 표지, 이를 검출하는 방법 및 이를 시약(예: 항체 및 핵산 프로브)에 통합하는 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있다.
일부 실시 형태에서, 검출 가능한 표지에는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학, 전자기, 방사화학, 또는 형광, 화학형광 또는 화학발광과 같은 화학적 수단, 또는 임의의 다른 적절한 수단에 의해 검출될 수 있는 표지가 포함될 수 있다. 검출가능한 표지는 1차 표지(표지가 직접 검출가능한 모이어티를 포함하거나 직접 검출가능한 모이어티를 생성하는 모이어티를 포함함)일 수 있으며; 또는 2차 표지(예를 들어 2차 및 3차 항체를 사용하는 면역학적 표지에서 일반적인 것과 같이 검출 가능한 표지가 검출 가능한 신호를 생성하기 위해 다른 모이어티에 결합하는 경우). 검출 가능한 표지는 공유 또는 비공유 수단에 의해 시약에 연결될 수 있다. 대안적으로, 검출 가능한 표지는 리간드-수용체 결합 쌍 배열 또는 기타 특정 인식 분자를 통해 시약에 대한 결합을 달성하는 분자를 직접 표지하는 것과 같이 연결될 수 있다. 검출 가능한 라벨에는 방사성 동위원소, 생물발광 화합물, 발색단, 항체, 화학발광 화합물, 형광 화합물, 금속 킬레이트 및 효소가 포함될 수 있지만 이에 국한되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, 본 개시내용의 다중 마커의 발현 수준은 동시에(예를 들어 다중 분석) 또는 병행하여 결정될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 마커 유전자와 연관된 유전자 발현 산물(단백질)을 검출하여 PSC의 존재를 결정할 수 있다. 이러한 검출 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 ELISA(효소 결합 면역흡착 분석), 웨스턴 블롯, FACS, 방사면역학적 분석; (RIA); 샌드위치 분석; 형광 현장 혼성화(FISH); 면역조직학적 염색; 면역전기영동; 항체 또는 단백질 결합제와 같은 검출 시약을 사용하는 면역침강 및 면역형광법을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 개시 내용은 샘플에서 ESC, iPSC, 또는 둘 다와 같은 PSC의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 세포 함유 조성물, 세포 함유 용액, 세포 응집체, 세포 현탁액 또는 조직이다. 특정 실시양태에서, 샘플은 주로 비-PSC 세포를 함유한다. 추가 실시양태에서, 샘플 내 세포는 주로 PSC보다 더 분화된 상태의 세포이며, 예를 들어 특수 세포를 포함하며, 방법은 조성물에 존재하는 PSC의 존재 및/또는 양을 결정한다. 추가 실시양태에서, 샘플 내 세포는 주로 PSC를 분화시킴으로써 생산된 PSC보다 더 분화된 상태의 세포이다. 예를 들어, PSC보다 더 분화된 상태의 세포는 예를 들어 광 수용체 전구체(PRP) 세포 또는 망막 색소 상피(RPE) 세포일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법은 PSC를 분화(예를 들어, 특화된 세포를 생성하기 위해)하는 공정 이후에 잔류 PSC를 포함하는 조성물 중 PSC를 검출 및/또는 정량화하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서 관심 샘플(예: 세포 함유 조성물, 세포 함유 용액, 세포 응집체, 세포 현탁액 또는 조직)를 테스트하여 PSC의 존재를 확인한다. 관심 샘플 내의 세포(들)에서 본 개시내용의 하나 이상의 마커의 발현. 일부 실시양태에서, 관심 샘플 내 하나 이상의 마커의 결정된 발현 수준은 또한 PSC를 함유하지 않는 것으로 알려진 기준 샘플로부터의 하나 이상의 마커의 발현 수준과 비교되어, 예를 들어 존재 또는 관심 샘플에 PSC가 없다.
다른 실시양태에서, 관심 샘플(세포 함유 조성물, 세포 함유 용액, 세포 응집체, 세포 현탁액 또는 조직 등) 내 PSC의 수는 초기에 발현을 측정함으로써 정량화된다. 관심 샘플 내 본 개시내용의 마커 중 하나 이상의 수준은, 관심 샘플 내 하나 이상의 마커의 검출된 발현 수준은 이후, 예를 들어 기준 샘플 내 모든 세포가 PSC인 기준 샘플로부터의 하나 이상의 마커의 발현 수준과 비교될 수 있다. 다른 실시양태에서, 관심 샘플 내 하나 이상의 마커의 검출된 발현 수준은 (샘플내의 모든 세포에 대해) PSC 세포의 공지된 비율을 함유하는 기준 샘플로부터의 하나 이상의 마커의 발현 수준과 비교된다. 전체 세포에 대한 PSC의 비율은 예를 들어 100% 이하, 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30%일 수 있다. 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.1% 이하, 0.01% 이하, 0.001% 이하, 0.0001% 이하, 0.00001% 예를 들어, 0.000001% 이하, 0.0000001% 이하, 0.00000001% 이하, 0.000000001% 이하, 0.000000001% 이하 등을 들 수 있다.
따라서, 관심 샘플 내 본 개시내용의 하나 이상의 마커의 측정된 발현 수준을 오직 PSC만을 함유하는(또는 공지된 비율을 함유하는) 기준 샘플로부터의 하나 이상의 마커의 발현 수준과 비교함으로써 샘플의 모든 세포에 대한 PSC의 비율), 관심 샘플의 세포가 PSC인 비율을 결정하는 것이 가능하다.
위의 방법에 따라 관심 샘플에 PSC가 포함되어 있지 않은 것으로 결정되면 이에 대한 결정이 내려질 수 있다. 추가적으로, 관심 샘플이 세포 배양 또는 조직 배양으로부터 획득된 경우, 배양 내 세포 또는 조직은 이러한 결정에 기초하여 추가 확장 또는 증식이 허용될 수 있다.
추가적으로, 관심 샘플이 피험자에게 투여하기 위한 세포 또는 조작된 조직의 조성물과 관련된 경우, 예를 들어, 세포 또는 조직은 추가 확장 또는 증식 단계 이전에 또는 추가 확장 또는 증식 단계 없이 투여될 수 있다. 이 결정에 따라 행정을 실시한다.
다른 실시 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 마커의 발현은 단일 세포 수준에서 검출 및/또는 정량화될 수 있다. 즉, 본 개시내용의 마커 중 하나 이상의 발현은 단일 PSC에서 검출 및/또는 정량화될 수 있다(예를 들어, 단일 세포 분석). 단일 세포 분석은 예를 들어 단일 세포의 단리 후에 수행될 수 있다(예를 들어 연속 희석, 미세조작, 레이저 포획 현미해부, FACS 및 미세유체학을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의함). 추가적으로, 본 개시내용은 관심 샘플이 다수의 다른(비-PSC) 세포 중에서 단일 PSC만을 함유할 수 있고, 본 개시내용의 마커 중 하나 이상의 발현이 검출될 수 있고/있는 실시양태를 포함한다. 또는 해당 단일 PSC에서 정량화된다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 본 출원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 분석을 위한 키트, 조성물 또는 장치를 지칭한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 결정하기 위한 선택적인 적어도 하나의 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 분석을 위한 키트, 조성물 또는 장치가 고려된다. 일부 실시 양태는 결정을 위해 선택적인 적어도 10개의 프라이머 및/또는 프로브, 적어도 30개의 프라이머 및/또는 프로브, 적어도 50개의 프라이머 및/또는 프로브, 또는 적어도 100개의 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는 키트, 조성물 또는 장치에 관한 것이다.
"프로브"라는 용어는 mRNA와 같은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있고 수 염기에서 수백 염기의 길이를 갖는 RNA 또는 DNA와 같은 뉴클레오티드 단편을 의미한다. 프로브는 방사성 동위원소로 표지되어 특정 mRNA의 존재 또는 부재 또는 발현 수준을 결정할 수 있다. 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, 단일 가닥 DNA 프로브, 이중 가닥 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 구성될 수 있다.
"프라이머"라는 용어는 자유 3' 히드록실기를 갖는 짧은 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 이는 상보적인 주형과 염기쌍 상호작용을 겪을 수 있고 주형 가닥을 복제하기 위한 출발점 역할을 할 수 있다. 프라이머는 중합용 시약(예: DNA 중합효소 또는 역전사효소)과 적절한 완충액 및 적절한 온도에서 4개의 서로 다른 뉴클레오시드 삼인산이 존재하는 경우 DNA 합성을 시작할 수 있다.
"뉴클레오티드"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 의미하며, 달리 언급되지 않는 한, 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드의 유사체 및 변형된 당 또는 염기를 포함하는 유사체를 포함할 수 있다.
프로브 또는 프라이머는 포스포라미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 알려진 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열은 또한 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예에는 메틸화, 캡슐화, 하나 이상의 천연 뉴클레오티드를 이의 유사체로 대체 및 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 하전되지 않은 접합체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등)에 대한 변형 또는 하전된 변형이 포함된다. 접합체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등).
프로브 또는 프라이머의 길이는 10개 뉴클레오티드 이상의 길이를 가질 수도 있고, 20개 이상의 뉴클레오티드 길이를 가질 수도 있다. 프로브 또는 프라이머의 길이는 100개 뉴클레오티드 이하, 90개 뉴클레오티드 이하, 80개 뉴클레오티드 이하, 70개 뉴클레오티드 이하, 60개 뉴클레오티드 이하, 50개 뉴클레오티드 이하, 40개 뉴클레오티드 이하, 30개 뉴클레오티드 이하, 또는 25개 이하의 뉴클레오티드.
키트에는 방법을 실행하기 위해 키트의 구성요소를 사용하기 위한 지침이 포함될 수도 있다. 방법을 실행하기 위한 지침은 일반적으로 적합한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 지침은 종이나 플라스틱 등과 같은 기판에 인쇄될 수 있다. 지침은 패키지 삽입물로서 키트에 존재할 수도 있고, 키트 용기 또는 그 구성 요소의 라벨링에 존재할 수도 있다(예: 포장 또는 하위 포장).
실험
본 발명의 비제한적 실시양태는 다음 실시 양태에 예시되어 있다. 사용된 수치(예: 양, 농도, 변화율 등)에 대한 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 이들 실시 양태는 단지 예시로서 제공되며 본 발명의 다양한 실시양태로서 발명자가 간주하는 범위를 제한하려는 의도가 아니라는 것이 이해되어야 한다. 각 예에 설명된 다음 단계가 모두 필요한 것은 아니며 각 예의 단계 순서가 제시된 대로 이루어져서도 안 된다.
SEQUENCE LISTING
<110> FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc.
<120> MARKERS SPECIFIC FOR PLURIPOTENT STEM CELLS, AND METHODS OF USING
THE SAME
<130> F272839
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 808
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
actcagcccc cctgcaccca ggtgaaataa acagccatgt tgctcacaca aagcctgttt 60
ggtgatctct tcacatggat gcacatgaaa tttggtgctg tgactcagat cgggggacct 120
cccttgggag atcaatcccc tgtactcctg ttctttgctc catgacaaag atccacctat 180
gacctcaggt cctcagaccg accagcccaa ggaacatctc accaattgta aatcaggtga 240
agtatgaagt tatgaggaga aaggaacaga ggacaaccac acagagaaag tgtagcttta 300
tctactagag ctgaagacat tcaaatttat gatccaacaa ttctactctg aagtgcagtg 360
gtgtatatac tgcaacaatg tgtactcatg tgccctgaga actagatatg aaaaaacctt 420
acagcaatat gcataatagt aaaaaaaaaa aaaaaaaact ggaaacaaca aaaatgttca 480
ttgaccatat acaatgataa atgtggtata ctcgtagcat ggaaaactac acaacattga 540
aaatgaacaa actaaaactg tacacagcaa catgaacgaa ttccacagat aatattgagt 600
gaaagatacc agacaccaaa taatatccca tatgatttca tttacattaa atgttttttt 660
tttgagatgg agtctcgctc tgttgcccag gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca 720
ctgcaacctc tgcttttcag gttcaagcta ttctcccact tcagcctccc cagtagctgg 780
gactacaggt acctgccacc acgcccaa 808
<210> 2
<211> 2305
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
acaaagcctg tttggtggtc tcttcacacg gacgcgcatg aaatttggtg ccatgactcg 60
gatcggggga cctcccttgg gagatcaatc ccctgtcttc ctgttctttg ctccgtgaga 120
aagatccacc tacaacctca ggtcctcaga ccgaccagcc caaggaacat ctcaccaatt 180
ttaaatcagc tccaggagaa tgggtgactt gaactggcaa ggagcaacct gctctctcca 240
cgggcctctg gaaccccggc aagagaagat cccttgatca ccatggacac tcaagttggc 300
aagaagagct ccttagagaa gtcgtgggag ggcaagcaag ctgatgtgga gccaggacga 360
tttgatgtgg gagcacctgc agtggagcac agccagggag agccatctcc ccaggcctga 420
cttgctccca taggagactt tagccctagg ggaactgtcc atcctgatct ctgcagggtg 480
gtcttgtcca tcagacaggg ctgattcgac ctgagcaccc cttggtctgc tggcctttct 540
ggggtcccag cctggccaga cctgcttgca gggcagtctt gggtgccctg gaggccacgc 600
catagcttct gtgctggcag atagtatctg actggtggag agctccagca aggctgcccc 660
taggccacac accagcccat ccaccccctc cccacactgc agcttcccta ggcccaggaa 720
actcctcacg tgtctttgct ggcacaagtc tgcacaggta ggttttgcct tccttgccct 780
gccagtgcat gggagtgtag tctgcccccc tgccccgtct ggctgtcatt gaagacagag 840
ccttggtggg cacagagcaa gccagctccc ccgcaacgcc cacctcaaca cctggccctt 900
gtgctaacac tgtgcagaga acagtggacc ctgctcgcac cctgagtgat cactcctgct 960
tgtggggcac agagaaggtg tccagacctg ctcacgccag tgccctgccc ccaagccaac 1020
accacatcca acaggagcct gcacccagtc ttcagcatag aggtgaaaga tctctacgag 1080
gagaactatg aaacactgct caaaataatc aaatatgata caagcaaatg gaagagcatg 1140
caatgctcat ggataggaag aatcaatatc ataaaaatgg ccatactgcc caaagcaatt 1200
tatagattca atgctattcc tattaaacta ccattgatat tcttcacaaa actagagaaa 1260
actattttaa agttcatatg gaaccaaaaa agagcctgaa tagccaagga aatcctaagc 1320
aaaaagaaca aagctggaag catcatgcta cccaacttca aactatacta caggactaca 1380
gtaaccaaaa cagcgtggta ctggtacaaa aacagacaca tagaccaatg aaacagaata 1440
gagaacccag aaatggttct ctatttcaca cacctacaac tatctgatct tcgacaaacc 1500
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gctagccata tgctgaagat taaaactgga ccccttcctt atactgtaca caaaaatcaa 1620
ctcaaaatgg atgaaagact taaatgtaaa acccaaaact ataacaacaa tagaagacaa 1680
cctaggcaat accatcttgg atataggaac aggcaaaaat ttcatgacaa agacaccaaa 1740
agcaattgaa acaaaagcaa aaattgaaaa gtgggttcta aataaaacta aagagctcct 1800
gcacagcaaa gaaaatacaa acagagtgaa cagacaacct acagaatgac agtatctgca 1860
aactatacat ccaacaaaga tctaatattc agcatctata agaaacttaa acaaatttcc 1920
aaaaacaacc ccattaaaaa gtgggcaaag catatgaaca gacacttttc aaaagaagac 1980
atacatgcag ccaacaaaca tgaaaaaggc tcaacaccac caatcattag agaaatgcaa 2040
atcaaaacca caatgagata ccatctcaca ctagtcagaa tggctgatgg ctgttattaa 2100
aaagtcaaaa aataacagat gctggcaagg ttgtggagaa aaggcaatgc ttatgcactg 2160
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agcttactac acgtgccggc aatctggcca ctgggccaag gaatgcccgc agcccgggat 360
tcctcctaag ccgcgtccca tctgtgtggg accccactgg aaatcggact gttcaactca 420
cctggcagcc actcccagag cccctggaac tctggcccaa ggctctctga ctgactcctt 480
cccagatctt cttggcttag cggctgaaga ctgacactgc ccgattgcct tggaagcccc 540
ctaaaccatc acggatgccg agcttcgggt aactctcaca gtggaaggga cgtgcatgaa 600
agttaggggt agaagaaaag atggattgag gttgtcctca gactttccat ggtatctgag 660
ctgttttcct cttccggaat tgtgtctcat atgaagttcc tcttcatttg ag 712
<210> 5
<211> 616
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ggaacatctc accaatttta aatcagtttt tcaagtggta cctgagattc agcacttcta 60
aaaagctcca aggtgatgaa ggtgctgcta gttggaggcc atactttgag ttgccagatg 120
ctaaaaattc aacagatggg gtatgtaagc agatagtgta gcatattgaa aacaactctc 180
agtttgaatc agaagcctgg gtctgtgata ttatgacact aactagctta atattttgtg 240
gattattgtg catgaaatat atccatttaa atatcatact ttcaatttaa attatgggtt 300
tcaactttgc caggcaaata taatcaacaa tatattcaat agtatgccac agctaaagac 360
acaaatgaaa acaatgatct cagacttttg atccaggtgc caagttagaa aaagaagtta 420
aaacagtgta gtttatttct gttcaatgtc ctgtataggt ggaaactaat ttcagggtta 480
atttttggtt aaacaactag cttggaaatt tataattatt tgggattgag gaccaaacaa 540
ggtgaggcac gataaagaaa ttagaagggg atcgctatga aaatcaagat gaataaaacg 600
aagggagtgt ttacgg 616
<210> 6
<211> 1059
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gtgctggctt ccccttcgcc ttctgccgtc atttgacagg aaattaggat gagcacgagc 60
aaagtcggtg gtcacaaggg agcagccagg ccagtcctgc ttaaactcct gctgttacat 120
gtttgcgatt gaactcgtag caagctgccg atggaacaca acctgcctcc ggcacagacg 180
ccgatcttca atcccttctc cccagcaccg gtgacagccc tagtcatcct tcaaggccca 240
gttcaaatgc ctccatctcc ataccatttc agttcgtggt tggggatagg agctcccgtc 300
gcgatcgtca tctttctgct gcagacagat tttgtttccc tctgtaaagt tggagtgcag 360
gggacaaggc tctgaacata gcatttaagt gacagagatg gttgtggtca tgtcccagta 420
tgtatttatc tatctcctgc tccagtaaat gtcacactcc ccggggcagc gagggtgtca 480
ccatctcggt gtccccacag cacctagcac agtctcccag acgatccagg gcagaccctt 540
cgcatgggaa cgcaagtccc tgtttgtccg ggtcactcag gtttacgcct attgtcctgt 600
aattatttat gcaccctctt ttgctgtcat aggtgttggg ttggaacagt caccctattt 660
agcacacacc tattaagcca aagcacctta gtgtgtaggc ttccctcacc caaacctgtt 720
cccaaaggtc ctttctcacc ggctactttg ggggccccag taatcttccc gacccctctg 780
gtcagggcca gagtggggag caagtgtcta aagcaaggcc ttcaacaagg tcccttccct 840
gagagactca gtttgtgacg cttgtgattg tgaagctcaa atggattatg tgactccaca 900
taactctgca aactgtggtg cgccctatta ttgccgttta acttgtcagt gtcggttctg 960
cacccctgca ggctctgtag gggctggaga agaacacttg atttggaatt tcggtaatag 1020
ccagtgagct aagaaccaca taaaataatg cagatcata 1059
<210> 7
<211> 1170
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
tgctggcttc cccttcgcct tctgccgtca ttgtgagccg tggggaggcc ttgagcgccc 60
cctggaggtg acactctgcc actacacata ggaaaccacc tggaaaccca accacagtgt 120
ctgatgtgac ttttcttagt gacaggaaat taggatgagc acgagcaaag tcggtggtca 180
caagggagca gccaggccag tcctgcttaa actcctgctg ttacatgttt gcgattgaac 240
tcgtagcaag ctgccgatgg aacacaacct gcctccggca cagacgccga tcttcaatcc 300
cttctcccca gcaccggtga cagccctagt catccttcaa ggcccagttc aaatgcctcc 360
atctccatac catttcagtt cgtggttggg gataggagct cccgtcgcga tcgtcatctt 420
tctgctgcag acagattttg tttccctctg taaagttgga gtgcagggga caaggctctg 480
aacatagcat ttaagtgaca gagatggttg tggtcatgtc ccagtatgta tttatctatc 540
tcctgctcca gtaaatgtca cactccccgg ggcagcgagg gtgtcaccat ctcggtgtcc 600
ccacagcacc tagcacagtc tcccagacga tccagggcag acccttcgca tgggaacgca 660
agtccctgtt tgtccgggtc actcaggttt acgcctattg tcctgtaatt atttatgcac 720
cctcttttgc tgtcataggt gttgggttgg aacagtcacc ctatttagca cacacctatt 780
aagccaaagc accttagtgt gtaggcttcc ctcacccaaa cctgttccca aaggtccttt 840
ctcaccggct actttggggg ccccagtaat cttcccgacc cctctggtca gggccagagt 900
ggggagcaag tgtctaaagc aaggccttca acaaggtccc ttccctgaga gactcagttt 960
gtgacgcttg tgattgtgaa gctcaaatgg attatgtgac tccacataac tctgcaaact 1020
gtggtgcgcc ctattattgc cgtttaactt gtcagtgtcg gttctgcacc cctgcaggct 1080
ctgtaggggc tggagaagaa cacttgattt ggaatttcgg taatagccag tgagctaaga 1140
accacataaa ataatgcaga tcatatgaaa 1170
<210> 8
<211> 778
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
atgtgggtgg ctgagaaggg cactagggtg ggggtggctg gaggaatttt aagtgctgtg 60
atgaaatggg cacccttctc tgccctccat cgccaagccc tacacctctg cgaagactgt 120
gacacataaa gtcctgtgtc aacgatctgt gcccgcagag agagcctgct ccagcctctt 180
tgctacagcc ttgagtcttc tgctgaagct gtggagacta ccaaatggac tcgtctagat 240
ttcacatgca acgtggctct gccttccctg agcactctgg gcctttccat ggagacagaa 300
tgaatagata atgggctgtc accatcttgc actgccagct gtcctctctg aaggttgaac 360
tcctaacaga agtttcctca tgtttgtggt agcagcacct tgagaagtag agaagacaag 420
aagaaaaaag gagtcagcac agatgacaag ctctgctttt tagtgtacat ggtcttcccc 480
agtatgcaca ttcttttcct attcttgact tatctccctt aacgataaaa tggccaagtt 540
agaaacccta gacactctta ttctcttttc tttctttctt tcttttcttt cttaagagac 600
agggtctcat tctgtcaccc aggctggagt acagtggcac aactgtaggt agctcactgc 660
agcctgaaat tcctaggctc aagtgattct cctgcctcag cgacttcgga gtggctgaga 720
ttccaagctt aaaccattgt gtcctgcact tctcactttc atggctgtta tcctgggg 778
<210> 9
<211> 1017
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
cataggctcc agaaaacaag aagcaagact ggaaagctgg ggatgattgt acgccctcgc 60
ctgaatctta cgtggttcct ccttcttcca cctggccagt gcagagccgt gggtgccacg 120
tggccacttc tggattgggt tccccttggc ctgccaccct gtccttctgc tttcccactt 180
tgccagccag agtcaatttg aggacgccaa gttctcctct ccatacagag ctcctggtct 240
ccttgtaact tgtaactcct gggcacagtt acaagtgctg aattcttgcg aggatgaact 300
caagatacaa aatatgcttg gcaactcacc cctgagtggc cacaggcaca cgcaggagtc 360
gaacccaccc acctctgctg acagtcatgg gtcaagctca aagtcctggc tgcttctctg 420
ctcaagatct gtgcccgcag agagagcctg ctccagcctc tttgctacag ccttgagtct 480
tctgctaaga aaagacacag aggcaaagag aaacacatag agaggagaat gcctcgtgaa 540
aatggagacc gagattggtg caatgtgtcc acaagccagg gaatgccaac gtggccagca 600
accaccagaa gctgggagag aggcatggaa cagagtcctc ggagcctcca gaaggaacca 660
accctgttga taccttgact gaaaacttcc agcctccaga actgtgacag aattaatttc 720
tgttatttaa agccattcag tctgtggtaa tttgttacat cagccctgaa tagcaaatac 780
agatgaccca ggtttaaatc ctagttctgc cacttatgag cgtgggtaca taactacttt 840
ctagagcccc ggtttcctca tctgtaaaaa acctcatacg gttattaaga agatcaaatg 900
agatacaaac ataaattctt aacagtgctg gcatgttaat tgttcaataa atatgagtta 960
tttacaacaa ttgtgatagt aatgagtaac acagagaaat gagaattgac ttaacag 1017
<210> 10
<211> 818
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
tggtagtgaa taactctcac aagatctgat ggtttgataa ggggaaaccc gtttcacttg 60
gctttcattc tctcttgcag ccaccatgcc accttccacc atgattttga ggcctcccca 120
gacacgtgga cctagcaaca catgttctaa catgtgtgag actgactgcc tctcctctat 180
gaagagatgc cagtgacagc caggactggt gtaggctcta ttgagcatca cagtcatatg 240
tgagtgccca agagaagcta ttcactttct cagatgcggt ttgcagaggg aacttcacag 300
gctctctggg attgctcaca tttggcagct aaagtggaat caccaatcca aaatactcac 360
cccaggcgtg gggtcactcc cagtggcgga gatgccctgc atttccattg cctggactga 420
ggaacagatg aaaggggaac cacaccaggg tggtggcctg ggatgtgcct actccctaag 480
ccaagcttct ctgtcctgag tgggcttagg gtcccctgca gcgtgggtgt taaatgctgc 540
ttcctaggcc tcaccctcag agcttccagt tcagtcgagt ccaggtccct aacctgtcgt 600
cgtccaattg attttgatca ggtgccccat ggccccactt tgagaagcag atcgagtcca 660
cctgtgcatc ttccctgttg tccctaaaaa taaggctaaa aaaaggcacc agttcaaaaa 720
tccagtttat ttgtttgaag ttcaggttta cagttcctcc aattctcaga tcgcagaaga 780
agcatctgga aggaaatgac ccctgcaccc accacacc 818
<210> 11
<211> 531
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
actgacactt ttcggactca gcctgcctgc acccaggtga ttaaaagctt tattgctcac 60
acaaagcctg tttggtggtc tcttcacatg gatgcgcatg aaatttggtg cggtgactcg 120
gatcggggga cctcccttgg gagatcaatc ccctgtcctc ctgttctttg ctccgtgaga 180
aagagccacc tacgacctca ggtcctcaga ccaaccaggc caagaaacat ctcaccaatt 240
tcaaatccgc cactcccaga gcccctggaa ctctggccca aggctctctg actgactcct 300
tcccagatct tctcggctta gcggctgaag actgacactg ctcaatcacc ttggaagccc 360
cctagaccat cacggacgcc gagcttcagc aggagaagac aaggagatgg agagactgtc 420
aacctagaac cagtaatgac cagttccaac ttaattacag aaagggagaa aagatcaatc 480
atttaagttg cttcatcgtc taaataaaag tgttttggct gttgaaacat g 531
<210> 12
<211> 2119
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
ggacttagcc cacctgcacc caggggaaat aaacagcctt gttgctcaca caaagcctgt 60
ttggtggtct cttcacacgg acgtgtgtga caaggaacac cctccttgag cacaggggga 120
gggtgaatat cagaactgaa tctgacttct gacaacatag gagctgaagg gaccttggat 180
gttgggtaag cagttcccac tgtctgtcac aagccctaat aaaatacaag taagagaaaa 240
gaacaaaact ggggcaatct aatcaagaaa ggctttctgg aatgcatgag gccccagcga 300
gatctaaaat tcctagatgg acttggtgtt gtggaagcaa gacagcagtc gggcaaagga 360
gagacaggaa gcaaatgaat tctaccttgc caacaatggg aaacagacat acttaatgtg 420
agtagagagg tagccttggc caggaaagtt tgtttgaaga tcctggtctg tcttgacttt 480
aaatcacttg cctttggaat ggaagagaac agacatctca tcaaatgaac caatctgaat 540
gcaaggagca cccgaatcca tccccactca ggaatcctgg ttacagatgc taaaagatgt 600
ctttgacagt gaacagtggg tcataagatc tatttctgcc tcctgtctgt gactcactgg 660
atgactcaag gtgaatctct ccccatttct gagtatctgg cccccatcca tgaagaacag 720
aagatcacat cagtatttcc cttcggcaag gttggccccc gctgcagcaa ctgtgcaaag 780
accaccagac tgccctctct gccagcttac tcttcagcct ttctggctct ttctcccact 840
tccacatccc tgcttcattt ttctttttct ccttttgcaa atagcattgc tccaaagcaa 900
cccaggcacg tgtcttgggg acagcgctgc gagctacccc tgagctgtgg ggagcaggcc 960
caagattgtt tgctattagc aactcctgtt tgcaggataa ataaagcgaa cctgagtgca 1020
ggctcctgtg ggctgggaca ttttcattct gcagcaggtc agcttccatt ccactagggg 1080
gctttgaatg ttaataggca tttctttcca ggtacccttc tcctttctct acagtgcacc 1140
agtccctgtg ggaccttcca ttggcatcct acggagagat tattactctt ttcattgttt 1200
tccttacaaa ttagtttctg gatttaatgg ctttggttgc tgagcagatt ttggaaattg 1260
gggcagatgg tggggtgggg tgatctgcag agcccattat gggcactggg ttattgactg 1320
cttgggattt aaggtggaat taacgctttc ctgtttcttg gggaattttg cgatggggtt 1380
ggaccttctt ttcccttaga aggaattgtg tttgttgtta ttgcatgttt aagaagcttc 1440
tagaaattgt agctctggaa tacaataggt agagaatgca ggtttttaat gggatgtggg 1500
ggagtgttgc tcagttgtgg gaagatttgt aataatggtt gggactgggg atagagcgtt 1560
acctgaggac ggttttatta atgccacaaa gcataaagtt taaaaaaaaa gaaaaaagaa 1620
aatccagggg tgtcttactg tcagaagctt tggaaccatg ttgaataggt gctgggtaaa 1680
atgagactga gacctgctgg gctgcattcc caggaggtta gggattcgca gtcacagggt 1740
gtttacagtt aagggaacag gttaataatg tttaccaaac agacccagga cttaacagac 1800
ccaagaaatg tcttgatgtc ctgctatctt aagcacaaaa gcattctttg tttagtaata 1860
aattttgctt taaagatagt aatatagatt cttgcaaaag tcagtagtta cacaaggatt 1920
aacaatcctt tgtcatgagc ccttgtaata gaccacatcc ttttcatgat tttttgcctt 1980
gttatctcat atataaacat gcattgcacc taataaggtg ggcgccttac tcctcttgct 2040
ttcagaaatg ccctgctcag tccatggagc aaccattctt tcattccttt actttcttaa 2100
taaacttgct ttcacttta 2119
<210> 13
<211> 584
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
actgaaccag tatcattaaa gcttgaagtg ttgaaataag tggcctggga ctggcttcca 60
cggtgataaa agattcatct ggtagcacca gagtaaaaga agtctcacta aacactggcc 120
gggcagctgc tgctcggtgt gagcatcccg gggatgcaag cgtgggggag gcatcccttt 180
gtttcctgag tcctagaagc aggtccccga cgaggaacaa cgatgcctgg actcagcttc 240
agcctctgtt cttctaccgt tcagaagcca ccctccggca aggtgacccc ggctgctgga 300
tggggcaagc ccaggaattc tcggcttctg acacatgacg cattcatctt ctccgacagt 360
gttcccatgc acaacttgtg gttcgggttg gaaatgcaaa gtggaaaaat gcatagcagt 420
atcccctcct ccaaggcctc agtctctgtg ctcatattca ctgagactag tgacccccga 480
cttcccactc gccggcccct cctcctcccc ttccaacata atatgctgtt tacttattta 540
ttgtgttcat tttccgtctc acccaaatct attctagaaa aggt 584
<210> 14
<211> 1185
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
gtggaggcac tgggccacct cagagggcca gtgtcttgct gaggggccgg agcagtcctg 60
tgcctgcagc ctccggagcc atgggaacag ggctgcgaag tcagtccttg cgagagcccc 120
gaccctccta tggaaagctg caggagccct gggggaggcc ccaggagggc caactccgca 180
gggcgctaag cctcagacag gggcaagaga agtccaggtc ccagggcctc gagagaggca 240
cagaagggcc agatgccact gcccaggagc gggtgccggg gagcctgggg gacacagagc 300
agctgatcca agcccagcga agaggcagcc ggtggtggct gaggcggtac caacaggtaa 360
gaagaaggtg ggagagcttt gtcgccatct tccccagcgt gactctgagt cagccggcct 420
ccccgtagcc cacactgggc accatcagct aaagatgctg gaagccatcg tggccccctt 480
gctgtgcctg gaccagccca ccgtgtctgc tgacctacct cttcacagct ctctggactt 540
tggctgggtg gccctaggag gcttctgcca ccagctcact ggagtcgcca cgtggctgcc 600
actcttagct ctggcccttc cactccagca ctagctctct ttgaagatcc cagcagggtc 660
aaaaagaagg gggctcagct gtctgccctc tgggcttggg taggggcctt ggactatgat 720
tctatgaagg tttagaagaa gcctgcccgg aatgggggct gtggacgctc ctgccccaca 780
cgaccagctg tcaacttcca ggacggagct tgatgaagcc agacccatgg ccgagaggct 840
cacggacgtt gcctggtcac tgggccatga cccaactgcc cttcttgtca gttgctgatg 900
gtgggccagg gcgcaggtct ccctcccaga tggtgagccc tctggggcaa ggaccacagc 960
tgggtggccc tcctggctga gcactctgtg ctgaaaacct ttgaacctca cggtgtcctg 1020
atgaaggaag cagaggaagt cttcctccct gtgtgacaga gggggaaact gaggcccaga 1080
gtggggaagg gatttcttgg ttttgacatc tccgacccca ccccacccca tccagtgtcc 1140
agcactggag tcgaacacag taataaagat gctgagaaaa agtca 1185
<210> 15
<211> 1703
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
ggcaaggccc gacctgaagc actggctcca gccttaggga aggttttggc cgtgggtttt 60
gttggcacgt accattttgc tgaaagacag agcaccttga ggacgttatc cctaaaatga 120
gagaggactg ggattgaaag gctgactaca gaaatggctg ctgcccagac gccctcaaaa 180
gccaaggatc ctcagagttg gttataaaat atttaagggc gagaaaagga tcgcaggagc 240
caggccctga gatgagcttg gagtccctgt ttcagcacat catcttcacc gagcatcagg 300
cggaggagag tcgccgtttg atgcgagaag taaggtcgga aataaccaga tgtcgtgaaa 360
aaattaagaa agcaacggag gagctgaatg aagagaaaat caagctggaa tctaaggttc 420
aacagttttt tgaaaaatcc ttcttcttac agcttttgaa agctcatgaa aatgctttag 480
aaaaacagta cagtgaaatt acaaaccata ggaatatgct tcttcaaacc tttgaggcta 540
taaagaaaca aatgatagag gaggaagaca aatttattaa ggaaattaca gactttaata 600
atgattatga aataacaaag aaaagagagc ttttgatgaa agaaaatgtc aagattgaaa 660
tatctgactt agaaaaccaa gcaaacatgt tgaaaagtga aatgaagtca atggaacatg 720
atagtagcca gttaaatgaa cttcaaaaac aaaagagtga attgatacaa gaattattta 780
ctctccaaag aaaacttaaa gtttttgaag atgaagagaa tgaatccatt tgtactacca 840
aatatctaga ggcagaaaaa ataaaaatca gtgaaaagcc tcaaaatgat acagaatgct 900
taagacttaa aaaagaatta gaactttata aggaagatga catggaaagt gtttatgaag 960
ctctccaaac agaaatagaa tttttggagt tgacattggc acagaaagat cttcaggaaa 1020
gcaaataact tacagagaat tgatcagcca tctgagattt gatcagaata tctgagaatc 1080
aaatctttgt gatagatata tgaatggtac ccgttacaac ggatccttgt gggaaatatg 1140
gggtttaaaa tattcaaatt gttattatct agaaatgatg tgttagccct ttaagataat 1200
ttttgtcttg ttactcaaac tttaagagtt cttctgtggt ttgattttgt ttctaaaaga 1260
aggaaaagga gaagaagtag ataccgtgtt cccaggcttc ttatatgccc ctgaacctca 1320
agctgtccta ttctttctaa tctatataat atggtttgga tctgtgtcca tgcccaaatc 1380
tcatgttgaa ttgtgatccc cactgttgga ggtgggtcct gataggaggt gattgggtca 1440
tgggggtggg tttctcatga atagcttagc accattcttc ttggtactgt ccttgagttc 1500
tcctgagagc tagttgttta ctagtgtata gcacttctcc actttgctcc tgctgccacc 1560
gtatgagatg tctcactccc cctttgcctt cagtcatgat tggaaacttc ctgaggcctc 1620
cctagaagca gaagtcacta tgcttcctgt acagcctgca gaaccgtggg acaattaaac 1680
ttgtgttctt tgtaaattaa aaa 1703
<210> 16
<211> 1940
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
gttaatatta ctgcagcttg attacaaaag gcaatgatta attttaaagc agacaaaaaa 60
gatatgccct gattacaaag gaatgattaa ggcggaatgt cagacattgc acatttatag 120
cagtctttgc catcgtcaaa gtataagact ttgtaaaagt ttatatttag aatcacagtt 180
actttgtact ttataatatt cagtgtttgc gccttggata ccgggcaacc ctactccaac 240
tgggcctaag acctttgggg ttcacatgcc cagggcaaac ctgcccccca caggatggtc 300
ccaatgagcc gccgtagttt aagttctcac aggcaaggcc cgacctgaag cactggctcc 360
agccttaggg aaggttttgg ccgtgggttt tgttggcacg taccattttg ctgaaagaca 420
gagcaccttg aggacgttat ccctaaaatg agagaggact gggattgaaa ggctgactac 480
agaaatggct gctgcccaga cgccctcaaa agccaaggat cctcagagtt ggttataaaa 540
tatttaaggg cgagaaaagg atcgcaggag ccaggccctg agatgagctt ggagtccctg 600
tttcagcaca tcatcttcac cgagcatcag gcggaggaga gtcgccgttt gatgcgagaa 660
gtaaggtcgg aaataaccag atgtcgtgaa aaaattaaga aagcaacgga ggagctgaat 720
gaagagaaaa tcaagctgga atctaagctt ttgaaagctc atgaaaatgc tttagaaaaa 780
cagtacagtg aaattacaaa ccataggaat atgcttcttc aaacctttga ggctataaag 840
aaacaaatga tagaggagga agacaaattt attaaggaaa ttacagactt taataatgat 900
tatgaaataa caaagaaaag agagcttttg atgaaagaaa atgtcaagat tgaaatatct 960
gacttagaaa accaagcaaa catgttgaaa agtgaaatga agtcaatgga acatgatagt 1020
agccagttaa atgaacttca aaaacaaaag agtgaattga tacaagaatt atttactctc 1080
caaagaaaac ttaaagtttt tgaagatgaa gagaatgaat ccatttgtac taccaaatat 1140
ctagaggcag aaaaaataaa aatcagtgaa aagcctcaaa atgatacaga atgcttaaga 1200
cttaaaaaag aattagaact ttataaggaa gatgacatgg aaagtgttta tgaagctctc 1260
caaacagaaa tagaattttt ggagttgaca ttggcacaga aagatcttca ggaaagcaaa 1320
taacttacag agaattgatc agccatctga gatttgatca gaatatctga gaatcaaatc 1380
tttgtgatag atatatgaat ggtacccgtt acaacggatc cttgtgggaa atatggggtt 1440
taaaatattc aaattgttat tatctagaaa tgatgtgtta gccctttaag ataatttttg 1500
tcttgttact caaactttaa gagttcttct gtggtttgat tttgtttcta aaagaaggaa 1560
aaggagaaga agtagatacc gtgttcccag gcttcttata tgcccctgaa cctcaagctg 1620
tcctattctt tctaatctat ataatatggt ttggatctgt gtccatgccc aaatctcatg 1680
ttgaattgtg atccccactg ttggaggtgg gtcctgatag gaggtgattg ggtcatgggg 1740
gtgggtttct catgaatagc ttagcaccat tcttcttggt actgtccttg agttctcctg 1800
agagctagtt gtttactagt gtatagcact tctccacttt gctcctgctg ccaccgtatg 1860
agatgtctca ctcccccttt gccttcagtc atgattggaa acttcctgag gcctccctag 1920
aagcagaagt cactatgctt 1940
<210> 17
<211> 1420
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
aatattactg cagcttgatt acaaaaggca atgattaatt ttaaagcaga caaaaaagat 60
atgccctgat tacaaaggaa tgattaaggc ggaatgtcag acattgcaca tttatagcag 120
tctttgccat cgtcaaagta taagactttg taaaagttta tatttagaat cacagttact 180
ttgtacttta taatattcag tgtttgcgcc ttggataccg ggcaacccta ctccaactgg 240
gcctaagacc tttggggttc acatgcccag ggcaaacctg ccccccacag gatggtccca 300
atgagccgcc gtagtttaag ttctcacagg caaggcccga cctgaagcac tggctccagc 360
cttagggaag gttttggccg tgggttttgt tggcacgtac cattttgctg aaagacagag 420
caccttgagg acgttatccc taaaatgaga gaggactggg attgaaaggc tgactacaga 480
aatggctgct gcccagacgc cctcaaaagc caaggatcct cagagttggt tataaaatat 540
ttaagggcga gaaaaggatc gcaggagcca ggccctgaga tgagcttgga gtccctgttt 600
cagcacatca tcttcaccga gcatcaggcg gaggagagtc gccgtttgat gcgagaagta 660
aggtcggaaa taaccagatg tcgtgaaaaa attaagaaag caacggagga gctgaatgaa 720
gagaaaatca agctggaatc taaggttcaa cagttttttg aaaaatcctt cttcttacag 780
cttttgaaag ctcatgaaaa tgctttagaa aaacagtaca gtgaaattac aaaccatagg 840
aatatgcttc ttcaaacctt tgaggctata aagaaacaaa tgatagagga ggaagacaaa 900
tttattaagg aaattacaga ctttaataat gattatgaaa taacaaagaa aagagagctt 960
ttgatgaaag aaaatgtcaa gattgaaata tctgacttag aaaaccaagc aaacatgttg 1020
aaaagtgaaa tgaagtcaat ggaacatgat agtagccagt taaatgaact tcaaaaacaa 1080
aagagtgaat tgatacaaga attatttact ctccaaagaa aacttaaagt ttttgaagat 1140
gaagagaatg aatccatttg tactaccaaa tatctagagg cagaaaaaat aaaaatcagt 1200
gaaaagcctc aaaatgatac agaatgctta aggtaactaa aagggtgagt ggtcaccacc 1260
taattctgat aggcatgaga agtcatacag aacctgtagt ccatttgaag tgaagagatg 1320
gatgagcacg tgttgatgga atggtgggaa tatctctacc attttatttg aaaaataaat 1380
ttattaaaaa gaaggcttat gtacatttca atagcagcat 1420
<210> 18
<211> 1617
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
gaaaaacaaa cccagggagg gacggaggcc tgagtcaggg gttccgccag ggaaaaaggc 60
agaccttgaa actgccctct tagggcgtga gggagaaaag cccggatcct cagagttggt 120
tataaaatat ttaagggcga gaaaaggatc gcaggagcca ggccctgaga tgagcttgga 180
gtccctgttt cagcacatca tcttcaccga gcatcaggcg gaggagagtc gccgtttgat 240
gcgagaagta aggtcggaaa taaccagatg tcgtgaaaaa attaagaaag caacggagga 300
gctgaatgaa gagaaaatca agctggaatc taaggttcaa cagttttttg aaaaatcctt 360
cttcttacag cttttgaaag ctcatgaaaa tgctttagaa aaacagtaca gtgaaattac 420
aaaccatagg aatatgcttc ttcaaacctt tgaggctata aagaaacaaa tgatagagga 480
ggaagacaaa tttattaagg aaattacaga ctttaataat gattatgaaa taacaaagaa 540
aagagagctt ttgatgaaag aaaatgtcaa gattgaaata tctgacttag aaaaccaagc 600
aaacatgttg aaaagtgaaa tgaagtcaat ggaacatgat agtagccagt taaatgaact 660
tcaaaaacaa aagagtgaat tgatacaaga attatttact ctccaaagaa aacttaaagt 720
ttttgaagat gaagagaatg aatccatttg tactaccaaa tatctagagg cagaaaaaat 780
aaaaatcagt gaaaagcctc aaaatgatac agaatgctta agacttaaaa aagaattaga 840
actttataag gaagatgaca tggaaagtgt ttatgaagct ctccaaacag aaatagaatt 900
tttggagttg acattggcac agaaagatct tcaggaaagc aaataactta cagagaattg 960
atcagccatc tgagatttga tcagaatatc tgagaatcaa atctttgtga tagatatatg 1020
aatggtaccc gttacaacgg atccttgtgg gaaatatggg gtttaaaata ttcaaattgt 1080
tattatctag aaatgatgtg ttagcccttt aagataattt ttgtcttgtt actcaaactt 1140
taagagttct tctgtggttt gattttgttt ctaaaagaag gaaaaggaga agaagtagat 1200
accgtgttcc caggcttctt atatgcccct gaacctcaag ctgtcctatt ctttctaatc 1260
tatataatat ggtttggatc tgtgtccatg cccaaatctc atgttgaatt gtgatcccca 1320
ctgttggagg tgggtcctga taggaggtga ttgggtcatg ggggtgggtt tctcatgaat 1380
agcttagcac cattcttctt ggtactgtcc ttgagttctc ctgagagcta gttgtttact 1440
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tttgccttca gtcatgattg gaaacttcct gaggcctccc tagaagcaga agtcactatg 1560
cttcctgtac agcctgcaga accgtgggac aattaaactt gtgttctttg taaatta 1617
<210> 19
<211> 660
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
gattaggcct ggtttgcgct ggagagtggt cttggttgtg agggtcataa gatgggaact 60
ctcccggcac gtagacatat cccgccgtgg gtgaaagttc ccgaagacct gaaagatcca 120
gaggtgttcc aggtccagac gcggctgctg aaagccattt tcggcccgga cggatctcga 180
atcccttaca tcgagcaggt gagcaaggcc atgctcgagc tgaaggctct ggagtcttca 240
gacctcaccg aggtcgtggt ttacggctcc tatttgtaca agctccggac caagtggatg 300
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gaagccatga atgccctcga actaggccct tggatgaagt gaaccagttt ccagccaatg 420
caatgaagcc gggttgcaga gattaggttg tggccagagc tagagtgatt ccttaagctt 480
gttttaaaat ctgctccagc ctaaagagtt aagggaaaac catttgttcc cttaaagagt 540
taagggaaaa cccttggctc tgagtcttgt tgtgaatatt tctttgatga ttgttaataa 600
aaagtgtttt ttcttttttc ccatttttaa aaataacaat aaagttttaa ataagttgat 660
<210> 20
<211> 3178
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
atggccacct actgcgacga cctgggcccc tcctcggccc cgcccggcca ggcccaggcc 60
accgcgcacc ccccgggcta tgagccaggg gatctgggcg cggtgggcgg gggccccctc 120
ctgtgggtga acgcgccagc gctcagcccc aagtcctacg cttcgggtcc cgggcctgcg 180
ccgccctacg cggccccgag ctacggggct cccggcccgc tcctcggcgc cccgggcggc 240
ctggcgggcg ccgacctcgc ctggctgagc ctctccggcc agcaggagct gctgaggctg 300
gtgcggccgc cctactccta ctcggcgctc atcgccatgg ccatccagag cgcgccgctg 360
cggaagctga cgctcagcca gatctaccag tacgtggctg gtaacttccc tttctacaag 420
cgcagcaagg cgggctggca gaactccatc cgccacaacc tgtcgctcaa cgactgcttc 480
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aactgcgaga agatgtttga caacgggaac ttccgaagga agaggaagag gagagctgaa 600
gccagcgcgg ccgtgcgctc gggagccagg agcgtgggag gggccgaggc gccagcgctg 660
gagcccccga gcgcggcttg cctggacctg caggcctcgc cctctccatc cgcacccgag 720
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accttccccg ggggcctggc gggcgacttt tctttcggga ggcggccacc gacagtcgcc 840
acccacgctc cccagaccct taacccctcc cctggcttcg cccctggcca ccagaccgcg 900
gccgccggct tccgcctcag tcacctcctc tacagccggg aagggaccga agtttgaagg 960
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ctggtgacag ccccacgtgt tggcgttgaa ggccttggtg ccctgggagg aagcgcagag 1080
ccgggggcgg ctcggccagc agggagctgg gctgagcggc tcttgggctt tggggtgggt 1140
ggcccttctg ctgtgcaccc ctcacccagg cgaccttcgg aacctccctg ctctgcctct 1200
aagtccagcc gccctgggcg tctagaacct gtgctctcga gggatttgcc ttgaaggggc 1260
ggcgggtcgg ccctcagctc cagcgttttc caaggaggct ggctgactcc aaagagcctt 1320
agagcagatg ggaagaaggt gggctgccag agcggcccag gtggtggggg ccctttccac 1380
ctccacccag cttggcccac ctggctcagg gccttccctt ctgcttcagg gaagctgccg 1440
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tgcagtgagg ggatctgaga cagttggcat tgggtcctgt gtaaggaagg tcttgctaat 1560
ggttggaact gctggtggtg ggagggagaa gcactgcgtg ggcagaaagc gcccttggga 1620
taccagctcc cttccctgtc actcagccct ggtccttgat gacccccctc taggacaagg 1680
caactcccca gggccccgcc accactgacc acaggagcgg tgcccagcac ccaggagttc 1740
cccaagggtc caggtttgtg ccacccacac ccacactcac acccacactc acacccacac 1800
tcacacccac acccacaccc acacccacac tcacactcac actcacaccc acactcacac 1860
ccacactcac acccacaccc acacccacac tcacacacac tcacacccac acccacactc 1920
acacccacac acactcacac ccacacacac ccacactcat actcacactc acacccacac 1980
tcacaccaca cccacactca cactgacacc cacactcaca cccacactca cactgacacc 2040
cacactcaca cccacactca tactcacact cacacccaca ctcacactca cacccacact 2100
cacaccacac tcacacccac acacacccac actcatactc acacccacac ccacactcat 2160
actcacacac ccacacccac acccacaccc acacccacac ccacacccac actcacacag 2220
gctcatggaa ggccacactt gttttggtct ctttcccctc caaacccaca gtttgagcca 2280
aagctgtgcg tgtgttcaga gctcctgaac agcagcctcc tgtgtaaatt gaaccctgcc 2340
ccacccagtt ccttcttagg gatggtatct ttgtgaagga caaggagccc ccagtcactg 2400
ggaagaggaa ttttttggcc tctgtactcc ttagaggacc taagtgcccc agtcagatgc 2460
cctgagtctt tgtggcatct gggactccct ggagatggag acgttggtgg ggggggggta 2520
cccaccttgt tgttgatggg ggtacctatc ttccctgcat tttgggggag ggtgggaggg 2580
gtccttccca ggaagagagt ggagacaggt tactgttact ttggagtggg acaggctggt 2640
ttagcaatcc taagccccag ccacgcaggt attcctgatc tgcctgcagg gcccctcact 2700
gcagctgcca ccagtgctgg aaatgagagc agggctcctg actgtcccta gagctgactc 2760
atcatggccc tgctgaagag tgaggtgtgt gtgtgtgtgt gcgtgtgtgc gtaagacaga 2820
gagggaggga gaaggaagga ggcgggggaa catggagaga aggagccagg agttgggata 2880
aacctggccc tggtcatatg tttcatcagc agtggctcct aactccacgt gccatctctg 2940
ctgctgccct ccacaagcag gtgagcagag tgccagttgt gttgaaggtg atgatgtcgc 3000
ctaactaaac tcacaaccaa cccgcaatct ctcttggggg gacactcccc ataagcaata 3060
caattaaaga agaccaggaa aggaaaataa attccttagc ttatacattt aaaaagtatc 3120
ccttgaacct attttaatag aatgaaatgc taaaaataaa gaccaatata acatacat 3178
<210> 21
<211> 1319
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
ctccacaccg ccttgcaagc tgagggagcc ggctccggcc tctgccagcc caggaagggg 60
ctcccacagt gcagcggcgg gctgaaggac tcctcaagtg ccaccaaagt gggagcccag 120
gcagaggagg cgccgagagc gagcgagggc tgcctgccag cacgctgtca cgtctcagca 180
atagactgct cttgaggctg gagtgcaatg ttgttatcat agctcactgc aacctggaac 240
ccctagtctc aagagatcct ccagcctcag cctccctggg atggctattt ttgttacttc 300
tgaattctac tacaaaagag tgctgcaata aaaatctttg aacaagttct aatgccgttc 360
aactggaatt gaagttttca atcgttggat atgtcaaaat ttaatcagat tgtatattgc 420
tcaattactt tcaaattatg tacaccaagt cattcttgct ctggcaaaat aagaatattt 480
tcattaatat atcattcaac ttgaaattgc ccagcttttc cttctcattt ccccccagtc 540
aaatgagttg aattaatact gtctaaaaat atatattcat ttgcttacct gttagtattt 600
gttccatgta ttaagaagct ttgctagtat atgaaaatat atgtattacc atgtcttgtg 660
aattagtact tttatcattt tgaaatgttt gttttcattt ctgctgaccg ttctaacctg 720
ggtatctatt ttgactggtt tttaatgtaa ctactaacat ctttttatgt tcagcacttt 780
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ggtggtcttg ttttattgta aatcaagtga caatctctat ttcataattg acatatttaa 900
tccatatata tttaatttaa ttgttgttat tttgagactt aatatccagt tttactattt 960
tggcccattt atttttggtt tattttagat gtcttgcctt atcttagatt gattgatatt 1020
tttagtattt aattacattt cttttataaa tgtaatttct tgaatatttg tttttatttt 1080
agcaattgct ctgggaatat aaaaatcatc tttaaaatct atttagagtt aatggtacta 1140
ctttatgcag taggtaaaaa catttcacta gcacaatttc atttgcaggc acctaacctt 1200
ctgtgatagt attgtcttat attgttatat ttatgagata caatcactac agtaaaatac 1260
tattttctat tcattgtgcc atcttataaa taaacagatg aataaacaga tatttttga 1319
<210> 22
<211> 670
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
ctccacaccg ccttgcaagc tgagggagcc ggctccggcc tctgccagcc caggaagggg 60
ctcccacagt gcagcggcgg gctgaaggac tcctcaagtg ccaccaaagt gggagcccag 120
gcagaggagg cgccgagagc gagcgagggc tgcctgccag cacgctgtca cgtctcagca 180
atagactgct cttgaggctg gagtgcaatg ttgttatcat agctcactgc aacctggaac 240
ccctagtctc aagagatcct ccagcctcag cctccctgtt ccaggataca tgtgcaggat 300
gtgcaagttt gctacatggg taaatatgtg ccatggcagt ttgctgcatc tattaaccca 360
ttacctaggt attaagcccg atacaagagt tatggaaaag ctgcactctt ctacttccaa 420
agtttaactt cttcacagaa gtcagtttca gagttgagaa aagcaaatac ttgctacata 480
ttttgaggaa caataagtat tgaagttgca aacaggttct atggatattt gtcaacagaa 540
gatagctgat cacaaatgcg cagagaggta gaaaaatgac acaatgacca ccctaccctc 600
tgagtcagca aattgttttc tcagtacatt tctactctgg tccttgttta ataaaacctc 660
tttctcctta 670
<210> 23
<211> 540
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
ctccacaccg ccttgcaagc tgagggagcc ggctccggcc tctgccagcc caggaagggg 60
ctcccacagt gcagcggcgg gctgaaggac tcctcaagtg ccaccaaagt gggagcccag 120
gcagaggagg cgccgagagc gagcgagggc tgcctgccag cacgctgtca cgtctcagca 180
atagactgct cttgaggctg gagtgcaatg ttgttatcat agctcactgc aacctggaac 240
ccctagtctc aagagatcct ccagcctcag cctccctgtt ccaggataca tgtgcaggat 300
gtgcaagttt gctacatggg taaatatgtg ccatggcagt ttgctgcatc tattaaccca 360
ttacctaggt attaagcccg gaaataagaa tggcagaaat gtgaagagtt attgtgtggg 420
gaagtggcct ctacatagaa atgtttttcc actgaatgtt cctgttgtgc tgatgaacaa 480
aggagttcat cacaggccag aaactaagat agatagataa ataaataaat aaataaataa 540
<210> 24
<211> 195
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
ctgccaccca ggctagagtg caatggcatg accatagctc actgctacct caaacacctg 60
ggctcaagtg atccccctgc ctcagcctct caattccagg atacatgtgc aggatgtgca 120
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taggtattaa gcccg 195
<210> 25
<211> 2716
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
gtgagggaat tccgtgtgtg ggaaccgtgg ggaggagctg ccaggattca ggagtttcct 60
gggtgaggcg tggccacaac ggacactcct gctttgtact agaaggaaga agtatggagt 120
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ccagatccca ggagagcccc tctgcccctt cggacctcgt ctcccatcta caaaacgtga 240
agattggccc agttagcgtg tctctacaaa aaggtgcata taccactgcc ccgctgcagg 300
ctgatctgag aaagcctctg gcccagggca gataccgcca tggccttcct gatgcacctg 360
ctggtctgcg tcttcggaat gggctcctgg gtgaccatca atgggctctg ggtagagctg 420
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tgcctttccg aagtgcccat catcttcacc ctgctgggcg tgggaaccgt cacctgcatc 600
atctttgcct tcctctggaa tatgacctcc tgggtgctgg acggccacca cagcatcgcc 660
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ccgttcatga gccggctgcc cacctactac ctcaccacct tctttgtggg tgaaggactc 780
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aatgtcactg agatatcaga cagcgtacca agccctgtac ccacgaggga gactgacatc 900
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ccagcctagg caggccgccg accccgcccc catcgctcac ggacggaact ggggtccaga 1800
gaggccaggt cacagagcaa ggggcaggaa cagagagaca gagcctgagt aattgaatca 1860
tgaacgcaag tgcccactgg ggactgtggg gaagatggca cctggaaatg caaggtgcgg 1920
ctctatcccc aactctgtgt cacactacct gtgacgacca gctcagatct cctttgcttt 1980
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agggaaacag ctgggacagc cggctgtccc ttcaggctgt gtgaccttgg gaaagtcatt 2100
tggcttctct gtgcctgttt cttcatgcat gcagtgggga ttccagtaag taccaactac 2160
ctcacaggca tggcacggag gcaaaaggaa aaagcagccc gcatcaagca agccctcctg 2220
ggccacctgc tgatctgaca gtccatcgta gtaacaagag tggcagtctg cacaacctag 2280
aagtggccag aagggttgag acacgcccct gccctctctc ctttgcccct cagtctcaca 2340
gaggggcttc tacaagacaa gcagataacg atagaatctt gggcatcttg gctttcggat 2400
tctcagtgtg gagggacgta gtaccccaca caccccttcc tgtcatcctt cctggcccat 2460
aaagcccact agttggagag taagtaccct cctggaagcc gggagagatg atttgctggt 2520
ggggctgggg aaggcccatc cctgagcctc tgaaagtgaa ctccccgacc aggttgggga 2580
ccagacatgc agagcccctg gaagtattct ctcaaatgga ggcaacagag gtgattgtta 2640
ttttgtttta gtttctgttt ttcatttttt taaataaagg cattccctgc ttttaaaaaa 2700
aaaaaaaaaa aaaaaa 2716
<210> 26
<211> 2624
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
atgcagagcg gctggggaac tggaccagca gaaggaagaa gtatggagtt aaagactgca 60
gcgtgaactg aggagtcccg gacaggccgc ttgctgcaga ggatccagtc cagatcccag 120
gagagcccct ctgccccttc ggacctcgtc tcccatctac aaaacgtgaa gattggccca 180
gttagcgtgt ctctacaaaa aggtgcatat accactgccc cgctgcaggc tgatctgaga 240
aagcctctgg cccagggcag ataccgccat ggccttcctg atgcacctgc tggtctgcgt 300
cttcggaatg ggctcctggg tgaccatcaa tgggctctgg gtagagctgc ccctgctggt 360
gatggagctg cccgagggct ggtacctgcc ctcctacctc acggtggtca tccagctggc 420
caacatcggg cccctcctgg tcaccctgct ccatcacttc cggcccagct gcctttccga 480
agtgcccatc atcttcaccc tgctgggcgt gggaaccgtc acctgcatca tctttgcctt 540
cctctggaat atgacctcct gggtgctgga cggccaccac agcatcgcct tcttggtcct 600
caccttcttc ctggccctgg tggactgcac ctcttcagtg accttcctgc cgttcatgag 660
ccggctgccc acctactacc tcaccacctt ctttgtgggt gaaggactca gcggcctctt 720
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ggcctgctgc ctcgtggcgt tctttgtcct ccagcgtcaa cccaggtgct gggaggcttc 1020
cgtggaagac ctcctcaatg accaggtcac cctccactcc atccggccgc gggaagagaa 1080
tgacttgggc cctgcaggca cggtggacag cagccagggc caggggtatc tagaggagaa 1140
agcagccccc tgctgcccgg cgcacctggc cttcatctat accctggtgg ccttcgtcaa 1200
cgcgctcacc aacggcatgc tgccctctgt gcagacctac tcctgcctgt cctatgggcc 1260
agttgcctac cacctggctg ccaccctcag cattgtggcc aaccctcttg cctcgttggt 1320
ctccatgttc ctgcctaaca ggtctctgct gttcctgggg gtcctctccg tgcttgggac 1380
ctgctttggg ggctacaaca tggccatggc ggtgatgagc ccctgccccc tcttgcaggg 1440
ccactggggt ggggaagtcc tcattgtggc ctcgtgggtg cttttcagcg gctgcctcag 1500
ttacgtcaag gtgatgctgg gcgtggtcct gcgcgacctc agccgcagcg ccctcttgtg 1560
gtgcggggcg gcggtgcagc tgggctcgct gctcggagcg ctgctcatgt tccctctggt 1620
caacgtgctg cggctcttct cgtccgcgga cttctgcaat ctgcactgtc cagcctaggc 1680
aggccgccga ccccgccccc atcgctcacg gacggaactg gggtccagag aggccaggtc 1740
acagagcaag gggcaggaac agagagacag agcctgagta attgaatcat gaacgcaagt 1800
gcccactggg gactgtgggg aagatggcac ctggaaatgc aaggtgcggc tctatcccca 1860
actctgtgtc acactacctg tgacgaccag ctcagatctc ctttgctttg actctcaaga 1920
gaggactgat ttgcagcatc tagctggagg caggcccaag ggtgttagaa gggaaacagc 1980
tgggacagcc ggctgtccct tcaggctgtg tgaccttggg aaagtcattt ggcttctctg 2040
tgcctgtttc ttcatgcatg cagtggggat tccagtaagt accaactacc tcacaggcat 2100
ggcacggagg caaaaggaaa aagcagcccg catcaagcaa gccctcctgg gccacctgct 2160
gatctgacag tccatcgtag taacaagagt ggcagtctgc acaacctaga agtggccaga 2220
agggttgaga cacgcccctg ccctctctcc tttgcccctc agtctcacag aggggcttct 2280
acaagacaag cagataacga tagaatcttg ggcatcttgg ctttcggatt ctcagtgtgg 2340
agggacgtag taccccacac accccttcct gtcatccttc ctggcccata aagcccacta 2400
gttggagagt aagtaccctc ctggaagccg ggagagatga tttgctggtg gggctgggga 2460
aggcccatcc ctgagcctct gaaagtgaac tccccgacca ggttggggac cagacatgca 2520
gagcccctgg aagtattctc tcaaatggag gcaacagagg tgattgttat tttgttttag 2580
tttctgtttt tcattttttt aaataaaggc attccctgct ttta 2624
<210> 27
<211> 3133
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
atgcagagcg gctggggaac tggaccagca gaaggaagaa gtatggagtt aaagactgca 60
gcgtgaactg aggagtcccg gacaggccgc ttgctgcaga ggatccagtc cagatcccag 120
gagagcccct ctgccccttc ggacctcgtc tcccatctac aaaacgtgaa gattggccca 180
gttagcgtgt ctctacaaaa aggtgcatat accactgaag ctgctttgtt tgcttttgtg 240
tgtcggattg aacttttctt tcatgaatca cggttaggaa aggcttctct tgttttctgc 300
taataaaaag acagcttggg ccaggcgtgg tggctcacac tgtaatccca gcactttggg 360
aggccgaggc aggcggatca cctgaggcca ggagttcgag accagcctga ccaacgtggg 420
gaaaccctgt ttccactaaa aatacaaaat tagctggcat ggtggcatgc acctgtaatc 480
ccagctattt gggaaactga ggcaggagaa tcacttgagc ccaggaggca gagggtcact 540
gagccgagat catcccattg cactccagcc tggactaaaa gagtgaaact atgtctcaaa 600
ggaaaaaaaa aaaagccagc ttgttcacag gaaggggagt aataagagaa aactctgggc 660
cccaggtccc agcatcttgc taggtggtga agctggaatt actcacctgg tgtccttctc 720
tgccagcccc gctgcaggct gatctgagaa agcctctggc ccagggcaga taccgccatg 780
gccttcctga tgcacctgct ggtctgcgtc ttcggaatgg gctcctgggt gaccatcaat 840
gggctctggg tagagctgcc cctgctggtg atggagctgc ccgagggctg gtacctgccc 900
tcctacctca cggtggtcat ccagctggcc aacatcgggc ccctcctggt caccctgctc 960
catcacttcc ggcccagctg cctttccgaa gtgcccatca tcttcaccct gctgggcgtg 1020
ggaaccgtca cctgcatcat ctttgccttc ctctggaata tgacctcctg ggtgctggac 1080
ggccaccaca gcatcgcctt cttggtcctc accttcttcc tggccctggt ggactgcacc 1140
tcttcagtga ccttcctgcc gttcatgagc cggctgccca cctactacct caccaccttc 1200
tttgtgggtg aaggactcag cggcctcttg cccgccctgg tggctcttgc ccagggctcc 1260
ggtctcacta cctgcgtcaa tgtcactgag atatcagaca gcgtaccaag ccctgtaccc 1320
acgagggaga ctgacatcgc acagggagtt cccagagctt tggtgtccgc cctccccgga 1380
atggaagcac ccttgtccca cctggagagc cgctaccttc ccgcccactt ctcacccctg 1440
gtcttcttcc tcctcctatc catcatgatg gcctgctgcc tcgtggcgtt ctttgtcctc 1500
cagcgtcaac ccaggtgctg ggaggcttcc gtggaagacc tcctcaatga ccaggtcacc 1560
ctccactcca tccggccgcg ggaagagaat gacttgggcc ctgcaggcac ggtggacagc 1620
agccagggcc aggggtatct agaggagaaa gcagccccct gctgcccggc gcacctggcc 1680
ttcatctata ccctggtggc cttcgtcaac gcgctcacca acggcatgct gccctctgtg 1740
cagacctact cctgcctgtc ctatgggcca gttgcctacc acctggctgc caccctcagc 1800
attgtggcca accctcttgc ctcgttggtc tccatgttcc tgcctaacag gtctctgctg 1860
ttcctggggg tcctctccgt gcttgggacc tgctttgggg gctacaacat ggccatggcg 1920
gtgatgagcc cctgccccct cttgcagggc cactggggtg gggaagtcct cattgtggcc 1980
tcgtgggtgc ttttcagcgg ctgcctcagt tacgtcaagg tgatgctggg cgtggtcctg 2040
cgcgacctca gccgcagcgc cctcttgtgg tgcggggcgg cggtgcagct gggctcgctg 2100
ctcggagcgc tgctcatgtt ccctctggtc aacgtgctgc ggctcttctc gtccgcggac 2160
ttctgcaatc tgcactgtcc agcctaggca ggccgccgac cccgccccca tcgctcacgg 2220
acggaactgg ggtccagaga ggccaggtca cagagcaagg ggcaggaaca gagagacaga 2280
gcctgagtaa ttgaatcatg aacgcaagtg cccactgggg actgtgggga agatggcacc 2340
tggaaatgca aggtgcggct ctatccccaa ctctgtgtca cactacctgt gacgaccagc 2400
tcagatctcc tttgctttga ctctcaagag aggactgatt tgcagcatct agctggaggc 2460
aggcccaagg gtgttagaag ggaaacagct gggacagccg gctgtccctt caggctgtgt 2520
gaccttggga aagtcatttg gcttctctgt gcctgtttct tcatgcatgc agtggggatt 2580
ccagtaagta ccaactacct cacaggcatg gcacggaggc aaaaggaaaa agcagcccgc 2640
atcaagcaag ccctcctggg ccacctgctg atctgacagt ccatcgtagt aacaagagtg 2700
gcagtctgca caacctagaa gtggccagaa gggttgagac acgcccctgc cctctctcct 2760
ttgcccctca gtctcacaga ggggcttcta caagacaagc agataacgat agaatcttgg 2820
gcatcttggc tttcggattc tcagtgtgga gggacgtagt accccacaca ccccttcctg 2880
tcatccttcc tggcccataa agcccactag ttggagagta agtaccctcc tggaagccgg 2940
gagagatgat ttgctggtgg ggctggggaa ggcccatccc tgagcctctg aaagtgaact 3000
ccccgaccag gttggggacc agacatgcag agcccctgga agtattctct caaatggagg 3060
caacagaggt gattgttatt ttgttttagt ttctgttttt cattttttta aataaaggca 3120
ttccctgctt tta 3133
<210> 28
<211> 1172
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
tggaaagcta cacgtgtgag cctagaggcg ggtcccggtt gcagacttgc catggcctcc 60
gaagcttctg tgcgtctagg ggtgccccct ggccgtctgt ggatccagag gcctggcatc 120
tacgaagatg aggaggggag aacctgggtg actgtggtcg tgcggttcaa tccctcgcgt 180
agggaatggg ccagggcctc ccagggcagc agatatgaac ccagcatcac agtgcacttg 240
tggcagatgg cagtgcatac ccgggagcta ctctcctccg gccagatgcc cttctcccag 300
ctgcccgccg tgtggcagct ctaccccggg aggaagtacc gagcagcgga ttccagtttc 360
tgggaaatag cagaccatgg ccagattgac tctatggagc agctggtcct aacatatcag 420
ccggagagga aagactgaca ctgggagtgg ctggccctgc tggccctgcc tcttctggcc 480
tggtgtctcc tcatgccccc tcagtgagga tcttcatgta cctgctcttc tgtttgcaca 540
cccagcatag cctccttgca ggcagaaggc agtagggccc ctgcacactc agtttctctc 600
gttttcctta gttatcagtc ctgtcctgtc ccactcaggt ctgtacttag ggcagctggc 660
ctggatgggc ttcactgggg ccctgtctgt gtgctgagcc agtttcccct gctggctgca 720
agctgtgggt tctttctcct ctgtgcccct catgctgatc ttctagatgc cactcccaaa 780
tccccttcat acccaccagg atgtgtgccc agccaggcct ccagcacccc cagtgcagct 840
cgtgattgga aactcaccat cggcaggcag tggttcggtt taagagatgg cattagaggg 900
agcccagtct ggatgtggac ttggatgccc tgtgggtatc agttctgctg acactttggc 960
ccgaaataga tccagtgctg agcaagcaat gtacaccaga gcctcagtga gcccatctgc 1020
acagtgggga gcatggaggg atgggtttgg cctgtgcttc tgcttattca gtccttcagc 1080
tcacggaagg gatgctagtc cgtgaaggtg acctcacagt actggttaat taaactttat 1140
tgctcactgt ccacttttgt gctgaaaaaa aa 1172
Claims (82)
- 만능 줄기 세포를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 다수의 세포를 포함하는 관심 샘플을 얻는 단계;
(b) 적어도 하나의 마커 유전자의 발현을 검출하기 위해 상기 관심 샘플을 분석하는 단계이고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하며; 및
(c) 상기 적어도 하나의 마커 유전자의 발현이 상기 관심 샘플에서 검출되는 경우, 상기 관심 샘플이 만능 줄기 세포를 함유하는 것으로 결정하는 단계. - 제1항에 있어서, 관심 샘플이 유도 만능 줄기 세포를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 관심 샘플이 배아 만능 줄기 세포를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 관심 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 액적 디지털 중합효소연쇄반응(dd-PCR), 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군에서 선택되는 기술을 포함하는 프로세스에 의해 검출되는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 기술은 마이크로어레이 분석 또는 차세대 서열분석을 포함하는 방법.
- 만능 줄기 세포를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 다수의 세포를 포함하는 관심 샘플을 얻는 단계;
(b) 상기 관심 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계이고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하며;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 만능 줄기 세포를 실질적으로 포함하지 않으며; 및
(d) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준이 상기 기준 발현 수준보다 큰 경우, 상기 관심 샘플이 만능 줄기 세포를 함유하는 것으로 결정하거나, 또는
단계 (b)에서 검출된 발현 수준이 상기 기준 발현 수준 이하인 경우, 상기 관심 샘플이 만능 줄기 세포를 실질적으로 함유하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 샘플 내 만능 줄기 세포의 수를 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 다수의 세포를 포함하는 관심 샘플을 얻는 단계;
(b) 상기 관심 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 적어도 90% 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현함 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과의 동일성;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계(상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어짐), 여기서 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 만능 줄기 세포를 포함하고, 상기 적어도 하나의 기준 샘플 내의 실질적으로 모든 세포는 만능 줄기 세포이고; 그리고
(d) 단계 (c)의 비교에 기초하여 상기 관심 샘플 내 만능 줄기 세포의 양을 계산하는 단계를 포함하는 방법. - 제9항에 있어서, 관심 샘플이 유도 만능 줄기 세포를 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, 관심 샘플이 배아 만능 줄기 세포를 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 관심 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
- 제9항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 방법.
- 제9항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 방법.
- 제14항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 과정에 의해 검출되는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 관심 샘플이 유도 만능 줄기 세포를 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 관심 샘플이 배아 만능 줄기 세포를 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 관심 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
- 제10항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 방법.
- 제10항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 방법.
- 제20항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 과정에 의해 검출되는 것인 방법.
- 치료제에서 잔여 iPSC를 검출하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은
(a) iPSC로부터 생산된 치료제 샘플을 얻는 단계이고, 상기 샘플은 다수의 세포를 함유하고,
(b) 적어도 하나의 마커 유전자의 발현을 검출하기 위해 상기 샘플을 분석하는 단계이고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고; 및
(c) 상기 적어도 하나의 마커 유전자의 발현이 상기 샘플에서 검출되는 경우, 상기 치료제가 잔여 iPSC를 포함하는지 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 제23항에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 분석법.
- 제23항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제23항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제25항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
- 치료제 중 잔여 iPSC의 수를 정량화하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은
(a) iPSC로부터 생산된 치료제 샘플을 얻는 단계이고, 상기 샘플은 다수의 세포를 함유하고,
(b) 상기 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 iPSC를 포함하고, 상기 적어도 하나의 기준 샘플 내의 실질적으로 모든 세포는 iPSC이고; 및
(d) 단계 (c)의 비교에 기초하여 상기 치료제 중 잔류 iPSC의 수를 정량화하는 단계를 포함하는 분석법. - 제28항에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 분석법.
- 제28항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제28항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제30항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
- 치료제에서 잔류 iPSC를 검출하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은,
(a) iPSC로부터 생산된 치료제 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플은 다수의 세포를 함유함,
(b) 상기 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 샘플에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보성 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하는 것인 단계 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 만능 줄기 세포를 실질적으로 포함하지 않으며; 및
(d) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준이 상기 기준 발현 수준보다 높은 경우, 상기 치료제가 잔류 iPSC를 포함하는지 결정하거나, 또는
단계 (b)에서 검출된 발현 수준이 상기 기준 발현 수준 이하인 경우, 상기 치료제가 잔류 iPSC를 실질적으로 함유하지 않는다고 결정하는 단계를 포함하는 분석법. - 제33항에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 분석법.
- 제33항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제33항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제35항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
- 다양한 분화 시점에 치료제 내 잔류 iPSC 수를 정량화하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은
(a) 치료제의 첫 번째 샘플을 얻는 단계이고, 상기 첫 번째 샘플은 첫 번째 분화 시점에 또는 분화가 시작되기 전에 얻어지며, 상기 첫 번째 샘플은 복수의 세포를 포함하며;
(b) 서로 다른 분화 시간에 복수의 세포를 함유하는 치료제의 하나 이상의 추가 샘플을 얻는 단계;
(c) (a) 및 (b)에서 얻은 샘플에서 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 하나 이상의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열 뉴클레오티드를 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고; 및
(d) 단계 (c)의 측정에 기초하여, 다양한 분화 시간에 상기 치료제 내 iPSC의 수를 정량화하는 단계;를 포함하는 분석법. - 제38항에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 분석법.
- 제38항에 있어서, 단계 (c)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제38항에 있어서, 단계 (c)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제40항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
- 차별화된 제품의 순도를 결정하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은
(a) 분화된 생성물의 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플은 다수의 세포를 함유하고 있는 단계;
(b) 상기 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 iPSC를 포함하고, 상기 적어도 하나의 기준 샘플 내의 실질적으로 모든 세포는 iPSC이고; 및
(d) 단계 (c)의 비교에 기초하여 상기 샘플 내 iPSC의 양을 계산하여 차별화된 생성물의 순도를 결정하는 단계;를 포함하는 분석법. - 제43항에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 분석법.
- 제43항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제43항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제45항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
- 차별화된 제품의 순도를 결정하기 위한 분석법으로서, 상기 분석법은,
(a) 분화된 생성물의 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플은 다수의 세포를 함유하고 있는 단계;
(b) 상기 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보성 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하는 것인 단계;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 만능 줄기 세포를 실질적으로 포함하지 않으며; 그리고
(d) 단계 (c)의 비교에 기초하여 상기 샘플 내 iPSC의 양을 계산하여 차별화된 생성물의 순도를 결정하는 단계;를 포함하는 분석법. - 제48항에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 분석법.
- 제48항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현이 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제48항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 분석법.
- 제50항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법에 의해 검출되는 분석법.
- iPSC 집단의 분화 능력을 평가하는 방법으로서,
(a) iPSC 집단의 첫 번째 샘플을 얻는 단계로서, 상기 첫 번째 샘플은 상기 iPSC의 분화가 유도되기 전에 얻어지며, 상기 첫 번째 샘플은 복수의 세포를 포함하고;
(b) iPSC 집단의 적어도 하나의 추가 샘플을 얻는 단계로서, 상기 적어도 하나의 추가 샘플은 상기 iPSC의 분화가 유도된 후에 얻어지며, 상기 적어도 하나의 추가 샘플은 다수의 세포를 포함하며;
(c) (a) 및 (b)에서 얻은 샘플에서 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 하나 이상의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 검출된 서로 다른 샘플의 발현 수준을 서로 및/또는 참조 발현 수준과 비교하여 상기 iPSC 집단에서 iPSC의 분화 능력을 평가하는 단계;를 포함하는 방법. - 제53항에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
- 제53항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 것인 방법.
- 제53항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 것인 방법.
- 제55항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 과정에 의해 검출되는 것인 방법.
- iPSC 집단의 만능성을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) iPSC 집단의 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플은 복수의 세포를 포함하는 단계;
(b) 상기 샘플에서 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고;
(c) 단계 (b)에서 검출된 발현 수준을 기준 발현 수준과 비교하는 단계이고, 상기 기준 발현 수준은 하나 이상의 기준 샘플에서 상기 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 얻어지며, 상기 하나 이상의 기준 샘플은 복수의 세포를 포함하며, 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 iPSC를 포함하고, 상기 적어도 하나의 기준 샘플 내의 실질적으로 모든 세포는 분화가 가능한 iPSC이고; 및
(d) 단계 (c)의 비교에 기초하여 상기 iPSC 집단에서 iPSC의 만능성을 평가하는 단계;를 포함하는 방법. - 제58항에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
- 제58항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현이 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 방법.
- 제58항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 것인 방법.
- 제60항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 과정에 의해 검출되는 것인 방법.
- iPSC 집단의 만능성을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) iPSC 집단의 첫 번째 샘플을 얻는 단계이고, 상기 첫 번째 샘플은 상기 iPSC의 분화가 유도되기 전에 얻어지며, 상기 첫 번째 샘플은 복수의 세포를 포함하며;
(b) iPSC 집단의 적어도 하나의 추가 샘플을 얻는 단계이고, 상기 적어도 하나의 추가 샘플은 상기 iPSC의 분화가 유도된 후에 얻어지며, 상기 적어도 하나의 추가 샘플은 다수의 세포를 포함하며;
(c) (a) 및 (b)에서 얻은 샘플에서 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 하나 이상의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고;
(d) 단계 (c)에서 검출된 다양한 샘플의 발현 수준을 서로 및/또는 기준 발현 수준과 비교하여 상기 iPSC 집단에서 iPSC 세포의 만능성을 평가하는 단계를 포함하는 방법. - 제63항에 있어서, 상기 샘플 내 상기 다수의 세포가 세포 혼합물, 세포 집합체 또는 조직의 형태인 방법.
- 제63항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현이 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 검출되는 방법.
- 제63항에 있어서, 단계 (b)에서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 발현된 단백질의 수준을 측정함으로써 검출되는 방법.
- 제65항에 있어서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현은 dd-PCR, 중합효소연쇄반응(PCR), 역-전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR, 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 혼성화 분석 및 차세대 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 과정에 의해 검출되는 것인 방법.
- 치료제에서 잔류 iPSC를 검출하기 위한 분석 키트로서, 상기 분석 키트는 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출하는데 적합한 적어도 하나의 시약을 포함하며, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 상응하는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상보성 DNA(cDNA) 서열을 가진 전사체를 발현하는 분석 키트.
- 제68항에 있어서, 상기 시약이 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산, 프로브 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하고, 상기 하나 이상의 마커 유전자가 포함되는 분석 키트.
- 치료제에서 잔여 iPSC를 검출하기 위한 분석 시약으로서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있으며, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 상응하는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사체를 발현하고, 및
상기 시약은 핵산, 프로브, 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하는 분석 시약. - 치료제 내 iPSC의 수를 정량하기 위한 분석 키트로서, 상기 분석 키트는 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출하는데 적합한 적어도 하나의 시약을 포함하고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는, SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사체를 발현하는 분석 키트.
- 제71항에 있어서, 상기 시약이 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산, 프로브 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자가 포함되는 분석 키트.
- 치료제 내 iPSC의 수를 정량하기 위한 분석 시약으로서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있으며, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열 전사물을 발현하고: 및
상기 시약은 핵산, 프로브, 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하는 분석 시약. - 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출하는데 적합한 적어도 하나의 시약을 포함하는, 분화된 생성물의 순도를 결정하기 위한 분석 키트로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사체를 발현하는 분석 키트.
- 제74항에 있어서, 상기 시약이 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산, 프로브 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자가 포함되는 분석 키트.
- 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 차별화된 산물의 순도를 결정하기 위한 분석 시약으로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 가진 전사체를 발현하고,
상기 시약은 핵산, 프로브, 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하는 분석 시약. - iPSC 집단의 분화 능력을 평가하기 위한 분석 키트로서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출하는데 적합한 적어도 하나의 시약을 포함하는 분석 키트로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하는 분석 키트.
- 제77항에 있어서, 상기 시약이 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산, 프로브 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자가 포함되는 분석 키트.
- iPSC 집단의 분화 능력을 평가하기 위한 분석 시약으로서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있으며, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사물을 발현하고,
상기 시약은 핵산, 프로브, 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하는 분석 시약. - iPSC 집단의 만능성을 평가하기 위한 분석 키트로서, 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출하는데 적합한 적어도 하나의 시약을 포함하는 분석 키트로서, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 갖는 전사체를 발현하는 분석 키트.
- 제80항에 있어서, 상기 시약이 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산, 프로브 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하고, 상기 하나 이상의 마커 유전자가 포함되는 분석 키트.
- iPSC 집단의 만능성을 평가하기 위한 분석 시약으로서, 상기 시약은 적어도 하나의 마커 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있고, 상기 적어도 하나의 마커 유전자는 SEQ ID NO: 1-5로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상응하는 상보적 DNA(cDNA) 서열을 가진 전사체를 발현하고,
상기 시약은 핵산, 프로브, 또는 하나 이상의 프라이머를 포함하는 분석 시약.
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