KR20230164436A - Method for high-yield production of heme using wild-type S. cerevisiae - Google Patents
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Abstract
본 발명은 헴 생산성이 높은 효모 균주를 선별하고 이를 특정 배지 조성물과 배양 조건을 이용하여 배양함으로써 헴 생산성을 극대화시킨 야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 유전적 변형없이 안전성이 입증된 식품 공정에 이미 사용되고 있는 야생형 효모 균주를 이용하여 헴을 생산하는 방법을 제공하고자 하는 것으로, 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하는 경우 헴을 저렴한 비용으로 산업적 규모로 대량생산이 가능한 장점이 있다.The present invention relates to a method for high heme production using a wild-type yeast strain that maximizes heme productivity by selecting a yeast strain with high heme productivity and culturing it using a specific medium composition and culture conditions. The present invention seeks to provide a method for producing heme using a wild-type yeast strain that is already used in food processing without genetic modification and whose safety has been proven. When using the method provided by the present invention, heme can be produced on an industrial scale at low cost. It has the advantage of being capable of mass production.
Description
본 발명은 야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 헴 생산성이 높은 효모 균주를 선별하고 이를 특정 배지 조성물과 배양 조건을 이용하여 배양함으로써 헴 생산성을 극대화시킨 야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for high heme production using a wild-type yeast strain. More specifically, the present invention relates to a wild-type yeast strain that maximizes heme productivity by selecting a yeast strain with high heme productivity and culturing it using a specific medium composition and culture conditions. It relates to a method for high production of heme using the method.
지구온난화, 식량부족, 동물복지 등의 문제를 해결하기 위한 해결책으로 대체 단백질 소재에 대한 관심이 높아지고 있다. 또한, 세계적으로 소비자들의 건강에 대한 관심과 함께 채식 인구가 증가하면서 대체육에 대한 관심도 더불어 증가하고 있다. 이러한 사회적 흐름에 부합하여 다양한 대체육 제품의 개발 및 출시가 활발하게 이루어지고 있으며 동물성 육류를 영향학적으로 대체할 수 있는 식물성 대체육 시장이 지속적으로 성장하고 있다. Interest in alternative protein materials is increasing as a solution to problems such as global warming, food shortage, and animal welfare. In addition, as the vegetarian population increases globally along with consumer interest in health, interest in alternative meat is also increasing. In line with this social trend, the development and launch of various alternative meat products is actively taking place, and the market for plant-based meat substitutes that can nutritionally replace animal meat is continuously growing.
초기 식물성 대체육 제조 기술은 조직 식물 단백질 (TVP)을 주원료로 시작되었으며, 원료 다변화와 원료별 특성 연구, 고수분 성형 기술을 이용한 고기의 식감구현, 고기 맛의 핵심 요소인 헴 (heme)의 생명공학기술을 이용한 생산 및 첨가의 순으로 발전해왔다.The early plant-based alternative meat manufacturing technology began with tissue plant protein (TVP) as the main raw material, diversifying raw materials and studying the characteristics of each raw material, realizing the texture of meat using high-moisture molding technology, and the life of heme, a key element of meat taste. It has developed in the order of production and addition using engineering technology.
대체육 시장에서 기술적으로 가장 앞서 있다고 평가받는 푸드테크 기업인 임파서블 푸드 (Impossible Foods)는 육류에 풍미를 내는데 중요한 역할을 하는 헴을 GMO (genetically modified organism) 효모를 이용하여 생산하여 첨가하고 있다 (대한민국 등록특허 10-2229968). 그러나, GMO 유래 식품을 반대하는 소비자들은 GMO 효모를 이용하여 생산된 헴의 소비에 부정적인 인식을 가지고 있다. 한편, 국내에서도 미국, 유럽과 마찬가지로 대체육에 대한 관심이 증가하고, 관련 식품 소비도 증가하고 있으나, 현재 생산되는 대체육은 주요 원료를 대부분 수입에 의존하고 있어 이를 국내산 자원으로 대체하는 연구가 필요한 실정이다. 특히, 국내에서는 GMO 유래 식품에 대한 규제가 강화되는 추세에 있어 GMO 효모를 이용하여 생산된 헴을 대체육에 첨가하는데 제약이 있다. Impossible Foods, a food tech company considered to be the most technologically advanced in the alternative meat market, produces and adds heme, which plays an important role in adding flavor to meat, using GMO (genetically modified organism) yeast (registered in Korea) Patent 10-2229968). However, consumers who oppose GMO-derived foods have a negative perception of the consumption of heme produced using GMO yeast. Meanwhile, in Korea, as in the United States and Europe, interest in alternative meat is increasing and consumption of related foods is also increasing. However, currently produced alternative meat relies on imports for most of its main raw materials, so research on replacing it with domestic resources is needed. This is the situation. In particular, as regulations on GMO-derived foods are being strengthened in Korea, there are restrictions on adding heme produced using GMO yeast to alternative meat.
한편, 헴은 일반적으로 유기용매나 효소적 가수분해에 의해 동물의 혈액에서 추출되기도 하지만, 도축 혈액으로부터 분리, 정제된 헴은 광우병 등과 같이 동물에서 유발될 수 있는 질병의 위험 때문에 안전성이 문제되고, 혈액 내 함량이 낮아 많은 혈액이 필요하며, 이 방법을 이용하는 경우 동물 도축이 반드시 요구되기 때문에 채식을 추구하는 소비자들은 동물을 도축하여 추출된 헴이 함유된 대체육 소비를 선호하지 않는다.Meanwhile, heme is generally extracted from animal blood using organic solvents or enzymatic hydrolysis, but the safety of heme separated and purified from slaughter blood is problematic due to the risk of diseases that can be caused in animals, such as mad cow disease. Because the blood content is low, a lot of blood is required, and because animal slaughter is required when using this method, vegetarian consumers do not prefer to consume alternative meat containing heme extracted from animal slaughter.
효모 (Saccahromyces cerevisiae)는 단세포 진핵생물로 오랜 기간 식품공정에서 주정 및 제빵 용도로 사용되고 있는 GRAS (Generally Recognized as Safe) 균주이다. 본 발명에서는 유전적 변형 없이 안전성이 입증된 야생형 효모를 사용하여 유전적 변형 없이 헴의 생산량을 현저히 향상시킬 수 있는 기술을 개발하고자 하였으며, 식품 산업에 이미 사용되고 있는 다양한 효모 균주를 대상으로 헴 생산 효율이 높은 균주를 일차적으로 선별하고, 헴 생산 균주의 헴 생산 효율을 극대화시킬 수 있는 배지 조성 및 배양 조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다. Yeast ( Saccahromyces cerevisiae ) is a single-celled eukaryote and is a GRAS (Generally Recognized as Safe) strain that has been used for alcohol and baking purposes in food processing for a long time. In the present invention, we sought to develop a technology that can significantly improve the production of heme without genetic modification using wild-type yeast whose safety has been proven, and to improve heme production efficiency for various yeast strains already used in the food industry. The present invention was completed by primarily selecting these high-quality strains and establishing medium composition and culture conditions that could maximize the heme production efficiency of the heme-producing strain.
본 발명에서는 유전자 변형없이 식품으로서 안전성이 입증된 야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법 및 이를 위한 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. The purpose of the present invention is to provide a method for high heme production using a wild-type yeast strain that has proven to be safe as a food without genetic modification, and a medium composition for the same.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 헴 생산방법을 제공한다:To achieve the above object, the present invention provides a heme production method comprising the following steps:
(a) S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 및 S. cerevisiae KCCM 12651로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 균주를 배양하는 단계: 및(a) cultivating one or more strains selected from the group consisting of S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 and S. cerevisiae KCCM 12651: and
(b) 상기 균주로부터 헴을 회수하는 단계.(b) recovering heme from the strain.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 탄소원으로 포도당, 과당 또는 갈락토오스를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, step (a) may be characterized by culturing in a medium containing glucose, fructose, or galactose as a carbon source.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 질소원으로 2 내지 6 %(w/v) 효모 추출물 및 0.1 내지 3 % (w/v) 펩톤을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, step (a) may be characterized by culturing in a medium containing 2 to 6% (w/v) yeast extract and 0.1 to 3% (w/v) peptone as a nitrogen source.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 pH 3 내지 6에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the strain in step (a) may be cultured at pH 3 to 6.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 20 내지 35 ℃에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the strain in step (a) may be cultured at 20 to 35°C.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 40 내지 120시간 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the strain in step (a) may be cultured for 40 to 120 hours.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 50 내지 400 rpm의 교반속도로 회분식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, step (a) may be characterized as batch culture at a stirring speed of 50 to 400 rpm.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 100 내지 1500 rpm의 교반속도로 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, step (a) may be characterized as fed-batch culture at a stirring speed of 100 to 1500 rpm.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 0.5 내지 10 vvm의 속도로 공기를 주입하며 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, step (a) may be characterized by fed-batch culture while injecting air at a rate of 0.5 to 10 vvm.
본 발명은 또한 (i) 탄소원; (ii) 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물; 및 (iii) 0.1 내지 3% (w/v) 펩톤;를 포함하는 S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 및 S. cerevisiae KCCM 12651로 구성된 군에서 선택되는 균주 배양용 배지 조성물을 제공한다.The present invention also relates to (i) a carbon source; (ii) 2 to 6% (w/v) yeast extract; and (iii) 0.1 to 3% ( w / v ) peptone; Provided is a medium composition for cultivating strains selected from the group consisting of:
본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물은 헴 생산용 배지 조성물인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the medium composition is characterized as a medium composition for heme production.
본 발명에 있어서, 상기 탄소원은 3 내지 7% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the carbon source is 3 to 7% (w/v) glucose, fructose or galactose.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 생산된 헴을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.The present invention also provides a food composition comprising heme produced by the above method.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 인공육 또는 육류 대체 식품인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the food is characterized as artificial meat or meat substitute food.
본 발명은 유전적 변형없이 안전성이 입증된 식품 공정에 이미 사용되고 있는 야생형 효모 균주를 이용하여 헴을 생산하는 방법을 제공하고자 하는 것으로, 본 발명에서 제공하는 헴 생산방법 및 배지 조성물을 이용하는 경우 헴을 저렴한 비용으로 산업적 규모로 대량생산이 가능한 장점이 있다.The present invention is intended to provide a method of producing heme using a wild-type yeast strain that is already used in food processing without genetic modification and whose safety has been proven. When using the heme production method and medium composition provided by the present invention, heme can be produced without genetic modification. It has the advantage of being able to be mass-produced on an industrial scale at low cost.
도 1은 효모 균주 세포 내 존재하는 헴을 추출하는 방법을 보여주는 모식도이다.
도 2는 다양한 야생형 효모 균주를 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 3은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 다양한 교반속도(80, 250, 350 rpm)에서 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 4는 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 다양한 탄소원에서 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 5는 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 다양한 질소원에서 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 6은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 질소원 비율의 달리하여 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 7은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 배양하는 기본 배지를 달리하여 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 8은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 pH 3.5 조건에서 40YP20D 배지를 이용하여 유가식 배양한 결과이다. (A)는 세포, 대사체, 헴 농도, (B)는 용존 산소량(DO%), (C)는 Feeding solution 주입속도를 나타낸다.
도 9는 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 pH 4.5 조건에서 40YP20D 배지를 이용하여 유가식 배양한 결과이다. (A)는 세포, 대사체, 헴 농도, (B)는 용존 산소량(DO%), (C)는 Feeding solution 주입속도를 나타낸다.
도 10은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 pH 4.5 조건에서 40YP20D 배지를 이용하여 유가식 배양한 결과이다. Feeding solution으로는 800 g/L의 포도당을 사용하였다. (A)는 세포, 대사체, 헴 농도, (B)는 용존 산소량(DO%), (C)는 Feeding solution 주입속도를 나타낸다.
도 11은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 pH 4.5 조건에서 40YP20D 배지를 이용하여 유가식 배양한 결과이다. 공기주입 속도는 1 vvm, 교반속도는 300 rpm 또는 500 rpm으로 유지하였다. (A)는 세포, 대사체, 헴 농도, (B)는 용존 산소량(DO%), (C)는 Feeding solution 주입속도를 나타낸다.
도 12는 배지 내 첨가한 헴 농도에 따른 S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 성장 곡선(A) 및 세포 내 헴 농도(B)를 비교한 결과이다. Figure 1 is a schematic diagram showing a method for extracting heme present in yeast strain cells.
Figure 2 shows the results of comparing the heme concentration (mg/L) by extracting the heme present in the cells after batch culturing various wild-type yeast strains.
Figure 3 shows the results of batch culturing the S. cerevisiae KCCM 12638 strain at various stirring speeds (80, 250, 350 rpm), extracting the heme present in the cells, and comparing the heme concentration (mg/L).
Figure 4 shows the results of batch culturing S. cerevisiae KCCM 12638 strain on various carbon sources, extracting the heme present in the cells, and comparing the heme concentration (mg/L).
Figure 5 shows the results of comparing the heme concentration (mg/L) by extracting the heme present in the cells after batch culturing the S. cerevisiae KCCM 12638 strain in various nitrogen sources.
Figure 6 shows the results of comparing the heme concentration (mg/L) by extracting the heme present in the cells after batch culturing the S. cerevisiae KCCM 12638 strain with different nitrogen source ratios.
Figure 7 shows the results of comparing the heme concentration (mg/L) by extracting the heme present in the cells after batch culturing the S. cerevisiae KCCM 12638 strain in different basic media.
Figure 8 shows the results of fed-batch culture of S. cerevisiae KCCM 12638 strain using 40YP20D medium under pH 3.5 conditions. (A) represents cells, metabolites, and heme concentrations, (B) represents dissolved oxygen (DO%), and (C) represents feeding solution injection speed.
Figure 9 shows the results of fed-batch culture of S. cerevisiae KCCM 12638 strain using 40YP20D medium under pH 4.5 conditions. (A) represents cells, metabolites, and heme concentrations, (B) represents dissolved oxygen (DO%), and (C) represents feeding solution injection speed.
Figure 10 shows the results of fed-batch culture of S. cerevisiae KCCM 12638 strain using 40YP20D medium under pH 4.5 conditions. 800 g/L of glucose was used as the feeding solution. (A) represents cells, metabolites, and heme concentrations, (B) represents dissolved oxygen (DO%), and (C) represents feeding solution injection speed.
Figure 11 shows the results of fed-batch culture of S. cerevisiae KCCM 12638 strain using 40YP20D medium under pH 4.5 conditions. The air injection speed was maintained at 1 vvm and the stirring speed was maintained at 300 rpm or 500 rpm. (A) represents cells, metabolites, and heme concentrations, (B) represents dissolved oxygen (DO%), and (C) represents feeding solution injection speed.
Figure 12 shows the results of comparing the growth curve (A) and intracellular heme concentration (B) of S. cerevisiae KCCM 12638 strain according to the heme concentration added in the medium.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this specification have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention pertains. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 특징부의 크기, 양 및 물리적 특성을 표현하는 모든 수는 모든 경우 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 명세서 및 특허청구범위에 개시된 수치 파라미터는 본 명세서에 개시된 교시 내용을 이용하여 당업자가 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다.All numbers expressing size, quantity and physical properties of features used in the specification and claims are to be understood in all instances as being modified by the term “about.” Accordingly, unless indicated to the contrary, the numerical parameters disclosed in the specification and claims are approximations that may vary depending on the desired properties sought to be achieved by a person skilled in the art using the teachings disclosed herein.
본 발명에서는 유전자 변형을 유도하지 않고 야생형 효모 균주로부터 헴을 대량생산하는 방법을 제공하고자, 제빵, 양조 등 다양한 식품 산업에 이미 활용되고 있는 다양한 야생형 효모 균주로부터 헴 생산성이 높은 효모 균주를 선별하고, 상기 효모 균주를 다양한 배지 조성 및 배양 조건에서 배양함으로써 헴 생산성을 극대화시킬 수 있는 방법을 개발하였다. In the present invention, in order to provide a method for mass producing heme from wild-type yeast strains without inducing genetic modification, yeast strains with high heme productivity are selected from various wild-type yeast strains already used in various food industries such as baking and brewing, A method to maximize heme productivity was developed by culturing the yeast strain under various medium compositions and culture conditions.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 다음 단계를 포함하는 헴 생산방법에 관한 것이다:Accordingly, the present invention in one aspect relates to a method for producing heme comprising the following steps:
(a) S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 및 S. cerevisiae KCCM 12651로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 균주를 배양하는 단계: 및(a) cultivating one or more strains selected from the group consisting of S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 and S. cerevisiae KCCM 12651: and
(b) 상기 균주로부터 헴을 회수하는 단계..(b) Recovering heme from the strain.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 탄소원으로 포도당, 과당 또는 갈락토오스를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 탄소원은 배지 총 부피에 대하여, 3 내지 7% (w/v), 구체적으로 4 내지 6% (w/v), 가장 구체적으로 약 5% (w/v)로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, step (a) may be characterized as culturing in a medium containing glucose, fructose, or galactose as a carbon source, but is not limited thereto. In the present invention, the carbon source is contained at 3 to 7% (w/v), specifically 4 to 6% (w/v), and most specifically about 5% (w/v) relative to the total volume of the medium. It may be characterized, but is not limited to this.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 질소원으로 효모 추출물 및 펩톤을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 질소원은 배지 총 부피에 대하여, 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물 및 0.1 내지 3 % (w/v) 펩톤, 구체적으로 3 내지 5 % (w/v) 효모 추출물 및 1 내지 2.5 % (w/v) 펩톤, 가장 구체적으로 약 4 % (w/v) 효모 추출물 및 약 2 (w/v) 펩톤을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 펩톤은구체적으로 박토 펩톤일 수 있다.In the present invention, step (a) may be characterized as culturing in a medium containing yeast extract and peptone as a nitrogen source, but is not limited to this. In the present invention, the nitrogen source is 2 to 6% (w/v) yeast extract and 0.1 to 3% (w/v) peptone, specifically 3 to 5% (w/v) yeast extract, based on the total volume of the medium. and 1 to 2.5% (w/v) peptone, most specifically about 4% (w/v) yeast extract and about 2 (w/v) peptone. The peptone may specifically be bacto peptone.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 배양 배지의 산도를 pH 3 내지 6를 유지시키며 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 pH 3.5 내지 5.5, 더 구체적으로 pH 4 내지 5, 가장 구체적으로 약 pH 4.5로 배양 배지의 산도를 유지시키며 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the strain in step (a) may be cultured while maintaining the acidity of the culture medium at pH 3 to 6, specifically pH 3.5 to 5.5, more specifically pH 4 to 5, and most preferably pH 3.5 to 5.5. Specifically, it may be characterized as culturing while maintaining the acidity of the culture medium at about pH 4.5, but is not limited to this.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 배양 배지의 온도를 20 내지 35 ℃로 유지시키며 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 25 내지 33 ℃, 더 구체적으로 26 내지 30 ℃, 더욱 구체적으로 27 내지 29 ℃, 가장 구체적으로 약 28 ℃로 배양 배지의 온도를 유지시키며 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the strain in step (a) may be cultured while maintaining the temperature of the culture medium at 20 to 35 ℃, specifically 25 to 33 ℃, more specifically 26 to 30 ℃, further Specifically, it may be characterized as culturing while maintaining the temperature of the culture medium at 27 to 29°C, most specifically about 28°C, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 40 내지 120 시간 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 42 내지 80시간, 더 구체적으로 44 내지 60 시간, 가장 구체적으로 46 내지 50 시간 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 배양 시간은 원하는 헴의 생성량이 수득될 때까지 계속 될 수 있다.In the present invention, the strain in step (a) may be cultured for 40 to 120 hours, specifically 42 to 80 hours, more specifically 44 to 60 hours, and most specifically 46 to 50 hours. It may be characterized, but is not limited to this, and the culturing time may continue until the desired amount of heme is obtained.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 50 내지 400 rpm의 교반속도로 회분식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며,구체적으로 250 내지 400 rpm, 더 구체적으로 350 내지 400 rpm의 교반속도로 회분식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. In the present invention, step (a) may be characterized as batch culturing at a stirring speed of 50 to 400 rpm, specifically 250 to 400 rpm, more specifically batch culturing at a stirring speed of 350 to 400 rpm. It may be characterized, but is not limited to this.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 100 내지 1500 rpm 의 교반속도로 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 300 내지 1300 rpm, 더 구체적으로 700 내지 1200 rpm의 교반속도로 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. In the present invention, step (a) may be characterized as fed-batch culture at a stirring speed of 100 to 1500 rpm, specifically 300 to 1300 rpm, more specifically 700 to 1200 rpm. It may be characterized by culturing, but is not limited to this.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 0.5 내지 10 vvm의 속도로 공기를 주입하며 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 1 내지 8 vvm, 예컨대, 2 내지 5 vvm의 속도로 공기를 주입하며 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. In the present invention, step (a) may be characterized by fed-batch culture while injecting air at a rate of 0.5 to 10 vvm, specifically, injecting air at a rate of 1 to 8 vvm, for example, 2 to 5 vvm. It may be characterized by injection and fed-batch culture, but is not limited to this.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 배양은 상기 균주를 배양한 전배양액을 그대로 사용하거나, 분리된 균주를 사용하거나 또는 동결 보관된 균주 또는 이의 배양물을 사용할 수 있다. In the present invention, the culture in step (a) can be performed by using the pre-culture medium in which the strain was cultured, by using an isolated strain, or by using a frozen strain or a culture thereof.
본 발명에서 용어, "배양"은 상기 균주를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되며, 구체적으로는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the term “culture” means growing the strain under appropriately artificially controlled environmental conditions. The culture method according to the present invention includes batch culture, continuous culture, and fed-batch culture, and specifically, batch process or injection batch or repeated injection batch process (fed). It can be cultured continuously in a batch or repeated fed batch process, but is not limited to this.
본 발명에 따른 배양은 특별히 한정되지는 않지만, 예컨대 액상 배양 탱크, 회전 드럼식 발효기(rotary drum fermentor) 또는 트레이 발효기 (tray fermentor)를 사용하여 배양할 수 있다. 상기 회전 드럼식 또는 트레이 발효기 이외에도 균주의 발효에 유용한 것이라면 그 형식에 제한 없이 본 발명의 방법에 사용될 수 있고, 생산 규모에 따라 적절한 장치를 선택하여 사용할 수 있다. The culture according to the present invention is not particularly limited, but can be cultured using, for example, a liquid culture tank, a rotary drum fermentor, or a tray fermentor. In addition to the rotary drum type or tray fermenter, if it is useful for fermentation of strains, it can be used in the method of the present invention without restrictions on its type, and an appropriate device can be selected and used depending on the production scale.
본 발명에서는 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입할 수 있다.In the present invention, the pH of the culture can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, and sulfuric acid to the culture in an appropriate manner. During cultivation, foam generation can be suppressed by using an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester. Additionally, in order to maintain the aerobic state of the culture, oxygen or oxygen-containing gas can be injected into the culture.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 효모 균주를 파쇄하여 헴을 회수하는 본 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. In the present invention, step (b) may be performed using a method known in the art for recovering heme by disrupting the yeast strain.
일 양태로서, 본 발명에 있어서 상기 (b) 단계는 도 1에 기재된 일련의 과정에 의해 수행될 수 있다.In one aspect, in the present invention, step (b) may be performed by a series of processes shown in FIG. 1.
상기 과정을 간략히 서술하면, 상기 (a) 단계의 배양 과정을 거친 효모 균주는 원심 분리한 후 OD600*mL=60 당 0.4 ml의 효모 용해 버퍼 (예컨대 Y-PER™ Yeast Protein Extraction Reagent)를 첨가하여 효모 세포를 파쇄하고, 파쇄된 0.4 ml의 효모 추출물에 1.2 ml의 아세토나이트릴 (acetonitrile, ACN)을 첨가하여 5분간 반응시킨 후 원심분리하여 상등액은 제거하고 침전물만 취한다. 회수된 침전물에 8 : 2의 부피비율로 섞어 제조한 아세토나이트릴 : 1.7 M 염산(HCl) 용액 1.6 ml을 첨가하여 20분 동안 반응시키고, 추가로 상온에서 포화된 농도의 MgSO4와 100 μg/L의 NaCl을 포함하는 용액 0.4 ml를 첨가하여 5분 동안 교반시킨 후, 원심분리하여 수용액층과 아세토나이트릴 층을 분리하고, 헴이 포함되어 있는 아세토나이트릴 층을 회수한다.To briefly describe the process, the yeast strain that has undergone the culture process in step (a) is centrifuged, and then 0.4 ml of yeast lysis buffer (e.g. Y-PER ™ Yeast Protein Extraction Reagent) is added per OD 600 *mL=60. The yeast cells are disrupted, 1.2 ml of acetonitrile (ACN) is added to 0.4 ml of the disrupted yeast extract, reacted for 5 minutes, centrifuged, the supernatant is removed, and only the precipitate is collected. Acetonitrile prepared by mixing at a volume ratio of 8:2 to the recovered precipitate: 1.6 ml of 1.7 M hydrochloric acid (HCl) solution was added and reacted for 20 minutes, and MgSO 4 at a saturated concentration at room temperature and 100 μg/ml were added. After adding 0.4 ml of a solution containing L NaCl and stirring for 5 minutes, the aqueous solution layer and the acetonitrile layer are separated by centrifugation, and the acetonitrile layer containing heme is recovered.
본 발명에 있어서 헴을 회수하는 방법에는, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.Methods for recovering heme in the present invention include centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, and HPLC, but are not limited to these examples.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 배지 내 헴 농도가 0.5 mM에 도달하기 전 균주를 수확(harvest)하여 헴을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 배지 내 헴 농도가 0.5 mM에 도달하면 효모 생장이 저해되어 헴 생산량이 감소하기 때문이다. In the present invention, step (b) may be characterized in that heme is recovered by harvesting the strain before the heme concentration in the medium reaches 0.5mM. This is because when the heme concentration in the medium reaches 0.5mM, yeast growth is inhibited and heme production decreases.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 배지 내 헴 농도가 0.25 내지 0.45 mM일 때 균주를 수확하여 헴을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. In the present invention, step (b) may be characterized by harvesting the strain and recovering heme when the heme concentration in the medium is 0.25 to 0.45 mM, but is not limited to this.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 균주 배양액에서 햄을 추가로 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, step (b) may be characterized by additional recovery of ham from the strain culture medium.
본 발명에서는 또한, 효모를 이용하여 헴을 생산하는데 적합한 배지 조성물을 개발하였다.In the present invention, a medium composition suitable for producing heme using yeast was also developed.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (i) 탄소원; (ii) 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물; 및 (iii) 0.1 내지 3% (w/v) 펩톤;를 포함하는 S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 및 S. cerevisiae KCCM 12651로 구성된 군에서 선택되는 균주 배양용 배지 조성물에 관한 것이다. Accordingly, in another aspect, the present invention relates to: (i) a carbon source; (ii) 2 to 6% (w/v) yeast extract; and (iii) 0.1 to 3% ( w / v ) peptone; It relates to a medium composition for cultivating strains selected from the group consisting of.
본 발명에 있어서, 상기 탄소원은 3 내지 7% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스, 구체적으로는 4 내지 6% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스, 가장 구체적으로는 약 5% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the carbon source is 3 to 7% (w/v) of glucose, fructose or galactose, specifically 4 to 6% (w/v) of glucose, fructose or galactose, most specifically about 5%. It may be characterized as (w/v) glucose, fructose, or galactose, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물은 구체적으로 (i) 4 내지 6% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스; (ii) 3 내지 5 % (w/v) 효모 추출물; 및 (iii) 1 내지 2.5 % (w/v) 펩톤;을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the medium composition specifically contains (i) 4 to 6% (w/v) of glucose, fructose or galactose; (ii) 3 to 5% (w/v) yeast extract; and (iii) 1 to 2.5% (w/v) peptone.
본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물은 가장 구체적으로 (i) 약 5 % (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스; (ii) 약 4 % (w/v) 효모 추출물; 및 (iii) 약 2 % (w/v) 펩톤;을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the medium composition most specifically includes (i) about 5% (w/v) of glucose, fructose, or galactose; (ii) about 4% (w/v) yeast extract; and (iii) about 2% (w/v) peptone.
본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물를 사용하는 경우 효모의 헴 생산량을 극대화 할 수 있는바, 상기 배지 조성물은 헴 생산용 배지 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, when using the above medium composition, the heme production of yeast can be maximized, and the medium composition may be characterized as being a medium composition for heme production.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 생산방법에 의해 생산된 헴에 관한 것이다.From another aspect, the present invention relates to heme produced by the above production method.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생산방법에 의해 생산된 헴을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a food composition containing heme produced by the above production method.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 인공육 또는 육류 대체 식품인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 인공육 또는 육류 대체 식품은 육류와 비슷한 식감, 질감, 풍미 및/또는 향미를 가지도록 모사한 고기 모조물을 의미한다. In the present invention, the food may be characterized as artificial meat or meat substitute food, but is not limited thereto. In the present invention, the artificial meat or meat substitute food refers to a meat replica imitated to have a texture, texture, flavor and/or flavor similar to meat.
상기 식품 조성물은 음용할 수 있는 식품이라면 특별히 한정되지 않는다. 상기 식품의 비제한적인 예로는, 핫도그, 버거, 세절육, 소시지, 스테이크, 필렛, 구운 고기, 가슴살, 넓적다리살, 날개살, 미트볼, 미트로프, 베이컨, 스트립, 핑거, 너겟, 커틀렛 또는 큐브 형태의 동물 기반 또는 비-동물 기반 (예를 들어, 식물 기반) 식제품, 또는 동물 기반 또는 비-동물 기반 식제품의 조합을 포함한다.The food composition is not particularly limited as long as it is a drinkable food. Non-limiting examples of such foods include hot dogs, burgers, meat cuts, sausages, steaks, fillets, grilled meats, breasts, thighs, wings, meatballs, meatloaf, bacon, strips, fingers, nuggets, cutlets or cubes. Includes any form of animal-based or non-animal-based (e.g., plant-based) food product, or a combination of animal-based or non-animal-based food products.
상기 식품은 또 다른 양태로서, 스프 또는 스튜 베이스, 부용, 예를 들어, 분말 또는 큐브, 풍미제 패킷, 또는 조미 패킷 또는 쉐이커와 같은 식품 첨가제 형태로 제공될 수 있다. In another embodiment, the food may be provided in the form of a soup or stew base, a bouillon, for example, a powder or cube, a flavor packet, or a food additive such as a seasoning packet or shaker.
실시예 Example
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예 1. 헴 고생산 효모 균주 선별Example 1. Selection of high heme-producing yeast strains
1-1. 헴 고생산 효모 균주 후보군1-1. Candidate heme-producing yeast strains
식품산업에 바로 적용 가능한 헴 고함량 효모 균주를 선별하기 위하여, 제빵, 양조 등 다양한 식품 산업에 활용되고 있는 야생형 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 및 근연종 32종을 농업유전자원정보센터와 한국미생물보존센터로부터 분양받았다 (표 1 참조). In order to select yeast strains with high heme content that can be directly applied to the food industry, wild type yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) and 32 related species used in various food industries such as baking and brewing were collected from the Agricultural Genetic Resources Information Center and the Korea Microorganism Conservation Center. It was sold (see Table 1).
1-2. 전배양1-2. Pre-culture
초저온 냉동고 (deep freezer)에 보관 중인 효모 글리세롤 (glycerol) 스탁 (stock) 50 ul을 5 mL YP20D (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone, 20 g/L glucose) 배지가 포함되어 있는 시험관에 접종하여 25 ℃, 250 rpm에서 48시간 전배양하였다. 50 ul of yeast glycerol stock stored in a deep freezer was mixed with 5 mL YP20D (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone, 20 g/L) medium. It was inoculated into a test tube and pre-cultured at 25°C and 250 rpm for 48 hours.
1-3. 본배양 및 효모 세포 파쇄1-3. Main culture and yeast cell disruption
전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이 되도록 100 mL YP50D (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone, 50 g/L glucose) 배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하였다. 25 ℃, 250 rpm 조건에서 48시간 진탕배양한 효모 균주 세포를 OD600×mL=60이 되도록 (예를 들어 OD600=1이라면 60 mL의 배양액) 원심분리로 회수한 후, 0.4 ml의 Y-PER™ Yeast Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA)를 첨가하여 효모 세포를 파쇄하였다. The pre-cultured yeast strain was baffled with 100 mL YP50D (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone, 50 g/L glucose) medium so that the optical density at 600 nm (OD 600 ) was 1.0. The flask was inoculated. Yeast strain cells cultured with shaking for 48 hours at 25°C and 250 rpm were recovered by centrifugation to an OD of 600 Yeast cells were disrupted by adding PER ™ Yeast Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA).
1-4. 헴 농도 측정1-4. Heme concentration measurement
효모 세포 파쇄 용액, 즉, 효모 추출물에 존재하는 헴 농도를 측정하기 위한 전처리 방법은 도 1에 기재된 바와 같다. 간단히 설명하면, 0.4 ml의 효모 추출물에 1.2 ml의 아세토나이트릴 (acetonitrile, ACN)을 첨가하여 5분간 반응시킨 후 원심분리하여 상등액은 제거하고 침전물만 취한다. 회수된 침전물에 8 : 2의 부피비율로 섞어 제조한 아세토나이트릴 : 1.7 M 염산(HCl) 용액 1.6 ml을 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. 추가로 상온에서 포화된 농도의 MgSO4와 100 μg/L의 NaCl을 포함하는 용액 0.4 ml를 첨가하여 5분 동안 교반시킨 후 원심분리하여 수용액층과 아세토나이트릴층을 분리하였다. 헴이 포함되어 있는 아세토나이트릴층을 취한 후 HPLC 분석을 진행하였다.The pretreatment method for measuring the heme concentration present in the yeast cell disruption solution, i.e., yeast extract, is as described in Figure 1. Briefly, 1.2 ml of acetonitrile (ACN) is added to 0.4 ml of yeast extract, reacted for 5 minutes, centrifuged, the supernatant is removed, and only the precipitate is collected. To the recovered precipitate, 1.6 ml of acetonitrile:1.7 M hydrochloric acid (HCl) solution prepared by mixing at a volume ratio of 8:2 was added and reacted for 20 minutes. Additionally, 0.4 ml of a solution containing saturated MgSO 4 and 100 μg/L NaCl at room temperature was added and stirred for 5 minutes, followed by centrifugation to separate the aqueous solution layer and the acetonitrile layer. The acetonitrile layer containing heme was taken and subjected to HPLC analysis.
헴의 농도는 YMC-Pack ODS-A, 12 nm, 5 um, 150 x 4.6 mm column (YMC, Japan) 및 UV 검출기가 장착된 HPLC (High performance liquid chromatography) (Thermo fisher Ultimate 3000)를 통해 측정하였다. 상세한 분석 조건은 표 2 및 표 3과 같다. 헴 표준물질로는 Hemin (Sigma, USA)을 사용하였다.The concentration of heme was measured using HPLC (High performance liquid chromatography) (Thermo fisher Ultimate 3000) equipped with YMC-Pack ODS-A, 12 nm, 5 um, 150 x 4.6 mm column (YMC, Japan) and UV detector. . Detailed analysis conditions are shown in Tables 2 and 3. Hemin (Sigma, USA) was used as a heme standard material.
실험용 효모 균주인 S. cerevisiae D452-2를 대조군으로 하여 표 1에 기재된 32종의 식용 효모 균주를 플라스크 수준에서 배양한 후 헴 농도를 측정한 결과, 도 2에서와 같이 헴 함량이 높은 야생형 효모 균주를 선별할 수 있었으며, 이중에서도 특히, 아메리칸 위스키 제조용 효모 균주인 S. cerevisiae KCCM 12638의 헴 농도 (mg/L)가 8.6 mg/L로 가장 높은 수치를 나타내었다. 따라서, 이후의 모든 실험은 S. cerevisiae KCCM 12638를 이용해 진행하였다.Using the experimental yeast strain S. cerevisiae D452-2 as a control, 32 edible yeast strains listed in Table 1 were cultured at the flask level and the heme concentration was measured. As a result, the wild-type yeast strain with high heme content was found as shown in Figure 2. were able to be selected, and in particular, the heme concentration (mg/L) of S. cerevisiae KCCM 12638, a yeast strain for making American whiskey, was the highest at 8.6 mg/L. Therefore, all subsequent experiments were conducted using S. cerevisiae KCCM 12638.
실시예 2. 헴 고생산을 위한 회분식 발효 공정 교반속도의 결정Example 2. Determination of agitation speed for batch fermentation process for high heme production
효모 균주의 회분식 발효에서 헴 고생산을 위한 교반속도를 결정하고자, 전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이 되도록 100 mL YP50D 배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하여 25 ℃에서 각각 80, 250, 혹은 350 rpm 조건으로 48시간 진탕배양하였다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다. To determine the stirring speed for high heme production in batch fermentation of yeast strains, preculture was performed in the same manner as Example 1-2. The pre-cultured yeast strain was inoculated into a baffled flask containing 100 mL YP50D medium so that the optical density at 600 nm (OD 600 ) was 1.0, and cultured for 48 hours at 25°C with shaking at 80, 250, or 350 rpm, respectively. did. Heme concentration was measured by the method described in Examples 1-4.
교반속도에 따른 S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 헴 생산 효과를 비교하기 위하여 80, 250, 350 rpm 조건에서 회분식 배양을 수행한 결과, 교반속도가 증가함에 따라 헴 생산량도 증가하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 350 rpm의 교반속도는 250 rpm의 교반속도 대비 헴 생산량이 32% 높게 나타났다 (도 3). 결론적으로 호기적 (aerobic) 조건이 헴 생산에 유리함을 알 수 있었다.To compare the heme production effect of S. cerevisiae KCCM 12638 strain according to stirring speed, batch culture was performed under conditions of 80, 250, and 350 rpm. As a result, heme production was found to increase as the stirring speed increased. Specifically, the stirring speed of 350 rpm showed a 32% higher heme production compared to the stirring speed of 250 rpm (Figure 3). In conclusion, it was found that aerobic conditions are favorable for heme production.
실시예 3. 헴 고생산을 위한 탄소원 결정Example 3. Determination of carbon source for high heme production
효모 균주의 회분식 발효에서 헴 고생산을 위한 탄소원을 결정하고자, 전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이 되도록 접종하였다. 이 때, YP (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone) 배지에 포도당 (glucose), 과당 (fructose), 갈락토오스 (galactose), 유당 (lactose). 엿당 (maltose), 혹은 서당 (sucrose)이 각각 50 g/L의 농도로 첨가된 100 mL 액체배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하였으며, 접종 후에는 25 ℃, 250 rpm 조건으로 48시간 진탕배양하였다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다. To determine the carbon source for high heme production in batch fermentation of yeast strains, preculture was performed in the same manner as Example 1-2. The pre-cultured yeast strain was inoculated so that the optical density at 600 nm (OD 600 ) was 1.0. At this time, glucose, fructose, galactose, and lactose were added to the YP (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone) medium. It was inoculated into a baffled flask containing 100 mL liquid medium supplemented with maltose or sucrose at a concentration of 50 g/L, and after inoculation, culture was shaken at 25°C and 250 rpm for 48 hours. . Heme concentration was measured by the method described in Examples 1-4.
S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 헴 생산을 증가시키기 위하여 최적의 탄소원을 확인한 결과, 과당과 갈락토오스를 탄소원으로 이용하는 경우 포도당을 이용하는 경우보다 헴 생산량이 각각 10%, 13% 증가하는 것으로 나타났다 (도 4). 그러나, 과당과 갈락토오스의 가격이 포도당 보다 현저히 높고, 헴 생산량이 증가되는 정도가 비교적 낮아, 경제성을 고려하여 포도당을 헴 생산을 위한 탄소원으로 사용하였다. As a result of identifying the optimal carbon source to increase heme production of S. cerevisiae KCCM 12638 strain, it was found that when fructose and galactose were used as carbon sources, heme production increased by 10% and 13%, respectively, compared to when glucose was used (Figure 4) . However, the prices of fructose and galactose are significantly higher than those of glucose, and the degree of increase in heme production is relatively low, so glucose was used as a carbon source for heme production in consideration of economic efficiency.
실시예 4. 헴 고생산을 위한 질소원 결정Example 4. Determination of nitrogen source for high heme production
효모 균주의 회분식 발효에서 헴 고생산을 위한 질소원을 결정하고자, 전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이 되도록 100 mL 액체배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하여 25 ℃, 250 rpm 조건으로 48시간 진탕배양하였다. 이 때, 이용된 배지의 탄소원은 5% (w/v) 포도당으로 고정하였고, 질소원은 YP 배지에 포함되어 있는 1% (w/v) 효모 추출물(yeast extract)와 2% (w/v) 박토 펩톤 (bacto peptone)의 75%를 다른 질소원으로 대체하며 헴 생산량을 비교하였다 (표 4).To determine the nitrogen source for high heme production in batch fermentation of yeast strains, preculture was performed in the same manner as Example 1-2. The pre-cultured yeast strain was inoculated into a baffled flask containing 100 mL liquid medium so that the optical density at 600 nm (OD 600 ) was 1.0, and cultured with shaking at 25°C and 250 rpm for 48 hours. At this time, the carbon source of the medium used was fixed to 5% (w/v) glucose, and the nitrogen source was 1% (w/v) yeast extract and 2% (w/v) contained in YP medium. Heme production was compared by replacing 75% of bacto peptone with other nitrogen sources (Table 4).
(Carbon source)Glucose
(Carbon source)
nitrogen source (2.25%)Additional
nitrogen source (2.25%)
예를 들어 표 4의 1번 조건의 경우 효모 추출물, 박토 펩톤의 농도가 각각 0.25% (w/v), 2.75% (w/v)이며, 2번 조건의 경우 효모 추출물, 박토 펩톤, 트립톤의 농도가 각각 0.25% (w/v), 0.5% (w/v), 2.25% (w/v)이다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다. For example, for condition 1 in Table 4, the concentrations of yeast extract and bacto-peptone are 0.25% (w/v) and 2.75% (w/v), respectively, and for condition 2, the concentrations of yeast extract, bacto-peptone, and tryptone are 0.25% (w/v) and 2.75% (w/v), respectively. The concentrations are 0.25% (w/v), 0.5% (w/v), and 2.25% (w/v), respectively. Heme concentration was measured by the method described in Examples 1-4.
S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 헴 생산을 증가시키기 위하여 최적의 질소원을 확인한 결과, 대조군인 YP50D 배지 대비 YP50D 배지의 질소원 75%를 효모 추출물로 대체하였을 때 (즉, 최종 효모 추출물과 박토 펩톤의 농도는 각각 2.5% (w/v)와 0.5% (w/v)인 경우) 헴 농도가 21% 증대되는 것으로 나타났다 (도 5). As a result of identifying the optimal nitrogen source to increase the heme production of S. cerevisiae KCCM 12638 strain, when 75% of the nitrogen source in the YP50D medium as the control medium was replaced with yeast extract (i.e., the concentrations of the final yeast extract and bacto peptone were In the case of 2.5% (w/v) and 0.5% (w/v), respectively), the heme concentration was found to increase by 21% (Figure 5).
실시예 5. 헴 고생산을 위한 질소원 비율의 조정Example 5. Adjustment of nitrogen source ratio for high heme production
헴은 화합물 내부에 질소를 함유하고 있어, 실시예 4에서 결정된 질소원 비율을 조절함으로써 햄 생산량을 현저히 향상시킬 수 있을 것으로 판단하였다. 이를 위하여 실시예 4에서 확인된 효모 추출물(yeast extract)과 박토 펩톤(bacto peptone)의 농도비를 조절하는 실험을 진행하였다.Since heme contains nitrogen within the compound, it was judged that ham production could be significantly improved by adjusting the nitrogen source ratio determined in Example 4. To this end, an experiment was conducted to adjust the concentration ratio of the yeast extract and bacto peptone identified in Example 4.
전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이 되도록 100 mL 액체배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하여 25℃, 250 rpm 조건에서 48시간 진탕배양하였다. 이 때, 이용된 배지의 탄소원은 5% (w/v) 포도당으로 고정하였고, 표 5와 같이 다양한 비율의 효모 추출물과 펩톤을 첨가하여 그 효과를 검증하였다. 대조군으로는 1% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 박토 펩톤, 5% (w/v) 포도당 농도를 갖는 YP50D 배지를 사용하였다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다. Pre-culture was carried out in the same manner as Example 1-2. The pre-cultured yeast strain was inoculated into a baffled flask containing 100 mL liquid medium so that the optical density at 600 nm (OD 600 ) was 1.0, and cultured with shaking at 25°C and 250 rpm for 48 hours. At this time, the carbon source of the medium used was fixed to 5% (w/v) glucose, and the effect was verified by adding various ratios of yeast extract and peptone as shown in Table 5. As a control, YP50D medium containing 1% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) bacto peptone, and 5% (w/v) glucose concentration was used. Heme concentration was measured by the method described in Examples 1-4.
(Carbon source)Glucose
(Carbon source)
S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 헴 생산량을 증대시키고자 효모 추출물 및 박토 펩톤의 첨가 비율을 변화시켜 본 결과, 4% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 박토 펩톤을 질소원으로 사용하는 경우, 헴 농도를 15.4 mg/L까지 향상시켜 대조군에 비해 2배 이상 헴 생산량을 증진시킬 수 있었다 (도 6).As a result of changing the addition ratio of yeast extract and bacto-peptone to increase the heme production of S. cerevisiae KCCM 12638 strain, 4% (w/v) yeast extract and 2% (w/v) bacto-peptone were used as nitrogen sources. In this case, the heme concentration was increased to 15.4 mg/L, thereby increasing heme production by more than two times compared to the control group (FIG. 6).
실시예 6. 헴 고생산을 위한 기본 배지 결정Example 6. Determination of basic medium for high heme production
효모 균주의 회분식 발효에서 헴 고생산을 위한 최적의 배지를 결정하고자, 전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이 되도록 100 mL 액체배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하여 25 ℃, 250 rpm 조건에서 48시간 진탕배양하였다. 사용된 배지는 SC 배지(표 6), M/CSL 배지(표 7), BPM 배지 (표 8)로, SC 배지는 2X, BPM 배지는 3X로 농축한 실험군도 추가로 비교하였다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다. To determine the optimal medium for high heme production in batch fermentation of yeast strains, preculture was performed in the same manner as Example 1-2. The pre-cultured yeast strain was inoculated into a baffled flask containing 100 mL liquid medium so that the optical density at 600 nm (OD 600 ) was 1.0, and cultured with shaking at 25°C and 250 rpm for 48 hours. The media used were SC medium (Table 6), M/CSL medium (Table 7), and BPM medium (Table 8), and the experimental groups concentrated at 2X for SC medium and 3X for BPM medium were also compared. Heme concentration was measured by the method described in Examples 1-4.
다양한 배지를 이용하여, S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 배양한 결과, SC, M/CSL, BPM 배지와 비교하여, 본 발명 상기 실시예들을 통해 도출된 변형된 YPD 배지에서 가장 높은 헴 농도인 13.8 mg/L가 생산되었다 (도 7). 구체적으로, 본 발명에서 개발한 변형된 YPD 배지는 각각 종래 YPD 배지에 비하여 210%, 1X SC 배지에 비하여 2600%, 2X SC 배지에 비하여 1300%, 1X BPM 배지에 비하여 3300%, 3X BPM 배지에 비하여 400%, M/CSL 배지에 비하여 2800% 헴 생산량이 증가하였다. As a result of cultivating S. cerevisiae KCCM 12638 strain using various media, compared to SC, M/CSL, and BPM media, the highest heme concentration in the modified YPD medium derived through the above examples of the present invention was 13.8 mg. /L was produced (Figure 7). Specifically, the modified YPD medium developed in the present invention is 210% compared to the conventional YPD medium, 2600% compared to the 1X SC medium, 1300% compared to the 2X SC medium, 3300% compared to the 1X BPM medium, and 3X BPM medium. Heme production increased by 400% and 2800% compared to M/CSL medium.
그 밖에도 당밀(molasses), 옥수수 침지액(corn steep liquor)을 5 내지 20% 농도로 5% 포도당과 다양하게 조합하여 탄소원으로 사용해보았으나, 유의하게 헴 생산을 증가시키지는 않는 것으로 확인되었다 (데이터 미도시).In addition, molasses and corn steep liquor were used as carbon sources in various combinations with 5% glucose at 5 to 20% concentration, but it was confirmed that they did not significantly increase heme production (data not shown) city).
실시예 7. 유가식 배양을 통한 헴 생산 농도의 추가 증대Example 7. Further increase in heme production concentration through fed-batch culture
유가식 배양은 회분식 배양과 다르게 미생물의 생장에 필요한 탄소원 및 질소원을 계속적으로 공급하여 균체량을 현저하게 증대시킬 수 있으며, 이에 따라 목적하는 물질의 생성량을 증대시킬 수 있다. 본 발명에서는 최종적으로 유가식 배양을 통해 S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 헴 생산량을 증대시키고자 하였다. Unlike batch culture, fed-batch culture can significantly increase the amount of bacterial cells by continuously supplying carbon and nitrogen sources necessary for the growth of microorganisms, thereby increasing the amount of production of the desired substance. In the present invention, we ultimately attempted to increase the heme production of S. cerevisiae KCCM 12638 strain through fed-batch culture.
유가식 배양은 2.5 L 규모의 생물배양기에서 working volume을 1 L로 하여 진행하였다. 전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이되도록 100 mL YP20D 배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하여 25℃, 250 rpm에서 48시간 계대배양을 진행하였다. 계대배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD600)가 1.0이 되도록 1 L의 40YP20D (40 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone, 20 g/L glucose) 배지에 접종하였다. 배양조건은 pH를 3.5 또는 4.5로 유지하여 25℃, 700 rpm, 2 vvm 조건에서 진행하였다. 초기 포도당을 모두 소모한 시점에서 추가로 feeding solution (280 g/L yeast extract, 140 g/L bacto peptone, 350 g/L glucose)을 4-24 mL/hr의 유속으로 주입하였다. Feeding solution의 주입속도는 효모 배양액의 포도당 농도가 0 g/L에 가깝고 에탄올의 농도가 10 g/L를 초과하지 않는 범위 내에서 결정하였다. 교반속도 및 공기주입 속도를 각각 최소 700 rpm 및 2 vvm에서 최대 1200 rpm 및 5 vvm까지 증가시켜 용존산소량 (DO)을 높은 수치로 유지하였다. 포도당 (glucose), 글리세롤 (glycerol), 초산 (acetate) 및 에탄올 (ethyl alcohol)의 배지 중 농도는 Rezex ROA-organic acid H+ column (Phenomenex, Torrance, CA) 및 RI (Refractive index) 검출기가 장착된 HPLC (High performance liquid chromatography) (Thermo fisher Ultimate 3000)를 통해 측정하였다. 컬럼 온도는 70 ℃로 유지하였으며 이동상으로는 5 mM의 황산 (H2SO4) 용액을 0.6 mL/min의 유속으로 흘려주어 검출하였다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다. Fed-batch culture was performed in a 2.5 L biological incubator with a working volume of 1 L. Pre-culture was carried out in the same manner as Example 1-2. The pre-cultured yeast strain was inoculated into a baffled flask containing 100 mL YP20D medium so that the optical density at 600 nm (OD 600 ) was 1.0, and subculture was performed at 25°C and 250 rpm for 48 hours. The subcultured yeast strain was inoculated into 1 L of 40YP20D (40 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone, 20 g/L glucose) medium so that the optical density at 600 nm (OD 600 ) was 1.0. Culture conditions were carried out at 25°C, 700 rpm, and 2 vvm while maintaining pH at 3.5 or 4.5. When all of the initial glucose was consumed, additional feeding solution (280 g/L yeast extract, 140 g/L bacto peptone, 350 g/L glucose) was injected at a flow rate of 4-24 mL/hr. The injection rate of the feeding solution was determined within the range where the glucose concentration of the yeast culture medium was close to 0 g/L and the ethanol concentration did not exceed 10 g/L. Dissolved oxygen (DO) was maintained at a high level by increasing the stirring speed and air injection speed from a minimum of 700 rpm and 2 vvm to a maximum of 1200 rpm and 5 vvm, respectively. The concentrations of glucose, glycerol, acetate, and ethyl alcohol in the medium were measured using a Rezex ROA-organic acid H + column (Phenomenex, Torrance, CA) and an RI (Refractive index) detector. It was measured using HPLC (High performance liquid chromatography) (Thermo fisher Ultimate 3000). The column temperature was maintained at 70°C, and detection was performed by flowing a 5 mM sulfuric acid (H 2 SO 4 ) solution as a mobile phase at a flow rate of 0.6 mL/min. Heme concentration was measured by the method described in Examples 1-4.
pH 3.5와 pH 4.5 조건에서 상기와 같은 방법으로 유가식 배양을 수행해본 결과 pH 3.5 조건에서는 최대 37.3 mg/L 헴이 생산되었고(도 8), pH 4.5 조건에서는 최대 48.5 mg/L 헴이 생산되어(도 9), pH 4.5 조건이 헴 생산에 바람직한 것으로 확인되었다. As a result of performing fed-batch culture in the same manner as above under pH 3.5 and pH 4.5 conditions, up to 37.3 mg/L heme was produced under pH 3.5 conditions (Figure 8), and under pH 4.5 conditions, up to 48.5 mg/L heme was produced. (Figure 9), pH 4.5 conditions were confirmed to be preferable for heme production.
Feeding solution에 포함되어 있는 질소원인 효모 추출물과 박토 펩톤 의 가격이 탄소원인 포도당과 비교하여 현저히 높기 때문에 도 10의 실험에서는 가격이 저렴한 탄소원만을 첨가하였을 때 헴 생산량이 어느 정도까지 도달하는지 확인하고자 하였다. 또한, 산업용 규모의 발효기 운용 시에 효모에 공급되는 산소주입 속도와 교반속도가 실험실용 발효기 조건에 비해 현저히 떨어지기 때문에 산업용 규모 발효기 환경을 모방하여 헴 생산량이 어느 정도까지 도달하는지 확인하고자 하였다. 이에 따라, 도 11의 실험에서는 공기주입 속도는 1 vvm으로 낮추어 고정하고 교반속도는 발효 초기에는 300 rpm, 발효 후기에는 500 rpm으로 낮추어 고정하였다. 그 결과, 기존의 feeding solution (280 g/L yeast extract, 140 g/L bacto peptone, 350 g/L glucose)과 교반속도 및 공기주입 속도를 유지하는 경우 가장 높은 헴 생산량을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 9 참조). 그러나 공기주입 속도와 교반속도를 현저하게 낮춘 경우에도 상당히 높은 농도 (30.0 mg/L)의 헴을 생산할 수 있었다.Since the prices of yeast extract and bacto-peptone, which are nitrogen sources, contained in the feeding solution are significantly higher than those of glucose, which is a carbon source, the experiment shown in Figure 10 sought to determine the level of heme production reached when only inexpensive carbon sources were added. In addition, when operating an industrial-scale fermentor, the oxygen injection rate and stirring rate supplied to the yeast are significantly lower than those in laboratory fermenters, so we sought to determine how much heme production can be achieved by imitating the industrial-scale fermentor environment. Accordingly, in the experiment of Figure 11, the air injection speed was fixed at 1 vvm, and the stirring speed was set at 300 rpm in the early stage of fermentation and 500 rpm in the late stage of fermentation. As a result, it was confirmed that the highest heme production was achieved when the existing feeding solution (280 g/L yeast extract, 140 g/L bacto peptone, 350 g/L glucose) and the stirring speed and air injection speed were maintained ( 9). However, even when the air injection speed and stirring speed were significantly lowered, heme could be produced at a fairly high concentration (30.0 mg/L).
실시예 8. Example 8. S. cerevisiae S. cerevisiae KCCM 12638 균주에 대한 헴 독성 시험Heme toxicity test for strain KCCM 12638
효모 균주를 이용하여 최대 헴 생산 농도에 도달하기 위해서는 효모 균주의 성장 저해를 일으키지 않는 배지 내 혹은 세포 내 최대 헴 농도를 알아야 한다. 먼저, 효모 배양을 통해 최대로 도달할 수 있는 배지 내 헴 농도를 알아보기 위해, 배지에 0 내지 4 mM의 헴을 첨가하고 균주의 성장이 저해되는지 70시간 동안 확인하였다.In order to reach the maximum heme production concentration using a yeast strain, it is necessary to know the maximum heme concentration in the medium or cell that does not cause growth inhibition of the yeast strain. First, to determine the maximum concentration of heme in the medium that can be achieved through yeast culture, 0 to 4 mM of heme was added to the medium and checked for 70 hours to see whether the growth of the strain was inhibited.
그 결과, 배지 내 헴 농도가 0.5 mM (308 mg/L) 이상일 때, 헴이 고농도로 효모 세포 내로 유입되면서 독성을 나타내어 효모 세포의 사멸을 유도하는 것으로 확인되었다 (도 12 참조). 따라서, 배지 내 분획에서 헴을 생산하고자 하는 경우에는 배지 내 헴 농도가 0.5 mM에 도달하기 전 효모로부터 헴을 회수하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.As a result, it was confirmed that when the heme concentration in the medium was more than 0.5mM (308 mg/L), heme was introduced into yeast cells at high concentration and exhibited toxicity, leading to death of yeast cells (see FIG. 12). Therefore, it was found that when it is desired to produce heme from the fraction in the medium, it is desirable to recover heme from the yeast before the heme concentration in the medium reaches 0.5mM.
한편, 0.2 mM의 헴을 배지 중에 첨가한 경우 효모 세포의 성장 저해 효과는 관찰되지 않았으며, 세포 내 헴 농도가 대략 25 mg 헴/g cell까지 증가되었다 (도 12 참조). 유가식 배양에서 일반적으로 효모 세포의 균체 농도가 100 g cell/L까지 도달하는 것을 고려하였을 때, 헴을 효모의 세포 내 분획에서 생산한다면 2.5 g/L 이상의 고농도로 생산 가능함을 확인하였다.Meanwhile, when 0.2 mM heme was added to the medium, no growth inhibitory effect on yeast cells was observed, and the intracellular heme concentration increased to approximately 25 mg heme/g cell (see FIG. 12). Considering that the concentration of yeast cells generally reaches up to 100 g cell/L in fed-batch culture, it was confirmed that if heme is produced from the intracellular fraction of yeast, it can be produced at a high concentration of 2.5 g/L or more.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. something to do. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (14)
(a) S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 및 S. cerevisiae KCCM 12651로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 균주를 배양하는 단계: 및
(b) 상기 균주로부터 헴을 회수하는 단계.
Heme production method comprising the following steps:
(a) cultivating one or more strains selected from the group consisting of S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 and S. cerevisiae KCCM 12651: and
(b) recovering heme from the strain.
The method of claim 1, wherein step (a) is performed in a medium containing glucose, fructose, or galactose as a carbon source.
The heme production according to claim 1, wherein step (a) is cultured in a medium containing 2 to 6% (w/v) yeast extract and 0.1 to 3% (w/v) peptone as a nitrogen source. method.
The method of claim 1, wherein the strain in step (a) is cultured at pH 3 to 6.
The method for producing heme according to claim 1, wherein the strain in step (a) is cultured at 20 to 35°C.
The method of claim 1, wherein the strain in step (a) is cultured for 40 to 120 hours.
The method for producing heme according to claim 1, wherein step (a) is performed in batch culture at a stirring speed of 50 to 400 rpm.
The method for producing heme according to claim 1, wherein step (a) is performed in fed-batch culture at a stirring speed of 100 to 1500 rpm.
The method for producing heme according to claim 1, wherein step (a) is performed by fed-batch culture while injecting air at a rate of 0.5 to 10 vvm.
(ii) 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물; 및
(iii) 0.1 내지 3% (w/v) 펩톤;를 포함하는 S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 및 S. cerevisiae KCCM 12651로 구성된 군에서 선택되는 균주 배양용 배지 조성물.
(i) carbon source;
(ii) 2 to 6% (w/v) yeast extract; and
( iii) 0.1 to 3% (w/ v ) peptone; A medium composition for cultivating a strain selected from the group.
The medium composition according to claim 10, wherein the medium composition is a medium composition for heme production.
The medium composition according to claim 10, wherein the carbon source is 3 to 7% (w/v) of glucose, fructose or galactose.
A food composition comprising the heme produced according to any one of claims 1 to 9.
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| KR102229968B1 (en) | 2015-05-11 | 2021-03-22 | 임파서블 푸즈 인크. | Expression constructs and methods for genetically engineering methyltrophic yeast |
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