KR20230160511A - 호중구 젤라티나제 리포칼린과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 파지 디스플레이 방법을 통해 NGAL 단백질에 특이적인 친화성 펩타이드 서열을 발굴하고 마이크로 컨택 프린팅 기법을 이용하여 분자 각인된 전기화학적 임피던스 기반의 NGAL 단백질 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 친화성 펩타이드가 분자각인된 바이오센서는 암, 급성신손상염 (acute kidney injury, AKI), 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 심장대사증후군 (cardiometabolic disorders), 제2형 당뇨병 (type 2 diabetes) 및 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease)과 같은 관련 질병에서 빈번하고 높은 농도로 존재하는 호중구 젤라티나제 리포칼린을 매우 간편하고 높은 민감성과 특이적으로 정확한 검출이 가능함을 보여주고 있어, 타 질병 조기진단을 위하여 유용한 방법으로 활용할 수 있다.
본 발명에 따른 친화성 펩타이드가 분자각인된 바이오센서는 암, 급성신손상염 (acute kidney injury, AKI), 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 심장대사증후군 (cardiometabolic disorders), 제2형 당뇨병 (type 2 diabetes) 및 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease)과 같은 관련 질병에서 빈번하고 높은 농도로 존재하는 호중구 젤라티나제 리포칼린을 매우 간편하고 높은 민감성과 특이적으로 정확한 검출이 가능함을 보여주고 있어, 타 질병 조기진단을 위하여 유용한 방법으로 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 호중구 젤라티나제 리포칼린과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 상세하게는 호중구 젤라티나제 리포칼린의 전기화학적 임피던스 검출을 위한 친화성 펩타이드가 각인된 전기화학적 임피던스 기반 바이오센서에 관한 것이다.
호중구 젤라티나제 리포칼린 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)은 중성구나 신장 세뇨관의 상피와 결합되어 있는 25 kDa 당단백으로, 여러 가지 원인으로 인해 신장 손상이 있게 되면 급속하게 증가하는 바이오마커 단백질 (biomarker protein)이다. NGAL은 대표적으로 급성신손상염 (acute kidney injury, AKI)의 바이오마커로 알려져 있으며, 그 외에도 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 심장대사증후군 (cardiometabolic disorders), 제2형 당뇨병 (type 2 diabetes) 및 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease)의 바이오마커로 제안되었다. 바이오마커란 암, 당뇨병 및 기타 대사 장애와 같은 다양한 질병에 의한 체내의 상태변화를 나타내는 지표로써 질병의 진단, 치료 및 질병의 예후관찰에 중요한 역할을 한다. 바이오마커는 일반적으로 체액에 낮은 농도로 존재하다가 특정 질병에 걸리게 되면 관련 인자의 농도가 빠르게 증가하고, 혈액 또는 소변 등의 체액으로 분비되기 때문에, 이를 이용한 다양한 질병의 조기진단에 활용되고 있다. 이러한 바이오마커의 검출은 다양한 방법에 의해 수행되며, 항체 기반의 분석법은 높은 특이성 및 재현성으로 인해 바이오마커의 정성적 및 정량적 검출을 위한 표준으로 널리 사용되었다. 그러나, 항체는 온도 및 이온 강도와 같은 다양한 환경 조건에 민감하고 일반적으로 매우 고가이다. 또한, 항체는 주로 포유류 세포에서 대량 생산하는데, 이는 생산 최적화 조건이 까다롭고 오랜 시간이 소요된다. 따라서 항체를 대체할 수 있는 효과적인 친화성 물질로 짧은 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 크게 관심을 받고 있다. 크기가 매우 작고 구조가 간단한 펩타이드는 다양한 환경 조건에서 상대적으로 더 안정적이고 항체보다 가격이 저렴하다는 장점이 있다. 게다가, 펩타이드는 바이오센서 분야에서 일부 링크 (linker) 또는 기능화를 위한 다른 서열과 쉽게 결합할 수 있으며, 이들을 이용한 다양한 바이오센서 시스템이 개발되었다. 하지만, 이러한 종래의 방법들은 안정성이 부족하여 실제 센서로 활용하기에는 어려움이 있었다.
분자각인 고분자 (molecularly imprinted polymers, MIPs)는 주형 (template) 분자 주위로 기능성 단량체 (monomer)를 공유 및 비공유 결합에 의한 중합반응을 통해 고분자로 만든 후 주형분자를 제거하여 만들어진 선택적 분자인식 부위를 갖는 고분자를 말하며, 고분자의 특징 때문에 주로 합성 항체라고 표현된다. MIPs는 재현성, 저비용 및 높은 화학적 안정성과 같은 큰 이점을 가지고 있어, 다양한 응용분야에서 분자 또는 생체 분자 인식자로 사용되어 왔다. 그러나, 세포나 단백질과 같은 큰 생체분자를 각인하는 것은 큰 크기, 복잡한 구조 및 형태학적 변동성으로 인한 주형 제거의 어려움, 느린 결합 반응, 적합한 기능성 단량체 및 중합 조건 선정의 어려움은 여전히 해결해야 할 문제점으로 남아있다.
이러한 문제를 해결하기 위해 고체상 합성, 나노입자 제조, 에피토프 고정 및 수용성 폴리머 사용과 같은 다양한 방법이 제시되었지만, 여전히 생체분자 각인을 위한 대안이 요구되고 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 종래 기술들의 한계점 극복을 위해 선별실험을 통해 NGAL 친화성 펩타이드를 발굴하고, 이를 적용한 필름, 키트, 및 마이크로 컨택 프린팅 기법을 이용해 개량된 친화성 펩타이드를 표면 각인하고 이를 이용하여 전기화학적인 검출기법 (electrochemical detection)을 통해 시료 속에 존재하는 NGAL을 검출할 수 있는 검출 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 호중구 젤라티나제 리포칼린(NGAL) 표적용 펩타이드를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 펩타이드가 각인된 NGAL 단백질 검출용 고분자 필름을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 NGAL 단백질 검출용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 펩타이드를 포함하는 NGAL 단백질 검출용 바이오센서를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 펩타이드가 각인된 NGAL 단백질 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 짧은 서열 아미노산으로 구성된 NGAL 친화성 펩타이드는 크기가 매우 작고 구조가 간단하여 MIPs에 쉽게 도입될 수 있으며, MIPs의 부족한 선택성 및 친화성이 보완될 수 있다. 또한, 친화성 펩타이드의 부족한 안정성은 뛰어난 안정성, 사용 및 보관 용이성의 장점을 가진 MIPs에 도입함으로써 개선될 수 있다. 이와 같은 기존 검출방법의 한계 극복을 위한 기술의 융합을 통해서 바이오마커 단백질 외에도 유해미생물 검출, 질병 바이오마커, 유해물질, 환경호르몬 등 분자진단용으로 사용이 가능할 것으로 기대된다.
본 발명의 NGAL 특이적 펩타이드가 각인된 반구형 고분자 필름은 NGAL 단백질에 대한 높은 안정성과 민감도를 가지고 있으며, 특히 일련의 과정을 거쳐 재사용할 수 있어 종래의 방법보다 비용 및 시간 효율적으로 NGAL 단백질의 검출 또는 급성신손상염 (acute kidney injury, AKI), 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 심장대사증후군 (cardiometabolic disorders), 제2형 당뇨병 (type 2 diabetes) 및 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease)과 같은 관련 질병을 진단할 수 있는 바, 기존의 NGAL 검출방법 및 관련 질병 진단법을 대체하여 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 컨택 프린팅 (micro-contact printing)기법을 이용한 호중구 젤라티나제 리포칼린 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)친화성 펩타이드의 표면 각인 분석 시스템의 일례를 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL 특이적 펩타이드가 발현된 M13박테리오파지의 NGAL 단백질에 대한 결합력을 비교 및 확인한 그래프로, 도 2의 A)는 NGAL 단백질에 대한 결합력을 비교한 그래프이다. 도 2의 B)는 선정된 NGAL 5#23 M13박테리오파지의 농도에 따른 영향을 확인한 그래프이며, 도 2의 C)는 NGAL단백질 농도에 따른 영향을 확인한 그래프이고, 도 2의 D)는 인간 혈청의 농도가 결합력에 주는 영향을 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리스타이렌 (polystyrene) 콜로이드 단층의 AFM 이미지이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 특정 농도의 펩타이드 용액에서 배양을 통해 제조한 NGAL BP 펩타이드로 개질된 PDMS 몰드로, 도 4의 A)는 제작 과정을 모식화 한 이미지이고, 도 4의 B) 및 C)는 배양된 펩타이드의 농도에 따른 PDMS의 변화를 SEM 분석법으로 비교한 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 도 4에서 제조된 NGAL BP 펩타이드로 개질된 PDMS 몰드를 사용한 MIPs 필름에 관한 것으로서, 도 5의 A)는 제작 과정을 모식화한 그림이다. 도 5의 B) 및 C)는 5 μM 농도의 펩타이드로 배양된 PDMS를 이용하여 제조된 NGAL BP 각인 고분자의 NGAL BP 제거 전(B)과 후(C)의 SEM 이미지이다. 도 5의 D) 및 E)는 10μM 농도의 펩타이드로 배양된 PDMS를 이용하여 제조된 NGAL BP 각인 고분자의 NGAL BP 제거 전(D)과 후(E)의 SEM 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 A) 3, B) 5, C) 7 및 D) 10 μM NGAL BP 펩타이드로 개질된 PDMS 몰드를 이용해 제조된 NGAL BP 펩타이드 각인 고분자의 추출 전, 후의 EIS 측정 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL BP 제거 및 재결합에 따른 영향을 EIS를 통해 확인한 결과로, 도 7의 A)는 추출 과정에서 시간에 따른 영향을 확인한 결과이고, 도 7의 B)는 NGAL BP 제거 및 재결합에 따른 영향을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL BP 펩타이드 각인 고분자의 NGAL BP 펩타이드 결합 조건을 최적화한 결과로, 도 8의 A)는 NGAL BP 펩타이드의 반응 시간에 따른 영향을 나타낸 그래프이고, 도 8의 B)는 A)로부터 획득된 반응 시간에 대한 ΔR ct(BLK)/R ct(BLK)값을 나타낸 그래프이다. 도 8의 C)는 0.46-27.76 μg/mL 농도의 NGAL BP 펩타이드의 영향을 나타낸 그래프이고, 도 8의 D)는 C)로부터 획득된 NGAL BP 펩타이드 농도의 로그함수에 대한 ΔR ct(BLK)/R ct(BLK)값을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL BP 펩타이드 각인 고분자의 NGAL 단백질 결합 조건을 최적화한 결과로, 도 9의 A)는 1-300 ng/mL 농도 NGAL에 따른 영향을 DPV로 측정한 그래프이고, 도 9의 B)는 EIS로 측정한 것 그래프이다. 또한, 도 9의 C)는 NGAL 농도 1, 100 및 300 ng/mL에서 반응 시간에 따른 ΔR ct(BLK)/R ct(BLK) 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 9의 D)는 NGAL BP 펩타이드가 각인된 필름과 각인되지 않은 필름의 NGAL 단백질에 대한 결합력을 비교한 그래프이고, 도 9의 E)는 다양한 농도의 NGAL 또는 BSA를 이용해 선택성을 확인한 그래프이다. 도 9의 F)는 NGAL BP 각인 필름의 단백질 흡착 시 예상되는 흡착 거동의 개략도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL BP 각인 고분자 필름을 이용하여 크론병 환자의 혈장에서 NGAL을 검출한 것으로, A-C) 경증, D-F) 중증 및 G, H) 위중증 환자 샘플에서의 NGAL 농도를 측정한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL BP 각인 고분자 필름을 이용하여 크론병 환자의 혈장에서 NGAL을 검출한 것으로, 도 11의 A)는 크론병 환자 혈장의 NGAL을 정량 분석한 그래프이고, 도 11의 B)는 본 발명에서 개발된 MIP 센서와 상업적으로 판매되고 있는 ELISA 키트와의 검출 성능을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL 특이적 펩타이드가 발현된 M13박테리오파지의 NGAL 단백질에 대한 결합력을 비교 및 확인한 그래프로, 도 2의 A)는 NGAL 단백질에 대한 결합력을 비교한 그래프이다. 도 2의 B)는 선정된 NGAL 5#23 M13박테리오파지의 농도에 따른 영향을 확인한 그래프이며, 도 2의 C)는 NGAL단백질 농도에 따른 영향을 확인한 그래프이고, 도 2의 D)는 인간 혈청의 농도가 결합력에 주는 영향을 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리스타이렌 (polystyrene) 콜로이드 단층의 AFM 이미지이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 특정 농도의 펩타이드 용액에서 배양을 통해 제조한 NGAL BP 펩타이드로 개질된 PDMS 몰드로, 도 4의 A)는 제작 과정을 모식화 한 이미지이고, 도 4의 B) 및 C)는 배양된 펩타이드의 농도에 따른 PDMS의 변화를 SEM 분석법으로 비교한 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 도 4에서 제조된 NGAL BP 펩타이드로 개질된 PDMS 몰드를 사용한 MIPs 필름에 관한 것으로서, 도 5의 A)는 제작 과정을 모식화한 그림이다. 도 5의 B) 및 C)는 5 μM 농도의 펩타이드로 배양된 PDMS를 이용하여 제조된 NGAL BP 각인 고분자의 NGAL BP 제거 전(B)과 후(C)의 SEM 이미지이다. 도 5의 D) 및 E)는 10μM 농도의 펩타이드로 배양된 PDMS를 이용하여 제조된 NGAL BP 각인 고분자의 NGAL BP 제거 전(D)과 후(E)의 SEM 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 A) 3, B) 5, C) 7 및 D) 10 μM NGAL BP 펩타이드로 개질된 PDMS 몰드를 이용해 제조된 NGAL BP 펩타이드 각인 고분자의 추출 전, 후의 EIS 측정 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL BP 제거 및 재결합에 따른 영향을 EIS를 통해 확인한 결과로, 도 7의 A)는 추출 과정에서 시간에 따른 영향을 확인한 결과이고, 도 7의 B)는 NGAL BP 제거 및 재결합에 따른 영향을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL BP 펩타이드 각인 고분자의 NGAL BP 펩타이드 결합 조건을 최적화한 결과로, 도 8의 A)는 NGAL BP 펩타이드의 반응 시간에 따른 영향을 나타낸 그래프이고, 도 8의 B)는 A)로부터 획득된 반응 시간에 대한 ΔR ct(BLK)/R ct(BLK)값을 나타낸 그래프이다. 도 8의 C)는 0.46-27.76 μg/mL 농도의 NGAL BP 펩타이드의 영향을 나타낸 그래프이고, 도 8의 D)는 C)로부터 획득된 NGAL BP 펩타이드 농도의 로그함수에 대한 ΔR ct(BLK)/R ct(BLK)값을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL BP 펩타이드 각인 고분자의 NGAL 단백질 결합 조건을 최적화한 결과로, 도 9의 A)는 1-300 ng/mL 농도 NGAL에 따른 영향을 DPV로 측정한 그래프이고, 도 9의 B)는 EIS로 측정한 것 그래프이다. 또한, 도 9의 C)는 NGAL 농도 1, 100 및 300 ng/mL에서 반응 시간에 따른 ΔR ct(BLK)/R ct(BLK) 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 9의 D)는 NGAL BP 펩타이드가 각인된 필름과 각인되지 않은 필름의 NGAL 단백질에 대한 결합력을 비교한 그래프이고, 도 9의 E)는 다양한 농도의 NGAL 또는 BSA를 이용해 선택성을 확인한 그래프이다. 도 9의 F)는 NGAL BP 각인 필름의 단백질 흡착 시 예상되는 흡착 거동의 개략도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL BP 각인 고분자 필름을 이용하여 크론병 환자의 혈장에서 NGAL을 검출한 것으로, A-C) 경증, D-F) 중증 및 G, H) 위중증 환자 샘플에서의 NGAL 농도를 측정한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 NGAL BP 각인 고분자 필름을 이용하여 크론병 환자의 혈장에서 NGAL을 검출한 것으로, 도 11의 A)는 크론병 환자 혈장의 NGAL을 정량 분석한 그래프이고, 도 11의 B)는 본 발명에서 개발된 MIP 센서와 상업적으로 판매되고 있는 ELISA 키트와의 검출 성능을 비교한 그래프이다.
이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일측면에 따르면, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 호중구 젤라티나제 리포칼린(NGAL) 표적용 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 다른 일측면에 따르면 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 NGAL 단백질 검출용 조성물을 제공하고, 본 발명의 또 다른 일측면에 따르면 펩타이드가 각인된 NGAL 단백질 검출용 고분자 필름을 제공한다. 본 발명의 또 다른 일측면에 따르면 펩타이드를 포함하는 NGAL 단백질 검출용 바이오센서 및 본 발명의 펩타이드를 포함하는 NGAL 단백질 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 서열번호를 유효성분으로 포함하는 조성물은 암, 알러지, 알츠하이머병(Alzheimer disease), 급성신손상염 (acute kidney injury, AKI), 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 심장대사증후군 (cardiometabolic disorders), 제2형 당뇨병 (type 2 diabetes) 및 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease)로 이루어진 군에서 선택된 질환에 특이적인 것인 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는 염증성 대장질환(Crohn's disease), 알츠하이머병(Alzheimer disease), 암, 알러지로 이루어진 군에서 선택된 질환에 특이 적인 것일 수 있으나, NGAL 단백질이 검출되는 특이적 질병에 사용되는 것에 모두 적용가능하다.
본 발명의 바이오센서는 하나 이상의 바이오리셉터가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 반구형 고분자 필름 기반의 바이오센서인 것이 바람직하다. 바이오리셉터는 물리적 흡착 또는 화학결합에 의해 반구형 고분자 필름에 고정화되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 호중구 젤라티나제 리포칼린의 전기화학적 임피던스 검출을 위한 친화성 펩타이드가 각인된 전기화학적 임피던스 검출방법을 제공하며 단계는 다음과 같다:
(a)
다공성 엘라스토머 스탬프를 제조방법하는 단계;
(b)
엘라스토머 스탬프 표면을 친수성으로 개질하는 단계;
(c)
상기 표면 개질된 스탬프 표면에 친화성 펩타이드를 결합하는 단계;
(d)
전극 표면에 친화성 펩타이드가 각인된 반구형 고분자 필름을 중합하는 단계;
기능성 단량체로 아크릴아미드 (acrylamide, AAm)와 이온화 가능한 단량체로 디알릴아민 (diallyamine, DAA) 및 가교제로 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 (N,N'-methylenebisacrylamide, MBAA) 및 중합개시제로 과황산암모늄 (ammonium persulfate, APS)인 것이 바람직하다.
전극은 금(Au), 은(Ag), 동(Cu), 알루미늄(Al), 백금(Pt), 니켈(Ni) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나이상 인 것이 바람직하다.
친화성 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것이 바람직하다. 친화성 펩타이드는 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이상 인 것이 바람직하다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 NGAL 단백질 검출용 펩타이드 또는 이러한 펩타이드가 각인된 고분자 필름을 제공한다.
DRWVARDPASIF(서열번호 1)
DRWVARDPASIFGGGGSC(서열번호 2)
서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열은 박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리 (phage display peptide library) Ph.D.12 (New England BioLab)를 이용한 바이오패닝을 통해 NGAL 단백질에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열을 찾아낸 것이며, 이를 이용하여 전기화학측정을 위해 전극표면에 마이크로 컨택 프린팅 기법을 기반으로 NGAL 특이적 펩타이드가 각인된 반구형 고분자 필름에도 활용 가능하다.
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 NGAL 검출용 펩타이드는 해당 분야에 공지된 다양한 링크서열 및 바이오센서 또는 검출 키트 고정화를 위한 서열이 부가될 수 있다.
바람직한 구현예로 본 발명의 펩타이드에 있어서, 상기 서열번호 2의 펩타이드는 유연한 결합을 위한 유연성 링크 (-GGGGS-)와 금 전극 표면 고정화를 위한 시스테인 (cysteine)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
더불어, 본 발명에 따른 제조된 NGAL 특이적 펩타이드가 각인된 반구형 고분자 필름은 바이오센서로 사용 가능한 다양한 칩 (금 (gold), 은 (silver), 자성 비드 (magnetic bead), 실리카 (silica), 그래핀 (graphene), 탄소 나노튜브 (carbon nanotube)) 등의 다양한 상에 특이적으로 고정될 수 있다.
본 발명의 검출방법에 있어서 반응의 검출은 순환 전압 전류법 (cyclic voltammetry, CV), 사각파전압전류법 (square wave voltammetry, SWV), 펄스차이 전압전류법 (different pulse voltammetry, DPV), 시간대전류법 (chronoamperometry, CA), 전기화학 임피던스 분광법 (electrochemical impedance spectroscopy, EIS), 생물층 간섭계 (bio-layer interferometry, BLI), 수정진동자 마이크로밸런스 (quartz crystal microbalance, QCM), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR), LFA (lateral flow assay)/VFA (variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법 (enzyme-linked immunoassay, ELISA), 형광 공명 에너지 전달 (fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법 (surface-enhanced raman spectroscopy)으로 이루어진 군 에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
본 명세서에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 그리고 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 명세서에서 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는한 복수형도 포함한다.
본 문서에서, "A 또는 B," "A 또는/및 B 중 적어도 하나," 또는 "A 또는/및 B 중 하나 또는 그 이상"등의 표현은 함께 나열된 항목들의 모든 가능한 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, "A 또는 B," "A 및 B 중 적어도 하나," 또는 "A 또는 B 중 적어도 하나"는, (1) 적어도 하나의 A를 포함, (2) 적어도 하나의 B를 포함, 또는 (3) 적어도 하나의 A 및 적어도 하나의 B 모두를 포함하는 경우를 모두 지칭할 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
<실시예>
실시예 1 : M13박테리오파지 디스플레이를 이용한 NGAL 단백질에 고특이적, 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 리셉터 발굴
본 발명에서 사용된 타깃 단백질은 재조합된 NGAL 단백질을 Randox life sciences사로부터 구입해 사용하였으며, Thermo scientific사의 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit을 사용하여 Biotinylation 과정을 거친 후 Bradford assay에 의해 농도를 계산하고, 사용 전까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
더불어 서로 다른 펩타이드가 발현된 재조합 M13박테리오파지로 구성된 M13박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리 (M13 Phage display peptide library)는 Ph.D.-12 (New-england bioLab)를 사용했다.
NGAL 단백질에 특이적인 펩타이드를 발굴하기 위한 선별실험은 스트렙트아비딘 (streptavidin)이 도포되어 있는 평판 (streptavidin high binding capacity coated 96-well plates, Thermo scientific, Cat. No. 15501)을 사용하여 수행되었다. 먼저 바이오틴 (biotin)이 결합된 NGAL 단백질 (30.8 μg/mL) 99 μL와 M13박테리오파지 (6.3×1012 PFU/mL) 1 μL을 마이크로튜브에 같이 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켜 사전 복합체 (pre-complex)를 형성하였다. 이후 스트렙트아비딘 (streptavidin)이 도포되어 있는 평판에 상기 반응물 전부 (100 μL 용량)를 넣고 150 rpm에서 10분간 반응시켜 준 후 200 μL의 0.1% TBST (0.1 mol TBS with 0.1% Tween 20)로 10번 반복하여 씻어주어 타깃 단백질과 결합력이 없거나 약한 M13박테리오파지를 제거하였다. 0.2 mol Glycin-HCl (pH 2.2) 용액으로 NGAL 단백질에 특이적으로 결합하는 파지를 용출하고, 높은 산성에 의한 M13박테리오파지의 변성을 막기위해 15 μL의 Tris-HCl (pH 9.1)을 넣어 중화 (neutralization)시켜 주었다. 용출된 M13박테리오파지 용액은 4℃에서 보관하였으며, NGAL에 특이적인 M13박테리오파지를 얻기 위해서 반응 횟수가 진행될수록 TBST의 트윈 20 (Tween-20) 농도를 0.1, 0.3, 0.5% 순으로 증가시켜 주었다. 상기 과정은 5회 반복 수행되었으며, DNA 서열 분석을 통해 반복적으로 나타나는 펩타이드 서열을 포함하는, 하기 표 1의 M13박테리오파지를 선별하였다.
| 후보군 | 아미노산 서열 (N→C term) |
| NGAL R5#9 | GDGNSVLKPGNW |
| NGAL R5#23 | DRWVARDPASIF |
실시예 2 : 효소면역 측정법 (enzymed-linked immunosorbent assay, ELISA)를 이용한 M13박테리오파지 후보군의 NGAL에 대한 결합력 확인
실시예 1을 통해 선별된 2개의 M13박테리오파지 후보군의 NGAL 단백질에 대한 결합력을 ELISA를 이용하여 확인하였다. 상기 ELISA는 실시예 1에서 사용 한 스트렙트아비딘 (streptavidin)이 코팅되어 있는 플레이트 (streptavidin high-binding capacity coated 96-well plates, 15501, Thermo scientific 사에서 구입)를 사용하였다.
더불어 동일한 농도 조건에서의 결합력 비교를 위해 M13 박테리오파지를 증폭 (amplification)하고 적정을 수행하였다. 먼저 LB 배지에 대장균 (ER 2738) 콜로니를 접종하고 흡광도 (optical density, OD)값이 0.03 - 0.05가 되도록 배양하였다. 그 후 배양액에 10 μL의 M13박테리오파지 후보군의 용출용액을 접종하고 210 rpm으로 교반 하면서 37℃에서 4시간 30분간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 4℃에서 12,000 g 속도로 10분간 원심분리하여 대장균을 제거해 주고, 20% PEG (polyethylen glycol)/2.5 mol NaCl에 의해 침전된 M13박테리오파지를 PBS (0.1 mol, pH 7.4)를 이용하여 수득하였다. 이 후 M13박테리오파지의 적정 (titration)을 수행하고 하기 수학식 1을 통해 파지의 농도 (PFU/mL: Plaque forming units/mL)를 계산하였다.
[수학식 1]
파지 농도(PFU/mL) = Plaque수 Х희석배수 Х mL로 환산한 접종량
상기와 같이 증폭시킨 M13박테리오파지 후보군들을 이용하여 ELISA를 수행하였다. 먼저 바이오틴이 결합된 NGAL 단백질을 스트렙토아비딘 플레이트에 넣고 4℃에서 밤새 배양하였다. 이 후 결합되지 않은 NGAL 단백질을 제거하고, NaHCO3 (pH 8.6) 10 mL에 BSA 0.5 mg을 넣어 제조한 블로킹 (blocking)용액을 넣고 밀봉한 후 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 0.1% TBST (0.1 mol TBS with 0.1% Tween 20, pH 7.4)로 플레이트를 6회 반복 세척하였다. 앞서 증폭된 M13박테리오파지 후보군 용액을 PBS (0.1 mol, pH7.4)를 이용하여 1011 PFU/mL 농도로 희석하고, 제조된 플레이트에 넣은 후 150 rpm으로 교반하면서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 0.1% TBST로 플레이트를 6회 반복 세척하고, HRP가 결합된 Anti-M13박테리오파지 항체 (diluted 1:10,000 in blocking buffer)를 넣어주었다. 반응이 끝난 후 0.1% PBST로 6회 반복 세척하고, ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))와 H2O2의 혼합액을 이용하여 405 nm에서 흡광도 (optical density, OD)값을 측정하였다. 그 결과 도 2의 A)와 같이, 2개의 파지 중에서 NGAL R5#23이 NGAL에 대해 더 큰 결합력을 가지는 것으로 나타났다.
더불어 상기와 동일한 방법으로 NGAL R5#23 후보군의 M13박테리오파지 농도에 따른 영향을 확인하기 위해 107-1011 PFU/mL 농도의 M13박테리오파지를 처리하였다.
그 결과 도 2의 B)와 같이, M13박테리오파지의 농도가 증가함에 따라 NGAL 단백질에 대한 결합력이 증가하였으며, 1011 PFU/mL에서 가장 높은 결합력을 나타내는 것으로 나타났다
동일한 방법으로 NGAL R5#23 후보군의 NGAL 단백질 농도에 따른 영향을 확인하기 위해 1-15.2 μg/mL 농도의 NGAL을 처리하였으며, 혈청의 농도에 따른 M13박테리오파지와 NGAL 단백질의 영향을 확인하기 위해 1-10% 농도의 혈청에 NGAL 단백질을 혼합하여 처리하였다.
그 결과 도 2의 C)와 같이, 소 혈청 알부민 (BSA)에 비해 높은 결합력을 나타내어 뛰어난 선택성을 나타냈고, NGAL 단백질의 농도가 증가함에 따라 NGAL 단백질에 대한 결합력이 증가하는 경향을 나타내었으며, NGAL 단백질 7.6 μg/mL 농도에서 포화되는 경향이 나타났다. 또한 도 2의 D)와 같이, 1%의 혈청에서도 NGAL 단백질에 대한 높은 결합력을 나타내었으며, 10%의 혈청에서는 감소한 결합력을 나타내는 것으로 나타났다.
실시예 3 : M13박테리오파지 디스플레이를 통해 발굴된 아미노산 서열 기반 펩타이드 합성
실시예 1 내지 2를 통해 선별된 NGAL R5#23후보군의 펩타이드(DRWVARDPASIF)를 기반으로, 유연한 결합을 위한 유연성 링커 (-GGGGS-)와 금 전극 표면 고정화를 위한 시스테인 (cysteine)을 포함하여 펩타이드를 디자인하여 하기 표 2의 펩타이드 리셉터를 합성하였다 (펩트론 (Peptron)사에 의뢰).
| 펩타이드 이름 | 아미노산 서열 (N→C term) |
| NGAL BP | DRWVARDPASIFGGGGSC |
실시예 4 : 육각형 밀집 콜로이드 단층의 배열
유리 기판을 아세톤 (acetone), 에탄올 (ethanol) 및 증류수에서 각각 5분 동안 초음파로 세척하였다. 질소 (N2) 가스 로 건조 후, 유리기판에 수산화기 (-OH)를 촉진하기 위해 피라냐 용액 (H2SO4:H2O2 = 3:1, v/v)으로 30분 동안 처리하였다. 다음으로, 전 처리된 유리 기판에 80 μL의 PS 라텍스 분산액을 도포하고, 스핀코터 (BGK, NSF-100DP)를 이용하여 300 rpm으로 5분 동안 스핀코팅 (spin-coating)하였다. 이 후 200 μL의 2wt% SDS (sodium dodecyl sulfate) 수용액을 물-공기 계면에 첨가하여 물 표면에 계면활성제층을 형성하고, 앞서 제조한 기판 위에 무작위로 배열된 PS 단층을 옮겨주었다. 강화된 팩킹 구조 형성을 위해 200 μL의 SDS 용액을 수면에 첨가하였다. 마지막으로 PS 단층을 2x2 cm2 유리기판으로 옮긴 후, 상온에서 하루 동안 건조하였다. 그 결과 도 3의 결과와 같이, 1 μm 지름의 단분산성 PS 입자가 육각형 팩킹 구조로 잘 배열되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 5 : 다공성 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 복제 몰드의 제조 및 친화성 펩타이드 결합
실시예 4에서 제조한 PS 콜로이드 단층을 사용하여 2D 다공성 PDMS 복제 몰드를 제작하였다. 먼저, Sylgard 184 silicone elastomer 키트(Dow Corning Co., MI, USA)를 이용하여 실리콘 엘라스토머 베이스 (silicone elastomer base) 30g과 경화제 (curing agent) 3g을 10분 동안 완전히 혼합하였다. 혼합 과정에서 생성된 기포를 진공 펌프 (DOA-P704-AC, Gas Manufacturing Inc., MI, USA)를 사용하여 제거하였다. 혼합물을 PS 단층에 부은 후, 60°C 오븐에서 3시간 동안 열경화 공정을 수행하였다. 다음으로 PDMS 몰드를 주형 몰드에서 조심스럽게 분리하고, PDMS 복제 몰드에 잔류하는 PS 입자를 톨루엔 (toluene)에 5분 동안 침지하여 제거하였다. 이 후 준비된 다공성 PDMS 복제 몰드의 효율적인 기능화를 위한 친수성 표면 개질을 위해 진공 플라즈마 시스템 (CUTE, Femto Science Inc., Gyeonggi Province, South Korea)을 사용하여 5분 동안 산소 플라즈마 처리하였다. 다음으로, 5 μM 및 10 μM 농도 NGAL BP 펩타이드 0.5 mL를 각각의 PDMS 몰드에 떨어트리고, 2시간 30분 동안 반응시켜 주었다. 반응이 끝난 후 결합되지 않은 NGAL BP 펩타이드를 증류수로 세척하여 제거하고, 제조된 PDMS 몰드를 질소 (N2) 가스 로 건조하였다. 그 결과 도 4의 B)와 같이, 5 μM 농도 펩타이드 배양된 PDMS 표면에 펩타이드를 식별하는 것은 어려웠다. 반면, 도 4의 C)와 같이, 높은 농도 (10 μM)에서 배양된 PDMS 표면에는 다공성 기공 내부에서 펩타이드 응집체를 관찰할 수 있었다.
실시예 6 : 마이크로 컨택 프린팅 기법을 이용한 반구형 NGAL 특이적 펩타이드가 분자각인된 고분자 필름 제조
반구형 NGAL 특이적 펩타이드 각인 고분자 필름을 금으로 코팅된 9MHz 수정 기판 (9 MHz gold-coated AT-cut quartz crystal substrate, QCs)위에 제조하였다. 먼저, NGAL 특이적 펩타이드의 각인을 위한 전구체 용액을 준비하기 위해 아크릴아마이드 (acrylamide, Aam) 200 mg 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 (N,N'-methylenebisacrylamide, MBAA) 100 mg을 1 mL 증류수 및 0.5 mL 에탄올에 각각 용해하였다. 제조된 두 용액을 혼합한 직후 5분 동안 초음파 처리를 수행하고, 10 μL 디알릴아민 (diallyamine, DAA)및 30 mg 과황산암모늄 (ammonium persulfate, APS)를 혼합 용액에 순차적으로 추가하였다. 이 후 혼합액을 부드럽게 섞어주고, 약한 초음파로 10초 간 처리해주었다. 제조된 전구체 용액을 UV 램프 (370 nm, 36W)를 사용하여 40-50초 동안 사전경화 (pre-curing)하고, 사전 경화된 전구체 용액 0.1 μL를 앞서 제조된 NGAL 특이적 펩타이드가 도포된 PDMS 몰드에 올려주고 잘 퍼지도록 가볍게 흔들어 주었다. 전구체 용액이 도포된 PDMS 몰드 표면을 QCs로 덮은 후, 상기와 동일한 조건에서 50분 동안 UV 중합을 수행하였다. 마지막으로, 반응이 끝나고 PDMS 몰드에서 분리된 QCs를 10 v/% SDS 및 아세트산이 포함된 수용액에 넣고 2시간 동안 침지하여 각인된 NGAL-특이적 펩타이드를 제거하고, 증류수로 10분 동안 세척한 후 질소 가스로 건조하였다.
그 결과 도 5의 B)와 같이, 5 μM 농도 NGAL BP 펩타이드와 배양된 PDMS를 이용하여 제조된 MIP 필름에서 미세 입자 형태의 NGAL-BP을 표면 전체에서 관찰할 수 있었고, 필름 높이는 약 150 nm로 나타났다. 또한, 도 5의 C)와 같이, NGAL-BP1 제거 과정을 거친 MIP 필름에서는 펩타이드를 인식할 수 있는 빈 미세 공극을 확인하였다. 반면, 도 5의 D)와 같이, 10 μM 농도 NGAL BP 펩타이드와 배양된 PDMS를 이용하여 제조된 MIP 필름에서는 펩타이드 응집 현상으로 인한 표면의 거대한 응집체가 확인되었다. 또한, 도 5의 E)와 같이, 펩타이드 제거 과정 후 NGAL-BP 펩타이드 응집체가 존재하는 것을 확인하였다.
실시예 7 : 전기화학적 측정법을 이용한 NGAL BP 친화성 펩타이드가 분자각인된 임피던스 바이오센서 최적화 I
실시예 5와 같은 방법을 이용하여 3 내지 10 μM 농도의 NGAL BP 펩타이드로 처리된 PDMS 몰드를 이용하여 제조된 반구형 NGAL BP 각인 고분자 필름의 추출 전과 후의 R ct를 임피던스 분광법 (electrochemical impedance spectroscopy, EIS)을 통해 측정 및 비교하였다. EIS의 측정은 NGAL BP 각인 고분자 필름 코팅된 QCs를 작업 전극, 백금 와이어를 상대 전극, Ag/AgCl을 기준 전극으로 각각 사용하는 일반적인 3전극법을 통해 100 kHz-0.01 Hz 주파수 범위, 0.2V의 DC 전위 및 10 mM 진폭에서 수행하였으며, 10 mM [Fe(CN)6]3-/4-를 포함하는 PBS 용액(10 mM, pH = 7.4)을 전해질로 사용하였다.
그 결과 도 6의 A)에서와 같이, 3 μM 농도의 NGAL BP 펩타이드가 처리된 PDMS 몰드를 통해 제조된 MIP의 추출 전과 후 R ct 변화는 불충분한 NGAL BP 펩타이드의 각인으로 인해 매우 낮게 나타났다. 도 6의 B)에서와 같이, 5 μM 농도의 NGAL BP 펩타이드에서 배양된 경우, 최적의 기공형성으로 인해 가장 큰 R ct 변화가 나타났다. 반면, 도 6의 C) 및 D)에서와 같이 7 μM 및 10 μM 농도에서 배양된 경우, NGAL-BP1의 큰 응집으로 인해 낮은 R ct 변화를 관찰할 수 있었다. 따라서 효율적인 표면 각인 감지 플랫폼 설계를 위해 PDMS에 처리되는 NGAL BP 펩타이드 농도를 5 μM로 설정하였다.
실시예 8 : 전기화학적 측정법을 이용한 NGAL BP 친화성 펩타이드가 분자각인된 임피던스 바이오센서 최적화 II (고분자 필름 내 펩타이드 제거 조건 최적화 및 재사용성 평가)
NGAL BP 각인 고분자 필름 내 펩타이드 제거 조건 최적화를 위해 SDS 수용액 (10 vol%) 및 아세트산 수용액 (10 vol%) 1:1 vol%로 구성된 혼합용액 내에서 NGAL BP 제거 과정을 수행하고, 실시예 7의 EIS 측정 방법을 이용하여 제거 시간에 따른 R ct 변화를 관찰하였다. 그 결과 도 7의 A)에서와 같이, 제거시간 2 시간에서 조건이 최적화된 것을 확인하였다.
또한 NGAL BP 각인 고분자 필름 재사용성을 평가하기 위해 펩타이드가 제거된 MIP 필름에 18.51 μg/mL 농도의 NGAL BP 펩타이드를 15분간 배양한 후, 배양 전과 후의 R ct 변화를 실시예 7의 EIS 측정 방법을 이용하여 세 차례 반복하여 측정하였다. 그 결과 도 7의 B)에서와 같이, 반복되는 주기에서 동일한 R ct 값이 확인되었으며, MIP 필름의 재사용 가능 여부를 확인하였다.
실시예 9 : 전기화학적 측정법을 이용한 NGAL BP 친화성 펩타이드가 분자각인된 임피던스 바이오센서 최적화 III (NGAL BP 각인 고분자 필름의 NGAL BP 배양 시간 최적화 및 농도의존성 분석)
실시예 7의 EIS 측정 방법을 이용하여 추출된 MIP 필름에 NGAL BP 펩타이드 반응시간과 NGAL BP 농도에 따른 R ct의 변화를 비교하였다. 그 결과 도 8의 A)에서와 같이 NGAL BP 흡착 시간이 경과함에 따라 결합된 NGAL BP 양이 비례적으로 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 8의 B)에서와 같이, NGAL BP 농도에 따른 임피던스 응답은 NGAL BP의 빠른 확산과 특이적 인식으로 인해 초기 10분 동안 점진적인 기울기를 나타내다가 그 이후에 안정화되어 평형에 도달하는 것을 확인하였으며, 도 8의 C)에서와 같이, NGAL BP 농도가 증가함에 따라 R ct 값이 비례적으로 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 8의 D)에서와 같이, log(CBP1) 및 ΔR ct/R ct(BLK) 플롯을 이용해 얻은 결정계수가 0.983, 기울기가 0.489인 선형 보정 곡선을 얻고 난 후, 하기 수학식 2를 이용하여 검출한계 (limit of detection, LOD) 및 정량 한계 (limit of quantification, LOQ)를 계산하였다.
[수학식 2]
검출한계 (limit of detection, LOD) = (3 Х y절편의 표준 편차) /보정 곡선의 기울기
정량 한계 (limit of quantification, LOQ) = (10 Х y절편의 표준 편차) /보정 곡선의 기울기
그 결과 MIP 필름의 LOD 및 LOQ 값은 각각 0.07 및 0.24 μg/mL로 나타났다.
실시예 10 : 전기화학적 측정법을 이용한 NGAL BP 친화성 펩타이드가 분자각인된 임피던스 바이오센서 최적화 IV (NGAL BP 펩타이드 각인 고분자 필름의 타깃단백질 농도의존성 및 선택성 측정)
상기 실시예에서 제조된 NGAL BP 펩타이드가 각인된 MIP 필름을 1-300 ng/mL 농도의 NGAL 단백질과 1 시간 동안 반응시킨 후, 전기화학적 특성의 변화를 차동펄스 전압법 (diffenrential pulse voltammetry, DPV) 및 상기의 EIS를 통해 분석하였다. DPV는 펄스 높이 25 mV, 펄스 폭 20 ms 및 스텝높이 5 mV에서 수행하였으며, 상기 기술된 EIS와 같이 상기의 3전극법을 이용하여 10 mM [Fe(CN)6]3-/4-를 포함하는 PBS 용액(10 mM, pH = 7.4)에서 수행하였다. 그 결과 도 9의 A)에서와 같이, DPV를 이용한 분석에서 MIP 필름의 전류는 NGAL 농도가 증가함에 따라 감소하였으며, EIS를 이용한 분석에서는 도 9의 B)에서와 같이 MIP 필름의 R ct 값이 NGAL 농도가 증가함에 따라 증가하는 것을 확인하였다.
더불어, 다양한 NGAL 농도에서의 반응 시간에 따른 흡착 거동을 조사하였으며, 도 9의 C)에서와 같이 낮은 농도에서는 4시간 반응 후에 안정화되었고, 그보다 더 높은 농도에서는 1시간 반응 후 안정화되었다.
또한, NGAL BP가 각인된 고분자 (I-MIP)와 NGAL BP 제거된 고분자 필름 (E-MIP)에 대한 NGAL단백질의 결합력을 비교한 결과, 도 9의 D)에서와 같이 I-MIP에서만 NGAL 단백질에 대한 결합력이 확인되었고, 소 혈청 단백질 (bovine serum albumin, BSA)을 이용하여 특이성을 비교한 결과, 도 9의 E)에서와 같이 NGAL 단백질에 대한 결합력이 BSA에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다.
따라서, 상기의 결과들을 종합하였을 때 제조된 NGAL BP가 각인된 MIP는 NGAL 단백질에 대한 높은 결합력과 선택성을 나타내는 것을 확인하였으며, 상기 실시예들을 통해 최적화된 반응 조건을 활용하여 본 발명의 새로운 검출법이 NGAL 단백질에 활용될 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 11 : NGAL BP 친화성 펩타이드가 분자각인된 임피던스 바이오센서 성능평가 (크론병 환자 샘플 테스트 및 개발된 센서와 시판된 ELISA 키트를 이용한 NGAL 검출 특성 비교분석)
상기의 EIS 측정 방법을 이용하여 총 8명의 크론병 환자의 조혈장 및 혈청의 100배 희석된 샘플을 1시간 동안 반응시킨 후, NGAL BP 각인 MIP 필름에 대한 EIS 측정을 수행하였다. 그 결과 도 10의 A) 내지 C) 및 D) 내지 F)에서와 같이, 경증 (n=3) 및 중증 (n=3)에서 환자 샘플 배양 전, 후 임피던스 특성 변화는 매우 미미하였다. 그러나, 도 10의 G) 및 H)에서와 같이, 위중증 (n=2) 환자 샘플에서 배양 전, 후 임피던스 특성은 유의미하게 차이나는 것을 확인하였다. 하기 표 3은 본 발명에 사용된 크론병 환자 샘플의 정보를 나타낸 것이다.
| 특징 | 크론병 환자 |
| 샘플갯수 | 8 |
| 성별 | 남: 4, 여: 2 |
| 평균 연령 (years) | 13.6 |
| 중증도 | |
| Mild (매우 경미) | 3 |
| Moderate (경미) | 3 |
| Severe (심각) | 2 |
도 3을 참고하여 설명하면, 도 11의 A)에서와 같이, 경증 및 중증 그룹의 NGAL 농도는 각각 141.01 및 264.73 ng mL-1인 반면 위중증 그룹의 NGAL 농도는 1131.69 ng mL-1로 나타났다. 또한, two-way ANOVA 분석에서 크론병 환자의 중증/위중증 및 경증/위중증 그룹의 NGAL 농도 변화는 경증/중증도 그룹 (p<0.05)과 대조적으로 유의하게 달랐고 (p<0.001) 이는 NGAL 발현 수준이 환자에 크게 의존함을 나타냈다.
또한, 도 13의 B)에서와 같이, MIP 센서 시스템의 성능을 테스트하기 위해 검출 감도를 상용 NGAL ELISA KIT와 비교하였다. 크론병 환자의 샘플에 대해 두 방법 (ELISA, MIP)에 대한 상관 계수는 0.937로 나타났다.
따라서 본 발명의 M13박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 NGAL 특이적 펩타이드 (NGAL BP)가 각인된 고분자 필름은 NGAL 단백질과 고선택적, 고민감도로 결합할 수 있음을 확인하였으며, 본 발명에 따른 NGAL BP가 각인된 고분자 필름은 염증성대장질환의 대표적인 크론병 환자의 혈장과 혈청에 미량 존재하는 NGAL 단백질의 검출 뿐만 아니라 NGAL 단백질 검출을 통한 실제 질병의 진단에 사용될 수 있음을 확인하였다.
전술한 내용은 후술할 발명의 청구범위를 더욱 잘 이해할 수 있도록 본 발명의 특징과 기술적 장점을 다소 폭넓게 상술하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (6)
- 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 표시되는 호중구 젤라티나제 리포칼린(NGAL) 표적용 펩타이드.
- 제 1 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 NGAL 단백질 검출용 조성물.
- 제 1 항의 펩타이드가 각인된 NGAL 단백질 검출용 고분자 필름.
- 제 1 항의 펩타이드를 포함하는 NGAL 단백질 검출용 바이오센서.
- 제 1 항의 펩타이드를 포함하는 NGAL 단백질 검출용 키트.
- 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 암, 알러지, 알츠하이머병(Alzheimer disease), 급성신손상염 (acute kidney injury, AKI), 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 심장대사증후군 (cardiometabolic disorders), 제2형 당뇨병 (type 2 diabetes) 및 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease)로 이루어진 군에서 선택된 질환에 특이적인 것임을 특징으로 하는 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220060064A KR20230160511A (ko) | 2022-05-17 | 2022-05-17 | 호중구 젤라티나제 리포칼린과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020220060064A KR20230160511A (ko) | 2022-05-17 | 2022-05-17 | 호중구 젤라티나제 리포칼린과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230160511A true KR20230160511A (ko) | 2023-11-24 |
Family
ID=88972352
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| Country | Link |
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| KR (1) | KR20230160511A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101940014B1 (ko) | 2010-02-05 | 2019-01-21 | 아스튜트 메디컬 인코포레이티드 | 신손상 및 신부전을 진단 및 예측하는 방법 및 조성물 |
-
2022
- 2022-05-17 KR KR1020220060064A patent/KR20230160511A/ko unknown
Patent Citations (1)
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| KR101940014B1 (ko) | 2010-02-05 | 2019-01-21 | 아스튜트 메디컬 인코포레이티드 | 신손상 및 신부전을 진단 및 예측하는 방법 및 조성물 |
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