KR20230152127A - 알레르기성이 감소된 면역원성 단백질 가수분해물 - Google Patents

알레르기성이 감소된 면역원성 단백질 가수분해물 Download PDF

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한스 베르텔센
소렌 클리트가드
롯데 네어가드 야콥센
디테 묄러 닐슨
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Abstract

본 발명은 감소된 알레르기성 및 유지된 면역원성을 갖는 새로운 유청 단백질 가수분해물에 관한 것이다. 상기 새로운 유청 단백질 가수분해물은 또한 더 큰 펩타이드들의 양이 적은 것이 특징이다. 본 발명은 또한 상기 새로운 유청 단백질 가수분해물을 제조하는 방법, 상기 새로운 유청 단백질 가수분해물의 용도 및 이 새로운 유청 단백질 가수분해물을 포함하는 식품에 관한 것이다.

Description

알레르기성이 감소된 면역원성 단백질 가수분해물
본 발명은 우유 알레르기 및 경구 내성 유발에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 알레르기성이 감소되고 그리고 면역원성은 유지된 유청 단백질 가수분해물 및 상기 유청 단백질 가수분해물의 제조 방법에 관한 것이다.
음식 알레르기는 특정 음식을 먹은 후 발생하는 비정상적인 면역 반응이다. 일반적으로, 알레르기는 알레르겐이라고 불리는, 무해한 단백질들에 대한 면역 내성이 발달하지 못하여 발생한다. 대신에, 감작(sensitization)이라고 알려진 면역 반응이 발생한다. 일단 민감해진, 개인은 충분한 양의 상기 알레르겐에 새롭게 노출되면 부작용(임상적 알레르기)을 경험할 수 있다. 상기 알레르기 반응은 일반적으로 노출 후 몇 분에서 몇 시간 내에 발생하고, 그리고 상기 증상 범위는 경증(입술 부종, 입 가려움증)부터 중증까지 다양하다. 어떤 사람들에게는 생명을 위협하는 반응(아나필락시스)을 일으킬 수도 있다. 알레르기는 피부, 호흡기, 위장 반응을 포함한 다양한 증상으로 나타난다.
3세 미만 어린이의 약 6~8%가 음식 알레르기에 영향을 받는 것으로 추정된다. 우유는 유병률 2~3%로 어린이의 음식 알레르기의 가장 흔한 원인 중 하나이다.
알레르기 질환은 전 세계적으로 증가하고 있으며, 이에 따라, 효과적인 예방 솔루션에 대한 필요성도 높아지고 있다. 우유 알레르기를 앓고 회복한 유아가 나중에 아토피 피부염, 천식 및 꽃가루 알레르기와 같은 아토피 증상을 보이는 경향이 강하기 때문에 예방이 중요하다. 이것은 질병 이후에 삶의 질, 그리고 의료비 측면에 부담이 되는 이른바 '알레르기 행진(allergic march)'이다. 현재 치료법은 없으며 그리고 알레르기 반응을 예방하는 가장 좋은 방법은 알레르겐으로 확인된 음식을 피하는 것이다.
우유에 대한 알레르기는 전 세계적으로 큰 문제이고, 그리고 우유 알레르기는 유아에게서 유병률이 높기 때문에, 알레르기 발병을 예방하는 유아용 조제분유에 대한 필요성이 매우 높다.
알레르기 반응을 피하기 위해 신체에서 사용하는 메커니즘 중 하나는 특정 물질에 대한 내성을 키우는 것(감작 방지)이다. 내성은 면역원성이 높은 물질에 의해 유발된다. 경구 내성은 경구 경로를 통해 투여된 알레르겐에 대한 면역 체계의 활성 무반응이다. 점막 면역 체계는 각각, 염증이나 내성을 유발하는 유해한 화합물과 무해한 화합물을 구별할 수 있다. 식품 성분은 면역 반응을 지속적으로 억제해야 하는 중요한 비자기 알레르겐이다. 이러한 유형의 내성 유도를 경구 내성이라고 한다. 알레르겐 회피가 알레르기 예방에 성공하지 못하거나 심지어 해로울 수도 있다는 것이 점점 더 분명해지고 있다. 식품 단백질들에서 추출한 펩타이드들에 의한 경구 내성 유도는 면역체계를 감작 대신 내성 방향으로 끌어들이는 강력한 수단이다.
유청 단백질 가수분해물을 유아용 조제분유를 포함한 다양한 식품의 성분으로 사용하는 것은 잘 알려져 있다. 유청 단백질 가수분해물은 일반적으로 유청 단백질 농축물과 같은, 유청 단백질 물질을 식품 등급의 단백질 분해 및/또는 펩타이드 분해 제제와 함께 원하는 가수분해의 정도까지 가수분해하여 제조된다. 어떤 상황에서는, 유청 단백질 가수분해물이 낮은 알레르기성을 가지도록 하기 위해 큰 펩타이드의 함량이 적고 가수분해의 정도가 높은 유청 단백질 가수분해물을 제조하는 것이 바람직하다.
알레르기 관리에 사용되는 기존 유청 단백질 가수분해물 중 일부는 한외여과를 하였다. 한외여과는 더 큰 펩타이드들을 제거하고, 그리고 한외여과된 유청 단백질 가수분해물은 알레르기 반응을 유발하지 않는다. 그러나, 한외여과된 유청 단백질 가수분해물은 알레르기성이 낮아 우유에 알레르기가 있는 유아나 어린이에게 투여하면 알레르기 반응을 피할 수 있음을 의미하지만, 면역원성도 또한 낮다는 단점이 있다. 따라서, 한외여과된 유청 단백질 가수분해물은 우유 단백질에 대한 경구 내성을 유발하지 않는다.
예를 들어 EP 0 642 307 A1에서, 발명자들은 가수분해의 정도가 15% 내지 35%인 유청 단백질 가수분해물을 제조하는 방법에서 가수분해 후 한외여과를 사용한다. EP 0 642 307 A1에 개시된 바와 같이, 획득된 상기 유청 단백질 가수분해물은 알레르기성을 감소시켰다. 그러나, 한외여과 단계 때문에, 상기 면역원성이 낮아져, 경구 내성 유도를 방해할 수 있다.
또한, 당업계에서는 높은 용해도 및 열 안정성을 갖는 유청 단백질 가수분해물을 생산하는 것을 원하였다. 이는 가수분해 동안에 제품에 미네랄을 첨가함으로써 달성될 수 있다.
그러나, 세계 각지의 지역 제한으로 인해, 제품에 회분을 포함한, 미네랄 첨가량을 제한하는 것이 요구된다. 중국에서는, 회분 함량을 5.5% 이하로 제한해야 한다.
따라서, 큰 펩타이드들(2500 Da 이상의 펩타이드들)의 비율이 낮기 때문에 면역원성을 감소시키지 않으면서 알레르기성을 감소시키는 유청 단백질 가수분해물이 유리할 것이다.
본 발명의 목적은 알레르기성이 감소되고 그리고 면역원성은 유지된 유청 단백질 가수분해물에 관한 것이다.
본 발명의 발명자들은 유청 단백질의 효소 가수분해를 위한 특정 효소 조합과 결합된, 가수분해 단계 사이에 열 처리와 함께 특정 2단계 가수분해 방법을 사용함으로써, 알레르기성을 감소시키고 그리고 면역원성을 유지한 적은 양의 큰 펩타이드들(총 단백질 함량의 2500 Da보다 큰 분자량을 갖는 7.5% 미만의 펩타이드들)을 함유한 유청 단백질 가수분해물을 얻을 수 있다는 점을 놀랍게도 발견하였다. 게다가, 유청 단백질 가수분해물은 소량의 회분을 포함한다.
상기 두 가수분해 단계 사이의 상기 열처리는 상기 단백질의 펼침을 유발한다. 이러한 펼침은 단백질의 묻혀 있는 부분을 노출시키고 그리고 가수분해의 제2 가수분해 단계에서 상기 효소가 열처리 전에는 접근할 수 없었던 새로운 절단 부위에 접근할 수 있게 해준다. 이로써, 상기 단백질의 추가 가수분해가 얻어지고, 그리고 얻은 상기 단백질 가수분해물은 열처리 없이 제조된 단백질 가수분해물과 비교하여 낮은 비율의 큰 펩타이드들을 포함한다.
본 발명의 일 양태는 다음 특징들을 갖는 유청 단백질 가수분해물에 관한 것이다:
i) 분자량이 2500 Da 이상인 펩타이드들을 총 단백질 함량의 7.5 중량% 이하로 포함하는 것;
ii) RBL 세포 분석에서 측정된 베타-락토글로불린(BLG)의 농도가 500 mg BLG/kg 단백질 미만인 것에 해당하는 알레르기 유발성;
iii) 가수분해되지 않은 유청 단백질과 본질적으로 동일한 면역화된 동물들의 혈청 IgG 적정농도에 기초한 면역원성;
iv) 본질적으로 원형 단백질을 포함하지 않는 것.
본 발명의 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 유청 단백질 가수분해물의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 유청 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;
b) 유청 단백질을 포함하는 상기 용액에, 적어도 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)로부터의 서브틸리신(subtilisin), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 서몰리신(thermolysin) 및 아나나스 초모수스(Ananas comosus)로부터의 시스테인 엔도프로테아제(cysteine endoprotease)를 첨가하고 그리고 제1 가수분해 단계를 수행하는 단계;
c) 단계 b)의 상기 가수분해된 용액을 적어도 60℃의 온도로 조절하고 그리고 남아있는 접힌 단백질을 펼치기 위해 충분한 시간 동안 상기 온도를 적어도 60℃로 유지함으로써 열처리하는 단계;
d) 단계 c)의 상기 열처리된 용액의 상기 온도를 50℃ 내지 70℃의 온도로 조절하는 단계
e) 단계 d)의 상기 가수분해물에 적어도 바실러스 리체니포미스로부터의 서브틸리신을 첨가하고 그리고 제2 가수분해 단계를 수행하는 단계;
f) 상기 가수분해의 정도가 적어도 17% 일때 상기 효소들을 비활성화하는 단계;
유청 단백질 가수분해물을 얻기 위함.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물을 포함하는 식품에 관한 것이다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물의 유아들 영양에서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 발명에 따른, 유아들 또는 이를 필요로 하는 환자들의 우유 단백질에 대한 알레르기 위험을 감소시키는데 사용하기 위한 것인, 유청 단백질 가수분해물에 관한 것이다.
더욱 추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 발명에 따른, 유아들 또는 이를 필요로 하는 환자들의 아토피성 피부염, 천식 및/또는 알레르기성 비염의 예방 또는 발병 위험을 감소시키기 위한 것인, 유청 단백질 가수분해물에 관한 것이다.
이제 본 발명을 이하에서 보다 상세하게 설명한다.
정의
본 발명을 더욱 상세하게 논의하기 전에, 다음 용어 및 관례가 먼저 정의될 것이다:
본 발명의 단수형 특징 또는 제한 사항에 대한 모든 언급은 언급된 문맥에 따라 달리 명시되거나 명백히 반대되는 의미를 갖지 않는 한, 상응하는 복수형 특징 또는 제한 사항을 포함해야 하며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본 명세서에 언급된 모든 백분율은 달리 명시되지 않는 한 중량 백분율이다. 또한, "건조물 중량 기준" 및 "건조물 기준"이라는 용어는 동일한 개념을 나타내고 그리고 상호 교환적으로 사용된다.
예를 들어 1% w/w에서와 같은 용어 "w/w"는 1 중량%의 화합물을 포함하는 조성물을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 상기 용어 "베타-락토글로불린"은 "BLG"로도 지칭될 수 있다. 상기 용어는 상호 교환적으로 사용될 수 있고 그리고 포유동물 종의 BLG와 관련되어 있다. 또한, 본 발명의 맥락에서 상기 용어 "알파-락트알부민"은 "ALA"로 지칭될 수 있고 그리고 포유동물 종으로부터의 알파-락트알부민에 관련 되어있다.
유청 단백질 가수분해물
일 양태에서, 본 발명은 다음 특징들을 갖는 유청 단백질 가수분해물에 관한 것이다:
i) 분자량이 2500 Da 이상인 펩타이드들을 총 단백질 함량의 7.5 중량% 이하로 포함하는 것;
ii) RBL 세포 분석에서 측정된 베타-락토글로불린(BLG)의 농도가 500 mg BLG/kg 단백질 미만인 것에 해당하는 알레르기 유발성;
iii) 가수분해되지 않은 유청 단백질과 본질적으로 동일한 면역화된 동물들의 혈청 IgG 적정농도에 기초한 면역원성;
iv) 본질적으로 원형 단백질을 포함하지 않는 것.
따라서, 본 발명은 감소된 알레르기성 및 유지된 면역원성 그리고 본질적으로 원형 단백질이 존재하지 않는 적은 양의 고분자량 펩타이드들을 갖는 유청 단백질 가수분해물에 관한 것이다.
"알레르기성" 이라는 용어는 알레르겐 물질을 의미한다. 알레르겐은 신체에 무해한 물질에 대해 원치 않는 면역 반응을 유도하는 일종의 항원이다. 상기 알레르겐은 대상의 상기 면역체계에 의한 IgE 반응을 통해 반응을 자극할 수 있다. IgE는 감염으로부터 신체를 방어하는 정상적인 조건하에 있다.
"알레르기 가능성" 이라는 용어는 항체 결합 능력을 가진 물질을 의미한다. 결합은 알레르기 반응이 일어나기 위한 전제 조건이다. 상기 알레르기 가능성은 ELISA 분석을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명과 관련하여, "감작"이라는 용어도 또한 사용된다. 알레르기의 면역 반응은 감작과 함께 시작된다. 감작성 알레르겐에 대해 첫 번째 노출은 혈장 B세포가 IgE 항체를 생성하도록 자극되고, 이는 다른 면역글로불린 동종형의 항체와 마찬가지로, 단편 항원 결합(Fab) 부분을 통해 특정 알레르겐에 결합할 수 있다. 다양한 알레르겐은 해당 알레르겐 특이 IgE 항체의 생성을 자극한다. 우유에서, 베타-락토글로불린은 우려되는 알레르겐이고 그리고 상기 면역 체계는 베타-락토글로불린의 특정 에피토프(epitope)를 향해 반응하는 항체의 클론 선택에 의해 알레르기 반응을 매개할 수 있다. 일단 형성되고 그리고 순환계로 방출되면, IgE는 결정화 가능한 단편(Fc) 부분을 통해, 비만 세포의 높은 친화성 수용체들에 결합하고, 나중에 알레르겐과 상호작용할 수 있는 알레르겐 특이적 수용체 부위(파라토프(paratope))를 남긴다(예. 베타-락토글로불린의 에피토프). IgE에 대한 높은 친화성 수용체들을 발현하는 것으로 알려진 다른 세포로는 호염기성세포(basophils), 랑게르한스 세포(Langerhans cells) 및 활성화된 단핵구(monocytes)가 있다. 알레르겐 특이적인 IgE 항체의 생산은 감작으로 알려진 상기 면역 반응을 완료한다. 동일한 알레르겐에 재노출된 후, 상기 알레르겐은 상기 비만 세포 표면의 특이적 IgE 항체와 결합 및 교차 결합하고, 상기 비만 세포의 탈과립화 및 히스타민과 같은 염증 매개체의 방출로 인해 알레르기 반응이 발생한다.
본 발명의 맥락에서 "유청 단백질 가수분해물" 이라는 용어는 당업자가 유청 단백질 가수분해물로 알고 있는 것과 동일한 것이고, 즉 유청 단백질 시재료의 효소 가수분해에 의해 얻어지는 가수분해된 유청 단백질 물질을 의미한다. 따라서 유청 단백질 가수분해물은 유청 단백질 시재료를 효소 가수분해하여 직접 얻은 제품이다. 따라서, 임의의 펩타이드들(유청에서 유래한 것 일지라도)을 결합한 조성물은 상기 조성물이 유청 단백질의 효소 가수분해에 의해 얻어지는 것이 아니라면 유청 단백질 가수분해물이 아니다.
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물은 알레르기성이 감소된 것을 특징으로 한다. 감소된 알레르기성은 베타-락토글로불린의 농도에 따라 나타날 수 있는데, 왜냐하면 상기 유청 단백질인, 베타-락토글로불린은 알레르겐이므로 우유에 알레르기가 있는 개인에게 알레르기 반응을 일으킬 수 있기 때문이다. 가수분해되지 않은 유청 단백질 농축물은 약 540,000mg/kg 분말의 양으로 베타-락토글로불린을 포함할 수 있다. 그러나, 프로테아제 처리 후, 베타-락토글로불린은 펩타이드들로 가수분해되고, 그리고 알레르기 반응을 일으킬 수 있는 상기 유청 단백질 가수분해물 내 상기 베타-락토글로불린의 농도가 감소한다. 따라서, 유청 단백질 가수분해물의 알레르기성을 표현할 때, 상기 베타-락토글로불린의 농도가 사용 될 수 있다. 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물에는, RBL(rat basophilic leukemia) 세포 분석에서 측정된 상기 베타-락토글로불린의 농도는 500 mg/kg 총 단백질 미만인 것으로 확인되었다.
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 상기 알레르기성은 단백질 가수분해물과 같은 단백질 제제에 의한 IgE 항체의 탈과립화에 의해 표현된다.
탈과립화는 호염기성세포/비만 세포와 같은 반응기 세포들에 대한 특정 IgE 항체들에 의한 식품 알레르겐들의 교차 결합의 결과이다. 탈과립화가 일어나기 위해서는, 알레르겐이 두 개의 서로 다른 에피토프들을 포함할 만큼 충분히 커야 하며 이에 따라 호염기성세포/비만 세포에 있는 두 개의 IgE 항체들과 결합해야 한다. 알레르겐이 세포에 부착된 두 개의 IgE 항체들에 결합되면 IgE 항체들의 교차 결합을 유발하여 탈과립을 일으키고, 이는 대상에게 다양한 증상을 유발하는 매개체를 방출하게 된다. 이러한 알레르겐의 비제한적인 예는 베타-락토글로불린이다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서 상기 유청 단백질 가수분해물은 RBL 세포 분석에서 측정된 500 mg BLG/kg 단백질 미만에 해당하는 알레르기성을 갖는다. RBL 세포 분석은 당업계에 잘 알려져 있고 그리고 RBL 세포들은 IgE 및 이의 FcεRI 수용체에 대한 세포의 강한 반응으로 인해 알레르기 연구에 사용되는 것으로 일반적으로 알려져 있고, 예를 들어 Na Sun et al "Use of a rat basophil leukemia (RBL) cell-based immunological assay for allergen identification, clinical diagnosis of allergy, and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy", 면역독성학 저널, p. 199-2052014 을 참조. 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 알레르기성을 측정하는 것과 관련하여 다양한 RBL 분석이 사용될 수 있으며, 예를 들어 폴란드 Polpharma Biologics S.A.에서 제공하는 RBL 분석이 있다.
본 발명의 맥락에서, 상기 용어 "베타-락토글로불린" 또는 (BLG)는 우유 유청의 주요 단백질을 의미한다. 유청 BLG는 잘 알려진 알레르겐 및 IgE 반응 유도 물질에 해당한다. 따라서, 베타-락토글로불린의 수준을 알레르기성을 매개하는 물질의 가능성을 나타내는 지표로서 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 측정한 베타-락토글로불린의 농도가 500 mg/kg 총 단백질 미만인 것에 상응하는 알레르기 가능성을 갖는다. ELISA 분석은 당업계에 잘 알려져 있고 그리고 임의의 유형의 ELISA 분석을 사용하여 BLG를 측정할 수 있다. 상기 베타-락토글로불린 농도를 측정하는 데 사용할 수 있는 ELISA 분석의 예로는 경쟁적 효소 면역분석, 즉 경쟁적 ELISA 분석이 있다. 예를 들어 독일, R-Biopharm AG에서 제공하는 상기 ELISA 분석 RIDASCREEN® 베타-락토글로불린 분석(Art. NO. R4901)이 될 수 있고, 이 분석은 유청 단백질 가수분해물 및 식품들에 있는 천연 및 가공된 잔류 베타-락토글로불린을 정량화하도록 설계되었다. 그러나, 다른 ELISA 분석을 사용하여 BLG 농도를 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 알레르기 가능성은 ELISA에서 측정된 베타-락토글로불린의 농도가 400 mg/kg 총 단백질 이하인 것에 해당하고, 바람직하게는 상기 알레르기 가능성은 ELISA에서 측정된 베타-락토글로불린의 농도가 350 mg/kg 총 단백질 이하인 것에 해당하고, 훨씬 더 바람직하게는 알레르기 가능성은 ELISA에서 측정된 베타-락토글로불린의 농도가 300mg/kg 총 단백질 이하인 것에 해당한다.
유청 단백질 가수분해물의 알레르기성을 표현하는 또 다른 방법은 상기 단백질 가수분해물을 처리한 동물들의 혈청 내 IgE 항체 적정농도에 의한 것이다. "IgE 적정농도"라는 용어는 상기 단백질 가수분해물이 처리된 동물들의 혈청 내 IgE 항체들의 상기 농도를 측정한 것이다. 여기서, 항체 적정농도(IgG 또는 IgE)는 유청 단백질의 에피토프들을 인식하는 쥐 혈청 내 항체 농도로 정의되고, ELISA에서 양성 결과를 나타내는 가장 높은 희석률의 역수로 표현된다.
알레르기성은 항체 또는 세포 매개일 수 있는 "면역학적 메커니즘에 의해 매개되는 과민반응"으로 정의될 수 있다. 대부분의 경우, 일반적으로 알레르기 반응을 일으키는 상기 항체는 상기 IgE 동종형에 속하고 그리고 개인은 IgE 매개 알레르기 질환을 앓고 있는 것으로 지칭될 수 있다. 따라서, 상기 단백질 가수분해물을 처리한 동물들의 혈청에서 IgE 항체 적정농도를 측정하는 것은 IgE 매개 알레르기성 수준을 표현하는 좋은 방법이다.
비IgE 매개 알레르기는 IgE 항체들 외에 면역 체계의 다른 구성 요소와 관련된 반응으로 인해 발생한다. 상기 반응은 음식 섭취 직후에는 나타나지 않고 그리고 일반적으로 위장관 반응과 관련이 있다. 대조적으로, IgE 매개 식품 알레르기의 징후 및 증상은 일반적으로 섭취 후 몇 분 이내에 발생하고 그리고 두드러기, 피부 발적, 구토를 포함하며 더 심각한 반응에서는 아나필락시스를 포함한다. IgE 매개 음식 알레르기와는 달리 이러한 유형의 음식 알레르기의 메커니즘은 잘 알려져 있지 않기 때문에, 비IgE 매개 음식 알레르기를 진단하는 데 일반 의학에서 유용하다고 입증된 혈액 또는 피부 검사가 없다.
음식 알레르기는 IgE 매개성 알레르기 및 비IgE 매개성 알레르기로 동등하게 구분되는 것으로 가정된다. 그러나, 두 가지 유형의 알레르기 모두 동일한 개인에게서 나타날 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 동일한 농도의 온전한 유청 단백질을 처리한 동물들로부터 35일 후 혈청에서 얻은 IgE 항체 적정농도의 최대 50%가 되는 단백질 가수분해물을 처리한 동물들로부터 35일 후 혈청 내 IgE 항체 적정농도를 제공한다. 상기 동물은 바람직하게는 포유동물이다. 본 발명을 설명하는 실시예에서, 상기 IgE 항체 적정농도를 측정하기 위해 쥐(rat)를 사용하였다. 바람직하게는, 상기 단백질 가수분해물을 처리한 동물들로부터 35일 후 혈청 내 상기 IgE 항체 적정농도는 동일한 농도의 온전한 유청 단백질을 처리한 동물들로부터 35일 후 혈청에서 얻은 IgE 항체 적정농도의 최대 40%이다.
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물은 또한 유지된 면역원성을 갖는 것을 특징으로 하고, 이는 상기 단백질 가수분해물을 처리한 동물들의 혈청 내 IgG 항체 적정농도에 의해 표현될 수 있다. "적정농도"라는 용어는 상기 단백질 가수분해물을 처리한 동물들의 혈청 내 항체들의 존재 및 양을 의미한다. IgG는 베타-락토글로불린과 같은 항원들에 대한 제1차 및 제2차 반응으로 생산된다. 따라서, 혈청 내 특정 항원을 향한 IgG의 상기 농도는 이 항원에 대한 상기 면역 체계의 노출 및 상기 면역 체계를 자극하는 항원의 능력(면역원성)을 측정하는 것이다.
"면역원성"이라는 용어는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 이물질의 능력을 의미한다. 음식 알레르기의 경우, 이는 베타-락토글로불린과 같은 알레르겐에 대한 통제된 면역 반응으로 간주된다. 상기 반응은 특정 IgG 항체들의 생성에 의해 매개된다.
본 발명에서, 발명자들은 상기 알레르기성을 감소시키면서 면역원성을 유지할 수 있는 단백질 가수분해물을 생산하는 방법을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 가수분해되지 않은 유청 단백질을 갖는 면역화된 동물들의 경우와 본질적으로 동일한 면역화된 동물들의 상기 혈청 IgG 적정농도에 기초한 면역원성을 갖는다. 면역화된 동물들의 IgG 적정농도에 기초한 상기 면역원성은 예를 들어 논문 "Preclinical Brown Norway Rat Models for the Assessment of Infant Formulas in the Prevention and treatment of Cow's Milk Allergy", Jensen et al., 국제 알레르기 및 면역학 기록 보관소에 게재, 2019년 2월 13일, DOI: 10.1159/000495801 및 논문 "Characterization of the Immunogenicity and Allergenicity of Two Cow's Milk Hydrolysates - A Study in Brown Norway Rats", Bøgh., 스칸디나비아 면역학 저널에 게재, 2014년 12월 23일, DOI:10.1111/sji.12271에 설명된 바와 같이 브라운 노르웨이 쥐 모델을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 "본질적으로 동일한" 이라는 용어는 상기 유청 단백질 가수분해물로 면역화된 동물들의 상기 혈청 IgG 적정농도 및 가수분해되지 않은 유청 단백질로 면역화된 동물의 IgG 적정농도가 크게 다르지 않은 것으로 지칭된다. 상기 용어 "본질적으로 동일한"을 정의하는 또 다른 방법은 상기 유청 단백질 가수분해물로 면역된 동물의 혈청 IgG 적정농도와 가수분해되지 않은 유청 단백질로 면역된 동물의 혈청 IgG 적정농도간의 차이가 5% 이하, 예를 들어 4% 이하, 그리고 바람직하게는 3% 이하이다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 방법으로, 분자량 2500 Da 이상인 펩타이드들 양이 총 단백질 함량의 7.5 중량% 이하로 유청 단백질 가수분해물을 얻을 수 있었고, 상기 가수분해물은 유지된 면역원성과 결합된 감소된 알레르기성을 갖는다는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명의 상기 단백질 가수분해물을 사용하면, 상기 면역 체계가 상기 가수분해물을 감지하는 것이 가능하고 그리고 경구 내성이 유도될 수 있다. 본 발명자들은 면역원성이 유지되고 그리고 알레르기성이 감소된 상기 가수분해물이 동물에 투여될 때, 부정적인 알레르기 반응 없이 경구 내성 유도를 유도할 수 있다고 믿는다. 상기 동물은 바람직하게는 포유동물이다.
본 발명의 목적은 어떤 한외여과 단계 없이 유지된 면역원성과 결합된 감소된 알레르기성을 갖는, 가수분해의 정도가 높은 유청 단백질 가수분해물을 제조하는 것이었다.
본 발명의 목적은 면역원성을 유지하면서 알레르기성은 감소하고 동시에 소량의 더 큰 펩타이드들을 갖는 유청 단백질 가수분해물을 제조하는 것이었다. 놀랍게도 본 발명의 방법으로 이것을 얻을 수 있다는 것이 본 발명의 발명자들에 의해 발견되었다. 본 발명의 상기 방법을 사용하면, 감소된 알레르기성 및 유지된 면역원성을 갖는 유청 단백질 가수분해물을 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 소량의 더 큰 펩타이드들, 즉 분자량이 2500 Da 이상인 총 단백질 함량의 7.5 중량% 이하인 펩타이드들을 갖는 유청 단백질 가수분해물을 얻을 수 있다는 것이 본 발명자들에게 특히 놀라운 일이었다. 또한, 가수분해의 정도가 높은 상기 특성을 갖는 유청 단백질을 얻을 수 있다는 것이 본 발명자들에게 놀라운 일이었다.
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물은 전형적으로 분자량이 375 내지 2500 Da인 총 단백질 함량의 70 중량% 초과 및 80 중량% 미만을 포함한다. 또한, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물 중 총 단백질 함량의 55 중량% 초과 및 68 중량% 미만은 375 내지 1250 Da의 분자량을 갖는다. 게다가, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물은 분자량이 375 Da 미만인 총 단백질 함량의 15 내지 20 중량%를 포함한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물의 상기 가수분해의 정도는 적어도 17%이며, 더욱 바람직하게는, 상기 유청 단백질 가수분해물의 상기 가수분해의 정도는 적어도 20%이다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물은 17 내지 30%, 예를 들어, 20 내지 25%의 가수분해의 정도를 갖는다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 본질적으로 원형 단백질을 포함하지 않는다. 따라서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 본질적으로 가수분해되지 않은 단백질을 포함하지 않는다. "원형 단백질"과 "가수분해되지 않은 단백질"이라는 용어는 동일한 것을 의미한다. 일 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 본질적으로 원형 유청 단백질을 포함하지 않고, 바람직하게는 상기 유청 단백질 가수분해물은 본질적으로 원형 베타-락토글로불린 및 원형 알파-락트알부민을 포함하지 않는다.
"본질적으로 원형 단백질이 없다"는 용어는 상기 유청 단백질 가수분해물 중 유청 단백질, 베타-락토글로불린 및 알파-락트알부민과 같은 원형 단백질의 양이 총 단백질 함량의 1.0 중량% 이하이고, 예를 들어 총 단백질 함량의 0.5 중량% 이하인 것을 의미한다. "총 단백질 함량"이라는 용어는 단백질 및 단백질로부터 유래된 펩타이드들의 총량을 말한다.
상기 유청 단백질 가수분해물은 단백질 이외의 다른 성분, 예를 들어 탄수화물, 지질 및 미네랄을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 총 고형분 함량을 기준으로 10 중량% 이하, 예를 들어 총 고형분 함량을 기준으로 5 중량% 이하, 그리고 바람직하게는 총 고형분 함량을 기준으로 4 중량% 이하의 양으로 탄수화물을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 총 상기 고형분 함량을 기준으로 15 중량% 이하, 예를 들어 상기 총 고형분 함량을 기준으로 10 중량% 이하, 바람직하게는 상기 총 고형분 함량을 기준으로 8 중량% 이하의 양으로 지질을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 상기 총 고형분 함량을 기준으로 1 중량% 이하, 예를 들어 상기 총 고형분 함량의 0.5 중량% 이하의 지질 함량을 포함한다.
본 발명의 상기 방법에 의해 얻은 상기 유청 단백질 가수분해물은 상기 단백질 가수분해물 중 낮은 회분 함량을 유지하면서 제조될 수 있다는 것이 본 발명의 발명자들에 의해 놀랍게도 발견되었다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 상기 고형분의 6.0 중량% 이하, 예를 들어 고형분의 5.0 중량% 이하로 회분을 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 유청 단백질 가수분해물의 분말은 바람직하게는 고형분 함량이 94-95 중량%이다. 따라서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 5.5 중량% 이하, 예를 들어 5.0 중량% 이하의 양으로 회분을 포함한다.
예를 들어 회분은 식품의 회분 함량을 측정하기 위한 GB5009.4-2016 중국 표준을 사용하여 측정할 수 있다. 본 표준은 식품에서 회분 함량을 결정하기 위한 중화인민공화국 식품안전국가표준이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 분말 또는 과립, 바람직하게는 분말과 같은 건조 조성물의 형태이다.
또 다른 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 액체 조성물이다.
상기 유청 단백질 가수분해물의 제조 방법:
일 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 유청 단백질 가수분해물의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 유청 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;
b) 유청 단백질을 포함하는 상기 용액에, 적어도 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)로부터의 서브틸리신(subtilisin), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 서몰리신(thermolysin) 및 아나나스 초모수스(Ananas comosus)로부터의 시스테인 엔도프로테아제(cysteine endoprotease)를 첨가하고 그리고 제1 가수분해 단계를 수행하는 단계;
c) 단계 b)의 상기 가수분해된 용액을 적어도 60℃의 온도로 조절하고 그리고 남아있는 접힌 단백질을 펼치기 위해 충분한 시간 동안 상기 온도를 적어도 60℃로 유지함으로써 열처리하는 단계;
d) 단계 c)의 상기 열처리된 용액의 상기 온도를 50℃ 내지 70℃의 온도로 조절하는 단계
e) 단계 d)의 상기 가수분해물에 적어도 바실러스 리체니포미스로부터의 서브틸리신을 첨가하고 그리고 제2 가수분해 단계를 수행하는 단계;
f) 상기 가수분해의 정도가 적어도 17% 일때 상기 효소들을 비활성화하는 단계;
유청 단백질 가수분해물을 얻기 위함.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 공급 물질은 유청 단백질을 포함하는 용액이다.
유청 단백질을 포함하는 용액:
본 발명의 맥락에서, "유청 단백질을 포함하는 용액"에서 처럼 용어 "용액"은 액체 및 고체 화합물 또는 단백질 입자와 같은 반고체 입자의 조합을 함유하는 조성물을 포함한다. 따라서 "용액"은 현탁액 또는 심지어 슬러리일 수 있다. 그러나, 상기 "용액"은 바람직하게는 펌핑 가능하고 그리고 유청 단백질을 포함하는 상기 용액 중 액체의 양은 바람직하게는 70-98%, 더 바람직하게는 80-96%이다. 상기 유청 단백질 용액에 사용되는 상기 액체는 일반적으로 물이다.
유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 전형적으로 상기 용액의 2 중량% 이상의 양으로 단백질을 포함할 것이다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 유청 단백질 용액은 상기 용액의 2 내지 20 중량% 범위의 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 상기 용액의 5 내지 15 중량% 범위의 양으로 단백질을 포함한다.
상기 가수분해에 사용되는 유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 유청 단백질을 포함하는 조성물을 물과 같은 액체에 분산시킴으로써 얻는다. 바람직하게는, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 우유 혈청 단백질 농축물, 유청 단백질 농축물, 우유혈청분리단백질 및/또는 분리유청단백질 중 임의의 것을 물과 혼합하여 제조된다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에서, 유청 단백질을 포함하는 용액은 우유 혈청 단백질 농축물, 유장 단백질 농축물, 우유혈청분리단백질 및/또는 분리유청단백질을 포함한다.
본 발명의 유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 총 고형분 함량을 기준으로 적어도 50%의 양으로 유청 단백질을 포함한다. 유청 단백질의 함량이 총 고형분 함량의 50% 미만인 경우, 전체 분자 구성(단백질, 탄수화물, 지질 및 미네랄 간의 비율)이 달라지며, 따라서 효소의 작용이 달라지므로 얻어지는 생성물도 달라진다.
유청 단백질 외에도, 상기 유청 단백질 용액은 예를 들어 카제인과 같은, 다른 단백질을 소량으로 포함할 수 있다.
상기 유청 단백질 용액은 일반적으로 단백질 외에 다른 성분들을 포함한다. 상기 유청 단백질 용액은 미네랄, 탄수화물 및/또는 지질과 같이 유청 또는 우유 혈청에서 일반적으로 발견되는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 유청 단백질 용액은 유청 또는 우유 혈청에 천연이 아닌 성분들을 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 비천연 우유 성분은 식품 생산에 사용하기에 적합하고 안전해야 한다.
총 고형분 함량을 기준으로, 상기 유청 단백질 용액의 단백질 함량이 낮을수록 유청 단백질보다 지질, 탄수화물(주로 유당) 및 다른 단백질의 함량이 높아진다.
유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 예를 들어 유당, 올리고당 및/또는 유당의 가수분해 생성물(즉, 포도당 및 갈락토스)과 같은 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 유청 단백질 용액은 예를 들어 총 고형분 함량을 기준으로 0 내지 15 중량% 범위의 탄수화물을 포함할 수 있다.
유청 단백질을 포함하는 상기 용액을 제조하기 위해 농축유청단백질(WPC) 또는 우유혈청단백질농축물(SPC)을 사용하는 경우, 상기 용액 내 탄수화물의 양은 바람직하게는 총 고형분 함량을 기준으로 2 내지 8 중량% 범위이다.
분리유청단백질(WPI)과 우유혈청분리단백질(SPI)은 유청 단백질을 포함하는 상기 용액을 제조하는 데 추가로 사용될 수 있다. 여기에는, 유당과 같은 탄수화물의 양이 매우 적다. 따라서, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액을 제조하기 위해 WPI 또는 SPI를 사용할 때, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액 내 탄수화물 함량은 총 고형분 함량을 기준으로 0 내지 1 중량% 범위이다.
유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 또한 지질을 포함할 수 있고, 예를 들어 중성지방 및/또는 인지질과 같은 다른 유형의 지질 형태이다.
본 발명의 맥락에서, "지방" 및 "지질"이라는 용어는 동일한 의미를 가지며 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 총 고형분 함량을 기준으로 적어도 50 중량%의 양으로 유청 단백질을 포함해야 한다. 유청 단백질을 포함하는 상기 용액 내 단백질 함량이 총 고형분 함량의 50 중량% 미만인 경우, 가수분해 후 얻은 상기 유청 단백질 가수분해물은 본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물을 정의하는 특성들을 갖지 못할 수 있다.
유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 예를 들어 총 고형분 함량을 기준으로 50-98 중량%, 예를들어 총 고형분 함량을 기준으로 60-92 중량%, 더욱 바잠직하게는, 총 고형분 함량을 기준으로 65-90 중량%의 유청 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시예에서, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 유청 단백질을 총 고형분 함량을 기준으로 적어도 80 중량%의 양으로 포함한다.
유청 단백질을 포함하는 상기 용액에 존재하는 상기 단백질은 주로 유청 단백질이다. 그러나, 예를 들어 카제인과 같은, 소량의 다른 단백질들이 존재할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 따라서 유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 단백질의 총량을 기준으로 90 중량% 이상의 양으로 유청 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 단백질 총량을 기준으로 유청 단백질을 95 중량% 이상의 양으로 포함한다. 따라서, 본 발명의 추가적인 실시예에서, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 단백질의 총량을 기준으로 최대 10 중량%의 카제인 또는 다른 비-유청 단백질을, 바람직하게는 단백질의 총량을 기준으로 최대 5 중량%, 더 바람직하게는 최대 3 중량%의 카제인 또는 다른 비-유청 단백질을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 유청 단백질 농축물 및/또는 우유 혈청 단백질 농축물인 유청 단백질을 포함하는 용액을 사용하여 얻는다. 바람직하게는, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 물에 혼합된 유청 단백질 농축물 또는 우유 혈청 단백질 농축물이다.
유청 단백질:
본 발명의 일 양태에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 유청 단백질을 포함하는 용액을 가수분해함으로써 획득된다.
본 발명의 맥락에서, "유청 단백질"이라는 용어는 유청 또는 우유 혈청에서 발견되는 단백질에 관한 것이다. 유청 단백질을 포함하는 용액에 존재하는 상기 유청 단백질은 유청 또는 우유 혈청에서 발견되는 단백질 종류의 부분 집합일 수 있거나 유청 및/또는 우유 혈청에서 발견되는 단백질 종류의 완전한 집합일 수 있다. 유청 단백질은 치즈 생산의 부산물로 생성되는 액체 물질인, 유청으로부터 분리된 단백질들의 혼합물이다. 유청 단백질들은 우유 또는 응고된 우유의 혈청 단계에 존재하는 단백질들이다. 우유의 상기 혈청 단계의 상기 단백질들은 유청 단백질 외에 때때로 우유 혈청 단백질들로 지칭된다.
"우유 혈청"이라는 용어는 예를 들어 미세여과 또는 큰 구멍 한외여과에 의해 우유로부터 카제인 및 유지방구가 제거되었을 때 남아 있는 액체를 의미한다. 우유 혈청은 또한 "이상적인 유청"이라고도 불릴 수 있다.
"우유 혈청 단백질" 또는 "혈청 단백질"이라는 용어는 우유 혈청에 존재하는 단백질을 의미한다.
"유청"이라는 용어는 우유의 카제인이 침전되고 제거된 후에 남은 액체 상층액을 의미한다. 카제인 침전은 예를 들어 우유의 산성화 및/또는 레닛(rennet) 효소를 사용하여 달성할 수 있다.
스위트 유청, 산성 유청, 카제인 유청과 같은 여러 타입의 유청이 있다.
본 발명의 상기 유청 단백질 용액에 존재하는 상기 유청 단백질은 다양한 유청 공급원, 예를 들어 카제인 유청, 산성 유청 또는 스위트 유청으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액에서 상기 유청 단백질은 스위트 유청으로부터 유래된다. 스위트 유청은 주로 베타-락토글로불린(BLG)(총 단백질 함량의 약 55-65%), 알파-락트알부민(ALA)(총 단백질 함량의 약 18-23%) 및 카제이노마크로펩타이드(CMP) 단백질들을 포함한다. 그러나, 스위트 유청에는 면역글로불린, 오스테오폰틴(osteopontin), 락토페린(lactoferrin), 소 혈청 알부민 및 지방구 막 단백질과 같은 다른 단백질들이 포함될 수도 있다. WPI와 WPC는 스위트 유청으로부터 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "스위트 유청"이라는 용어는 레닛형 치즈를 제조하는 동안 우유를 응고시키고 걸러낸 후 남은 액체를 의미한다. "스위트 유청"은 체다 또는 스위스 치즈와 같은 레닛형 경질 치즈를 생산하는 과정에서 얻는다. 스위트 유청은 우유 조성물에 레닛 효소를 첨가하여 얻어지며, 이는 카파-카제인을 파라-카파-카제인과 펩타이드 카제이노마크로펩타이드(CMP)로 분해하고, 그렇게 함으로써 카제인 미셀을 불안정하게 하고 그리고 카제인이 침전되도록 한다. 상기 레닛 침전 카제인을 둘러싸고 있는 상기 액체를 스위트 유청으로 지칭한다. 스위트 유청의 pH 값은 5.2에서 6.7 사이이다.
"카제인 유청"(때때로 신 유청 또는 산성 유청이라고도 함)이라는 용어는 카제인/카제인산염 생산에서 얻은 유청과 관련이 있다. 본 발명의 맥락에서, 상기 카제인 유청은 산성 유청과 동일하지 않다. 카제인 유청은 미세여과를 통해 카제인/카제인산염을 분리한 후 얻은 상기 유청 분획물이다. SPC와 SPI는 카제인 유청으로부터 얻는다.
산성 유청이라는 용어는 코티지 치즈 및 쿼크와 같은 산성 유형 치즈를 생산하는 동안 얻어진 상기 유청에 사용된다. 산성 유형 치즈를 제조할 때, 카제인은 우유에서 산성 침전에 의해 제거된다, 즉, 상기 우유의 pH 값을 카제인의 등전점인 4.6 미만의 pH로 낮추고 그리고 상기 카제인 미셀을 분해 및 침전시키는 것이다. 상기 pH는 종종 3.8 내지 4.6 범위로 감소된다. 상기 산성 침전 카제인을 둘러싸고 있는 상기 액체를 종종 산성 유청으로 지칭한다. WPC와 WPI는 산성 유청으로부터 얻는다.
본 발명의 일 실시예에서, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액에 사용되는 상기 유청 단백질은 산성 유청 또는 카제인 유청이 아니다.
본 발명에서 유청 단백질을 포함하는 상기 용액에 사용되는 상기 유청 단백질은 바람직하게는 농축유청단백질(WPC) 또는 우유혈청단백질농축물(SPC)일 수 있다. 또한, 분리유청단백질(WPI) 또는 우유혈청분리단백질(SPI)이 대안이 된다. 농축유청단백 및 분리유청단백질의 차이점은 생성물의 구성, 특히 상기 단백질 함량이다. 분리유청단백질은 농축물보다 더 순수하며, 상기 유청 단백질을 "분리"하기 위해 다른 비단백질 성분들이 부분적으로 제거되었다. 따라서, 분리유청단백질은 단백질 함량이 더 높고 그리고 사실상 유당, 탄수화물, 지방, 콜레스테롤이 없을 만큼 충분히 순수할 수 있다.
본 맥락에서 "농축유청단백질(WPC)" 및 "농축혈청단백질(SPC)"이라는 용어는 유청 단백질의 건조 및 액체 조성물들을 모두 포함한다. 본 발명에 사용되는 WPC 및 SPC의 상기 단백질 함량은 총 고형분 함량을 기준으로 50 중량% 이상이다. 그러나, 유청 단백질 농축물은 더 많은 양의 유청 단백질, 예를 들어 상기 건조 물질 함량을 기준으로 80 중량%의 유청 단백질을 포함할 수 있다. 액체 유청의 상기 건조 부분은 상기 건조 생성물이 유청 단백질 함량을 50 중량% 이상 포함하기 위하여 유청으로부터 비단백질 구성 성분들을 충분히 제거하여 얻는다.
본 발명에 사용되는 WPC 또는 SPC는 바람직하게는 다음을 포함한다:
총 고형분 함량 대비 50~89 중량%의 단백질
총 단백질 함량 대비 15~70 중량%의 BLG
총 단백질 함량 대비 8~50 중량%의 ALA
총 단백질 함량 대비 0-40 중량%의 CMP.
대안적으로, 바람직하게는 다음을 포함하는 WPC 또는 SPC이다:
총 고형분 함량 대비 50~89 중량%의 단백질
총 단백질 함량 대비 15~80 중량%의 BLG
총 단백질 함량 대비 4~50 중량%의 ALA
총 단백질 함량 대비 0-40 중량%의 CMP.
보다 바람직하게는, WPC 또는 SPC는 다음을 포함한다:
총 고형분 함량 대비 70~89 중량%의 단백질
총 단백질 함량 대비 30~80 중량%의 BLG
총 단백질 함량 대비 4~35 중량%의 ALA
총 단백질 함량 대비 0~25 중량%의 CMP.
"분리유청단백질" 및 "분리혈청단백질"이라는 용어는 건조 또는 액체 조성물들과 관련되고, 일반적으로 유당 및 콜레스테롤이 거의 없는 것으로 간주되고 그리고 총 고형분 함량을 기준으로 적어도 90 중량%의 단백질 함량을 가진다. 분리유청단백질은 예를 들어 총 고형분 함량을 기준으로 92 중량% 이상의 유청 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, WPI 및 SPI는 총 고형분 함량을 기준으로 90-100 중량%의 단백질, 예를 들어 총 고형분 함량을 기준으로 92-99중량%의 단백질을 포함한다.
WPI 또는 SPI는 바람직하게는 다음을 포함할 수 있다:
총 고형분 함량 대비 90~100 중량%의 단백질
총 단백질 함량 대비 15~70 중량%의 BLG
총 단백질 함량 대비 8~50 중량%의 ALA
총 단백질 함량 대비 0-40 중량%의 CMP.
대안적으로, 바람직하게는 WPI 또는 SPI는 다음을 포함할 수 있다.
총 고형분 함량 대비 90~100% 중량의 단백질
총 단백질 함량 대비 30~80 중량%의 BLG
총 단백질 함량 대비 4~35 중량%의 ALA
총 단백질 함량 대비 0~25 중량%의 CMP.
바람직하게는, WPI는 다음으로 포함할 수 있다.
총 고형분 함량 대비 90~100 중량%의 단백질
총 단백질 함량 대비 60~70 중량%의 BLG
총 단백질 함량 대비 10~25 중량%의 ALA
총 단백질 함량 대비 10~25 중량%의 CMP.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 있어서 상기 유청 단백질 가수분해물의 상기 제조에 사용되는 유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 건조 물질의 50-98 중량%, 예를 들어 60-92 중량%, 바람직하게는 70-90 중량% 범위의 유청 단백질 총량을 포함한다.
본 발명에 있어서 유청 단백질을 포함하는 상기 용액을 제조하기 위해 임의의 적합한 유청 단백질 공급원이 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서 유청 단백질을 포함하는 용액에 사용되는 상기 유청 단백질은 바람직하게는 소, 양, 염소, 버팔로, 낙타, 라마, 암말, 말 및/또는 사슴의 우유와 같은, 포유동물 우유의 유청 단백질들이다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 유청 단백질은 소(bovine)(소(cow))의 우유로부터 유래된다.
유청 단백질을 포함하는 상기 용액 중 회분의 함량이 낮은 것이 일반적으로 바람직하다. 본 발명의 방법을 이용하면, 놀랍게도 회분 함량이 낮은 유청 단백질 가수분해물을 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에서, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액 내 회분 함량은 총 고형분 함량을 기준으로 6% 이하, 보다 바람직하게는 5.5% 이하이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유청 단백질 용액은 총 단백질 함량의 30 중량% 이상의 BLG, 예를 들어 40 중량% 이상의 BLG를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 유청 단백질 용액은 총 단백질 함량을 기준으로 50 중량% 이상의 BLG를 포함하고, 더욱 바람직하게는, 상기 유청 단백질 용액은 총 단백질 함량을 기준으로 55 중량% 이상의 BLG를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 유청 단백질 용액은 총 단백질 함량을 기준으로 30 내지 95 중량% BLG, 예를 들어 총 단백질 함량을 기준으로 40 내지 90 중량%의 BLG, 더욱 바람직하게는 총 단백질 함량을 기준으로 45 내지 80 중량% 범위의 양으로 BLG를 포함한다.
열처리를 통한 2단계 효소 가수분해:
본 발명에 있어서, 상기 유청 단백질 용액은 그 사이에 열처리 단계를 포함하는 2단계 효소 가수분해를 거친다. 제1 가수분해 단계는 본 방법의 단계 b)이고 그리고 제2 가수분해 단계는 본 방법의 단계 e)이다. 열처리는 본 발명의 방법의 단계 c)이다.
본 발명의 방법의 단계 b)에서는, 유청 단백질을 포함하는 상기 용액에, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)로부터의 서브틸리신(subtilisin), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 서몰리신(thermolysin) 및 아나나스 초모수스(Ananas comosus)로부터의 시스테인 엔도프로테아제(cysteine endoprotease)를 첨가하고, 그리고 제1 가수분해 단계가 수행된다. 바실러스 리체니포미스로부터의 서브틸리신, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스로부터의 서몰리신 및 아나나스 초모수스로부터의 시스테인 엔도프로테아제를 상기 제1 가수분해 단계 b)에서 사용하는 것이 중요하다. 다양한 효소들은 펩타이드들/단백질들에서 다양한 절단 부위를 가지고, 그리고 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 상기 제1 가수분해 단계에 이어서 열 처리 단계 및 두 번째 가수분해 단계에서 언급된 효소들이 더 큰 펩타이드들(2500 Da 이상)의 양이 7.5 중량% 이하인 유청 단백질 가수분해물을 생성할 것이라는 사실을 발견하였다. 동시에, 상기 알레르기성은 다른 부분 가수분해물들보다 낮고 그리고 상기 면역원성은 한외여과에 의해 생성된 광범위한 가수분해물들보다 높다. 바실러스 리체니포미스로부터의 서브틸리신, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스로부터의 서몰리신 및 아나나스 초모수스로부터의 시스테인 엔도프로테아제는 가수분해의 정도, 펩타이드 크기 분포, 알레르기성 및 면역원성과 관련하여 원하는 생성물을 얻기 위해 필요했기 때문에 선택되었다. 이러한 효소들이 포함되지 않은 경우 가수분해의 정도, 펩타이드 크기 분포, 알레르기성 및 면역원성의 유사한 조합을 얻을 수 없다. 효소들 중 하나를 예를 들어 트립신으로 대체해도 상기 동일한 구성이 제공되지 않았다.
상기 세 가지 효소는 동시에 또는 따로따로 첨가될 수 있고, 그리고 본 발명은 세 가지 효소를 첨가하는 순서에 제한되어서는 안 된다. 일반적으로, 상기 효소들은 한 번에 하나씩 따로 첨가하지만, 이는 기술적인 이유 때문일 뿐이다. 본 특허 출원의 실시예들은 상기 효소들이 한 번에 하나씩 첨가되지만, 상기 효소들이 시뮬레이션으로 또는 다른 순서로 첨가될 수 있는 본 발명의 일 실시예를 보여준다.
바실러스 리체니포미스로부터의 서브틸리신은 일반적으로 알칼라제(Alcalase)인 반면, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스로부터의 서몰리신은 일반적으로 뉴트라제(Neutrase)이고 아나나스 초모수스로부터의 시스테인 엔도프로테아제는 일반적으로 Promod 523 MDP이다. 그러나, 다른 브랜드들의 효소들을 사용할 수도 있다.
상기 제1 가수분해 단계 b)는 단지 상기 세 가지 효소를 포함하는 것으로 제한되지 않으며, 따라서 소량의 다른 효소들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 가수분해 단계는 3개, 4개, 5개 이상의 효소들을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 추가 효소들은 예를 들어 엔도프로테아제/펩티다아제 또는 엑소프로테아제/펩티다아제(예: 세린-프로테아제, 메탈로-프로테아제, 시스테인-프로테아제, 아스파르트산-프로테아제, 아미노-펩티다아제 또는 카르복시-펩티다아제)일 수 있다. 유청 단백질을 가수분해하는 데 적합한 또 하나의 프로테아제는 세린-프로테아제의 트립신 유사 프로테아제일 수 있다.
"트립신 유사 프로테아제"라는 용어는 미생물 기원의 프로테아제이다. 따라서, 예를 들어 "트립신 유사 프로테아제"라는 용어에는 미생물 기원이 아닌 판크레아틴(pancreatin)이 포함되지 않는다. 반대로, 판크레아틴은 예를 들어 트립신, 키모트립신, 아밀라아제 및 리파아제를 포함하는 췌장에서 유래된 효소들의 혼합물이다. 또한, "트립신 유사 프로테아제"라는 용어를 "트립신"과 혼동해서는 안 된다.
본 발명의 추가 실시예에서, 상기 제1 가수분해 단계에 사용되는 상기 효소들은 효소 위원회 번호(EC)를 갖는 다음 효소들의 군으로부터 선택된다: EC 3.4.21.62, EC 3.4.24.28, EC 3.4.22.32 및 EC 3.4 .22.33. 그러나 위에서 언급한 것처럼 다른 효소들이 존재할 수도 있다.
단계 b)에서 상기 가수분해가 시작된 후, 원하는 가수분해의 정도를 얻기에 충분한 기간 동안 유지될 것이다. 상기 가수분해가 중단되기 전, 상기 효소 가수분해 기간은 사용된 효소들의 양과 활성에 달려있다. 바람직하게는, 상기 제1 가수분해 단계에서의 가수분해는 상기 가수분해의 정도가 적어도 12%, 예를 들어 적어도 15%가 될 때까지 유지된다.
본 발명의 일 실시예에서, 단계 b)의 상기 가수분해는 적어도 45분 동안, 예를 들어 적어도 60분, 바람직하게는 적어도 1.5시간, 더욱 더 바람직하게는 적어도 2시간 동안 수행된다. 바람직하게는, 단계 b)의 상기 가수분해는 상한 시간으로 제한되지 않고 그리고 중단이 필요할 때까지 계속될 수 있다. 그러나, 일례로, 단계 b)의 상기 가수분해는 45분 내지 8시간, 더욱 바람직하게는 1시간 내지 4시간 동안 수행된다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 단계 b)의 상기 가수분해는 2 내지 3시간 동안 수행된다.
또 다른 실시예에서, 단계 b)의 상기 가수분해는 30℃내지 70℃, 예를 들어 35℃내지 65℃, 바람직하게는 40℃내지 62℃, 더 바람직하게는 50℃ 내지 60℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 단계 b)로부터의 상기 가수분해된 조성물을 제2 가수분해 단계인 단계 e)로 처리하기 전에 열처리 단계 c)를 수행하면 높은 가수분해의 정도를 갖고 그리고 분자량이 2500 Da 이상인 펩타이드들을 총 펩타이드 양의 7.5 중량% 이하로 포함하는 유청 단백질 가수분해물이 생성될 것이라는 것을 발견하였다.
상기 두 가수분해 단계 사이의 상기 열처리로 인해 남아 있는 단백질 유래 3차 구조가 펼쳐진다. 이러한 펼침은 단백질 또는 단백질 단편의 묻혀있는 부분을 노출시키고 그리고 제2 가수분해의 단계에서 상기 효소들이 이전에 접근할 수 없었던 절단 부위에 접근하여 가수분해를 증가시키고 따라서 열처리가 생략된 경우보다 생성물 내 큰 펩타이드들의 비율이 낮아진다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서, 상기 가수분해된 조성물은 상기 제1 가수분해 단계(단계 b)) 후 및 상기 제2 가수분해 단계(단계 e)) 전에 상기 조성물의 온도를 적어도 60℃로 조정하여 열처리 단계(단계 c))로 처리된다. 상기 온도는 남은 단백질들을 펼치기에 충분한 기간 동안 적어도 60℃로 유지된다. 상기 효소들이 비활성화되는 온도까지 열처리할 필요는 없지만, 그러나 남아있는 단백질의 펼침을 시작하기 위해 온도가 60℃ 이상이어야 한다.
본 발명의 상기 방법은 특정 가열 시간으로 제한되어서는 안 되는데, 그 이유는 단계 c)의 상기 가열 시간이 사용된 가열 장치의 유형 및 상기 열처리 동안의 상기 온도에 따라 달라지기 때문이다. 상기 온도가 높을수록, 남은 단백질들의 펼침을 위해 필요한 시간이 짧아진다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 가수분해된 조성물은 단계 c)에서 5분 내지 120분, 더욱 바람직하게는 10분 내지 60분 동안 열처리된다. 이 가열 시간은 상기 온도가 60℃ 내지 100℃인 경우에 적합하다. 또 다른 실시예에서, 단계 c)의 열처리에서 상기 가열 시간은 4초 내지 10분이다. 이 가열 시간은 온도가 90℃ 내지 145℃ 만큼 높은 경우에 적합하다. 단계 c)의 상기 열처리는 열 교환기를 사용하거나 또는 열 주입을 사용에 의한 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서 단계 c)의 상기 열처리는 온도를 적어도 60℃로 조정하여 수행된다. 일 실시예에서, 단계 c)의 상기 열처리는 온도를 적어도 65℃이상, 예를 들어 적어도 70℃이상으로 조정함으로써 수행된다. 전형적으로, 단계 c)의 상기 온도는 60℃ 내지 145℃, 더욱 바람직하게는 65℃ 내지 100℃, 예를 들어 68℃ 내지 90℃ 및 훨씬 더 바람직하게는 70℃ 내지 85℃ 범위이다.
바람직한 실시예에서, 단계 c)의 상기 열처리는 60℃ 내지 90℃의 온도에서 5분 내지 2시간 동안, 바람직하게는 70℃ 내지 80℃에서 5분 내지 2시간 동안 또는 적어도 5분 동안 수행된다. 또 다른 실시예에서, 상기 열처리는 90℃ 내지 145℃의 온도에서 4초 내지 10분 동안, 예를 들어 90℃ 내지 120℃에서 30초 내지 10분 동안 가열함으로써 수행된다.
단계 c)의 열처리 후, 그리고 상기 제2 가수분해 단계를 시작하기 전에, 단계 d)에서 상기 열처리된 용액의 상기 온도는 상기 제2 가수분해 단계에 사용되는 상기 효소(들)에 적합한 온도로 조정된다. e) 단계가 시작될 때 상기 온도가 너무 높을 경우, 상기 효소들이 손상된다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, c) 단계의 상기 열처리 용액의 상기 온도는 50℃ 내지 70℃, 더욱 바람직하게는, 50℃ 내지 60℃의 온도로 조절된다.
단계 d) 이후에, 단계 e)의 상기 제2 가수분해 단계는 바실러스 리체니포미스로부터의 적어도 하나 이상의 서브틸리신을 상기 가수분해된 조성물에 첨가함으로써 개시된다.
본 발명의 일 실시예에서, 바실러스 리체니포미스로부터의 상기 서브틸리신은 알칼라제이다.
바실러스 리체니포미스로부터의 서브틸리신 이외의 다른 효소들을 상기 제2 가수분해 단계에 첨가할 수 있지만, 그러나 첨가되는 주요 효소들은 바실러스 리체니포미스로부터의 서브틸리신이다. 다른 효소들을 첨가하는 경우에는, 통상적으로 총 효소량의 20% 이하, 예를 들어 총 효소량의 10% 이하로 첨가한다.
본 발명의 추가 실시예에서, 단계 e)의 상기 가수분해는 단계 b)와 동일한 시점 및 온도에서 수행된다.
본 발명의 단계 f)에서는, 상기 효소들을 비활성화시킴으로써 효소 가수분해가 중단된다.
상기 효소 가수분해는 일반적으로 상기 가수분해의 정도(DH)가 적어도 17%일 때 단계 f)에서 중단된다. 상기 가수분해의 정도(DH)는 가수분해에 의해 절단된 원래 단백질들의 펩타이드 결합 비율로 정의된다. 상기 가수분해의 정도는 문헌 Adler-Nissen, J. Determination of the Degree of the Degree of food Protein Hydrolysates by Trinitrobenzenesulfonic acid. J. Agric. Food Chem. 27, 1256-1262 (1979) 및 Nielsen, P. M., Petersen, D. & Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. J. Food Sci. 66, 642-646 (2001)에 설명된 대로 측정할 수 있다.
추가 실시예에서, 단계 f)에서 상기 가수분해가 중단되면 본질적으로 원형 단백질이 남지 않는다. 본 발명의 맥락에서 "원형 단백질"이라는 용어는 가수분해되지 않은 단백질을 의미한다. 또한, 본 발명의 맥락에서 "본질적으로 원형 단백질이 없음"이라는 용어는 총 단백질 함량의 3% 미만이 원형 단백질임을 의미한다. 바람직하게는, 총 단백질의 2% 미만이 원형 단백질이고, 더욱 더 바람직하게는 총 단백질의 1% 미만이 원형 단백질이다.
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 상기 제조 방법은 상기 가수분해 단계 동안 첨가되는 상기 효소의 양으로 제한되어서는 안되며, 왜냐하면 첨가되는 상기 효소의 양은 상기 효소의 유형 및 상기 효소의 비활성(specific activity)에 따라 달라지기 때문이다. 그러나, 지침에 따라, 상기 효소 가수분해는 효소들의 총량이 단백질 100g당 0.05 내지 10g, 예를 들어 단백질 100g당 0.1 내지 7.5g의 효소 범위에서 효소들의 조합으로 수행된다. 바람직하게는, 상기 효소의 양은 단백질 100g당 0.2 내지 5.0g이다. "비활성"이라는 용어는 상기 효소의 양당 효소의 활성을 의미한다.
유청 단백질을 포함하는 상기 용액은 바람직하게는 효소 가수분해 동안 6 내지 9 범위의 pH를 갖는다. 바람직한 실시예에서, 상기 효소 가수분해 동안 상기 pH는 6.0 내지 7.5이다. 이 pH 범위에서 프로테아제는 가장 높은 비활성을 가지며 따라서 상기 단백질들을 가장 효율적으로 펩타이드들로 절단한다. 또한, 이 pH 범위에서는 상기 가수분해 과정뿐만 아니라 상기 효소들을 비활성화하기 위한 상기 열처리 과정에서도 응집이 방지된다.
본 발명에 따른 유청 단백질 가수분해물의 상기 제조 방법의 단계 f)에서는, 상기 효소들을 비활성화시켜 상기 효소 가수분해를 중단시킨다. 본 발명의 맥락에서, "비활성화"라는 용어는 상기 효소의 비가역적 비활성화를 의미한다. 효소들의 상기 비활성화는 다른 조건들에서 상기 효소들이 활성화되지 않도록 비가역적이어야 한다. 단계 c)의 상기 열처리는 상기 제1 가수분해 단계에서 사용된 상기 효소들의 비활성화를 수반할 수 있으며, 이는 상기 열처리 온도에 따라 달라진다. 그러나, 단계 f)에서는 단계 b)와 단계 e) 둘다인 상기 방법에 사용된 모든 효소들이 비활성화된다.
상기 가수분해의 정도가 적어도 17%, 예를 들어 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 23%일 때 상기 가수분해가 중단된다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 가수분해의 정도가 17% 내지 30%, 바람직하게는 19% 내지 30%, 더욱 더 바람직하게는 21% 내지 28% 범위일 때 단계 f)에서 상기 가수분해가 중단된다.
단계 f)에서 상기 효소들의 상기 비활성화, 그리고 이에 따른 상기 가수분해의 중단은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 효소들의 비활성화는 상기 온도를 상기 효소들이 비활성이고 그리고 변성되는 온도로 수정함으로써 이루어질 수 있다. 상기 효소들의 상기 비활성화 및 변성은 상기 용액의 pH를 상기 효소들이 비활성인 pH로 수정함으로써 이루어질 수도 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에서, 단계 f)에서 상기 효소들의 비활성화는 유청 단백질 및 첨가된 효소들을 포함하는 상기 용액을 적어도 80℃의 온도로 가열함으로써 이루어진다. 효소들의 상기 비활성화는 바람직하게는 80℃ 내지 130℃, 예를 들어 85℃ 내지 125℃, 더욱 바람직하게는 90℃ 내지 120℃의 온도로 가열함으로써 이루어진다. 가열에 의한 단계 f)에서 상기 효소들의 비활성화는 예를 들어 110℃ 내지 130℃에서 5 내지 30초 동안 가열하는 것과 같이, 짧은 시간 동안 고온으로 가열함으로써 이루어질 수 있다. 대안적으로, 단계 f)에서 상기 효소들의 상기 비활성화는 상대적으로 낮은 온도로 가열함으로써 이루어질 수 있지만, 더 오랜 시간 동안 수행될 수 있다. 이는 2 내지 10분 동안 80℃ 내지 90℃로 가열하는 것이 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 단계 f)에서 효소들의 상기 비가역적 비활성화는 첨가된 효소들, 즉, 상기 효소들이 비활성인 pH로 상기 유청 단백질 가수분해물을 첨가한 상기 유청 단백질 용액의 pH를 증가시키거나 감소시키는 것을 포함한다. 본 발명의 실시예에서, 상기 pH는 pH 10 이상으로 증가된다. 또 다른 실시예에서, 상기 pH는 pH 4 이하로 감소된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 단계 f)에서 얻은 상기 유청 단백질 가수분해물의 한외여과 단계를 포함하지 않는다. 단계 b)의 상기 가수분해와 단계 e) 사이에 단계 c)의 상기 열처리를 추가하면 한외여과를 적용할 때 흔히 볼 수 있는 면역원성을 감소시키지 않으면서 분자량이 2500 Da 이상인 펩타이드들 총량의 7.5 중량% 이하를 갖는 펩타이드들의 양이 생성된다는 것은 본 발명의 발명자들을 놀라게 하였다.
본 발명의 맥락에서, "한외여과"라는 용어는 1,500 Da 내지 50,000 Da, 바람직하게는 2,000 Da 내지 20,000 Da 범위의 분자량을 차단(MWCO)하는 막을 이용한 막 여과를 의미한다.
단백질 가수분해물의 한외여과 동안, 지방, 원형 단백질 및 일부 큰 펩타이드들은 한외여과막에 의해 유지되고 그리고 투석유물에 유지되는 반면, 유리 아미노산, 더 작은 펩타이드들 및 미네랄들은 한외여과 투과물에 유지된다.
본 발명의 상기 방법에 의해 얻은 상기 유청 단백질 가수분해물은 바람직하게는 농축 및/또는 건조될 수 있다. 농축은 예를 들어 단위 작업 나노여과, 역삼투 여과 및 증발 중 하나 이상에 의해 이루어는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 건조 단계는 분무 건조, 동결 건조 및 스핀-플래시 건조, 회전 건조 및/또는 유동층 건조가 사용되는 하나 이상의 단위 작업들이 포함된다.
식품:
일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물을 포함하는 식품을 제공하는 것에 관한 것이다.
바람직한 실시예에서, 상기 식품은 유아용 조제분유 또는 다른 유아용 영양 제품과 같은, 유아용 영양 제품이다.
상기 식품이 액체 형태인 경우, 상기 식품은 본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 식품은 가수분해된 유청 단백질 2 내지 25 중량%, 바람직하게는 가수분해된 유청 단백질 3 내지 20 중량%, 예를 들어 가수분해된 유청 단백질 3~15 중량%, 훨씬 더 바람직하게는 가수분해된 유청 단백질을 3 내지 10 중량%에 해당하는 양의 상기 유청 단백질 가수분해물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물을 포함하는 액체 식품은 중성 pH, 즉 22℃에서 4% 단백질 용액에서 6.5 내지 8.0 범위의 pH를 갖는다.
본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물은 유아용 조제분유와 같은 유아용 영양식에 사용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "유아용 조제분유"라는 용어는 팔로우온(follow-on) 조제분유, 그로잉업(growing-up) 조제분유 및 미숙아 조제분유를 포함하는, 모든 유형의 유아용 조제분유를 의미한다.
본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물을 유아용 조제분유에 사용하는 경우, 유아용 조제분유 중 상기 단백질 함량은 1.6 내지 5.0 g/100 kcal 범위이다. 유청 단백질 가수분해물 외에도, 상기 유아용 조제분유에는 지질, 비타민 및 미네랄뿐만 아니라 유당 및 올리고당과 같은 탄수화물도 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 유청 단백질 가수분해물은 또한 유아용 조제분유 이외의 다른 유아용 영양식, 예를 들어 스무디(smoothie), 포리지(porridge) 등의 제조에도 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물은 바람직하게는 유아들, 더욱 바람직하게는 알레르기 발병 위험이 있는 유아를 위한 유아용 조제분유에 사용되도록 의도된다. 그러나, 상기 가수분해물이 의료영양 응용과 같은 다른 목적들로 사용될 수 있는 경우도 배제되지 않는다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 임상 음료 제조 시 식품 성분으로 사용된다. 본 발명의 맥락에서, "임상 음료"라는 용어는 임상적 또는 의학적 지시를 갖는 음료를 의미한다. 예를 들어, 임상 음료는 건강과 관련된 효과를 가질 수 있다. 임상 음료는 일반적으로 영양 장애가 있는 입원 환자 또는 노인 또는 질병에서 회복하기 위해 사전 소화된 단백질이 필요한 개인에 사용된다. 예를 들어, 임상 음료는 영양실조 또는 흡수장애로 고통받는 개인에게 사용되는 음료일 수 있다. 상기 임상 음료는 위장 질환을 겪고 있는 개인을 위한 것일 수도 있다. 본 맥락에서 "임상 음료" 라는 용어 및 "의료 음료"는 동일한 의미를 갖는다.
임상 음료는 예를 들어 가수분해된 유청 단백질을 2 내지 20 중량% 포함하는 상기 음료에 상응하는 양으로 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물을 포함할 수 있다. 상기 임상 음료는 상기 음료의 5 내지 50 중량%의 양으로 탄수화물을 포함할 수 있다. 탄수화물의 상기 양은 예를 들어 10 내지 40 중량%, 예를 들어 15 내지 35 중량%의 범위일 수 있다. 상기 임상 음료는 지방을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 상기 임상 음료의 상기 지방 함량은 2 내지 30 중량%, 예를 들어 3 내지 20 중량%, 더 바람직하게는 3 내지 18 중량%의 범위일 수 있다.
일 예에서, 상기 임상 음료는 가수분해된 유청 단백질 4-10 중량%, 지방 3-15 중량% 및 탄수화물 10-35 중량%에 해당하는 본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물을 포함한다.
상기 임상 음료는 바람직하게는 중성 pH 값, 즉 6.5 내지 8.0 범위의 pH를 갖는다.
상기 임상 음료는 투명한 음료, 유백색 음료, 튜브 공급 형태, 또는 액체에 재구성되는 분말 형태일 수도 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물은 또한 주스-스타일 음료의 제조에 사용될 수 있다. 상기 주스-스타일 음료는 바람직하게는 가수분해된 유청 단백질 4-10 중량%, 지방 0-1 중량% 및 탄수화물 15-35 중량%에 해당하는 양으로 본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물을 포함한다.
상기 임상 음료가 튜브 공급 형태인 경우, 가수분해물을 가수분해된 유청 단백질 4 내지 15 중량%, 탄수화물 약 5-35 중량%, 지방 약 3 내지 15 중량%에 해당하는 양으로 본 발명에 따른 상기 유청 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 유아들의 우유 단백질들에 대한 알레르기 위험을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 이를 필요로 하는 환자들의 우유 단백질에 대한 알레르기 위험을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 유아들 또는 이를 필요로 하는 환자들의 우유 단백질에 대한 알레르기 위험을 감소시키기 위한, 본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유아들 또는 이를 필요로 하는 환자들의 아토피성 피부염, 천식 및/또는 알레르기성 비염을 예방하거나 발병 위험을 감소시키기 위한, 본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물에 관한 것이다.
"아토피성 피부염"이라는 용어는 습진으로 지칭될 수도 있는 반면, 알레르기성 비염은 꽃가루 알레르기로 지칭될 수 있다.
본 발명의 양태들 중 하나의 맥락에서 설명된 실시예 및 특징은 본 발명의 다른 양태들에도 적용된다는 점에 유의해야 한다.
본 출원에 인용된 모든 특허 및 비특허 참고문헌은 이로써 그들의 전체 내용이 참고로 포함된다.
이제 본 발명은 다음의 비제한적인 실시예에서 더 자세히 설명될 것이다.
본 발명은 감소된 알레르기성 및 유지된 면역원성을 갖는 새로운 유청 단백질 가수분해물에 관한 것이다. 상기 새로운 유청 단백질 가수분해물은 또한 더 큰 펩타이드들의 양이 적은 것이 특징이다. 본 발명은 또한 상기 새로운 유청 단백질 가수분해물을 제조하는 방법, 상기 새로운 유청 단백질 가수분해물의 용도 및 이 새로운 유청 단백질 가수분해물을 포함하는 식품에 관한 것이다.
도 1은 베타-락토글로불린과 알파-락트알부민의 검출 및 정량을 위한 본 발명의 유청 단백질 가수분해물 샘플의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 2a, b 및 c는 가수분해되지 않은 유청 단백질 및 가수분해된 유청 단백질의 서로 다른 샘플로 면역화된 쥐들의 각각 21일, 28일 및 35일에 쥐 혈청 내 IgG1 적정농도를 나타낸다.
도 3a, b 및 c는 가수분해되지 않은 유청 단백질 및 가수분해된 유청 단백질의 서로 다른 샘플로 면역화된 쥐들의 각각 21일, 28일, 35일에 쥐 혈청 내 IgE 적정농도를 나타낸다.
실시예 1: 분석 방법
실시예 1.1: 가수분해의 정도(DH) 측정
상기 가수분해의 정도(DH)는 가수분해에 의해 절단되는 펩타이드 결합의 백분율로 정의되고, 아래 방정식(1)을 참조할 것. 상기 DH 값은 형성된 펩타이드들 수에 대한 정보를 제공하며, 이는 사용 가능한 펩타이드 결합들 수와 관련된다.
상기 유청 단백질 가수분해물의 상기 DH는 Adler-Nissen, J. Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid. J. Agric. Food Chem. 27, 1256-1262 (1979) 및 Nielsen, P. M., Petersen, D. & Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. J. Food Sci. 66, 642-646 (2001)에 설명된 대로 측정되었다. 방정식(1)에서 h는 절단된 펩타이드 결합의 수를 나타내고 그리고 htotal은 이용 가능한 총 펩타이드 결합의 수를 나타낸다. 따라서 DH는 절단된 펩타이드 결합의 백분율을 제공한다.
방정식(1): DH=(유리 아미노 말단 수)/(사용 가능한 총 펩타이드 결합 수)·100%=h/htotal·100%
가수분해 후 형성된 상기 유리 알파-아미노 그룹은 o-프탈알데하이드(OPA)와 반응하고 그리고 340 nm에서 빛을 흡수하는 노란색 복합체를 형성하므로 따라서 분광광도계로 측정될 수 있다. 상기 색상 형성을 기준으로, DH를 계산할 수 있다.
가수분해물을 적절한 농도(0.03-0.08% 단백질)로 물에 재부유시키고 그리고 2 부피를 15 부피의 OPA 시약(100 mM Na2B4O7, 0.1% 나트륨도데실-황산염, 6 mM DL-dithioreitol, 6 mM o-프탈알데하이드 및 2% 에틸 알코올)과 함께 25℃에서 2분 동안 반응시켰다. 일련의 L-세린 농도를 생성하기 위해 유사한 반응들이 이루어졌다. 다음으로, 340nm(A340)에서 흡광도를 측정하고 그리고 물과 함께 OPA의 상기 반응으로부터 상기 A340 신호를 뺀다. 실제 DH를 찾기 위해, Adler-Nissen이 제안한 상기 설명된 OPA 방법과 동일한 반응을 주는 트리니트로벤젠설포닉산(Trinitrobenzenesulfonic acid) 방법 [Adler-Nissen J; Agricultural and Food Chemistry, 1979 27 (6) 1256]에 따라 상층액에서 측정된 세린 등가물을 수정하였다. 상기 유청 단백질 가수분해물에 사용된 상기 인자는 a=1, b=0.4, htotal=8.8이었다.
실시예 1.2: 총 단백질 측정
샘플의 총 단백질 함량(단백질 등가물)은 다음과 같이 결정된다:
1) ISO 8968-1/2IIDF 020-1/2-우유 - 질소 함량 측정 - 파트 172: 킬달(Kjeldahl) 방법을 사용한 질소 함량 측정에 따른 상기 샘플의 총 질소 측정.
2) 단백질 총량을 다음과 같이 계산한다: Nx6.38
실시예 1.3: 유청 단백질 가수분해물 내 펩타이드 분포를 결정하는 방법
상기 유청 단백질 가수분해물 내 펩타이드들의 상기 분자량 분포를 분석하기 위해 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하였다. SEC는 폴리머 유형의 분자들을 크기별로 분리하는 데 사용된다. 여기서는 펩타이드들인, 다양한 크기의 성분들의 혼합물을 SEC로 분리할 수 있다. 용출 시간은 상기 분자 크기에 달려있다. 상기 분자가 작을수록, 상기 용출 시간이 길어진다.
상기 샘플을 이동상에 0.5% w/v의 농도로 용해시켰다. 주입하기 전에, 상기 샘플을 0.45μm 필터를 통해 여과하였다. 크로마토그래피 분리는 일렬로 묶인 3개의 TSK G2000 SWXL(125 Å, 5 μm, 7.5 mm x 300 mm) 컬럼에서 수행되었다. 0.0375M 인산 완충액, 0.375M 염화암모늄, 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA), 및 25% 아세토니트릴(CH3CN)의 완충액을 분당 0.7mL의 흐름으로 이동상으로 사용하였다. 214 nm에서 측정하는 UV 검출기를 사용하여 펩타이드들의 검출을 수행하였다. 머무름 시간을 기준으로, 펩타이드들의 상기 분포를 크기에 따라 나누고, 상기 상대적인 양은 상기 분자량에 따라 정해진다.
실시예 2 - 본 발명의 유청 단백질 가수분해물의 제조
실시예 2는 본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물의 제조예를 보여준다.
먹이 물질 및 기질로는, Arla Foods Ingredients로부터 농축유청단백질(WPC)인 Lacprodan® DI-8306 용액을 사용하였다. 상기 WPC를 8 중량%의 단백질 농도가 되도록 물에 희석하였다. 상기 용액을 대략 50℃로 가열하고 그리고 4.2% KOH/5.8% NaOH의 용액을 사용하여 pH를 7.0으로 조정하였다. Novozymes A/S로부터 Neutrase conc BG는 수산화나트륨 및 수산화칼륨의 혼합물을 사용하여 pH를 7로 유지하는 동안 제1 가수분해 단계를 시작하기 위해 16 AU-N/kg 단백질(AU-N은 Anson Units-Neutrase를 나타냄)의 양을 첨가하였다. 약 15분 후, Biocatalysts로부터 Promod 523 MPD를 12500 GDU/kg 단백질(GDU는 젤라틴 분해 단위를 나타냄)의 양으로 첨가하고 그리고 pH를 7로 유지하면서 상기 가수분해를 계속하였다. 추가 15분 후(상기 가수분해 시작 후 30분), Novozymes A/S의 Alcalase conc BG를 상기 단백질 질량의 27%에 해당하는 4.2% KOH/5.8% NaOH의 총 질량(kg)이 첨가될 때까지(초기 pH 조정에 사용된 양 포함) pH를 7로 유지하는 동안 14 AU-A/kg 단백질(AU-A는 Anson Units-Alcalase를 나타냄)의 양으로 첨가하였고 그리고 상기 가수분해된 용액의 온도를 75℃로 조정하기 전에 추가 75분 동안 상기 가수분해를 계속하였다. 65℃로 조절하기 전에 75℃에서 30분동안 상기 열처리하고 그리고 Alcalase conc BG를 35 AU-A/kg 단백질의 양으로 첨가함으로써 제2 가수분해를 수행하였다. 가수분해를 120분 동안 계속한 후 상기 반응에서 단백질 양(kg)의 7.3%에 해당하는 양(kg)의 10% 시트르산을 첨가하였다. 상기 제2 가수분해 단계에서 120분의 가수분해 후, 상기 효소들을 비활성화하기 위해 240초의 유지 시간으로 90℃로 가열함으로써 상기 가수분해를 중단하였다. 상기 얻어진 유청 단백질 가수분해물을 역삼투압 처리하여 물을 제거하고, 그 후에 분무 건조 및 최종 분말을 수집 전에 저온살균하였다.
실시예 3 - 본 발명의 유청 단백질 가수분해물의 분석
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 상기 펩타이드 분포를 측정하고 그리고 네슬레(Nestle)로부터 시판되는 유아용 조제분유 조성물 NAN HA1 내 상기 펩타이드들의 상기 펩타이드 분포와 비교하였다. NAN HA1은 저알레르기성으로 알려진 유아용 조제분유이고 그리고 우유 단백질들에 대한 알레르기가 발생할 위험이 있는 건강한 어린이를 위해 홍보되었다. NAN HA1 조제분유의 상기 단백질 공급원은 단백질 가수분해물이다. NAN HA1은 많은 임상 연구에서 테스트되었으며, 알레르기 발생 위험이 있는 유아들에서 알레르기 반응/증상을 예방하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 그러나, 아래 표 1에 나타난 바와 같이, NAN HA1의 상기 펩타이드 분포는 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물과 매우 다르다.
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 샘플은, 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였고, 그리고 NAN HA1의 샘플을 제조하고 그리고 실시예 1.3에 개시된 상기 방법으로 상기 펩타이드 크기 분포를 측정하였다. 결과는 표 1에 나타내었다. 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 샘플은 "WPHinvention"으로 지칭된다.
<375 Da 375-750 Da 750-1250 Da 1250-2500 Da >2500 Da
WPHinvention 17 37.5 25.5 15.5 4.5
NAN HA1 9.3 21.4 17.2 27.2 24.9
표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 상기 펩타이드 크기 분포는 NAN HA1의 상기 펩타이드들의 상기 펩타이드 크기 분포와 매우 다르다. 예를 들어, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물에서 상기 더 큰 펩타이드의 양은(상기 펩타이드들의 4.5%가 2500 Da 이상의 분자량을 가짐) NAN HA1(NAN HA1에서 펩타이드들의 24.9%는 2500Da 이상의 분자량을 가짐)에서보다 더 적다. 또한, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물에서 375 Da 미만의 상기 작은 펩타이드들의 양은 NAN HA1(9.3%)보다 더 높다(17%).
또한, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 상기 가수분해의 정도(DH) 및 회분 함량을 측정하였다. 상기 DH는 실시예 1.1에 개시된 상기 방법에 따라 측정한 반면, 상기 회분 함량은 Eurofins Laboratories에서 GB.5009.4 표준에 따른 중량 측정법을 사용하여 측정하였다. 결과는 표 2에 나타내었다.
Ash (고형분 중량%) 4.8
DH (%) 23.5
NAN HA1에 사용된 상기 가수분해물의 상기 DH는 본 발명의 상기 가수분해물보다 낮은 것으로 추정되는데, 이는 NAN HA1의 더 큰 펩타이드들의 상기 양이 본 발명의 상기 가수분해물보다 높기 때문이다. 예를 들어, NAN HA1에 있는 상기 펩타이드들의 약 51.6%는 1250 Da 이상의 분자량을 갖는 반면, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물에 있는 상기 펩타이드들의 오직 20%만이 1250 Da 이상의 분자량을 갖는다.
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 상기 회분 함량은 고형분의 약 4.8 중량%이었고, 그리고 분말 형태의 상기 유청 단백질 가수분해물(수분 5~6% 포함)에서 4.5 중량%였다. 상기 유청 단백질 가수분해물 내 상기 회분의 양은 다른 유사한 유청 단백질 가수분해물에 비해 놀라울 정도로 낮은 것을 확인하였다.
실시예 4 - 원형 단백질의 존재 분석
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물인, WPHinvention 내 상기 유청 단백질 알파-락트알부민 및 베타-락토글로불린의 양을 HPLC를 사용하여 측정하였다.
상기 샘플을 환원제로서 사용되는 2-메르캅토에탄올(2-mercapthoethanol)과 함께 6M 구아니딘(guanidine) HCl 완충액에 용해시켰다. 분리는 변성된 단백질들의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 기반으로 하였다. 상기 방법에서는 시료 용매 및 HPLC 이동상으로 6M 구아니딘 HCl 완충액을 사용하였다. 상기 분리는 원료 내 주요 단백질들의 적절한 분리를 달성하기 위해 두 개의 TSK-GEL G3000SWXL(7.7mm x 30.0cm) 컬럼 및 일렬로 연결된 가드 컬럼을 기반으로 한다. 알파-락트알부민의 상기 검출 및 정량화는 UV 검출(280nm)을 통해 수행되었다. 베타-락토글로불린은 33.50분 후에 용출되는 반면 알파-락토알부민은 35.8분 후에 용출된다. 상기 HPLC 분석 결과는 도 1에 나타내었으며, 여기서 상기 WPHinvention에는 검출 가능한 베타-락토글로불린 또는 알파-락트알부민이 존재하지 않는 것이 분명하다.
실시예 5 - ELISA에 의한 알레르기 가능성 분석
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 상기 알레르기 가능성은 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA) 테스트 방법인, R4901을 사용하여 Intertek Food Services GmbH에 의해 측정되었다. 상기 R4901 분석법은 가수분해된 유제품 또는 이유식의 베타-락토글로불린(BLG)의 상기 함량을 정량적으로 측정하는 경쟁적 효소 면역분석법이다. 상기 분석 키트는 RIDASCREEN 베타-락토글로불린으로 알려져 있고, 그리고 R-Biopharm AG(품목 번호: R4901)에서 이용할 수 있다. 마이크로타이터 웰은 상기 BLG로 코팅되고 그리고 표준, 샘플 용액 및 항-BLG가 추가된다. 유리 및 고정된 BLG는 상기 항체 결합 부위를 두고 경쟁한다. 세척 후, 퍼옥시다아제로 표지된 2차 항체들을 첨가하고 그리고 상기 항체-BLG-복합체에 결합한다. 결합되지 않은 효소 접합체는 세척 단계를 통해 제거된다. 발색성 효소 기질을 상기 웰에 첨가한다. 결합된 효소 복합체는 상기 무색 발색 기질을 유색 생성물로 전환시킨다. 상기 측정은 광도계로 이루어지고 그리고 상기 흡수는 상기 샘플의 BLG 농도에 반비례한다.
다음 샘플이 분석되었다:
- WPHinvention - 실시예 2에서 얻어진 상기 유청 단백질 가수분해물
- NAN HA1
- Arla Foods Ingredients로부터 Peptigen® IF-3080(DH가 23-29%인 한외여과된 유청 단백질 가수분해물)
"n=3" 및 "n=4"라는 용어는 각각 3개 및 4개의 샘플들이 테스트되었음을 의미한다. 결과는 표 3에 나타내었다.
또한, 상기 유청 단백질 가수분해물 제조에 사용된 원료에서 가수분해되지 않은 원형 단백질의 양을 계산할 수 있고 따라서 상기 베타-락토글로불린(BLG) 함량의 배수 감소를 계산할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물은 54% BLG, 즉 540,000mg BLG/kg 분말을 포함하는 유청 단백질 농축물을 사용하여 제조된다. 상기 분말의 상기 단백질 함량은 80 중량%이므로 BLG의 양은 432,000mg BLG/kg 단백질에 해당한다. BLG의 배수 감소도 표 3에 나타내었다.
mg BLG/kg protein 가수분해되지 않은 기질의 BLG와 WPHinvention의 BLG 사이의 비율
WPHinvention (n=3) <300 >1440 (*)
NAN HA (n=4) <400
Peptigen IF-3080 <20
* 원형의 가수분해되지 않은 BLG와 WPHinvention의 BLG 사이의 비율은 (432000:300=1440)와 같이 계산되었다.
표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물에서 BLG 상기 함량은 적어도 1440배 감소되었다. WPHinvention의 상기 BLG 함량 및 그에 따른 상기 알레르기 가능성은 NAN HA1의 상기 알레르기 가능성과 유사하고 그리고 예상대로 상기 한외여과된 가수분해물 Peptigen® IF-3080의 알레르기 가능성도 또한 낮다. 상기 가수분해물을 한외여과함으로써, 더 큰 펩타이드들이 제거된다. NAN HA1의 상기 알레르기 가능성은 임상 연구를 통해 낮은 것으로 알려져 있기 때문에, 두 제품의 상기 BLG 함량이 유사하므로 WPHinvention의 상기 알레르기 가능성도 NAN HA1만큼 낮을 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 상기 단백질 가수분해물 및 NAN HA1는 유사하고 그리고 낮은 알레르기 가능성을 갖는다.
실시예 6 - 탈과립화 분석
알레르기성의 측정으로서 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 탈과립화를 분석하였다.
상기 탈과립화 및 이에 따른 알레르기 유발성은 RBL 세포 분석을 사용하여 Polpharma Biologics에 의해 측정되었다. RBL(rat basophil leukemia) 세포는 베타-락토글로불린에 대한 6가지 서로 다른 키메라(생쥐/인간) 항체들의 풀로 감작되었다. 다양한 가수분해물에 노출되었을 때, 상기 세포들의 탈과립화를 측정하고(세포외 헥소사미니다아제(hexosaminidase) 활성을 측정에 의해) 그리고 알레르기성을 확인하였다.
탈과립화는 항체들에 대해 상기 가수분해물에서 상기 항체들로 에피토프들의 상기 결합으로 인해 항체들의 교차 결합, 매개체들의 방출, 그리고 최종적으로 알레르기 반응을 일으키는 것을 의미한다.
탈과립화이 없거나 또는 낮은 결과는 상기 가수분해 과정에서 상기 에피토프들이 파괴/감소되었기 때문에, 가수분해물에서 항체들로 에피토프들의 결합 및 교차 결합이 감소했음을 나타낸다.
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물(WPHinvention)의 탈과립화 효과를 분석하고 그리고 알레르기성을 결정했을 뿐만 아니라, 가수분해된 단백질들을 포함하는 시판되는 유아용 조제분유 NAN HA1도 분석하였다.
샘플 1-3: NAN HA1
샘플 4-6: WPHinvention
결과는 아래 표 4에 나타내었다:
가수분해물 제품 유형 mg BLG/kg 단백질
샘플 1 NAN HA1 83 x 103
샘플 2 NAN HA1 84 x 103
샘플 3 NAN HA1 88 x 103
샘플 4 WPHinvention 309
샘플 5 WPHinvention 378
샘플 6 WPHinvention 441
따라서, 표 4의 상기 데이터는 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 알레르기성이 NAN HA1의 알레르기성보다 더 낮다는 것을 보여준다, 즉, 에피토프들에 대한 항체들의 상기 교차 결합 가능성은 NAN HA1을 사용할 때보다 본 발명의 상기 가수분해물을 사용할 때 더 낮다는 것을 나타낸다. 상기 WPHinvention의 상기 알레르기성은 500mg BLG/kg 단백질 미만이다. 반대로, NAN HA1의 탈과립화에 의해 측정된 상기 알레르기성은 80 x 103 mg BLG/kg 단백질보다 높다. 따라서, NAN HA1이 임상 연구에서 알레르기를 일으키지 않는 것으로 나타났음에도 불구하고, 상기 알레르기성(탈과립화)은 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물보다 150배 이상 높다.
실시예 7 - 면역원성 및 알레르기성/감작의 분석
본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물의 면역원성 및 알레르기성/감작은 음식 알레르기 감작에 대한 Brown Norway 쥐 모델을 사용하여 유청 단백질 농축물 및 광범위하게 가수분해되고, 여과된 유청 단백질 제품과 비교되었다. 감작은 알레르기의 전조현상이므로, 알레르기성의 지표로서 인식된다.
상기 Brown Norway 쥐는 IgE 응답기(responder)가 높아, 알레르기가 발생하기 쉬운 경향이 있는 아토피성 인간들과 유사하다. 상기 Brown Norway 쥐 모델을 사용한 실험은 덴마크 기술 대학에서 수행되었다. Brown Norway 쥐 모델은 "Characterization of the Immunogenicity and Allergenicity of Two Cow's Milk Hydrolysates - A Study in Brown Norway Rats", Bøgh et al., Scandinavian Journal of Immunology, 2014년 12월 23일, DOI:10.1111/sji.12271에 개재된 논문에 설명되어 있다.
상기 면역원성 및 감작을 평가하기 위해, 샘플/제품의 용량당 100μg 또는 200μg을 상기 쥐들에게 복강내 주사하였고 그리고 상기 특정 IgG1 및 특정 IgE 항체들은 "Preclinical Brown Norway Rat Models for the Assessment of Infant Formulas in the Prevention and treatment of Cow's Milk Allergy", Jensen et al., published in International Archives of Allergy and Immunology, 13 February 2019, DOI: 10.1159/000495801 and Bøgh et al, 2014.에 개시된 ELISA 분석을 사용하여 측정되었다. 최대 감작을 보장하기 위해 200μg의 용량을 사용했고 -가능한 경우- 반면 제품의 상기 감작 차이를 조사하기 위해 100μg의 용량을 사용하였다. 상기 제품의 상기 면역원성 및 감작은 Arla Foods Ingredients로부터 상기 원형의 유청 제품 WPC Lacprodan® DI-8306에 대한 특정 IgG1(면역원성) 및 특정 IgE(감작/알레르기성) 항체들의 수준을 기준으로 평가되었다.
상기 쥐들은 적어도 10세대 동안 우유가 없는 식단을 유지하였고 따라서 우유에는 경험이 없었다. 상기 동물들은 5-8주령이었으며, 물과 먹이를 자유롭게 주고 그리고 동성 쌍으로 3마리씩 마크로론(macrolon)케이지에 보관하였다. 상기 쥐들에 대한 다른 조건들은 Jensen et al., 2019 및 Bøgh et al., 2014에 개시되어 있다.
상기 쥐들은 연구 기간 동안 3회 i.p. 예방접종을 받았다; 0일, 14일 및 28일에 0.5mL/동물의 용액과 함께. 혈액 샘플들은 21일 및 28일에 혀 정맥에서 채취되었고, 게다가 35일에 상기 동물들이 희생될 때 수집되었다. 혈청을 얻기 위해 Jensen et al., 2019 및 Bøgh et al., 2014에 개시된 것처럼 모든 혈액 샘플을 수집하고 혈청으로 전환하였다. Jensen et al., 2019 및 Bøgh et al., 2014에 개시된 두 가지 서로 다른 ELISA를 사용하여 상기 혈청을 특정 IgG1(면역원성) 및 특정 IgE(감작)에 대해 분석하였다.
다음 샘플들의 상기 면역원성(IgG1) 및 감작(IgE)을 테스트하였다:
- PBS(인산 완충 생리 식염수).
- WPC: Arla Foods Ingredients의 상기 유청 단백질 농축물 Lacprodan® DI-8306에서 추출한 원형 유청 단백질이 사용되었다.
- 광범위하게 가수분해된 WPC1: 광범위하게, 25-30의 가수분해의 정도를 갖는 Arla Foods Ingredients로부터 여과된 가수분해된 유청 단백질인, Peptigen® IF-3080(batch 1)가 사용되었다.
- 광범위하게 가수분해된 WPC2: 또 다른 광범위하게, 여과된 가수분해된 유청 단백질 가수분해물인, 25-30의 가수분해의 정도를 갖는 Peptigen® IF-3080(batch 2)이 사용되었다.
- 부분적으로 가수분해된 WPC1: 본 발명의 상기 방법의 첫 번째 단계에 의해 제조되었지만, 그러나 어떠한 열처리 및 상기 제2 가수분해 없이 제조된 유청 단백질 가수분해물.
- 부분적으로 가수분해된 WPC2: 실시예 2의 상기 방법에 따라 제조된 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물. 상기 부분적으로 가수분해된 WPC2는 이전 실시예들의 상기 WPHinvention에 해당하고 그리고 가수분해의 정도는 약 23.5이다.
모든 샘플들을 PBS에 용해시키고 그리고 i.p.를 쥐에게 주입하였다.
도 2a, b 및 c는 각각 21일, 28일 및 35일에 상기 쥐 혈청의 IgG1 적정농도를 나타낸다. PBS를 투여한 대조군과 비교하여 다른 그룹들 간의 통계적으로 유의미한 차이는 별표로 나타내었다: *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001. 상기 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 7.00(San Diego, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. a)는 두 번째 투여 1주 후(21일차) 특정 IgG1을 나타내고, b)는 두 번째 투여 2주 후(28일차) 특정 IgG1을 나타내고, c)는 세 번째 투여 1주 후(35일차) 특정 IgG1을 나타낸다.
도 2a-c로부터, 면역화 후에, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물 및 상기 유청 단백질 농축물로 면역화된 상기 그룹, 모두가 이들 제품들이 면역원성 IgG 반응을 유도한 것을 나타내는 상기 대조군과 비교하였을 때 Lacprodan® DI-8306에 대해 상당히 더 높은 수준의 특정 IgG1을 발생시켰다는 것이 분명하다. 반대로, 광범위하게 가수분해된 유청 단백질을 주사한 쥐들 그룹에서는 혈청에서 IgG가 검출되지 않아, 상기 광범위하게 가수분해된 유청 단백질 가수분해물이 면역원성 IgG 반응을 유도하지 않았음을 나타냈다.
그림 3a, b 및 c는 각각 21일, 28일 및 35일에 WPC Lacprodan® DI-8306에 대한 특정 IgE의 적정농도로서의 감작을 나타낸다. 서로 다른 그룹들 간의 통계적으로 유의미한 차이는 별표로 나타내었다: *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001. a)는 두 번째 투여 1주일 후(21일차) 특정 IgE를 나타내고, b)는 두 번째 투여 2주 후(28일차) 특정 IgE를 나타내고, c)는 세 번째 투여 후 1주일(35일차) 특정 IgE를 나타낸다.
도 3은 28일 후 IgE 적정농도가 광범위하게 가수분해된 WPC1 및 WPC2 또는 부분적으로 가수분해된 WPC 1 또는 WPC 2로 면역된 동물들보다 WPC로 면역된 동물들에서 더 높다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 상기 유청 단백질 가수분해물 및 광범위하게 가수분해된 유청 단백질 가수분해물의 상기 감작은 낮다. 35일 후에는, 부분적으로 가수분해된 WPC의 상기 적정농도가 광범위하게 가수분해된 WPCs의 상기 적정농도보다 높다. 본 발명의 부분적으로 가수분해된 WPC 2의 상기 적정농도는 35일 후 WPC의 상기 적정농도보다 낮다.

Claims (14)

  1. 다음 특징들을 갖는 유청 단백질 가수분해물:
    i) 분자량이 2500 Da 이상인 펩타이드들을 총 단백질 함량의 7.5 중량% 이하로 포함하는 것;
    ii) RBL 세포 분석에서 측정된 베타-락토글로불린(BLG)의 농도가 500 mg BLG/kg 단백질 미만인 것에 해당하는 알레르기 유발성;
    iii) 가수분해되지 않은 유청 단백질과 본질적으로 동일한 면역화된 동물들의 혈청 IgG 적정농도에 기초한 면역원성;
    iv) 본질적으로 원형 단백질을 포함하지 않는 것.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가수분해의 정도(degree of hydrolysis)가 적어도 17%인 것인, 유청 단백질 가수분해물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 가수분해의 정도는 17% 내지 30%의 범위 내에 있는 것인, 유청 단백질 가수분해물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베타-락토글로불린의 농도는 ELISA 분석을 사용하여 측정된 500 mg/kg 총 단백질 미만인 것인, 유청 단백질 가수분해물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유청 단백질 가수분해물은 고형분 함량의 6.0 중량% 이하의 범위 내 회분 양을 포함하는 것인, 유청 단백질 가수분해물.
  6. 다음 단계를 포함하는 유청 단백질 가수분해물의 제조 방법:
    a) 유청 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;
    b) 유청 단백질을 포함하는 상기 용액에, 적어도 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)로부터의 서브틸리신(subtilisin), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 서몰리신(thermolysin) 및 아나나스 초모수스(Ananas comosus)로부터의 시스테인 엔도프로테아제(cysteine endoprotease)를 첨가하고 그리고 제1 가수분해 단계를 수행하는 단계;
    c) 단계 b)의 상기 가수분해된 용액을 적어도 60℃의 온도로 조절하고 그리고 남아있는 접힌 단백질을 펼치기 위해 충분한 시간 동안 상기 온도를 적어도 60℃로 유지함으로써 열처리하는 단계;
    d) 단계 c)의 상기 열처리된 용액의 상기 온도를 50℃ 내지 70℃의 온도로 조절하는 단계
    e) 단계 d)의 상기 가수분해물에 적어도 바실러스 리체니포미스로부터의 서브틸리신을 첨가하고 그리고 제2 가수분해 단계를 수행하는 단계;
    f) 상기 가수분해의 정도가 적어도 17% 일때 상기 효소들을 비활성화하는 단계;
    유청 단백질 가수분해물을 얻기 위함.
  7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 획득된 상기 유청 단백질 가수분해물의 한외여과를 포함하지 않는 것인, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 제1 가수분해 단계 b)는 적어도 45분의 기간동안 수행되는 것인, 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, pH는 6.0 내지 7.5인 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물을 포함하는 식품.
  11. 제10항에 있어서, 상기 식품은 유아용 영양 제품인 것인, 식품.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 상기 유청 단백질 가수분해물의 유아들 영양에서의 용도.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유아들 또는 이를 필요로 하는 환자들의 우유 단백질에 대한 알레르기 위험을 감소시키는데 사용하기 위한 것인, 유청 단백질 가수분해물.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유아들 또는 이를 필요로 하는 환자들의 아토피성 피부염, 천식 및/또는 알레르기성 비염의 예방 또는 발병 위험을 감소시키기 위한 것인, 유청 단백질 가수분해물.
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