KR20230149886A - 재프로그램가능한 tnpb 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

재프로그램가능한 tnpb 폴리펩티드 및 이의 용도

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KR20230149886A
KR20230149886A KR1020237026710A KR20237026710A KR20230149886A KR 20230149886 A KR20230149886 A KR 20230149886A KR 1020237026710 A KR1020237026710 A KR 1020237026710A KR 20237026710 A KR20237026710 A KR 20237026710A KR 20230149886 A KR20230149886 A KR 20230149886A
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tnpb
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protein
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KR1020237026710A
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펑 장
한 알테-트란
소움야 칸난
수치타 네티
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더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드
매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

폴리뉴클레오티드를 표적화하기 위한 시스템, 방법, 및 조성물이 본 명세서에서 상술된다. 특히, 신규 TnpB 폴리펩티드 및 재프로그램가능한 표적화 핵산 성분을 포함하는 조작된 DNA-표적화 시스템 및 사용 방법 및 적용 분야가 제공된다.

Description

재프로그램가능한 TNPB 폴리펩티드 및 이의 용도
관련 출원에 관한 교차-참조
본 출원은 2021년 1월 25일 출원된 미국 가출원 제63/141,371호, 2021년 6월 1일 출원된 미국 가출원 제63/195,610호, 2021년 6월 15일 출원된 미국 가출원 제63/210,860호, 및 2021년 11월 23일 출원된 미국 가출원 제63/282,352호의 이득을 청구한다. 상기 확인된 출원의 전체 내용은 참조로 본 명세서에서 전체로 편입된다.
연방정보 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원이 수여하는 보조금 번호 HL141201 및 HG09761 하의 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
서열 목록
본 출원은 출원과 동시에 제출되고, "COPY 1," "COPY 2," 및 "3 of 3"으로 표지된 CD-ROM에 서열 목록을 함유한다. 각각은 2022년 1월 25일 생성되고, 222,687,678 바이트 (디스크 상에 222.7 MB)의 크기를 갖는, BROD-5345WP_ST25.txt 명칭의 ASCII.txt 파일을 함유한다. 서열 목록의 내용은 그 전문이 본 명세서에 편입된다.
기술 분야
본 명세서에 개시된 대상 주제는 일반적으로 TnpB 폴리펩티드를 포함하는 시스템을 이용하는 표적화된 유전자 변형 및 핵산 편집에 사용되는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다.
표적화된 게놈 섭동을 일으키는데 이용가능한 게놈-편집 기술이 존재하지만, 게놈 내에서 다수 위치를 표적화하기 위해서, 신규 전략 및 분자 기전을 적용하고 가격이 감당가능하며, 설정하는데 용이하고, 다루기 쉬운 새로운 게놈 조작 기술의 필요성이 여전히 남아있다. 게놈 조작 및 생물공학에서 추가적인 바람직한 도구는 기술을 더 발전시키게 될 것이다.
본 출원에서 임의 문헌의 인용 또는 확인은 이러한 문서가 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용가능하다는 인정은 아니다.
일정 예의 구현예에서, a) RuvC 유사 도메인을 포함하는 TnpB 폴리펩티드 및 b) 스캐폴드 및 재프로그램가능한 스페이서 서열을 포함하는 핵산 성분 분자, ωRNA를 포함하는 비-천연 발생 조작된 조성물로서, RNA 분자는 TnpB 폴리펩티드와 복합체를 형성할 수 있고 TnpB 폴리펩티드를 표적 폴리뉴클레오티드로 유도할 수 있다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 약 200 내지 약 500 아미노산을 포함한다. 조성물은 10 뉴클레오티드 내지 30 뉴클레오티드 길이의 ωRNA 성분 분자 재프로그램가능한 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 구현예에서, 핵산 성분 분자는 약 80 내지 200 뉴클레오티드 길이의 스캐폴드를 포함한다. 일 양태에서, 표적 서열은 서열 TCA 또는 TTCAN을 포함할 수 있는 표적 폴리뉴클레오티드의 5'의 표적 인접 모티프 (TAM) 서열을 포함한다.
일 구현예에서, TnpB 단백질은 표 1A, 표 1B, 또는 도 1로부터 선택되거나, 또는 표 1C의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일 구현예에서, TnpB 단백질은 표 1A, 표 1B, 표 1C 또는 도 1로부터 선택되거나, 또는 도 1의 서열 정렬의 195D, 277E, 또는 361D에 상응하는 하나 이상의 촉매성 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, TnpB 단백질은 45℃ 내지 60℃의 온도 범위에서, 활성이고, 다시 말해서, 뉴클레아제 활성을 보유한다.
일 구현예에서, TnpB 단백질은 악티노마두라 셀룰로실리티카 (Actinomadura cellulosilytica) 균주 DSM 45823, 악티노마두라 나미비엔시스 (Actinomadura namibiensis) 균주 DSM 44197, 악티노플라누스 로바투스 (Actinoplanus lobatus) 균주 DSM 43150 (TnpB-1 및 TnpB-2), 리핑장겔라 할로필라 (Lipingzhangella halophila) 균주 DSM 102030, 크테도노박터 라세미페르 (Ktedonobacter racemifer), 및 엡실론프로테오박테리아 박테리움 (Epsilonproteobacteria bacterium) QNF01000004_Extraction_(reversed), 및 알리시클로바실러스 마크로스포란기이두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) 균주 DSM 17980로부터 선태고딘다.
구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일 양태에서, 핵산 성분은 압타머를 더 포함한다. 일 구현예에서, ωRNA 성분 분자는 RNA 주형을 첨가하기 위해 연장부를 더 포함한다.
구현예에서, 조성물은 TnpB 단백질과 연합된 기능성 도메인을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 기능성 도메인은 트랜스포사제 활성, 리콤비나제 활성, 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 번역 활성화 활성, 번역 억제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 염색질 변형 또는 리모델링 활성, 히스톤 변형 활성, 뉴클레아제 활성, 단일-가닥 RNA 절단 활성, 이중-가닥 RNA 절단 활성, 단일-가닥 DNA 절단 활성, 이중-가닥 DNA 절단 활성, 핵산 결합 활성, 검출가능한 활성, 또는 이의 임의 조합을 갖는다. 조성물은 세린 또는 티로신 리콤비나제를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 표적 폴리뉴클레오티드로 삽입을 위한 도너 서열을 포함하는 상동성 재조합 도너 주형을 더 포함할 수 있다.
일 양태에서, 조성물은 DNA 폴리뉴클레오티드의 절단을 포함할 수 있는 부위-특이적 변형을 제공한다. 일 양태에서, 절단은 표적-인접 모티프에 대해 원위에서 발생될 수 있는, 5' 오버행을 생성시킨다. 일 구현예에서, TnpB 매개된 절단은 스페이서 어닐링 부위 또는 표적 서열의 3'의 부위에서 발생된다.
벡터 시스템이 또한 제공되고 본 명세서에 상술되는 바와 같은 TnpB 폴리펩티드 및 ωRNA 성분 조성물을 코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다.
구현예에서, 본 명세서에 상술되는 바와 같은 조성물을 포함하는 조작된 세포가 제공된다.
조성물, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 벡터를 본 명세서에 개시된 바와 같은 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 세포의 개체군에 전달하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드에서 핵산을 편집하는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA 내 표적 서열이다. 일 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기에서 편집되어서 G→A 또는 C→T 돌연변이가 도입된다.
단리된 세포 또는 이의 자손은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 만들어진 하나 이상의 염기 편집을 포함하는 것이 또한 제공된다.
세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법이 본 명세서에서 제공되며, 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물 중 어느 하나를 세포에 도입시키는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 폴리펩티드 및/또는 ωRNA 성분은 폴리펩티드 및/또는 ωRNA(들)를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 통해서 제공되고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 TnpB 폴리펩티드 및/또는 ωRNA 분자를 발현하도록 작동적으로 구성된다. 일 구현예에서, 방법은 치환, 결실, 및 삽입을 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 도입시킨다.
구현예에서, 본 명세서는 a) TnpB 폴리펩티드로서, 촉매적으로 불활성인 TnpB 폴리펩티드; b) TnpB 단백질과 연합되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 데아미나제; 및 c) TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 서열에서 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 성분 분자를 포함하는 조작된, 비-천연 발생 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 뉴클레오티드 데아미나제는 아데노신 데아미나제 또는 시토딘 데아미나제이다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 벡터가 또한 제공된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물의 하나 이상의 성분을 발현하도록 유전자 조작된 세포 또는 이의 자손이 제공된다.
구현예에서, 본 명세서는 a) 촉매적 데드 TnpB 폴리펩티드; b) TnpB 폴리펩티드와 연합되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 역전사 효소; 및 c) TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 대한 복합체의 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 성분 분자를 포함하는 조작된, 비-천연 발생 조성물을 제공하고, 가이드 분자는 표적 폴리뉴클레오티드로 삽입을 위한 도너 서열을 코딩하는 도너 주형을 더 포함한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 벡터가 제공된다.
뉴클레오티드를 포함하는, 세포 또는 세포의 개체군에 전달하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법이 제공되고, 복합체는 역전사효소를 표적 서열로 유도하고, 역전사효소는 표적 폴리뉴클레오티드로 ωRNA 성분 분자 유래 도너 주형에 의해 코딩되는 도너 서열의 삽입을 촉진한다.
구현예에서, 본 명세서는 도너 서열의 삽입이 a) 하나 이상의 염기 편집을 도입시키거나; b) 조기 중지 코돈을 교정하거나 또는 도입시키거나; c) 스플라이스 부위를 파괴하거나; d) 스플라이스 부위를 삽입시키거나 또는 복원시키거나; e) 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 양쪽 대립유전자에서 유전자 또는 유전자 단편을 삽입시키거나; 또는 f) 이의 조합인 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 만들어진 변형을 포함하는 단리된 세포 또는 이의 자손을 제공한다.
구현예에서, 본 명세서는 a) TnpB 폴리펩티드; b) TnpB 폴리펩티드와 연합되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질; 및 c) TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 대해 복합체의 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 성분 분자을 포함하는 조작된, 비-천연 발생 조성물을 제공하고, ωRNA 분자는 표적 폴리뉴클레오티드로 삽입을 위한 도너 서열을 코딩하고 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 2개 결합 구성요소 사이에 위치되는 도너 주형을 더 포함한다.
일 구현예에서, 본 명세서는 TnpB 단백질이 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질의 N-말단에 융합된 것인 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 본 명세서는 TnpB 단백질이 닉카제 활성을 갖도록 조작된 것인 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, ωRNA 성분 분자는 표적화된 삽입 부위의 5'의 표적 서열로 융합 단백질을 유도하고, TnpB 단백질은 표적화된 삽입 부위에서 가닥 파손을 생성시킨다. 일 구현예에서, ωRNA 성분 분자는 표적화된 삽입 부위의 3'의 표적 서열로 융합 단백질을 유도하고, TnpB 단백질은 표적화된 삽입 부위에서 가닥 파손을 생성시킨다. 일 구현예에서, 도너 폴리뉴클레오티드는 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단 프로세싱을 촉진하기 위해서 폴리머라제 프로세싱 구성요소를 더 포함한다. 일 구현예에서, 도너 폴리뉴클레오티드는 도너 구성체의 5' 말단, 도너 구성체의 3' 말단, 또는 둘 모두 상의 표적 서열에 대한 상동성 영역을 더 포함한다. 일례의 구현예에서, 상동성 영역은 8 내지 25 염기쌍이다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물의 하나 이상의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터가 제공된다.
상기 조성물, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 벡터를 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포 또는 세포의 개체군에 전달하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법이 제공되고, 방법에서 복합체는 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질을 표적 서열로 유도하고 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질은 표적 폴리뉴클레오티드로 도너 구성체 유래 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 촉진한다.
구현예에서, 본 명세서에서 도너 서열의 삽입이 a) 하나 이상의 염기 편집을 도입시키거나; b) 조기 중지 코돈을 교정하거나 또는 도입시키거나; c) 스플라이스 부위를 파괴하거나; d) 스플라이스 부위를 삽입시키거나 또는 복원시키거나; e) 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 양쪽 대립유전자에서 유전자 또는 유전자 단편을 삽입시키거나; 또는 f) 이의 조합인 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 만들어진 변형을 포함하는 단리된 세포 또는 이의 자손을 제공한다.
구현예에서, 본 명세서는 a) TnpB 폴리펩티드; b) TnpB 폴리펩티드와 연합되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 인테그라제 단백질; 및 c) TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 대한 복합체의 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 성분 분자를 포함하는 조작된, 비-천연 발생 조성물을 제공하고, 가이드 분자는 표적 폴리뉴클레오티드로 삽입을 위한 도너 서열을 코딩하고 인테그라제 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 2개 결합 구성요소 사이에 위치되는 도너 주형을 더 포함한다. 일 구현예에서, TnpB 단백질은 인테그라제 단백질, 및 임의로 역전사효소에 융합된다. 일 구현예에서, 본 명세서는 TnpB 단백질이 닉카제 활성을 갖도록 조작된 것인 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, ωRNA 성분 분자는 융합 단백질을 표적 서열로 유도하고, TnpB 단백질은 표적화된 삽입 부위에 닉 (nick)을 생성한다. 일 구현예에서, 도너 폴리뉴클레오티드 도너 구성체의 5' 말단, 도너 구성체의 3' 말단, 또는 둘 모두 상의 표적 서열에 대한 상동성 영역을 더 포함한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물의 하나 이상의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터가 제공된다.
상기 조성물, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 벡터를 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포 또는 세포의 개체군에 전달하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법이 제공되고, 방법에서 복합체는 표적 서열로 인테그라제 단백질을 유도하고, 인테그라제 단백질은 표적 폴리뉴클레오티드로 도너 구성체 유래 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 촉진한다.
구현예에서, 본 명세서는 도너 서열의 삽입이 a) 하나 이상의 염기 편집을 도입시키거나; b) 조기 중지 코돈을 교정하거나 또는 도입시키거나; c) 스플라이스 부위를 파괴하거나; d) 스플라이스 부위를 삽입시키거나 또는 복원시키거나; e) 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 양쪽 대립유전자에서 유전자 또는 유전자 단편을 삽입시키거나; 또는 f) 이의 조합인 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 만들어진 변형을 포함하는 단리된 세포 또는 이의 자손을 제공한다.
구현예에서, 본 명세서는 부차적 활성을 보유하는 하나 이상의 TnpB 단백질; 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있고 하나 이상의 TnpB 단백질과 복합체를 형성하도록 디자인된 서열을 포함하는 적어도 하나의 ωRNA 성분; 폴리뉴클레오티드 성분을 포함하는 검출 구성체; 및 임의로, 등온 증폭 시약을 포함하는, 샘플에서 표적 뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 조성물을 제공하고, 여기서 TnpB 단백질은 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고, 표적 서열에 의해 활성화되면 검출 구성체의 폴리뉴클레오티드 성분을 절단한다.
일 구현예에서, TnpB 단백질은 표 1A, 표 1B, 또는 도 1로부터 선택되거나, 또는 표 1C의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일 구현예에서, TnpB 단백질은 표 1A, 표 1B, 또는 도 1로부터 선택되거나, 또는 도 1의 서열 정렬의 195D, 277E, 또는 361D에 상응하는 하나 이상의 촉매성 잔기를 포함하거나, 또는 표 1C의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일 구현예에서, TnpB 단백질은 45℃ 내지 60℃의 온도 범위에서, 활성이고, 다시 말해 뉴클레아제 활성을 보유한다.
일 구현예에서, 등온 증폭 시약은 루프-매개 등온 증폭 (LAMP) 시약이다. 일례의 구현예에서, LAMP 시약은 LAMP 프라이머를 포함한다.
일 구현예에서, 본 명세서는 반응 특이성 또는 동역학을 증가시키기 위해 하나 이상의 첨가제를 더 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 명세서는 폴리뉴클레오티드 결합 비드를 포함하는 조성물을 제공한다.
구현예에서, 표적 서열, 예를 들어, 코로나바이러스의 검출을 위한 시스템이 제공된다. 샘플에서 표적 서열의 존재를 검출하기 위한 시스템은 TnpB 단백질; 표적 서열에 결합할 수 있고 TnpB 단백질과 복합체를 형성하도록 디자인된 서열을 포함하는 적어도 하나의 ωRNA 성분 분자; 및 폴리뉴클레오티드 성분을 포함하는 검출 구성체를 포함할 수 있고, TnpB 단백질은 부차적 RNase 활성을 나타내고, 표적 서열에 의해 활성화되면 검출 구성체의 폴리뉴클레오티드 성분을 절단한다.
예의 구현예에서, 샘플에서 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 조성물이 제공되고, 조성물은 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 등온 증폭 시약, 및 세포 또는 바이러스 입자로부터 폴리뉴클레오티드를 단리하기 위한 무추출 용액을 포함한다. 등온 증폭 시약은 F3, B3, FIP, BIP, 루프 전방향 및 루프 역방향 프라이머를 포함하는 LAMP 시약을 포함할 수 있다. 일 양태에서, LAMP 시약은 올리고뉴클레오티드 가닥 치환 (OSD) 프로브를 더 포함할 수 있다.
시스템 및 방법은 하나 이상의 TnpB 단백질을 이용할 수 있고, 일 양태에서, TnpB 단백질은 열안정성이다. 검출을 위한 조성물은 DNA 추출 용액을 포함할 수 있다. 검출 방법은 본 명세서에 개시된 시스템과 샘플을 접촉시키기 전에 DNA 추출 용액으로 샘플을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 추출은 또한 샘플의 관심 표적을 농축할 수 있는 비드의 첨가 단계를 포함할 수 있고, 일 양태에서, 비드는 자성이다.
일 구현예에서, TnpB 복합체에 대한 표적 폴리뉴클레오티드의 결합에 의한 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드의 검출은 45℃ 내지 60℃의 온도 범위에서 발생된다.
일 구현예에서, TnpB 복합체 중 TnpB 단백질은 악티노마두라 셀룰로실리티카 균주 DSM 45823, 악티노마두라 나미비엔시스 균주 DSM 44197, 악티노플라누스 로바투스 균주 DSM 43150 (TnpB-1 및 TnpB-2), 리핑장겔라 할로필라 균주 DSM 102030, 크테도노박터 라세미페르, 및 엡실론프로테오박테리아 박테리움 QNF01000004_Extraction_(reversed), 및 알리시클로바실러스 마크로스포란기이두스 균주 DSM 17980으로부터 선택된다.
검출 시스템을 포함하는 장치가 제공된다. 장치는 측류 장치 또는 카트리지를 포함할 수 있다. 제1 말단 및 제2 말단을 포함하는 기재를 포함하는 측류 장치가 또한 제공되고, 제1 말단은 샘플 로딩 부분, 검출가능한 리간드를 포함하는 제1 영역, 본 명세서에서 제공되는 청구항의 둘 이상의 시스템, 및 각각이 제1 결합제를 포함하는 것인 하나 이상의 제1 포획 영역을 포함하고; 기재는 제1 말단의 제1 영역 및 제2 말단 사이에 둘 이상의 제2 포획 영역을 포함하고, 각각의 제2 포획 영역은 상이한 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 제1 말단은 2종의 검출 구성체를 포함하고, 2종의 검출 구성체의 각각은 제1 말단 상에 제1 분자 및 제2 말단 상에 제2 분자를 포함하는, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일 양태에서, 제1 말단은 3종의 검출 구성체를 포함하고, 3종의 검출 구성체의 각각은 제1 말단 상에 제1 분자 및 제2 말단 상에 제2 분자를 포함하는, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 측류 장치는 TnpB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 핵산 성분 분자는 다중화 폴리뉴클레오티드로서 제공되고, 다중화 폴리뉴클레오티드는 둘 이상의 핵산 성분 분자를 포함하도록 구성된다.
적어도 제1 및 제2 앰풀, 용해 챔버, 증폭 챔버 및 샘플 수용 챔버를 포함하는 카트리지가 제공될 수 있고, 제1 앰풀은 샘플 수용 챔버에 유체 연결되고, 샘플 수용 챔버는 용해 챔버에 추가로 연결되고, 용해 챔버는 제2 앰풀 및 증폭 챔버에 계량 채널을 통해 연결된다.
카트리지는 가열 수단, 광학 수단, 카트리지 상에 시약 방출을 위한 수단, 및 어세이 결과의 판독을 위한 수단을 포함하는 시스템에 맞도록 구성될 수 있다. 카트리지는 용해 완충액을 포함하는 제1 앰풀, 및/또는 TnpB 시스템을 포함하는 제2 앰풀을 포함할 수 있고, TnpB 시스템은 하나 이상의 TnpB 단백질 및 적어도 하나의 핵산 성분 분자을 포함한다.
일 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 및 검출을 위한 TnpB 부차적 검출 시스템의 TnpB 단백질이 45℃ 내지 60℃의 온도 범위에서, 활성이고, 다시 말해, 뉴클레아제 활성을 보유하는 것인 카트리지가 제공된다.
일 구현예에서, TnpB 단백질이 악티노마두라 셀룰로실리티카 균주 DSM 45823, 악티노마두라 나미비엔시스 균주 DSM 44197, 악티노플라누스 로바투스 균주 DSM 43150 (TnpB-1 및 TnpB-2), 리핑장겔라 할로필라 균주 DSM 102030, 크테도노박터 라세미페르, 및 엡실론프로테오박테리아 박테리움 QNF01000004_Extraction_(reversed), 및 알리시클로바실러스 마크로스포란기이두스 균주 DSM 17980 유래의 표 1A의 TnpB인 카트리지가 제공된다.
샘플에서 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법이 제공되고, 방법은 하나 이상의 표적 서열을 TnpB, TnpB와 복합체를 형성할 수 있고 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 서열-특이적 결합을 유도할 수 있는 적어도 하나의 ωRNA 성분 및 검출 구성체와 접촉시키는 단계로서, TnpB는 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고 하나 이상의 표적 서열에 의해 활성화되면 검출 구성체를 절단하는 것인 단계; 및 검출 구성체의 절단으로부터의 신호를 검출하여서 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 포함한다. 샘플에서 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 방법은 접촉 단계 전에 등온 증폭을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 더 포함한다. 일 구현예에서, TnpB 복합체에 대한 표적 폴리뉴클레오티드의 결합을 통한 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드의 검출이 45℃ 내지 60℃의 온도 범위에서 발생되는 것인 방법이 제공된다. 일례의 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 1시간 이내에 검출된다.
또한 본 명세서에 기술된 장치와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위한 방법이 또한 제공된다.
예시적인 구현예의 이들 및 다른 양태, 목적, 특성 및 장점은 예시적인 구현예의 하기 상세한 설명을 고려하면 당업자에게 자명해질 것이다.
본 발명의 특성 및 장점의 이해는 본 발명의 원리를 이용할 수 있는, 실례적인 구현예를 기재하는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조하여 수득될 것이다:
도 1 - 예시적인 TnpB 펩티드의 서열 정렬을 도시한다. RuvC 촉매성 아미노산 잔기는 밑줄로 표시된다.
도 2 - 예시적인 TnpB 서열의 정렬.
도 3 - 예시적인 TnpB 유전자좌의 3' 말단의 정렬.
도 4 - 예시적인 TnpB의 5' 반전 말단 반복부 (ITR) 서열을 도시한다.
도 5 - IscB의 5' ITR는 예시적인 TnpB와 서열 수준에서 유사성을 보인다.
도 6 - 예시적인 크테도노박터 라세미페르 TnpB 유전자, RNA 보존 영역 및 가이드 (즉, 스페이서)를 도시한다.
도 7 - 5' ITR 및 3'ITR를 포함한, 케이. 라세미페르 (K. racemifer) 유래의 예시적인 TnpB 유전자좌의 주석달린 서열을 도시한다.
도 8 - 악티노플라네스 로바투스 (Actinoplanes lobatus) 균주 DSM 43150 및 엡실론프로테오박테리아 박테리움 단리주 B11의 예시적인 TnpB 단백질의 TAM 요건의 조사를 위한 실험 설정을 도시한다.
도 9 - 악티노플라네스 로바투스 균주 DSM 43150 (TCAG) 및 엡실론프로테오박테리아 박테리움 단리주 B11 (TCAT)의 5' TAM 웹로고를 도시한다.
도 10 - 표적 절단의 평가에서 사용되는 예시적인 플라스미드 절단 어세이의 개략도를 도시한다.
도 11A-11D - 오솔로그 5의 TnpB Rd1 요약을 도시한다. Rd1은 IscB ncRNA에 대한 서열 유사성을 갖는 ncRNA와 연관된 것으로 보이는 10개 오솔로그의 선택이다. (11A) RNA-seq 분석은 TnpB가 ncRNA와 연관된 것을 검증한다. (11B) 모든 포획된 TAM 중에서 농축된 TAM (Fn 스페이서 영역에 대해 30 bp 가이드)을 보여주는 TnpBRd1_5_Fn30_TAM의 웹로고. (11C) 포획된 TAM 중 상위 15% 중에서 농축된 TAM (644PSP1 스페이서 영역에 대해 30 bp 가이드)을 보이는 TnpBRd1_5_644PSP1_30의 웹로고. (11D) TCAG TAM에 대해 관찰된 10% 고갈 중에서 고갈된 TAM (Fn 스페이서 영역에 대해 30 bp 가이드)의 웹로고.
도 12A-12B - 오솔로그 1 및 4의 TnpB Rd1 검증을 도시한다. (12A) 플라스미드 기질의 TXTL 절단 어세이는 에이. 로바투스 (A. lobatus) TnpB-1 및 에이. 셀룰로실리티카 (A. cellulosilytica) TnpB에서 TAM-특이적 절단을 검증한다. 각 조건은 상이한 기질의 직접 비교를 위해 동일한 농도로 2개 별개 플라스미드를 포함한다. (12B) 어댑터 결찰 부위는 TAM 스크린 및 검증 (오솔로그 4에 대해 표시된 결과) 간에 유사하다. 비-표적 (NT) 및 표적 (T) 가닥의 8N TAM 라이브러리 플라스미드 (상단 막대 그래프)를 사용한 어댑터 결찰의 위치는 어댑터 결찰 부위는 각각의 가닥에 대해 약간 상이하다는 것을 보여준다. 단일 TAM 플라스미드가 비-표적 (NT) 가닥과 사용될 때 (하단 막대 그래프), 어댑터 결찰 부위는 TAM 라이브러리가 사용될 때 비-표적 (NT) 가닥과 유사하다.
도 13A-13B - 7종의 예시적인 TnpB 오솔로그에서 TAM 서열의 확인을 보여준다. (13A) 2가지 방법을 사용하여 5' TAM을 갖는 오솔로그에서 TAM 서열을 결정하였다: (i) 온전한 pTarget의 시퀀싱 및 (ii) 절단 및 어댑터 결찰 이후 농축된 TAM의 시퀀싱. (13B) 악티노마두라 셀루올로실리티카 (Actinomadura celluolosilytica) 균주 DSM 45823, 악티노마두라 나미비엔시스 균주 DSM 44197, 악티노플라네스 로바투스 균주 DSM 43150 유래 2종 TnpB, 알리시클로바실러스 마크로스프란기이두스 (Alicyclobacillus macrosprangiidus) 균주 DSM 17980, 리핑장겔라 할로필라 균주 DSM 102030, 및 엡실론프로테오박테리움 박테리움 (Epsilonproteobacterium bacterium) 및 크테도노박터 라세미페르를 포함하는 7개 박테리아 TnpB 오솔로그 서열의 TAM을 보여주는 웹로고.
도 14 - 2종 TnpB 오솔로그에 대한 TAM의 검증을 도시한다. TAM은 에이. 로바투스 TnpB-1 및 에이. 셀룰로실리티카 TnpB에 대해 절단 생산물의 어댑터-결찰 이후에 결정되었다.
도 15A-15B - (15A) 표적 가닥 (TS) 및 비-표적 가닥 (NTS) 둘 모두에 대한 에이. 로바투스 TnpB-2의 DNA 절단 부위의 확인을 도시한다. 검은색 삼각형은 시퀀싱 후에 확인된 양쪽 가닥 상의 특이적 절단 부위를 표시한다. (15B) 에이. 로바투스 TnpB-2로부터의 8N TAM 라이브러리 플라스미드 절단 생산물의 시퀀싱 및 분석. 비-표적 (NT) 및 표적 (T) 가닥 둘 모두를 절단하였고 스페이서 영역 (bp) 중 상이한 위치에서 판독치의 존재비를 도시한다.
도 16A-16B - 에이. 로바투스 TnpB와 연합된 비-코딩 RNA (ncRNA)의 특징규명을 도시한다. (16A) 이. 콜라이에서 에이. 로바투스 TnpB-2의 발현 및 RNA 풀다운은 TnpB-2 ORF의 바로 하류에 173 nt 스캐폴드에 이어서 가이드 서열을 보여준다. (16B) 전체-길이 173 nt부터 TAM-특이적 농축을 유지하는 것으로 확인된 102 nt까지 절두된 크기 범위의 RNA 스캐폴드.
도 17 - 케이. 라세미페르 TnpB와 연합된 비-코딩 RNA 영역을 보여준다.
도 18A-18F - IS200/605 수퍼패밀리 뉴클레아제의 다양성의 조사를 보여준다. (18A) IS200/605 트랜스포존 수퍼패밀리-코딩된 뉴클레아제 및 연합된 RNA 간 진화. 점선은 잠정적/미지 관계를 반영한다. (18B) 케이. 라세미페르 (K. racemifer)에서 TnpB ωRNA의 천연 발현. (18C) 케이. 라세미페르 IscB 및 TnpB 유전자좌 유래 ωRNA의 비교. (18D) KraTnpB-연결된 ωRNA의 2차 구조 예측. (18E) IVTT TAM 스크린에서 재프로그램된 가이드를 사용한 에이. 로바투스 및 에이. 셀룰로실리티카 TnpB 절단 TAM의 웹로고. (18F) 에이. 로바투스 및 에이. 셀룰로실리티카 TnpB를 사용한 플라스미드 경쟁 어세이 (*는 p < 0.05를 의미함).
도 19 - 천연 발생 RNA-가이드된 DNA-표적화 시스템을 보여준다.
Ω (Obligate Mobile Element Guided Activity (OMEGA)) 시스템과 다른 기지 RNA-가이드된 시스템의 비교. 스페이서 서열을 포획하고 유전자좌의 CRISPR 어레이 내에 그들을 저장하는 CRISPR 시스템과 대조적으로, Ω 시스템은 그들 유전자좌 (또는 트랜스-작용 유전자좌)를 표적 서열로 전좌시켜서, 분명하게, 가이드 징집이라고 불릴 수 있는 과정에서 표적을 ωRNA 가이드로 전환시킨다.
도 20 - TnpB 보존 분석의 결과를 보여준다. KraIscB-1 트랜스포존 말단을 공유하는 TnpB 유전자좌의 3' 말단의 보존성. TnpB 유전자좌의 3' 영역 상의 보존 영역은 IscB의 ωRNA의 5' 영역에 상응한다. 3' 말단 상에 ORF 밖에서 TnpB 유전자좌의 보존성은 IscB의 ωRNA와 유사하게 기능할 수 있는 비-코딩 RNA의 존재를 시사한다.
도 21A-21C - TnpB ωRNA-가이드된 절단의 특징규명.
(21A) 하류에서 예측되는 ωRNA 및 가이드의 존재 하에서 재조합적으로 정제된 에이. 로바투스 TnpB-2의 소형 RNA-seq. 예측된 ωRNA 스캐폴드 및 에이. 로바투스 TnpB-2 단백질과 공동-정제된 추정 가이드를 구성하는 하류 영역은 ωRNA 전사물과 단백질의 상호작용을 시사한다. (21B) 추가적인 TnpB 유전자좌의 TAM 스크린. (21C) SpCas9를 사용한 플라스미드 경쟁 어세이 양성 대조군. 예상한 바와 같이, SpCas9는 절단-특이적 어댑터 결찰 생산물의 존재에 의해 의미하는 바와 같이, 오직 TAM 및 표적-함유 플라스미드만을 절단한다. 통계적 유의성은 양측 T-검정을 사용하여 + 단백질 대 - 단백질 조건에서 열거된 제2 플라스미드의 어댑터-결찰된 판독치의 평균에 대해 정규화된 각 조건에서 열거된 제2 플라스미드의 어댑터-결찰된 판독치의 수를 비교하여 평가되었다.
도 22 - dsDNA 기질의 상이한 온도 (37℃ 내지 80℃ 범위)에서 TnpB 단백질을 사용한, 표적화된 인접 모티프 (TAM) 및 표적-의존적 dsDNA 절단이 TAM 및 표적 둘 모두를 요구하고, 45℃와 60℃ 사이에서 가장 강력하다는 것을 보여준다. 이 실험에서, TnpB 단백질은 알리시클로바실러스 마크로스포란기이두스 균주 DSM 17980에 상응하는, 오솔로그 6으로부터 수득되었고, 1 M 단백질의 최종 농도 및 100 ng의 dsDNA 기질에서 첨가되었다.
도 23 - 60℃에 1 M의 최종 농도에서 알리시클로바실러스 마크로스포란기이두스 균주 DSM 17980 유래 TnpB 단백질을 사용한 부차적 기질 (부차적 기질 1)의 부차적 절단을 보여주는 사진이다. "ssDNA 기질" 및 "dsDNA 기질"은 RNA가 결합하도록 디자인된 표적 서열을 함유한다. "부차적 기질 1"은 표적 서열을 함유하지 않는다. 사진은 부차적 기질 1의 절단은 dsDNA 기질이 표적 서열 및 TAM 둘 모두를 갖는 것인 dsDNA 기질의 존재 하에서 유도된다는 것을 보여준다. 부차적 기질 1의 절단은 또한 TAM이 존재 및 부재하고, 표적 서열이 존재하는 ssDNA 기질 존재 하에서 유도되었다.
본 명세서의 도면은 오직 예시 목적을 위한 것이고 반드시 척도에 따라 도시된 것은 아니다.
일반 정의
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학의 일반 용어 및 기술의 정의는 하기 문헌에서 확인할 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) (Sambrook, Fritsch, and Maniatis); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition (2012) (Green and Sambrook); Current Protocols in Molecular Biology (1987) (F.M. Ausubel et al. eds.); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (1995) (M.J. MacPherson, B.D. Hames, and G.R. Taylor eds.): Antibodies, A Laboratory Manual (1988) (Harlow and Lane, eds.): Antibodies A Laboratory Manual, 2nd edition 2013 (E.A. Greenfield ed.); Animal Cell Culture (1987) (R.I. Freshney, ed.); Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992); 및 Marten H. Hofker and Jan van Deursen, Transgenic Mouse Methods and Protocols, 2nd edition (2011).
본 명세서에서 사용되는, 단수 형태 "한", "하나", 및 "그"는 문맥에서 달리 명확하게 명시하지 않으면, 단수 및 복수 대상 둘 모두를 포함한다.
용어 "임의의" 또는 "임의로"는" 후술되는 사건, 상황 또는 치환기가 존재하지 않을 수도 있거나 또는 존재할 수도 있고, 그 설명은 사건 또는 상황이 일어나는 예 및 일어나지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다.
종료점에 의한 수치 범위의 설명은 언급된 종료점을 비롯하여, 각 범위 내에 포함된 모든 수 및 분수를 포함한다.
측정가능한 값 예컨대 매개변수, 양, 시간적 지속기간 등을 언급할 때 본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략" 은 명시된 값과 그로부터의 변동, 예컨대 그러한 변동이 개시된 발명에서 수행하기에 적절하다면, 명시된 값과 그로부터의 +/-10% 이하, +/-5% 이하, +/-1% 이하, 및 +/-0.1% 이하의 변동을 포괄한다는 것을 의미한다. 수식어 "약" 또는 "대략"이 언급되는 값은 그 자체로 또한 특별히, 그리고 바람직하게 개시된다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용되는, "생물학적 샘플"은 전체 세포 및/또는 생존 세포 및/또는 세포 찌꺼기를 함유할 수 있다. 생물학적 샘플은 "체액" 을 함유할 수 있다 (또는 그로부터 유래할 수 있다). 본 발명은 양수, 안방수, 유리체액, 담즙, 혈액 혈청, 모유, 뇌척수액, 귀지 (이구), 유미, 유미즙, 내림프, 외림프, 삼출물, 대변, 여성 사정액, 위산, 위액, 림프, 점액 (비강 배액 및 가래 포함), 심장막액, 복막액, 흉막액, 고름, 점막 분비물, 타액, 피지 (피부 유분), 정액, 객담, 활액, 땀, 눈물, 소변, 질 분비물, 구토물 및 이의 하나 이상의 혼합물로부터 선택되는 것인 구현예를 포함한다. 생물학적 샘플은 세포 배양물, 체액, 체액으로부터의 세포 배양물을 포함한다. 체액은 예를 들어, 천자, 또는 다른 수집 또는 샘플 채취 과정을 통해 포유동물 유기체로부터 수득될 수 있다.
용어 "대상체", "개체", 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게 포유동물, 보다 바람직하게 인간을 언급하고자 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 포유동물은 쥣과동물, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 반려 동물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 생체 내에서 수득되거나 또는 시험관 내에서 배양된 생물학적 독립체의 조직, 세포 및 그들 자손이 또한 포괄된다.
이하 다양한 구현예를 기재한다. 특정 구현예는 본 명세서에 논의되는 보다 넓은 양태에 대한 제한으로서 또는 완전한 설명으로서 의도되지 않는다는 것을 유의해야 한다. 특정 구현예와 함께 기재되는 하나의 양태는 반드시 그 구현예로 제한되지 않으며 임의의 다른 구현예(들) 로 실시될 수 있다. 본 명세서 전반에서 "하나의 구현예", "한 구현예", "예시적 구현예" 에 대한 언급은 구현예와 함께 기술된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 구현예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에서 다양한 위치에서 어구 "일 구현예에서", "일 구현예에서", 또는 "예시적인 구현예"의 출현은 반드시 모두 동일한 구현예를 언급하는 것은 아니지만, 그럴 수도 있다. 더 나아가서, 특정한 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서, 본 개시로부터 당업자에게 자명하게 되는 바와 같이, 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 더 나아가서, 본 명세서에 기술된 일부 구현예가 다른 구현예에 포함된 다른 특성은 아니지만, 일 특성을 포함하지만, 상이한 구현예의 특성의 조합이 본 발명의 범주 내에 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 첨부된 청구항에서, 임의의 청구된 구현예는 임의 조합으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 인용되는 모든 출판물, 공개 특허 문서, 및 특허 출원은 각각의 개별 출판물, 공개 특허 문서, 또는 특허 출원이 참조로 편입된다고 특별히 개별적으로 표시한 바와 동일한 정도로 참조로 본 명세서에 편입된다.
개요
본 명세서에 개시된 구현예는 조작된 TnpB 시스템을 제공한다. TnpB 시스템은 TnpB 폴리펩티드 및 TnpB 폴리펩티드와 복합체를 형성할 수 있고 복합체를 표적 폴리뉴클레오티드로 유도할 수 있는 핵산 성분을 포함한다. TnpB 시스템 및 TnpB/핵산 성분 복합체는 또한 본 명세서에서 OMEGA (Obligate Mobile Element Guided Activity) 시스템 또는 복합체, 또는 짧게 오메가 시스템 또는 복합체라고 지칭될 수 있다. TnpB 시스템은 IscB, IsrB, 및 IshB 시스템을 더 포함하는, 오메가 시스템의 별개 유형이다. 오메가 시스템의 핵산 성분은 다른 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예컨대 CRISPR-Cas 시스템과 구조적으로 구별되며, 또한 RNA라고도 할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, TnpB 시스템은 RNA-우세한데, 즉 핵산 성분은 다른 RNA-가이드된 뉴클레아제 시스템 예컨대 CRISPR-Cas에 비해서 TnpB 복합체의 전체 크기에 더 큰 기여를 한다. 또한, 다른 기지의 프로그램가능한 뉴클레아제 예컨대 CRISPR-Cas에 비해서 TnpB의 보다 최소의 구조적 특성을 고려하면, 폴리뉴클레오티드 결합 포켓은 개방되어 있어 보다 접근가능하여서, 결합된 폴리뉴클레오티드 상의 표적 영역에서 뉴클레오티드를 조작하거나, 변형시키거나, 편집하거나, 제거하거나 또는 삭제하기 위한 더 큰 접근성 및 능력을 촉진할 수 있다. 본 명세서는 다른 기능성 도메인과 커플링될 수 있는 뉴클레아제, 닉카제, 또는 촉매적 불활성 폴리뉴클레오티드결합 단백질로서 기능할 수 있는 TnpB 시스템을 개시한다.
일 구현예에서, TnpB 시스템 및 관련 조성물은 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA를 특이적으로 표적화할 수 있다. 일 구현예에서, TnpB 시스템은 이중-가닥 DNA에 결합하여 절단할 수 있다. 일 구현예에서, TnpB 시스템은 양쪽 가닥에 파손을 도입시키지 않고 이중-가닥 DNA에 결합할 수 있다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드 또는 뉴클레아제/핵산 성분 복합체는 개방될 수 있어서, 2개 DNA 가닥 중 하나의 연속성을 파괴하여, 이중 가닥 DNA의 닉을 도입시킬 수 있다. 일 구현예에서, 이론에 국한하지 않고, TnpB 시스템의 크기 및 구성은 단일-가닥 형태일 수 있는, 비-표적화 가닥에 노출을 허용하여서, 비-표적 가닥 상에 폴리뉴클레오티드를 변형시키거나, 편집하거나, 삭제하거나 또는 삽입하는 능력을 허용한다. 일 구현예에서, 이러한 접근성은 표적 및/또는 비-표적 가닥에 대한 증강된 편집 결과, 예를 들어, 증가된 특이성, 증강된 편집 효율을 추가로 허용한다.
다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 구현예는 치료 및 진단 조성물 및 용도를 포함하여, 본 명세서의 조성물의 적용을 포함한다. 다양한 세포로, 및 다양한 전달 비히클을 통한 것을 포함하여, 개시된 단백질 및 시스템의 전달을 또한 제공한다.
TnpB 조성물
일 양태에서, 본 명세서에 개시된 구현예는 TnpB 및 TnpB와 복합체를 형성할 수 있고 표적 폴리뉴클레오티드 상의 표적 서열로 TnpB의 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 RNA를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
TnpB 폴리펩티드
본 발명의 TnpB 폴리펩티드는 Ruv-C-유사 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 TnpB 서열은 도 1, 표 1A, 표 1B, 표 1C 및 표 5에 표시된다. RuvC 도메인은 RuvC-I, RuvC-II, 및 RuvC-III 서브도메인을 포함하는 분할 RuvC 도메인일 수 있다. TnpB는 HTH 도메인, 가교 나선 도메인 및 아연 핑거 도메인 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. TnpB 폴리펩티드는 HNH 도메인을 포함하지 않는다. 일례의 구현예에서, TnpB 단백질은 N-말단에서 출발하여, HTH 도메인, RuvC-I 서브-도메인, 가교 나선 도메인, RuvC-II 서브-도메인, 아연 핑거 도메인, 및 RuvC-III 서브-도메인을 포함한다. 일례의 구현예에서, RuvC-III 서브-도메인은 TnpB 폴리펩티드의 C-말단을 형성한다.
일정 예의 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 175와 800 사이의 아미노산 크기, 200과 790 사이의 아미노산 크기, 200과 780 사이의 아미노산 크기, 200과 770 사이의 아미노산 크기, 200과 760 사이의 아미노산 크기, 200과 750 사이의 아미노산 크기, 200과 740 사이의 아미노산 크기, 200과 730 사이의 아미노산 크기, 200과 720 사이의 아미노산 크기, 200과 720 사이의 아미노산 크기, 200과 710 사이의 아미노산 크기, 200과 700 사이의 아미노산 크기, 200과 690 사이의 아미노산 크기, 200과 680 사이의 아미노산 크기, 200과 670 사이의 아미노산 크기, 200과 660 사이의 아미노산 크기, 200과 650 아미노산 크기, 200과 640 아미노산 크기, 200과 630 사이의 아미노산 크기, 200과 620 사이의 아미노산 크기, 200과 610 사이의 아미노산 크기, 200과 600 사이의 아미노산 크기, 200과 590 사이의 아미노산 크기, 200과 580 사이의 아미노산 크기, 200과 570 사이의 아미노산 크기, 200과 560 사이의 아미노산, 200과 550 사이의 아미노산, 200과 540 사이의 아미노산, 200과 530 사이의 아미노산, 200과 520 사이의 아미노산, 200과 510 사이의 아미노산, 200과 500 사이의 아미노산, 200과 490 사이의 아미노산, 200과 480 사이의 아미노산, 200과 470 사이의 아미노산, 200과 460 사이의 아미노산, 200과 450 사이의 아미노산, 200과 440 사이의 아미노산, 200과 430 사이의 아미노산, 200과 420 사이의 아미노산, 200과 410 사이의 아미노산, 210과 500 사이의 아미노산, 220과 500 사이의 아미노산이다. 230과 500 사이의 아미노산, 240과 500 사이의 아미노산, 250과 500 사이의 아미노산, 260과 500 사이의 아미노산, 270과 500 사이의 아미노산, 280과 500 사이의 아미노산, 290과 500 사이의 아미노산, 300과 500 사이의 아미노산, 250과 490 사이의 아미노산, 250과 480 사이의 아미노산, 250과 490 사이의 아미노산, 또는 250과 600 사이의 아미노산이다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 300과 500 사이의 아미노산, 또는 350과 450 사이의 아미노산이다.
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 변형된 천연 발생 단백질, 이의 기능성 단편 또는 절두형 형태, 또는 비-천연 발생 단백질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 다른 TnpB 폴리펩티드로부터 기원하는, 보다 특히 상이한 유기체로부터 기원하는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 인 실리코 접근법을 통해서 디자인될 수 있다. 인 실리코 단백질 디자인의 예는 당분야에 설명되어 있고 따라서 당업자에게 공지되어 있다.
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 엡실론프로테오박테리아 박테리움, 또는 악티노플라네스 로바투스 균주 DSM 43150, 악티노마두라 셀루올로실리티카 균주 DSM 45823, 악티노마두라 나미비엔시스 균주 DSM 44197, 알리시클로바실러스 마크로스프란기이두스 균주 DSM 17980, 리핑장겔라 할로필라 균주 DSM 102030, 또는 크테도노박터 레세미페르 (Ktedonobacter recemifer) 유래이다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 크테도노박터 라세미페르 유래이거나, 또는 케이. 라세미페르 TnpB 유전자좌의 5' ITR에 대해 유사성을 갖는 보존된 RNA 영역을 포함한다. 예를 들어, 표 5, 도 2를 참조한다. 일 양태에서, TnpB 폴리펩티드는 5' ITR/RNA (3' 가닥 상에 RNA 가짐), TnpB (3' 가닥), 및 마지막으로 3' ITR을 코딩한다. 일례의 구현예에서, TnpB는 진핵생물 게놈에서 발견되는, TnpB 상동체인, Fanzor 단백질을 포함한다.
TnpB 폴리펩티드는 또한 그의 서열이 특히 본 명세서에 기술되는 TnpB 폴리펩티드의 상동체 또는 오솔로그를 포괄한다. 용어 "오솔로그" 및 "상동체"는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 추가 지침에 따라서, 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "상동체"는 상동체인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 동일 종의 단백질이다. 상동성 단백질은 그러나 구조적으로 관련될 필요가 없을 수 있거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "오솔로그"는 오솔로그인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 상이한 종의 단백질이다. 오솔로그 단백질은 구조적으로 관련될 수 있지만, 항상 그렇지 않을 수 있거나 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 지칭되는 바와 같은 TnpB 폴리펩티드의 상동체 또는 오솔로그는 TnpB 폴리펩티드 또는 표 1A, 1B, 1C, 5, 또는 도 1에서 확인되는 TnpB 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84% 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 상동체 또는 오솔로그는 이의 도메인 구조 및/또는 기능에 따라서 확인된다. 구현예에서, 상동체 또는 오솔로그는 도 1 및 18에서 확인되는 것을 포함하여, 본 명세서에서 정의되는 바와 같은 촉매성 잔기 및/또는 도메인을 포함한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행된 서열 정렬을 비롯하여 본 명세서에 교시된 바와 같은 폴딩 연구 및 도메인 예측은 TnpB 폴리펩티드를 확인하는 구조적 및 기능적 특징을 갖는 상동체 또는 오솔로그, 특히 TnpB 폴리펩티드의 촉매성 잔기 및 도메인을 포함한, 보존된 잔기를 갖는 것의 확인에 도움이 될 수 있다.
일 구현예에서, TnpB 유전자좌는 반전 말단 반복부 (ITR)를 포함한다. 반전 말단 반복부는 TnpB 서열의 5' 또는 3' 말단에 존재할 수 있다. 일 양태에서, 반전 말단 반복부는 약 20과 약 40 사이의 뉴클레오티드, 예를 들어, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 구현예에서, ITR은 약 25 내지 35 뉴클레오티드, 약 28 내지 32 뉴클레오티드를 포함한다. 일 양태에서, ITR은 TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 하나 이상의 반전 말단 반복부와 유사성을 공유한다. 일 구현예에서, TnpB의 5' ITR 또는 3' ITR은 IscB 5' ITR 또는 3' ITR과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성의 서열 동일성 또는 상동성을 갖는다. 일 구현예에서, TnpB의 5' ITR은 IscB의 5' ITR와 상동성이다. 예시적인 IscB ITR은 하기 문헌에 개시되어 있고, 특히 보충 재료 데이터 S1 내지 S4 및 표 S1 내지 S6을 포함하여, 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다: Altae-Tran et al., Science 9 Sep 2021, 374: 6563, pp. 57-65; doi:10.1126/science.abj685.
일 구현예에서, TnpB 유전자좌는 TnpB 유전자좌의 5' 말단에서 RNA의 존재를 의미하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 높은 보존성의 영역을 포함한다. 일 양태에서, TnpB의 5' ITR의 상류 영역은 가이드 서열을 포함하는 RNA 종을 코딩하는 영역을 포함한다.
키메라 효소는 제1 단편 및 제2 단편을 포함할 수 있고, 단편은 속 또는 종 유기체의 TnpB 폴리펩티드 오솔로그의 것일 수 있고, 예를 들어, 단편은 상이한 종의 TnpB 폴리펩티드 오솔로그 유래이다.
RuvC 도메인
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 적어도 적어도 하나의 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. RuvC 도메인은 RuvC 촉매성 잔기를 의미하는 보존된 촉매적 아미노산을 포함할 수 있다. 일례의 구현예에서, RuvC 촉매성 잔기는 표 1A의 TnpB 폴리펩티드 488601079의 186D, 270E 또는 354D; 표 1A의 TnpB 폴리펩티드 297565028의 172D, 254E, 또는 337D; 또는 표 1A의 TnpB 폴리펩티드 257060308의 179D, 268E, 또는 351D에 대해 참조할 수 있다. 촉매성 잔기는 도 1의 서열 정렬의 195D, 277E, 또는 361D에 대해 참조할 수 있다. 일 양태에서, RuvC 도메인은 다수 서브도메인, 예를 들어 RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III을 포함할 수 있다. 서브도메인은 단백질의 아미노산 서열을 개재하여 분리될 수 있다. 예의 TnpB 폴리펩티드의 예시적인 도메인 아키텍처는 도 18A에 도시된다.
일 구현예에서, RuvC 도메인의 예는 당분야에 기술된 RuvC 도메인과 구조적 유사성 및/또는 서열 유사성의 임의 폴리펩티드를 포함한다. 일례에서, RuvC 도메인은 당분야에 공지된 RuvC 도메인과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일례에서, RuvC 도메인은 RuvC-I 서브-도메인, RuvC-II 서브-도메인, 및 RuvC-III 서브-도메인을 포함한다. RuvC-I 서브-도메인의 예는 또한 당분야에 기술된 RuvC-I 도메인에 대해 구조적 유사성 및/또는 서열 유사성을 갖는 임의 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, RuvC-I 도메인은 박테리아 또는 고세균 종에서 발견되는 RuvC-I에 대해 구조적 유사성 및/또는 서열 유사성을 공유할 수 있다. 일례에서, RuvC 도메인은 RuvC-I 도메인과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 5%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. RuvC-II 도메인은 또한 당분야에 기술된 RuvC-II 도메인과 구조적 유사성 및/또는 서열 유사성의 임의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 예에서, RuvC 도메인은 RuvC-II 도메인과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 5%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. RuvC-III 도메인은 또한 당분야에 기술된 RuvC-III 도메인과 구조적 유사성 및/또는 서열 유사성의 임의 폴리펩티드를 포함한다. 일례에서, RuvC 도메인은 RuvC-III 도메인과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 5%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 당분야에 기술된 바와 같이 (예를 들어, Crystal structure of Cas9 in complex with nucleic acid component molecule and target DNA, Nishimasu et al. Cell, 2014), RuvC는 α-나선 (α33, α34 및 α39-α45)이 측접된 6-가닥 혼합 β-시트 (β1, β2, β5, β11, β14 및 β17) 및 2개의 추가적인 2-가닥 역평형 β-시트 (β3/β4 및 β15/β16)로 이루어질 수 있다. 일부 RuvC 도메인은 RNase H 폴드를 특징으로 하는 레트로바이러스 인테그라제 수퍼패밀리 구성원, 예컨대 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) RuvC (PDB 코드 1HJR, 14% 동일성, 126 당량 Cα 원자 경우 3.6Å의 평균 제곱근 편차 (rmsd)) 및 써무스 써모필루스 (Thermus thermophilus) RuvC (PDB 코드 4LD0, 12% 동일성, 131 당량 Cα 원자의 경우 3.4Å의 rmsd)와 구조적 유사성을 공유한다고 기술되어 있다. 이. 콜라이 RuvC는 5개 알파-나선 사이에 샌드위치된 5-가닥 β-시트를 함유하는 3-층 알파-β 샌드위치이다. RuvC 뉴클레아제는 4개 촉매성 잔기 (예를 들어, 티. 써모필루스 (T. thermophilus) RuvC의 Asp7, Glu70, His143 및 Asp146)를 갖고, 2-금속 기전을 통해서 홀리데이 접합부 (또는 구조적으로 유사한 십자형 접합부)를 절단한다. Cas9 RuvC 도메인의 Asp10 (Ala), Glu762, His983 및 Asp986은 티. 써모필루스 RuvC의 촉매성 잔기의 것과 유사한 위치에 위치된다. TnpB 폴리펩티드의 RuvC-유사 도메인은 1, 2, 3 또는 4개의 촉매성 잔기를 포함할 수 있다.
구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 뉴클레아제이다. 일 구현예에서, TnpB 및 핵산 성분은 서열-특이적 뉴클레아제 활성을 유도할 수 있다. 절단은 5' 오버행을 생성시킬 수 있다. 절단은 표적-인접 모티프 (TAM)에 대해 원위에서 발생될 수 있고, 표적 서열의 3' 또는 스페이서 (가이드) 어닐링 부위의 부위에서 발생될 수 있다. 일 양태에서, TnpB는 핵산 성분 어닐링 부위 내 및 그 외의 다수 위치에서 절단된다. 일 양태에서, DNA 절단은 TAM에 대해 원위의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 이상의 염기쌍에서 발생되고 5' 오버행을 생성시킨다.
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 약 37℃ 내지 약 80℃의 온도 범위에서 활성이고, 다시 말해 뉴클레아제 활성을 보유한다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 약 37℃ 내지 약 75℃, 약 37℃ 내지 약 70℃, 약 37℃ 내지 약 65℃, 약 37℃ 내지 약 60℃, 약 37℃ 내지 약 55℃, 약 37℃ 내지 약 50℃, 약 37℃ 내지 약 45℃에서 활성이다. 일례의 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 37℃ 내지 65℃ 범위에서 활성이다. 일례의 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 45℃ 내지 65℃ 범위에서 활성이다. 일례의 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 45℃ 내지 60℃ 범위에서 활성이다. 추가 예의 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 악티노마두라 셀룰로실리티카 균주 DSM 45823, 악티노마두라 나미비엔시스 균주 DSM 44197, 악티노플라누스 로바투스 균주 DSM 43150 (TnpB-1 및 TnpB-2), 리핑장겔라 할로필라 균주 DSM 102030, 크테도노박터 라세미페르, 및 엡실론프로테오박테리아 박테리움 QNF01000004_Extraction_(reversed)으로부터 선택되는 TnpB 단백질이다. 다른 예의 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 알리시클로바실러스 마크로스포란기이두스 균주 DSM 17980 유래이다. 일례의 구현예에서, 알리시클로바실러스 마크로스포란기이두스 균주 DSM 17980 TnpB 단백질은 45℃ 내지 60℃ 범위에서 가장 활성이다 (도 22).
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 이의 동족 표적의 활성화 및 절단 시에, 비-동족 핵산의 비-특이적 절단이 발생되는, 트랜스 절단이라고도 불리는, 부차적 활성을 나타낸다. 일 양태에서, TnpB 폴리펩티드는 표적 인식에 의해 촉발되면 부차적 활성을 보유한다. 일 양태에서, 표적 서열에 결합 시, TnpB 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, DNA를 비-특이적으로 절단하게 된다. TnpB의 표적-활성화된 비특이적 뉴클레아제 활성은 또한 본 명세서에서 부차적 활성이라고 한다.
일 구현예에서, TnpB 단백질은 ssDNA 및 dsDNA 표적 서열 둘 모두에 대해서 뉴클레아제 활성을 나타낸다. 일 구현예에서, TnpB 단백질은 TAM이 ssDNA 표적을 절단하는데 필수적이지 않을 수 있는 것인 ssDNA 및 dsDNA 둘 모두에 대한 뉴클레아제 활성을 나타낸다 (도 23).
구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 뉴클레아제이다. 일 구현예에서, TnpB 및 핵산 성분 분자는 서열-특이적 뉴클레아제 활성을 유도할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 TnpB 폴리펩티드는 또한 RNA-가이드된 리콤비나제 활성을 나타낼 수 있다. RuvC 도메인에 대한 상동성 및 리콤비나제의 DDE 패밀리와의 관련성은 잠재적 리콤비나제 활성을 의미한다. 일 구현예에서, 본 명세서에 상술되는 일부 TnpB 폴리펩티드는 뉴클레아제 활성의 결여, 또는 감소된 뉴클레아제 활성을 천연적으로 나타낼 수 있거나, 또는 나타내도록 조작될 수 있고, RNA-가이드된 표적 특이적 변형을 허용하는, 본 명세서에 상술된 바와 같은 기능성 도메인, 예를 들어, 뉴클레오티드 데아미나제, 역전사효소, 전이성 인자, 예를 들어, 트랜스포사제, 인테그라제, 리콤비나제가 제공될 수 있다.
예시적인 TnpB 폴리펩티드
일정 예의 구현예에서, TnpB 단백질은 표 1A, 표 IB, 또는 표 1C에 기재된 바와 같은 서열을 포함할 수 있다. 표 1A에서, 에이. 셀룰로실리티카, 에이. 로바투스 TnpB-1, 에이치. 알바 (H. alba), 에이. 나미비엔시스 (A. namibiensis), 에이. 움브리나 (A. umbrina) 및 엡실론프로테오박테리아 박테리움 10 QNFX01000004 extraction_(reversed)에 대한 천연 TnpB 아미노산 서열이 제공되는데 모두 발린 (GTG)에서 출발 (+1 위치)하지만 당분야에 충분히 공지된 바와 같이 개시자 tRNA의 고유한 성질때문에 메티오닌으로서 번역된다.
표 1B. SEQ ID NOs: 38 - 64,263 에 상응하는 TnpB 폴리펩티드
표 1B. 예시적 TnpB 서열
표 1C. 예시적 TnpB 폴리뉴클레오티드 및 직접 반복부
TnpB 폴리펩티드는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. TnpB 폴리펩티드에 대해서 본 명세서에서 사용되는, 용어 "변형된"은 일반적으로 그것이 유래된 야생형 대응물과 비교하여 하나 이상의 변형 또는 돌연변이 (점 돌연변이, 절두, 삽입, 결실, 키메라, 융합 단백질 등을 포함)를 갖는 TnpB 폴리펩티드를 의미한다. 유래된이란 유래된 효소가 높은 정도의 서열 또는 구조적 상동성을 갖는다는 의미에서, 야생형 효소를 대체로 기반으로 하지만, 당분야에 공지된 바와 같이 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 일부 방식으로 돌연변이된 (변형된) 것을 의미한다.
변형된 단백질, 예를 들어, 변형된 TnpB 폴리펩티드는 촉매적으로 불활성 (데드라고도 함)일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 촉매적 불활성 또는 데드 뉴클레아제는 야생형 대응물 뉴클레아제와 비교하여 뉴클레아제 활성이 감소될 수 있거나, 또는 없을 수 있다. 일부 경우에, 촉매적 불활성 또는 데드 뉴클레아제는 닉카제 활성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 촉매적 불활성 또는 데드 뉴클레아제는 닉카제 활성을 갖지 않을 수 있다. 이러한 촉매적 불활성 또는 데드 뉴클레아제는 표적 폴리뉴클레오티드 상에 이중-가닥 또는 단일-가닥 파손을 만들지 않을 수 있지만, 표적 폴리뉴클레오티드에 여전히 결합할 수 있거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있다.
일 구현예에서, 박테리아 TnpB의 진핵생물 상동체가 본 발명에서 이용될 수 있다. 이들 TnpB-유사 단백질, Fanzor 1 및 Fanzor 2는, 그들 C-말단 절반 영역에서 공유된 아미노산 모티프를 갖지만, 그들 N-말단 영역은 가변적이다. 하기 문헌을 참조한다: Bao et al., Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA 4, 12 (2013). Doi:10.1186/1759-8753-4-12. 일 양태에서, TnpB와 fanzor 간에 보존된 서열은 D-X(125, 275)-[TS]-[TS]-X-X-[C4 아연 핑거]-X(5,50)-RD를 포함한다. Fanzor 단백질은 TnpB로부터 그들 N-말단 영역에서 다양한 것 이외에도, 더 높은 다양성을 가져서, Fanzor 단백질은 상이한 트랜스포존 및 조성물과 연관된다. TnpB 폴리펩티드 활성을 재프로그래밍하기 위한 기전 및 핵산 분자에 대한 출원인의 발견으로, Fanzor 시스템의 유사성은 유사한 용도 및 적용을 허용할 수 있다.
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드의 변형은 변경된 기능성을 초래할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 예로서, 변경된 기능성을 일으키지 않는 변형은 특정 숙주로 발현을 위해, 예를 들어 코돈 최적화를 포함하거나, 또는 (예를 들어, 가시화를 위해) 특정 마커를 뉴클레아제에 제공한다. 변경된 기능성을 야기시킬 수 있는 변형은 또한 키메라 뉴클레아제 (예를 들어, 상이한 오솔로그 또는 상동체 유래 도메인 포함) 또는 융합 단백질을 비롯하여, 점 돌연변이, 삽입, 결실, 절두 (분할 뉴클레아제 포함) 등을 포함한, 돌연변이를 포함할 수 있다. 융합 단백질은 제한 없이 예를 들어 이종성 도메인 또는 기능성 도메인 (예를 들어, 국재화 신호, 촉매성 도메인 등)과의 융합을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 다양한 상이한 변형은 조합될 수 있다 (예를 들어, 촉매적으로 불활성이고, 예컨대 예를 들어 DNA 메틸화, 또는 예컨대 제한없이 파손 (예를 들어, 상이한 뉴클레아제 (도메인)에 의함), 돌연변이, 결실, 삽입, 치환, 결찰, 분해, 파손 또는 재조합을 포함한, 다른 핵산 변형을 유도하기 위해 기능성 도메인에 추가로 융합된 돌연변이된 뉴클레아제). 본 명세서에서 사용되는, "변경된 기능성"은 제한없이, 변경된 특이성 (예를 들어, 변경된 표적 인식, 증가된 (예를 들어, "증강된" TnpB 폴리펩티드) 또는 감소된 특이성, 또는 변경된 TAM 인식), 변경된 활성 (예를 들어, 촉매적 불활성 뉴클레아제 또는 닉카제를 포함한, 증가되거나 또는 감소된 촉매적 활성), 및/또는 변경된 안정성 (예를 들어, 탈안정화 도메인과 융합)을 포함한다. 모든 이들 변형의 예는 당분야에 공지되어 있다. 본 명세서에서 언급되는 바와 같은 "변형된" 뉴클레아제, 및 특히 "변형된" TnpB 폴리펩티드 또는 시스템 또는 복합체는 바람직하게 (예를 들어, 핵산 성분 분자와 복합체로) 폴리핵산과 상호작용하거나 또는 결합하는 능력을 여전히 보유하는 것으로 이해될 것이다. 이러한 변형된 TnpB 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 데아미나제 단백질 또는 이의 활성 도메인과 조합될 수 있다.
일 구현예에서, 비변형된 TnpB 폴리펩티드는 절단 활성을 가질 수 있다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 표적 서열의 위치 또는 근처에서, 예컨대 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 상보체 내에서 또는 표적 서열과 연관된 서열에서 하나 또는 양쪽 핵산 (DNA 또는 RNA) 가닥의 절단을 유도할 수 있다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 표적 서열의 처음 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 이상의 염기쌍 또는 뉴클레오티드 내에서 하나 또는 양쪽 DNA 또는 RNA 가닥의 절단을 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 절단은 스태거드일 수 있는데, 다시 말해서 점성 말단을 생성시킬 수 있다. 일 구현예에서, 절단은 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단이다. 일 구현예에서, 절단은 1 내지 5 뉴클레오티드, 바람직하게 4 또는 5 뉴클레오티드의 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단이다. 특정 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 DNA 가닥을 절단한다.
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 상응하는 야생형 효소에 대해서 돌연변이될 수 있어서 돌연변이된 TnpB는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 양쪽 가닥을 절단하는 능력이 결여된다. 추가 예로서, TnpB 폴리펩티드의 둘 이상의 촉매성 도메인 (예를 들어, RuvC)은 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 돌연변이된 TnpB 폴리펩티드를 생산하도록 돌연변이될 수 있다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 돌연변이된 효소의 폴리뉴클레오티드 절단 활성이 효소의 비-돌연변이된 형태의 핵산 절단 활성의 25% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.1% 이하, 0.01% 이하일 때 모든 폴리뉴클레오티드 절단 활성이 실질적으로 결여된 것으로 간주될 수 있고; 예로서, 돌연변이된 형태의 핵산 절단 활성이 비-돌연변이된 형태와 비교하여 없거나 또는 무시할만할 때일 수 있다.
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 예컨대 표적화되거나 또는 비-표적화된 가닥을 안정화시키는 돌연변이 잔기를 포함하여, 증강된 활성 및/또는 특이성을 일으키는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 조작된 TnpB 폴리펩티드의 변경되거나 또는 변형된 활성은 증가된 표적화 효율 또는 감소된 오프-표적 결합을 포함한다. 일 구현예에서, 조작된 TnpB 폴리펩티드의 변경된 활성은 변형된 절단 활성을 포함한다. 일 구현예에서, 변경된 활성은 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해서 증가된 절단 활성을 포함한다. 일 구현예에서, 변경된 활성은 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해서 감소된 절단 활성을 포함한다. 일 구현예에서, 변경된 활성은 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해서 감소된 절단 활성을 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 뉴클레아제는 RNA, 또는 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌의 가닥, 또는 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌의 가닥을 포함하는 핵산 분자와 단백질의 연합을 변경시키는 변형을 포함한다. 본 발명의 일 양태에서, 조작된 TnpB 폴리펩티드는 TnpB 폴리펩티드 및 관련 복합체의 형성을 변경시키는 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 변경된 활성은 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해서 증가된 절단 활성을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌와 비교하여 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대한 증가된 특이성이 존재한다. 다른 구현예에서, 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌와 비교하여 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해 감소된 특이성이 존재한다. 일 구현예에서, 돌연변이는 감소된 오프-표적 효과 (예를 들어, 절단 또는 결합 성질, 활성, 또는 동역학)를 일으키며, 예컨대 TnpB 폴리펩티드 경우에 예를 들어, 표적과 RNA 간 불일치에 대한 보다 낮은 내성을 일으킨다. 다른 돌연변이는 증가된 오프-표적 효과 (예를 들어, 절단 또는 결합 성질, 활성, 또는 동역학)를 야기할 수 있다. 다른 돌연변이는 증가되거나 또는 감소된 온-표적 효과 (예를 들어, 절단 또는 결합 성질, 활성, 또는 동역학)를 야기할 수 있다. 일 구현예에서, 돌연변이는 변경된 (예를 들어, 증가 또는 감소된) 활성, 기능성 뉴클레아제 복합체의 연합 또는 형성을 일으킨다. 예시적인 돌연변이는 특이성을 증강시키기 위해서, 음성 또는 중성 잔기의 양으로 하전된 잔기로의 돌연변이, 또는 양으로 하전된 잔기의 중성으로의 돌연변이 또는 중성 잔기의 음성 잔기 및/또는 (진화적) 보존된 잔기, 예컨대 보존된 양으로 하전된 잔기로의 돌연변이를 포함한다. 예컨대, 하기 문헌을 참조한다: Zhou et al., Chem Rev. 2018 Feb 28: 118(4): 1691-1741, doi: 10.1021/acs/chemrev.7b00305 (단백질 결합에서 정전기적 상호작용 및 이러한 정전기적 상호작용에 대한 아미노산 돌연변이의 효과를 논의함). 일 구현예에서, 이러한 잔기는 비하전된 잔기, 예컨대 알라닌으로 돌연변이될 수 있다. TnpB 폴리펩티드는 TnpB 폴리펩티드의 길이에 걸쳐서 가이드 또는 결합된 DNA와 상호작용하기 때문에, TnpB 폴리펩티드 전반에서 잔기의 돌연변이는 변경된 활성에 대해 이용될 수 있다. 일 양태에서, 돌연변이를 위한 TnpB 폴리펩티드 잔기는 데이노코쿠스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans) ISDra2의 아미노산 서열 위치를 기반으로 변경되며, 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Karvelis et al., Nature 599, 692-696 (2021). ISDra2 아미노산은 하기 서열을 포함할 수 있다:
일 구현예에서, 하나 이상의 잔기는 TnpB 폴리펩티드의 TAM 특이성을 변경시키기 위해 돌연변이된다. 일 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 ISDra2의 아미노산 서열 위치를 기반으로 52TYR,　53GLY,　56SER,　57SER,　60THR,　72SER,　75ASP,　76LYS,　77PHE,　80GLN,　84LYS,　119ARG,　121GLN,　122PHE,　123THR,　124ASN,　125ASN,　126ASN,　137PRO,　138LYS,　153LYS,　155LEU,　및 172LEU 중 하나 이상에 상응한다.
일 구현예에서, 하나 이상의 잔기는 ISDra2의 아미노산 서열 위치를 기반으로 ?85MET,　286ARG,　287　LYS,　288ASN,　289ARG,　290ARG,　291LEU,　292ALA,　293LEU,　294SER,　295ILE,　296SER,　및 297ASP 중 하나 이상으로부터 선택되는 TnpB의 특이성 및/또는 활성을 변경시키기 위해 돌연변이된다.
특정 과학 이론에 국한하지 않지만, V형 CRISPR-Cas 시스템은 TnpB 시스템으로부터 진화되었다고 여겨진다. V형 시스템은 단일-가닥 DNA에 대해서 시험관내에서 부차적 활성을 보유하는 것으로 알려져 있고, 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Chen et al., Science. 2018 Apr 27; 360(6387): 436-439.
특수 TnpB 시스템
일 구현예에서, 시스템은 특수화된 기능 또는 활성을 수행할 수 있는 TnpB-기반 시스템이다. 예를 들어, TnpB 단백질은 하나 이상의 이종성 기능성 도메인과 융합될 수 있거나, 작동적으로 커플링될 수 있거나, 또는 달리 연합될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, TnpB 단백질은 촉매적 데드 TnpB 단백질일 수 있고/있거나 닉카제 활성을 가질 수 있다. 닉카제는 이중 가닥 표적의 오직 하나의 가닥만을 절단하는 TnpB 단백질이다. 이러한 구현예에서, 촉매적 불활성 TnpB 또는 닉카제는 표적 서열로 기능성 도메인을 전달하거나 또는 근접하게 하는 ωRNA를 통해서 서열 특이적 표적화 기능성을 제공한다.
전체로서 TnpB 복합체는 둘 이상의 기능성 도메인과 연합될 수 있다고 또한 예상된다. 예를 들어, TnpB 폴리펩티드와 연합되는 둘 이상의 기능성 도메인이 존재할 수 있거나, 또는 (하나 이상의 어댑터 단백질 또는 압타머를 통해서) 핵산 성분과 연합되는 둘 이상의 기능성 도메인이 존재할 수 있거나, 또는 TnpB 폴리펩티드와 연합되는 하나 이상의 기능성 도메인 및 핵산 성분과 연합되는 하나 이상의 기능성 도메인이 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 예를 들어, Konnerman et al. (Nature 517, 583-588, 29 January 2015)의 변형된 가이드와 사용되는, 어댑터 단백질을 통해서 TnpB 폴리펩티드와 연합된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 어댑터 단백질에 부착되어서 RNA 분자 및 표적에 Tnpb 폴리펩티드의 결합 시, 기능성 도메인은 기능성 도메인이 이의 귀속된 기능으로 기능하도록 허용하는 공간적 배향으로 존재한다.
일 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 데드 핵산 성분과 연합된다. 일 구현예에서, 활성 TnpB 폴리펩티드와 복합체는 유전자의 유전자좌에서 기능성 도메인에 의한 유전자 조절을 유도하는 한편 핵산 성분과 연합된 기능성 도메인은 다른데서 활성 TnpB 폴리펩티드에 의한 DNA 절단을 유도한다. 일 구현예에서, 핵산 성분은 오프-표적 조절과 비교하여 관심 유전자의 유전자좌에 대한 조절의 선택성을 최대화하도록 선택된다. 일 구현예에서, 핵산 성분은 표적 유전자 조절을 최대화하고 표적 절단을 최소화하도록 선택된다. 핵산 성분의 루프는 별개 루프(들) 또는 별개 서열(들)에 결합할 수 있는 어댑터 단백질을 동원할 수 있는 별개 루프(들) 또는 별개 서열(들)의 삽입을 통해 TnpB 폴리펩티드와 충돌없이, 연장될 수 있다. 어댑터 단백질은 다양한 박테리오파지 외피 단백질 내에 존재하는 직교성 폴리뉴클레오티드-결합 단백질/압타머 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 외피 단백질의 목록은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: Qβ, F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, φCb5, φCb8r, φCb12r, φCb23r, 7s 및 PRR1. 이들 어댑터 단백질 또는 직교성 RNA 결합 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 이펙터 단백질 또는 융합체를 추가로 동원할 수 있다.
TnpB 단백질과 융합될 수 있거나, 작동적으로 커플링될 수 있거나, 또는 달리 연합될 수 있는 예시적인 기능성 도메인은 핵 국재화 신호 (NLS) 도메인, 핵 이출 신호 (NES) 도메인, 번역 활성화 도메인, 전사 활성화 도메인 (예를 들어, VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, 및 SET7/9), 번역 개시 도메인, 전사 억제 도메인 (예를 들어, KRAB 도메인, NuE 도메인, NcoR 도메인, 및 SID 도메인 예컨대 SID4X 도메인), 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, FokI), 히스톤 변형 도메인 (예를 들어, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제), 광 유도성/제어성 도메인, 화학적 유도성/제어성 도메인, 트랜스포사제 도메인, 상동성 재조합 기구 도메인, 리콤비나제 도메인, 리가제 도메인, 토포이소머라제 도메인, 인테그라제 도메인, 및 이의 조합일 수 있거나 또는 이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 기능성 도메인은 HNH 도메인이고, 닉카제를 조작하기 위해서 천연적으로 촉매적 불활성인 TnpB 단백질과 사용될 수 있다. 촉매적 데드 TnpB 또는 닉카제 TnpB를 생성시키는 방법은 Cas9 단백질의 접근법으로부터 조정될 수 있고, 예를 들어, 당분야에 공지되고 참조로 본 명세서에 편입되는, 하기 문헌을 참조한다: WO 2014/204725, Ran et al. Cell. 2013 Sept 12; 154(6):1380-1389. 간략하게, RuvC 도메인의 촉매성 도메인 및/또는 TnpB 단백질의 HNH 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 도입하여서 NHEJ 활성을 감소시킬 수 있거나 또는 폐기할 수 있다. 일 양태에서, RuvC 도메인에 적어도 하나의 돌연변이 및 HNH 도메인에 적어도 하나의 돌연변이가 제공된다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 데이노코쿠스 라디오두란스　ISDra2의 아미노산 서열 위치를 기반으로 D191 및/또는 E278에 돌연변이를 포함한다. 일 양태에서, 아미노산 돌연변이는 데이노코쿠스 라디오두란스　ISDra2의 아미노산 서열 위치를 기반으로 D191A 및/또는 E278A를 포함한다.
일 구현예에서, 기능성 도메인은 하기 활성 중 하나 이상을 가질 수 있다: 핵염기 데아미나제 활성, 역전사효소 활성, 레트로트랜스포라제 활성, 트랜스포사제 활성, 인테그라제 활성, 리콤비나제 활성, 토포이소머라제 활성, 리가제 활성, 폴리머라제 활성, 헬리카제 활성, 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 번역 활성화 활성, 번역 개시 활성, 번역 억제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, 뉴클레아제 활성 (예를 들어, VirD2), 단일-가닥 RNA 절단 활성, 이중-가닥 RNA 절단 활성, 단일-가닥 DNA 절단 활성, 이중-가닥 DNA 절단 활성, 분자 스위치 활성, 화학 유도성, 광 유도성, 및 핵산 결합 활성. 일 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 에피토프 태그 또는 리포터를 포함할 수 있다. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터의 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광성 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 시안색 형광성 단백질 (CFP), 노란색 형광성 단백질 (YFP), 및 파란색 형광성 단백질 (BFP)을 포함한 자기-형광성 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나 이상의 기능성 도메인(들)은 이펙터 단백질 (예를 들어, TnpB 단백질)의 말단에서, 근처에서, 및/또는 근접하여 위치될 수 있다. 둘 이상의 기능성 도메인을 갖는 구현예에서, 둘 중 각각은 이펙터 단백질 (예를 들어, TnpB 단백질)의 말단에서 또는 근처에서 또는 근접하여 위치될 수 있다. 일 구현예에서, 기능성 도메인이 이펙터 단백질에 작동적으로 커플링되는 경우와 같이, 하나 이상의 기능성 도메인은 이펙터 단백질 (예를 들어, TnpB 단백질)에 적합한 링커 (제한없이, GlySer 링커 포함)를 통해서 속박될 수 있거나 또는 연결될 수 있다. 하나 초과의 기능성 도메인이 존재할 때, 기능성 도메인은 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 일 구현예에서, 모든 기능성 도메인은 동일하다. 일 구현예에서, 모든 기능성 도메인은 서로 상이하다. 일 구현예에서, 기능성 도메인 중 적어도 2개는 서로 상이하다. 일 구현예에서, 기능성 도메인 중 적어도 2개는 서로 동일하다.
히스톤 변형 도메인이 또한 바람직하다. 일 구현예에서. 예시적인 히스톤 변형 도메인은 하기에 논의된다. 트랜스포사제 도메인, HR (상동성 재조합) 기구 도메인, 리콤비나제 도메인, 및/또는 인테그라제 도메인이 또한 본 발명의 기능성 도메인으로서 바람직하다. 일 구현예에서, DNA 통합 활성은 HR 기전 도메인, 인테그라제 도메인, 리콤비나제 도메인, 및/또는 트랜스포사제 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, DNA 절단 활성은 뉴클레아제에 기인한다. 일 구현예에서, 뉴클레아제는 Fok1 뉴클레아제를 포함한다. ["Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing", Shengdar Q. Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, Jennifer A. Foden, Vishal Thapar, Deepak Reyon, Mathew J. Goodwin, Martin J. Aryee, J. Keith Joung Nature Biotechnology 32(6): 569-77 (2014)]을 참조하고, 이것은 연장된 서열을 인식하고 인간 세포에서 높은 효율로 내생성 유전자를 편집할 수 있는 이량체 RNA-가이드된 FokI 뉴클레아제에 관한 것이다.
기능성 도메인은 전사, 예를 들어, 전사 억제를 조절하는데 사용될 수 있다. 전사 억제는 종종 염색질 변형 효소 예컨대 히스톤 메틸트랜스퍼라제 (HMT) 및 데아세틸라제 (HDAC)에 의해 매개된다. 억제성 히스톤 이펙터 도메인은 공지되어 있고 예시적인 목록은 하기에 제공된다. (예를 들어, AAV를 통한) 효율적인 바이러스 패키징을 촉진하도록 소형 크기의 단백질 및 기능성 절두가 바람직하다. 그러나, 일반적으로, 도메인은 HDAC, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 (HMT), 및 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 억제제를 비롯하여, HDAC 및 HMT 동원 단백질을 포함할 수 있다. 기능성 도메인은 일 구현예에서, HDAC 이펙터 도메인, HDAC 리크루터 이펙터 도메인, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 (HMT) 이펙터 도메인, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 (HMT) 리크루터 이펙터 도메인, 또는 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 억제제 이펙터 도메인일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 기능성 도메인은 메틸트랜스퍼라제 (HMT) 이펙터 도메인일 수 있다. 바람직한 예는 NUE, vSET, EHMT2/G9A, SUV39H1, dim-5, KYP, SUVR4, SET4, SET1, SETD8, 및 TgSET8을 포함한다. NUE는 본 발명의 실시예에서 예시되고, 바람직하지만, 클래스의 다른 것들이 또한 유용할 것임을 고려한다.
일 구현예에서, 기능성 도메인은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 (HMT) 리크루터 이펙터 도메인일 수 있다. 바람직한 예는 Hp1a, PHF19, 및 NIPP1을 포함한다.
일 구현예에서, 기능성 도메인은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 억제제 이펙터 도메인일 수 있다. 바람직한 예는 SET/TAF-1β를 포함한다.
일부 경우에, 프로모터 또는 프로모터-근위 구성요소이외에도 표적 내생성 (조절성) 제어 구성요소 (예컨대, 인핸서 및 사일렌서). 따라서, 본 발명은 또한 프로모터의 표적화이외에도, 내생성 제어 구성요소 (인핸서 및 사일렌서 포함)를 표적화하는데 사용될 수 있다. 이들 제어 구성요소는 전사 출발 부위 (TSS)의 상류 및 하류에 위치될 수 있고, TSS로부터 200 bp로부터 시작하여 100 kb 까지 멀어진다. 기지의 제어 구성요소의 표적화는 관심 유전자를 활성화하거나 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 단일 제어 구성요소는 다수 표적 유전자의 전사에 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, 단일 제어 구성요소의 표적화는 다수 유전자의 전사를 동시에 제어하는데 사용될 수 있다.
다른 한편으로 추정 제어 구성요소의 표적화 (예를 들어, 구성요소 주변 200 bp 내지 100 kB를 비롯하여 추정 제어 구성요소의 영역을 타일링하는 것에 의함)는 관심 유전자의 전사를 측정하여) 이러한 구성요소를 검증하거나 또는 (예를 들어, 관심 유전자의 TSS의 상류 및 하류에 100 kb를 타일링하여) 신규한 제어 구성요소를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 또한, 추정 제어 구성요소의 표적화는 질환의 유전적 원인을 이해하는 상황에서 유용할 수 있다. 질환 표현형과 연관된 많은 돌연변이 및 공통 SNP 변이체는 코딩 영역 밖에 위치된다. 본 명세서에 기술된 활성화 또는 억제 시스템에 의한 이러한 영역의 표적화는 a) 추정 표적 세트 (예를 들어, 제어 구성요소에 가장 가까이 근접하여 위치된 유전자 세트) 또는 b) 예를 들어, RNAseq 또는 마이크로어레이에 의한 전체-전사체 판독치의 전사의 판독치가 뒤따를 수 있다. 이것은 질환 표현형에 관여되는 가능한 후보 유전자의 확인을 허용하게 된다. 이러한 후보 유전자는 신규 약물 표적으로서 유용할 수 있다.
일 구현예에서 하나 이상의 기능성 도메인은 아세틸트랜스퍼라제, 바람직하게 히스톤 아세틸트랜스퍼라제를 포함한다. 이들은 후생유전학 분야에서, 예를 들어, 후생유전체를 조사하는 방법에서 유용하다. 후생유전체를 조사하는 방법은 예를 들어, 후생유전체 서열의 표적화를 포함할 수 있다. 후생유전체 서열의 표적화는 후생유전체 표적 서열로 유도하는 ωRNA를 포함할 수 있다. 후생유전체 표적 서열은 프로모터, 사일렌서 또는 인핸서 서열를 포함할 수 있고, 일 구현예에서, 포함할 수 있다.
기능성 도메인은 아세틸트랜스퍼라제 도메인일 수 있다. 아세틸트랜스퍼라제가 공지되어 있지만, 일 구현예에서, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제는 인간 아세틸트랜스퍼라제 p300의 촉매적 코어를 포함할 수 있다 (Gerbasch & Reddy, Nature Biotech 6th April 2015).
핵 국재화 서열
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 하나 이상의 핵 국재화 서열 (NLS), 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 NLS에 융합된다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 NLS를 아미노-말단 또는 그 근처에, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 NLS를 카르복시-말단 또는 그 근처에, 또는 이들 조합 (예를 들어, 아미노-말단에 0 또는 적어도 하나 이상의 NLS 및 카르복시 말단에 0 또는 하나 이상의 NLS)을 포함한다. 하나 초과의 NLS가 존재할 때, 각각은 서로 독립적으로 선택될 수 있어서, 단일 NLS는 하나 초과의 카피 및/또는 하나 이상의 키파로 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 조합하여 존재할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 6개 이하의 NLS를 포함한다. 일 구현예에서, NLS는 NLS의 가장 가까운 아미노산이 N-말단 또는 C-말단으로부터 폴리펩티드 사슬을 따라서 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 이상의 아미노산 내에 있을 때 N-말단 또는 C-말단 근처로 간주된다. NLS의 비제한적인 예는 하기로부터 유래되는 NLS 서열을 포함한다: 아미노산 서열 PKKKRKV (SEQ ID NO: 64,264)을 갖는 SV40 바이러스 거대 T-항원의 NLS; 서열 KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 64,265)을 갖는 뉴클레오플라스민 유래 NLS (예를 들어, 뉴클레오플라스민 이분 NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 64,266) 또는 RQRRNELKRSP (SEQ ID NO: 64,267)를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ ID NO: 64,268)을 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파 유래 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (SEQ ID NO: 64,269); 근종 T 단백질의 서열 VSRKRPRP (SEQ ID NO: 64,270) 및 PPKKARED (SEQ ID NO: 64,271); 인간 p53의 서열 PQPKKKPL (SEQ ID NO: 64,272); 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP (SEQ ID NO: 64,273); 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR (SEQ ID NO: 64,274) 및 PKQKKRK (SEQ ID NO: 64,275); 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL (SEQ ID NO: 64,276); 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR (SEQ ID NO: 64,277); 인간 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (SEQ ID NO: 64,278); 및 스테로이드 호르몬 수용체 (인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK (SEQ ID NO: 64,279). 일반적으로, 하나 이상의 NLS는 진핵생물 세포의 핵에서 검출가능한 양으로 TnpB 폴리펩티드의 축적을 구동하기에 충분한 강도이다. 일반적으로, 핵 국재화 활성의 강도는 TnpB 폴리펩티드의 NLS 개수, 사용된 특정 NLS(들), 또는 이들 인자의 조합으로부터 유래될 수 있다. 핵에서 축적의 검출은 임의의 적합한 기술을 통해서 수행될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 마커는 TnpB 폴리펩티드에 융합될 수 있어서, 세포 내 위치는 예컨대, 핵의 위치를 검출하기 위한 수단 (예를 들어, 핵에 특이적인 염료 예컨대 DAPI)과 조합하여, 가시화할 수 있다. 세포 핵은 또한 세포로부터 단리될 수 있고, 이의 내용물은 이후에 단백질을 검출하기 위한 임의의 적합한 과정, 예컨대 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 또는 효소 활성 어세이를 통해서 분석될 수 있다. 핵 내 축적은 또한 간접적으로, 예컨대 TnpB 폴리펩티드 또는 복합체에 노출되지 않거나, 또는 하나 이상의 NLS가 결여된 TnpB 폴리펩티드에 노출된 대조군과 비교하여, 복합체 형성의 효과에 대한 어세이 (예를 들어, 표적 서열에서 돌연변이 또는 DNA 절단에 대한 어세이, 또는 복합체 형성에 의해 영향받는 변경된 유전자 발현 활성 및/또는 TnpB 폴리펩티드 활성에 대한 어세이)를 통해서 결정될 수 있다. 본 명세서에 기술된 TnpB 폴리펩티드 단백질 복합체 및 시스템의 일 구현예에서, 코돈 최적화된 TnpB 폴리펩티드 단백질은 단백질의 C-말단에 부착된 NLS를 포함한다. 일 구현예에서, 다른 국재화 태그는 예컨대 제한없이, 세포내 특정 부위, 예컨대, 소기관, 예컨대 미토콘드리아, 색소체, 엽록체, 소포체, 골지 (핵 또는 세포) 막, 리보솜, 핵소체, ER, 세포골격, 액포, 중심체, 뉴클레오솜, 과립, 중심소체 등으로 TnpB 폴리펩티드를 국재화시키기 위해서, TnpB 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 적어도 하나의 핵 국재화 신호 (NLS)는 TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 부착된다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나 이상의 C-말단 또는 N-말단 NLS는 부착된다 (그리하여 TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자(들)는 NLS(들)의 코딩을 포함하여서, 발현된 생산물이 부착되거나 또는 연결된 NLS(들)를 가짐). 바람직한 구현예에서 C-말단 NLS는 진핵생물 세포, 바람직하게 인간 세포에서 최적 발현 및 핵 표적화를 위해 부착된다. 본 발명은 또한 다수의 핵산 성분을 전달하기 위한 방법을 포괄하고, 각각의 핵산 성분은 상이한 관심 표적 유전자좌에 대해 특이적이어서 다수의 관심 표적 유전자좌를 변형시킨다. 복합체의 핵산 성분은 하나 이상의 단백질-결합 RNA 압타머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 압타머는 박테리오파지 외피 단백질에 결합할 수 있다.
링커
일부 바람직한 구현예에서, 기능성 도메인은 TnpB 폴리펩티드 (예를 들어, 활성 또는 데드 TnpB 폴리펩티드)에 연결되어서 후생유전체 서열 예컨대 프로모터 또는 인핸서를 표적화하고 활성화시킨다. 이러한 프로모터 또는 인핸서로 유도되는 하나 이상의 ωRNA는 또한 이러한 프로모터 또는 인핸서에 대한 TnpB 폴리펩티드의 결합을 유도하도록 제공될 수 있다.
용어 "연관된"은 TnpB 폴리펩티드 단백질 또는 어댑터 단백질에 대한 기능성 도메인의 연합과 관련되어 본 명세서에서 사용된다. 한 분자가 예를 들어 어댑터 단백질과 기능성 도메인 간에, 또는 TnpB 폴리펩티드 단백질과 기능성 도메인 간에, 다른 것에 대해서 어떻게 '연합'되는가와 관련하여 사용된다. 이러한 단백질-단백질 상호작용의 경우에, 이러한 연합은 항체가 에피토프를 인식하는 방식으로 인식에 관하여 생각될 수 있다. 대안적으로, 하나의 단백질은 2개의 융합을 통해서, 다른 단백질과 연합될 수 있고, 예를 들어, 하나의 서브유닛은 다른 서브유닛에 융합된다. 융합은 전형적으로 예를 들어 각각의 단백질 또는 서브유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 함께 스플라이싱을 통해서, 하나의 아미노산 서열을 다른 것에 첨가하여 발생된다. 대안적으로, 이것은 본질적으로 2개 분자 간 결합 또는 직접 연결, 예컨대 융합 단백질로서 볼 수 있다. 임의 경우에, 융합 단백질은 관심의 2개 서브유닛 간에 (즉, 효소와 기능성 도메인 간에 또는 어댑터 단백질과 기능성 도메인 간에) 링커를 포함할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드 단백질 또는 어댑터 단백질은 그에 결합하여서 기능성 도메인과 연합된다. 다른 구현예에서, TnpB 폴리펩티드 또는 어댑터 단백질은 임의로 중간 링커를 통해서, 2개가 함께 융합되기 때문에, 기능성 도메인과 연합된다.
융합 단백질과 관련하여 사용되는 용어 "링커"는 단백질에 연결되어 융합 단백질을 형성하는 분자를 의미한다. 일반적으로, 이러한 분자는 단백질 간 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관련성을 보존하거나 또는 연결시키는 것 이외에 특별한 생물학적 활성을 갖지는 않는다. 그러나, 일 구현예에서, 링커는 링커 및/또는 융합 단백질의 일부 속성 예컨대 링커의 폴딩, 순전하, 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수도 있다.
본 발명의 방법에서 사용을 위해 적합한 링커는 당업자에게 충분히 공지되어 있고 제한없이, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 복소환 탄소 링커, 또는 펩티드 링커를 포함한다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 링커는 또한 공유 결합 (탄소-탄소 결합 또는 탄소-이종원자 결합)일 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 각각의 단백질이 이의 필요한 기능성 성질을 보유하는 것을 보장하기에 충분한 거리만큼 TnpB 폴리펩티드 및 뉴클레오티드 데아미나제를 분리시키는데 사용된다. 바람직한 펩티드 링커 서열은 가요성의 연장된 입체형태를 채택하고 정렬된 2차 구조를 발생시키는 경향을 보이지 않는다. 일 구현예에서, 링커는 단량체, 이량체, 다량체 또는 중합체일 수 있는 화학적 모이어티일 수 있다. 바람직하게, 링커는 아미노산을 포함한다. 가요성 링커에서 전형적인 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser을 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, 링커는 Gly, Asn 및 Ser 아미노산 중 하나 이상의 조합을 포함한다. 다른 중성인 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala이 또한 링커 서열에서 사용될 수 있다. 예시적인 링커는 하기 문헌에 개시된다: Maratea et al. (1985), Gene 40: 39-46; Murphy et al. (1986) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 83: 8258-62; 미국 특허 제4,935,233호; 및 미국 특허 제4,751,180호. 예를 들어, GlySer 링커 GGS, GGGS (SEQ ID NO: 64,280) 또는 GSG가 사용될 수 있다. GGS, GSG, GGGS (SEQ ID NO: 64,280) 또는 GGGGS (SEQ ID NO: 64,281) 링커는 적합한 길이를 제공하도록, 3 (예컨대 (GGS)3 (SEQ ID NO: 64,282), (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 64,283)) 또는 5, 6, 7, 9 또는 심지어 12 이상의 반복으로 사용될 수 있다. 일부 경우에, 링커는 (GGGGS)3-15 (SEQ ID NO: 64,283-64,295)일 수 있고, 예를 들어, 일부 경우에, 링커는 (GGGGS)3-11 (SEQ ID NO: 64,283-64,291), 예를 들어, GGGGS (SEQ ID NO: 64,281), (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 64,296), (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 64,283), (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 64,284), (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 64,285), (GGGGS)6 (SEQ ID NO: 64,286), (GGGGS)7 (SEQ ID NO: 64,287), (GGGGS)8 (SEQ ID NO: 64,288), (GGGGS)9 (SEQ ID NO: 64,289), (GGGGS)10 (SEQ ID NO: 64,290), 또는 (GGGGS)11 (SEQ ID NO: 64,291)일 수 있다.
특정 구현예에서, 링커 예컨대 (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 64,283)이 바람직하게 본 명세서에서 사용된다. (GGGGS)6 (SEQ ID NO: 64,286), (GGGGS)9 (SEQ ID NO: 64,289) 또는 (GGGGS)12 (SEQ ID NO: 64,292)가 바람직하게 대안으로서 사용될 수 있다. 다른 바람직하게 대안은 (GGGGS)1 (SEQ ID NO: 64,281), (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 64,296), (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 64,284), (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 64,285), (GGGGS)7 (SEQ ID NO: 64,287), (GGGGS)8 (SEQ ID NO: 64,288), (GGGGS)10 (SEQ ID NO: 64,290), 또는 (GGGGS)11 (SEQ ID NO: 64,291)이다. 역시 추가 구현예에서, LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTR (SEQ ID NO: 64,297)이 링커로서 사용된다. 역시 추가적인 구현예에서, 링커는 XTEN 링커이다. 특정 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTR (SEQ ID NO: 64,297) 링커를 통해서 데아미나제 단백질 또는 이의 촉매성 도메인에 연결된다. 추가의 특정 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTR (SEQ ID NO: 64,297) 링커를 통해서 데아미나제 단백질 또는 이의 촉매성 도메인의 N-말단에 C-말단에서 연결된다. 또한, N-말단 및 C-말단 NLS는 또한 링커 (예를 들어, PKKKRKVEASSPKKRKVEAS (SEQ ID NO: 64,298))로서 기능할 수 있다.
링커의 예는 하기 표 2 에 표시된다.
표 2.
링커는 ωRNA 분자와 기능성 도메인 (활성인자 또는 억제인자) 간에, 또는 TnpB 폴리펩티드와 기능성 도메인 간에 사용될 수 있다. 링커는 "기계적 가요성"의 적절한 양을 조작하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 제어가능하고, 예를 들어 유도가능하다.
다른 적합한 기능성 도메인은 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/018423, 예를 들어 [0678]-[0692]에서 확인할 수 있다. 예시적인 기능성 도메인은 본 명세서의 다른 곳에 추가로 상술된다.
ωRNA 분자
본 명세서에서 TnpB 시스템은 본 명세서에서 또한 오메가 RNA (ωRNA)라고도 하는, 하나 이상의 핵산 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 핵산 성분은 RNA, DNA, 또는 이의 조합을 포함할 수 있고, 이하에서 추가로 기술되는 바와 같이 변형 및 비-정규 뉴클레오티드를 포함한다. ωRNA는 TnpB 폴리펩티드와 상호작용하는 스캐폴드 및 재프로그램가능한 스페이서 서열을 포함할 수 있다. ωRNA는 TnpB 폴리펩티드와 복합체 (Ω 복합체)를 형성할 수 있고, 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 대한 복합체의 서열-특이적 결합을 유도한다. 일례의 구현예에서, ωRNA는 스캐폴드 서열 및 스페이서 서열을 포함하는 단일 분자이다. 일정 예의 구현예에서, 스페이서는 스캐폴드 서열의 5' 이다. 일례의 구현예에서, ωRNA는 스캐폴드와 스페이서 부분 간에 보존된 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
구현예에서, ωRNA는 스페이서 서열 및 스캐폴드 서열, 예를 들어, 보존된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구현예에서, ωRNA는 약 45 내지 약 250 뉴클레오티드, 또는 약 45, 46, 47 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 17, 138, 19, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 11, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180. 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 2340, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 또는 250 뉴클레오티드를 포함한다.
구현예에서, ωRNA는 스캐폴드 서열, 예를 들어 보존된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러므로, 스캐폴드 서열은 전형적으로 보존된 영역을 포함하고, 스캐폴드는 약 30 내지 200 뉴클레오티드, 약 50 내지 180, 약 80 내지 175 뉴클레오티드, 또는 약 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 이상의 nt를 포함한다. 일 양태에서, 핵산 성분 스캐폴드는 하나의 보존된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구현예에서, 보존된 뉴클레오티드 서열은 스캐폴드의 5' 말단에 또는 근처에 있다.
ωRNA는 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열로 부위-특이적 결합을 유도하도록 재-프로그램될 수 있는, 스페이서를 더 포함할 수 있다. 스페이서는 또한 ωRNA 스캐폴드 또는 ωRNA의 일부로서 본 명세서에서 지칭될 수 있고, 조작된 이종성 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서 스캐폴드는 표 5의 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 스캐폴드는 표 5의 RNA 보존 영역에 대한 하나 이상의 보존된 서열을 포함하고 도 2에 도시된다. 일 구현예에서, ωRNA의 2차 구조는 도 18D에 표시된 다수-헤어핀 영역을 포함한다. 일 양태에서, RNA 종은 comprises the RNA 보존 영역 + 가이드 서열을 포함하는데, CRISPR-Cas 시스템의 DR + 스페이서 입체형태와 구별되지만, 일반적으로 관련된다.
일 구현예에서, ωRNA의 스페이서 길이는 10 내지 50 nt이다. 일 구현예에서, ωRNA의 스페이서 길이는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 뉴클레오티드이다. 일 구현예에서, 스페이서 길이는 10 내지 40 뉴클레오티드, 15 내지 30 nt, 15 내지 17 nt, 예를 들어, 15, 16, 또는 17 nt, 17 내지 20 nt, 예를 들어, 17, 18, 19, 또는 20 nt, 20 내지 24 nt, 예를 들어, 20, 21, 22, 23, 또는 24 nt, 23 내지 25 nt, 예를 들어, 23, 24, 또는 25 nt, 24 내지 27 nt, 예를 들어, 24, 25, 26, 또는 27 nt, 27 내지 30 nt, 예를 들어, 27, 28, 29, 또는 30 nt, 30 내지 35 nt, 예를 들어, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35 nt, 또는 35 nt 이상이다. 예의 구현예에서, 스페이서 서열은 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 48, 49, 또는 50 nt이다.
일 구현예에서, ωRNA의 서열은 ωRNA 내에서 2차 구조 정도를 감소시키도록 선택된다. 일 구현예에서, 핵산-표적화 ωRNA 성분의 뉴클레오티드의 약 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 또는 이하는 최적으로 폴딩될 때 자기-상보성 염기 쌍형성에 참여한다. 최적 폴딩은 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스 자유 에너지의 계산을 기반으로 한다. 이러한 한 알고리즘의 예는 Zuker 및 Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)가 기술한 바와 같은, mFold이다. 폴딩 알고리즘의 다른 예는 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하여, 비엔나 대학의 이론 화학 연구소 (Institute for Theoretical Chemistry at the University of Vienna) 에서 개발한 온라인 웹서버 RNAfold이다 (참조: 예를 들어, A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; 및 PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62).
본 명세서에서 사용되는, 이종성 ωRNA는 TnpB 폴리펩티드와 동일한 종으로부터 유래되지 않은 ωRNA이거나, 또는 TnpB 폴리펩티드와 동일한 종으로부터 유래되지 않은, 분자, 예를 들어 스페이서의 일부를 포함한다. 예를 들어, A 종으로부터 유래되는 TnpB 폴리펩티드의 이종성 ωRNA는 A 종과 상이한 종으로부터 유래되는 폴리뉴클레오티드, 또는 인공 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, ωRNA는 보존된 뉴클레오티드 서열에 연결된 스페이서를 포함하고, 보존된 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 스템 루프 또는 최적화된 2차 구조를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 보존된 뉴클레오티드 서열은 16 nt의 최소 길이 및 단일 스템 루프를 갖는다. 추가 구현예에서, 보존된 뉴클레오티드 서열은 16 nt 초과의 길이, 바람직하게 17 nt 초과의 길이를 갖고, 하나 초과의 스템 루프 또는 최적화된 2차 구조를 갖는다. 특정 구현예에서, 스페이서 서열은 천연 보존된 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, ωRNA 아키텍처의 일정 양태는 예를 들어, 특성의 첨가, 차감, 또는 치환을 통해서 변형될 수 있는 한편, 아키텍처의 일정 다른 양태는 유지된다. 제한없이, 삽입, 결실, 및 치환을 포함한, 조작된 ωRNA 변형에 대한 바람직한 위치는 TnpB 폴리펩티드 및/또는 표적과 복합체 형성할 때 노출되는 ωRNA의 영역 및 ωRNA 말단을 포함한다.
일 구현예에서, ωRNA는 DNA 또는 RNA일 수 있는, 별개의 비-공유적으로 연결된 서열과 스템루프를 형성한다. 특정 구현예에서, ωRNA를 형성하는 서열은 표준 포스포르아미다이트 합성 프로토콜을 사용해 먼저 합성된다 (Herdewijn, P., ed., Methods in Molecular Biology Col 288, Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Humana Press, New Jersey (2012)). 일 구현예에서, 이들 서열은 당분야에 공지된 표준 프로토콜을 사용하여 결찰을 위한 적절한 작용기를 함유하도록 작용화될 수 있다 (Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (2013)). 작용기의 예는 히드록실, 아민, 카르복실산, 카르복실산 할라이드, 카르복실산 활성 에스테르, 알데히드, 카르보닐, 클로로카르보닐, 이미다졸릴카르보닐, 히드로지드, 세미카르바지드, 티오 세미카르바지드, 티올, 말레이미드, 할로알킬, 수포닐, 알릴, 프로파르길, 디엔, 알킨, 및 아지드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 서열이 작용화되면, 공유 화학 결합 또는 연결이 이러한 서열 및 보존된 뉴클레오티드 서열 간에 형성될 수 있다. 화학 결합의 예는 카바메이트, 에테르, 에스테르, 아미드, 이민, 아미딘, 아미노트리진, 히드로존, 디술피드, 티오에테르, 티오에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 술폰아미드, 술포네이트, 풀폰, 술폭시드, 우레아, 티오우레아, 히드라지드, 옥심, 트리아졸, 광불안정 연결, C-C 결합 형성기를 기반으로 하는 것들 예컨대 딜스-알더 (Diels-Alder) 고리-부가 쌍 또는 고리-폐쇄 복분해 쌍, 및 마이클 (Michael) 반응 쌍을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 이들 스템-루프 형성 서열은 화학적으로 합성될 수 있다. 일 구현예에서, 화학 합성은 2'-아세톡시에틸 오르토에스테르 (2'-ACE) (Scaringe et al., J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 11820-11821; Scaringe, Methods Enzymol. (2000) 317: 3-18) 또는 2'-티오노카바메이트 (2'-TC) 화학 (Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc. (2011) 133: 11540-11546; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33:985-989)과 자동화, 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 기계를 사용한다.
반복부:역반복부 듀플렉스는 ωRNA 성분의 2차 구조로부터 분명해질 것이다. 이것은 전형적으로 폴리 U 트랙 이후 (5'에서 3' 방향) 및 테트라루프 이전에 제1 상보성 스트레치; 및 테트라루프 이후 (5'에서 3' 방향) 및 폴리 A 트랙 이전에 제2 상보성 스트레치일 수 있다. 제1 상보성 스트레치 ("반복부")는 제2 상보성 스트레치 ("역-반복부")에 상보적이다. 이와 같이, 그들은 왓슨-크릭 염기 쌍형성되어서 서로에 대해 폴딩될 때 dsRNA의 듀플렉스를 형성한다. 이와 같이, A-U 또는 C-G 염기쌍에 관해서 뿐만 아니라, 또한 역-반복부가 테트라루프에 기인하여 역배향이라는 사실에 관해서, 역-반복부 서열은 반복부의 상보성 서열이다.
본 발명의 일 구현예에서, ωRNA 성분 분자 아키텍처의 변형은 스템루프 2의 염기를 치환시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 스템루프 2의 "actt" (RNA 경우 "acuu") 및 "aagt" (RNA 경우 "aagu") 염기는 "cgcc" 및 "gcgg"로 치환된다. 일 구현예에서, 스템루프2의 "actt" 및 "aagt" 염기는 4개 뉴클레오티드의 상보성 GC-풍부 영역으로 치환된다. 일 구현예에서, 4개 뉴클레오티드의 상보성 GC-풍부 영역은 "cgcc" 및 "gcgg" (둘 모두 5'에서 3' 방향)이다. 일 구현예에서, 4개 뉴클레오티드의 상보성 GC-풍부 영역은 "gcgg" 및 "cgcc" (둘 모두 5'에서 3' 방향)이다. 4개 뉴클레오티드의 상보성 GC-풍부 영역에서 C 및 G의 다른 조합은, CCCC 및 GGGG를 포함하여, 자명할 것이다.
일 양태에서, 스템루프 2, 예를 들어, "ACTTgtttAAGT (SEQ ID NO: 64,304)"는 임의의 "XXXXgtttYYYY (SEQ ID NO: 64,305)"로 치환될 수 있고, 예를 들어, 여기서 XXXX 및 YYYY는 함께 서로와 염기쌍을 형성하여서 스템을 생성시키게 되는 뉴클레오티드의 임의의 상보성 세트를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "스페이서"는 또한 "가이드 서열"이라고 할 수 있다. 일 구현예에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬했을 때, 소정 표적 서열에 대한 스페이서 서열의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 일정 예의 구현예에서, ωRNA 분자는 표적 서열과 적어도 하나의 불일치를 갖도록 디자인될 수 있는 스페이서 서열을 포함하여서, 서열과 표적 서열 간에 RNA 듀플렉스가 형성된다. 따라서, 상보성 정도는 99% 미만이다. 예를 들어, 스페이서 서열이 24 뉴클레오티드로 이루어지는 경우에, 상보성 정도는 보다 특히 약 96% 이하이다. 특정 구현예에서, 스페이서 서열은 둘 이상의 인접한 불일치 뉴클레오티드의 스트레치를 갖도록 디자인되어서, 전체 서열 상에서 상보성의 정도는 더 감소된다. 예를 들어, 스페이서 서열이 24 뉴클레오티드로 이루어지는 경우에, 상보성 정도는 둘 이상의 불일치 뉴클레오티드의 스트레치가 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 뉴클레오티드 등을 포괄하는지 여부에 의존하여서, 보다 특히 약 96% 이하, 보다 특히, 약 92% 이하, 보다 특히 약 88% 이하, 보다 특히 약 84% 이하, 보다 특히 약 80% 이하, 보다 특히 약 76% 이하, 보다 특히 약 72% 이하이다. 일 구현예에서, 하나 이상의 불일치 뉴클레오티드의 스트레치 이외에도, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬했을 때, 상보성 정도는 약 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있고, 이의 비제한적인 예는 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분치 (Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우-윌러 트랜스폼 (Burrows-Wheeler Transform) 기반 알고리즘 (예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; www.novocraft.com에서 입수가능), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 입수가능), 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 입수가능)을 포함한다. 표적 핵산 서열에 대한 핵산-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 (핵산-표적화 ωRNA 분자 내) 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이를 통해서 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험하려는 ωRNA 분자 서열를 포함하여, TnpB-표적화 복합체를 형성하기에 충분한 ωRNA 시스템의 성분은 상응하는 표적 핵산 서열을 갖는 숙주 세포에게, 예컨대 TnpB-표적화 복합체의 성분을 코딩하는 벡터의 형질감염에 의해서 제공될 수 있고, 이어서 예컨대, 본 명세서에 기술된 바와 같은 Surveyor 어세이를 통해서 표적 핵산 서열 내 우선적 표적화 (예를 들어, 절단)의 평가가 후속될 수 있다. 유사하게, 표적 핵산 서열 (또는 이의 부근 서열)의 절단은 표적 핵산 서열, 시험하려는 서열을 포함한, TnpB-표적화 복합체, 및 시험 ωRNA와 상이한 제어 서열을 제공하고, 시험 및 제어 ωRNA 분자 서열 반응 간에 표적 서열 또는 그 부근에서 결합 또는 절단 속도를 비교하여 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 어세이가 가능하고, 당업자에게 일어날 수 있다. 스페이서 서열, 및 따라서 핵산-표적화 ωRNA은 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다.
ωRNA, 및 따라서 핵산-표적화 스페이서는 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 표적 서열은 DNA일 수 있다. 표적 서열은 임의의 RNA 서열일 수 있다. 일 구현예에서, 표적 서열은 메신저 RNA (mRNA), 프리-mRNA, 리보솜 RNA (rRNA), 전달 RNA (tRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 소형 인 RNA (snoRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 비-코딩 RNA (ncRNA), 장형 비-코딩 RNA (lncRNA), 및 소형 세로질 RNA (scRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA, 프리-mRNA, 및 rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 ncRNA, 및 lncRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내 서열일 수 있다. 일부 보다 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA 분자 또는 프리-mRNA 분자 내 서열일 수 있다.
일 구현예에서, ωRNA는 DNA 또는 RNA일 수 있는, 별개의 비-공유적으로 연결된 서열과 스템루프를 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, ωRNA 성분을 형성하는 서열은 표준 포스포르아미다이트 합성 프로토콜을 사용해 먼저 합성된다 (Herdewijn, P., ed., Methods in Molecular Biology Col 288, Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Humana Press, New Jersey (2012)). 일 구현예에서, 이들 서열은 당분야에 공지된 표준 프로토콜을 사용하여 결찰을 위한 적절한 작용기를 함유하도록 작용화될 수 있다 (Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (2013)). 작용기의 예는 히드록실, 아민, 카르복실산, 카르복실산 할라이드, 카르복실산 활성 에스테르, 알데히드, 카르보닐, 클로로카르보닐, 이미다졸릴카르보닐, 히드로지드, 세미카르바지드, 티오 세미카르바지드, 티올, 말레이미드, 할로알킬, 수포닐, 알릴, 프로파르길, 디엔, 알킨, 및 아지드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 서열이 작용화되면, 공유 화학 결합 또는 연결이 이러한 서열과 보존된 뉴클레오티드 서열 간에 형성될 수 있다. 화학 결합의 예는 카바메이트, 에테르, 에스테르, 아미드, 이민, 아미딘, 아미노트리진, 히드로존, 디술피드, 티오에테르, 티오에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 술폰아미드, 술포네이트, 풀폰, 술폭시드, 우레아, 티오우레아, 히드라지드, 옥심, 트리아졸, 광불안정성 연결, C-C 결합 형성기를 기반으로 하는 것들, 예컨대 딜스-알더 고리-부가 쌍 또는 고리-폐쇄 복분해 쌍 및 마이클 반응 쌍을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
ωRNA 화학적 변형
일 구현예에서, 이들 스템-루프 형성 서열은 화학적으로 합성될 수 있다. 일 구현예에서, 화학 합성은 2'-아세톡시에틸 오르토에스테르 (2'-ACE) (Scaringe et al., J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 11820-11821; Scaringe, Methods Enzymol. (2000) 317: 3-18) 또는 2'-티오노카바메이트 (2'-TC) 화학 (Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc. (2011) 133: 11540-11546; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33:985-989)과 자동화, 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 기계를 사용한다.
일 구현예에서, ωRNA 성분 분자은 비-천연 발생 핵산 및/또는 비-천연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 화학적 변형을 포함한다. 바람직하게, 이들 비-천연 발생 핵산 및 비-천연 발생 뉴클레오티드는 ωRNA 서열 외부에 위치된다. 비-천연 발생 핵산은 예를 들어, 천연 및 비-천연 발생 뉴클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 비-천연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 리보스, 포스페이트 및/또는 염기 모이어티에서 변형될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, ωRNA 성분 핵산은 리보뉴클레오티드 및 비-리보뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 일 구현예에서, ωRNA 성분은 하나 이상의 리보뉴클레오티드 및 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, ωRNA 성분은 하나 이상의 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 예컨대 포스포로티오에이트 연결을 갖는 뉴클레오티드, 리보스 고리의 2' 및 4' 탄소 사이에 메틸렌 가교를 포함하는 잠김 핵산 (LNA) 뉴클레오티드, 또는 가교 핵산 (BNA)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 다른 예는 2'-O-메틸 유사체, 2'-데옥시 유사체, 또는 2'-플루오로 유사체를 포함한다. 변형된 염기의 추가 예는 제한없이 2-아미노푸린, 5-브로모-우리딘, 슈도우리딘, 이노신, 7-메틸구아노신을 포함한다. ωRNA 화학적 변형의 예는 제한없이 하나 이상의 말단 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트 (MS), S-속박형 에틸 (cEt), 또는 2'-O-메틸 3'티오PACE (MSP)의 도입을 포함한다. 이러한 화학적으로 변형된 ωRNA 성분은 비변형된 ωRNA 성분과 비교하여 증가된 안정성 및 증가된 활성을 포함할 수 있지만, 온-표적 대 오프-표적 특이성은 예측불가하다 (참조: Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290, published online 29 June 2015 Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111; Allerson et al., J. Med. Chem. 2005, 48:901-904; Bramsen et al., Front. Genet., 2012, 3:154; Deng et al., PNAS, 2015, 112:11870-11875; Sharma et al., MedChemComm., 2014, 5:1454-1471; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985-989; Li et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1, 0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066). 일 구현예에서, ωRNA 성분의 5' 및/또는 3' 말단은 형광 염료, 폴리에틸렌 글리콜, 콜레스테롤, 단백질, 또는 검출 태그를 포함한 다양한 기능성 모이어티에 의해 변형된다 (참조: Kelly et al., 2016, J. Biotech. 233:74-83). 일 구현예에서, ωRNA 성분은 표적 서열에 결합하는 영역에 리보뉴클레오티드 및 TnpB 폴리펩티드에 결합하는 영역에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일 구현예에서, 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 조작된 ωRNA 성분 구조에 도입된다. 일 구현예에서, ωRNA 성분의 3' 또는 5' 말단에서 3-5 뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다. 일 구현예에서, 단지 미미한 변형만이, 예컨대 2'-F 변형이 씨드 영역에 도입된다. 일 구현예에서, 2'-F 변형은 ωRNA 성분의 3' 말단에서 도입된다. 일 구현예에서, ωRNA 성분의 5' 및/또는 3' 말단에서 3개 내지 5개 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸 3' 포스포로티오에이트 (MS), S-속박형 에틸(cEt), 또는 2'-O-메틸 3' 티오PACE (MSP)에 의해서 화학적으로 변형된다. 이러한 변형은 게놈 편집 효율을 증강시킬 수 있다 (참조: Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985-989). 일 구현예에서, ωRNA 성분의 모든 포스포디에스테르 결합은 유전자 파괴의 수준을 증강시키기 위해서 포스포로티오에이트 (PS)로 치환된다. 일 구현예에서, ωRNA 성분의 5' 및/또는 3' 말단에서 5개 초과 뉴클레오티드가 2'-O-Me, 2'-F 또는 S-속박형 에틸 (cEt)에 의해 화학적으로 변형된다. 이러한 화학적으로 변형된 ωRNA 성분은 유전자 파괴의 증강된 수준을 매개할 수 있다 (참조: Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111). 본 발명의 일 구현예에서, ωRNA 성분은 이의 3' 및/또는 5' 말단에서 화학적 모이어티를 포함하도록 변형된다. 이러한 모이어티는 아민, 아지드, 알킨, 티오, 디벤조시클로옥틴 (DBCO), 또는 로다민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 화학적 모이어티는 링커, 예컨대 알킬 사슬에 의해서 ωRNA 성분에 접합된다. 일 구현예에서, 변형된 핵산 성분의 화학적 모이어티는 ωRNA 성분을 다른 분자, 예컨대 DNA, RNA, 단백질, 또는 나노입자에 부착시키는데 사용될 수 있다. 화학적으로 변형된 ωRNA 성분은 TnpB 폴리펩티드 및 관련 시스템에 의해 총칭적으로 편집된 세포를 확인하거나 또는 농축하는데 사용될 수 있다 (참조: Lee et al., eLife, 2017, 6:e25312, DOI:10.7554).
특정 구현예에서, 보존된 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 단백질-결합 RNA 압타머를 포함하도록 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 압타머 예컨대 최적화된 2차 구조의 일부가 포함될 수 있다. 이러한 압타머는 본 명세서에서 추가로 상술하는 바와 같은 박테리오파지 외피 단백질에 결합할 수 있다.
구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 TnpB 단백질과 상호작용을 촉진하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 ωRNA 성분 스캐폴드를 이용하여서, 표적 폴리뉴클레오티드와 핵산 성분 분자의 서열 특이적 결합 및/또는 표적화를 허용한다. ωRNA 성분 스캐폴드의 화학적 합성은 다양한 생물접합 반응, 루프, 가교, 및 당의 변형을 통한 비-뉴클레오티드 연결, 뉴클레오티드간 포스포디에스테르 결합, 푸린 및 피리미딘 잔기를 사용하는 공유 연결 (Sletten et al., Angew. Chem. Int. Ed. (2009) 48:6974-6998; Manoharan, M. Curr. Opin. Chem. Biol. (2004) 8: 570-9; Behlke et al., Oligonucleotides (2008) 18: 305-19; Watts, et al., Drug. Discov. Today (2008) 13: 842-55; Shukla, et al., ChemMedChem (2010) 5: 328-49; 2'-아세톡시에틸 오르토에스테르 (2'-ACE)와 자동화, 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 (Scaringe et al., J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 11820-11821; Scaringe, Methods Enzymol. (2000) 317: 3-18) 또는 2'-티오노카바메이트 (2'-TC) 화학 (Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc. (2011) 133: 11540-11546; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33:985-989)을 사용하는 화학 합성을 사용하는 것이 고려된다.
일정 예의 구현예에서, 스캐폴드 및 스페이서는 단일 분자로 혼성화될 수 있거나 또는 공유적으로 연결될 수 있는 2개의 별개 분자로서 디자인될 수 있다. 공유 연결은 모이어티, 예컨대 스페이서, 부착, 생물접합체, 발색단, 리포터 그룹, 염료 표지된 RNA, 및 비-천연 발생 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 링커 (예를 들어, 비-뉴클레오티드 루프)를 통할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 목적에 적합한 스페이서는 제한 없이, 폴리에테르 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리알코올, 폴리프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 혼합물), 폴리아민기 (예를 들어, 스펜닌, 스페르미딘 및 이의 중합체 유도체), 폴리에스테르 (예를 들어, 폴리(에틸 아크릴레이트)), 폴리포스포디에스테르, 알킬렌 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 부착물은, 예컨대 그러나 제한 없이 형광 표지와 같은 링커에 추가적인 특성을 추가하기 위해 링커에 첨가될 수 있는 임의의 모이어티를 포함할 수 있다. 적합한 생물접합체는 펩티드, 글리코시드, 지질, 콜레스테롤, 인지질, 다이아실 글리세롤 및 디알킬 글리세롤, 지방산, 탄화수소, 효소 기질, 스테로이드, 바이오틴, 디곡시게닌, 탄수화물, 다당류를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 발색단, 리포터 기 및 염료 표지된 RNA는 형광 염료, 예컨대 플루오레세인 및 로다민, 화학발광, 전자화학발광 및 생체발광 마커 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. ωRNA와 사용을 위해 조정될 수 있는 2개 핵산 성분을 접합시키는 예시적인 링커의 디자인은 또한 WO 2004/015075에 기술된다.
링커 (예를 들어, 비-뉴클레오티드 루프)는 임의 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 약 0-16 뉴클레오티드와 동등한 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 링커는 약 0-8 뉴클레오티드와 동등한 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 링커는 약 0-4 뉴클레오티드와 동등한 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 링커는 약 2 뉴클레오티드와 동등한 길이를 갖는다. 예시적인 링커 디자인은 또한 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/008730에 기술된다.
에스코트 ωRNA 성분
특정 구현예에서, 조성물 또는 복합체는 ωRNA 성분 분자 구조, 아키텍처, 안정성, 유전자 발현, 또는 이의 임의 조합을 개선시키도록 디자인된 기능적 구조를 갖는 ωRNA 성분 분자를 갖는다. 이러한 구조는 압타머를 포함할 수 있다.
압타머는 예를 들어, 기하급수적 농축을 통한 리간드의 체계적 진화 (SELEX; Tuerk C, Gold L: "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to Bacteriophage T4 DNA polymerase." Science 1990, 249:505-510)라고 불리는 기술을 사용하여, 다른 리간드에 단단하게 결합하도록 디자인되거나 또는 선택될 수 있는 생물분자이다. 핵산 압타머는 예를 들어, 광범위한 생물의학적으로 관련된 표적에 대한 높은 결합 친화성 및 특이성으로, 무작위-서열 올리고뉴클레오티드의 풀로부터 선택될 수 있어서, 압타머에 대한 광범위한 치료적 활용성을 시사한다 (Keefe, Anthony D., Supriya Pai, and Andrew Ellington. "Aptamers as therapeutics." Nature Reviews Drug Discovery 9.7 (2010): 537-550). 이들 특징은 또한 약물 전달 비히클로서 압타머에 대한 광범위한 용도를 시사한다 (Levy-Nissenbaum, Etgar, et al. "Nanotechnology and aptamers: applications in drug delivery." Trends in biotechnology 26.8 (2008): 442-449; and, Hicke BJ, Stephens AW. "Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy." J Clin Invest 2000, 106:923-928). 압타머는 또한 녹색 형광 단백질의 활성을 모방하는 형광단에 결합하는 RNA 압타머와 같이, 특성 변화에 의한 신호에 반응하는, 분자 스위치로서 기능하도록 구축될 수 있다 (Paige, Jeremy S., Karen Y. Wu, and Samie R. Jaffrey. "RNA mimics of green fluorescent protein." Science 333.6042 (2011): 642-646). 압타머는 예를 들어 세포 표면 단백질을 표적화하는, 표적화된 siRNA 치료제 전달 시스템의 성분으로서 사용될 수 있다는 것이 또한 제안되었다 (Zhou, Jiehua, and John J. Rossi. "Aptamer-targeted cell-specific RNA interference." Silence 1.1 (2010): 4).
따라서, 특정 구현예에서, ωRNA 성분 분자는 예를 들어, 세포막을 통해서, 세포내 구획으로, 또는 핵으로 전달을 포함하여, ωRNA 성분 분자 전달을 개선시키도록 디자인된 하나 이상의 압타머(들)를 통해서 변형된다. 이러한 구조는 핵산 성분 분자가 선택된 이펙터에 대해서 전달가능하거나, 유도가능하거나 또는 반응성이게 만들기 위해서, 하나 이상의 압타머(들)이외에도, 또는 이러한 하나 이상의 압타머(들)없이, 모이어티(들)를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 제한없이 pH, 저산소, O2 농도, 온도, 단백질 농도, 효소 농도, 지질 구조, 빛 노출, 기계적 파괴 (예를 들어, 초음파), 자기장, 전기장, 또는 전자기 방사선을 포함하는, 정상 또는 병적 생리학적 조건에 반응하는 ωRNA 성분 분자를 이해한다.
유도성 시스템의 광 반응성은 크립토크롬-2 및 CIB1의 활성화 및 결합을 통해 달성될 수 있다. 파란색 빛 자극은 크립토크롬-2의 활성화 입체형태 변화를 유도하여서, 이의 결합 파트너 CIB1의 동원을 야기시킨다. 이러한 결합은 빠르고 가역적이어서, 펄스된 자극 후에 <15초의 포화를 획득하고 자극 종료 후 <15분에 기준치로 복귀된다. 이들 신속한 결합 동역학은 유도제의 흡수 및 청소보다는, 전사/번역 및 전사물/단백질 분해의 속도에 의해서만 시간적으로 제한되는 시스템을 야기시킨다. 크립토크롬-2 활성화는 또한 고도로 민감하여서, 저광도 자극의 사용을 허용하고 광독성 위험성을 완화시킨다. 또한, 온전한 포유동물 뇌와 같은 경우에, 가변 광 강도를 사용하여 자극된 영역의 크기를 제어할 수 있어서, 단독 벡터 전달이 제공할 수 있는 것에 비해서 더 큰 정밀도를 허용한다.
에너지원 예컨대 전자기 방사선, 소리 에너지 또는 열 에너지는 핵산 성분 분자를 유도할 수 있다. 유리하게, 에너지원 예컨대 전자기 방사선, 소리 에너지 또는 열 에너지는 핵산 성분 분자를 유도할 수 있다. 유리하게, 전자기 방사선은 가시광의 성분이다. 바람직한 구현예에서, 빛은 약 450 내지 약 495 nm 파장의 파란색 빛이다. 특히 바람직한 구현예에서, 파장은 약 488 nm이다. 다른 바람직한 구현예에서, 및 자극은 펄스를 통한다. 빛 동력은 약 0-9 mW/cm2 범위일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 15초마다 0.25초 만큼 낮은 자극 파라다임이 최대 활성화를 야기시켜야 한다.
화학적 또는 에너지 민감성 ωRNA 성분은 ωRNA로서 작용하고 TnpB 폴리펩티드 시스템 또는 복합체 기능을 갖도록 허용하는 에너지에 의해서 또는 화학적 공급원의 결합에 의해서 유도시 입체형태 변화를 겪을 수 있다. 본 발명은 ωRNA 기능 및 TnpB 폴리펩티드 시스템 또는 복합체 기능을 갖도록 화학적 공급원 또는 에너지를 인가하는 단계; 및 임의로 게놈 유전자좌의 발현이 변경되는가를 추가로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
몇가지 상이한 디자인의 이러한 화학적 유도성 시스템이 존재한다: 1. 압시스산 (ABA)에 의해 유도가능한 ABI-PYL 기반 시스템 (참조: 예를 들어, stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/sigtrans;4/164/rs2), 2. 라파마이신 (또는 라파마이신 기반의 관련 화학물)에 의해 유도가능한 FKBP-FRB 기반 시스템 (참조: 예를 들어, nature.com/nmeth/journal/v2/n6/full/nmeth763.html), 3. 지베렐린 (GA)에 의해 유도가능한 GID1-GAI 기반 시스템 (참조: 예를 들어, nature.com/nchembio/journal/v8/n5/full/nchembio.922.html).
화학적 유도성 시스템은 4-히드록시타목시펜 (4OHT)에 의해 유도가능한 에스트로겐 수용체 (ER) 기반 시스템일 수 있다 (참조: 예를 들어, pnas.org/content/104/3/1027.abstract). ERT2라고 하는 에스트로겐 수용체의 돌연변이된 리간드-결합 도메인은 4-히드록시타목시펜의 결합 시 세포의 핵으로 전좌된다. 본 발명의 추가 구현예에서, 임의의 핵 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, 레티노산 수용체, 에스트로겐 수용체, 에스트로겐-관련 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체의 임의의 천연 발생 또는 조작된 유도체는 ER 기반 유도성 시스템과 유사한 유도성 시스템에서 사용될 수 있다.
다른 유도성 시스템은 에너지, 열, 또는 전파에 의해 유도가능한 일시적 수용체 전좌 (TRP) 이온 채널 기반 시스템을 사용하는 디자인을 기반으로 한다 (참조: 예를 들어, sciencemag.org/content/336/6081/604). 이들 TRP 패밀리 단백질은 빛과 열을 포함한, 상이한 자극에 반응한다. 이러한 단백질은 빛 또는 열에 의해 활성화될 때, 이온 채널이 열리게 되어 칼슘 이온과 같은 이온의 형질막으로의 진입을 허용한다. 이온의 이러한 유입은 핵산 성분 및 TnpB 폴리펩티드/ ωRNA 분자 복합체 또는 시스템의 다른 성분을 포함하여 폴리펩티드에 연결되는 세포내 이온 상호작용 파트너에 결합하게 되고, 결합은 폴리펩티드의 세포하 국재화의 변화를 유도하게 되어서, 전체 폴리펩티드가 세포의 핵으로 진입하게 야기한다. 핵 내부에 있으면, 핵산 성분 단백질, 및 TnpB 폴리펩티드/ωRNA 분자 복합체의 다른 성분은 세포에서 활성화되어서 표적 유전자 발현을 조절하게 된다.
광활성화가 유리한 구현예일 수 있지만, 때때로 빛이 피부 또는 다른 장기를 침투할 수 없는 생체내 적용에서 특히 불리할 수 있다. 이러한 예에서, 에너지 활성화의 다른 방법, 특히 유사한 효과를 갖는 전기장 에너지 및/또는 초음파가 고려된다.
전기장 에너지는 바람직하게, 생체 내 조건 하에서 약 1 Volt/cm 내지 약 10 kVolts/cm의 하나 이상의 전기 펄스를 사용하여, 실질적으로 당분야에 기술된 바와 같이 투여된다. 펄스 대신에 또는 그이외에도, 전기장은 연속적인 방식으로 전달될 수 있다. 전기 펄스는 1 μs와 500 밀리초 사이, 바람직하게 1 μs와 100 밀리초 사이 동안 인가될 수 있다. 전기장은 약 5분 동안 펄스식 방식으로 또는 연속적으로 인가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, '전기장 에너지'는 세포가 노출되는 전기 에너지이다. 바람직하게 전기장은 생체내 조건 하에서 약 1 Volt/cm 내지 약 10 kVolts/cm 이상의 강도를 갖는다 (참조: WO97/49450).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "전기장"은 가변 용량 및 전압에서 하나 이상의 펄스를 포함하고, 지수파 및/또는 사각파 및/또는 변조파 및/또는 변조 사각파 형태를 포함한다. 전기장 및 전기에 대한 언급은 세포의 환경에서 전위차의 존재의 언급을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 이러한 환경은 당분야에 공지된 바와 같이, 정전기, 교류 (AC), 직류 (DC) 등을 통해서 설정될 수 있다. 전기장은 균일하거나, 불균일하거나, 또는 그렇지 않을 수 있고, 시간 의존적 방식으로 강도 및/또는 방향이 가변적일 수 있다.
전기장의 단회 또는 다회 인가뿐만 아니라 초음파의 단회 또는 다회 인가는 임의의 순서로 그리고 임의의 조합으로 가능하다. 초음파 및/또는 전기장은 단회 또는 다회 연속 인가로서, 또는 펄스 (박동성 전달)로서 전달될 수 있다.
전기천공은 살아있는 세포로 외래 물질을 도입시키는 시험관 내 및 생체내 절차에서 사용되어 왔다. 시험관내 적용에서, 생 세포 샘플은 먼저 관심 작용제와 혼합되고 전극 예컨대 평행판 사이에 배치된다. 다음으로, 전극은 세포/임플란트 혼합물에 전기장을 인가한다. 시험관내 전기천공을 수행하는 시스템의 예는 Electro Cell Manipulator ECM600 제품, 및 Electro Square Porator T820을 포함하고, 둘 모두 BTX Division of Genetronics, Inc에서 제조되었다 (참조: 미국 특허 제5,869,326호).
기지의 전기천공 기술 (시험관내 및 생체내)은 치료 영역 주변에 배치된 전극에 짧은 고전압 펄스를 인가하여서 기능한다. 전극 사이에서 발생된 전기장은 세포막을 일시적으로 다공성이 되게 하여서, 그때에 관심 작용제의 분자가 세포로 진입한다. 기지의 전기천공 적용에서, 이러한 전기장은 약 100 .mu.s 지속 기간 동안 1000 V/cm의 정도로 단일 구형파 펄스를 포함한다. 이러한 펄스는 예를 들어, Electro Square Porator T820의 기지 적용에서 발생될 수 있다.
바람직하게, 전기장은 시험관내 조건 하에서 약 1 V/cm 내지 약 10 kV/cm의 강도를 갖는다. 따라서, 전기장은 1 V/cm, 2 V/cm, 3 V/cm, 4 V/cm, 5 V/cm, 6 V/cm, 7 V/cm, 8 V/cm, 9 V/cm, 10 V/cm, 20 V/cm, 50 V/cm, 100 V/cm, 200 V/cm, 300 V/cm, 400 V/cm, 500 V/cm, 600 V/cm, 700 V/cm, 800 V/cm, 900 V/cm, 1 kV/cm, 2 kV/cm, 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm, 50 kV/cm 이상의 강도를 가질 수 있다. 보다 바람직하게 시험관내 조건 하에서 약 0.5 kV/cm 내지 약 4.0 kV/cm 이다. 바람직하게 전기장은 생체내 조건 하에서 약 1 V/cm 내지 약 10 kV/cm의 강도를 갖는다. 그러나, 표적 부위에 전달된 펄스 수가 증가되는 경우에 전기장 강도는 낮아질 수 있다. 따라서, 더 낮은 전계 강도에서 전기장의 박동식 전달이 예상된다.
바람직하게, 전기장의 인가는 다수 펄스의 형태, 예컨대 동일한 강도 및 전기용량의 이중 펄스 또는 다양한 강도 및/또는 전기용량의 순차적 펄스이다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "펄스"는 다양한 전기용량 및 전압에서 하나 이상의 전기 펄스를 포함하고 지수 및/또는 구형파 및/또는 변조파 및/또는 구형파 형태를 포함한다.
바람직하게, 전기 펄스는 지수 파형, 사각 파형, 변조 파형 및 변조 사각 파형으로부터 선택되는 파형으로서 전달된다.
바람직한 구현예는 저전압에서 직류를 적용한다. 따라서, 출원인은 1 V/㎝와 20V/㎝ 사이의 전기장 강도에서, 100 밀리초 이상, 바람직하게는 15분 이상의 기간 동안 세포, 조직 또는 조직 덩어리에 인가되는 전기장의 사용을 개시한다.
초음파는 유리하게 약 0.05 W/cm2 내지 약 100 W/cm2의 전력 수준으로 투여된다. 진단 또는 치료 초음파, 또는 이의 조합이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "초음파"는 기계적 진동으로 이루어지고, 이의 주파수는 너무 높아서 인간 청력 범위 이상인 에너지의 형태를 의미한다. 초음파 스펙트럼의 하한 주파수는 일반적으로 약 20 kHz 로서 간주될 수 있다. 초음파의 대부분의 진단 적용은 1 내지 15 MHz' 범위의 주파수를 적용한다 (Ultrasonics in Clinical Diagnosis, P. N. T. Wells, ed., 2nd. Edition, Publ. Churchill Livingstone [Edinburgh, London & NY, 1977]).
초음파는 진단 및 치료 적용분야 둘 모두에서 사용되었다. 진단 도구 ("진단 초음파")로서 사용될 때, 초음파는 전형적으로 최대 약 100 mW/cm2 (FDA 권장)의 에너지 밀도 범위에서 사용되지만, 최대 750 mW/cm2의 밀도가 사용되어 왔다. 물리치료에서, 초음파는 전형적으로 약 3 내지 4 W/㎠ (WHO 권장사항) 범위에서 에너지 공급원으로서 사용된다. 다른 치료적 적용에서, 더 높은 강도의 초음파가, 예를 들어 짧은 시간 기간 동안 100 W/cm 내지 1 kW/cm2 (또는 그 이상)의 HIFU가 적용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "초음파"는 진단, 치료, 및 집속 초음파를 포괄하는 것으로 의도된다.
집속 초음파 (FUS)는 침습적 프로브없이 열 에너지를 전달하도록 허용한다(참조: Morocz et al 1998 Journal of Magnetic Resonance Imaging Vol.8, No. 1, pp.136-142). 집속 초음파의 다른 형태는 하기 문헌에서 고찰한 고강도 집속 초음파 (HIFU)이다 (Moussatov et al in Ultrasonics (1998) Vol.36, No.8, pp.893-900 및 TranHuuHue et al in Acustica (1997) Vol.83, No.6, pp.1103-1106).
바람직하게, 진단 초음파와 치료 초음파의 조합이 사용된다. 이러한 조합은 그러나 제한하려는 의도가 아니고, 숙련된 독자는 임의의 다양한 초음파 조합이 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가적으로, 에너지 밀도, 초음파의 주파수, 및 노출 기간은 가변적일 수 있다.
바람직하게, 초음파 에너지원에 대한 노출은 약 0.05 내지 약 100 Wcm-2의 전력 밀도에서이다. 보다 더 바람직하게, 초음파 에너지원에 대한 노출은 약 1 내지 약 15 Wcm-2의 전력 밀도이다.
바람직하게, 초음파 에너지원에 대한 노출은 약 0.015 내지 약 10.0 MHz의 초음파에서 이다. 보다 바람직하게 초음파 에너지원에 대한 노출은 약 0.02 내지 약 5.0 MHz 또는 약 6.0 MHz의 초음파이다. 가장 바람직하게, 초음파는 3 MHz의 주파수에서 인가된다.
바람직하게 노출은 약 10밀리초 내지 약 60분의 기간 동안이다. 바람직하게 노출은 약 1초 내지 약 5분의 기간 동안이다. 보다 바람직하게, 초음파는 약 2분 동안 인가된다. 그러나, 파괴하려는 특정 표적 세포에 의존하여, 노출은 더 긴 지속기간 동안, 예를 들어, 15분 동안일 수 있다.
유리하게, 표적 조직은 약 0.015 내지 약 10 MHz 범위의 주파수에서 약 0.05 Wcm-2 내지 약 10 Wcm-2의 음향 전력 밀도에서 초음파 에너지원에 노출된다 (참조: WO 98/52609). 그러나, 대안적으로 100 Wcm-2 이상의 음향 전력 밀도이지만, 감소된 기간 동안, 예를 들어, 1000 Wcm-2 에서 밀리초 범위 이하의 기간 동안 초음파 에너지원에 노출이 또한 가능하다.
바람직하게, 초음파의 적용은 다수 펄스의 형태이고; 따라서, 연속파 및 펄스파 (초음파의 박동식 전달) 둘 모두가 임의 조합으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 연속파 초음파가 인가될 수 있고, 이어서 펄스파 초음파가 후속되거나, 또는 그 반대일 수도 있다. 이것은 임의 횟수, 임의 순서, 및 조합으로 반복될 수 있다. 펄스파 초음파는 연속파 초음파의 배경에 대해서 적용될 수 있고, 임의 수의 펄스가 임의 수의 그룹에서 사용될 수 있다.
바람직하게, 초음파는 펄스파 초음파를 포함할 수 있다. 매우 바람직한 구현예에서, 초음파는 0.7 Wcm-2 또는 1.25 Wcm-2의 전력 밀도에서 연속파로서 적용된다. 펄스파 초음파가 사용되는 경우에 더 높은 전력 밀도가 적용될 수 있다.
초음파의 사용은 표적 상에서 정확하게 집속시킬 수 있기 때문에 빛만큼 유리하다. 게다가, 초음파는 빛과 달리 조직에 더 깊게 집속시킬 수 있기 때문에 유리하다. 따라서 전체 조직 침투 (예컨대, 이에 제한없이, 간엽) 또는 전체 장기 (예컨대, 제한없이, 전체 간 또는 전체 근육, 예컨대, 심장) 요법에 더 적합하게 된다. 다른 중요한 장점은 초음파가 다양한 진단 및 치료 적용에서 사용되는 비-침습성 자극이라는 것이다. 예로서, 초음파는 의료 이미지화 기술, 및 추가적으로 정형외과 요법에서 충분히 알려져 있다. 더 나아가, 대상 척추동물에 대한 초음파의 적용에 적합한 기기가 널리 이용 가능하며, 그들의 용도는 당업계에 충분히 공지되어 있다.
특정 구현예에서, ωRNA 분자는 TnpB 폴리펩티드 및 관련 시스템의 특이성을 증가시키기 위해서 2차 구조에 의해 변형되고 2차 구조는 엑소뉴클레아제 활성에 대해 보호될 수 있고 보호된 핵산 성분 분자로서 본 명세서에서 역시 언급되는 핵산 성분 서열에 대한 5' 첨가를 허용한다.
일 양태에서, 본 발명은 핵산 성분 분자의 서열에 대한 "보호자 RNA"를 혼성화하기 위해 제공되고, "보호자 RNA"는 핵산 성분 분자의 3' 말단에 상보적인 RNA 가닥이어서, 부분적으로 이중-가닥인 핵산 성분을 생성시킨다. 본 발명의 일 구현예에서, 완벽하게 상보성인 보호자 서열에 의한 불일치된 염기 (즉, 핵산 성분 서열의 일부를 형성하지 않는 핵산 성분 분자의 염기)의 보호는 3' 말단에서 불일치된 염기쌍에 대한 표적 DNA 결합의 가능성을 감소시킨다. 본 발명의 특정 구현예에서, 연장된 길이를 포함하는 추가적인 서열은 또한 핵산 성분 분자 내에 존재할 수 있어서 핵산 성분은 핵산 성분 분자 내에 보호자 서열을 포함한다. 이러한 "보호자 서열"은 "노출된 서열" (표적 서열과 혼성화하는 핵산 성분 서열의 일부를 포함)이외에도 핵산 성분 분자가 "보호된 서열"을 포함한다는 것을 보장한다. 특정 구현예에서, 핵산 성분 분자는 2차 구조 예컨대 헤어핀을 포함하도록 보호자 핵산 성분의 존재에 의해서 변형된다. 유리하게, 보호된 서열, 핵산 성분 서열 또는 둘 모두에 대해 상보성을 갖는 3 또는 4 내지 30 이상, 예를 들어 약 10 이상의 인접한 염기쌍이 존재한다. 보호된 부분은 이의 표적과 상호작용하는 TnpB 폴리펩티드 및 관련 시스템의 열역학을 방해하지 않는 것이 유리하다. 부분적으로 이중 가닥인 핵산 성분 분자를 포함하는 이러한 연장부를 제공함으로써, 핵산 성분 분자는 보호된 것으로 간주되고, 비활성을 유지하면서, TnpB 폴리펩티드/핵산 성분 분자 복합체의 개선된 특이적 결합을 야기한다.
특정 구현예에서, 절두된 ωRNA 성분 (tru-핵산 성분), 즉정규 핵산 성분 서열 길이에 대해서 길이가 절두된 핵산 성분 서열을 포함하는 핵산 성분 분자를 사용한다. Nowak et al. (Nucleic Acids Res (2016) 44 (20): 9555-9564)에 기술된 바와 같이, 이러한 핵산 성분 분자는 표적 DNA 절단없이 촉매적 활성 TnpB 폴리펩티드가 이의 표적에 결합하도록 허용할 수 있다. 특정 구현예에서, 표적의 결합을 허용하지만 TnpB 폴리펩티드의 닉카제 활성만을 보유하는 절두된 핵산이 사용된다.
일 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 성분에 대한 삼중안테나 N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc)의 접합은 전달, 예를 들어, 선택된 세포 유형, 예를 들어 간세포로의 전달을 개선시키는데 사용될 수 있다 (참조: 참조로 본 명세서에 편입되는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/118272; Nair, JK et al., 2014, Journal of the American Chemical Society 136 (49), 16958-16961). 이것은 당-기반 입자로 간주되고, 다른 입자 전달 시스템 및/또는 제제에 대한 추가 상세 사항이 본 명세서에 제공된다. 그러므로, GalNAc 는 본 명세서에 기술된 다른 입자의 의미에서 입자로 간주될 수 있어서, 일반 용도 및 다른 고려 사항, 예를 들어, 상기 입자의 전달이 역시 GalNAc 입자에 적용된다. 용액-상 접합 전략은 예를 들어 5'-헥실아미노 변형된 올리고뉴클레오티드 상에 PFP (펜타플루오로페닐) 에스테르로서 활성화된 삼중안테나 GalNAc 클러스터 (mol. wt. ∼2000)를 부착시키기 위해 사용될 수 있다 (5'-HA ASOs, mol. wt. ∼8000 Da; Østergaard et al., Bioconjugate Chem., 2015, 26 (8), pp 1451-1455). 유사하게, 생체내 핵산 전달을 위한 폴리(아크릴레이트) 중합체가 기술된 바 있다 (참조: 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2013158141). 추가의 대안적인 구현예에서, TnpB 폴리펩티드 나노입자 (또는 단백질 복합체)와 천연 발생 혈청 단백질의 사전 혼합은 전달을 개선시키기 위해서 사용될 수 있다 (Akinc A et al, 2010, Molecular Therapy vol. 18 no. 7, 1357-1364).
스크리닝 기술은 예를 들어 화학 라이브러리를 스크리닝하여서, 전달 인핸서를 확인하는데 이용가능하다 (Gilleron J. et al., 2015, Nucl. Acids Res. 43 (16): 7984-8001). 또한 성분에 효과적인 전달 비히클을 확인하기 위해 적용될 수 있는, 지질 나노입자와 같은, 전달 비히클의 효율을 평가하기 위한 접근법이 기술되었다 (참조: Sahay G. et al., 2013, Nature Biotechnology 31, 653-658).
표적 인접 모티프
본 명세서에 개시된 TnpB 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 상의 표적 서열을 인식하고 결합하기 위해서 표적 인접 모티프 (TAM)를 인식할 수 있다. 일 구현예에서, 핵산-가이드된 뉴클레아제 및 관련 조성물은 TAM 요건을 갖는다. TAM에 대한 정확한 서열 및 길이 요건은 사용되는 핵산-가이드된 뉴클레아제에 의존하여 상이할 것이다. 일례에서, TAM은 전형적으로 프로토스페이서 (즉, 표적 서열)에 인접한 2-5 염기쌍 서열이다. 일례의 구현예에서, TAM은 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 3' 인접한다. 다른 예의 구현예에서, TAM은 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 대해서 5' 인접한다.
일 구현예에서, 절단 부위는 TAM으로부터 멀리 있고, 예를 들어, 절단은 비-표적 가닥 상의 n번째 이후 및 표적 가닥 상의 뉴클레오티드 이후에 발생된다. 일 구현예에서, 절단 부위는 비-표적 가닥 상의 확인된 뉴클레오티드 (TAM으로부터 계측) 이후에 및 표적화된 가닥 상의 추가 확인된 뉴클레오티드 (TAM로부터 계측) 이후에 발생된다. 일 구현예에서, 벡터는 상응하는 야생형 효소에 대해서 돌연변이될 수 있는 핵산-표적화 이펙터 단백질을 코딩하여서, 돌연변이된 핵산-표적화 이펙터 단백질은 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 DNA 및 RNA 가닥 중 하나 또는 둘 모두를 절단하는 능력이 결여된다.
일례의 구현예에서 TAM 서열은 TCAG이다. 다른 예의 구현예에서, TAM 서열은 TCAA이다. TAM 확인 및 특이성은 예를 들어, 하기 실시예 섹션에 개시된 방법을 사용하여 확인할 수 있다.
HDR 도너 주형
일 구현예에서, 본 명세서의 조성물 및 시스템은 상동성-유도된 복구 매개 편집에서 사용을 위한 하나 이상의 HDR 도너 주형을 더 포함할 수 있다. 일부 경우에, HDR 도너 주형은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일정 경우에, HDR 도너 주형은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. HDR 도너 주형은 DNA 주형일 수 있다.
HDR 도너 주형은 표적 폴리뉴클레오티드의 편집에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 도너 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드에 도입시키려는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이의 예는 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 조합을 포함한다. 돌연변이는 표적 폴리뉴클레오티드 상에서 오픈 리딩 프레임의 이동을 초래할 수 있다. 일부 경우에, HDR 도너 주형은 표적 폴리뉴클레오티드에서 중지 코돈을 변경시킨다. 예를 들어, HDR 도너 주형은 조기 중지 코돈을 교정할 수 있다. 교정은 중지 코돈을 결실시키거나 또는 중지 코돈에 하나 이상의 돌연변이를 도입시켜서 획득될 수 있다. 다른 예의 구현예에서, HDR 도너 주형은 예를 들어, 일정 질환 상황에서, 유전자의 기능성 카피, 또는 이의 기능적 단편, 또는 기능성 조절 서열 또는 조절 서열의 기능성 단편을 삽입시키거나 또는 복원시켜서 일어날 수 있는, 기능 상실, 돌연변이, 결실, 또는 전좌를 처리한다. 기능성 단편은 야생형 유전자 또는 비-코딩 조절 서열 (예를 들어, 긴 비-코딩 RNA를 코딩하는 서열)의 기능성을 복원시키기에 충분한 뉴클레오티드 서열을 제공하여서 유전자의 전체 카피 미만인 것을 의미한다. 일정 예의 구현예에서, 명세서에 개시된 시스템은 결함성 유전자의 단일 유전자좌 또는 이의 결함성 단편을 치환시키는데 사용될 수 있다. 다른 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템은 결함성 유전자의 양쪽 대립유전자 또는 결함성 유전자 단편을 치환시키는데 사용될 수 있다. "결함성 유전자" 또는 "결함성 유전자 단편"은 발현되었을 때 상응하는 야생형 유전자의 기능성과 함께 기능성 단백질 또는 비-코딩 RNA를 생성시키는데 실패한 유전자 또는 유전자의 일부이다. 일정 예의 구현예에서, 이들 결함성 유전자는 하나 이상의 질환 표현형과 연관될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 결함성 유전자 또는 유전자 단편은 치환되지 않지만 본 명세서에 기술된 시스템은 결함성 유전자 발현을 보상하거나 또는 무시하는 유전자 또는 유전자 단편을 코딩하는 HDR 도너 주형을 삽입하는데 사용되어서, 결함성 유전자 발현과 연관된 세포 표현형이 제거되거나 또는 상이하거나 또는 원하는 세포 표현형으로 변화된다.
본 발명의 일 구현예에서, HDR 도너 주형은 유전자 또는 유전자 단편, 발현시키려는 코딩되는 단백질 또는 RNA 전사물, 조절 구성요소, 복구 주형 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따라서, HDR 도너 주형은 삽입을 매개하는 전좌 성분과 기능하는 좌측 말단 및 우측 말단 서열 구성요소를 포함할 수 있다.
일정 경우에, HDR 도너 주형은 표적 폴리뉴클레오티드 상에서 스플라이싱 부위를 조작한다. 일례에서, HDR 도너 주형은 스플라이싱 부위를 파괴한다. 파괴는 폴리뉴클레오티드를 스프라이싱 부위를 삽입하고/하거나 하나 이상의 돌연변이를 스플라이싱 부위에 도입시켜서 획득될 수 있다. 일정 예에서, HDR 도너 주형은 스프라이싱 부위를 복원할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 스플라이싱 부위서열을 포함할 수 있다.
삽입하려는 HDR 도너 주형은 10 염기쌍 또는 뉴클레오티드 내지 50 kb 길이, 예를 들어, 50 내지 40k, 100 내지 30 k, 100 내지 10000, 100 내지 300, 200 내지 400, 300 내지 500, 400 내지 600, 500 내지 700, 600 내지 800, 700 내지 900, 800 내지 1000, 900 내지 1100, 1000 내지 1200, 1100 내지 1300, 1200 내지 1400, 1300 내지 1500, 1400 내지 1600, 1500 내지 1700, 600 내지 1800, 1700 내지 1900, 1800 내지 2000 염기쌍 (bp) 또는 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다.
시스템 및 복합체
일 양태에서, 본 개시는 핵산-표적화 시스템을 제공한다. 이러한 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드를 표적화하고, 변형시키고, 달리 조작하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 시스템은 TnpB 폴리펩티드 및 하나 이상의 ωRNA를 포함한다. TnpB 폴리펩티드는 예를 들어 DNA를 절단할 수 있는, 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 예를 들어, 이중-가닥 핵산 예컨대 dsDNA 또는 dsRNA 상에 단일-가닥 파손을 생성시킬 수 있는, 닉카제 활성을 가질 수 있거나 또는 갖도록 조작될 수 있다.
일례에서, 본 명세서의 시스템에서 둘 이상의 성분이 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 성분은 별개 분자이지만 직접적으로 또는 간접적으로 서로 상호작용한다. 본 명세서의 시스템에서 둘 이상의 일정 성분은 융합 단백질에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "표적 서열"은 ωRNA가 상보성을 갖도록 디자인된 서열을 의미하는 것으로서 표적 서열과 ωRNA 사이의 혼성화는 폴리뉴클레오티드 표적화 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 유발하고 TnpB-표적화 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 반드시 요구되지는 않는다. 표적 서열은 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치된다. 일 구현예에서, 표적 서열은 진핵생물 세포의 소기관, 예를 들어, 미토콘드리온 또는 엽록체 내에 존재할 수 있다. 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로 재조합을 위해 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 서열"이라고 한다. 본 발명의 양태에서, 외생성 주형은 편집 주형이라고 할 수 있다. 일 양태에서 재조합은 상동성 재조합이다.
일 구현예에서, TnpB-표적화 복합체의 형성 (표적 서열에 혼성화하고 하나 이상의 핵산-표적화 이펙터 단백질과 복합체 형성하는 ωRNA를 포함)은 표적 서열에서 또는 근처에서 (예를 들어, 그로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 이상의 염기쌍 내에서) 하나 또는 둘 모두의 핵산 가닥의 절단을 일으킨다. 일 구현예에서, TnpB 시스템의 하나 이상의 구성요소의 발현을 구동하는 하나 이상의 벡터가 숙주 세포로 도입되어서 TnpB 시스템의 구성요소의 발현은 하나 이상의 표적 부위에서 TnpB 복합체의 형성을 유도한다. 예를 들어, TnpB 폴리펩티드 및 ωRNA는 각각이 별개 벡터 상에서 별개 조절 구성요소에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 또는 상이한 조절 구성요소로부터 발현되는 구성요소 중 둘 이상은 제1 벡터에 포함되지 않은 TnpB 시스템의 임의 성분을 제공하는 하나 이상의 추가적인 벡터와, 단일 벡터로 조합될 수 있다. 단일 벡터로 조합된 TnpB 시스템 구성요소는 임의의 적합한 배향으로 배열될 수 있고, 예컨대 하나의 구성요소는 제2 구성요소에 대해서 5' (그의 "상류") 또는 3' (그의 "하류")에 위치된다. 하나의 구성요소의 코딩 서열은 제2 구성요소의 코딩 서열의 동일하거나 또는 반대의 가닥에 위치될 수 있고, 동일하거나 또는 반대의 방향으로 배향될 수 있다. 일 구현예에서, 단일 프로모터는 하나 이상의 인트론 서열 (예를 들어, 상이한 인트론에서 각각, 적어도 하나의 인트론 내에서 둘 이상, 또는 단일 인트론 내에 모두) 내에 내포된 TnpB 및 ωRNA를 코딩하는 전사물의 발현을 구동한다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드 및 ωRNA는 동일 프로모터에 작동적으로 연결되어서 그로부터 발현된다.
본 개시는 새로운 TnpB 폴리펩티드를 예측하고, 성분 및 그의 새로운 TnpB 시스템을 확인하기 위한 컴퓨터 방법 및 알고리즘을 포괄한다. 일례에서, 후보의 신규한 TnpB 폴리펩티드 유전자좌 분석을 확인하는 컴퓨터 방법은 추가 상동체에 대한 메타게놈 데이터베이스를 검색하여서 수행될 수 있다.
일 양태에서 모든 예측된 단백질 코딩 유전자의 확인은 조상 도메인 및 전체-길이 단백질에 대한 주석이 잘 달려진 다수 서열 정렬 모델의 컬렉션으로 이루어진 단백질 주석 리소스인 NCBI 보존성 도메인 데이터베이스 (CDD)에 따라서 TnpB 폴리펩티드 특이적 프로파일을 갖는 유전자를 확인하고 주석을 달아서 수행된다. 이들은 RPS-BLAST를 통해 단백질 서열 내 보존된 도메인의 신속한 확인을 위한 단백질-특이적 점수 매트릭스 (PSSM)로 이용가능하다. CDD 내용은 도메인 경계를 분명하게 정하기 위해 3D-구조 정보를 사용하는, NCBI-큐레이트 (NCBI-curated) 도메인을 포함하고, 서열/구조/기능 관계에 대한 통찰뿐만 아니라 다수의 외부 소스 데이터베이스 (Pfam, SMART, COG, PRK, TIGRFAM)로부터 유입된 도메인 모델을 제공한다.
추가 양태에서, 사례별 분석은 PSI-BLAST (Position-Specific Iterative Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 수행된다. PSI-BLAST는 단백질-단백질 BLAST를 사용하여 소정 점수 한계치 이상에서 검출된 서열의 다중 서열 정렬로부터의 프로파일 또는 위치-특이적 채점 매트릭스 (Position-specific scoring matrix; PSSM)를 구동한다. 이러한 PSSM은 새로운 매치를 위해 데이터베이스를 더 검색하는데 사용되고, 이들 새롭게 검출된 서열로 후속 반복을 위해 업데이트된다. 따라서, PSI-BLAST는 단백질 간 장거리 상관도를 검출하는 수단을 제공한다.
다른 양태에서, 사례별 분석은 HHpred, 서열 데이터베이스 검색을 위한 방법 및 BLAST 또는 PSI-BLAST를 사용하기에 용이하고 그리고 동시에 멀리 떨어진 상동체를 발견함에 있어서 훨씬 더 민감한 구조 예측을 이용하여 수행된다. 사실, HHpred의 감도는 현재 이용가능한 구조 예측을 위한 가장 강력한 서버와 경쟁력이 있다. HHpred는 프로파일 은닉 마코프 모델 (hidden Markov model:HMM)의 쌍별 비교에 기반한 제1 서버이다. 대부분의 통상의 서열 검색 방법은 UniProt 또는 NR과 같은 서열 데이터베이스를 검색하는데 반해, HHpred는 Pfam 또는 SMART와 같은 정렬 데이터베이스를 검색한다. T이것은 단일 서열의 클러터 (clutter) 대신에 다수의 서열 패밀리에 대한 히트 목록을 상당히 단순화시킨다. 모든 주요한 공공으로 입수가능한 프로파일 및 정렬 데이터베이스는 HHpred를 통해 이용가능하다. HHpred는 입력치로서 단일 문의 서열 또는 다수 정렬을 수용한다. 단지 수분 내에, 이는 검색 결과를 PSI-BLAST의 것과 유사한 읽기 쉬운 형식으로 되돌린다. 검색 옵션은 국소 또는 전체 정렬 및 2차 구조 유사성 채점을 포함한다. HHpred는 쌍별 문의-주형 서열 정렬, 병합 문의-주형 다중 정렬 (예를 들어, 추이적 검색)을 비롯하여, HHpred 정렬로부터 MODELLER 소프트웨어를 통해 계산된 3D 구조 모델을 생성시킬 수 있다.
특수화된 시스템
TnpB 폴리펩티드는 데드 형태일 수 있고, 예를 들어, 뉴클레아제 또는 닉카제 활성을 갖지 않는다. 일 구현예에서, 시스템은 하나 이상의 기능성 도메인, 예를 들어, 뉴클레오티드 데아미나제, 역전사효소, 비-LTR 레트로트랜스포존 (및 코딩된 단백질), 폴리머라제, 다양성 생성 구성요소 (및 코딩된 단백질) 및 인테그라제를 더 포함한다. 일례에서, 시스템은 하나 이상의 도너 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다. 도너 폴리뉴클레오티드는 시스템에 의해서 표적 폴리뉴클레오티드에 삽입될 수 있다. 도너 폴리뉴클레오티드는 핵산 주형에 포함될 수 있거나 또는 그에 의해 코딩될 수 있다.
TnpB 염기 편집 시스템
본 개시는 또한 염기 편집 시스템을 제공한다. 일반적으로, 이러한 시스템은 TnpB 폴리펩티드와 연합 (예를 들어, 융합)된 핵염기 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제 또는 시티딘 데아미나제)를 포함할 수 있다. TnpB 폴리펩티드는 촉매적으로 불활성일 수 있거나, 또는 데드 TnpB 폴리펩티드, dTnpB일 수 있다. 일정 예에서, 핵염기 데아미나제는 아데노신 데아미나제의 돌연변이된 형태이다. 아데노신 데아미나제의 돌연변이된 형태는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제 활성 둘 모두를 가질 수 있다.
일례에서, 본 개시는 dTnpB, dTnpB와 연합되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 핵염기 데아미나제, 및 TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 편집하려는 단일뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍에서 또는 인접하여 표적 서열에서 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA를 포함하는 조작된, 비-천연 발생 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 뉴클레오티드 데아미나제 또는 다른 편집 효소는 DNA 내에서 표적 염기를 뒤집는다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Hong and Cheng et al., DNA Base Flipping: A general Mechanism for Writing Reading and Erasing DNA Modifications, Adv. Exp Med Biol., 2016:945:321-341, doi:10.1007/978-3-316-43624-1_14. 이론에 국한하지 않지만, 표적에 결합된 TnpB-ωRNA 복합체는 예를 들어, CRISPR-Cas 단백질, 예를 들어, Cas9, Cas12에 대해서 보다 개방된 포켓을 제공하여서, 유리하게 복합체에 대해 더 많은 접근성 및 데아미나제 또는 다른 염기 편집화 효소에 의한 표적 뉴클레오티드의 염기 플립핑을 제공하여, 입체 방해를 감소시키고 염기 편집화 시스템의 특이성을 증강시키는 것을 가능하게 만든다.
일 양태에서, 염기 편집은 TAM의 말단으로부터 약 2 내지 100 염기쌍, 또는 TAM의 말단으로부터 약 4 내지 100, 50 내지 100, 6, 내지 100, 7 내지 100, 8 내지 100, 9. 내지 100, 10, 내지 100, 11 내지 100, 12 내지 100, 13 내지 100, 14 내지 100, 15 내지 100, 16 내지 100, 17 내지 100, 18 내지 100, 18 내지 100, 19 내지 100, 20 내지 100, 25 내지 100, 3 내지 90, 3 내지 80, 3 내지 70, 3 내지 60, 3 내지 50, 3 내지 40, 3 내지 30, 또는 약 3 내지 30 염기쌍을 표적화할 수 있다. 일 양태에서, 염기 편집자가 TnpB에 융합될 때, 링커 길이는 원하하는 위치에서 보다 정확한 염기 편집을 허용하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 상술된 바와 같이, 링커 길이는 TAM에 더 가깝거나 또는 더 멀리서 염기 편집을 촉진하도록 조율될 수 있고, 결합 부위에서 원하는 구성 또는 표현을 생성시키도록 강성 및 다른 성질을 증가시키거나 또는 감소시키도록 구성될 수 있다. TnpB 복합체의 결합 포켓에서 보다 개방된 구성은 표적 부위로 접근의 특이성 및 TnpB 편집 시스템의 구성에서 더 많은 유연성을 허용할 수 있다.
일 양태에서, 본 개시는 조작된 아데노신 데아미나제를 제공한다. 조작된 아데노신 데아미나제는 그에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 조작된 아데노신 데아미나제는 시티딘 데아미나제 활성을 갖는다. 일정 예에서, 조작된 아데노신 데아미나제는 시티딘 데아미나제 활성 및 아데노신 데아미나제 둘 모두를 갖는다. 일부 경우에, 본 명세서의 염기 편집자에 의한 변형은 번역후 신호전달 또는 촉매 반응을 표적화하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서의 조성물은 염기 편집 시스템의 하나 이상의 성분을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 염기-편집 시스템은 TnpB 폴리펩티드 또는 이의 변이체와 융합된 데아미나제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제 또는 시티딘 데아미나제)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 G→A 또는 C→T 돌연변이를 도입하도록 하나 이상의 염기에서 편집된다.
일부 경우에, 아데노신 데아미나제는 이중-가닥 RNA-특이적 아데노신 데아미나제 (ADAR)이다. ADAR의 예는 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Yiannis A Savva et al., The ADAR protein family, Genome Biol. 2012; 13(12): 252. 일부 예에서, ADAR은 hADAR1일 수 있다. 일정 예에서, ADAR은 hADAR2일 수 있다. hADAR2의 서열은 등록 번호 AF525422.1 하에 기술된 것일 수 있다.
일부 경우에, 데아미나제는 데아미나제 도메인, 예를 들어, ADAR의 데아미나제 도메인 ("ADAR-D")일 수 있다. 일례에서, 데아미나제는 예를 들어, 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 하기 문헌에 기술된 바와 같은 hADAR2의 데아미나제 도메인 ("hADAR2-D)일 수 있다: Phelps KJ et al., Recognition of duplex RNA by the deaminase domain of the RNA editing enzyme ADAR2. Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(2):1123-32. 특정 예에서, hADAR2-D 는 hADAR2-D의 아미노산 299-701, 예를 들어, 등록 번호 AF525422.1 하의 서열의 아미노산 299-701을 포함하는 서열을 갖는다.
일정 예에서, 시스템은 dTnpB와 융합된 아데노신 데아미나제의 돌연변이된 형태를 포함한다. 아데노신 데아미나제의 돌연변이된 형태는 아데노신 데아미나제 및 시티딘 데아미나제 활성 둘 모두를 가질 수 있다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, S495N, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, S495N, K418E, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, S495N, K418E, S661T, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이. 일부 예에서, 본 명세서에서 제공하는 것인 돌연변이된 아데노신 데아미나제, 예를 들어, 데드 TnpB 폴리펩티드 또는 TnpB 폴리펩티드 닉카제와 융합된, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, S495N, K418E, S661T 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 아데노신 데아미나제를 포함한다. 일부 예에서, 본 명세서에서 제공하는 것은 돌연변이된 아데노신 데아미나제, 예를 들어, 데드 TnpB 폴리펩티드 또는 TnpB 폴리펩티드 닉카제와 융합된, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, S495N, K418E, 및 S661T를 포함하는 아데노신 데아미나제를 포함한다. 일례에서, 본 명세서에서 제공하는 것은 돌연변이된 아데노신 데아미나제, 예를 들어, 데드 TnpB 폴리펩티드 또는 TnpB 폴리펩티드 닉카제와 융합된, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, S495N, K418E, S661T, 및 S375N을 포함하는 아 데노신 데아미나제를 포함한다.
일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 tRNA-특이적 아데노신 데아미나제 또는 이의 변이체일 수 있다. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, W23L, W23R, R26G, H36L, N37S, P48S, P48T, P48A, I49V, R51L, N72D, L84F, S97C, A106V, D108N, H123Y, G125A, A142N, S146C, D147Y, R152H, R152P, E155V, I156F, K157N, K161T, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, D108N 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, D147Y, E155V, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, A142N, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, A142N, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, W23R, P48A, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, W23R, P48A, A142N, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, W23R, P48A, R152P, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이. 일 구현예에서, 아데노신 데아미나제는 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함할 수 있다: 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로, A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, W23R, P48A, R152P, A142N, 및 상기에 상응하는 상동성 데아미나제 단백질의 돌연변이.
일례에서, 염기 편집 시스템은 염기 편집자의 생체내 전달을 가능하게 하는 인테인-매개 트랜스-스플라이싱 시스템, 예를 들어, 트랜스-스플라이싱되도록 조작된, 분할-인테인 시티딘 염기 편집자 (CBE) 또는 아데닌 염기 편집자 (ABE)를 포함할 수 있다. 이러한 염기 편집 시스템의 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Colin K.W. Lim et al., Treatment of a Mouse Model of ALS by In Vivo Base Editing, Mol Ther. 2020 Jan 14. pii: S1525-0016(20)30011-3. doi: 10.1016/j.ymthe.2020.01.005; 및 Jonathan M. Levy et al., Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses, Nature Biomedical Engineering volume 4, pages97-110(2020) (이들 전문이 참조로 본 명세서에 편입되고, TnpB 폴리펩티드에 적합화하여 사용될 수 있음).
염기 편집 시스템의 예는 하기 문헌들에 기술된 것들을 포함하고, 그들 전체는 참조로 본 명세서에 편입되고, TnpB 폴리펩티드에 대해 적합화되도록 사용될 수 있다: 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/071048 (예를 들어, 단락 [0933]-[0938]), WO 2019/084063 (예를 들어, 단락 [0173]-[0186], [0323]-[0475], [0893]-[1094]), WO 2019/126716 (예를 들어, 단락 [0290]-[0425], [1077]-[1084]), WO 2019/126709 (예를 들어, 단락 [0294]-[0453]), WO 2019/126762 (예를 들어, 단락 [0309]-[0438]), WO 2019/126774 (예를 들어, 단락 [0511]-[0670]), Cox DBT, et al., RNA editing with CRISPR-Cas13, Science. 2017 Nov 24;358(6366):1019-1027; Abudayyeh OO, et al., A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing, Science 26 Jul 2019: Vol. 365, Issue 6451, pp. 382-386; Gaudelli NM et al., Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage, Nature volume 551, pages 464-471 (23 November 2017); Komor AC, et al., Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4; Jordan L. Doman et al., Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors, Nat Biotechnol (2020). doi.org/10.1038/s41587-020-0414-6; and Richter MF et al., Phage-assisted evolution of an adenine base editor with improved Cas domain compatibility and activity, Nat Biotechnol (2020). doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z.
TnpB 프라임 편집 시스템
일 구현예에서, 본 개시는 조성물 및 시스템을 제공하고, 이들은 TnpB 또는 dTnpB, 하나 이상의 핵산 성분, 및 역전사효소를 포함할 수 있다. 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드에 도너 폴리뉴클레오티드를 삽입시키는데 사용될 수 있다. 일례에서, 조성물 또는 시스템은 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드, TnpB 폴리펩티드와 연합되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 역전사효소, 및 TnpB 폴리펩티드와 복합체를 형성할 수 있고 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 대한 복합체의 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 핵산 성분 분자를 포함하고, 핵산 성분 분자는 역전사효소에 의해서 표적 폴리뉴클레오티드로 도너 서열의 삽입을 위한 주형으로서 기능하는 도너 주형을 더 포함한다.
일부 경우에, TnpB 또는 dTnpB는 닉카제, 예를 들어 DNA 닉카제일 수 있다. TnpB 닉카제는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일례에서, TnpB는 RuvC 뉴클레아제의 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일례에서, TnpB는 천연적으로 촉매적 불활성이고, 뉴클레아제 도메인, 예를 들어 HNH 또는 FokI 도메인과의 융합을 포함한다
역전사효소 도메인은 역전사효소 또는 이의 단편일 수 있다. 일정 양태에서, 역전사효소는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) RT, 조류 근아세포증 바이러스 (AMV) RT, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 (M-MLV) RT, 그룹 II 인트론 RT, 그룹 II 인트론-유사 RT, 또는 키메라 RT이다. 일정 구현예에서, RT는 이들 RT의 변형된 형태, 예컨대, 조류 근아세포증 바이러스 (AMV) RT, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 (M-MLV) RT, 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) RT의 조작된 변이체를 포함한다 (참조: 예를 들어, Anzalone, et al., Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA, Nature. 2019 Dec; 576(7785):149-157).
일례에서, 조성물 및 시스템은 본 명세서의 TnpB 단백질; TnpB 단백질과 연결되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 역전사효소 (RT) 폴리펩티드; 및 TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 대한 TnpB 복합체의 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 것인 ωRNA 서열; 표적 폴리뉴클레오티드의 절단된 상류 가닥에 결합할 수 있는 3' 결합 부위 영역; 및 연장된 서열을 코딩하는 RT 주형 서열을 포함하는 것인 ωRNA 분자를 포함할 수 있고, 연장된 서열은 변이체 영역 및 표적 폴리뉴클레오티드의 하류 절단된 가닥에 혼성화할 수 있는 3' 상동성 서열을 포함한다.
광범위하게 다양한 역전사효소 (RT)는 원핵생물 및 진핵생물 RT를 포함하여, 본 발명의 대안적인 구현예에서 사용될 수 있고, 단 RT는 RNA 주형으로부터 도너 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하도록 숙주 내에서 기능한다. 바람직하다면, 천연 RT의 뉴클레오티드 서열은, 원하는 숙주 내에서 발현이 최적화되도록, 기지의 코돈 최적화 기술을 사용하여, 변형될 수 있다. 역전사효소 (RT)는 역전사라고 불리는 과정인, RNA 주형으로부터 상보성 DNA (cDNA)를 생성시키는데 사용되는 효소이다. 역전사효소는 그들 게놈을 복제하기 위해 레트로바이러스에 의해서, 숙주 게놈 내에서 증식하기 위해 레트로트랜스포존 이동성 유전자 구성요소에 의해서, 그들 선형 염색체의 말단에서 텔로미어를 연장하기 위해 진핵생물 세포에 의해서, 일부 비-레트로바이러스 예컨대 dsDNA-RT 바이러스인, 헤파드나비리다에 구성원인, B형 간염 바이러스에 의해 사용된다. 레트로바이러스 RT는 다음의 3가지 순차적 생화학적 활성을 갖는다: RNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성, 리보뉴클레아제 H, 및 DNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성. 집합적으로, 이들 활성은 효소가 단일-가닥 RNA를 이중-가닥 cDNA로 전환시킬 수 있게 한다. 일 구현예에서, 역전사효소의 RT 도메인은 본 발명에서 사용된다. 도메인은 오직 RNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성만을 포함할 수 있다. 일례에서, RT 도메인은 비-돌연변이원성이고, 다시 말해서, 도너 폴리뉴클레오티드에서 돌연변이를 유발하지 않는다 (예를 들어, 역전사효소 과정 동안). 일부 경우에, 일례에서, RT 도메인은 비-레트론 RT, 예를 들어, 바이러스 RT 또는 인간 내생성 RT 일 수 있다. 일부 예에서, RT 도메인은 레트론 RT 또는 DGR RT 일 수 있다. 일례에서, RT 는 대응물 야생형 RT에 비해서 덜 돌연변이원성일 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 RT 는 돌연변이원성이 아니다.
역전사효소는 TnpB의 C-말단에 융합될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 역전사효소는 TnpB의 N-말단에 융합될 수 있다. 융합은 링커 및/또는 어댑터 단백질을 통할 수 있다. 일부 예에서, 역전사효소는 M-MLV 역전사효소 또는 이의 변이체일 수 있다. M-MLV 역전사효소 변이체는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, M-MLV 역전사효소는 D200N, L603W, 및 T330P를 포함할 수 있다. 다른 예에서, M-MLV 역전사효소는 D200N, L603W, T330P, T306K, 및 W313F를 포함할 수 있다. 특정 예에서, TnpB 폴리펩티드 및 역전사효소의 융합은 M-MLV 역전사효소와 융합된 돌연변이 (D200N+L603W+T330P+T306K+W313F)를 갖는 TnpB 폴리펩티드이다.
본 명세서의 TnpB 폴리펩티드의 소형 크기는 예를 들어, 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여, 프라임 편집 시스템의 보다 쉬운 패키징 및 전달을 허용할 수 있다. 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는, 하기 문헌을 참조하고, 특히 표 1을 참조하고, CRISPR 전달 접근법에 대해서 참조로 본 명세서에 편입된다: Lino et al. Drug Deliv. 2018; 25(1): 1234-1257; doi: 10.1080/10717544.2018.1474964.
단일-가닥 파손 (닉)은 표적 부위에서 TnpB 폴리펩티드에 의해서 표적 DNA 상에 생성될 수 있어서 3'-히드록실 기를 노출시키고, 따라서 표적 부위로 직접적으로 핵산 성분 분자 상에서 편집-코딩된 연장부의 역전사를 프라이밍한다. 이들 단계는 다음의 2개의 중복 단일-가닥 DNA 플랩을 갖는 분지형 중간체를 생성시킬 수 있다: 미편집된 DNA 서열을 함유하는 5' 플랩, 및 핵산 성분으로부터 카피된 편집 서열을 함유하는 3' 플랩. 5' 플랩은 구조-특이적 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 후행-가닥 DNA 합성 및 긴-패치 염기 절제 복구 동안 생성된 5' 플랩을 절제하는 FEN122에 의해 제거될 수 있다. 비-편집 DNA 가닥은 비-편집 가닥을 우선적으로 치환하도록 편향 DNA 복구를 유도하기 위해 닉형성할 수 있다. 프라임 편집 시스템 및 방법의 예는 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Anzalone AV et al., Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA, Nature. 2019 Oct 21. doi: 10.1038/s41586-019-1711-4.
TnpB (예를 들어, 닉카제 형태)는 표적 DNA, 상에서 단일 뉴클레오티드를 프라임-편집하는데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, TnpB 폴리펩티드는 표적 DNA 상에서 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 또는 적어도 1000 뉴클레오티드를 프라임-편집하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 프라임 편집은 더 긴 3' 영역 (예를 들어, 20 뉴클레오티드)을 생성시키는데 먼저 사용된다. 프라임 편집 시스템 및 방법의 예는 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Anzalone AV et al., Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA, Nature. 2019 Oct 21. doi: 10.1038/s41586-019-1711-4. 이러한 경우에, 시스템은 닉카제 활성, 역전사효소 도메인, 및 DNA 폴리머라제를 갖는 TnpB 단백질, 및 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 결합 서열 및 편집 서열을 포함하는 ωRNA 분자를 포함한다. 생성된 영역은 본 명세서에 기술된 바와 같이 DNA 주형 상에서 추가로 연장될 수 있다. 후자는 일반 도너 서열과 호환가능한, 표적-독립적 서열의 생성을 허용할 수 있다.
TnpB 단백질은 표적 서열에서 제1 절단 및 표적 폴리뉴클레오티드 상에서 표적 서열 밖의 제2 절단을 생성시킬 수 있다. 일부 변형에서, 표적 부위 부근에서 제2 TnpB-매개 절단을 만들 수 있고, 이것은 연장된 DNA의 보다 효율적인 침입을 가능하게 할 수 있다.
일례에서, 본 명세서의 TnpB 단백질의 조성물 및 시스템은 TnpB 단백질과 연결되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 역전사효소 (RT) 폴리펩티드; TnpB 단백질과 제1 TnpB-역전사효소 복합체를 형성할 수 있고, 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 대한 제1 TnpB-역전사효소 복합체의 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 서열; 표적 폴리뉴클레오티드의 절단 또는 닉형성 가닥에 결합할 수 있는 제1 결합 부위 영역; 및 제1 연장된 서열을 코딩하는 RT 주형 서열을 포함하는 것인 제1 ωRNA 분자; TnpB 단백질과 제2 TnpB-역전사효소 복합체를 형성할 수 있고, 표적 폴리뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 대한 제2 TnpB-역전사효소 복합체의 부위 특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 서열; 표적 폴리뉴클레오티드의 절단 또는 닉형성 가닥에 결합할 수 있는 제2 결합 부위 영역; 및 제2 연장된 서열을 코딩하는 RT 주형 서열을 포함하는 것인 제2 ωRNA 분자를 포함한다.
일부 경우에, 조성물 및 시스템은 도너 주형; TnpB 단백질과 TnpB-역전사효소 복합체-ωRNA를 형성할 수 있고, 도너 주형 상의 표적 서열에 대한 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 서열; 도너 주형의 절단 또는 닉형성 가닥에 결합할 수 있는 제3 결합 영역; 및 표적 폴리뉴클레오티드 상에 생성된 제1 연장 영역에 상보성인 제3 연장 영역을 코딩하는 RT 주형을 포함하는 제3 ωRNA 서열; 및 TnpB 단백질과 TnpB-역전사효소 복합체를 형성할 수 있고, 도너 주형 상에서 제2 표적 서열에 대한 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 서열; 도너 주형의 절단 또는 직형성 가닥에 결합할 수 있는 제4 결합 영역; 및 표적 폴리뉴클레오티드 상에 생성된 제2 연장 영역에 상보성인 제4 연장 영역을 코딩하는 RT 주형을 포함하는 제4 ωRNA 서열을 더 포함할 수 있다.
유리하게, CRISPR-Cas 효소에 대한 TnpB 복합체의 보다 개방된 구성은 표적 부위에 상보성인 서열을 비롯하여, RT 주형 서열 및 역전사효소에 대한 개선된 접근성을 허용할 수 있어서, 표적 부위에서 편집 효율을 증가시킬 수 있다. 추가로, TnpB의 더 작은 최소 크기는 하기에 추가로 상술되는 바와 같이, 역전사효소에 의한 전달을 위해 증가된 패키징 효율, 추가적인 ωRNA 서열의 전달을 위한 접근성을 허용하고, 이들 모두는 편집 효율을 추가로 개선시킬 수 있다.
일부 경우에, 조성물 및 시스템은 부위-특이적 리콤비나제로서, 제1 및 제2 연장된 영역이 서로 상보적이고 세린 인테그라제 재조합 부위를 도입하는 것인 리콤비나제; 및 표적 폴리펩티드에 삽입을 위한 도너 서열 및 세린 인테그라제 재조합 부위에 대한 상보적 재조합 부위를 포함하는 도너 분자를 더 포함할 수 있다.
일례에서, 조성물 및 시스템은 리콤비나제를 더 포함할 수 있다. 리콤비나제는 TnpB 단백질과 연결되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있다. 일정 구현예에서, 복합체는 역전사효소에 의해서 ωRNA 서열의 3' 연장부 상에서 재조합 부위를 코딩하는 RT 주형의 연장을 통해서 관심 DNA 유전자좌에 재조합 부위를 삽입할 수 있다. 일정 구현예에서, 호환가능한 재조합 부위를 포함하는 도너 주형은 재조합 부위에 특이적인 리콤비나제가 제공될 때 삽입된 재조합 부위와 단방향으로 재조합될 수 있는 것이 제공된다. 일정 구현예에서, 도너 주형은 상보적 재조합 부위 및 관심 DNA 유전자좌에서 삽입을 위한 임의 서열을 포함하는 플라스미드이다. 일정 구현예에서, 리콤비나제는 TnpB 효소와 연결되거나 또는 복합체를 형성할 수 있어서, 모든 효소 단백질이 관심 유전자좌에서 접촉된다. 일정 구현예에서, 리콤비나제는 진핵생물 세포에 대해 코돈 최적화된다 (본 명세서에 추가로 기술됨). 일정 구현예에서, 리콤비나제는 NLS를 포함한다 (본 명세서에 추가로 기술됨). 일정 구현예에서, 리콤비나제는 별개 단백질로서 제공된다. 별개 리콤비나제는 이량체를 형성할 수 있고 도너 주형 재조합 부위에 결합될 수 있다. 리콤비나제는 역시 리콤비나제에 의해 인식되는 호환가능한 재조합 부위의 삽입 결과로서 관심 유전자좌에 대해 표적화될 수 있다. 따라서, 리콤비나제는 관심 DNA 유전자좌에 삽입된 재조합 부위 및 도너 상의 재조합 부위를 인식할 수 있고, 리콤비나제에 대한 임의의 추가적인 변형없이 관심 DNA 유전자좌에 대해 표적화될 수 있다.
일정 구현예에서, 리콤비나제에 연결된 제2 TnpB 복합체는 관심 DNA 유전자좌에 대해 표적화된다. 일정 구현예에서, 제2 TnpB 복합체는 데드 TnpB 단백질 (본 명세서에 추가로 기술되는 dTnpB)을 포함하여서, 리콤비나제가 관심 DNA 유전자좌에 표적화되지만, 표적 서열은 추가로 절단되지 않는다. 일정 구현예에서, dTnpB는 재조합 부위의 삽입 이후에만 생성되는 서열을 표적화한다. 일정 구현예에서, 리콤비나제는 도너 주형 재조합 부위 및 삽입된 재조합 부위를 인식하여 결합한다. 일정 구현예에서, 리콤비나제는 별개 단백질로서 제공되는 리콤비나제와 이량체를 형성한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "리콤비나제"는 둘 이상의 재조합 부위 (예를 들어, 억셉터 및 도너 부위) 사이에서 재조합을 촉매하는 효소를 의미한다. 본 발명에서 유용한 리콤비나제는 특정 리콤비나제에 의해 인식되는 특이적 폴리뉴클레오티드 서열인 특이적 재조합 부위에서 재조합을 촉매한다. "단방향 리콤비나제" 또는 "인테그라제"는 그의 인식 부위가 재조합이 일어난 이후에 파괴되는 리콤비나제 효소를 의미한다. 용어 "인테그라제"는 리콤비나제의 한 유형을 의미한다. 달리 말해서, 리콤비나제에 의해 인식되는 서열은 재조합 시에 리콤비나제에 의해 인식되지 않는 것으로 변화된다. 그 결과로서, 서열이 단방향 리콤비나제에 의한 재조합을 겪으면, 리콤비나제의 계속된 존재는 이전 재조합 사건을 반전시킬 수 없다
"재조합 부위"는 본 명세서에 기술된 리콤비나제 효소에 의해 인식되는 특이적 폴리뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 2개 상이한 부위가 관여되는데 ("상보성 부위"라고 하는 재조합에 대해), 하나는 표적 핵산 (예를 들어, 진핵생물의 염색체 또는 에피솜)에 존재하고, 나머지는 표적 재조합 부위에서 통합시키려는 핵산에 있다. 용어 "attB" 및 "attP"는 본래 각각 박테리아 표적 (박테리아의 부착 부위) 및 파지 도너 (파지의 부착 부위) 유래의 부착 (또는 재조합) 부위를 의미하는 것으로서, 본 명세서에서 사용되지만, 특정 효소에 대한 재조합 부위는 상이한 명칭을 가질 수 있다. 2개 부착 부위는 몇개 염기쌍 정도로 적은 서열 동일성을 공유할 수 있다. 재조합 부위는 전형적으로 코어 또는 스페이서 영역에 의해 분리된 좌측 및 우측 팔부를 포함한다. 따라서, attB 재조합 부위는 BOB'으로 이루어지고, 여기서 B 및 B' 은 각각 좌측 및 우측 팔부이고, O는 코어 영역이다. 유사하게, attP는 POP'이고, 여기서 P 및 P'은 팔부이고, O는 역시 코어 영역이다. aatB 및 attP 부위 사이의 재조합, 및 표적에서 핵산의 부수적인 통합 시, 통합된 DNA가 측접하는 재조합 부위는 "aatL" 및 "aatR"이라고 한다. 상기 용어를 사용하여, attL 및 attR 부위는, 따라서, 각각 BOP' 및 POB'으로 이루어진다. 본 명세서의 일부 표현에서, "O"는 생략되고, attB 및 attP는, 예를 들어, 각각 BB' 및 PP'로 표시된다.
TnpB-연관된 트랜스포사제 시스템
본 명세서의 시스템 및 조성물은 TnpB, 하나 이상의 핵산 성분, 및 트랜스포사제의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 일례의 구현예에서, TnpB는 RNA-가이드된 TnpA-촉매된 전좌를 매개한다. 일례의 구현예에서, TnpB는 RNA-가이드된 Tn7-촉매된 전좌를 매개한다.
일례의 구현예에서, 트랜스포사제는 TnpA를 포함할 수 있다. 트랜스포사제는 IS200/IS605 패밀리의 Y1 트랜스포사제일 수 있는데, 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 유래 삽입 서열 (IS) IS608, 예를 들어, 데이노코쿠스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans) 유래, TnpAIS608, 예를 들어, 할라나에로비움 히드로게니포르만스 (Halanaerobium hydrogeniformans) 또는 술폴로부스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus) 유래 ISDra2 에 의해 코딩될 수 있다. 트랜스포사제의 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Barabas, O., Ronning, D.R., Guynet, C., Hickman, A.B., TonHoang, B., Chandler, M. and Dyda, F. (2008) Mechanism of IS200/ IS605 family DNA transposases: activation and transposon-directed target site selection. Cell, 132, 208-220; Sadler et al., Genes 2020, 11, 484, doi: 10.3390/genes11050484, 및 He et al., (2013) NAR, 41:5, 3302-3313. 일정 예의 구현예에서, 트랜스포사제는 단일 가닥 DNA 트랜스포사제이다. 일정 예의 구현예에서, 단일 가닥 DNA 트랜스포사제는 TnpA 또는 이의 기능성 단편이다. 일 양태에서, 삽입 부위로 호밍에 사용되는 TnpA 모티프는 TnpB의 TAM에 대해 적어도 50%, 75% 또는 100% 상보적이어서, TnpA 촉매된 전좌는 서열의 TAM 부분에서 또는 근처에서 일어날 수 있다.
일례에서, 하나 이상의 트랜스포사제 또는 트랜스포사제 서브유닛은 Tn7 트랜스포사제이거나, 또는 이로부터 유래된다. 특정 구현예에서, Tn7 또는 TN7-유사 트랜스포사제는 Tn5053 트랜스포사제일 수 있다. 예를 들어, Tn5053 트랜스포사제는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함하고, 이들 문헌은 그들 전문이 참조로 본 명헤서에 편입된다: Minakhina S et al., Tn5053 family transposons are res site hunters sensing plasmidal res sites occupied by cognate resolvases. Mol Microbiol. 1999 Sep;33(5):1059-68; 및 Partridge SR et al., Mobile Genetic Elements Associated with Antimicrobial Resistance, Clin Microbiol Rev. 2018 Aug 1;31(4)의 도 4 및 관련 텍스트. 일부 경우에, 하나 이상의 Tn5053 트랜스포사제는 TniA, TniB, 및 TniQ 중 하나 이상을 포함할 수 있다. TniA는 또한 TnsB로도 알려져 있다. TniB는 또한 TnsC로도 알려져 있다. TniQ는 또한 TnsD로도 알려져 있다. 따라서, 일 구현예에서 이들 Tn5053 트랜스포사제 서브유닛은 각각 TnsB, TnsC, 및 TnsD로서 지칭될 수 있다. 일정 경우에, 하나 이상의 트랜스포사제는 TnsB, TnsC, 및 TnsD를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 트랜스포사제는 하나 이상의 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) Tn6677 트랜스포사제일 수 있다. 일례에서, 트랜스포존은 tnsA, tnsB, 및 tnsC 유전자를 포함하는 말단 오페론을 포함할 수 있다. 트랜스포존은 tniQ 유전자를 더 포함할 수 있다. 일 구현예에서, TnsE는 트랜스포존에 부재할 수 있다.
일정 예에서, 트랜스포사제는 Mu-트랜스포사제, TniQ, TniB, 또는 이의 기능성 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일정 예에서, 트랜스포사제는 TniQ, TniB, TnpB, 또는 이의 기능성 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일정 예에서, 트랜스포사제는 rve 인테그라제, TniQ, TniB, 또는 이의 기능성 도메인 중 하나 이상을 포함한다.
일 구현예에서 시스템, 보다 특히 트랜스포사제는 rve 인테그라제를 포함하지 않는다. 일 구현예에서 시스템, 보다 특히 트랜스포사제는 Mu-트랜스포사제, TniQ, TniB, TnpB, IstB 도메인 또는 이의 기능성 도메인 중 하나 이상을 포함하지 않는다.
일정 예에서, 트랜스포사제는 Mu-트랜스포사제, TniQ, TniB, 또는 이의 기능성 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일정 예에서, 트랜스포사제는 TniQ, TniB, TnpB, 또는 이의 기능성 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일정 예에서, 트랜스포사제는 rve 인테그라제, TniQ, TniB, TnpB 도메인, 또는 이의 기능성 도메인 중 하나 이상을 포함한다.
우측 말단 서열 구성요소 또는 좌측 말단 서열 구성요소는 예시적인 Tn7 트랜스포존을 참조하여 만들어진다. 정규 Tn7의 좌측 말단 (LE) 및 우측 말단 (RE) 서열 구성요소의 일반 구조는 확립되어 있다. Tn7 말단은 일련의 22-bp TnsB-결합 부위를 포함한다. 가장 먼 TnsB-결합 부위 옆에 5'-TGT-3'/3'-ACA-5'으로 종료되는 8-bp 말단 서열이 존재한다. Tn7의 우측 말단은 ∼90-bp 우측 말단 구성요소 중에 4개의 중복 TnsB-결합 부위를 함유한다. 좌측 말단은 ∼150-bp 좌측 말단 구성요소에 분산된 3개 TnsB-결합 부위를 함유한다. TnsB-결합 부위의 개수 및 분포는 Tn7-유사 구성요소 간에 다양할 수 있다. Tn7-관련 구성요소의 말단 서열은 직접 반복 5-bp 표적 부위 중복, 말단 8-bp 서열, 및 22-bp TnsB-결합 부위를 확인하여 결정할 수 있다 (Peters JE et al., 2017). 우측 말단 서열 구성요소 및 좌측 말단 서열 구성요소를 포함한, 예시적인 Tn7 구성요소는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Parks AR, Plasmid, 2009 Jan; 61(1):1-14.
TnpB 리콤비나제/인테그라제 시스템
본 명세서의 시스템 및 조성물은 TnpB 시스템, 및 리콤비나제 또는 인테그라제 중 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 일 양태에서, TnpB는 천연적으로 촉매적 불활성이고, 부위-특이적 표적화를 제공하기 위한 하나 이상의 핵산 성분, 및 변형을 도입하기 위한 리콤비나제의 하나 이상의 성분과 함께 이용된다. 일 양태에서, TnpB 폴리펩티드는 촉매성 도메인 (예를 들어, RuvC)의 하나 이상의 잔기의 돌연변이를 통해서 또는 절두를 통해서 촉매적으로 불활성일 수 있고, 부위-특이적 표적화를 제공하기 위한 하나 이상의 핵산 성분, 및 변형을 도입하는 리콤비나제의 하나 이상의 성분과 이용된다. 일 구현예에서, 천연적으로 불활성인 TnpB는 리콤비나제, 예를 들어, 인테그라제, 및 임의로 역전사효소가 제공된다. 본 명세서의 시스템 및 조성물은 TnpB 폴리펩티드, 하나 이상의 핵산 성분, 및 인테그라제의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 일 양태에서, TnpB 폴리펩티드는 닉카제이고, 변형을 도입하는 인테그라제의 하나 이상의 성분과 함께, 부위-특이적 표적화를 제공하는 하나 이상의 핵산 성분과 이용된다. 시스템 및 조성물은 표적 폴리뉴클레오티드에 도너 폴리뉴클레오티드를 삽입시키는데 사용된다. 시스템 및 조성물은 도너 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 리콤비나제는 단방향 부위-특이적 재조합을 매개힌다. 일 구현예에서, 리콤비나제는 예를 들어, IS607　패밀리,　Tn4451, 및 박테리오파지 phiC31에 의해 코딩되는, 세린 인테그라제라고도 하는, 세린 리콤비나제 (SR)이다. 일반적으로, 하기 문헌을 참조한다: Smith MC, Thorpe HM: Diversity in the serine recombinases. Mol Microbiol. 2002, 44: 299-307. 10.1046/j.1365-2958.2002.02891.x; Li et al.,(2018)　 J. Mol. Biol. 430:21, 4401-4418.
일 구현예에서, 리콤비나제는　IS91,　헬리트론,　IS200/IS605,　크립톤, 또는 DIRS-레트로트랜스포존 패밀리에 의해 코딩되는 티로신 리콤비나제 (YR)이다. 일반적으로, 하기 문헌을 참조한다: Goodwin TJ, Butler MI, Poulter T: Cryptons: a group of tyrosine-recombinase-encoding DNA transposons from pathogenic fungi. Microbiology. 2003, 149: 3099-3109. Doi:10.1099/mic.0.26529-0; Cappello J, Handelsman K, Lodish HF: Sequence of Dictyostelium DIRS-1: an apparent retrotransposon with inverted terminal repeats and an internal circle junction sequence. Cell. 1985, 43: 105-115. 10.1016/0092-8674(85)90016-9.
일 양태에서, 리콤비나제는 조성물과 제공될 수 있는 주형, 예를 들어, 도너 올리고뉴클레오티드의 부위-특이적 통합을 제공한다. 이론에 국한하지 않고, 리콤비나제는 페이로드 크기와 독립적인 통합을 허용하고, 다수의 세포 유형에 걸처서 가닥 교환을 조정할 수 있고 재결찰할 수 있어서, 폴리뉴클레오티드의 긴 스트레치의 통합을 허용한다. 예시적인 구현예에서, 세린 리콤비나제는 PhiC31 이고, 표적은 DNA이다. 일 양태에서, phiC31 은 attP 또는 슈도attP 인식 부위를 포함하는 표적 부위의 통합을 허용한다. 예를 들어, 다음을 참조한다: systembio.com/wp-content/uploads/phiC31_productsheet-1.pdf. phiC231을 이용하는 일 구현예에서, 도너 올리고뉴클레오티드는 표적 게놈의 aatP 부위에서 부착을 촉진하는 서열에서 attB가 제공될 것이다. 리콤비나제에 대한 부착 부위에 상보적인 서열을 갖는 도너 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 유사한 접근법이 본 발명과 함께 사용을 위해 디자인될 수 있다. 참조: 예를 들어, Li et al.,(2018)　 J. Mol. Biol. 430:21, 4401-4418.
바람직한 구현예에서, 인테그라제는 역전사효소 및 인테그라제 둘 모두에 융합된 TnpB 닉카제를 사용해 삽입을 유도하여서 다양한 유전자좌에서 유전자 통합을 매개한다. 일 구현예에서, 인테그라제는 예를 들어, BxbINT에 의해 코딩되는, 세린 인테그라제이다. 일반적으로, 하기 문헌을 참조하고, 이의 전문은 참조로 본 명세서에 편입된다: Ioannidi et al., "Drag-and-drop genome insertion without DNA cleavage with CRISPR-directed integrases"; doi:10.1101/2021.11.01.466786m. Ioannidi, Gootenberg, Abudayyeh, 및 동료들은 부착 부위-함유 가이드 RNA라고 하는, AttB 착률 부위를 포함하는 가이드 RNA를 이용하는, 비-분열 및 초대 세포에서 기능성을 갖는 단일 용량의 플라스미드를 통한 전달과 PASTE (Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements)라고 하는 역전사효소 및 세린 인테그라제에 융합된 CRISPR-Cas9 닉카제를 사용한 통합이 최대 약 36 kB로 크기가 다양한, 상이한 유전자좌에 걸쳐서 삽입될 수 있는 다양한 카고 서열을 포함한, 서열을 삽입시키는데 사용된 것을 보여준다. PASTE 시스템의 추가적인 용도는 유전자 태그화, 유전자 치환, 유전자 전달, 및 단백질 생산 및 분비를 포함하였고, 이러한 접근법은 TnpB 닉카제 및 인테그라제 접근법과 사용에 고려된다. 일 양태에서, 오메가 RNA는 AttB 착륙 부위를 포함한다. 일 양태에서, 리콤비나제는 조성물과 제공될 수 있는, 주형, 예를 들어 도너 올리고뉴클레오티드의 부위-특이적 통합을 제공한다.
추가적인 거대한 세린 인테그라제는 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는, 하기 문헌에서 확인되고 기술되는 바와 같은, TnpB 폴리펩티드와 사용될 수 있다: Durrant et al., Large-scale discovery of recombinases for integrating DNA into the human genome, doi:10.1101/2021.11.05.467528. 다른 인테그라제는 BceINT, SscINT, SacINT를 포함한다. 예를 들어, 참조: Ioannidi, 2021의 도 6d, 및 도 10a.
이론에 국한하지 않고, 리콤비나제는 페이로드 크기와 독립적인 통합을 허용하고, 다수의 세포 유형에 걸처서 가닥 교환을 조정할 수 있고 재결찰할 수 있어서, 폴리뉴클레오티드의 긴 스트레치의 통합을 허용한다. 예시적인 구현예에서, 인테그라제는 BxbINT이고 표적은 DNA이다. 일 양태에서, BxbINT는 attP 또는 슈도 attP 인식 부위를 포함하는 표적 부위의 통합을 허용한다. BxbINT를 이용하는 일 구현예에서, 도너 올리고뉴클레오티드는 표적 게놈의 attP 부위에서 부착을 촉진하는 서열에서 attB가 제공될 것이다. 인테그라제에 대한 부착 부위에 상보적인 서열을 갖는 도너 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 유사한 접근법이, 본 발명, 예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은, AttP 부착 부위를 함유하는 원형 이중-가닥 DNA 주형, 또는 아데노바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 통한 거대 카고의 전달에서 사용을 위해 디자인될 수 있다. 참조: 예를 들어, Ioannidi et al., 2021의 도 1a, 1b 및 5b.
TnpB 토포이소머라제 시스템
하나 이상의 기능성 도메인은 하나 이상의 토포이소머라제 도메인일 수 있다. 토포이소머라제는 핵산 가닥의 파괴 및 연결을 통해서 DNA의 토폴로지 상태를 변형시키는 효소 클래스이다. 일부 경우에, 토포이소머라제는 전사 동안 DNA의 토폴로지 상태를 제어 및 변경시키고, 가닥이 서로를 통과하게 하여서, DNA의 토폴로지를 변셩시키는 DNA의 단일 가닥의 일시적 파괴 및 연결을 촉매하는 효소로서, DNA 토포이소머라제일 수 있다.
일 구현예에서, 토포이소머라제 도메인은 표적 폴리뉴클레오티드와 도너 폴리뉴클레오티드를 결찰시킬 수 있다. 결찰은 점성 및 블런트 말단 결찰에 의해 획득될 수 있다. 일례에서, 도너 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 오버행을 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드와 도너 폴리뉴클레오티드의 결찰 예는 TOPO 클로닝, 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: "The Technology Behind TOPO Cloning," at www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/topo/topo-resources/the-technology-behind-topo-cloning.html.
일 구현예에서, 토포이소머라제 도메인는 도너 폴리뉴클레오티드와 연합될 수 있다. 예를 들어, 토포이소머라제 도메인은 도너 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 연결된다. 일 구현예에서, 토포이소머라제 도메인은 TnpB 또는 이의 변이체와 함께, 예를 들어, 연합 (예를 들어, 융합)되어 제공될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 토포이소머라제 도메인은 TnpB 폴리펩티드와 상이한 분자 상에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 토포이소머라제 도메인은 도너 폴리뉴클레오티드와 연합될 수 있다. 예를 들어, 토포이소머라제 도메인은 도너 DNA 분자와 공유적으로 사전-로딩될 수 있다. 이러한 디자인은 오직 특이적 카고의 효율적인 결찰을 허용할 수 있다. 토포이소머라제 도메인은 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유리된 이중-가닥 DNA 말단) 상의 표적 부위에 도너 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 분자)를 결찰시킬 수 있다. 일 구현예에서, 도너 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 오버행을 가질 수 있다. 예를 들어, 오버행은 TnpB 폴리펩티드에 의해 생성되는 절단 부위에서 표적 폴리뉴클레오티드에 침입될 수 있다.
토포이소머라제의 예는 이중 가닥 핵산 분자의 단일 가닥을 절단하는 IA형 및 IB형 토포이소머라제를 포함한, I형, 및 이중 가닥 핵산 분자의 양쪽 가닥을 절단하는 II형 토포이소머라제 (예를 들어, 자이라제)를 포함할 수 있다.
IA형 및 IB 토포이소머라제는 이중 가닥 핵산 분자의 한 가닥을 절단한다. 일례에서, IA형 토포이소머라제에 의한 이중-가닥 핵산 분자의 절단은 절단 부위에서 5' 포스페이트 및 3' 히드록실을 생성시키고, IA형 토포이소머라제는 절단된 가닥의 5' 말단에 공유적으로 결합된다. IB형 토포이소머라제에 의한 이중 가닥 핵산 분자의 절단은 절단 부위에서 3' 포스페이트 및 5' 히드록실을 생성할 수 있고, IB형 토포이소머라제는 절단된 가닥의 3' 말단에 공유적으로 결합된다.
IA형 토포이소머라제의 예는 다른 IA형 토포이소머라제를 포함하여, 이. 콜라이 토포이소머라제 I, 이. 콜라이 토포이소머라제 III, 진핵생물 토포이소머라제 II, 고세균 역자이라제, 효모 토포이소머라제 III, 드로소필라 (Drosophila) 토포이소머라제 III, 인간 토포이소머라제 III, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae) 토포이소머라제 III 등을 포함한다. DNA-단백질 부가물은 5'-티미딘에 공유적으로 결합하는 효소에 의해 형성되고, 절단은 2개 티미딘 잔기 간에 발생된다.
IB형 토포이소머라제의 예는 모든 진핵생물 세포에 존재하는 핵 I형 토포이소머라제 및 백시니아 및 다른 세포 폭스바이러스에 의해 코딩되는 것들을 포함한다. 진핵생물 IB형 토포이소머라제는 인간 세포를 포함하여, 포유동물 세포, 드로소필라, 및 효모에서 발현되는 것들을 예로 들 수 있다. 바이러스 IB형 토포이소머라제는 척추동물 폭스바이러스 (백시니아, 쇼페 섬유종 바이러스, ORF 바이러스, 계두 바이러스, 및 물사마귀 바이러스), 및 곤충 폭스바이러스 (암삭타 무레이 엔토모폭스바이러스 (Amsacta moorei entomopoxvirus))에 의해 생산되는 것들을 예로 들 수 있다.
II형 토포이소머라제의 예는 박테리아 자이라제, 박테리아 DNA 토포이소머라제 IV, 진핵생물 DNA 토포이소머라제 II, 및 T-짝수 파지 코딩된 DNA 토포이소머라제를 포함한다. II형 토포이소머라제는 절단 및 결찰 활성 둘 모두를 가질 수 있다. II형 토포이소머라제의 기질 이중 가닥 핵산 분자는 II형 토포이소머라제가 절단 부위에서 한 가닥에 공유 연결을 형성할 수 있도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 송아지 흉선 II형 토포이소머라제는 5' 말단으로부터 3개의 뉴클레오티드에 위치한 5' 오목한 토포이소머라제 인식 부위를 함유하는 기질 ds 핵산 분자를 절단할 수 있으며, 그 결과 절단 부위에 대한 5'에서 3개 핵산 분자의 해리 및 ds 핵산 분자의 5' 말단에 대한 토포이소머라제의 공유 결합을 일으킨다. 또한, 이러한 II형 토포이소머라제-충전된 ds 핵산 분자와 3' 히드록실 기를 함유한는 제2 핵산 분자를 접촉 시, II형 토포이소머라제는 서열을 함께 결찰시킬 수 있고, 그 다음에 재조합 핵산 분자로부터 방출된다.
토포이소머라제의 구조적 분석은 IA형, IB형 및 II형 토포이소머라제를 포함한 각각의 특정 토포이소머라제 패밀리의 구성원이 다른 패밀리 구성원과 공통 구조적 특성을 공유한다는 것을 나타낸다. 또한, 다양한 IB형 토포이소머라제의 서열 분석은 특히 촉매성 도메인에서 구조가 매우 보존되어 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 314 아미노산 백시니아 토포이소머라제의 아미노산 81 내지 314를 포함하는 도메인은 다른 IB형 토포이소머라제와 실질적인 상동성을 공유하고, 단리된 도메인은 전체 길이 토포이소머라제와 본질적으로 동일한 활성을 갖지만, 단리된 도메인은 보다 느린 턴오버 속도 및 인식 부위에 대한 보다 낮은 결합 친화성을 갖는다. 또한, 아미노 말단 도메인 (예를 들어, 아미노산 잔기 70 및 72)에서 돌연변이된, 돌연변이체 백시니아 토포이소머라제는 전체 길이 토포이소머라제와 동일한 성질을 나타낼 수 있다. 백시니아 IB형 토포이소머라제의 돌연변이 분석은 토포이소머라제의 활성에 영향을 미치지 않고 돌연변이될 수 있는 다수의 아미노산 잔기를 밝혀주었고, 활성에 필요한 몇개 아미노산을 확인하였다. 백시니아 토포이소머라제 촉매성 도메인 및 다른 IB형 토포이소머라제 간에 공유된 높은 상동성, 및 백시니아 토포이소머라제의 상세한 돌연변이 분석의 관점에서, IB형 토포이소머라제 및 다양한 아미노산 돌연변이를 갖는 IB형 토포이소머라제의 단리된 촉매성 도메인이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있고, 따라서 본 발명의 목적을 위한 토포이소머라제로 간주된다는 것을 인식할 것이다.
다양한 토포이소머라제는 다양한 서열 특이성을 나타낸다. 예를 들어, II형 토포이소머라제는 다양한 서열에 결합할 수 있지만, 매우 특이적인 인식 부위에서 절단할 수 있다. IB형 토포이소머라제는 특이적 뉴클레오티드 서열 ("토포이소머라제 인식 부위")에 결합하여 절단하는, 부위 특이적 토포이소머라제를 포함할 수 있다. 토포이소머라제, 예를 들어, IB형 토포이소머라제에 의한 이중-가닥 핵산 분자의 절단 시, 포스포디에스테르 결합의 에너지는 토포이소머라제의 특이적 티로신 잔기와 토포이소머라제 인식 부위의 3' 뉴클레오티드 간에 포스포티로실 연결의 형성을 통해 보존된다. 토포이소머라제 절단 부위가 핵산 분자의 3' 말단 근처인 경우에, 하류 서열 (절단 부위에 대해 3')은 해리되어서, 새롭게 생성된 3' 말단에 공유 결합된 토포이소머라제를 갖는 핵산 분자를 남겨둘 수 있다.
공유적으로 결합된 토포이소머라제는 또한 역 반응, 예를 들어, 유리 5' 히드록실 기를 함유하는 핵산 분자, 및 IB형 토포이소머라제가 포스포티로실 결합을 통해 연결되는, 인식 서열의 3' 뉴클레오티드의 공유 연결을 촉매할 수 있다. 이와 같이, 재조합 핵산 분자를 생산하도록 IB형 토포이소머라제를 사용하기 위한 방법이 개발되었다. cDNA 라이브러리, 또는 제한 단편, 또는 이러한 벡터에 클로닝하려는 전단 게놈 DNA 서열을 포함하는 것과 같은 핵산 분자는 예를 들어, 포스파타제로 처리되어서 5' 히드록실 말단을 생성시킨 다음에, 히드록실 기를 함유하는 5' 말단 및 공유 결합된 토포이소머라제를 함유하는 3' 말단에서 토포이소머라제가 핵산 분자를 결찰시키도록 허용하는 조건 하에서 선형 벡터에 첨가된다.
백시니아 바이러스의 예는 이중 가닥 DNA의 부위-특이적 단일-가닥 닉형성을 비롯하여, 5' 히드록실 구동 재-결찰을 할 수 있는 314 아미노산 I형 토포이소머라제 효소를 코딩한다. 부위-특이적 I형 토포이소머라제는 바이러스 토포이소머라제 예컨대 폭스 바이러스 토포이소머라제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폭스 바이러스 토포이소머라제의 예는 쇼페 섬유종 바이러스 및 ORF 바이러스를 포함한다. 다른 부위-특이적 토포이소머라제는 당업자에게 충분히 공지되어 있고, 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다.
백시니아 토포이소머라제의 예는 듀플렉스 DNA에 결합하여 높은 수준의 서열 특이성을 나타내면서 1개 가닥의 포스포디에스테르 골격을 절단한다. 절단은 공통 펜타피리미딘 구성요소 5'-(C/T)CCTT↓ 또는 분리되기 쉬운 가닥의 관련 서열에서 일어날 수 있다. 일 구현예에서, 분리되기 쉬운 결합은 듀플렉스 DNA의 3' 말단으로부터 1 내지 12 bp 범위에 위치된다. 다른 구현예에서, 백시니아 토포이소머라제에 의한 절단가능한 복합체 형성은 절단 부위의 하류에 2개 뉴클레오티드 상류에 6개 듀플렉스 뉴클레오티드를 필요로 한다.
일례에서, 토포이소머라제는 DNA 토포이소머라제 I, 예를 들어, 백시니아 바이러스 토포이소머라제 I이다. 토포이소머라제는 도너 폴리뉴클레오티드가 사전 로딩될 수 있다. 백시니아 바이러스 토포이소머라제는 5' -OH 기를 포함하는 표적을 필요로 할 수 있다.
TnpB 가이드된 절제-전위 시스템
본 명세서에 개시된 구현예는 조작되거나 또는 비-천연 가이드된 절제-전위 시스템을 제공한다. 조작되거나 또는 비-천연 가이드된 절제-전위 시스템은 ωRNA-TnpB 시스템의 하나 이상의 성분, 예를 들어 ωRNA 스캐폴드 및 스페이서 및/또는 TnpB 폴리펩티드, 및 클래스 II 트랜스포존의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. ωRNA-TnpB 시스템의 성분은 클래스 II 트랜스포존 성분(들)을 표적 핵산 서열에 대한 레트로트랜스포존으로 유도할 수 있고, 수용 폴리뉴클레오티드로 이의 전좌를 유도할 수 있다.
예를 들어, 조작되거나 또는 비-천연 가이드된 절제-전위 시스템은 (a) 제1 TnpB 단백질; (b) 제1 TnpB 단백질과 커플링되거나 또는 달리 복합체 형성할 수 있는 제1 클래스 II 트랜스포존 폴리펩티드; (c) 제1 TnpB 단백질과 제1 ωRNA-TnpB 복합체를 형성할 수 있고 제1 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 대한 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 제1 가이드 분자; (d) 제2 TnpB 단백질; (e) 제2 TnpB 단백질과 커플링할 수 있거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 제2 클래스 II 트랜스포존 폴리펩티드; (f) 제1 TnpB 단백질과 제2 ωRNA-TnpB 복합체를 형성할 수 있고 제1 표적 폴리뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 대해 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 제2 가이드 분자; 및 (g) 제1 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제1 및 제2 TnpB 단백질, 제1 및 제2 가이드 분자, 및 제1 및 제2 클래스 II 트랜스포존 폴리펩티드와 복합체를 형성할 수 있는, 클래스 II 트랜스포존 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 조작되거나 또는 비-천연 가이드된 절제-전위 시스템은 (h) 제1 TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 대한 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 제3 가이드 분자로서, 임의로 제1 TnpB 단백질에 커플링되는 것인 제3 가이드 분자; (i) 임의로, 제3 가이드 분자를 코딩하는 제1 가이드 분자 폴리뉴클레오티드; (j) 제2 TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 대한 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 제4 가이드 분자로서, 임의로 제2 TnpB 단백질에 커플링되는 것인 제4 가이드 분자; 및 (k) 임의로, 제4 가이드 분자를 코딩하는 제2 가이드 분자 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 클래스 II 트랜스포존 폴리펩티드는 클래스 II 트랜스포존 폴리뉴클레오티드로부터 제1 표적 폴리뉴클레오티드를 절제할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 클래스 II 트랜스포존 폴리펩티드는 제2 표적 폴리뉴클레오티드에서 제1 표적 폴리뉴클레오티드를 전좌시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 표적 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 클래스 II 트랜스포존 긴 말단 반복부를 포함하지 않는다.
본 명세서에 기술된 조작되거나 또는 비-천연 가이드된 절제-전위 시스템은 클래스 II 트랜스포존 또는 클래스 II 트랜스포존 시스템을 기반으로 할 수 있다. 조작되거나 또는 비-천연 가이드된 절제-전위 시스템은 도너 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스포존이라고도 하는 제1 표적 폴리뉴클레오티드, 및 본 명세서에서 수용자 폴리뉴클레오티드라고도 하는 제2 표적 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "트랜스포존" (운반가능한 구성요소라고도 함)은 게놈에서의 위치를 다른 곳으로 이동시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 몇개 클래스의 트랜스포존이 존재한다. 트랜스포존은 레트로트랜스포존 (클래스 I 트랜스포존) 및 DNA 트랜스포존 (클래스 II 트랜스포존)을 포함한다. 일부 경우에, 레트로트랜스포존은 새로운 게놈 또는 폴리뉴클레오티드로 폴리뉴클레오티드를 운반하기 위해서 이동 (또는 전좌)되는 폴리뉴클레오티드의 전사를 요구한다. DNA 트랜스포존은 새로운 게놈 또는 폴리뉴클레오티드로 폴리뉴클레오티드를 운반하기 위해 이동 (또는 전좌)되는 폴리뉴클레오티드의 역 전사를 요구하지 않는 것이다.
임의의 적합한 트랜스포존 시스템이 사용될 수 있다. 적합한 트랜스포존 및 이의 시스템은 Sleeping Beauty 트랜스포존 시스템 (Tc1/mariner 수퍼패밀리) (참조: 예를 들어, Ivics et al. 1997. Cell. 91(4): 501-510), piggyBac (piggyBac 수퍼패밀리) (참조: 예를 들어, Li et al. 2013 110(25): E2279-E2287 and Yusa et al. 2011. PNAS. 108(4): 1531-1536), Tol2 (수퍼패밀리 hAT), Frog Prince (Tc1/mariner 수퍼패밀리) (참조: 예를 들어, Miskey et al. 2003 Nucleic Acid Res. 31(23):6873-6881) 및 이의 변이체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 클래스 II 트랜스포존 폴리펩티드는 DD[E/D] 트랜스포존 또는 트랜스포존 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서 제1 및/또는 제2 클래스 II 트랜스포존 폴리뉴클레오티드는 Tc1/mariner, PiggyBac, Frog Prince, Tn3, Tn5, hAT, CACTA, P, Mutator, PIF/Harbinger, Transib, 또는 Merlin/IS1016 트랜스포존 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 클래스 II 트랜스포존 폴리펩티드는 Tc1/mariner, PiggyBac, Frog Prince, Tn3, Tn5, hAT, CACTA, P, Mutator, PIF/Harbinger, Transib, 또는 Merlin/IS1016 트랜스포존 폴리펩티드이다.
이용할 수 있는 적합한 클래스 II 트랜스포존 시스템 및 성분은 예를 들어, 제한없이, 하기 문헌에 기술된 것들이지만, 이에 제한되지 않는다: Han et al., 2013. BMC Genomics. 14:71, doi: 10.1186/1471-2164-14-71, Lopez and Garcia-Perez. 2010. Curr. Genomics. 11(2):115-128; Wessler. 2006. PNAS. 103(47): 176000-17601; Gao et al., 2017. Marine Genomics. 34:67-77; Bradic et al. 2014. Mobile DNA. 5(12) doi:10.1186/1759-8753-5-12; Li et al., 2013. PNAS. 110(25)E2279-E2287; Kebriaei et al. 2017. Trends in Genetics. 33(11): 852-870); Miskey et al. 2003. Nucleic Acid Res. 31(23):6873-6881; Nicolas et al. 2015. Microbiol Spectr. 3(4) doi: 10.1128/microbiolspec.MDNA3-0060-2014); W.S. Reznikoff. 1993. Annu Rev. Microbiol. 47:945-963; Rubin et al. 2001. Genetics. 158(3): 949-957; Wicker et al. 2003. Plant Physiol. 132(1): 52-63; Majumdar and Rio. 2015. Microbiol. Spectr. 3(2) doi: 10.1128/microbiolspec.MDNA3-0004-2014; D. Lisch. 2002. Trends in Plant Sci. 7(11): 498-504; Sinzelle et al. 2007. PNAS. 105(12): 4715-4720; Han et al. 2014; Genome Biol. Evol. 6(7):1748-1757; Grzebelus et al. 2006; Mol. Genet. Genomics. 275(5):450-459; Zhang et al. 2004. Genetics. 166(2):971-986; Chen and Li. 2008. Gene. 408(1-2):51-63; 및 C. Feschotte. 2004. Mol. Biol. Evol. 21(9):1769-1780.
TnpB 레트로트랜스포존 시스템
본 명세서의 시스템 및 조성물은 TnpB, 하나 이상의 핵산 성분, 및 레트로트랜스포존, 예를 들어 비-LTR 레트로트랜스포존의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 레트로트랜스포존의 하나 이상의 성분은 레트로트랜스포존 단백질 및 레트로트랜스포존 RNA를 포함한다. 시스템 및 조성물은 표적 폴리뉴클레오티드로 도너 폴리뉴클레오티드를 삽입시키는데 사용될 수 있다. 시스템 및 조성물은 도너 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
일례에서, 본 개시는 TnpB 폴리펩티드, TnpB 폴리펩티드와 연합되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질; TnpB 폴리펩티드와 복합체를 형성할 수 있고 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 대해 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 단일 핵산 성분을 포함하는 조작된, 비-천연 발생 조성물을 제공한다. 조성물은 표적 폴리뉴클레오티드에 삽입을 위한 도너 폴리뉴클레오티드를 포함하고 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 2개 결합 구성요소 사이에 위치되는 도너 구성체를 더 포함할 수 있다. 일부 경우에, TnpB 폴리펩티드는 닉카제 활성을 갖도록 조작된다.
일례에서, TnpB 폴리펩티드는 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질의 N-말단에 융합된다. 일례에서, TnpB 폴리펩티드는 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질의 C-말단에 융합된다.
핵산 성분 분자는 표적화된 삽입 부위의 5' 표적 서열에 대한 융합 단백질을 유도할 수 있고, TnpB 폴리펩티드는 표적화된 삽입 부위에서 이중-가닥 파손을 생성시킨다. 핵산 성분 분자는 표적화된 삽입 부위의 3' 표적 서열에 대한 융합 단백질을 유도할 수 있고, TnpB 폴리펩티드는 표적화된 삽입 부위에서 이중-가닥 파손을 생성시킨다.
도너 폴리뉴클레오티드는 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단 프로세싱을 촉진하기 위해 폴리머라제 프로세싱 구성요소를 더 포함할 수 있다. 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, 예를 들어, DNA 폴리머라제 I일 수 있다. 일부 예에서, 폴리머라제는 RNA 폴리머라제일 수 있다.
일례에서, 도너 폴리뉴클레오티드는 도너 구성체의 5' 말단, 도너 구성체의 3' 말단, 또는 둘 모두 상의 표적 서열에 대한 상동성 영역을 더 포함한다. 일례에서, 상동성 영역은 1 내지 50, 5 내지 30, 8 내지 25, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 염기쌍 길이이다.
천연 또는 야생형 비-LTR 레트로트랜스포존은 그들 자기-동원에 필요한 단백질 기구를 코딩한다. 비-LTR 레트로트랜스포존 구성요소는 숙주 게놈으로 통합되는 DNA 구성요소를 포함한다. 이러한 DNA 구성요소는 하나 또는 2개 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 봄빅스 모리 (Bombyx mori)의 R2 구성요소는 역전사효소 (RT) 활성 및 제한 효소-유사 (REL) 도메인을 함유하는 단일 ORF를 코딩한다. L1 구성요소는 2개 ORF로서, ORF1 및 ORF2를 코딩한다. ORF1은 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 류신 지퍼 도메인 및 C-말단 핵산 결합 도메인을 함유한다. ORF2는 N-말단 무푸린/무피리미딘 엔도뉴클레아제 (APE), 중심 RT 도메인, 및 C-말단 시스테인 히스티딘 풍부 도메인을 갖는다. 비-LTR 레트로트랜스포존의 예시적인 복제 주기는 전체-길이 레트로트랜스포존 구성요소의 전사를 포함하여서 mRNA 활성 구성요소 (레트로트랜스포존 RNA)를 생성시킨다. 활성 구성요소 mRNA는 번역되어서 코딩된 레트로트랜스포존 단백질 또는 폴리펩티드를 생성시킨다. 활성 구성요소 및 레트로트랜스포존 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체가 형성되고, 이러한 RNP는 게놈으로 활성 구성요소의 통합을 촉진한다. RNA-트랜스포사제 복합체는 게놈에 닉을 형성한다. 닉 형성된 DNA의 3' 말단은 프라이머로서 제공되어서, cDNA로 트랜스포존 RNA의 역전사를 허용한다. 네번째로, 트랜스포사제 단백질은 cDNA를 게놈에 통합시킨다.
이들 시스템의 구성요소는 본 발명의 상황 내에서 작용하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 비-LTR 레트로트랜스포존 폴리펩티드는 부위-특이적 뉴클레아제에 융합될 수 있다. 비-LTR 레트로트랜스포존 폴리펩티드가 천연 레트로트랜스포존 DNA 구성요소에 결합하도록 허용하는 결합 구성요소는 표적 폴리펩티드로 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 진입을 촉진하기 위해서 도너 구성체로 조작될 수 있다.
본 발명에서, 비-LTR 레트로트랜스포존의 단백질 성분은 부위-특이적 뉴클레아제, 예를 들어, TnpB 폴리펩티드와 복합체를 형성하도록 연결될 수 있거나 또는 달리 조작될 수 있다. 레트로트랜스포존 RNA는 도너 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일정 예의 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는, 핵산 성분 분자 서열과 TnpB 폴리펩티드 복합체의 형성을 통해서, 레트로트랜스포존 복합체 (예를 들어, 레트로트랜스포존 폴리펩티드(들) 및 레트로트랜스포존 RNA)를 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열로 유도하고, 여기서 레트로트랜스포존 RNP 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드로 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 통합을 촉잰한다. 따라서, 하나 이상의 비-LTR 레트로트랜스포존 성분은 레트로트랜스포존 RNA의 결합, cDNA로 레트로트랜스포존 RNA의 역전사, 및/또는 표적 폴리뉴클레오티드로 도너 폴리뉴클레오티드의 통합을 촉진하는, 레트로트랜스포존 폴리펩티드, 또는 이의 기능 도메인을 비롯하여, 도너 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하도록 변형된 레트로트랜스포존 RNA 구성요소를 포함할 수 있다.
예시적인 비-LTR 레트로트랜스포존은 CRE, R2, R4, L1, RTE, Tad, R1, LOA, I, Jockey, CR1을 포함한다. 일례에서, 비-LTR 레트로트랜스포존은 R2이다. 다른 예에서, 비-LTR 레트로트랜스포존은 L1이다. 비-LTR 레트로트랜스포존의 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함할 수 있고, 그들 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다: Christensen SM et al., RNA from the 5' end of the R2 retrotransposon controls R2 protein binding to and cleavage of its DNA target site, Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Nov 21;103(47):17602-7; Eickbush TH et al, Integration, Regulation, and Long-Term Stability of R2 Retrotransposons, Microbiol Spectr. 2015 Apr;3(2):MDNA3-0011-2014. doi: 10.1128/microbiolspec.MDNA3-0011-2014; Han JS, Non-long terminal repeat (non-LTR) retrotransposons: mechanisms, recent developments, and unanswered questions, Mob DNA. 2010 May 12;1(1):15. doi: 10.1186/1759-8753-1-15; Malik HS et al., The age and evolution of non-LTR retrotransposable elements, Mol Biol Evol. 1999 Jun;16(6):793-805.
비-LTR 레트로트랜스포존 폴리펩티드의 예는 또한 클로노르키스 시넨시스 (Clonorchis sinensis) 또는 조노트리키아 알비콜리스 (Zonotrichia albicollis) 유래 R2를 포함한다.
비-LTR 레트로트랜스포존은 다수의 레트로트랜스포존 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, the 레트로트랜스포존 폴리펩티드는 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 비-LTR 레트로트랜스포존은 예를 들어, 이량체를 형성하는 2개 레트로트랜스포존 폴리펩티드를 포함하는, 이량체이다. 이량체 서브유닛은 직렬 융합으로 연결되거나 또는 그를 형성할 수 있다. TnpB 폴리펩티드는 이러한 복합체의 하나 이상의 서브유닛과 연합 (예를 들어, 연결)될 수 있다. 일례에서, 비-LTR 레트로트랜스포존은 2개 레트로트랜스포존 폴리펩티드의 이량체로서, 레트로트랜스포존 폴리펩티드 중 하나는 뉴클레아제 또는 닉카제 활성을 포함하고 TnpB 폴리펩티드와 연결된다.
레트로트랜스포존 폴리펩티드는 예를 들어, 도너 폴리뉴클레오티드 인식, 표적-프라이밍된 주형 인식 (TPTR)의 특이성 또는 효율을 증강시키기 위해 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 레트로트랜스포존 폴리펩티드는 도너 폴리뉴클레오티드 인식 및 TPTR을 보유하는 최소 폴리펩티드에 도달하기 위해 야생형 단백질의 도메인 또는 영역을 제거하도록 하나 이상의 절두 또는 절제를 포함할 수 있다. 일부 예의 구현예에서, 천연 엔도뉴클레아제 활성은 돌연변이되어서 엔도뉴클레아제 활성이 제거될 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 비-LTR 레트로트랜스포존 펩티드의 변형 또는 절두는 아연 핑거 영역, Myb 영역, 염기성 영역, 역전사효소 도메인, 시스테인-히스티딘 풍부 모티프, 또는 엔도뉴클레아제 도메인에 있을 수 있다.
비-LTR 레트로트랜스포존은 하나 이상의 레트로트랜스포존 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 조절 구성요소를 포함할 수 있다. 조절 구성요소는 프로모터일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 상의 조절 구성요소 및 프로모터는 본 출원 전반에 기술된 것을 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 pol2 프로모터, pol3 프로모터, 또는 T7 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 표적 서열에 상보성인 이의 서열의 적어도 일부분을 갖는 레트로트랜스포존 RNA를 코딩한다. 예를 들어, 레트로트랜스포존 RNA의 3' 말단은 표적 서열에 상보적일 수 있다. RNA는 닉형성된 표적 서열의 일부분에 상보적일 수 있다. 일 구현예에서, 레트로트랜스포존 RNA는 하나 이상의 도너 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일정 경우에, 레트로트랜스포존 RNA는 하나 이상의 도너 폴리뉴클레오티드를 코딩할 수 있다.
레트로트랜스포존 RNA는 레트로트랜스포존 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 이러한 레트로트랜스포존 RNA는 레트로트랜스포존 폴리펩티드에 대한 결합을 위한 하나 이상의 구성요소를 포함할 수 있다. 결합 구성요소의 예는 헤어핀 구조, 슈도노트 (예를 들어, 한 스템의 절반이 다른 스템의 2개 절반 사이에서 인터컬레이팅되는 적어도 2개 스템-루프 구조를 함유하는 핵산 2차 구조), 스템 루프, 및 벌지 (예를 들어, 핵산 듀플렉스 중 한 가닥 내에서 위치되는 뉴클레오티드의 쌍형성되지 않은 스트레치)를 포함한다. 일정 예에서, 레트로트랜스포존 RNA는 하나 이상의 헤어핀 구조를 포함한다. 일례에서, 레트로트랜스포존 RNA는 하나 이상의 슈도노트를 포함한다. 일정 예에서, 레트로트랜스포존 RNA는 레트로트랜스포존 폴리펩티드와 복합체를 형성하기 위한 하나 이상의 결합 구성요소 및 도너 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 결합 구성요소는 5' 말단 또는 3' 말단에 위치될 수 있다.
일 구현예에서, 레트로트랜스포존 RNA는 표적 부위에서 표적 폴리뉴클레오티드의 오버행과 혼성화할 수 있는 영역을 포함한다. 오버행은 단일 가닥 DNA의 스트레치일 수 있다. 오버행은 cDNA로 레트로트랜스포존 RNA의 적어도 일부분의 역전사를 위한 프라이머로서 기능할 수 있다. 일부 경우에, cDNA의 영역은 표적 폴리뉴클레오티드의 제2 오버행에 혼성화할 수 있다. 제2 오버행은 이중 가닥 cDNA를 생성시키기 위한 제2 가닥의 합성을 위한 프라이머로서 기능할 수 있다. cDNA는 도너 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 2개 오버행은 표적 폴리뉴클레오티드의 상이한 가닥 유래일 수 있다.
역전사효소 도메인
하나 이상의 기능성 도메인은 하나 이상의 역전사효소 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 시스템은 TnpB 단백질 또는 이의 변이체 (예를 들어, dTnpB); 역전사효소 (RT) 도메인; 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 삽입시키려는 도너 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 또는 코딩하는 RNA 주형; 및 ωRNA 분자 (즉, 재프로그래밍을 위한 스캐폴드를 포함하는 천연 단일 가이드 RNA 분자)를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 조작된 시스템을 포함한다.
역전사효소는 RNA 주형을 기반으로 단일 가닥 DNA를 생성시킬 수 있다. 단일 가닥 DNA는 비-레트론, 레트론, 또는 다양성 생성 역구성요소 (DGR)에 의해 생성될 수 있다. 일례에서, 단일 가닥 DNA는 자기-프라이밍 RNA 주형으로부터 생성될 수 있다. 자기-프라이밍 RNA 주형은 개별 프라이머의 필요없이 DNA를 생성시키는데 사용될 수 있다.
역전사효소 도메인은 역전사효소 또는 이의 단편일 수 있다. 광범위하게 다양한 역전사효소 (RT)는 원핵생물 및 진핵생물 RT를 포함하여, 본 발명의 대안적인 구현예에서 사용될 수 있고, 단 RT는 RNA 주형으로부터 도너 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하도록 숙주 내에서 기능한다. 바람직하다면, 천연 RT의 뉴클레오티드 서열은, 원하는 숙주 내에서 발현이 최적화되도록, 기지의 코돈 최적화 기술을 사용하여, 변형될 수 있다. 역전사효소 (RT)는 역전사라고 불리는 과정인, RNA 주형으로부터 상보성 DNA (cDNA)를 생성시키는데 사용되는 효소이다. 역전사효소는 그들 게놈을 복제하기 위해 레트로바이러스에 의해서, 숙주 게놈 내에서 증식하기 위해 레트로트랜스포존 이동성 유전자 구성요소에 의해서, 그들 선형 염색체의 말단에서 텔로미어를 연장하기 위해 진핵생물 세포에 의해서, 일부 비-레트로바이러스 예컨대 dsDNA-RT 바이러스인, 헤파드나비리다에 구성원인, B형 간염 바이러스에 의해 사용된다. 레트로바이러스 RT는 다음의 3가지 순차적 생화학적 활성을 갖는다: RNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성, 리보뉴클레아제 H, 및 DNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성. 집합적으로, 이들 활성은 효소가 단일-가닥 RNA를 이중-가닥 cDNA로 전환시킬 수 있게 한다. 일정 구현예에서, 역전사효소의 RT 도메인은 본 발명에서 사용된다. 도메인은 오직 RNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성만을 포함할 수 있다. 일례에서, RT 도메인은 비-돌연변이원성이고, 다시 말해서, 도너 폴리뉴클레오티드에서 돌연변이를 유발하지 않는다 (예를 들어, 역전사효소 과정 동안). 일례에서, RT 도메인은 비-레트론 RT, 예를 들어, 바이러스 RT 또는 인간 내생성 RT 일 수 있다. 일례에서, RT 도메인은 레트론 RT 또는 DGR RT 일 수 있다. 일례에서, RT 는 대응물 야생형 RT에 비해서 덜 돌연변이원성일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 RT 는 돌연변이원성이 아니다.
레트론
일정 구현예에서, 상동성 재조합을 위한 도너 주형은 역전사를 위한 자기-프라이밍 RNA 주형의 사용에 의해 생성된다. 자기-프라이밍 역 전사 시스템의 비제한적인 예는 레트론 시스템이다. 용어 "레트론"이란 분지된 RNA-연결된 단일 가닥 DNA (msDNA)의 합성을 가능하게 하는 성분 및 역전사효소를 코딩하는 유전자 구성요소를 의미한다. msDNA를 코딩하는 레트론은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 제한없이, 미국 특허 제6,017,737호; 미국 특허 제5,849,563호; 미국 특허 제5,780,269호; 미국 특허 제5,436,141호; 미국 특허 제5,405,775호; 미국 특허 제5,320,958호; CA 2,075,515이 있고, 이들 모두는 참조로 본 명세서에 편입된다.
일정 구현예에서, 역전사효소 도메인은 레트론 RT 도메인이다. 일정 구현예에서, RNA 주형은 레트론 역전사효소 도메인에 의해 인식되어서 역전사되는 레트론 RNA 주형을 코딩한다. 많은 박테리아 종에 걸쳐서 보존된, 레트론은 상대적으로 알려지지 않은 기능의 매우 효율적인 역전사 시스템이다. 레트론 시스템은 레트론 RT 단백질을 비롯하여, 각각 프라이머 및 주형 서열로서 기능하는 msr 및 msd 전사물로 이루어진다. 레트론 시스템의 모든 성분은 msr-msd 를 포함하고, 레트론 RT 단백질을 코딩하는 단일 전사물로서 단일 오픈 리딩 프레임으로부터 발현된다 (Lampson, et al., 2005, Retrons, msDNA, and the bacterial genome. Cytogenet Genome Res 110:491-499). 레트론의 msr 구성요소 ORF 는 msDNA 분자의 RNA 부분을 제공하는 한편, msd 구성요소 ORF는 msDNA 분자의 DNA 부분을 제공한다. msr-msd 영역으로부터의 1차 전사물은 msDNA를 생산하도록 주형 및 프라이머 둘 모두로서 제공된다고 여겨진다. msDNA의 합성은 이의 2'-OH 기를 사용하여 RNA 전사물의 내부 rG 잔기로부터 프라이밍된다. msd, 또는 msr의 변형은 또한 msDNA의 기능 또는 생산의 변경없이 msd 내에서 도너 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 RNA 주형의 삽입을 허용하도록 만들 수 있다. 도너 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 RNA 주형은 임의 길이일 수 있지만, 바람직하게 약 5 kb 미만의 뉴클레오티드이거나, 또는 약 2 kB 미만이거나, 또는 500 염기 미만이고, 단 msDNA 생산물이 생산된다.
TnpB 다양성 생성 역구성요소 시스템
일정 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 다양성 생성 역구성요소(들) (예를 들어, US20100041033A1에 기술된 DGR)일 수 있다. 일부 구현예에서, DGR는 이의 호밍 기전을 갖는 도너 폴리뉴클레오티드를 삽입할 수 있다. 예를 들어, DGR은 촉매적 불활성 TnpB 단백질 (예를 들어, 데드 TnpB)과 연합될 수 있고, 호밍 기전을 사용해 단일-가닥 DNA를 통합시킨다. 일례에서, DGR 은 대응물 야생형 DGR에 비해서 덜 돌연변이원성일 수 있다. 일례에서, tDGR 은 에러-프론이 아니다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 DGR은 돌연변이원성이 아니다. 비-돌연변이원성 DGR 은 야생형 DGR의 돌연변이체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "DGR" 은 다양성 생성 역구성요소 폴리뉴클레오티드 및 다양성 생성 역구성요소 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질 둘 모두를 포괄한다. 일례에서, DGR은 역전사효소 활성을 갖는 다양성 생성 역구성요소 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질일 수 있다. 일례에서, DGR 은 역전사효소 활성 및 인테그라제 활성을 갖는 다양성 생성 역구성요소 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질일 수 있다. 일부 경우에, 주형 또는 도너 폴리뉴클레오티드는 다양성 생성 역구성요소 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 일정 경우에, 주형은 예를 들어, 별개 구성체 또는 분자로서 제공되는, 다양성 생성 역구성요소 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 DGR은 또한 그룹 II 인트론 (및 코딩되는 임의의 단백질 및 폴리뉴클레오티드)을 포함할 수 있고, 이것은 전구체 RNA로부터 자기-스플라이싱되어서 절제된 인트론 라리어트 RNA를 산출한 다음에, 역 스플라이싱을 통해서 새로운 게놈 DNA 부위를 침범하는 이동성 리보자임이다. 그룹 II 인트론의 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Lambowitz AM et al., Group II Introns: Mobile Ribozymes that Invade DNA, Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Aug; 3(8): a003616.
일부 구현예에서, 다양성-생성 역구성요소 (DGR)는 이들 구성요소를 운반하는 게놈에서 표적화된, 대량 변이를 생성시킬 수 있는 유전자 구성요소이다. 일부 구현예에서, DGR 시스템은 돌연변이원성 레트로호밍이라고 불리는 과정으로, TR 영역과 유사한 가변 영역 (VR)이라고 하는 절편을 치환하기 위해서, 주형 영역 (TR)으로부터 돌연변이유발된 cDNA (A-에서-N 돌연변이 함유)를 생산하기 위한 에러-프론 역전사효소에 의존한다 (참조: 예를 들어, Sharifi and Ye, MyDGR: a server for identification and characterization of diversity-generating retroelements. Nucleic Acids Res. 2019 Jul 2; 47(W1): W289-W294). DGR 은 DNA의 서열 다양성을 생성시키는 역구성요소의 고유한 패밀리를 포함할 수 있다. 그들은 박테리아, 고세균, 파지, 및 플라스미드에 광범위하게 존재하고, 변이를 도입하고 표적 단백질의 진화를 가속화하여서 그들 숙주에게 유익하다 (참조: 예를 들어, Yan et al., Discovery and characterization of the evolution, variation and functions of diversity-generating retroelements using thousands of genomes and metagenomes. BMC Genomics. 2019; 20: 595). 제1 DGR은 보르데텔라 (Bordetella) 파지, BPP-1에서 발현되었다. 보르데텔라는 BvgAS 신호 전달 시스템에 의해 제어되는 인간 및 많은 다른 포유동물에서 호흡기 감염을 유발한다. 보르데텔라의 표면은 감염성 주기에서 동적 유전자 발현 덕분에 매우 가변적이다. 보르데텔라로 BPP-1의 침입은 파지 꼬리부 섬유 단백질 Mtd에 의존한다. 돌연변이원성 역전사 및 cDNA 통합 과정으로, DGR 은 Mtd 유전자에 다의 뉴클레오티드 치환을 유도할 수 있고, 상이한 수용체-결합 분자를 생성시키므로, BPP-1이 다양한 세포 표면을 갖는 보르데텔라에 (Bordetellae)를 침입하는 능력을 만들게 된다.
시스템은 레트로- 또는 DGR RT를 사용해 ssDNA 도너를 생성시키는데 사용될 수 있고, 이어서 TnpB 폴리펩티드를 사용하여 표적 절단 또는 닉형성 시 상동성 재조합에 의해 통합된다. 일부 구현예에서, 시스템은 DGR 및/또는 그룹-II 인트론 역전사효소를 포함할 수 있다. DGR 또는 그룹-II 인트론의 호밍 기전은 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는데 사용될 수 있다. DGR 또는 그룹-II 인트론 역전사효소는 뉴클레아제-데드 TnpB 폴리펩티드, TALE, 또는 ZF 단백질에 속박시켜서 표적 폴리뉴클레오티드로 가이드될 수 있다. 다른 구현예에서, 비-레트론/DGR 역전사효소 (예를 들어, 바이러스 RT)는 자기-프라이밍 RNA의 cDNA를 생성시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, ssDNA는 RT에 의해 생성될 수 있지만, 데드 TnpB 효소를 사용해 이를 통합시켜서, 닉형성/절단 대신에 접근가능한 R-루프를 생성시킬 수 있다.
TnpB 토포이소머라제 시스템
하나 이상의 기능성 도메인은 하나 이상의 토포이소머라제 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 변헝시키기 위한 조작된 시스템은 TnpB 단백질; 토포이소머라제 도메인; 및 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 삽입시키려는 도너 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 또는 코딩하는 핵산 주형을 포함한다. 일례에서, TnpB 단백질; 토포이소머라제 도메인; 및 핵산 주형 중 둘 이상은 복합체를 형성할 수 있다. 일부 예에서, TnpB 단백질; 토포이소머라제 도메인 중 둘 이상은 융합 단백질에 포함될 수 있다.
토포이소머라제는 핵산 가닥의 파괴 및 연결을 통해서 DNA의 토폴로지 상태를 변형시키는 효소 클래스이다. 일부 경우에, 토포이소머라제는 전사 동안 DNA의 토폴로지 상태를 제어 및 변경시키고, 가닥이 서로를 통과하게 하여서, DNA의 토폴로지를 변셩시키는 DNA의 단일 가닥의 일시적 파괴 및 연결을 촉매하는 효소로서, DNA 토포이소머라제일 수 있다.
일부 구현예에서, 토포이소머라제 도메인은 표적 폴리뉴클레오티드와 도너 폴리뉴클레오티드를 결찰시킬 수 있다. 결찰은 점성 및 블런트 말단 결찰에 의해 획득될 수 있다. 일례에서, 도너 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 오버행을 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드와 도너 폴리뉴클레오티드의 결찰의 예는 TOPO 클로닝을 포함하고, 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: "The Technology Behind TOPO Cloning," at www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/topo/topo-resources/the-technology-behind-topo-cloning.html.
일부 구현예에서, 토포이소머라제 도메인는 도너 폴리뉴클레오티드와 연합될 수 있다. 예를 들어, 토포이소머라제 도메인은 도너 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 토포이소머라제 도메인은 TnpB 단백질 (예를 들어, TnpB 단백질 또는 이의 변이체 예컨대 데드 TnpB 또는 TnpB 닉카제)과 함께, 예를 들어, 연합 (예를 들어, 융합)되어 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 토포이소머라제 도메인은 TnpB 단백질과 상이한 분자 상에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 토포이소머라제 도메인은 도너 폴리뉴클레오티드와 연합될 수 있다. 예를 들어, 토포이소머라제 도메인은 도너 DNA 분자와 공유적으로 사전-로딩될 수 있다. 이러한 디자인은 오직 특이적 카고의 효율적인 결찰을 허용할 수 있다. 토포이소머라제 도메인은 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유리된 이중 가닥 DNA 말단) 상에서 표적 부위에 도너 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 분자)를 결찰시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 도너 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 오버행을 가질 수 있다. 예를 들어, 오버행은 TnpB 단백질에 의해 생성된 절단 부위에서 표적 폴리뉴클레오티드로 침입될 수 있다.
토포이소머라제의 예는 이중 가닥 핵산 분자의 단일 가닥을 절단하는 IA형 및 IB형 토포이소머라제를 포함한, I형, 및 이중 가닥 핵산 분자의 양쪽 가닥을 절단하는 II형 토포이소머라제 (예를 들어, 자이라제)를 포함할 수 있다.
IA형 및 IB 토포이소머라제는 이중 가닥 핵산 분자의 한 가닥을 절단한다. 일례에서, IA형 토포이소머라제에 의한 이중-가닥 핵산 분자의 절단은 절단 부위에서 5' 포스페이트 및 3' 히드록실을 생성시키고, IA형 토포이소머라제는 절단된 가닥의 5' 말단에 공유적으로 결합된다. IB형 토포이소머라제에 의한 이중 가닥 핵산 분자의 절단은 절단 부위에서 3' 포스페이트 및 5' 히드록실을 생성할 수 있고, IB형 토포이소머라제는 절단된 가닥의 3' 말단에 공유적으로 결합된다.
IA형 토포이소머라제의 예는 다른 IA형 토포이소머라제를 포함하여, 이. 콜라이 토포이소머라제 I, 이. 콜라이 토포이소머라제 III, 진핵생물 토포이소머라제 II, 고세균 역자이라제, 효모 토포이소머라제 III, 드로소필라 토포이소머라제 III, 인간 토포이소머라제 III, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 토포이소머라제 III 등을 포함한다. DNA-단백질 부가물은 5'-티미딘에 공유적으로 결합하는 효소와 형성되고, 절단은 2개 티미딘 잔기 간에 발생된다.
IB형 토포이소머라제의 예는 모든 진핵생물 세포에 존재하는 핵 I형 토포이소머라제 및 백시니아 및 다른 세포 폭스바이러스에 의해 코딩되는 것들을 포함한다. 진핵생물 IB형 토포이소머라제는 인간 세포를 포함하여, 포유동물 세포, 드로소필라, 및 효모에서 발현되는 것들을 예로 들 수 있다. 바이러스 IB형 토포이소머라제는 척추동물 폭스바이러스 (백시니아, 쇼페 섬유종 바이러스, ORF 바이러스, 계두 바이러스, 및 물사마귀 바이러스), 및 곤충 폭스바이러스 (암삭타 무레이 엔토모폭스바이러스 (Amsacta moorei entomopoxvirus))에 의해 생산되는 것들을 예로 들 수 있다.
II형 토포이소머라제의 예는 박테리아 자이라제, 박테리아l DNA 토포이소머라제 IV, 진핵생물 DNA 토포이소머라제 II, 및 T-짝수 파지 코딩된 DNA 토포이소머라제를 포함한다. II형 토포이소머라제는 절단 및 결찰 활성 둘 모두를 가질 수 있다. II형 토포이소머라제의 기질 이중 가닥 핵산 분자는 II형 토포이소머라제가 절단 부위에서 한 가닥에 공유 연결을 형성할 수 있도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 송아지 흉선 II형 토포이소머라제는 5' 말단으로부터 3개의 뉴클레오티드에 위치한 5' 오목한 토포이소머라제 인식 부위를 함유하는 기질 ds 핵산 분자를 절단할 수 있으며, 그 결과 절단 부위에 대한 5'에서 3개 핵산 분자의 해리 및 ds 핵산 분자의 5' 말단에 대한 토포이소머라제의 공유 결합을 일으킨다. 또한, 이러한 II형 토포이소머라제-충전된 ds 핵산 분자와 3' 히드록실 기를 함유한는 제2 핵산 분자를 접촉 시, II형 토포이소머라제는 서열을 함께 결찰시킬 수 있고, 그 다음에 재조합 핵산 분자로부터 방출된다.
일례에서, 토포이소머라제는 DNA 토포이소머라제 I, 예를 들어, 백시니아 바이러스 토포이소머라제 I이다. 토포이소머라제는 도너 폴리뉴클레오티드가 사전 로딩될 수 있다. 백시니아 바이러스 토포이소머라는 5' -OH 기를 포함하는 표적을 필요로 할 수 있다.
TnpB 포스파타제 시스템
본 명세서에서 시스템은 포스파타제 도메인을 더 포함할 수 있다. 포스파타제는 분자 예를 들어, 핵산 예컨대 DNA로부터의 포스페이트 기를 제거할 수 있는 효소이다. 포스파타제의 예는 송아지 장내 포스파타제, 새우 알칼리 포스파타제, 남극 포스파타제, 및 APEX 알칼리 포스파타제를 포함한다.
일례에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 5'-OH 기는 포스파타제에 의해 생성될 수 있다. 5' 포스페이트 표적과 호환가능한 토포이소머라제는 안정한 로딩된 중간체를 생성시키는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드를 절단한 후 5' OH를 남기는 TnpB 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 포스파타제 도메인은 TnpB 단백질과 연합 (예를 들어, 융합)될 수 있다. 포스파타제 도메인은 표적 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에서 -OH 기를 생성시킬 수 있다. 포스파타제는 예를 들어, 별도 단백질로서, 다른 성분과 별도 벡터 상에서, 시스템의 다른 성분으로부터 분리되어, 전달될 수 있다.
TnpB 폴리머라제 시스템
본 명서세의 시스템은 폴리머라제 도메인을 더 포함할 수 있다. 폴리머라제는 핵산의 사슬을 합성하는 효소를 의미한다. 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 또는 RNA 폴리머라제일 수 있다.
일부 구현예에서, 시스템은 TnpB 단백질; DNA 폴리머라제 도메인; 및 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 삽입시키려는 도너 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 주형을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 조작된 시스템을 포함한다. 일례에서, TnpB 단백질; DNA 폴리머라제 도메인; 및 DNA 주형 중 둘 이상이 복합체를 형성할 수 있다. 일부 예에서, TnpB 단백질; DNA 폴리머라제 도메인 중 둘 이상이 융합 단백질에 포함된다. 예를 들어, TnpB 단백질 및 DNA 폴리머라제 도메인은 융합 단백질에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 시스템은 TnpB 효소 (또는 이의 변이체 예컨대 dTnpB 또는 TnpB 닉카제) 및 DNA 폴리머라제 (예를 들어, phi29, T4, T7 DNA 폴리머라제)를 포함할 수 있다. 시스템은 단일-가닥 DNA 또는 이중-가닥 DNA 주형을 더 포함할 수 있다. DNA 주형은 i) 표적 폴리뉴클레오티드 상에서 TnpB 단백질의 표적 부위에 상동성인 제1 서열, 및/또는 ii) 표적 폴리뉴클레오티드의 다른 영역에 상동성인 제2 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 주형은 합성 단일 가닥 또는 PCR-생성 DNA 분자, (임의로 변형된 뉴클레오티드에 의해 말단 보호됨), 또는 바이러스 게놈 (예를 들어, AAV)일 수 있다. 다른 구현예에서, 주형은 역전사효소를 사용해 생성된다. 시스템이 세포에 전달될 때, 세포의 내생성 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 외생성 DNA 폴리머라제는 세포에서 발현될 수 있다.
DNA 주형은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드에 의해 말단-보호되거나, 또는 바이러스 게놈의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 주형은 LNA 또는 다른 변형 (예를 들어, 3' 말단에)을 포함한다. LNA 및/또는 변형의 존재는 TnpB 단백질 절단에 의해 생성된 3' 플랩과 보다 효율적인 어닐링을 야기할 수 있다.
DNA 폴리머라제의 예는 Taq, Tne (exo-), Tma (exo-), Pfu (exo-), Pwo (exo-), 써모아나에로박터 써모히드로술푸리쿠스 (Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus) DNA 폴리머라제, 써모코쿠스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis) DNA 폴리머라제 I, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I, Taq DNA 폴리머라제 I, Tth DNA 폴리머라제 I, 바실러스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus) (Bst) DNA 폴리머라제 I, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 III, 박테리오파지 T5 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 M2 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 T7 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 phi29 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 PRD1 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 phi15 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 phi21DNA 폴리머라제, 박테리오파지 PZE DNA 폴리머라제, 박테리오파지 PZA DNA 폴리머라제, 박테리오파지 Nf DNA 폴리머라제, 박테리오파지 M2Y DNA 폴리머라제, 박테리오파지 B103 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 SF5 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 GA-1 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 Cp-5 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 Cp-7 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 PR4 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 PR5 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 PR722 DNA 폴리머라제 및 박테리오파지 L17 DNA 폴리머라제를 포함한다.
TnpB 리가제 시스템
일반적으로, 시스템은 TnpB 단백질 및 TnpB 단백질과 연합된 리가제를 포함한다. TnpB 단백질은 표적 서열에 결합할 수 있는 스페이서를 포함하는 ωRNA에 의해서 표적 서열로 동원될 수 있고, 표적 서열 상에 파손을 생성시킬 수 있다. ωRNA는 원하는 돌연변이 또는 다른 서열 구성요소를 갖는 주형 서열을 더 포함할 수 있다. 주형 서열은 핵산 분자에 돌연변이 또는 다른 서열을 도입시키기 위해 표적 서열에 결찰될 수 있다. TnpB 단백질은 핵산 분자 상에 단일-가닥 파손을 생성시키는 닉카제일 수 있고, 리가제는 단일-가닥 DNA 리가제일 수 있다. 일부 구현예에서, 시스템은 2개의 별개 ωRNA 서열과 TnpB-리가제 복합체의 쌍을 포함한다. 각각의 TnpB-리가제 복합체는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 한 가닥을 표적화할 수 있고, 함께 작용하여서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 서열을 효과적으로 변형시킬 수 있다.
일례에서, TnpB는 리가제 또는 이의 기능성 단편과 연합된다. 리가제는 TnpB에 의해 생성되는 단일-가닥 파손 (닉)을 결찰시킬 수 있다. 일정 경우에, 리가제는 TnpB에 의해 생성되는 이중-가닥 파손을 결찰시킬 수 있다. 일정 예에서, TnpB는 역전사효소 또는 이의 기능성 단편과 연합된다.
본 발명은 별개의 TnpB-리가제-ωRNA 복합체의 쌍을 사용하여 핵산 서열을 변형시키는 시스템 및 방법을 추가로 제공하고, 상기 시스템 및 방법은 (a) 리가제와 연결되거나 또는 복합체 형성하는 조작된 TnpB 단백질; (b) 제1 및 제2의 별개 TnpB-리가제 ωRNA 복합체를 형성하도록 이러한 TnpB-리가제 단백질 복합체와 복합체 형성하는 2개의 별개 ωRNA 서열; (c) 표적 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 한 가닥에 결합하는 제1 TnpB-리가제 ωRNA 복합체, 및 표적 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 다른 가닥에 결합하는 제2 TnpB-리가제-ωRNA 복합체; (d) 관심 유전자좌에 상기 복합체의 결합 시, 이펙터 단백질이 관심 표적 유전자좌에서 또는 그와 연합된 서열의 변형을 유도하여서, 2개 TnpB-리가제-ωRNA 복합체는 이중-가닥 표적 서열의 상이한 가닥 상에서 함께 작용하여 서열을 변형시키는 것을 포함한다.
TnpB-리가제-ωRNA복합체의 이러한 "쌍"을 사용하는 한가지 장점은 표적 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 관심 유전자좌에서 또는 그와 연합된 서열의 변형에서 높은 효율을 포함한다.
일부 구현예에서, TnpB 단백질은 닉카제일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 리가제는 TnpB 단백질에 연결된다. 리가제는 표적 서열에 도너 서열을 결찰시킬 수 있다. 리가제는 단일-가닥 DNA 리가제 또는 이중-가닥 DNA 리가제일 수 있다. 리가제는 TnpB 단백질의 카르복실-말단, 또는 TnpB 단백질의 아미노-말단에 융합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "리가제"는 핵산의 인접한 염기 사이의 파손 (예를 들어, 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손 ("닉"))의 연결을 촉매하는 효소를 의미한다. 예를 들어, 리가제는 5' 포스페이트 기 및 3' 히드록실 기 간에 분자 내 또는 분자간 공유 결합을 형성할 수 있는 효소일 수 있다. 용어 "결찰하다"는 뉴클레오티드간 연결의 형성을 통해서 인접한 올리고뉴클레오티드를 공유적으로 연결하는 반응을 의미한다.
DNA 리가제는 다음의 2개 일반 범주로 나뉜다: ATP-의존적 DNA 리가제 (EC 6.5.1.1), 및 NAD (+) 의존적 DNA 리가제 (EC 6.5.1.2). NAD (+) 의존적 DNA 리가제는 오직 박테리아 (및 일부 바이러스)에서 발견되는 한편, ATP-의존적 DNA 리가제는 편재성이다. ATP-의존적 DNA 리가제는 다음의 4개 클래스로 분류될 수 있다: DNA 리가제 I, II, III, 및 IV. DNA 리가제 I은 오카자키 단편을 연결하여서 DNA의 연속 가닥을 형성하고; DNA 리가제 II는 오직 비-분열 세포에서 발견되는 DNA 리가제 III의 선택적 스플라이싱 형태이고; DNA 리가제 III은 염기 절제 복구에 관여하고; DNA 리가제 IV 는 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)을 통해서 DNA 이중 가닥 파손의 복구에 관여한다. 모든 리가제 중에서, 블런트-말단, 이중 가닥 DNA 결찰을 촉진하기 위해 특히 충분히 적합한 2개 유형의 원핵생물 및 1개 유형의 진핵생물 리가제가 존재한다: 원핵생물 DNA 리가제 (T3 및 T4) 및 진핵생물 DNA 리가제 (리가제1).
일부 경우에, 리가제는 이중-가닥 핵산 (예를 들어, dsDNA, dsRNA, RNA/DNA 듀플렉스)에 특이적이다. 이중-가닥 DNA 및 DNA/RNA 하이브리드에 특이적인 리가제의 예는 T4 DNA 리가제이다. 일부 경우에, 리가제는 단일-가닥 핵산 (예를 들어, ssDNA, ssRNA)에 특이적이다. 이러한 리가제의 예는 CircLigase II이다. 일부 경우에, 리가제는 RNA/DNA 듀플렉스에 특이적이다. 일부 경우에, 리가제는 임의 조합으로 단일-가닥, 이중-가닥, 및/또는 RNA/DNA 핵산에서 작용할 수 있다.
일부 경우에, 리가제는 DNA 및 RNA 표적 둘 모두를 결찰시키는 능력을 갖는 단일 리가제인, 범-리가제일 수 있다. 리가제는 표적에 특이적 (예를 들어, DNA-특이적 또는 RNA-특이적)일 수 있다. 일부 경우에, 리가제는 임의 조합으로, DNA-특이적, RNA-특이적, 및/또는 범-리가제를 포함하는, 이중 리가제 시스템일 수 있다.
본 개시에서 사용될 수 있는 리가제의 예는 T4 DNA 리가제, T3 DNA 리가제, T7 DNA 리가제, 이. 콜라이 DNA 리가제, HiFi Taq DNA 리가제, 9° N™ DNA 리가제, Taq DNA 리가제, SplintR® 리가제 (PBCV-1 DNA 리가제 또는 콜레라 바이러스 DNA 리가제로도 알려짐), 열안정성 5' AppDNA/RNA 리가제, T4 RNA 리가제, T4 RNA 리가제2, T4 RNA 리가제2 절두형, T4 RNA 리가제2 절두형 K227Q, T4 RNA 리가제2, 절두형 KQ, RtcB 리가제 (다른 RNA에 3"-포스페이트 또는 2',3'-환형 포스페이트를 갖는 단일 가닥 RNA를 연결), CircLigase II, CircLigase ssDNA 리가제, CircLigase RNA 리가제, 또는 Ampligase® 열안정성 DNA 리가제, Taq DNA 리가제를 포함한 NAD-의존적 리가제, 써무스 필리포르미스 (Thermus filiformis) DNA 리가제, 에스케리치아 콜라이 DNA 리가제, Tth DNA 리가제, 써무스 스코토덕투스 (Thermus scotoductus) DNA 리가제 (I 및 II), 열안정성 리가제, Ampligase 열안정성 DNA 리가제, VanC-형 리가제, 9°NDNA 리가제, Tsp DNA 리가제, 및 생물탐사로 발굴된 신규 리가제; T4 RNA 리가제, T4 DNA 리가제, T3 DNA 리가제, T7 DNA 리가제, Pfu DNA 리가제, DNA 리가제 I, DNA 리가제 III, DNA 리가제 IV를 포함한 ATP-의존적 리가제, 및 생물탐사로 발귤된 신규 리가제, 및 야생형, 돌연변이체 이소폼, 및 이의 유전자 조작된 변이체를 포함한다. 특정 예에서, 리가제는
일부 구현예에서, 리가제의 예는 결찰 반응에 의한 시퀀싱 또는 합성에 의한 시퀀싱에서 사용되는 것들을 포함한다.
TnpB 헬리트론 시스템
본 명세서의 시스템 및 조성물은 TnpB 폴리펩티드, 하나 이상의 핵산 성분, 및 헬리트론의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 시스템 및 조성물은 표적 폴리뉴클레오티드에 도너 폴리뉴클레오티드를 삽입시키는데 사용될 수 있다. 시스템 및 조성물은 도너 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "헬리트론"은 진핵생물에서 유전자 단편을 포착해서 동원하는 트랜스포존으로서 인식되는, 폴리뉴클레오티드 (또는 핵산 절편)를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "헬리트론"은 엔도뉴클레아제 도메인 및 C-말단 헬리카제 도메인을 포함하는 트랜스포사제를 의미한다. 헬리트론은 롤링-써클 RNA 트랜스포존이다. 특정 구현예에서, 헬리트론은 1400 내지 약 2000 아미노산, 또는 약 1800 아미노산 다중도메인 트랜스포사제를 코딩한다. 구현예에서, 헬리트론은 전위 종결자로서 기능하도록 3' 말단 근처에 헤어핀을 포함한다. 구현예에서, 트랜스포존은 복제 개시자 (Rep) 및 DNA 헬리카제 (hel) 도메인을 포함하는 RepHel 모티프를 포함한다. 참조: Thomas J. & Pritham E. J.　helitrons, the eukaryotic rolling-circle transposable elements.　Microbiol. Spectr.　3, 893-926 (2015). 구현예에서, 헬리트론은 Rep 뉴클레아제 도메인 및 C-말단 헬리카제 도메인을 포함하고, 단일 가닥 DNA의 AT 디뉴클레오티드 사이에 합입된다. 일 양태에서, C-말단 헬리카제는 5'에서 3' 방향으로 DNA를 풀어준다. HUH 뉴클레아제 도메인은 하나 또는 2개 활성 부위 티로신 잔기를 포함할 수 있고, 구현예에서, 2 티로신 (Y2) HUH 엔도뉴클레아제 도메인이다. 헬리트론은 헬렌트론, 프로토-헬렌트론 및 헬리트론 2형 단백질을 포괄할 수 있고, 이의 구조는 [Thomas et al., 2015]의 도 1 및 3에 기술된 바와 같을 수 있고, 이를 참조로 특별히 편입시킨다. 헬리트론 또는 헬렌트론이 발견된 특정 유기체는 하기 문헌의 표 1의 것을 포함할 수 있고, 이를 참조로 본 명세서에 편입시킨다: Thomas J. & Pritham E. J.　Helitrons, the eukaryotic rolling-circle transposable elements.　Microbiol. Spectr.　3, 893-926 (2015). 유사하게, 헬리트론은 적어도 부분적으로 Rep 모티프, 및 헬리트론의 보존된 잔기를 기반으로, 특히 참조로 본 명세서에 편입되는 하기 문헌의 도 2의 정렬 서열에 따라서 확인할 수 있다: Thomas J. & Pritham E. J.　Helitrons, the eukaryotic rolling-circle transposable elements.　Microbiol. Spectr.　3, 893-926 (2015).
본 명세서에서 사용되는 용어 "헬리트론 반응"은 트랜스포사제가 표적 폴리뉴클레오티드 상의 삽입 부위에 또는 그에 인접하여 도너 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입시키는 반응을 의미한다. 삽입 부위는 헬리트론에 의해 인식되는 서열 또는 2차 구조 및/또는 도너 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입될 수 있는 표적 폴리뉴클레오티드의 삽입 모티프 서열을 함유할 수 있다.
[Grabundzija 2018]에 기술된 바와 같이, 헬리트론 말단 서열은 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 팰린드롬 서열이 선행되는 우측 말단 서열 (RTS)의 말단에 테트라뉴클레오티드, 및 좌측 말단 서열 (LTS)의 말단에 절대적으로 보존된 디뉴클레오티드를 갖는 별개의 ∼150 염기쌍 (bp) 길이 서열을 함유한다. Grabundzija et al., Nat. Commun. 2018; 9: 1278; doi:10.1035/s41467-018-03688-w.
헬리트론 말단 서열은 전위를 위한 도너 폴리뉴클레오티드를 확인하는 역할을 할 수 있다. 헬리트론 말단 서열은 전위 반응을 수행하는데 사용될 수 있는 DNA 서열일 수 있고, 말단 서열은 우측 말단 서열 및 좌측 말단 서열로서 본 명세서에서 언급될 수 있다. 도너 폴리뉴클레오티드는 헬리트론 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 좌측 말단 서열 및/또는 우측 말단 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보적인 제1 및 제2 헬리트론 인식 서열을 포함하도록 구성될 수 있다.
일 양태에서, 팰린드롬 서열은 우측 말단 서열의 상류에, 예를 들어, 우측 말단 서열 말단의 상류 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 뉴클레오티드, 또는 우측 말단 서열 말단의 상류 약 10 내지 15 뉴클레오티드, 우측 말단 서열 말단의 상류 약 10 내지 12 뉴클레오티드 또는 약 11 뉴클레오티드에 위치될 수 있다. Ivana Grabundzija, Nat Commun. 2016; 7:10716, doi:10.1038/ncomms10716 (참조로 본 명세서에 편입됨).
예시적인 헬리트론은 광범위한 식물 게놈에서 헬리트론을 확인하기 위해 사용되는 소프트웨어, 예를 들어, (EAHelitron)을 사용하여 확인할 수 있다. 참조: Hu, K., Xu, K., Wen, J.　et al.　Helitron　distribution in Brassicaceae and whole Genome　Helitron　density as a character for distinguishing plant species.　BMC Bioinformatics　20,　354 (2019). doi: 10.1186/s12859-019-2945-8 (참조로 본 명세서에 편입됨).
헬리트론은 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 헬리트론은 포유동물 게놈, 일 양태에서, 베스페르틸리오니드 (vespertilionid) 박쥐, 예를 들어, Helibat로부터 유래된다. 구현예에서, 헬리트론은 Helibat1 트랜스포존으로부터 유래된다. 구현예에서, 헬리트론은 Helraiser로서, 참조로 본 명세서에 특별히 편입되는, 보충 도 1에서 [Grabundzija, 2016]이 제공하는, 확인된 헤어핀을 비롯하여서, 좌측 말단 및 우측 말단 서열을 포함한 공통 트랜스포존의 전체 DNA 서열이다. 일 양태에서, 헬리트론은 트랜스포존의 좌측 및 우측 말단 서열이 측접된다. 일 양태에서, 좌측 말단 서열 및 우측 말단 서열은 보존된 5'-TC/CTAG-3' 모티프로 종결된다. 일 구현예에서, 헬리트론은 헤어핀 구조를 형성할 잠재성을 갖는 약 10 내지 약 35, 또는 약 5-25 bp 또는 약 19-bp-길이 팰린드롬 서열인 팰린드롬 서열을 포함할 수 있다.
이들 시스템의 구성요소는 본 발명의 상황 내에서 작용하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 헬리트론 폴리펩티드는 R-루프를 생성할 수 있는 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 융합은 임의의 적절한 링커, 예시적인 구현예에서, XTEN16에 의할 수 있다. 헬리트론 폴리펩티드가 결합하도록 허용하는 결합 구성요소, 예를 들어, 헬리트론의 우측 말단 서열 및 좌측 말단 서열에 상보적인 서열의 사용은 표적 폴리뉴클레오티드로 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 진입을 촉진하도록 도너 구성체내에 조작될 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 핵산 성분 서열과 복합체의 형성을 통해서, Isc 폴리펩티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열로 헬리트론 폴리펩티드를 유도하고, 여기서 헬리트론은 표적 폴리뉴클레오티드로 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 통합을 촉진한다.
헬리트론 폴리펩티드는 최소 폴리펩티드에 도달하도록 야생형 단백질의 도메인 또는 영역을 제거하기 위한 하나 이상의 절두 또는 절제를 포함할 수 있어서, 헬리트론이 사용되는 시스템에 따라 기능성을 변경하거나, 또는 헬리트론과 연관된 특정 활성, 즉 뉴클레아제 활성 또는 헬리카제 활성을 증강시키거나 또는 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있다.
다중화
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 다중 (직렬) 표적화 접근법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 TnpB 폴리펩티드는 활성 손실없이 하나 초과의 핵산 성분 분자를 적용할 수 있다. 이것은 본 명세서에 정의된 바와 같은 단일 효소, 시스템 또는 복합체를 사용하여, 다수 DNA 표적, 유전자 또는 유전자의 유전자좌를 표적화하기 위해 본 명세서에 정의된 바와 같은 TnpB 폴리펩티드, 시스템 또는 복합체의 사을 가능하게 할 수 있다. 핵산 성분 분자는 본 명세서에 정의된 바와 같은 보존된 뉴클레오티드 서열같은 뉴클레오티드 서열에 의해서 임의로 이격되어, 직렬로 배열될 수 있다. 상이한 핵산 성분 분자의 위치는 직렬로서, 활성에 영향을 미치지 않는다.
일 양태에서, TnpB 폴리펩티드는 직렬 또는 다중 표적화에 사용될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에서 임의의 TnpB 폴리펩티드, 복합체, 또는 조성물은 이러한 접근법에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 임의의 방법, 제품, 조성물 및 용도는 하기 추가로 상술되는 다중화 또는 직렬 표적화 접근법과 동등하게 적용가능하다. 추가 지침을 통해서, 하기 특정 양태 및 구현예가 제공된다.
일 양태에서, 본 발명은 다수 유전자의 유전자좌를 표적화하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 TnpB 폴리펩티드, 복합체 또는 시스템의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 이것은 다수 (직렬 또는 다중) 핵산 성분 분자 서열을 사용하여 확립될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 직렬 또는 다중 표적화를 위해 본 명세서에 정의되는 바와 같은 TnpB 폴리펩티드, 복합체 또는 시스템의 하나 이상의 구성요소를 사용하는 방법을 제공하고, 본 명세서의 상기 시스템은 다수 핵산 성분 분자 서열을 포함한다. 상기 서열은 뉴클레오티드 서열, 예컨대 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 보존된 뉴클레오티드 서열에 의해 분리된다.
본 명세서에 정의되는 바와 같은 TnpB 폴리펩티드, 조성물, 시스템 또는 복합체는 다수 표적 폴리뉴클레오티드를 변형하기 위한 효과적인 수단을 제공한다. 본 명세서에 정의되는 바와 같은 TnpB 폴리펩티드, 시스템 또는 복합체는 다수의 세포 유형에서 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입, 전좌, 불활성화, 활성화)을 포함하여 다양한 유용성을 갖는다. 본 발명의 명세서에서 정의되는 바와 같은 이러한 TnpB 폴리펩티드, 시스템 또는 복합체는 단일 시스템 내에서 다수 유전자의 유전자좌를 표적화하는 것을 포함하여, 예를 들어 유전자 요법, 약물 스크리닝, 질환 진단, 및 예후에서 광범위한 적용성을 갖는다.
일 양태에서, 본 개시는 이와 연합된 적어도 하나의 탈안정화 도메인을 갖는 TnpB 폴리펩티드, 및 다수 핵산 분자 예컨대 DNA 분자를 표적화하는 다수의 핵산 성분 분자를 갖는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 TnpB 폴리펩티드, 시스템 또는 복합체를 제공하고, 이에 의해 각각의 상기 다수 핵산 성분 분자는 이의 상응하는 핵산 분자, 예를 들어, DNA 분자를 특이적으로 표적화한다. 각각의 핵산 분자 표적, 예를 들어 DNA 분자는 유전자 산물을 코딩할 수 있거나 또는 유전자의 유전자좌를 포괄할 수 있다. 다수 핵산 성분 분자의 사용은 다수의 유전자의 유전자좌 또는 다수 유전자의 표적화를 가능하게 한다. 일 구현예에서 TnpB 폴리펩티드는 유전자 산물을 코딩하는 DNA 분자를 절단할 수 있다. 일 구현예에서 유전자 산물의 발현이 변경된다. TnpB 폴리펩티드 및 핵산 성분 분자는 천연적으로 함께 발생되지 않는다. 본 개시는 직렬로 배열된 핵산 성분 분자를 포함하는 핵산 성분 분자를 이해한다. 본 개시는 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된 TnpB 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 추가로 이해한다. 일 구현예에서 진핵생물 세포는 포유동물 세포, 식물 세포 또는 효모 세포이고, 보다 바람직한 구현예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 유전자 산물의 발현은 감소될 수 있다. TnpB 폴리펩티드는 각각이 세포에서 관심 게놈 유전자좌의 표적 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는, 일련의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 25, 30, 또는 30 초과의 핵산 성분 분자를 포함하는 직렬로 배열된 핵산 성분 분자를 더 포함하는, 시스템 또는 복합체의 일부를 형성할 수 있다. 일 구현예에서, 기능성 시스템 또는 복합체는 다수 표적 서열에 결합한다. 일 구현예에서, 기능성 시스템 또는 복합체는 다수 표적 서열을 편집할 수 있고, 예를 들어, 표적 서열은 게놈 유전자좌를 포함할 수 있고, 일 구현예에서, 유전자 발현의 변경이 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 기능성 시스템 또는 복합체는 기능성 도메인을 더 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 다수의 유전자 생산물의 발현을 변경 또는 변형시키기 위한 방법을 제공한다. 방법은 상기 표적 핵산, 예를 들어, DNA 분자를 함유하거나, 또는 표적 핵산, 예를 들어, DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포에 도입시키는 단계를 포함할 수 있고, 예를 들어, 표적 핵산은 유전자 산물을 코딩할 수 있거나 또는 유전자 산물의 발현을 위해 제공될 수 있다 (예를 들어, 조절 서열).
일 구현예에서, 다중 표적화에 사용되는 TnpB 폴리펩티드는 하나 이상의 기능성 도메인과 연합된다. 일부 보다 특정한 구현예에서, 다중 표적화에 사용되는 TnpB 폴리펩티드는 데드 TnpB 폴리펩티드이다. 발명자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 TnpB 폴리펩티드가 DNA:RNA 듀플렉스에 관여되는 하나 이상의 뉴클레오티드에 대한 개선되고/되거나 직접 접근을 가능하게 할 수 있다는 것을 발견하였다.
유도성 시스템
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 유도성 성분의 일부를 형성할 수 있다. 시스템의 유도성 성질은 에너지 형태를 사용하여 유전자 편집 또는 유전자 발현의 시공간적 제어를 가능하게 할 것이다. 에너지 형태는, 제한은 아니지만, 전자기선, 소리 에너지, 화학 에너지 및 열 에너지를 포함할 수 있다. 유도성 시스템의 예는 테트라사이클린 유도성 프로모터(Tet-온 또는 Tet-오프), 소형 분자 2-하이브리드 전사 활성화 시스템 (FKBP, ABA 등), 또는 광 유도성 시스템 (피토크롬, LOV 도메인, 또는 크립토크롬)을 포함한다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 서열-특이적 방식으로 전사 활성을 변화를 유도하기 위한 광 유도성 전사 이펙터 (LITE)의 일부일 수 있다. 광성분은 TnpB 폴리펩티드, 광-반응성 시토크롬 이종이량체 (예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 유래), 및 전사 활성화/억제 도메인을 포함할 수 있다. 유도성 DNA 결합 단백질 및 그들 사용 방법의 추가 예는 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 가출원 제61/736,465호 및 US 61/721,283, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/018423 A2에서 제공된다.
자기-불활성화 시스템
세포의 게놈에서 유전자의 모든 카피가 편집되면, 그 세포에서 시스템의 연속 발현은 더 이상 필요하지 않다. 실제로, 지속된 발현은 의도하지 않은 게놈 부위 등에서 오프-표적 효과의 경우에 원치않은 것이다. 따라서, 시간-제한적인 발현이 유용하게 된다. 유도성 발현은 한 접근법을 제공하지만, 추가로 출원인은 벡터 그 자체 내에서 비-코딩 핵산 성분 분자 표적 서열의 사용에 의존하는 자기-불활성화 시스템을 조작하였다. 따라서, 발현이 시작된 이후에, 시스템은 그 자신의 파괴를 일으킬 것이지만, 파괴가 완료되기 전에, 이는 표적 유전자의 게놈 복제물을 편집할 시간이 있을 것이다 (이는, 이배체 세포에서 정상의 점 돌연변이를 이용하여, 많아야 2 개의 편집물을 필요로 함). 단순하게, 자기-불활성화 시스템은 TnpB 폴리펩티드 자체에 대한 코딩 서열을 표적화하거나 또는 하기 중 하나 이상에 존재하는 고유한 서열에 상보적인 하나 이상의 비-코딩 핵산 성분 분자 표적 서열을 표적화하는 추가 RNA (예를 들어, 핵산 성분 분자)를 포함한다: (a) 비-코딩 RNA 구성요소의 발현을 구동하는 프로모터 내, (b) TnpB 폴리펩티드 유전자의 발현을 구동하는 프로모터 내, (c) TnpB 폴리펩티드 코딩 서열에서 ATG 번역 출발 코돈의 100 bp 내, (d) 바이러스 전달 벡터, 예를 들어, AAV 게놈의 반전 말단 반복부 (iTR) 내.
일부 양태에서, TnpB 폴리펩티드 출발 코돈의 하류 서열에 혼성화할 수 있는 단일 핵산 성분 분자가 제공되어서, 일정 시간 이후에 TnpB 폴리펩티드의 발현 손실이 있게 된다. 일부 양태에서, 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 코딩 또는 비-코딩 영역에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 핵산 성분 분자(들)가 제공되어서, 일정 시간 이 후에, 시스템 중 하나 이상 또는 일부 경우에 전부의 불활성화가 있게 된다. 시스템의 일부 양태에서, 이론에 국한하지 않고, 세포는 다수의 복합체를 포함할 수 있고, 복합체의 제1 서브세트는 편집하려는 게놈의 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적화할 수 있는 제1 핵산 성분 분자를 포함하고, 복합체의 제2 서브세트는 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 표적화할 수 있는 적어도 하나의 제2 핵산 성분 분자를 포함하고, 복합체의 제1 서브세트는 표적화된 게놈 유전자좌 또는 유전자좌들의 편집을 매개하고, 복합체의 제2 서브세트는 궁극적으로 시스템을 불활성화시켜서, 세포에서 추가 발현이 불활성화된다.
댜앙한 코딩 서열 (TnpB 폴리펩티드 및 핵산 성분 분자)은 단일 벡터 또는 다수 벡터에 포함될 수 있다. 예를 들어, 한 벡터 상에서 효소 및 다른 벡터 상에서 다양한 RNA 서열을 코딩하거나, 또는 한 벡터에서 효소 및 하나의 핵산 성분 분자, 및 다른 벡터 상에 나머지 핵산 성분 분자를 코딩하거나, 또는 임의의 다른 순열이 가능하다. 일반적으로, 총 하나 또는 2개의 상이한 벡터를 사용하는 시스템이 바람직하다.
다수의 벡터가 사용되는 경우에, 그들을 다른 개수, 및 이상적으로 제2 핵산 성분 분자에 대해 제1 핵산 성분 분자를 코딩하는 과량의 벡터를 사용해 전달하는 것이 가능하여서, 게놈 편집이 일어날 기회를 가질 때까지 시스템의 최종 불활성화의 지연을 보조한다.
제1 핵산 성분 분자는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 게놈 내 임의의 관심 표적 서열을 표적화할 수 있다. 제2 핵산 성분는 TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 벡터 내 서열을 표적화하여서, 벡터로부터 효소의 발현을 불활성화시킨다. 따라서, 벡터 내 표적 서열은 발현을 불활성화시킬 수 있어야 한다. 적합한 표적 서열은 예를 들어, TnpB 폴리펩티드 코딩 서열에 대한 번역 출발 코돈 근처 또는 그 내에서, 비-코딩 RNA 구성요소의 발현을 구동하는 프로모터의 비-코딩 서열 내, TnpB 폴리펩티드 유전자의 발현을 구동하는 프로모터 내, TnpB 폴리펩티드 코딩 서열에서 ATG 번역 출발 코돈의 100 bp 내, 및/또는 바이러스 전달 벡터, 예를 들어 AAV 게놈의 반전 말단 반복부 (iTR) 내에 있을 수 있다. 이 영역 근처에 이중 가닥 파손은 TnpB 폴리펩티드 코딩 서열에서 프레임 시프트를 유도할 수 있어서, 단백질 발현의 상실을 초래한다. 핵산 성분 분자를 "자기-불활성화"시키기 위한 대안적인 표적 서열은 시스템의 발현 또는 벡터의 안정화에 필요한 조절 영역/서열을 편집/불활성화시키는 것을 목적으로 한다. 예를 들어, TnpB 폴리펩티드 코딩 서열에 대한 프로모터가 파괴되면, 전사는 억제 또는 방지될 수 있다. 유사하게, 벡터가 복제, 유지 또는 안정성을 위한 서열을 포함하면, 이들을 표적화하는 것이 가능하다. 예를 들어, AAV 벡터 내에서 유용한 표적 서열은 iTR 내에 있다. 표적화하기 위한 다른 유용한 서열은 프로모터 서열, 폴리아데닐화 부위 등일 수 있다.
더 나아가서, 핵산 성분 분자가 어레이 형식으로 발현되면, 양쪽 프로모터를 동시에 표적화하는 핵산 성분 분자의 "자기-불활성화"는 TnpB 폴리펩티드 발현 구성체 내에서 부터 개재 뉴클레오티드의 절제를 일으켜서, 효과적으로 이의 완전한 불활성화를 초래한다. 유사하게, 개재된 뉴클레오티드의 절제는 핵산 성분 분자가 양쪽 ITR을 표적화하거나, 또는 둘 이상의 다른 성분을 동시에 표적화하는 경우에 일어나게 된다. 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 자기-불활성화는 시스템의 조절을 제공하기 위해서, 일반적으로 시스템과 적용가능하다. 예를 들어, 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 자기-불활성화는 본 명세서에서 설명되는 바와 같이, 돌연변이의 복구, 예를 들어, 확장 장애에 적용될 수 있다. 이러한 자기-불활성화의 결과로서 복구는 오직 일시적으로 활성일 수 있다.
"자기-불활성화" 핵산 성분 분자의 5' 말단에 비-표적화 뉴클레오티드의 첨가 (예를 들어, 1-10 뉴클레오티드, 바람직하게 1-5 뉴클레오티드)는 셧다운 전에 표적화된 게놈 유전자좌에서 편집을 보장하는 수단으로서 이의 프로세싱을 지연시키고/시키거나 이의 효율을 변형시키는데 사용될 수 있다.
자기-불활성화 AAV 시스템의 일 양태에서, 관심 게놈 서열 (예를 들어, 1-2, 1-5, 1-10, 1 -15, 1-20, 1-30)을 표적화하는 하나 이상의 핵산 성분 분자를 공발현하는 플라스미드는 조작된 ATG 출발 부위 또는 근처 (예를 들어, 5 뉴클레오티드 내, 15 뉴클레오티드 내, 30 뉴클레오티드 내, 50 뉴클레오티드 내, 100 뉴클레오티드 내)에서 TnpB 폴리펩티드 서열을 표적화하는 "자기-불활성화" 핵산 성분 분자에 의해 확립될 수 있다. U6 프로모터 영역에서 조절 서열은 또한 핵산 성분 분자에 의해 표적화될 수 있다. U6-구동된 핵산 성분 분자는 어레이 형태로 디자인될 수 있어서 다수의 핵산 성분 분자가 동시에 방출될 수 있다. 표적 조직/세포 (남은 세포)로 먼저 전달될 때 핵산 성분 분자는 TnpB 폴리펩티드 수준을 핵에서 상승시키면서 축적되기 시작한다. TnpB 폴리펩티드는 모든 핵산 성분 분자와 복합체 형성하여서 TnpB 폴리펩티드 플라스미드의 게놈 편집 및 자기-불활성화를 매개한다.
자기-불활성화 시스템의 일 양태는 1 내지 4개 이상의 상이한 핵산 성분 서열, 예를 들어, 최대 약 20 또는 약 30 서열의 단일 또는 직렬 어레이 형태의 발현이다. 각각의 개별 자기-불활성화 핵산 성분 분자 서열은 상이한 표적을 표적화할 수 있다. 이렇게 예를 들어, 하나의 키메라 pol3 전사물로부터 프로세싱될 수 있다. Pol3 프로모터 예컨대 U6 또는 H1 프로모터가 사용될 수 있다. Pol2 프로모터 예컨대 본 명세서 전반에 언급된 것들. 반전 말단 반복부 (iTR) 서열은 Pol3 프로모터 - 핵산 성분 분자(s)-Pol2 프로모터- TnpB 폴리펩티드에 측접될 수 있다.
직렬 어레이 전사물의 일 양태는 하나 이상의 핵산 성분 분자(들)가 하나 이상의 자기-불활성화 핵산 성분 분자가 시스템을 불활성화시키면서 하나 이상의 표적(들)을 편집하는 것이다. 따라서, 예를 들어, 확장 장애를 복구하기 위한 기술된 시스템은 본 명세서에 기 술된 자기-불활성화 시스템과 직접적으로 조합될 수 있다. 이러한 시스템은 예를 들어, 복구를 위한 표적 영역에 유도되는 2개 핵산 성분 분자를 비롯하여 TnpB 폴리펩티드 또는 시스템의 자기-불활성화로 유도되는 적어도 제3 핵산 성분을 가질 수 있다.
핵산 성분 분자는 제어 분자일 수 있다. 예를 들어, 그 개시가 참조로 본 명세서에 편입되는, 미국 특허 출원 공개 번호 US2015232881A1호에 기술된 바와 같이, TnpB 폴리펩티드 그 자체를 코딩하는 핵산 서열을 표적화하도록 조작될 수 있다. 일 구현예에서, 시스템 또는 조성물을 TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 표적화하도록 조작된 핵산 성분 분자만이 제공될 수 있다. 또한, 시스템 또는 조성물은 TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 표적화하도록 조작된 핵산 성분 분자를 비롯하여, TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및 임의로, 제2 핵산 성분 분자, 및 추가로, 임의로 복구 주형이 제공될 수 있다. 제2 핵산 성분은 시스템 또는 조성물의 1차 표적 (본 명세서에 정의된 바와 같은, 치료, 진단, 톡아웃 등)일 수 있다. 이러한 방식으로, 시스템 또는 조성물은 자기-불활성이다. 이것은 US2015232881A1 (WO2015070083 (A1)로도 공개됨)의 Cas와 관련하여 예시되고, 본 명세서에 개시된 TnpB 폴리펩티드, 예를 들어 TnpB 폴리펩티드에 대해 추정될 수 있다.
TnpB 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터
시본 명세서의 시스템은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드(들)는 본 명세서의 시스템의 성분, 예를 들어, TnpB 폴리펩티드, 핵산 성분(들), 기능성 도메인(들), 도너 폴리뉴클레오티드(들), 및/또는 시스템의 다른 성분의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 본 개시는 본 명세서의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 벡터 시스템을 더 제공한다. 벡터 또는 벡터 시스템은 본 명세서의 전달 섹션에 기술된 것들을 포함한다
용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 그들은 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 기지의 또는 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예이다:유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 유전자좌들 (유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 이 용어는 또한 합성 골격을 갖는 핵산-유사 구조를 포괄하고, 예를 들어, 하기 문헌들을 참조한다: Eckstein, 1991; Baserga et al., 1992; Milligan, 1993; WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, 1997; Strauss-Soukup, 1997; 및 Samstag, 1996. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예를 들어, 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형"은 당업자에 의해 이해되는 당업계의 용어이며, 이것이 돌연변이체 또는 변이체 형태와 구별되는 자연서 발생하는 대로의 유기체, 균주, 유전자 또는 특징의 통상적인 형태를 의미한다. "야생형"은 기준선일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "변이체"천연에서 발생하는 것에서 벗어난 패턴을 갖는 특성의 표현을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "비-천연 발생" 또는 "조작된"은 상호교환 가능하게 사용되며, 인간의 손의 개입을 나타낸다. 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 언급할 때, 이 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 자연계에서 천연적으로 회합되고 자연계에서 발견되는 적어도 하나의 다른 성분이 적어도 실질적으로 없다는 것을 의미한다. "상보성"은 통상의 왓슨-크릭 염기쌍 형성 또는 기타 비-전형적 유형에 의해 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성 백분율은 제2 핵산 서열과 수소 결합 (예를 들어, 왓슨-크릭 염기 쌍형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내의 잔기의 백분율을 나타낸다 (예를 들어, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보성임). 완전한 상보성"은 핵산 서열의 모든 연속 잔기가 동일한 수의 제2 핵산 서열 내의 연속 잔기와 수소 결합할 것임을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "실질적인 상보성"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 이상의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상보성 정도를 지칭하거나, 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 2개의 핵산을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는, 혼성화를 위한 "엄격한 조건"은 표적 서열에 대하여 상보성을 갖는 핵산 서열이 대개 표적 서열과 혼성화하며, 비-표적 서열에는 실질적으로 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열-의존적이며, 다수의 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 서열이 길수록, 서열이 그의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 온도가 더 높아진다. 엄격한 조건의 비제한적인 예는 하기 문헌에 상세히 기술되어 있다: Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”, Elsevier, N.Y. 폴리뉴클레오티드 서열이 언급될 때, 상보성 또는 부분 상보성 서열도 고려된다. 이들은 바람직하게 높은 엄격성 조건하에 기준 서열에 혼성화할 수 있다. "혼성화"는 하나 이상의 폴리 뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기 쌍형성, 후그스타인 (Hoogstein) 결합 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2 개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3 개 이상의 가닥, 단일의 자기 혼성화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 보다 광범위한 과정에서, 예컨대 PCR의 개시, 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오티드의 절단에서 한 단계를 구성할 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "상보물"로 지칭된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "게놈 유전자좌" 또는 "유전자좌"(복수의 유전자좌)는 염색체에서 유전자 또는 DNA 서열의 특정 위치이다. "유전자"는 유기체에서 작동하는 기능적 역할을 가진 RNA 사슬 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 RNA의 스트레치로서, 이에 따라, 살아있는 유기체에서 유전의 분자 단위를 말한다. 본 발명의 목적을 위해서, 유전자는 이러한 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하든 아니든 유전자 산물의 생성을 조절하는 영역을 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 반드시 제한되는 것은 아니지만, 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위와 같은 번역 조절 서열, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 원점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 조절 영역을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, 게놈 유전자좌의 발현" 또는 "유전자 발현"은 유전자로부터의 정보가 기능적 유전자 산물의 합성에서 사용되는 과정이다. 유전자 발현의 산물은 주로 단백질이지만, rRNA 유전자 또는 tRNA 유전자와 같은 비-단백질 코딩 유전자에서는 이 산물은 기능적 RNA이다. 유전자 발현 과정은 생존을 위한 기능적 산물들을 생성하기 위해서 모든 알려진 생명체, 즉 진핵생물 (다세포 유기체 포함), 원핵생물 (박테리아 및 고세균) 및 바이러스에 의해서 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 유전자 또는 핵산의 "발현"은 세포 유전자 발현뿐만 아니라 클로닝 시스템 및 임의의 다른 맥락에서 핵산(들)의 전사 및 번역을 포괄한다. 본 명세서에서 사용되는, "발현"은 또한 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예컨대, mRNA 또는 다른 RNA 전사물로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 이어서 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 말한다. 전사물 및 코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"이라고 언급될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되면, 발현은 진핵생물 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 그것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그것은 비-아미노산이 개재될 수 있다. 또한, 상기 용어는 변형된 아미노산 중합체, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 기타 조작, 예를 들어, 표지화 성분과의 접합을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 및 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "도메인" 또는 "단백질 도메인"은 단백질 사슬의 나머지 부분과 독립적으로 존재하며 기능할 수 있는 단백질 서열의 일부를 말한다. 본 발명의 양태들에서 설명된 대로, 서열 동일성은 서열 상동성과 관련된다. 상동성 비교는 눈으로, 또는 더 일반적으로는 쉽게 이용가능한 서열 비교 프로그램의 도움하에 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열 사이의 상동성 퍼센트 (%)를 계산할 수 있고, 또한 둘 이상의 아미노산 또는 핵산 서열에 의해서 공유된 서열 동일성을 계산할 수 있다.
일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 DNA이다. 추가 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 추가 서열을 더 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 서열은 시험관내 합성된다.
본 개시는 본 명세서의 임의 구현예에서 언급되는 바와 같은 시스템의 하나 이상의 성분 또는 TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 분자는 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 제한없이 지침에 따라서, 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 플라스미드, 미니써클, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스 벡터, 피기백 벡터, 또는 tol2 벡터의 일부일 수 있다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 이중시스트론 발현 구성체일 수 있다. 추가 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 게놈에 통합될 수 있다. 역시 추가 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 게놈의 일부일 수 있다. 추가 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 인공 염색체에 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 및/또는 3' 말단은 분해를 적극적으로 피하는 서열의 안정성을 개선시키도록 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리오파지에 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 아그로박테리움 (agrobacterium) 종에 함유될 수 있다. 일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 동결건조된다.
코돈 최적화
본 발명의 양태는 본 명세서의 임의 구현예에 기술된 바와 같이 하나 이상의 시스템의 하나 이상의 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자에 관한 것이고, 폴리뉴클레오티드 분자의 적어도 하나 이상의 영역은 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서의 임의 구현예에 기술된 바와 같이 하나 이상의 시스템의 하나 이상의 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 포유동물 세포 또는 식물 세포에서 발현을 위해 최적화된다.
코돈-최적화된 서열의 예는, 이러한 예에서, 진핵생물, 예를 들어, 인간 (즉, 인간에서의 발현을 위해 최적화됨), 또는 다른 진핵생물에서, 본 명세서에서 논의되는 동물 또는 포유류에 대해, 발현을 위해 최적화된 서열이다. 일 구현예에서, DNA/RNA-표적화 TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 효소 코딩 서열은 특정 세포, 예컨대 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. T진핵생물 세포는 특정 유기체, 예컨대, 제한없이 인간, 또는 비-인간 진핵생물 또는 본 명세서에서 논의되는 동물 또는 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 가축 또는 인간이외의 포유동물 또는 영장류를 포함하는, 포유동물 또는 식물의 것일 수 있거나 또는 그로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 인간의 배선 유전자 정체성을 변형시키는 방법 및/또는 인간 또는 동물에게 임의의 실질적인 의학적 이득없이 고통을 야기시킬 수도 있는 동물의 유전자 정체성을 변형시키는 방법, 및 그러한 방법으로 얻어진 동물은 배제할 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 개 이상의 코돈)을 숙주 세포의 유전자에 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하면서, 고유 아미노산 서열을 유지함으로써 대상 숙주 세포에서의 발현의 증진을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 소정의 코돈에 대한 특정 편향성을 나타낸다. 코돈 편향성 (유기체 사이의 코돈 용법 차이)은 종종 메신저 RNA (mRNA)의 번역 효율과 상관관계가 있는데, 이는 결국 특히 번역 중인 코돈의 특성 및 특정 전달 RNA(tRNA) 분자의 이용 가능성에 의존하는 것으로 여겨진다. 세포에서의 선택된 tRNA 의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영하는 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기반으로 하여 주어진 유기체에서의 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 용법 표는, 예를 들어, www.kazusa.orjp/codon/에서 이용 가능한 "코돈 용법 데이터베이스"에서 용이하게 이용 가능하며, 이들 표는 다수의 방법에서 적합하게 될 수 있다. 참조: Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화시키는 컴퓨터 알고리즘이 또한 이용가능하며, 예를 들어 Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA) 가 또한 이용가능하다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 서열에서 하나 이상의 코돈 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 이상, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 상응한다.
전달
본 개시는 또한 세포, 조직, 장기, 또는 유기체에 본 명세서의 시스템 및 조성물의 성분을 도입시키기 위한 전달 시스템을 제공한다. 전달 시스템은 하나 이상의 전달 비히클 및/또는 카고를 포함할 수 있다. 예시적인 전달 시스템 및 방법은 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입되고, 본 명세서에 개시된 TnpB 단백질과 사용을 위해 적합화될 수 있는, Feng Zhang et al., (WO2016106236A1)의 단락 [00117] 내지 [00278], 및 하기 문헌의 페이지 1241-1251 및 표 1에 기술된 것들을 포함한다: Lino CA et al., Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches, DRUG DELIVERY, 2018, VOL. 25, NO. 1, 1234-1257.
일 구현예에서, 전달 시스템은 식물 세포에 시스템 및 조성물의 성분을 도입시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 성분은 전기천공, 미세주입, 식물 세포 원형질체의 에어로졸 빔 주입, 유전자총 방법, DNA 입자 충격, 및/또는 아그로박테리움-매개 형질전환을 사용하여 식물에 전달될 수 있다. 식물에 대한 방법 및 전달 시스템의 예는 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 하기 문헌들에 기술된 것들을 포함한다: Fu et al., Transgenic Res. 2000 Feb;9(1):11-9; Klein RM, et al., Biotechnology. 1992;24:384-6; Casas AM et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Dec 1; 90(23): 11212-11216; 및 미국 특허 제5,563,055호, Davey MR et al., Plant Mol Biol. 1989 Sep;13(3):273-85.
조성물 또는 TnpB 폴리펩티드와 관련된 본 명세서에 기술된 예시적인 전달 조성물, 시스템, 및 방법이 또한 기능성 도메인 및 다른 성분 (예를 들어, TnpB 폴리펩티드와 관련된 다른 단백질 및 폴리뉴클레오티드, 예컨대 역전사효소, 뉴클레오티드 데아미나제, 레트로트랜스포존, 도너 폴리뉴클레오티드 등)에 적용된다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 mRNA를 통한 폴리펩티드의 전달을 포함한다.
RNA 전달
일 구현예에서, TnpB 시스템은 TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA로서 전단을 포함할 수 있다. ωRNA는 TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA와 함께 또는 별개로 전달될 수 있다. mRNA의 생체내 번역 효율은 RNA 조작을 통해서 추가로 증가될 수 있다. 효과적인 번역을 달성하기 위해서, mRNA는 5' 캡, 3' 폴리(A) 꼬리부, 단백질-코딩 서열 및 5' 및 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함한, 5개 구조적 구성요소를 필요로 하고, 이들 구성요소 중 하나 이상의 서열 조작은 생체내 번역을 개선시키는데 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 mRNA는 자기-복제성이 아니다.
일부 구현예에서, 단리된 mRNA는 하나 이상의 5'말단 캡 (또는 캡 구조), 3'말단 캡, 5'비번역 영역, 3'비번역 영역, 꼬리부 영역, 또는 이의 임의 조합을 포함하고/하거나 코딩한다.
일부 구현예에서, 단리된 mRNA 영역의 캡핑 영역은 1 내지 10, 예를 들어, 2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10, 또는 적어도 2, 또는 10 이하의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 캡은 부재한다.
예시적인 구현예에서, mRNA는 시험관내에서 합성될 수 있고 표적 세포로 직접 전달될 수 있으며, 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 단백질 생산을 촉진할 수 있는, 폴리아데닐화 3' 말단과 7-메틸구아노신 캡 구조를 갖게 변형된 내생성 mRNA의 5' 말단을 포함할 수 있다. 피리미딘 잔기의 변형을 또한 수행하여서 전달된 mRNA로부터 이식유전자 발현을 증강시킬 수 있는데, 숙주 세포의 선천성 면역계의 자극을 낮출 수 있기 때문이다. 일례의 구현예에서, mRNA는 안티-리버스 캡 유사체 및 120-nt 폴리(A) 꼬리부를 포함하고, 임의로 5-메틸시토신 및 슈도우리딘으로 치환된 시토신 및 우리딘 잔기를 포함할 수 있다. 참조로 본 명ㅅ ㅔ서에 편입되는 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0151474를 참조한다.
일부 구현예에서, 5'-캡 구조는 cap0, cap1, ARCA, 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'-플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신, 또는 2-아지도-구아노신이다.　　
일부 구현예에서, 5'말단 캡은 7mG(5')ppp(5')NlmpNp, m7GpppG 캡, N7-메틸구아닌이다. 일부 구현예에서, 3'말단 캡은 3'-O-메틸-m7GpppG이다.
일부 구현예에서, 3'-UTR은 알파-글로빈 3'-UTR이다. 일부 구현예에서, 5'-UTR은 코작 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 고리부 서열은 부재 내지 500 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 적어도 60, 70, 80, 90, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500 뉴클레오티드) 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 꼬리부 영역은 폴리A 꼬리부이거나 또는 그를 포함한다. 꼬리부 영역이 폴리A 꼬리부인 경우에, 길이는 폴리A 결합 단백질 결합의 단위에서 또는 그의 함수로서 결정될 수 있다. 이러한 구현예에서, 폴리A 꼬리는 폴리A 결합 단백질의 적어도 4개 단량체가 결합하기에 충분하게 길다. 폴리A 결합 단백질 단량체는 대략 38 뉴클레오티드의 스트레치에 결합한다. 이와 같이, 약 80 뉴클레오티드 및 160 뉴클레오티드의 폴리A 꼬리부가 기능성인 것으로 관찰되었다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리부는 적어도 160 뉴클레오티드 길이이다.　　
일부 구현예에서, mRNA 폴리뉴클레오티드는 안정화 구성요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화 구성요소는 히스톤 스템-루프이다. 일부 구현예에서, 안정화 구성요소는 야생형 서열에 비해서 증가된 GC 함량을 갖는 핵산 서열이다.
일 구현예에서, 전달을 위해서 mRNA의 면역원성 서열 모티프를 감소시키는 것이 바람직하다. 예시적인 기술은 당분야에 공지되어 있고, 참조로 본 명세서에 편입되는, 인간 TLR8에 결합할 수 있는 것을 포함하여, 제거를 위한 예시적인 면역원성 서열 모티퍼를 논의하는, 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2020/033720을 참조한다.
단리된 mRNA(들)는 시험관내 전사만을 사용하거나 또는 부분적으로 만들 수 있다. 시험관내 전사를 통한 폴리뉴클레오티드의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있고, 하기 문헌들에 기술되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그들 전체가 참조로 본 명세서 편입된다: 미국 가출원 번호 61/618,862, 61/681,645, 61/737,130, 61/618,866, 61/681,647, 61/737,134, 61/618,868, 61/681,648, 61/737,135, 61/618,873, 61/681,650, 61/737,147, 61/618,878, 61/681,654, 61/737,152, 61/618,885, 61/681,658, 61/737,155, 61/618,896, 61/668,157, 61/681,661, 61/737,160, 61/618,911, 61/681,667, 61/737,168, 61/618,922, 61/681,675, 61/737,174, 61/618,935, 61/681,687, 61/737,184, 61/618,945, 61/681,696, 61/737,191, 61/618,953, 61/681,704 61/737,203,; 국제 특허 출원 공개 번호 WO2013151666, WO2013151668,　WO2013151663, WO2013151669, WO2013151670, WO2013151664, WO2013151665, WO2013151736, WO2013151672, WO2013151671 WO2013151667, 및 WO/2020/205793A1. 대규모 합성을 포함하여, 리보핵산을 제조하는 세포 무함유 제조 방법은 예를 들어, 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 특허 제10,954,541호에 기술된다.
mRNA의 표적화된 전달 및 엔도솜 탈출은 일반적으로 효과적인 mRNA 사용의 요건이다. 지질 나노입자, 지질-유사 물질, 중합체를 포함한, 지질은 본 명세서의 다른 곳에 상술되는 바와 같이, 특히 바람직한 전달 비히클이다.
카고
전달 시스템은 하나 이상의 카고를 포함할 수 있다. 카고는 본 명세서의 시스템 및 조성물의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 카고는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: i) 조성물 및 시스템의 하나 이상의 단백질 성분 예컨대 TnpB 폴리펩티드 및/또는 기능성 도메인을 코딩하는 플라스미드; ii) 하나 이상의 핵산 성분을 코딩하는 플라스미드, iii) 조성물 및 시스템의 하나 이상의 단백질 성분 예컨대 TnpB 폴리펩티드 및/또는 기능성 도메인의 하나 이상의 mRNA; iv) 하나 이상의 핵산 성분 분자; v) 조성물 및 시스템의 하나 이상의 단백질 성분 예컨대 TnpB 폴리펩티드 및/또는 기능성 도메인; vi) 이의 임의 조합. The 하나 이상의 단백질 성분는 핵산-가이드된 뉴클레아제 (예를 들어, Cas), 역전사효소, 뉴클레오티드 데아미나제, 레트로트랜스포존 단백질, 다른 기능성 도메인, 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있다.
일례에서, 카고는 조성물 및 시스템의 하나 이상의 단백질 성분 예컨대 TnpB 폴리펩티드 및/또는 기능성 도메인 및 하나 이상의 (예를 들어, 다수의) 핵산 성분 분자를 코딩하는 플라스미드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 플라스미드는 또한 재조합 주형 (예를 들어, HDR용)을 코딩할 수 있다. 일 구현예에서, 카고는 하나 이상의 단백질 성분 및 하나 이상의 핵산 성분 분자를 코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다.
일례에서, 카고는 예를 들어, 리보뉴클레오단백질 복합체 (RNP)의 형태로, 하나 이상의 단백질 성분 및 하나 이상의 핵산 성분 분자를 포함할 수 있다. 리보뉴클레오단백질 복합체는 본 명세서의 방법 및 시스템에 의해 전달될 수 있다. 일부 경우에, 리보뉴클레오단백질은 폴리펩티드-기반 셔틀 작용제에 의해 전달될 수 있다. 일례에서, 리보뉴클레오단백질은 세포 침투 도메인 (CPD), 히스티딘-풍부 도메인 및 CPD, 예를 들어, WO2016161516에 기술된 것들에 작동적으로 연결되는 엔도솜 누수 도메인 (ELD)을 포함하는 합성 펩티드를 사용하여 전달될 수 있다. RNP는 또한 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 바와 같이, 식물 세포에 조성물 및 시스템을 전달하는데 사용될 수 있다: Wu JW, et al., Nat Biotechnol. 2015 Nov;33(11):1162-4.
물리적 전달
일 구현예에서, 카고는 물리적 전달 방법을 통해서 세포에 도입될 수 있다. 물리적 방법의 예는 미세주입, 전기천공, 유체역학 전달을 포함한다. 단백질 및 핵산 둘 모두는 이러한 방법을 사용해 전달될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 단백질 성분은 시험관내에서 제조될 수 있고, 단리 (필요하면 재폴딩, 정제)될 수 있고, 세포에 도입될 수 있다.
미세주입
카고를 세포에 직접 미세주입하면 예를 들어 90% 이상 또는 약 100% 이상의 고효율을 달성할 수 있다. 일 구현예에서, 현미경 및 바늘 (예를 들어, 0.5-5.0 ㎛ 직경)을 사용하여 미세주입을 수행하여 세포막을 뚫고 카고를 세포 내의 표적 부위로 직접 전달할 수 있다. 미세주입은 시험관내 및 생체외 전달에 사용될 수 있다.
하나 이상의 단백질 성분 및/또는 핵산 성분, mRNA, 및/또는 핵산 성분 분자에 대한 코딩 서열을 포함하는 플라스미드가 미세주입될 수 있다. 일부 경우에, 미세주입은 i) 세포핵으로 DNA 직접 전달, 및/또는 ii) 세포 핵 또는 세포질로 mRNA (예를 들어, 시험관내 전사) 전달에 사용될 수 있다. 일정 예에서, 핵산 성분을 직접적으로 핵에 그리고 mRNA를 세포질에 전달하여서, 예를 들어 번역을 촉진하고 핵으로 하나 이상의 단백질 성분을 이동시키는데 사용될 수 있다.
미세주입은 유전자 변형된 동물을 생성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집 카고는 효율적인 배선 변형을 허용하도록 접합체에 주입할 수 있다. 이러한 접근법은 원하는 변형(들)을 품고 있는 정상적인 배아 및 만삭 마우스 새끼를 생산할 수 있다. 미세주입은 또한 예를 들어, TnpB를 사용하여, 세포의 게놈 내 특정 유전자를 일시적으로 상향 또는 하향 조절하도록 제공하는데 사용될 수 있다.
전기천공
일 구현예에서, 카고 및/또는 전달 비히클은 전기천공을 통해 전달될 수 있다. 전기천공은 펄스된 고전압 전류를 사용하여서 완충액에 현탁된 세포의 세포막내 나노미터-크기 포어를 일시적으로 개방시켜서, 수십 나노미터의 유체역학적 직경을 갖는 성분이 세포 내로 흘러가게 할 수 있다. 일부 경우에, 전기천공은 다양한 세포 유형에서 사용될 수 있고 세포로 카고를 효율적으로 전달할 수 있다. 전기천공은 시험관내 및 생체외 전달에 사용될 수 있다.
전기천공은 또한 예를 들어, 뉴클레오펙션을 통해서, 특정 전압 및 시약을 적용하여서 포유동물 세포의 핵으로 카고를 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Wu Y, et al. (2015). Cell Res 25:67-79; Ye L, et al. (2014). Proc Natl Acad Sci USA 111:9591-6; Choi PS, Meyerson M. (2014). Nat Commun 5:3728; Wang J, Quake SR. (2014). Proc Natl Acad Sci 111:13157-62. 전기천공은 또한 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 방법을 사용하여서, 생체내에서 카고를 전달하는데 사용될 수 있다: Zuckermann M, et al. (2015). Nat Commun 6:7391.
유체역학적 전달
유체역학적 전달은 또한 예를 들어, 생체내 전달을 위해서, 카고를 전달하는데 사용될 수 있다. 일례에서, 유체역학적 전달은 대상체 (예를 들어, 인간 또는 동물)의 혈류에, 예를 들어, 마우스에게, 꼬리 정맥을 통해서, 유전자 편집 카고를 포함하는 대량 부피 (8-10% 체중) 용액을 신속하게 밀어넣어서 수행될 수 있다. 혈액이 비압축성이므로, 큰 액체 볼루스는 유체역학적 압력을 증가시켜서 내피 및 실질 세포로의 투과성을 일시적으로 증강시켜서, 정상적으로는 세포막을 통과할 수 없는 카고가 세포로 통과하게 한다. 이러한 접근법은 나형 DNA 플라스미드 및 단백질을 전달하는데 사용될 수 있다. 전달된 카고는 간, 신장, 폐, 근육, 및/또는 심장에서 농축될 수 있다.
형질감염
카고, 예를 들어, 핵산은 세포로 핵산을 도입시키는 형질감염 방법으로 세포에 도입될 수 있다. 형질감염 방법의 예는 칼슘 포스페이트-매개 형질감염, 양이온성 형질감염, 리포솜 형질감염, 덴드리머 형질감염, 열충격 형질감염, 마그네토펙션, 리포펙션, 임팔러펙션, 광학 형질감염, 독점 제제-증강된 핵산 흡수를 포함한다.
전달 비히클
전달 시스템은 하나 이상의 전달 비히클을 포함할 수 있다. 전달 비히클은 세포, 조직, 장기, 또는 유기체 (예를 들어, 동물 또는 식물)에 카고를 전달할 수 있다. 카고는 전달 비히클로 패키징, 운반, 또는 달리 연합될 수 있다. 전달 비히클은 전달하려는 카고의 유형을 기반으로 선택될 수 있고/있거나, 전달은 시험관내 및/또는 생체내이다. 전달 비히클의 예는 벡터, 바이러스, 비-바이러스 비히클, 및 본 명세서에 기술된 다른 전달 시약을 포함한다.
본 발명에 따른 전달 비히클은 100 미크론 (㎛) 미만의 최고 치수 (예를 들어, 직경)를 가질 수 있다. 일 구현예에서, 전달 비히클은 10 ㎛ 미만의 최고 치수를 갖는다. 일 구현예에서, 전달 비히클은 2000 나노미터 (nm) 미만의 최고 치수를 가질 수 있다. 일 구현예에서, 전달 비히클은 1000 나노미터 (nm) 미만의 최고 치수를 가질 수 있다. 일 구현예에서, 전달 비히클은 900 nm 미만, 800 nm 미만, 700 nm 미만, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm 미만, 200 nm 미만, 150 nm 미만, 또는 100 nm 미만, 50nm 미만의 최고 치수 (예를 들어, 직경)을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 전달 비히클은 25 nm와 200 nm 사이 범위의 최고 치수를 가질 수 있다.
일 구현예에서, 전달 비히클은 입자일 수 있거나 또는 입자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전달 비히클은 나노입자 (예를 들어, 1000 nm 이하의 최고 치수 (예를 들어, 직경)을 갖는 입자)일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 입자는 상이한 형태, 예를 들어, 고체 입자 (예를 들어, 금속 예컨대 은, 금, 철, 티타늄), 비-금속, 지질-기반 고체, 중합체), 입자 현탁액 또는 이의 조합으로 제공될 수 있다. 금속, 유전체, 및 반도체 입자뿐만 아니라 하이브리드 구조 (예를 들어, 코어-쉘 입자)가 제조될 수 있다. 나노입자는 또한 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 바와 같이, 식물 세포에 조성물 및 시스템을 전달하는데 사용될 수 있다: 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2008042156, US 특허 출원 공개 번호 US 20130185823, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/089419.
벡터
시스템, 조성물, 및/또는 전달 시스템은 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 본 개시는 또한 벡터 시스템을 포함한다. 벡터 시스템은 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 벡터는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터는 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 부분 이중 가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 유리 말단을 포함하거나, 또는 유리 단부가 없는 (예를 들어, 원형) 핵산 분자; DNA, RNA, 또는 둘 모두를 포함하는 핵산 분자; 및 당분야에 공지된 다른 다양한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 벡터는 추가적인 DNA 절편이, 예컨대, 표준 분자 클로닝 기법에 의해 삽입될 수 있는 예를 들어, 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 플라스미드이다. 일정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포에서 자율적 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 일부 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합되고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 일정 예에서, 벡터는 예를 들어, 그들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있는, 발현 벡터일 수 있다. 일부 경우에, 발현 벡터는 진핵생물 세포에서 발현을 위한 것이다. 재조합 DNA 기술에 유용한 통상적인 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다.
벡터의 예는 pGEX, pMAL, pRIT5, 이. 콜라이 발현 벡터 (예를 들어, pTrc, pET 11d, 효모 발현 벡터 (예를 들어, pYepSec1, pMFa, pJRY88, pYES2, 및 picZ, 배큘로바이러스 벡터 (예를 들어, 곤충 세포, 예컨대 SF9 세포에서 발현용) (예를 들어, pAc 시리즈 및 pVL 시리즈), 포유동물 발현 벡터 (예를 들어, pCDM8 및 pMT2PC)를 포함한다.
벡터는 i) 하나 이상의 단백질 성분 코딩 서열(들), 및/또는 ii) 단일, 또는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 32, 적어도 48, 적어도 50 핵산 성분 분자(들) 코딩 서열을 포함할 수 있다. 단일 벡터에서, 각각의 RNA 코딩 서열에 대한 프로모터가 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단일 벡터에서, 다수의 RNA 코딩 서열을 제어 (예를 들어, 전사 및/또는 발현 구동)하는 프로모터가 존재할 수 있다.
또한, 조성물 또는 시스템은 복합체를 코딩하는 벡터, 예를 들어, 별도 벡터 또는 동일 벡터를 통해 전달될 수 있다. 별도 벡터로 제공될 때, TnpB 폴리펩티드 발현을 표적화하는 RNA는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.+ 순차적으로 투여될 때, TnpB 폴리펩티드 발현을 표적화하는 RNA는 예를 들어, 유전자 편집 또는 유전자 조작이 의도되는 RNA 이후에 전달되어야 한다. 이러한 기간은 분 단위 기간 (예를 들어, 5분, 10분, 20분, 30분, 45분, 60분)일 수 있다. 기간은 시간 단위의 기간 (예를 들어, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간)일 수 있다. 이러한 기간은 일 단위 기간 (예를 들어, 2일, 3일, 4일, 7일)일 수 있다. 이러한 기간은 주 단위의 기간 (예를 들어, 2주, 3주, 4주)일 수 있다. 이러한 기간은 월 단위의 기간 (예를 들어, 2개월, 4개월, 8개월, 12개월)일 수 있다. 이러한 기간은 년 단위의 기간 (2년, 3년, 4년)일 수 있다. 이러한 방식으로, TnpB 폴리펩티드는 제1 표적, 예컨대 관심 유전자좌 또는 유전자좌들에 혼성화할 수 있는 제1 핵산 성분 분자외 연합되고 시스템의 바람직한 기능(들) (예를 들어, 유전자 조작)을 착수하며; 후속하여 TnpB 폴리펩티드는 TnpB 폴리펩티드의 적어도 일부를 포함하는 서열에 혼성화할 수 있는 제2 핵산 성분 분자와 연합될 수 있다. 핵산 성분 분자가 TnpB 폴리펩티드의 발현을 코딩하는 서열을 표적화할 때, 효소는 방해되고, 시스템은 자기-불활성화된다. 동일한 방식으로, 예를 들어, 본 명세서에 설명된 바와 같은 리포솜, 리포펙션, 입자, 미세소포를 통해서 적용된 TnpB 폴리펩티드 발현을 표적화하는 RNA는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 유사하게, 자기-불활성화는 하나 이상의 표적을 표적화하는데 사용되는 하나 이상의 핵산 성분 분자의 불활성화에 사용될 수 있다.
조절 구성요소
벡터는 하나 이상의 조절 구성요소를 포함할 수 있다. 조절 구성요소(들)는 TnpB 폴리펩티드, 보조 단백질, 핵산 성분 스캐폴드 및/또는 핵산 성분 분자 또는 이의 조합의 코딩 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된"은 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포에 도입될 때 숙주 세포에서) 관심 뉴클레오티드 서열이 조절 구성요소(들)에 연결된다는 것을 의미하고자 한다. 일정 예에서, 벡터는 TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 구성요소, 및 핵산 성분 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 구성요소를 포함할 수 있다.
조절 구성요소의 예는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 및 다른 발현 제어 구성요소 (예를 들어, 전사 종결 신호, 예컨대 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함한다. 이러한 조절 구성요소는 예를 들어, 하기 문헌에 기술된다: Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). 조절 구성요소는 다수 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드의 구성적 발현을 유도하는 것 및 오직 소정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도시키는 것 (예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 원하는 관심 조직, 예컨대 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 장기 (예를 들어, 간, 췌장), 또는 특정 세포 유형 (예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 유도할 수 있다. 조절 구성요소는 또한 시간-의존적 방식으로, 예컨대 세포-주기 의존적 또는 발생 단계-의존적 방식으로 발현을 유도할 수 있고, 이것은 또한 조직 또는 세포-유형 특이적일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수도 있다.
프로모터의 예는 하나 이상의 pol III 프로모터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 이상의 pol III 프로모터), 하나 이상의 pol II 프로모터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 이상의 pol II 프로모터), 하나 이상의 pol I 프로모터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 이상의 pol I 프로모터s), 또는 이의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예들은, 제한은 아니지만, U6 및 H1 프로모터를 포함한다. pol II 프로모터의 예는 레트로바이러스 루이스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의로 RSV 인핸서 존재), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의로 CMV 인핸서 존재), SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1α프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
바이러스 벡터
카고는 바이러스에 의해 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터가 사용된다. 바이러스 벡터는 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함성 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)에 패키징을 위해서 바이러스-유래 DNA 또는 RNA 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포 내로 형질감염을 위해 바이러스에 의해 수행되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바이러스 및 바이러스 벡터는 시험관내, 생체외, 및/또는 생체내 전달에 사용될 수 있다.
아데노 연관 바이러스 (AAV)
본 명세서의 시스템 및 조성물은 아데노 연관 바이러스 (AAV)에 의해 전달될 수 있다. AAV 벡터는 이러한 전달에 사용될 수 있다. 디펜도바이러스 속 및 파르보비리다에 과의 AAV는 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 일 구현예에서, AAV 는 제공되는 DNA의 지속적인 공급원을 제공할 수 있는데, AAV 전달된 게놈 재료가 예를 들어, 외생성 DNA로서, 또는 일부 변형을 가지고, 숙주 DNA에 직접적으로 통합되어서, 세포에서 무한하게 존재할 수 있다. 일 구현예에서, AAV 는 인간에서 임의의 질병을 유발하거나 이와 관련되지 않는다. 바이러스 자체는 선천성 또는 적응성 면역 반응 또는 관련 독성을 거의 또는 전혀 유발하지 않으면서 세포를 효율적으로 감염시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용될 수 있는 AAV 는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-8, 및 AAV-9를 포함한다. AAV의 유형은 표적화하려는 세포에 대해서 선택될 수 있고; 예를 들어, 뇌 또는 뉴런 세포를 표적화하기 위해 AAV 혈청형 1, 2, 5 또는 하이브리드 캡시드 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합을 선택할 수 있고; 심장 조직을 표적화하기 위해 AAV4를 선택할 수 있다. AAV8은 간으로의 전달에 유용하다. AAV-2-기반 벡터가 CF 기도로 CFTR 전달을 위해 원래 제안되었지만, AAV-1, AAV-5, AAV-6, 및 AAV-9와 같은 다른 혈청형이 다양한 폐 상피 모델에서 개선된 유전자 이송 효율을 나타낸다. AAV에 의해 표적화되는 세포 유형의 예는 하기 문헌에 기술되고, 하기 표에 표시된다: Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)).
AAV 입자는 HEK 293 T 세포에서 생성될 수 있다. 특이적 향성을 갖는 입자가 생성되면, 그들은 천연 바이러스 입자가 하는 동일한 방식으로 표적 세포주를 감염시키는데 사용될 수 있다. 이것은 감염된 세포 유형에서 성분의 지속적인 존재를 허용할 수 있고, 장기간 발현이 바람직한 경우에 특히 적합하게 이러한 전달 형태를 만들 수 있다. 사용할 수 있는 AAV에 대한 용량 및 제제의 예는 미국 특허 제8,454,972호 및 제8,404,658호에 기술된 것들을 포함한다.
다양한 전략이 AAV로 본 명세서의 시스템 및 조성물을 전달하는데 사용될 수 있다. 일례에서, TnpB 폴리펩티드 및 핵산 성분의 코딩 서열은 하나의 DNA 플라스미드 벡터에 직접적으로 패키징되어서 AAV 입자를 통해 전달될 수 있다. 일례에서, AAV는 TnpB 폴리펩티드를 발현하도록 사전에 조작된 세포로 핵산 성분을 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 예에서, TnpB 폴리펩티드 및 핵산 서열의 코딩 서열은 표적 세포의 공-형질감염에 사용되는 2개의 별개 AAV 입자로 만들어질 수 있다. 일례에서, 마커, 태그, 및 다른 서열은 TnpB 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분의 코딩 서열과 동일한 AAV 입자에 패키징될 수 있다.
렌티바이러스
본 명세서의 시스템 및 조성물은 렌티바이러스에 의해 전달될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 이러한 전달에 사용될 수 있다. 렌티바이러스는 유사분열 및 유사분열 후 세포 둘 모두에서 그들 유전자를 감염시키고 발현하는 능력을 갖는 복합 레트로바이러스이다.
렌티바이러스의 예는 광범위한 세포 유형을 표적화하기 위해 다른 바이러스의 이의 엔벨로프 당단백질을 사용할 수 있는, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV); 안구 요법에 사용할 수 있는, 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV)를 기반으로 하는 최소 비-영장류 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, HIV tat/rev와 공유하는 공통 엑손을 표적화하는 siRNA, 핵소체-국재화 TAR 디코이, 및 항-CCR5-특이적 해머헤드 리소자임을 갖는 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터 (참조: 예를 들어, DiGiusto et al. (2010) Sci Transl Med 2:36ra43)가 본 명세서의 TnpB 시스템에 사용 및/또는 적합화될 수 있다.
렌티바이러스는 수포성 구내염 바이러스의 G 단백질과 같은 다른 바이러스 단백질과 유사-유형화될 수 있다. 그렇게 하여, 렌티바이러스의 세포 향성은 바람직하다면 광범위하거나 또는 협소하게 변형될 수 있다. 일부 경우에, 안전성을 개선시키기 위해서, 2세대 및 3세대 렌티바이러스 시스템은 3개 플라스미드에 걸쳐서 필수 유전자를 분할하여서, 세포 내에서 생존 바이러스 입자의 우발적 재구성 가능성을 감소시킬 수 있다.
일례에서, 통합 능력을 활용하여, 렌티바이러스는 예를 들어 유전자 및 신호전달 경로를 스크리닝 및/또는 연구하기 위해 다양한 유전적 변형을 포함하는 세포 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있다.
아데노바이러스
본 명세서의 시스템 및 조성물은 아데노바이러스에 의해 전달될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 이러한 전달에 사용될 수 있다. 아데노바이러스는 이중 가닥 DNA 게놈을 함유하는 20면체 뉴클레오캡시드를 가진 비-엔벨로프형 바이러스를 포함한다. 아데노바이러스는 분열 및 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다. 일 구현예에서, 아데노바이러스는 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않으며, 유전자 편집 적용에서 시스템의 오프-표적 효과를 제한하는데 사용될 수 있다.
식물에 전달을 위한 바이러스 비히클
시스템 및 조성물은 바이러스 비히클을 사용하여 식물 세포로 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물 및 시스템은 식물 바이러스 벡터를 사용해 식물 세포에 도입될 수 있다 (예를 들어, 하기 문헌에 기술된 바와 같음: Scholthof et al. 1996, Annu Rev Phytopathol. 1996;34:299-323). 이러한 바이러스 벡터는 DNA 바이러스, 예를 들어, 제미니바이러스 (예를 들어, 캐비지 잎 말림 바이러스, 콩 누른오갈병 바이러스, 밀 오갈병 바이러스, 토마토 잎 말림 바이러스, 메이즈 도말 바이러스, 담배 잎 말림 바이러스, 또는 토마토 골든 모자이크 바이러스) 또는 나노바이러스 (예를 들어, 잠두 괴사성 황화 바이러스) 유래 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 RNA 바이러스, 예를 들어, 토브라바이러스 (예를 들어, 담배 얼룩 바이러스, 담배 모자이크 바이러스), 포텍스바이러스 (예를 들어, 감자 바이러스 X) 또는 호르데이바이러스 (예를 들어, 보리 줄무늬병 모자이크 바이러스) 유래 벡터일 수 있다. 식물 바이러스의 복제 게놈은 비-통합형 벡터일 수 있다.
비-바이러스 비히클
전달 비히클은 비-바이러스 비히클을 포함할 수 있다. 일반적으로, 핵산 및/또는 단백질을 전달할 수 있는 방법 및 비히클이 본 명세서의 시스템 및 조성물을 전달하는데 사용될 수 있다. 비-바이러스 비히클의 예는 지질 나노입자, 세포-침투성 펩티드 (CPP), DNA 나노클루, 금 나노입자, 스트렙토리신 O, 다기능성 엔벨로프-유형 나노장치 (MEND), 지질-코팅된 메조다공성 실리카 입자, 및 다른 무기 나노입자를 포함한다. RNA의 표적화된 전달 및 엔도솜 탈출은 일반적으로 효과적인 RNA 사용의 요건이다. 지질 나노입자, 지질-유사 물질, 중합체를 포함한, 지질은 하기 추가로 상술되는 바와 같이, RNA에 특히 바람직한 전달 비히클이다.
나노입자
본 발명의 조성물과 사용을 위한 전달 비히클은 지질 나노입자를 포함하는 나노입자를 포함할 수 있다. 중합체 기반 물질 예컨대 칼슘 포스페이트-실리케이트 나노입자, 칼슘 포스페이트 나노입자, 실리카 나노입자, 및 폴리(아미도-아민), 폴리-β 아미노-에스테르 (PBAE), 및 폴리에틸렌이민 (PEI)을 포함한 다른 입자 시스템이 사용될 수 있다. 참조: 예를 들어, Trepotec et al. Mol. Therapy 27:4 April 2019. 일 구현예에서, 예시적인 나노입자는 코어, 하나 이상의 동종성 또는 이종성 중간체 및 핵산, 예를 들어 mRNA의 내포 및 전달을 위한 말단층을 포함하는 변형된 덴드리머를 포함한다. 변형된 덴드리머는 바람직하게 예를 들어, 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머, 폴리프로필렌 이민 (PPI) 덴드리머, 또는 폴리에틸렌 이민 (PEI) 덴드리머를 포함한, 소수성 단위 (예를 들어, 지방산 유도체)에 대한 아민 링커 (예를 들어, 폴리아민)을 통해 표면에 부착된 폴리에스테르와, 폴리에스테르 단위의 하나 이상의 종류로 분지되는 코어를 포함하는, 하나 이상의 폴리에스테르 덴드리머를 포함할 수 있다. 다수의 중간체층은 엔도솜 탈출을 위해 변형된 적어도 하나의 층 및 폴리플루오로카본 둘 모두를 포함할 수 있다. 예시적인 분자 및 제조 방법은 참조로 본 명세서에 편입되는, WO/2020/132196, 및 WO 2021/207020에서 확인할 수 있다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2021/207020의 화학식 IB, II 및 III은 핵산의 전달을 위한 예시적인 나노입자 전달 비히클로서 참조하여 본 명세서에 특별히 편입된다.
지질 입자
전달 비히클는 지질 입자, 예를 들어, 지질 나노입자 (LNP) 및 리포솜을 포함할 수 있다. 지질성 아미노글리코시드 및 이의 유도체는 참조로 본 명세서에 편입되는, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2008/040792에 상술되는 바와 같은, 디올레일아민-A-숙시닐-네오마이신 ("DOSN"), 디올레일아민-A-숙시닐-파로모마이신 ("DOSP"), NeoCHol. NeoSucChol, ParomoChol. ParomoCapSucDOLA, ParamoLysSucDOLA, NeoDiSucDODA, NeodiLysSucDOLA, 및 [ParomoLys]2-Glu-Lys-[SucDOLA]2를 포함한, RNA의 전달을 위해 당분야에 공지되어 있다.
지질 나노입자 (LNP)
LNP 는 양이온성 지질 입자 (예를 들어, 리포솜) 내에 핵산을 캡슐화할 수 있고, 상대적으로 용이하게 세포에 전달될 수 있다. 일부 예에서, 지질 나노입자는 임의의 바이러스 성분을 함유하지 않아서, 안전성 및 면역원성 우려를 최소화하도록 도움을 준다. 지질 입자는 시험관내, 생체외, 및 생체내 전달에 사용될 수 있다. 지질 입자는 다양한 규모의 세포 개체군에 사용될 수 있다.
일례에서. LNP는 DNA 분자 (예를 들어, TnpB 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분의 코딩 서열을 포함하는 것) 및/또는 RNA 분자 (예를 들어, TnpB 폴리펩티드의 mRNA, 핵산 성분 분자)를 전달하는데 사용될 수 있다. 일정 경우에, LNP는 TnpB 폴리펩티드/핵산 성분의 RNP 복합체를 전달하는데 사용될 수 있다.
양이온성 지질은 mRNA와 복합체를 형성하여서 이후 세포에 의해 세포내이입되는 리포플렉스를 형성한다. 일례의 구현예에서, LNP는 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 콜레스테롤, 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 일례의 구현예에서, LNP는 아미드 또는 포스포르아미드 링커를 갖는, 파로모마이신-기반 양이온성 지질, 및 다른 한편으로 링커로서 기능하는 아미드 또는 포스포르아미드 기능을 역시 갖는, 2개 이미다졸-기반 중성 지질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 양이온성 및 헬퍼 지질이 상이한 링커를 포함할 때 조립체를 수득할 수 있다. 참조: Colombani, et al., Self-assembling complexes between binary mixtures of lipids with different linkers and nucleic acids promote universal mRNA, DNA and siRNA delivery. J. Control Release. (2017) doi: 10.1016/j.jconrel.2017.01.041
일 구현예에서, 나노입자는 선택된 기관 표적화 (SORT)에 따라 개발되었는데, 다수 클래스의 지질 나노입자가 보충 SORT 분자의 첨가를 통해서 간외 조직을 독접적으로 편집하기 위해 체계적으로 조작된다. 참조: 예를 들어, Cheng et al., Nature Nanotechnology 15, 313-320 2020). 접근법은 이온화 양이온성 지질 (5A2-SC8, C12-200, 또는 DLin-MC3-DMA)36,48,49, 양쪽성 지질 (DOPE 또는 DSPC), 콜레스테롤, DMG-PEG, 및 영구적 양이온성 지질 (DOTAP, DDAB 또는 EPC)의 사용을 포함하여, 덴드리머 지질 나노입자 (DLNP), 안정한 핵산 지질 입자 (SNALP), 및 지질-유사 나노입자 (LLNP)를 사용해 보여주었다. Wei et al., Systemic nanoparticle delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleproteins for effective tissue specific genome editing., Nature Comm. (2020) 11:3232, doi:10.1038/s4146020170293 (참조로 본 명세서에 편입됨).
일 구현예에서, 조성물은 양이온성 지질, 중성 지질, 콜레스테롤, PEG 지질, 또는 이의 조합을 포함하는 다수의 지질 나노입자를 포함하고, 다수의 지질 나노입자는 임의로 80 nm와 160 nm 사이의 평균 입자 크기를 갖고, 지질 나노입자는 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드, 예를 들어, TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
LNP의 성분은 양이온성 지질 1,2-디리네오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DLinDAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-N,N- 디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레일옥시케토-N,N-디메틸-3-아미노프로판 (DLinK-DMA), 1,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLinKC2-DMA), (3-o-[2"-(메톡시폴리에틸렌글리콜 2000) 숙시노일]-1,2-디미리스토일-sn-글리콜 (PEG-S-DMG), R-3-[(ro-메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)2000) 카바모일]-1,2-디미리스틸옥슬프로필-3-아민 (PEG-C-DOMG, 및 이의 임의 조합을 포함한다. LNP의 제조 및 캡슐화는 하기 문헌으로부터 적합화될 수 있다: Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011.
추가 양이온성 지질은 디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄-프로판, (DOTMA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP), DOTMA의 생분해성 유사체를 단독으로, 또는 추가 물질, 예컨대, 예를 들어, 콜레스테롤과 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 양이온성 지질 LNP는 예를 들어, 나노에멀션으로서 전달될 수 있고, 카보네이트 아파타이트 (입자와 세포막 간 상호작용 증가)를 추가로 도입시킬 수 있거나, 또는 피브로넥틴과 접합하여, 세포내이입을 가속화시킬 수 있다. 다른 4차 암모늄 지질, 예컨대 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)는 또한 2,3-디옥레일옥시-N-[2-(스퍼민카르복사미도) 에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA)이고 또한 전달에서 사용이 고려된다.
mRNA 전달을 위한 지질 나노입자는 2-(((((3S,8S,9S,10R,13R,14S, 17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]펜안트렌-3-일)옥시)카르보닐)아미노)-N,N-비스(2-히드록시에틸)-N-메틸에탄-1-아미늄 브로마이드 (BHEM-콜레스테롤)를 포함할 수 있다. 참조: Zhang, Y. et al. In situ repurposing of dendritic cells with CRISPR/Cas9-based nanomedicine to induce transplant tolerance. Biomaterials 217, 119302 (2019) (참조로 본 명세서에 편입됨).
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 20-60% 이온화 양이온성 지질, 5-25% 비-양이온성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-변형된 지질의 몰비율을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 미국 특허 제10,442,756호에 기술된 임의의 나노입자이고/이거나, 본 명세서에 기술된 화학식 (IA) 또는 (II) 중 어느 하나에 따른 나노입자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 미국 특허 제10,442,756호에 기술된 임의 화합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 예를 들어, 미국 특허 제10,266,485호에 기술된 임의 나노입자이고/이거나, 본 명세서에 기술된 화학식 (II)에 따른 나노입자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 미국 특허 제10,266,485호에 기술된 임의 화합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 미국 특허 제9,868,692호에 기술된 나노입자이고/이거나, 화학식 (I), (1A), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe)에 따른 나노입자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 예를 들어 미국 특허 제9,868,692호에 기술된 화합물을 포함한다,
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 미국 특허 제10272150호에 기술된 바와 같은 화학식 (I) 및/또는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA는 미국 특허 제10,272,150호의 화합물 3, 18, 20, 25, 26, 29, 30, 60, 108-112 및 122로부터 선택되는 화합물을 포함하는 지질 나노입자로 제제화된다.　
일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임의 우라실의 적어도 80% (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%)는 화학적 변형을 갖고, 임의로, 백신은 지질 나노입자로 제제화된다 (예를 들어, 지질 나노입자는 양이온성 지질, PEG-변형된 지질, 스테롤 및 비-양이온성 지질을 포함함).
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 50-200 nm의 평균 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 미국 특허 제10272150호에 기재된 바와 같은 화합물 3, 18, 20, 25, 26, 29, 30, 60, 108-112, 또는 122를 포함한다.　
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 0.4 미만 (예를 들어, 0.3, 0.2 또는 0.1 미만)의 다분산도값을 갖는다.
일부 구현예에서, 다수의 지질 나노입자는, 예컨대 제제에 제제에 함유되는 경우에, 0.02와 0.2 사이의 평균 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, 다수의 지질 나노입자는, 예컨대 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 제제에 함유되는 경우에, 10과 20 사이의 평균 지질 대 폴리뉴클레오티드 비율 (wt/wt)을 갖는다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 중성 pH 값에서 순 중성 전하를 갖는다.
리포솜
일 구현예에서, 지질 입자는 리포솜일 수 있다. 리포솜은 내부 수성 구획을 둘러싼 단층판 또는 다층판 지질 이중층 및 상대적으로 불침투성 외부 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구형 소포 구조이다. 일 구현예에서, 리포솜은 생체적합성, 무독성이고, 친수성 및 친지성 약물 분자를 전달할 수 있고, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들 카고를 보호하고, 생물학적 막 및 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 가로질러스 그들 부하를 수송할 수 있다.
리포솜은 몇몇 상이한 유형의 지질, 예를 들어, 인지질로 만들어질 수 있다. 리포솜은 천연 인지질 및 지질 예컨대 1,2-디스테아로릴-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린 (DSPC), 스핀고미엘린, 계란 포스파티딜콜린, 모노시알로강글리오시드, 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있다.
몇몇 다른 첨가제는 그들 구조 및 성질을 변형시키기 위해서 리포솜에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 예를 들어, 안정성을 증가시키고/시키거나 리포솜 내부 카고의 누수를 방지하기 위해서, 콜레스테롤, 스핀고미엘린, 및/또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)을 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 리포솜은 1.5 초과 및 10 미만의 히스티딘 대 비-히스티딘 아미노산의 비율 및 적어도 10 아미노산을 포함하는, 임의로 분지될 수 있는 수송 중합체를 포함한다. 분지된 수송 중합체는 하나 이상의 골격, 하나 이상의 말단 분지, 및 임의로, 하나 이상의 비-말단 분지를 포함할 수 있다. 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, 미국 특허 제7,070,807호를 참조한다. 일 구현예에서, 수송 중합체는 mRNA 및 다른 카고를 패키징하고 전달하는데 사용되는 히스티딘-리신 공중합체 (HKP)이다. 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 특허 제7,163,695호, 및 제7,772,201호를 참조한다.
안정한 핵산-지질 입자 (SNALP)
일 구현예에서, 지질 입자는 안정한 핵산 지질 입자 (SNALP)일 수 있다. SNALP는 이온화 지질 (DLinDMA) (예를 들어, 저 pH에서 양이온), 중성 헬퍼 지질, 콜레스테롤, 확산성 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-지질, 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있다. 일례에서, SNALP는 합성 콜레스테롤, 디팔미토일포스파티딜콜린, 3-N-[(w-메톡시 폴리에틸렌 글리콜)2000)카바모일]-l,2-디미레스틸옥시프로필아민, 및 양이온성 l,2-디리놀레일옥시-3-N,N디메틸아미노프로판을 포함할 수 있다. 일례에서, SNALP는 합성 콜레스테롤, l,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, PEG-cDMA, 및 l,2-디리놀레일옥시-3-(N;N-디메틸)아미노프로판 (DLinDMA)을 포함할 수 있다.
기타 지질
지질 입자는 또한 하나 이상의 다른 유형의 지질, 예를 들어, 양이온성 지질, 예컨대 아미노 지질 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-KC2-DMA), DLin-KC2-DMA4, C12-200 및 코리피드 디스테로일포스파티딜 콜린, 콜레스테롤, 및 PEG-DMG를 포함할 수 있다.
리포플렉스/폴리플렉스
일 구현예에서, 전달 비히클은 리포플렉스 및/또는 폴리플렉스를 포함한다. 리포플렉스는 음으로 하전된 세포막에 결합될 수 있고, 세포로의 세포내이입을 유도할 수 있다. 리포플렉스의 예는 지질(들) 및 비-지질 성분을 포함하는 복합체일 수 있다. 리포플렉스 및 폴리플렉스의 예는 FuGENE-6 시약, 지질 및 다른 성분을 함유하는 비-리포솜 용액, 쌍성이온 아미노 지질 (ZAL), Ca2þ (예를 들어, DNA/Ca2+ 미세복합체 형성), 폴리에텐이민 (PEI) (예를 들어, 분지된 PEI), 및 폴리(L-리신) (PLL)을 포함한다. 코어-쉘 구조화된 리포폴리플렉스 전달 플랫폼이 또한 사용될 수 있고, mRNA에 대한 바람직한 전달 중 하나인데, 특히 코어-쉘 구조화된 입자가 단백질이고 중합체의 분해 시 점진적으로 mRNA를 방출할 수 있다. 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 특허 출원 공개 번호 2018/0360756을 참조한다.
세포 침투성 펩티드
일 구현예에서, 전달 비히클은 세포 침투성 펩티드 (CPP)를 포함한다. CPP는 다양한 분자 카고의 세포 흡수를 촉진하는 짧은 펩티드이다 (예를 들어, 나노크기 입자에서 소형 화학 분자 및 대형 DNA 단편까지).
CPP는 상이한 크기, 아미노산 서열, 및 전하일 수 있다. 일례에서, CPP는 우너형질막을 전좌시킬 수 있고, 세포질 또는 소기관으로 다양한 분자 카고의 전달을 촉진한다. CPP는 상이한 기전, 예를 들어, 막으로 직접 침투, 세포내이입-매개 진입, 및 전좌 구조의 형성을 통한 전좌를 통해서, 세포로 도입될 수 있다.
CPP는 높은 상대 존재비로 양으로 하전된 아미노산 예컨대 리신 또는 아르기닌을 함유하거나 또는 극성/하전된 아미노산 및 비-극성, 소수성 아미노산의 교대식 패턴을 함유하는 서열을 갖는 아미노산 조성물을 가질 수 있다. 이들 2개 유형의 구조는 각각 다가양이온성 또는 양쪽성으로 지칭될 수 있다. 제3 클래스의 CPP는 세포 흡수에 핵심적인 소수성 아미노산 기를 갖거나 또는 낮은 순전하를 갖는, 오직 무극성 잔기를 함유하는, 소수성 펩티드이다. CPP의 다른 유형은 인간 면역결핍 바이러스 1 (HIV-1) 유래의 트랜스-작용성 전사 활성인자 (Tat)이다. CPP의 예는 페너트라틴, Tat (48-60), 트랜스포르탄, 및 (R-AhX-R4) (Ahx 는 아미노헥사노일임), 카포시 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 신호 펩티드 서열, 인테그린 β3 신호 펩티드 서열, 폴리아르기닌 펩티드 Arg 서열, 구아닌 풍부-분자 수송체, 및 스위트 애로우 펩티드를 포함한다. CPP의 예 및 관련 적용은 미국 특허 제8,372,951호에 기술된 것들을 포함한다.
CPP는 시험관내 및 생체외 작업을 위해 매우 쉽게 사용할 수 있고, 각각의 카고 및 세포 유형에 대한 광범위한 최적화가 드물게 요구된다. 일례에서, CPP는 TnpB 폴리펩티드에 직접적으로 공유적으로 부착될 수 있고, 그 다음에 핵산 성분과 복합체를 형성하고 세포로 전달된다. 일례에서, 다수 세포로 CPP-TnpB 및 CPP-핵산 성분의 별개 전달이 수행될 수 있다. CPP는 또한 RNP를 전달하는데 사용될 수 있다.
CPP는 식물에서 조성물 및 시스템을 전달하는데 사용될 수 있다. 일례에서, CPP는 식물 원형질체에 성분을 전달하는데 사용될 수 있고, 이후에 식물 세포 및 식물로 더 재생된다.
DNA 나노클루
일 구현예에서, 전달 비히클은 DNA 나노클루를 포함한다. DNA 나노클루는 DNA의 구형-유사 구조 (예를 들어, 원사 볼 형상)을 의미한다. 나노클루는 구조의 자기-조립을 보조하는 팰린드롬 서열로 롤링 써클 증폭을 통해서 합성될 수 있다. 그 다음에 구체는 페이로드가 로딩될 수 있다. DNA 나노클루의 예는 하기 문헌에 기술된다: Sun W et al, J Am Chem Soc. 2014 Oct 22;136(42):14722-5; 및 Sun W et al, Angew Chem Int Ed Engl. 2015 Oct 5;54(41):12029-33. DNA 나노클로는 TnpB 폴리펩티드:핵산 성분 리보뉴클레오단백질 복합체 내에 핵산 성분 분자에 부분적으로 상보성인 팰린드롬 서열을 가질 수 있다. DNA 나노클로는 코팅될 수 있는데, 예를 들어 PEI로 코팅되어서 엔도솜 탈출을 유도할 수 있다.
금 나노입자
일 구현예에서, 전달 비히클은 금 나노입자 (AuNPs 또는 콜로이드 금이라고도 함)를 포함한다. 금 나노입자는 카고와 복합체, 예를 들어 TnpB 폴리펩티드:핵산 성분 RNP를 형성할 수 있다. 금 나노입자는 코팅될 수 있는데, 예를 들어 실리케이트 및 엔도솜 파괴 중합체, PAsp(DET)로 코팅될 수 있다. 금 나노입자의 예는 AuraSense Therapeutics의 구형 핵산 (SNA™) 구성체, 및 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Mout R, et al. (2017). ACS Nano 11:2452-8; Lee K, et al. (2017). Nat Biomed Eng 1:889-901.
iTOP
일 구현예에서, 전달 비히클은 iTOP를 포함한다. iTOP는 임의의 형질도입 펩티드와 독립적으로, 천연 단백질의 매우 효율적인 세포내 전달을 구동하는 소형 분자의 조합을 의미한다. iTOP는 세포외 거대분자의 세포로 거대음세포 흡수를 촉발하기 위해서 형질도입 화합물 (프로판베타인)과 함께 NaCl-매개 고삼투압을 사용하여, 삼투압 및 프로판베타인을 통해 유도 형질도입에 사용될 수 있다. iTOP 방법 및 시약의 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: D'Astolfo DS, Pagliero RJ, Pras A, et al. (2015). Cell 161:674-690.
중합체-기반 입자
일 구현예에서, 전달 비히클은 중합체-기반 입자 (예를 들어, 나노입자)를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 중합체-기반 입자는 막 융합의 바이러스 기전을 모방할 수 있다. 중합체-기반 입자는 인플루엔자 바이러스 기구의 합성 카피일 수 있고 산성 구획의 형성을 포함하는 과정인, 세포내이입 경로를 통해 세포가 흡수하는 다양한 유형의 핵산 (siRNA, miRNA, 플라스미드 DNA, 또는 shRNA, mRNA)과 형질감염 복합체를 형성한다. 후기 엔도솜의 저 pH는 화학 스위치로서 작용하여 입자 표면을 소수성으로 만들어서 막 크로싱을 촉진한다. 시토졸로 들어가면, 입자는 세포 작용을 위해 이의 페이로드를 방출한다. 이러한 활성 엔도솜 탈출 기술은 안전하고 천연 흡수 경로를 사용하므로 형질감염 효율을 최대화시킨다. 일 구현예에서, 중합체-기반 입자는 알킬화 및 카르복시알킬화 분지형 폴리에틸렌이민을 포함할 수 있다. 일례에서, 중합체-기반 입자는 VIROMER, 예를 들어, VIROMER RNAi, VIROMER RED, VIROMER mRNA이다. 본 명세서의 시스템 및 조성물을 전달하는 예시적인 방법은 하기 문헌에 기술된 것을 포함한다: Bawage SS et al., Synthetic mRNA expressed Cas13a mitigates RNA virus infections, biorxiv.org/content/10.1101/370460v1.full doi: doi.org/10.1101/370460, Viromer® RED, a powerful tool for transfection of keratinocytes. doi: 10.13140/RG.2.2.16993.61281, Viromer® Transfection - Factbook 2018: technology, product overview, users' data., doi:10.13140/RG.2.2.23912.16642.
스트렙토리신 O (SLO)
전달 비히클은 스트렙토리신 O (SLO)일 수 있다. SLO는 포유동물 세포막에 포어를 생성시켜서 작업하는 그룹 A 스트렙토코쿠스에 의해 생산되는 독소이다. SLO 는 가역적 방식으로 작용할 수 있어서, 전체 생존능 악화없이 세포의 시토졸로 단백질 (예를 들어, 최대 100 kDa)의 전달을 허용한다. SLO의 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Sierig G, et al. (2003). Infect Immun 71:446-55; Walev I, et al. (2001). Proc Natl Acad Sci U S A 98:3185-90; Teng KW, et al. (2017). Elife 6:e25460.
다기능성 엔벨로프-유형 나노장치 (MEND)
전달 비히클은 다기능성 엔벨로프-유형 나노장치 (MEND)를 포함할 수 있다. MEND는 응축 플라스미드 DNA, PLL 코어, 및 지질 필름 쉘을 포함할 수 있다. MEND는 세포-침투성 펩티드 (예를 들어, 스테아릴 옥타아르기닌)를 더 포함할 수 있다. 세포 침투성 펩티드는 지질 쉘에 존재할 수 있다. 지질 엔벨로프는 하나 이상의 기능성 성분, 예를 들어, 하기 중 하나 이상으로 변형될 수 있다: 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어 혈액 순환 시간 증가), 특이적 조직/세포의 표적화를 위한 리간드, 추가의 세포-침투성 펩티드 (예를 들어, 더 큰 세포 전달을 위함), 엔도솜 탈출을 증강시키는 지질, 및 핵 전달 태그. 일부 예에서, MEND 는 세포 핵 및 미토콘드리아를 표적화할 수 있는 테트라-라멜라 MEND (T-MEND)일 수 있다. 일정 예에서, MEND는 방광암 세포를 표적화할 수 있는, PEG-펩티드-DOPE-접합된 MEND (PPD-MEND)일 수 있다. MEND의 예는 하기 문헌에 기술된 것을 포함한다: Kogure K, et al. (2004). J Control Release 98:317-23; Nakamura T, et al. (2012). Acc Chem Res 45:1113-21.
지질-코팅된 메조다공성 실리카 입자
전달 비히클은 지질-코팅된 메조다공성 실리카 입자를 포함할 수 있다. 지질-코팅된 메조다공성 실리카 입자는 메조다공성 실리카 나조입자 코어 및 지질막 쉘을 포함한다. 실리카 코어는 큰 내부 표면적을 가져서, 높은 카고 로딩 능력을 야기한다. 일 구현예에서, 포어 크기, 포어 화학, 및 전체 입자 크기는 상이한 유형의 카고를 로딩하기 위해 변형될 수 있다. 입자의 지질 코팅은 또한 카고 로딩을 최대화하고, 순환 시간을 증가시키고, 정밀한 표적화 및 카고 방출을 제공하도록 변형될 수 있다. 지질-코팅된 메조다공성 실리카 입자의 예는 하기 문헌에 기술된 것을 포함한다: Du X, et al. (2014). Biomaterials 35:5580-90; Durfee PN, et al. (2016). ACS Nano 10:8325-45.
무기 나노입자
전달 비히클은 무기 나노입자를 포함한다. 무기 나노입자의 예는 탄소 나노튜브 (CNT) (예를 들어, [Bates K and Kostarelos K. (2013). Adv Drug Deliv Rev 65:2023-33.]에 기술된 바와 같음), 베어 메조다공성 실리카 나노입자 (MSNP) (예를 들어, [Luo GF, et al. (2014). Sci Rep 4:6064]에 기술된 바와 같음), 및 조밀한 실리카 나노입자 (SiNP) ([Luo D and Saltzman WM. (2000). Nat Biotechnol 18:893-5]에 기술된 바와 같음)를 포함한다.
엑소솜
전달 비히클은 엑소솜을 포함할 수 있다. 엑소솜은 다양한 유형의 생분자, 예컨대 단백질, 탄수화물, 지질, 및 핵산, 및 이의 복합체를 함유하고 전달하는데 사용될 수 있는, 막 결합 세포외 소포를 포함한다 (예를 들어, RNP). 엑소솜의 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Schroeder A, et al., J Intern Med. 2010 Jan;267(1):9-21; El-Andaloussi S, et al., Nat Protoc. 2012 Dec;7(12):2112-26; Uno Y, et al., Hum Gene Ther. 2011 Jun;22(6):711-9; Zou W, et al.,Hum Gene Ther. 2011 Apr;22(4):465-75. 예시적인 엑소솜은 293F 세포로부터 생성될 수 있는, mRNA-로딩된 엑소솜은 일부 예에서 mRNA 로딩된 LNP에 비해서 더 높은 mRNA 발현을 구동한다. 참조: 예를 들어, J. Biol. Chem. (2021) 297(5) 101266
일례에서, 엑소솜은 카고의 하나 이상의 성분에 (예를 들어, 직접적으로 또는 간접적으로 결합하여) 복합체를 형성할 수 있다. 일정 예에서, 엑소솜의 분자는 제1 어댑터 단백질과 융합될 수 있고, 카고의 성분은 제2 어댑터 단백질과 융합될 수 있다. 제1 및 제2 어댑터 단백질은 서로 특이적으로 결합될 수 있어서, 카고를 엑소솜에 연합시킬 있다. 이러한 엑소솜의 예는 하기 문헌에 기술된 것을 포함한다: Ye Y, et al., Biomater Sci. 2020 Apr 28. doi: 10.1039/d0bm00427h.
레트로바이러스 유사 전달 시스템
전달 비히클은 바이러스-유사 입자에 카고를 도입시킬 수 있는, 레트로-바이러스 유사 단백질, 예컨대 PEG10을 포함할 수 있다. 이와 같이 시스템은 특이적 카고를 패키징하도록 재-프로그램될 수 있어서, 본 명세서에 개시된 TnpB 시스템의 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 레트로-바이러스 유사 VLP로 TnpB 성분의 선택적 패키징을 야기시키는 인식 서열에 의해 추가로 변형될 수 있다. 상기 VLP는 조직 또는 세포 특이성을 부여하는 융합성 단백질로 추가로 변형될 수 있다. 예시적인 시스템은 하기 문헌에 개시되어 있고, 이들을 참조로 본 명세서에 편입시킨다: Segel et al. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped f또는 mRNA delivery. 373 Science, 882-889 (2021). 바이러스 유사 입자를 형성하고 mRNA 카고를 전달할 수 있는 천연 단백질, 또는 SEND (Selective Endogenous eNcapsidation for cellular Delivery)의 이용은 다른 전달 접근법과 비교하여 면역원성 반응을 감소시킬 수 있다.
유전자 변형된 세포 및 유기체
본 개시는 본 개시의 조성물 및 시스템의 하나 이상의 성분, 예를 들어, TnpB 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 포함하는 세포를 더 제공한다. 또한 본 명세서의 시스템 및 방법에 의해 변형된 세포, 및 이러한 세포 또는 이의 자손을 포함하는 세포 배양물, 조직, 장기, 유기체를 포함하는 것이 또한 제공된다. 일 구현예에서, 세포 또는 유기체를 변형시키는 방법을 제공한다. 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 포유 동물 세포는 많은 경우 비-인간 영장류, 소, 돼지, 설치류 또는 마우스 세포일 수 있다. 세포는 비-포유류 진핵생물 세포 예컨대 가금류, 어류 또는 새우의 세포일 수 있다. 세포는 치료 T 세포 또는 항체 생산 B 세포일 수 있다. 세포는 식물 세포일 수도 있다. 식물 세포는 카사바, 옥수수, 수수, 밀 또는 쌀과 같은 작물 식물의 것일 수 있다. 식물 세포는 또한 조류, 수목 또는 채소의 세포일 수 있다. 본 발명에 의해 세포에 도입된 변형은, 세포 및 세포의 자손이 항체, 전분, 알콜 또는 기타 바람직한 세포 산출물과 같은 생물학적 생성물의 개선된 생산에 대해 변경되도록 할 수 있다. 본 발명에 의해 세포에 도입된 변형은 세포 및 세포의 자손이 생성된 생물학적 생성물을 변화시키는 변경을 포함하도록 하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, TnpB 시스템의 하나 이상의 구성요소를 포함하는 조성물, 시스템, 또는 전달 시스템의 하나 이상의 구성요소의 발현을 구동하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 또는 벡터 시스템은 숙주 세포로 도입되어서 TnpB 시스템의 구성요소의 발현은 하나 이상의 표적 부위에서 TnpB-표적화 복합체의 형성을 유도한다. 본 발명의 일 구현예에서 숙주 세포는 진핵생물 세포, 진핵생물 세포, 또는 식물 세포일 수 있다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 세포주의 세포이다. 세포주는 당업자에게 공지된 다양한 공급원으로부터 입수 가능하다 (참조: 예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Va)). 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포는 하나 이상의 벡터-유래 서열을 포함하는 새로운 세포주를 확립하는 데 사용된다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 시스템의 성분으로 (예컨대, 하나 이상의 벡터의 일시적 형질감염, 또는 RNA에 의한 형질감염에 의해) 일시적으로 형질감염되고 복합체 활성을 통해 변형된 세포는 변형을 함유하지만 임의의 다른 외생성 서열을 결여하는 세포를 포함하는 새로운 세포주를 확립하는 데 사용된다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 벡터에 의해 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된 세포, 또는 이러한 세포로부터 유래된 세포주는 하나 이상의 시험 화합물을 평가하는데 사용된다.
본 명세서의 임의의 구현예에 기술된 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포 중 하나 이상을 포함하는 단리된 인간 세포 또는 조직, 식물 또는 비-인간 동물을 더 의도한다. 일 양태에서, (단리된) 줄기 세포 및 이의 자손을 포함하는 본 발명의 조성물, 시스템 또는 변형된 효소에 의해 변형되거나 또는 이들을 포함하는 숙주 세포 및 세포주가 제공된다.
일 구현예에서, 식물 또는 비-인간 동물은 식물 또는 비-인간 동물의 적어도 하나의 조직 유형에 본 명세서의 임의 구현예에 기술된 시스템 성분, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포 중 적어도 하나를 포함한다. 일 구현예에서, 비-인간 동물은 적어도 하나의 조직 유형에서 본 명세서의 임의 구현예에 기술된 시스템 성분, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포 중 적어도 하나를 포함한다. 일 구현예에서, 시스템 성분의 존재는 그들이 시간 경과에 따라 분해된다는 점에서, 일시적이다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포에 포함된 임의 구현예에 기술된 시스템 및 조성물의 성분의 발현은 식물 또는 비-인간 동물에서 일정 조직 유형 또는 영역에 제한된다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포에 포함된 임의 구현예에 기술된 시스템 및 조성물의 성분의 발현은 생리학적 신호에 의존한다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포에 포함된 임의 구현예에 기술된 시스템 및 조성물의 성분의 발현은 외생성 분자에 의해 촉발될 수 있다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포에 포함되는 임의 구현예에 기술된 시스템 및 조성물의 성분의 발현은 식물 또는 비-인간 동물에서 비-TnpB 분자의 발현에 의존적이다.
일반적인 적용 및 용도
본 명세서에 기재된 시스템, 벡터 시스템, 벡터 및 조성물은 다양한 핵산-표적화 응용, 유전자 산물, 예컨대 단백질의 합성 변경 또는 변형, 핵산 절단, 핵산 편집, 핵산 스플라이싱; 표적 핵산의 수송, 표적 핵산의 추적, 표적 핵산의 단리, 표적 핵산의 시각화 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 양태는 또한, 예를 들어 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서, 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포에서, 하나 이상의 유전자 또는 하나 이상의 유전자 산물의 발현을 변경하거나 조작하기 위한, 게놈 조작에서 본 명세서에 기재된 조성물 및 시스템의 방법 및 용도를 포함한다. 일례에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 핵 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 또는 엽록체 DNA를 포함한, 게놈 DNA 내 표적 서열이다.
전형적으로, TnpB 시스템의 상황에서, TnpB 복합체 (표적 서열과 혼성화하고 하나 이상의 핵산-표적화 이펙터 단백질과 복합체를 형성하는 핵산 성분 분자 (ωRNA)를 포함)의 형성은 표적 서열에서 또는 근처에서 (예를 들어, 그로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 이상의 염기쌍 내에서) DNA 또는 RNA 가닥 중 하나 또는 둘 모두의 절단을 일으킨다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "관심 표적 유전자좌와 연관된 서열(들)"은 표적 서열 근처 서열 (예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 이상의 염기쌍 내로서, 표적 서열은 관심 표적 유전자좌 내에 포함됨)을 의미한다.
일 구현예에서, 본 개시는 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플 (예컨대, 세포, 세포의 개체군, 조직, 장기, 또는 유기체)을 조성물, 시스템, 폴리뉴클레오티드(들) 또는 벡터(들)와 접촉시키는 단계를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 표적화하는 방법을 제공한다. 접촉은 유전자 산물의 변형 또는 유전자 산물의 양 또는 발현의 변형을 야기한다. 일례에서, 접촉은 유전자 생산물의 변형 또는 유전자 생산물의 양 또는 발현의 변형을 야기한다.
일 구현예에서, 본 개시는조성물, 2개 중 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 벡터를 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 세포의 개체군에 전달하는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법을 제공하고, 복합체는 역전사효소를 표적 서열로 유도하고, 역전사효소는 핵산 성분으로부터 표적 폴리뉴클레오티드로 도너 서열의 삽입을 촉진한다.
표적 폴리뉴클레오티드의 예는 신호전달 생화학적 경로와 연관된 서열, 예를 들어, 신호전달 생화학적 경로-연관된 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예는 질환 연관 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "질환-연관된" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 비-질환 대조군의 조직 또는 세포와 비교하여 질환-발생된 조직으로부터 유래된 세포에서 비정상 수준 또는 비정상 형태의 전사 또는 번역 생성물을 산출하는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이것은 비정상적으로 높은 수준으로 발현되게 되는 유전자일 수 있거나, 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되게 되는 유전자일 수 있고, 여기서 변경된 발현은 질환의 발생 및/또는 진행과 상관된다. 질환-연관된 유전자는 또한 질환의 병인론에 책임이 있는 유전자(들)와의 연결 불균형 상태 또는 직접적으로 책임이 있는 유전자 프로세싱 돌연변이(들) 또는 유전 변이를 지칭한다. 전사 또는 번역 산물은 기지 또는 미지일 수 있고, 정상 또는 비정상 수준일 수 있다.
복합체의 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵생물 세포에 내생성 또는 외생성인 임의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵생물 세포의 핵에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 유전자 산물 (예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열 (예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드 또는 정크 DNA)일 수 있다. 이론에 국한하고 싶지 않지만, 표적 서열은 TAM (표적 인접 모티프)와 연관되어야 하는 것으로 여겨지고, 다시 말해서, 복합체에 의해 인식되는 짧은 서열이다. TAM에 대한 정확산 서열 및 길이 요건은 사용되는 TnpB 폴리펩티드에 의존하여 상이하지만, TAM은 전형적으로 프로토스페이서에 인접한 2-5 염기쌍 서열 (즉, 표적 서열)이다. TAM 특이성은 예를 들어 도 8에 기술된 실험 설정에 따라서 결정될 수 있다. 일 구현예에서, TAM 서열은 TCA를 포함한다. 구현예에서, TAM 서열은 TCAN이고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 구현예에서 TAM 서열은 TCAG 또는 TCAT를 포함한다. 당업자는 소정 TnpB 폴리펩티드와 사용을 위한 추가 TAM 서열을 확인할 수 있을 것이다. 추가로, TAM 상호작용 (PI) 도메인의 조작은 TAM 특이성의 프로그래밍을 허용할 수 있고, 표적 부위 인식 충실도를 개선시킬 수 있고, TnpB 폴리펩티드, 게놈 조작 플랫폼의 다재다능성을 증가시킬 수 있다. TnpB 폴리펩티드는 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 바와 같이, 그들 TAM 특이성을 변경시키도록 조작될 수 있다: Kleinstiver BP et al. engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered TAMspecificities. Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5. doi: 10.1038/nature14592.
표적 폴리뉴클레오티드의 예는 신호전달 생화학적 경로와 연관된 서열, 예를 들어, 신호전달 생화학적 경로-연관된 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예는 질환 연관 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 질환-연관된" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 비-질환 대조군의 조직 또는 세포와 비교하여 질환-발생된 조직으로부터 유래된 세포에서 비정상 수준 또는 비정상 형태의 전사 또는 번역 산물을 산출하는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이것은 비정상적으로 높은 수준으로 발현되게 되는 유전자일 수 있거나, 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되게 되는 유전자일 수 있고, 여기서 변경된 발현은 질환의 발생 및/또는 진행과 상관된다. 질환-연관된 유전자는 또한 질환의 병인론에 책임이 있는 유전자(들)와의 연결 불균형 상태 또는 직접적으로 책임이 있는 유전자 프로세싱 돌연변이(들) 또는 유전 변이를 지칭한다. 전사 또는 번역 산물은 기지 또는 미지일 수 있고, 정상 또는 비정상 수준일 수 있다.
발명의 양태는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 본 명세서의 임의의 구현예에 기술된 바와 같은 조성물, 시스템 또는 TnpB 폴리펩티드, 본 명세서의 임의의 구현예에 기술된 바와 같은 조성물, 시스템 또는 TnpB 폴리펩티드를 포함하는 전달 시스템, 본 명세서의 임의의 구현예에 기술된 바와 같은 조성물, 시스템 또는 TnpB 폴리펩티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 본 명세서의 임의의 구현예에 기술된 바와 같은 조성물, 시스템 또는 TnpB 폴리펩티드를 포함하는 벡터, 또는 본 명세서의 임의의 구현예에 기술된 바와 같은 조성물, 시스템 또는 TnpB 폴리펩티드를 포함하는 벡터 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하는 폴리뉴크레오티드를 표적화하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 적어도 2종의 상이한 조성물, 시스템 또는 TnpB 폴리펩티드와 접촉된다. 추가 구현예에서, 2종의 상이한 TnpB 폴리펩티드는 상이한 표적 폴리뉴클레오티드 특이성 또는 특이성 정도를 갖는다. 일 구현예에서, 2종의 상이한 TnpB 폴리펩티드는 상이한 TAM 특이성을 갖는다.
또한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 본 명세서의 조성물 및 시스템, 벡터, 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 표적화하는 방법을 고려하고, 접촉은 유전자 산물의 변형 또는 유전자 산물의 양 또는 발현의 변형을 일으킨다. 일 구현예에서, 표적화된 유전자 산물의 발현은 방법을 통해 증가된다. 일 구현예에서, 표적화된 유전자 산물의 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 100% 까지 증가시킨다. 일 구현예에서, 표적화된 유전자 산물의 발현은 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 2.5-배, 적어도 3-배, 적어도 3.5-배, 적어도 3.5-배, 적어도 4-배, 적어도 4.5-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배까지 증가된다. 일 구현예에서, 표적화된 유전자 산물의 발현은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100% 까지 감소된다. 일 구현예에서, 표적화된 유전자 산물의 발현은 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 2.5-배, 적어도 3-배, 적어도 3.5-배, 적어도 3.5-배, 적어도 4-배, 적어도 4.5-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 25-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배 까지 감소된다. 대안적인 구현예에서, 표적화된 유전자 산물의 발현은 방법에 의해 감소된다. 추가 구현예에서, 표적화된 유전자의 발현은 완전하게 제거될 수 있거나, 또는 표적화된 유전자의 남은 발현 수준이 유전자의 발현 수준을 정량, 검출, 또는 모니터링하는데 사용되는 당분야에 공지된 방법의 검출 한계 이하로 떨어지면 제거된 것으로 간주될 수 있다.
일 구현예에서, TnpB 시스템의 하나 이상의 구성요소의 발현을 구동하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 또는 벡터 시스템, 또는 TnpB 시스템의 하나 이상의 구성요소를 포함하는 전달 시스템이 숙주 세포에 도입되어서 TnpB 시스템의 구성요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 TnpB-표적화 복합체의 형성을 유도한다. 본 발명의 일 구현예에서 숙주 세포는 진핵생물 세포, 원핵생물 세포, 또는 식물 세포일 수 있다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 세포주의 세포이다. 세포주는 당업자에게 공지된 다양한 공급원으로부터 입수 가능하다 (참조: 예를 들어, the American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Va.)). 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포는 하나 이상의 벡터-유래 서열을 포함하는 새로운 세포주를 확립하는 데 사용된다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 시스템의 성분으로 (예컨대, 하나 이상의 벡터의 일시적 형질감염, 또는 RNA에 의한 형질감염에 의해) 일시적으로 형질감염되고 복합체 활성을 통해 변형된 세포는 변형을 함유하지만 임의의 다른 외생성 서열을 결여하는 세포를 포함하는 새로운 세포주를 확립하는 데 사용된다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비일시적으로 형질감염된 세포, 또는 이러한 세포로부터 유래된 세포주는 하나 이상의 시험 화합물을 평가하는 데 사용된다.
본 명세서의 임의의 구현예에 기술된 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포 중 하나 이상을 포함하는 단리된 인간 세포 또는 조직, 식물 또는 비-인간 동물을 더 의도한다. 일 양태에서, (단리된) 줄기 세포 및 이의 자손을 포함하는 본 발명의 조성물, 시스템 또는 변형된 효소에 의해 변형되거나 또는 이들을 포함하는 숙주 세포 및 세포주가 제공된다.
일 구현예에서, 식물 또는 비-인간 동물은 식물 또는 비-인간 동물의 적어도 하나의 조직 유형에 본 명세서의 임의 구현예에 기술된 조성물, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포 중 적어도 하나를 포함한다. 일정 구현예에서, -인간 동물은 적어도 하나의 조직 유형에서 본 명세서의 임의 구현예에 기술된 조성물, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포 중 적어도 하나를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물의 존재는 그들이 시간 경과에 따라 분해된다는 점에서, 일시적이다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포에 포함된 임의 구현예에 기술된 조성물의 발현은 식물 또는 비-인간 동물에서 일정 조직 유형 또는 영역에 제한된다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포에 포함된 임의 구현예에 기술된 조성물의 발현은 생리학적 신호에 의존한다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포에 포함된 임의 구현예에 기술된 조성물의 발현은 외생성 분자에 의해 촉발될 수 있다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터, 벡터 시스템, 또는 세포에 포함된 임의 구현예에 기술된 조성물의 발현은 식물 또는 비-인간 동물에서 비-Cas 분자의 발현에 의존적이다.
일 양태에서, 본 발명은 TnpB 시스템의 하나 이상의 구성요소를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 TnpB-표적화 복합체는 표적 DNA 또는 RNA (단일 또는 이중 가닥, 선형 또는 수퍼-코일)를 변형시키기 위한 효과적인 수단을 제공한다. 본 발명의 TnpB-표적화 복합체는다수 세포 유형에서 표적 DNA 또는 RNA를 변형 (예를 들어, 결실, 삽입, 전좌, 불활성화, 활성화)시키는 단계를 포함하는 다양한 활용성을 갖는다. 이와 같이, 본 발명의 TnpB-표적화 복합체는 예를 들어, 유전자 요법, 약물 스크리닝, 질환 진단, 및 예후에서, 광범위한 적용성을 갖는다. 예시적인 TnpB-표적화 복합체는 관심 표적 유전자좌 내 표적 서열에 혼성화하는 핵산 성분 분자와 복합체를 형성하는 DNA 또는 RNA-표적화 이펙터 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드를 절단하는 방법을 제공한다. 방법은 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하여 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 실시하는 TnpB-표적화 복합체를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 TnpB-표적화 복합체는 세포에 도입될 때, 폴리뉴클레오티드 서열에 파손 (예를 들어, 단일 또는 이중 가닥 파손)을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 방법은 세포에서 질환 폴리뉴클레오티드를 절단하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상류 서열 및 하류 서열이 측접하는 통합하려는 서열을 포함하는 외생성 주형이 세포에 도입될 수 있다. 상류 및 하류 서열은 폴리뉴클레오티드 내 통합 부위의 어느 한 측면과의 서열 유사성을 공유한다. 외생성 주형은 통합하려는 서열 (예를 들어, 돌연변이된 RNA)을 포함한다. 통합을 위한 서열은 세포에 대해 내생성 또는 외생성 서열일 수 있다. 통합시키려는 서열의 예로는 단백질 또는 비-코딩 RNA (예를 들어, 마이크로RNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 통합을 위한 서열은 적절한 제어 서열 또는 서열들에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 통합될 서열은 조절 작용을 제공할 수 있다. 재조합 주형에서 상류 또는 하류 서열은 관심 RNA 서열 및 재조합 간 재조합을 촉진하도록 선택된다. 상류 서열은 통합을 위한 표적화된 부위의 상류 서열과 서열 유사성을 공유하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 유사하게, 하류 서열은 통합의 표적화된 부위 하류의 폴리뉴클레오티드 서열과 서열 유사성을 공유하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 재조합 주형에서 상류 또는 하류 서열은 표적화된 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게, 재조합 주형에서 상류 또는 하류 서열은 표적화된 서열과 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 방법에서, 재조합 주형에서 상류 또는 하류 서열은 표적화된 서열과 약 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 상류 또는 하류 서열은 약 20 bp 내지 약 2500 bp, 예를 들어, 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 또는 2500 bp를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 예시적인 상류 또는 하류 서열은 약 200 bp 내지 약 2000 bp, 약 600 bp 내지 약 1000 bp, 또는 보다 특히 약 700 bp 내지 약 1000 bp를 갖는다. 일부 방법에서, 재조합 주형은 마커를 더 포함할 수 있다. 그러한 마커는 표적된 통합을 스크리닝하기 쉽게 만들 수 있다. 적합한 마커의 예로는 제한 부위, 형광 단백질 또는 선택성 마커를 포함한다. 본 발명의 재조합 주형은 재조합 기술을 사용해 구축될 수 있다 (참조: 예를 들어, Sambrook et al., 2001 and Ausubel et al., 1996). 재조합 주형을 통합시켜서 표적 서열을 변형시키기 위한 방법에서, 파손 (예를 들어, 이중 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA에서 이중 또는 단일 가닥 파손)은 TnpB-표적화 복합체에 의해 DNA 또는 RNA 서열에 도입되고, 파손은 재조합 주형과 상동성 재조합을 통해 복구되어서 주형이 표적에 통합된다. 이중-가닥 파손의 존재는 주형의 통합을 촉진한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 진핵생물 세포에서 RNA의 발현을 변형시키는 방법을 제공한다. 방법은 DNA 또는 RNA (예를 들어, mRNA 또는 프리-mRNA)에 결합하는 TnpB-표적화 복합체를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키거나 또는 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 방법에서, 표적은 세포에서 발현의 변형에 영향을 미치도록 불활성화될 수 있다. 예를 들어,세포에서 표적 서열에 대한 TnpB-표적화 복합체의 결합 시, 표적은 불활성화되어서 서열은 번역되지 않고, 코딩된 단백질이 생산되지 않거나, 또는 서열은 야생형 서열처럼 기능하지 않는다. 예를 들어, 단백질 또는 마이크로RNA 코딩 서열은 불활성화되어서 단백질 또는 마이크로RNA 또는 프리-마이크로RNA 전사물은 생산되지 않는다. TnpB-표적화 복합체의 표적은 진핵생물 세포에 내생성 또는 외생성인 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포의 핵에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 유전자 산물 (예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열 (예를 들어, ncRNA, lncRNA, tRNA, 또는 rRNA)일 수 있다. 표적 RNA의 예는 신호전달 생화학적 경로와 연관된 서열, 예를 들어, 신호전달 생화학적 경로-연관된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예는 질환 연관된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "질환-연관" 폴리뉴클레오티드는 비질환 대조군의 조직 또는 세포와 비교하여 질환 영향받은 조직에서 유래하는 세포에서 비정상적인 형태 또는 비정상적인 수준으로 번역 산물을 산출하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이것은 비정상적으로 높은 수준으로 발현되게 되는 유전자일 수 있거나, 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되게 되는 유전자일 수 있고, 여기서 변경된 발현은 질환의 발생 및/또는 진행과 상관된다. 질환-연관된 유전자는 또한 질환의 병인론에 책임이 있는 유전자(들)와의 연결 불균형 상태 또는 직접적으로 책임이 있는 유전자 프로세싱 돌연변이(들) 또는 유전 변이를 지칭한다. 번역된 생성물은 기지이거나 또는 미지일 수 있고, 정상 또는 비정상 수준일 수 있다. TnpB-표적화 복합체의 표적 RNA는 진핵생물 세포에 내생성 또는 외생성인 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 RNA는 진핵생물 세포의 핵에 존재하는 RNA일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 유전자 산물 (예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열 (예를 들어, ncRNA, lncRNA, tRNA, 또는 rRNA)일 수 있다.
일 구현예에서, 방법은 조성물이 표적 DNA 또는 RNA에 결합하여서 상기 표적 DNA 또는 RNA의 절단을 실시하도록 허용하여서 표적 DNA 또는 RNA를 변형시키는 단계를 포함할 수 있고, TnpB-표적화 복합체는 상기 표적 DNA 또는 RNA 내에서 표적 서열과 혼성화하는 핵산 성분 분자와 복합체를 형성하는 핵산-표적화 이펙터 단백질을 포함한다. 일 양태에서, 본 발명은 진핵생물 세포에서 DNA 또는 RNA의 발현을 변형시키는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 방법은 TnpB-표적화 복합체가 DNA 또는 RNA에 결합하도록 허용하여서 상기 결합에 의해서 상기 DNA 또는 RNA의 발현이 증가되거나 또는 감소되는 것인 단계를 포함하고, TnpB-표적화 복합체는 핵산 성분 분자와 복합체 형성하는 핵산-표적화 이펙터 단백질을 포함한다. 유사한 고려사항 및 조건이 표적 DNA 또는 RNA를 변형시키는 방법을 위해 상기에서 처럼 적용된다. 실제로, 이들 샘플링, 배양 및 재도입 옵션들이 본 발명의 양태들에 걸쳐 적용된다. 일 양태에서, 본 발명은 생체내, 생체외 또는 시험관내일 수 있는, 진핵생물 세포에서 표적 DNA 또는 RNA를 변형시키는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 방법은 인간 또는 비-인간 동물로부터 세포 또는 세포의 개체군을 샘플채취하는 단계, 및 세포 또는 세포들을 변형시키는 단계를 포함한다. 배양은 생체 외에서 임의의 단계에서 발생할 수 있다. 세포 또는 세포들은 비-인간 동물 또는 식물 내로 재도입될 수도 있다. 재도입된 세포의 경우, 세포는 줄기 세포인 것이 특히 바람직할 수 있다. 본 명세서의 임의 구현예에 기술된 바와 같은 조성물은 핵산 식별자를 검출하는데 사용될 수 있다. 핵산 식별자는 특정한 물품을 식별하는데 사용될 수 있는 비코딩 핵산이다. 일례의 핵산 식별자, 예컨대 DNA 워터마크는 하기 문헌에 기술된다: Heider and Barnekow. "DNA watermarks: A proof of concept" BMC Molecular Biology 9:40 (2008). 핵산 식별자는 또한 핵산 바코드일 수 있다. 핵산 기반 바코드는 회합된 분자, 예컨대 표적 분자 및/또는 표적 핵산에 대한 식별자로서 사용되는 짧은 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, DNA, RNA, 또는 이의 조합) 이다. 핵산 바코드는 적어도, 예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있고, 단일-가닥 형태일 수 있거나 또는 이중-가닥 형태일 수 있다. 하나 이상의 핵산 바코드는 표적 분자 및/또는 표적 핵산에 부착, 또는 "태그화" 될 수 있다. 이러한 부착은 직접적 (예를 들어, 표적 분자에 바코드의 공유 또는 비공유 결합)일 수 있거나 또는 간접적 (예를 들어, 추가 분자, 예를 들어, 특이적 결합제, 예컨대 항체 (또는 다른 단백질) 또는 바코드 수용 어댑터 (또는 다른 핵산 분자)를 통해서) 일 수 있다. 표적 분자 및/또는 표적 핵산은 조합적인 방식으로 다수 핵산 바코드, 예컨대 핵산 바코드 콘카테머로 표지될 수 있다. 전형적으로, 핵산 바코드는 특정한 구획 (예를 들어, 이산 부피) 으로부터, 특정한 물리적 특성 (예를 들어, 친화성, 길이, 서열 등) 을 갖는 것으로, 또는 일정한 처리 조건을 겪은 것으로, 표적 분자 및/또는 표적 핵산을 식별하는데 사용된다. 표적 분자 및/또는 표적 핵산은 모든 이들 특성 (및 그 이상) 에 관한 정보를 제공하도록 다수의 핵산 바코드와 회합될 수 있다. 핵산-바코드를 생성하는 방법은 예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2014/047561에 개시되어 있다.
일 구현예에서, 조성물은 HDR-매개 교정을 유도하려는 목적으로 이중 가닥 파손을 유도한다. 추가 구현예에서, TnpB 폴리펩티드 또는 이의 오솔로그 또는 상동체와 복합체를 형성하는 둘 이상의 핵산 성분 분자는 HDR-매개 교정을 유도하려는 목적을 위해서 다중화된 파손을 유도하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 재조합 주형 핵산은 표적 위치의 구조를 변경하기 위해 본 명세서에 개시된 조성물과 함께 사용될 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 일 구현예에서, 표적 핵산은 전형적으로 절단 부위(들)에서 또는 그 근처에서, 재조합 주형 핵산의 서열의 일부 또는 전부를 갖도록 변형된다. 일 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 단일 가닥이다. 대안적인 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 이중 가닥이다. 일 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 DNA, 예를 들어, 이중 가닥 DNA이다. 대안적인 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 단일 가닥 DNA이다.
일 구현예에서, 재조합 주형은 상동성 재조합에서, 예컨대 TnpB-표적화 복합체의 일부로서 핵산-표적화 이펙터 단백질에 의해 절단되거나 또는 닉형성되는 표적 서열 내 또는 그 근처에서, 주형으로서 역할하도록 제공된다.
재조합 주형은 별도의 벡터에 포함되거나 또는 별도의 폴리뉴클레오티드로 제공되는, 본 명세서에 기술된 다른 벡터의 성분일 수 있다. 재조합 주형 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 길이, 예컨대 약 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 일부에 상보적이다. 최적으로 정렬된 경우 재조합 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 이상의 뉴클레오티드)와 중복될 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 주형 서열 및 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 최적으로 정렬될 때, 재조합 주형 폴리뉴클레오티드의 가장 가까운 뉴클레오티드는 표적 서열로부터 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 이상의 뉴클레오티드 이내에 있다.
일 구현예에서, 재조합 형 핵산은 상동성 재조합에 참여함으로써 표적 위치의 구조를 변경시킨다. 일 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 표적 위치의 서열을 변경시킨다. 일 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 표적 핵산으로 변형되거나, 또는 비-천연 발생 염기의 도입을 야기한다.
재조합 주형 서열은 표적 서열과 파손 매개되거나 또는 촉매된 재조합을 겪을 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 TnpB 폴리펩티드 매개 절단 사건에 의해 절단되는 표적 서열 상의 부위에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 제1 TnpB 폴리펩티드 매개된 사건에서 절단되는 표적 서열 상의 제1 부위 및 제2 TnpB 폴리펩티드 매개 사건에서 절단되는 표적 서열 상의 제2 부위 둘 모두에 상응하는 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 번역된 서열의 코딩 서열 내에서의 변경을 초래하는 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 단백질 생성물 내에서 하나의 아미노산을 또 다른 것으로 치환, 예를 들어 돌연변이체 대립유전자를 야생형 대립유전자로 형질전환, 야생형 대립유전자를 돌연변이체 대립유전자로 형질전환, 및/또는 중지 코돈의 도입, 아미노산 잔기의 삽입, 아미노산 잔기의 결실, 또는 논센스 돌연변이를 초래하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 비-코딩 서열에서의 변경, 예를 들어 엑손에서의 변경 또는 5' 또는 3' 비-번역 또는 비-전사된 영역을 초래하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 제어 구성요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 및 시스-작용 또는 트랜스-작용 제어 구성요소에서의 변경을 포함한다.
표적 유전자에서 표적 위치와의 상동성을 갖는 재조합 주형 핵산은 표적 서열의 구조를 변경시키는 데 사용될 수 있다. 재조합 주형 서열은 원치않는 구조, 예를 들어 원치않는 또는 돌연변이체 뉴클레오티드를 변경시키는 데 사용될 수 있다. 재조합 주형 핵산은 통합될 때, 양성 제어 구성요소의 활성 감소; 양성 제어 구성요소의 활성 증가; 음성 제어 구성요소의 활성 감소; 음성 제어 구성요소의 활성 증가; 유전자의 발현 감소; 유전자의 발현 증가; 질병 또는 질환에 대한 내성 증가; 바이러스 진입에 대한 내성 증가;돌연변이 교정 또는 유전자 산물의 생물학적 속성을 부여, 증가, 폐기 또는 감소시키는 원치 않는 아미노산 잔기의 변경, 예를 들어 효소의 효소 활성 증가, 또는 다른 분자와 상호작용하는 유전자 산물의 능력 증가를 야기시키는 서열을 포함할 수 있다.
재조합 주형 핵산은 표적 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 이상의 뉴클레오티드 서열의 변화를 초래하는 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 20+/- 10, 30+/- 10, 40+/- 10, 50+/- 10, 60+/- 10, 70+/- 10, 80+/- 10, 90+/- 10, 100+/- 10, 1 10+/- 10, 120+/- 10, 130+/- 10, 140+/- 10, 150+/- 10, 160+/- 10, 170+/- 10, 1 80+/- 10, 190+/- 10, 200+/- 10, 210+/-10, 220+/- 10 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 30+/-20, 40+/-20, 50+/-20, 60+/-20, 70+/- 20, 80+/-20, 90+/-20, 100+/-20, 1 10+/-20, 120+/-20, 130+/-20, 140+/-20, I 50+/-20, 160+/-20, 170+/-20, 180+/-20, 190+/-20, 200+/-20, 210+/-20, 220+/-20 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 주형 핵산은 10 내지 1,000, 20 내지 900, 30 내지 800, 40 내지 700, 50 내지 600, 50 내지 500, 50 내지 400, 50 내지 300, 50 내지 200, 또는 50 내지 100 뉴클레오티드 길이이다.
재조합 주형 핵산은 하기 성분을 포함할 수 있다: [5' 상동성 팔부]-[치환 서열]-[3' 상동성 팔부]. 상동성 팔부는 염색체 내로의 재조합을 제공하고, 따라서 원하지 않는 구성요소, 예를 들어 돌연변이 또는 특징을 치환 서열로 대체시킨다. 일 구현예에서, 상동성 팔부는 가장 원위의 절단 부위에 측접한다. 일 구현예에서, 5' 상동성 팔부의 3' 말단은 치환 서열의 5' 말단 다음의 위치이다. 일 구현예에서, 5' 상동성 팔부는 치환 서열의 5' 말단으로부터 5'으로 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 뉴클레오티드가 연장될 수 있다. 일 구현예에서, 3' 상동성 팔부의 5' 말단은 치환 서열의 3' 말단 옆의 위치이다. 일 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 치환 서열의 3' 말단으로부터 3'으로 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000 뉴클레오티드가 연장될 수 있다.
일 구현예에서, 하나 또는 양쪽 상동성 팔부는 일정 서열 반복부 구성요소의 포함을 피하도록 단축될 수 있다. 예를 들어, 5' 상동성 팔부는 서열 반복부 구성요소의 포함을 피하도록 단축될 수 있다. 다른 구현예에서, 3' 상동성 팔부는 서열 반복부 구성요소의 포함을 피하도록 단축될 수 있다. 일 구현예에서, 5' 및 3' 상동성 팔부 둘 모두는 일정 서열 반복부 구성요소의 포함을 피하도록 단축될 수 있다.
일 구현예에서, 돌연변이 교정을 위한 재조합 주형 핵산은 단일-가닥 올리고뉴클레오티드로서 사용을 위해 디자인될 수 있다. 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 사용할 때, 5' 및 3' 상동성 팔부는 최대 약 200 염기쌍 (bp) 길이, 예를 들어 적어도 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200 bp 길이 범위일 수 있다.
DNA 수준에서 유전자를 돌연변이시켜서 발현을 영구적으로 제거하는, TnpB 폴리펩티드-매개 유전자 녹아웃과 달리, TnpB 폴리펩티드 녹다운은 인공 전사 인자의 사용을 통해서 유전자 발현의 일시적 감소를 허용한다. TnpB 폴리펩티드의 양쪽 DNA 절단 도메인 중 핵심 잔기의 돌연변이는 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드의 생성을 야기한다. 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드는 핵산 성분 분자와 복합체를 형성하고 그 핵산 성분 분자의 표적화 도메인에 의해 특정되는 DNA 서열에 위치되지만, 표적 DNA를 절단하지 않는다. 이펙터 도메인, 예를 들어, 전사 억제 도메인에 대한 불활성 TnpB 폴리펩티드 단백질의 융합은 핵산 성분 분자에 의해 특정된 임의 DNA 부위로 이펙터의 동원을 가능하게 한다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드는 전사 억제 도메인에 융합될 수 있고, 유전자의 프로모터 영역으로 동원될 수 있다. 특히 유전자 억제 경우에, 내생성 전사 인자의 결합 부위 차단이 유전자 발현의 하향 조절에 도움이 된다는 것을 본 명세서에서 고려한다. 다른 구현예에서, 불활성 TnpB 폴리펩티드는 염색질 변형 단백질에 융합될 수 있다. 염색질 상태 변경으로 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
일 구현예에서, 핵산 성분 분자는 기지 전사 반응 구성요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 등), 기지 상류 활성화 서열, 및/또는 표적 DNA의 발현을 제어할 수 있다고 의심되는 기지 또는 미지 기능의 서열에 대해 표적화될 수 있다.
일부 방법에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현의 변형을 일으키도록 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 세포 내 표적 서열에 조성물의 결합 시, 표적 폴리뉴클레오티드는 불활성화되어서 서열이 전사되지 않거나, 코딩되는 단백질이 생산되지 않거나, 또는 서열이 야생형 서열처럼 기능하지 않게 된다. 예를 들어, 단백질 또는 마이크로RNA 코딩 서열은 불활성화되어 단백질이 생산되지 않게 된다.
비-상동성 말단-연결
일 구현예에서, 뉴클레아제-유도된 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)은 유전자-특이적 녹아웃을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 뉴클레아제-유도된 NHEJ는 또한 관심 유전자에서 서열을 제거 (예를 들어, 결실)시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로, NHEJ 는 2개 말단을 함께 연결하여 DNA에서 이중 가닥 파손을 복구시키지만, 일반적으로, 본래 서열은 2개 양립가능한 말단이, 그들이 정확하게 이중 가닥 파손에 의해 형성되는 것처럼, 완벽하게 결찰되는 경우에만 복원된다. 이중 가닥 파손의 DNA 말단은 종종 효소 처리의 대상이 되어 말단이 다시 결합되기 전에 한 가닥 또는 두 가닥 모두에서 뉴클레오티드가 추가되거나 제거된다. 이러한 결과로 NHEJ 복구 부위에서 DNA 서열에 삽입 및/또는 결실 (indel) 돌연변이의 존재를 야기한다. 이러한 돌연변이의 2/3는 전형적으로 리딩 프레임을 변경하여 비기능성 단백질을 생성시킨다. 추가적으로, 리딩 프레임을 유지하지만, 상당한 양의 서열을 삽입 또는 결실시키는 돌연변이는 단백질의 기능성을 파괴할 수 있다. 이것은 핵심 기능성 도메인의 돌연변이가 아마도 단백질의 비-핵심 영역의 돌연변이에 비해서 덜 용인되는 듯하므로 유전자좌 의존적이다. NHEJ에 의해 생성된 indel 돌연변이는 자연계에서 예측불가하지만, 소정 파단 부위에서 일정 indel 서열은 아마도 미세상동성의 작은 영역덕분에, 개체군에서 선호되고 과잉으로 나타난다. 결실 길이는 광범위하게 다양할 수 있고, 가장 일반적으로는 1-50 bp 범위이지만, 용이하게 50 bp 초과일 수 있고, 예를 들어, 약 100-200 bp 초과에 쉽게 도달할 수 있다. 삽입은 더 짧은 경향이 있으며, 종종 파손 부위 주위를 바로 둘러싸는 서열의 짧은 복제물을 포함한다. 그러나, 큰 삽입부를 수득하는 것이 가능하며, 이 경우에, 삽입된 서열은 게놈의 기타 다른 영역 또는 세포 내 존재하는 플라스미드 DNA로 종종 추적된다.
NHEJ는 돌연변이원성 과정이기 때문에, 또한 특이적 최종 서열의 생성이 요구되지 않는 한 작은 서열 모티프를 결실하는 데 사용될 수 있다. 이중 가닥 파손이 짧은 표적 서열 근처를 표적화하면, NHEJ 복구에 의해 유발되는 결실 돌연변이는 종종 포괄되고, 그러므로, 원치않는 뉴클레오티드를 제거한다. 더 큰 DNA 절편의 결실 경우, 서열 각 측면 중 하나에서, 2개 이중 가닥 파손을 도입하여서, 전체 개재 서열의 제거가 있는 말단 사이에서 NHEJ를 야기할 수 있다. 이 두 가지 접근 방식 모두 특정 DNA 서열을 삭제하는 데 사용할 수 있지만, 그러나 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ의 특성으로 인해 여전히 복구 부위에서 indel 돌연변이가 발생할 수 있다.
양쪽 이중 가닥 절단 TnpB 폴리펩티드, 또는 이의 오솔로그 또는 상동체, 및 단일 가닥, 또는 닉카제, TnpB 폴리펩티드, 또는 이의 오솔로그 또는 상동체 , 분자는 NHEJ-매개 indel을 생성하도록 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 유전자, 예를 들어, 코딩 영역, 예를 들어 관심 유전자의 초기 코딩 영역으로 표적화되는 NHEJ-매개 indel은 관심 유전자를 녹아웃 (즉, 관심 유전자의 발현을 제거)하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 유전자의 초기 코딩 영역은, 전사 출발 부위 직후, 서열의 제1 엑손 내,또는 전사 출발 부위의 500 bp 내 예를 들어, 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp 또는 50 bp 미만)에 있는 열을 포함한다.
핵산 성분 분자 및 TnpB 폴리펩티드, 또는 이의 오솔로그 또는 상동체가 NHEJ-매개 indel의 유도 목적을 위해 이중 가닥 파손을 생성시키는 일 구현예에서, RNA 성분 분자는 표적 위치의 뉴클레오티드에 근접하여 하나의 이중-가닥 파손을 위치시키도록 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0 bp와 500 bp 사이 (예를 들어, 표적 위치로부터 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 25 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp, 9 bp, 8 bp, 7 bp, 6 bp, 5 bp, 4 bp, 3 bp, 2 bp 또는 1 bp 미만) 떨어져 있을 수 있다.
일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드, 또는 이의 오솔로그 또는 상동체, 예를 들어, TnpB 폴리펩티드 닉카제와 복합체를 형성하는 2개 핵산 성분 분자가 NHEJ-매개 indel 유도의 목적으로 2개 단일 가닥 파손을 유도하는 경우에, 2개 핵산 성분 분자는 표적 위치의 뉴클레오티드를 NHEJ 복구에 제공하도록 2개 단일-가닥 파손을 위치시키도록 구성될 수 있다.
일례에서, 본 명세서의 시스템은 NHEJ 경로를 통해서 하나 이상의 indel을 도입시킬 수 있고, HDR을 통해 조합 주형으로부터 서열을 삽입시킬 수 있다.
예시적인 적용성
본 발명은 비-천연 발생 또는 조작된 조성물, 또는 상기 조성물의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 표적 세포를 변형하는 데 사용하기 위한 상기 조성물 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 벡터 또는 전달 시스템을 제공하고, 일단 변형되면, TnpB 폴리펩티드 변형된 세포의 자손 또는 세포주는 변경된 표현형을 보유하도록 세포를 변경시키는 방식으로 수행될 수 있다. 변형된 세포 및 자손은 다중 세포 유기체, 예컨대, 목적하는 세포 유형에 대한 조성물 생체외 또는 생체내 적용을 갖는 식물 또는 동물의 일부분일 수 있다. 본 명세서의 방법은 치료의 치료적 방법을 포함한다. 치료의 치료적 방법은 유전자 또는 게놈 편집, 또는 유전자 요법을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터가 비-인간 유전자이식 동물 또는 유전자이식 식물을 생산하는 데 사용된다. 일 구현예에서, 유전자이식 동물은 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 또는 토끼이다. 유전자이식 동물 및 식물의 생산 방법은 당업계에 알려져 있으며, 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 형질감염의 방법을 이용하여 시작된다.
직교성 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드의 사용
특정 구현예에서, TnpB 폴리펩티드 닉카제는 상기 닉카제의 효율을 증가시키기 위해서 직교성 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드와 조합하여 사용된다(예를 들어, 하기 문헌에 기술된 바와 같음: Chen et al. 2017, Nature Communications 8:14958; doi:10.1038/ncomms14958). 보다 특히, 직교성 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드는 AD-작용화된 조성물에서 사용되는 TnpB 닉카제와 상이한 TAM 인식 부위를 특징으로 하고, 상응하는 핵산 성분 분자 서열은 작용화된 TnpB 폴리펩티드의 닉카제의 것에 근접한 표적 서열에 결합하도록 선택된다. 본 발명의 상황에서 사용되는 바와 같은 직교성 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드는 작용화된 조성물의 일부를 형성하지 않지만, 단지 상기 닉카제의 효율을 증가시키도록 기능하고 상기 TnpB 폴리펩티드에 대해 당분야에 기술된 표준 핵산 성분과 조합하여 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 직교성 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드는 데드 TnpB 폴리펩티드로서, 다시 말해서, 상기 TnpB 폴리펩티드의 뉴클레아제 활성을 없애는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것이다. 특정 구현예에서, 촉매적 불활성 직교성 TnpB 폴리펩티드는 닉카제의 표적 서열에 근접한 표적 서열에 혼성화할 수 있는 둘 이상의 핵산 성분이 제공된다. 특정 구현예에서, 적어도 2개 핵산 성분이 상기 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드를 표적화하는데 사용되는데, 이들 중 적어도 하나의 핵산 성분은 닉카제의 표적 서열의 5' 표적 서열에 혼성화할 수 있고, 적어도 하나의 핵산 성분은 작용화된 조성물의 닉카제의 표적 서열의 3' 표적 서열에 혼성화할 수 있어서, 상기 하나 이상의 표적 서열은 TnpB 닉카제의 표적 서열과 동일하거나 또는 반대의 DNA 가닥 상에 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 직교성 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드의 하나 이상의 핵산 성분의 가이드 서열은 표적 서열이 작용화된 조성물의 표적화, 예를 들어, 닉카제의 표적화를 위해 핵산 성분의 것에 근접하도록 선택된다. 특정 구현예에서, 직교성 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드의 하나 이상의 표적 서열은 5 초과이지만 450 염기쌍 미만만큼 닉카제의 표적 서열로부터 각각 분리된다. 작용화된 조성물의 표적 서열 및 직교성 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드와 사용을 위한 핵산 성분 분자의 표적 서열 간 최적 거리는 당업자가 결정할 수 있다. 특정 구현예에서, 촉매적 불활성 직교성 TnpB 폴리펩티드는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 이의 TAM 특이성을 변경시키도록 변형되었다. 특정 구현예에서, TnpB 폴리펩티드 닉카제는 그 자체로 인간 세포에서 제한된 활성을 갖지만, 불활성 직교성 TnpB 폴리펩티드 및 하나 이상의 상응하는 근위 핵산 성분 분자와 조합하여, 필요한 닉카제 활성을 보장하는, 닉카제이다.
검출 방법 예컨대 FISH
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드를 포함하는 조작된, 비-천연 발생 조성물을 제공하고, FISH (fluorescence in situ hybridization) 같은 검출 방법에서 이러한 시스템을 사용한다. DNA 이중-가닥 파손을 생산하는 능력이 결여된 데드 TnpB 폴리펩티드는 may be fused with a 마커, 예컨대 형광 단백질, 예컨대, 증강된 녹색 형광성 단백질 (eEGFP)과 융합될 수 있고, 소형 핵산 성분 분자와 공-발현되어서 생체내에서 협동원체, 동원체, 및 텔로미어 반복부를 표적화한다. 데드 TnpB 폴리펩티드 시스템은 인간 게놈에서 반복 서열 및 개별 유전자 둘 모두를 가시화하는데 사용될 수 있다. 표지된 데드 TnpB 폴리펩티드의 이러한 새로운 적용성은 특히 소형 핵 부피 또는 복합 3-D 구조를 사용하는 경우에, 세포를 이미지화하고 기능성 핵 아키텍처를 연구하는데서 중요할 수 있다 (Chen B, Gilbert LA, Cimini BA, Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW, Park J, Blackburn EH, Weissman JS, Qi LS, Huang B. 2013. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell 155(7):1479-91. doi: 10.1016/j.cell.2013.12.001).
환자-특이적 스크리닝 방법
DNA, 예를 들어, 트리뉴클레오티드 반복부를 표적화하는 핵산-표적화 시스템은 이러한 반복부의 존재에 대해서 환자 또는 환자 샘플을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 반복부는 TnpB 시스템의 ωRNA의 표적일 수 있고, TnpB 시스템에 의해 그에 대한 결합이 존재하면, 그 결합을 검출할 수 있어서, 이러한 반복부가 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, TnpB 시스템은 반복부의 존재에 대해 환자 또는 환자 샘플을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이후, 환자는 병태를 해결하기 위해 적합한 화합물(들)이 투여될 수 있거나, 또는 결합하여서, 삽입, 결실 또는 돌연변이를 유발하고 병태를 경감시키도록 TnpB 시스템이 투여될 수 있다.
유전적 및 후생적 병태 모델
본 발명의 방법은, 예컨대 관심 돌연변이의 모델 또는 질환 모델을 통하여, 질환 모델로서 사용될 수 있는 식물, 동물 또는 세포를 형성하고/형성하거나 관심 유전적 또는 후생유전적 병태를 연구하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "질환"은 대상체에서 질환, 장애 또는 징후를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 질환과 관련된 하나 이상의 핵산 서열에 변형을 포함하는 동물이나 세포, 또는 질환과 관련된 하나 이상의 핵산 서열의 발현이 변경된 식물, 동물 또는 세포를 생성하기 위해서 사용될 수 있다. 그러한 핵산 서열은 질환 연관 단백질 서열을 코딩할 수 있거나, 질환 연관 제어 서열일 수 있다. 따라서, 본 발명의 구현예에서, 식물, 대상체, 환자, 생물 또는 세포는 비-인간 대상, 환자, 생물 또는 세포일 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명은 본 방법에 의해 생산된 식물, 동물 또는 세포, 또는 이의 자손을 제공한다. 자손은 생산된 식물 또는 동물의 클론일 수 있거나, 또는 그들 자손에 바람직한 형질을 더 유전자이입하기 위해 동일 종의 다른 개체와 교배시켜서 유성생식으로부터 얻어질 수 있다. 세포는 다세포 유기체, 특히 동물 또는 식물의 경우에 생체내 또는 생체외에 존재할 수 있다. 세포가 배양되는 경우, 적절한 배양 조건이 충족되고 바람직하게는 세포가 이러한 목적에 적합하게 적응된다면 (예를 들어, 줄기 세포) 세포주가 확립될 수 있다. 본 발명에 의해서 생성된 박테리아 세포주가 또한 고려된다.
일부 방법에서, 질환 모델은 동물 또는 세포에서 돌연변이의 효과 및 질환 연구에 통상 사용되는 척도를 사용하여 질환의 발생 및/또는 진행을 연구하기 위해서 사용될 수 있다. 대안적으로, 이러한 질환 모델은 질환에 대한 약학적으로 활성인 화합물의 효과를 연구하는데 유용하다.
일부 방법에서, 질환 모델은 잠재적 유전자 요법 전략의 효율을 평가하기 위해서 사용될 수 있다. 즉, 질환-관련 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 질환 발생 및/또는 진행이 억제되거나 감소되도록 변형될 수 있다. 특히, 방법은 변경된 단백질이 생산되고, 그 결과 동물 또는 세포가 변경된 반응을 갖도록 질환 연관 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함한다. 따라서, 일부 방법에서, 유전자 변형된 동물이 질환 발생 소인이 있는 동물과 비교될 수 있으며, 이로써 유전자 요법 사건의 효과가 평가될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 질환 유전자와 연관된 세포 신호전달 사건을 조절하는 생물학적 활성제를 개발하는 방법을 제공한다. 방법은 TnpB 폴리펩티드, 및 가이드/스페이서 서열에 연결된 보존된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 발현을 구동하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 예를 들어, 세포에 함유된 질환 유전자의 돌연변이와 연관된 세포 신호전달 사건의 감소 또는 증대를 표시하는 판독치의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
세포 모델 또는 동물 모델은 세포 기능 변화를 스크리닝하기 위하여 본 발명의 방법과 조합하여 구성될 수 있다. 이러한 모델은 관심 세포 기능에 대한 본 발명의 복합체에 의해서 변형된 게놈 서열의 효과를 연구하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 기능 모델은 세포내 신호전달 또는 세포외 신호전달에 대한 변형된 게놈 서열의 효과를 연구하기 위해서 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포 기능 모델은 감각 인식에 대한 변형된 게놈 서열의 효과를 연구하기 위해서 사용될 수 있다. 일부 이러한 모델에서, 모델에서의 신호전달 생화학적 경로와 관련된 하나 이상의 게놈 서열이 변형된다.
몇몇 질환 모델이 특히 연구되어 왔다. 이들은 신규 자폐증 위험 유전자 CHD8, KATNAL2, 및 SCN2A; 및 증후군성 자폐증 (안젤만 증후군) 유전자 UBE3A를 포함한다. 이들 유전자 및 생성된 자폐증 모델이 물론 바람직하지만, 유전자 및 상응하는 모델에 걸쳐 본 발명의 광범위한 적용가능성을 보여주는 역할을 한다. 신호전달 생화학적 경로와 연관된 하나 이상의 게놈 서열의 변경된 발현은 그들이 후보 작용제와 접촉했을 때 시험 모델 세포 및 대조군 세포 간 상응하는 유전자의 mRNA 수준 차이를 어세이하여서 결정될 수 있다. 대안적으로, 신호전달 생화학 경로와 연관된 서열의 차등 발현은 코딩되는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 산물의 수준에서의 차이를 검출함으로써 결정된다.
mRNA 전사물 또는 상응하는 폴리뉴클레오티드의 수준에서 작용제-유도된 변경을 분석하기 위하여, 샘플 내 포함된 핵산을 먼저 해당 분야의 표준 방법에 따라 추출한다. 예를 들어, mRNA 는 [Sambrook et al. (1989)]에 기재된 절차에 따라 다양한 용해 효소 또는 화학 용액을 사용해 단리될 수 있거나, 또는 제조사가 제공하는 첨부 설명서에 따라서 핵산-결합 수지에서 추출될 수 있다. 추출된 핵산 샘플 내에 함유된 mRNA는 이후 당분야에서 공지된 방법 또는 본 명세서에서 예시된 방법을 기반으로 하는 증폭 절차 또는 통상의 혼성화 분석 (예를 들어, 노던 블롯 분석)에 의해 검출된다.
본 발명의 목적을 위하여, 증폭은 타당한 충실도로 표적 서열을 복제할 수 있는 폴리머라제 및 프라이머를 사용하는 임의의 방법을 의미한다. 증폭은 천연 또는 재조합 DNA 폴리머라제, 예를 들어, TaqGold™, T7 DNA 폴리머라제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편 및 역전사효소에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 증폭 방법은 PCR이다. 특히, 단리된 RNA는 신호전달 생화학 경로와 연관된 서열의 발현 수준을 정량화하기 위하여 정량적 폴리머라제 연쇄반응과 연결된 역전사 분석 (RT-PCR) 처리될 수 있다.
유전자 발현의 검출은 증폭 분석에서 실시간으로 수행될 수 있다. 일 양태에서, 증폭 산물은 DNA 인터컬레이터 및 DNA 홈 결합제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 형광성 DNA-결합제로 직접적으로 가시화될 수 있다. 이중가닥 DNA 분자에 통합된 인터컬레이터의 양은 전형적으로 증폭된 DNA 생성물의 양에 비례하기 때문에, 당 분야의 종래의 광학 시스템을 사용하여 삽입된 염료의 형광을 정량함으로써 증폭된 생성물의 양을 편리하게 결정할 수 있다. 본 출원에 적합한 DNA-결합 염료는 SYBR 그린, SYBR 블루, DAPI, 프로피듐 요오드, Hoeste, SYBR 골드, 에티듐 브로마이드, 아크리딘, 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리플라빈, 플루오르쿠마닌, 엘립티신, 다우노마이신, 클로로퀸, 디스타마이신 D, 크로모마이신, 호미듐, 미스라마이신, 루테늄 폴리피리딜, 안트라마이신 등을 포함한다.
다른 양태에서, 서열 특이적 프로브와 같은 기타 형광 표지는, 증폭된 생성물의 검출 및 정량화를 촉진하기 위하여 증폭 반응에서 사용될 수 있다. 프로브-기반 정량 증폭은 원하는 증폭된 생성물의 서열-특이적 검출에 의존한다. 이는 형광, 표적-특이적 프로브 (예를 들어, TaqMan® 프로브)를 이용하며, 그 결과 특이성 및 감도를 증가시킨다. 프로브-기준 정량적 증폭의 수행 방법은 당 기술 분야에서 잘 확립되어 있으며, 미국 특허 제5,210,015호에 교시되어 있다.
또 다른 양태에서, 신호전달 생화학 경로와 연관된 서열과 상동성을 공유하는 혼성화 프로브를 이용하는 통상의 혼성화 분석이 수행될 수 있다. 전형적으로, 프로브는 혼성화 반응에서 시험 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플에 함유된 신호전달 생화학적 경로와 관련된 서열과 안정한 복합체를 형성하게 된다. 안티센스가 프로브 핵산으로 사용된 경우, 샘플에 제공되는 표적 폴리뉴클레오티드는 안티센스 핵산의 서열에 상보성이도록 선택된다는 것은 당업자가 이해할 것이다. 반대로, 뉴클레오티드 프로브가 센스 핵산인 경우, 표적 폴리뉴클레오티드는 센스 핵산에 상보성이도록 선택된다.
혼성화는 다양한 엄격성 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 실시에 적합한 혼성화 조건은 프로브와 신호전달 생화학 경로와 연관된 서열 간의 인식 상호작용이 충분히 특이적이고 충분히 안정적이도록 하는 것이다. 혼성화 반응의 엄격성을 증가시키는 조건은 해당 기술 분야에서 공지 및 공개되어 있다. 예를 들어, 다음을 참조한다: (Sambrook, et al., (1989); Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual, Boehringer Mannheim, second edition). 혼성화 분석은, 제한은 아니지만, 니트로셀룰로스, 유리, 규소 및 다양한 유전자 어레이를 포함하는 임의의 고체 지지체 상에 고정된 프로브를 사용하여 형성될 수 있다. 바람직한 혼성화 분석은 미국 특허 제5,445,934호에 기재된 바와 같은 고밀도 유전자 칩 상에서 수행된다.
혼성화 분석 동안 형성된 프로브-표적 복합체의 편리한 검출을 위하여, 뉴클레오티드 프로브는 검출가능한 표지에 접합된다. 본 발명에서의 이용에 적합한 검출가능한 표지는 광화학, 생화학, 분광학, 역 화학, 전기, 광학 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물을 포함한다. 광범한 다양한 적합한 검출가능한 표지가 당 분야에 알려져 있으며, 이들은 형광 또는 화학발광 표지, 방사성활성 동위원소 표지, 효소 또는 다른 리간드들을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 형광 표지 또는 효소 태그, 예컨대 디곡시제닌, ß-갈락토시다제, 우레아제, 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제, 아비딘/바이오틴 복합체가 바람직하게 사용될 것이다.
혼성화 강도를 검출하거나 정량하기 위해서 사용되는 검출 방법은 전형적으로 상기 선택된 표지에 의존적일 것이다. 예를 들어, 방사성표지는 사진 필름 또는 포스포이미저를 사용하여 검출될 수 있다. 형광 마커는 방출된 광을 검출하기 위한 광검출기를 이용하여 검출 및 정량화될 수 있다. 효소 표지는 전형적으로 효소에 기질을 제공하고 기질에 대한 효소의 작용으로 생산된 반응 산물을 검출하여 검출되며, 최종적으로 비색 표지는 유색 표지를 간단히 가시화하여 검출된다.
신호전달 생화학적 경로와 관련된 서열의 발현에서 작용제-유도 변화는 또한 상응하는 유전자 생성물을 검사함으로써 결정될 수 있다. 단백질 수준의 결정은 통상적으로, a) 생물학적 샘플 내에 포함된 단백질을, 신호전달 생화학 경로와 연관된 단백질에 특이적으로 결합하는 작용제와 접촉시키는 단계; 및 (b) 그렇게 형성된 임의 작용제:단백질 복합체를 확인하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예의 일 양태에서, 신호전달 생화학적 경로와 관련된 단백질과 특이적으로 결합하는 작용제는 항체, 바람직하게 단일클론 항체이다.
반응은 작용제 및 신호전달 생화학적 경로와 연관된 단백질 간에 복합체를 형성하도록 허용하게 되는 조건 하에서 시험 샘플로부터 유래되는 신호전달 생화학적 경로와 연관된 단백질 샘플과 작용제를 접촉시켜서 수행된다. 복합체의 형성은 당분야의 표준 절차에 따라서 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 직접 검출 방법에서 작용제는 검출가능한 표지와 제공되고 미반응 작용제는 복합체로부터 제거될 수 있고, 그리하여 남은 표지의 양은 형성된 복합체의 양을 의미한다. 이러한 방법에서, 엄격 세척 조건 하에서도 작용제에 부착된 채로 남은 표지를 선택하는 것이 바람직하다. 표지는 결합 반응을 방해하지 않는 것이 바람직하다. 대안적으로, 간접 검출 절차는 화학적으로 또는 효소적으로 도입되는 표지를 함유하는 작용제를 사용할 수 있다. 바람직한 표지는 일반적으로 최종 작용제:폴리펩티드 복합체의 결합 또는 안정성을 방해하지 않는다. 그러나, 표지는 전형적으로 효과적인 결합을 위해 항체에 접근가능하고, 그리하여 검출가능한 신호를 생성하도록 디자인된다.
단백질 수준을 검출하기에 적합한 다양한 표지가 당분야에 공지되어 있다. 비제한적인 예는 방사성동위원소, 효소, 콜로이드 금속, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 및 화학발광 화합물을 포함한다.
결합 반응 동안 형성된 작용제:폴리펩티드 복합체의 양은 표준 정량 어세이를 통해서 정량될 수 있다. 상기 예시한 바와 같이, 작용제:폴리펩티드 복합체의 형성은 결합 부위에 남아있는 표지의 양을 통해 직접적으로 측정될 수 있다. 대안적으로, 신호전달 생화학적 경로와 연관된 단백질은 특이적 작용제의 결합 부위에 대해 표지된 유사체와 경쟁하는 이의 능력에 대해 시험된다. 이러한 경쟁 어세이에서, 포획된 표지의 양은 시험 샘플에 존재하는 신호전달 생화학적 경로와 연관된 단백질 서열의 양에 반비례한다.
상기 개략된 일반적인 원리에 기초한 단백질 분석을 위한 다수의 기술이 당 분야에서 이용될 수 있다. 그들은 이로 제한되지는 않지만, 방사성면역분석, ELISA (효소 결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역방사계 분석, 제자리 면역분석 (예를 들어, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성동위원소 표지를 이용), 웨스턴 블롯 분석, 면역침강 분석, 면역형광 분석, 및 SDS-PAGE를 포함한다.
신호전달 생화학적 경로와 관련된 단백질을 특이적으로 인식하거나 그것과 결합하는 항체가 상기 언급된 단백질 분석을 수행하는데 바람직하다. 바람직한 경우, 번역후 변형의 특이적 유형 (예를 들어, 신호전달 생물학 경로 유도성 변형)을 인식하는 항체가 사용될 수 있다. 번역후 변형은 이로 제한되지는 않지만, 글리코실화, 지질화, 아세틸화 및 인산화를 포함한다. 이러한 항체는 상업적 공급사에서 구입할 수 있습니다. 예를 들어, 티로신-포스포릴화 단백질을 특이적으로 인식하는 항포스포티로신 항체가 Invitrogen 및 Perkin Elmer를 포함하는 다수의 판매사로부터 입수가능하다. 항-포스포티로신 항체는, 특히 ER 스트레스에 반응하여 그의 티로신 잔기 상에서 별도로 포스포릴화된 단백질을 검출하는데 있어서 특히 이용가능하다. 이러한 단백질은, 제한은 아니지만 진핵생물 번역 개시 인자 2 알파 (eIF-2α)를 포함한다. 대안적으로, 이들 항체는 통상의 다클론성 또는 단일클론성 항체 기술을 이용하여, 숙주 동물 또는 항체-생산 세포를 바람직한 번역후 변형을 나타내는 표적 단백질로 면역화함으로써 생성될 수 있다.
게놈 와이드 녹-아웃 스크리닝
본 명세서에 기술된 TnpB 폴리펩티드 및 시스템은 효율적이고 비용 효과적인 기능성 게놈 스크리닝을 수행하는데 사용될 수 있다. 이러한 스크린은 TnpB 폴리펩티드 기반 게놈 와이드 라이브러리를 이용할 수 있다. 이러한 스크린 및 라이브러리는 유전자의 기능, 유전자가 관여하는 세포 경로 및 유전자 발현의 변경이 특정 생물학적 과정을 초래할 수 있는 방법을 결정하기 위해 제공될 수 있다. 본 발명의 장점은 조성물이 오프-표적 결합 및 이의 최종 부작용을 피한다는 것이다. 이것은 표적 DNA에 대한 높은 정도의 서열 특이성을 갖도록 배열된 시스템을 사용해 획득될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, TnpB 폴리펩티드 복합체는 TnpB 폴리펩티드 복합체이다.
본 발명의 구현예에서, 게놈 와이드 라이브러리는 진핵생물 세포의 개체군에서 다수의 게놈 유전자좌의 다수의 표적 서열을 표적화할 수 있는 가이드/스페이서 서열을 포함하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 다수의 TnpB 폴리펩티드 핵산 성분 분자를 포함할 수 있다. 세포의 개체군은 배아 줄기 (ES) 세포의 개체군일 수 있다. 게놈 유전자좌의 표적 서열은 비-코딩 서열일 수 있다. 비-코딩 서열은 인트론, 조절 서열, 스플라이스 부위, 3' UTR, 5' UTR, 또는 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 하나 이상의 유전자 산물의 유전자 기능은 상기 표적화에 의해 변경될 수 있다. 표적화는 유전자 기능의 녹아웃을 야기할 수 있다. 유전자 산물의 표적화는 하나 초과의 핵산 성분 분자를 포함할 수 있다. 유전자 산물은 유전자 당 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 핵산 성분 분자, 바람직하게 3 내지 4에 의해 표적화될 수 있다. 오프-표적 변형은 TnpB 폴리펩티드 복합체에 의해 생성되는 스태거드 이중 가닥 파손을 조사하거나 또는 조성물에서 사용되는 것과 유사한 반ㅇ법을 이용하여 최소화될 수 있다 (참조: 예를 들어, DNA targeting specificity of RNA-guided Cas nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, O., Cradick, TJ., Marraffini, LA., Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647 (2013), (참조로 본 명세서에 편입됨)). 표적화는 약 100 이상의 서열일 수 있다. 표적화는 약 1000 이상의 서열일 수 있다. 표적화는 약 20,000 이상의 서열일 수 있다. 표적화는 전체 게놈의 것일 수 있다. 표적화는 관련 또느 바람직한 경로에 집중되는 표적 서열의 패널일 수 있다. 경로는 면역 경로일 수 있다. 경로는 세포 분열 경로일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 다수의 게놈 유전자좌의 다수 표적 서열을 표적화할 수 있는 가이드/스페이서 서열을 포함할 수 있는 다수의 핵산 성분 분자를 포함할 수 있는 게놈 와이드 라이브러리를 이해하고, 상기 표적화는 유전자 기능의 녹아웃을 일으킨다. 이러한 라이브러리는 유기체의 게놈에서 각각 및 모든 유전자를 표적화하는 핵산 성분 분자를 잠재적으로 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 유기체 또는 대상체는 진핵생물(인간을 포함하는 포유동물 포함) 또는 비인간 진핵생물 또는 비인간 동물 또는 비인간 포유동물이다. 일 구현예에서, 일 구현예에서, 유기체 또는 대상체는 비-인간 동물이고, 절지동물, 예컨대 곤충일 수 있거나, 또는 선충일 수 있다. 본 발명의 일부 방법에서 유기체 또는 대상체는 식물이다. 본 발명의 일부 방법에서, 유기체 또는 대상체는 포유동물 또는 비-인간 포유동물이다. 비-인간 포유동물은 예를 들어 설치류 (바람직하게는 마우스 또는 래트), 유제류, 또는 영장류일 수 있다. 본 발명의 일부 방법에서 유기체 또는 대상체는 미세조류를 포함하는 조류이거나, 또는 진균이다.
유전자 기능의 녹아웃은 본 명세서의 조작된, 비-천연 발생 조성물을 포함하는 하나 이상의 벡터의 벡터 시스템을 세포의 개체군의 각 세포에 도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 핵산 성분 분자 서열은 각 세포에서 고유한 유전자를 표적화할 수 있고, TnpB 폴리펩티드는 조절 구성요소에 작동적으로 연결되고, 전사될 대, 스페이서 서열을 포함하는 핵산 성분 분자는 고유한 유전자의 게놈 유전자좌의 표적 서열에 대한 TnpB 폴리펩티드의 서열-특이적 결합을 유도하여서, TnpB 폴리펩티드에 의한 게놈 유전자좌의 절단을 유도하고, 세포 개체군의 각 세포에서 다수의 고유한 유전자에서 상이한 녹아웃 돌연변이를 확인하여서, 유전자 녹아웃 세포 라이브러리를 생성한다. 본 발명은 세포의 개체군이 진핵생물의 개체군이고, 바람직한 구현예에서, 세포의 개체군이 배아 줄기 (ES) 세포의 개체군임을 이해한다.
하나 이상의 벡터는 플라스미드 벡터이다. 벡터는 TnpB 폴리펩티드, 핵산 성분, 및 임의로, 선택 마커를 포함하는 표적 세포로의 단일 벡터일 수 있다. 이론에 국한하지 않지만, 단일 벡터를 통해서 TnpB 폴리펩티드 및 핵산 성분을 동시에 전달하는 능력은 TnpB 폴리펩티드를 발현하는 세포주를 먼저 생산할 필요성없이, 임의의 관심 세포 유형에 대한 적용을 가증하게 한다. 조절 구성요소는 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터는 독시사이클린 유도성 프로모터일 수 있다. 본 발명의 일부 방법에서 핵산 성분 분자 서열의 발현은 T7 프로모터의 제어 하에 있고 T7 폴리머라제의 발현에 의해 구동된다. 상이한 녹아웃 돌연변이의 확인은 전체 엑솜 시퀀싱에 의할 수 있다. 녹아웃 돌연변이는 100 이상의 고유한 유전자에서 획득될 수 있다. 녹아웃 돌연변이는 1000 이상의 고유한 유전자에서 획득될 수 있다. 녹아웃 돌연변이는 20000 이상의 고유한 유전자에서 획득될 수 있다. 녹아웃 돌연변이는 전체 게놈에서 획득될 수 있다. 유전자 기능의 녹아웃은 특정 생리적 경로 또는 병태에서 기능하는 다수의 고유한 유전자에서 획득될 수 있다. 경로 또는 병태는 면역 경로 또는 병태일 수 있다. 경로 또는 병태는 세포 분열 경로 또는 병태일 수 있다.
기능적 변경 및 스크리닝
다른 양태에서, 본 발명은 유전자의 기능적 평가 및 스크리닝 방법을 제공한다. 기능성 도메인을 정확하게 전달하거나, 유전자를 활성화 또는 억제하거나 또는 관심 특정 유전자좌의 메틸화 부위를 정확하게 변경시켜서 후생적 상태를 변경시키기 위한 조성물의 용도는 단일 세포 또는 세포의 개체군에 적용되는 하나 이상의 핵산 성분 분자 또는 다수의 핵산 성분 (스페이서 분자 포함)을 포함하는 라이브러리의 투여 또는 발현을 포함하는 생체외 또는 시험관내에서 세포 풀의 게놈에 대해 적용되는 라이브러리에 의할 수 있고, 스크리닝은 TnpB 폴리펩티드의 용도를 더 포함하고, TnpB 폴리펩티드를 포함하는 복합체는 이종성 기능성 도메인을 포함하도록 변형된다. 일 양태에서 본 발명은 라이브러리의 생체내 숙주에서 발현 또는 숙주에 투여 단계를 포함하는 게놈 스크리닝 방법을 제공한다. 일 양태에서 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 숙주로 투여되거나 숙주 내에서 발현되는 활성인자를 추가로 포함하는 방법을 제공한다. 일 양태에서 본 발명은 활성인자가 TnpB 폴리펩티드에 부착되는 것인 본 명세서에 논의되는 방법을 제공한다. 일 양태에서 본 발명은 TnpB 폴리펩티드의 N A말단 또는 C 말단에 활성인자가 부착되는 것인 본 명세서에 논의되는 바와 같은 방법을 제공한다. 일 양태에서 본 발명은 활성인자가 핵산 성분 루프에 부착되는 것인 본 명세서에 논의되는 바와 같은 방법을 제공한다. 일 양태에서 본 발명은 숙주에 투여되거나 또는 숙주에서 발현되는 억제인자를 더 포함하는 본 명세서에 논의되는 바와 같은 방법을 제공한다. 일 양태에서 본 발명은 스크리닝이 유전자 활성화, 유전자 억제, 또는 유전자좌에서의 절단을 실시하고 검출하는 단계를 포함하는 것인 본 명세서에 논의된 바와 같은 방법을 제공한다.
프로모터 또는 프로모터-근위 구성요소에 추가하여, 내생성 (조절) 제어 구성요소 (예컨대, 인핸서 및 사일렌서)를 표적화하는 것이 또한 바람직하다. 따라서, 본 발명은 또한 프로모터의 표적화이외에도, 내생성 제어 구성요소 (인핸서 및 사일렌서 포함)를 표적화하는데 사용될 수 있다. 이들 제어 구성요소는 전사 출발 부위(TSS)의 상류 및 하류에 위치될 수 있으며, 이는 TSS로부터 200bp로부터 시작하여 100kb 까지 멀어진다. 기지 제어 구성요소의 표적화는 관심 유전자를 활성화 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 단일 제어 구성요소는 다수의 표적 유전자의 전사에 영향을 미칠 수 있다. 단일 제어 요소의 표적화는 따라서 다수의 유전자의 전사를 동시에 제어하는데 사용될 수 있을 것이다.
한편 추정 제어 구성요소 표적화 (예를 들어, 추정 제어 구성요소의 영역을 비롯하여 구성요소 주변 200bp 내지 100kB까지 타일링함으로써)는 (관심 유전자의 전사를 측정함으로써) 그러한 구성요소를 검증하는 또는 신규 제어 구성요소를 (예를 들어, 관심 유전자의 TSS의 100kb 상류 및 하류를 타일링함으로써) 검출하는 수단으로서 사용될 수 있다. 또한, 추정 제어 구성요소의 표적화는 질환의 유전적 요인을 이해하는 상황에서 유용할 수 있다. 질환 표현형과 연관된 많은 돌연변이 및 일반 SNP 변이체는 코딩 영역 밖에 위치된다. 본 명세서에 기술된 활성화 또는 억제 시스템에 의한 이러한 영역의 표적화는 a) 추정 표적 세트 (예를 들어, 제어 구성요소에 가장 가까이 근접하여 위치된 유전자 세트) 또는 b) 예를 들어, RNAseq 또는 마이크로어레이에 의한 전체-전사체 판독치의 전사 판독이 뒤따를 수 있다. 이것은 질환 표현형에 관여되는 가능성 있는 후보 유전자의 확인을 허용하게 된다. 이러한 후보 유전자는 신규한 약물 표적으로서 유용할 수 있다.
히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 억제제억제제가 본 명세서에서 언급된다. 그러나, 대안적인 구현예는 하나 이상의 기능성 도메인이 아세틸트랜스퍼라제, 바람직하게 히스톤 아세틸트랜스퍼라제를 포함하는 것이다. 이들은 후생유전학 분야에서, 예를 들어 후생유전체의 조사 방법에서 유용하다. 후생유전체를 조사하는 방법은 예를 들어 후생유전체 서열을 표적화하는 것을 포함할 수 있다. 후생유전체 서열의 표적화는 후생유전체 표적 서열로 유도되는 핵산 성분 분자를 포함할 수 있다. 후생유전체 표적 서열은 프로모터, 사일렌서 또는 인핸서 서열을 포함할 수 있다.
포화 돌연변이유발
본명세서의 조성물은 세포 표현형과 함께 게놈 유전자좌의 포화 또는 딥 스캐닝 돌연변이유발을 수행하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 유전자 발현, 약물 내성 및 질병의 반전에 필요한 기능적 요소의 중요한 최소 특징 및 개별 취약성을 결정하기 위해 사용할 수 있다. 포화 또는 딥 스캐닝 돌연변이 유발이라 함은 모든 또는 본질적으로 모든 DNA 염기가 게놈 유전자좌 내에서 절단됨을 의미한다. Cas1 이펙터 단백질 핵산 성분 분자의 라이브러리는 세포의 개체군에 도입될 수 있다. 라이브러리가 도입되어서, 각 세포가 단일 핵산 성분을 수용하게 된다. 라이브러리가 본 명세서에 기술된 바와 같은, 바이러스 벡터의 형질도입을 통해서 도입되는 경우에, 낮은 감염 다중도 (MOI)가 사용된다. 라이브러리는 게놈 유전자좌의 (표적화된 인접 모티프) (TAM) 서열의 상류 모든 서열을 표적화하는 핵산 성분을 포함할 수 있다. 라이브러리는 게놈 유전자좌 내 1000 염기쌍 마다 TAM 서열의 상류에 적어도 100 비-중복 게놈 서열을 포함할 수 있다. 라이브러리는 적어도 하나의 상이한 TAM 서열의 상류 서열을 표적화하는 핵산 성분을 포함할 수 있다. 조성물은 하나 초과의 TnpB 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 TnpB 폴리펩티드 단백질은 오솔로그 또는 조작된 TnpB 폴리펩티드를 포함한다. 핵산 성분에 대한 오프 표적 부위의 빈도는 500 미만일 수 있다. 오프 표적 점수는 최저 오프 표적 부위를 갖는 핵산 성분을 선택하기 위해 생성될 수 있다. 핵산 성분 표적 부위에서 절단과 연관된 것으로 결정된 임의 표현형은 단일 실험에서 동일 부위를 표적화하는 핵산 성분을 사용하여 확인될 수 있다. 표적 부위의 검증은 본 명세서에 기술된 바와 같은, 변형된 TnpB 폴리펩티드, 및 관심 게놈 부위를 표적화하는 2개 핵산 성분을 사용하여 수행될 수 있다. 이론에 국한하지 않고, 표적 부위는 표현형의 변화가 검증 실험에서 관찰되는 경우 진짜 히트이다.
게놈 유전자좌는 적어도 하나의 연속 게놈 영역을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 연속 게놈 영역은 전체 게놈까지 포함될 수 있다. 적어도 하나의 연속 게놈 영역은 게놈의 기능성 구성요소를 포함할 수 있다. 기능성 구성요소는 비-코딩 영역, 코딩 유전자, 인트론 영역, 프로모터, 또는 인핸서 내에 있을 수 있다. 적어도 하나의 연속 게놈 영역은 적어도 1 kb, 바람직하게 적어도 50 kb의 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 연속 게놈 영역은 전사 인자 결합 부위를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 연속 게놈 영역은 DNase I 과민성 영역을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 연속 게놈 영역은 전사 인핸서 또는 억제인자 구성요소를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 연속 게놈 영역은 후생적 서명에 대해 농축된 부위를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 연속 게놈 DNA 영역은 후생적 인슐레이터를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 연속 게놈 영역은 물리적으로 상호작용하는 둘 이상의 연속 게놈 영역을 포함할 수 있다. 상호작용하는 게놈 영역은 '4C 기술'에 의해 결정될 수 있다. 4C 기술은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 하기 문헌에 기술된 바와 같이 선택 DNA 단편과 물리적으로 상호작용하는 DNA 절편에 대해서 미편향된 방식으로 전체 게놈의 스크리닝을 허용한다: Zhao et al. ((2006) Nat Genet 38, 1341-7) 및 미국 특허 제8,642,295호. T후생적 서명은 히스톤 아세틸화, 히스톤 메틸화, 히스톤 유비퀴틴화, 히스톤 인산화, DNA 메틸화, 또는 이의 결여일 수 있다.
포화 또는 딥 스캐닝 돌연변이 유발을 위한 조성물은 세포의 개체군에서 사용될 수 있다. 조성물은 제한없이 포유동물 및 식물 세포를 포함하는, 진핵생물 세포에서 사용될 수 있다. 세포의 개체군은 원핵생물 세포일 수 있다. 진핵생물 세포의 개체군은 배아 줄기 (ES) 세포, 신경 세포, 상피 세포, 면역 세포, 내분비 세포, 근육 세포, 적혈구, 림프구, 식물 세포 또는 효모 세포의 개체군일 수 있다.
일 양태에서, 발명은 표현형 변화와 관련된 기능성 구성요소의 스크리닝 방법을 제공한다. 라이브러리는 TnpB 폴리펩티드를 함유하도록 적합화된 세포의 개체군으로 도입될 수 있다. 세포는 표현형을 기반으로 적어도 2개 그룹으로 분류될 수 있다. 표현형은 유전자의 발현, 세포 성장, 또는 세포 생존능일 수 있다. 각 그룹에 존재하는 핵산 성분 분자의 상대적 표시를 결정하여서, 표현형 변화와 연관된 게놈 부위는 각 그룹에 존재하는 핵산 성분 분자의 펴시에 의해 결정된다. 표현형에서의 변화는 관심 유전자의 발현에서의 변화일 수 있다. 관심 유전자는 상향조절, 하향조절, 또는 녹아웃될 수 있다. 세포는 고발현 군 및 저발현 군으로 분류될 수 있다. 세포의 개체군은 표현형을 결정하는데 사용되는 리포터 구성체를 포함할 수 있다. 리포터 구성체는 검출가능 마커를 포함할 수 있다. 세포는 검출가능 마커의 사용에 의해 분류될 수 있다.
다른 양태에서, 다른 양태에서, 본 발명은 화학 화합물에 대한 내성과 연관된 게놈 부위의 스크리닝 방법을 제공한다. 화학 화합물은 약물 또는 살충제일 수 있다. 라이브러리는 TnpB 폴리펩티드를 함유하도록 적합화된 세포의 개체군으로 도입될 수 있고, 개체군의 각 세포는 하나 이하의 핵산 성분 분자를 함유하고; 세포의 개체군은 화학 화합물로 처리되고; 핵산 성분 분자의 표시는 초기 시점과 비교하여 이후 시점에 화학 화합물로 처리 후 결정되어서, 화학 화합물에 대한 내성과 연관된 게놈 부위는 핵산 성분의 농축에 의해 결정된다. 핵산 성분의 표시는 딥 시퀀싱 방법으로 결정될 수 있다.
조성물을 이용하는 본 발명의 실시에서 유용한 것은 조성물에서 사용되는 방법이고, 하기 제목의 논문을 참조하고, 논문은 참조로 본 명세서에 편입되고, 이하에서 간략하게 논의된다: BCL11A enhancer dissection by Cas-mediated in situ saturating mutagenesis. Canver, M.C., Smith, E.C., Sher, F., Pinello, L., Sanjana, N.E., Shalem, O., Chen, D.D., Schupp, P.G., Vinjamur, D.S., Garcia, S.P., Luc, S., Kurita, R., Nakamura, Y., Fujiwara, Y., Maeda, T., Yuan, G., Zhang, F., Orkin, S.H., & Bauer, D.E. DOI:10.1038/nature15521 (2015년 9월 16일 온라인 공개됨).
Canver 등은 태아 헤모글로불린 (HbF) 수준과 연관된 인핸서로서 이전에 확인되고 그의 마우스 오솔로그가 적혈구 BCL11A 발현에 필수적인 인간 및 마우스 BCL11A 적혈구 인핸서의 제자리 포화 돌연변이유발을 수행하기 위한 신규한 풀링된 가이드 RNA 라이브러리를 포함한다. 이러한 접근법은 이들 인핸서의 결정적인 최소 특성 및 별개 취약성을 밝혀주었다. 초대 인간 전구체 및 마우스 유전자 이식의 편집을 통해서 저자는 HbF 재유도를 위한 표적으로서 BCL11A 적혈구 인핸서를 검증하였다. 저자는 치료적 게놈 편집 정보를 제공하는 상세한 인핸서 맵을 생성하였다.
세포 또는 유기체의 변형
본 개시는 본 명세서의 시스템의 하나 이상의 성분, 예를 들어 TnpB 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 포함하는 세포를 더 제공한다. 또한 본 명세서의 시스템 및 방법으로 변형된 세포, 및 이러한 세포 또는 이의 자손을 포함하는 세포 배양, 조직, 장기, 유기체를 제공한다. 본 발명은 일 구현예에서 세포 또는 유기체를 변형시키는 방법을 포괄한다. 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 포유동물 세포는 비-인간 영장류, 소, 돼지, 설치류 또는 마우스 세포일 수 있다. 세포는 비-포유동물 진핵생물 세포 예컨대 가금류, 어류 또는 새우의 세포일 수 있다. 세포는 또한 식물 세포일 수 있다. 식물 세포는 작물 식물 예컨대 카사바, 옥수수, 수수, 밀 또는 쌀의 세포일 수 있다. 식물 세포는 또한 조류, 수목 또는 채소의 것일 수 있다. 본 발명에 의해 세포에 도입된 변형은, 세포 및 세포의 자손이 항체, 전분, 알콜 또는 기타 바람직한 세포 산출물과 같은 생물학적 생성물의 개선된 생산을 위해 변경되도록 할 수 있다. 본 발명에 의해 세포로 도입된 변형은 세포 및 세포의 자손이 생산된 생물제 생성물을 변형시키는 변경을 포함하도록 할 것이다.
치료적 용도 및 치료 방법
본 명세서는 또한 대상체에서 또는 그의 질환, 상태, 또는 병태를 진단, 예후, 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 대상체에서 또는 그의 질환, 상태, 또는 병태의 진단, 예후, 치료, 및/또는 예방 방법은 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 또는 이의 성분을 사용하여 대상체 또는 이의 세포에서 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 단계를 포함하고/하거나, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 또는 이의 성분을 사용하여 대상체 또는 이의 세포에서 질환 또는 건강한 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 치료 또는 예방 방법은 대상체 또는 이의 세포 내에서 감염성 유기체 (예를 들어, 박테리아 또는 바이러스)의 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 조성물, 시스템 또는 이의 성분을 사용하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 치료 또는 예방 방법은 대상체내에서 감염성 유기체 또는 공생 유기체의 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위해서 조성물, 시스템, 또는 이의 성분을 사용하는 단계를 포함한다. 조성물, 시스템, 및 이의 성분은 질환, 상태, 또는 병태의 모델을 개발하는데 사용될 수 있다. 조성물, 시스템, 및 이의 성분은 예컨대 본 명세서에 기술된 치료 또는 예방 방법을 통해서, 질환 상태 또는 이의 교정을 검출하는데 사용될 수 있다. 조성물, 시스템, 및 이의 성분은 예를 들어, 본 명세서에 기술된 치료 또는 예방으로서 사용할 수 있는 세포를 스크리닝하고 선택하는데 사용될 수 있다. 조성물, 시스템, 및 이의 성분은 대상체 또는 이의 세포에서 하나 이상의 생물학적 기능 또는 활성을 변형시키는데 사용되는 생물학적 활성제를 개발하는데 사용될 수 있다.
일반적으로, 방법은 적절한 전달 기술 및/또는 조성물에 의해 조성물, 시스템 및/또는 이의 구성요소를 대상체 또는 이의 세포, 또는 감염성 또는 공생 유기체에 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 투여되면 성분은 핵산 변형 사건을 유발하도록 본 명세서의 다른 곳에 기술된 대로 작동할 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 변형 사건은 게놈, 후생유전체 및/또는 전사체 수준에서 발생할 수 있다. DNA 및/또는 RNA 절단, 유전자 활성화, 및/또는 유전자 탈활성화가 발생될 수 있다. 추가 특성, 용도, 및 장점은 이하 상세히 기술된다. 이 개념에 기반하여, 몇몇 변형은 DNA 절단, 유전자 활성화 또는 유전자 탈활성화를 비롯한 게놈 유전자좌 사건을 유발하는 데 적절하다. 제공된 조성물을 이용하여, 당업자는 하나 이상의 게놈 유전자좌 사건을 유발하기 위해 동일 또는 상이한 기능성 도메인을 갖는 단일 또는 다중 유전자좌를 유리하게 그리고 특이적으로 표적화할 수 있다. 대상체에서 질환의 치료 및/또는 예방이외에도, 조성물은 생체내에서 기능성 모델링 및 세포에서 라이브러리의 스크리닝을 위한 다양한 방법에서 적용될 수 있다 (예를 들어, lincRNA의 유전자 활성화 및 기능 확인; 기능 획득 모델링; 기능 상실 모델링; 최적화 및 스크리닝 목적을 위해 세포주 및 유전자이식 동물을 확립하기 위한 본 발명의 조성물의 용도).
본 명세서의 다른 곳에 기술된 조성물, 시스템, 및 이의 성분은 대상체에서 유전적 및/또는 후생적 질환과 같은 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기술된 조성물, 시스템, 및 이의 성분은 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 기생충 감염 및 이들의 조합과 같은 대상체의 유전성 감염 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기술된 조성물, 시스템, 및 이의 성분은 대상체에서 마이크로바이옴 조성 또는 프로파일을 변형시키는데 사용될 수 있고, 이후에 대상체의 건강 상태를 변형시킬 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템은 생체외에서 세포를 변형시키는데 사용될 수 있어서, 대상체에게 투여할 수 있어서 변형된 세포가 질환 또는 이의 증상을 치료 또는 예방할 수 있다. 이것을 또한 일부 상황에서 양자 요법이라고 한다. 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템은 미토콘드리아 질환을 치료하는데 사용되고, 미토콘드리아 질환 병인론은 미토콘드리아 DNA의 돌연변이를 포함한다.
본 명세서는 조성물, 시스템, 또는 복합체 중 하나 이상의 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 명세서에 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 대상체를 형질전환시켜서 유전자 편집을 유도하는 단계 및 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 적합한 복구 주형은 예를 들어, 상기 복구 주형을 포함하는 벡터에 의해 전달되어서, 제공될 수 있다. 복구 주형은 본 명세서의 재조합 주형일 수 있다. 또한 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 대상체를 형질전환시켜서 다수의 표적 유전자좌의 전사 활성화 또는 억제를 유도하는 단계를 포함하는, 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 다수의 TnpB 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 시스템, 복합체 또는 이의 성분 중 하나 이상의 성분을 코딩하거나 또는 포함한다. 임의 치료가 생체외에서, 예를 들어, 세포 배양에서 일어나는 경우에, 용어 '대상체'는 어구 "세포 또는 세포 배양"으로 대체될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
또한 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, 방법은 TnpB 폴리펩티드(들)로 대상체를 형질전환시키고, 조성물, 시스템, (예를 들어, RNA)의 나머지 부분을 생체내에서 유리하게 코딩하고 발현시켜서 유전자 편집을 유도하는 단계를 포함한다. 적합한 복구 주형은 예를 들어, 상기 복구 주형을 포함하는 벡터에 의해 전달되어서, 제공될 수 있다. 또한, 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, 방법은 TnpB 폴리펩티드(들)로 대상체를 형질전환시키고, 조성물, 시스템, (예를 들어, 핵산 성분 분자)의 나머지 부분을 유리하게 생체내에서 코딩하고 발현시켜서, 전사 활성화 또는 억제를 유도하는 단계를 포함하고; 유리하게, 일 구현예에서 TnpB 폴리펩티드는 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드이고, 하나 이상의 연관된 기능성 도메인을 포함한다. 임의 치료가 생체외에서, 예를 들어, 세포 배양에서 일어나는 경우에, 용어 '대상체'는 어구 "세포 또는 세포 배양"으로 대체될 수 있다는 것을 이해한다.
본 명세서에 기술되는 조성물 및 시스템의 하나 이상의 성분은 조성물, 예컨대 약학 조성물에 포함될 수 있고, 숙주에게 개별적으로 또는 집합적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 이들 성분은 숙주에 투여를 위해 단일 조성물로 제공될 수 있다. 숙주에 대한 투여는 숙주에 전달을 위해 당업자에게 공지되거나 또는 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터)를 통해 수행될 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 바와 같이, 상이한 선택 마커 (예를 들어, 렌티바이러스 핵산 성분 선택용) 및 핵산 성분의 농도 (다수 핵산 성분이 사용되는지 여부에 의존)의 사용은 개선된 효과를 유발하는데 유리할 수 있다.
따라서, 또한 대상체, 감염성 유기체, 및/또는 대상체의 마이크로바이옴의 유기체의 진핵생물 또는 원핵생물 세포 또는 이의 성분 (예를 들어, 미토콘드리아)에서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변형을 유도하는 방법이 기술된다. 변형은 하나 이상의 세포(들)의 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형은 시험관내, 생체외, 제자리, 또는 생체내에서 일어날 수 있다.
일 구현예에서, 진핵생물 유기체 또는 비-인간 유기체의 게놈 유전자좌에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 유발되는 병태 또는 질환을 치료하거나 또는 억제하는 방법은 표적 서열의 조작에 의해서 대상체 또는 비-인간 대상체를 변형시키는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체 또는 비-인간 대상체에서 표적 서열의 상기 게놈 유전자좌의 코딩, 비-코딩 또는 조절 구성요소 내 표적 서열의 조작을 포함할 수 있고, 병태 또는 질환은 상기 구현예 중 어느 하나의 입자 전달 시스템 또는 전달 시스템 또는 상기 구현예 중 어느 하나의 세포를 포함하는 조성물을 전달하는 단계를 포함하는 치료를 제공하는 것을 포함하는 표적 서열의 조작에 의한 치료 또는 억제에 감수성이다.
본 명세서는 또한 생체외 또는 생체내 유전자 또는 게놈 편집에서; 또는 시험관내, 생체외 또는 생체내 유전자 요법에서 사용을 위한, 상기 구현예 중 어느 하나의 입자 전달 시스템 또는 전달 시스템 또는 바이러스 입자 또는 상기 구현예 중 어느 하나의 세포의 용도를 제공한다. 본 명세서는 또한 시험관내, 생체외 또는 생체내 유전자 또는 게놈 편집을 위한 약물의 제조에서 사용하거나 또는 시험관내, 생체외 또는 생체내 유전자 요법에서 사용하거나 또는 질환 연관된 게놈 유전자좌의 표적 서열의 조작에 의해서 유기체 또는 비-인간 유기체를 변형시키는 방법 또는 진핵생물 유기체 또는 비-인간 유기체에서 게놈 유전자좌의 하나 이상의 돌연변이에 의해 유발되는 병태 또는 질환을 치료 또는 억제하는 방법에서 사용을 위한 상기 구현예 중 어느 하나의 입자 전달 시스템, 비-바이러스 전달 시스템, 및/또는 바이러스 입자, 또는 상기 구현예 중 어느 하나의 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 변형은 상기 세포(들)의 상기 폴리뉴클레오티드의 각 표적 서열에서 1-75 뉴클레오티드의 도입, 결실, 또는 치환을 포함한다. 변형은 각 표적 서열에서 적어도 1, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형은 상기 세포(들)의 각 표적 서열에서 적어도 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 뉴클레오티드의 도입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형은 상기 세포(들)의 각 표적 서열에서 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 뉴클레오티드의 도입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형은 상기 세포(들)의 각 표적 서열에서 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 뉴클레오티드의 도입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형은 상기 세포(들)의 각 표적 서열에서 적어도 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 또는 500 뉴클레오티드의 도입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형은 각 표적 서열에서 적어도 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 또는 9900 내지 10000 뉴클레오티드의 도입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 변형은 핵산 성분 (예를 들어, 핵산 성분 분자(들) RNA(들) 또는 핵산 성분(들))을 통해서 상기 세포(들)의 각 표적 서열에서 뉴클레오티드의 도입, 결실, 또는 치환, 예컨대 본 명세서의 다른 곳에 기술된 조성물, 시스템, 또는 성분에 의해 매개되는 것들을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 변형은 조성물, 시스템, 또는 기술을 통해서 상기 세포(들)의 표적 또는 무작위 서열에서 뉴클레오티드의 도입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분은 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)을 촉진할 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분에 의한 폴리뉴클레오티드, 예컨대 질환 폴리뉴클레오티드의 변형은 NHEJ를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분에 의한 이러한 복구 경로의 촉진은 표적 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 특이적 녹-아웃 및/또는 녹-인을 표적화하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분에 의한 이러한 복구 경로의 촉진은 NHEJ-매개 indel을 생성시키는데 사용될 수 있다. 뉴클레아제-유도된 NHEJ는 또한 관심 유전자에서 서열을 제거 (예를 들어, 결실)시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로, NHEJ 는 2개 말단을 함께 연결하여 DNA에서 이중 가닥 파손을 복구시키지만, 일반적으로, 본래 서열은 2개 양립가능한 말단이, 그들이 정확하게 이중 가닥 파손에 의해 형성되는 것처럼, 완벽하게 결찰되는 경우에만 복원된다. 이중 가닥 파손의 DNA 말단은 종종 효소 처리의 대상이 되어 말단이 다시 결합되기 전에 한 가닥 또는 두 가닥 모두에서 뉴클레오티드가 추가되거나 제거된다. 이러한 결과로 NHEJ 복구 부위에서 DNA 서열에 삽입 및/또는 결실 (indel) 돌연변이의 존재를 야기한다. indel은 1-50 이상의 염기쌍 크기 범위일 수 있다. 일 구현예에서 indel은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 또는 500 염기쌍 이상일 수 있다. 이중 가닥 파손이 짧은 표적 서열 근처를 표적화하면, NHEJ 복구에 의해 유발되는 결실 돌연변이는 종종 포괄되고, 그러므로, 원치않는 뉴클레오티드를 제거한다. 더 큰 DNA 절편의 결실 경우, 서열 각 측면 중 하나에서, 2개 이중 가닥 파손을 도입하여서, 전체 개체 서열의 제거가 있는 말단 사이에서 NHEJ를 야기할 수 있다. 이들 접근법 둘 모두는 특이적 DNA 서열을 결실시키는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 매개된 NHEJ는 작은 서열 모티프를 결실시키는 방법에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템, 매개된 NHEJ는 유전자, 예를 들어, 코딩 영역을 표적화할 수 있는 MHEJ-매개된 indel을 생성시키는 방법에서 사용될 수 있어서, 예를 들어, 관심 유전자의 초기 코딩 영역은 관심 유전자의 녹아웃 (즉, 발현의 제거)에 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 유전자의 초기 코딩 영역은, 코딩 서열의 제1 엑손 내 또는 전사 출발 부위의 500 bp 내(예를 들어, 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp 또는 50 bp 미만)에 있는, 전사 출발 부위 직후의 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 성분 및 TnpB 폴리펩티드가 NHEJ-매개된 indel의 유도 목적을 위해 이중 가닥 파손을 생성시키는 경우에, 핵산 성분은 표적 위치의 뉴클레오티드에 근접하여 하나의 이중-가닥 파손을 위치시키도록 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0과 500 bp 사이 (예를 들어, 표적 위치로부터 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 bp 미만)에 있을 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 닉카제와 복합체 형성된 2개 성분 RNA가 NHEJ-매개 indel 유도의 목적을 위해 2개 단일 가닥 파손을 유도하는 경우에, 2개 성분 RNA은 NHEJ 복구를 위해 표적 위치의 뉴클레오티드를 제공하기 위해서 2개 단일-가닥 파손이 위치되도록 구성될 수 있다.
독성 및 오프-표적 효과의 최소화를 위해서, 전달되는 TnpB 폴리펩티드 mRNA 및 성분 RNA의 농도를 제어하는 것이 중요할 수 있다. TnpB 폴리펩티드 mRNA 및 성분 RNA의 최적 농도는 세포 또는 비-인간 진핵생물 동물 모델에서 상이한 농도를 시험하고 잠재적 오프-표적 게놈 유전자좌에서 변형의 정도를 분석하도록 딥 시퀀싱을 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 독성 및 오프-표적 효과의 수준을 최소화하기 위해서, 닉카제 mRNA (예를 들어, 돌연변이된 TnpB)는 관심 부위를 표적화하는 핵산 성분의 쌍을 사용해 정달될 수 있다.
전형적으로, 내생성 TnpB 폴리펩티드의 상황에서, TnpB 폴리펩티드 또는 복합체 (표적 서열과 혼성화되고 하나 이상의 TnpB 폴리펩티드와 복합체형성하는 폴리뉴클레오티드 성분 서열을 포함함)의 형성은 표적에서 또는 근처 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 이상의 염기쌍 내)에서 하나 또는 양쪽 가득의 절단, 닉형성, 및/또는 다른 변형을 일으킨다.
일 구현예에서, 질환을 치료 또는 예방하기 위해서 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법은 조성물, 시스템이 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 할 수 있는 바와 같이, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분이 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하여서, 예를 들어, 절단, 닉형성, 또는 다른 변형을 실시하도록 허용하여서, 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 단계를 포함하고, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분은 핵산 성분 분자 서열과 복합체를 형성하고, 표적 폴리뉴클레오티드 내 표적 서열에 대해 상기 핵산 성분 분자 서열을 혼성화시키고, 상기 핵산 성분 분자 서열은 핵산 성분 스캐폴드 서열에 임의로 연결된다. 이들 구현예의 일부에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분은 핵산 성분 분자 서열과 복합체 형성하는 TnpB 폴리펩티드 복합체일 수 있거나 또는 그를 포함한다. 일 구현예에서, 변형은 조성물, 시스템, 또는 이의 성분의 하나 이상의 성분에 의해서 표적 서열의 위치에서 하나 또는 2개 가닥을 절단 또는 닉형성하는 단계를 포함할 수 있다.
조성물, 시스템에 의해 수행될 수 있는 절단, 닉형성, 또는 다른 변형은 표적 폴리뉴클레오티드의 전사를 변형시킬 수 있다. 일 구현예에서, 전사의 변형은 표적 폴리뉴클레오티드의 전사 감소를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 변형은 표적 폴리뉴클레오티드의 전사 증가를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 방법은 재조합 주형 폴리뉴클레오티드와 상동성 재조합에 의해서 상기 절단된 표적 폴리뉴클레오티드를 복구하는 단계를 포함하고, 상기 복구는 변형 예컨대, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 일으키지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 상기 변형은 표적 서열을 포함하는 유전자로부터 발현되는 단백질에서 하나 이상의 아미노산 변화를 일으킨다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분이 부여하는 변형은 제한없이, 본 명세서의 다른 곳에 더 상세히 기술되는 임의 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 질환 또는 이의 증상을 교정할 수 있는 전사물 및/또는 단백질을 제공한다.
일 구현예에서, 질환을 치료 또는 예방하는 방법은 하나 이상의 벡터 또는 벡터 시스템을 세포, 예컨대 진핵생물 또는 원핵생물 세포에 전달하는 단계를 포함할 수 있고, 하나 이상의 벡터 또는 벡터 시스템은 조성물, 시스템, 또는 이의 성분을 포함한다. 일 구현예에서, 벡터(들) 또는 벡터 시스템(또는)은 본 명세서의 다른 곳에 상술되는, 바이러스 벡터 또는 벡터 시스템, 예컨대 AAV 또는 렌티바이러스 벡터 시스템일 수 있다. 일 구현예에서, 질환을 치료 또는 예방하는 방법은 조성물, 시스템, 또는 이의 성분을 함유하는, 하나 이상의 바이러스 입자, 예컨대 AAV 또는 렌티바이러스 입자를 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 바이러스 입자는 조직 특이적 향성을 갖는다. 일 구현예에서, 바이러스 입자는 간, 근육, 눈, 심장, 췌장, 신장, 뉴런, 상피 세포, 내피 세포, 성상세포, 신경아교세포, 면역 세포, 또는 적혈 세포 특이적 향성을 갖는다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 조성물, 및 시스템, 예컨대 본 발명에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 방법에서 사용을 위한, 조성물 및 시스템은 조성물, 시스템에 공지된 임의 유형의 적용에서, 바람직하게 진핵생물에서 적합하게 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일정 양태에서, 적용은 치료적이고, 바람직하게, 예컨대 동물 (인간 포함), 식물, 조류, 진균 (효모 포함) 등을 포함하여, 진핵생물 유기체에서 치료적이다. 대안적으로, 또는 추가로, 일정 양태에서, 적용은 하나 이상의 특정 형질 또는 특징, 예컨대 역시 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은, 유전형 및/또는 표현형 형질 또는 특징을 수반하거나 또는 유도하는 것을 포함할 수 있다.
순환계의 질환 치료
일 구현예에서, 일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분은 순환계 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 예시적인 질환은 예를 들어, 표 2 및 3에 제공된다. 일 구현예에서 Wahlgren 등 (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 e130)의 혈장 엑소솜은 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분은 순환계 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 순환계 질환은 생체내 또는 생체외에서 조혈 줄기 세포 (HSC)를 변형시키기 위해 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템을 전달하기 위해 렌티바이러스를 사용하여 치료될 수 있다 (참조: 예를 들어, Drakopoulou, "Review Article, The Ongoing Challenge of Hematopoietic Stem Cell-Based Gene Therapy for β-Thalassemia," Stem Cells International, Volume 2011, Article ID 987980, 10 pages, doi:10.4061/2011/987980; 본 명세서의 설명 관점에서, 본 명세서의 조성물, 시스템과 사용을 위해 적합화될 수 있음). 일 구현예에서, 순환계 장애는 본 명세서의 조성물, 시스템, 또는 이의 성분을 사용해 질환에 대해 HSC를 교정하여 치료될 수 있고, 조성물, 시스템은 임의로 적합한 HDR 복구 주형을 포함한다 (참조: 예를 들어, Cavazzana, "Outcomes of Gene Therapy for β-Thalassemia Major via Transplantation of Autologous Hematopoietic Stem Cells Transduced Ex Vivo with a Lentiviral βA-T87Q-globin Vector."; Cavazzana-Calvo, "Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human β-thalassaemia", Nature 467, 318-322 (16 September 2010) doi:10.1038/nature09328; Nienhuis, "Development of Gene Therapy for Thalassemia, Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, doi: 10.1101/cshperspect.a011833 (2012), LentiGlobin BB305, a lentiviral vector containing an engineered β-globin gene (βA-T87Q); and Xie et al., "Seamless gene correctioin of β-thalassaemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyback" Genome Research gr.173427.114 (2014) www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.173427.114 (Cold Spring Harbor Laboratory Press; [1599] Watts, "Hematopoietic Stem Cell Expansion and Gene Therapy" Cytotherapy 13(10):1164-1171. doi:10.3109/14653249.2011.620748 (2011); 본 명세서의 설명의 관점에서 본 명세서의 조성물, 시스템과 사용을 위해 적합화됨). 일 구현예에서, iPSC는 순환계 질환과 연관된 질환 폴리뉴클레오티드를 교정하기 위해 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템을 사용해 변형될 수 있다. 이와 관련하여, iPSC의 변형에 대해서 Xu et al. (Sci Rep. 2015 Jul 9;5:12065. doi: 10.1038/srep12065) 및 Song et al. (Stem Cells Dev. 2015 May 1;24(9):1053-65. doi: 10.1089/scd.2014.0347. Epub 2015 Feb 5)의 교시는 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템과 함께 본 명세서의 관점에서 사용을 위해 적합화될 수 있다.
용어 "조혈 줄기 세포” 또는 "HSC”는 HSC, 예를 들어 모든 다른 혈액 세포를 발생시키고 중간엽으로부터 유래되고; 대부분의 뼈 중심에 함유된 적색 골수에 위치하는, 혈액 세포로 간주되는 광범위한 세포를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 HSC는 소형 크기, 계통 (lin) 마커의 결여, 및 CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, 및 또한 c-kit, -줄기 세포 인자의 수용체같이, 분화 클러스터 시리즈에 속하는 마커에 의해서 확인되는, 조혈 줄기 세포의 표현형을 갖는 세포를 포함한다. 조혈 줄기 세포는 계통 관련성의 검출에 사용되는 마커에 대해 음성이고, 따라서, Lin-라고 불리고; FACS에 의한 그들 정제 동안, 다수의 최대 14개 상이한 성숙한 혈액-계통 마커, 예를 들어, 인간에서, 골수 경우 CD13 및 CD33, 적혈구 경우 CD71, B 세포 경우 CD19, 거핵세포 경우 CD61 등; 및 B 세포 경우 B220 (마우스 CD45), 단핵구 경우 Mac-1 (CD11b/CD18), 과립구 경우 Gr-1, 적혈 세포 경우 Ter119, T 세포 경우 Il7Ra, CD3, CD4, CD5, CD8 등이다. 마우스 HSC 마커: CD34lo/-, SCA-1+, Thy1.1+/lo, CD38+, C-kit+, lin-, 및 인간 HSC 마커: CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo/-, C-kit/CD117+, 및 lin-. HSC는 마커를 통해서 확인된다. 그러므로 본 명세서에 논의된 구현예에서, HSC는 CD34+ 세포일 수 있다. HSC는 또한 CD34-/CD38- 인 조혈 줄기 세포이다. HSC로서 작용하는 것으로 간주되는 세포 표면 상의 c-kit가 결여될 수 있는 줄기 세포는 본 발명의 영역 내에 있을뿐만 아니라, 유사하게 CD133+ 세포도 당분야에서 HSC로 간주한다.
일 구현예에서, 순환계 또는 혈관 질환을 치료 하기 위한 치료 또는 예방은 본 명세서에 기술된 임의 변형으로 인간 제대혈 세포를 변형시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 순환계 또는 혈액 질환을 치료하기 위한 치료 또는 예방은 본 명세서에 기술된 임의 변형으로 과립구 콜로니-자극 인자-동원된 말초 혈액 세포 (mPB)를 변형시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 인간 제대혈 세포 또는 mPB는 CD34+ 일 수 있다. 일 구현예에서, 변형된 제대혈 세포(들) 또는 mPB 세포(들)는 자기유래일 수 있다. 일 구현예에서, 제대혈 세포(들) 또는 mPB 세포(들)는 동종이계일 수 있다. 질환 유전자(들)의 변형이외에도, 동종이계 세포는 수용자에게 전달했을 때 세포의 면역원성을 감소시키기 위해 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템을 사용하여 더욱 변형될 수 있다. 이러한 기술은 본 명세서의 다른 곳에 기 술되어 있고, 예를 들어, 하기 문헌에 기술되어 있다: Cartier, "MINI-SYMPOSIUM: X-Linked Adrenoleukodystrophypa, Hematopoietic Stem Cell Transplantation and Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy in X-Linked Adrenoleukodystrophy," Brain Pathology 20 (2010) 857-862 (본 명세서의 조성물, 시스템과 사용을 위해 적합화될 수 있음). 변형된 제대혈 세포(들) 또는 mPB 세포(들)는 임의로 시험관내에서 확장될 수 있다. 변형된 제대혈 세포(들) 또는 mPB 세포(들)는 임의의 적합한 전달 기술을 사용해 이를 필요로 하는 대상체에게 전달될 수 있다.
조성물은 HSC에서 유전자의 유전자좌 또는 유전자좌를 표적화하도록 조작될 수 있다. 일 구현예에서, TnpB 폴리펩티드(들)는 진핵생물 세포 및 특히 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, HSC, 또는 iPSC에 대해 코돈-최적화될 수 있고, 순환계 질환같은, HSC에서 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적화하는 핵산 성분을 제조할 수 있다. 이들은 입자를 통해 전달될 수 있다. 입자는 TnpB 폴리펩티드 및 핵산 성분을 혼합하여 형성될 수 있다. 핵산 성분 및 TnpB 폴리펩티드 혼합물은 예를 들어, 계면활성제, 인지질, 생분해성 중합체, 지단백질 및 알콜을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 혼합물과 혼합될 수 있어서, 핵산 성분 및 TnpB 폴리펩티드를 함유하는 입자가 형성될 수 있다. 본 발명은 이렇게 만든 입자 및 이러한 방법에 의한 입자를 비롯하여 이의 용도를 이해한다. 혈액 또는 순환계의 상황에서 조성물의 입자 적합한 전달 또는 혈액 또는 순환계로 HSC 전달은 본 발명의 다른 곳에서 보다 상세히 설명된다.
일 구현예에서, 생체외 변형 이후에 HSC 또는 iPCS는 대상체에게 투여 전에 확장될 수 있다. HSC는 임의의 적합한 방법 예컨대 하기 문헌에 기술된 것을 통할 수 있다: Lee, "Improved ex vivo expansion of adult hematopoietic stem cells by overcoming CUL4-mediated degradation of HOXB4." Blood. 2013 May 16;121(20):4082-9. doi: 10.1182/blood-2012-09-455204. Epub 2013 Mar 21.
일 구현예에서, 변형된 HSC 또는 iPSC 는 자기유래일 수 있다. 일 구현예에서, HSC 또는 iPSC는 동종이계일 수 있다. 질환 유전자(들)의 변형이외에도, 동종이계 세포는 수용자에게 전달했을 때 세포의 면역원성을 감소시키기 위해 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템을 사용하여 더욱 변형될 수 있다. S이러한 기술은 본 명세서의 다른 곳 및 예를 들어, 하기 문헌들에 기술되어 있고, 본 명세서의 조성물, 시스템과 사용에 적합화될 수 있다: Cartier, "MINI-SYMPOSIUM: X-연결된 Adrenoleukodystrophypa, Hematopoietic Stem Cell Transplantation and Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy in X-Linked Adrenoleukodystrophy," Brain Pathology 20 (2010) 857-862.
신경학적 질환의 치료
일 구현예에서, 명세서에 기술되는 조성물, 시스템은 뇌 및 CNS의 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 뇌에 대한 전달 옵션은 리포솜에 DNA 또는 RAN의 형태로 TnpB 폴리펩티드 및 핵산 성분 분자의 캡슐화 및 혈액 뇌 장벽 (BBB) 관통 전달을 위한 분자 트로이 목마와 접합을 포함한다. 분자 트로이 목마는 비인간 영장류의 뇌 내로 B-gal 발현 벡터의 전달에 효과적인 것으로 나타났다. 동일한 접근법이 TnpB 폴리펩티드 및 핵산 성분 분자를 함유하는 벡터를 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Xia CF and Boado RJ, Pardridge WM ("Antibody-mediated targeting of siRNA via the human insulin receptor using avidin-biotin technology." Mol Pharm. 2009 May-Jun;6(3):747-51. doi: 10.1021/mp800194)은 배양 세포로 짧은 간섭 RNA (siRNA)를 전달하는 방법을 기술하고, 생체내에서, 수용체-특이적 단일클론 항체 (mAb) 및 아비딘-바이오틴 기술의 조합 사용이 가능하다. 저자는 또한 표적화 mAb 및 siRNA 간 결합이 아비딘-바이오틴 기술로 안정하기 때문에, 별개 부위, 예컨대 뇌에서 RNAi 효과가 표적화된 siRNA의 정맥내 투여 후 생체내에서 관찰되었다고 보고하여서, 이의 교시는 본 명세서의 조성물, 시스템에 사용을 위해 적합화될 수 있다. 다른 구현예에서, 인공 바이러스는 CNS 및/또는 뇌 전달을 위해 생성될 수 있다. 예를 들어, Zhang 등 (Mol Ther. 2003 Jan;7(1):11-8.))을 참조하고, 이의 교시는 본 명세서의 조성물, 시스템과 사용을 위해 적합화될 수 있다.
청각 질환의 치료
일 구현예에서 본 명세서에 기술된 조성물 및 시스템은 한쪽 귀 또는 양쪽 귀의 난청 또는 청각 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 난청은 종종 청각 뉴런으로 신호를 전달할 수 없는 손실되거나 손상된 모발 세포에 의해 발생된다. 이러한 경우에서, 달팽이관 이식은 신경 세포로 소리에 대한 반응 및 전기 신호 전달을 위해 사용될 수 있다. 그러나 성장 인자가 손상된 모발 세포에 의해 거의 방출되지 않기 때문에 이들 뉴런은 종종 퇴화하고 달팽이관으로부터 후퇴한다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템 또는 변형된 세포는 임의의 적합한 방법 또는 기술에 의해 청력 질환 또는 청력 상실을 치료 또는 예방하기 위해 한쪽 귀 또는 양쪽 귀에 전달될 수 있다. 적합한 방법 및 기술은 US 특허 공개 번호 제20120328580호에 기술된 것을을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 여기서는 귀 (예를 들어, 귀 투여), 예컨대 달팽이관의 관내강 (예를 들어, 중앙계, 정전계, 및 고실계)으로, 예를 들어, 시린지, 예를 들어, 단일-용량 시린지를 사용한 약학 조성물의 주사를 기술한다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 화합물은 고막내 주사 (예를 들어, 중이로) 및/또는 외이, 중이 및/또는 내이로의 주사; 카테터 또는 펌프를 통해 제자리 투여 (참조: 예를 들어, McKenna et al., (U.S. 특허 공개 번호 제2006/0030837호) 및 Jacobsen et al., (미국 특허 제7,206,639호); 기계적 장치, 예컨대 외이에 착용하는 보청기 또는 인공와우와 조합한 투여 (참조:예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제2007/0093878호로서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템의 귀로의 전달에 적합한 예시적인 인공와우를 제공함)에 의해 투여될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 인간 귀로 스테로이드 및 항체의 투여를 위해 당 분야에서 관례적으로 사용된다. 주사는, 예를 들어 귀의 원창을 통하거나 혹은 달팽이관 캡슐을 통할 수 있다. 다른 내이 투여 방법이 당 분야에서 공지되었다 (참조: 예를 들어, Salt and Plontke, Drug Discovery Today, 10:1299-1306, 2005). 일 구현예에서, 카테터 또는 펌프는 수술 과정 동안, 예를 들어, 환자의 귀 (예를 들어, 외이, 중이, 및/또는 내이)에 배치될 수 있다. 일 구현예에서, 카테터 또는 펌프는 수술 과정 필요 없이, 예를 들어, 환자의 귀 (예를 들어, 외이, 중이, 및/또는 내이)에 위치될 수 있다.
일반적으로, 미국 특허 출원 공개 번호 제20120328580호에 기재된 세포 치료 방법이 실험관내 내이의 성숙 세포 유형 (예를 들어, 모발 세포)에 대해 또는 이를 향해 세포의 완전한 부분적 분화를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 그런 다음 이러한 방법으로부터 야기된 세포는 이러한 치료가 필요한 환자에게 이식되거나 주입될 수 있다. 적합한 세포 유형을 확인하고 스크리닝하기 위한 방법을 포함하는 이들 방법을 실시하기 위해 요구되는 세포 배양 방법, 선택된 세포의 완전한 또는 부분적 분화를 촉진하는 방법, 완전히 또는 부분적으로 분화된 세포 유형을 확인하기 위한 방법, 및 완전히 또는 부분적으로 분화된 세포를 이식하는 방법이 하기에 기재된다.
본 발명에서 사용을 위해 적합한 세포는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 화합물 중 하나 이상과 시험관내에서 접촉될 때 내이의 성숙 세포, 예를 들어 모발 세포 (예를 들어 내부 및/또는 외부 모발 세포)로 완전히 또는 부분적으로 분화할 수 있는 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 모발 세포로 분화할 수 있는 예시적 세포는 줄기 세포 (예를 들어, 내이 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 골수 유래 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 피부 줄기 세포, iPS 세포, 및 지방 유래 줄기 세포), 전구세포(예를 들어, 내이 전구세포), 지지 세포(예를 들어, 다이테르스 세포, 주상세포, 내부 지골 세포, 시개 세포 및 헨젠 세포), 및/또는 생식 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 내이 감각 세포의 대체를 위한 줄기 세포의 사용은 Li et al., (U.S. 특허 공개 번호 제2005/0287127호) 및 Li et al., (미국 특허 출원 제11/953,797호)에 기술된다. 내이 감각 세포의 대체를 위한 골수 유래 줄기 세포의 사용은 하기 문헌에 기술된다: Edge et al., PCT/US2007/084654. iPS 세포는 예를 들어, 하기 문헌들에 기술된다: Takahashi et al., Cell, Volume 131, Issue 5, Pages 861-872 (2007); Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-76 (2006); Okita et al., Nature 448, 260-262 (2007); Yu, J. et al., Science 318(5858):1917-1920 (2007); Nakagawa et al., Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008); 및 Zaehres and Scholer, Cell 131(5):834-835 (2007). 이러한 적합한 세포는 하나 이상의 조직 특이적 유전자의 존재를 분석 (예를 들어, 정성적 또는 정량적)하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현은 하나 이상의 조직-특이적 유전자의 단백질 산물을 검출하여 검출될 수 있다. 단백질 검출 기법은 적절한 항원에 대해 항체를 사용하는 (예를 들어, 세포 추출물 또는 전체 세포를 사용하는) 염색 단백질을 수반한다. 이러한 경우에서, 적절한 항원은 조직-특이적 유전자 발현의 단백질 산물이다. 원칙적으로 제1 항체(즉, 항원에 결합하는 항체)가 표지될 수 있지만, 제1 항체 (예를 들어, 항-IgG)로 향하는 제2 항체를 사용하는 것이 좀더 일반적 (및 시각화를 개선함)이다. 이 제2 항체는 형광색소 또는 비색법 반응에 대한 적절한 효소, 또는 금 비드(전자 현미경에 대해), 또는 바이오틴-아비딘 시스템과 접합되고, 따라서 1차 항체의 위치 및 그에 따른 항원이 인식될 수 있다.
조성물 및 시스템은 US 특허 출원 공개 번호 제20110142917호로부터 변형된 조성물로, 외이에 약학 조성물의 직접 도포를 통해 귀에 전달될 수 있다. 일 구현예에서 약학 조성물은 이도에 도포된다. 귀로의 전달은 청각 또는 귀 전달을 의미할 수 있다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분 및/또는 벡터 또는 벡터 시스템은 본 발명의 TnpB 시스템에 적용될 수 있는 신규한 단백질 전달 기술을 통해서 온전한 원창을 통해서 내이로 형질감염을 통해 귀에 전달될 수 있다 (참조: 예를 들어, Qi et al., Gene Therapy (2013), 1-9). 약 40㎕의 10 mM RNA가 귀에 투여를 위한 용량으로서 고려될 수 있다.
Rejali 등 (Hear Res. 2007 Jun;228(1-2):180-7)에 따라서, 달팽이관 이식 기능은 이식물에 의한 전기적 자극의 표적인 나선청신경절 뉴런의 양호한 보정에 의해 개선될 수 있으며, 뇌 유래 신경성장 인자 (BDNF)는 실험적으로 청각을 잃은 귀에서 나선청신경절 생존을 향상시키는 것으로 이전에 나타났다. Rejali 등은 BDNF 유전자 삽입을 이용하여 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 섬유아세포의 코팅을 포함하는 달팽이관 이식 전극의 변형된 설계를 시험하였다. 이 유형의 생체외 유전자 이송을 완수하기 위해, Rejali 등은 BDNF 유전자 카세트 삽입을 갖는 아데노바이러스를 기니아피그 섬유아세포에 형질도입시키고, 이 세포들이 BDNF를 분비하는 것을 밝힌 후 BDNF-분비 세포를 아가로스 겔을 통해 달팽이관 이식 전극에 부착시키고 고실계에 전극을 이식했다. Rejali 등은 BDNF 발현 전극이 대조군 전극에 비해 이식 48일 후에 달팽이관의 기본 회전에서 상당히 더 많은 나선청신경절을 보존할 수 있다는 것을 결정하였고, 나선청신경절 뉴런 생존을 향상시키기 위한 생체밖 유전자 전달과 달팽이관 이식 요법을 조합하는 것의 실행가능성을 입증하였다. 이러한 시서템은 귀로 전달을 위해 본 발명의 TnpB 시스템에 적용될 수 있다.
일 구현예에서, Mukherjea 등 (Antioxidants & Redox Signaling, Volume 13, Number 5, 2010)이 기재한 시스템은 귀에 조성물, 시스템, 또는 이의 성분의 경고막 투여에 적합화될 수 있다. 일 구현예에서, 약 2 mg 내지 약 4 mg 용량의 TnpB 폴리펩티드가 인간에 투여를 위한 것이다.
일 구현예에서, [Jung et al. (Molecular Therapy, vol. 21 no. 4, 834-841 apr. 2013)]에 기재된 시스템은 귀로 조성물, 시스템, 또는 이의 성분의 전정 상피 전달을 위해 적합화될 수 있다. 일 구현예에서, 약 1 내지 약 30 mg 용량의 TnpB 폴리펩티드가 인간에 투여를 위한 것이다.
비분열 세포의 질환 치료
일 구현예에서, 교정하려는 유전자 또는 전사물은 비-분열 세포에 존재한다. 예시적인 비-분열 세포는 근육 세포 또는 뉴런이다. 비분열 (특히 비분열, 완전 분화) 세포 유형은 예를 들어 상동성 재조합 (HR)이 일반적으로 G1 세포-주기 시기에서 억제되기 때문에, 유전자 표적화 또는 게놈 조작에 문제를 제기한다. 그러나, 세포가 정상 DNA 복구를 조절하는 기전을 연구하면서, Durocher는 비분열 세포에서 HR을 "끔"으로 유지시키는 이전에 알려지지 않은 스위치를 발견하였고 이러한 스위치를 다시 켜는 전략을 고안하였다. Orthwein 등 (Daniel Durocher's lab at the Mount Sinai Hospital in Ottawa, Canada)의 최근 보고 (Nature 16142, 2015년 12월 9일 온라인 공개)는 HR의 억제가 해제될 수 있고 유전자 표적화가 신장 (293T) 및 골육종 (U2OS) 세포에서 성공적이라고 결론내렸다. 종양 억제인자, BRCA1, PALB2 및 BRAC2는 HR에 의한 DNA DSB 복구를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 그들은 PALB2 -BRAC2와 BRCA1의 복합체의 형성이 PALB 상의 유비퀴틴 부위에 의해 지배되어서, E3 유비퀴틴 리가제에 의한 부위상의 작용을 확인하였다. 이러한 E3 유비퀴틴 리가제는 쿨린-3 (CUL3)-RBX1과의 복합체에 KEAP1 (PALB2 -상호작용 단백질)로 구성된다. PALB2 유비퀴틴화는 BRCA1과 이의 상호작용을 억제하고 그 자체로 세포 주기 제어 하에 있는, 데유비퀴틸라제 USP11에 의해 대항된다. DNA-말단 절제의 활성화와 조합된 BRCA1-PALB2 상호작용의 복원은 (pX459 벡터로부터 발현된) USP11 또는 KEAP1로 유도된 TnpB 폴리펩티드 뉴클레아제-기반 유전자-표적화 어세이를 포함한 수많은 방법으로 측정하여, G1에서 상동성 재조합을 유도하기에 충분하다. 그러나, BRCA1-PALB2 상호작용이 KEAP1 고갈 또는 PALB2-KR 돌연변이체의 발현을 사용한 절제-적격 G1 세포에서 복원되었을 때, 유전자-표적화 사건에서 강력한 증가가 검출되었다. 이들 교시는 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템에 적합화 및/또는 적용될 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 세포, 특히 비분열, 완전 분화된 세포 유형에서 HR의 재활성화가 바람직하다. 일 구현예에서, BRCA1-PALB2 상호작용의 촉진이 일 구현예에서, 바람직하다. 일 구현예에서, 표적 세포는 비-분열 세포이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 뉴런 또는 근육 세포이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 생체내에서 표적화된다. 일 구현예에서, 세포는 G1 이고 HR은 억제된다. 일 구현예에서, KEAP1 고갈의 사용, 예를 들어, KEAP1 활성의 발현 억제가 바람직하다. KEAP1 고갈은 예를 들어 Orthwein 등이 확인한 바와 같이, siRNA를 통해 달성될 수 있다. 대안적으로, PALB2-KR 돌연변이체 (BRCA1-상호작용 도메인 내 모든 8개 Lys의 결여)의 발현이 KEAP1 고갈과 조합하여 또는 단독으로 바람직하다. PALB2-KR은 세포 주기 위치와 무관하게, BRCA1과 상호작용한다. 따라서, 특히 G1 세포에서 BRCA1-PALB2 상호작용의 촉진 또는 복원이 바람직하다. 일 구현예에서, 특히 표적 세포가 비-분열이거나, 또는 제거 및 복귀 (생체외 유전자 표적화)가 문제인 경우에, 예를 들어 뉴건 또는 근육 세포이다. KEAP1 siRNA는 ThermoFischer에서 입수가능하다. 일 구현예에서, BRCA1-PALB2 복합체는 G1 세포로 전달될 수 있다. 일 구현예에서, PALB2 탈유비퀴틴화는 예를 들어 데유비퀴틸라제 USP11의 증가된 발현을 통해서 촉진될 수 있어서, 데유비퀴티나제 USP11의 발현 또는 활성을 촉진하거나 또는 상향조절하도록 제공될 수 있다는 것을 고려한다.
안 질환의 치료
일 구현예에서, 치료하려는 질환은 눈에 발병되는 질환이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 또는 이의 성분은 한쪽 또는 양쪽 눈에 전달된다.
조성물, 시스템은 하기 문헌에 더욱 기술되는 몇몇 유전적 돌연변이로부터 발생되는 안구 결함을 교정하는데 사용될 수 있다: Genetic Diseases of the Eye, Second Edition, edited by Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012.
일 구현예에서, 치료 또는 표적화되는 병태는 눈 장애이다. 일 구현예에서, 눈 장애는 녹내장을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 눈 장애는 망막 변성 질환을 포함한다. 일 구현예에서, 망막 변성 질환은 스타르가르트병, 바르뎃-비들 증후군, 베스트병, 파란색 원추 단색형 색각, 맥락막결손, 원뿔-막대 세포 이영양증, 선천성 고정형 야맹증, 증대 S-추체 증후군, 소아 X-연관 망막분리증, 레버 선천성 흑내장, 말라티아 레벤티네세 (Malattia Leventinesse), 노리에병 또는 X-연관 가족 삼출 유리체망막병증, 패턴 이영양증, 소르스비 이영양증, 어셔 증후군, 망막 색소변성증, 완전색맹 또는 황반 이영양증 또는 변성, 망막색소변성증, 완전색맹, 및 나이 관련 황반 변성으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 망막 변성 질환은 레버 선천성 흑내장 (LCA) 또는 망막 색소변성증이다. 다른 예시적인 눈 질환은 본 명세서의 다른 곳에 상세히 기술된다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템은 임의로 유리체내 주사 또는 망막하 주사를 통해 눈에 전달된다. 안내 주입은 수술 현미경의 도움으로 실행될 수 있다. 망막하 및 유리체내 주사에서, 눈은 가벼운 손가락 압력에 의해 탈출될 수 있으며 기반부는 현미경용 유리 슬라이드 커버슬립으로 덮은 각막 상에 커플링 배지 용액을 떨어뜨리는 것으로 구성된 콘텍트 렌즈 시스템을 사용하여 시각화되었다. 망막하 주사에서, 5-㎕ 해밀턴 주사기에 고정된 10-mm 34-게이지 바늘의 끝부분이, 망막하 공간에서 바늘의 구멍이 보일 때까지, 우세한 적도 공막을 통해 접선으로 후두극을 향해 직접 시각화 하에서 진전될 수 있다. 그런 다음, 2 ㎕의 벡터 상청액을 주사하여 우세한 수포성 망막 분리를 생성할 수 있으며, 따라서 이는 망막하 벡터 투여를 확인하는 것이다. 이러한 접근법은 RPE에 의해 흡수될 때까지, 일반적으로 48시간의 과정 내에 벡터 상청액이 망막하 공간에서 보유되도록 하는 자기-밀봉 공막절단을 창출한다. 이 과정은 하위 망막 분리를 생성하기 위해 하위 반구에서 반복될 수 있다. 이 기술은 벡터 현탁액으로 대략 70% 의 감각신경 망막 및 RPE의 노출을 야기한다. 유리체내 주사에서, 바늘 끝은 공막을 통해 각공막 경계 1 mm 뒤로 전진될 수 있으며 2 ㎕의 벡터 현탁액은 유리체강으로 주사된다. 전방내 주사에서, 바늘 끝은 각공막 경계 천자를 통해, 중앙 각막을 향해 진전될 수 있으며, 2 ㎕의 벡터 현탁액이 주사될 수 있다. 전방내 주사에서, 바늘 끝은 각공막 경계 천자를 통해, 중앙 각막을 향해 진전될 수 있으며, 2 ㎕의 벡터 현탁액이 주사될 수 있다. 이들 벡터는 1.0-1.4 Х 1010 또는 1.0-1.4 Х 109 형질도입 단위 (TU)/ml의 적정가가 주사될 수 있다.
일 구현예에서, 눈에 투여를 위해, 렌티바이러스 벡터가 있다. 일 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV) 벡터이다. 눈 전달을 위한 예시적인 EIAV 벡터는 하기 문헌에 기술되고, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템과 사용을 위해 적합화될 수 있다: Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 - 285, 2005년 11월 21일에 Wiley InterScience에서 온라인 공개됨 (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845; Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (September 2012). 일 구현예에서, 용량은 100 ㎕의 총 부피 중 눈 당 1.1 x 105 형질도입 유닛 (TU/눈)일 수 있다.
다른 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터, 예컨대 하기 문헌에 기술된 것들이 눈 전달에 사용될 수 있고, 문헌은 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템과 사용을 위해 적합화될 수 있다: Campochiaro et al., Human Gene Therapy 17:167-176 (February 2006), Millington-Ward et al. (Molecular Therapy, vol. 19 no. 4, 642-649 apr. 2011; Dalkara et al. (Sci Transl Med 5, 189ra76 (2013)). 일 구현예에서, 용량은 약 106 내지 109.5 입자 단위 범위일 수 있다. Millington-Ward AAV 벡터의 경우에서, 약 2 x 1011 내지 약 6 x 1013 바이러스 입자가 투여될 수 있다. Dalkara 벡터 경우, 약 1 x 1015 내지 약 1 x 1016 vg/ml의 용량이 인간에게 투여된다.
일 구현예에서, RXi Pharmaceuticals의 sd-rxRNA® 시스템이 눈으로 조성물, 시스템의 전달을 위해 사용되고/되거나 적합화될 수 있다. 이러한 시스템에서, 3 ㎍의 sd-rxRNA의 단일 유리체내 투여는 14일 동안 PPIB mRNA 수준의 서열-특이적 감소를 야기한다. sd-rxRNA® 시스템이 본 발명의 TnpB 시스템에 적용될 수 있고, 약 3 내지 20 mg 용량의 조성물이 인간 투여에 고려된다.
다른 구현예에서, 인간 로돕신 유전자로부터 표적 서열을 절단하는 방법에 대한 미국 특허 출원 공개 번호 20130183282의 방법은 또한 본 발명의 TnpB 시스템에 대해 변형될 수 있다.
다른 구현예에서, Puf-A 유전자 (눈 조직의 망막 신경절 및 색소 세포에서 발현되고 고유한 항-세포사멸 활성을 나타냄)를 눈의 망막하 또는 유리체 공간으로 전달과 관련된 망막증 및 시력-위협 안과적 장애를 치료하기 위한 미국 특허 출원 공개 번호 20130202678의 방법이 사용될 수 있거나 또는 적합화될 수 있다. 특히, 바람직한 표적은 zgc:193933, prdm1a, spata2, tex10, rbb4, ddx3, zp2.2, Blimp-1 및 HtrA2이고, 이들 모두는 본 발명의 조성물, 시스템에 의해 표적화될 수 있다.
Wu (Cell Stem Cell,13:659-62, 2013)는 DNA 절단이 유도되는 경우에, 마우스에서 백내장을 초래하는 단일 염기쌍 돌연변이로 Cas9를 이끄는 가이드 RNA를 디자인하였다. 다음으로, 접합체 복구 기전에 대해 제공되는 다른 야생형 대립유전자 또는 올리고를 사용하여 파괴된 대립유전자의 서열을 교정하였고 돌연변이체 마우스에서 백내장-초래 유전적 결합을 교정하였다. 이러한 접근법은 본 명세서에 기술되는, TnpB 조성물, 시스템에 대해 적합화 및/또는 적용될 수 있다.
미국 특허 출원 공개 번호 20120159653은 세포, 동물을 유전자 변형시키기 위한 아연 핑거 뉴클레아제, 및 황반 변성 (MD)과 연관된 단백질의 사용을 기술하고, 이의 교시는 본 명세서에 기술된, TnpB 조성물, 시스템에 대해 적용 및/또는 적합화될 수 있다.
미국 특허 출원 공개 번호 20120159653의 일 양태는 본 발명의 TnPB 시스템에 적용할 수 있는 MD와 연관된 단백질을 코딩하는 임의의 염색체 서열의 편집에 관한 것이다.
근육 질환 및 심혈관 질환의 치료
일 구현예에서, 조성물, 시스템은 근육 질환 연관된 순환계 또는 심혈관 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 심장에, 본 명세서에 기술된, 조성물, 시스템, 예를 들어, TnpB 이펙터 단백질 시스템의 전달을 고려한다. 심장 경우에, 심장에서 우선적인 유전자 수송을 보이는 심근 열대성 아데나-연관 바이러스(AAVM), 특히 AAVM41이 바람직하다 (참조: 예를 들어, Lin-Yanga et al., PNAS, March 10, 2009, vol. 106, no. 10). 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 약 1-10 x 1014 벡터 게놈의 용량이 전신 투여에 고려된다. 또한, 하기 문헌을 참조하고, 이의 교시는 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템에 적합화 및/또는 적용될 수 있다.
예를 들어, US 특허 출원 공개 번호 제20110023139호는 심혈관 질환과 관련된 세포, 동물 및 단백질을 유전적으로 변형하기 위한 아연 핑거 뉴클레아제의 사용을 기술하고 있으며, 이의 교시는 조성물, 시스템에 적합화 및/또는 적용될 수 있다. 심혈관 질환은 일반적으로 고혈압, 심장마비, 심부전, 및 뇌졸중 및 TIA를 포함한다. 심혈관 질환에 수반된 임의의 염색체 서열 또는 심혈관 질환에 수반된 임의의 염색체 서열에 의해 암호화된 단백질은 본 개시내용에 기재된 방법에서 이용될 수 있다. 심혈관-관련 단백질은 전형적으로 심혈관 질환의 발병에 대한 심혈관-관련 단백질의 실험 연관성에 근거하여 선택된다. 예를 들어, 심혈관-관련 단백질의 생산 비율 또는 순환 농도는 심혈관 장애가 결여된 집단에 비하여 심혈관 장애를 갖는 집단에서 상승되거나 감소될 수 있다. 단백질 수준에서의 차이는 웨스턴 블롯, 면역 조직화학적 염색, 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 및 질량 분석을 포함하는 프로테오믹스 기술을 사용하여 평가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 심혈관-관련 단백질은 DNA 마이크로어레이 분석, 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), 및 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (Q-PCR)을 포함하는 게놈 기술을 사용하여 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 발현 프로파일을 수득함으로써 확인될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서의 조성물, 시스템은 근육계 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 이펙터 단백질 시스템을 근육(들)에 전달하는 것을 고려한다.
일 구현예에서, 치료하려는 근육 질환은 근이영양증 예컨대 DMD이다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 예컨대 RNA 변형할 수 있는 시스템은 질환 유전자의 교정을 달성하기 위해 엑손 스키핑을 획득하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "엑손 스키핑"은 하나 이상의 상보성 안티센스 올리고뉴클레오티드(들) (AON)를 사용한 프리-mRNA 내 스플라이스 공여자 및/또는 억셉터 부위의 표적화에 의한 프리-mRNA 스플라이싱의 변형을 의미한다. 하나 이상의 스플라이스 공여자 또는 억셉터 부위에 스플라이시오솜의 접근을 차단하여, AON은 스플라이싱 반응을 방지하여서 완전하게 프로세싱된 mRNA로부터 하나 이상의 엑손의 결실을 초래할 수 있다. 엑손 스키핑은 프리-mRNA의 성숙화 과정 동안 핵에서 획득될 수 있다. 일례에서, 엑손 스키핑은 RNA 변형할 수 있는 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템을 사용하여 표적화된 엑손의 스플라이싱에 관여되는 핵심 서열의 차폐를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 엑손 스키핑은 디스트로핀 mRNA에서 달성될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템은 디스트로핀 mRNA의 엑손 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 45, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 이의 임의 조합에서 엑손 스키핑을 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템은 디스트로핀 mRNA의 엑손 43, 44, 50, 51, 52, 55, 또는 이의 임의 조합에서 엑손 스키핑을 유도할 수 있다. 이들 엑손의 돌연변이는 또한 비-엑손 스키핑 폴리뉴클레오티드 변형 방법을 사용해 교정될 수 있다.
일 구현예에서, 근육 질환의 치료를 위해서, [Bortolanza et al. Molecular Therapy vol. 19 no. 11, 2055-2064 Nov. 2011)]의 방법이 TnpB 폴리펩티드를 발현하는 AAV에 적용될 수 있고, 약 2 Х 1015 또는 2 Х 1016 vg 벡터 용량으로 인간에게 주사될 수 있다. Bortolanza 등의 교시는 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템에 적합화 및/또는 적용될 수 있다.
일 구현예에서, Dumonceaux 등 (Molecular Therapy vol. 18 no. 5, 881-887 May 2010)의 방법은 TnpB 폴리펩티드를 발현하는 AAV에 적용될 수 있고, 인간에게, 예를 들어, 약 1014 내지 약 1015 vg 용량의 벡터가 주사될 수 있다. 본 명세서에 기술된 Dumonceaux의 교시는 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템에 적합화 및/또는 적용될 수 있다.
일 구현예에서, [Kinouchi et al. (Gene Therapy (2008) 15, 1126-1130)]의 방법은 본 명세서에 기술된 조성물에 적용될 수 있고, 인간에게 예를 들어, 약 500 내지 1000 ml 용량의 40 μM 용액이 근육에 주사될 수 있다.
일 구현예에서, [Hagstrom et al. (Molecular Therapy Vol. 10, No. 2, August 2004)]의 방법은 본 명세서의 조성물, 시스템에 적합화 및/또는 적용될 수 있고, 약 15 내지 약 50 mg의 용량으로 인간의 대복재 정맥에 주사될 수 있다.
일 구현예에서, 방법은 겸상 적혈 세포 관련 질병, 예를 들어 겸상 적혈 세포 소질, 겸상 적혈 세포 질환 예컨대 겸상 적혈 세포 빈혈, β-지중해빈혈을 치료하는 것을 포함한다. 예를 들어, t방법 및 시스템은 예를 들어, β-글로빈 유전자의 하나 이상의 돌연변이를 교정하여서, 겸상 적혈구 세포의 게놈을 변형시키는데 사용될 수 있다. β-지중해 빈혈 경우에, 겸상 적혈 세포 빈혈은 시스템으로 HSC를 변형시켜서 교정될 수 있다. 시스템은 이의 DNA를 절단하여 세포의 게놈의 특이적 편집을 허용한 다음에 그 자체로 복구되게 한다. TnpB 폴리펩티드는 돌연변이된 점으로 핵산 성분 분자에 의해 삽입 및 유도된 다음에, 그 지점에서 DNA를 절단한다. 동시에, 서열의 건강한 형태가 삽입된다. 이러한 서열은 유도된 절단을 고정시키도록 세포 자신의 복구 시스템에 의해 사용된다. 이 방식으로, TnpB 폴리펩티드는 이전에 수득된 줄기 세포에서 돌연변이의 교정을 허용한다. 방법 및 시스템은 돌연변이를 표적화하여 교정하는 시스템을 사용하여 겸상 세포 빈혈에 대해 HSC를 교정하는데 사용될 수 있고 (예를 들어, β-글로빈, 유리하게 비-겸상 β-글로빈에 대한 코딩 서열을 전달하는 적합한 HDR 주형 사용); 특히, 핵산 성분 분자는 겸상 세포 빈혈을 일으키는 돌연변이를 표저고하할 수 있고, HDR은 β-글로빈의 적절한 발현의 코딩을 제공할 수 있다. 돌연변이-및-TnpB 폴리펩티드 함유 입자를 표적화하는 핵산 성분 분자는 돌연변이를 보유하는 HSC와 접촉된다. 입자는 또한 β-글로빈의 적절한 발현을 위해 돌연변이를 교정하기에 적합한 HDR 주형을 함유할 수 있거나; 또는 HSC는 HDR 주형을 함유하거나 또는 전달하는 제2 입자 또는 벡터와 접촉될 수 있다. 이렇게 접촉된 세포가 투여될 수 있고; 임의로 치료/확장될 수 있다; cf. Cartier. HDR 주형은 조작된 β-글로빈 유전자 (예를 들어, βA-T87Q), 또는 β-글로빈을 발현하도록 HSC에 제공될 수 있다.
간 및 신장 질환의 치료
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 또는 이의 성분은 신장 또는 간 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물 또는 이의 성분의 전달은 간 또는 신장에 대한 것이다.
치료적 핵산의 세포 흡수를 유도하는 전달 전략은 물리적 힘 또는 벡터 시스템, 예컨대 바이러스-, 지질- 또는 복합체- 기반 전달, 또는 나노운반체를 포함한다. 적은 가능성의 임상 관련성을 갖는 초기 적용으로부터, 유체역학적 고압 주사를 이용하여 핵산이 체계적으로 신장 세포에 어드레스된 경우, 넓은 범위의 유전자 치료적 바이러스 및 비-바이러스 담체가 생체 내에서 상이한 동물 신장 질환 모델에서 전사 후 사건을 표적화하도록 이미 적용된 바 있다 (Csaba Revesz and Peter Hamar (2011). Delivery Methods to Target RNAs in the Kidney, Gene Therapy Applications, Prof. Chunsheng Kang (Ed.), ISBN: 978-953-307-541-9, InTech, Available from: www.intechopen.com/books/gene-therapy-applications/delivery-methods-to-target-rnas-inthe-kidney). 신장으로 전달 방법은 하기 문헌의 것들을 포함할 수 있다: Yuan et al. (Am J Physiol Renal Physiol 295: F605-F617, 2008). Yuang 등의 방법은 신장에 전달을 위해 인간에 대해서 콜레스테롤과 접합된 폴리펩티드 뉴클레아제의 1-2 g 피하 주사를 고려하는 본 발명의 조성물에 적용될 수 있다. 일 구현예에서, Molitoris 등 (J Am Soc Nephrol 20: 1754-1764, 2009)의 방법은 조성물에 적합화될 수 있고, 인간에 대해 12- 20 mg/kg의 누적 용량이 신장의 근위 세뇨관 세포에 전달을 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, Thompson et al. (Nucleic Acid Therapeutics, Volume 22, Number 4, 2012)의 방법이 조성물에 대해 적합화될 수 있고, 최대 25 mg/kg 용량이 i.v 투여를 통해 전달될 수 있다. 일 구현예에서, Shimizu et al. (J Am Soc Nephrol 21: 622-633, 2010)의 방법이 조성물에 적합화될 수 있고, i.p. 투여를 위해 약 1-2 리터의 생리적 유체 중 나노담체와 복합체 형성된 약 10-20 μmol 용량 성물이 사용될 수 있다.
다른 다양한 전달 비히클, 예컨대 바이러스, 유체역학, 지질, 중합체 나노입자, 압타머, 및 이의 다양한 조합은 신장으로 조성물, 시스템을 전달하는데 사용될 수 있다 (참조: 예를 들어, Larson et al., Surgery, (Aug 2007), Vol. 142, No. 2, pp. (262-269); Hamar et al., Proc Natl Acad Sci, (Oct 2004), Vol. 101, No. 41, pp. (14883-14888); Zheng et al., Am J Pathol, (Oct 2008), Vol. 173, No. 4, pp. (973-980); Feng et al., Transplantation, (May 2009), Vol. 87, No. 9, pp. (1283-1289); Q. Zhang et al., PloS ONE, (Jul 2010), Vol. 5, No. 7, e11709, pp. (1-13); Kushibikia et al., J Controlled Release, (Jul 2005), Vol. 105, No. 3, pp. (318-331); Wang et al., Gene Therapy, (Jul 2006), Vol. 13, No. 14, pp. (1097-1103); Kobayashi et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, (Feb 2004), Vol. 308, No. 2, pp. (688-693); Wolfrum et al., Nature Biotechnology, (Sep 2007), Vol. 25, No. 10, pp. (1149-1157); Molitoris et al., J Am Soc Nephrol, (Aug 2009), Vol. 20, No. 8 pp. (1754-1764); Mikhaylova et al., Cancer Gene Therapy, (Mar 2011), Vol. 16, No. 3, pp. (217-226); Y. Zhang et al., J Am Soc Nephrol, (Apr 2006), Vol. 17, No. 4, pp. (1090-1101); Singhal et al., Cancer Res, (May 2009), Vol. 69, No. 10, pp. (4244-4251); Malek et al., Toxicology and Applied Pharmacology, (Apr 2009), Vol. 236, No. 1, pp. (97-108); Shimizu et al., J Am Soc Nephrology, (Apr 2010), Vol. 21, No. 4, pp. (622-633); Jiang et al., Molecular Pharmaceutics, (May-Jun 2009), Vol. 6, No. 3, pp. (727-737); Cao et al, J Controlled Release, (Jun 2010), Vol. 144, No. 2, pp. (203-212); Ninichuk et al., Am J Pathol, (Mar 2008), Vol. 172, No. 3, pp. (628-637); Purschke et al., Proc Natl Acad Sci, (Mar 2006), Vol. 103, No. 13, pp. (5173-5178).
일 구현예에서, 전달은 간 세포에 대한 것이다. 일 구현예에서, 간 세포는 간의 세포이다. 본 명세서의 조성물 및 시스템의 전달은 바이러스 벡터, 특히 AAV (특히 AAV2/6) 벡터를 통할 수 있다. 이들은 정맥내 주사를 통해 투여될 수 있다. 시험관 또는 생체내 무관하게, 간에 대해 바람직한 표적은 알부민 유전자이다. 이것은 알부민이 매우 높은 수준으로 발현되므로 소위 "세이프 하버 (safe harbor)"라고 하며 그래서 성공적인 유전자 편집 후 알부민 생산의 감소는 견딜만 하다. 또한, 알부민 프로모터/인핸서로부터 보여지는 높은 수준의 발현은 간세포의 작은 부분만이 편집되는 경우에도 유용한 수준의 올바르거나 또는 이식유전자 생산 (삽입된 재조합 주형으로부터)이 달성될 수 있도록 하기 때문에 바람직하다. 본 명세서의 조성물, 시스템과 사용을 위해 적합화될 수 있는 하기 문헌에 의해 확인되는 사이트를 참조한다: Wechsler et al. (reported at the 57th Annual Meeting and Exposition of the American Society of Hematology - ash.confex.com/ash/2015/webprogram/Paper86495.html에서 요약문 입수가능 및 2015년 12월 6일 공개).
치료 및/또는 예방될 수 있는 예시적인 간 및 신장 질환은 본 명세서의 다른 곳에 기술된다.
상피 및 폐 질환의 치료
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물 및 시스템으로 치료 또는 예방하려는 질환은 폐 또는 상피 질환일 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물 및 시스템은 상피 및/또는 폐 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 한쪽 또는 양쪽 폐로, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템의 전달을 고려할 수 있다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터로서 조성물, 시스템, 또는 이의 성분을 폐에 전달하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, AAV는 폐에 전달을 위해 AAV-1, AAV-2, AAV-5, AAV-6, 및/또는 AAV-9이다 (참조: 예를 들어, Li et al., Molecular Therapy, vol. 17 no. 12, 2067-2077 Dec 2009). 일 구현예에서, MOI는 1 X 103 내지 4 X 105 벡터 게놈/세포로 다양할 수 있다. 일 구현예에서, 전달 벡터는 Zamora 등 (Am J Respir Crit Care Med Vol 183. pp 531-538, 2011)의 RSV 벡터일 수 있다. Zamora 등의 방법은 본 발명의 TnpB 시스템에 적합화될 수 있고, 예를 들어, 0.6 mg/kg 용량의 에어로졸화된 조성물이 본 발명에서 고려될 수 있다.
폐 질환에 대해 치료된 대상체는, 예를 들어 자발적으로 호흡하면서 폐에 대해 기관지내 삽관으로 전달되는 약학적 유효량의 에어로졸화된 AAV 벡터 시스템을 받을 수 있다. 이와 같이, 일반적으로 AAV 전달에 에어로졸화된 전달이 바람직하다. 전달을 위해 아데노바이러스 또는 AAV 입자가 사용될 수 있다. 각각 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된 적합한 유전자 구성체가 전달 벡터에 클로닝될 수 있다. 이러한 예에서, 하기 구성체가 예로서 제공된다: TnpB 경우 Cbh 또는 EF1a 프로모터, 핵산 성분 분자 경우 U6 또는 H1 프로모터): 바람직한 배열은 핵산 성분 분자를 표적화하는 CFTR델타508, 델타F508 돌연변이용 복구 주형 및 코돈 최적화된 조성물과, 임의로 하나 이상의 핵 국재화 신호 또는 서열(들) (NLS(들)), 예를 들어, 2개 (2) NLS를 사용하는 것이다.
피부 질환의 치료
본 발명에 기술된 조성물 및 시스템은 피부 질환의 치료에서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한, 본 명세서에 기술된 조성물 및 시스템을 피부에 전달하는 것을 고려한다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템 또는 그의 성분의 피부로의 전달 (피내 전달)은 하나 이상의 미세바늘 또는 미세바늘 함유 장치를 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서 Hickerson 등 (Molecular Therapy-Nucleic Acids (2013) 2, e129)의 방법 및 장치가 본 명세서에 기술된, 조성물, 시스템을 예를 들어, 300 ㎕의 0.1 mg/ml 조성물의 용량으로 피부에 전달하기 위해 사용 및/또는 적합화될 수 있다.
일 구현예에서, Leachman 등 (Molecular Therapy, vol. 18 no. 2, 442-446 Feb. 2010)의 방법 및 기술이 본 명세서에 기술된 조성물을 피부에 전달하기 위해 사용 및/또는 적합화될 수 있다.
일 구현예에서, Zheng 등 (PNAS, July 24, 2012, vol. 109, no. 30, 11975-11980)의 기술 및 방법이 피부로 본 명세서에 기술된 조성물의 나노입자 전달을 위해 사용 및/또는 적합화될 수 있다. 일 구현예에서, 단일 적용으로 적용되는 약 25 nM의 용량이 피부에서 유전자 녹다운을 달성할 수 있다.
암의 치료
본 명세서에 기술되는 조성물, 시스템은 암의 치료에서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 암 세포에 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템의 전달을 고려한다. 또한 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 조성물, 시스템을 사용하여 면역 세포, 예컨대 CAR 또는 CAR T 세포를 변형시켜서, 암을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 이것은 또한 그 개시가 참조로 본 명세서에 편입되고, 이하 본 명세서에 기술되는, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/161276에 기술된다.
암의 치료 또는 예방에 적합한 표적 유전자는 표 2 및 3에 기재된 것들을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 암의 치료 및 예방을 위한 표적 유전자는 또한 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/048577에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시는 참조로 본 명세서에 편입되고, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템에 적합화 및/또는 적용될 수 있다.
양자 세포 요법
본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 및 이의 성분은 양자 세포 요법을 위해 세포를 변형시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 암 면역요법과 관련하여 표적 핵산 서열을 편집하거나, 표적 핵산 서열의 발현을 조절하는 방법 및 조성물 및 이의 적용은 본 발명의 조성물, 시스템을 적합화시켜서 이해된다. 일부 예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 양자 세포 요법에 사용될 수 있는 변형된 자연 살해 세포, 감마 델타 T 세포, 및 알파 베타 T 세포를 유래시키기 위한 줄기 세포 (예를 들어, 유도 만능 세포)를 변형시키는데 사용될 수 있다. 일정 예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 자연 살해 세포, 감마 델타 T 세포, 및 알파 베타 T 세포를 변형시키는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "ACT", "양자 세포 요법" 및 "양자 세포 전달"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 양자 세포 요법 (ACT)은 세포의 생착에 의해 새로운 숙주에게 기능성 및 특징을 전달하려는 목적으로 환자에게 세포의 전달을 의미한다 (참조: 예를 들어, Mettananda et al., Editing an α-globin enhancer in primary human hematopoietic stem cells as a treatment for β-thalassemia, Nat Commun. 2017 Sep 4;8(1):424). 본 명세서에서 사용되는, 용어 "생착 (engraft, 또는 engraftment)"은 조직의 존재하는 세포와 접촉을 통해 생체내에서 관심 조직으로 세포 도입의 과정을 의미한다. 양자 세포 요법 (ACT) 은 면역학적 기능 및 특징을 새로운 숙주로 전달하는 것을 목표로, 세포, 가장 일반적으로 면역-유래된 세포를 동일한 환자 또는 새로운 수용자 숙주에 다시 전달하는 것을 지칭할 수 있다. 가능한 경우, 자기유래 세포의 사용은 GVHD 문제를 최소화함으로써 수용자에게 도움을 준다. 자기유래 종양 침윤성 림프구 (TIL)의 양자 전달 (Zacharakis et al., (2018) Nat Med. 2018 Jun;24(6):724-730; Besser et al., (2010) Clin. Cancer Res 16 (9) 2646-55; Dudley et al., (2002) Science 298 (5594): 850-4; and Dudley et al., (2005) JouRNAl of Clinical Oncology 23 (10): 2346-57) 또는 유전자 재-지정 말초 혈액 단핵 세포 (Johnson et al., (2009) Blood 114 (3): 535-46; and Morgan et al., (2006) Science 314(5796) 126-9)가 흑색종, 전이성 유방암 및 직결장 암종을 포함한, 진행성 고형 종양을 갖는 환자를 비롯하여, CD19-발현 혈액학적 악성종을 갖는 환자를 성공적으로 치료하는데 사용되었다 (Kalos et al., (2011) Science Translationa Medicine 3 (95): 95ra73). 일 구현예에서, 동종이계 면역 세포가 전달된다 (참조: 예를 들어, Ren et al., (2017) Clin Cancer Res 23 (9) 2255-2266). 본 명세서에서 더욱 기술된 바와 같이, 동종이계 세포는 동종이식편 반응을 감소시키고 이식편 대 숙주 질환을 예방하기 위해 편집될 수 있다. 따라서, 동종이계 세포의 사용은 건강한 도너로부터 세포를 수득할 수 있게 하고 진단 후 환자로부터 자기유래 세포를 제조하는 것이 아니라 환자에서 사용을 위해 준비하게 한다.
본 발명의 양태는 선택된 항원, 예컨대 종양 연관 항원 또는 종양 특이적 신생항원에 특이적인, 면역계 세포, 예컨대 T 세포의 양자 전달을 포함한다 (참조: 예를 들어, Maus et al., 2014, Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses, Annual Review of Immunology, Vol. 32: 189-225; Rosenberg and Restifo, 2015, Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer, Science Vol. 348 no. 6230 pp. 62-68; Restifo et al., 2015, Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12(4): 269-281; and Jenson and Riddell, 2014, Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells. Immunol Rev. 257(1): 127-144; and Rajasagi et al., 2014, Systematic identification of personal tumor-specific neoantigens in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2014 Jul 17;124(3):453-62).
일 구현예에서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 특히 CAR 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원 (예컨대, 종양 항원)은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: MR1 (참조: 예를 들어, Crowther, et al., 2020, Genome-wide CRISPR-Cas9 screening reveals ubiquitous T cell cancer targeting via the monomorphic MHC class I-related protein MR1, Nature Immunology volume. 21, pages178-185), B 세포 성숙화 항원 (BCMA) (참조: 예를 들어, Friedman et al., Effective Targeting of Multiple BCMA-Expressing Hematological Malignancies by Anti-BCMA CAR T Cells, Hum Gene Ther. 2018 Mar 8; Berdeja JG, et al. Durable clinical responses in heavily pretreated patients with relapsed/refractory multiple myeloma: updated results from a multicenter study of bb2121 anti-Bcma CAR T cell therapy. Blood. 2017;130:740; 및 Mouhieddine and Ghobrial, Immunotherapy in multiple Myeloma: The Era of CAR T Cell Therapy, Hematologist, May-June 2018, Volume 15, issue 3); PSA (전립선-특이적 항원); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); PSCA (전립선 줄기 세포 항원); 티로신-단백질 키나제 경막 수용체 ROR1; 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP); 종양-연관된 당단백질 72 (TAG72); 암배 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); 메소텔린; 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (ERBB2 (Her2/neu)); 프로스타제; 프로스타트산 포스파타제 (PAP); 연장 인자 2 돌연변이체 (ELF2M); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-1R); gplOO; BCR-ABL (브레이크포인트 클러스터 영역-아벨손); 티로시나제; 뉴욕 식도 편평 세포 암종 1 (NY-ESO-1); κ-경쇄, LAGE (L 항원); MAGE (흑색종 항원); 흑색종-연관된 항원 1 (MAGE-A1); MAGE A3; MAGE A6; 레구마인; 인간 파필로마바이러스 (HPV) E6; HPV E7; 프로스테인; 서비빈; PCTA1 (갈렉틴 8); 멜란-A/MART-1; Ras 돌연변이체; TRP-1 (티로시나제 관련 단백질 1, or gp75); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP2); TRP-2/INT2 (TRP-2/인트론 2); RAGE (신장 항원); RAGE1 (receptor for advanced glycation end products 1); 신장 편재성 1, 2 (RU1, RU2); 장 카르복실 에스터라제 (iCE); 열충격 단백질 70-2 (HSP70-2) 돌연변이체; 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); CD123; CD171; CD19; CD20; CD22; CD26; CD30; CD33; CD44v7/8 (분화 클러스터 44, 엑손 7/8); CD53; CD92; CD100; CD148; CD150; CD200; CD261; CD262; CD362; CS-1 (CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24); C-형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1); 강글리오시드GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); Tn 항원 (Tn Ag); Fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3); CD38; CD138; CD44v6; B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (IL-13Ra2); 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-11Ra); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); 뮤신 1, 세포 표면 연관 (MUC1); 뮤신 16 (MUC16); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 카본산 언히드라제 IX (CAIX); 프로테아솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 9형 (LMP2); 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 에프린 B2; 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오시드GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); TGS5; 고분자량-흑색종-연관된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2); 폴레이트 수용체 알파; 폴레이트 수용체 베타; 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); G 단백질-커플링된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라미드의 육탄당 부분 (GloboH); 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 우로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질-커플링된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (WT1); ETS 전위-변이체 유전자 6, 염색체 12p에 위치 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A (XAGE1); 안지오포이어틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); CT (암/고환 (항원)); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; p53; p53 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 브레이크포인트s; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (경막 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍형성 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; 사이클린 D1; v-myc 조류 골수세포종증 바이러스 종양유전자 신경아세포종 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS); T 세포-1 또는 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART1, SART3); 쌍형성 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 브레이크포인트-1, -2, -3 또는 -4 (SSX1, SSX2, SSX3, SSX4); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연관된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C-형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 마우스 더블 미니트 2 상동체 (MDM2); 리빈; 알파페토단백질 (AFP); 경막 활성인자 및 CAML 인터액터 (TACI); B-세포 활성화 인자 수용체 (BAFF-R); V-Ki-ras2 커스텐 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체 (KRAS); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLL1); 707-AP (707 알라닌 프롤린); ART-4 (T4 세포가 인식하는 선암종 항원); BAGE (B 항원; b-카테닌/m, b-카테닌/돌연변이형); CAMEL (흑색종의 CTL-인식 항원); CAP1 (암배 항원 펩티드 1); CASP-8 (캐스파제-8); CDC27m (세포-분열 주기 27 돌연변이형); CDK4/m (사이클린-의존적 키나제 4 돌연변이형); Cyp-B (사이클로필린 B); DAM (분화 항원 흑색종); EGP-2 (상피 당단백질 2); EGP-40 (상피 당단백질 40); Erbb2, 3, 4 (적혈아세포 백혈구 바이러스 종양유전자 상동체-2, -3, 4); FBP (폴레이트 결합 단백질); fAchR (태아 아세틸콜린 수용체); G250 (당단백질 250); GAGE (G 항원); GnT-V (N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 V); HAGE (헬리코스 항원); ULA-A (인간 백혈구 항원-A); HST2 (human signet ring tumor 2); KIAA0205; KDR (키나제 삽입 도메인 수용체); LDLR/FUT (저밀도 지질 수용체/GDP L-푸코스: b-D-갈락토시다제2-a-L 푸코실트랜스퍼라제); L1CAM (L1 세포 부착 분자); MC1R (멜라노코르틴 1 수용체); 미오신/m (미오신 돌연변이형); MUM-1, -2, -3 (흑색종 편재성 돌연변이형 1, 2, 3); NA88-A (환자 M88의 NA cDNA 클론); KG2D (자연 살해 그룹 2, 구성원 D) 리간드; 종양태아 항원 (h5T4); p190 마이너 bcr-abl (190KD bcr-abl의 단백질); Pml/RARa (promyelocytic leukemia/retinoic acid receptor a); PRAME (preferentially expressed antigen of melanoma); SAGE (육종 항원); TEL/AML1 (translocation Ets-family leukemia/acute myeloid leukemia 1); TPI/m (트리오스포스페이트 이소머라제 돌연변이형); CD70; 및 이의 임의 조합.
일 구현예에서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 특히 CAR 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원은 종양-특이적 항원 (TSA)이다.
일 구현예에서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 특히 CAR 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원은 신생항원이다.
일 구현예에서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 특히 CAR 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원은 종양-연관 항원 (TAA)이다.
일 구현예에서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 특히 CAR 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원은 유니버설 종양 항원이다. 일정 바람직한 구현예에서, 유니버설 종양 항원은 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서비빈, 마우스 더블 미니트 2 상동체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B 1 (CYP1B), HER2/neu, 빌름스 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, 알파페토단백질 (AFP), 암배 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), p53, 사이클린 (Dl), 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 특히 CAR 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원 (예컨대, 종양 항원)은 CD19, BCMA, CD70, CLL-1, MAGE A3, MAGE A6, HPV E6, HPV E7, WT1, CD22, CD171, ROR1, MUC16, 및 SSX2로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일정 바람직한 구현예에서, 항원은 CD19일 수 있다. 예를 들어, CD19는 혈액학적 악성종, 예컨대 림프종, 보다 특히 B-세포 림프종, 예컨대 제한 없이 미만성 거대 B-세포 림프종, 원발성 종격동 b-세포 림프종, 형질전환 여포성 림프종, 변연부 림프종, 맨틀 세포 림프종, 성인 및 소아 ALL을 포함한 급성 림프아구성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 나태 비-호지킨 림프종, 또는 만성 림프구성 백혈병에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, BCMA는 다수의 골수종 또는 형질 세포 백혈병에서 표적화될 수 있다 (참조: 예를 들어, 2018 American Association for Cancer Research (AACR) Annual meeting Poster: Allogeneic Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting B Cell Maturation Antigen). 예를 들어, CLL1은 급성 골수성 백혈병에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, MAGE A3, MAGE A6, SSX2, 및/또는 KRAS는 고형 종양에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, HPV E6 및/또는 HPV E7은 자궁경부암 또는 두경부암에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, WT1은 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수이형성 증후군 (MDS), 만성 골수성 백혈병 (CML), 비-소세포 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암 또는 직결장암, 또는 중피종에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, CD22는 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 또는 급성 림프아구성 백혈병을 포함한, B 세포 악성종에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, CD171은 신경아세포종, 교아세포종, 폐암, 췌장암, 또는 난소암에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, ROR1은 비-소세포 폐암, 삼중 음성 유방암, 췌장암, 전립선암, ALL, 만성 림프구성 백혈병, 또는 맨틀 세포 림프종을 포함하는, ROP1+ 악성종에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, MUC16은 MUC16ecto+ 상피 난소암, 난관암, 또는 원발성 복막암에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, CD70은 혈액학적 악성종을 비롯하여 고형암, 예컨대 신장 세포 암종 (RCC), 신경아교종 (예를 들어, GBM), 및 두경부암 (HNSCC)에서 표적화될 수 있다. CD70은 혈액학적 악성종을 비롯하여 고형암에서 발현되는 한편, 정상 조직에서 발현은 림프계 세포 유형의 서브세트에 제한된다 (참조: 예를 들어, 2018 American Association for Cancer Research (AACR) Annual meeting Poster: Allogeneic CRISPR Engineered Anti-CD70 CAR-T Cells Demonstrate Potent Preclinical Activity Against Both Solid and Hematological Cancer Cells).
예를 들어, 다양한 전략이 예를 들어, 선택된 펩티드 특이성을 갖는 새로운 TCR α 및 β 사슬을 도입시켜서 T 세포 수용체 (TCR)의 특이성을 변경시킴으로써 T 세포를 유전자 변형시키는데 적용될 수 있다 (참조: 미국 특허 제8,697,854호; PCT 특허 공개 번호: WO2003020763, WO2004033685, WO2004044004, WO2005114215, WO2006000830, WO2008038002, WO2008039818, WO2004074322, WO2005113595, WO2006125962, WO2013166321, WO2013039889, WO2014018863, WO2014083173; 미국 특허 제8,088,379호).
TCR 변형에 대한 대안으로서 또는 추가로, 기술되었던 매우 다양한 수용체 키메라 구성체를 사용하여, 악성 세포와 같은, 선택 표적에 특이적인 면역반응성 세포, 예컨대, T 세포를 생성하기 위해 키메라 항원 수용체 (CAR)가 사용될 수 있다 (참조: 미국 특허 제5,843,728호; 제5,851,828호; 제5,912,170호; 제6,004,811호; 제6,284,240호; 제6,392,013호; 제6,410,014호; 제6,753,162호; 제8,211,422호; 및 PCT 공개 번호 WO 9215322).
일반적으로, CAR는 세포외 도메인, 경막 도메인, 및 세포내 도메인으로 구성되고, 세포외 도메인은 사전결정된 표적에 특이적인 항원-결합 도메인을 포함한다. CAR의 항원-결합 도메인이 종종 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 단일 사슬 가변 단편, scFv)이지만, 결합 도메인은 표적의 특이적 인식을 야기시키는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 일 구현예에서, 항원-결합 도메인은 수용체를 포함할 수 있어서, CAR은 수용체의 리간드에 결합할 수 있다. 대안적으로, 항원-결합 도메인은 리간드를 포함할 수 있어서, CAR은 그 리간드의 내생성 수용체에 결합할 수 있다.
CAR의 항원-결합 도메인은 일반적으로 힌지 또는 스페이서에 의해 경막 도메인으로부터 이격된다. 스페이서는 또한 특별히 제한되지 않으며, CAR에 가요성을 부여하도록 설계된다. 예를 들어, 스페이서 도메인은 CH3 도메인의 일부분을 포함하여, 인간 Fc 도메인의 일부, 또는 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM, 또는 이의 변이체의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 더 나아가서, 힌지 영역은 FcR 또는 다른 잠재적 간섭 객체에 의한 오프-표적 결합을 방지하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 힌지는 FcR에 결합을 감소시키기 위해서 S228P, L235E, 및/또는 N297Q 돌연변이 (카밧 번호매김에 따름)가 존재하거나 또는 없는 IgG4 Fc를 포함할 수 있다. 추가 스페이서/힌지는 제한없이 CD4, CD8 및 CD28 힌지 영역을 포함한다.
CAR의 경막 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래할 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질에서 유래할 수 있다. 본 개시의 특정 용도의 경막 영역은 CD8, CD28, CD3, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154, TCR로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 경막 도메인은 합성일 수 있고, 이러한 경우에 류신 및 발린 같은 소수성 잔기를 주로 포함하게 될 것이다. 바람직하게, 페닐알라닌, 트립토판, 및 발린의 삼중항이 합성 경막 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 임의로, 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게 2 내지 10개 아미노산 길이인 것이 CAR의 세포질 신호전달 도메인 및 경막 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중항은 특히 적합한 링커를 제공한다.
대안적 CAR 구성체는 연속 세대에 속하는 것으로 특징규명될 수 있다. 1세대 CAR은 전형적으로 예를 들어, CD3ξ 또는 FcRγ의 경막 및 세포내 신호전달 도메인에, 가요성 링커, 예를 들어, CD8α 힌지 도메인 및 CD8α경막 도메인을 통해서 연결된, 특이적 항체의 VH에 연결된 VL를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 단일-사슬 가변 단편으로 이루어진다 (scFv-CD3ξ 또는 scFv-FcRγ, 참조: 미국 특허 제7,741,465호; 미국 특허 제5,912,172호; 미국 특허 제5,906,936호). 2세대 CAR은 하나 이상의 공자극 분자의 세포내 도메인, 예컨대 엔도도메인 내 CD28, OX40 (CD134), 또는 4-1BB (CD137)를 도입한다 (예를 들어, scFv-CD28/OX40/4-1BB-CD3ξ, 참조: 미국 특허 제8,911,993호; 제8,916,381호; 제8,975,071호; 제9,101,584호; 제9,102,760호; 제9,102,761호). 3세대 CAR은 공자극 엔도도메인, 예컨대 CD3ξ 사슬, CD97, GDI la-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CDS, OX40, 4-1BB, CD2, CD7, LIGHT, LFA-1, NKG2C, B7-H3, CD30, CD40, PD-1, 또는 CD28 신호전달 도메인의 조합을 포함한다 (예를 들어, scFv-CD28-4-1BB-CD3ξ 또는 scFv-CD28-OX40-CD3ξ, 참조: 미국 특허 제8,906,682호; 미국 특허 제8,399,645호; 미국 특허 제5,686,281호; PCT 공개 번호 WO 2014/134165; PCT 공개 번호 WO 2012/079000). 일 구현예에서, 1차 신호전달 도메인은 CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, 일반 FcR 감마 (FCERIG), FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc 감마 RIIa, DAP10, 및 DAP12로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일정 바람직한 구현예에서, 1차 신호전달 도메인은 CD3ξ 또는 FcRγ의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다: CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, 및 NKG2D와 특이적으로 결합하는 리간드. 일 구현예에서, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 4-1BB, CD27, 및 CD28로 이루어진 군으로부터, 각각 독립적으로 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 CD3ξ 사슬의 세포내 도메인 (예컨대, US 제7,446,190호의 SEQ ID NO: 14로 표시된 바와 같은, 인간 CD3 제타 사슬의 아미노산 잔기 52-163), CD28 유래 신호전달 영역 및 항원-결합 구성요소 (또는 부분 또는 도메인; 예컨대 scFv)를 포함하는, 미국 특허 제7,446,190호에 기술된 바와 같이 디자인될 수 있다. CD28 부분은 제타 사슬 부분 및 항원-결합 구성요소 사이에 있을 때, CD28의 경막 및 신호전달 도메인 (예컨대 SEQ ID NO: 10의 아미노산 잔기 114-220, US 제7,446,190호의 SEQ ID NO: 6에 표시된 전체 서열;이들은 Genbank 식별자 NM_006139로 기재되는 CD28의 이하 부분을 포함할 수 있음)을 적합하게 포함할 수 있다. 대안적으로, 제타 서열이 CD28 서열 및 항원-결합 구성요소 사이에 놓일 때, CD28의 세포내 도메인이 단독으로 사용될 수 있다 (예컨대, US 제7,446,190호의 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열). 그리하여, 일정 구현예는 (a) 인간 CD3ζ 사슬의 세포내 도메인을 포함하는 제타 사슬 부분, (b) 공자극 신호전달 영역, 및 (c) 항원-결합 구성요소 (또는 부분 또는 도메인)을 포함하는 CAR을 적용하고, 공자극 신호전달 영역은 US 제7,446,190호의 SEQ ID NO: 6에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
대안적으로, 공자극은 그들의 천연 αβTCR의 맞물림 후, 예를 들어 전문적 항원-제시 세포 상에서 항원에 의해, 수반하는 공자극으로 활성화되고 확장될 수 있도록 선택되는 항원-특이적 T 세포에서 CAR을 발현시킴으로써 조직될 수 있다. 또한, 추가의 조작된 수용체가 예를 들어, T-세포 공격의 표적화를 개선시키고/시키거나 부작용을 최소화하기 위해서 면역반응성 세포에 제공될 수 있다.
예로서, 제한없이, [Kochenderfer et al., (2009) J Immunother. 32 (7): 689-702]는 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)를 기술한다. FMC63-28Z CAR은 FMC63 마우스 하이브리도마 유래 CD19를 인식하는 단일 사슬 가변 영역 모이어티 (scFV) (Nicholson et al., (1997) Molecular Immunology 34: 1157-1165), 인간 CD28 분자의 일부분, 및 인간 TCR-ζ 분자의 세포내 성분을 함유하였다. FMC63-CD828BBZ CAR은 FMC63 scFv, CD8 분자의 힌지 및 경막 영역, CD28 및 4-1Bb의 세포질 도메인, 및 TCR-ζ 분자의 세포질 성분을 함유하였다. FMC63-28Z CAR에 포함되는 CD28 분자의 정확한 서열은 Genbank 식별자 NM_006139에 상응하고, 서열은 아미노산 서열 IEVMYPPPY (SEQ ID NO: 64,306)로 출발하는 모든 아미노산을 포함하고, 단백질의 카르복시-말단까지 모든 방식으로 계속된다. 벡터의 항-CD19 scFv 성분을 코딩하기 위해서, 저자는 이전에 공개된 CAR의 일부분을 기반으로 하는 DNA 서열을 디자인하였다 (Cooper et al., (2003) Blood 101: 1637-1644). 이 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 인프레임으로 하기 성분들을 코딩하였다: XhoI 부위, 인간 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 수용체 α-사슬 신호 서열, FMC63 경쇄 가변 영역 (Nicholson et al., supra), 링커 펩티드 (Cooper et al., supra), FMC63 중쇄 가변 영역 (Nicholson et al., supra), 및 NotI 부위. 이러한 서열을 코딩하는 플라스미드는 XhoI 및 NotI로 분해되었다. MSGV-FMC63-28Z 레트로바이러스 벡터를 형성하기 위해서, FMC63 scFv를 코딩하는 XhoI 및 NotI-분해 단편을 MSGV 레트로바이러스 골격 (Hughes et al., (2005) Human Gene Therapy 16: 457-472)을 비롯하여, 인간 CD28의 세포외 부분의 일부, 인간 CD28의 전체 경막 및 세포질 부분, 및 인간 TCR-ζ 분자의 세포질 부분 (as in Maher et al., 2002) Nature Biotechnology 20: 70-75)을 코딩하는 제2 XhoI 및 NotI-분해 단편과 결찰시켰다. FMC63-28Z CAR은 재발성/난치성 공격적 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL)을 갖는 환자를 특히 치료하기 위해서, Kite Pharma, Inc.가 개발하는 KTE-C19 (axicabtagene ciloleucel) 항-CD19 CAR-T 요법에 포함되었다. 따라서, 일 구현예에서, 양자 세포 요법이 의도되는 세포, 보다 특히 면역반응성 세포 예컨대 T 세포는 Kochenderfer 등 (supra)이 기술한 대로 FMC63-28Z CAR을 발현할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 양자 세포 요법이 의도되는 세포, 보다 특히 면역반응성 세포 예컨대 T 세포는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-결합 구성요소 (또는 부분 또는 도메인; 예컨대 scFv), CD3ζ 사슬의 세포내 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하는 공자극 신호전달 영역을 포함하는 CAR을 포함할 수 있다. 바람직하게, CD28 아미노산 서열 Genbank 식별자 NM_006139 (서열 형식 1, 2 또는 3)로 기재되어 있는데, 아미노산 서열 IEVMYPPPY (SEQ ID NO: 64,306)로 출발하여 단백질의 카르복시-말단까지 모든 방식으로 계속된다. 바람직하게, 항원은 CD19이고, 보다 바람직하게 항원-결합 구성요소는 항-CD19 scFv이고, 보다 더 바람직하게 Kochenderfer 등 (supra)이 기술된 항-CD19 scFv이다.
추가 항-CD19 CAR은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/187528에 더 기술된다. 보다 특히 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2015187528의 실시예 1 및 표 1은 전체 인간 항-CD19 단일클론 항체 (47G4, 참조: US20100104509) 및 마우스 항-CD19 단일클론 항체 (Nicholson et al. 이 기술하고 상기 설명된 바와 같음)를 기반으로 하는 항-CD19 CAR의 생성을 입증하였다. 신호 서열 (인간 CD8-알파 또는 GM-CSF 수용체), 세포외 및 경막 영역 (인간 CD8-알파) 및 세포내 T-세포 신호전달 도메인 (CD28-CD3ξ; 4-1BB-CD3ξ; CD27-CD3ξ; CD28-CD27-CD3ξ; 4-1BB-CD27-CD3ξ; CD27-4-1BB-CD3ξ; CD28-CD27-FcεRI 감마 사슬; 또는 CD28-FcεRI 감마 사슬)의 다양한 조합이 개시되었다. 그리하여, 일 구현예에서, 양자 세포 요법이 의도되는 세포, 보다 특히 면역반응성 세포 예컨대 T 세포는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-결합 구성요소, WO2015187528의 표 1에 기재된 세포외 및 경막 영역, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/187528의 표 1에 기재된 세포내 T-세포 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 포함할 수 있다. 바람직하게, 항원은 CD19이고, 보다 바람직하게 항원-결합 구성요소는 항-CD19 scFv이고, 보다 더 바람직하게 WO 2015/187528의 실시예 1에 기술된 마우스 또는 인간 항-CD19 scFv이다. 일 구현예에서, CAR은 WO2015187528의 표 1에 기재된 바와 같이 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다.
예로서 제한없이, CD70 항원을 인식하는 키메라 항원 수용체는 WO2012058460A2에 기술된다 (참조: 또한, Park et al., CD70 as a target for chimeric antigen receptor T cells in head and neck squamous cell carcinoma, Oral Oncol. 2018 Mar;78:145-150; and Jin et al., CD70, a novel target of CAR T-cell therapy for gliomas, Neuro Oncol. 2018 Jan 10;20(1):55-65). CD70은 미만성 거대 B-세포 및 여포성 림프종에 의해서, 또한 호지킨 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 및 다수 골수종의 악성 세포에 의해서, HTLV-1- 및 EBV-연관된 악성종에 의해서 발현된다 (Agathanggelou et al. Am.J.Pathol. 1995;147: 1152-1160; Hunter et al., Blood 2004; 104:4881. 26; Lens et al., J Immunol. 2005;174:6212-6219; Baba et al., J Virol. 2008;82:3843-3852). 또한, CD70은 비-혈액학적 악성종 예컨대 신장 세포 암종 및 교모세포종에 의해 발현된다. (Junker et al., J Urol. 2005;173:2150-2153; Chahlavi et al., Cancer Res 2005;65:5428-5438). 생리적으로, CD70 발현은 일시적이고, 고도로 활성화된 T, B 및 수지상 세포의 서브세트에 제한된다.
예로서 제한없이, BCMA를 인식하는 키메라 항원 수용체가 기술되었다 (참조: 예를 들어, US20160046724A1; WO2016014789A2; WO2017211900A1; WO2015158671A1; US20180085444A1; WO2018028647A1; US20170283504A1; 및 WO2013154760A1).
일 구현예에서, 면역 세포는 CAR 또는 외생성 TCR 이외에도, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하고 제2 표적 항원의 인식 시 억제성 또는 면역억제성 또는 저해성 신호를 유도할 수 있는 키메라 억제성 수용체 (억제성 CAR) 를 더 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키메라 억제성 수용체는 표적 항원에 특이적으로 결합하도록 구성된 세포외 항원-결합 구성요소 (또는 부분 또는 도메인), 경막 도메인, 및 세포내 면역억제성 또는 저해성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 제2 표적 항원은 암 세포 또는 감염된 세포의 표면 상에서 발현되지 않는 항원이거나 또는 이의 발현이 암 세포 또는 감염된 세포에서 하향조절된 것이다. 일 구현예에서, 제2 표적 항원은 MHC-클래스 I 분자이다. 일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 체크포인트 분자, 예컨대 예를 들어, PD-1 또는 CTLA4의 기능성 신호전달 부분을 포함한다. 유리하게, 이러한 억제성 CAR의 포함은 비-표적 (예를 들어, 비-암) 조직을 공격하는 조작된 면역 세포의 기회를 감소시킨다.
대안적으로, CAR을 발현하는 T-세포는 오프-표적 효과를 감소시키기 위해서 내생성 TCR의 발현을 감소시키거나 또는 제거하도록 더 변형될 수 있다. 내생성 TCR의 감소 또는 제거는 오프-표적 효과를 감소시키고 T 세포의 유효성을 증가시킨다 (U.S. 9,181,527). 기능성 TCR의 발현이 안정하게 결여된 T 세포는 다양한 접근법을 사용해 생산될 수 있다. T 세포는 복합체로서 전체 T 세포 수용체를 내재화하고, 분류하고, 분해하며, 휴지기 T 세포에서 반감기가 약 10시간이고 자극된 T 세포에서는 3시간이다 (von Essen, M. et al. 2004. J. Immunol. 173:384-393). TCR 복합체의 적절한 기능성은 TCR 복합체를 구성하는 단백질의 적절한 화학양론적 비율을 요구한다. TCR 기능은 또한 ITAM 모티프를 갖는 2개 기능성 TCR 제타 단백질을 요구한다. 이의 MHC-펩티드 리간드의 관여 시 TCR의 활성화는 동일한 T 세포 상에서 몇몇 TCR의 관여를 요구하고, 모두 적절하게 신호전달해야만 한다. 따라서, TCR 복합체가 적절하게 회합되지 않거나 또는 최적으로 신호전달할 수 없는 단백질로 탈안정화되면, T 세포는 세포 반응을 시작하기에 충분하게 활성화되지 않을 것이다.
따라서, 일 구현예에서, TCR 발현은 RNA 간섭 (예를 들어, s핵산 성분, siRNA, miRNA 등), TnpB 폴리펩티드 또는 초대 T 세포에서 특이적 TCR (예를 들어, TCR-α 및 TCR-β) 및/또는 CD3 사슬을 코딩하는 핵산을 표적화하는 다른 방법을 사용해 제거될 수 있다. 이들 단백질 중 하나 이상의 발현을 차단하여서, T 세포는 더 이상 TCR 복합체의 하나 이상의 핵심 성분을 생산하지 않아서, TCR 복합체가 탈안정화되고 기능성 TCR의 세포 표면 발현이 방지된다.
일부 예에서, CAR은 또한 CAR의 발현 및/또는 활성화를 제어하기 위한 스위치 기전을 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR은 세포외, 경막, 및 세포내 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 세포외 도메인은 표적 세포 상에서 또는 그에 의해 발현되는 표적 항원 이외의 분자에 특이적인 표지, 결합 도메인, 또는 태그를 포함하는 표적-특이적 결합 구성요소를 포함한다. 이러한 구현예에서, CAR의 특이성은 표적 항원 결합 도메인 (예를 들어, CAR 상의 표지 또는 태그 및 표적 항원 둘 모두에 특이적인 scFv 또는 이중특이적 항체) 및 CAR 상의 표지, 결합 도메인 또는 태그에 의해 인식되거나 또는 결합하는 도메인을 포함하는 제2 구성체에 의해 제공된다. 참조: 예를 들어, WO 2013/044225, WO 2016/000304, WO 2015/057834, WO 2015/057852, WO 2016/070061, US 9,233,125, US 2016/0129109. 이러한 방식으로, CAR을 발현하는 T-세포를 대상체에게 투여할 수 있지만, CAR은 항원-특이적 결합 도메인을 포함하는 제2 조성물이 투여될 때까지 이의 표적 항원에 결합할 수 없다.
대안적 스위치 기전은 T-세포 반응을 유발하기 위해서, 그들 신호전달 기능을 활성화시키기 위해 다량체화 (참조: 예를 들어, US 특허 출원 공개 번호 US 2015/0368342, US 2016/0175359, US 2015/0368360) 및/또는 외생성 신호, 예컨대 소형 분자 약물 (US 2016/0166613, Yung et al., Science, 2015)을 요구하는 CAR을 포함한다. 일부 CAR은 치료 후 CAR T-세포의 세포 사멸을 유도 (Buddee et al., PLoS One, 2013)하거나 또는 표적 항원에 결합 후 CAR의 발현을 하향조절 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/011210)하기 위해서 "자살 스위치"를 포함할 수도 있다.
표적 면역반응성 세포를 형질전환시키기 위해 대안적 기술, 예컨대 원형질체 융합, 리포펙션, 형질감염 또는 전기천공법이 사용될 수 있다. 매우 다양한 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 트랜스포존, 예컨대, 슬리핑 뷰티 트랜스포존이 사용될 수 있고 (미국 특허 제6,489,458호; 제7,148,203호; 제7,160,682호; 제7,985,739호; 제8,227,432호 참조), 예를 들어 CD3ζ 및 CD28 또는 CD137 중 하나를 통해 2세대 항원-특이적 CAR 신호전달을 이용하여 CAR을 도입시키는데 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는, 예를 들어, HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV에 기반한 벡터를 포함할 수 있다.
형질전환을 위해 표적화된 세포는, 예를 들어 T 세포, 자연살해 (NK) 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 조절성 T 세포, 인간 배아 줄기 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL) 또는 림프구 세포가 그로부터 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포를 포함할 수 있다. 목적하는 CAR을 발현시키는 T 세포는, 예를 들어, 암 항원 및 공자극 분자를 공동발현시키는 γ-조사된 활성화 및 증식 세포 (AaPC)와 함께 공배양을 통해 선택될 수 있다. 조작된 CAR T-세포는 예를 들어 가용성 인자, 예컨대 IL-2 및 IL-21 의 존재 하에 AaPC 에 대한 공동배양에 의해, 확장될 수 있다. 이러한 확장은, 예를 들어 기억 CAR+ T 세포가 제공되도록 실행될 수 있다 (예를 들어, 비효소적 디지털 어레이 및/또는 다중-패널 유세포 분석에 의해 평가될 수 있음). 이러한 방식으로, 항원-보유 종양에 대해 (선택적으로 목적하는 케모카인, 예컨대, 인터페론-γ의 생성과 함께) 특이적 세포독성 활성을 갖는 CAR T 세포가 제공될 수 있다. 이러한 종류의 CAR T 세포는 예를 들어 종양 이종이식을 치료하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, ACT는 상승적 항종양 반응을 유도하기 위해서 CD4+ Th1 세포 및 CD8+ CTL를 공동-전달하는 것을 포함한다 (참조: 예를 들어, Li et al., Adoptive cell therapy with CD4+ T helper 1 cells and CD8+ cytotoxic T cells enhances complete rejection of an established tumor, leading to generation of endogenous memory responses to non-targeted tumor epitopes. Clin Transl Immunology. 2017 Oct; 6(10): e160).
일 구현예에서, Th17 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 전달된다. Th17 세포는 Th1 세포에 비해서 더 큰 정도로 마우스에서 흑색종 종양을 직접적으로 제거하는 것으로 보고되었다 (Muranski P, et al., Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood. 2008 Jul 15; 112(2):362-73; and Martin-Orozco N, et al., T helper 17 cells promote cytotoxic T cell activation in tumor immunity. Immunity. 2009 Nov 20; 31(5):787-98). 이들 연구는 티로시나제 종양 항원을 인식하는 TCR을 발현하는 CD4+　T 세포를 이용하는, 양자 T 세포 전달 (ACT) 요법 접근법을 포함한다. TCR의 이용은 자기유래 종양-보유 숙주에게 재주입을 위해 생체외에서 대량으로 Th17 개체군의 신속한 확장을 이끈다.
일 구현예에서, ACT는 자기유래 iPSC-기반 백신, 예컨대 자기유래 항-종양 백신에서, 조사된 iPSC를 포함할 수 있다 (참조: 예를 들어, Kooreman, Nigel G. et al., Autologous iPSC-Based Vaccines Elicit Anti-tumor Responses In Vivo, Cell Stem Cell 22, 1-13, 2018, doi.org/10.1016/j.stem.2018.01.016).
MHC 제한적인 T-세포 수용체 (TCR)와 달리, CAR은 임의의 세포 표면-발현 항원에 강력하게 결합할 수 있고 따라서 환자를 치료하는데 더 보편적으로 사용될 수 있다 (참조: Irving et al., Engineering Chimeric Antigen Receptor T-Cells for Racing in Solid Tumors: Don't Forget the Fuel, Front. Immunol., 03 April 2017, doi.org/10.3389/fimmu.2017.00267). 일 구현예에서, TIL 요법 및 면역 체크포인트 차단의 사용을 배제하는, 내생성 T-세포 침윤의 부재 하에서 (예를 들어, 비정상적 항원 프로세싱 및 제시로 인함), CAR T-세포의 전달을 사용해 환자를 치료할 수 있다 (참조: 예를 들어, Hinrichs CS, Rosenberg SA. Exploiting the curative potential of adoptive T-cell therapy for cancer. Immunol Rev (2014) 257(1):56-71. doi:10.1111/ imr.12132).
앞서 언급한 것과 같은 접근방식은 예를 들어 선택된 항원에 결합하는 수용체를 인식하는 항원을 포함하는 유효량의 면역반응성 세포를 투여함으로써, 질환, 예컨대 신생물을 갖는 대상체를 치료하고/하거나 생존을 증가시키는 방법이 제공되도록 조정될 수 있으며, 여기서 결합은 면역반응성 세포를 활성화시켜, 그로써 질환 (예컨대 신생물, 병원균 감염, 자가면역 장애 또는 동종이계 이식 반응)을 치료하거나 예방한다.
일 구현예에서, 치료는 화학요법 (전형적으로 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 조합) 또는 방사선요법의 형태로 림프구 고갈 전처치 후 투여될 수 있다. ACT의 초기 연구들은 짧은 수명 반응을 가졌고 전달된 세포는 매우 오랫동안 생체내에서 지속되지 못하였다 (Houot et al., T-cell-based immunotherapy: adoptive cell transfer and checkpoint inhibition. Cancer Immunol Res (2015) 3(10):1115-22; and Kamta et al., Advancing Cancer Therapy with Present and Emerging Immuno-Oncology Approaches. Front. Oncol. (2017) 7:64). 면역 억제 세포 예컨대 Treg 및 MDSC는 필요한 사이토카인과 경쟁하여서 전달된 세포의 활성을 약화시킬 수 있다. 이론에 국한하지 않지만, 림프구 고갈 전처치는 억제자 세포를 제거하여서, TIL이 지속되게 할 수 있다.
일 구현예에서, 치료는 면역억제성 치료 (예를 들어, 글루코코르티코이드 치료)를 겪는 환자에게 투여될 수 있다. 세포 또는 세포의 개체군은 이러한 면역억제제에 대한 수용체를 코딩하는 유전자의 불활성화로 인해 적어도 하나의 면역억제제에 내성이게 만들 수 있다. 일 구현예에서, 면역억제성 치료는 환자 내에서 면역반응성 T 세포의 선택 및 확장을 제공한다.
일 구현예에서, 치료는 1차 치료 전에 종양을 수축시키기 위해 1차 치료 (예를 들어, 수술 또는 방사선 요법) 전에 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 치료는 남아있는 암 세포를 제거하기 위한 1차 치료 후에 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 면역물질대사 장벽은 ACT 또는 CAR T-세포 요법에 대한 반응을 향상시키고 내생성 면역을 지원하기 위해 ACT 이전 및/또는 동안 치료적으로 표적화될 수 있다 (참조: 예를 들어, Irving et al., Engineering Chimeric Antigen Receptor T-Cells for Racing in Solid Tumors: Don't Forget the Fuel, Front. Immunol., 03 April 2017, doi.org/10.3389/fimmu.2017.00267).
본 명세서에 개시된 바와 같은, 세포 또는 세포의 개체군, 예컨대 면역계 세포 또는 세포 개체군, 예컨대 보다 특히 면역반응성 세포 또는 세포 개체군의 투여는 에어로졸, 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 임플란트 또는 이식을 포함하여, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 세포 또는 세포의 개체군은 환자에게, 피하, 피내, 중양내, 낭내, 척수내, 근육내, 척수강내, 정맥내 또는 림프내 주사 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 개시된 CAR은 종양 조직의 절제에 의해 형성된 공동내로 (즉, 공동내 전달) 또는 절제 전에 종양 내로 직접 전달되거나 (즉, 종양내 전달) 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 세포 조성물은 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여된다.
세포 또는 세포 개체군의 투여는 104 내지 109 세포/㎏ 체중, 바람직하게는 105 내지 106 세포/㎏ 체중 (해당 범위 내에서 세포의 모든 정수 값을 포함함)의 투여로 이루어질 수 있다. CAR T 세포 요법에서 용량은, 예를 들어, 림프구고갈 과정의 존재 또는 부재로, 예를 들어 시클로포스파미드 존재에서, 106 내지 109개의 세포/㎏의 투여를 수반할 수 있다. 세포 또는 세포 집단은 1회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 유효량의 세포는 단일 용량으로서 투여된다. 다른 구현예에서, 세포의 유효량은 일정 기간에 걸쳐 1회 초과의 용량으로서 투여된다. 투여 시기는 담당 의사의 판단 내에 있으며 환자의 임상적 병상에 따라 좌우된다. 세포 또는 세포의 개체군은 임의의 공급원, 예컨대 혈액 은행 또는 공여자로부터 수득할 수 있다. 각각의 요구가 다르지만, 특정 질환 또는 병태에 대해 유효량의 주어진 세포 유형의 최적 범위의 결정은 당업자의 기술 내이다. 유효량은 치료적 또는 예방적 이득을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 용량은 연령, 수용자의 건강상태 및 체중, 있다면 병용 치료의 종류, 치료 빈도 및 목적하는 효과의 특성에 따를 것이다.
다른 구현예에서, 세포 또는 이들 세포를 포함하는 조성물의 유효량은 비경구로 투여된다. 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 투여는 종양 내에서 주사에 의해 직접적으로 행해질 수 있다.
가능한 유해 반응에 대해 보호하기 위해, 조작된 면역반응성 세포는 특정 신호에 대한 노출에 취약한 세포를 제공하는 이식유전자의 형태로 유전자이식 안전성 스위치를 구비할 수 있다. 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (TK) 유전자는 줄기 세포 이식 이후에 도너 림프구 주입으로서 사용되는 동종이계 T 세포에 도입을 통해 이러한 방식으로 사용될 수 있다 (Greco, et al., Improving the safety of cell therapy with the TK-suicide gene. Front. Pharmacol. 2015; 6: 95). 이러한 세포에서, 뉴클레오시드 프로드러그, 예컨대, 간시클로비어 또는 아시클로비어의 투여는 세포 사멸을 야기한다. 대안적인 안전성 스위치 구성체는, 예를 들어 활성 효소를 형성하는 2개의 비기능성 icasp9 분자와 함께 소형 분자 이량체의 투여에 의해 촉발되는 유도성 카스파아제 9 를 포함한다. 세포 증식 제어를 구현하기 위한 다양한 대안적인 접근법이 기술되어 있다 (참조: U.S. 특허 출원 공개 번호 20130071414; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/146862; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/011987; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/040371; Zhou et al. BLOOD, 2014, 123/25:3895 - 3905; Di Stasi et al., The New England Journal of Medicine 2011; 365:1673-1683; Sadelain M, The New England Journal of Medicine 2011; 365:1735-173; Ramos et al., Stem Cells 28(6):1107-15 (2010)).
양자 요법의 추가 개선에서, 게놈 편집이 예를 들어 편집 CAR T 세포를 제공하는 대안적인 실행을 위해 면역반응성 세포를 조정하는데 사용될 수 있다 (참조: Poirot et al., 2015, multiplex genome edited T-cell manufacturing platform for "off-the-shelf" adoptive T-cell immunotherapies, Cancer Res 75 (18): 3853; Ren et al., 2017, multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition, Clin Cancer Res. 2017 May 1;23(9):2255-2266. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-16-1300. Epub 2016 Nov 4; Qasim et al., 2017, Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells, Sci Transl Med. 2017 Jan 25;9(374); Legut, et al., 2018, CRISPR-mediated TCR replacement generates superior anticancer transgenic T cells. Blood, 131(3), 311-322; and Georgiadis et al., Long Terminal Repeat CRISPR-CAR-Coupled "Universal" T Cells Mediate Potent Anti-leukemic Effects, Molecular Therapy, In Press, Corrected Proof, Available online 6 March 2018). 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 CRISPR 시스템 및 방법을 사용해 편집될 수 있다. 조성물 및 시스템은 본 명세서에 기술된 면역 세포로 전달될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포는 생체외에서 편집되고, 이를 필요로 하는 대상체에게 전달된다. 면역반응성 세포, CAR T 세포 또는 양자 세포 전달을 위해 사용되는 임의의 세포는 편집될 수 있다. 편집은 예를 들어, 외생성 유전자, 예컨대 CAR 또는 TCR을 코딩하는 외생성 유전자를 세포의 사전선택된 유전자좌 (예를 들어, TRAC 유전자좌)에서 삽입 또는 녹-인시키기 위해서; 잠재적 동종반응성 T-세포 수용체 (TCR)를 제거하거나 또는 내생성 및 외생성 TCR 사슬간 부적절한 쌍형성을 방지하기 위해서, 예컨대 세포에서 내생성 TCR의 발현을 녹-아웃 또는 녹-다운하기 위해서; 세포에서 화학요법제의 표적을 파괴하기 위해서; 면역 체크포인트의 차단을 위해서, 예컨대 세포에서 면역 체크포인트 단백질 또는 수용체의 발현을 녹-아웃 또는 녹-다운시키기 위해서; 세포에서 다른 유전자 또는 유전자들의 발현의 녹-아웃 녹-다운, 세포를 사용하는 양자 요법의 효능을 증강시킬 수 있는 발현의 결여 또는 감소된 발현; 내생성 유전자로서, 외생성 CAR 또는 TCR에 의해 표적화되는 항원을 코딩하는 내생성 유전자의 발현을 세포 내에서 녹-아웃 또는 녹-다운하기 위해서; 세포에서 하나 이상의 MHC 성분 단백질의 발현을 녹-아웃 또는 녹-다운하기 위해서; 세포가 소진 또는 이상기능에 내성이도록 세포를 조절하기 위해서; 및/또는 기능적으로 소진 또는 이상 기능성 CD8+ T-세포의 분화 및/또는 증식을 증가시키기 위해서 수행될 수 있다 (참조: 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/176915, WO 2014/059173, WO 2014/172606, WO 2014/184744, 및 WO 2014/191128).
일 구현예에서, 편집은 유전자의 불활성화를 일으킬 수 있다. 유전자의 불활성화를 통해서, 관심 유전자가 기능성 단백질 형태로 발현되지 않게 하고자 한다. 특정 구현예에서, 시스템은 하나의 표적 유전자에서 절단을 특이적으로 촉매하여 상기 표적 유전자를 불활성화시킨다. 초래된 핵산 가닥 파손은 일반적으로 상동성 재조합 또는 비상동성 말단 연결 (NHEJ)의 별개 기전을 통해 복구된다. 그러나, NHEJ는 종종 절단 부위에서 DNA 서열에 변화를 초래하는 불완전한 복구 과정이다. 비상동성 말단 연결 (NHEJ)을 통한 복구가 종종 작은 삽입 또는 결실 (Indel)을 야기시키고 특이적 유전자 녹아웃의 생성에 사용될 수 있다. 절단 유도된 돌연변이유발 사건이 발생된 세포는 당분야에 충분히 공지된 방법으로 확인 및/또는 선택할 수 있다. 일 구현예에서, 상동성 지정 복구 (HDR)는 동시에 유전자 (예를 들어, TRAC)를 불활성화시키고 불활성화된 유전자좌로 내생성 TCR 또는 CAR을 삽입시키는데 사용된다.
따라서, 일 구현예에서, 세포, 특히 양자 세포 요법에 의도된 세포, 보다 특히 면역반응성 세포 예컨대 T 세포의 편집은 외생성 유전자, 예컨대 CAR 또는 TCR을 코딩하는 외생성 유전자를 세포에서 사전선택된 유전자좌에서 삽입하거나 또는 녹-인시키기 위해 수행될 수 있다. 통상적으로, CAR 또는 TCR을 코딩하는 핵산 분자는 무작위 통합 벡터를 사용해 세포에 형질감염 또는 형질도입되며, 통합 부위에 의존하여, 클론 확장, 종양발생 형질전환, 다양한 이식유전자 발현 및/또는 이식유전자의 전사 침묵화를 일으킬 수 있다. 이식유전자(들)를 세포의 특정 위치로 유도하면 이러한 위험을 최소화하거나 피할 수 있고 유리하게는 세포에 의한 이식유전자(들)의 균일한 발현을 제공할 수 있다. 제한 없이, 유도된 이식유전자 통합을 위한 적합한 '세이프 하버' 유전자좌는 CCR5 또는 AAVS1을 포함한다. 상동성-지정 복구 (HDR) 전략은 공지되어 있고 본 명세서의 다른 곳에 기술되어서 원하는 유전자좌 (예를 들어, TRAC 유전자좌)로 이식유전자를 삽입할 수 있게 한다.
이식유전자, 특히 CAR 또는 외생성 TCR 이식유전자의 삽입을 위한 추가의 적합한 유전자좌는 제한 없이 내생성 T-세포 수용체의 성분을 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자좌, 예컨대 T-세포 수용체 알파 유전자좌 (TRA) 또는 T-세포 수용체 베타 유전자좌 (TRB), 예를 들어, T-세포 수용체 알파 불변 (TRAC) 유전자좌, T-세포 수용체 베타 불변 1 (TRBC1) 유전자좌 또는 T-세포 수용체 베타 불변 2 (TRBC1) 유전자좌를 포함한다. 유리하게, 그러한 유전자좌로 이식유전자의 삽입은 잠재적으로 내생성 프로모터에 의해 제어되는, 이식유전자의 발현, 및 내생성 TCR의 녹-아웃 발현을 동시에 획득할 수 있다. 이러한 접근법은 [Eyquem et al., (2017) Nature 543: 113-117]에 예시되어 있는데, 저자는 내생성 프로모터의 하류 TRAC 유전자좌로 CD19-특이적 CAR을 코딩하는 DNA 분자를 녹인하기 위해서 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하였고, CRISPR에 의해 수득된 CAR-T 세포는 감소된 강직한 CAR 신호전달 및 소진의 측면에서 상당히 우수하였다.
T 세포 수용체 (TCR) 는 항원 제시에 반응하는 T 세포의 활성화에 참여하는 세포 표면 수용체이다. TCR 은 일반적으로, 이종이량체를 형성하도록 조립되고 세포 표면 상에 제시되는 T 세포 수용체 복합체를 형성하기 위해 CD3-형질도입 서브유닛과 회합하는 2 개의 사슬, 즉, α 및 β 로 이루어진다. TCR의 각각의 α 및 β 쇄는 면역글로불린-유사 N-말단의 가변 (V) 및 불변 (C) 영역, 소수성 경막 도메인 및 짧은 세포질 영역으로 이루어진다. 면역글로불린 분자에 대해서와 같이, α 및 β 쇄의 가변 영역은 V(D)J 재조합에 의해 생성되어, T 세포 개체군 내에서 매우 다양한 항원 특이성을 생성시킨다. 그러나, 온전한 항원을 인식하는 면역글로불린과 대조적으로, T 세포는 MHC 분자와 회합되는 가공된 펩티드 단편에 의해 활성화되어, MHC 제한으로서 알려진 T 세포에 의한 항원 인식에 대해 여분의 치수를 도입한다. T 세포 수용체를 통한 도너와 수용자 사이의 MHC 차이의 인식은 T 세포 증식 및 이식편대 숙주반응 (GVHD)의 잠재적 발생을 야기한다. TTCRα 또는 TCRβ의 불활성화는 T 세포 표면으로부터 TCR 의 제거를 초래하여 동종항원의 인식을 방지하고 그에 따라 GVHD 를 방지할 수 있다. TCR 붕괴는 일반적으로 CD3 신호전달 성분의 제거를 초래하고 추가적인 T 세포 확장 수단을 변경시킨다.
따라서, 일 구현예에서, 세포, 특히 양자 세포 요법이 의도되는 세포, 보다 특히 면역반응성 세포 예컨대 T 세포의 편집은 세포에서 내생성 TCR 발현의 녹-아웃 또는 녹-다운을 위해 수행된다. 예를 들어, NHEJ-기반 또는 HDR-기반 유전자 편집 접근법은 내생성 TCR 알파 및/또는 베타 사슬 유전자를 파괴하는데 적용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집 시스템 또는 시스템들, 예컨대 TnpB 시스템 또는 시스템들, 베타 1 및 베타 2 불변 영역 유전자 (TRBC1 및 TRBC2) 간에 보존된 TCR 베사 사슬에서 발견되는 서열을 표적화하고/하거나 TCR 알파 사슬 (TRAC) 유전자의 불변 영역을 표적화하도록 디자인될 수 있다.
동종이계 세포는 숙주 면역계에 의해 빠르게 거부된다. 비-조사된 혈액 생산물에 존재하는 동종이계 백혈구는 5일 내지 6일 이하 동안 지속된다는 것이 입증되었다 (Boni, Muranski et al. 2008 Blood 1;112(12):4746-54). 따라서, 동종이계 세포의 거부를 방지하기 위해, 숙주의 면역계는 보통 일정 정도로 억제되어야 한다. 그러나, 양자 세포 전달의 경우에, 면역억제 약물의 사용이 또한 도입된 치료적 T 세포에 대해 해로운 효과를 갖는다. 그러므로, 이들 조건에서 양자 면역요법 접근을 효과적으로 사용하기 위해, 도입된 세포는 면역억제 치료에 내성일 필요가 있을 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은, 바람직하게는 면역억제제에 대한 표적을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 불활성화에 의해, T 세포를 면역억제제에 내성이 되도록 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 면역억제제는 몇몇 작용 메커니즘 중 하나에 의해 면역 기능을 억제하는 작용제이다. 면역억제제는 칼시뉴린 억제제, 라파마이신의 표적, 인터루킨-2 수용체 α-사슬 차단제, 이노신 모노포스페이트 데히드로게나제의 억제제, 디히드로폴산 리덕타제의 억제제, 코르티코스테로이드 또는 면역억제성 항대사물질일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명은 T 세포 내 면역억제제의 표적을 불활성화시킴으로써 면역요법을 위해 T 세포에 면역억제 내성을 부여하도록 허용한다. 비제한적인 예로서, 면역억제제에 대한 표적은 면역억제제에 대한 수용체 예컨대: CD52, 글루코코르티코이드 수용체 (GR), FKBP 패밀리 유전자 구성원 및 사이클로필린 패밀리 유전자 구성원일 수 있다.
일 구현예에서, 세포, 특히 양자 세포 요법이 의도되는 세포, 보다 특히 면역반응성 세포의 편집은 예컨대 T 세포는 면역 체크포인트를 차단하기 위해서, 예컨대 세포에서 면역 체크포인트 단백질 또는 수용체의 발현을 녹-아웃 또는 녹-다운시키기 위해 수행될 수 있다. 면역 체크포인트는 면역반응을 늦추거나 중단시키고, 면역 세포의 제어되지 않은 활성으로부터의 과도한 조직 손상을 방지하는 억제 경로이다. 일 구현예에서, 표적화된 면역 체크포인트는 프로그램된 사멸-1 (PD-1 또는 CD279) 유전자 (PDCD1)이다. 다른 구현예에서, 표적화된 면역 체크포인트는 세포독성 T-림프구-연관 항원 (CTLA-4)이다. 추가 구현예에서, 표적화된 면역 체크포인트는 CD28 및 CTLA4 Ig 수퍼패밀리의 다른 구성원 예컨대 BTLA, LAG3, ICOS, PDL1 또는 KIR 이다. 표적화된 면역 체크포인트는 TNFR 수퍼패밀리의 구성원 예컨대 CD40, OX40, CD137, GITR, CD27 또는 TIM-3 이다.
추가의 면역 체크포인트 Src 상동체성 2 도메인-함유 단백질 티로신 포스파타제1 (SHP-1)를 포함한다 (Watson HA, et al., SHP-1: the next checkpoint target for cancer immunotherapy? Biochem Soc Trans. 2016 Apr 15;44(2):356-62). SHP-1은 널리 발현되는 억제성 단백질 티로신 포스파타제 (PTP)이다. T-세포에서, 이것은 항원-의존적 활성화 및 증식의 음성 조절자이다. 이는 시토졸 단백질이고, 따라서 항체-매개 요법을 받을 수 없지만, 활성화 및 증식에서 이의 역할은 양자 전달 전략, 예컨대, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포에서 유전자 조작을 위한 매력적인 표적이 되게 한다. 면역 체크포인트는 Ig 및 ITIM 도메인 (TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9) 및 VISTA를 갖는 T 세포 면역수용체를 포함할 수도 있다 (Le Mercier I, et al., (2015) Beyond CTLA-4 and PD-1, the generation Z of negative checkpoint regulators. Front. Immunol. 6:418).
국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/172606 은 소진된 CD8+ T-세포의 증식 및/또는 활성을 증가시키고 CD8+ T-세포 소진을 감소 (예를 들어, 기능적으로 소진되거 또는 비반응성 CD8+ 면역 세포를 감소)시키기 위한 MT1 및/또는 MT2 억제제의 용도에 관한 것이다. 일 구현예에서, 메탈로티오네인은 양자적으로 전달된 t 세포에서 유전자 편집에 의해 표적화된다.
일 구현예에서, 유전자 편집의 표적은 면역 체크포인트 단백질의 발현에 관여되는 적어도 하나의 표적화된 유전자좌일 수 있다. 이러한 표적은 CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, ICOS (CD278), PDL1, KIR, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244 (2B4), TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, VISTA, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, MT1, MT2, CD40, OX40, CD137, GITR, CD27, SHP-1, TIM-3, CEACAM-1, CEACAM-3, 또는 CEACAM-5를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, PD-1 또는 CTLA-4 유전자의 발현에 관여되는 유전자의 유전자좌가 표적화된다. 다른 바람직한 구현예에서, 유전자의 조합, 예컨대 제한없이, PD-1 및 TIGIT가 표적화된다.
예로서, 제한 없이, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/196388 은 (a) 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체로서, CAR일 수 있는 수용체; 및 (b) PD-L1를 코딩하는 파괴된 유전자, PD-L1를 코딩하는 유전자의 파괴를 위한 작용제, 및/또는 PD-L1을 코딩하는 유전자의 파괴로서, 유전자 편집 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), CRISPR/Cas9 및/또는 TALEN에 의해 매개될 수 있는 것인 유전자 파괴를 포함하는 조작된 T 세포에 관한 것이다. WO2015142675는 암의 치료에서 면역 이펙터 세포의 효능을 증가시키는 작용제 (예컨대, 본 명세서의 조성물 또는 시스템)과 조합하여 CAR을 포함하는 면역 이펙터에 관한 것으로서, 작용제는 면역 억제성 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR 베타, CEACAM-1, CEACAM-3, 또는 CEACAM-5를 억제할 수 있다. [Ren et al., (2017) Clin Cancer Res 23 (9) 2255-2266]은 CAR의 렌티바이러스 전달 및 내생성 TCR, β-2 마이크로글로불린 (B2M) 및 PD1을 동시에 표적화하는 Cas9 mRNA 및 gRNA의 전기-전달을 수행하여서, TCR, HLA 클래스 I 분자 및 PD1이 결핍된 유전자-파괴 동종이계 CAR T 세포를 생성시켰다.
일 구현예에서, 세포는 CAR을 발현하도록 조작될 수 있고, 세포에서 메틸시토신 디옥시게나제 유전자 (TET1, TET2 및/또는 TET3)의 발현 및/또는 기능이 감소 또는 제거되었다 (예컨대, 본 명세서의 조성물 또는 시스템)(예를 들어, WO201704916에 기술됨).
일 구현예에서, 세포, 특히 양자 세포 요법이 의도된 세포, 보다 특히 면역반응성 세포, 예컨대 T 세포의 편집은 세포에서 내생성 유전자의 발현을 녹-아웃 또는 녹-다운시키기 위해 수행될 수 있고, 상기 내생성 유전자는 외생성 CAR 또는 TCR에 의해 표적화되는 항원을 코딩하여서, 조작된 세포의 표적화 가능성을 감소시킨다. 일 구현예에서, 표적화된 항원은 CD38, CD138, CS-1, CD33, CD26, CD30, CD53, CD92, CD100, CD148, CD150, CD200, CD261, CD262, CD362, 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서비빈, 마우스 더블 미니트 2 상동체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, 빌름스 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, 알파페토단백질 (AFP), 암배 항원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), p53, 사이클린 (D1), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), 경막 활성인자 및 CAML 인터액터 (TACI), 및 B-세포 활성화 인자 수용체 (BAFF-R) (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/011210 및 WO 2017/011804에 기술된 바와 같음)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항원일 수 있다.
일 구현예에서,세포, 특히 양자 세포 요법이 의도된 세포, 보다 특히 면역반응성 세포 예컨대 T 세포의 편집은 하나 이상의 MHC 성분 단백질, 예컨대 하나 이상의 HLA 단백질 및/또는 베타-2 마이크로글로불린 (B2M)의 발현을 세포에서, 녹-아웃 또는 녹-다운시키기 위해 수행될 수 있어서, 수용자의 면역계에 의한 비-자기유래 (예를 들어, 동종이계) 세포의 거부를 감소시킬 수 있거나 또는 피할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 HLA 클래스 I 단백질, 예컨대 HLA-A, B 및/또는 C, 및/또는 B2M은 녹-아웃 또는 녹-다운될 수 있다. 바람직하게, B2M은 녹-아웃 또는 녹-다운될 수 있다. 예로서, [Ren et al., (2017) Clin Cancer Res 23 (9) 2255-2266]은 CAR의 렌티바이러스 전달 및 내생성 TCR, β-2 마이크로글로불린 (B2M) 및 PD1을 동시에 표적화하는 Cas9 mRNA 및 gRNA의 전기-전달을 수행하여서, TCR, HLA 클래스 I 분자 및 PD1이 결핍된 유전자-파괴 동종이계 CAR T 세포를 생성시켰다.
다른 구현예에서, 적어도 2개 유전자가 편집된다. 유전자 쌍은 PD1 및 TCRα, PD1 및 TCRβ, CTLA-4 및 TCRα, CTLA-4 및 TCRβ, LAG3 및 TCRα, LAG3 및 TCRβ, Tim3 및 TCRα, Tim3 및 TCRβ, BTLA 및 TCRα, BTLA 및 TCRβ, BY55 및 TCRα, BY55 및 TCRβ, TIGIT 및 TCRα, TIGIT 및 TCRβ, B7H5 및 TCRα, B7H5 및 TCRβ, LAIR1 및 TCRα, LAIR1 및 TCRβ, SIGLEC10 및 TCRα, SIGLEC10 및 TCRβ, 2B4 및 TCRα, 2B4 및 TCRβ, B2M 및 TCRα, B2M 및 TCRβ를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 세포는 (1) 내생성 TCR (예를 들어, TRBC1, TRBC2 및/또는 TRAC) 발현의 녹-아웃 또는 녹-다운, (2) 면역 체크포인트 단백질 또는 수용체 (예를 들어, PD1, PD-L1 및/또는 CTLA4) 발현의 녹-아웃 또는 녹-다운; 및 (3) 하나 이상의 MHC 성분 단백질 (예를 들어, HLA-A, B 및/또는 C, 및/또는 B2M, 바람직하게 B2M) 발현의 녹-아웃 또는 녹-다운을 위해 본 명세서에 교시된 바와 같이 다중 편집 (다수 게놈 편집)될 수 있다.
T 세포의 유전자 변형 이전이거나 또는 이후이거나, T 세포는 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 일반적으로 활성화될 수 있고 확장될 수 있다: 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 제7,572,631호. T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 확장될 수 있다.
면역 세포는 당분야에 공지된 임의 방법을 사용해 수득될 수 있다. 일 구현예에서, 동종이계 T 세포는 건강한 대상체로부터 수득될 수 있다. 일 구현예에서 종양을 침윤하는 T 세포가 단리된다. T 세포는 수술 동안 제거될 수 있다. T 세포는 종양 조직 생검의 제거 후 단리될 수 있다. T 세포는 당분야에 공지된 임의 수단으로 단리될 수 있다. 일 구현예에서, T 세포는 성분 채집술로 수득된다. 일 구현예에서, 방법은 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 통해 종양 샘플로부터 T 세포의 대용량 개체군을 수득하는 단계를 포함한다. 예를 들어, T 세포의 대용량 개체군은 특이적 세포 개체군을 선택할 수 있는 세포 현탁액으로 종양 샘플을 해리하여서 종양 샘플로부터 수득될 수 있다. T 세포의 대용량 개체군을 수득하는 적합한 방법은 종양의 기계적 해리 (예를 들어, 분쇄), 종양의 효소적 해리 (예를 들어, 분해), 및 흡인 (예를 들어, 바늘 사용) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
종양 샘플로부터 수득된 T 세포의 대용량 개체군은 임의의 적합한 유형의 T 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게, 종양 샘플로부터 수득된 T 세포의 대용량 개체군은 종양 침윤성 림프구 (TIL)를 포함한다.
종양 샘플은 임의의 포유동물로부터 수득될 수 있다. 달리 명시하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는, 용어 "포유동물" 은 토끼목, 예컨대 토끼; 고양이과 (고양이) 및 개과 (개) 를 포함하는 식육목; 소과 (소) 및 돼지과 (돼지) 를 포함하는 우제목; 또는 말과 (말) 를 포함하는 말목의 포유동물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 영장목, 세보이드 (Ceboid) 또는 시모이드 (Simoid) 목 (원숭이), 또는 유인원목 (인간 및 유인원) 의 비-인간 영장류일 수 있다. 일 구현예에서, 포유동물은 설치목의 포유동물, 예컨대 마우스 및 햄스터일 수 있다. 바람직하게, 포유동물은 비-인간 영장류 또는 인간이다. 특히 바람직한 포유동물은 인간이다.
T 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수, 림프절 조직, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, T 세포는 T 세포는 피콜 (Ficoll) 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 다수 기법을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 혈액 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 수득된다. 혈액 성분채집술 생성물은 전형적으로 림프구, 예컨대 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 일 구현예에서, 혈액 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 넣을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세척된다. 대안적 구현예에서, 세척 용액은 칼슘이 결여되고 마그네슘이 결여되거나 또는 전부는 아니지만 많은 이가 양이온이 결여될 수 있다. 칼슘의 부재 하의 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 초래한다. 당업자가 쉽게 이해하는 바와 같이, 세척 단계는 당분야에 공지된 방법, 예컨대 제조사 설명서에 따라서 반자동 "관류" 원심분리 (예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기)를 사용하여 수행될 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충제, 예를 들어 Ca-불포함, Mg-불포함 PBS 에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 혈액 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있으며 세포는 배양 배지에 직접 재현탁된다.
다른 구현예에서, T 세포는 적혈구 세포를 용해시키고 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정 하위개체군, 예컨대 CD28+, CD4+, CDC, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술을 통해 더 단리될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 일 구현예에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 시간 기간 동안 항-CD3/항-CD28 (즉, 3 x 28)-접합 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, 또는 XCYTE DYNABEADSTM 와 함께 인큐베이션하여 단리된다. 일 구현예에서, 시간 기간은 약 30분이다. 추가 구현예에서, 시간 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상의 범위 및 그 사이의 모든 정수 값이다. 추가 구현예에서, 시간 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 시간 기간은 10 내지 24시간이다. 바람직한 일 구현예에서, 인큐베이션 시간 기간은 24시간이다. 백혈병 환자로부터 T 세포를 단리하기 위해, 24 시간과 같은 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간은 다른 세포 유형에 비해 T 세포가 적은 임의의 상황에서, 예를 들어 종양 조직으로부터 또는 면역손상된 개체로부터 종양 침윤 림프구 (TIL) 를 단리하는 데 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 개체의 농후화는 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 유도된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 바람직한 방법은 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이며 이는 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 유도된 단일클론 항체의 칵테일을 사용한다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농후화하기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8 에 대한 항체를 포함한다.
또한, 단핵구 개체군 (즉, CD14+ 세포)은 항-CD14 코팅된 비드 또는 컬럼을 포함하는 다양한 방법, 또는 제거를 용이하게 하기 위한 이들 세포의 식세포 활성의 활용에 의해 혈액 제제로부터 고갈될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 식세포성 단핵구에 의해 삼켜지기에 충분한 크기의 상자성 입자를 사용한다. 일 구현예에서, 상자성 입자는 상업적으로 이용 가능한 비드, 예를 들어 Dynabeads™라는 상품명으로 Life Technologies에서 생산되는 것이다. 일 구현예에서, 상자성 입자를 "무관한" 단백질(예를 들어, 혈청 단백질 또는 항체)로 코팅함으로써 다른 비특이적 세포가 제거된다. 무관한 단백질 및 항체는 단리될 T 세포를 특이적으로 표적화하지 않는 이들 단백질 및 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 무관한 비드는 양 항-마우스 항체, 염소 항-마우스 항체, 및 인간 혈청 알부민으로 코팅된 비드를 포함한다.
요약하면, 이러한 단핵구의 고갈은, 전혈, 부착된 말초혈, 또는 종양으로부터 단리된 T 세포를, 단핵구의 제거를 허용하는 임의의 양 (대략 20:1 비드:세포 비)의 하나 이상의 다양한 무관하거나 또는 비-항체 커플링된 상자성 입자와 함께 약 30분 내지 2시간 동안 22 내지 37℃에서 예비 인큐베이션한 후, 상자성 입자에 부착되거나 삼켜진 세포를 자기 제거함으로써 수행된다. 이러한 분리는 당업계에서 이용가능한 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 시판되는 다양한 것들, DYNAL® Magnetic Particle Concentrator (DYNAL MPC®))을 포함하는 임의의 자기 분리 방법이 사용될 수 있다. 필요한 고갈의 보증은 고갈 전 및 후에 CD14 양성 세포의 유세포 분석을 포함하는, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 모니터링될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 원하는 세포 집단의 단리를 위해, 세포 및 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자) 의 농도는 다양할 수 있다. 일 구현예에서,세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 (즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 20억 세포/ml 의 농도가 사용된다. 일 구현예에서, 10 억 세포/ml 의 농도가 사용된다. 추가 구현예에서, 1 억 세포/ml 초과의 세포가 사용된다. 추가 구현예에서, 1천만, 1천 500만, 2천만, 2천 500만, 3천만, 3천 5백만, 4천만, 4천 500만 또는 5천만개 세포/ml 의 농도가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 7천 500만, 8천만, 8천 500만, 9천만, 9천 500만 또는 1억개 세포/ml 의 농도가 사용된다. 추가 구현예에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만개 세포/ml 의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도의 사용은 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 증가시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등) 로부터 더욱 효율적인 포획을 허용한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 수득하기에 바람직할 것이다. 예를 들어, 높은 농도의 세포를 사용하는 것은 통상적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.
관련 구현예에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석시킴으로써, 입자와 세포 사이의 상호작용이 최소화된다. 이는 입자에 결합될 원하는 항원을 다량으로 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28 을 발현하며, 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일 구현예에서, 사용되는 세포의 농도는 5X106/ml 이다. 다른 구현예에서, 사용되는 농도는 약 1X105/ml 내지 1X106/ml, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
T 세포는 냉동될 수 있다. 이론에 국한하지 않지만, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 당업계에 공지되어 있고, 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함하며, 이어서 세포를 분당 1°의 속도로 -80℃에서 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기상으로 저장한다. -20°C 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않은 동결 뿐만 아니라 다른 제어되는 동결 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 T 세포는 또한 항원-특이적 T 세포일 수 있다. 예를 들어, 종양-특이적 T 세포가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 항원-특이적 T 세포는 관심 환자, 예컨대 암 또는 감염성 질환을 앓는 환자로부터 단리될 수 있다. 일 구현예에서, 네오에피토프가 대상체에 대해 결정되고 이들 항원에 특이적인 T 세포가 단리된다. 확장에서 사용을 위한 항원-특이적 세포가 또한 당분야에 공지된 임의의 많은 방법, 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 것들을 사용해 시험관내에서 생성될 수 있다: 미국 특허 출원 공개 번호 US 20040224402, 명칭 Generation and Isolation of Antigen-Specific T Cells, 또는 미국 특허 제6,040,177호. 본 발명에서 사용을 위한 항원-특이적 세포는 또한 당분야에 공지된 임의의 많은 방법, 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 것들을 사용해 생성될 수 있다: Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Cell Biology, both published by John Wiley & Sons, Inc., Boston, Mass.
관련 구현예에서, 1회 또는 2회 확장 라운드 이전 또는 이후에 항원 특이적 세포를 분류하거나 또는 달리 양성적으로 (예를 들어, 자성 선택을 통해) 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 항원-특이적 세포의 분류 또는 양성 선택은 펩티드-MHC 사량체를 사용하여 실행될 수 있다 (Altman, et al., Science. 1996 Oct. 4; 274(5284):94-6). 다른 구현예에서, 개조가능한 사량체 기술이 사용된다 (Andersen et al., 2012 Nat Protoc. 7:891-902). 사량체는 이전 가설을 기반으로 하는 예측된 결합 펩티드를 이용해야 할 필요성 및 특이적 HLA 에 대한 제약에 의해 제한된다. 펩티드-MHC 사량체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있고, 본 명세서에에 기재된 바와 같이 임의의 관심 MHC 분자 및 임의의 관심 항원으로 만들어질 수 있다. 이러한 맥락에서 사용되는 특이적 에피토프는 당업계에 공지된 수많은 어세이를 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, MHC 클래스 I에 결합하는 폴리펩티드의 능력은 125I 표지된 β2-마이크로글로불린 (β2m)을 MHC 클래스 I/β2m/펩티드 이종삼량체 복합체로의 도입을 촉진하는 능력을 모니터링하여 간접적으로 평가될 수 있다 (참조: Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994).
일 구현예에서 세포는 유세포 분석에 의한 단리를 위해 에피토프-특이적 시약으로 직접 표지된 후 표현형 및 TCR 의 특징분석이 이어진다. 일 구현예에서, T 세포는 T 세포 특이적 항체를 접촉시킴으로써 단리된다. 항원-특이적 T 세포, 또는 일반적으로 본 발명의 임의의 세포의 분류는 MoFlo 분류기 (DakoCytomation, Fort Collins, Colo.) FACSAria™, FACSArray™, FACSVantage™, BD™ LSR II 및 FACSCalibur™ (BD Biosciences, San Jose, Calif.) 를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 시판 세포 분류기를 사용하여 실행될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 방법은 또한 CD3 을 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 방법은 임의의 적합한 방식으로 세포를 특이적으로 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게, 선택은 유세포 분석을 사용하여 실행된다. 유세포 분석은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 실행될 수 있다. 유세포 분석은 임의의 적합한 항체 및 염료를 이용할 수 있다. 바람직하게, 항체는 선택되는 특정 바이오마커를 특이적으로 인식하고 이에 결합하도록 선택된다. 예를 들어, CD3, CD8, TIM-3, LAG-3, 4-1BB, 또는 PD-1의 특이적 선택은 항-CD3, 항-CD8, 항-TIM-3, 항-LAG-3, 항-4-lBB, 또는 항-PD-1 항체를 각각 사용하여 수행될 수 있다. 항체 또는 항체들은 비드 (예를 들어, 자기 비드) 또는 형광색소에 접합될 수 있다. 바람직하게, 유세포 분석은 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 이다. T 세포 상에서 발현되는 TCR 은 자기유래 종양에 대한 반응성을 기반으로 하여 선택될 수 있다. 추가로, 종양에 반응성인 T 세포는 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, 특허 출원 공개 번호 WO2014133567 및 WO2014133568에 기술된 방법을 사용하여 마커를 기반으로 선택될 수 있다. 추가로, 활성화된 T 세포는 CD107a의 표면 발현을 기반으로 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 방법은 농후화된 세포 개체군에서 T 세포의 수를 확장시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 방법은 미국 특허 제8,637,307호에 기술되어 있고, 이의 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다. T 세포의 수는 적어도 약 3-배 (또는 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 또는 9-배), 보다 바람직하게 적어도 약 10-배 (또는 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 또는 90-배), 보다 바람직하게 적어도 약 100-배, 보다 바람직하게 적어도 약 1,000 배, 또는 가장 바람직하게 적어도 약 100,000-배 증가된다. T 세포의 수는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 확장될 수 있다. 예시적인 세포 수 확장 방법은 하기 문헌들에 기술되고, 이들 각각은 참조로 본 명세서에 편입된다: 특허 출원 공개 번호 WO 2003/057171, 미국 특허 제8,034,334호, 및 U.S. 특허 출원 공개 번호 2012/0244133.
일 구현예에서, 생체외 T 세포 확장은 T 세포의 단리 및 후속적인 자극 또는 활성화 및 이후의 추가 확장에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, T 세포는 단일 작용제에 의해 자극되거나 활성화될 수 있다. 다른 구현예에서, T 세포는 2개의 작용제로 자극되거나 활성화되는데, 하나는 1차 신호를 유도하고, 두 번째는 공동자극 신호이다. 단일 신호를 자극하거나 1차 신호 및 2차 신호를 자극하는 부속 분자를 자극하는데 유용한 리간드가 가용성 형태로 사용될 수 있다. 리간드는 세포의 표면, 조작된 다가 신호전달 플랫폼 (Engineered Multivalent Signaling Platform (EMSP)) 에 부착되거나 표면 상에 고정될 수 있다. 바람직한 구현예에서 1차 및 2차 작용제 둘 모두는 표면, 예를 들어 비드 또는 세포 상에 공동-고정화된다. 일 구현예에서, 1차 활성화 신호를 제공하는 분자는 CD3 리간드일 수 있고, 공동-자극 분자는 CD28 리간드 또는 4-1BB 리간드일 수 있다.
일 구현예에서, CAR 또는 외생성 TCR을 포함하는 T 세포는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/120096에 기술된 대로 제조될 수 있는데, 도너 또는 대상체로부터 수득되는 림프구의 개체군을 농후화시키는 단계; 림프구의 개체군을 하나 이상의 T-세포 자극제로 자극시켜서 활성화된 T 세포의 개체군을 생성시키는 단계로서, 자극은 혈청-무함유 배양 배지를 사용한 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 단일 사이클 형질도입을 사용해 CAR 또는 TCR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터를 활성화된 T 세포의 개체군에 형질도입시켜서 형질도입된 T 세포의 개체군을 생산하는 단계로서, 형질도입은 혈청-무함유 배양 배지를 사용해 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 및 사전결정된 시간 동안 형질도입된 T 세포의 개체군을 확장시켜서 조작된 T 세포의 개체군을 생성시키는 단계로서, 확장은 혈청-무함유 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계를 포함하는 방법에 의한다. 일 구현예에서, CAR 또는 외생성 TCR을 포함하는 T 세포는 WO 2015/120096에 기술된 대로 제조되며, 림프구의 개체군을 수득하는 단계; 하나 이상의 자극제로 림프구의 개체군을 자극하여 활성화된 T 세포의 개체군을 생산하는 단계로서, 자극은 혈청-무함유 배양 배지를 사용해 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 적어도 1회 사이클의 형질도입을 사용하여, CAT 또는 TCR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터를 활성화된 T 세포의 개체군에 형질도입시켜서, 형질도입된 T 세포의 개체군을 생성시키는 단계로서, 형질도입은 혈청-무함유 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계; 및 형질도입된 T 세포의 개체군을 확장시켜서 조작된 T 세포의 개체군을 생산하는 단계로서, 확장은 혈청-무함유 배양 배지를 사용하여 폐쇄 시스템에서 수행되는 것인 단계를 포함하는 방법에 의한다. 형질도입된 T 세포의 개체군을 확장시키기 위한 사전 결정된 시간은 3일일 수 있다. 조작된 T 세포를 생산하기 위해 림프구의 개체군의 농축으로부터의 시간은 6일일 수 있다. 폐쇄 시스템은 폐쇄된 백 시스템일 수 있다. 상기 방법으로 수득가능하거나 또는 수득된 CAR 또는 외생성 TCR을 포함하는 T 세포의 개체군, 및 이러한 세포를 포함하는 약학 조성물이 또한 제공된다.
일 구현예에서, 시험관내 T 세포 성숙화 또는 분화는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2017/070395에 기술된 바와 같은 방법에 의해 지연 또는 억제될 수 있고, 방법은 T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터의 하나 이상의 T 세포를 AKT 억제제 (예컨대, 예를 들어, WO2017070395의 청구항 8에 개시된 둘 이상의 AKT 억제제의 하나 또는 둘 이상의 조합) 및 외생성 인터루킨-7 (IL-7) 및 외생성 인터루킨-15 (IL-15) 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계로서, 최종 T 세포는 지연된 성숙화 또는 분화를 나타내고/내거나, 최종 T 세포는 AKT 억제제 부재 하에서 배양된 T 세포의 T 세포 기능에 비해서 개선된 T 세포 기능 (예컨대, 예를 들어, 증가된 T 세포 증식; 증가된 사이토카인 생산; 및/또는 증가된 세포용해 활성)을 나타내는 것인 단계를 포함한다.
일 구현예에서, T 세포 요법을 필요로 하는 환자는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/191756에 기술된 방법으로 조건화될 수 있는데, 방법은 200 mg/m2/일 내지 2000 mg/m2/일의 사이클로포스파미드 용량 및 20 mg/m2/day 내지 900 mg/m2/일의 플루다라빈 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
질환
유전 질환 및 유전적 및/또는 후생적 측면을 갖는 질환
조성물, 시스템, 또는 이의 성분은 유전적 및/또는 후생적 측면을 갖는 질환 또는 유전 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 예시되는 유전자 및 조건이 총망라된 것은 아니다. 일 구현예에서, 유전 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법은 조성물, 시스템, 및/또는 하나 이상의 이의 성분을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 조성물, 시스템, 및/또는 하나 이상의 이의 성분은 대상체의 하나 이상의 세포에서 유전 질환 또는 유전적 및/또는 후생적 측면을 갖는 질환과 연관된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 카피를 변형시킬 수 있다. 일 구현예에서, 대상체에서 유전적 및/또는 후생적 측면을 갖는 유전 질환 또는 질환과 연관된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 카피의 변형은 대상체에서 유전 질환 또는 이의 증상을 제거할 수 있다. 일 구현예에서, 대상체에서 유전적 및/또는 후생적 측면을 갖는 유전 질환 또는 질환과 연관된 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 카피의 변형은 대상체에서 유전 질환 또는 이의 증상의 중증도를 감소시킬 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분은 제한없이, 표 4A에 기재된 어느 하나 이상을 포함하여, 유전 질환 및/또는 유전적 측면 및/또는 후생적 측면을 갖는 것을 포함한, 하나 이상의 질환과 연관된 하나 이상의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 본 명세서에 열거된 질환 및 관련 유전자는 완전하지 않고 제한적이지 않음을 이해할 것이다. 추가 일부 유전자가 다수 질환의 발생에서 역할을 한다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템 또는 이의 성분은 하나 이상의 세포 기능과 연관된 하나 이상의 유전자, 예컨대 표 4B 에서 언급된 것 임의의 하나 이상을 개질함으로써 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 질환은 유전 질환 또는 장애이다. 구현예 중 일부에서, 조성물, 시스템 또는 이의 성분은 하나 이상의 유전 질환, 예컨대 표 4B 에서 언급된 것 임의의 것과 연관된 하나 이상의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 개질할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에서 유전 질환의 개별화 또는 개인화 치료 방법을 제공한다: (a) 조직, 장기, 세포 또는 포유동물의의 세포(들)에, 상기 구현예 중 어느 하나의 입자 전달 시스템 또는 전달 시스템 또는 바이러스 입자 또는 상기 구현예 중 어느 하나의 세포를 포함하는 조성물의 전달을 포함하여, 하나 이상의 돌연변이를 생체외에서 조직, 장기 또는 세포주에, 또는 생체내에서 유전자이식 비-인간 동물에 도입시키는 단계로서, 특이적 돌연변이 또는 정확한 서열 치환은 유전 질환과 상관있거나 또는 상관된 것인 단계; (b) 유전 질환과 상관있는 특이적 돌연변이 또는 정확한 서열 치환을 갖는 것인 벡터가 전달된 세포에서 유전 잘환에 대한 치료(들)를 시험하는 단계; ?? (c) 단계 (b)의 치료(들)의 시험 결과를 기반으로 대상체를 치료하는 단계.
감염성 질환
일 구현예에서, 조성물, 시스템(들) 또는 이의 성분(들)은 미생물, 예컨대 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충, 또는 이의 조합에 의해 유발되는 감염성 질환을 진단, 예후, 치료, 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 시스템(들) 또는 이의 성분(들)은 혼합 개체군 내에서 특이적 미생물을 표적화할 수 있다. 이러한 기술의 예시적인 방법은 예를 들어, 하기 문헌에 기술되어 있고, 이의 교시는 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템 및 성분과 함께 사용을 위해 적합화될 수 있다: Gomaa AA, Klumpe HE, Luo ML, Selle K, Barrangou R, Beisel CL. 2014. Programmable removal of bacterial strains by use of genome-targeting composition, systems, mBio 5:e00928-13; Citorik RJ, Mimee M, Lu TK. 2014. Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided nucleases. Nat Biotechnol 32:1141-1145.
일 구현예에서, 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분은 병원성 및/또는 약물-내성 미생물, 예컨대 박테리아, 바이러스, 기생충, 및 진균을 치료할 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분은 병원성 미생물의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 표적화하여 변형시킬 수 있어서, 미생물이 덜 병독성이거나, 사멸되거나, 억제되거나, 또는 달리 숙주 세포에서 질환 유발 및/또는 감염 및/또는 복제를 할 수 없게 만든다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분(들)에 의해 표적화 및/또는 변형될 수 있는 병원성 박테리아는 하기 속의 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 악티노마이세스 (Actinomyces) (예를 들어, 에이. 이스라엘리 (A. israelii)), 바실러스 (Bacillus) (예를 들어, 비. 안트라시스 (B. anthracis), 비. 세레우스 (B. cereus)), 박테로이데스 (Bactereoides) (예를 들어, 비. 프라질리스 (B. fragilis)), 바르토넬라 (Bartonella) (비. 헨셀라에 (B. henselae), 비. 퀸타나 (B. quintana)), 보르데텔라 (Bordetella) (비. 퍼투시스 (B. pertussis)), 보렐리아 (Borrelia) (예를 들어, 비. 부르그도르페리 (B. burgdorferi, B. garinii), 비. 아프젤리 (B. afzelii), 및 비. 레쿠레엔티스 (B. recurreentis)) 브루셀라 (Brucella) (예를 들어, 비. 아보르투스 (B. abortus), 비. 카니스 (B. canis), 비. 멜리텐시스 (B. melitensis), 및 비. 수이스 (B. suis)), 캄필로박터 (Campylobacter) (예를 들어, 씨. 제주니 (C. jejuni)), 클라미디아 (Chlamydia) (예를 들어, 씨. 뉴코니아에 (C. pneumoniae) 및 씨. 트라코마티스 (C. trachomatis)), 클라미도필라 (Chlamydophila) (예를 들어, 씨. 프시트시 (C. psittaci)), 클로스트리듐 (Clostridium) (예를 들어, 씨. 보툴리늄 (C. botulinum), 씨. 디피실 (C. difficile), 씨. 퍼프린젠스, (C. perfringens), 씨. 테타니 (C. tetani)), 코리네박테리움 (Corynebacterium) (예를 들어, 씨. 디프테리아에 (C. diptheriae)), 엔테로코쿠스 (Enterococcus) (예를 들어, 이. 프라에칼리스 (E. Faecalis), 이. 패시움 (E. faecium)), 에르리키아 (Ehrlichia) (이. 카니스 (E. canis) 및 이. 카펜시스 (E. chaffensis)), 에스케리치아 (Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)), 프람시셀라 (Francisella) (예를 들어, 에프. 투랄렌시스 (F. tularensis)), 해모필루스 (Haemophilus) (예를 들어, 에이치. 인플루엔자에 (H. influenzae)), 헬리코박터 (Helicobacter) (에이치. 파일로리 (H. pylori)), 클렙시엘라 (Klebsiella) (예를 들어, 케이. 뉴모니아에 (K. pneumoniae)), 레지오넬라 (Legionella) (예를 들어, 엘. 뉴모필라 (L. pneumophila)), 렙토스피라 (Leptospira) (예를 들어, 엘. 인테로간스 (L. interrogans), 엘. 산타로사이 (L. santarosai), 엘. 웨일리 (L. weilii), 엘. 노구치 (L. noguchii)), 리스테레이아 (Listereia) (예를 들어, 엘. 모노시토게에네스 (L. monocytogeenes)), 마이코박테리움 (Mycobacterium) (예를 들어, 엠. 레프라에 (M. leprae), 엠. 튜버큘로시스 (M. tuberculosis), 엠. 울세란스 (M. ulcerans), 마이코플라스마 (Mycoplasma) (엠. 뉴모니아에 (M. pneumoniae)), 네이세리아 (Neisseria) (엔. 고노로에아에 (N. gonorrhoeae) 및 엔. 메닌지티디스 (N. menigitidis), 노카르디아 (Nocardia) (예를 들어, 엔. 아스테레로이데스 (N. asteeroides)), 슈도모나스 (Pseudomonas) (피. 애루지노사 (P. aeruginosa)), 리켓치아 (Rickettsia) (알. 리켓치아 (R. rickettsia)), 살모넬라 (Salmonella) (에스. 티피 (S. typhi) 및 에스. 티피뮤리움 (S. typhimurium)), 시겔라 (Shigella) (에스. 손네이 (S. sonnei) 및 에스 디센테리아에 (S. dysenteriae), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) (에스. 아우레우스 (S. aureus), 에스. 에피더미디스 (S. epidermidis), 및 에스. 사프로피티쿠스 (S. saprophyticus), 스트렙토코쿠스 (Streeptococcus) (에스. 아갈락티아에 (S. agalactiaee), 에스. 뉴모니아에 (S. pneumoniae), 에스. 피오게네스 (S. pyogenes)), 트레포네마 (Treponema) (ㅌ. 팔리둠 (T. pallidum)), 우레에아플라스마 (Ureeaplasma) (예를 들어, 유. 우레알리티쿰 (U. urealyticum)), 비브리오 (Vibrio) (예를 들어, 브이. 콜레라에 (V. cholerae)), 여시니아 (Yersinia) (예를 들어, 와이. 페스티스 (Y. pestis), 와이, 엔테로콜리티카 (Y. enteerocolitica), 및 와이 슈도튜버큘로시스 (Y. pseudotuberculosis)).
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분(들)으로 표적화 및/또는 변형될 수 있는 병원성 바이러스는 이중 가닥 DNA 바이러스, 부분 이중 가닥 DNA 바이러스, 단일 가닥 DNA 바이러스, 양성 단일 가닥 RNA 바이러스, 음성 단일 가닥 RNA 바이러스, 또는 이중 가닥 RNA 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 병원성 바이러스 하기 바이러스 과 유래일 수 있다: 아데노비리다에 (예를 들어, 아데노바이러스), 헤르페스비리다에 (예를 들어, 헤르페스 심플렉스, 1형, 헤르페스 심플렉스, 2형, 바리셀라-조스터 바이러스, 엡스테인-바 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스, 8형), 파필로마비리다에 (예를 들어, 인간 파필로마바이러스), 폴리오마비리다에 (예를 들어, BK 바이러스, JC 바이러스), 폭스비리다에 (예를 들어, 천연두), 헤파드나비리다에 (예를 들어, B형 간염), 파르보비리다에 (예를 들어, 파르보바이러스 B19), 아스트로비리다에 (예를 들어, 인간 아스트로바이러스), 칼리시비리다에 (예를 들어, 노르워크 바이러스), 피코르나비리다에 (예를 들어, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스), 코로나비리다에 (예를 들어, 중증 급성 호흡기 증후군-관련 코로나바이러스, 균주: 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, 중증 급성 호흡기 바이러스 코로나바이러스 2 (COVID-19)), 플라비비리다에 (예를 들어, C형 간염 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일바이러스, TBE 바이러스), 토가비리다에 (예를 들어, 루벨라 바이러스), 헤페비리다에 (예를 들어, E형 간염 바이러스), 레트로비리다에 (인간 면역결핍 바이러스 (HIV)), 오르토믹소비리다에 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 아레나비리다에 (예를 들어, 라싸 바이러스), 부니야비리다에 (예를 들어, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 한탄 바이러스), 필로비리다에 (예를 들어, 에볼라 바이러스 및 마르부르그 바이러스), 파라믹소비리다에 (예를 들어, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스), 라브도비리다에 (공수병 바이러스), D형 간염 바이러스, 레오비리다에 (예를 들어, 로타바이러스, 오르비바이러스, 콜티바이러스, 반나 바이러스).
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분(들)으로 표적화 및/또는 변형될 수 있는 병원성 진균은 하기 속의 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 칸디다 (Candida) (예를 들어, 씨. 알비칸스 (C. albicans)), 아스퍼질러스 (Aspergillus) (예를 들어, 에이. 푸미가투스 (A. fumigatus), 에이. 플라부스 (A. flavus), 에이. 클라바투스 (A. clavatus)), 크립토코쿠스 (Cryptococcus) (예를 들어, 씨. 네오포르만스 (C. neoformans), 씨. 가티 (C. gattii)), 히스토플라스마 (Histoplasma) (에??. 캅술라툼 (H. capsulatum)), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) (예를 들어, 피. 지로비이시 (P. jiroveecii)), 스타키포트리스 (Stachybotrys) (예를 들어, 에스. 카르타룸 (S. chartarum)).
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분(들)으로 표적화 및/또는 변형될 수 있는 병원성 기생충은 원충, 연충 및 외부 기생충을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분(들)으로 표적화 및/또는 변형될 수 있는 병원성 원충은 사르코디나 (Sarcodina) (예를 들어, 아메바 (ameba) 예컨대 엔타메바 ( Entamoeba)), 마스티고포라 (Mastigophora) (예를 들어, 플라젤라테스 (flagellates) 예컨대 지아르디아 (Giardia) 및 리슈마니아 (Leishmania)), 실로포라 (Cilophora) (예를 들어, 실리아테스 (ciliates) 예컨대 발란티둠 (Balantidum)), 및 스포로조아 (sporozoa) (예를 들어, 플라스모듐 (plasmodium) 및 크립토스포리듐 (cryptosporidium))의 군으로부터의 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분(들)으로 표적화 및/또는 변형될 수 있는 병원성 연충은 편평동물 (플라티헬민스 (platyhelminths)), 가시 머리 벌레 (아칸토세에팔린스 (acanthoceephalins)), 및 회충 (네마토데스 (nematodes))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분(들)으로 표적화 및/또는 변형될 수 있는 병원성 외부기생충은 진드기 벼룩, 이, 및 응애를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분(들)으로 표적화 및/또는 변형될 수 있는 병원성 기생충은 하기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 아칸사메바 (Acanthamoeba) spp., 발라무티아 만드릴라리스 (Balamuthia mandrillaris), 바베시오시스 (Babesiosis) spp. (예를 들어, 바베시아 (Babesia), 비. 디버젠스 (B. divergens), 비. 비게미나 (B. bigemina), 비. 에쿠이 (B. equi), 비. 미크로프티 (B. microfti), 비. 둔카니 (B. duncani)), 발란티디아시스 (Balantidiasis) spp. (예를 들어, 발란티디움 콜라이 (Balantidium coli)), 블라스토시스티스 (Blastocystis) spp., 크립토스포리듐 (Cryptosporidium) spp., 사이클로스포리아시스 (Cyclosporiasis) spp. (예를 들어, 사이클로스포라 카이에타넨시스 (Cyclospora cayetanensis)), 디엔타메비아시스 (Dientamoebiasis) spp. (예를 들어, 디엔타메바 프라질리스 (Dientamoeba fragilis)), 아메비아시스 (Amoebiasis) spp. (예를 들어, 엔타메바 히스토릴리카 (Entamoeba histolytica)), 지아르디아시스 (Giardiasis) spp. (예를 들어, 지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia)), 이소스포리아시스 (Isosporiasis) spp. (예를 들어, 이소스포라 벨리 (Isospora belli)), 리슈마니아 (Leishmania) spp., 내글레리아 (Naegleria) spp. (예를 들어, 내글레리아 파울러리 (Naegleria fowleri)), 플라스모듐 (Plasmodium) spp. (예를 들어, 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발레 쿠르티시 (Plasmodium ovale curtisi), 플라소듐 오발레 왈리케리 (Plasmodium ovale wallikeri), 플라스모듐 말라리아에 (Plasmodium malariae), 플라스모듐 노울레시 (Plasmodium knowlesi), 리노스포리디오시스 (Rhinosporidiosis) spp. (예를 들어, 리노스포리듐 시베리 (Rhinosporidium seeberi)), 사르코시스토시스 (Sarcocystosis) spp. (예를 들어, 사르코시스티스 보비호미니스 (Sarcocystis bovihominis), 사르코시스티스 수이호미니스 (Sarcocystis suihominis)), 톡소플라스마 (Toxoplasma) spp. (예를 들어, 톡소플라스미 곤디 (Toxoplasma gondii)), 트리코모나스 (Trichomonas) spp. (예를 들어, 트리코모나스 바지날리스 (Trichomonas vaginalis)), 트리파노소마 (Trypanosoma) spp. (예를 들어, 트리파소노마 브루세이 (Trypanosoma brucei), 트리파노소마 (Trypanosoma) spp. (예를 들어, 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi)), 촌충 (Tapeworm) (예를 들어, 세스토다 (Cestoda), 타에니 멀티셉스 (Taenia multiceps), 타에니 사기나타 (Taenia saginata), 타에니 솔리움 (Taenia solium)), 디필로보트리움 라툼 (Diphyllobothrium latum) spp., 에키노코쿠스 (Echinococcus) spp. (예를 들어, 에키노코쿠스 그라눌로수스 (Echinococcus granulosus), 에키노코쿠스 멀티로쿨라리스 (Echinococcus multilocularis), 이. 보겔리 (E. vogeli), 이. 올리가르트루스 (E. oligarthrus)), 하이메놀레피스 (Hymenolepis) spp. (예를 들어, 하이메놀레피스 나나 (Hymenolepis nana), 하이메놀레피스 디미누타 (Hymenolepis diminuta), 베르티엘라 (Bertiella) spp. (예를 들어, 베르티엘라 무크로나타 (Bertiella mucronata), 베르티엘라 스투데리 (Bertiella studeri)), 스피로메트라 (Spirometra) (예를 들어, 스피로메트라 에리나세이에우로파에이 (Spirometra erinaceieuropaei)), 클로노르키스 (Clonorchis) spp. (예를 들어, 클로노르키스 시넨시스 (Clonorchis sinensis); 클로노르키스 비베리니 (Clonorchis viverrini), 디크로코엘리움 (Dicrocoelium) spp. (예를 들어, 디크로코엘리움 덴드리티쿰 (Dicrocoelium dendriticum)), 파시올라 (Fasciola) spp. (예를 들어, 파시올라 헤파티카 (Fasciola hepatica), 파시올라 기간티카 (Fasciola gigantica)), 파시올롭시스 (Fasciolopsis) spp. (예를 들어, 파시올롭시스 부스키 (Fasciolopsis buski)), 메타고니무스 (Metagonimus) spp. (예를 들어, 메타고니무스 요코가와 (Metagonimus yokogawai)), 메토르키스 (Metorchis) spp. (예를 들어, 메토르키스 콘준투스 (Metorchis conjunctus)), 오피스토르키스 (Opisthorchis) spp. (예를 들어, 오피스토르키스 비베리니 (Opisthorchis viverrini), 오피스토르키스 펠리네우스 (Opisthorchis felineus)), 클로노르키스 (Clonorchis) spp. (예를 들어, 클로노르키스 시넨시스 (Clonorchis sinensis)), 파라고니무스 (Paragonimus) spp. (예를 들어, 파라고니무스 웨스테르마니 (Paragonimus westermani); 파라고니무스 아프리카누스 (Paragonimus africanus); 파라고니무스 칼리엔시스 (Paragonimus caliensis); 파라고니무스 켈리코티 (Paragonimus kellicotti); 파라고니무스 스크르자비니 (Paragonimus skrjabini); 파라고니무스 우테로빌라테랄리스 (Paragonimus uterobilateralis)), 스키스토소마 (Schistosoma) sp., 스키스토소마 (Schistosoma) spp. (예를 들어, 스키스토소마 만소니 (Schistosoma mansoni), 스키스토소마 해마토비움 (Schistosoma haematobium), 스키스토소마 자포니쿰 (Schistosoma japonicum), 스키스토소마 메콘기 (Schistosoma mekongi), 및 스키스토소마 인테르칼라툼 (Schistosoma intercalatum)), 이케노스토마 (Echinostoma) spp. (예를 들어, 아, 애키나툼 (E. echinatum)), 트리코빌하르지아 (Trichobilharzia) spp. (예를 들어, 트리코빌하르지아 레겐트 (Trichobilharzia regent)), 안시클로스토마 (Ancylostoma) spp. (예를 들어, 안시클로스토마 듀오데날레 (Ancylostoma duodenale)), 네카토르 (Necator) spp. (예를 들어, 네카토르 아메리카누스 (Necator americanus)), 안지오스트론길루스 (Angiostrongylus) spp., 아니사키스 (Anisakis) spp., 아스카리스 (Ascaris) spp. (예를 들어, 아스카리스 룸브리코이데스 (Ascaris lumbricoides)), 바일리사스카리스 (Baylisascaris) spp. (예를 들어, 바일리사스카리스 프로시오니스 (Baylisascaris procyonis)), 브루기아 (Brugia) spp. (예를 들어, 브루기아 말라이 (Brugia malayi), 브루기아 티모리 (Brugia timori)), 디옥토피메 (Dioctophyme) spp. (예를 들어, 디오토피메 레날레 (Dioctophyme renale)), 드라쿤쿨루스 (Dracunculus) spp. (예를 들어, 트라쿤쿨루스 메디넨시스 (Dracunculus medinensis)), 엔테로비우스 (Enterobius) spp. (예를 들어, 엔테로비우스 버미쿨라리스 (Enterobius vermicularis), 엔테로비우스 그레고리 (Enterobius gregorii), 그나토스토마 (Gnathostoma) spp. (예를 들어, 그나토스토마 스피니게룸 (Gnathostoma spinigerum), 그나토스토마 히스피둠 (Gnathostoma hispidum)), 할리세팔로부스 (Halicephalobus) spp. (예를 들어, 하리세팔로부스 진지발리스 (Halicephalobus gingivalis), 로아 로아 (Loa loa) spp. (예를 들어, 로아 로아 필라리아 (Loa loa filaria)), 만소넬라 (Mansonella) spp. (예를 들어, 만소넬라 스트렙토세르카 (Mansonella streptocerca)), 온코세르카 (Onchocerca) spp. (예를 들어, 온코세르카 볼불루스 (Onchocerca volvulus)), 스트론길로이데스 (Strongyloides) spp. (예를 들어, 스트론길로이데스 스테르코랄리스 (Strongyloides stercoralis)), 텔라지아 (Thelazia) spp. (예를 들어, 텔라지아 칼리포르니엔시스 (Thelazia californiensis), 텔라지아 칼리파에다 (Thelazia callipaeda)), 톡소카라 (Toxocara) spp. (예를 들어, 톡소카라 카니스 (Toxocara canis), 톡소카라 카티 (Toxocara cati), 톡사스카리스 레오니네 (Toxascaris leonine)), 트리키넬라 (Trichinella) spp. (예를 들어, 트리키넬라 스피랄리스 (Trichinella spiralis), 트리키넬라 브리토비 (Trichinella britovi), 트리키넬라 넬소니 (Trichinella nelsoni), 트리키넬라 나티바 (Trichinella nativa)), 트리쿠리스 (Trichuris) spp. (예를 들어, 트리쿠리스 트리키우라 (Trichuris trichiura), 트리쿠리스 불피스 (Trichuris vulpis)), 우케레리아 (Wuchereria) spp. (예를 들어, 우케레리아 반크로프티 (Wuchereria bancrofti)), 더마토비아 (Dermatobia) spp. (예를 들어, 더마토비아 호미니스 (Dermatobia hominis)), 툰가 (Tunga) spp. (예를 들어, 툰가 페네트란스 (Tunga penetrans)), 콜클리오미이아 (Cochliomyia) spp. (예를 들어, 코클리오미아 호미니보락스 (Cochliomyia hominivorax)), 린구아툴라 (Linguatula) spp. (예를 들어, 린구아툴라 세라타 (Linguatula serrata)), 아키아칸토세팔라 (Archiacanthocephala) sp., 모닐리포르미스 (Moniliformis) sp. (예를 들어, 모닐리포르미스 모닐리포르미스 (Moniliformis moniliformis)), 페디쿨루스 (Pediculus) spp. (예를 들어, 페디쿨루스 휴마누스 카피티스 (Pediculus humanus capitis), 페디쿨루스 휴마누스 휴마누스 (Pediculus humanus humanus)), 프티루스 (Pthirus) spp. (예를 들어, 프티루스 푸비스 (Pthirus pubis)), 아라크니다 (Arachnida) spp. (예를 들어, 트롬비쿨리다에 (Trombiculidae), 익소디다에 (Ixodidae), 아르가시데 (Argaside)), 시포납테라 (Siphonaptera) spp (예를 들어, 시포납테라 (Siphonaptera): 풀리시나에 (Pulicinae)), 시미시다에 (Cimicidae) spp. (예를 들어, 시멕스 렉툴라리우스 (Cimex lectularius) 및 시멕스 헤미프테루스 (Cimex hemipterus)), 디프테라 (Diptera) spp., 데모덱스 (Demodex) spp. (예를 들어, 데모덱스 폴리쿨로룸/브레비스/카니스 (Demodex folliculorum/brevis/canis)), 사르콥테스 (Sarcoptes) spp. (예를 들어, 사르콥테스 스카비에이 (Sarcoptes scabiei)), 더마니수스 (Dermanyssus) spp. (예를 들어, 더마니수스 갈리나에 (Dermanyssus gallinae)), 오르니토니수스 (Ornithonyssus) spp. (예를 들어, 오르니토니수스 실비아룸 (Ornithonyssus sylviarum), 오르니토니수스 부르사 (Ornithonyssus bursa), 오르니토니수스 바코티 (Ornithonyssus bacoti)), 라엘랍스 (Laelaps) spp. (예를 들어, 라엘랍스 에키드니나 (Laelaps echidnina)), 리포니소이데스 (Liponyssoides) spp. (예를 들어, 리포니소이데스 산귀네우스 (Liponyssoides sanguineus)).
일 구현예에서 유전자 표적은 하기 문헌의 표 1에 기재된 임의의 것들일 수 있고, 그 전체로 본 명세서에 표시된 대로 본 명세서에 편입된다: Strich and Chertow, 2019. J. Clin. Microbio. 57:4 e01307-18.
일 구현예에서, 방법은 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분을 본 명세서에 기술된 병원성 유기체에 전달하여서, 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분이 병원성 유기체의 하나 이상의 표적에 특이적으로 결합하고 그를 변형시켜서, 변형이 병원성 유기체의 병원성을 사멸, 억제, 감소시키거나, 또는 달리 병원원 유기체를 비-병원성으로 만들게 하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템의 전달은 생체내에서 (즉, 치료되는 대상체에서) 일어난다. 일 구현예에서 대상체에 대해 비병원성이지만 폴리뉴클레오티드를 전달할 수 있고/있거나 병원성 미생물을 감염시킬 수 있는 미생물 또는 파지와 같은 매개체에 의해 발생한다. 일 구현예에서, 중간 미생물은 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분(들) 및/또는 벡터 및/또는 벡터 시스템을 함유하는 조작된 박테리아, 바이러스 또는 파지일 수 있다. 방법은 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분(들) 및/또는 벡터 및/또는 벡터 시스템을 함유하는 중간체 미생물을 치료하려는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 중간체 미생물은 이어서 조성물 및/또는 이의 성분을 생산하거나 또는 조성물, 시스템, 폴리뉴클레오티드를 병원성 유기체에 전달될 수 있다. 구현예에서, 조성물 및/또는 이의 성분, 벡터, 또는 벡터 시스템이 병원성 미생물에 전달되는 경우에, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분은 병원성 미생물에서 생산되어 병원성 미생물을 변형시켜서, 덜 병독성이거나, 사멸시키거나, 억제시키거나, 또는 달리 숙주 또는 이의 세포에서 질환을 유발 및/또는 감염 및/또는 복제할 수 없게 만든다.
일 구현예에서, 병원성 미생물이 이의 유전 물질을 숙주 (예를 들어, 바이러스) 세포의 게놈에 삽입시키는 경우, 조성물, 시스템은 바이러스 DNA 또는 cDNA 가 숙주 세포의 기구에 의해서 기능성 바이러스로 복제될 수 없도록 숙주의 게놈을 변형시키기 위해 디자인될 수 있다. 일 구현예에서, 병원성 미생물이 숙주 세포 (예를 들어, 바이러스)의 게놈에 이의 유전 물질을 삽입시키는 경우에, 조성물, 시스템은 바이러스 DNA 또는 cDNA가 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되도록 숙주 세포의 게놈을 변형시키기 위해 디자인될 수 있다.
병원성 미생물의 억제 또는 사멸은, 대상체에서 이의 감염이 유발하는 질환 및/또는 병태를 치료할 수 있거나 또는 예방할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 명세서에 기술된 것과 같은 임의의 하나 이상의 병원성 미생물에 의해 유발되는 하나 이상의 질병 또는 이의 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법이 또한 제공된다.
미토콘드리아 질환
가장 도전적인 미토콘드리아 장애 중 일부는 미토콘드리아 DNA의 돌연변이 (mtDNA)로서, 모계 유전되는 고카피 수 게놈에서 발현된다. 일 구현예에서, mtDNA 돌연변이는 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템을 사용해 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 진단, 예후, 치료, 및/또는 예방되는 미토콘드리아 질환은 MELAS (미토콘드리아 근병증 뇌병증, 및 락트산증 및 뇌졸중 유사 에피소드), CPEO/PEO (만성 진행성 외안근마비 증후군/ 진행성 외안근병, KSS (컨스-세이어 증후군), MIDD (모계 유전 당뇨병 및 난청), MERRF (불균일 적색 섬유와 관련된 근간대성 간질), NIDDM (비인슐린 의존성 진성 당뇨병), LHON (레베르 유전성 시신경병증), LS (레이 증후군) 아미노글리코시드 유도된 청력 장애, NARP (신경병증, 운동실조 및 색소성 망막병증), 무운동경직을 동반한 추체외로 장애, 정신병, 및 비증후군성 청력 상실, 심근병증, 뇌근병증, 피어슨 증후군, 또는 이의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, 대상체의 mtDNA 는 생체내 또는 생체외에서 변형될 수 있다. 일 구현예에서, mtDNA 가 생체외에서 변형되는 경우에, 변형 후에 변형된 미토콘드리아를 함유하는 세포는 다시 대상체에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분은 mtDNA 돌연변이, 또는 이의 조합을 교정할 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 mtDNA 돌연변이 중 적어도 하나는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: A3243G, C3256T, T3271C, G1019A, A1304T, A15533G, C1494T, C4467A, T1658C, G12315A, A3421G, A8344G, T8356C, G8363A, A13042T, T3200C, G3242A, A3252G, T3264C, G3316A, T3394C, T14577C, A4833G, G3460A, G9804A, G11778A, G14459A, A14484G, G15257A, T8993C, T8993G, G10197A, G13513A, T1095C, C1494T, A1555G, G1541A, C1634T, A3260G, A4269G, T7587C, A8296G, A8348G, G8363A, T9957C, T9997C, G12192A, C12297T, A14484G, G15059A, 위치 305-314 및/또는 956-965에서 CCCCCTCCCC-직렬 (SEQ ID NO: 64,307) 반복부의 중복, 8,469-13,447, 4,308-14,874, 및/또는 4,398-14,822으로부터의 위치에 결실, 961ins/delC, 미토콘드리아 공통 결실 (예를 들어, mtDNA 4,977 bp 결실), 및 이의 조합.
일 구현예에서, 미토콘드리아 돌연변이는 mitomap.org 에서 입수가능한 Mitomap에서 입수할 수 있는 하나 이상의 생물정보학적 도구의 사용을 통해서 확인되거나 또는 그에 기재된 바와 같은 임의 돌연변이일 수 있다. 이러한 도구는 "Variant Search, aka Market Finder", Find Sequencess for Any Haplogroup, 또한 "Sequence Finder", "Variant Info", "POLG Pathogenicity Prediction Server", "MITOMASTER", "Allele Search", "equence and Variant Downloads", "Data Downloads"를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. MitoMap 은 질환과 연관될 수 있는 mtDNA의 돌연변이 보고서를 함유하고 보고된 미토콘드리아 DNA 염기 치환 질환s: rRNA/tRNA 돌연변이의 데이터베이스를 유지한다.
일 구현예에서, 방법, 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분을 세포, 보다 특히 세포의 하나 이상의 미토콘드리아를 전달하여, 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분이 세포, 보다 특히 세포에서 하나 이상의 미트콘드리아를 변형시킬 수 있게 하는 단계를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 어느 하나 이상같은 mtDNA의 돌연변이에 상응할 수 있다. 일 구현예에서, 변형은 미토콘드리아의 기능을 변경시켜서 미토콘드리아가 정상적으로 기능하거나 또는 비변형된 미토콘드리아와 비교하여 적어도 덜 기능이상이게 된다. 변형은 생체내 또는 생체외에서 일어날 수 있다. 변형이 생체외에서 수행되는 경우에, 변형된 미토콘드리아를 함유하는 세포는 자기유래 또는 동종이계 방식으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.
마이크로바이옴 변형
마이크로바이옴은 건강 및 질환에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 장내 마이크로바이옴은 소화를 제어하고, 병원성 미생물의 성장을 방지하여 건강에서 역할을 할 수 있고, 감정 및 기분에 영향을 미칠 수 있다고 제안되었다. 불균형한 마이크로바이옴은 질환을 촉진할 수 있고, 체중 증가, 비조절 혈당, 고콜레스테롤, 암 및 다른 장애의 원인이 되는 것으로 제안된다. 건강한 마이크로바이옴은 건강하지 않는 개체와 구별될 수 있는 일련의 관절 특징을 가지며, 따라서, 질환-연관된 마이크로바이옴의 검출 및 확인은 개체에서 질환을 진단하고 검출하는데 사용될 수 있다. 조성물, 시스템, 및 이의 성분은 마이크로바이옴 세포 개체군을 스크리닝하는데 사용될 수 있고 질환 연관된 마이크로바이옴을 확인하는데 사용될 수 있다. 조성물, 시스템, 및 이의 성분을 이용하는 세포 스크리닝 방법은 본 명세서의 다른 곳에 기술되어 있고, 대상체의, 마이크로바이옴, 예컨대 장, 피부, 질, 및/또는 구강 마이크로바이옴을 스크리닝하는데 적용될 수 있다.
일 구현예에서, 대상체에서 마이크로바이옴의 미생물 개체군은 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템 및/또는 이의 성분을 사용해 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분은 마이크로바이옴에서 하나 이상의 세포 유형을 확인 및 선택하고, 마이크로바이옴 개체군으로부터 그들을 제거하는데 사용될 수 있다. 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분을 사용하여 세포를 선택하는 예시적인 방법이 본 명세서의 다른 곳에 기술된다. 이러한 방식으로, 마이크로바이옴의 구성 또는 미생물 프로파일이 변경될 수 있다. 일 구현예에서, 변경은 질환 마이크로바이옴 조성에서 건강한 마이크로바이옴 조성으로의 변화를 유발한다. 이러한 방식으로, 한 유형 또는 종의 미생물 대 다른 것의 비율, 예컨대 질환 비율 대 건강 비율같이, 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 선택되는 세포는 병원성 미생물이다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기술되는 조성물 및 시스템은 대상체에서 마이크로바이옴의 미생물의 폴리뉴클레오티드를 변형시키는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 미생물은 병원성 미생물이다. 일 구현예에서, 미생물은 공생 및 비-병원성 미생물이다. 대상체의 세포에서 폴리뉴클레오티드의 변형 방법은 본 명세서의 다른 곳에 기술되고 이들 구현예에 적용될 수 있다.
질환 및 병태의 모델
일 양태에서, 본 발명은 이의 발현을 위해 조성물을 작동적으로 코딩하는 하나 이상의 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터 시스템을 포함하는 비-천연 발생 또는 조작된 조성물을 포함하는 상기 게놈 유전자좌의 코딩, 비-코딩 또는 조절 구성요소 내 표적 서열의 조작을 포함하는 진핵생물 유기체 또는 비-인간 유기체에서 게놈 유전자와 연관된 질환을 모델링하는 방법을 제공하고, 조성물은 상기 구현예 중 어느 하나의 입자 전달 시스템 또는 전달 시스템 또는 바이러스 입자 또는 상기 구현예 중 어느 하나의 세포를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 돌연변이된 질환 유전자 및/또는 감염성 미생물을 포함하는 모델 진핵생물 세포 및/또는 감염성 미생물을 생성시키는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 질환 유전자는 질환을 갖거나 또는 발생될 위험성의 증가와 연관된 임의 유전자이다. 일 구현예에서, 방법은 (a) 하나 이상의 벡터를 진핵생물 세포로 도입시키는 단계로서, 하나 이상의 벡터는 조성물, 시스템, 및/또는 핵산 성분 분자 서열, 하나 이상의 TnpB 폴리펩티드, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분의 발현을 구동할 수 있는 벡터 또는 벡터 시스템을 포함하는 것인 단계, 및 (b) 조성물, 시스템, 또는 복합체가 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하여서, 예를 들어, 상기 질환 유전자 내 표적 폴리뉴클레오티드의 절단, 닉형성, 또는 다른 변형을 실시하게 하는 단계로서, 조성물, 시스템, 또는 복합체는 (1) 표적 폴리뉴클레오티드(들) 내 표적 서열(들)에 혼성화하는 하나 이상의 핵산 성분 분자 서열, 및 임의로 (2) 핵산 성분 스캐폴드 서열(들)과 복합체를 형성하는 하나 이상의 TnpB 폴리펩티드로 구성되어서, 하나 이상의 돌연변이된 질환 유전자(들)를 포함하는 모델 진핵생물 세포를 생성시키는 것인 단계를 포함한다. 따라서, 일 구현예에서 조성물 및 시스템은 TnpB 폴리펩티드, 핵산 성분 분자 서열 및/또는 상동성 재조합 주형 및/또는 TnpB 폴리펩티드가 탈안정화 도메인을 갖는 경우 안정화 리간드 중 하나 이상에 대한 핵산 분자를 함유하고 그의 발현을 구동시킨다. 일 구현예에서, 상기 절단은 TnpB 폴리펩티드에 의해서 표적 서열의 위치에서 하나 또는 2개 가닥의 절단을 포함한다. 일 구현예에서, 닉형성은 TnpB 폴리펩티드에 의해서 표적 서열의 위치에서 하나 또는 2개 가닥의 닉형성을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 절단 또는 닉형성은 표적 폴리뉴클레오티드의 변형된 전사를 일으킨다. 일 구현예에서, 변형은 표적 폴리뉴클레오티드의 감소된 전사를 일으킨다. 일 구현예에서, 방법은 재조합 주형 폴리뉴클레오티드과 상동성 재조합에 의해서 상기 절단 또는 닉형성된 표적 폴리뉴클레오티드를 복구하는 단계를 더 포함하고, 상기 복구는 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하는 돌연변이를 일으킨다. 일 구현예에서, 상기 돌연변이는 표적 서열을 포함하는 유전자로부터 단백질 발현의 하나 이상의 아미노산 변화를 일으킨다.
모델링된 질환은 유전적 또는 후생적 성분을 갖는 임의 질환일 수 있다. 일 구현예에서, 모델링된 질환은 본 명세서의 다른 곳에 논의된 바와 같은 어느 것일 수 있다.
제자리 질환 검출
조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분은 하기와 같은 진단 검출 방법에서 사용될 수 있고, 하기 모든 문헌은 그들 전체로 표시된 대로 참조로 본 명세서에 편입되고, 이의 교시는 본 명세서의 설명 관점에서 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 및 이의 성분에 적합화될 수 있다: CASFISH (참조: 예를 들어, Deng et al. 2015. PNAS USA 112(38): 11870-11875), CRISPR-Live FISH (참조: 예를 들어, Wang et al. 2020. Science; 365(6459):1301-1305), sm-FISH (Lee and Jefcoate. 2017. Front. Endocrinol. doi.org/10.3389/fendo.2017.00289), 순차적 FISH CRISPRainbow (Ma et al. Nat Biotechnol, 34 (2016), pp. 528-530), CRISPR-Sirius (Nat Methods, 15 (2018), pp. 928-931), Casilio (Cheng et al. Cell Res, 26 (2016), pp. 254-257), Halo-태그 기반 게놈 유전자좌 가시화 기술 (예를 들어, Deng et al. 2015. PNAS USA 112(38): 11870-11875; Knight et al., Science, 350 (2015), pp. 823-826), RNA-압타머 기반 방법 (예를 들어, Ma et al., J Cell Biol, 214 (2016), pp. 529-537), 분자-비콘 기반 방법 (예를 들어, Zhao et al. Biomaterials, 100 (2016), pp. 172-183; Wu et al. Nucleic Acids Res (2018)), 퀀텀 도트-기반 시스템 (예를 들어, Ma et al. Anal Chem, 89 (2017), pp. 12896-12901), 다중화 방법 (예를 들어, Ma et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 112 (2015), pp. 3002-3007; Fu et al. Nat Commun, 7 (2016), p. 11707; Ma et al. Nat Biotechnol, 34 (2016), pp. 528-530; Shao et al. Nucleic Acids Res, 44 (2016), Article e86); Wang et al. Sci Rep, 6 (2016), p. 26857), 및 다른 제자리 CRISPR-혼성화 기반 방법 (예를 들어, Chen et al. Cell, 155 (2013), pp. 1479-1491; Gu et al. Science, 359 (2018), pp. 1050-1055; Tanebaum et al. Cell, 159 (2014), pp. 635-646; Ye et al. Protein Cell, 8 (2017), pp. 853-855; Chen et al. Nat Commun, 9 (2018), p. 5065; Shao et al. ACS Synth Biol (2017); Fu et al. Nat Commun, 7 (2016), p. 11707; Shao et al. Nucleic Acids Res, 44 (2016), Article e86; Wang et al., Sci Rep, 6 (2016), p. 26857).
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분은 본 명세서에 기술된 제자리 검출 방법 같은, 검출 방법에서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분은 본 명세서에 기술된 촉매적 불활성화 TnpB 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 검출 방법 예컨대 형광 제자리 혼성화 (FISH) 또는 본 명세서에 임의의 다른 것들에서 이러한 시스템을 사용한다. 일 구현예에서, 불활성화된 TnpB 폴리펩티드는 DNA 이중 가닥 파손을 생산하는 능력이 결여된 것이고, 마커, 예컨대 형광성 단백질, 예컨대 증강된 녹색 형광 단백질 (eEGFP)에 융합되어서, 생체내에서 협동원체, 동원체 및 텔로미어 반복부를 표적화하도로 소형 핵산 성분 분자와 공발현된다. 데드 TnpB 폴리펩티드 또는 이의 시스템은 인간 게놈의 개별 유전자 및 반복 서열 둘 모두를 가시화하기 위해 사용될 수 있다. 표지된 데드 TnpB 폴리펩티드 및 조성물, 이의 시스템의 이러한 새로운 적용은 특히 소형 핵 부피 또는 복합체 3-D 구조 경우에, 기능성 핵 아키텍처를 연구하고 세포를 이미지화하는데 중요할 수 있다.
세포 선택
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분은 세포를 스크리닝 및/또는 선택하는 방법에서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템,-기반 스크리닝/선택 방법은 세포 개체군에서 질환 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 세포의 선택은 세포에 변형을 일켜서 선택된 세포가 죽게 된다. 이러한 방식으로, 질환 세포를 확인하고, 건강한 세포 개체군으로부터 제거된다. 일 구현예에서, 일 구현예에서, 질환 세포는 암 세포, 전암성 세포, 바이러스 또는 다른 병원성 유기체 감염된 세포, 또는 달리 비정상 세포일 수 있다. 일 구현예에서, 변형은 원하는 세포의 선택을 촉진하는 선택하려는 세포에서의 다른 검출가능한 변화 (예를 들어, 기능성 변화 및/또는 게놈 바코드)를 부여할 수 있다. 일 구현예에서 음성 선택 계획은 원하는 세포 개체군을 수득하는데 사용될 수 있다. 선택하려는 세포는 변형되고, 따라서, 세포에 부여되는 검출가능한 변화를 기반으로 확인 또는 분류되거나 또는 그들 사멸을 기반으로 세포 개체군으로부터 제거될 수 있다. 따라서, 이들 구현예에서, 선택 후 나머지 세포는 원하는 세포 개체군이다.
일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 변형을 함유하는 하나 이상의 세포(들)를 선택하는 방법은 하나 이상의 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분, 및/또는 벡터 또는 벡터 시스템을 세포(들)에 도입시키는 단계로서, 조성물, 시스템(들) 및/또는 이의 성분, 및/또는 벡터 또는 벡터 시스템은 TnpB 폴리펩티드, 핵산 성분 서열, 및 재조합 주형 중 하나 이상을 함유하고/하거나 발현할 수 있고, 예를 들어, 조성물, 시스템, 벡터 또느 벡터 시스템 및/또는 재조합 주형에 의해서 생체내 발현되고 발현되는 것은 TnpB 폴리펩티드 절단을 폐기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 단계; 선택하려는 세포(들)에서 표적 폴리뉴클레오티드와 재조합 주형의 상동성 재조합을 허용하는 단계: 조성물, 시스템, 또는 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하여서 상기 유전자 내 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 실시하게 하는 단계로서, AAV-복합체는 (1) 표적 폴리뉴클레오티드 내 표적 서열과 혼성화하는 핵산 성분 분자 서열, 및 (2) 핵산 성분 스캐폴드와 복합체 형성하는 TnpB 폴리펩티드를 포함하고, 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 복합체의 결합은 세포 사멸을 유도하거나 또는 세포에 일부 다른 검출가능한 변화를 부여하여서, 하나 이상의 돌연변이가 도입된 하나 이상의 세포(들)를 선택하게 하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 선택하려는 세포는 진핵생물 세포일 수 있다. 일 구현예에서, 선택하려는 세포는 원핵생물 세포일 수 있다. 본 명세서의 방법을 통해 특이적 세포의 선택은 역선택 시스템을 포함할 수 있는 2-단계 과정 또는 선택 마커 필요없이 수행될 수 있다.
치료제 개발
본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 및 이의 성분은 TnpB 폴리펩티드-기반 생물학적 활성제, 예컨대 소형 분자 치료제를 개발하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서는 질환 및/또는 질환 유전자와 연관된 신호전달 사건 및/또는 세포 기능을 조절하는 생물학적 활성제를 개발하기 위한 방법을 기술한다. 일 구현예에서, (a) 시험 화합물을 질환 세포 및/또는 질환 유전자 세포를 함유하는 세포와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 질환 또는 질환 유전자와 연관된 세포 신호전달 사건 또는 다른 세포 기능성의 감소 또는 증대를 의미하는 판독치의 변화를 검출하여서, 상기 질환 유전자와 연관된 상기 세포 신호전달 사건 또는 다른 기능성을 조절하는 상기 생물학적 활성제를 개발하는 것인 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 질환 세포는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 모델 세포이다. 일 구현예에서, 질환 세포는 치료를 필요로 하는 대상체로부터 단리된 질환 세포이다. 일 구현예에서, 시험 화합물은 소형 분자 작용제이다. 일 구현예에서, 시험 화합물은 소형 분자 작용제이다. 일 구현예에서, 시험 화합물 생물 분자제이다.
일 구현예에서, 방법은 본 명세서에 기술된, 조성물, 시스템을 기반으로 치료제를 개발하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료제는 관심 표적 서열에 혼성화할 수 있는 재프로그램가능한 스페이서를 갖는 핵산 성분 및 TnpB 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료제는 a) TnpB 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 구성요소; 및 b) 재프로그램가능한 스페이서 서열, 보존된 RNA 서열을 포함하는 핵산 성분을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 구성요소를 함유하는 벡터 또는 벡터 시스템이고; 성분 (a) 및 (b)는 동일하거나 또는 상이한 벡터 상에 위치된다. 특정 구현예에서, 생물학적 활성제는 조성물, 시스템, 또는 이의 성분, 및/또는 상기 성분을 함유하거나 또는 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 벡터, 또는 벡터 시스템을 세포에 전달하고 본 명세서의 조성물 및 시스템의 성분과 복합체를 형성할 수 있도록 작동적으로 구성된 전달 시스템을 포함하는 조성물이고, 상기 복합체는 세포에서 작동가능하다. 일 구현예에서, 복합체는 본 명세서에 기술된 바와 같은, TnpB 폴리펩티드, 가이드 서열 (재프로그램가능한 스페이서 서열)을 포함하는 핵산 성분 스캐폴드, 및 보존된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 조성물에, 전달 시스템은 효모 시스템, 리포펙션 시스템, 미세주입 시스템, 유전자총 시스템, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온, 지질:핵산 접합체, 또는 인공 비리온, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 다른 시스템일 수 있다. 특정 구현예에서, 전달은 입자, 나노입자, 지질 또는 세포 침투성 펩티드 (CPP)를 통한다.
본 명세서는 또한 조성물, 시스템,, 임의로 요법 또는 치료 기반 조성물, 시스템을 개발 또는 디자인하기 위한 방법을 기술하고, 방법은 (a) (치료적) 관심 유전자좌에 대해서 핵산 성분 표적 부위를 선택하는 단계로서, 상기 표적 부위는 개체군 전반에서 최소 서열 변이를 갖고, 상기 선택된 표적 부위로부터 표적 부위를 하위선택하고, 상기 표적 부위에 대한 핵산 성분은 상기 개체군 전반에서 최소 개수의 오프-표적 부위를 인식하는 것인 단계, 또는 (b) (치료적) 관심 유전자좌에 대해서 핵산 성분 표적 부위를 선택하는 단계로서, 상기 표적 부위는 개체군 전반에서 최소 서열 변이를 갖거나, 또는 (치료적) 관심 유전자좌에 대해 핵산 성분 표적 부위를 선택하는 것으로서, 상기 표적 부위에 대한 핵산 성분은 상기 개체군 전반에서 최소수의 오프-표적 부위를 인식하고, 임의로 개체군을 치료하거나 또는 달리 조절 조작하는데 필요한 (하위)선택 표적 부위의 개수를 추정하고, 임의로 개별 개체에 대한 하나 이상의 (하위)선택된 표적 부위를 검증하고, 임의로 하나 이상의 상기 (하위)선택된 표적 부위를 인식하는 하나 이상의 핵산 성분을 디자인하는 것인 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 임의로 요법 또는 치료제를 기반으로 하는 조성물, 시스템을 개발 또는 디자인하기 위한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: (a) (치료적) 관심 유전자좌에 대해서 핵산 성분 표적 부위를 선택하는 단계로서, 상기 표적 부위는 개체군 전반에서 최소 서열 변이를 갖고, 상기 선택된 표적 부위로부터, 표적 부위를 하위선택하고, 상기 표적 부위에 대한 핵산 성분 분자는 상기 개체군 전반에서 최소수의 오프-표적 부위를 인식하는 것인 단계, 또는 (b) (치료적) 관심 유전자좌에 대해 핵산 성분 분자 표적 부위를 선택하는 단계로서, 상기 표적 부위는 개체군에 걸쳐서 최소 서열 변이를 갖거나, 또는 (치료적) 관심 유전자좌에 대해 핵산 성분 분자 표적 부위를 선택하고, 상기 표적 부위에 대한 핵산 성분 분자는 상기 개체군 전반에서 최소수의 오프-표적 부위를 인식하고, 임의로 개체군을 치료하거나 또는 달리 조정 또는 조작하는데 필요한 (하위)선택된 표적 부위의 개수를 추정하고, 임의로 개별 대상체에 대해서 하나 이상의 (하위)선택된 표적 부위를 검증하고, 임의로 하나 이상의 상기 (하위)선택된 표적 부위를 인식하는 하나 이상의 핵산 성분 분자를 디자인하는 것인 단계.
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 임의로 개체군에서 요법 또는 치료제를 기반으로 하는 조성물, 시스템을 개발 또는 디자인하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: (a) (치료적) 관심 유전자좌에 대해서 재프로그램가능한 스페이서 표적 부위를 선택하는 단계로서, 상기 표적 부위는 개체군 전반에서 최소 서열 변이를 갖고, 상기 선택된 표적 부위로부터 표적 부위를 하위선택하고, 상기 표적 부위에 대한 핵산 성분은 상기 개체군 전반에서 최소수의 오프-표적 부위를 인식하는 것인 단계, 또는 (b) (치료적) 관심 유전자좌에 대해 핵산 성분 재프로그램가능한 스페이서 표적 부위를 선택하는 단계로서, 상기 표적 부위는 개체군 전반에서 최소 서열 변이를 갖거나, 또는 (치료적) 관심 유전자좌에 대해 핵산 성분 재프로그램가능한 스페이서 표적 부위를 선택하는 것으로서, 상기 표적 부위에 대한 핵산 성분은 상기 개체군 전반에서 최소수의 오프-표적 부위를 인식하고, 임의로 개체군을 치료하거나 또는 달리 조정 또는 조작하는데 필요한 (하위)선택된 표적 부위의 개수를 추정하고, 임의로 개별 대상체에 대해서 하나 이상의 (하위)선택된 표적 부위를 검증하고, 임의로 하나 이상의 상기 (하위)선택된 표적 부위를 인식하는 하나 이상의 핵산 성분을 디자인하는 것인 단계.
일 구현예에서 조성물, 시스템, 임의로 개체군에서 요법 또는 치료제를 기반으로 하는 조성물, 시스템에서 사용을 위한 핵산 성분 분자를 개발 또는 디자인하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: (a) (치료적) 관심 유전자좌에 대해서 핵산 성분 분자 표적 부위를 선택하는 단계로서, 상기 표적 부위는 개체군 전반에서 최소 서열 변이를 갖고, 상기 선택된 표적 부위로부터 표적 부위를 하위선택하고, 상기 표적 부위에 대한 핵산 성분 분자는 상기 개체군 전반에서 최소수의 오프-표적 부위를 인식하는 것인 단계, 또는 (b) (치료적) 관심 유전자좌에 대해서 핵산 성분 분자 표적 부위를 선택하는 단계로서, 상기 표적 부위는 개체군 전반에서 최소 서열 변이를 갖거나, 또는 (치료적) 관심 유전자좌에 대해 핵산 성분 분자 표적 부위를 선택하는 것으로서, 상기 표적 부위에 대한 핵산 성분 분자는 상기 개체군 전반에서 최소수의 오프-표적 부위를 인식하고, 임의로 개체군을 치료하거나 또는 달리 조정 또는 조작하는데 필요한 (하위)선택 표적 부위의 개수를 추정하고, 임의로 개별 대상체에 대한 하나 이상의 (하위)선택된 표적 부위를 검증하고, 임의로 하나 이상의 상기 (하위)선택된 표적 부위를 인식하는 하나 이상의 핵산 성분 재프로그램가능한 스페이서를 디자인하는 것인 단계.
일 구현예에서, 임의로 개체군에서, 조성물, 시스템, 예컨대 개체군에서 요법 또는 치료제를 기반으로 하는 조성물, 시스템의 개발 또는 디자인; 임의로 개체군에서, 조성물, 시스템, 임의로 요법 또는 치료제를 기반으로 하는 조성물, 시스템에서 사용을 위한 핵산 성분 재프로그램가능한 스페이서의 개발 또는 디자인을 위한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 표적 개체군에서 하나 이상의 유전자좌에 대한 표적 서열 세트를 선택하는 단계로서, 표적 서열은 표적 개체군에서 한계치 대립유전자 빈도 이상으로 발생되는 변이체를 함유하지 않는 것인 단계 (즉, 백금 표적 서열); 상기 선택된 (백금) 표적 서열로부터 고빈도 오프-표적 후보 (세트 내 다른 (백금) 표적에 대함)를 갖는 임의의 표적 서열을 제거하여서 최종 표적 서열 세트를 한정하는 단계; 최종 표적 서열 세트를 기반으로, 하나 이상의 이러한 조성물, 시스템의 세트를 제조하는 단계로서, 임의로 제조된 조성물의 개수는 (적어도 부분적으로) 표적 개체군의 크기를 기반으로 하는 것인 단계.
일 구현예에서, 오프-표적 후보/오프-표적, TAM 제한성, 표적 절단 효율, 또는 이펙터 단백질 특이성은 예컨대 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 시퀀싱-기반 이중 가닥 파손 (DSB) 검출 어세이를 사용하여 확인되거나 또는 결정된다. 일 구현예에서, 오프-표적 후보/오프-표적은 예컨대 본 명세서의 다른 곳에 기술된, 시퀀싱 -기반 이중 가닥 파손 (DSB) 검출 어세이를 사용해 확인 또는 결정된다. 일 구현예에서, 오프-표적, 또는 오프 표적 후보는 적어도 1, 바람직하게 1-3, 불일치 또는 (원위) TAM 불일치, 예컨대 1 이상, 예컨대 1, 2, 3, 이상 (원위) TAM 불일치를 갖는다. 일 구현예에서, 시퀀싱-기반 DSB 검출 어세이는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 프라이머 결합 부위를 포함하는 어댑터로 DSB의 부위를 표지하는 단계, 바코드 또는 고유한 분자 식별자로 DSB의 부위를 표지화하는 단계, 또는 이의 조합을 포함한다.
핵산 성분의 재프로그램가능한 스페이서 서열은 표적 부위와 100% 상보성이고, 다시 말해서 표적 부위와 임의의 불일치를 포함하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 재프로그램 가능한 스페이서에 의한 (오프-) 표적 부위의 "인식"은 조성물, 시스템, 기능성을 전제로 하고, 다시 말해서 (오프-) 표적 부위는 (오프-)표적 부위에 재프로그램 가능한 스페이서 RNA의 결합이 조성물, 시스템, 활성을 일으키는 경우에 (예컨대 단일 또는 이중 가닥 DNA 절단의 유도, 전사 조절 등), 재프로그램 가능한 스페이서 RNA에 의해서만 인식된다는 것을 또한 이해한다.
일 구현예에서, 개체군에 걸쳐서 최소 서열 변이를 갖는 표적 부위는 개체군의 적어도 99%, 바람직하게 적어도 99.9%, 보다 바람직하게 적어도 99.99% 에서 서열 변이의 부재를 특징으로 한다. 일 구현예에서, 최적화된 표적 위치는 개체군의 적어도 99%, 바람직하게 적어도 99.9%, 보다 바람직하게 적어도 99.99%에서 서열 변이의 부재를 갖는 표적 서열 또는 유전자좌를 선택하는 단계를 포함한다. 이들 표적은 본 명세서의 다른 곳에서 "백금 표적"이라고 한다. 일 구현예에서, 상기 개체군은 적어도 1000 개체, 예컨대 적어도 5000 개체, 예컨대 적어도 10000 개체, 예컨대 적어도 50000 개체를 포함한다.
일 구현예에서, 오프-표적 부위는 오프-표즉 부위와 핵산 성분 간에 적어도 하나의 불일치를 특징으로 한다. 일 구현예에서, 오프-표적 부위는 오프-표적 부위와 핵산 성분 간에 5 이하, 바람직하게 4 이하, 보다 바람직하게 3 이하의 불일치를 특징으로 한다. 일 구현예에서, 오프-표적 부위는 오프-표적 부위와 핵산 성분 간에 적어도 하나의 불일치, 및 오프-표적 부위와 핵산 성분 간에 5 이하, 바람직하게 4 이하, 보다 바람직하게 3 이하의 불일치를 특징으로 한다.
일 구현예에서, 상기 개체군 전반에서 오프-표적 부위의 상기 최소수는 상기 개체군에서 고빈도 일배체형에 대해 결정된다. 일 구현예에서, 상기 개체군 전반에서 오프-표적 부위의 상기 최소수는 상기 개체군에서 오프-표적 부위 유전자좌의 고빈도 일배체형에 대해 결정된다. 일 구현예에서, 상기 개체군 전반에서 오프-표적 부위의 상기 최소수는 상기 개체군에서 표적 부위 유전자좌의 고빈도 일배체형에 대해 결정된다. 일 구현예에서, 고빈도 일배체형은 개체군의 적어도 0.1%에서 발생을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 개체군을 치료하는데 필요한 (하위)선택된 표적 부위의 개수는 저빈도 서열 변이, 예컨대 대규모 시퀀싱 데이터세트에서 포착된 저빈도 서열 변이를 기반으로 추정된다. 일 구현예에서, 소정 크기의 개체군을 치료하는데 필요한 (하위)선택된 표적 부위의 개수가 추정된다.
일 구현예에서, 방법은 치료하려는 대상체의 게놈 시퀀싱 데이터를 수득하는 단계; 및 조성물, 시스템의 세트로부터 선택된, 조성물, 시스템으로 대상체를 치료하는 단계로서, 선택된 조성물, 시스템은 개체의 게놈 시퀀싱을 (적어도 부분적으로) 기반으로 하는 것인 단계를 더 포함한다. 일 구현예에서, ((하위)선택된) 표적은 게놈 시퀀싱, 바람직하게 전체 게놈 시퀀싱으로 검증된다
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적 서열 또는 유전자좌는 하나 이상의 매개변수, 예컨대 TAM 유형 (천연 또는 변형), TAM 뉴클레오티드 함량, TAM 길이, 표적 서열 길이, TAM 제한성, 표적 절단 효율, 및 유전자, 유전자좌, 또는 다른 게놈 영역 내 표적 서열 위치의 최적화를 기반으로 (추가로) 선택된다. 최적화 방법은 본 명세서의 다른 곳에서 상세히 논의된다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적 서열 또는 유전자좌는 표적 유전자좌 위치, 표적 길이, 표적 특이성, 및 TAM 특징 중 하나 이상의 최적화를 기반으로 (추가로) 선택된다. 본 명세서에서 사용되는, TAM 특징은 예를 들어 TAM 서열, TAM 길이, 및/또는 TAM GC 함량을 포함한다. 일 구현예에서, TAM 특징의 최적화는 TAM의 뉴클레오티드 함량의 최적화를 포함한다. 일 구현예에서, TAM의 뉴클레오티드 함량의 최적화는 하나 이상의 표적 유전자좌에서 존재비를 최대화하거나, 돌연변이 빈도를 최소화하거나, 또는 둘 모두의 모티프를 갖는 TAM 을 선택하는 것이다. 돌연변이 빈도의 최소화는 예를 들어, 낮거나 또는 최소의 CpG를 갖거나 또는 없이 TAM 서열을 선택하여 획득될 수 있다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템의 세트에서, 각 조성물 및 시스템에 대한 이펙터 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 매개변수의 최적화를 기반으로 선택된다; 이펙터 단백질 크기, 높은 염색질 접근성의 영역에 접근하는 이펙터 단백질의 능력, 게놈 표적 전반에서 균일한 효소 활성 정도, 후생적 내성, 불일치/벌지 내성, 이펙터 단백질 특이성, 이펙터 단백질 안정성 또는 반감기, 이펙터 단백질 면역원성 또는 독성. 최적화 방법은 본 명세서의 다른 곳에서 상세히 논의된다.
시스템의 최적화
본 발명의 방법은 조성물, 시스템, 및/또는 이의 기능성, 본 명세서의 다른 곳에서 더욱 기술되는 바와 같이, 조성물, 시스템, 및/또는 이의 기능성과 연관된 선택된 매개변수 또는 변수의 최적화를 포함한다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에서, 조성물, 시스템의 최적화는 표적(들), 예컨대 치료 표적 또는 치료 표적들, 조성물, 시스템의 방식 또는 유형, 조정, 예컨대 조성물, 시스템, 기반 치료 표적(들) 조정, 변형, 또는 조작을 비롯하여, 조성물, 시스템, 성분의 전달에 의존한다. 하나 이상의 표적은 유전자형 분석 및/또는 표현형 분석 결과에 따라서, 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 치료 표적은 (유전자) 질환 병인론 또는 바람직한 치료 결과에 따라서 선택될 수 있다. (치료적) 표적(들)은 단일 유전자, 유전자좌, 또는 다른 게놈 부위일 수 있거나, 또는 다수 유전자, 유전자좌, 또는 다른 게놈 부위일 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 단일 유전자, 유전자좌, 또는 다른 게놈 부위는 1회 초과로, 예컨대 다수의 핵산 성분, 또는 핵산 성분 스캐폴드 및 다수의 재프로그램가능한 스페이서의 사용을 통해서 표적화될 수 있다.
조성물 및/또는 시스템, 예컨대 TnpB 폴리펩티드-기반 요법 또는 치료제의 활성은 표적 파괴, 예컨대 녹아웃을 일으키는 예컨대 표적 돌연변이를 포함할 수 있다. 조성물 및/또는 시스템, 예컨대 TnpB 폴리펩티드-기반 요법 또는 치료제의 활성은 예컨대 표적 교정을 일으키는 특정 표적 부위의 치환을 포함할 수 있다. TnpB 폴리펩티드 기반 요법 또는 치료제는 예컨대 표적 결실을 일으키는, 특정 표적 부위의 제거를 포함할 수 있다. 조성물 및/또는 시스템, 예컨대 TnpB 폴리펩티드-기반 요법 또는 치료제의 활성은 표적 부위 기능성의 조절, 예컨대 예를 들어 (전사 또는 후생적) 유전자 또는 게놈 영역 활성화 또는 유전자 또는 게놈 영역 침묵화를 일으키는 표적 부위 활성 또는 접근성의 조절을 포함할 수 있다. 당업자는 표적 부위 기능성의 조절이 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, TnpB 폴리펩티드 돌연변이 (예컨대, 예를 들어 촉매적 불활성 TnpB 폴리펩티드의 생성) 및/또는 작용화 (예컨대, 예를 들어 TnpB 폴리펩티드와 이종성 기능성 도메인, 예컨대 전사 활성인자 또는 억제인자의 융합)를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 관한것으로서, 하나 이상의 (치료적) 표적의 선택 단계, 하나 이상의 조성물 및/또는 시스템의 기능성 선택 단계, 및 조성물 및/또는 이의 기능성과 연관된 선택된 매개변수 또는 변수의 최적화를 포함한다. 관련 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 관한 것으로서, (a) 하나 이상의 (치료적) 표적 유전자좌를 선택하는 단계, (b) 하나 이상의 조성물 기능성을 선택하는 단계, (c) 임의로 전달 방식 중 하나 이상을 선택하고, 단계 (a)-(c)를 기반으로 선택된 본 명세서에서의 조성물을 제조, 개발, 또는 디자인하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 게놈 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 단일 게놈 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 다수의 게놈 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 녹아웃을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 단일 녹아웃을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 다수의 녹아웃을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 유전자 교정을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 단일 유전자 교정을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 다수의 유전자 교정을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 게놈 영역 교정을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 단일 게놈 영역 교정을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 다수의 게놈 영역 교정을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 유전자 결실을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 단일 유전자 결실을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 다수의 유전자 결실을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 게놈 영역 결실을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 단일 게놈 영역 결실을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 다수의 게놈 영역 결실을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 유전자 또는 게놈 영역 기능성의 조절을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 단일 유전자 또는 게놈 영역 기능성의 조절을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 다수의 유전자 또는 게놈 영역 기능성의 조절을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 유전자 또는 게놈 영역 기능성, 예컨대 유전자 또는 게놈 영역 활성을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 단일 유전자 또는 게놈 영역 기능성, 예컨대 유전자 또는 게놈 영역 활성을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 다수의 유전자 또는 게놈 영역 기능성, 예컨대 유전자 또는 게놈 영역 활성을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 임의로 전사 및/또는 후생적 유전자 또는 게놈 영역 활성화 또는 유전자 또는 게놈 영역 침묵화를 일으키는 유전자 활성 또는 접근성의 조절을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 임의로 전사 및/또는 후생적 유전자 또는 게놈 영역 활성화 또는 유전자 또는 게놈 영역 침묵화를 일으키는 단일 유전자 활성 또는 접근성의 조절을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은 임의로 전사 및/또는 후생적 유전자 또는 게놈 영역 활성화 또는 유전자 또는 게놈 영역 침묵화를 일으키는 다수의 유전자 활성 또는 접근성의 조절을 포함한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에서 선택된 매개변수 또는 변수의 최적화는 최적화되거나 또는 개선된 시스템 예컨대 TnpB 폴리펩티드-기반 요법 또는 치료제, 특이성, 효능, 및/또는 안전성을 야기할 수 있다. 일 구현예에서, 하기 매개변수 또는 변수 중 하나 이상이 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에서 고려되거나, 선택되거나 또는 최적화된다: TnpB 폴리펩티드 알로스테릭 상호작용, TnpB 폴리펩티드 기능성 도메인 및 기능성 도메인 상호작용, TnpB 폴리펩티드 특이성, 핵산 성분 특이성, 조성물 특이성, TAM 제한성, TAM 유형 (천연, 또는 변형), TAM 뉴클레오티드 함량, TAM 길이, TnpB 폴리펩티드 활성, 핵산 성분 활성, TnpB 폴리펩티드/핵산 성분 분자 복합체 활성, 표적 절단 효율, 표적 부위 선택, 표적 서열 길이, 높은 염색질 접근성 영역에 접근하는 이펙터 단백질의 능력, 게놈 표적 전반에서 균일한 효소 활성 정도, 후생적 내성, 불일치/벌지 내성, TnpB 폴리펩티드 안정성, TnpB 폴리펩티드 mRNA 안정성, 핵산 성분 분자 안정성, TnpB 폴리펩티드 복합체 안정성, TnpB 폴리펩티드 단백질 또는 mRNA 면역원성 또는 독성, 핵산 성분 분자 면역원성 또는 독성, TnpB 폴리펩티드 면역원성 또는 독성, TnpB 폴리펩티드 또는 mRNA 용량 또는 적정가, 핵산 성분 분자 용량 또는 적정가, 용량 또는 적정가, TnpB 폴리펩티드 단백질 크기, TnpB 폴리펩티드 발현 수준, 핵산 성분 분자 발현 수준, TnpB 폴리펩티드 발현 수준, TnpB 폴리펩티드 시공간적 발현, 핵산 성분 분자 시공간적 발현, TnpB 폴리펩티드/핵산 성분 시공간적 발현.
예로서, 제한 없이, 매개변수 또는 변수 최적화은 다음과 같이 획득될 수 있다. TnpB 폴리펩티드 특이성은 가장 특이적인 TnpB 폴리펩티드, 예를 들어, TnpB를 선택하여 최적화될 수 있다. 이것은 예를 들어 가장 특이적인 TnpB 폴리펩티드 오솔로그를 선택하거나 또는 특이성을 증가시키는 특이적 TnpB 폴리펩티드 돌연변이에 의해 획득될 수 있다. 핵산 성분 특이성은 가장 특이적인 핵산 성분을 선택하여 최적화될 수 있다. 이것은 예를 들어, 오프-표적 부위에 대해서, 낮은 상동성, 즉 적어도 하나 또는 더 바람직하게, 예컨대 적어도 2, 또는 바람직하게 적어도 3의 불일치를 갖는 핵산 성분을 선택하여 획득될 수 있다. 특이성은 상기처럼 TnpB 폴리펩티드 특이성 및/또는 핵산 성분 특이성을 증가시켜서 최적화될 수 있다.
표적 길이 또는 표적 서열 길이는 적절한 TnpB 폴리펩티드, 예컨대 바람직한 표적 또는 표적 서열 뉴클레오티드 길이를 인식하는 적절한 TnpB 폴리펩티드를 선택하여 최적화될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 표적 (서열) 길이는 전형적으로 TnpB 폴리펩티드, 예컨대 천연 발생 TnpB 폴리펩티드와 연관된 표적 (서열)길이를 벗어나는 길이를 갖는 표적을 제공하여 최적화될 수 있다. TnpB 폴리펩티드 또는 표적 (서열) 길이는 천연 발생일 수 있거나 또는 예를 들어 변경된 표적 (서열) 길이 인식, 또는 표적 (서열) 길이 인식 레파토리를 갖는 TnpB 폴리펩티드 돌연변이체를 기반으로 최적화될 수 있다. 예를 들어, 표적 (서열) 길이의 증가 또는 감소는 표적 인식 및/또는 오프-표적 인식에 영향을 미칠 수 있다. TnpB 폴리펩티드 활성은 가장 활성적인 TnpB 폴리펩티드를 선택하여 최적화될 수 있다. 이것은 예를 들어 가장 활성적인 TnpB 폴리펩티드 오솔로그를 선택하거나 또는 활성을 증가시키는 특이적 TnpB 폴리펩티드 돌연변이에 의해 획득될 수 있다. 높은 염색질 접근성 영역에 접근하는 TnpB 폴리펩티드 단백질의 능력은 적절한 TnpB 폴리펩티드 또는 이의 돌연변이체를 선택하여 최적화될 수 있고, TnpB 폴리펩티드의 크기, 전하, 또는 다른 치수적 변수 등을 고려할 수 있다. 균일한 TnpB 폴리펩티드 활성 정도는 적절한 TnpB 폴리펩티드 또는 이의 돌연변이체를 선택하여 최적화될 수 있고, TnpB 폴리펩티드 특이성 및/또는 활성, TAM특이성, 표적 길이, 불일치 내성, 후생적 내성, TnpB 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분 안정성 및/또는 반감기, TnpB 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분 면역원성 및/또는 독성 등을 고려할 수 있다. 핵산 성분 활성은 가장 활성적인 핵산 성분을 선택하여 최적화될 수 있다. 일 구현예에서, 이것은 RNA 변형을 통해서 핵산 성분 안정성을 증가시켜서 획득될 수 있다. 조성물 활성은 상기처럼 TnpB 폴리펩티드 활성 및/또는 핵산 성분 활성을 증가시켜서 최적화될 수 있다.
표적 부위 선택은 유전자, 유전자좌 또는 다른 게놈 영역 내에서 표적 부위의 최적 위치를 선택하여 최적화될 수 있다. 표적 부위 선택은 낮은 가변성을 갖는 유전자, 유전자좌 또는 다른 게놈 영역을 갖는 표적을 선택하는 포함하여 표적 위치를 최적화시켜서 최적화될 수 있다. 이것은 예를 들어, 초기 및/또는 보존된 엑손 또는 도메인 (즉, 개체군 내에서, 낮은 가변성, 예컨대 다형성을 가짐)에서 표적 부위를 선택하여 획득될 수 있다.
일 구현예에서, 표적 (서열) 길이 표적 (서열) 길이의 최적화는 5와 25 사이 뉴클레오티드의 하나 이상의 표적 유전자좌 내에서 표적 서열의 선택을 포함한다. 일 구현예에서, 표적 서열은 20 뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, 표적 특이성의 최적화는 오프-표적 후보를 최소화하는 표적 유전자좌의 선택을 포함한다.
일 구현예에서, 표적 부위는 오프-표적 효과의 최소화에 의해 선택될 수 있다 (예를 들어, 바람직하게 개체군 내에서 또한 가변성으로 고려되는, 표적과 비교하여 1-5, 1-4, 또는 바람직하게 1-3 불일치를 갖는 것으로 한정된 오프-표적). TnpB 폴리펩티드 안정성은 적절한 반감기, 예컨대 바람직하게 여전히 충분한 활성을 유지할 수 있는 짧은 반감기를 갖는 TnpB 폴리펩티드를 선택하여 최적화될 수 있다. 일 구현예에서, 이것은 특정 반감기를 갖는 적절한 TnpB 폴리펩티드 오솔로그를 선택하여서 또는 안정화 또는 탈안정화 도메인 또는 서열의 포함 (예를 들어, 융합)같이, 반감기 또는 안정성에 영향을 미치는 특정 TnpB 폴리펩티드 돌연변이에 의해 획득될 수 있다. TnpB 폴리펩티드 mRNA 안정성은 TnpB 폴리펩티드 mRNA 안정성을 증가시키거나 또는 감소시켜서 최적화될 수 있다. 일 구현예에서,이것은 mRNA 변형을 통해서 TnpB 폴리펩티드 mRNA 안정성을 증가시켜서 획득될 수 있다. 핵산 성분 안정성은 핵산 성분 안정성을 증가시키거나 또는 감소시켜서 최적화될 수 있다. 일 구현예에서, 이것은 RNA 변형을 통해서 핵산 성분 안정성을 증가시키거나 또는 감소시켜서 획득될 수 있다. 안정성은 상기와 같이 TnpB 폴리펩티드 안정성 및/또는 핵산 성분 분자 안정성을 증가시키거나 또는 감소시켜서 최적화될 수 있다. TnpB 폴리펩티드 단백질 또는 mRNA 면역원성 또는 독성은 TnpB 폴리펩티드 또는 mRNA 면역원성 또는 독성을 감소시켜서 최적화될 수 있다. 일 구현예에서, 이것은 mRNA 또는 단백질 변형에 의해 획득될 수 있다. 유사하게, DNA 기반 발현 시스템 경우에, DNA 면역원성 또는 독성을 감소시킬 수 있다. 핵산 성분 면역원성 또는 독성은 핵산 성분 면역원성 또는 독성을 감소시켜서 최적화될 수 있다. 일 구현예에서, 이것은 핵산 성분 변형을 통해 획득될 수 있다. 유사하게, DNA 기반 발현 시스템 경우에, DNA 면역원성 또는 독성을 감소시킬 수 있다. 면역원성 또는 독성은 상기와 같이 npB 폴리펩티드 면역원성 또는 독성 및/또는 핵산 성분 면역원성 또는 독성을 감소시키거나 또는 적어도 면역원성 또는 독성 TnpB 폴리펩티드/핵산 성분 조합을 선택하여 최적화될 수 있다. 유사하게, DNA 기반 발현 시스템 경우에, DNA 면역원성 또는 독성은 감소될 수 있다. TnpB 폴리펩티드 단백질 또는 mRNA 용량 또는 적정가는 독성을 최소화하고/하거나 특이성 및/또는 효능을 최대화하기 위한 용량 또는 적정가를 선택하여 최적화될 수 있다. 핵산 성분 용량 또는 적정가 독성을 최소화하고/하거나 특이성 및/또는 효능을 최대화하는 용량 또는 적정가를 선택하여 최적화될 수 있다. 조성물 용량 또는 적정가는 독성을 최소화하고/하거나 특이성 및/또는 효능을 최대화하기 위한 용량 또는 적정가를 선택하여 최적화될 수 있다. TnpB 폴리펩티드 크기는 특히 바이러스 매개 전달을 위해서, 전달 효율을 증가시키기 위해 최소 단백질 크기를 선택하여 최적화될 수 있다. TnpB 폴리펩티드, 핵산 성분, 또는 이의 복합체 발현 수준은 발현 지속기간을 제한 (또는 연장)하고/하거나 발현 수준을 제한 (또는 증가)시켜서 최적화될 수 있다. 이것은 예를 들어, 예컨대 자기-표적화 (예를 들어, TnpB 폴리펩티드 표적화) 핵산 성분 분자를 포함하는, 자기-불활성화 조성물, 시스템을 사용하거나, 제한된 발현 지속기간을 갖는 바이러스 벡터를 사용하거나, 낮은 (또는 높은) 발현 수준을 위한 적절한 프로모터를 사용하거나, 개별 TnpB 시스템 성분에 대한 상이한 전달 방법을 조합하여서, 예컨대 핵산 성분의 비-바이러스 매개 전달과 조합된 TnpB 폴리펩티드 코딩 핵산의 바이러스 매개 전달, 또는 TnpB 폴리펩티드 또는 mRNA의 비-바이러스 매개 전달과 조합된 핵산 성분의 바이러스 매개 전달에 의해서 획득될 수 있다. TnpB 폴리펩티드, 핵산 성분, 또는 TnpB 복합체 시공간적 발현은 제어가능한 TnpB 폴리펩티드 활성 임의로 탈안정화된 TnpB 폴리펩티드 및/또는 분할 TnpB 폴리펩티드, 및/또는 세포- 또는 조직-특이적 발현 시스템을 포함하는 조건적 및/또는 유도성 발현 시스템의 적절한 선택에 의해 최적화될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 (치료적) 표적의 선택, 조성물 및/또는 시스템의 기능성의 선택, 조성물 전달 방식의 선택, 조성물 전달 비히클 또는 발현 시스템의 선택, 및 조성물 및/도는 이의 기능성과 연관된 선택된 매개변수 또는 변수의 최적화를 포함하여, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 관한 것으로서, 임의로 매개변수 또는 변후는 하기로부터 선택되는 하나 이상이다: TnpB 폴리펩티드 특이성, 핵산 성분 특이성, TnpB 복합체 특이성, TnpB 폴리펩티드 활성, 핵산 성분 분자 활성, TnpB 폴리펩티드/핵산 성분 복합체 활성, 표적 절단 효율, 표적 부위 선택, 표적 서열 길이, 높은 염색질 접근성 영역에 접근하는 이펙터 단백질의 능력, 게놈 표적 전반에서 균일한 효소 활성 정도, 후생적 내성, 불일치/벌지 내성, TnpB 폴리펩티드 안정성, TnpB 폴리펩티드 mRNA 안정성, 핵산 성분 안정성, TnpB 복합체 안정성, TnpB 폴리펩티드 단백질 또는 mRNA 면역원성 또는 독성, 핵산 성분 면역원성 또는 독성, TnpB 폴리펩티드/핵산 성분 복합체 면역원성 또는 독성, TnpB 폴리펩티드 단백질 또는 mRNA 용량 또는 적정가, 핵산 성분 용량 또는 적정가, TnpB 복합체 용량 또는 적정가, TnpB 폴리펩티드 단백질 크기, TnpB 폴리펩티드 발현 수준, 핵산 성분 발현 수준, TnpB 폴리펩티드/핵산 성분 분자 복합체 발현 수준, TnpB 폴리펩티드 시공간적 발현, 핵산 성분 시공간적 발현, TnpB 폴리펩티드/핵산 성분 복합체 시공간적 발현.
최적화하려는 매개변수 또는 변수를 비롯하여 최적화의 성질은 (치료적) 표적, 조성물 및/또는 시스템의 기능성은, 시스템 전달 방식, 및/또는 조성물 전달 비히클 또는 발현 시스템에 의존적일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 개체군 수준에서 핵산 성분 특이성의 최적화를 포함하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 핵산 성분 특이성의 상기 최적화는 개체군 전반에서 핵산 성분 표적 부위 서열 변이의 최소화 및/또는 개체군 전반에서 핵산 성분 오프-표적 발생 최소화를 포함한다.
일 구현예에서, 최적화는 천연발생이거나 또는 변형된 TnpB 폴리펩티드의 선택을 야기할 수 있다. 일 구현예에서, 최적화는 뉴클레아제, 닉카제, 데아미나제, 트랜스포사제를 갖고/갖거나, 탈활성화 또는 제거된 하나 이상의 이펙터 기능성을 갖는 TnpB 폴리펩티드의 선택을 야기할 수 있다. 일 구현예에서, TAM 특이성 최적화는 변형된 TAM 특이성을 갖는 TnpB 폴리펩티드의 선택을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 최적화는 최소 크기를 갖는 TnpB 폴리펩티드의 선택을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 이펙터 단백질 안정성의 최적화는 예컨대 특정 반감기 또는 안정성을 갖는 적절한 TnpB 폴리펩티드 오솔로그를 선택하여서, 충분한 활성을 유지하면서 짧은 반감기를 갖는 이펙터 단백질의 선택을 포함한다. 일 구현예에서, 면역원성 또는 독성의 최적화는 단백질 변형에 의한 이펙터 단백질 면역원성 또는 독성의 최소화를 포함한다. 일 구현예에서, 특이적 기능성의 최적화는 핵산 성분 분자와 하나 이상의 표적 유전자좌 사이에 불일치/벌지 내성이 감소된 단백질 이펙터의 선택을 포함한다.
일 구현예에서, 효능 최적화는 전체 효율, 후생적 내성, 또는 둘 모두의 최적화를 포함한다. 일 구현예에서, 전체 효율의 최대화는 염색질 복잡성이 다양한 표적 유전자좌에 걸쳐서 균일한 효소 활성을 갖는 이펙터 단백질의 선택, 개방 염색질 접근성 영역에 제한되는 효소 활성을 갖는 이펙터 단백질의 선택을 포함한다. 일 구현예에서, 염색질 접근성은 ATAC-seq, 또는 DNA-근접 결찰 어세이 중 하나 이상을 사용하여 측정된다. 일 구현예에서, 후생적 내성의 최적화는 메틸화 내성, 후생적 마커 경쟁, 또는 둘 모두의 최적화를 포함한다. 일 구현예에서, 메틸화 내성 최적화는 메틸화 DNA를 변형시키는 이펙터 단백질의 선택을 포함한다. 일 구현예에서, 후생적 내성의 최적화는 염색체의 침묵화된 영역을 변형시킬 수 없는 이펙터 단백질의 선택, 염색체의 침묵화된 영역을 변형시킬 수 있는 이펙터 단백질의 선택, 또는 후생적 마커에 대해 농축되지 않은 표적 유전자좌의 선택을 포함한다.
일 구현예에서, 최적화된 핵산 성분 분자의 선택은 안정성, 면역원성, 또는 둘 모두, 또는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 다른 연관된 매개변수 또는 변수의 최적화를 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 성분 분자 안정성 및/또는 핵산 성분 분자 면역원성의 최적화는 RNA 변형, 또는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 다른 핵산 성분 분자 연관된 매개변수 또는 변수를 포함한다. 일 구현예에서, 변형은 핵산 성분 분자의 표적 상보성 영역의 3' 말단으로부터 1-3 뉴클레오티드의 제거를 포함한다. 일 구현예에서, 변형은 핵산 성분 분자와 표적 서열 간, 또는 둘 모두에서 연장된 상보성 뉴클레오티드, 또는 오프-표적 유전자좌의 표적에서 핵산 성분 분자 쌍형성과 경쟁하는 핵산 성분 분자 내에 안정한 구조를 생성하는 연장된 핵산 성분 분자 및/또는 트랜스 RNA/DNA 구성요소를 포함한다.
일 구현예에서, 전달 방식은 DNA 기반 발현 시스템으로서, 핵산 성분 분자 및/또는 TnpB 폴리펩티드 전달, 핵산 성분 분자 및/또는 TnpB 폴리펩티드 mRNA 전달, 또는 핵산 성분 분자 및/또는 TnpB 폴리펩티드 전달을 포함한다. 일 구현예에서, 리포솜, 지질 입자, 나노입자, 유전자총, 또는 바이러스-기반 발현/전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전달 비히클 및/또는 발현 시스템을 선택하는 단계를 더 포함한다. 일 구현예에서, 발현은 시공간적 발현이고, 제어가능한 TnpB 폴리펩티드 활성 임의로 탈안정화된 TnpB 폴리펩티드 및/또는 분할 TnpB 폴리펩티드, 및/또는 세포- 또는 조직-특이적 발현 시스템을 포함한, 조건적 및/또는 유도성 발현 시스템의 선택에 의해 최적화된다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 방법은 전달 방식의 선택을 더 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 핵산 성분 및/또는 TnpB 폴리펩티드가 전달되거나 또는 전달될 것이다. 일 구현예에서, 핵산 성분 및/또는 TnpB 폴리펩티드 mRNA가 전달되거나 또는 전달될 것이다. 일 구현예에서, DNA-기반 발현 시스템에 제공되는 핵산 성분 및/또는 TnpB 폴리펩티드가 전달되거나 또는 전달될 것이다. 일 구현예에서, 개별 시스템 성분의 전달은 상기 전달 방식의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, 전달은 DNA 기반 발현 시스템으로서 핵산 성분 및/또는 TnpB 폴리펩티드 단백질 전달, 핵산 성분 및/또는 TnpB 폴리펩티드 mRNA 전달, 또는 핵산 성분 및/또는 TnpB 폴리펩티드 전달을 포함한다.
본 명세서에 기술된 방법은 조성물 전달 비히클 및/또는 발현 시스템의 선택을 더 포함한다. 전달 비히클 및 발현 시스템은 본 명세서의 다른 곳에 기술된다. 예로서, 핵산 및/또는 단백질의 전달 비히클은 나노입자, 리포솜 등을 포함한다. DNA용 전달 비히클, 예컨대 DNA-기반 발현 시스템은 예를 들어 유전자총, 바러스 기반 벡터 시스템 (예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스) 등을 포함한다. 당업자는 전달 방식을 비롯하여 전달 비히클 또는 발현 시스템의 선택이 예를 들어, 표저고하하려는 세포 또는 조직에 의존적일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템, 또는 이의 성분을 전달하기 위한 전달 비히클 및/또는 발현 시스템은 리포솜, 지질 입자, 나노입자, 유전자총, 또는 바이러스-기반 발현/전달 시스템을 포함한다.
치료적 적용의 고려사항
게놈 편집 요법에서 고려사항은 서열-특이적 뉴클레아제, 예컨대 TnpB 폴리펩티드의 선택이다. 각각의 뉴클레아제 변이체는 그 자신의 고유한 세트의 강점 및 약점을 보유할 수 있고, 많은 이들은 치료적 이득을 극대화하기 위해 치료 상황에서 균형을 맞춰야만 한다. 특별한 편집 요법이 효과적이기 위해서, 충분하게 높은 수준의 변형이 질환 증상을 반전시키기 위해 표적 세포 개체군에서 달성되어야만 한다. 이러한 치료적 변형 '한계치'는 치료 후 편집된 세포의 피트니스 및 증상을 반전시키는데 필요한 유전자 산물의 양에 의해 결정된다. 피트니스와 관련하여, 편집은 그들의 미편집 대응부에 대해서 치료된 세포에 대해 3가지 잠재적인 결과: 증가, 중화, 또는 감소 피트니스를 일으킨다. 증가된 피트니스 경우에, 교정된 세포는 요법을 매개하기 위해 그들 질환 대응물에 비해서 확장될 수 있다. 이러한 경우에, 편집된 세포가 선택적 장점을 보유하는 경우에, 비록 작은 수의 편집된 세포가 확장을 통해 증폭될 수 있어도, 환자에게 치료적 이득을 제공한다. 편집된 세포의 피트니스에 변화가 없는 경우 치료적 교정 한계치는 보장된다. 이와 같이, 유의하게 더 큰 수준의 편집이 질환을 치료하는데 요구되고, 여기서 편집은 편집이 표적 세포에 대해 증가된 피트니스를 생성시키는 질환에 비해서, 중성 피트니스 장점을 생성시킨다. 편집이 피트니스 단점을 부여하면, 암 세포에서 종양 억제인자 유전자에 기능을 복원시키기 위한 경우에서 처럼, 변형된 세포는 그들 질환 대응물이 능가하여, 편집 비율에 비해 치료 이득이 낮아지게 된다. 이것은 질환 대응물에 비해서 편집된 세포의 피트니스 및/또는 역가를 증가시키는 보충 요법을 극복할 있다.
세포 피트니스 이외에도, 질환을 치료하는데 필요한 유전자 산물의 양은 또한 질환 또는 이의 증상을 치료하거나 또는 예방할 수 있는 치료적 게놈 편집의 최소 수준에도 영향을 미칠 수 있다. 유전자 산물 수준의 작은 변화가 임상 결과에서 유의한 변화를 일으킬 수 있는 경우에, 치료적 게놈 편집의 최소 수준은 유전자 생산물 수준의 보다 큰 변화가 임상적 관련 반응을 얻는데 필요한 경우에 비해서 덜하다. 일 구현예에서, 치료적 게놈 편집의 최소 수준은 0.1 내지 1%, 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45%. 45-50%, 또는 50-55% 범위일 수 있다. 따라서, 유전자 산물 수준의 작은 변화가 임상 결과에 영향을 미칠 수 있는 경우에, 편집된 세포에 유리한 피트니스가 존재하는 질환은, 치료적 변형 한계치가 높은 성공 기회를 허용하기에 충분히 낮기 때문에 게놈 편집 요법의 이상적인 표적이다.
NHEJ 및 HDR DSB 복구의 활성은 세포 유형 및 세포 상태에 따라 유의하게 다양하다. NHEJ는 세포 주기에 의해 고도로 조절되지 않고 세포 유형에 걸쳐 효율적이어서, 접근가능한 표적 세포 개체군에서 높은 수준의 유전자 파괴를 허용한다. 대조적으로, HDR은 S/G2 시기 동안 주로 작용하고, 그러므로 활동적으로 분열하는 세포에 제한되어서, 정확한 게놈 변형을 요구하는 치료를 유사분열 세포에 국한시킨다 [Ciccia, A. & Elledge, S.J. Molecular cell 40, 179-204 (2010); Chapman, J.R., et al. Molecular cell 47, 497-510 (2012)].
HDR을 통한 교정의 효율은 후생적 상태 또는 표적화된 유전자좌의 서열, 또는 사용되는 특이적 복구 주형 구성 (단일 대 이중 가닥, 장형 대 단형 상동성 팔부)에 의해 제어될 수 있다 [Hacein-Bey-Abina, S., et al. The New England journal of medicine 346, 1185-1193 (2002); Gaspar, H.B., et al. Lancet 364, 2181-2187 (2004); Beumer, K.J., et al. G3 (2013)]. 표적 세포에서 NHEJ 및 HDR 기구의 상대적 활성이 또한 이들 경로가 DSB를 분해하기 위해 경쟁할 수 있으므로, 유전자 교정 효율에 영향을 미칠 수 있다 [Beumer, K.J., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 19821-19826 (2008)]. HDR은 또한 뉴클레아제 및 복구 주형의 동시 전달을 사용하므로, NHEJ 전략에서 보이지 않은 전달 도전을 부여한다. 따라서, 이러한 차이는 본 명세서의 다른 곳에서 상세히 기술된 바와 같이 TnpB 폴리펩티드 기반 치료제를 디자인, 최적화 및/또는 선택할 때 고려할 수 있다.
TnpB 폴리펩티드-기반 폴리뉴클레오티드 변형 적용은 단백질, 소형 RNA 분자, 및/또는 복구 주형의 조합을 포함할 수 있고, 일 구현예에서, 예를 들어, 전통적인 소형 치료제에 비해서 이들 다수 부분의 전달을 실질적으로 더 도전적이게 만들 수 있다. 조성물, 시스템 및 이의 성분의 전달을 위한 주요한 2개 전략이 개발되었다: 생체외 및 생체내. 생체외 치료의 일 구현예에서, 질환 세포는 대상체로부터 제거되고, 편집된 다음에 환자에게 다시 이식된다. 다른 구현예에서, 건강한 동종이계 도너로부터의 세포를 수집하고, 조성물, 또는 이의 성분을 사용해 변형시켜서, 다양한 기능성을 부여하고/하거나, 면역원성을 감소시키고, 치료를 필요로 하는 동종이계 수용자에게 투여된다. 생체외 편집은 표적 세포 개체군을 충분히 한정하도록 하는 장점 및 특정한 세포에게 전달되는 치료 분자의 특별한 용량을 갖는다. 후자의 고려사항은 특히 오프-표적 변형이 우려될 때 중요할 수 있는데, 뉴클레아제의 양 적정은 이러한 돌연변이를 감소시킬 수 있기 때문이다 (Hsu et al., 2013). 생체외 접근법의 다른 장점은 전형적으로 높은 편집율인데, 연구 및 유전자 요법 적용을 위해서 배양 세포로 단백질 및 핵산의 효율적인 전달 시스템의 개발에 기인하여서, 획득될 수 있다.
조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분을 통한 생체내 폴리뉴클레오티드 변형은 그들 천연 조직의 세포 유형에 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분의 직접 전달을 포함한다. 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분을 통한 생체내 폴리뉴클레오티드는 변형은 발병된 세포 개체군이 생체외 조작할 수 없는 질환을 치료할 수 있게 한다. 또한, 제자리에서 세포로 조성물, 시스템, 및/또는 이의 성분의 전달은 다수 조직 및 세포 유형의 치료를 허용한다.
일 구현예에서, 예컨대 바이러스 벡터 시스템이 세포로 조성물 및/또는 이의 성분을 전달하기 위한 바이러스 입자를 생성시키는데 사용되는 경우에, 조성물 및/또는 이의 성분의 전체 카고 크기는 벡터 시스템이 바이러스 입자 내부에 카고를 패키징하고/하거나 그로부터 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 크기가 제한적일 수 있음을 고려해야 한다. 일 구현예에서, 벡터 시스템, 예컨대 바이러스 벡터 시스템의 향성은 조성물 또는 이의 성분이 효율적이고/이거나 효과적으로 전달될 수 있는 세포 유형에 영향을 미친다는 것을 고려해야 한다.
바이러스-기반 시스템을 통한 시스템 또는 이의 성분의 전달 경우, 대상체 또는 세포(들)에 전달될 때 바이러스 입자에 의해 유발될 수 있는 잠재적 면역 반응을 설명하기 위해서 치료적 효과를 달성하는데 필요하게 되는 바이러스 입자의 양을 고려하는 것이 중요할 수 있다. 바이러스 기반 시스템을 통해서 시스템 또는 이의 성분을 전달할 때, 생체내 시스템의 분포 및/또는 용량을 제어하는 기전을 고려하는 것이 중요할 수 있다. 일반적으로, 오프-표적 효과에 대한 잠재성을 감소시키기 위해서, 시스템의 양을 최저 또는 최소 유효 용량에 가깝게 하는 것이 반드시는 아니지만 최적이다. 실제로 이것은 그렇게 하는것이 어려울 수 있다.
일 구현예에서, 시스템 또는 이의 성분의 면역원성을 고려하는 것이 중요하다. 구현예에서, 시스템 또는 이의 성분의 면역원성이 우려될 때, 면역원성 시스템 또는 이의 성분을 감소시킬 수 있다. 단지 예로서, 시스템 또는 이의 성분의 면역원성은 Tangri 등이 기재한 접근법을 사용해 감소시킬 수 있다. 따라서, 직접 진화 또는 합리적 디자인을 사용하여 숙주 종 (인간 또는 다른 종)에서 TnpB 폴리펩티드의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
이종이식
본 발명은 또한 이식을 위해 변형된 조직을 제공하기 위해 사용하도록 적합화된 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 제공하기 위한, 본 명세서에 기술된 조성물, 예를 들어, TnpB 폴리펩티드 단백질 시스템의 용도를 고려한다. 예를 들어, RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제는 예를 들어 인간 면역계에 의해 인식되는 에피토프를 코딩하는 유전자, 즉 이종항원 유전자의 발현을 파괴하여, 유전자이식 돼지 (예컨대 인간 헴 옥시게나제-1 유전자이식 돼지 품종)같은 동물에서 선택된 유전자를 녹아웃, 녹다운 또는 파괴시키는데 사용될 수 있다. 파괴를 위한 후보 돼지 유전자는 예를 들어 α(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 및 시티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 히드록실라제 유전자를 포함한다 (참조: PCT 특허 공개 번호 WO 2014/066505). 또한, 내생성 레트로바이러스를 코딩하는 유전자는 예를 들어, 모든 돼지 내생성 레트로바이러스를 코딩하는 유전자를 파괴할 수 있다 (참조: Yang et al., 2015, Genome-wide Inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs), Science 27 November 2015: Vol. 350 no. 6264 pp. 1101-1104). 또한, RNA-가이드 DNA 뉴클레아제는 초급성 거부에 대한 보호를 개선시키기 위해서 이종이식 도너 동물에서 추가 유전자, 예컨대 인간 CD55 유전자의 통합을 위한 부위를 표적화하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 구현예는 유전자의 녹아웃, 유전자의 증폭 및 DNA 반복부 불안정성 및 신경계 장애와 관련된 특정 돌연변이의 복구에 관한 방법 및 조성물에 관한 것이다 (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Second Edition, Academic Press, Oct 13, 2011 - Medical). 직렬 반복 서열의 특정 양태는 20개가 넘는 인간 질환의 원인인 것으로 밝혀졌다 (New insights into repeat instability: role of RNA·DNA hybrids. McIvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. 2010 Sep-Oct;7(5):551-8). 본 이펙터 단백질 시스템은 게놈 불안정성의 이러한 결함을 교정하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 몇몇 추가 양태는 National Institutes of Health under the topic subsection Genetic Disorders의 웹사이트에 더 기술되는 광범위 유전 질환과 연관된 결함을 교정하는 것에 관한 것이다 (health.nih.gov/topic/GeneticDisorders의 웹사이트). 유전적 뇌 질병은 부신백질이영양증, 뇌들보 무발생, 에카르디 증후군, 알퍼스병, 알츠하이머병, 바르트 증후군, 배튼병, CADASIL, 소뇌변성, 파브리병, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커 병, 헌팅톤병 및 기타 3중 반복 장애, 라이병, 레슈-니한 증후군, 멘케스 질병, 미토콘드리아 근병증 및 NINDS 거대후두각을 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 이들 질환은 National Institutes of Health under the subsection Genetic Brain Disorders의 웹 사이트에 더 기술되어 있다.
식물 및 진균에서 적용
본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 및 방법은 식물 및 진균에서 유전자 게놈 조사 또는 편집 또는 조작을 수행하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 적용은 예를 들어 식물 또는 진균 게놈을 생성, 확인, 개발, 최적화, 또는 식물에 형질(들) 또는 특징(들) 부여, 또는 형질전환을 위해, 식물 유전자 또는 게놈의 조사 및/또는 선택 및/또는 탐색 및/또는 비교 및/또는 조작 및/또는 형질전환을 포함한다. 따라서, 식물, 형질 또는 특징의 새로운 조합을 갖는 새로운 식물들 또는 증강된 형질을 갖는 새로운 식물의 개선된 생산이 있을 수 있다. 조성물, 시스템, 및 방법은 시스템은 부위-지정 통합 (SDI) 또는 유전자 편집 (GE) 또는 임의의 근접 리버스 육종 (NRB) 또는 리버스 육종 (RB) 기법으로 식물에 관해 사용될 수 있다.
본 명세서의 조성물, 시스템, 및 방법은 본질적으로 임의 식물 및 진규, 및 그들 세포 및 조직에 대해서 원하는 형질 (예를 들어, 증강된 영양 품질, 질환에 대해 증가된 내성 및 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 내성, 및 상업적으로 가치있는 식물 생산물 또는 이종성 화합물의 증가된 생산)을 부여하는데 사용될 수 있다. 조성물, 시스템, 및 방법은 임의의 외래 유전자의 게놈에 영구적인 도입없이 그들 발현을 변형시키거나 또는 내생성 유전자를 변형시키는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 RNAi 또는 유사한 게놈 편집 기술이 이전에 사용된 경우 또는 식물에서 게놈 편집에 사용될 수 있다: 참조: 예를 들어, Nekrasov, "Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR-Cas system," Plant Methods 2013, 9:39 (doi:10.1186/1746-4811-9-39); Brooks, "Efficient gene editing in tomato in 제1 generation using the CRISPR-Cas9 system," Plant Physiology September 2014 pp 114.247577; Shan, "Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system," Nature Biotechnology 31, 686-688 (2013); Feng, "Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system," Cell Research (2013) 23:1229-1232. doi:10.1038/cr.2013.114; published online 20 August 2013; Xie, "RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system," Mol Plant. 2013 Nov;6(6):1975-83. doi: 10.1093/mp/sst119. Epub 2013 Aug 17; Xu, "Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice," Rice 2014, 7:5 (2014), Zhou et al., "Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate: CoA ligase specificity and Redundancy," New Phytologist (2015) (Forum) 1-4 (available online only at www.newphytologist.com); Caliando et al, "Targeted DNA degradation using a CRISPR device stably carried in the host genome, NATURE COMMUNICATIONS 6:6989, DOI: 10.1038/ncomms7989, www.nature.com/naturecommunications DOI: 10.1038/ncomms7989; 미국 특허 제6,603,061호 - Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; 미국 특허 제7,868,149호 - Plant Genome Sequences and Uses Thereof and US 2009/0100536 - Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits, Morrell et al "Crop genomics: advances and applications," Nat Rev Genet. 2011 Dec 29;13(2):85-96, 이들 각각의 모든 내용 및 개시는 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다. 조성물, 시스템, 및 방법을 이용하는 양태는 식물에서 조성물의 사용과 유사할 수 있고, 식물 시스템에서 핵산 변형에 대한 방향에 대해서 다음의 웹사이트를 언급할 수 있다: University of Arizona website "CRISPR-PLANT" (genome.arizona.edu/crispr/) (supported by Penn State and AGI).
"원형질체"는 세포벽을 재형성, 증식 및 재생할 수 있고, 적절한 성장 조건 하에 전체 식물로 성장할 수 있는 살아있는 식물의 무손상의 생화학적 적격 단위를 생성하는 기계적 또는 효소적 수단을 이용하여, 완전히 또는 부분적으로 제거되는 보호 세포벽을 갖는 식물 세포이다.
조성물, 시스템, 및 방법은 관심 유전자 (예를 들어, 내생성, 돌연변이)를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 일부 예에서, 관심 유전자는 일반적으로 종, 문, 및 식물계 전반에서, 관심 작물 형질에 영향을 미치는 유전자 또는 첨가된 영양적 가치의 성분의 생산에 관여되는 코딩 효소를 포함한다. 예를 들어, 대사 경로의 효소를 코딩하는 유전자를 선택적으로 표적화하여서, 식물의 일정 영양적 측면을 담당하는 유전자를 확인할 수 있다. 유사하게, 바람직한 작물학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 유전자를 선택적으로 표적화함으로써, 관련 유전자가 확인될 수 있다. 따라서, 본 발명은 특정 영양학적 가치 및/또는 작물학적 형질을 갖는 화합물의 생성에 관여되는 효소를 코딩하는 유전자에 대한 스크리닝 방법을 포함한다.
따라서, 본 명세서에서 동물 세포에 대한 언급은 또한 분명하지 않으면 준용하여 식물 또는 진균 세포에 적용될 수 있고, 감소된 오프-표적 효과를 갖는 본 명세서의 효소 및 이러한 효소를 적용하는 시스템은 본 명세서에 언급된 것을 포함하여, 식물 적용분야에서 사용될 수 있다는 것을 또한 이해한다.
일부 경우에, 식물 및 진쥰에 도입되는 핵산은 식물 및 진균에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화 방법은 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Kwon KC, et al., Codon Optimization to Enhance Expression Yields Insights into Chloroplast Translation, Plant Physiol. 2016 Sep;172(1):62-77.
조성물 및 시스템의 성분 (예를 들어, TnpB 폴리펩티드)은 본 명세서에 기술된 하나 이상의 기능성 도메인을 더 포함할 수 있다. 일부 예에서, 기능성 도메인은 엑소뉴클레아제일 수 있다. 이러한 엑소뉴클레아제는 TnpB 폴리펩티드 기능의 효율, 예를 들어, 돌연변이유발 효율을 증가시킬 수 있다. 기능성 도메인의 예는 하기 문헌에 기술된, Trex2이다: Weiss T et al., www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.11.037572v1, doi: doi.org/10.1101/2020.04.11.037572.
식물의 예
본 명세서의 조성물, 시스템 및 방법은 본질적으로 임의 식물에 대해 원하는 형질을 부여하는데 사용될 수 있다. 다양한 식물 및 식물 세포 시스템은 원하는 생리학적 및 농경학적 특징을 위해 조작될 수 있다. 일반적으로, "식물"이라는 용어는 특징적으로 세포 분열에 의해 성장하고, 엽록소를 함유하고, 셀룰로스로 구성된 세포벽을 갖는, 식물계의 임의의 각종 광합성, 진핵성, 단세포 또는 다세포 생물에 관한 것이다. 용어 식물은 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다.
조성물, 시스템, 및 방법은 광범위한 식물, 예컨대, 마그니오랄레스 (Magniolales), 일리시알레스 (Illiciales), 라우랄레스 (Laurales), 피페랄레스 (Piperales), 아리스토치알레스 (Aristochiales), 님파에알레스 (Nymphaeales), 라눈쿠 랄레스 (Ranunculales), 파페베랄레스 (Papeverales), 사라세니아케아이 (Sarraceniaceae), 트로코덴드랄레스 (Trochodendrales), 하마멜리달레스 (Hamamelidales), 유코미알레스 (Eucomiales), 레이트네리알레스 (Leitneriales), 미리칼레스 (Myricales), 파갈레스 (Fagales), 카수아리날레스 (Casuarinales), 카리오필랄레스 (Caryophyllales), 바탈레스 (Batales), 폴리고날레스 (Polygonales), 플룸바지날레스 (Plumbaginales), 딜레니알레스 (Dilleniales), 테알레스 (Theales), 말발레스 (Malvales), 우르티칼레스 (Urticales), 레시티달레스 (Lecythidales), 비올랄레스 (Violales), 살리칼레스 (Salicales), 카파랄레스 (Capparales), 에리칼레스 (Ericales), 디아펜살레스 (Diapensales), 에베날레스 (Ebenales), 프리무랄레스 (Primulales), 로살레스 (Rosales), 파발레스 (Fabales), 포도스테말레스 (Podostemales), 할로라갈레스 (Haloragales), 미르탈레스 (Myrtales), 코르날레스 (Cornales), 프로테알레스 (Proteales), 산탈레스 (Santales), 라플레시알레스 (Rafflesiales), 셀라스트랄레스 (Celastrales), 유포르비알레스 (Euphorbiales), 람날레스 (Rhamnales), 사핀달레스 (Sapindales), 유글란달레스 (Juglandales), 게라니알레스 (Geraniales), 폴리갈랄레스 (Polygalales), 움벨랄레스 (Umbellales), 겐티아날레스 (Gentianales), 폴레모니알레스 (Polemoniales), 라미알레스 (Lamiales), 플란타지날레스 (Plantaginales), 스크로풀라리알레스 (Scrophulariales), 캄파누랄레스 (Campanulales), 루비알레스 (Rubiales), 딥사칼레스 (Dipsacales) 및 아스테랄레스 (Asterales) 목에 속하는 쌍자엽 식물; 알리스마탈레스 (Alismatales), 히드로차리탈레스 (Hydrocharitales), 나자달레스 (Najadales), 트리우리달레스 (Triuridales), 콤멜리날레스 (Commelinales), 에리오카우랄레스 (Eriocaulales), 레스티오날레스 (Restionales), 포알레스 (Poales), 준칼레스 (Juncales), 시페랄레스 (Cyperales), 티팔레스 (Typhales), 브로멜리알레스 (Bromeliales), 진기베랄레스 (Zingiberales), 아레칼레스 (Arecales), 시클란탈레스 (Cyclanthales), 판다날레스 (Pandanales), 아랄레스 (Arales), 릴리알레스 (Lilliales) 및 오르치달레스 (Orchidales) 목에 속하는 것과 같은 단자옆식물, 또는 겉씨식물문에 속하는 식물, 예를 들어 피날레스 (Pinales), 징코알레스 (Ginkgoales), 시카달레스 (Cycadales) 및 네탈레스 (Gnetales) 목에 속하는 것들에 사용될 수 있다.
본 명세서의 조성물, 시스템, 및 방법은 하기 쌍자엽, 외자엽 또는 겉씨 식물 속의 비제한적인 목록에 포함되는 광범위한 식물 종에 걸쳐 사용될 수 있다: 아트로파 (Atropa), 알세오다프네 (Alseodaphne), 아나카르디움 (Anacardium), 아라치스 (Arachis), 벨리쉬 미에디아 (Beilschmiedia), 브라시카 (Brassica), 카르타무스 (Carthamus), 코쿠루스 (Cocculus), 크로톤 (Croton), 쿠쿠미스 (Cucumis), 시트러스 (Citrus), 시트룰루스 (Citrullus), 캅시쿰 (Capsicum), 카타란투스 (Catharanthus), 코코스 (Cocos), 코페아 (Coffea), 쿠쿠르비타 (Cucurbita), 다우쿠스 (Daucus), 두구에티아 (Duguetia), 에스크스 콜지아 (Eschscholzia), 피쿠스 (Ficus), 프라가리아 (Fragaria), 글라우시움 (Glaucium), 글리신 (글리신), 고시 피움 (Gossypium), 헬리안투스 (Helianthus), 헤베아 (Hevea), 히오시아무스 (Hyoscyamus), 락투카 (Lactuca), 란돌피아 (Landolphia), 리눔 (Linum), 리트세아 (Litsea), 리코페르시콘 (Lycopersicon), 루피누스 (Lupinus), 마니호트 (Manihot), 마조라나 (Majorana), 말루스 (Malus), 메디카고 (Medicago), 니코티아나 (Nicotiana), 올레아 (Olea), 파르테니움 (Parthenium), 파파베르 (Papaver), 페르세아 (Persea), 파세올루스 (Phaseolus), 피스타치아 (Pistacia), 피숨 (Pisum), 피루스 (Pyrus), 프루누스 (Prunus), 라파누스 (Raphanus), 리치누스 (Ricinus), 세네치오 (Senecio), 시노메니움 (Sinomenium), 스테파니아 (Stephania), 시나피스 (Sinapis), 솔라눔 (Solanum), 테오브로마 (Theobroma), 트리폴리움 (Trifolium), 트리고넬라 (Trigonella), 비키아 (Vicia), 빈카 (Vinca), 비티스 (Vitis) 및 비그나 (Vigna); 및 알리움 (Allium), 안드로포곤 (Andropogon), 아라그로스티스 (Aragrostis), 아스파라거스 (Asparagus), 아베나 (Avena), 시노돈 (Cynodon), 엘라에리스 (Elaeis), 페스투카 (Festuca), 페스투로리움 (Festulolium), 헤테로칼리스 (Heterocalis), 호르데움 (Hordeum), 렘나 (Lemna), 롤리움 (Lolium), 무사 (Musa), 오리자 (Oryza), 파니쿰 (Panicum), 판네세툼 (Pannesetum), 플레움 (Phleum), 포아 (Poa), 세칼레 (Secale), 소르굼 (Sorghum), 트리티쿰 (Triticum) 및 제아(Zea) 속 외떡잎식물; 또는 아비에스 (Abies), 쿤닝하미아 (Cunninghamia), 피세아 (Picea), 피누스 (Pinus) 및 프세우도추가 (Pseudotsuga).
일 구현예에서, 조작을 위한 표적 식물 및 식물 세포는 단자엽 및 쌍자엽 식물, 예컨대, 곡물 (예를 들어, 밀, 메이즈, 벼, 낱알 곡물, 보리), 과일 작물 (예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물 (예를 들어, 알팔파), 뿌리 식물 작물 (예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 잎줄기채소 작물 (예를 들어, 상추, 시금치); 개화 식물 (예를 들어, 페튜니아, 장미, 국화), 송백류 및 소나무 (예를 들어, 소나무 전나무, 가문비나무); 식물 환경 정화에서 사용되는 식물 (예를 들어, 중금속 축적 식물); 기름 작물(예를 들어, 해바라기, 평지씨) 및 실험 목적으로 사용되는 식물 (예를 들어, 애기장대)를 포함하는 작물을 포함한다. 구체적으로, 식물은 제한 없이 다음을 포함하고자 한다: 속씨 식물 및 겉씨 식물, 예컨대 아카시아, 알팔파, 아마란스, 사과, 살구, 아티초크, 물푸레나무, 아스파라거스, 아보카도, 바나나, 보리, 콩, 비트, 자작나무, 너도밤나무, 블랙베리, 블루베리, 브로콜리, 방울 양배추, 양배추, 카놀라, 칸탈루프, 당근, 카사바, 콜리플라워, 삼나무, 곡물, 셀러리, 밤, 체리, 중국 배추, 감귤류, 클레멘타인, 클로버, 커피, 옥수수, 목화, 동부, 오이, 사이프러스, 가지, 느릅나무, 꽃상추, 유칼립투스, 회향, 무화과, 전나무, 제라늄, 포도, 자몽, 땅콩, 꽈리, 검 헴록 (gum hemlock), 히코리, 케일, 키위, 콜라비, 낙엽송, 상추, 대파, 레몬, 라임, 로커스트, 소나무, 공작고사리, 옥수수, 망고, 단풍나무, 멜론, 기장, 버섯, 겨자, 견과류, 참나무, 귀리, 기름야자, 오크라, 양파, 오렌지, 장식용 식물 또는 꽃 또는 나무, 파파야, 야자, 파슬리, 파스닙, 콩, 복숭아, 땅콩, 배, 피트, 후추, 감, 나무콩, 소나무, 파인애플, 플랜테인, 자두, 석류, 감자, 호박, 라디키오, 무, 유채, 라스베리, 쌀, 호밀, 수수, 홍화, 갯버들, 대두, 시금치, 가문비 나무, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 고구마, 스위트콘, 귤, 녹차, 담배, 토마토, 나무, 라이밀, 잔디풀, 순무, 포도나무, 호두, 물냉이, 수박, 밀, 참마, 주목나무, 주키니 호박.
식물이라는 용어는, 뿌리, 잎 및 기타 고등 식물을 특징짓는 기타 기관이 적어서 주로 일차적으로 연합된 광독립영양생물인, 조류를 또한 포함한다. 조성물, 시스템, 및 방법은 광범위하게 "조류" 또는 "조류 세포"에 거쳐서 사용될 수 있다. 조류의 예는 로도파이타 (Rhodophyta) (홍조류), 클로로파이타 (Chlorophyta) (녹조류), 파에오파이타 (Phaeophyta) (갈조류), 파실라리오파이타 (Bacillariophyta) (규조류), 유스티그마토파이타 (Eustigmatophyta) 및 디노플라겔라테스 (dinoflagellates) 를 포함한, 진핵생물 문을 비롯하여, 원핵생물 문 시아노박테리아 (Cyanobacteria) (남조류)를 포함한다. 조류 종의 예는 암포라 (Amphora), 아나바나 (Anabaena), 아니크스트로데스미스 (Anikstrodesmis), 보트리오코커스 (Botryococcus), 차에토세로스 (Chaetoceros), 클라미도모나스 (Chlamydomonas), 클로렐라 (Chlorella), 클로로코쿰 (Chlorococcum), 시클로텔라 (Cyclotella), 실린드로테카 (Cylindrotheca), 두날리엘라 (Dunaliella), 에밀리아나 (Emiliana), 유글레나 (Euglena), 헤마토코커스 (Hematococcus), 이소크리시스 (Isochrysis), 모노크리시스 (Monochrysis), 모노라피디움 (Monoraphidium), 나노클로리스 (Nannochloris), 나노클로롭시스 (Nannnochloropsis), 나비쿨라 (Navicula), 네프로클로리스 (Nephrochloris), 네프로셀미스 (Nephroselmis), 니츠키아 (Nitzschia), 노둘라리아 (Nodularia), 노스톡 (Nostoc), 오크로모나스 (Oochromonas), 우시스티스 (Oocystis), 오실라르토리아 (Oscillartoria), 파블로바 (Pavlova), 파에오닥틸룸 (Phaeodactylum), 플라이트모나스 (Playtmonas), 플레우로크리시스 (Pleurochrysis), 포르히라 (Porhyra), 슈도아나바나 (Pseudoanabaena), 피라미모나스 (Pyramimonas), 스티코코커스 (Stichococcus), 시네코코커스 (Synechococcus), 시네코시스티스 (Synechocystis), 테트라셀미스 (Tetraselmis), 탈라시오시라 (Thalassiosira) 및 트리코데스뮴 (Trichodesmium)의 것을 포함한다.
식물 프로모터
식물 세포에서 적절한 발현을 보장하기 위해서, 본 명세서의 성분 및 시스템의 성분은 식물 프로모터의 제어 하에 배치될 수 있다. 식물 프로모터는 식물 세포에서 작동가능한 프로모터이다. 식물 프로모터는 이의 기원이 식물 세포인지 여부와 무관하게, 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있다. 상이한 유형의 프로모터의 사용이 고려된다.
일부 예에서, 식물 프로모터는 식물의 모든 또는 거의 모든 발생 단계 동안 모든 또는 거의 모든 식물 조직에서 제어되는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 발현 ("항상성 발현"이라함)시킬 수 있는 프로모터이다. 항상성 프로모터의 한 가지 비제한적 예는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터이다. 일부 예에서, 식물 프로모터는 조절되는 프로모터로서, 항상성은 아니지만, 시간적 및/또는 공간적으로 조절되는 방식으로 유전자 발현을 지정하고, 조직-특이적, 조직-선호 및 유도성 프로모터를 포함한다. 상이한 프로모터는 상이한 조직 또는 세포 유형에서 또는 상이한 발생 단계 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자 발현을 유도할 수 있다. 일부 예에서, 식물 프로모터는 조직-선호된 프로모터로서 특정 식물 조직 내에서 소정의 세포 유형 내, 예를 들어, 잎 또는 뿌리 내의 맥관 세포 또는 종자의 특정 세포 내 증진된 발현을 표적화하는데 사용될 수 있다.
예시적인 식물 프로모터는 식물, 식물 바이러스, 및 박테리아 예컨대 식물 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 아그로박테리움 (Agrobacterium) 또는 리조비움 (Rhizobium)으로부터 수득되는 것을 포함한다. 프로모터의 추가 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Kawamata et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:792-803; Yamamoto et al., (1997) Plant J 12:255-65; Hire et al, (1992) Plant Mol Biol 20:207-18,Kuster et al, (1995) Plant Mol Biol 29:759-72, and Capana et al., (1994) Plant Mol Biol 25:681 -91.
일부 예에서, 식물 프로모터는 유도성이고 유전자 편집의 시공간적 제어를 허용하거나 또는 유전자 발현이 에너지의 형태를 사용할 수 있는, 유도성 프로모터일 수 있다. 에너지 형태는 소리 에너지, 전자기 복사, 화학적 에너지 및/또는 열 에너지를 포함할 수 있다. 유도성 시스템의 예는 테트라사이클린 유도성 프로모터 (Tet-온 또는 Tet-오프), 소형 분자 2-하이브리드 전사 활성화 시스템 (FKBP, ABA 등), 또는 광 유도성 시스템 (피토크롬, LOV 도메인 또는 크립토크롬), 예컨대, 서열-특이적 방식으로 전사 활성의 변화를 지시하는 광 유도성 전사 이펙터 (LITE)를 포함한다. 특정 예에서, 광유도성 시스템의 성분은 TnpB 폴리펩티드, 광-반응성 시토크롬 이종이량체 (예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 유래), 및 전사 활성화/억제 도메인을 포함한다.
일부 예에서, 프로모터는 화학-조절 프로모터 (외생성 화학물의 적용이 유전자 발현을 유도하는 경우) 또는 화학-억제성 프로모터 (화학물이 유전자 발현을 억제하는 적용 경우)일 수 있다. 화학-유도성 프로모터는 옥수수 ln2-2 프로모터 (벤젠 술폰아미드 제초제 완화제에 의해 활성화), 옥수수 GST 프로모터 (발아전 제초제로서 사용되는 소수성 친전자성 화합물에 의해 활성화), 담배 PR-1 a 프로모터 (살리실산에 의해 활성화), 항생제에 의해 조절되는 프로모터 (예컨대 테트라사이클린-유도성 및 테트라사이클린-억제성 프로모터)를 포함한다.
식물 게놈으로 안정한 통합
일 구현예에서, 조성물 및 시스템의 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물 세포의 게놈에 안정하게 통합을 위해 도입될 수 있다. 일부 경우에, 벡터 또는 발현 시스템은 이러한 통합에 사용될 수 있다. 벡터 또는 발현 시스템의 디자인은 핵산 성분 분자 및/또는 TnpB 폴리펩티드 유전자가 발현되는 시간, 장소, 및 조건에 따라서 조정될 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 식물 소기관, 예컨대 색소체, 미토콘드리아 또는 엽록체에 통합될 수 있다. 발현 시스템의 구성요소는 원형 예컨대 플라스미드 또는 형질전환 벡터, 또는 비-원형 예컨대 선형 이중 가닥 DNA인 하나 이상의 발현 구성체에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 통합 방법은 일반적으로 적합한 숙주 세포 또는 숙주 조직을 선택하는 단계, 숙주 세포 또는 숙주 조직으로 구성체(들)를 도입시키는 단계, 및 식물 세포 또는 그로부터의 식물을 재생시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 식물 세포의 게놈으로 안정한 통합을 위한 발현 시스템은 하기 구성요소 중 하나 이상을 함유할 수 있다: 식물 세포에 RNA 및/또는 TnpB 폴리펩티드 뉴클레아제를 발현하는데 사용될 수 있는 프로모터 구성요소; 발현을 증가시키기 위한 5' 미번역 영역; 일정 세포, 예컨대 단자엽 세포에서 발현을 더 증강시키기 위한 인트론 구성요소; 핵산 성분 분자 및/또는 TnpB 폴리펩티드 유전자 서열 및 다른 원하는 구성요소를 삽입시키기 위한 편리한 제한 부위를 제공하는 다중 클로닝 부위; 및 발현된 전사물의 효율적인 종결을 제공하는 3' 미번역 영역.
식물에서 일시적 발현
일 구현예에서, 조성물 및 시스템의 성분은 식물 세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. 일부 예에서, 조성물 및 시스템은 핵산 성분 분자 및 TnpB 폴리펩티드가 세포에 존재할 때만 표적 핵산을 변형시킬 수 있어서, 게놈 변형이 더 제어될 수 있다. TnpB 폴리펩티드의 발현이 일시적이므로 이러한 식물 세포로부터 재생된 식물은 전형적으로 외래 DNA를 함유하지 않는다. 일정 예에서, TnpB 폴리펩티드는 안정하게 발현되고 핵산 성분 분자 서열은 일시적으로 발현된다.
DNA 및/또는 RNA (예를 들어, mRNA)는 일시적 발현을 위해 식물 세포에 도입될 수 있다. 이러한 경우에 도입된 핵산은 세포를 변형시키기에 충분한 양으로 제공되지만 고려되는 시간 기간이 지난 후에 또는 하나 이상의 세포 분열 후에는 지속되지 않는다.
일시적 발현은 적합한 벡터를 사용해 달성될 수 있다. 일시적 발현에 사용될 수 있는 예시적인 벡터는 pEAQ 벡터 (아그로박테리움-매개 일시적 발현을 위해 재단될 수 있음) 및 양배추 잎말림 바이러스 (CaLCuV), 및 하기 문헌에 기술된 벡터를 포함한다: Sainsbury F. et al., Plant Biotechnol J. 2009 Sep;7(7):682-93; and Yin K et al., Scientific Reports volume 5, Article number: 14926 (2015).
상기 기술된 상이한 방법의 조합이 또한 고려된다.
특별한 식물 소기관에서 전좌 및/또는 발현
본 명세서의 조성물 및 시스템은 특별한 식물 소기관에서 전좌 및/또는 발현을 위한 구성요소를 포함할 수 있다.
엽록체 표적화
일 구현예에서, 조성물 및 시스템이 엽록체 유전자를 특이적으로 변형시키거나 또는 엽록체에서 발현을 보장하도록 사용되는 것을 고려한다. 조성물 및 시스템 (예를 들어, TnpB 폴리펩티드, 핵산 성분, 또는 그들 코딩 폴리뉴클레오티드)는 형질전환, 구획화, 및/또는 엽록체로 표적화될 수 있다. 예에서, 색소체 게놈으로 유전적 변형의 도입은 생물안전성 무제 예컨대 화분을 통한 유전자 흐름을 감소시킬 수 있다.
엽록체 형질전환 방법의 예는 입자 충격, PEG 처리, 및 미세주입, 및 핵 게놈에서 색소체로 형질전환 카세트의 전화를 포함한다. 일부 예에서, 엽록체의 표적화는 조성물 및 시스템의 성분을 코딩하는 서열의 5' 영역에 작동적으로 연결된, 엽록체 전이 펩티드 (CTP) 또는 색소체 전이 펩티드를 코딩하는 서열의 발현 구성체, 및/또는 엽록체 국재화 서열을 도입시켜서 획득될 수 있다. 엽록체의 형질전환, 표적화 및 국재화의 추가 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함하고, 이의 전문은 참조로 본 명세서에 편입된다: WO2010061186, Protein Transport into Chloroplasts, 2010, Annual Review of Plant Biology, Vol. 61: 157-180, and US 20040142476 (이들 전문이 참조로 본 명세서에 편입됨).
식물에서 예시적인 적용
조성물, 시스템, 및 방법은 관심 식물 (예를 들어, 작물)에서 유전적 변이(들)를 생성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 게놈의 하나 이상의 위치를 표적화하는 하나 이상의, 핵산 성분의 라이브러리의가 제공될 수 있고, TnpB 폴리펩티드와 함께 식물 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 게놈-규모 점 돌연변이 및 유전자 녹-아웃의 수집물이 생성될 수 있다. 일부 예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 그렇게 얻은 세포로부터 식물 부분 또는 식물을 생성시키고 관심 형질에 대해 세포를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 표적 유전자는 코딩 및 비-코딩 영역 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 형질은 스트레스 내성이고, 방법은 스트레스-내성 작물 변종의 생성을 위한 방법이다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 내생성 유전자를 변형시키거나 또는 그들 발현을 변형시키기 위해 사용된다. 성분의 발현은 TnpB 폴리펩티드, 및 임의로 재조합 주형 DNA의 도입에 의해서, 또는 표적화된 유전자의 변형에 의해서, 게놈의 표적화된 변형을 유도할 수 있다. 본 명세서에 기술된 상이한 전략은 식물 게놈으로 성분의 도입을 요구하지 않고, TnpB 폴리펩티드-매개 표적화 게놈 편집을 허용한다.
일부 경우에, 변형은 임의의 식물 게놈에 외래 DNA의 존재를 피하기 위해서, 본 명세서의 조성물의 성분을 코딩하는 것을 포함하여, 임의의 외래 유전자의 식물 게놈으로의 영구적인 도입없이 수행될 수 있다. 이것은 비-유전자이식 식물에 대한 규제 요건이 덜 엄격하므로 흥미로울 수 있다. 식물 세포에 일시적으로 도입된 성분은 전형적으로 교배 시 제거된다.
예를 들어, 변형은 조성물 및 시스템의 성분의 일시적 발현에 의해 수행될 수 있다. 일시적 발현은 바이러스 벡터에 의한 조성물 및 시스템의 성분 전달, 특정 분자 예컨대 나노입자 또는 CPP 도움으로 원형질체에 전달을 통해 수행될 수 있다.
원하는 형질을 갖는 식물의 생성
본 명세서의 조성물, 시스템, 및 방법은 식물에 원하는 형질을 도입하는데 사용될 수 있다. 접근법은 관심 형질을 부여하는 하나 이상의 외래 유전자의 도입, 관심 형질을 부여하도록 내생성 유전자의 편집 또는 조절을 포함한다.
농업적 형질
일 구현예에서, 작물 식물은 특별한 식물 형질에 영향을 미쳐서 개선될 수 있다. 형질의 예는 개선된 농업적 형질 예컨대 제조제 내성, 질환 내성, 비생물적 스트레스 내성, 고수확량, 및 우수한 품질, 살충제-내성, 질환 내성, 곤충 및 선충 내성, 기생 잡초 내성, 가뭄 내성, 영양가, 스트레스 내성, 자가 수분 배설, 마초 소화성 생물량, 및 곡물 수확량을 포함한다.
일 구현예에서, 해충 또는 질병에 대한 내성을 부여하는 유전자를 식물에 도입할 수 있다. 식물에 그러한 내성을 부여하는 내생성 유전자가 존재하는 경우에, 그들 발현 및 기능이 증강될 수 있다 (예를 들어, 추가 카피 도입, 발현 및/또는 활성 증가시키는 변형 도입).
내성을 부여하는 유전자의 예는 식물 질환 내성 유전자 (예를 들어, Cf- 9, Pto, RSP2, SlDMR6-1), 해충 내성 부여 유전자 (예를 들어, WO96/30517에 기재), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 단백질, 렉틴, 비타민-결합 단백질 (예를 들어, 아비딘), 효소 억제제 (예를 들어, 프로테아제 또는 프로테아나제 억제제 또는 아밀라제), 곤충 특이적 호르몬 또는 페로몬 (예를 들어, 엑디스테로이드 또는 유충 호르몬, 이의 변이체, 이에 기초한 모방체 또는 길항제) 또는 이의 작용제) 또는 이러한 호르몬 및 페로몬, 곤충 특이적 펩티드 또는 신경펩티드, 곤충 특이적 독 (예를 들어, 뱀, 말벌 등 또는 이의 유사체에 의해 생성됨)의 생성 및 조절에 관여하는 유전자, 모노터펜, 세스퀴터펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 살충 활성을 갖는 다른 비단백질 분자의 과축적의 원인인 효소, 물학적 활성 분자의 변형에 관여하는 효소 (예를 들어, 천연 또는 합성이건간에, 해당 효소, 단백질 분해 효소, 지질분해 효소, 뉴클레아제, 시클라제, 트랜스아미나제, 에스터라제, 히드록실라제, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 폴리머라제, 엘라스타제, 키티나제 및 글루카나제), 신호 전달을 자극하는 분자, 바이러스 - 침습성 단백질 또는 그로부터 유래된 복합 독소, 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생성된 발생-저지 단백질, 식물에 의해 자연에서 생성된 발생-저지 단백질, 또는 이의 임의 조합을 포함한다.
조성물, 시스템 및 방법은 특정 병원체, 예를 들어 숙주 특이적 병원체에 대한 감수성을 야기하는 유전적 가변성을 야기하는 돌연변이 또는 서열을 확인, 스크리닝, 도입 또는 제거하는 데 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 비-숙주 내성인 식물을 생성시킬 수 있는데, 예를 들어, 숙주 및 병원체는 양립할 수 없거나 또는 전형적으로 다수의 유전자에 의해 제어되는 모든 품종의 병원균에 대해 부분적 내성일 수 있고/있거나 일부 품종의 병원균에 대해서는 완전한 내성이지만 다른 품종에 대해서는 그렇지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 식물 질환에 관여되는 유전자를 변형시키는데 사용될 수 있다. 이러한 유전자는 제거, 불활성화, 또는 달리 조절 또는 변형될 수 있다. 식물 질환의 예는 US20140213619A1의 [0045]-[0080]에 기술된 것들을 포함하고, 이의 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
일 구현예에서, 제초제 내성을 부여하는 유전자가 식물에 도입될 수 있다. 제초제 내성을 부여하는 유전자의 예는 생장점 또는 분열조직을 억제하는 제조제, 예컨대 이미다졸리논 또는 술포닐우레아에 내성을 부여하는 유전자, 글리포세이트 내성 (예를 들어, 예를 들어, 각각 돌연변이체 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 유전자, aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 (GAT) 유전자가 부여하는 내성), 또는 다른 포스포노 화합물, 예컨대 글루포시네이트 (스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이세스 비리디크로모게네스 (Streptomyces viridichromogenes)를 포함한 스트렙토마이세스 종 유래 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자), 및 ACCase 억제제-코딩 유전자에 의한 피리디녹시 또는 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손)에 대한 내성을 부여하는 유전자, 광합성을 억제하는 제조제 (예컨대 트리아진 (psbA 및 gs+ 유저자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자), 및 글루타티온 S-트랜스퍼라제)에 대한 내성을 부여하는 유전자, 제초제 해독 효소 또는 억제 내성의 돌연변이체 글루타민 신타제 효소를 코딩하는 유전자, 해독 효소 코딩 유전자, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (예컨대 스트렙토마이세스 종 유래 bar 또는 pat 단백질)를 코딩하는 효소, 히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD) 억제제, 예를 들어, 천연 발생 HPPD 내성 효소를 코딩하는 유전자, 및 돌연변이 또는 키메라 HPPD 효소를 코딩하는 유전자를 포함한다.
일 구현예에서, 비생물적 스트레스에 관여하는 유전자가 식물에 도입될 수 있다. 유전자의 예는 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP) 유전자의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 것, PARG 코딩 유전자의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 이식 유전자, 니코틴아미다제, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제, 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 트랜스퍼라제, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 신써타제 또는 니코틴 아미드 포스포리보실트랜스퍼라제를 포함한 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 회수 합성 경로의 식물 기능성 효소를 코딩하는 유전자, 탄수화물 생합성에 관여하는 효소, 폴리프룩토스 (예를 들어, 이눌린 및 레반-유형)의 생산, 알파-1,6 분지 알파-1,4-글루칸의 생산, 알터난 생산, 히알루로난 생산에 관여하는 효소를 포함한다.
일 구현예에서, 가뭄 내성을 개선시키는 유전자가 식물에 도입될 수 있다. 유전자의 예는 유비퀴틴 단백질 리가제 단백질 (UPL) 단백질 (UPL3), DR02, DR03, ABC 수송체, 및 DREB1A를 포함한다.
영양적으로 개선된 식물
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 영양적으로 개선된 식물을 생산하는데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 이러한 식물은 기능성 식품, 예를 들어, 전통적으로 함유되는 영양분보다 건강적 이득을 제공할 수 있는 변형된 식품 또는 식품 성분을 제공할 수 있다. 일정 예에서, 이러한 식물은 약효 식품, 예를 들어, 질환의 예방 및 치료를 포함하여, 건강적 이득을 제공하고, 식품 또는 식품의 일부로 간주될 수 있는 물질을 제공할 수 있다. 약효 식품은 동물 및 인간에서 질환, 예를 들어, 암, 당뇨병, 심혈관 질환, 및 고혈압의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있다.
개선된 식품은 하나 이상의 원하는 화합물을 천연적으로 생산할 수 있고 변형은 화합물의 수준 또는 활성 또는 품질을 증강시킬 수 있다. 일부 경우에, 개선된 식물은 화합물(들)을 천연적으로 생산하지 않지만, 변형으로 이러한 화합물(들)을 생산하게 될 수 있다. 일부 경우에, 조성물, 시스템, 및 방법은 예를 들어, 이러한 화합물의 대사를 제어하는 하나 이상의 전사 인자를 변형시켜서 간접적으로 이들 화합물의 내생성 합성을 변형시키는데 사용될 수 있다.
영양적으로 개선된 식물의 예는 변형된 단백질 품질, 함량, 및/또는 분량, 함량 및/또는 아미노산 조성, 필수 아미노산 함량, 오일 및 지방산, 탄수화물, 비타민, 카로테노이드, 기능성 2차 대사산물, 및 미네랄을 포함하는 식물을 포함한다. 일부 예에서, 개선된 식물은 건강적 이득을 갖는 화합물을 포함할 수 있거나 또는 생산할 수 있다. 영양적으로 개선된 식물의 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Newell-McGloughlin, Plant Physiology, July 2008, Vol. 147, pp. 939-953.
생산할 수 있는 화합물의 예는 카로테노이드 (예를 들어, α-카로텐 또는 β-카로텐), 루테인, 리코펜, 제아잔틴, 식이 섬유 (예를 들어, 불용성 섬유, β-글루칸, 가용성 섬유, 지방산 (예를 들어, ω-3 지방산, 공액 리놀레산, GLA), 플라보노이드 (예를 들어, 히드록시신나메이트, 플라보놀, 카테킨 및 탄닌), 글루코시놀레이트, 인돌, 이소티오시아네이트 (예를 들어, 술포라판), 페놀릭 (예를 들어, 스틸벤, 카페산 및 페룰산, 에피카테킨), 식물 스타놀/스테롤, 프룩탄, 이눌린, 푸룩토-올리고당, 사포닌, 대두 단백질, 파이토에스트로겐 (예를 들어, 이소플라본, 리그난), 술피드 및 티올 예컨대 디알릴 술피드, 알릴 메틸 트리술피드, 디티올티온, 탄닌 예컨대 프로안트로시아니딘, 또는 이의 임의 조합을 포함한다.
조성물, 시스템, 및 방법은 또한 단백질/전분 기능성, 저장 수명, 맛/미관, 섬유 품질, 및 알레르겐, 항영양소, 및 독소 감소 형질을 변형시키기 위해 사용될 수 있다.
형질을 도입시키도록 변형될 수 있는 유전자 및 핵산의 예는 스테아릴-ACP 데사투라제, 낮은 수준의 피트산을 특징으로 하는 옥수수 돌연변이체의 원인인 단일 대립유전자와 연관된 DNA, Tf RAP2.2 및 이의 상호작용 파트너 SINAT2, Tf Dof1, 및 DOF Tf AtDof1.1 (OBP2)을 포함한다.
배수체 식물의 변형
조성물, 시스템, 및 방법은 배수체 식물을 변형시키는데 사용될 수 있다. 배수체 식물은 그들 게놈의 중복 카피를 보유한다 (예를 들어, 밀에서 처럼, 최대 6개). 일부 경우에, 조성물, 시스템, 및 방법은 유전자의 모든 카피에 영향을 미치거나, 또는 수십개 유전자를 한번에 표적화하도록 다중화될 수 있다. 예를 들어, 조성물, 시스템, 및 방법은 질환에 대한 방어의 억제를 담당하는 상이한 유전자에서 기능 상실 돌연변이를 동시에 보장하기 위해 사용될 수 있다. 변형은 백분병균에 밀 식물이 내성이게 보장하기 위해서, 밀 식물에서 TaMLO-Al, TaMLO-Bl 및 TaMLO-Dl 핵산 서열의 발현을 동시에 억제하여서 그로부터 밀 식물을 재생시킬 수 있다 (예를 들어, WO2015109752 참조).
과실-숙성 조절
조성물, 시스템, 및 방법은 과실의 숙성을 조절하는데 사용될 수 있다. 숙성은 과일 및 채소의 숙성 과정에서 정상적인 단계이다. 시작 후에 단지 며칠 만에 과실 또는 채소를 먹을 수 없게 되어서, 농부와 소비자 모두에게 상당한 손실을 가져올 수 있다.
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 에틸렌 생산을 감소시키는데 사용된다. 일부 예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 발현 및/또는 활성 of ACC 신타제의 발현 및/또는 활성을 억제하고, ACC 데아미나제 유전자 또는 이의 기능성 단편을 삽입시키고, SAM 히드롤라제 유전자 또는 이의 기능적 단편을 삽입하고, ACC 옥시다제 유전자 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 조성물, 시스템, 및 방법은 에틸렌 수용체 (예를 들어, ETR1 억제) 및/또는 폴리갈락투로나제 (PG)를 변형시키는데 사용될 수 있다. 유전자의 억제는 돌연변이, 안티센스 서열, 및/또는 유전자의 절두된 카피를 게놈에 도입시켜서 획득될 수 있다.
식물의 저장 수명 증가
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 식물 또는 식물 일부분의 저장 수명에 영향을 미치는 화합물의 생산에 관여되는 유전자를 변형시키는데 사용된다. 변형은 감자 괴경에서 환원당의 축적을 방지하는 유전자에 있을 수 있다. 고온 처리 시, 이들 환원당은 유리 아미노산과 반응하여서, 갈색의, 쓴 맛이 나는 생성물 및 잠재적 발암 물질인 아크릴아미드의 상승된 수준을 초래한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 수크로스를 글루코스 및 프룩토스로 분해하는 단백질을 코딩하는 액포성 인버타제 유전자 (VInv)의 발현을 감소시키거나 또는 억제하는데 사용된다.
식물에서 알레르겐 감소
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 소비자에게 더 안전하게 만들도록, 알레르겐의 수준이 감소된 식물을 생성시키는데 사용된다. 이를 위해서, 조성물, 시스템, 및 방법은 식물 알레르겐의 생산을 담당하는 하나 이상의 유전자를 확인하고 변형 (예를 들어, 저해)하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 Lol p5를 비롯하여, 땅콩, 대두, 렌틸, 완두콩, 루핀, 녹색콩, 녹두의 것을 비롯하여, 하기 문헌에 기술된 것들을 포함하고, 문헌은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다: Nicolaou et al., Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 2011;11(3):222) (이의 전문이 참조로 본 명세서에 편입됨).
웅성 불임 식물의 생성
조성물, 시스템, 및 방법은 웅성 불임 식물을 생성시키는데 사용될 수 있다. 잡종 식물은 전형적으로 근친교배 식물에 비해 유리한 작물학적 형질을 갖는다. 그러나, 자기-수분 식물의 경우, 잡종의 생성은 어려울 수 있다. 상이한 식물 유형 (예를 들어, 옥수수 및 쌀)에서, 식물 생식력, 보다 특히 웅성 생식력에 중요한 유전자가 확인되었다. 이러한 유전자 변형되는 식물은 잡종 육종 프로그램에 사용될 수 있다.
조성물, 시스템, 및 방법은 웅성 생식력에 관여되는 유전자 변형, 예를 들어, 웅성 생식력에 요구되는 유전자를 불활성화 (예컨대, 돌연변이 도입에 의함)시키는데 사용될 수 있다. 웅성 생식력에 관여되는 유전자의 예는 시토크롬 P450-유사 유전자 (MS26) 또는 메가뉴클레아제 유전자 (MS45), 및 하기 문헌에 기술된 것을 포함한다: Wan X et al., Mol Plant. 2019 Mar 4;12(3):321-342; 및 Kim YJ, et al., Trends Plant Sci. 2018 Jan;23(1):53-65.
식물 수정 단계의 증가
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 식물 예컨대 벼의 수정 단계를 연장시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 벼 수정 단계 유전자 예컨대 Ehd3은 식물에 돌연변이를 생성시키기 위해 표적화될 수 있고 소식물체는 연장된 재생 식물 수정 단계를 위해 선택될 수 있다.
생산물 조기 수확량 생산
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 생산물의 조기 수확량을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 개화 과정은 예를 들어, 개화 억제인자 유전자 예컨대 SP5G를 돌연변이시켜서 조절될 수 있다. 이러한 접근법의 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Soyk S, et al., Nat Genet. 2017 Jan;49(1):162-168.
오일 및 생물연료 생산
조성물, 시스템, 및 방법은 오일 및 생물연료 생산을 위한 식물을 생성시키는데 사용될 수 있다. 생물연료는 식물 및 식물 유래 자원으로 만든 연료를 포함한다. 생물연료는 에너지가 탄소 고정 과정을 통해 수득되거나 또는 생물량의 사용 또는 전환을 통해 만들어지는 유기물로부터 추출될 수 있다. 이러한 생물량은 직접적으로 생물연료로 사용될 수 있거나 또는 열 전환, 화학 전환, 및 생화학 전환에 의해 편리한 에너지 함유 물질로 전환될 수 있다. 생물량 전환은 고체, 액체, 또는 가스 형태의 연료를 생성시킬 수 있다. 생물연료는 바이오에탄올 및 바이오디젤을 포함한다. 바이오에탄올은 옥수수 및 사탕수수로부터 유래되는, 셀룰로스 (전분)의 당 발효 과정에 의해 생산될 수 있다. 바이오디젤은 오일 작물, 예컨대 유채, 야자수, 및 대두로부터 생산될 수 있다. 생물연료는 운송에 사용될 수 있다.
식물성 오일 및 생물연료의 생산을 위한 식물의 생성
조성물, 시스템, 및 방법은 높은 수준의 오일 또는 생물연료를 발현 또는 과발현하는 조류 (예를 들어, 규조류) 및 다른 식물 (예를 들어, 포도)를 생성시키는데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 조성물, 시스템, 및 방법은 지질의 양 및/또는 지질의 품질 변형에 관여되는 유전자를 변형시키는데 사용될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 지방산 합성 경로에 관여되는 것들, 예를 들어, 아세틸-CoA 카르복실라제, 지방산 신타제, 3-케토아실_아실-캐리어 단백질 신타제 III, 글리세롤-3-포스페이트 데스히드로게나제 (G3PDH), 에노일-아실 캐리어 단백질 리덕타네 (에놀-ACP-리덕타네), 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제, 리소포스파티드산 아실 트랜스퍼라제 또는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제, 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제, 포스파티데이트 포스파타제, 지방산 티오에스터라제 예컨대 팔미토일 단백질 티오에스터라제, 또는 말산 효소 활성을 포함한다.
추가 구현예에서, 지질 축적이 증가된 규조류를 생성시키는 것이 계획된다. 이것은 지질 이화작용을 감소시키는 유전자를 표적으로 하여 달성될 수 있다. 유전자의 예는 트리아실글리세롤 및 유리 지방산의 활성화, 지방산의 β-산화에 관여되는 것들, 예컨대 아실--CoA 신써타제, 3-케토아실-CoA 티올라제, 아실-CoA 옥시다제 활성 및 포스포글루코뮤타제의 유전자를 포함한다.
일부 예에서, 조류는 지방산 (예를 들어, 지방 에스테르 예컨대 산 메틸 에스테르 (FAME) 및 지방산 에틸 에스테르 (FAEE))을 포함하여, 오일 및 생물연료의 생산을 위해 변형될 수 있다. 미세조류를 변형시키는 방법은 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Stovicek et al. Metab. Eng. Comm., 2015; 2:1; 미국 특허 제8,945,839호; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/086795.
일부 예에서, 하나 이상의 유전자를 식물 (예를 들어, 조류)에 도입 (예를 들어, 과발현)하여서 탄소원 (예를 들어, 알콜)으로부터 오일 및 생물연료 (예를 들어, 지방산)를 생산할 수 있다. 유전자의 예는 아실-CoA 신타제, 에스테르 신타제, 티오에스터라제 (예를 들어, tesA, 'tesA, tesB, fatB, fatB2, fatB3, fatAl, 또는 fatA), 아실-CoA 신타제 (예를 들어, fadD, JadK, BH3103, pfl-4354, EAV15023, fadDl, fadD2, RPC_4074,fadDD35, fadDD22, faa39), 에스테르 신타제 (예를 들어, 신몬드시아 키넨시스 (Simmondsia chinensis), 아시네토박터 (Acinetobacter) sp. ADP, 알카니보락스 보르쿠멘시스 (Alcanivorax borkumensis), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa),푼디박터 자덴시스 (Fundibacter jadensis), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 또는 알칼리게네스 유트로푸스 (Alkaligenes eutrophus), 또는 이의 변이체 유래 신타제/아실-CoA:디아실글리세릴아실트랜스퍼라제)를 코딩하는 유전자를 포함한다.
추가로 또는 대안적으로, 식물 (예를 들어, 조류)에서 하나 이상의 유전자가 불활성화될 수 있다 (예를 들어, 유전자 발현이 감소). 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이가 유전자에 도입될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 아실-CoA 데히드로게나제 (예를 들어, fade), 외막 단백질 수용체,및 지방산 생합성의 전사 조절인자 (예를 들어, 억제인자) (예를 들어, fabR), 피루베이트 포르메이트 리아제 (예를 들어, pflB), 락테이트 데히드로게나제 (예를 들어, IdhA)를 코딩하는 유전자를 포함한다.
유기산 생산
일 구현예에서, 식물은 유기산, 예컨대 락트산을 생산하도록 변형될 수 있다. 식물은 당, 펜토스 또는 헥소스 당을 사용해 유기산을 생산할 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 하나 이상의 유전자가 식물에 도입 (예를 들어, 과발현)될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 LDH 유전자를 포함한다.
일부 예에서, 하나 이상의 유전자가 불활성화 될 수 있다 (예를 들어, 유전자 발현이 감소됨). 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이가 유전자에 도입될 수 있다. 유전자는 관심 유기산 이외의 대사산물을 생산하는 내생성 대사경로에 관여되는 단백질을 코딩하는 것을 포함할 수 있고/있거나, 내생성 대사 경로는 유기산을 소비한다.
변형되거나 또는 도입될 수 있는 유전자의 예는 피루베이트 데카르복실라제 (pdc), 푸마레이트 리덕타제, 알콜 데히드로게나제 (adh), 아세트알데히드 데히드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 (ppc), D-락테이트 데히드로게나제 (d-ldh), L-락테이트 데히드로게나제 (l-ldh), 락테이트 2-모노옥시게나제, 락테이트 데히드로게나제, 시토크롬-의존적 락테이트 데히드로게나제 (예를 들어, 시토크롬 B2-의존적 L-락테이트 데히드로게나제)를 코딩하는 것을 포함한다.
생물연료 생산을 위한 식물 성질 향상
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 발효를 위해 보다 효율적인 당 방출을 위한 핵심 가수분해제에 의한 접근이 용이하도록 식물의 세포벽 성질을 변셩시키는데 사용된다. 식물에서 리그닌 비율을 감소시켜서 셀룰로스 비율을 증가시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 리그닌 생합성은 발효가능 탄수화물을 증가시키기 위해 식물에서 하향조절될 수 있다.
일부 예에서, 하나 이상의 리그닌 생합성 유전자가 하향조절될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 4-쿠마레이트 3-히드록실라제 (C3H), 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL), 신나메이트 4-히드록실라제 (C4H), 히드록시신나모일 트랜스퍼라제 (HCT), 카페산 O-메틸트랜스퍼라제 (COMT), 카페오일 CoA 3-O-메틸트랜스퍼라제 (CCoAOMT), 페룰레이트 5-히드록실라제 (F5H), 신나밀 알콜 데히드로게나제 (CAD), 신나모일 CoA-리덕타제 (CCR), 4-쿠마레이트-CoA 리가제 (4CL), 모노리그놀-리그닌-특이적 글리코실트랜스퍼라제, 및 알데히드 데히드로게나제 (ALDH), 및 WO 2008064289에 기술된 것을 포함한다.
일부 예에서, 발효 동안 보다 낮은 수준의 아세트산을 생산하는 식물량이 감소될 수 있다. 이를 위해서, 다당류 아세틸화에 관여되는 유전자 (예를 들어, Cas1L 및 WO 2010096488에 기술된 것들)가 불활성화될 수 있다.
오일 및 생물연료 생산을 위한 기타 미생물
일 구현예에서, 식물 이외의 미생물이 본 명세서의 조성물, 시스템, 및 방법을 사용해 오일 및 생물연료를 생산하는데 사용될 수 있다. 미생물의 예는 에스케리치아 (Escherichia), 바실러스 (Bacillus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 로도코커스 (Rhodococcus), 시네코코쿠스 (Synechococcus), 시네코이스티스 (Synechoystis), 슈도모나스 (Pseudomonas), 아스퍼질러스 (Aspergillus), 트리코더마 (Trichoderma), 뉴로스포라 (Neurospora), 푸사리움 (Fusarium), 휴미콜라 (Humicola), 리조무코르 (Rhizomucor), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 무코르 (Mucor), 마이셀리오프토라 (Myceliophtora), 페니시릴움 (Penicillium), 파네로카에테 (Phanerochaete), 플레우로투스 (Pleurotus), 트라메테스 (Trametes), 크리소스포리움 (Chrysosporium), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 스테노트로파모나스 (Stenotrophamonas), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 야로위아 (Yarrowia), 또는 스트렙토마이세스 (Streptomyces)의 속의 것들을 포함한다.
식물 배양 및 재생
일 구현예에서, 변형된 식물 또는 식물 세포는 형질전환 또는 변형된 유전자형 및 따라서 원하는 표현형을 보유하는 전체 식물을 재생시키기 위해 배양될 수 있다. 재생 기술의 예는 조직 배양 성장 배지에서 일정 식물 호르몬의 조작에 의존하는 것, 배양된 원형질체, 식물 캘러스, 외식편, 기관, 꽃가루, 배아 또는 그 일부에서 얻은 원하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 및/또는 제초제 마커에 의존하는 것이 포함된다.
식물 게놈-선별 마커에서의 변형 검출
조성물, 시스템 및 방법을 사용하여 식물을 변형시키는 경우, 적합한 방법을 사용하여 식물에서 이루어진 변형을 확인하고 검출할 수 있다. 일부 예에서, 다양한 변형이 이루어진 경우, 하나 이상의 원하는 변형 또는 변형에 의한 형질이 선택 및 검출될 수 있다. 검출 및 확인은 생화학 및 분자 생물학 기술, 예컨대 서던 분석, PCR, 노던 블롯, S1 RNAse 보호, 프라이머-연장, 또는 역전사효소-PCR, 효소 어세이, 리보자임 활성, 겔 전기영동, 웨스턴 블롯, 면역침강, 효소-연결 면역어세이, 제자리 혼성화, 효소 염색, 및 면역염색에 의해 수행될 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 마커, 예컨대 선별가능 및 검출가능 마커가 식물에 도입될 수 있다. 이러한 마커는 원하는 변형 및 형질을 갖는 세포 및 식물을 선택, 모니터링, 단리하는데 사용될 수 있다. 선별가능 마커는 양성 또는 음성 선택을 부여할 수 있고 외부 기질 존재에 대해 조건적 또는 비-조건적이다. 이러한 마커의 예는 항생제 예컨대 하이그로마이신 (hpt) 및 카나마이신 (nptII)에 대한 내성을 부여하는 유전자 및 단백질, 및 제초제, 예컨대 포스피노트리신 (bar) 및 크롤로술푸론 (als)에 내성을 부여하는 유전자, 유색 물질을 생산 또는 처리할 수 있는 효소 (예를 들어, β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, B 또는 C1 유전자)를 포함한다.
진균에서 적용
본 명세서에 기술된 조성물, 시스템, 및 방법은 진균 또는 진균 세포, 예컨대 효모에서 효율적이고 비용 효율적인 유전자 또는 게놈 조사 또는 편집 또는 조작을 수행하는데 사용될 수 있다. 식물에서 접근법 및 적용이 진균에도 적용될 수 있다.
진균 세포는 진균계의 임의 유형의 진핵생물 세포, 예컨대 아스코마이코타 (Ascomycota) 바시디오마이코타 (Basidiomycota), 플라스토클라디오마이코타 (Blastocladiomycota) 키트리디오마이코타 (Chytridiomycota), 글로메로마이코타 (Glomeromycota), 미크로스포리디아 (Microsporidia) 및 네오칼리마스티고마이코타 (Neocallimastigomycota) 문을 포함할 수 있다. 진균 또는 진규 세포의 예는 효모, 곰팡이 사상 진균을 포함한다.
일 구현예에서, 진균 세포는 효모 세포이다. 효모 세포는 아스코마이코타 및 바시디오마이코타 문의 임의 진균 세포를 의미한다. 효모의 예는 발아 효모, 핵분열 효모, 및 곰팡이, 에스. 세레비지아에 (S. cerervisiae), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 이삭켄키아 오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis), 칸디다 (Candida) 종, (예를 들어, 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)), 야로위아 (Yarrowia) 종 (예를 들어, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)), 피키아 (Pichia) 종, (예를 들어, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종 (예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 및 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus)), 뉴로스포라 (Neurospora) 종 (예를 들어, 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)), 푸사리움 (Fusarium) 종 (예를 들어, 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)), 및 이사켄시아 (Issatchenkia) 종 (예를 들어, 이사켄시아 오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis), 피키아 쿠드리아브제비 (Pichia kudriavzevii) 및 칸디다 아시도써모필룸 (Candida acidothermophilum))을 포함한다.
일 구현예에서, 진균 세포는 필라멘트, 예를 들어, 균사 또는 균사체로 성장하는 사상 진균 세포이다. 사상 진균 세포의 예는 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종 (예를 들어, 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger)), 트리코더마 (Trichoderma ) 종 (예를 들어, 트리코더마 레세이 (Trichoderma reesei)), 리조푸스 (Rhizopus) 종 (예를 들어, 리조푸스 오리자에 (Rhizopus oryzae)), 및 모르티에렐라 (Mortierella) 종 (예를 들어, 모르티에렐라 이사벨리나 (Mortierella isabellina))를 포함한다.
일 구현예에서,진균 세포는 산업적 균주이다. 산업적 균주는 산업 공정, 예를 들어 상업적 또는 산업적 규모로 제품 생산에 사용되거나 또는 그로부터 단리된 진균 세포의 임의 균주를 포함한다. 산업적 균주는 산업적 공정에서 전형적으로 사용되는 진균 종을 지칭하거나 또는 또한 비산업적 목적 (예를 들어, 산업적 연구)을 위해 사용될 수 있는 진균 종의 단리물을 지칭할 수 있다. 산업적 공정의 예는 (예를 들어, 식품 또는 음료 제품의 생산에서) 발효, 증류, 생물연료 생산, 화합물의 생산 및 폴리펩티드의 생산을 포함한다. 산업적 균주의 예는 제한 없이, JAY270 및 ATCC4124를 포함한다.
일 구현예에서, 진균 세포는 그 게놈이 하나 초과의 카피로 존재하는 배수체 세포이다. 배수체 세포는 배수체 상태로 자연계에서 발견되는 세포, 및 배수체 상태로 존재하도록 유도된 세포 (예를 들어, 감수분열, 세포질분열, 또는 DNA 복제의 특이적 조절, 변경, 불활성화, 활성화, 또는 변형에 의함)를 포함한다. 배수체 세포는 전체 게놈이 배수체인 세포일 수 있거나, 또는 특정한 관심 게놈 유전자좌에서 배수체인 세포일 수 있다. 일부 예에서, 핵산 성분 분자의 존재비는 보다 더 종종 반수체 세포에 비해서 배수체 세포의 게놈 조작에서 속도-제한 성분일 수 있고, 따라서, 본 명세서의 조성물을 사용하는 방법은 일정 진균 세포 유형을 사용하여 활용할 수 있다.
일 구현예에서, 진균 세포는 이배체 세포로서, 이의 게놈이 2개 카피로 존재한다. 이배체 세포는 이배체 상태로 자연적으로 발견되는 세포, 및 이배체 상태로 존재하도록 유도된 세포 (예를 들어, 감수분열, 세포질분열, 또는 DNA 복제의 특이적 조절, 변경, 불활성화, 활성화, 또는 변형에 의함)를 포함한다. 이배체 세포는 그의 전체 게놈이 이배체인 세포를 지칭할 수 있거나, 특정한 관심 게놈 유전자좌 내 이배체인 세포를 지칭할 수 있다.
일 구현예에서, 진균 세포는 그의 게놈이 1개 카피로 존재하는 반수체 세포이다. 반수체 세포는 빈수체 상태로 자연적으로 발견되는 세포, 및 반수체 상태로 존재하도록 유도된 세포 (예를 들어, 감수분열, 세포질분열, 또는 DNA 복제의 특이적 조절, 변경, 불활성화, 활성화, 또는 변형에 의함)를 포함한다. 반수체 세포는 그의 전체 게놈이 반수체인 세포를 지칭할 수 있거나, 특정한 관심 게놈 유전자좌 내 반수체인 세포를 지칭할 수 있다.
조성물 및 시스템, 및 이를 코딩하는 핵산은 본 명세서에 기술된 전달 시스템 및 방법을 사용해 진균 세포에 도입될 수 있다. 전달 시스템의 예는 리튬 아세테이트 처리, 충격, 전기천공 및 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Kawai et al., 2010, Bioeng Bugs. 2010 Nov-Dec; 1(6): 395-403.
일부 예에서, 효모 발현 벡터 (예를 들어, 하나 이상의 조절 구성요소를 갖는 것)가 사용될 수 있다. 이러한 벡터의 예는 동원체 (CEN) 서열, 자율 증식 서열 (ARS), 프로모터, 예컨대, 관심 서열 또는 유전자에 작동적으로 연결된, RNA 폴리머라제 III 프로모터, RNA 폴라머라제 III 종결자와 같은 종결자, 복제 기원, 및 마커 유전자 (예를 들어, 영양요구성, 항생성, 또는 다른 선별 마커)를 함유할 수 있다. 효모에서 사용하기 위한 발현 벡터의 예는 플라스미드, 효모 인공 염색체, 2μ 플라스미드, 효모 통합 플라스미드, 효모 복제성 플라스미드, 셔틀 벡터 및 에피솜 플라스미드를 포함할 수 있다.
진균에 의한 생물연료 및 재료 생산
일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 생물연료 및 재료 생산을 위해 변형된 진균을 생성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 발효가능한 당으로부터 생물연료 또는 생물중합체를 생산하고, 임의로 발효가능한 당의 공급원으로서 농업 폐기물로부터 유래된 식물-유래 리그노셀룰로스를 분해할 수 있도록 진균을 변형시킨다. 생물연료 생산 및 합성에 필요한 외래 유전자가 진균에 도입될 수 있다. 일부 예에서, 유전자는 피루베이트를 에탄올 또는 다른 관심 생성물로 전환, 셀룰로스 분해 (예를 들어, 셀룰라제), 생물연료 생산 경로와 경쟁하는 내생성 대사 경로에 관여되는 효소를 코딩할 수 있다.
일부 예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 개선된 자일로스 또는 셀로비오스 이용성, 이소프레노이드 생합성, 및/또는 락트산 생산의 효모 균주를 생성 및/또는 선택하기 위해 사용될 수 있다. 이들 화합물의 물질대사 및 합성에 관여되는 하나 이상의 유전자가 변형될 수 있고/있거나 효모 세포에 도입될 수 있다. 방법 및 유전자의 예는 락테이트 데히드로게나제, PDC1 및 PDC5, 및 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Ha, S.J., et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(2):504-9 and Galazka, J.M., et al. (2010) Science 330(6000):84-6; Jakociunas T et al., Metab Eng. 2015 Mar;28:213-222; Stovicek V, et al., FEMS Yeast Res. 2017 Aug 1;17(5).
개선된 식물 및 효모 세포
본 개시는 개선된 식물 및 진균을 더 제공한다. 개선된 진균은 본 명세서의 조성물, 시스템, 및 방법에 의해 도입된 하나 이상의 유전자 및/또는 변형된 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 개선된 식물 및 진균은 증가된 식품 또는 사료 생산 (예를 들어, 높은 단백질, 탄수화물, 영양분 또는 비타민 수준), 오일 및 생물연료 생산 (예를 들어, 메탄올, 에탄올), 해충, 제초제, 가뭄, 저온 또는 고온, 과량의 물에 대한 내성을 가질 수 있다.
식물 또는 진균은 개량된 하나 이상의 부분, 예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리, 덩이줄기, 종자, 배젖, 밑주름 및 화분을 가질 수 있다. 부분은 생존, 비생준, 재생가능, 및/또는 재생불가일 수 있다.
개량된 식물 및 진균은 개량된 식물 및 진균의 배우체, 종자, 배아, 접합체 또는 체세포, 자손 및/또는 잡종을 포함할 수 있다. 자손은 생산된 식물 또는 동물의 클론일 수 있거나, 또는 그들 자손에 바람직한 형질을 더 유전자이입하기 위해 동일 종의 다른 개체와 교배시켜서 유성생식으로부터 얻어질 수 있다. 세포는 다세포 유기체, 특히 식물에서 생체내 또는 생체외일 수 있다.
식물에서 추가 적용
식물 및 진균에 대한 조성물, 시스템, 및 방법의 추가 적용은 다음을 포함한다: 유전자 구성요소 동역학의 가시화 (예를 들어, Chen B, et al., Cell. 2013 Dec 19;155(7):1479-91), 시험관내 및 생체내에서 표적화된 유전자 파괴 양성-선택 (Malina A et al., Genes Dev. 2013 Dec 1;27(23):2602-14), 예컨대 TnpB 폴리펩티드 및 히스톤-변형 효소의 융합체를 사용한 후생적 변형 (예를 들어, Rusk N, Nat Methods. 2014 Jan;11(1):28), 전사 조절인자 확인(예를 들어, Waldrip ZJ, Epigenetics. 2014 Sep;9(9):1207-11), RNA 및 DNA 바이러스에 대한 항-바이러스 치료 (예를 들어, Price AA, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 May 12;112(19):6164-9; Ramanan V et al., Sci Rep. 2015 Jun 2;5:10833), 게놈 복잡성 예컨대 염색체 수의 변경 (예를 들어, Karimi-Ashtiyani R et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Sep 8;112(36):11211-6; Anton T, et al., Nucleus. 2014 Mar-Apr;5(2):163-72), 제어된 불활성화/활성화를 위한 조성물의 자기-절단 (예를 들어, Sugano SS et al., Plant Cell Physiol. 2014 Mar;55(3):475-81), 다중화 유전자 편집 (Kabadi AM et al., Nucleic Acids Res. 2014 Oct 29;42(19):e147), 다중 게놈 편집용 키트의 개발 (Xing HL et al., BMC Plant Biol. 2014 Nov 29;14:327), 전분 생산 (Hebelstrup KH et al., Front Plant Sci. 2015 Apr 23;6:247), 패밀리 또는 경로에서 다수 유전자 표적화 (예를 들어, Ma X et al., Mol Plant. 2015 Aug;8(8):1274-84), 비-코딩 유전자 및 서열의 조절 (예를 들어, Lowder LG, et al., Plant Physiol. 2015 Oct;169(2):971-85), 나무의 유전자 편집 (예를 들어, Belhaj K et al., Plant Methods. 2013 Oct 11;9(1):39; Harrison MM, et al., Genes Dev. 2014 Sep 1;28(17):1859-72; Zhou X et al., New Phytol. 2015 Oct;208(2):298-301), 숙주-특이적 병원체 및 해충에 대한 내성을 위한 돌연변이 도입.
조성물, 시스템, 및 방법을 사용해 수행할 수 있는 식물 및 진균의 변형의 추가 예는 하기 문헌에 기술된 유사한 변형을 포함한다: 국제 특허 출원 공개 번호 WO2016/099887, WO2016/025131, WO2016/073433, WO2017/066175, WO2017/100158, WO 2017/105991, WO2017/106414, WO2016/100272, WO2016/100571, WO 2016/100568, WO 2016/100562, 및 WO 2017/019867.
비-인간 동물에서 적용
조성물, 시스템, 및 방법은 예를 들어, 원하는 형질 및 질환 회복력을 도입하고, 번식을 촉진하기 위해서, 비-인간 동물을 연구 및 변형시키는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 방법은 번식을 개선하고 원하는 형질을 도입하기 위해서, 예를 들어, 형질-연관 대립유전자 빈도의 증가, 연관 드래그없이 다른 품종/종으로부터 대립유전자의 이입, 및 신규한 바람직한 대립유전자의 생성을 위해서 사용될 수 있다. 표적화할 수 있는 유전자 및 다른 유전자 구성요소는 스크리닝하고 확인할 수 있다. 적용 및 접근법의 예는 하기 문헌에 기술된 것들을 포함하고 이들 전체를 참조로 본 명세서에 편입시킨다: Tait-Burkard C, et al., Livestock 2.0 - genome editing for fitter, healthier, and more productive farmed animals. Genome Biol. 2018 Nov 26;19(1):204; Lillico S, Agricultural applications of genome editing in farmed animals. Transgenic Res. 2019 Aug;28(Suppl 2):57-60; Houston RD, et al., Harnessing genomics to fast-track genetic improvement in aquaculture. Nat Rev Genet. 2020 Apr 16. doi: 10.1038/s41576-020-0227-y. 다른 섹션에 기술된 적용, 예컨대 치료제, 진단제 등이 또한 본 명세서에서 동물에 사용될 수 있다.
조성물, 시스템, 및 방법은 동물 예컨대 어류, 양서류, 파충류, 포유류, 및 조류에서 사용될 수 있다. 동물은 농장 및 농업 동물, 또는 반려동물일 수 있다. 농장 및 농업 동물의 예는 말, 염소, 양, 돼지, 소, 라마, 알파카 및 새, 예를 들어, 닭, 칠면조, 오리 및 거위를 포함한다. 동물은 비-인간 영장류, 예를 들어, 개코원숭이, 꼬리감는 원숭이, 침팬지, 여우 원숭이, 짧은 고리 원숭이 마 모센, 타마린, 거미 원숭이, 다람쥐 원숭이, 버벳 원숭이일 수 있다. 반려동물의 예는 개, 고양이, 말, 늑대, 토끼, 페럿, 게르빌루스쥐, 햄스터, 친칠라, 팬시 래트, 기니 피그, 카나리아, 잉꼬 및 앵무새를 포함한다.
일 구현예에서, 하나 이상의 유전자가 동물에 도입 (예를 들어, 과발현)되어서 하나 이상의 원하는 형질을 수득하거나 또는 향상시킬 수 있다. 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF-1)를 동물, 예를 들어, 돼지 또는 연어의 성장을 증가시키기 위해 도입할 수 있다 (예컨대, Pursel VG et al., J Reprod Fertil Suppl. 1990;40:235-45; Waltz E, Nature. 2017;548:148에 기술됨). Fat-1 유전자 (예를 들어, 씨. 엘레강스 (C. elegans) 유래)가 더 높은 비율의 n-3 대 n-6 지방산의 생산을 위해 도입될 수 있고, 예를 들어, 돼지에서 유도될 수 있다 (예컨대 Li M, et al., Genetics. 2018;8:1747-54). 파이타제 (예를 들어, 이. 콜라이 유래), 자일라나제 (예를 들어, 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger) 유래), 베타-글루카나제 (예를 들어, 바실러스 리케니포르미스 (bacillus lichenformis) 유래)가 예를 들어, 돼지에서, 인 및 질소 방출 감소를 통해 환경 영향을 감소시키기 위해 도입될 수 있다 (예컨대, Golovan SP, et al., Nat Biotechnol. 2001;19:741-5; Zhang X et al., elife. 2018에 기술됨). s핵산 성분 디코이는 예를 들어, 닭에서 조류 인플루엔자 회복력을 유도하기 위해 도입될 수 있다 (예컨대, Lyall et al., Science. 2011;331:223-6에 기술됨). 리소자임 또는 리소스타핀은 예를 들어, 염소 및 소에서 유선염 회복력을 유도하기 위해 도입될 수 있다 (예컨대, Maga EA et al., Foodborne Pathog Dis. 2006;3:384-92; Wall RJ, et al., Nat Biotechnol. 2005;23:445-51에 기술됨). 히스톤 데아세틸라제 예컨대 HDAC6은 예를 들어, 돼지에서 PRRSV 회복력을 유도하기 위해 도입될 수 있다 (예컨대, Lu T., et al., PLoS One. 2017;12:e0169317에 기술됨). CD163은 돼지에서 PRRSV 회복력을 도입하도록 변형 (예를 들어, 불활성화 또는 제거)된다 (예컨대, Prather RS et al., Sci Rep. 2017 Oct 17;7(1):13371에 기술됨). 유사한 접근법이 동물에서 인간으로 전파될 수 있는 바이러스 및 박테리아 (예를 들어, 인플루엔자 C 및 H1N1, H1N2, H2N1, H3N1, H3N2, 및 H2N3으로 알려진 인플루엔자 A 아형을 비롯하여, 폐렴, 수막염 및 부종을 포함한 돼지 인플루엔자 바이러스 (SVI) 균주)를 억제하거나 또는 제거하기 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 유전자가 질환 내성 및 생산 형질을 위해 변형 또는 편집될 수 있다. 미오스타틴 (예를 들어, GDF8)은 예를 들어, 소, 양, 염소, 메기, 및 돼지에서 근육 성장을 증가시키기 위해 변형될 수 있다 (예컨대, Crispo M et al., PLoS One. 2015;10:e0136690; Wang X, et al., Anim Genet. 2018;49:43-51; Khalil K, et al., Sci Rep. 2017;7:7301; Kang J-D, et al., RSC Adv. 2017;7:12541-9에 기술됨). Pc POLLED는 예를 들어, 소에서 무혈을 유도하기 위해 변형될 수 있다 (예컨대, Carlson DF et al., Nat Biotechnol. 2016;34:479-81에 기술됨). KISS1R 은 예를 들어, 돼지에서 보어테인트 (성적 성숙 동안 원치않는 고기맛을 초래하는 호르몬 방출)를 유도하도록 변형될 수 있다. 데드 말단 단백질 (dnd)은 예를 들어, 연어에서 불임을 유도하도록 변형될 수 있다 (예컨대, Wargelius A, et al., Sci Rep. 2016;6:21284에 기술됨). Nano2 및 DDX는 예를 들어, 돼지 및 닭에서 불임 (예를 들어, 대리 숙주)을 유도하기 위해 변형될 수 있다 (예컨대, Park K-E, et al., Sci Rep. 2017;7:40176; Taylor L et al., Development. 2017;144:928-34에 기술됨). CD163은 예를 들어, 돼지에서 PRRSV 회복력을 유도하도록 변형될 수 있다 (예컨대, Whitworth KM, et al., Nat Biotechnol. 2015;34:20-2에 기술됨). RELA는 예를 들어, 돼지에서 ASFV 회복력을 유도하기 위해 변형될 수 있다 (예컨대, Lillico SG, et al., Sci Rep. 2016;6:21645에 기술됨). CD18은 예를 들어, 소에서 만헤이미아 (파스퇴렐라) 해몰리티카 (Mannheimia (Pasteurella) haemolytica) 회복력을 유도하기 위해 변형될 수 있다 (예컨대, Shanthalingam S, et al., roc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:13186-90에 기술됨). NRAMP1은 예를 들어, 소에서 결핵 회복력을 유도하도록 변형될 수 있다 (예컨대, Gao Y et al., Genome Biol. 2017;18:13에 기술됨). 내생성 레트로바이러스 유전자는 하기 문헌에 기술된 것과 같이 이종이식을 위해 변형될 수 있거나 또는 제거될 수 있다: Yang L, et al. Science. 2015;350:1101-4; Niu D et al., Science. 2017;357:1303-7). 근육량의 음성 조절인자 (예를 들어, 미오스타틴)은 예를 들어, 개에서 근육량을 증가시키기 위해 변형 (예를 들어, 불활성화)될 수 있다 (예를 들어, Zou Q et al., J Mol Cell Biol. 2015 Dec;7(6):580-3에 기술됨).
동물 예컨대 중증 복합 면역결핍 (SCID) 돼지를 생성시켜서 (예를 들어, RAG2의 변형에 의함) 재생 의학, 이종이식 (본 명세서의 다른 곳에 논의됨), 및 종양 발달에 유용한 모델을 제공할 수 있다. 방법 및 접근법은 하기 문헌에 기술된 것을 포함한다: Lee K, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 May 20;111(20):7260-5; 및 Schomberg et al. FASEB JouRNAl, April 2016; 30(1):Suppl 571.1.
동물의 SNP는 변형될 수 있다. 방법 및 접근법의 예는 다음의 문헌에 기술된 것들을 포함한다: Tan W. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Oct 8;110(41):16526-31; Mali P, et al., Science. 2013 Feb 15;339(6121):823-6.
줄기 세포 (예를 들어, 유도 만능 줄기 세포)는 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 바와 같이, 변형될 수 있고 원하는 자손 세포로 분화될 수 있다: Heo YT et al., Stem Cell Dev. 2015 Feb 1;24(3):393-402.
프로파일 분석 (예컨대, Igenity)은 경제적 형질과 관련된 유전자 변이를 스크리닝하고 확인하기 위해 동물에서 수행될 수 있다. 유전자 변이는 형질,예컨대 도체 조성, 도체 품질, 모체 및 생식 형질, 및 평균 일일 증체량을 도입하거나 또는 개선시키기 위해 변형될 수 있다.
검출 조성물 및 검출 방법
다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 구현예는 폴리뉴클레오티드 검출 조성물, 시스템 및 방법에 관한 것이다. 검출 조성물은 상기 논의된 바와 같은 임의의 TnpB 폴리펩티드 및 임의의 하나 이상의 ωRNA를 포함할 수 있다. 또한, 조성물 및 시스템은 검출 구성체를 포함할 수 있다. 일례의 구현예에서, 검출 구성체는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분을 포함한다. 하나 이상의 ωRNA는 표적 폴리펩티드 상의 표적 서열에 결합하도록 구성된다. 표적 서열에 대한 TnpB 복합체의 결합은 TnpB 절단 활성을 활성화시키고 TnpB 부차적 활성을 추가로 활성화시켜서 TnpB는 후속하여 비-표적 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 ωRNA-독립적 방식으로 절단한다. 따라서, 검출 구성체는 검출 구성체의 단일-가닥 부분의 절단 시에 검출가능한 신호가 생성되어서 샘플 중 표적 서열의 존재를 의미하도록 구성될 수 있다. 예시적인 검출 구성체는 하기에 추가로 상세히 논의된다. 추가 예의 구현예에서, 조성물은 증폭 시약을 더 포함할 수 있다. 증폭 시약은 표적 서열을 증폭시키는데 필요한 프라이머 및 폴리머라제 및/또는 역전사효소를 포함한다. 일례의 구현예에서, 증폭 시약은 등온 증폭 시약이다. 다른 예의 구현예에서, 조성물 및 시스템은 미정제 샘플 중에서 또는 증폭 및/또는 검출 전에 최소 정제하여 표적 서열의 검출을 허용하는 신속 추출 용액을 더 포함할 수 있다.
검출 구성체
본 명세서에 기술된 시스템 및 방법은 검출 구성체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, "검출 구성체"는 본 명세서에 기술된 활성화된 TnpB 시스템 단백질에 의해 절단될 수 있거나 또는 달리 탈활성화될 수 있는 분자를 의미한다. 용어 "검출 구성체"는 또한 "차폐성 구성체"로서 대안적으로 지칭될 수 있다. TnpB 단백질의 뉴클레아제 활성 및 이용되는 방법에 따라서, 차폐성 구성체는 RNA-기반 차폐성 구성체 또는 DNA-기반 차폐성 구성체일 수 있다. 핵산-기반 차폐성 구성체는 TnpB 단백질에 의해 절단가능한 핵산 구성요소를 포함한다. 핵산 구성요소의 절단은 작용제를 방출하거나 또는 검출가능한 신호가 생산되도록 허용하는 입체적변화를 일으킨다. 핵산 구성요소를 사용하여 검출가능한 신호의 생성을 방지하거나 또는 차폐하는 방법을 입증하는 예시적인 구성체는 하기 기술되고, 본 발명의 구현예는 이의 변이체를 포함한다. 절단 이전에, 또는 차폐성 구성체가 '활성' 상태일 때, 차폐성 구성체는 양성의 검출가능한 신호의 발생 또는 검출을 차단한다. 일 구현예에서, 검출 구성체는 특정 TnpB 단백질의 모티프의 절단을 위해 디자인된다.
최소 배경 신호가 활성 차폐성 구성체의 존재 하에서 생성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 양성 검출가능 신호는 광학, 형광, 화학발광, 전기화학 또는 다른 당분야에 공지된 검출 방법을 사용해 검출될 수 있는 임의 신호일 수 있다. 용어 "양성 검출가능 신호"는 차폐성 구성체의 존재 하에서 검출가능할 수 있는 다른 검출가능한 신호와 구별하기 위해 사용된다. 예를 들어, 일 구현예에서 제1 신호는 차폐제가 존재할 때 또는 TnpB 시스템이 활성화되지 않았을 때 검출될 수 있고 (즉, 음성 검출가능 신호), 이것은 이후에 표적 분자 및 차폐제의 절단 또는 탈활성화 시, 또는 TnpB 단백질의 활성화 시에 제2 신호 (예를 들어, 양성 검출가능 신호)로 전환된다. 그러면, 양성 검출가능 신호는 TnpB 단백질의 활성화시에 검출되는 신호이고, 비색 또는 형광 어세이에서, 측류 기질의 구성에 따라서, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, 대조군에 비해서 형광 또는 색의 증가 또는 대조군에 비해서 형광 또는 색의 감소일 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 HCR 개시제 서열 및 절단 모이어티, 또는 HCR 반응의 개시를 방해하는, 절단가능한 구조적 구성요소, 예컨대 루프 또는 헤어핀을 포함할 수 있다. 절단 모이어티는 활성화된 TnpB 이펙터 단백질 중 하나에 의해 우선적으로 절단될 수 있다. 활성화된 TnpB 단백질에 의한 절단 모이어티 또는 구조적 구성요소의 절단 시에, 개시제가 방출되어서 HCR 반응을 촉발하고, 이의 검출은 샘플 중 하나 이상의 표적 존재를 의미한다. 일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 RNA 루프 내에 헤어핀을 포함한다. 활성화된 TnpB 단백질이 RNA 루프를 절단할 때, 개시제는 방출되어서 HCR 반응을 촉발시킬 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 유전자 생성물의 발생을 억제할 수 있다. 유전자 생성물은 샘플에 첨가되는 리포터 구성체에 의해 코딩될 수 있다. 차폐성 구성체는 RNA 간섭 경로에 관여되는 간섭 RNA, 예컨대 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 또는 소형 간섭 RNA (siRNA)일 수 있다. 차폐성 구성체는 또한 마이크로RNA (miRNA)를 포함할 수 있다. 존재하는 경우에, 차폐성 구성체는 유전자 생성물의 발현을 억제한다. 유전자 생성물은 형광 단백질 또는 다른 RNA 전사물일 수 있거나 또는 달리 표지된 프로브, 압타머, 또는 항체에 의해 검출가능하지만 차폐성 구성체의 존재를 위한 단백질일 수 있다. 이펙터 단백질의 활성화 시에 차폐성 구성체는 절단되거나 또는 달리 침묵화되어서 양성 검출가능 신호로서 유전자 생성물의 발현 및 검출이 가능하게 된다. 바람직한 구현예에서, 차폐성 구성체는 둘 이상의 검출가능한 신호, 예를 들어, 형광계의 상이한 채널에서 판독될 수 있는 형광 신호를 포함한다.
특정 구현예에서, 차폐성 구성체는 리포터 구성체에 의해 코딩되는 유전자 산물의 생산을 저해하는 침묵화 RNA를 포함하고, 유전자 산물은 발현될 때 검출가능한 양성 신호를 발생시킨다.
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 차폐성 구성체로부터 하나 이상의 시약의 방출이 검출가능한 양성 신호의 발생을 일으키도록 검출가능한 양성 신호를 발생시키는데 필요한 하나 이상의 시약을 격리시킬 수 있다. 하나 이상의 시약은 비색 신호, 화학 발광 신호, 형광 신호, 또는 임의의 다른 검출가능한 신호를 생성시키도록 조합될 수 있고, 이러한 목적에 적합한 것으로 공지된 임의 시약을 포함할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 하나 이상의 시약은 하나 이상의 시약에 결합하는 RNA 압타머에 의해 격리된다. 하나 이상의 시약은 표적 분자의 검출 시 이펙터 단백질이 활성화되고 RNA 또는 DNA 압타머가 분해될 때 방출된다.
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 개별 이산 부피 (하기에 더욱 정의됨) 내에 고형 기재 상에 고정화될 수 있고, 단일 시약을 격리시킬 수 있다. 예를 들어, 시약은 염료를 포함하는 비드일 수 있다. 고정화 시약에 의해 격리될 때, 개별 비드는 너무 확산되어 검출가능한 신호를 발생시키지 못하지만, 차폐성 구성체로부터 방출 시에 예를 들어 응집에 의해서 또는 용액 농도의 단순 증가에 의해서 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 고정된 차폐제는 표적 분자의 검출 시에 활성화된 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 RNA- 또는 DNA-기반 압타머이다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 용액 중 고정화 시약에 결합하여서 용액 중에 유리된 별개의 표지된 결합 파트너에 결합하는 시약의 능력을 차단한다. 따라서, 샘플에 세척 단계의 적용 시, 표지된 결합 파트너는 표적 분자의 부재 하에서 샘플을 세척해 낼 수 있다. 그러나, 이펙터 단백질이 활성화되면, 차폐성 구성체는 시약에 결합하는 차폐성 구성체의 능력을 방해하도록 충분한 정도로 절단되어서 표지된 결합 파트너가 고정화 시약과 결합할 수 있게 한다. 따라서, 표지된 결합 파트너는 세척 단계 후에 남아서 샘플 내의 표적 분자의 존재를 의미한다. 일정 양태에서, 고정화된 시약에 결합하는 차폐성 구성체는 DNA 또는 RNA 압타머이다. 고정화 시약은 단백질일 수 있고 표지된 결합 파트너는 표지된 항체일 수 있다. 대안적으로, 고정화된 시약은 스트렙타비딘일 수 있고 표지된 결합 파트너는 표지된 바이오틴일 수 있다. 상기 구현예에서 사용되는 결합 파트너 상의 표지는 당분야에 공지된 임의의 검출가능한 표지일 수 있다. 또한, 다른 공지된 결합 파트너가 본 명세서에 기술된 전체 디자인에 따라서 사용될 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 리보자임을 포함할 수 있다. 리보자임은 촉매적 특성을 갖는 RNA 분자이다. 천연 및 조작 리보자임은 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질에 의해 표적화될 수 있는, RNA를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 리보자임은 음성 검출가능한 신호를 발생시키거나 또는 양성 대조군 신호의 발생을 방지하는 반응을 촉매하도록 선택될 수 있거나 또는 조작될 수 있다. 활성화된 이펙터 단백질에 의한 리보자임의 탈활성화 시 음성의 대조군 신호를 발생시키거나, 또는 양성의 검출가능한 신호의 발생을 방지하는 반응은 제거되고 그리하여 양성의 검출가능한 신호가 발생될 수 있게 한다. 리보자임은 용액이 제1 색상을 나타내게 하는 비색 반응을 촉매할 수 있다. 리보자임이 탈활성화될 때 용액은 제2 색상으로 바뀌고, 제2 색상은 검출가능한 양성 신호이다. 리보자임을 사용하여 비색 반응을 촉매하는 방법의 예는 [Zhao et al. "Signal amplification of glucosamine-6-phosphate based on ribozyme glmS," Biosens Bioelectron. 2014; 16:337-42]에 기술되고, 본 명세서에 개시된 구현예의 상황에서 이러한 시스템이 작동하도록 변형될 수 있는 방법의 예를 제공한다. 대안적으로, 리보자임은 존재하는 경우에, 예를 들어 RNA 전사물의 절단 생성물을 발생시킬 수 있다. 따라서, 양성 검출가능한 신호의 검출은 오직 리보자임의 부재 하에서만 발생되는 비절단된 RNA 전사물의 검출을 포함할 수 있다
일 구현예에서, 차폐성 구성체는 음성 검출가능 신호를 발생시키는 리보자임일 수 있고, 양성 검출가능 신호는 리보자임이 탈활성화될 때 발생된다.
일정 예의 구현예에서, 하나 이상의 시약은 단백질이 단백질에 하나 이상의 DNA 또는 RNA 압타머의 결합에 의해 검출가능한 신호를 발생시킬 수 없도록 억제되거나 또는 격리되는, 검출가능한 신호, 예컨대 비색, 화학발광 또는 형광발광 신호의 발생을 촉진할 수 있는, 단백질, 예컨대 효소이다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시, DNA 또는 RNA 압타머는 그들이 더 이상 검출가능한 신호를 발생시키는 단백질의 능력을 억제하지 않는 정도까지 절단 또는 분해된다. 일정 예의 구현예에서, 압타머는 트롬빈 억제제 압타머이다. 일정 예의 구현예에서 트롬빈 억제제 압타머는 GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCC (SEQ ID NO: 64,308)의 서열을 갖는다. 이러한 압타머가 절단될 때, 트롬빈은 활성화될 것이고 펩티드 비색 또는 형광 기질을 절단할 것이다. 일정 예의 구현예에서, 비색 기질은 트롬빈에 대한 펩티드 기질에 공유적으로 연결된 파라-니트로아닐리드 (pNA)이다. 트롬빈에 의해 절단 시, pNA가 방출되고 노란 색상이 되어 쉽게 육안으로 볼 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 형광 기질은 형광 검출기를 사용하여 검출할 수 있는 7-아미노-4-메틸쿠마린 파란색 형광단이다. 억제성 압타머가 또한 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 베타-갈락토시다제, 또는 송아지 알칼리 포스파타제 (CAP)에 대해 사용될 수 있고, 상기 제시된 일반 원리에 속한다.
일 구현예에서, RNAse 또는 DNAse 활성은 효소-억제성 압타머의 절단을 통해 비색적으로 검출된다. DNAse 또는 RNAse 활성을 ㄹ비색 신호로 전환하는 하나의 가능한 방식은 비색 출력을 생산할 수 있는 효소의 재활성화와 DNA 또는 RNA 압타머의 절단을 커플링시키는 것이다. RNA 또는 DNA 절단의 부재 하에서, 온전한 압타머는 효소 표적에 결합하여 이의 활성을 억제하게 될 것이다. 이러한 판독 시스템의 장점은 효소가 추가 증폭 단계를 제공한다는 것이다: 부차적 활성 (예를 들어, TnpB 부차적 활성)을 통해서 압타머로부터 유리되면, 비색 효소는 비색 생성물을 계속 생성시켜서, 신호의 배가를 일으키게 될 것이다.
일 구현예에서, 비색 판독의 효소를 억제하는 현존 압타머가 사용된다. 비색 판독되는 몇몇 압타머/효소 쌍에는 예컨대 트롬빈, 단백질 C, 호중구 엘라스타제 및 서브스틸리신이 존재한다. 이들 프로테아제는 pNA를 기반으로 비색 기질을 가지며 상업적으로 입수가능하다. 일 구현예에서, 일반적인 비색 효소를 표적화하는 신규한 압타머가 사용된다. 일반적인 강건한 효소, 예컨대 β-갈락토시다제, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 송아지 장 알칼리 포스파타제는 선택 전략 예컨대 SELEX에 의해 디자인된 조작된 압타머에 의해 표적화될 수 있다. 이러한 전략은 나노몰 결합 효율로 압타머의 신속한 선택을 가능하게 하고 비색 판독을 위한 추가의 효소/압타머 쌍의 개발에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 차폐성 구성체는 DNA 또는 RNA 압타머일 수 있고/있거나, DNA 또는 RNA-속박된 억제제를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 차폐성 구성체는 검출가능한 리간드 및 차폐성 성분이 부착되는 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, RNAse 또는 DNase 활성은 RNA-속박된 억제제의 절단을 통해서 비색 검출된다. 많은 일반 비색 효소는 경쟁적, 가역적 억제제를 갖는데, 예를 들어, β-갈락토시다제는 갈락토스에 의해 억제될 수 있다. 많은 이들 억제제는 약하지만, 그들 효과는 국소 농도의 증가에 의해 증가될 수 있다. DNase RNAse 활성에 대한 억제제의 국소 농도를 연결시켜서, 비색 효소 및 억제제 쌍은 DNase 및 RNAse 센서에 조작될 수 있다. 소형-분자 억제제를 기반으로 하는 비색 DNase 또는 RNAse 센서는 다음의 3개 성분을 포함한다: 비색 효소, 억제제, 및 억제제 및 효소에 공유적으로 연결되어 억제제를 효소에 속박시키는 가교 RNA 또는 DNA. 미절단 구성에서, 효소는 소형 분자의 증가된 국소 농도에 의해 억제되고; DNA 또는 RNA가 (예를 들어, TnpB 부차적 절단에 의해) 절단될 때, 억제제는 방출되어서, 비색 효소가 활성화된다.
일 구현예에서, 압타머 또는 DNA- 또는 RNA-속박된 억제제는 효소를 격리시킬 수 있는데, 효소는 기질에 작용하여 압타머 또는 DNA 또는 RNA 속박된 억제제로부터 방출 시 검출가능한 신호를 발생시킨다. 일 구현예에서, 압타머는 효소를 억제하고 효소가 기질로부터 검출가능한 신호의 발생을 촉매하는 것을 방지하는 억제제 압타머일 수 있다. 일 구현예에서, the DNA- 또는 RNA-속박된 억제제는 효소를 억제할 수 있고 효소가 기질로부터 검출가능한 신호의 발생을 촉매하는 것을 방지할 수 있다.
일 구현예에서, RNAse 활성은 G-사중체의 형성 및/또는 활성화를 통해 비색적으로 검출된다. DNA의 G 사중체는 헴 (heme) (철 (III)-프로토폴피린 IX)과 복합체를 형성하여 퍼옥시다제 활성을 갖는 DNAzyme을 형성할 수 있다. 퍼옥시다제 기질 (예를 들어, ABTS: (2,2'-아지노비스 [3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄 염))이 공급될 때, 과산화수소의 존재 하에서 G-사중체-헴 복합체가 기질의 산화를 야기하고, 그 다음에 용액 중에서 녹색을 형성시킨다. G-사중체 형성 서열의 예는 GGGTAGGGCGGGTTGGGA (SEQ ID NO: 64,309)이다. 이러한 DNA 압타머에 대해, "스테이플"이라고 본 명세서에서 지칭되는 추가적인 DNA 또는 RNA 서열을 혼성화시켜서, G-사중체 구조의 형성을 제한하게 된다. 부차적 활성화 시에, 스테이플은 절단되어서 G 사중체가 형성되어 헴이 결합하게 허용한다. 이러한 전략은 특히 매력적인데 색 형성이 효소적이기 때문인데, 부차적 활성화 이후 추가 증폭이 존재함을 의미한다.
일 구현예에서, 차폐성 구성체는 G-사중체 형성 서열에 결합하도록 디자인된 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, G-사중체 구조는 차폐성 구성체의 절단 시에 G-사중체 형성 서열에 의해 형성되고, G-사중체 구조는 검출가능 양성 신호를 발생시킨다.
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 개별 이산 부피 (하기에 더욱 정의됨) 내에 고형 기재 상에 고정화될 수 있고, 단일 시약을 격리시킬 수 있다. 예를 들어, 시약은 염료를 포함하는 비드일 수 있다. 고정화 시약에 의해 격리될 때, 개별 비드는 너무 확산되어 검출가능한 신호를 발생시키지 못하지만, 차폐성 구성체로부터 방출 시에 예를 들어 응집에 의해서 또는 용액 농도의 단순 증가에 의해서 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 고정된 차폐제는 표적 분자의 검출 시에 활성화된 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 DNA- 또는 RNA-기반 압타머이다.
일례의 구현예에서, 차폐성 구성체는 검출제가 응집되는지 또는 용액에 분산되는지 여부에 따라서 생상을 변화시키는 검출제를 포함한다. 예를 들어, 일정한 나노입자, 예컨대 콜로이드 금은 그들이 응집물로부터 분산된 입자로 이동하면서 가시적인 보라색에서 붉은 색으로 색상 이동을 겪는다. 따라서, 일정 예의 구현예에서, 이러한 검출제는 하나 이상의 가교 분자에 의해 응집물로 유지될 수 있다. 가교 분자의 적어도 일부분은 RNA 또는 DNA를 포함한다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시에, 가교 분자의 RNA 또는 DNA 부분은 절단되어서 검출제가 분산될 수 있게 하고 색상의 상응하는 변화를 일으킬 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 검출제는 콜로이드 금속이다. 콜로이드 금속 재료는 액체, 히드로졸 또는 금속 졸에 분산된 수불용성 금속 입자 또는 금속 화합물을 포함할 수 있다. 콜로이드 금속은 주기율표의 그룹 IA, IB, IIB 및 IIIB의 금속을 비롯하여, 전이 금속, 특히 그룹 VIII의 것으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 금속은 금, 은, 알루미늄, 루테늄, 아연, 철, 니켈 및 칼슘을 포함한다. 다른 적합한 금속은 또한 모든 그들의 다양한 산화 상태의 하기의 것들을 포함한다: 리튬, 소듐, 마그네슘, 포타슘, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 코발트, 구리, 갈륨, 스트론튬, 니오븀, 몰리브데늄, 팔라듐, 인듐, 주석, 텅스텐, 레늄, 플래티늄, 및 가돌리늄. 금속은 바람직하게 적절한 금속 화합물로부터 유래된 이온 형태, 예를 들어 A13+, Ru3+, Zn2+, Fe3+, Ni2+ 및 Ca2+ 이온으로 제공된다.
RNA 또는 DNA 가교가 활성화된 TnpB 폴리펩티드에 의해 절단될 때, 상기 언급된 색 이동이 관차로딘다. 일정 예의 구현예에서 입자는 콜로이드 금속이다. 일정한 다른 예의 구현예에서, 콜로이드 금속은 콜로이드 금이다. 일정 예의 구현예에서, 콜로이드 나노입자는 15 nm 금 나노입자 (AuNP)이다. 콜로이드 금 나노입자의 고유한 표면 성질 덕분에, 용액에서 완전히 분산되고 육안으로 붉은 색상이 나타날 때 520 nm에서 최대 흡광도가 관찰된다. AuNP의 응집 시, 그들은 최대 흡광도에서 붉은색-이동을 나타내고 색상이 더 진하게 나타나며, 궁극적으로 용액으로부터 진한 보라색 응집체로 침전된다. 일정 예의 구현예에서 일정 예의 구현예에서, 나노입자는 나노입자의 표면으로부터 연장된 DNA 링커를 포함하도록 변형된다. 개별 입자는 DNA 링커의 적어도 일부분에 대해 각 말단에서 혼성화되는 단일-가닥 RNA (ssRNA) 또는 단일-가닥 DNA (ssDNA) 가교에 의해 함께 연결된다. 따라서, 나노입자는 연결된 입자의 망을 형성하게 되고 응집하게 되어, 진한 침전물로서 나타나게 될 것이다. 본 명세서에 개시된 TnpB 폴리펩티드의 활성화 시에, ssRNA 또는 ssDNA 가교가 절단되어서, 연결된 메시로부터 AU NPS를 방출하고 가시적 적색을 생산한다. 예시적인 DNA 링커 및 가교 서열은 하기에 열거된다. DNA 링커의 말단 상에 티올 링커는 AuNPS와 표면 접합을 위해 사용될 수 있다. 다른 형태의 접합이 사용될 수도 있다. 일정 예의 구현예에서, 각 DNA 링커에 대해 하나씩, AuNP의 2개 개채군이 발생될 수 있다. 이것은 적절한 배향으로 ssRNA 가교의 적절한 결합을 촉진하도록 돕게 될 것이다. 일정 예의 구현예에서, 제1 DNA 링커는 3' 말단으로 접합되는 반면 제2 DNA 링커는 5' 말단으로 접합된다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 검출가능한 표지 및 그 검출가능한 표지의 차폐제가 부착되는 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 검출가능한 표지/차폐제 쌍의 예는 형광단 및 형광단의 소광제가 있다. 형광단의 소광은 형광단 및 다른 형광단 또는 비형광 분자 간 비형광성 복합체의 형성 결과로서 일어날 수 있다. 이러한 기전은 바닥-상태 복합체 형성, 정적 소광, 또는 접촉 소광으로서 알려져 있다. 따라서, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드는 형광단 및 소광제가 접촉 소광이 일어나도록 충분히 근접하도록 디자인될 수 있다. 형광단 및 그들의 동족 소광제는 당분야에 공지되어 있고, 당업자에 의해서 이러한 목적을 위해 선택될 수 있다. 특정한 형광단/소광제 쌍은 본 발명의 상황에서 결정적인 것은 아니고, 오직 형광단/소광제 쌍의 선택이 형광단의 차폐를 보장한다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시에, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드는 절단되고, 그리하여 접촉 소광 효과를 유지하는데 필요한 형광단 및 소광제 간 근접성을 잘라낸다. 따라서, 형광단의 검출은 샘플 내의 표적 분자의 존재를 확인하는데 사용될 수 있다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 하나 이상의 금속 나노입자, 예컨대 금 나노입자가 부착되는 하나 이상의 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 차폐성 구성체는 닫힌 루프를 형성하는 다수의 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드에 의해 가교된 다수의 금속 나노입자를 포함한다. 일 구현예에서, 차폐성 구성체는 닫힌 루프를 형성하는 3개의 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드에 의해 교차된 3개의 금 나노입자를 포함한다. 일 구현예에서, TnpB 단백질에 의한 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드의 절단은 금속 나노입자에 의해 생성되는 검출가능한 신호를 야기한다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 하나 이상의 퀀텀 도트가 부착되는 하나 이상의 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, TnpB 단백질에 의한 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드의 절단은 퀀텀 도트에 의해 생성되는 검출가능한 신호를 야기한다.
일례의 구현예에서, 차폐성 구성체는 퀀텀 도트를 포함할 수 있다. 퀀텀 도트는 표면에 부착되는 다수의 링커 분자를 가질 수 있다. 링커 분자의 적어도 일부분은 RNA 또는 DNA를 포함한다. 링커 분자는 한쪽 말단에서 퀀텀 도트에 부착되고 링커의 길이를 따라서 또는 말단부에서 하나 이상의 소광제에 부착되어서 소광제가 퀀텀 도트의 소광이 일어나도록 충분히 근접하게 유지된다. 링커는 분지될 수 있다. 상기처럼, 퀀텀 도트/소광제 쌍은 핵심적이지 않고, 오직 퀀텀 도트/소광제 쌍의 선택이 형광단의 차폐를 보장한다. 퀀텀 도트 및 그들의 동족 소광제는 당분야에 공지되어 있고 당업자에 의해서 이러한 목적을 위해 선택될 수 있다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시, 링커 분자의 RNA 또는 DNA 부분은 절단되어서 소광 효과를 유지하는데 필요한 하나 이상의 소광제 및 퀀텀 도트 간 근접성을 제거한다. 일정 예의 구현예에서 퀀텀 도트는 스트렙타비딘 접합된다. RNA 또는 DNA는 바이오틴 링커를 통해 부착되고 하기 서열을 갖는 소광 분자를 동원한다: /5Biosg/UCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ (SEQ ID NO: 64,310) 또는 /5Biosg/UCUCGUACGUUCUCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ (SEQ ID NO: 64,311), 여기서 /5Biosg/는 바이오틴 태그이고, /3lAbRQSp/는 아이오와 블랙 소광제 (Iowa Black FQ)이다. 절단 시, 본 명세서에 개시된 활성화된 이펙터에 의해서 퀀텀 도트는 가시적으로 형광발광하게 될 것이다.
특정 구현예에서, 검출가능한 리간드는 형광단일 수 있고, 차폐성 성분으 소광제 분자일 수 있다.
유사한 방식으로, 형광 에너지 전달 (FRET)은 검출가능한 양성 신호를 발생시키기 위해 사용될 수 있다. FRET는 에너지 여기된 형광단 (즉, "도너 형광단")으로부터의 광자가 다른 분자 (즉, "억셉터") 내 전자의 에너지 상태를 더 높은 진동 수준의 여기된 단일항 상태로 상승시키는 비복사 과정이다. 도너 형광단은 그 형광단의 특징적인 형광을 발광하지 않고 바닥 상태로 되돌아간다. 억셉터는 다른 형광단일 수 있거나 또는 비형광성 분자일 수 있다. 억셉터가 형광단이면, 전달된 에너지는 그 형광단의 특징적인 형광으로서 발광된다. 억셉터가 비형광성 분자이면 흡수된 에너지는 열로서 소실된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 구현예의 상황에서, 형광단/소광제 쌍은 올리고뉴클레오티드 분자에 부착된 도너 형광단/억셉터 쌍으로 교체된다. 온전할 때, 차폐성 구성체는 억셉터로부터 방출되는 열 또는 형광에 의해 검출되는 제1 신호 (음성 검출가능한 신호)를 발생시킨다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시 RNA 올리고뉴클레오티드는 절단되고 FRET은 파괴되어서 도너 형광단의 형광이 이제 검출된다 (양성 검출가능한 신호).
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 짧은 뉴클레오티드로 긴 RNA 또는 DNA의 절단에 대응하여 그들 흡광도를 변화시키는 인터컬레이팅 염료의 사용을 포함한다. 몇몇 이러한 염료가 존재한다. 예를 들어, 파이로닌-Y는 RNA와 복합체를 형성하게 될 것이고, 572 nm에서 흡광도를 갖는 복합체를 형성하게 될 것이다. RNA의 절단은 그 결과로 흡광도의 소실 및 색상 변화를 일으킨다. 메틸렌 블루는 유사한 방식으로 사용될 수 있고, RNA 절단 시 688 nm에서의 흡광도가 변화한다. 따라서, 일정 예의 구현예에서 차폐성 구성체는 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질에 의한 RNA의 절단 시에 흡광도를 변화시키는 RNA 및 인터컬레이트 염료 복합체를 포함한다.
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 HCR 반응을 위한 개시제를 포함할 수 있다. 참조: 예를 들어, Dirks and Pierce. PNAS 101, 15275-15728 (2004). HCR 반응은 2가지 헤어핀 종에서 위치 에너지를 이용한다. 헤어핀 중 하나의 상응하는 영역에 상보성인 부분을 갖는 단일 가닥 개시제가 이전에 안정된 혼합물로 방출될 때, 이것이 한 종의 헤어핀을 개방시킨다. 이어서 이 과정은 다른 종의 헤어핀을 개방시키는 단일 가닥 영역을 노출시킨다. 다음으로 이 과정은 본래 개시제와 동일한 단일 가닥 영역을 노출시킨다. 최종 연쇄 반응은 헤어핀 공급이 고갈될 때까지 성장하는 닉형성된 이중 나선의 형성을 일으킬 수 있다. 최종 생성물의 검출은 겔 상에서 또는 비색적으로 수행될 수 있다. 비색 검출 방법의 예는 예를 들어, 하기 문헌들에 개시된 것들을 포함한다: Lu et al. "Ultra-sensitive colorimetric assay system based on the hybridization 연쇄 반응-triggered enzyme cascade amplification ACS Appl Mater Interfaces, 2017, 9(1):167-175, Wang et al. "An enzyme-free colorimetric assay using hybridization chain reaction amplification and split aptamers" Analyst 2015, 150, 7657-7662, 및 Song et al. "Non-covalent fluorescent labeling of hairpin DNA probe coupled with hybridization chain reaction for sensitive DNA detection." Applied Spectroscopy, 70(4): 686-694 (2016).
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 활성화된 TnpB 단백질에 의해 절단되거나, 또는 변형될 때까지 검출가능 양성 신호의 발생을 저해한다. 일 구현예에서, 차폐성 구성체는 검출가능한 양성 신호의 차폐에 의해서, 또는 대신에 검출가능한 음성 신호를 발생시켜서 검출가능한 양성 신호의 발생을 저해할 수 있다.
증폭 시약
일정 예의 구현예에서, 표적 RNA 및/또는 DNA는 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키기 전에 증폭될 수 있다. 임의의 적합한 RNA 또는 DNA 증폭 기술이 사용될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, RNA 또는 DNA 증폭은 등온 증폭이다. 일정 예의 구현예에서, 등온 증폭은 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 리콤비나제 폴리머라제 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 치환 증폭 (SDA), 헬리카제-의존적 증폭 (HDA), 또는 닉형성 효소 증폭 반응 (NEAR)일 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 비-등온 증폭 방법은 PCR, 다중 치환 증폭 (MDA), 롤링 써클 증폭 (RCA), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 또는 세분화 증폭 방법 (RAM)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 것이 사용될 수 있다.
일정 예의 구현예에서, RNA 또는 DNA 증폭은 RNA/DNA 듀플렉스를 형성하기 위해 서열-특이적 역방향 프라이머에 의한 표적 RNA의 역전사에 의해 개시되는, NASBA 이다. 그 다음으로 RNase H는 RNA 주형을 분해하는데 사용되어서, 프로모터, 예컨대 T7 프로모터를 함유하는 전방향 프라이머가 결합되어 상보성 가닥의 연장을 개시할 수 있고, 이중-가닥 DNA 생성물이 생성된다. DNA 주형의 RNA 폴리머라제 프로모터-매개 전사는 표적 RNA 서열의 카피를 생성시킨다. 중요한 것은, 신규 표적 RNA 각각이 가이드 RNA 에 의해 검출될 수 있고 그리하여 어세이의 감도를 더 증강시킬 수 있다는 것이다. 그런 다음, 가이드 RNA 에 의한 표적 RNA 의 결합이 CRISPR 이펙터 단백질의 활성화를 야기시키고 방법은 상기 약술된 대로 진행된다. NASBA 반응은 예를 들어 대략 41℃ 의 중간 등온 조건 하에서 진행될 수 있다는 추가의 장점을 가져서, 임상 실험실로부터 멀리 떨어진 현장에서 조기 및 직접 검출을 위해 배치된 시스템 및 장치에 적합하다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 리콤비나제 폴리머라제 증폭 (RPA) 반응은 표적 핵산을 증폭시키는데 사용될 수 있다. RPA 반응은 듀플렉스 DNA 의 상동성 서열과 서열-특이적 프라이머의 쌍을 형성할 수 있는 리콤비나아제를 이용한다. 표적 DNA 가 존재하면, DNA 증폭이 개시되고 다른 샘플 조작 예컨대 열 사이클 또는 화학적 용융이 필요하지 않다. 전체 RPA 증폭 시스템은 건조된 제제로서 안정하고 냉동 없이 안전하게 수송될 수 있다. RPA 반응은 또한 37-42℃ 의 최적 반응 온도로 등온 온도에서 실행될 수 있다. 서열 특이적 프라이머는 검출할 표적 핵산 서열을 포함하는 서열이 증폭되도록 디자인된다. 일정 예의 구현예에서, RNA 폴리머라제 프로모터, 예컨대 T7 프로모터는 프라이머 중 하나에 첨가된다. 그 결과로 표적 서열 및 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 증폭된 이중-가닥 DNA 생성물이 얻어진다. RPA 반응 이후, 또는 그 동안, RNA 폴리머라제가 첨가되어 이중-가닥 DNA 주형으로부터 RNA 를 생성시키게 될 것이다. 이어서, 증폭된 표적 RNA 가 그 다음으로 CRISPR 이펙터 시스템에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방식으로 표적 DNA는 본 명세서에 개시된 실시형태를 사용하여 검출될 수 있다. RPA 반응은 또한 표적 RNA를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 표적 RNA는 먼저 역전사효소를 사용해 cDNA로 전환되고, 그 다음으로 제2 가닥 DNA 합성이 후속되며, 이 시점에 RPA 반응은 상기 약술된 대로 진행된다.
본 발명의 일 구현예에서 닉카제-기반 증폭을 포함할 수 있다. 닉형성 효소는 CRISPR 단백질일 수 있다. 따라서, dsDNA로 닉의 도입은 프로그램가능할 수 있고 서열-특이적일 수 있다. 도 115는 dsDNA 표적의 반대 가닥을 표적화하도록 디자인된 2개 가이드에서 시작되는 본 발명의 일 구현예를 도시한다. 본 발명에 따라서, 닉카제는 Cpf1, C2c1, Cas9 또는 임의의 오솔로그 또는 DNA 듀플렉스의 단일 가닥을 절단하거나 또는 절단하도록 조작된 CRISPR 단백질일 수 있다. 닉형성된 가닥은 이후에 폴리머라제에 의해 연장될 수 있다. 일 구현예에서, 닉의 위치는 폴리머라제에 의한 가닥의 연장이 닉 부위 사이의 표적 듀플렉스 DNA의 중심 부분을 향하도록 선택된다. 일정 구현예에서, 연장된 가닥과 혼성화할 수 있는 프라이머가 반응에 포함되고 이후에 2개 dsDNA 조각을 재생하도록 프라이머의 추가의 폴리머라제 연장이 후속된다: Cpf1 가이드 부위 또는 제1 및 제2 가닥 Cpf1 가이드 부위 둘 모두를 포함하는 제1 dsDNA, 및 제2 가닥 Cpf1 가이드 부위 또는 제1 및 제2 가닥 Cprf 가이드 부위 둘 모두를 포함하는 제2 dsDNA. 이들 조각은 닉형성 부위 사이의 표적의 영역을 기하급수적으로 증폭시키는 순환 반응에서 계속 닉형성되고 연장된다.
증폭은 등온성일 수 있고, 온도에 대해 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 증폭은 37℃ 에서 신속하게 진행된다. 다른 구현예에서, 등온 증폭의 온도는 상이한 온도에서 작동가능한 폴리머라제 (예를 들어, Bsu, Bst, Phi29, klenow 단편 등)를 선택하여 선택될 수 있다.
따라서, 닉형성 등온 증폭 기술은 (예를 들어, 닉형성 효소 증폭 반응 또는 NEAR에서) 고정된 서열 선호도를 갖는 닉형성 효소를 사용하여, 표적의 말단에 닉형성 기질을 첨가하는 프라이머의 어닐링 및 연장을 허용하기 위해 본래 dsDNA 표적의 변성을 필요로 하지만, 닉형성 부위가 가이드 RNA를 통해서 프로그램될 수 있는 것인 CRISPR 닉카제의 사용은 변성 단계를 필요로 하지 않아서, 전체 반응이 진짜로 등온성이게 된다는 것을 의미한다. 이것은 또한 닉형성 기질을 첨가하는 이들 프라이머가 이후 반응에서 사용되는 프라이머와 상이하기 때문에 반응을 단순화시키며, 이것은 NEAR이 2개 프라이머 세트 (즉, 4개 프라이머)를 필요로 하지만 Cpf1 닉형성 증폭은 오직 하나의 프라이머 세트 (즉, 2개 프라이머)를 필요로 한다는 것을 의미한다. 이것은 변성 및 이후 등온 온도로 냉각을 수행하기 위해 복잡한 장비없이 작업하도록 닉형성 Cpf1 증폭을 훨씬 더 단순하고 쉽게 만든다.
따라서, 일정 예의 구현예에서 본 명세서에 개시된 시스템은 증폭 시약을 포함할 수 있다. 핵산의 증폭에 유용한 상이한 성분 또는 시약은 본 명세서에 기술되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 증폭 시약은 완충제, 예컨대 Tris 완충제를 포함할 수 있다. Tris 완충제는 예를 들어, 제한 없이, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 1 M 등의 농도를 포함하여, 바람직한 적용 또는 용도에 적절한 임의 농도로 사용될 수 있다. 당업자는 완충제 예컨대 본 발명에서 사용을 위한 Tris의 적절한 농도를 결정할 수 있을 것이다.
생물학적 또는 화학적 반응의 다른 성분은 세포 안의 물질의 분석을 위해 세포를 파쇄하거나 용해시키기 위해 세포 용해 성분을 포함할 수 있다. 세포 용해 성분은 세제, 상기 기재된 바와 같은 염, 예컨대 NaCl, KCl, 암모늄 술페이트 [(NH4)2SO4], 또는 다른 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 적절할 수 있는 세제는 Triton X-100, 소듐 도데실 술페이트 (SDS), CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트), 에틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올 (NP-40) 을 포함할 수 있다. 세제의 농도는 특정 적용분야에 의존적일 수 있고, 일부 경우에서 반응에 특이적일 수 있다. 증폭 반응은 예컨대 제한 없이, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 950 nM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM 등의 농도를 포함하여, 본 발명에 적절한 임의 농도로 사용되는 dNTP 및 핵산 프라이머를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 따라서 유용한 폴리머라제는 Taq 폴리머라제, Q5 폴리머라제 등을 포함하는, 당분야에 공지되어 있고 본 발명에서 유용한 임의의 특이적이거나 일반적인 폴리머라제일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 증폭 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용에 적절할 수 있다. 핫 스타트 증폭은 어댑터 분자 또는 올리고의 이량체화를 감소시키거나 제거시키기 위해서, 또는 달리 원치않는 증폭 생성물 또는 인공물을 방지하고 바람직한 생성물의 최적 증폭을 수득하기 위해서 일부 구현예에서 유리할 수 있다. 증폭에 사용을 위한 본 발명에 기술된 많은 성분이 또한 핫-스타트 증폭에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 핫-스타트 증폭에서 사용하기에 적절한 시약 또는 성분은 적절하다면 조성물 성분 중 하나 이상 대신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제 또는 다른 시약은 특정한 온도 또는 다른 반응 조건에서 바람직한 활성을 나타내는 것이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용을 위해 디자인되거나 또는 최적화된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 폴리머라제는 전위 이후 또는 특정한 온도에 도달 이후에 활성화될 수 있다. 이러한 폴리머라제는 항체-기반 또는 압타머-기반일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리머라제가 당분야에 공지되어 있다. 이러한 시약의 예는 제한 없이, 핫-스타트 폴리머라제, 핫-스타트 dNTP, 및 광-케이징된 dNTP를 포함할 수 있다. 이러한 시약은 공지되어 있고 당분야에서 입수가능하다. 당업자는 개별 시약에 적절하게 최적 온도를 결정할 수 있을 것이다.
핵산의 증폭은 특별한 열 사이클 기계 또는 장비를 사용하여 수행될 수 있고, 단일 반응으로 또는 대량으로 수행될 수 있어, 임의의 바람직한 횟수의 반응이 동시에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭은 미세유체 또는 로봇식 장치를 사용하여 수행될 수 있거나, 바람직한 증폭을 달성하도록 온도의 수동 변경을 사용하여 수행될 수도 있다. 일부 구현예에서, 특정한 적용분야 또는 물질에 대한 최적 반응 조건을 수득하기 위해 최적화가 수행될 수 있다. 당업자는 충분한 증폭이 수득되도록 반응 조건을 이해하게 될 것이고 최적화시킬 수 있을 것이다.
일정 구현예에서, 본 발명의 방법 또는 시스템에 의한 DNA 의 검출은 검출 전에 (증폭된) DNA 를 RNA 로 전사시키는 것을 필요로 한다.
본 발명의 검출 방법이 다양한 조합으로 핵산 증폭 및 검출 절차를 포함할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 검출하려는 핵산은 검출할 수 있는 중간 생성물을 제공하기 위한 임의의 적합한 방법에 의해 증폭될 수 있는, DNA 및 RNA 를 제한없이 포함하는, 임의의 천연 발생 또는 합성 핵산일 수 있다. 중간 생성물의 검출은 직접 또는 부차적 활성에 의해 검출가능한 신호 모이어티를 생성시키는 CRISPR 단백질의 결합 및 활성화를 제한없이 포함하는, 임의의 적합한 방법에 의한 것일 수 있다.
LAMP-기반 등온 증폭
일정 예의 구현예에서, LAMP 증폭 시약은 SARS-COV2에 대한 프라이머를 포함할 수 있다. LAMP 시약은 비색 및/또는 형광 검출 시약, 예컨대 히드록시 나프톨 블루 (참조: 예를 들어, Goto, M., et al., Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques, 2009. 46(3): p. 167-72.), 류코 트리페닐메탄 염료 (참조: 예를 들어, Miyamoto, S., et al., Method for colorimetric detection of double-stranded nucleic acid using leuco triphenylmethane dyes. Anal Biochem, 2015. 473: p. 28-33) 및 pH-감수성 염료 (참조: 예를 들어, Tanner, N.A., Y. Zhang, and T.C. Evans, Jr., Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. Biotechniques, 2015. 58(2): p. 59-68);를 비롯하여, 형광 검출 (참조: 예를 들어, Yu et al., Clinical Chemistry, hvaa102, doi:10.1093/clinchem/hvaa102 12 May 2020)과, 소광 프로브 사용 포함 (참조: 예를 들어, Shirato et al., J Virol Methods. 2018 Aug;258:41-48. doi: 10.1016/j.jviromet.2018.05.006)을 더 포함할 수 있다. 서열-특이적 검출을 위한, OSD-LAMP를 포함한, LAMP 방법의 개요는 참조로 본 명세서에 편입되는, 하기 문헌에 기술된다: Becherer et al., Anal. Methods, 2020,12, 717-746, doi: 10.1039/C9AY02246.
구현예에서, LAMP 증폭 시약은 올리고뉴클레오티드 가닥 치환 (OSD) 프로브를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 올리고뉴클레오티드 가닥 치환 프로브는 또한 본 명세서에서 올리고뉴클레오티드 가닥 교환 프로브 또는 1-단계 가닥 치환 프로브라고 한다. OSD 교환의 사용에 관한 일반 개념은 하기 문헌의 도 1에 도시된다: Bhadra et al., High-surety isothermal amplification and detection of SARS-CoV-2, including with crude enzymes, doi:10.1101/2020.04.13.039941. OSD 프로브는 가닥 교환 반응을 일으키는 LAMP 반응의 앰플리콘과 표적-결합 프로브 간 결합 엔탈피에 의존하여서, 형광 신호의 쉬운 판독 변화를 야기한다. 그 결과로서, LAMP 반응의 결과는 형광발생 OSD 프로브를 시각적으로 또는 광학적으로 판독할 수 있다.
일 양태에서, OSD 프로브는 표적 분자에 특이적인 서열을 포함한다. OSD 프로브는 사전-혼성화된 핵산 서열, 가닥을 포함할 수 있고, 표적 서열은 혼성화되는 가닥에 비해서 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 뉴클레오티드가 더 길어서, 상보성 표적과 서열-특이적 상호작용을 허용하고, OSD는 가닥 교환을 겪고 형광 신호의 변화를 일으킨다.
일 양태에서, OSD 프로브는 약 50 nM 내지 200 nM, 약 75 nM 내지 150 nM, 200 nM, 190 nM, 180 nM, 170 nM, 160 nM, 150 nM, 140 nM, 130 nM, 120 nM, 110 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 75 nM, 65 nM, 또는 50 nM 이하의 농도로 제공된다. 프로브는 LAMP 프라이머에 대한 F1c 및 F2 프라이므 결합 부위 사이에 루프 영역에 상보적이도록 디자인될 수 있고, 이것은 긴 토우홀드 영역이라고 할 수 있다. 상보성 부분은 약 9와 14 뉴클레오티드 사이 길이, 보다 바람직하게 11-12 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일 양태에서, OSD의 더 긴 가닥은 가닥의 5' 또는 3' 말단에서 형광 분자로 표지된다. 일 양태에서, 표지는 디자인된 상보성 표적 영역 (긴 토우홀드 영역)에 대향하는 말단 상에 제공된다. 짧은 가닥은 프로브의 한 말단 상에 소광제를 갖게 제조되고, 긴 가닥의 일부에 상보적인 영역을 포함하도록 디자인될 수 있다. OSD 프로브는 일부 예에서, 동결건조 시약으로서 제공되는 것을 포함하여, 본 명세서에 제공되는 바와 같은 임의 조성물에서, 도는 임의의 장치, 카트리즈에서 그들 사용을 포함할 수 있는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 LAMP 시약의 일부로서 제공될 수 있다.
추출 용액
일정 양태에서, 본 명세서에 개시된 구현예는 무추출 용해 및 표적 핵산의 증폭을 단일 반응 부피로 통합하는 조성물 및 키트에 관한 것이다. 일정 예의 구현예에서, 무추출 용해 시약은 세포 및/또는 바이러스 입자로부터 핵산을 추출하는데 사용될 수 있다. 현존 프로토콜과 대조적으로, 무추출 용해 용액은 추가 증폭 이전에 핵산의 단리를 요구하지 않는다. 무추출 용해 시약은 증폭 시약 예컨대 표준 RT-PCR 증폭 반응과 혼합될 수 있다.
일 구현예에서, 무추출 용해 용액 및 등온 증폭 시약은 단일 반응 부피로 동결건조될 수 있어서, 어세이하려는 샘플의 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 일정 다른 구현예에서, 무추출 용해 용액 및 등온 증폭 시약은 동결건조될 수 있고, 하기에 추가로 상세히 논의되는 바와 같이, 카트리지 또는 측류 스트립에 저장될 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 단일 용해 반응 조성물 및 키트는 부차적 활성을 보유하는 하나 이상의 TnpB 단백질 및 검출 구성체를 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 TnpB 단백질과 쌍형성은 어세이의 감도 또는 특이도를 증가시킬 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 하나 이상의 TnpB 단백질은 열안정성 TnpB 단백질일 수 있다. 예시적인 TnpB 단백질은 하기에 추가로 상세히 개시된다.
일정 예의 구현예에서, 단일 용해 증폭 반응 조성물 및 키트는 최적화된 프라이머 및/또는 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 디자인은 증폭에서 사용되는 프라이머를 최적화한다. 특정 양태에서, 등온 증폭은 단독으로 사용된다. 다른 양태에서, 등온 증폭은 TnpB 시스템과 사용된다. 양쪽 접근법에서, 디자인 고려사항은 반응의 최적화를 위한 합리적 디자인을 따를 수 있다. 일례에서, 특이적 프라이머, 표적, TnpB 단백질, 온도, 및 반응 내 다른 첨가제 농도와 다양한 첨가제를 확인할 수 있다. 최적화는 반응에서 발생해야 하는 단계의 개수 및 완충액 교환을 감소시키고, 반응을 단순화하고 수송 단계에서 오염 위험성 감소의 목적으로 이루어질 수 있다. 일 양태에서, 억제제, 예컨대 프로테이나제 K의 첨가는 완충액 교환을 감소시키기 위해 고려될 수 있다. 유사하게, 염 수준을 비롯하여 이용되는 염의 유형의 최적화는 본 명세서에 개시된 1-포트 검출을 추가로 촉진하고 최적화할 수 있다. 일 양태에서, 이러한 증폭 접근법이 용해 단계에서 비드 농도와 사용될 때 소듐 클로라이드에 비해서 포타슘 클로라이드가 이용될 수 있다.
일 구현예에서, 조성물 및 키트는 핵산 결합 비드를 더 포함할 수 있다. 비드는 특정 물질을 포획하거나, 농축하거나 또는 달리 농후화시키는데 사용될 수 있다. 비드는 자성일 수 있고, 핵산 물질을 포획하기 위해 제공될 수 있다. 다른 양태에서, 비드는 실리카 비드이다. 비드는 본 명세서에 개시된 방법의 추출 단계에서 이용될 수 있다. 비드는 임의로 큰 부피 샘플, 예컨대 타액 또는 단일 1-포트 반응 방법을 허용하도록 면봉 샘플로부터 바이러스 핵산의 농축을 허용하는 1-포트 방법을 포함하여, 본 명세서에 기술된 방법과 사용될 수 있다. 원하는 표적 분자의 농도는 약 10-배, 50-배, 100-배, 200-배, 500-배, 800-배, 1000-배, 1500-배, 2000-배, 2500-배, 3000-배 이상까지 증가될 수 있다.
PEG 및 염 용액 중 자성 비드는 일 앙태에서, 바람직하고, 구현예에서, 농축 및 용해를 동시에 허용하는 바이러스 RNA 및/또는 DNA에 결합한다. 실리카 비드는 다른 양태에서 사용될 수 있다. 포획 모이어티, 예컨대 올리고뉴클레오티드 작용화된 비드가 사용이 고려된다. 비드는 추출 시약과 사용될 수 있어서, 샘플 및 용해/추출 완충액과 인큐베이션을 허용하여서, 비드 상에 표적 분자를 응집시킬 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 상술되는 카트리지 장치와 사용될 때, 자석은 활성화될 수 있고, 비드를 수집할 수 있으며, 추출 완충액의 선택적 세척 및 하나 이상의 세척이 수행된다. 유리하게, 비드는 비드의 추가 세척없이 1-포트 방법 및 시스템에서 사용될 수 있어서, 다수 단계 과정에서 오염 위험성 증가없이 보다 효율적인 과정을 허용한다. 비드는 본 명세서에 상술된 등온 증폭과 이용될 수 있고, 비드는 카트리지의 증폭 챔버로 흐를 수 있거나 또는 증폭 단계를 위한 포트에 유지될 수 있다. 가열 시, 핵산은 비드로부터 방출될 수 있다.
진단 장치
본 명세서에 기술된 장치는 진단 장치 상에서 구현될 수 있다. 다수의 기질 및 구성이 사용될 수 있다. 장치는 장치 내 다수의 개별 이산 부피를 한정할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "개별 이산 부피"는 본 명세서에 개시된 방법을 수행하는데 필요한 핵산 및 시약의 이동을 방지 및/또는 억제하는 성질에 의해 한정될 수 있는 개별 부피 또는 개별 공간, 예컨대 용기, 리셉타클, 또는 다른 한정된 부피 또는 공간, 예를 들어, 물리적 성질 예컨대 벽, 예를 들어, 투과성 또는 반투과성일 수 있는, 웰, 튜브, 또는 액적 표면의 벽에 의해 한정되거나, 또는 다른 수단 예컨대 화학, 확산 속도 제한, 전자기, 또는 광 조사, 또는 이의 임의 조합에 의해 한정될 수 있는 부피 또는 공간이다. 개별 이산 부피는 분자 태그, 예컨대 핵산 바코드에 의해 식별될 수 있다. "확산 속도 제한" (확산 한정 부피)이란 확산이 한 스트림에서 다른 스트림으로 표적 분자의 이동을 제한하게 되는 2개의 평행한 층류 스트림의 경우처럼 확산 제한이 효과적으로 공간 또는 부피를 한정하기 때문에 일정한 분자 또는 반응에만 접근가능한 공간을 의미한다. "화학적" 한정된 부피 또는 공간이란 예를 들어 겔 비드가 예컨대 비드의 내부로 진입할 수 있는 종의 선택을 가능하게 할 수 있는 비드의 표면 전하, 매트릭스 크기 또는 다른 물리적 특성에 의해서, 다른 것들은 아니지만, 비드로의 진입에 일정한 종을 배제할 수 있는 경우에, 그들의 화학적 또는 분자적 특성, 예컨대 크기때문에, 오직 일정한 표적 분자가 존재할 수 있는 공간을 의미한다. "전자기적으로" 한정된 부피 또는 공간이란 표적 분자 또는 그들 지지체의 전자기 특성 예컨대 전하 또는 자성이 자기장 내에서 또는 직접적으로 자석 상에서 자성 입자를 포획하는 것과 같이, 공간에서 일정한 영역을 한정하는데 사용될 수 있는 공간을 의미한다. 광학적으로" 한정된 부피란 한정된 공간 또는 부피내 표적 분자만이 표지될 수 있도록 가시광, 자외선, 적외선, 또는 다른 파장의 광으로 조사하여 한정될 수 있는 임의의 공간 영역을 의미한다. 무벽, 또는 반투과성 이산 부피의 사용의 한가지 장점은 일부 시약, 예컨대 완충제, 화학적 활성인자, 또는 다른 작용제가 이산 부피를 통해서 통과할 수 있는 한편, 다른 재료, 예컨대 표적 분자는 이산 부피 또는 공간에 유지될 수 있다는 것이다. 전형적으로, 이산 부피는 표지화를 가능하게 하는 조건 하에서 색인가능한 핵산 식별자로 표적 분자의 표지화에 적합한 유체 매질 (예를 들어, 수용액, 오일, 완충제, 및/또는 세포 성장을 지지할 수 있는 배지)을 포함할 수 있다. 개시된 방법에서 유용한 예시적인 이산 부피 또는 공간은 특히 액적 (예를 들어, 미세유체 액적 및/또는 에멀션 액적), 히드로겔 비드 또는 다른 중합체 구조 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 비드 또는 아가로스 비드), 조직 슬라이드 (예를 들어, 화학적, 광학적, 또는 물리적 수단으로 한정된 특정한 영역, 부피 또는 공간을 갖는 고정 포르말린 파라핀 포매된 슬라이드), 정돈된 어레이 또는 무작위 패턴으로 시약을 배치하여 한정된 영역을 갖는 현미경 슬라이드, 튜브 (예컨대, 원심분리 튜브, 미세원심분리 튜브, 시험관, 큐벳, 코니칼 튜브 등), 병 (예컨대 유리병, 플라스틱병, 세라믹 병, 엘렌메이어 플라스크, 섬광 바이알 등), 웰 (예컨대 플레이트의 웰), 플레이트, 피펫, 또는 피펫 팁을 포함한다. 일정 구현예에서, 구획은 유중수 에멀션 중 수성 액적이다. 특정 구현예에서, 정확하고 균일한 부피를 요구하는 본 명세서에 기술된 임의의 적용, 방법, 또는 시스템은 음향 액체 분배기의 사용을 채택할 수 있다.
일부 구현예에서, 개별 이산 부피는 액적일 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 장치는 많은 스폿이 한정될 수 있는 가요성 재료 기재를 포함한다. 진단 및 바이오센싱에서 사용이 적합한 가요성 기재 재료는 당분야에 공지되어 있다. 가요성 기재 재료는 식물 유래 섬유, 예컨대 셀룰로스계 섬유로 만들어질 수 있거나, 또는 가요성 중합체 예컨대 가요성 폴리에스테르 필름 및 다른 중합체 유형으로 제조될 수 있다. 각각의 한정된 스폿 내에서, 본 명세서에 기술된 시스템의 시약은 개별 스폿에 적용된다. 각각의 스폿은 상이한 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 세트를 제외하고, 동일한 시약을 함유할 수 있거나, 또는 적용가능한 경우에, 한번에 다수의 표적을 스크리닝하기 위한 상이한 검출 압타머를 함유할 수 있다. 따라서, 본 명세서의 시스템 및 장치는 동일 표적의 존재에 대해서 다수의 공급원 (예를 들어, 상이한 개체 유래의 다수 임상 샘플) 유래 샘플을 스크리닝할 수 있거나, 또는 샘플 중 다수의 상이한 표적의 존재에 대해서 제한된 수의 표적, 또는 단일 샘플의 분취액 (또는 동일 공급원 유래 다수의 샘플)에 대해 스크리닝할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 본 명세서에 기술된 시스템의 구성요소는 종이 또는 직물 기재 상에서 동결 건조된다. 일정 예에서 사용될 수 있는 예시적인 가요성 물질 기반 기재는 하기 문헌에 개시된다: Pardee et al. Cell. 2016, 165(5):1255-66 and Pardee et al. Cell. 2014, 159(4):950-54. 혈액을 포함하여, 생물학적 유체와 사용을 위한 적합한 가요성 물질-기반 기재는 하기 문헌에 개시된다: 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2013/071301 ("Paper based diagnostic test" to Shevkoplyas et al.), 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0111517 ("Paper-based microfluidic systems" to Siegel et al.) 및 Shafiee et al. "Paper and Flexible Substrates as Materials for Biosensing Platforms to Detect Multiple Biotargets" Scientific Reports 5:8719 (2015). 착용형 진단 장치에 사용에 적합한 것을 포함하여, 추가의 가요성 기반 물질은 하기 문헌에 개시된다: Wang et al. "Flexible Substrate-Based Devices for Point-of-Care Diagnostics" Cell 34(11):909-21 (2016). 추가의 가요성 기반 재료는 니트로셀룰로스, 폴리카보네이트, 메틸에틸 셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 폴리스티렌, 또는 유리 (예를 들어, US20120238008 참조)를 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 이산 부피는 소수성 표면, 예컨대 제한없이, 왁스, 포토레지스트, 또는 고형 잉크에 의해 이격된다.
일부 구현예에서, 선량계 또는 뱃지는 사용자가 일정한 미생물 또는 다른 작용제에 노출을 통지하게 하는 센서 또는 지시자로서 제공하는 것이 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 시스템은 특정한 병원체를 검출하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 상기 개시된 압타머 기반 구현예는 폴리펩티드를 비롯하여, 특이적 압타머가 결합할 수 있는, 다른 작용제, 예컨대 화학제 둘 모두를 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 장치는 예를 들어, 생물전 또는 화학전 작용제 검출을 위해, 가능한 신속하게 잠재적으로 위험한 미생물에 노출에 관한 정보를 제공하기 위해서, 군인 또는 다른 병사를 비롯하여, 임상의, 연구자, 병원 의료진 등의 감시에 유용할 수 있다. 다른 구현예에서, 이러한 감시 뱃지는 면역약화 환자, 화상 환자, 화학요법을 겪은 환자, 어린이, 또는 노령 개체에서 위험한 미생물 또는 병원체에 노출을 방지하기 위해 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 각각의 개별 이산 부피는 차폐된 RNA 폴리머라제 프로모터 결합 부위 또는 차폐된 프라이머 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 검출 압타머를 더 포함할 수 있다. 이와 같이, 각각의 개별 이산 부피는 핵산 증폭 시약을 더 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 표적 분자는 표적 DNA일 수 있고, 개별 이산 부피는 표적 DNA에 결합하고 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 프라이머를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 시스템 및 장치를 사용하여 분석할 수 있는 샘플 공급원은 대상체의 생물학적 샘플 또는 환경적 샘플을 포함한다. 환경적 샘플은 표면 또는 유체를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 제한없이, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 객담, 점액질, 림프, 활액, 척수액, 뇌척수액, 피부 또는 점막의 면봉, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일례의 구현예에서, 환경적 샘플은 식품 또는 다른 민감한 조성물 및 재료의 제조에서 사용되는 표면과 같은, 고형 표면으로부터 채취된다.
다른 예의 구현예에서, t본 명세서에 기술된 시스템의 구성요소는 일회용 기재, 예컨대 표면 또는 샘플 유체를 면봉으로 닦는데 사용되는 면봉 또는 직물 상에 위치될 수 있다. 예를 들어, 시스템은 식품, 예컨대 과일 또는 야채의 표면을 면봉으로 닦아서 식품 상에 병원체의 존재에 대해 시험하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 일회용 기재는 일정한 미생물 또는 작용제의 검출을 위해서, 예컨대 검색 스크리닝에서 사용을 위해서 다른 표면을 면봉으로 닦는데 사용될 수 있다. 일회용 기재는 또한 포렌식에서 적용성을 가질 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 샘플에 존재하는 생물학적 물질의 유형을 결정하기 위해서 의심되거나, 또는 일정한 조직 또는 세포 마커를 식별하는데 사용할 수 있는, 예를 들어 식별 DNA SNP를 검출하도록 디자인된다. 유사하게, 일회용 기재는 환자 유래 샘플 - 예컨대 구강 유래 타액 샘플 - 또는 피부의 면봉을 수집하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 샘플 또는 면봉은 육류 제품 상에 또는 그 내에 오염물의 존재 또는 부재를 검출하기 위해서 육류 제품에서 채취될 수 있다.
식품, 임상, 산업, 및 다른 환경 상황의 경우 근실시간 미생물 진단이 필요하다 (참조: 예를 들어, Lu TK, Bowers J, and Koeris MS., Trends Biotechnol. 2013 Jun;31(6):325-7). 일정 구현예에서, 본 발명은 병원체 (예를 들어, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 살모넬라 (Salmonella) spp., 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 시겔라 (Shigella) spp., 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcal aureus), 스타필로코커스 엔테리티스 (Staphylococcal enteritis), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 비브리오 파라해몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 벌니피커스 (Vibrio vulnificus), 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica) 및 여시니아 슈도튜버큘로시스 (Yersinia pseudotuberculosis), 브루셀라 (Brucella) spp., 코리네박테리움 울세란스 (Corynebacterium ulcerans), 콕시엘라 부르네티이 (Coxiella burnetii), 또는 플레시오모나스 시겔로이데스 (Plesiomonas shigelloides))에 특이적인 가이드 RNA를 사용하는 식품유래 병원체의 신속한 검출을 위해 사용된다.
일정 구현예에서, 장치는 플로우 스트립이거나 또는 그를 포함한다. 예를 들어, 측류 스트립은 색상에 따른 검출을 허용한다. 리포터는 5' 말단에 부착된 제1 분자 (예컨대 예를 들면 FITC) 및 3' 말단에 부착된 제2 분자 (예컨대 예를 들면 바이오틴)를 갖도록 변형된다 (또는 반대도 같음). 측류 스트립은 항-제1 분자 (예를 들어, 항-FITC) 항체가 제1 라인에서 혼성화되고 항-제2 분자 (예를 들어, 항-바이오틴) 항체는 제2 하류 라인에서 혼성화되는 2개 포획 라인을 갖도록 디자인된다. 반응물이 스트립 아래로 흐르면서, 미절단된 리포터는 제1 포획 라인에서 항-제1 분자 항체에 결합하게 되는 한편, 절단된 리포터는 제2 분자를 방출하게 되고 제2 포획 라인에서 제2 분자 결합을 가능하게 한다. 예를 들면 나노입자, 예컨대 금 나노입자에 접합된, 제2 분자 샌드위치 항체는 제1 또는 제2 라인에서 임의의 제2 분자에 결합하게 될 것이고 그 결과 강력한 판독치/신호 (예를 들어, 색상)를 야기시키게 될 것이다. 리포터가 더 절단되면서, 더 많은 신호가 제2 포획 라인에서 축적되어지고 적은 신호가 제1 라인에서 나타나게 될 것이다. 일정 양태에서, 본 발명은 핵산 또는 폴리펩티드를 검출하기 위해서 본 명세서에 기술된 바와 같은 플로우 스트립의 사용에 관한 것이다. 일정 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 플로우 스트립으로 핵산 또는 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법, 예를 들어 (측면) 흐름 시험법 또는 (측면) 흐름 면역크로마토그래피 어세이에 관한 것이다.
본 명세서에 개시된 구현예는 TnpB 시스템을 포함하는 측류 검출 장치에 관한 것이다. 장치는 TnpB 부차적 반응의 검출을 위한 측류 기질을 포함할 수 있다. 측류 어세이에 사용하기에 적합한 기판은 당업계에 공지되어 있다. 이들은 제한 없이, 셀룰로스 및/또는 유리 섬유로 만들어진 막 또는 패드, 폴리에스테르, 니트로셀룰로스 또는 흡수성 패드를 포함할 수 있다 (J Saudi Chem Soc 19(6):689-705; 2015). TnpB 시스템, 즉 하나 이상의 TnpB 시스템 및 상응하는 리포터 구성체는 전형적으로 측류 기재의 한쪽 말단 상에서, 측류 기재의 한정된 시약 부분에서 측류 기재에 첨가된다. 본 발명의 상황에서 사용되는 리포터 구성체는 DNA 링커에 의해 연결되는 제1 분자 및 제2 분자를 포함한다. 측류 기재는 샘플 부분을 더 포함한다. 샘플 부분은 시약 부분과 동일하거나, 이에 연속적이거나, 이에 인접할 수 있다. 측류 스트립은 제1 포획 라인, 전형적으로 장치를 가로 질러 흐르는 수평 라인을 포함하지만, 다른 구성이 가능하다. 제1 포획 영역은 샘플 로딩 부분과 측류 기판의 동일한 말단부에 근접하고 그 위에 있다. 리포터 구성체의 제1 분자에 특이적으로 결합하는 제1 결합제는 제1 포획 영역에 고정되거나 다르게는 고정된다. 제2 포획 영역은 제1 결합 영역으로부터 측류 기재의 반대 말단부를 향해 위치한다. 제2 결합제는 제2 포획 영역에 고정되거나 다르게는 고정된다. 제2 결합제는 리포터 구성체의 제2 분자에 특이적으로 결합하거나, 또는 제2 결합제는 검출가능한 리간드에 결합할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 리간드는 콜로이드 입자와 같은 입자일 수 있고, 이것이 응집될 때 시각적으로 검출될 수 있다. 입자는 리포터 구성체 상의 제2 분자에 특이적으로 결합하는 항체로 변형될 수 있다. 리포터 구성체가 절단되지 않으면, 이는 제1 결합 영역에서 검출가능한 리간드의 축적을 촉진할 것이다. 리포터 구성체가 절단되면, 검출가능한 리간드가 방출되어 제2 결합 영역으로 흐른다. 이러한 구현예에서, 제2 결합제는 검출가능한 리간드 상의 항체 상의 검출가능한 리간드를 특이적으로 또는 비특이적으로 결합할 수 있는 작용제이다. 이러한 구현예에 대한 적합한 결합제의 예는 단백질 A 및 단백질 G 를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
측면 지지 기판은 하우징 내에 위치될 수 있다 (참조: 예를 들어, "Rapid Lateral Flow Test Strips" Merck Millipore 2013). 하우징은 샘플을 로딩하기 위한 적어도 하나의 개구부 및 제1 및 제2 포획 영역에서 생성된 검출가능한 신호의 판독을 허용하는 제2 단일 개구부 또는 별도의 개구부를 포함할 수 있다.
TnpB 시스템은 측류 기재에 냉동 건조될 수 있고, 특시 사용 장치로서 포장되거나, 또는 TnpB 시스템은 장치를 사용하는 시점에 측류 기재의 시약 부분에 첨가될 수 있다. 스크리닝될 샘플은 측류 기제의 샘플 로딩 부분에 로딩된다. 샘플은 액체 샘플 또는 적절한 용매에 용해되고, 일반적으로 수성인 샘플이어야 한다. 액체 샘플은 TnpB 시약을 재구성하여서 TnpB 반응이 일어날 수 있다. 액체 샘플은 제1 및 제2 포획 영역을 향해서 기재의 샘플 부분으로부터 흐르기 시작한다. 온전한 리포터 구성체는 제1 결합제와 제1 분자 사이의 결합에 의해 제1 포획 영역에서 결합된다. 마찬가지로, 검출제는 온전한 리포터 구성체 상의 제2 분자에 결합함으로써 제1 결합 영역에서 수집을 시작할 것이다. 표적 분자(들)가 샘플에 존재하면, TnpB 부차적 효과가 활성화된다. 활성화된 TnpB가 결합된 리포터 구성체와 접촉하면서, 리포터 구성체는 절단되어서, 제2 분자를 방출하여서 제2 결합 영역을 향해서 측류 기재 아래로 더 흐르게 된다. 이어서 방출된 제2 분자는 제2 결합제에 결합함으로써 제2 포획 영역에서 포획되며, 여기서 추가의 검출제는 또한 제2 분자에 결합함으로써 축적될 수 있다. 따라서, 표적 분자(들)가 샘플에 존재하지 않으면, 검출가능한 신호는 제1 포획 영역에 나타날 것이고, 표적 분자(들)가 샘플에 존재하면, 검출가능한 신호는 제2 포획 영역의 위치에 나타날 것이다.
특이적 결합-통합 분자는 본 발명에서 사용될 수 있는 결합 쌍의 임의의 구성원을 포함한다. 이러한 결합 쌍은 당업자에게 공지되어 있으며, 항체-항원 쌍, 효소-기질 쌍, 수용체-리간드 쌍 및 스트렙타비딘-바이오틴을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 공지된 결합 쌍 외에, 신규한 결합 쌍이 특별히 디자인될 수 있다. 결합쌍의 특징은 결합쌍의 2개 구성원 간에 결합이다.
양쪽 말단 상에 분자를 갖는 올리고뉴클레오티드 링커는 TnpB가 DNA 부차적 활성을 가지면 DNA를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 링커는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 일정 구현예에서, 그들은 RNA 및 DNA 영역 둘 모두를 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 링커는 다양한 길이, 예컨대 5-10 뉴클레오티드, 10-20 뉴클레오티드, 20-50 뉴클레오티드 또는 그 이상의 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 식별자 구성요소는 친화성 태그, 예컨대 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, FLAG 태그, V5 태그, 키틴 결합 단백질 (CBP) 태그, 말토스-결합 단백질 (MBP) 태그, GST 태그, 폴리-His 태그, 및 형광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광성 단백질 (GFP), 노란색 형광성 단백질 (YFP), 시안색 형광성 단백질 (CFP), dsRed, mCherry, Kaede, Kindling, 및 이의 유도체, FLAG 태그, Myc 태그, AU1 태그, T7 태그, OLLAS 태그, Glu-Glu 태그, VSV 태그, 또는 이의 조합을 포함한다. 다른 친화성 태그는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 이러한 표지는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 (예를 들어, 특정 친화성 태그를 인식하는 항체와 같은 특이적 결합제를 사용하여) 검출 및/또는 단리될 수 있다. 이러한 특이적 결합제 (예를 들어, 항체)는 예를 들어 동위원소 표지와 같은 검출가능한 표지 및/또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 핵산 바코드를 추가로 함유할 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 측류 장치는 샘플의 적용을 위한 제1 말단을 포함하는 측류 기재를 포함한다. 제1 영역에는 본 명세서에 개시된 것과 같은 검출가능한 리간드, 예를 들어 금 나노입자가 로딩된다. 금 나노입자는 항-FITC 항체와 같은 제1 항체로 변형될 수 있다. 제1 영역은 또한 검출 구성체를 포함한다. 일례의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 DNA 검출 구성체 및 TnpB 시스템. 일례의 구현예에서, 추가 예시 목적으로, DNA 구성체는 검출 구성체의 제1 말단 상에 FAM 분자 및 검출 구성체의 제2 말단 상에 바이오틴을 포함할 수 있다. 측류 기재의 제1 말단으로부터 용액 흐름의 상류는 제1 시험 밴드이다. 시험 밴드는 바이오틴 리간드를 포함할 수 있다. 따라서, DNA 검출 구성체가 이의 개시 상태로 존재하는 경우에, 즉 표적 부재 하에서, 제1 말단의 FAM 분자는 금 나노입자 상의 항-FITC 항체에 결합하게 되고, DNA 구성체의 제2 말단 상의 바이오틴은 바이오틴 리간드에 결합하여 검출가능한 리간드가 제1 시험에서 축적되게 허용하여, 검출가능한 신호를 발생시킨다. 제1 밴드에서 검출가능 신호의 발생은 표적 리간드의 부재를 의미한다. 표적 존재 하에서, TnpB 복합체가 형성되고, TnpB는 활성화되어서 DNA 검출 구성체의 절단을 일으킨다. 온전한 DNA 검출 구성체의 부재 하에서, 콜로이드 금은 제2 스트립을 지나 흐르게 된다. 측류 장치는 제1 밴드의 상류에, 제2 밴드를 포함할 수 있다. 제2 밴드는 항체-표지된 콜로이드 금 분자에 결합할 수 있는 분자, 예를 들어 콜로이드 금 상에 토끼 항-FTIC 항체에 결합할 수 있는 항-토끼 항체를 포함할 수 있다. 그러므로, 하나 이상의 표적의 존재 하에서, 검출가능한 리간드는 제2 밴드에 축적되어서, 샘플 중 하나 이상의 표적의 존재를 의미한다.
일정 예의 구현예에서, 장치는 상이한 액적 (즉, 개별 이산 부피)을 생성시키고/시키거나 병합시키는 미세유체 장치이다. 예를 들어, 액적의 제1 세트는 스크리닝하려는 샘플을 함유하게 형성될 수 있고 액적의 제2 세트는 본 명세서에 기술된 시스템의 구성요소를 함유하게 형성된다. 그 다음으로, 액적의 제1 및 제2 세트를 병합시키고 나서 본 명세서에 기술된 바와 같은 진단 방법은 병합된 액적 세트 상에서 수행된다. 본 명세서에 개시된 미세유체 장치는 실리콘-기반 칩일 수 있고 제한없이, 핫 엠보싱, 엘라스토머의 성형, 사출 성형, LIGA, 소프트 리쏘그라피, 규소 제작 및 관련 박막 프로세싱 기술을 포함한, 다양한 기술을 사용하여 제작될 수 있다. 미세유체 장치를 제작하기 위한 적합한 재료는 제한없이, 환형 올레핀 공중합체 (COC), 폴리카보네이트, 폴리(디메틸실록산) (PDMS), 및 폴리(메틸아크릴레이트) (PMMA)를 포함한다. 일 구현예에서, PDMS의 소프트 리쏘그라피는 미세유체 장치를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 몰드는 기재 내에서 흐름 채널, 밸브 및 필터의 위치를 한정하는 포토리쏘그라피를 사용해 제조될 수 있다. 기재 재료를 몰드에 붓고 경화되게 하여 스탬프를 생성시킨다. 그 다음으로, 스탬프는 고형 지지체, 예컨대 제한없이, 유리에 밀봉된다. 일부 단백질을 흡착하고 일정한 생물학적 프로세스를 억제할 수 있는, 일부 중합체, 예컨대 PDMS의 소수성 성질에 기인하여, 부동태화제가 필요할 수 있다 (Schoffner et al. Nucleic Acids Research, 1996, 24:375-379). 적합한 부동태화제는 당분야에 공지되어 있고, 제한없이, 실란, 파릴렌, n-도데실-b-D-마토시드 (DDM), 플루론산, Tween-20, 다른 유사한 계면활성제, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 알부민, 콜라겐, 및 다른 유사한 단백질 및 펩티드를 포함한다.
일정 예의 구현예에서, 시스템 및/또는 장치는 유세포측정 판독으로의 전환을 위해 적합화되거나 또는 단일 실험에서 수백만 세포의 민감하고 정량적인 측정을 허용하고 현행 흐름-기반 방법, 예컨대 PrimeFlow 어세이에 비해 개선될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 세포는 이후에 유세포측정에 의한 분석에 적합한 단일-세포 액적으로 캐스팅될 수 있는, 미중합된 겔 단량체를 함유하는 액적에 캐스팅될 수 있다. 형광성 검출가능한 표적을 포함하는 검출 구성체는 미중합된 겔 단량체로 캐스팅될 수 있다. 겔 단량체의 중합시 액적 내에 비드가 형성된다. 겔 중합은 자유-라디칼 형성을 통하기 때문에, 형광성 리포터는 겔에 공유 결합된다. 검출 구성체는 링커, 예컨대 아민을 포함하도록 더욱 변형될 수 있다. 소광제는 겔 형성 후에 첨가될 수 있고 링커를 통해서 리포터 구성체에 결합하게 될 것이다. 따라서, 소광제는 겔에 결합되지 않고 리포터가 tNPb에 의해 절단될 때 자유롭게 멀리 확산된다. 액적에서 신호의 증폭은 혼성화 연쇄 반응 (HCR 개시제) 증폭과 검출 구성체를 커플링하여 획득될 수 있다. DNA/RNA 하이브리드 헤어핀은 RNase 민감성 도메인을 갖는 헤어핀 루프를 포함할 수 있는 겔에 도입될 수 있다. RNase 민감성 도메인을 갖는 헤어핀 루프 내 가닥 치환 토우홀드를 보호하여서, HCR 개시제는 TnpB 시스템에 의한 헤어핀 루프의 절단 이후에 선택적으로 탈보호될 수 있다. 토우홀드 매개된 가닥 치환을 통해서 HCR 개시제의 탈보호 이후, 형광성 HCR 단량체는 겔로 세척되어서 개시제가 탈보호되는 경우에 신호를 증폭시킬 수 있게 한다.
본 발명의 상황에서 사용될 수 있는 미세유체 장치의 예는 하기 문헌에 기술된다: Hour et al. "Direct Detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics" Lap Chip. 15(10):2297-2307 (2016).
본 명세서에 기술된 시스템은 대상체의 생물학적 샘플, 예컨대 생물학적 유체를 클리닉 환경 외부에서 평가하고 의료 전문가가 접속할 수 있는 중심 서버에 원격으로 어세이의 결과를 보고하는 착용형 의료 장치에 더 도입될 수 있다. 장치는 하기 문헌에 개시된 장치같이, 혈액을 자기-채취하는 능력을 포함할 수 있다: 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0342509 ("Needle-free Blood Draw to Peeters et al.), 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0065821 ("Nanoparticle Phoresis" to Andrew Conrad).
일부 구현예에서, 개별 이산 부피는 마이크로웰이다.
일정 예의 구현예에서, 장치는 개별 웰, 예컨대 마이크로플레이트 웰을 포함할 수 있다. 마이크로플레이트 웰의 크기는 표준 6, 24, 96, 384, 1536, 3456, 또는 9600 크기 웰의 크기일 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 본 명세서에 기술된 시스템의 구성요소는 동결 건조될 수 있고 유통 및 사용 전에 웰의 표면 상에 적용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 장치는 입구 및 출구 포트를 더 포함할 수 있고, 이들은 차례로 밸브, 튜브, 채널, 챔버, 및 시린지 및/또는 장치 내부 및 외부로 유체의 유입 및 추출을 위한 펌프에 이후에 연결될 수 있다. 장치는 미세유체 장치 내에서 유체의 지향성 움직임을 가능하게 하는 유체 흐름 액츄에이터에 연결될 수 있다. 예시적인 액츄에이터는 제한없이, 시린지 펌프, 기계 작동식 재순환 펌프, 전기삼투 펌프, 벌브, 벨로우, 다이어프램, 또는 유체를 움직이게 하려는 버블을 포함한다. 일정 예의 구현예에서, 장치는 장치를 통해서 유체를 움직이게 함께 작동하는 프로그램가능한 밸브를 갖는 제어기에 연결된다. 일정 예의 구현예에서, 장치는 하기에 더욱 상세하게 기술되는 제어기에 연결된다. 장치는 장치 상의 입구 포트에 삽입을 위한 금속 핀으로 종결되는 튜빙에 의해서 흐름 액츄에이터, 제어기, 및 샘플 로딩 장치에 연결될 수 있다.
본 명세서에 도시된 바와 같이, 시스템의 구성요소는 동결건조될 때 안정하고, 그러므로, 지지 장치를 필요로 하지 않는 구현예가 또한 고려되며, 즉, 시스템은 본 명세서에 개시된 반응을 지지하게 되는 임의의 표면 또는 유체에 적용될 수 있고, 그 표면 또는 용액으로부터 양성 검출가능한 신호의 검출을 가능하게 한다. 동결-건조 이외에도, 시스템은 또한 펠렛화된 형태로 안정하게 저장되고 이용될 수 있다. 적합한 펠렛화 형태를 형성하는데 유용한 중합체는 당분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 개별 이산 부피는 고형 기재 상에 한정된다. 일부 구현예에서, 개별 이산 부피는 기재 상에 한정된 스폿이다. 일부 구현예에서, 기재는 예를 들어, 제한없이, 종이 기재, 섬유 기재, 또는 가요성 중합체-기반 기재를 포함하는, 가요성 재료 기재일 수 있다. 특정 구현예에서, 가요성 물질 기재는 종이 기재 또는 가요성 중합체 기반 기재이다.
일정 구현예에서, TnpB는 장치에서 각각의 이상 부피에 결합된다. 각각의 이산 부피는 상이한 표적 분자에 특이적인 상이한 ωRNA를 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 샘플은 각각이 표적 분자에 특이적인 ωRNA를 포함하는 하나 초과의 이산 부피를 포함하는 고형 기재에 노출된다. 이론에 국한하지 않고, 각각의 ωRNA는 샘플로부터 이의 표적 분자를 포획하게 되고 샘플은 별개 어세이로 나뉠 필요가 없다. 따라서, 가치있는 샘플을 보존할 수 있다. 이펙터 단백질은 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 친화성 태그는 당분야에 충분히 공지되어 있다 (예를 들어, HA 태그, Myc 태그, Flag 태그, His 태그, 바이오틴). 이펙터 단백질은 바이오틴 분자에 연결될 수 있고 이산 부피는 스트렙타비딘을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질은 이펙터 단백질에 특이적인 항체에 의해 결합된다. CRISPR 효소에 결합하는 방법은 이전에 기술된 바 있다 (참조: 예를 들어, US20140356867A1).
본 명세서에 개시된 장치는 또한 다른 방법을 통해 샘플을 분석하기 위해 당분야에 공지된 현장 진단 (POC) 장치의 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: St John and Price, "Existing and Emerging Technologies for Point-of-Care Testing" (Clin Biochem Rev. 2014 Aug; 35(3): 155-167).
본 발명은 무선 랩-온-칩 (LOC) 진단 센서 시스템과 사용될 수 있다 (참조: 예를 들어, 미국 특허 제9,470,699호, "Diagnostic radio frequency identification sensors and applications thereof"). 일정 구현예에서, 본 발명은 무선 장치 (예를 들어, 휴대폰, 개인 정보용 단말기 (PDA), 타블렛)에 의해 제어되는 LOC에서 수행되고 결과가 상기 장치에 보고된다.
RFID (Radio frequency identification) 태그 시스템은 RFID 판독기 (인터로게이트라고도 함)에 의한 수신을 위해 데이터를 전송하는 RFID 태그를 포함한다. 전형적인 RFID 시스템에서, 개별 객체 (예를 들어, 상점 상품)는 트랜스폰더를 함유하는 상대적으로 소형의 태그가 장착된다. 전형적인 RFID 시스템에서, 개별 객체 (예를 들어, 상점 상품)는 트랜스폰더를 함유하는 상대적으로 소형의 태그가 장착된다. RFID 판독기는 통신 프로토콜의 사용을 통해서 태그 내 트랜스폰더를 활성화시키는 신호를 방출한다. 따라서, tRFID 판독기는 태그에 대한 데이타를 읽고 쓸 수 있다. 추가적으로, RFID 태그 판독기는 RFID 태그 시스템 어플리케이션에 따라서 데이타를 처리한다. 현재, 수동형 및 능동형 RFID 태그가 존재한다. 수동형 RFID 태그 내부 전력원을 함유하지 않지만, FRID 판독기로부터 수신된 라디오 주파수 신호에 의해 작동된다. 대안적으로, 능동형 RFID 태그는 이 능동형 RFID 태그가 더 큰 전파 범위 및 메모리 용량을 보유할 수 있게 하는 내부 전력원을 함유한다. 수동형 대 능동형 태그의 사용은 특정한 적용 분야에 따라 좌우된다.
랩-온-더 칩 기술은 과학 문헌에 충분히 설명되어 있고, 다수의 미세유체 채널, 투입 또는 화학적 웰로 이루어진다. 웰 내에서의 반응은 RFID 전자 칩으로부터의 전도성 리드가 시험 웰 각각에 직접 연결될 수 있으므로 RFID 태그 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 안테나는 장치의 후면 상에 직접적으로 또는 전자 칩의 다른 층에 장착되거나 또는 인쇄될 수 있다. 더 나아가서, 리드, 안테나 및 전자 칩은 LOC 칩에 내장될 수 있고, 그리하여 전극 또는 전자 장치의 단락을 방지한다. LOC가 복합체 샘플 분리 및 분석을 가능하게 하므로, 이러한 기술은 LOC 시험을 복잡하거나 또는 값비싼 판독기와 독립적으로 수행하는 것을 가능하게 한다. 대신 단순 무선 장치 예컨대 휴대폰 또는 PDA를 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 무선 장치는 또한 보다 복잡한 LOC 분석을 위한 미세유체 채널의 분리 및 제어를 통제한다. 일 구현예에서, LED 및 다른 전자 측정 또는 감지 장치는 LOC-RFID 칩에 포함된다. 이론에 국한하려는 것이 아니나, 이러한 기술은 일회성이어서 분리 및 혼합을 요구하는 복잡한 시험을 실험실 밖에서 수행하는 것을 가능하게 한다.
바람직한 구현예에서, LOC는 미세유체 장치일 수 있다. LOC는 수동형 칩일 수 있고, 여기서 칩은 무선 장치를 통해서 작동되고 제어된다. 일정 구현예에서, LOC는 시약을 수용하기 위한 미세유체 채널 및 샘플을 도입시키기 위한 채널을 포함한다. 일정 구현예에서, 무선 장치로부터의 신호는 전력을 LOC에 전달하여 샘플 및 어세이 시약의 혼합을 활성화시킨다. 특히, 본 발명의 경우에서, 시스템은 차폐제, CRISPR 이펙터 단백질, 및 표적 분자에 특이적인 가이드 RNA를 포함할 수 있다. LOC의 활성화 시, 미세유체 장치는 샘플 및 어세이 시약을 혼합할 수 있다. 혼합 시, 센서는 신호를 검출하고 결과를 무선 장치로 전송한다. 일정 구현예에서, 비차폐제는 전도성 RNA 분자이다. 전도성 RNA 분자는 전도성 재료에 부착될 수 있다. 전도성 분자는 전도성 나노입자, 전도성 단백질, 단백질 또는 라텍스에 부착되는 금속 입자 또는 전도성인 다른 비드일 수 있다. 일정 구현예에서, DNA 또는 RNA가 사용되면 전도성 분자는 부응하는 DNA 또는 RNA 가닥에 직접 부착될 수 있다. 전도성 분자의 방출은 센서에 걸쳐 검출될 수 있다. 어세이는 단일 단계 과정일 수 있다.
표면적의 전기 전도성은 측정할 수 있으므로 정밀하게 정량된 결과가 일회용 무선 RFID 전기-어세이에서 가능하다. 더 나아가서, 시험 면적은 매우 작아서 소정 면적에서 더 많은 시험을 수행할 수 있게 하여 그 결과로 비용이 절감될 수 있다. 일정 구현예에서, 각각이 센서에 고정된 상이한 CRISPR 이펙터 단백질 및 가이드 RNA와 연합된 별개의 센서가 다수의 표적 분자를 검출하는데 사용된다. 이론에 국한하려는 것은 아니나, 상이한 센서의 활성화는 무선 장치에 의해 구별될 수 있다.
본 명세서에 기술된 전도성 방법이외에도, 일회용 RFID 어세이를 위한 기본적인 저비용 통신 및 전력 플랫폼 때문에 RFID 또는 블루투스에 의존하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 광학 수단을 사용하여 소정 표적 분자의 존재 및 수준을 평가할 수 있다. 일정 구현예에서, 광학 센서는 형광성 차폐제의 탈차폐를 검출한다.
일정 구현예에서, 본 발명의 장치는 어세이의 진단 판독을 위한 소형 휴대용 장치를 포함할 수 있다 (참조: 예를 들어, Vashist et al., Commercial Smartphone-Based Devices and Smart Applications for Personalized Healthcare Monitoring and Management, Diagnostics 2014, 4(3), 104-128; mReader from Mobile Assay; and Holomic Rapid Diagnostic Test Reader).
본 명세서에 언급된 바와 같이, 일정 구현예는 구현예가 신호를 판독하기 위해 보다 복잡한 검출 장비로의 접근이 제한될 수 있는 자원 부족 환경 및/또는 POC 상황에서 이용될 때 일부 부수적인 이득을 갖는 비색성 변화를 통한 검출을 가능하게 한다. 그러나, 본 명세서에 개시된 휴대용 실시형태는 또한 가시 범위 밖의 신호의 검출할 수 있게 하는 소형 분광광도계와 커플링될 수 있다. 본 발명과 조합하여 사용될 수 있는 휴대용 분광광도계의 예는 하기 문헌에 기술된다: Das et al. "Ultra-portable, wireless smartphone spectrophotometer for rapid, non-destructive testing of fruit ripeness." Nature Scientific Reports. 2016, 6:32504, DOI: 10.1038/srep32504. 마지막으로, 퀀텀 도트-기반 차폐성 구성체를 이용하는 일정한 구현예에서, 소형 UV 광, 또는 다른 적합한 장치는 퀀텀 도트에 의해 제공되는 거의 완전한 퀀텀 수율 덕분에 신호를 검출하는데 성공적으로 사용될 수 있다.
핵산 검출 방법
어세이 플랫폼의 저비용 및 적응성은 그 자체로 (i) 일반적인 RNA/DNA/단백질 정량, (ii) 신속한, 복합 RNA/DNA 및 단백질 발현 검출, 및 (iii) 임상 및 환경적 샘플 둘 모두에서 표적 핵산, 펩티드 및 단백질의 민감한 검출을 포함하는 수많은 적용성을 부여한다. 추가적으로, 본 명세서에 개시된 시스템은 생물학적 환경, 예컨대 세포 내에서 전사물의 검출을 위해 개조될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 CRISPR 이펙터의 고도로 특이적인 성질을 고려하면, 살아있는 세포에서 전사물 또는 질환-연관 돌연변이의 대립유전자 특이적 발현을 추적하는 것이 가능할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 TnpB 시스템을 포함하는 하나 이상의 개별 이산 부피로 샘플 또는 샘플 세트를 분포시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 핵산의 검출을 포함한다. 샘플 또는 샘플 세트는 하나 이상의 표적 분자에 대한 하나 이상의 ωRNA의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있고, TnpB 단백질은 하나 이상의 표적 분자에 대한 하나 이상의 ωRNA의 결합을 통해서 활성화될 수 있고, CRISPR 이펙터 단백질의 활성화로 검출 구성체의 변형이 일어나서 검출가능한 양성 신호가 발생된다. 하나 이상의 검출가능 양성 신호를 이후 검출할 수 있고, 검출은 샘플 중 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 TnpB 및 펩티드 검출 압타머를 포함하는 개별 이산 부피의 세트로 샘플 또는 샘플 세트를 분포시키는 단계를 포함하는, 샘플에서 폴리펩티드의 검출을 포함한다. 샘플 또는 샘플 세트는 하나 이상의 표적 분자에 대한 펩티드 검출 압타머의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있고, 상응하는 표적 분자에 대한 압타머의 결합은 RNA 폴리머라제 결합 부위 또는 프라이머 결합 부위를 노출시켜서 기폭제 RNA의 생성을 일으킨다. 이어서 TnpB는 기폭제 RNA에 대한 하나 이상의 ωRNA의 결합을 통해 활성화될 수 있고, TnpB 단백질의 활성화는 검출 구성체의 변형을 일으켜서 검출가능한 양성 신호를 생산한다. 검출가능 양성 신호가 이후 검출될 수 있고, 검출가능한 양성 신호의 검출은 샘플 중 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미한다.
일정 예의 구현예에서, 단일 표적에 특이적인 단일 가이드 서열은 별개 부피에 위치된다. 각 부피는 이후 상이한 샘플 또는 동일 샘플의 분취액을 수용할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 각각이 표적을 분리시키는 다수의 ωRNA는 단일 웰에 위치될 수 있어서 다수의 표적이 상이한 웰에서 스크리닝될 수 있다. 단일 부피에서 다수의 ωRNA를 검출하기 위해서, 일정 예의 구현예에서, 상이한 특이성을 갖는 다수의 TnpB 단백질이 사용될 수 있다.
구현예에서, 상이한 서열 특이성을 갖는 상이한 TnpB 오솔로그가 사용될 수 있다. 절단 모이어티는 상이한 오솔로그의 서열 특이성을 이용하는데 사용될 수 있다. 검출 구성체는 소정 TnpB 오솔로그에 의해 우선적으로 절단되는 절단 모이어티를 포함할 수 있다. 절단 모이어티 서열은 특정 뉴클레오티드 염기, 동종 중합체의 반복 뉴클레오티드 염기, 또는 염기의 이종중합체일 수 있다. 절단 모이어티는 디뉴클레오티드 서열, 트리뉴클레오티드 서열 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드 모티프를 포함하는 보다 복잡한 모티프일 수 있다. 예를 들어, 하나의 오솔로그는 A를 우선적으로 전단할 수 있는 반면, 나머지는 C, G, U/ T를 우선적으로 절단한다. 따라서, 단일 뉴클레오티드의 실질적인 부분으로 구성되거나 또는 완전하게 포함하는 검출 구성체가 생성될 수 있고, 각각은 상이한 파장에서 검출될 수 있는 상이한 형광단을 갖는다. 이러한 방식으로 최대 4개이ㅡ 상이한 표적이 단일 개별 이산 부피에서 스크리닝될 수 있다. 일정한 다른 예의 구현예에서, 상이한 뉴클레오티드 편집 선호도를 갖는 상이한 오솔로그 예컨대 TnpB가 Cas13 or Cas12와 조합하여 사용될 수 있다.
단일 염기 편집 선호도 이외에도, 추가 검출 구성체는 TnpB, Cas12, 및 Cas13 오솔로그의 다른 모티프 절단 선호도를 기반으로 디자인될 수 있다. 예를 들어, Cas13 또는 Cas12 오솔로그는 디뉴클레오티드 서열, 트리뉴클레오티드 서열 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드 모티퍼를 포함하는 보다 복잡한 모티프를 우선적으로 절단할 수 있다. 예로서, LwaCas13a는 헥사뉴클레오티드 모티프 서열에 대해 강력한 선호도를 보였고, CcaCas13b는 다른 헥사뉴클레오티드 모티프에 대해 강력한 선호도를 보인다. 따라서, 본 명세서에 개시된 구현예를 사용하는 다중 어세이에 대한 상한은 구별가능한 검출가능 표지의 개수 및 그들을 검출하는데 필요한 검출 채널에 의해 주로 제한된다. 일정 예의 구현예에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 25, 27, 28, 29, 또는 30의 상이한 표적이 검출된다. 이러한 모티퍼를 확인하는 예시적인 방법은 하기 작업예에 추가로 개시된다.
특정 구현예에서, 표적 분자는 표적 DNA일 수 있고, 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같이, RNA 폴리머라제를 포함하는 프라이머와 표적 DNA의 결합을 더 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 ωRNA는 표적 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 전사물의 스플라이스 변이체에서 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하도록 디자인될 수 있다.
본 발명에서 사용을 위한 샘플은 생물학적 또는 환경적 샘플, 예컨대 식품 샘플 (신선 과일 또는 채소, 육류), 음료 샘플, 종이 표면, 패브릭 표면, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 대기 공기 또는 다른 가스 샘플에의 노출, 또는 이의 조합일 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 금속, 목재, 플라스틱, 고무 등을 비제한적으로 포함하는 임의의 재료로 만들어진 가정용/상업적/산업적 표면을 면봉으로 닦아서 오염을 시험할 수 있다. 토양 샘플은 환경적 목적 및/또는 인간, 동물 또는 식물 질환 검사를 위해, 병원성 박테리아 또는 기생충, 또는 다른 미생물의 존재에 대해 시험될 수 있다. 물 샘플 예컨대 담수 샘플, 폐수 샘플, 또는 염수 샘플은 예를 들어, 크립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 또는 다른 미생물 오염의 존재를 검출하기 위해, 청정도 및 안정성, 및/또는 휴대성에 대해 평가될 수 있다. 추가 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 객담, 점액질, 림프, 활액, 뇌척수액, 복수, 흉수, 혈청종, 고름, 담즙, 안방수 또는 유리액, 누출액, 삼출액, 피부 또는 점막 표면의 면봉을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 환경적 샘플 또는 생물학적 샘플은 미가공 샘플일 수 있고/있거나 하나 이상의 표적 분자는 방법의 적용 이전에 샘플로부터 정제되지 않을 수 있거나 증폭되지 않을 수 있다. 미생물의 식별은 임의의 많은 적용분야에서 유용하고/하거나 필요할 수 있고, 따라서 당업자가 적절하다고 여기는 임의 출처 유래의 임의 유형의 샘플이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 ωRNA는 세포 무함유 핵산에 결합하도록 디자인될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 ωRNA는 표적 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 전사물의 스플라이스 변이체에서 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하도록 디자인될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 질환 상태에 대한 진단인 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 디자인된다.
일부 구현예에서, 질환 상태는 감염, 장기 질환, 혈액 질환, 면역계 질환, 암, 뇌 및 신경계 질환, 내분비 질환, 임신 또는 출산 관련 질환, 유전 질환, 또는 환경-획득 질환일 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 샘플, 예컨대 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중 하나 이상의 미생물원의 존재를 검출하는 것에 관한 것이다. 일정 예의 구현예에서, 미생물은 박테리아, 진균, 효모, 원충, 기생충, 또는 바이러스일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법은 미생물 종의 신속한 식별, 미생물 단백질 (항원), 항체, 항체 유전자의 존재의 모니터링, 일정 표현형 (예를 들어, 박테리아 내성)의 검출, 질환 진행 및/또는 대발생의 모니터링, 및 항생제 스크리닝을 요구하는 다른 방법과 (또는 조합하여) 다른 방법에서 사용을 위해 적합화될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 미생물 종의 신속한 식별, 미생물 단백질 (항원), 항체, 항체 유전자의 존재의 모니터링, 일정 표현형 (예를 들어, 박테리아 내성)의 검출, 질환 진행 및/또는 대발생의 모니터링, 및 항생제 스크리닝을 요구하는 다른 방법과 (또는 조합하여) 다른 방법에서 사용을 위해 적합화될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예의 신속하고 민감한 진단 능력, 단일 뉴클레오티드 편차에 이르는, 기생충 유형의 검출, 및 POC 장치로서 배치되는 능력 때문에, 본 명세서에 개시된 구현예는 치료 계획, 예컨대 적절한 항생제 또는 항바이러스제의 선택을 가이드하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예는 또한 미생물 오염의 존재에 대해 환경적 샘플 (공기, 물, 표면, 식품 등) 을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.　
미생물 종, 예컨대 박테리아, 바이러스, 진균, 효모 또는 기생충 종 등을 식별하는 방법을 개시한다. 본 명세서에 개시된 특정 구현예는 단일 샘플 내에서, 또는 다수 샘플에 걸쳐 미생물 종을 식별하고 구별하여, 많은 상이한 미생물의 인식을 가능하게 하는 방법 및 시스템을 기재한다. 본 발명은 샘플 중 표적 핵산 서열의 존재를 검출하여, 생물학적 또는 환경적 샘플 중에서 하나 이상의 유기체, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 효모, 원충, 및 진균 또는 이의 조합 중 2종 이상을 구별하고, 병원체의 검출을 가능하게 한다. 샘플로부터 수득된 양성 신호는 미생물의 존재를 의미한다. 다수 미생물은 하나를 초과하는 이펙터 단백질의 사용을 적용하여, 본 발명의 방법 및 시스템을 사용해 동시에 식별될 수 있고, 여기서 각각의 이펙터 단백질은 특이적 미생물 표적 서열을 표적으로 한다. 이러한 방식으로, 임의 수의 미생물을 한번에 검출할 수 있는 다층 분석을 특정한 대상체에 대해 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 다수 미생물의 동시 검출은 하나 이상의 미생물 종을 식별할 수 있는 프로브의 세트를 사용하여 수행할 수 있다.
샘플의 다중복합 분석은 샘플의 대규모 검출을 가능하게 하여 분석 시간 및 비용을 절감한다. 그러나, 다중복합 분석은 종종 생물학적 샘플의 이용가능성에 의해 제한된다. 그러나 본 발명에 따라서, 다중복합 분석의 대안은 다수 이펙터 단백질을 단일 샘플에 첨가할 수 있고 각각의 차폐성 구성체는 개별 소광제 염료와 조합할 수 있도록 수행될 수 있다. 이러한 경우, 양성 신호는 단일 샘플 중 복합 검출을 위해 개별적으로 각각의 소광제 염료로부터 수득될 수 있다.
본 명세서는 샘플 중 하나 이상의 유기체의 둘 이상의 종을 구별하기 위한 방법을 개시한다. 방법은 또한 샘플 중 하나 이상의 유기체의 하나 이상의 종을 검출할 수 있게 한다.
일부 구현예에서, 방법은 바람직하게 병원체 또는 세포에서 항생제 또는 약물 내성 또는 감수성 유전자 또는 전사물 도는 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 특징으로 하는 질환 상태의 검출을 위해 제공된다.
검출 어세이용 장치
일 구현예에서, 검출 어세이?z 카트리지 또는 칩에 제공될 수 있다. 일 양태에서, 카트리지는 통신적으로 커플링되어서, 카트리지의 챔버를 통해 비드의 사용과 함께 또는 없이 시약 및 샘플의 수송, 교환 또는 이동을 허용하고, 카트리지 상에서 검출 어세이를 촉진하도록 시스템/장치를 이용하는 검출 어세이를 촉진하는 하나 이상의 앰풀 및 하나 이상의 웰을 포함할 수 있다.
카트리지
본 발명에 따른, 본 명세서에 칩이라고도 하는, 카트리지는 카트리지 상의 하나 이상의 다른 성분과 통신적으로 커플링되는 앰풀 및 챔버의 일련의 성분을 포함한다. 커플링은 전형적으로, 예를 들어 채널을 통한 유체 통신이다. 카트리지는 하나 이상의 챔버 및/또는 앰풀을 밀봉하는 막을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 막은 카트리지를 덮고 밀봉하는 시약, 완충액 및 다른 고형 또는 유체 성분의 저장을 허용한다. 막은 시약 방출을 위한 수단을 통해 카트리지의 하나 이상의 성분을 밀봉 또는 덮개로부터 달리 방출되거나, 구멍내거나 또는 뚫어지도록 구성될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 일정 구현예는 표적 핵산을 농축하기 위해 핵산 결합 비드의 사용을 가능하게 하지만, 단리된 핵산의 용출을 요구하지 않는다. 따라서, 일정 예의 구현예에서, 카트리지는 활성화가능한 자석, 예컨대 전자석을 더 포함할 수 있다. 자석을 활성화시키는 수단은 장치 상에 위치될 수 있거나, 또는 자석을 공급하거나 또는 카트리지 상의 자석을 활성화시키기 위한 수단이 예컨대 하기에 추가로 상세히 개시되는 바와 같은, 제2 장치에 의해 제공될 수 있다.
앰풀
블리스터라고도 하는 앰풀은 카트리지 전체에 시약의 저장 및 방출을 허용한다. 앰풀은 한 앰풀에 액체 또는 고체 시약, 예를 들어 용해 시약, 및 다른 앰풀에 반응 시약을 포함한다. 시약은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같을 수 있고, 카트리지에서 사용을 위해 적합화될 수 있다. 앰풀은 앰풀의 내용물을 파열, 천공, 또는 기타 방출하게 허용하는 필름에 의해 밀봉될 수 있다. 예를 들어, Becker, H. & Gartner, C. Microfluidics-enabled diagnostic systems: markets, challenges, and examples. In Microchip Diagnostics: Methods and Protocols (eds Taly, V. et al.) (Springer, New York, 2017); Czurratis et al., doi: 10.1088/0960-1317/25/4/045002. 앰풀에 대한 고려 사항은 예를 들어, 하기 문헌에 논의된 것들을 포함할 수 있다: Smith, S., et al., Blister pouches for effective 시약 storage on microfluidic chips for blood cell counting. Microfluid Nanofluid 20, 163 (2016). DOI:10.1007/s10404-016-1830-2. 일 양태에서, 밀봉부는 카트리지 본체에 조립된 복합층 필름으로 형성된 깨지기 쉬운 밀봉이다. 앰풀로서 본 명세서에서 지칭되지만, 앰풀은 방출 수단에 의해 개방되는 밀봉된 필름을 포함하는 칩 상의 공동을 포함할 수 있다.
챔버
칩 상에 챔버가 위치될 수 있고 앰풀 및/또는 칩 상의 다른 챔버와 채널 또는 다른 통신 수단을 통해 유체 통신하도록 크기가 정해진다.
어세이 결과의 판독 수단
어세이 결과의 판독을 위한 수단이 시스템에 제공된다. 어세이 결과를 판독하기 위한 수단은 어세이에 의해 발셩되는 검출가능한 신호 유형에 부분적으로 의존하게 된다. 특정 구현예에서, 어세이는 검출가능한 형광 또는 색상 판독치를 생성시킨다. 이들 예에서, 어세이의 결과에 대한 수단은 광학 수단, 예를 들어 단일 채널 또는 다수-채널 광학 수단 예컨대 형광계, 비색계 또는 다른 분광 센서일 수 있다.
어세이 결과 판독을 위한 수단의 조합을 이용할 수 있고, 산란, 편광 효과 등을 포함하여, 탁도, 온도, 무선, 또는 전기적 특성 및 광학 특성같은 판독을 포함할 수 있다.
시스템은 어세이 결과의 판독 및/또는 장치의 프로그래밍을 위한 사용자 인터페이스를 더 포함할 수 있다. 사용자 인터페이서는 LED 스크린을 포함할 수 있다. 시스템은 4개 이상의 장치의 도킹을 허용할 수 있는 USB 포트에 대해 더 구성될 수 있다.
일 양태에서, 시스템은 카트리지 상에 또는 그 안에 배치되는 자성의 활성화를 위한 수단을 포함한다.
측류 장치
일 구현예에서, 검출 어세이는 측류 장치에 제공될 수 있고, 예시적인 측류 장치에 대한 참조로 본 명세서에 편입되는, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개번호 WO 2019/071051을 참조한다. 측류 장치는 하나 이상의 코로나바이러스 및/또는 코로나바이러스와 조합된 다른 바이러스를 검출하도록 적합화될 수 있다. 측류 장치는 가요성 기재, 예컨대 종이 기재 또는 가요성 중합체-기반 기재를 포함할 수 있고, 이것은 어세이 결과의 육간 판독으로 검출 어세이를 위한 냉동-건조 시약을 포함할 수 있다. WO 2019/071051의 [0145]-[0151] 및 실시예 2를 참조하고, 특히 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 일 양태에서, 동결건조된 시약, 예를 들어, 트레할로스, 히스티딘 및/또는 글리신은, 반응 속도, 특이성, 또는 다른 변수를 보조하는 바람직한 부형제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 코로나바이러스 어세이는 등온 증폭 시약과 이용될 수 있어서, 현장에서 입수불가능할 수 있는 복합 장비없이 증폭을 허용한다. 따라서, 어세이는 측류 장치 상에서 육안 판독을 포함한, 현장 진단, 신속하고, 민감한 검출을 위해 적합화될 수 있고, 조기 및 직접 검출을 위해 배치될 수 있다. 비색 검출을 이용할 수 있고 특히 하기 문헌에 기술된 바와 같이, 현장 배치가능한 적용을 위해 적합할 수 있다: 국제 특허 출원 PCT/US2019/015726, 공개 번호 WO2019/148206. 특히, 비색 검출은 WO2019/148206의 도 102, 105, 107-111 및 [00306]-[00324]에 기술된 바와 같고, 참조로 본 명세서에 편입되며, TnpB 시스템과 이용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 제1 단부 및 제2 단부을 포함하는 기재를 포함하는 측류 장치를 제공한다. 제1 단부는 샘플 로딩 부분, 샘플 로딩 부분, 검출가능한 리간드, 둘 이상의 TnpB 시스템, 둘 이상의 검출 구성체, 및 하나 이상의 제1 포획 영역을 포함하는 제1 영역을 포함하고, 각각은 제1 결합제를 포함한다. 기재는 또한 제1 단부 및 제2 단부의 제1 영역 사이에 둘 이상의 제2 포획 영역을 포함할 수 있고, 각각의 제2 포획 영역은 상이한 결합제를 포함한다. 각각의 둘 이상의 TnpB 시스템은 TnpB 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분 분자를 포함할 수 있고, 각각의 핵산 성분 분자 서열은 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 구성된다.
장치는 TnpB 폴리펩티드 및 검출 구성체의 표적 분자 촉발된 부차적, 비-특이적 절단 간 반응을 검출하기 위한 측류 기재를 포함할 수 있다. 측류 어세이에 사용에 적합한 기재는 당분야에 공지되어 있다. 이들은 제한없이 셀룰로스 및/또는 유리 섬유, 폴리에스테르, 니트로셀룰로스로 만든 막 또는 패드 또는 흡착 패드를 포함할 수 있지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니고 (J Saudi Chem Soc 19(6):689-705; 2015), 다른 구현예가 본 명세서에서 추가로 기술된다. 검출 시스템, 즉 하나 이상의 TnpB 시스템 및 상응하는 리포터 구성체는 전형적으로 측류 기재의 한 단부 상에서, 측류 기재의 한정된 시약 부분에서 측류 기제에 첨가된다. 본 발명의 상황 내에서 리포팅 구성체는 DNA 또는 RNA 링커를 통해 연결된 제1 분자 및 제2 분자를 포함할 수 있다. 측류 기재는 샘플 부분을 더 포함한다. 샘플 부분은 시약 부분과 동등하거나, 그와 연속되거나, 또는 인접할 수 있다. 일 양태에서, 측류 기재는 추가 장치 내에 함유될 수 있다. 일 야태에서, 측류 기재는 1-포트 반응에서 검출가능한 신호의 육간 판독을 위해 이용될 수 있고, 예를 들어 추출, 증폭 및 검출 단계가 개별 이산 부피에서 수행된다.
측류 기재
일정 예의 구현예에서, 측류 장치는 검출을 수행하려는 측류 기재를 포함한다. 측류 어세이에 사용에 적합한 기재는 당분야에 공지되어 있다. 이들은 제한없이 셀룰로스 및/또는 유리 섬유, 폴리에스테르, 니트로셀룰로스로 만든 막 또는 패드, 또는 흡착 패드이지만, 반드시 이에 제한되지 않는다 (J Saudi Chem Soc 19(6):689-705; 2015).
측류 지지 기재는 제1 및 제2 단부, 및 각각 결합제를 포함하는 하나 이상의 포획 영역을 포함한다. 제1 단부는 샘플 로딩 부분, 검출가능한 리간드, 둘 이상의 TnpB 시스템, 둘 이상의 검출 구성체, 및 하나 이상의 제1 포획 영역을 포함하는 제1 영역을 포함할 수 있고, 각각은 제1 결합제를 포함한다. 기재는 또한 제1 단부 및 제2 단부의 제1 영역 사이에 둘 이상의 제2 포획 영역을 포함할 수 있고, 각각의 제2 포획 영역은 상이한 결합제를 포함한다. 각각의 둘 이상의 TnpB 시스템은 TnpB 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분 분자를 포함할 수 있고, 각각의 핵산 성분은 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 구성된다. 측류 기재는 반응을 검출하도록 구성될 수 있고, 부차적, 비특이적 절단은 TnpB 단백질에 의해 반응 중에서 표적 분자의 결합 및 절단 시에 촉발된다.
측면 지지 기재는 하우징 내에 위치될 수 있다 (참조: 예를 들어, "Rapid Lateral Flow Test Strips" Merck Millipore 2013). 하우징은 샘플 로딩을 위한 적어도 하나의 개구부 및 제1 및 제2 포획 영역에서 발생되는 검출가능한 신호의 판독을 허용하는 제2 단일 개구부 또는 별개 개구부를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 구현예는 편리한 분배 및 관리 시점 (POC) 적용을 위해 동결-건조된 형태로 제조될 수 있다. 이러한 구현예는 예를 들어, 바이러스 검출, 박테리아 균주 타이핑, 민감성 유전형분석 및 질환-연관 세포 무함유 DNA의 검출을 포함하는 인간 건강의 다중 시나리오에 유용하다. 따라서, 검출가능한 리간드, TnpB 시스템, 검출 구성체, 및 결합제를 포함하는, 시스템의 구성요소 중 하나 이상을 포함하는 측류 기재는 측류 기재로 냉동-건조될 수 있고, 즉시 사용 장치로서 포장될 수 있다. 대안적으로, 시스템의 구성요소의 일부 또는 전부는 장치 사용 시점에 측류 기재의 시약 일부에 첨가될 수 있다.
기재의 제1 단부 및 제2 단부
측류 장치의 기재는 제1 및 제2 단부를 포함한다. TnpB 시스템, 즉 하나 이상의 TnpB 시스템 및 상응하는 리포터 구성체는 전형적으로 측류 기재의 제1 단부 상에서, 측류 기재의 정해진 시약 부분에서 측류 기재에 첨가된다. 본 발명의 상황 내에서 사용되는 리포팅 구성체는 DNA 또는 RNA 링커에 의해 연결되는 제1 분자 및 제2 분자를 포함한다. 측류 기재는 샘플 부분을 더 포함한다. 샘플 부분은 시약 부분과 동등하거나, 연속되거나, 또는 인접할 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 제1 단부는 제1 영역을 포함한다. 제1 영역은 검출가능한 리간드, 둘 이상의 TnpB 시스템, 둘 이상의 검출 구성체, 및 하나 이상의 제1 포획 영역을 포함하고, 각각은 제1 결합제를 포함한다.
포획 영역
측류 기재는 하나 이상의 포획 영역을 포함할 수 있다. 구현예예서, 측류 기재의 제1 단부는 기재의 제1 단부의 제1 영역과 기재의 제2 단부 사이에 둘 이상의 제2 포획 영역을 갖는, 하나 이상의 제1 포획 영역을 포함한다. 포획 영역은 포획 라인으로서, 전형적으로 장치를 가로지르는 수평 라인으로서 제공될 수 있지만, 다른 구성도 가능하다. 제1 포획 영역은 샘플 로딩 부분과 동일한 측류 기재 단부에 근접하여 그에 존재한다.
결합제
특이적 결합-통합 분자는 본 발명에서 사용될 수 있는 결합 쌍의 임의의 구성원을 포함한다. 이러한 결합 쌍은 당업자에게 공지되어 있으며, 항체-항원 쌍, 효소-기질 쌍, 수용체-리간드 쌍 및 스트렙타비딘-바이오틴을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 공지된 결합 쌍 외에, 신규한 결합 쌍이 구체적으로 설계될 수 있다. 결합 쌍의 특징은 결합 쌍의 두 구성원 사이의 결합이다.
리포터 구성체의 제 1 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 결합제는 제 1 포획 영역에 고정되거나 다르게는 부동화된다. 제 2 포획 영역은 제 1 결합 영역으로부터 측류 기재의 반대 단부를 향해 위치한다. 제 2 결합제는 제 2 포획 영역에 고정되거나 다르게는 부동화된다. 제 2 결합제는 리포터 구성체의 제 2 분자에 특이적으로 결합하거나, 또는 제 2 결합제는 검출가능한 리간드에 결합할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 링커가 입자, 예컨대 콜로이드 입자일 수 있고, 응집될 때 육안으로 검출할 수 있고 검출가능 양성 신호를 발생시킨다. 입자는 리포터 구성체 상의 제 2 분자에 특이적으로 결합하는 항체로 변형될 수 있다. 리포터 구성체가 절단되지 않으면, 이는 제 1 결합 영역에서 검출가능한 리간드의 축적을 촉진할 것이다. 리포터 구성체가 절단되면, 검출가능한 리간드가 방출되어 제 2 결합 영역으로 흐른다. 이러한 구현예에서, 제2 결합 영역은 검출가능한 리간드의 항체 상에서 검출가능한 리간드에 비특이적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있는 제2 결합제를 포함한다. 결합제는 예를 들어, 특정 태그를 인식하는 항체일 수 있다. 이러한 결합제는 예를 들어, 검출가능한 표지, 예컨대 동위원소 표지 및/또는 핵산 바코드를 더 함유할 수 있다. 바코드는 식별자로서 사용되는 뉴클레오티드의 짧은 서열 (예를 들어, DNA, RNA, 또는 이의 조합)이다. 핵산 바코드는 4-100 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있고, 단일 또는 이중-가닥이다. 바코드를 사용해 세포를 식별하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 TnpB 시스템의 핵산 성분 분자가 바코드를 검출하는데 사용될 수 있다.
검출가능한 리간드
제 1 영역에는 본 명세서에 개시된 것과 같은 검출가능한 리간드, 예를 들어 금 나노입자가 로딩된다. 검출가능한 리간드는 콜로이드 입자와 같은 입자일 수 있고, 이것이 응집될 때 시각적으로 검출될 수 있다. 입자는 리포터 구성체 상의 제 2 분자에 특이적으로 결합하는 항체로 변형될 수 있다. 리포터 구성체가 절단되지 않으면, 이는 제 1 결합 영역에서 검출가능한 리간드의 축적을 촉진할 것이다. 리포터 구성체가 절단되면, 검출가능한 리간드가 방출되어 제 2 결합 영역으로 흐른다. 이러한 구현예에서, 제 2 결합제는 검출가능한 리간드 상의 항체 상의 검출가능한 리간드에 특이적으로 또는 비특이적으로 결합할 수 있는 작용제이다. 이러한 구현예에 적합한 결합제의 예는 단백질 A 및 단백질 G를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 검출가능한 리간드는 제1 항체, 예컨대 항-FITC 항체로 변형될 수 있는, 금 나노입자이다.
측류 검출 구성체
제 1 영역은 또한 검출 구성체를 포함한다. 일례의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 RNA 검출 구성체 및 TnpB 시스템 (하나 이상의 표적 서열에 결합하도록 구성된 TnpB 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분 분자). 일례의 구현예에서, 추가 예시 목적을 위해서, RNA 구성체는 검출 구성체의 제 1 말단부 상에 FAM 분자 및 검출 구성체의 제 2 말단부 상에 바이오틴을 포함할 수 있다. 측류 기재의 제1 단부로부터 용액 흐름 상류는 제1 시험 밴드이다. 시험 밴드는 바이오틴 리간드를 포함할 수 있다. 따라서, RNA 검출 구성체가 그것의 개시 상태, 즉 표적의 부재 시에 존재하는 경우, 제 1 말단부 상의 FAM 분자는 금 나노입자 상의 항-FITC 항체에 결합할 것이고, RNA 구성체의 제 2 말단부 상의 바이오틴은 바이오틴 리간드에 결합하여 검출가능한 리간드가 제 1 시험에서 축적되어 검출가능한 신호를 생성할 것이다. 제 1 밴드에서 검출가능한 신호의 생성은 표적 리간드의 부재를 나타낸다. 표적의 존재 하에서, TnpB 복합체가 형성되고 TnpB 단백질은 활성화되어서 검출 구성체의 절단을 일으킨다. 온전한 RNA 검출 구성체 부재 하에서, 콜로이드 금은 제2 스트림을 지나 흐르게 된다. 측류 장치는 제1 밴드 상류에, 제2 밴드를 포함할 수 있다. 제2 밴드는 항체-표지된 콜로이드 금 분자에 결합할 수 있는 분자, 예를 들어, 콜로이드 금 상에 토끼 항-FITC 항체에 결합할 수 있는 항-토끼 항체를 포함할 수 있다. 그러므로, 하나 이상의 표적 존재 하에서, 검출가능한 리간드는 제2 밴드에 축적되고, 샘플 중 하나 이상의 표적의 존재를 의미한다.
일 구현예에서, 측류 장치의 제1 단부는 2개 검출 구성체를 포함하고, 각각의 2개 검출 구성체는 제1 단부 상에 제1 분자 및 제2 단부 상에 제2 분자를 포함하는, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 제1 분자 및 제2 분자는 RNA 또는 DNA 링커에 의해 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 제1 검출 구성체의 제1 단부 상의 제1 분자는 FAM일 수 있고, 제1 검출 구성체의 제2 단부 상의 제2 분자는 바이오틴일 수 있고, 그 반대도 가능하다. 일 구현예에서, 제2 검출 구성체의 제1 단부 상의 제1 분자는 FAM일 수 있고, 제2 검출 구성체의 제2 단부 상의 제2 분자는 디옥시게닌 (DIG)일 수 있고, 그 반대도 마찬가지이다.
일 구현예에서, 제1 단부는 3개 검출 구성체를 포함할 수 있는데, 각각의 3개 검출 구성체는 제1 단부 상에 제1 분자 및 제2 단부 상에 제2 분자를 포함하는, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 검출 구성체 상의 제1 및 제2 분자는 각각 Tye 665 및 Alexa 488; Tye 665 및 FAM, 및 Tye 665 및 디옥시게닌 (DIG)을 포함한다.
일 구현예에서, 측류 장치의 제1 단부는 TnpB 시스템이라고도 하는 둘 이상의 TnpB 시스템을 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 TnpB 시스템은 하나 이상의 표적 서열에 결합하도록 구성되는 하나 이상의 핵산 성분 분자 및 TnpB 단백질을 포함한다.
샘플
측류 기재가 구비된 검출 시스템을 이용할 때, 스크리닝 하려는 샘플은 측류 기재의 샘플 로딩 부분에 로딩된다. 샘플은 액체 샘필 또는 적절한 용매에 용해되거나, 또는 수성인 샘플이어야 한다. 액체 샘플은 검출 시약을 재구성하여서 검출 반응이 일어날 수 있다. 액체 샘플은 제1 및 제2 포획 영역을 향해서 기질의 샘플 부분으로부터 흐르기 시작한다.
본 발명에서 사용을 위한 샘플은 생물학적 또는 환경적 샘플, 예컨대 표면 샘플, 유체 샘플, 또는 식품 샘플 (신선한 과일 또는 채소, 육류)일 수 있다. 식품 샘플은 음료 샘플, 종이 표면, 패브릭 샘플, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 대기 공기 또는 다른 가스 샘플에 노출, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 금속, 목재, 플라스틱, 고무 등을 비제한적으로 포함하는 임의의 재료로 만들어진 가정용/상업적/산업적 표면을 면봉으로 닦아서 오염을 시험할 수 있다. 토양 샘플은 환경적 목적 및/또는 인간, 동물 또는 식물 질환 검사를 위해, 병원성 박테리아 또는 기생충, 또는 다른 미생물의 존재에 대해 시험될 수 있다. 물 샘플 예컨대 담수 샘플, 폐수 샘플, 또는 염수 샘플은 예를 들어, 크립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 또는 다른 미생물 오염의 존재를 검출하기 위해, 청정도 및 안정성, 및/또는 휴대성에 대해 평가될 수 있다. 추가 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 객담, 점액질, 림프, 활액, 뇌척수액, 복수, 흉수, 혈청종, 고름, 담즙, 안방수 또는 유리액, 누출액, 삼출액, 피부 또는 점막 표면의 면봉을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 환경적 샘플 또는 생물학적 샘플은 미가공 샘플일 수 있고/있거나 하나 이상의 표적 분자는 방법의 적용 이전에 샘플로부터 정제되지 않을 수 있거나 증폭되지 않을 수 있다. 미생물의 식별은 임의의 많은 적용분야에서 유용하고/하거나 필요할 수 있고, 따라서 당업자가 적절하다고 여기는 임의 출처 유래의 임의 유형의 샘플이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 방법 및 시스템은 환자 샘플로부터 직접 검출에 이용될 수 있다. 일 양태에서, 방법 및 시스템은 현장-배치가능성을 더 촉진하도록 육한 판독으로 환자 샘플로부터 직접 검출을 추가로 허용할 수 있다. 일 양태에서, 현장 배치가능한 형태는 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 측류 장치 및 시스템 및/또는 비색 검출을 포함할 수 있다. 방법 및 시스템은 다수의 바이러스 종 및 균주를 구별하고 우한에서 코로나바이러스 발발 (2019-nCoV)과 같은 바이러스 대유행에 중요한 임상적으로 관련된 돌연변이를 식별하는데 이용될 수 있다. 일 양태에서, 샘플은 비인두 면봉 또는 타액 샘플 유래이다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Wyllie et al., "Saliva is more sensitive for SARS-CoV-2 detection in COVID-19 patients than nasopharyngeal swabs," DOI: 10.1101/2020.04.16.20067835.
표적 핵산의 검출 및/또는 정량 방법
일 구현예에서, 본 발명은 샘플에서 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 샘플을 본 명세서에 기술된 바와 같은 측류 장치의 제1 단부와 접초깃키는 단계를 포함할 수 있다. 측류 장치의 제1 단부는 샘플 로딩 부분을 포함할 수 있고, 샘플은 제1 및 제2 포획 영역을 향해서 기재의 샘플 로딩 부분으로부터 흐르고 검출가능한 신호를 발생시킨다.
양성 검출가능 신호는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 광학, 형광, 화학발광, 전기화학 또는 당분야에 공지된 다른 검출 방법을 사용해 검출할 수 있는 임의 신호일 수 있다.
일 구현예에서, 측류 장치는 2개 상이한 표적 핵산 서열을 검출할 수 있다. 일 구현예에서, 2개 상이한 표적 핵산 서열의 이러한 검출은 동시에 일어날 수 있다.
일 구현예에서, 샘플 중 표적 핵산 서열의 부재는 각 포획 영역에서 검출가능한 형광 신호를 유발한다. 이러한 예에서, 샘플 중 임의의 표적 핵산 서열의 부재는 제1 및 제2 포획 영역에서 검출가능 신호가 나타나도록 야기할 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 측류 장치는 3개 상이한 표적 핵산 서열을 검출할 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 핵산 서열이 샘플에 부재할 때, 형광 신호는 3개 포획 영역 각각에서 발생될 수 있다. 이러한 예시적인 구현예에서, 형광 신호는 샘플이 하나 이상의 표적 핵산 서열을 함유할 때 상응하는 표적 핵산 서열에 대한 포획 영역에서 부재할 수 있다.
크리닝될 샘플은 측류 기재의 샘플 로딩 부분에 로딩된다. 샘플은 액체 샘플 또는 적절한 용매에 용해된, 일반적으로 수성인 샘플이어야 한다. 액체 샘플은 시스템 시약을 재구성하여서 검출 반응이 일어날 수 있다. 온전한 리포터 구성체는 제1 결합제 및 제1 분자 간에 결합에 의해 제1 포획 영역에서 결합된다. 유사하게, 검출제는 온전한 리포터 구성체 상의 제2 분자에 결합하여 제1 결합 영역에서 수집되기 시작한다. 표적 분자(들)가 샘플에 존재하면, TnpB 단백질 부차적 효과가 활성화된다. 활성화된 TnpB 단백질이 결합된 리포터 구성체와 접촉하게 되면, 리포터 구성체가 절단되어서, 제2 분자가 방출되어서 제2 결합 영역을 향해 측류 기재 아래로 더 흐르게 된다. 방출된 제2 분자는 제2 결합제에 결합하여 제2 포획 영역에서 포획되고, 추가 검출제는 또한 제2 분자에 결합하여 축적될 수 있다. 따라서, 표적 분자(들)가 샘플에 존재하지 않으면, 검출가능 신호는 제1 포획 영역에서 나타나게 되고, 표적 분자(들)가 샘플에 존재하면, 검출가능 신호는 제2 포획 영역의 위치에서 나타나게 된다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 둘 이상의 TnpB 시스템을 포함하는 하나 이상의 개별 이산 부피로 샘플 또는 샘플 세트를 분포시키는 단계를 포함하는 샘플에서 표적을 정량하는 방법을 제공한다. 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 샘플 또는 샘플 세트에서 하나 이상의 표적 분자를 증폭하도록 HDA를 사용하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 하나 이상의 표적 분자에 핵산 성분 분자의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 샘플 또는 샘플 세트를 인큐베이션시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 하나 이상의 표적 분자에 핵산 성분 분자의 결합을 통해서 TnpB 단백질을 활성화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. TnpB 단백질의 활성화로 검출 구성체의 변형이 일어나서 검출가능 양성 신호가 발생된다. 방법은 하나 이상의 검출가능 양성 신호를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 검출은 샘플 중 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미한다. 방법은 샘플 중 핵산을 정량하기 위해 대조군에 대해 하나 이상의 신호 강도를 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 증폭, 인큐베이션, 활성화, 및 검출 단계는 모두 동일한 개별 이산 부피에서 수행될 수 있다.
"개별 이산 부피"는 개별 부피 또는 개별 공간, 예컨대 본 명세서에 개시된 방법을 수행하는데 필요한 핵산 및 시약의 이동을 방지하고/하거나 억제하는 특성에 의해 한정될 수 있는 용기, 리셉타클, 또는 다른 한정된 부피 또는 공간으로서, 예를 들어 투과성 또는 반투과성일 수 있는, 물리적 성질 예컨대 벽, 예를 들어 웰의 벽, 튜브, 또는 액적 표면에 의해 한정되거나, 또는 화학, 확산속도 제한, 전자기, 또는 광 조사, 또는 이의 임의 조합과 같은 다른 수단에 의해 한정되는, 부피 또는 공간이다. "확산 속도 제한" (확산 한정 부피)이란 확산이 한 스트림에서 다른 스트림으로 표적 분자의 이동을 제한하게 되는 2개의 평행한 층류 스트림의 경우에서 처럼 확산 제한이 효과적으로 공간 또는 부피를 한정하기 때문에 일정한 분자 또는 반응에만 접근가능한 공간을 의미한다. "화학적" 한정된 부피 또는 공간이란 예를 들어 겔 비드가 예컨대 비드의 내부로 진입할 수 있는 종의 선택을 가능하게 할 수 있는 비드의 표면 전하, 매트릭스 크기 또는 다른 물리적 특성에 의해서, 다른 것들은 아니지만, 비드로의 진입에 일정한 종을 배제할 수 있는 경우에, 그들의 화학적 또는 분자적 특성, 예컨대 크기때문에, 오직 일정한 표적 분자가 존재할 수 있는 공간을 의미한다. "전자기적으로" 한정된 부피 또는 공간이란 표적 분자 또는 그들 지지체의 전자기 특성 예컨대 전하 또는 자성이 자기장 내에서 또는 직접적으로 자석 상에서 자성 입자를 포획하는 것과 같이, 공간에서 일정한 영역을 한정하는데 사용될 수 있는 공간을 의미한다. "광학적으로" 한정된 부피란 한정된 공간 또는 부피내 표적 분자만이 표지될 수 있도록 가시광, 자외선, 적외선, 또는 다른 파장의 광으로 조사하여 한정될 수 있는 임의의 공간 영역을 의미한다. 무벽, 또는 반투과성의 사용의 한가지 장점은 일부 시약, 예컨대 완충제, 화학적 활성인자, 또는 다른 작용제가 이산 부피를 통해서 통과할 수 있는 한편, 다른 재료, 예컨대 표적 분자는 이산 부피 또는 공간에 유지될 수 있다는 것이다. 무벽, 또는 반투과성 이산 부피의 사용의 한가지 장점은 일부 시약, 예컨대 완충제, 화학적 활성인자, 또는 다른 작용제가 이산 부피를 통해서 통과할 수 있는 한편, 다른 재료, 예컨대 표적 분자는 이산 부피 또는 공간에 유지될 수 있다는 것이다. 개시된 방법에서 유용한 예시적인 이산 부피 또는 공간은 특히 액적 (예를 들어, 미세유체 액적 및/또는 에멀션 액적), 히드로겔 비드 또는 다른 중합체 구조 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 비드 또는 아가로스 비드), 조직 슬라이드 (예를 들어, 화학적, 광학적, 또는 물리적 수단으로 한정된 특정한 영역, 부피 또는 공간을 갖는 고정 포르말린 파라핀 포매된 슬라이드), 정돈된 어레이 또는 무작위 패턴으로 시약을 배치하여 한정된 영역을 갖는 현미경 슬라이드, 튜브 (예컨대, 원심분리 튜브, 미세원심분리 튜브, 시험관, 큐벳, 코니칼 튜브 등), 병 (예컨대 유리병, 플라스틱병, 세라믹 병, 엘렌메이어 플라스크, 섬광 바이알 등), 웰 (예컨대 플레이트의 웰), 플레이트, 피펫, 또는 피펫 팁을 포함한다. 일정 예의 구현예에서, 개별 이산 부피는 마이크로플레이트의 웰이다. 일정 예의 구현예에서, 마이크로플레이트는 96웰, 384웰, 또는 1536웰 마이크로플레이트이다.
본 명세서에 기술된 바와 같이 증폭 단계 또는 추출 단계에서 샘플의 인큐베이션은 단분야에 공지된 열원을 사용해 수행될 수 있다. 유리하게, 열원은 복잡한 장비를 필요로 하지 않고 쉽게 상업적으로 입수가능한 열원일 수 있다. 예시적인 가열 시스템은 상업적으로 입수가능한 수비드 쿠커에 의해 온도가 유지되는 가열 블록, 인큐베이터, 및/또는 수조를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 샘플 진단이 진단 실험실 및 병원 환경에서 주로 사용되는 고가의 독점 장비없이도 수행될 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 종이 기반 미세유체를 사용해 샘플 또는 시약을 전달할 수 있다. 예를 들어, 종이 계량봉의 끝에서 정해진 거리에 인쇄된 왁스 장벽을 갖는 종이 스트립이 수송하려는 시약 또는 샘플의 부피를 한정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 왁스 장벽은 마이크로리터 부피를 한정하도록 종이 계량봉에 걸쳐서 인쇄되어서 계량봉이 시약 또는 샘플 부피로 전단될 때 오직 마이크로리터의 상기 시약 또는 샘플만이 계량봉에 흡수된다. 계량봉은 제2 시약 믹스에 위치될 수 있고, 여기서 시약 또는 샘플이 반응 혼합물로 확산된다. 이러한 성분은 피펫터같은 특수 장비없이 어세이의 제조 및 사용을 가능하게 한다.
광학 수단은 소정 표적 분자의 존재 및 수준을 평가하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 광학 센서는 형광 차폐제의 탈차폐를 검출한다. 일 구현예에서, 본 발명의 장치는 어세이의 진단 판독을 위한 소형 휴대용 장치를 포함할 수 있다 (참조: 예를 들어, Vashist et al., Commercial Smartphone-Based Devices and Smart Applications for Personalized Healthcare Monitoring and Management, Diagnostics 2014, 4(3), 104-128; mReader from Mobile Assay; and Holomic Rapid Diagnostic Test Reader).
본 명세서에 언급된 바와 같이, 일정 구현예는 구현예가 신호를 판독하기 위해 보다 복잡한 검출 장비로의 접근이 제한될 수 있는 자원 부족 환경 및/또는 POC 상황에서 이용될 때 일부 부수적인 이득을 갖는 비색성 변화를 통한 검출을 가능하게 한다. 그러나, 본 명세서에 개시된 휴대용 구현예는 또한 가시 범위 밖의 신호의 검출할 수 있게 하는 소형 분광광도계와 커플링될 수 있다. 본 발명과 조합하여 사용될 수 있는 휴대용 분광광도계 장치의 예는 하기 문헌에 기술되어 있다: Das et al. "Ultra-portable, wireless smartphone spectrophotometer for rapid, non-destructive testing of fruit ripeness." Nature Scientific Reports. 2016, 6:32504, DOI: 10.1038/srep32504. 마지막으로, 퀀텀 도트-기반 차폐성 구성체를 이용하는 일 구현예에서, 소형 UV 광, 또는 다른 적합한 장치는 퀀텀 도트에 의해 제공되는 거의 완전한 퀀텀 수율 덕분에 신호를 검출하는데 성공적으로 사용될 수 있다.
표적 분자의 증폭
하나 이상의 표적 분자의 증폭 단계는 당분야에 공지된 증폭 시스템을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 증폭은 등온이다. 일정 예의 구현예에서, 표적 RNA 및/또는 DNA는 TnpB 단백질의 활성화 전에 증폭될 수 있다. 임의의 적합한 RNA 또는 DNA 증폭 기술이 사용될 수 있다. 일정 구현예예서, 증폭 단계는 약 1시간, 50분, 40분, 30분, 25분, 20분 또는 15분 미만이 걸리고, 샘플, 출발 농도 및 사용되는 증폭 성질에 의존하게 된다.
일 구현예에서, 표적 분자의 증폭 및 표적 분자의 검출은 단일 반응, 예를 들어, '1-포트' 방법으로 수행될 수 있다. 1-포트 접근법의 사용을 위한 일반 지침은 하기 문헌에 기술된 바와 같을 수 있다: Gootenberg, et al., Science 2018 Apr 27: 360(6387) 439-444 (using Cas13, Cas12a and Csm6 generally, detecting multiple targets in a single reaction, and specifically performing DNA extraction in a sample and using as input for direct detection at Figure S33); 및 Ding et al., "All-in-One Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) Assay: A Case for Rapid, Ultrasensitive and Visual Detection of Novel Coronavirus SARS-CoV-2 and HIV Virus," doi:10.1101/2020.03.19.998724, biorxiv preprint (utilizing a pair of crRNAs with dual CRISPR-Cas12a detection for a one-pot approach to target-specific nucleic acid detection).
일정 예의 구현예에서, RNA 또는 DNA 증폭은 등온 증폭이다. 일정 예의 구현예에서, 등온 증폭은 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 리콤비나제 폴리머라제 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 치환 증폭 (SDA), 헬리카제-의존적 증폭 (HDA), 또는 닉형성 효소 증폭 반응 (NEAR)일 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 비-등온 증폭 방법은 PCR, 다중 치환 증폭 (MDA), 롤링 써클 증폭 (RCA), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 또는 세분화 증폭 방법 (RAM)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 것들이 사용될 수 있다.
표적 분자의 증폭은 본 명세서에 상술되는 방법에 의해 최적화될 수 있다. 일 양태에서, 디자인은 증폭에서 사용되는 프라이머를 최적화한다. 특정 양태에서, 등온 증폭은 TnpB 시스템과 사용된다. 양쪽 접근법에서 디자인 고려사항은 반응의 최적화를 위한 합리적 디자인을 따를 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법의 최적화는 특정 표적, TnpB 단백질 및/또는 반응을 위해 잘 작용하는 하나 이상의 프라이머 세트를 확인하기 위한 제1 스크리닝 프라이머를 포함할 수 있다. 프라이머가 스크리닝되면, 마그네슘 농도의 적정을 수행하여 더 높은 신호 대 노이즈 판독을 위한 최적 마그네슘 농도를 확인할 수 있다. 일례에서, 반응 내에서 특이적 프라이머, 표적, TnpB 단백질, 온도, 및 다른 첨가제 농도에 따라 다양한 첨가제가 확인될 수 있다. 최적화는 반응에서 일어나야 하는 단계 및 완충액 교환 횟수를 감소시키고 반응을 단순화하고 전달 단계에서 오염 위험성을 감소시키려는 목적으로 만들 수 있다. 유리하게, 염 수준을 비롯하여 이용되는 염 유형의 최적화는 본 명세서에 개시된 1-포트 검출을 추가로 촉진하고 최적화할 수 있다.
루프-매개 등온 증폭
일정 예의 구현예에서, 루프-매개 등온 증폭 (LAMP) 반응은 LAMP 및 RT-LAMP 반응 둘 모두를 포괄하여, 핵산을 표저고하하는데 사용될 수 있다. LAMP는 폴리머라제와 함께 등온 핵산 증폭을 위한 4-프라이머 시스템으로 수행될 수 있다. Notomi et al., Nucleic Acids Res.. 2000, 28, 12, Nagamine et al., Molecular and Cellular Probes (2002) 16, 223-229, doi: 10.1006/mcpr.2002.0415. 4-프라이머 시스템과 LAMP를 수행할 때, FIP 및 BIP로 표시되는 2개 루프-형성 내부 프라이머는 2개 외부 프라이머, F3 및 B3과 제공될 수 있다. 내부 프라이머 각각은 2개 별개 서열을 함유하는데, 하나는 증폭의 제1 단계에서 프라이밍을 위한 것이고 나머지 서열은 후속 증폭 단계에서 자기-프라이밍을 위한 것이다. 2개 외부 프라이머는 FIP 및 BIP 프라이머로부터 개시되는 핵산 가닥의 가닥 치환을 개시하여서, 루프의 형성 및 제공된 폴리머라제를 이용하는 가닥 치환 핵산 합성을 일으킨다. LAMP는 2 내지 6개 프라이머로 수행될 수 있는데, 오직 2개 루프-형성 프라이머로부터 2개 외부 프라이머와 2개 외부 프라이머와 함께 최대 적어도 2개 추가 프라이머, LF 및 LB 첨가 범위일 수 있다. LAMP 기술은 유리하게 높은 특이성을 갖고 다양한 pH 및 온도에서 작동한다. 바람직한 양태에서, LAMP는 약 45℃와 75℃ 사이, 55℃와 70℃ 사이 또는 60℃와 65℃ 사이에서 등온 반응이다. 비색 LAMP (Y. Zhang et al., doi:10.1101/2020.92.26.20028373), RT-LAMP (Lamb et al., doi: 10.1101/2020.02.19.20025155; 및 Yang et al., doi:10.1101/2020.03.02.20030130)가 COVID-19 검출을 위해 개발되었고, 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
일 구현예에서, LAMP 시약은 Bst 2.0 + RTx 또는 Bst 3.0 (New England Biolabs)를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, LAMP 시약은 비색 또는 형광 검출을 포함할 수 있다. LAMP 산물의 검출은 예컨대 하기와 같은 비색 도구를 사용해 수행될 수 있다: 히드록시 나프톨 블루 (참조: 예를 들어, Goto, M., et al., Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques, 2009. 46(3): p. 167-72.), 류코 트리페닐메탄 염료 (참조: 예를 들어, Miyamoto, S., et al., Method for colorimetric detection of double-stranded nucleic acid using leuco triphenylmethane dyes. Anal Biochem, 2015. 473: p. 28-33) 및 pH-민감성 염료 (참조: 예를 들어, Tanner, N.A., Y. Zhang, and T.C. Evans, Jr., Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. Biotechniques, 2015. 58(2): p. 59-68)를 비롯하여; 형광 검출 (참조: 예를 들어, Yu et al., Clinical Chemistry, hvaa102, doi:10.1093/clinchem/hvaa102 12 May 2020), 소광 프로브 사용 포함 (참조: 예를 들어, Shirato et al., J Virol Methods. 2018 Aug;258:41-48. doi: 10.1016/j.jviromet.2018.05.006).
일 양태에서, LAMP용 프라이머 세트는 하나 이상의 표적 서열을 증폭하여, 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 앰플리콘을 생성하도록 디자인된다. 임의로, 프라이머는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 대로 디자인될 수 있는 바코드를 포함할 수 있다. 폴리머라제 및 임의로 역전사효소 (RT-LAMP 경우 사용)를 사용하여, LAMP 증폭에 충분한 온도, 예를 들어, 50℃-72℃, 보다 바람직하게 55℃ 내지 65℃에서 인큐베이션한다. 바람직하게 LAMP 반응에서 이용되는 효소는 열-안정성이다. LAMP 프라이머 부위를 디자인할 수 있고, 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Park et al., "Development of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays Targeting SARS-CoV-2" J. of Mol. Diag. (2020). 임의로, 대조군 주형은 표적 서열과 상이할 수 있지만 프라이머 결합 부위를 공유하는 샘플과 추가로 제공된다. 예시적인 구현예에서, 검출 결과의 육안 판독은 상업적으로 입수가능한 측류 기재, 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 종이 기재를 사용해 수행될 수 있다.
NASBA
일정 예의 구현예에서, RNA 또는 DNA 증폭은 RNA/DNA 듀플렉스를 형성하기 위해 서열-특이적 역방향 프라이머에 의한 표적 RNA의 역전사에 의해 개시되는, NASBA 이다. RNase H는 RNA 주형을 분해하는데 사용되어서, 프로모터, 예컨대 T7 프로모터를 함유하는 전방향 프라이머가 결합되어 상보성 가닥의 연장을 개시할 수 있고, 이중-가닥 DNA 생성물이 생성된다. DNA 주형의 RNA 폴리머라제 프로모터-매개 전사는 표적 RNA 서열의 카피를 생성시킨다. 중요한 것은 새로운 표적 RNA 각각이 핵산 성분 분자에 의해 검출될 수 있으므로, 어세이의 감도를 향상시킬 수 있다. 핵산 성분 분자에 의한 표적 RNA의 결합은 TnpB 단백질의 활성화를 야기하고 방법은 상기 요약된 대로 진행된다. NNASBA 반응은 예를 들어 대략 41℃ 의 중간 등온 조건 하에서 진행될 수 있다는 추가의 장점을 가져서, 임상 실험실로부터 멀리 떨어진 현장에서 조기 및 직접 검출을 위해 배치된 시스템 및 장치에 적합하다.
RPA
일정한 다른 예의 구현예에서, 리콤비나제 폴리머라제 증폭 (RPA) 반응은 표적 핵산을 증폭시키는데 사용될 수 있다. RPA 반응은 듀플렉스 DNA 의 상동성 서열과 서열-특이적 프라이머의 쌍을 형성할 수 있는 리콤비나제를 이용한다. 표적 DNA 가 존재하면, DNA 증폭이 개시되고 다른 샘플 조작 예컨대 열 사이클 또는 화학적 용융이 필요하지 않다. 전체 RPA 증폭 시스템은 건조된 제제로서 안정하고 냉동없이 안전하게 수송될 수 있다. RPA 반응은 또한 37-42℃ 의 최적 반응 온도로 등온 온도에서 실행될 수 있다. 서열 특이적 프라이머는 검출할 표적 핵산 서열을 포함하는 서열이 증폭되도록 디자인된다. 일정 예의 구현예에서, RNA 폴리머라제 프로모터, 예컨대 T7 프로모터는 프라이머 중 하나에 첨가된다. 그 결과로 표적 서열 및 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 증폭된 이중-가닥 DNA 생성물이 얻어진다. RPA 반응 이후, 또는 그 동안, RNA 폴리머라제가 첨가되어 이중-가닥 DNA 주형으로부터 RNA 를 생성시키게 될 것이다. 이어서, 증폭된 표적 RNA 가 그 다음으로 TnpB 시스템에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방식으로 표적 DNA는 본 명세서에 개시된 구현예를 사용하여 검출될 수 있다. RPA 반응은 또한 표적 RNA를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 표적 RNA는 먼저 역전사효소를 사용해 cDNA로 전환되고, 그 다음으로 제2 가닥 DNA 합성이 후속되며, 이 시점에 RPA 반응은 상기 약술된 대로 진행된다.
트랜스포사제 기반 증폭
본 명세서에 개시된 구현예는 표적 핵산 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 트랜스포존 복합체와 접촉시킴으로써 표적 핵산 서열의 등온 증폭을 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA, DNA, 또는 RNA/DNA 하이브리드 올리고뉴클레오티드일 수 있다. T트랜스포존 복합체는 트랜스포사제, 및 하나 이상의 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 트랜스포존 서열을 포함한다. 트랜스포사제는 하나 이상의 RNA 폴리머라제 프로모터의 올리고뉴클레오티드로의 삽입을 용이하게 한다. RNA 폴리머라제 프로모는 삽입된 하나 이상의 RNA 폴리머라제 프로모터로부터 표적 핵산 서열을 전사할 수 있다. 이 시스템의 한 가지 장점은 RNA 폴리머라제에 이중 가닥 주형이 필요하므로 이중 가닥 DNA 주형을 가열하거나 용융시킬 필요가 없다는 것이다. 이러한 등온 증폭은 빠르고 간단하여, 변성 및 냉각을 위한 복잡하고 값비싼 기기의 필요성을 제거한다. 일정 예의 구현예에서, NA 폴리머라제 프로모터는 변형된 T7 RNA 프로모터로부터의 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "트랜스포존"은 트랜스포사제 또는 인테그라아제 효소에 의해 인식되며, 전위될 수 있는 기능적 핵산-단백질 복합체 (즉, 트랜스포솜) 의 필수 성분인 핵산 절편을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "트랜스포사제"는 전위를 매개하며 전위 가능한 기능적 핵산-단백질 복합체의 성분인 효소를 지칭한다. 용어 "트랜스포사제" 는 또한 레트로트랜스포존으로부터의 또는 레트로바이러스 기원의 인테그라아제를 지칭한다. 트랜스포존 복합체는 트랜스포사제 효소와 "트랜스포존 말단" 으로 지칭되는 효소에 대한 특이적 결합 서열을 함유하는 이중 가닥 DNA 의 단편 사이에 형성된다. 트랜스포존 결합 위치의 서열은 트랜스포존 복합체가 표적 DNA로 효율적으로 전위될 수 있는 안정한 구조를 형성하는 능력에 영향을 주지 않고 특정 위치에서 다른 염기로 변형될 수 있다.
본 명세서에 제공되는 구현예에서, 트랜스포존 복합체는 트랜스포사제, 및 하나 이상의 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 트랜스포존 서열을 포함할 수 있다. 용어 "프로모터" 는 전사를 개시하기 위해 RNA 폴리머라제와 결합하는데 관여하는 DNA 부위를 지칭한다. 특정 구현예에서, RNA 폴리머라제 프로모터는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터일 수 있다. T7 RNA 프로모터는 트랜스포사제를 사용하여 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 삽입될 수 있다. 일 구현예에서, T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 올리고뉴클레오티드로의 삽입은 무작위일 수 있다.
전위의 빈도는 활성을 제한하기 위해 복잡한 메커니즘을 사용하는 대부분의 트랜스포존에 대해 매우 낮다. 예를 들어, Tn5 트랜스포사제는 차선인 DNA 결합 서열을 이용하며 트랜스포사제의 C-말단은 DNA 결합을 방해한다. Tn5 전위에 관련된 메커니즘은 Reznikoff 와 동료들에 의해 신중하게 분석되었다. Tn5 는 잘라내기-및-붙여넣기 메커니즘에 의해 전위한다. T트랜스포존은 트랜스포사제에 의해 활용되는 19 bp 요소의 2 개 쌍: 외부 요소 (OE) 와 내부 요소 (IE) 를 갖는다. 하나의 트랜스포사제 단량체는 활용되는 두 요소 각각에 결합한다. 단량체가 트랜스포존의 각 말단에 결합된 후, 두 단량체는 이량체화되어 시냅스를 형성한다. 적어도 200 bp 이지만 1000 bp 미만인 도너 골격을 갖는 벡터는 박테리아에서의 전위를 위해 가장 기능적이다. 트랜스포존 절단은 트랜스 촉매 작용에 의해 발생하며 각 DNA 말단에 결합된 단량체가 시냅스 복합체에 있을 때에만 발생한다. Tn5 는 완화된 표적 위치 선택으로 전위하며, 따라서 표적 서열 특이도가 거의 없거나 전혀 없이 표적 DNA 에 삽입할 수 있다.
Tn5 전위의 자연적인 하향 조절은 과활성 트랜스포사제의 선택 및 트랜스포사제-결합 요소의 최적화에 의해 극복될 수 있다 [Yorket al. 1998]. 야생형 OE 의 3 개 염기의 변형에 의해 만들어진 모자이크 요소 (ME) 는 박테리아 뿐만 아니라 무-세포 시스템에서 전이 이벤트를 50 배 증가시켰다. 최적화된 ME 와 과활성 돌연변이 트랜스포사제의 조합된 효과는 전위 활성을 100 배 증가시키는 것으로 추정된다. Goryshin 등은 미리 형성된 Tn5 전위 복합체가 전기천공법에 의해 박테리아 또는 효모에 기능적으로 도입될 수 있음을 보여주었다 [Goryshin et al. 2000]. DNA 의 선형화는 트랜스포존의 양쪽 말단에 정확히 위치하는 반전된 반복부를 갖기 위해 Goryshin 과 동료들이 전위의 절단 단계를 우회하여 전위 효율성을 향상시킬 수 있도록 하였다.
일 구현예에서, 트랜스포사제는 표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 태그먼트 (tagment) 하는데 사용될 수 있다. 용어 "태그먼트화"는 기술된 대로 ATAC-seq (Assay for Transposase Accessible Chromatin using sequencing)의 단계를 의미한다 (참조: Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J., Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenome profiling of open chromatin, DNA-binding proteoins and nucleosome position. Nature methods 2013; 10 (12): 1213-1218). 특히, 고처리량 DNA 시퀀싱을 위한 어댑터와 함께 시험관내에서 로딩된 과활성 Tn5 트랜스포사제는 시퀀싱 어댑터로 게놈을 동시에 단편화하고 태그화할 수 있다. 일 구현예에서 어댑터는 본 명세서에 기술된 방법과 양립가능하다.
일 구현예에서, 트랜스포사제는 Tn5 트랜스포사제일 수 있다. 일 구현예에서, 트랜스포사제는 Tn5 트랜스포사제의 변이체, 또는 조작된 트랜스포사제일 수 있다. 트랜스포사제는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 조작될 수 있다. 조작된 트랜스포사제는 30℃ 내지 45℃, 35℃ 내지 40℃ 범위의 온도, 또는 그 사이의 임의의 온도에서 기능하도록 최적화될 수 있다. 조작된 트랜스포사제는 야생형 트랜스포사제에 비해 더 빠른 속도로 올리고뉴클레오티드로부터 방출되도록 최적화될 수 있다.
일 구현예에서, 트랜스포사제는 Tn5 트랜스포사제, Mu 트랜스포사제, 또는 Tn7 트랜스포사제일 수 있다. 시험관내 전위 효율은 사용한 트랜스포존 시스템에 따라 가변적일 수 있다. 일반적으로, Tn5 및 Mu 트랜스포사제는 더 높은 수준의 전위 효율에 영향을 준다. 일 구현예에서, 삽입은 무작위적일 수 있다. 일 구현예에서, 삽입은 표적 서열의 GC 풍부 영역에서 일어날 수 있다.
일 구현예에서, 트랜스포존 서열은 2 개의 19 개 염기쌍 모자이크 말단 (ME) Tn5 트랜스포사제 인식 서열을 포함할 수 있다. Tn5 트랜스포사제는 일반적으로 이러한 짧은 19 개 염기쌍 ME Tn5 트랜스포사제 인식 서열 사이에 포함된 임의의 DNA 서열을 전위할 것이다.
일 구현예에서, 트랜스포사제의 사용은 가열 또는 용융의 부재 하에 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 분리를 허용한다. 접근법은 참조로 본 명세서에 편입되는 PCT/US2019/039195에 기술된 것에 적합화될 수 있다.
닉카제 의존적 증폭
본 발명의 일 구현예에서 닉카제-기반 증폭을 포함할 수 있다. 닉형성 효소는 TnpB 단백질일 수 있다. 따라서, dsDNA로 닉의 도입은 프로그램가능하고 서열-특이적일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 2개 가이드는 dsDNA 표적의 반대 가닥을 표적화하도록 디자인될 수 있다. 본 발명에 따라서, 닉카제는 TnpB일 수 있거나, 또는 임의의 CRISPR 단백질 예컨대 Cpf1, C2c1, Cas9, 또는 임의의 오솔로그 또는 DNA 듀플렉스의 단일 가닥을 절단하거나 또는 절단하도록 조작된 CRISPR 단백질을 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, TnpB는 닉카제 의존적 증폭에서 이용된다. 닉형성 가닥은 폴리머라제에 의해 연장될 수 있다. 일 구현예에서, 닉의 위치는 폴리머라제에 의한 가닥의 연장이 닉 부위 사에의 표적 듀플렉스 DNA의 중심 부위를 향하도록 선택된다. 일 구현예에서, 프라이머는 연장된 가닥과 혼성화할 수 있는 반응에 포함되고 이어서 프라이머의 추가 폴리머라제 연장으로 2개 dsDNA 조각: 제1 가닥 TnpB 가이드 부위 또는 제1 및 제2 가닥 둘 모두의 TnpB 가이드 부위를 포함하는 제1 dsDNA, 및 제2 가닥 TnpB 가이드 부위 또는 제1 및 제2 가닥 둘 모두의 TnpB 가이드 부위를 포함하는 제2 dsDNA를 재생시킬 수 있다. 이들 조각은 닉킹 부위 사이의 표적의 영역을 기하급수적으로 증폭시키는 순환 반응에서 계속 닉킹되고 연장된다. 대안적으로, TnpB 대신에 CRISPR-Cas 단백질이 닉카제-기반 증폭에 사용될 수 있고, 이러한 방법은 당분야에 공지되어 있다.
증폭은 등온성일 수 있고, 온도에 대해 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 증폭은 37℃ 에서 신속하게 진행된다. 다른 구현예에서, 등온 증폭의 온도는 상이한 온도에서 작동가능한 폴리머라제 (예를 들어, Bsu, Bst, Phi29, klenow 단편 등)를 선택하여 선택될 수 있다.
따라서, 닉킹 등온 증폭 기술은 (예를 들어, 닉킹 효소 증폭 반응 또는 NEAR에서) 고정된 서열 선호도를 갖는 닉킹 효소를 사용하여, 표적의 말단에 닉킹 기질을 첨가하는 프라이머의 어닐링 및 연장을 허용하기 위해 본래 dsDNA 표적의 변성을 필요로 하지만, 닉킹 부위가 RNA 분자를 통해 재프로그램가능한 닉카제의 사용은 변성 단계를 필요로 하지 않아서, 전체 반응이 진짜로 등온성이게 된다는 것을 의미한다. 이것은 또한 닉킹 기질을 첨가하는 이들 프라이머가 이후 반응에서 사용되는 프라이머와 상이하기 때문에 반응을 단순화시키며, 이것은 NEAR이 2개 프라이머 세트 (즉, 4개 프라이머)를 필요로 하지만 Cpf1 닉킹 증폭은 오직 하나의 프라이머 세트 (즉, 2개 프라이머)를 필요로 한다는 것을 의미한다. 이것은 변성 및 이후 등온 온도로 냉각을 수행하기 위해 복잡한 장비없이 작업하도록 닉킹 Cpf1 증폭을 훨씬 더 단순하고 쉽게 만든다.
일 양태에서, 등온 증폭 시약은 열안정성 TnpB 단백질과 이용될 수 있다. 열안정성 단백질 및 등온 증폭 시약의 조합은 검출 및 진단을 위해 반응 회소룰 추가로 개선시키는데 이용될 수 있다.
따라서, 일정 예의 구현예에서 본 명세서에 개시된 시스템은 증폭 시약을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 시스템은 증폭 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 증폭 시약은 완충제, 예컨대 Tris 완충제를 포함할 수 있다. Tris 완충제는 예를 들어, 제한 없이, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 1 M 등의 농도를 포함하여, 바람직한 적용 또는 용도에 적절한 임의 농도로 사용될 수 있다. 당업자는 완충제 예컨대 본 발명에서 사용을 위한 Tris의 적절한 농도를 결정할 수 있을 것이다.
염, 예컨대 마그네슘 클로라이드 (MgCl2), 포타슘 클로라이드 (KCl), 또는 소듐 클로라이드 (NaCl) 가 핵산 단편의 증폭을 개선시키기 위해서, 증폭 반응, 예컨대 PCR 에 포함될 수 있다. 염 농도가 특정한 반응 및 적용분야에 의존적일 것이지만, 일부 구현예에서, 특정한 크기의 핵산 단편은 특정한 염 농도에서 최적 결과를 초래할 수 있을 것이다. 바람직한 결과를 생성시키기 위해서, 더 큰 생성물은 변경된 염 농도, 전형적으로 더 낮은 염을 요구할 수 있는 한편, 더 작은 생성물의 증폭은 더 높은 염 농도에서 보다 양호한 결과를 생성시킬 수 있을 것이다. 당업자는 염 농도의 변경과 함께, 염의 존재 및/또는 농도가 생물학적 또는 화학적 반응의 엄격도를 변경시킬 수 있고, 그러므로 본 명세서에서 기재된 바와 같이 본 발명의 반응을 위해 적절한 조건을 제공하는 임의의 염을 사용할 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 일정 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 추출 비드 예컨대 자성 비드가 이용되는 경우에, 식물 QuickExtract 용액이 본 개시에 따른 최적화된 검출 방법에서 KCl 완충액과 조합하여 사용될 수 있다.
생물학적 또는 화학적 반응의 다른 성분은 세포 안의 물질의 분석을 위해 세포를 파쇄하거나 용해시키기 위해 세포 용해 성분을 포함할 수 있다. 세포 용해 성분은 세제, 상기 기재된 바와 같은 염, 예컨대 NaCl, KCl, 암모늄 술페이트 [(NH4)2SO4], 또는 다른 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 적절할 수 있는 세제는 Triton X-100, 소듐 도데실 술페이트 (SDS), CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트), 에틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올 (NP-40) 을 포함할 수 있다. 세제의 농도는 특정 적용분야에 의존적일 수 있고, 일부 경우에서 반응에 특이적일 수 있다. 증폭 반응은 예컨대 제한 없이, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 950 nM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM 등의 농도를 포함하여, 본 발명에 적절한 임의 농도로 사용되는 dNTP 및 핵산 프라이머를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 따라서 유용한 폴리머라제는 Taq 폴리머라제, Q5 폴리머라제 등을 포함하는, 당분야에 공지되어 있고 본 발명에서 유용한 임의의 특이적이거나 일반적인 폴리머라아제일 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 증폭 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용하기에 적절할 수 있다. 핫 스타트 증폭은 어댑터 분자 또는 올리고의 이량체화를 감소시키거나 제거시키기 위해, 또는 달리 원치않는 증폭 생성물 또는 인공물을 방지하고 바람직한 생성물의 최적 증폭을 수득하기 위해 일 구현예에서 유리할 수 있다. 증폭에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 많은 성분이 또한 핫-스타트 증폭에서 사용될 수 있다. 핫-스타트 증폭에서 사용하기에 적절한 시약 또는 성분은 적절하다면 조성물 성분 중 하나 이상 대신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제 또는 다른 시약은 특정한 온도 또는 다른 반응 조건에서 바람직한 활성을 나타내는 것이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용을 위해 디자인되거나 또는 최적화된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 폴리머라제는 전위 이후 또는 특정한 온도에 도달 이후에 활성화될 수 있다. 이러한 폴리머라제는 항체-기반 또는 압타머-기반일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리머라제는 당분야에 공지되어 있다. 이러한 시약의 예는 제한 없이, 핫-스타트 폴리머라제, 핫-스타트 dNTP, 및 광-케이징된 dNTP를 포함할 수 있다. 이러한 시약은 공지되어 있고 당분야에서 입수가능하다. 당업자는 개별 시약에 적절하게 최적 온도를 결정할 수 있을 것이다.
핵산의 증폭은 특별한 열 사이클 기계 또는 장비를 사용하여 수행될 수 있고, 단일 반응으로 또는 대량으로 수행될 수 있어, 임의의 바람직한 횟수의 반응이 동시에 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 증폭은 미세유체 또는 로봇식 장치를 사용해 수행될 수 있거나, 또는 바람직한 증폭을 달성하도록 온도의 수동 변경을 사용해 수행될 수도 있다. 일 구현예에서, 특정한 적용분야 또는 물질에 대한 최적 반응 조건을 수득하기 위해 최적화가 수행될 수 있다. 당업자는 충분한 증폭을 수득하도록 반응 조건을 이해하게 될 것이고 최적화시킬 수 있을 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법 또는 시스템에 의한 DNA 의 검출은 검출 전에 (증폭된) DNA 를 RNA 로 전사시키는 것을 필요로 한다.
본 발명의 검출 방법이 다양한 조합으로 핵산 증폭 및 검출 절차를 포함할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 검출하려는 핵산은 검출할 수 있는 중간 생성물을 제공하기 위한 임의의 적합한 방법에 의해 증폭될 수 있는, DNA 및 RNA 를 제한없이 포함하는, 임의의 천연 발생 또는 합성 핵산일 수 있다. 중간 생성물의 검출은 직접 또는 부차적 활성에 의해 검출가능한 신호 모이어티를 생성시키는 TnpB 단백질의 결합 및 활성화를 제한없이 포함하는, 임의의 적합한 방법에 의한 것일 수 있다.
헬리카제-의존적 증폭
헬리카제-의존적 증폭에서, 헬리카제 효소를 사용하여 이중 가닥 핵산을 풀어서, 프라이머 혼성화 및 후속적 프라이머-연장을 위한 주형을 생성한다. 이 과정은 표적 서열을 함유하는 센스 가닥 또는 역상보적 표적 서열을 함유하는 안티센스 가닥의 3'-말단에 각각 혼성화하는 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한다. HDA 반응은 헬리카제-의존적 핵산 증폭을 위한 일반적 방법이다.
TnpB 검출 시스템과 이 방법을 조합하여, 표적 핵산은 제1 및 제2 TnpB 복합체를 사용해 표적 핵산의 R-루프를 개방하여 증폭될 수 있다. 표적 핵산의 제 1 및 제 2 가닥은 헬리카제를 사용하여 풀릴 수 있으며, 이는 등온 조건 하에 프라이머 및 중합효소가 DNA 에 결합하여 그것을 연장시키는 것을 허용한다.
용어 "헬리카제" 는 본 명세서에서 이중 가닥 핵산을 효소적으로 풀 수 있는 임의의 효소를 지칭한다. 예를 들어, 헬리카제는 모든 유기체에서 및 핵산을 수반하는 모든 과정 예컨대 복제, 재조합, 복구, 전사 및 RNA 스플라이싱에서 발견되는 효소이다 (Kornberg and Baker, DNA Replication, W. H. Freeman and Company (2nd　ed. (1992)), especially chapter 11). DNA 또는 RNA 를 따라 5' 에서 3' 방향으로 또는 반대로 3' 에서 5' 방향으로 전위하는 임의의 헬리카제가 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다. 이는 원핵생물, 바이러스, 고세균류, 및 진핵생물 또는 재조합 형태의 자연적으로 존재하는 효소 뿐만 아니라 명시된 활성을 갖는 유사체 또는 유도체로부터 수득된 헬리카제를 포함한다. 천연 발생 DNA 헬리카제D의 예 (Kornberg and Baker가 [DNA Replication, W. H. Freeman and Company (2nd　ed. (1992))]의 그들 책 챕터 11에 기재함)는 이. 콜라이 헬리카제　I, II, III, & IV, Rep, DnaB, PriA, PcrA, T4 Gp41 헬리카제, T4 Dda　헬리카제, T7 Gp4 헬리카제, SV40 거대 T 항원, 효모 RAD를 포함한다. HDA에서 유용할 수 있는 추가 헬리카제는 RecQ　헬리카제　(Harmon and Kowalczykowski,　J. Biol. Chem. 276:232-243 (2001)), 티. 텡콘겐시스 (T. tengcongensis) 유래　(본 발명의 실시에 XII에 개시) 및 티. 써모필루스 (T. thermophilus)　 유래 (Collins and McCarthy,　Extremophiles.　7:35-41. (2003))의 열안정성 UvrD 헬리카제, 티. 아쿠아티쿠스 (T. aquaticus) 유래 열안정성 DnaB　헬리카제　　(Kaplan and Steitz,　J. Biol. Chem. 274:6889-6897 (1999)), 및 고세균 및 진핵생물 유기체 유래 MCM　헬리카제　((Grainge et al.,　Nucleic Acids Res. 31:4888-4898 (2003))를 포함한다.
헬리카제의 전통적 정의는 에너지원으로 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP) 가수분해 (예컨대 ATP) 를 사용하여 핵산 듀플렉스 (DNA, RNA 또는 하이브리드) 의 나선 구조를 단일-가닥 구성요소로의 분리/지퍼풀림/풀림 반응을 촉진하는 효소이다. 그러나, 모든 헬리카제가 더 이상 이 정의에 부합하는 것은 아니라는 점에 유의해야 한다. 더욱 일반적인 정의로 그것은 만난 듀플렉스화된 핵산을 풀 수 있거나 또는 풀 수 없는 단일-가닥 또는 이중 가닥 핵산을 따라 (통상적으로 특정 방향, 3' 에서 5' 방향 또는 5' 에서 3' 방향, 또는 둘 모두의 방향으로) 이동하는, 즉 전위하는, 운동 단백질이다. 또한, 일부 헬리카제는 명백한 전위효소 활성 없이 듀플렉스화된 핵산 구조에 단순히 결합하여 "융해" 시킨다.
헬리카제는 모든 살아 있는 유기체에 존재하고 모든 측면의 핵산 대사에서 기능한다. 헬리카제는 아미노산 서열, 방향성, 올리고머화 상태 및 핵산 유형 및 구조 선호도에 기초하여 분류된다. 가장 흔한 분류 방법은 모티프로 호칭되는, 특정 아미노산 서열의 존재에 기초하여 개발되었다. 이러한 분류에 따라서, 헬리카제는 다음의 6개 수퍼패밀리로 분류된다: SF1, SF2, SF3, SF4, SF5 및 SF6. SF1 및 SF2 헬리카제는 핵산 주변에서 고리 구조를 형성하지 않지만, SF3 내지 SF6은 형성한다. 수퍼패밀리 분류는 고전적인 분류에 의존적이지 않다.
DNA 헬리카제는 이중-가닥 DNA (dsDNA) 분자를 그 각각의 단일-가닥 핵산 (ssDNA) 형태로 푸는 것을 촉진하는 것을 책임진다. 구조적 및 생화학적 연구는 어떻게 다양한 헬리카제가 뉴클레오티드 당 하나의 ATP 를 소모하면서 ssDNA 상에서 방향성 있에 전위할 수 있는지를 밝혔지만, 핵산 풀림의 메카니즘 및 어떻게 풀림 활성이 조절되는지는 여전히 분명하지 않고 논란이 많다 (T. M. Lohman, E. J. Tomko, C. G. Wu, "Non-hexameric DNA helicases and translocases: mechanisms and regulation," Nat Rev Mol Cell Biol 9:391-401 (2008)). 헬리카제는 잠재적으로 만나는 모든 핵산을 풀 수 있으므로, 어떻게 그것의 풀림 활성이 조절되는지에 대한 이해는 생명공학 응용에서 헬리카제 기능의 활용을 초래할 수 있다.
용어 "HDA" 는 헬리카제 의존적 증폭을 지칭하며, 이는 이중 가닥 핵산을 풀기 위해 헬리카제 제제를 사용하여 프라이머 혼성화 및 후속적 프라이머-연장을 위한 주형을 생성함으로써 핵산을 증폭시키는 시험관내 방법이다. 이 과정은 표적 서열을 함유하는 센스 가닥 또는 역상보적 표적 서열을 함유하는 안티센스 가닥의 3'-말단에 각각 혼성화하는 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한다. HDA 반응은 헬리카제-의존성 핵산 증폭을 위한 일반적 방법이다.
본 발명은 당해 기술분야에 알려진 임의의 적합한 헬리카제의 사용을 포함한다. 이들은 UvrD 헬리카제, CRISPR-Cas3 헬리카제, 이. 콜라이 헬리카제 I, 이. 콜라이 헬리카제 II, 이. 콜라이 헬리카제 III, 이. 콜라이 헬리카제 IV, Rep 헬리카제, DnaB 헬리카제, PriA 헬리카제, PcrA 헬리카제, T4 Gp41 헬리카제, T4 Dd헬리카제, SV40 거대 T 항원, 효모 RAD 헬리카제, RecD 헬리카제, RecQ 헬리카제, 열안정성 티. 텡콘겐시스 UvrD 헬리카제, 열안정성 티. 써모필루스 UvrD 헬리카제, 열안정성 티. 아쿠이티쿠스 DnaB 헬리카제, Dd헬리카제, 파필로마 바이러스 E1 헬리카제, 고세균 MCM 헬리카제, 진핵생물 MCM 헬리카제, 및 T7 Gp4 헬리카제를 포함하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
특히 바람직한 구현예에서, 헬리카제는 수퍼 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 이. 콜라이 돌연변이가 기술되었지만, 돌연변이는 서열 정렬에 의해 생성되었고 (예를 들어, TteUvrd 경우 D409A/D410A) 그 결과로 본 명세서에 기 술된 증폭 방법 및 시스템에서 유리한 37℃ 같이 낮은 온도에서 작동하는 호열성 효소가 생성된다. 일 구현예에서, 수퍼 돌연변이는 서열 정렬을 기반으로 하는 위치에서, 아스파테이트의 알라닌으로의 돌연변이이다. 일 구현예에서, 수퍼 돌연변이체 헬리카제는 WP_003870487.1 써모아나에로박터 에타놀리쿠스 (Thermoanaerobacter ethanolicus) 403/404, WP_049660019.1 바실러스 (Bacillus) sp. FJAT-27231 407/408, WP_034654680.1 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 415/416, WP_095390358.1 바실러스 심플렉스 (Bacillus simplex) 407/408, 및 WP_055343022.1 파에니클로스트리듐 소르델리 (Paeniclostridium sordellii) 402/403으로부터 선택된다.
인큐베이션
본 명세서에 개시된 시스템을 사용하여 검출 및/또는 추출하는 방법은 하나 이상의 표적 분자에 대한 핵산 성분 분자의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 샘플 또는 샘플 세트를 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다. 추출은 22℃ 내지 60℃에서 30 내지 70분 동안 또는 90℃ -100℃에서 약 10분 동안 인큐베이션을 포함할 수 있는, 샘플에 존재하는 바이러스 RNA의 방출을 허용하기에 충분한 조건 하에서 샘플을 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 본 발명에서 증폭 및 검출의 인큐베이션 시간은 단축될 수 있다. 어세이는 효소 반응이 일어나는데 필요한 시간에 수행될 수 있다. 당업자는 5분 동안 생화학적 반응 (예를 들어, 5분 결찰)을 수행할 수 있다. 인큐베이션은 샘플, 시스템의 시약 및 성분에 의존하여 약 10분과 90분 사이, 바람직하게 90분, 75분, 60분, 45분, 30분, 25분, 20분, 15분, 또는 10분 미만의 시간 기간 동안 하나 이상의 온도에서 일어날 수 있다. 일 구현예에서, 증폭을 위한 인큐베이션은 약 20℃와 80℃ 사이의 하나 이상의 온도, 일 구현예에서, 약 37℃에서 수행된다. 일 구현예에서, 증폭을 위한 인큐베이션은 약 55℃와 65℃ 사이, 약 59℃와 61℃ 사이에 하나 이상의 온도, 일 구현예에서, 약 60℃에서 수행된다.
활성화
일정 예의 구현예에서, TnpB 단백질의 활성화는 하나 이상의 표적 분자에 대한 핵산 성분 분자를 통한 TnpB 복합체의 결합을 통해 일어나고, TnpB 단백질은 검출 구성체의 변형을 일으켜서 검출가능한 신호가 발생된다.
신호의 검출
검출은 대조군에 대한 양성 신호의 육안 관찰을 포함할 수 있다. 검출은 하나 이상의 포획 영역에서 신호의 손실 또는 신호의 존재, 예를 들어, 비색 검출, 또는 형광 검출을 포함할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 추가 변형은 검출가능 양성 신호를 추가로 증폭하도록 도입될 수 있다. 예를 들어, 활성화된 TnpB 단백질 부차적 활성화은 2차 표적 또는 추가 핵산 성분 분자 서열, 또는 둘 모두를 생성시키는데 사용될 수 있다. 일례의 구현예에서, 반응은 높은 농도에서 스파이크되는 2차 표적을 함유한다. 2차 표적은 1차 표적 (즉, 어세이가 검출하도록 디자인된 표적)과 구별되고, 일정 에예서 모든 반응 부피 전반에서 공통일 수 있다. 2차 표적을 위한 2차 핵산 성분 분자 서열은 RNA 루프와 헤어핀같은 2차 구조적 특성에 의해 보호될 수 있고, TnpB 단백질 또는 2차 표적에 결합할 수 없다. 활성화된 TnpB 단백질에 의한 보호기의 절단 (즉, 용액 중 1차 표적(들) 과의 복합체 형성에 의한 활성화 후) 및 용액 중 자유 TnpB 단백질과의 복합체 형성 및 2차 표적에서의 스파이크된 것으로부터의 활성화가 있다. 일정한 다른 예의 구현예에서, 유사한 개념이 2차 표적 및 보호된 2차 표적에 대한 유리 핵산 성분 분자 서열과 함께 사용된다. 2차 표적의 보호기의 절단은 추가 TnpB 단백질, 핵산 성분 서열, 2차 표적 서열이 형성되도록 허용한다. 또 다른 예의 구현예에서, 1차 표적(들)에 의한 TnpB 단백질의 활성화는 보호 또는 원형화 프라이머를 절단하는데 사용될 수 있어서, 이후에 2차 핵산 성분 서열, 2차 표적, 또는 둘 모두에 대한 주형 상에서, 본 명세서에 개시된 것과 같은, 등온 증폭 반응을 수행하도록 방출된다. 이러한 증폭된 주형의 후속 전사는 더 많은 2차 핵산 성분 분자 서열 및/또는 2차 표적 서열을 생산하고 이후, 추가적인 TnpB 단백질 부차적 활성화가 후속된다.
정량
특정 방법에서, 대조군에 대해 하나 이상의 신호 강도의 비교를 수행하여 샘플에서 핵산을 정량한다. 용어 "대조군"은 시험 샘플 중 발현 생성물과 비교를 제공하기에 적합한 임의의 기준 표준을 의미한다. 일 구현예에서, 대조군은 발현 생성물 수준을 검출하고 시험 샘플로부터의 발현 생성물 수준과 비교하여 "대조군 샘플"을 수득하는 것을 포함한다. 이러한 대조군 샘플은 제한없이, 기지 결과를 갖는 대조군 환자로부터의 샘플 (저장된 샘플이거나 또는 이전 샘플 측정일 수 있음); 대상체, 예컨대 정상 환자 또는 관심 병태를 갖는 환자로부터 단리된 정상 조직, 유체, 또는 세포를 포함하는 임의의 적합한 샘플을 포함할 수 있다.
신호 강도는 양을 평가하기 위해 적용되는 표준 오차에 비해서 더큰 양까지 정상 또는 대조군 수준에 비해서 각각 신호가 더 크거나 또는 더 작으면 정상 강도에 비해서 신호 강도는 "유의하게" 더 높거나 또는 더 낮고, 바람직하게 그 양에 비해서 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 350%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 이다. 대안적으로, 신호는 양이 적어도 약 2, 바람직하게 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 2배, 3배, 4배, 5배 이상, 또는 이 사이의 임의 범위, 예컨대 정상 및/또는 대조군 신호에 비해서 각각 5%-100% 더 높거나 또는 더 낮으면, 정상 및/또는 대조군 신호에 비해서 "유의하게" 더 높거나 또는 더 낮은 것으로 간주될 수 있다. 이러한 유의한 조정값은 본 명세서에서 임의의 미터법, 예컨대 변경된 발현 수준, 변경된 활성, 바이오마커 억제의 변화, 시험제 결합의 변화 등에 적용될 수 있다.
일 구현예에서, 검출가능 양성 신호는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 대조군에 비해서 형광 신호 또는 비색의 상실일 수 있다. 일 구현예에서, 검출가능 양성 신호는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 측류 장치에서 검출될 수 있다.
검출 방법의 적용
시스템 및 방법은 박테리아, 진균 및 바이러스 미생물을 포함한, 미생물의 검출 및 진단을 위해 디자인될 수 있다. 일 양태에서, 시스템은 코로나바이러스, 관련 코로나바이러스 또는 호흡기 바이러스일 수 있는 상이한 바이러스, 또는 이의 조합을 포함하여, 바이러스 감염의 다수의 변이체를 다중 검출하는 것을 포함할 수 있다. 구현예에서, 어세이는 본 명세서에 상술된 개시를 사용하여 급성 호흡기 감염을 포함한 다양한 바이러스 및 바이러스 감염에 대해 수행될 수 있다. 시스템은 코로나바이러스를 포함하여, 다수의 호흡기 감염 또는 바이러스 감염을 검출하기 위해, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같아, 다중화하기 위해 둘 이상의 TnpB 시스템을 포함할 수 있다. 코로나바이러스는 다양한 동물 및 인간을 감염시키는, 양성-센스 단일 가닥 RNA 패밀리이다. SARS-CoV는 코로나 바이러스 감염의 한 유형일 뿐만 아니라, 우한 시에서 검출된 2019-nCoV를 포함하여, 하나 이상의 코로나바이러스의 MERS-CoV 검출이 고려된다. 2019-nCoV의 서열은 GISAID 등록번호 EPI_ISL_402124 및 EPI_ISL_402127-402130로 입수가능하고, DOI: 10.1101/2020.01.22.914952에 기술된다. GISAID 플랫폼에 기탁된 SARS-CoV-2의 추가 기착물은 EP_ISL_402119-402121 및 EP_ISL 402123-402124를 포함하고, 또한 GenBank 등록 번호 MN908947.3을 참조한다.
표적 분자 검출은 TnpB 단백질을 이용하는 둘 이상의 검출 시스템을 포함할 수 있다. TnpB 단백질은 바람직하게 열안정성일 수 있고, 상이한 서열 특이성, 작동가능한 온도, 또는 절단 선호도를 갖는 상이한 TnpB 단백질을 사용할 수 있도록 다중 디자인된다.
다중 구현예는 다른 바이러스, 예를 들어, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 중동 호흡기 증후군 (MERS) 코로나바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군-관련 (SARS) 코로나바이러스, 및 인플루엔자와 조합하여, SARS-CoV-2를 포함하는, 코로나바이러스의 하나 이상의 변이체 또는 코로나바이러스의 하나 이상의 변이체를 추적하도록 디자인된다. 구현예에서, 어세이는 관련 코로나바이러스 또는 호흡기 바이러스, 또는 이의 조합일 수 있는, 상이한 바이러스, 코로나 바이러스의 다수의 변이체를 검출하도록 다중으로 수행될 수 있다. 일 양태에서, 각각의 어세이는 개별 이산 부피에서 일어날 수 있다. "개별 이산 부피"는 본 명세서에 개시된 방법을 수행하는데 필요한 핵산 및 시약의 이동을 방지 및/또는 억제하는 성질에 의해 한정될 수 있는 개별 부피 또는 개별 공간, 예컨대 용기, 리셉타클, 또는 다른 한정된 부피 또는 공간, 예를 들어, 물리적 성질 예컨대 벽, 예를 들어, 투과성 또는 반투과성일 수 있는, 웰, 튜브, 또는 액적 표면의 벽에 의해 한정되거나, 또는 다른 수단 예컨대 화학, 확산 속도 제한, 전자기, 또는 광 조사, 또는 이의 임의 조합에 의해 한정될 수 있는 부피 또는 공간이다. "확산 속도 제한" (확산 한정 부피)이란 확산이 한 스트림에서 다른 스트림으로 표적 분자의 이동을 제한하게 되는 2개의 평행한 층류 스트림의 경우에서 처럼 확산 제한이 효과적으로 공간 또는 부피를 한정하기 때문에 일정한 분자 또는 반응에만 접근가능한 공간을 의미한다. "화학적" 한정된 부피 또는 공간이란 예를 들어 겔 비드가 예컨대 비드의 내부로 진입할 수 있는 종의 선택을 가능하게 할 수 있는 비드의 표면 전하, 매트릭스 크기 또는 다른 물리적 특성에 의해서, 다른 것들은 아니지만, 비드로의 진입에 일정한 종을 배제할 수 있는 경우에, 그들의 화학적 또는 분자적 특성, 예컨대 크기때문에, 오직 일정한 표적 분자가 존재할 수 있는 공간을 의미한다. "전자기적으로" 한정된 부피 또는 공간이란 표적 분자 또는 그들 지지체의 전자기 특성 예컨대 전하 또는 자성이 자기장 내에서 또는 직접적으로 자석 상에서 자성 입자를 포획하는 것과 같이, 공간에서 일정한 영역을 한정하는데 사용될 수 있는 공간을 의미한다. "광학적으로" 한정된 부피란 한정된 공간 또는 부피내 표적 분자만이 표지될 수 있도록 가시광, 자외선, 적외선, 또는 다른 파장의 광으로 조사하여 한정될 수 있는 임의의 공간 영역을 의미한다. 무벽, 또는 반투과성의 사용의 한가지 장점은 일부 시약, 예컨대 완충제, 화학적 활성인자, 또는 다른 작용제가 이산 부피를 통해서 통과할 수 있는 한편, 다른 재료, 예컨대 표적 분자는 이산 부피 또는 공간에 유지될 수 있다는 것이다. 전형적으로, 이산 부피는 표지화를 가능하게 하는 조건 하에서 색인가능한 핵산 식별자로 표적 분자의 표지화에 적합한 유체 매질 (예를 들어, 수용액, 오일, 완충제, 및/또는 세포 성장을 지지할 수 있는 배지)을 포함할 수 있다. 개시된 방법에서 유용한 예시적인 이산 부피 또는 공간은 특히 액적 (예를 들어, 미세유체 액적 및/또는 에멀션 액적), 히드로겔 비드 또는 다른 중합체 구조 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 비드 또는 아가로스 비드), 조직 슬라이드 (예를 들어, 화학적, 광학적, 또는 물리적 수단으로 한정된 특정한 영역, 부피 또는 공간을 갖는 고정 포르말린 파라핀 포매된 슬라이드), 정돈된 어레이 또는 무작위 패턴으로 시약을 배치하여 한정된 영역을 갖는 현미경 슬라이드, 튜브 (예컨대, 원심분리 튜브, 미세원심분리 튜브, 시험관, 큐벳, 코니칼 튜브 등), 병 (예컨대 유리병, 플라스틱병, 세라믹 병, 엘렌메이어 플라스크, 섬광 바이알 등), 웰 (예컨대 플레이트의 웰), 플레이트, 피펫, 또는 피펫 팁을 포함한다. 일정 예의 구현예에서, 개별 이산 부피는 마이크로플레이트의 웰이다. 일정 예의 구현예에서, 마이크로플레이트는 96웰, 384웰, 또는 1536웰 마이크로플레이트이다.
일정 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 샘플, 예컨대 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중 하나 이상의 미생물원의 존재를 검출하는 것에 관한 것이다. 일정 예의 구현예에서, 미생물은 박테리아, 진균, 효모, 원충, 기생충, 또는 바이러스일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법은 미생물 종의 신속한 식별, 미생물 단백질 (항원), 항체, 항체 유전자의 존재의 모니터링, 일정 표현형 (예를 들어, 박테리아 내성) 의 검출, 질환 진행 및/또는 대발생의 모니터링, 및 항생제 스크리닝을 요구하는 다른 방법과 (또는 조합하여) 다른 방법에서 사용을 위해 적합화될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예의 신속하고 민감한 진단 능력, 단일 뉴클레오티드 편차에 이르는, 미생물 종 유형의 검출, 및 POC 장치로서 배치되는 능력으로 인해, 본 명세서에 개시된 구현예는 가이드 치료 계획, 예컨대 적절한 항생제 또는 항바이러스제의 선택에 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예는 또한 미생물 오염의 존재에 대해 환경적 샘플 (공기, 물, 표면, 식품 등) 을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
미생물 종, 예컨대 박테리아, 바이러스, 진균, 효모 또는 기생충 종 등을 식별하는 방법을 개시한다. 본 명세서에 개시된 특정 구현예는 단일 샘플 내에서, 또는 다수 샘플에 걸쳐 미생물 종을 식별하고 구별하여, 많은 상이한 미생물의 인식을 가능하게 하는 방법 및 시스템을 기재한다. 본 발명은 샘플 중 표적 핵산 서열의 존재를 검출하여, 생물학적 또는 환경적 샘플 중에서 하나 이상의 유기체, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 효모, 원충, 및 진균 또는 이의 조합 중 2종 이상을 구별하고, 병원체의 검출을 가능하게 한다. 샘플로부터 수득된 양성 신호는 미생물의 존재를 의미한다. 다수 미생물은 하나를 초과하는 이펙터 단백질의 사용을 적용하여, 본 발명의 방법 및 시스템을 사용해 동시에 식별될 수 있고, 여기서 각각의 이펙터 단백질은 특이적 미생물 표적 서열을 표적으로 한다. 이러한 방식으로, 임의수의 미생물을 한번에 검출할 수 있는 특정 대상체, 예를 들어, 미지의 호흡기 감염을 갖거나, 코로나 바이러스의 증상을 갖거나, 또는 코로나바이러스에 노출되었거나 또는 그러한 위험성이 있는 개체인 대상체에 대해서 다단계 분석을 수행할 수 있다. 일 구현예에서, 다수 미생물의 동시 검출이 하나 이상의 미생물 종을 식별할 수 있는 프로브 세트를 사용해 수행될 수 있다.
미생물 검출
일 구현예에서, 미생물을 검출하기 위한 방법이 제공되고, 방법은 하나 이상의 개별 이산 부피로 샘플 또는 샘플 세트를 분배하는 단계로서, 개별 이산 부피는 본 명세서에 기술된 바와 같은 TNPB 시스템을 포함하는 것인 단계; 하나 이상의 미생물-특이적 표적에 대해 하나 이상의 핵산 성분의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 샘플 또는 샘플 세트를 인큐베이션하는 단계; 하나 이상의 표적 분자에 대해 하나 이상의 핵산 성분 분자의 결합을 통해 TnpB 단백질을 활성화시키는 단계로서, TnpB 단백질의 활성화는 RNA-기반 차폐성 구성체의 변형을 일으켜서 검출가능 양성 신호가 발생되는 것인 단계; 및 검출가능한 양성 신호를 검출하는 단계로서, 검출가능 양성 신호의 검출이 샘플에서 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 단계를 포함한다. 하나 이상의 표적 분자는 둘 이상의 미생물 종/균주를 서로 구별하는데 사용될 수 있는 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA, gDNA (코딩 또는 비코딩), trRNA, 또는 rRNA 일 수 있다. 핵산 성분 분자는 표적 서열을 검출하도록 디자인될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예는 핵산 성분 분자와 표적 RNA 간에 혼성화를 개선시키는 일정 단계를 이용할 수 있다. 리보핵산 혼성화를 증강시키는 방법은 하기 문헌에 개시되고, 이를 참조로 본 명세서에 편입시킨다: WO 2015/085194, entitled "Enhanced Methods of Ribonucleic Acid Hybridization". 미생물-특이적 표적은 RNA 또는 DNA 또는 단백질일 수 있다. DNA 방법은 본 명세서에 기술된 RNA 폴리머라제 프로모터를 도입하는 DNA 프라이머의 사용을 더 포함할 수 있다. 표적이 단백질이면 방법은 본 명세서에 기술된 단백질 검출에 특이적인 단계 및 압타머를 이용할 것이다.
단일 뉴클레오티드 변이체의 검출
일 구현예에서, 하나 이상의 식별된 표적 서열은 본 명세서에 기술된 표적 서열에 특이적이고 그에 결합하는 핵산 성분 분자를 사용해 검출될 수 있다. 본 발명의 시스템 및 방법은 상이한 미생물 중 중에 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성 간에서도 구별될 수 있고, 따라서, 본 발명에 따른 다수의 핵산 성분 분자의 사용은 종 간 구별에 사용될 수 있는 표적 서열의 수를 더 확장시키거나 또는 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 일 구현에예서, 하나 이상의 핵산 성분 분자는 종, 속, 과, 목, 강, 문, 계, 또는 표현형, 또는 이의 조합으로 미생물을 구별할 수 있다
rRNA 서열 기반 검출
일정 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 장치, 시스템, 및 방법은 샘플 중 다수 미생물 종을 구별하는데 사용될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 식별은 16S, 23S, 및 5S 서브유닛을 포함하는, 리보솜 RNA 서열을 기반으로 할 수 있다. 관련 rRNA 서열을 식별하는 방법은 미국 특허 출원 공개 번호 2017/0029872에 개시된다. 일정 예의 구현예에서, 핵산 성분 분자 세트는 각 종 또는 균주에 고유한 가변 영역에 의해 각 종을 구별하도록 디자인될 수 있다. 핵산 성분 분자는 또한 속, 과, 목, 강, 문, 계 수준 또는 이들의 조합에서 미생물을 구별하는 표적 RNA 유전자를 디자인할 수 있다. 일정 예의 구현예에서 증폭이 사용되는 경우에, 증폭 프라이머의 세트는 리보솜 RNA 서열의 측접 불변 영역에 대해 디자인될 수 있고 핵산 성분 분자는 가변 내부 영역에 의해 각 종을 구별하도록 디자인된다. 일정 예의 구현예에서, 프라이머 및 핵산 성분 분자는 각각 16S 서브유닛 내 보존 및 가변 영역에 대해 디자인될 수 있다. 종 또는 종의 서브세트 전반에서 고유하게 가변적인 다른 유전자 또는 게놈 영역, 예컨대 RecA 유전자 패밀리, RNA 폴리머라제 β 서브유닛이 또한 사용될 수 있다. 다른 적합한 계통발생 마커, 및 이를 식별하는 방법은 예를 들어, 하기 문헌에서 논의된다: Wu et al. arXiv:1307.8690 [q-bio.GN].
일정 예의 구현예에서, 방법 또는 진단은 동시에 다수의 계통 및/또는 표현형 수준에 걸쳐 미생물을 스크리닝하도록 디자인된다. 예를 들어, 진단 방법은 상이한 핵산 성분 분자와 다수의 TnpB 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 핵산 성분 분자의 제1 세트는 예를 들어, 마이코박테리아, 그람 양성, 및 그람 음성 박테리아를 구별할 수 있다. 이들 일반 부류는 더욱 세분화될 수 있다. 예를 들어, 핵산 성분은 그람 음성 박테리아 내에서 장내 및 비-장내 박테리아를 구별하는 방법 또는 진단에서 디자인되어 사용될 수 있다. 핵산 성분 분자의 제2 세트는 미생물을 속 또는 종 수준에서 구별하도록 디자인될 수 있다. 따라서, 들 부류 중 하나 내에 속하는 소정 샘플 중에서 식별되는 박테리아 종의 각 속에 대해 모든 마이코박테리아, 그람 양성, 그람 음성 (장내 및 비-장내로 더 분류됨)을 식별하는 매트릭스가 생성될 수 있다. 전술한 내용은 단지 예시의 목적이다. 다른 미생물 유형을 분류하기 위한 다른 수단이 또한 고려되고 상기 기재된 일반 구조를 따르게 될 것이다.
약물 내성에 대한 스크리닝
일정 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 장치, 시스템 및 방법은 관심 미생물 유전자, 예를 들어, 항생제 및/또는 항바이러스 내성 유전자에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 핵산 성분 분자는 기지의 관심 유전자를 구별할 수 있다. 임상 샘플을 포함한, 샘플은 이러한 유전자의 검출에 대해 본 명세서에 개시된 구현예를 사용해 스크리닝될 수 있다. POC에서 약물 내성에 대해 스크리닝하는 능력은 적절한 치료 계획의 선택에서 엄청난 이득을 갖는다. 일정 예의 구현예에서, 항생제 내성 유전자는 KPC, NDM1, CTX-M15, OXA-48을 포함한 카르바페네마제이다. 다른 항생제 내성 유전자가 공지되어 있고, 예를 들어, 다음에서 확인할 수 있다: Comprehensive Antibiotic Resistance Database (Jia et al. "CARD 2017: expansion and model-centric curation of the Comprehensive Antibiotic Resistance Database." Nucleic Acids Research, 45, D566-573).
리바비린은 수많은 RNA 바이러스를 공격하는 효과적인 항바이러스제이다. 구제역 바이러스 doi:10.1128/JVI.03594-13; polio virus (Pfeifer and Kirkegaard. PNAS, 100(12):7289-7294, 2003); 및 C형 간염 바이러스 (Pfeiffer and Kirkegaard, J. Virol. 79(4):2346-2355, 2005)를 포함하여, 몇몇 임상적으로 중요한 바이러스에서 리바비린 내성이 진화되었다. 다수의 다른 지속성 RNA 바이러스, 예컨대 간염 및 HIV는 기존 항바이러스 약물에 대한 내성이 진화되었다: B형 간염 바이러스 (라미부딘, 테노포비르, 에테카비르) doi:10/1002/hep22900; C형 간염 바이러스 (텔라프레비르, BILN2061, ITMN-191, SCh6, 보세프레비르, AG-021541, ACH-806) doi:10.1002/hep.22549; 및 HIV (다제 내성 돌연변이) hivb.standford.edu. 본 명세서에 개시된 구현예는 특히 변이체를 검출하는데 사용될 수 있다.
약물 내성이외에도, 본 명세서에 개시된 구현예로 검출할 수 있는 다수의 임상적으로 관련된 돌연변이, 예컨대 LCMV에서 재속성 대 급성 감염 (doi:10.1073/pnas.1019304108), 및 에볼라에서 증가된 감염성 (Diehl et al. Cell. 2016, 167(4):1088-1098)이 존재한다.
본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 밀접하게 관련된 미생물 종 (예를 들어, 소정 표적 서열에서 오직 단일 뉴클레오티드 차이만 가짐)은 핵산 성분 분자에서 합성 불일치의 도입에 의해 구별될 수 있다.
미생물 대발생의 모니터링
일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 TnpB 시스템 또는 이의 사용 방법은 병우너체 대발생의 진화를 결정하는데 사용될 수 있다. 방법은 하나 이상의 대상체 유래의 다수 개의 샘플로부터 하나 이상의 표적 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 표적 서열은 대발생을 야기하는 미생물 유래의 서열이다. 이러한 방법은 병원체 전파의 패턴, 또는 병원체에 의해 야기되는 질환 대발생에 관여하는 기전을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
병원체 전파의 패턴은 병원체의 천연 병원소로부터의 계속적인 신규 전파 또는 천연 병원소로부터의 단일 전파 후 대상체 대 대상체 전파 (예를 들어, 인간 대 인간 전파) 또는 이 둘의 혼합을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 병원체 전파는 박테리아 또는 바이러스 전파일 수 있고, 이러한 경우, 표적 서열은 바람직하게는 미생물 게놈 또는 이의 단편이다. 일 구현예에서, 병원체 전파의 패턴은 병원체 전파의 조기 패턴, 즉 병원체 대발생의 시작 시의 패턴이다. 대발생의 시작 시 병원체 전파의 패턴 결정은 가능한 가장 빠른 시점에 대발생을 중단시킬 가능성을 증가시키고, 그리하여 지역 및 국가간 전파 확률을 감소시킨다.
병원체 전파의 패턴을 결정하는 단계는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 병원체 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 병원체 전파의 패턴을 결정하는 단계는 대상체 간 병원체 서열의 공유된 숙주내 변이를 검출하는 단계 및 공유된 숙주내 변이가 시간적 패턴을 보이는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 관찰된 숙주내 및 숙주간 변이의 패턴은 전파 및 역학에 관한 중요한 통찰을 제공한다 (Gire, et al., 2014).
시간적 패턴을 보이는 대상체 간 공유된 숙주내 변이의 검출은, 다수 공급원으로부터의 대상체 감염 (중복감염), 샘플 오염 재발성 돌연변이 (돌연변이의 강화를 위한 균형 선택의 존재 또는 부재 하), 또는 전파 사슬의 초기에 돌연변이에 의해 발생된 약간의 발산된 바이러스의 동시-전파에 의해 설명될 수 있기 때문에, 대상체 간 (특히 인간 사이)의 전파 관련성을 나타낸다 (Park, et al., Cell 161(7):1516-1526, 2015). 대상체 간 공유된 숙주내 변이의 검출은 공통 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 위치에 위치하는 숙주내 변이체의 검출을 포함할 수 있다. 공통 (SNP) 위치에 위치된 숙주내 변이체의 양성 검출은 숙주내 변이체에 대한 주요 설명으로서 중복감염 및 오염을 의미한다. 중복감염 및 오염은 숙주간 변이체로서 나타나는 SNP 빈도를 기반으로 구별될 수 있다 (Park, et al., 2015). 그렇지 않으면 중복감염 및 오염은 배제시킬 수 있다. 이 후자의 경우에, 대상체 간 공유된 숙주내 변이의 검출은 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도를 평가하는 단계 및 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도를 서로 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 비동의성 돌연변이는 단백질의 아미노산을 변경시키는 돌연변이이고, 아마도 그 결과로 자연 선택을 겪은 미생물에서 생물학적 변화를 야기시킬 듯 하다. 동의성 치환은 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 동일한 빈도는 중성적으로 진화하는 숙주내 변이체를 의미한다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도가 다른 경우, 숙주내 변이체는 균형 선택에 의해 유지될 가능성이 있다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도가 낮은 경우, 이것은 재발성 돌연변이를 의미한다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도가 높은 경우, 이것은 동시-전파를 의미한다 (Park, et al., 2015).
에볼라 바이러스처럼, 라싸 바이러스 (LASV) 는 사망률이 높은 출혈열을 야기시킬 수 있다. Andersen 등은 임상 및 설치류 병원소 샘플로부터 거의 200 종의 LASV 서열의 게놈 카탈로그를 생성시켰다 (Andersen, et al., Cell Volume 162, Issue 4, p 738-750, 13 August 2015). Andersen 등은 20132015 년 EVD 유행병이 인간-대-인간 전파에 의해 자극된데 반해, LASV 감염은 주로 병원소-대-인간 감염에 의한다는 것을 보여준다. Andersen 등은 서아프리카 전역에서 LASV 의 확산을 밝혀주었으며 이러한 이동은 LASV 게놈 존재비, 사망률, 코돈 적응, 및 번역 효율의 변화가 수반되었다는 것을 보여준다. 방법은 제 1 병원체 서열을 제 2 병원체 서열과 계통발생적으로 비교하는 단계, 및 제 1 및 제 2 병원체 서열 간 계통발생적 연결성이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제 2 병원체 서열은 초기 참조 서열일 수 있다. 계통발생적 연결성이 존재한다면, 방법은 제 1 병원체 서열의 계통발생을 제 2 병원체 서열에 기원시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 따라서, 제 1 병원체 서열의 계통을 구축하는 것이 가능하다.(Park, et al., 2015).
방법은 돌연변이가 유해성 또는 적응성인지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 유해성 돌연변이는 전파-손상 바이러스 및 종말 감염을 의미하고, 따라서 정상적으로 오직 개별 대상체에만 존재한다. 하나의 개별 대상체에 고유한 돌연변이는 계통수의 외부 분지에서 발생되는 것들인데 반해, 내부 분지 돌연변이는 다수 샘플 (즉, 다수 대상체) 에 존재하는 것들이다. 더 높은 비율의 비-동의성 치환은 계통수의 외부 분지를 특징으로 한다 (Park, et al., 2015).
계통수의 내부 분지에서, 선택은 유해성 돌연변이를 여과시켜 버릴 더 많은 기회를 가졌었다. 정의에 의해, 내부 분지는 다수의 후손 계통을 생성시켰고, 따라서 적응 비용으로 돌연변이를 포함시킬 가능성이 덜 할 수 있다. 따라서, 더 낮은 비율의 비-동의성 치환은 내부 분지를 의미한다 (Park, et al., 2015).
적응도에 대한 영향이 덜 할 가능성이 있는, 동의성 돌연변이는 내부 및 외부 분지 상에서 보다 비슷한 빈도로 발생하였다 (Park, et al., 2015).
시퀀싱된 표적 서열, 예컨대 바이러스 게놈을 분석하여, 2014 년 에볼라 대발생 동안과 같은 유행병 에피소드의 중증도에 대한 원인이 되는 기전을 발견하는 것이 가능하다. 예를 들어, 이전 대발생 유래의 모든 20 종 게놈에 대해서 2014 년 대발생의 게놈의 계통발생적 비교를 만든 Gire 등은 2014 년 서아프리카 바이러스가 지난 십여년 내에 중앙 아프리카로부터 확산된 가능성이 있다는 것을 제안한다. 다른 에볼라 바이러스 게놈으로부터의 분기를 이용하여 계통발생을 기원시키는 것은 문제가 있었다 (6, 13). 그러나, 가장 오래된 대발생에 대해 계통수를 기원시키는 것은 샘플 날짜와 뿌리부터 첨단까지의 거리 사이에 강력한 상관성을 밝혀주었고, 치환율은 연간 부위 당 8 × 10-4 였다 (13). 이것은 가장 최근의 대발생 3 건의 계통이 모두 대략 2004년 경에, 대체로 동일한 시점에 공통 조상으로부터 분기되었다는 것을 시사하며, 이는 각각의 대발생이 이의 천연 병원소의 동일한 유전적으로 다양한 바이러스 개체군으로부터의 독립적인 동물원성 감염 사건을 나타낸다는 가설을 뒷받침한다. 이들은 또한 2014 년 EBOV 대발생이 천연 병원소로부터의 단일 전파와 그 이후 대발생 동안 인간 대 인간 전파에 의해 야기되었을 것임을 발견하였다. 그들 결과는 또한 시에라리온에서의 유행병 에피소드가 대략 동일 시점에 기니로부터의 2종의 유전적으로 별개인 바이러스의 유입에 기인하였을 것임을 시사한다 (Gire, et al., 2014).
특히 인간 대 인간 전파 덕분에, 라싸 바이러스가 이의 원점으로부터 어떻게 확산되었는가를 결정하고 심지어 이러한 확산 400년의 역사를 역추적하는 것이 또한 가능하였다 (Andersen, et al., Cell 162(4):738-50, 2015).
2013-2015년 EBOV 대발생 동안 필요했던 작업 및 대발생 현장에서 의료진이 직면했던 어려움과 관련하여, 보다 일반적으로, 본 발명의 방법은 소수의 선택된 프로브를 사용하여 시퀀싱을 수행하는 것을 가능하게 만들어서 시퀀싱을 가속화시킬 수 있고, 따라서 샘플 채취부터 결과 입수까지 필요한 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 키트 및 시스템은 현장에서 사용가능하게 디자인될 수 있어서 환자의 진단이 샘플을 국가 또는 세계의 다른 부분으로 수송하거나 또는 발송할 필요없이 쉽게 수행될 수 있다.
상기 기재된 임의의 방법에서, 표적 서열 또는 이의 단편의 시퀀싱은 상기 기재된 임의의 시퀀싱 방법을 사용할 수 있다. 또한, 표적 서열 또는 이의 단편의 서열분석은 근실시간 시퀀싱일 수 있다. 표적 서열 또는 이의 단편의 시퀀싱은 이전에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있다 (Experimental Procedures: Matranga et al., 2014; and Gire, et al., 2014). 표적 서열 또는 이의 단편의 서열분석은 다수 개의 표적 서열의 병행 서열분석을 포함할 수 있다. 표적 서열 또는 이의 단편의 서열분석은 Illumina 서열분석을 포함할 수 있다.
선택된 프로브 중 하나 이상과 하이브리드화하는 표적 서열 또는 이의 단편의 분석은 식별 분석일 수 있는데, 표적 서열 또는 이의 단편과 선택된 프로브의 하이브리드화는 샘플 내의 표적 서열의 존재를 의미한다.
현재, 1차 진단은 환자가 갖고 있는 증상을 기반으로 한다. 그러나, 다양한 질환은 동일한 증상을 공유할 수 있어, 진단은 통계에 많이 의존한다. 예를 들어, 말라리아는 감기-유사 증상: 두통, 발열, 오한, 관절통, 구토, 용혈성 빈혈, 황달, 소변 중 헤모글로빈, 망막 손상, 및 경련을 촉발시킨다. 이들 증상은 또한 패혈증, 위장염, 및 바이러스 질환에서 공통이다. 그들 중에서, 에볼라 출혈열은 하기의 증상: 발열, 인후염, 근육통, 두통, 구토, 설사, 발진, 간 및 신장 기능 감소, 내부 및 외부 출혈을 갖는다.
환자가 예를 들어 열대 아프리카의 의료단에 출석했을 때, 기초 진단은 통계적으로 아프리카의 지역 내에서 말라리아가 가장 개연성있는 질환이기 때문에 말라리아로 결론내릴 것이다. 그러한 결과로 환자가 실제로 그 질환에 걸리지 않았을지라도 말라리아에 대해 치료받게 되어 결국 환자는 올바르게 치료되지 않게 된다. 이러한 올바른 치료의 부족은 특히 환자가 걸린 질환이 빠른 진화를 나타낼 때 생명 위협적일 수 있다. 환자에게 제공된 치료가 비효과적이고, 올바른 진단을 해서 환자에게 적절한 치료를 투여하는 것을 의료진이 깨닫기 전에 너무 늦을 수도 있다.
본 발명의 방법은 이러한 상황에 대한 해결책을 제공한다. 실제로, 핵산 성분 분자의 개수는 극적으로 감소될 수 있기 때문에, 이는 다수의 질환, 예를 들어 바이러스 감염을 동시에 진단할 수 있도록, 단일 칩 상에, 각각의 군이 하나의 질환에 대해 특이적인, 군들로 나뉘는 선택된 프로브를 제공하는 것을 가능하게 만든다. 본 발명 덕분에, 3 종이 넘는 질환을 단일 칩 상에서 진단할 수 있고, 바람직하게는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 종을 초과하는 질환을 동시에, 바람직하게는 소정 지리적 영역의 개체군 내에서 가장 일반적으로 발병되는 것인 질환을 진단할 수 있다. 선택된 프로브의 각 그룹이 진단된 질환 중 하나에 대해 특이적이므로, 보다 정확한 진단을 수행할 수 있고, 따라서 환자에게 부적절한 치료를 투여할 위험성이 감소된다.
다른 경우에서, 바이러스 감염과 같은 질환은 임의의 증상없이 발병될 수 있거나, 또는 증상을 야기하지만 환자가 의료진에게 나타나기 전에 소멸되었다. 이러한 경우, 환자는 임의의 의료 지원을 찾지 않거나 출석날 증상의 부재로 인해 진단이 복잡해진다.
본 발명은 또한 핵산, 예컨대 미가공, 비정제 샘플 중 mRNA 와 같은 핵산의 검출을 기반으로 질환의 진단, 병원체의 식별 및 치료의 최적화를 위한 다른 방법과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 이러한 상황을 해결하기 위한 강력한 도구를 제공한다. 실제로, 각각의 군이 소정 지역의 개체군 내에서 발병된 가장 일반적인 질환 중 하나에 특이적인, 선택된 핵산 성분 분자의 다수 군이 단일 진단 내에 포함되므로, 의료진은 오직 환자로부터 채취된 생물학적 샘플을 칩과 접촉시키는 것만을 필요로 한다. 칩의 판독은 환자가 걸린 질환을 밝혀준다.
일부 경우에, 일부 경우, 환자는 특정 증상의 진단을 위해 의료진에게 출석한다. 본 발명의 방법은 어떠한 질환이 이들 증상을 야기시켰는지를 식별할뿐만 아니라 동시에 환자가 자각하지 못한 또 다른 질환을 앓고 있는지 여부를 결정하는 것을 가능하게 만든다.
이러한 정보는 대발생의 기전을 찾을 때 최고로 중요할 것이다. 실제로, 동일한 바이러스를 갖는 환자 군은 또한 대상체 대 대상체 전파 연결성을 시사하는 시간적 패턴을 보인다.
예시적 미생물
본 명세서에 개시된 구현예는 수많은 상이한 미생물을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 미생물은 박테리아, 진균, 원충, 기생충, 및 바이러스를 포함한다.
박테리아
본 명세서에 개시된 구현예를 사용하여 검출될 수 있는 미생물 유형의 예시적인 목록을 하기에 제공한다. 일정 예의 구현예에서, 미생물은 박테리아이다. 개시된 방법에 따라 검출할 수 있는 박테리아의 예는 제한없이 하기 중 어느 하나 (또는 이의 임의 조합)을 포함한다: 아시네토박터 바우만니 (Acinetobacter baumanii), 악티노바실러스 (Actinobacillus) sp., 악티노마이세테스 (Actinomycetes), 악티노마이세트 (Actinomyces) sp. (예컨대 악티노마이세스 이스라엘리 (Actinomyces israelii) 및 악티노마이세스 나에스룬디 (Actinomyces naeslundii)), 애로모나스 (Aeromonas) sp. (예컨대 애로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila), 애로모나스 베로니 (Aeromonas veronii) 생물형 소브리아 (애로모나스 소브리아 (Aeromonas sobria), 및 애로모나스 카비아에 (Aeromonas caviae)), 아나플라스마 파고시토필럼 (Anaplasma phagocytophilum), 아나플라스마 마르기날레 (Anaplasma marginale), 알칼리게네스 실로소시단스 (Alcaligenes xylosoxidans), 아시네토박터 바우마니이 (Acinetobacter baumanii), 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스 (Actinobacillus actinomycetemcomitans), 바실러스 (Bacillus) sp. (예컨대, 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis), 및 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus)), 박테로이데스 (Bacteroides) sp. (예컨대, 박테로이데스 프라길리스 (Bacteroides fragilis)), 바르토넬라 (Bartonella) sp. (예컨대, 바르토넬라 바실리포르미스 (Bartonella bacilliformis) 및 바르토넬라 헨셀라에 (Bartonella henselae), 비피도박테리움 (Bifidobacterium) sp., 보르데텔라 (Bordetella) sp. (예컨대, 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis), 보르데텔라 파라퍼투시스 (Bordetella parapertussis), 및 포르데텔라 브론치셉티카 (Bordetella bronchiseptica)), 보렐리아 (Borrelia) sp. (예컨대, 보렐리아 레쿠렌티스 (Borrelia recurrentis), 및 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi)), 브루셀라 (Brucella) sp. (예컨대, 브루셀라 아보르투스 (Brucella abortus), 브루셀라 카니스 (Brucella canis), 브루셀라 멜린텐시스 (Brucella melintensis) 및 브루셀라 수이스 (Brucella suis)), 버크홀데리아 (Burkholderia) sp. (예컨대, 버크홀데리아 슈도말레이 (Burkholderia pseudomallei) 및 버크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia)), 캄필로박터 (Campylobacter) sp. (예컨대, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캄필로박터 라리 (Campylobacter lari) 및 캄필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)), 카프노시토파가 (Capnocytophaga) sp., 카디오박테리움 호미니스 (Cardiobacterium hominis), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 클라미도필라 프시타시 (Chlamydophila psittaci), 시트로박터 (Citrobacter) sp. 콕시엘라 부르네티이 (Coxiella burnetii), 코리네박테리움 (Corynebacterium) sp. (예컨대, 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 제이케움 (Corynebacterium jeikeum) 및 코리네박테리움 (Corynebacterium)), 클로스트리듐 (Clostridium) sp. (예컨대 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile), 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 및 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani)), 에이케넬라 코로덴스 (Eikenella corrodens), 엔테로박터 (Enterobacter) sp. (예컨대, 엔테로박터 애로제네스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 아글로머란스 (Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae) 및 기회감염성 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 예컨대 장독소원성 이. 콜라이, 장침습성 이. 콜라이, 장병원성 이. 콜라이, 장출혈성 이. 콜라이, 장응집성 이. 콜라이 및 요로병원성 이. 콜라이를 포함한, 에스케리치아 콜라이), 엔테로코커스 (Enterococcus) sp. (예컨대, 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 및 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium)), 엘리키아 (Ehrlichia) sp. (예컨대, 엘리키아 카페엔시아 (Ehrlichia chafeensia) 및 엘리키아 카니스 (Ehrlichia canis)), 에피더모피톤 플로코섬 (Epidermophyton floccosum), 에리시펠로트릭스 루시오파티아 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 유박테리움 (Eubacterium) sp., 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 푸소박테리움 뉴클레아텀 (Fusobacterium nucleatum), 가드네렐라 바지날리스 (Gardnerella vaginalis), 게멜라 모빌로럼 (Gemella morbillorum), 해모필러스 (Haemophilus) sp. (예컨대, 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus Influenzae), 해모필러스 두크레이이 (Haemophilus ducreyi), 해모필러스 애집티우스 (Haemophilus aegyptius), 해모필러스 파라인플루엔자 (Haemophilus Parainfluenzae), 해모필러스 해몰리티커스 (Haemophilus haemolyticus) 및 해모필러스 파라해몰리티커스 (Haemophilus parahaemolyticus), 헬리코박터 (Helicobacter) sp. (예컨대, 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori), 헬리코박터 시나에디 (Helicobacter cinaedi) 및 헬리코박터 펜넬리아 (Helicobacter fennelliae)), 킨겔라 킨기이 (Kingella kingii), 클렙시엘라 (Klebsiella) sp. (예컨대, 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 그라눌로마티스 (Klebsiella granulomatis) 및 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca)), 락토바실러스 (Lactobacillus) sp., 리스테리아 모노시토제네스 (Listeria monocytogenes), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus) sp., 만헤이미아 헤몰리티카 (Mannheimia hemolytica), 마이크로스포럼 카니스 (Microsporum canis), 모라셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 모르가넬라 (Morganella) sp., 모빌룬커스 (Mobiluncus) sp., 마이크로코커스 (Micrococcus) sp., 마이코박테리움 (Mycobacterium) sp. (예컨대, 마이코박테리움 레프라에 (Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 파라튜버큘로시스 (Mycobacterium paratuberculosis), 마이코박테리움 인트라셀룰라레 (Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 및 마이코박테리움 마리넘 (Mycobacterium marinum)), 마이코플라즘 (Mycoplasm) sp. (예컨대, 마이코플라스마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라스마 호미니스 (Mycoplasma hominis) 및 마이코플라스마 제니탈리움 (Mycoplalsma genitalium)), 노카르디아 (Nocardia) sp. (예컨대, 노카르디아 아스테로이데스 (Nocardia asteroides), 노카르디아 시리아시제오르기카 (Nocardia cyriacigeorgica) 및 노카르디아 브라실리엔시스 (Nocardia brasiliensis)), 네이세리아 (Neisseria) sp. (예컨대, 네이세리아 고노레아 (Neisseria gonorrhoeae) 및 네이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis)), 파스퇴렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida), 피티로스포럼 오르비쿨라레 (Pityrosporum orbiculare) (말라세지아 푸르푸르 (Malassezia furfur)), 플레시오모나스 시겔로이데스 (Plesiomonas shigelloides), 프레보텔라 (Prevotella) sp., 포르피로모나스 (Porphyromonas) sp., 프레보텔라 멜라니노제니카 (Prevotella melaninogenica), 프로테우스 (Proteus) sp. (예컨대, 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris) 및 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis)), 프로비덴시아 (Providencia) sp. (예컨대, 프로비덴시아 알칼리파시엔스 (Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri) 및 프로비덴시아 스투아르티 (Providencia stuartii)), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 로도코커스 에쿠이 (Rhodococcus equi), 리켓치아 (Rickettsia) sp. (예컨대, 리켓치아 리켓치이 (Rickettsia rickettsii), 리켓치아 아카리 (Rickettsia akari) 및 리켓치아 프로와제키이 (Rickettsia prowazekii), 오리엔티아 쯔쯔가무시 (Orientia tsutsugamushi) (이전: 리켓치아 쯔쯔가무시 (Rickettsia tsutsugamushi)) 및 리켓치아 티피 (Rickettsia typhi)), 로도코커스 (Rhodococcus) sp., 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 스테노트로포모나스 말토필라 (Stenotrophomonas maltophilia), 살모넬라 (Salmonella) sp. (예컨대, 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 살모넬라 파라티피 (Salmonella paratyphi), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis) 및 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium)), 세라티아 (Serratia) sp. (예컨대, 세라티아 마르세산스 (Serratia marcesans) 및 세라티아 리퀴파시엔스 (Serratia liquifaciens)), 시겔라 (Shigella) sp. (예컨대, 시겔라 디센테리아 (Shigella dysenteriae), 시겔라 프렉스네리 (Shigella flexneri), 시겔라 보이디이 (Shigella boydii) 및 시겔라 손네이 (Shigella sonnei)), 스타필로코커스 (Staphylococcus) sp. (예컨대 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 헤몰리티커스 (Staphylococcus hemolyticus), 스타필로코커스 사프로피티커스 (Staphylococcus saprophyticus)), 스트렙토코커스 (Streptococcus) sp. (예컨대, 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) (예를 들어, 클로람페니콜-내성 혈청형 4 스트렙토코커스 뉴모니아, 스펙티노마이신-내성 혈청형 6B 스트렙토코커스 뉴모니아, 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 스트렙토코커스 뉴모니아, 에리쓰로마이신-내성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니아, 옵토킨-내성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니아, 리팜피신-내성 혈청형 18C 스트렙토코커스 뉴모니아, 테트라사이클린-내성 혈청형 19F 스트렙토코커스 뉴모니아, 페니실린-내성 혈청형 19F 스트렙토코커스 뉴모니아, 및 트리메토프림-내성 혈청형 23F 스트렙토코커스 뉴모니아, 클로람페니콜-내성 혈청형 4 스트렙토코커스 뉴모니아, 스펙티노마이신-내성 혈청형 6B 스트렙토코커스 뉴모니아, 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 스트렙토코커스 뉴모니아, 옵토킨-내성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니아, 리팜피신-내성 혈청형 18C 스트렙토코커스 뉴모니아, 페니실린-내성 혈청형 19F 스트렙토코커스 뉴모니아, 또는 트리메토프림-내성 혈청형 23F 스트렙토코커스 뉴모니아), 스트렙토코커스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 피로제네스 (Streptococcus pyogenes), 그룹 A 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 피로제네스, 그룹 B 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 아갈락티아, 그룹 C 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 안지노서스 (Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 에퀴스밀리스 (Streptococcus equismilis), 그룹 D 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 보비스 (Streptococcus bovis), 그룹 F 스트렙토코커스, 및 스트렙토코커스 안지노서스 그룹 G 스트렙토코커스), 스피릴럼 미너스 (Spirillum minus), 스트렙토바실러스 모닐리포르미 (Streptobacillus moniliformi), 트레포네마 (Treponema) sp. (예컨대, 트레포네마 카라테움 (Treponema carateum), 트레포네마 페테누에 (Treponema petenue), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum) 및 트레포네마 엔데미컴 (Treponema endemicum), 트리코피톤 루브럼 (Trichophyton rubrum), 티. 멘타그로피테스 (T. mentagrophytes), 프로테리마 위펠리이 (Tropheryma whippelii), 우레아플라스마 우레아리티컴 (Ureaplasma urealyticum), 베일로넬라 (Veillonella) sp., 비브리오 (Vibrio) sp. (예컨대, 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티커스 (Vibrio parahemolyticus), 비브리오 벌니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 파라해몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 벌니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 알기놀리티커스 (Vibrio alginolyticus), 비브리오 미미커스 (Vibrio mimicus), 비브리오 홀리사에 (Vibrio hollisae), 비브리오 플루비알리스 (Vibrio fluvialis), 비브리오 멧치니코비이 (Vibrio metchnikovii), 비브리오 담셀라 (Vibrio damsela) 및 비브리오 퍼니시이 (Vibrio furnisii)), 여시니아 (Yersinia) sp. (예컨대, 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 여시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 및 여시니아 슈도튜버큘로시스 (Yersinia pseudotuberculosis)) 및 잔토모나스 말토필리아 (Xanthomonas maltophilia).
진균
일정 예의 구현예에서, 미생물은 진균 또는 진균 종이다. 개시된 방법에 따라서 검출할 수 있는 진균의 예는 제한없이, 하기 중 어느 하나 이상 (또는 이의 임의 조합)을 포함한다: 개시된 방법에 따라 검출할 수 있는 진균의 예는 아스퍼질러스 (Aspergillus), 블라스토마이세스 (Blastomyces), 칸디디아시스 (Candidiasis), 콕시디오도마이코시스 (Coccidiodomycosis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티 (Cryptococcus gatti), sp., 히스토플라스마 (Histoplasma) sp. (예컨대 히스토플라스마 캡술라텀 (Histoplasma capsulatum)), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) sp. (예컨대 뉴모시스티스 지로벡시이 (Pneumocystis jirovecii)), 스타키보트리스 (Stachybotrys) (예컨대 스타키보트리스 카르타럼 (Stachybotrys chartarum)), 무크로임코시스 (Mucroymcosis), 스포로트릭스 (Sporothrix), 진균성 안구 감염 백선, 엑세로힐럼 (Exserohilum), 클라도스포리움 (Cladosporium).
일정 예의 구현예에서, 진균은 효모이다. 개시된 방법에 따라서 검출할 수 있는 효모의 예는 제한없이 하기 중 하나 이상 (또는 이의 임의 조합)을 포함한다: 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종 (예컨대 아스퍼질러스 푸미가터스 (Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus) 및 아스퍼질러스 클라바터스 (Aspergillus clavatus)), 크립토코커스 sp. (Cryptococcus sp.) (예컨대 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티 (Cryptococcus gattii), 크립토코커스 라우렌티이 (Cryptococcus laurentii) 및 크립토코커스 알비더스 (Cryptococcus albidus)), 제오트리컴 (Geotrichum) 종, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종, 한세눌라 (Hansenula) 종, 칸디다 종 (예컨대 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 종, 피키아 (Pichia) 종, 또는 이의 조합. 일정 예의 구현예에서, 진균은 곰팡이이다. 곰팡이의 예는 페니실리움 (Penicillium) 종, 클라도스포리움 (Cladosporium) 종, 비소클라미스 (Byssochlamys) 종, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
원충
일정 예의 구현예에서, 미생물은 원충이다. 개시된 방법 및 장치에 따라 검출할 수 있는 원충의 예는 유글레노조아 (Euglenozoa), 헤테로로보세아 (Heterolobosea), 디플로모나디다 (Diplomonadida), 아메보조아 (Amoebozoa), 블라스토시스틱 (Blastocystic), 및 아피콤플렉사 (Apicomplexa) 중 임의의 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 비제한적으로 포함한다. 예시적인 유글레노조아 (Euglenoza) 는 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) (샤가스 병), 티. 브루세이 감비엔스 (T. brucei gambiense), 티. 브루세이 로데시엔스 (T. brucei rhodesiense), 리슈마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), 엘. 인판텀 (L. infantum), 엘. 멕시카나 (L. mexicana), 엘. 마조르 (L. major), 엘. 트로피카 (L. tropica), 및 엘. 도노바니 (L. donovani) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 헤테로로보세아 (Heterolobosea) 는 내글레리아 파울러리 (Naegleria fowleri) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 디플로모나디드 (Diplomonadid) 는 지아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis) (지. 람블리아 (G. lamblia), 지. 듀오데날리스 (G. duodenalis)) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 아메보조아 (Amoebozoa) 는 아칸타메바 카스텔라니이 (Acanthamoeba castellanii), 발라무티아 마드릴라리스 (Balamuthia madrillaris), 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 블라스토시스트는 제한없이, 블라스토시스틱 호미니스 (Blastocystic hominis)를 포함한다. 예시적인 아피콤플렉사는 제한없이, 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 크립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카이에타넨시스 (Cyclospora cayetanensis), 플라스모듐 팔시파럼 (Plasmodium falciparum), 피. 비박스 (P. vivax), 피. 오발레 (P. ovale), 피. 말라리아에 (P. malariae), 및 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondii)를 포함한다.
기생충
일정 예의 구현예에서, 미생물은 기생충이다. 개시된 방법에 따라 검출할 수 있는 기생충의 예는 온코세르카 (Onchocerca) 종 및 플라스모듐 (Plasmodium) 종 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 비제한적으로 포함한다.
바이러스
일정 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치, 및 방법은 샘플에서 바이러스를 검출하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 구현예는 (예를 들어, 대상체 또는 식물의) 바이러스 감염을 검출하거나, 또는 단일 뉴클레오티드 다형성이 상이한 바이러스 균주를 포함하여, 바이러스 균주의 결정에 사용될 수 있다. 바이러스는 DNA 바이러스, RNA 바이러스, 또는 레트로바이러스일 수 있다. 본 발명으로 유용한 바이러스의 비제한적인 예는 에볼라, 홍역, SARS, 치쿤구니아, 간염, 마르부르크, 황열, MERS, 뎅기, 라싸, 인플루엔자, 랩도바이러스 또는 HIV 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 간염 바이러스는 A 형 바이러스, B 형 바이러스 또는 C 형 바이러스를 포함할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 예를 들어, A 형 인플루엔자 또는 B 형 인플루엔자를 포함할 수 있다. HIV 는 HIV 1 또는 HIV 2 를 포함할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 바이러스 서열은 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 수단 에볼라 바이러스, 분디분교 바이러스, 타이 포레스트 에볼라 바이러스, 레스톤 에볼라 바이러스, 아키모타, 애데스 플라비바이러스, 아구아카테 바이러스, 아까바네 바이러스, 알레티노피드 렙타레나바이러스, 알파우아요 맘마레나바이러스, 아마파리 엠마레나 바이러스, 안데스 바이러스, 아포이 바이러스, 아라반 바이러스, 아로아 바이러스, 아룸워트 바이러스, 대서양 연어 파라믹소바이러스, 오스트레일리아 박쥐 릿사바이러스, 조류 보르나바이러스, 조류 메타뉴모바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 펭귄 또는 포클랜드섬 바이러스, BK 폴리오마바이러스, 바가자 바이러스, 반나 바이러스, 박쥐 헤페바이러스, 박쥐 사포바이러스, 베어 캐년 맘마레나바이러스, 베일롱 바이러스, 베타코로노아바이러스, 베타파필로마바이러스 1-6, 반자 바이러스, 보켈로 박쥐 릿사바이러스, 보르나병 바이러스, 버번 바이러스, 소 헤파시바이러스, 소 파라인플루엔자 바이러스 3, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 브라조란 바이러스, 부니암웨라 바이러스, 칼리시바이러스과 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 칸디루 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 개 뉴모바이러스, 체다 바이러스, 세포융합제 바이러스, 세타시안 모르빌리바이러스, 찬디푸라 바이러스, 챠오양 바이러스, 차파레 맘마레나바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 콜로버스 원숭이 파필로마바이러스, 콜로라도 진드기열 바이러스, 우두 바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 쿨렉스 플라비바이러스, 쿠픽시 맘마레나바이러스, 뎅기 바이러스, 도브라바-벨그라데 바이러스, 동강 바이러스, 두그베 바이러스, 듀벤헤이즈 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 엔테베 박쥐 바이러스, 장바이러스 A-D, 유럽 박쥐 릿사바이러스 1-2, 이야크 바이러스, 고양이 모빌리바이러스, 페르-드-랑스 파라믹소바이러스, 피츠로이 리버 바이러스, 플라비바이러스과 바이러스, 플렉살 맘마레나바이러스, GB 바이러스 C, 가이로 바이러스, 제미서큘러바이러스, 거위 파라믹소바이러스 SF02, 그레이트 아일랜드 바이러스, 구아나리토 맘마레나바이러스, 한탄 바이러스, 한타바이러스 Z10, 하트랜드 바이러스, 헨드라 바이러스, A/B/C/E 형 간염 바이러스, 델타형 간염 바이러스, 인간 보카바이러스, 인간 코로나바이러스, 인간 내인성 레트로바이러스 K, 인간 장 코로나바이러스, 인간 생식기-연관 원형 DNA 바이러스-1, 인간 헤르페스바이러스 1-8, 인간 면역결핍 바이러스 1/2, 인간 마스타데노바이러스 A-G, 인간 파필로마바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1-4, 인간 파라에코바이러스, 인간 피코르나바이러스, 인간 스마코바이러스, 이코마 릿사바이러스, 일헤우스 바이러스, 인플루엔자 A-C, 입피 맘마레나바이러스, 이르쿠트 바이러스, J-바이러스, JC 폴리오마바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 후닌 맘마레나바이러스, KI 폴리오마바이러스, 카디피로 바이러스, 카미티 리버 바이러스, 케두구 바이러스, 후잔트 바이러스, 코코베라 바이러스, 키아사누 삼림병 바이러스, 라고스 박쥐 바이러스, 란가트 바이러스, 라싸 맘마레나바이러스, 라티노 맘마레나바이러스, 레오파즈 힐 바이러스, 랴오닝 바이러스, 류간 바이러스, 로우비 바이러스, 루핑 일 바이러스, 룰요 맘마레나바이러스, 루나 맘마레나바이러스, 렁크 바이러스, 림프구성 맥락수막염 맘마레나바이러스, 릿사바이러스 오제르노에, MSSI2＼.225 바이러스, 마츄포 맘마레나바이러스, 마마스트로바이러스 1, 만자닐라 바이러스, 마푸에라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 마야로 바이러스, 홍역 바이러스, 메낭글 바이러스, 메르카데오 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마바이러스, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스, 모발라 맘마레나바이러스, 모독 바이러스, 모이장 바이러스, 모콜로 바이러스, 원두증 바이러스, 몬타나 미오티스 류코엔찰리티스 바이러스, 모페이아 라사 바이러스 재편성체 29, 모페이아 맘마레나바이러스, 모로고로 바이러스, 모스만 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 쥐과 폐렴 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 나리바 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 니파 바이러스, 노르워크 바이러스, 노르웨이 박쥐 헤파시바이러스, 은타야 바이러스, 오니옹-니옹 바이러스, 올리베로스 맘마레나바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스, 오로퓨스 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 5, 파라나 맘마레나바이러스, 파라마타 리버 바이러스, 가성 우역 바이러스, 피찬드 맘마레나바이러스, 피코르나바이러스과 바이러스, 피리탈 맘마레나바이러스, 피시헤페바이러스 A, 돼지 파라인플루엔자 바이러스 1, 돼지 루불라바이러스, 파와산 바이러스, 영장류 T-림프친화성 바이러스 1-2, 영장류 적혈파보바이러스 1, 푼타 토로 바이러스, 푸울말라 바이러스, 꽝빈 바이러스, 공수병 바이러스, 라즈단 바이러스, 파충류 보르나바이러스 1, 리노바이러스 A-B, 리프트 밸리 발열 바이러스, 우역 바이러스, 리오 브라보 바이러스, 설치류 토크 테노 바이러스, 설치류 헤파시바이러스, 로스 리버 바이러스, 로타바이러스 A-I, 로얄 팜 바이러스, 루벨라 바이러스, 사비아 맘마레나바이러스, 세일럼 바이러스, 모래파리열 나폴리 바이러스, 모래파리열 시칠리아 바이러스, 사포로 바이러스, 사투페리 바이러스, 물개 아넬로바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 센다이 바이러스, 서울 바이러스, 세픽 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군-관련 코로나바이러스, 혈소판감소증 증후군 수반 중증 발열 바이러스, 샤몬다 바이러스, 시모니 박쥐 바이러스, 슈니 바이러스, 심부 바이러스, 원숭이 토크 테노 바이러스, 시미언 바이러스 40-41, 신 놈브레 바이러스, 신드비스 바이러스, 소형 아넬로바이러스, 소수가 바이러스, 스페인 염소 뇌염 바이러스, 스폰드웨니 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 선샤인 바이러스, TTV-유사 미니 바이러스, 타카리브 맘마레나바이러스, 타일라 바이러스, 타마나 박쥐 바이러스, 타미아미 맘마레나바이러스, 템부수 바이러스, 토고토 바이러스, 토타팔라얌 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 티오만 바이러스, 토가바이러스과 바이러스, 토크 테노 카니스 바이러스, 토크 테노 두루쿨리 바이러스, 토크 테노 펠리스 바이러스, 토크 테노 미디 바이러스, 토크 테노 수스 바이러스, 토크 테노 타마린 바이러스, 토크 테노 바이러스, 토크 테노 잘로퍼스 바이러스, 투호코 바이러스, 툴라 바이러스, 투파이아 파라믹소바이러스, 우수투 바이러스, 유우쿠니에미 바이러스, 백시니아 바이러스, 바리올라 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 수포성 구내염 인디아나 바이러스, WU 폴리오마바이러스, 웨셀스브론 바이러스, 서부 코카시안 박쥐 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, 화이트워터 아로요 맘마레나바이러스, 황열병 바이러스, 요코세 바이러스, 유그 보그다노박 바이러스, 자이르 에볼라바이러스, 지카 바이러스, 또는 자이고사카로마이세스 바일리 바이러스 Z 바이러스 서열일 수 있다. 검출할 수 있는 RNA 바이러스의 예는 코로나바이러스과 바이러스, 피코르나바이러스과 바이러스, 칼리시바이러스과 바이러스, 플라비바이러스과 바이러스, 토가바이러스과 바이러스, 보르나바이러스과, 필로바이러스과, 파라믹소바이러스과, 뉴모바이러스과, 랩도바이러스과, 아레나바이러스과, 부니아바이러스과, 오르쏘믹소바이러스과, 또는 델타바이러스 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합)을 포함한다. 일정 예의 구현예에서, 바이러스는 코로나바이러스, SARS, 폴리오바이러스, 리노바이러스, A 형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트나일 바이러스, C 형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 루벨라 바이러스, 로스 리버 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 보르나병 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 니파 바이러스, 헨드라 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 공수병 바이러스, 라싸 바이러스, 한타바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 인플루엔자, 또는 D 형 간염 바이러스이다.
일정 예의 구현예에서, 바이러스는 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 토마토 반점 위조 바이러스 (TSWV), 오이 모자이크 바이러스 (CMV), 감자 바이러스 Y (PVY), RT 바이러스 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV), 자두 곰보 바이러스 (PPV), 브롬 모자이크 바이러스 (BMV), 감자 바이러스 X (PVX), 감귤 트리스테자 바이러스 (CTV), 보리 황화 위축 바이러스 (BYDV), 감자 잎말림 바이러스 (PLRV), 토마토 덤불 위축 바이러스 (TBSV), 벼 퉁그로 구형 바이러스 (RTSV), 벼 누렁 얼룩 바이러스 (RYMV), 흰잎 벼 바이러스 (RHBV), 옥수수 라야도 피노 바이러스 (MRFV), 옥수수 난장이 모자이크 바이러스 (MDMV), 사탕수수 모자이크 바이러스 (SCMV), 고구마 모틀 바이러스 (SPFMV), 고구마 선켄 베인 클로스테로바이러스 (SPSVV), 포도 부채잎 바이러스 (GFLV), 포도 바이러스 A (GVA), 포도 바이러스 B (GVB), 포도 잎반점 바이러스 (GFkV), 포도 잎말림-연관 바이러스-1, 포도 잎말림-연관 바이러스-2, 및 포도 잎말림-연관 바이러스-3 (GLRaV-1, GLRaV-2, 및 GLRaV-3), 아라비스 모자이크 바이러스 (ArMV), 또는 루페스트리스 고접병-연관 바이러스 (RSPaV) 를 포함하는 군으로부터 선택되는 식물 바이러스일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 표적 RNA 분자는 상기 병원체의 일부이거나 상기 병원체의 DNA 분자로부터 전사된다. 예를 들어, 표적 서열은 RNA 바이러스의 게놈에 포함될 수 있다. TnpB 단백질은 상기 병원체가 상기 식물을 감염시키거나 감염시켰다면, 상기 식물 중 상기 병원체의 상기 표적 RNA 분자를 가수분해시키는 것이 더 바람직하다. 따라서 TnpB 시스템 (또는 이의 완료에 필요한 부분) 이 치료적으로, 즉 감염이 일어난 이후에, 또는 예방적으로, 즉 감염이 일어나기 전에 적용되는 경우 둘 모두에서, TnpB 시스템은 식물 병원체 유래 표적 RNA 분자를 절단할 수 있는 것이 바람직하다.
일정 예의 구현예에서, 바이러스는 레트로바이러스일 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예를 사용하여 검출할 수 있는 레트로바이러스의 예는 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 엡실론레트로바이러스, 렌티바이러스, 스푸마바이러스의 바이러스 속, 또는 메타바이러스과, 슈도바이러스과, 및 레트로바이로스과 (HIV 포함), 헤파드나바이러스과 (B 형 간염 바이러스 바이러스 포함), 및 콜리모바이러스과 (콜리플라워 모자이크 바이러스 포함) 의 바이러스과 중 하나 이상 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
일정 예의 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스이다. 본 명세서에 개시된 구현예를 사용하여 검출할 수 있는 DNA 바이러스의 예는 그 중에서도, 미오바이러스과, 포도바이러스과, 시포바이러스과, 알로헤르페스바이러스과, 헤르페스바이러스과 (인간 헤르페스 바이러스 및 바리셀라 조스터 바이러스 포함), 말로코헤르페스바이러스과, 리포트릭스바이러스과, 루디바이러스과, 아데노바이러스과, 암풀라바이러스과, 아스코바이러스과, 아스파르바이러스과 (아프리카 돼지 열병 바이러스 포함), 배큘로바이러스과, 시카우다바이러스과, 클라바바이러스과, 코르티코바이러스과, 푸셀로바이러스과, 글로불로바이러스과, 굿타바이러스과, 히트로사바이러스과, 이리도바이러스과, 마르세이유바이러스과, 미미바이러스과, 누디바이러스과, 니마바이러스과, 판도라바이러스과, 파필로마바이러스과, 피코드나바이러스과, 플라스마바이러스과, 폴리드나바이러스, 폴리오마바이러스과 (시미언 바이러스 40, JC 바이러스, BK 바이러스 포함), 폭스바이러스과 (우두 및 천연두 포함), 스파에롤리포바이러스과, 텍티바이러스과, 투리바이러스과, 디노드나바이러스, 살터프로바이러스, 리지도바이러스의 바이러스과 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 포함한다. 일 구현예에서, 박테리아 감염을 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 종-특이적 박테리아 감염을 진단하는 방법은 대상체로부터 박테리아 리보솜 리보핵산을 포함하는 샘플을 수득하는 단계; 샘플을 기재된 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 단계, 및 샘플에 존재하는 박테리아 리보솜 리보핵산 서열과 프로브 간 하이브리드화를 검출하는 단계로서 설명되고, 여기서 하이브리드화의 검출은 대상체가 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 스타필로코커스 아갈락티아 (Staphylococcus agalactiae), 또는 스타필로코커스 말토필리아 (Staphylococcus maltophilia) 또는 이의 조합으로 감염된 것을 의미한다.
코로나바이러스
새기된 본 발명의 시스템 및 방법은 코로나바이러스를 검출하도록 디자인되고, 일 양태에서, 표적 서열은 2019-nCoV이고, 본 명세서에서 또한 SARS-CoV-2라고 하고, COVID-19를 유발한다. 코로나바이러스는 다양한 동물 및 인간을 감엿키기는 양성-센스 단일 가닥 RNA 패밀리의 바이러스이다. SARS-CoV는 MERS-CoV를 비롯하여, 코로나바이러스 감염의 한 유형이다. 우한시에서 검출된 SARS-CoV-2를 포함하여, 하나 이상의 코로나바이러스의 검출이 고려된다. sARS-CoV-2의 서열은 GISAID 등록번호 EPI_ISL_402124 및 EPI_ISL_402127-402130으로 입수가능하고, DOI: 10.1101/2020.01.22.914952에 기술된다. SARS-CoV2의 추가 기탁물은 GISAID 플랫폼에 기탁되어서 EP_ISL_402119-402121 및 EP_ISL 402123-402124를 포함하고, 또한 GenBank 등록번호 MN908947.3을 참조한다. 일 양태에서, 비-중복 정렬을 생성하기 위해서 하나 이상의 숙주로부터 기지의 SARS 및 SARS-관련 코로나바이러스또는 다른 바이러스를 사용할 수 있다. 관련 바이러스는 예를 들어 박쥐에서 발견될 수 있다.
일 구현예에서, 시스템은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 디자인되는 적어도 하나의 고도로 활성인 핵산 성분 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 디자인된다. 바람직한 구현예에서, 핵산 성분 폴리뉴클레오티드는 고유한 코로나바이러스 게놈 서열인 적어도 하나의 표적 서열에 결합하여서 다른 바이러스를 배제하고 코로나바이러스의 존재를 식별한다. 시스템 및 방법은 코로나바이러스를 포함하여, 다수의 호흡기 감염 또는 바이러스 감염을 검출하도록 디자인될 수 있다.
일 양태에서 적어도 하나의 핵산 성분 폴리뉴클레오티드는 숙주 면역계에 면역자극성인 폴리펩티드를 코딩하는 코로나바이러스 서열에 결합한다. 면역자극성 폴리펩티드는 전형적으로 면역계의 성분 (예를 들어, 면역 세포)의 활성 또는 활성화를 유도하여서, 면역계의 반응을 증강, 자극, 또는 증가시키는 능력을 갖는다. 구현예에서, 면역자극성 폴리펩티드는 숙주에서 면역-매개 질환의 원인이 된다. 일 양태에서, 숙주는 코로나바이러스에 의해 감염될 수 있는, 포유동물, 예를 들어, 인간, 박쥐, 또는 천산갑이다 (Cyranoski, D. Did pangolins spread the China coronavirus to people? Nature, 7 Feb, 2020). 일 구현예에서, 핵산 성분 폴리뉴클레오티드는 육류, 살아있는 동물 및 인간에서 SARS-CoV-2 또는 이의 변이체를 검 출하도록 디자인되어서 예를 들어 검사가 오염원이 발생될 수 있는 시장 및 공공 장소에서 수행될 수 있다.
유전자 표적은 ORF1ab, N 단백질, RNA-의존적 RNA 폴리머라제 (RdRP), E 단백질, ORF1b-nsp14, 스파이크 당단백질 (S), 또는 판코로나 표적을 포함할 수 있다. 분자 어세이는 개발 중에 있고 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템에 대한 핵산 성분 분자를 개발하는 출발점에서 사용될 수 있다 (참조: "Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR" Charite, Berlin Germany　(17 January 2020)' Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) in suspected human cases by RT-PCR - Hong Kong University (23 January 2020); PCR and sequencing protocol for 2019-nCoV - Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health, Thailand (updated 28 January 2020); PCR and sequencing protocols for 2019-nCoV- National Institute of Infectious Diseases Japan (24 January 2020); US CDC panel primer and probes- U.S. CDC, USAV - U.S. CDC, USA (28 January 2020); China CDC Primers and probes for detection 2019-nCoV (24 January 2020) (참조로 본 명세서에 편입됨). 또한, 핵산 성분 분자 디자인은 SARS-CoV와의 차이 또는 유사성을 활용할 수 있다. 연구자들은 최근에 2019-nCoV와 SARS-CoV 간 유사성 및 차이를 확인하였다 ("Coronavirus Genome Annotation Reveals Amino Acid Differences with Other SARS Viruses," genomeweb, February 10, 2020). 예를 들어, SARS-CoV에 존재하지만 SARS-CoV-2에 부재하는 8a 단백질을 기반으로 핵산 성분 분자를 이용하여 바이러스를 구별할 수 있다. 유사하게, 8b 및 3b 단백질은 SARS -CoV 및 sARS-CoV-2에서 상이한 길이를 갖고 2개 바이러스에서 코딩되는 뉴클레오티드의 비중복 단백질을 검출하기 위해 핵산 분자 성분을 디자인하는데 이용될 수 있다 (Wu et al., Composition and Divergence of the Novel Coronavirus (2019-nCoV) Originating in China, Cell Host & Microbe (2020), DOI: 10.1016/j.chom.2020.02.001; 모든 보충 정보, 특히 표 S1을 포함하여, 참조로 본 명세서에 편입됨). 돌연변이는 예를 들어, SARS-CoV-2 바이러스에서 변화를 특이적으로 검출하도록 디자인된 핵산 성분 및/또는 프라이머를 사용해 검출될 수 있다. 일 구현예에서, 핵산 성분 또는 프라이머는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에서 D614G 돌연변이를 검출하도록 디자인될 수 있다 (참조: Korber et al., Cell 182, 812-827 (2020); doi: 10.1016/j.cell.2020.06.043). 스파이크 단백질의 다른 돌연변이는 cov.lanl.gov에서 입수가능한 COVID-19 바이러스 게놈 분석 파이브라인을 이용해 디자인될 수 있다. 코로나바이러스 또는 코로나바이러스 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 및 핵산 성분을 디자인하기 위한 추가 소스를 하기 문헌에서 확인할 수 있다: Starr, et al, , "Deep Mutational Scanning of SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain Reveals Constraints in Folding and ACE2 Binding," Cell, 182, 1-16 (2020); doi: 10.1016/j.cell.2020.08.012.
시스템 및 검출 방법은 단일 뉴클레오티드 변이체의 확인, rRNA 서열 기반 검출, 약물 내성에 대한 스크리닝, 미생물 발발의 모니터링, 유전자 섭동, 환경 샘플의 스크리닝에 사용될 수 있고, 참조로 본 명세서에 편입되는 하기 문헌에 기술된 바와 같다: 2018년 10월 22일 출원된 PCT/US2018/054472의 [0183] - [0327].
일정 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 바이오마커 검출에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 SNP 검출 및/또는 유전자형 분석에 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 또한 이상 유전자 발현을 특징으로 하는 임의의 질환 상태 또는 장애의 검출에 사용될 수 있다. 이상 유전자 발현은 발현된 유전자, 발현의 위치 및 발현도에서의 이상성을 포함한다. 다른 질환 중에서도 심혈관, 면역 장애, 및 암과 관련된 다수의 전사물 또는 단백질 마커가 검출될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 구현예는 용해를 포함하여 질환의 무세포 DNA 검출에 사용될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 구현예는무세포 DNA 의 태아기 검사를 위한 보다 빠르고 보다 휴대가능한 검출에 이용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예는 특히 SARS-CoV2가 진화된 상이한 코로나바이러스, 및 다른 관련 호흡기 바이러스 감염과 연관된 상이한 SNP의 패널 스크리닝에 사용될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 밀접하게 관련된 유전자형/대립 유전자 또는 바이오마커 (예를 들어, 소정 표적 서열에 오직 단일 뉴클레오티드 편차를 가짐) 는 핵산 성분 분자에 합성 미스매치의 도입에 의해 구별될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위한 방법에 관한 것으로서, 하나 이상의 개별 이산 부피로 샘플 또는 샘플 세트를 분배하는 단계로서, 개별 이산 부피는 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 TnpB 시스템을 포함하는 것인 단계; 하나 이상의 표적 분자에 대한 하나 이상의 핵산 성분의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 샘플 또는 샘플 세트를 인큐베이션하는 단계; 하나 이상의 표적 분자에 대한 하나 이상의 핵산 성분 분자의 결합을 통해 TnpB 단백질을 활성화시키는 단계로서, TnpB 단백질의 활성화고 RNA-기반 차폐성 구성체의 변형이 일어나서 검출가능 양성 신호가 발생되는 것인 단계로서, 검출가능한 양성 신호의 검출은 샘플 중 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 단계를 포함한다.
본 명세서에 기술된 어세이의 민감도는 표적 핵산이 희석되거나 샘플 재료가 제한적인 샘플을 포함하여, 광범위하게 다양한 생물학적 샘플 중 표적 핵산의 검출에 충분히 적합하다. 현장 배치가능하고 신속한 진단 어세이를 위한 방법은 이용되는 동일 물질의 유형에 대해 최적화될 수 있고 당분야에 공지된 다른 어세이에 사용되는 접근법으로부터 적합화될 수 있다 (참조: 예를 들어, Myhrvold et al., 2018). 바이오마커 스크리닝은 제한없이, 타액, 소변, 혈액, 대변, 객담, 및 뇌척수 유체를 포함하는, 수많은 샘플 유형에 대해 수행될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 실시형태는 또한 유전자의 상향조절 및/또는 하향조절을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 샘플은 오직 과발현된 유전자만 어세이의 검출 한계값 이상으로 남도록 연속 희석될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 생물학적 유체 (예를 들어, 소변, 혈액 혈청 또는 혈청, 객담, 뇌척수 유체) 의 샘플을 수득하는 단계, 및 DNA 또는 RNA를 추출하는 단계를 제공한다. 검출하려는 돌연변이체 뉴클레오티드 서열은 거대 분자의 분획일 수 있거나, 또는 초기에 별개 분자로서 존재할 수 있다.
구현예에서, DNA 는 암 환자의 혈장/혈청으로부터 단리된다. 비교를 위해서, DNA 샘플은 신생물 조직으로부터 단리되고 제 2 샘플은 동일 환자 유래 비신생물성 조직 (대조군), 예를 들어 림프구로부터 단리될 수 있다. 비신생물성 조직은 상이한 장기 출처로부터 유래될 수 있거나 또는 신생물성 조직과 동일한 유형일 수 있다. 일 구현예에서, 혈액 샘플을 채혈하고 혈장은 원심분리를 통해서 혈액 세포로부터 즉시 분리시킨다. 혈청은 여과될 수 있고, DNA/RNA 추출 전에 동결 저장될 수 있다.
일 양태에서, 샘플 제조는 다른 RNA 추출 방법을 우회하기 위해 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법을 포함할 수 있고,표준 증폭 기술 예컨대 RT-PCR을 비롯하여 본 명세서에 개시된 TnpB 검출 방법과 사용될 수 있다. 일 양태에서, 방법은 일 양태에서, RT-qPCR 검사 방법, 측류 검출 방법 또는 다른 본 명세서에 개시된 TnpB 검출 방법일 수 있는, 코로나바이러스에 대해 검사되는 샘플과 사용될 수 있는 1-단계 무추출 RNA 제조를 포함할 수 있다. 유리하게, RNA 추출 방법은 다른 검사 프로토콜과 직접적으로 이용될 수 있다. 일 양태에서, 방법은 Quick ExtractTM DNA 추출 용액 (QE09050), Lucigen, 또는 QuickExtract Plant DNA 추출 용액, Lucigen과 비인두 면봉, 비강 염수 세척액, 또는 다른 비강 샘플 (예를 들어, 전비강 면봉)의 사용을 포함한다. 일 양태에서, 샘플은 2:1, 1:1 또는 1:2 샘플:DNA 추출 용액으로 희석된다. 샘플:추출 믹스는 약 90℃ 내지 약 98℃, 바람직하게 약 95℃에서 인큐베이션된다. 다른 양태에서, 인큐베이션은 약 20℃와 약 90℃ 사이, 약 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 86, 87, 88, 89 또는 90℃에서 수행된다. 인큐베이션 기간은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30분, 바람직하게 약 4 내지 6분, 또는 약 5분일 수 있다. 인큐베이션 시간 및 온도는 샘플 크기 및 품질에 따라 다양할 수 있고, 인큐베이션 시간은 더 낮은 온도를 사용하면 증가될 수 있다. 현재 CDC 실시간 RT-PCR 진단 패널은 하기에 기술된다: fda.gov/media/134922/download, "CDC 2019-Novel Coronavierus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel". 일 구현예에서, DNA 추출 용액은 인큐베이션 이후에 샘플 내에 잔존할 수 있고 검출 방법을 위해 다음 단계에서 이용될 수 있다. 일 양태에서, 검출 방법은 RT-qPCR 반응이고 추출 용액은 반응 혼합물의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 미만의 농도로 유지되고, 반응 혼합물은 검출 반응 시약, 샘플 및 추출 용액을 포함한다.
일 구현예에서, 비드는 본 발명의 특정 구현예와 이용될 수 있고 추출 용액에 포함될 수 있다. 비드는 특정 물질에 대한 포획, 농축 또는 달리 농후화에 사용될 수 있다. 비드는 자성일 수 있고, 핵산 물질을 포획하도록 제공될 수 있다. 다른 양태에서, 비드는 실리카 비드이다. 비드는 본 명세서에 개시된 방법의 추출 단계에서 이용될 수 있다. 비드는 임의로 큰 부피 샘플, 예컨대 타액 도는 면봉 로부터 바이러스 핵산의 농축을 허용하여 단일 1-포트 반응 방법이 가능한 1-포트 방법을 포함하여, 본 명세서에 기술된 방법과 사용될 수 있다. 원하는 표적 분자의 농도는 약 10-배, 50-배, 100-배, 200-배, 500-배, 800-배, 1000-배, 1500-배, 2000-배, 2500-배, 3000-배 이상까지 증가될 수 있다.
PEG 및 염 용액 중 자성 비드는 일 양태에서 바람직하고, 일 구현예에서 농축 및 용해를 동시에 허용하는 바이러스 RNA 및/또는 DNA에 결합한다. 실리카 비드는 다른 양태에서 사용될 수 있다. 포획 모이어티 예컨대 올리고뉴클레오티드 작용화된 비드가 사용이 고려된다. 비드는 추출 시약과 사용되어서 샘플 및 용해/추출 완충액과 인큐베이션되어서, 비드 상에 표적 분자를 농축시킨다. 추출은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 22℃-60℃에서 수행되고, 이후에 등온 증폭 및/또는 TnpB 검출은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 조건 하에서 수행된다. 본 명세서의 다른 곳에 상술된 카트리지 장치와 사용될 때, 자석은 활성화되고 비드가 수집되며, 추출 완충액의 선택적 세척 및 하나 이상의 세척이 수행될 수 있다. 유리하게, 비드는 비드의 추가 세척없이, 다단계 과정에서 오염의 증가된 위험성없이 보다 효율적인 과정을 허용하는, 1-포트 방법 및 시스템에서 사용될 수 있다. 비드는 본 명세서에 상술되는 등온 증폭과 이용될 수 있고, 비드는 증폭 단계를 위해 포트에 유지되거나 또는 카트리지의 증폭 챔버로 흘러 갈 수 있다. 가열 시 핵산이 비드로부터 방출될 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 표적 핵산은 미가공 또는 미처리된 샘플, 예컨대 혈청, 혈청, 타액, 뇌척수액, 객담, 또는 소변으로부터 직접 검출된다. 일정 예의 구현예에서, 표적 핵산은 세포 무함유 DNA이다.
키트
일 양태에서, 본 발명은 상기 방법 및 조성물에서 개시되는 임의의 하나 이상의 구성요소를 함유하는 키트를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 하나 이상의 성분을 포함하는 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 키트는 본 명세서의 조성물 및 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 일 구현예에서, 키트는 벡터 시스템 및 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 일 구현예에서, 키트는 전달 시스템 및 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 일 구현예에서, 키트는 벡터 시스템 및 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 구성요소는 개별적으로 또는 조합하여 제공될 수 있고, 임의의 적합한 용기, 예컨대 바이알, 병, 또는 튜브에 제공될 수 있다. 키트는 핵산 성분 및 임의로 본 명세서에 기술된 바와 같은 미결합된 보호자 가닥을 포함할 수 있다. 키트는 핵산 성분 서열의 재프로그램 가능한 스페이서 부분에 적어도 부분적으로 결합하는 보호자 가닥을 갖는 핵산 성분을 포함할 수 있다 (즉, p핵산 성분). 따라서, 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같이 부분적으로 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 형태인 p핵산 성분을 포함한다. 일 구현예에서, 키트는 하나 이상의 언어, 예를 들어, 하나 초과의 언어의 설명서를 포함한다. 설명서는 본 명세서에 기술된 적용 및 방법에 특이적일 수 있다.
일 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 구성요소를 이용하는 방법에서 사용을 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 시약은 임의 적합한 용기에 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 반응 또는 저장 완충액을 제공할 수 있다. 시약은 사용 전에 하나 이상의 다른 성분의 첨가를 요구하는 형태, 또는 특정 어세이에서 사용가능한 형태로 제공될 수 있다 (예를 들어, 농축물 또는 동결건조 형태). 완충제는 소듐 카보네이트 완충제, 소듐 바이카보네이트 완충제, 보레이트 완충제, Tris 완충제, MOPS 완충제, HEPES 완충제, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의 완충액일 수 있다. 일 구현예에서, 완충제는 알칼리성이다. 일 구현예에서, 완충제는 약 7 내지 약 10의 pH를 갖는다. 일 구현예에서, 키트는 핵산 성분 서열 및 조절 구성요소를 작동적으로 연결하기 위해서, 벡터에 삽입을 위한 재프로그램 가능한 서열, 핵산 성분 스캐폴드에 상응하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일 구현예에서, 키트는 상동성 재조합 주형 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 벡터 및/또는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 키트는 유리하게 본 발명의 시스템의 모든 구성요소를 제공하도록 한다.
실시예
실시예 1 -
출원인은 TnpB의 진짜 RNA를 추론하기 위해서 IscB ITR과 반전 말단 반복부 (ITR)를 공유한 TnpB를 검토하였다. 특히, 크테도노박터 라세미페르의 TnpB는 ITRS를 크테도노박터 라세미페르 IscB와 공유한다. 도 2는 케이. 라세미페르의 TnpB와 유사성을 포함하는 예시적인 TnpB의 정렬을 제공한다. 중요한 것은, 단백질의 전형적인 말단으로 보이는 것 이상으로 존재하는 높은 보존성 영역이 존재한다는 것이다 (도 2). 이러한 보존 영역은 ITR 및 또한 발현된 RNA의 가능한 존재를 표시한다. 이러한 영역이 RNA를 표시한다는 사실의 뒷받침은 TnpB 유전자좌의 3' 말단이 훨씬 약한 보존성을 갖는다는 것으로서 (도 3), 3' 말단이 RNA로서 발현되지 않는다는 것을 시사한다. TnpB와 IscB 간 ITR의 유사성은 IscB의 5' ITR (도 5)에 상동성인 TnpB의 5' ITR (도 4)을 포함할 수 있다.
TnpB 및 IscB의 5' ITR은 서열 수준에서 유사하고, IscB 유전자좌와 유사성을 기반으로, 유전자좌에 대한 TnpB 가이드 배향은 일관적이다. IscB에서, 가이드는 유전자좌의 5'으로, 가이드 + (hRNA 보존 영역) 발현된 RNA를 생성한다. 이것은 TnpB의 5' ITR로부터 바로 상류 영역이 또한 가이드로서 제공된다는 것을 시사한다. 보존된 RNA 영역의 바로 3'인 코딩 서열의 말단의 위치를 기반으로, 보존된 RNA 영역은 CDS로부터 런오프 전사로서 발현될 수 있어서, 이것은 ITR을 지나 쉽게 흐를 수 있고 유전자좌의 일부가 아닌 주변 영역의 일부 (가이드 영역)을 포함한다는 것을 시사한다. 이것은 이들 시스템에 대한 RNA 종이 많은 V형 CRISPR이 취하는 DR + 스페이서 구성과 유사한 (TnpB RNA 보존 영역) + 가이드라는 것을 시사한다.
케이. 라세미페르 유래의 존재하는 RNA seq 데이터를 사용하여서, 실제로 제안된 RNA는 RNA의 나머지에 대해서 예약된 50-60 bp를 갖는 15 bp 가이드의 증거로 표현된다 (도 6). 이것은 발현이 3' -> 5'임을 시사하는데 RNA가 아래 가닥을 반영함을 의미한다. IscB가 반전 말단 반복부 (5' ITR로부터 바로 상류)에 대해서 동일 위치에 유사하게 가이드를 갖는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제이지만, TnpB 기반 트랜스포존의 DNA 트랜스포존에 대한 이펙터 단백질의 배양은 IscB의 것과 반대이다. IscB 유전자좌의 배향은 5' ITR/hRNA(중복), IscB (5' 가닥), 및 마지막으로 3' ITR이다. IscB와 ITR을 공유하는 TnpB 경우에, 5'ITR/RNA (3' 가닥 상에 RNA), TnpB (3' 가닥), 및 마지막으로 3' ITR이다. TnpB의 RuvC 도메인과 함께 이러한 작업은 TnpB 시스템이 RNA 가이드된 DNA 엔도뉴클레아제로 작용한다는 것을 뒷받침하고, 가이드는 5' 말단으로부터 바로 상류에서 발현되는 RNA이다. 5' ITR 및 3'ITR을 포함하여, 케이. 라세미페르 유래의 예시적인 TnpB 유전자좌의 주석달린 서열 (도 7).
출원인은 2개 기능성 TnpB 오솔로그, 악티노플라네스 로바투스 균주 DSM 43150 및 엡실론프로테오박테리아 박테리움 단리주 B11을 확인하였다. 출원인은 도 8의 실험 접근법을 사용하여 이들 기능성 TnpB 오솔로그에 대한 TAM 요건을 조사하였다. 실험을 기반으로, 악티노플라네스 로바투스 균주 DSM 43150 및 엡실론프로테오박테리아 박테리움 단리주 B11에 대한 TAM는 도 9에서 확인되는데, TCAG는 악티노플라네스 로바투스 균주 DSM 43150에 대한 TAM으로서 확인되었고, TCAT는 엡실론프로테오박테리아 박테리움 단리주 B11에 대해 확인되었다.
실시예 2 - 플라스미드 절단 어세이
TnpB 단백질 및 ωRNA는 올바른 동족 표적 및 TAM 서열 (도 10의 예시적인 TCAT)을 함유하는 하나 및 올바르지 않은 TAM을 갖거나 또는 표적을 전혀 함유하지 않는 하나로서, 2개 플라스미드와 시험관내 전사/번역 반응물에 혼합된다. 절단이 일어나면, 어댑터가 결찰될 수 있고 증폭 및 차세대 시퀀싱에 사용될 수 있다. 플라스미드가 절단되지 않으면, 어댑터는 결찰되지 않고 생산물이 증폭되지 않는다. 서열의 확인은 절단이 일어난 것을 의미한다. 출원인은 +TAM/+표적 플라스미드에서만 일어나는 것으로 관찰하였고, 따라서 절단은 오직 이들 기질에서만 발생된다는 결론내렸다.
실시예 3- 오솔로그 5의 TnpB Rd1 요약
RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)은 IscB ncRNA와 서열 유사성을 갖는 비-코딩 RNA (ncRNA)와 연관된 것으로 보이는 TnpB-Rd1의 10개 오솔로그의 선택물에 대해 수행되었다. RNA-seq의 결과는 TnpB가 ncRNA와 연관된 것을 검증하였다. 173 뉴클레오티드 (nt) 스캐폴드는 102 nt 까지 절두될 수 있고 TnpB 활성을 유지한다는 것을 관찰하였다 (도 11A). 분석은 Fn 스페이서 영역에 대해서 30 bp 가이드를 갖는 모든 포획된 TAM에 대한 농후화를 사용해 오솔로그 TnpBRd1_5_Fn30_TAM을 사용하여 수행되었고 (도 11B), Fn에 대해 동일한 30 bp 가이드를 사용하여 TAM의 15% 고갈 (도 11C) 및 644PSP1 스페이서에 대해 30 bp 가이드를 사용하여 TAM의 농후화 (포획된 TAM의 상위 10%에 대함; 도 11D)가 있었다. 이러한 결과는 TnpB 활성이 재프로그램가능하고 가이드 특이적임을 보여주었는데, 다시 말해서, TAM 농후화가 비-표적화 가이드에서 관찰되지 않았고, TnpB 활성은 닉형성과 일관적이지 않았는데 NEB 닉카제는 닉형성 부위로 유도되지 않고 가이드 길이는 15-30 nt의 가이드 길이는 허용되기 때문이다.
실시예 4 - 오솔로그 1 및 4의 TnpB Rd1 검증.
TXTL 전달 어세이를 사용한 Rd1 오솔로그 1 및 4의 검증은 에이. 로바투스 TnpB-1 및 에이. 셀룰로실리티카 TnpB에서 압타머-결찰된 판독의 TAM-특이적 절단의 플라스미드 기질을 사용해 수행되었다 (도 12A). 각 조건에 대해서, 동일한 농도에서 2개의 별개 플라스미드가 상이한 기질의 직접 비교에 사용되었다 (도 12A). 어댑터 결찰의 부위는 증폭 생산물에서 차세대 시퀀싱을 사용해 결정되었고 TAM 스크린과 검증 간에 일관적인 것으로 보였다 (결과는 오솔로그 4 기반). 비-표적 (NT) 및 표적 (T) 가닥의 8N TAM 라이브러리 플라스미드 (도 12B, 상단 그래프)를 사용한 어댑터 결찰의 위치는 어댑터 결찰의 부위가 각 가닥에 대해서 약간 상이하다는 것을 보여준다. 단일 TAM 플라스미드가 비-표적 (NT) 가닥과 사용될 때 (도 12, 하단 막대 그래프), 어댑터 결찰의 부위는 TAM 라이브러리가 사용될 때 비-표적 (NT) 가닥과 유사하다.
실시예 5 - 5' TAM을 갖는 TnpB 오솔로그의 확인.
오솔로그는 IscB ncRNA와 서열 유사성을 보유하는 비-코딩 RNA (ncRNA)를 함유한 다양한 박테리아 유래 Tnp 오솔로그의 실험적 특징규명을 기반으로 선택되었다. 오솔로그는 악티노마두라 셀루올로실리티카 균주 DSM 45823, 악티노마두라 나미비엔시스 균주 DSM 44197, 악티노마두라 셀룰로실리티카 균주 DSM 45823 유래 2개 TnpB, 악티노마두라 나미비엔시스 균주 DSM 44197, 악티노플라누스 로바투스 균주 DSM 43150, 알리시클로바실러스 마크로스포라기이두스 (Alicyclobacillus macrosporagiidus) 균주 DSM 17980, 리핑장겔라 할로필라 균주 DSM 102030, 할로악티노스포라 알바 (Haloactinospora alba) 균주 DSM 45015, 엡실론박테리아 박테리움 (Epsilonbacteria bacterium), 크테도노박터 라세미페르, 메이써무스 실바나 (Meiothermus Silvana) 균주 DSM 9946 및 QNF01000004_Extraction_(reversed)로부터 유래되었다.
오솔로그에서 TAM을 결정하기 위해서, 2개 방법이 사용되었다 (도 13A-13B). 첫번째는 재프로그램가능한 pTarget (예를 들어, Fn) 및 ωRNA 스캐폴드 및 재표적화를 위한 가이드를 발현하는 T7와 함께 작동적으로-연결된 T7 프로모터로부터 TnpB 발현으로 이루어졌다. 온전한 pTarget은 어떠한 TAM이 절단을 허용하였는가를 결정하기 위해 시퀀싱되었다 (도 13A). 제2 방법은 시험관내 전사 및 번역을 포함하였다. TAM-특이적 pTarget 절단에 이어서 어댑터 결찰, 절단 특이적 증폭 및 최종적으로 농후화된 TMA의 시퀀싱이 후속되었다. 5' TAM의 확인은 절단된 서열에서만 허용되었다 (도 13A). 10개 오솔로그 중 7개의 확인된 TAM이 확인되었고 각각 서열 TTCAN을 갖는다 (도 13B).
실시예 6 - 2개 TnpB 오솔로그에 대한 TAM의 검증.
악티노플라네스 로바투스 균주 DSM 43150 (TnpB-2) 및 악티노마두라 셀루올로실리티카 균주 DSM 45823으로부터의 2개 TnpB 오솔로그의 검증은 TnpB 단백질의 존재 (+단백질) 또는 부재 (-단백질) 하에서 어댑터-결찰된 판독치를 사용해 수행되었다 (도 14). 결과는 양쪽 오솔로그에서 표적 플라스미드의 절단이 TnpB-단백질 의존적이고 표적 및 TAM 둘 모두의 존재를 필요로 한다는 것을 보여주었다 (도 14).
실시예 7 - TnpB-2 DNA 절단.
출우너인은 표적 및 비-표적 가닥 둘 모두에서 에이. 로바투스 TnpB-2 절단을 결정하였다 (도 15A). 일부 Cas12 단백질과 유사하게, TnpB는 가이드 어닐링 부위 내 및 그 이상에 다수 위치에서 절단되는 것을 관찰하였다 (도 15B).
실시예 8 - 에이. 로바투스 TnpB와 연관된 ncRNA의 특징규명.
에이. 로바투스 TnpB-2 ORF는 대략 200 bp의 하류 영역을 포함하여 이. 콜라에서 발현되었다. 하류 영역은 173 nt 스캐폴드 (reRNA) 및 RNA 가이드 서열을 함유하는 것으로 확인되었다 (도 16A). 201 nt에서 102 nt로 일련의 절두를 야기한 조작된 스캐폴드 서열은 가이드 및 dsDNA의 존재 하에서 TAM-특이적 농후화를 유지하였다 (도 16B).
실시예 9 - 케이. 라세미페르 TnpB와 연관된 ncRNA의 특징규명
케이. 라세미페르 TnpB 의 바로 하류에 위치된 영역은 ncRNA 및 가이드 서열을 코딩하는 것으로 보인다 (도 17).
실시예 10 - IS200/IS605 구성요소는 다양한 RNA-가이드된 뉴클레아제를 코딩한다
출원인은 일반적으로, IS200/605 트랜스포존이 RNA-가이드된 이펙터를 보유하는지 여부를 결정하고자 하였다. IS200/IS605 트랜스포존는 보다 일반적으로, 별개 단백질 패밀리이고, IsrB와 유사하게, 유일한 엔도뉴클레아제 도메인으로서 RuvC 도메인을 함유하고, Cas12s의 조상, V형 CRISPR 이펙터로서 여겨지는 TnpB를 코딩한다 (도 18A). TnpB 패밀리는 IscB 패밀리에서 비해서 훨씬 더 다양하고; HMMER 검색은 공공으로 입수가능한 원핵생물 게놈에서 1백만개 초과의 TnpB 유전자좌를 확인하였다. 서열 보존 분석은 많은 TnpB의 CDS 바로 하류에 보존된 비-코딩 영역을 밝혀주어서, 가이드 RNA로 작용될 수 있는 연관된 ncRNA의 존재를 시사한다 (도 20). 이전 작업은 또한 고세균 및 박테리아에서 tnpB 유전자의 3'-유전자와 중복된 ncRNA를 확인하였지만, 이들 ncRNA의 기능은 특징규명되지 않았다. 케이. 라세미페르의 소형 RNA-seq는 ωRNA의 별개 클래스로서 분류된 연관된 tnpB ORF (도 18B)의 3' 말단과 중복된 ncRNA의 천연 발현을 입증하였다. 케이. 라세미페르 TnpB ωRNA 3' 말단의 역 상보성은 각 유전자좌에서 예측된 트랜스포존 말단에 상응하는 영역인, 일부 케이. 라세미페르 IscB에세서 ωRNA의 5' 과 거의 동일하였다 (도 18C). tnpB 유전자를 함유하는 비-중복 유전자좌의 분석은 IS200/605 트랜스포존 말단에 상응하는 유전자좌의 3' 말단에서 보존성의 급격한 하락을 보였다 (도 20). 소형 RNA-seq 추적과 비교는 보존성 하락 이상의 발현을 밝혀주어서, 전사물 내 가이드 서열의 가능한 존재를 의미한다 (도 18D). 이러한 가능성을 조사하기 위해서, 출원인은 ORF가 중복되는 예측된 ωRNA의 존재 하에서 이들 TnpB 중 하나 (악티노프라네스 로바투스 유래)를 재조합 발현 및 정제하였다. 공-정제된 RNA의 소형 RNA-seq는 에이. 로바투스의 추정 가이드 영역을 함유하는 예측된 ωRNA가 TnpB 단백질과 상호작용한다는 것을 보여주었다 (도 21A). 재프로그램된 가이드를 사용하여 이러한 클러스터로부터 다수의 TnpB 단백질의 시험관내 플라스미드 절단 어세이는 5' TAM으로 RNA-가이드된 절단을 입증하였다 (도 18E). 절단-특이적 어댑터 결찰 및 TAM-함유 표적화 플라스미드의 시퀀싱은 TnpB의 재프로그램가능한 RNA-가이드된 dsDNA 엔도뉴클레아제 활성을 확인해 주었다 (도 18F). 에이. 로바투스 TnpB-2, 에이. 마크로스포란기두스 TnpB 및 엡실로박테리아 박테리움 단리주 B11_G4 TnpB TAM을 포함한 추가적인 TnpB 유전자좌의 TAM 스크린을 수행하였다 (도 21B). SpCas9를 사용한 플라스미드 경쟁 어세이 양성 대조군. SpCas9는 절단-특이적 어댑터 결찰 생산물의 존재로 확인되는 바와 같이 오직 TAM 및 표적-함유 플라스미드만을 절단하였다. 통계적 유의성은 양측 T-검정을 사용하여 + 단백질 대 - 단백질 조건에서 열거된 제2 플라스미드의 어댑터-결찰된 판독치의 평균에 대해 정규화된 각 조건에서 열거된 제1 플라스미드의 어댑터-결찰 판독치의 수를 비교하여 평가되었다 (도 21C).
특이적 가이드 로딩 시스템 예컨대 오메가 (OMEGA) 및 CRISPR 시스템 및 비-특이적 가이드 로딩 시스템 예컨대 아르고노트/RNAi 시스템을 포함하는 RNA-가이드된 시스템의 예는 도 19에 도시된다.
재료 및 방법
프로파일 엄선
IscB에 대한 초기 프로파일은 출발 씨드 서열로부터 최대 20000 표적 서열까지 8회 반복하여 NR 데이터베이스 상에서 NCBI의 PSI-BLAST를 사용해 엄선되었다. 강력한 필터링 매개변수 (1e-5의 예상 한계값 및 1e-6의 PSI-BLAST)는 HNH 도메인, 예컨대 제한 효소 또는 호밍 엔도뉴클레아제를 또한 함유하는 미관련 단백질의 축적을 감소시키도록 선택되었다. 260 aa 보다 작은 모든 단백질이 폐기되었다. 나머지 단백질은 MAFFT FFT-NS-1을 사용해 정렬되었고, 부분 단백질을 비롯하여서 HNH에 대한 빈약한 정렬 커버리지를 갖는 단백질도 폐기되었다. 필터링된 세트는 70%의 최소 커버리지로 70% 서열 동일성에서 MMSeqs2 를 사용해 클러스터링되었다. 각 클러스터에 대한 MMSeqs2 대표는 MAFFT-einsi 를 사용해 정렬되었다. 최종 정렬은 각 영역에 대한 뚜렷한 HHAlign 프로파일을 생성시키기 위해 다수의 도메인 (NTD, RuvC-I, RuvC-II, HNH, 및 RuvC-III)으로 더 분할되었다. HMMER 프로파일 경우, RuvC-I, BH, 및 RuvC-II는 거짓 양성을 감소시키기 위해 단일 프로파일로 조합되었다.
TnpA에서 광범위한 다양성 덕분에, PSI-BLAST 검색은 20000 초과의 상동성 서열을 생성시켰다. TnpA 가 단일한 연속적인 촉매 도메인으로 이루어졌기 때문에, HHblits 가 대신에 사용되어서 1e-3의 E-값 컷오프, 80%의 최소 히트 확률 및 UniRef30_2020_06 데이터베이스에서 8회 반복을 사용해 더 많은 비-중복 상동체를 확인하였다. 최종 단백질은 MAFFT-einsi 를 사용해 정렬되었고, 부분 단백질을 제거하였다
IscB, IsrB, 및 IshA의 확인
모든 원핵생물 게놈은 명시적인 허가된 JGI 프로젝트를 비롯하여, NCBI, 및 NCBI WGS에서 다운로드하였다. 모든 contig 상의 ORF는 80 aa의 최소 크기로 예측되었고, 대안적인 출발 코돈 GTG 및 TTG를 허용하였다. 기존 단백질 주석과 동일한 중지 위치 및 가닥 (+/-)를 공유하는 ORF는 기존 주석을 위해 폐기되었다. 모든 ORF는 이후 18의 최소 비트 점수로 HMMER 및 6 IscB 프로파일을 사용해 검색되었다. 임의의 6 도메인에 대한 히트를 갖는 임의의 ORF/단백질은 관심 단백질 (POI)로서 간주되었고 추가 분석을 위해 유지되었다. 중복 감소를 위해서, 모든 단백질은 85% 커버리지로 90% 서열 동일성에서 MMSeqs2를 사용해 클러스터링되었다. contig 가장자리의 200 bp 내 출발 또는 종료 부위를 갖는 단백질은 부분적인 것으로 간주되었다. 각각의 90% 클러스터 내에서, 길이의 80번째 백분위수에 비해서 작은 단백질은 폐기되었다. 나머지 단백질 중에서, X (모호) 아미노산을 함유하는 단백질은 그들 제거가 서열의 빈 세트를 생성시키지 않으면 폐기하였다. 나머지 단백질 중에서, 대표적인 서열은 계통 분석을 기반으로 단백질의 출발 또는 종료 부위로부터 IscB-IsrB-Cas9 RuvC/BH 및 RuvC/BH/HNH 도메인까지 최소 거리의 최대를 갖는 서열로 선택되었다.
IscB 도메인-기반 검색에서 확인된 Cas9 는 RuvC 기반 트리로부터 단계통 분기를 나타냈지만, 모든 Cas9가 이 검색에서 확인된 것은 아니었다. 분석에 포함된 Cas9s의 공간을 확장하기 위해서, Koonin lab의 Cas9 프로파일, TIGRFAM, 및 CRISPRDisco로부터의 Cas9 단백질의 MAFFT 정렬로 만든 프로파일을 사용하여서 500 aa의 단백질 길이 및 25의 최소 비트 점수를 갖는 HMMER을 사용하여 초기 IscB 도메인-기반 검색에서 발견되지 않은 추가 Cas9 단백질을 확인하였다. IscB 도메인 검색으로부터의 Cas9 단백질은 Cas9 검색으로부터의 Cas9 단백질과 조합하였고 중복제거하였다. Cas9 ORF 출발 부위는 GLIMMER(8)을 사용해 개량되었다. Cas9 단백질의 수퍼 세트는 85% 커버리지와 90% 서열 동일성으로 클러스터링하였고 IscB 검색과 동일한 방식으로 중복을 감소시켰다. 비중복 Cas9 단백질의 수퍼세트는 50% 서열 동일성 및 60% 커버리지에서 재클러스터링하였다. 50% 서열 동일성의 선택은 핵심 영역 (RuvC, BH, 및 HNH)에서 대략 100 aa 더 느리게 진화하는 IscB 및 Cas9 사이의 보존된 영역 크기의 차이를 반영한다. 400 aa 단백질에 대한 65% 최소 서열 동일성의 클러스터링 기준은 대략 100 aa에 걸쳐서 동일한 보존된 도메인을 갖는 더 큰 1000 aa Cas9에 대해서 65%-100/400+100/1000=50% 서열 동일성으로 기능적으로 유사하다. Cas9 클러스터는 계통발생 분석을 위해 IscB 클러스터와 풀링되었다.
상기 필터링 기준으로부터 수득된 IscB, IsrB 및 Cas9 는 MAFFT-x2 (2회 반복) 및 BLOSUM62 채점 (언급하지 않으면 디폴트)을 사용하여 정렬되었다. Cas9의 RuvC-I 및 BH 영역은 이들 분기 단백질 패밀리의 상이한 도메인 아키텍처 및 크기로 인해서 IscB 및 IsrB의 RuvC-I 및 BH 영역과 정렬되지 않았다. RuvC-I 및 BH 는 수동으로 그룹화하고 MAFFT-x2를 사용해 재정렬되었다. 정렬의 RuvC-I 도메인 영역에서 불충분한 커버리지의 서열은 IscB-RuvC-I 또는 Cas9-RuvC-I 프로파일에 대한 그들 HHAlign 점수가 21 미만이면 제거되었다. RuvC-I 및 BH에 대한 HHAlign 히트를 함유하는 Cas9-유사 및 IscB-유사 서열 둘 모두를 갖는 소형 단백질은 전형적으로 그들 하이브리드 속성으로 인해서 모든 다른 단백질에 대해서 전형적으로 RuvC-I 및 BH와 올바른 정렬을 갖지 않았다. 이러한 단백질 경우에, N 말단 및 RuvC-II 사이의 모든 아미노산은 정렬을 위해서 RuvC-I 및 BH 로서 함께 그룹화되었다. 다음으로 RuvC-I 및 BH 영역은 MAFFT-linsi를 사용해 재정렬되었다. HNH 도메인으로부터 IsrB 정렬된 컬럼은 RuvC-II 컬럼 그룹으로 옮겼다. RuvC-II, RuvC-III, HNH, 및 NTD 도메인은 MAFFT-linsi 를 사용해 순차적으로 정렬되었다. BH 도메인 및 RuvC-II 사이의 초과 영역은 EC-유사 삽입의 확인을 위해서 MAFFT-einsi 및 BLOSUM30 을 사용해 정렬되었다. 임의의 RuvC 또는 BH 도메인에 대해 정렬이 없거나 또는 불량한 서열은 제거되었다. 다음으로 최종 정렬은 계통발생 분석에 대해 사용되었다.
모든 3개 유형의 단백질에 공통이 아닌 모든 도메인, 즉, NTD, REC1, REC2, PI 도메인, 및 IscB/IsrB C-말단 도메인은 정렬로부터 제거하여서, RuvC-I, BH, RuvC-II, 및 RuvC-III 도메인의 고도로 보존된 부분만을 함유하는 정돈된 정렬을 남겨서, IscB, IsrB, 및 Cas9를 함유하는 RuvC/BH 정렬을 생성시켰다. 다른 정렬은 RuvC/BH/HNH 정렬이라고 불리는, 오직 IscB 및 Cas9에 대해 오직 RuvC-I, BH, RuvC-II, HNH, 및 RuvC-III 도메인만을 함유하는 것이 생성되었다. 이들 양쪽 정렬 경우에, 죽은 대표적인 서열을 갖는 클러스터 (돌연변이된 핵심 촉매 부위를 갖는 서열)는 제거되었다. 특히, 필터링된 위치는 RuvC-I 보존된 D RuvC-II 보존된 E, HNH 보존된 H (적용가능할 때), 및 RuvC-III 보존된 D 및 H이다. IQ Tree 2에서 구현된 대칭 검사를 사용하여서 정렬에 대한 잠재적인 계통 발생 위반을 확인하였다 (도 S#74fu2). RuvC/BH/HNH 정렬은 전형적인 계통발생 분석에서 사용되는 3개 주요 가정 (가역성, 정상성, 균질성)의 정상성 가정에 대한 유의한 위반을 나타냈다. 정렬이 IQ-Tree 2에서 헤테로타키 모델의 사용에 대해 너무 많은 분류군을 함유하므로, 정상성 위반의 출처를 확인하기 위해 차감 접근법을 사용한다. 예비 분석은 II-B Cas9의 주요 단분기군이 ≥1의 분기 길이를 갖는 Cas9의 나머지로부터 일관적으로 분할된다는 것을 보여주어서, 트리를 따라서 이의 정확한 배치가 어려울 수 있다는 것을 시사한다. 주변 대칭 검정 p-값으로 결정하여 실질적으로 정상성 위반을 감소시키는, RuvC/BH/HNH 정렬로부터의 II-B Cas9의 주요 단분기군을 제거하였다 (도 S#74fu2). 출원인은 또한 임의의 정상성 위반을 완전하게 제거하는, Cas9 진화의 초기 단계로부터의 IscB 및 Cas9로만 이루어지는 다른 정렬을 생성시켰다. 각 정렬 경우에, 치환 모델 선택은 IQ Tree 2에서 구현되는 모델 찾기 도구를 사용해 수행되었다. 최적 모델은 작은 샘플 크기에 대해 보정된 Akaike 정보 기준 (AICc)을 사용해 선택되었다. 대부분의 경우에, AICc 최상 모델은 BIC (Bayesian Information Criterion) 또는 AIC (standard Akaike Information Criterion)와 상이하였고, 일부 분석은 양쪽 모델 세트에 대해 실행되었지만, AICc 는 일반적으로 작은 샘플 크기 보정때문에 바람직하였다. 다음으로, 각 정렬 경우에, 계통발생 트리는 교차 비교를 위해 다수의 방법을 사용해 구축되었다 (IQ Tree 2, RAxML, MrBayes). FastTree2가 계통발생 정보의 신속한 가시화를 위해 사용되었지만, 이러한 방법을 사용해 수득된 우도 점수는 IQ Tree 2, RAxML, 또는 MrBayes의 것에 비해서 실질적으로 더 악화되었다. 그 결과로, FastTree2 는 종합 교차 비교에 사용되지 않았다.
주오 텍스트 계통발생 도면 경우에, 하이브리드 트리 접근법은 계통발생 정확도를 유지하면서 Cas9에 관한 정보를 압축하기 위해 사용되었다. 이러한 접근법을 위해서, Cas9 클러스터의 서브샘플이 IscB 및 IsrB의 완전한 세트 이외에도, 정렬로부터 선택되었다. 최종 하위-정렬은 동일한 매개변수와 IQ-Tree 2를 사용하여 계통발생 추론에 사용되었다. 하위-정렬에 존재하는 잠재적으로 왜곡된 Cas9 관련 정보덕분에, Cas9 계통의 배치는 본래 정렬로부터 추론된 트리로부터 추론되었다. 이것은 하위 정렬 트리로부터 Cas9 분기를 분리하고 더 작은 분리 분기를 갖는 본래 트리 상에서 본래 Cas9 분기를 대체하여서 수행되었다. 이식에 선택된 분기는Cas9_849 및 모든 다른 Cas9 사이에서 분기되었는데, 이러한 영역이 양쪽 트리 사이에서 동일한 토폴로지를 공유하였기 때문이다. Cas9 아형 진화의 순서는 Cas9 단백질의 실질적인 다운샘플링 이후에 호환성을 보장하기 위해서 각 트리 사이에서 일관성에 대해 검토되었다.
IscB/IsrB ωRNA 발굴, 엄선, 및 분석
IscB 도메인 검색 결과만을 사용하여, 적어도 17 비트 점수를 갖는 임의의 RuvC-I, RuvC-II, 또는 RuvC-III에 대해 적어도 3개 단백질 및 적어도 2HHAlign 히트를 갖는 클러스터로부터의 모든 대표를 수집하였다. 모든 IscB 및 IsrB 단백질에 대한 상류 (출발 코돈의 -300 bp 내지 +200 bp), 및 하류 (중지 코돈의 -200 bp 내지 +300 bp)의 모든 영역은 별개로 MAFFT-einsi를 사용해 정렬되었다. 상류 정렬은IscB/IsrB의 전형적인 CDS 경계 밖의 큰 보존된 영역을 입증하였다. 하류 정렬은 임의의 대형 보존 영역을 함유하지 않았고 추가 분석을 위해 폐기되었다. 보존된 상류 영역의 개별 서열은 ViennaRNA RNAFold를 사용해 폴딩되었다 (9). 정렬의 서열은 정렬에서 핵심 별개 영역에 대한 보존성을 기반으로 별도 그룹으로 분할되었다. 주요 그룹은 G1a 로 표지되었고 많은 수의 IscB ωRNA를 포괄한다. R-scape 를 사용하여서 계통발생 상관성에 대해 올바른 공분산-폴딩된 RNA 구조를 추론하였다. 모든 프로파일에 대해 사용되는 R-scape 매개변수는 1e-2의 E-값 한계치 및 0.75의 갭 한계치였다. Infernal의 CMbuild를 사용하여서 RNA 정렬을 최적화하였고 공변량 모델 (CM)을 구축하였다. R2R 은 최종 RNA 구조를 가시화하는데 사용되었다. IscB/IsrB ωRNA에 대한 추가 정렬 그룹 (G1b, G1c,...)은 현존 ωRNA 그룹과 강력하게 연관되지 않은 RuvC 트리의 IscB/IsrB의 분기군으로부터 보존된 상류 영역 (ORF에 대함)을 기반으로 반복적으로 생성되었다. 이들 그룹에 대한 모델은 ViennaRNA를 사용해 확인된 공통 2차 구조가 샘플 크기가 너무 작아서 정확한 공변량-폴딩된 구조를 허용하지 못할 때 R-scape 구조 대신에 사용된 것을 제외하고, 동일한 방식으로 구축되었다. 슈도노트는 Infernal에 대한 공변량 모델에서 명시적으로 코딩되지 않았다. CRISPR-연관된 IscB와 연관된 하이브리드 CRISPR/ωRNA에 대한 구조는 소형 샘플 크기로 인해서 공변량-폴딩된 구조 대신에 공통 2차 구조를 사용해, 동일한 방식으로 추론되었다.
클러스터 주석
모든 10kb 게놈 프레임 (관심 단백질 (POI) 주변 10 kb 영역)을 수집하였다. CRISPR 서열은 CRT를 사용해 확인되었다. TnpA는 HMMER을 사용해 PIO의 10 kb 이내에 모든 ORF에 대해 예측되었다. 모든 ωRNA 프로파일은 Infernal-1.1의 공변량 기반 핵산 hmm 검색, cmsearch을 사용해 게놈 DNA 상에서 예측되었다. 35 이하의 점수를 갖는 RNA 프로파일 히트는 폐기하였다. 각 게놈 프레임 경우에, 모든 RNA 프로파일 히트는 중복 세트로 그룹화되었고, 세트의 각각의 ωRNA 히트는 세트의 적어도 하나의 다른 ωRNA와 게놈적으로 중복된다. 각각의 중복 그룹은 그룹에서 최고 비트점수를 갖는 ωRNA 히트에 할당되었다. GraphLAN은 상이한 계통발생 트리 상에서 최종 정보를 시각화하는데 사용되었다.
IscB/IsrB ωRNA에 대한 가이드 코딩 기전의 확인
IscB 및 IsrB에 따른 모든 주요 ωRNA 유형의 완전한 분류 및 엄선 시에, 케이. 라세미페르의 게놈은 이전에 기술된 프로파일과 HMMER을 사용하여 IscB 및 IsrB의 모든 예에 대해 검색되었다. 게놈은 G1a-G1i RNA 공변량 모델과 CMsearch를 사용하여 IscB/IsrB ωRNA의 모든 예에 대해 검색되었다. 거의 동일한 ωRNA와 연 관된 다수의 거의 동일한 IscB의 존재는 BLASTn에서 확인되었고, 트랜스포존 확장으로서 분류되었다. 동일 가닥 상에서 500 bp 내에 검출가능한 IscB 또는 IsrB없는 ωRNA의 존재는 독립형 트랜스-작용성 ωRNA로 분류되었다. 일부 예에서, ωRNA 및 상응하는 IscB/IsrB는 그들 사이에 미관련 트랜스포존의 삽입에 의해 분리될 수 있다. 이러한 경우에, ωRNA는 트랜스-작용성 ωRNA로 간주되지 않는다.
모든 공변량 모델은 우리의 원핵생물 게놈 데이터베이스에서 검색되었다. 300 bp 내 동일 가닥 상에서 다수의 ωRNA의 예는 추가 분석을 위해 보유하였고 ωRNA 어레이로서 분류되었다.
원핵생물 IscB 오솔로그의 확인
모든 진핵생물 게놈은 NCBI에서 다운받았다. 모든 가능한 IscB를 포착하기 위해서, 기존 유전자 모델은 이 분석을 위해 폐기하였다. 모든 DNA 서열은 6 프레임 아미노산 번역으로 번역되었고, 중지 코돈 (*)으로 분할하여서 ORF로 분할하였다. 다음으로 각각의 ORF 는 IscB 프로파일 엄선 단계를 통해 생성된 HMMER 프로파일을 사용하여 IscB 도메인에 대해 검색되었다. IscB HNH 및 RuvC 도메인 둘 모두에 대해 히트를 갖는 ORF가 추가 분석을 위해 보유되었다. 다음으로 ORF 주변 영역은 이 연구에서 생성된 IscB-연결 ωRNA 공변량 모델 및 CMsearch를 사용하여 IscB-연결 ωRNA에 대해 검색되었다.
IshB의 발굴
PLMP, RuvC-I, BH, RuvC-II, HNH, 및 RuvC-III 도메인의 모든 가능한 도메인 조합의 파워세트가 생성되었다. 각각의 도메인 조합 경우에, 21의 최소 비트 점수를 갖는 조합에서 모든 도메인에 대한 히트를 갖는 IscB 도메인으로부터의 클러스터의 개수를 계산하였다. 조합 내에서 높은 수준의 단백질 상동성을 나타내는 도메인 조합이 추가 분석을 위해 보유되었다. IscB, Cas9, 또는 IsrB의 N-말단 또는 C-말단 절두인 도메인 조합은 폐기되었다. 나머지 조합으로부터, PLMP + HNH은 다른 도메인 조합, 예컨대 RuvC-II + PLMP 단독에 대해서 높은 클러스터 계수를 나타내었고, 조합이 실제 단백질 패밀리에 상응한다는 것을 시사한다. 이들 단백질은 이후에 IscB 및 IsrB에 존재하는 PLMP 도메인을 또한 함유하면서, HNH 도메인의 존재 덕분에 IshB라고 명명되었다.
ωRNA의 TnpB 엄선 및 분석
케이. 라세미페르로부터의 IscB-연결된 ωRNA의 예는 BLASTn을 사용하여 케이. 라세미페르 게놈에서 검색되었다. IscB 또는 IsrB 부근의 히트는 폐기하였다. 다수의 부분 히트가 TnpB 부근에서 발견되었고, 히트는 항상 TnpB 유전자의 하류였다. 이들 히트의 탐색은 다수의 TnpB가 IscB와 트랜스포존 말단을 공유한다는 것을 밝혀주었다. 상류 및 하류 유전자좌 보존성 분석이 IscB에 대해 수행된 바와 같이 관련 TnpB 유전자좌에 대해 수행되었다. TnpB 는 매우 다양하므로, mmseqs2 검색에서 높은 유사성을 통해서 확인가능 TnpB 만이 포함되었다.
소형 RNA 시퀀싱
이. 콜라이에서 이종성 발현
Stbl3 화학적으로 적격한 이. 콜라이는 관심 유전자좌를 함유하는 플라스미드로 형질전환되었다. 단일 콜로니를 사용하여서 5 mL 밤샘 배양에 파종되었다. 밤샘 성장 후에, 배양물을 스핀 다운하였고, 750 ㎕ TRI 시약 (Zymo)에 재현탁하고 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 0.5 mm 지르코니아/실리카 비드 (BioSpec Products)를 첨가하였고 배양물을 대략 1분 동안 와류시켜서 세포를 기계적으로 용해시켰다. 200 ㎕ 클로로포름 (Sigma Aldrich)을 첨가하였고, 배양물은 조심스럽게 혼합을 위해 반전시켰으며, 실온에서 3분 동안 인큐베이션한 다음에, 12000xg로 4℃에서 15분 동안 스핀다운하였다. 수성층을 Direct-zol RNA miniprep plus kit (Zymo)를 사용한 RNA 추출용 투입물로서 사용하였다. 추출된 RNA는 10 유닛의 DNase I (NEB)로 30분 동안 37℃에서 처리하여서 잔류 DNA를 제거하였고, 다시 RNA Clean & Concentrator-25 kit (Zymo)로 정제하였다. 리보솜 RNA는 절반 부피 반응물을 사용하여 제조사 프로토콜에 따라서 박테리아용 RiboMinus Transcriptome Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용해 제거하였다. 정제된 샘플은 20 유닛의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (NEB)로 6시간 동안 37℃에서 처리되었고, RNA Clean & Concentrator-25 (Zymo) kit로 다시 정제되었다. 정제된 RNA는 20 유닛의 5' RNA 폴리포스파타제 (Lucigen)로 30분 동안 37℃에서 처리되었고, 다시 RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo)를 사용해 정제되었다. 정제된 RNA는 최종 PCR에서 60초의 연장 시간 및 16 사이클로 제조사 프로토콜에 따라서 Illumina 용 NEBNext Small RNA Library Prep(NEB)에 투입물로서 사용되었다. 증폭된 라이브러리는 겔 추출되었고, Illumina 용 KAPA Library Quantification Kit (Roche)를 사용해 StepOne Plus 기계 (Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific)에서 qPCR을 통해 정량되었고, 판독 1의 42 사이클, 판독 2의 46 사이클 및 인덱스 1의 6사이클로 Illumina NextSeq에서 시퀀싱되었다. 어댑터는 CutAdapt를 사용하여 다듬고 Bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml)를 사용하여 관심 유전자좌로 맵핑되었다. 채워진 판독치를 수득하고 200 bp 초과의 채워진 판독치는 맞춤형 Python script를 사용해 가시화시켰다.
리보뉴클레오단백질
RNP 는 기술된 대로 정제되었다. 100 ㎕ 농축된 RNP 가 투입물로서 사용되었다. 상기 프로토콜을 하기 변형에 따랐다: 300 ㎕ TRI 시약 (Zymo) 및 60 ㎕ 클로로포름 (Sigma Aldrich)이 RNA 추출에 사용되었다.
케이. 라세미페르
냉동-건조된 케이. 라세미페르 SOSP1-21 DSM 44963은 DSMZ (dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/DSM-44963)로부터 수득하였고, GYM 스트렙토마이세스 배지 (1 L 물 중 4 g 글루코스, 10 g 맥아 추출물, 4 g 효모 추출물)에 재현탁하고 진탕 인큐베이터에서 28℃에서 성장시켰다. 76일 이후에, 배양물을 스핀 다운하였고, 하기 변형에 따라 상기 프로토콜을 후속하였다: 지르코니아 비드를 사용한 기계적 용해가 대략 30분의 와류와 함께 수행되었다. 리보솜 RNA는 제조사 프로토콜에 따라서 NEBNext rRNA Depletion Kit (박테리아) (NEB)를 사용해 제거되었고, rRNA-고갈 샘플은 T4 PNK 처리 전에 Agencourt RNAClean XP 비드 (Beckman Coulter)를 사용해 정제되었다. T4 PNK 처리는 1.5시간 동안 수행되었고, RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo)로 정제되었다. 소량 RNA 라이브러리 프렙에서 최종 PCR은 5 사이클을 함유하였다.
TAM 라이브러리 클로닝
8N 축퇴성 측접 서열을 갖는 표적 서열은 IDT를 통해 합성되었고 NEBNext High Fidelity 2X 마스터 믹스 (NEB)를 사용한 PCR을 통해서 증폭되었다. 골격 플라스미드는 제한효소 (pACYC: EcoRV; pUC19: Eco88I 및 HindIII, Thermo Fisher Scientific)로 분해되었고 FastAP 알칼리 포스파타제 (Thermo Fisher Scientific)로 처리되었다. 증폭된 라이브러리 단편은 삽입부:벡터의 8:1 몰 비율로 2X Gibson Assembly Master Mix (NEB)를 사용해 1시간 동안 50℃에서 깁슨 조립을 통해 골격 플라스미드에 삽입되었다. 다음으로 깁슨 조립 반응은 동일 부피의 이소프로판올 (Sigma Aldrich), 50 mM NaCl의 최종 농도, 및 1 ㎕의 GlycoBlue 핵산 공침전제 (Thermo Fisher Scientific)를 첨가하여 이소프로판올 침전시켰다. 실온에서 15분 인큐베이션 후에, 용액을 최대 속도로 4℃에서 15분 동안 스핀 다운하였고, 상청액을 피펫팅 해 버리고 펠렛화된 DNA 는 12 ㎕ TE에 재현탁하였고 50℃ 에서 10분 동안 인큐베이션하여서 용해시켰다. 다음으로 2 ㎕ 는 제조사 설명서에 따라서 Endura 전기적격 이. 콜라이 (Lucigen)에 전기천공을 통해 형질전환시켰고, 37℃에서 1시간 동안 진탕하여 회수한 다음에, 적절한 항생제 내성이 존재하는 5 22.7cm x 22.7cm BioAssay 플레이트에 도말하였다. 37℃에서 12-16시간 성장 후에, 세포를 플레이트로부터 스크래핑하였고 NucleoBond Midi- 또는 Maxi-prep kit (Machery Nagel)를 사용해 미디- 또는 맥시-프렙하였다.
이. 콜라이 TAM 스크린
관심 유전자좌 및 표적 8N 축퇴성 측접 라이브러리 플라스미드를 함유하는 100 ng의 각각의 플라스미드를 제조사의 프로토콜에 따라서 관심 유전좌 당 3개 복제물을 비롯하여 빈 대조군의 3개 복제물로, 30 ㎕ Endura 전기적격 이. 콜라이 (Lucigen)에 전기천공하여 형질전환시켰다. 37℃에서 1시간 동안 진탕으로 회수한 후에, 세포를 적절한 항생제 내성이 존재하는 1 22.7cm x 22.7 cm BioAssay 플레이트에 도말하였고, 12-16시간 동안 37℃에서 성장시켰다. 세포를 플레이트로부터 스크래핑하였고 충분히 혼합하였고, 2 mL의 스크래핑된 세포를 미니프렙 (Qiagen)의 투입물로서 사용하였다. 100 ng의 미니프렙한 플라스미드를 PCR에 투입하여서 NEBNext High Fidelity 2X PCR 마스터 믹스 (NEB)를 사용하여 12-사이클 PCR로 TAM-함유 영역을 증폭시켰는데, 63℃의 어닐링 온도에 이어서, 제2 18-사이클의 PCR 라운드를 후속하여서 Illumina 어댑터 및 바코드를 더 첨가하였다. 증폭된 라이브러리를 겔 추출하였고, Qubit dsDNA HS 어세이 (Thermo Fisher Scientific)로 정량하고 판독 1 75 사이클, 인덱스 1 8 사이클 및 인덱스 2 8 사이클로 Illumina NextSeq에서 단일-말단 시퀀싱을 수행하였다. TAM를 추출하였고 고갈된 TAM을 도시하는 웹로고는 맞춤형 Python script를 사용해 가시화하였다.
시험관내 절단 어세이
이중 가닥 DNA (dsDNA) 기질은 표적 부위 및 TAM 서열을 함유하는 pUC19 플라스미드의 PCR 증폭을 통해 생산하였다. Cy3 및 Cy5-접합된 DNA 올리고뉴클레오티드 (IDT)는 프라이머로서 사용되어서 표지된 dsDNA 기질을 생성시켰다. 단일 가닥 DNA (ssDNA) 기질은 Cy5.5-접합된 올리고뉴클레오티드 (IDT)로서 주문하였다. 생화학 어세이에서 사용된 모든 ωRNA는 Twist Biosciences에서 구매한 DNA 주형으로부터 HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit (New England Biolabs)를 사용해 시험관내에서 전사되었다. 표적 절단 어세이는 20 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 및 5 mM MgCl2의 최종 1X 반응 완충액 중 10 nM의 DNA 기질, 1 μM의 단백질, 및 4 μM의 ωRNA를 함유하는 AwaIscB 로 수행되었다. 어세이는 37℃에서 1시간 동안 진행되도록 한 다음에, 5분 동안 50℃로 옮겼고, RNA 분해 전에 RNA 구조를 완화시키는데 도움이 되도록 바로 얼음 상에 배치하였다. 다음으로 반응물은 RNAse A (Qiagen), 및 프로테이나제 K (New England Biolabs)로 처리하였고, PCR cleanup kit (Qiagen)를 사용해 정제하였다. DNA는 Novex 10% TBE (dsDNA 기질), 6% TBE-우레아(dsDNA 기질), 및 15% TBE-우레아 (ssDNA 기질) 폴리아크릴아미드 겔 (Thermo Fisher Scientific) 상에서 겔 전기영동으로 분해하였다. 450 nM RNP는 단백질 및 ωRNA로 대체하고, 반응물을 1.5시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 것을 제외하고, CRISPR-연관된 IscB RNP로 수행되는 표적 절단 어세이는 유사하게 수행하였다. 세정된 반응물을 4% 아가로스 E-겔 (Thermo Fisher Scientific) 상에서 러닝하였다.
AwaIscB 활성의 동역학적 분석을 위해서, 절단 반응물은 클린업 전에 각 시점에 11 mM의 EDTA로 켄칭하였다. 금속 스크리닝을 위해서, MgCl2 는 반응 완충액으로부터 제거하였고, 한편 2 mM의 EDTA, 및 7 mM의 표시된 금속은 첨가하였다. 부차적 절단 어세이는 10 nM의 Cy5.5-표지된 부차적 ssDNA 기질과 함께 10 nM의 미표지된 ds/ssDNA 기질을 사용해 수행하였고, 반응은 3시간 동안 37℃에서 진행되도록 허용하였다. 표지된 비표적화 ssDNA의 절단은 15% TBE-우레아 폴리아크릴아미드 겔 상에서 평가되었다.
단일 가닥 RNA (ssRNA) 기질은 시험관내에서 전사하였고 그들 3' 말단에서 pCp- Cy5 (Jena Bioscience)로 표지되었다. 3' 말단 표지화를 위해서, 50 pmol의 ssRNA 는 50 mM Tris pH 7.8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 및 10% DMSO 중 100 pmol의 pCp-Cy5 및 50 U의 T4 RNA 리가제 1 (New England Biolabs)과 4℃에서 40시간 동안 인큐베이션되었다. 표지화 반응은 20 mM EDTA로 켄칭하였고 RNA Clean 및 Concentrator kit (Zymo)를 사용해 정제되었다. ssRNA 절단 어세이는 DNA 절단 어세이와 유사하게 수행되었고, 반응의 종료 시에 19 mM EDTA로 켄칭하고, 프로테이나제 K로 처리하였으며, 6% TBE-우레아 폴리아크릴아미드 겔 상에서 가시화하였다.
세포-무함유 전사/번역/TAM 스크린
IscB 단백질 서열은 GenScript 코돈 최적화 도구를 사용해 인간 코돈 최적화하였고, IscB 유전자, 내생성 코돈 최적화된 TnpB 유전자 및 ωRNA 스캐폴드는 Twist Biosciences를 통해 합성되었다. 전사/번역 주형은 맞춤형 합성 생산물로부터 PCR을 통해 생성되었다. 세포-무함유 전사/번역반응은 75 ng의 관심 단백질에 대한 주형, 125 ng의 TAM 라이브러리를 표적화하는 가이드와 상응하는 ωRNA에 대한 주형, 및 25 ng의 TAM 라이브러리 플라스미드를 사용하여, 절반 부피 반응물과 제조사 프로토콜에 따라서 PURExpress 시험관내 단백질 합성 키트 (NEB)를 사용해 수행하였다. 반응은 37℃에서 4시간 동안 수행된 다음에, 4℃ 또는 얼음에 놓고 켄칭시키고 10 ㎍ RNAse A (Qiagen) 및 8 유닛 프로테이나제 K (NEB)를 첨가하고 각각 37℃에서 5분 인큐베이션하였다. DNA는 PCR 정제로 추출하였고 어댑터는 제조사 프로토콜에 따라서 Illumina (NEB)용 NEBNext 어댑터를 사용하여 Illumina (NEB)용 NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit를 사용해 결찰시켰다. 어댑터 결찰 후에, 절단된 생산물은 TAM 라이브러리 골격에 특이적인 한 프라이머 및 NEBNext 어댑터에 특이적인 한 프라이머를 사용하고 NEBNext High Fidelity 2X PCR 마스터 믹스 (NEB)를 사용한 12-사이클 PCR로 특이적으로 증폭되었는데, 63℃의 어닐링 온도에 이어서, 제2의 18 사이클 PCR 라운드를 후속하여서 Illumina i5 어댑터를 더 첨가하였다. 증폭된 라이브러리를 겔 추출하였고, StepOne Plus 기계 (Applied Biosystmes/Thermo Fisher Scientific) 상에서 Illumina (Roche)용 KAPA Library Quantification Kit를 사용한 qPCR을 통해 정량하였고 판독 1의 80 사이클, 인덱스 1의 8 사이클 및 인덱스 2의 8 사이클로 Illumina MiSeq 상에서 단일-말단 시퀀싱을 수행하였다. TAM을 추출하였고 각 TAM에 대한 농축 점수는 하나 초과로 존재하는 모든 TAM을 필터링하여 계산하였고 동일한 시험관내 전사/번역 및 켄칭 반응이 수행된 투입 라이브러리에서의 TAM 빈도에 대해 정규화되었다. 농축 점수를 기반으로 하는 위치 가중치 매트릭스를 생성시켰고 웹로고는 맞춤형 Python script를 사용해 이러한 위치 가중치 매트릭스를 기반으로 가시화하였다
KraIscB-1 RNP 복합체의 발현 및 정제
이의 천연 유전자좌의 ncRNA와 복합체로 KraIscB-1의 정제는 하기 변형으로 CRISPR-연관 IscB-ncRNA RNP 복합체에 대해 유사하게 수행하였다: (1) KraIscB-1 CDS는 변화되지 않았고 인간 코돈 최적화되었다; (2) ncRNA와 공발현은 BL21(DE3) 세포 (New England Biolabs)에서 100 마이크로그램/ml 암피실린, 및 25 마이크로그램/ml 카나마이신의 존재 하에서 수행되었다; (3) bdSENP1 프로테아제는 KraIscB-1 단백질이 N-말단 태그에 부착되지 않았지만, 이의 C-말단에 오직 twin-strep 태그화만되었으므로 사용되지 않았다. 공정제된 RNA가 소형 RNA 시퀀싱에 의해 정의되면, 예측된 ωRNA 서열은 유도성 발현을 위한 pCOLADuet-1 벡터의 T7 프로모터 하류에 클로닝되었고, KraIscB-1-ωRNA 복합체는 동일한 절차에 따라 제조되었다.
세포-무함유 전사/번역 절단 어세이
ωRNA 주형은 기술된 대로 맞춤형 합성 제품으로부터 증폭되었고, 2 ㎕ 중 150 ng DNA 주형과 2 ㎕ T7 RNA 폴리머라제 믹스 (NEB) 및 6.67 mM 최종 농도의 각 NTP를 30 ㎕ 반응물로 하여서 HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEB)를 사용해 시험관내에서 전사하였고 RNA Clean & Concentrator-25 kit (Zymo)로 정제하였다. 단백질 서열은 맞춤형 합성 또는 유전자좌 플라스미드 주형으로부터 증폭되었다. 표적을 생성시키기 위해서, 적절한 오버행을 갖는 TAM 서열 및 표적을 함유하는 짧은 올리고를 Genewiz에서 합성하였고 Golden Gate 또는 제한-결찰 클로닝을 통해서 상응하는 골격 플라스미드에 클로닝하였다. 표지된 선형 표적을 생성시키기 위해 표지된 프라이머는 IDT에 의해 합성되었고, 선형 표적은 제조사 프로토콜에 따라 Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix (NEB)을 사용한 PCR을 통해서 표적 플라스미드로부터 증폭되었다.
세포-무함유 전사/세포-무함유 전사/번역 반응은 관심 단백질에 대한 75 ng의 주형 및 1 μM의 최종 농도의 시험관내 전사된 ωRNA를 사용하여 절반 부피 반응물을 사용해 제조사 프로토콜에 다라서 PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit (NEB)를 사용해 수행되었다. 반응물은 37℃에서 4시간 동안 인튜베이션된 다음에 시험관내 전사/번역을 켄칭하기 위해 얼음에 두었다. 50-100 ng의 표적 기질을 첨가하였고 반응물을 명시된 온도에서 추가 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물은 10 ug RNAse A (Qiagen) 및 8유닛 프로테이나제 K (NEB)를 첨가하여 켄칭하였고 각각은 37℃에서 5분 인큐베이션하였다. DNA 는 PCR 정제를 통해 추출하였고 명시된 대로, 제조사 프로토콜에 따라서 10% 또는 6% Novex TBE-우레아 겔, 또는 10% Novex TBE 겔 (Thermo Fisher Scientific)에서 러닝하였다. 겔은 명시된 경우에 10-15분 동안 1X SYBR Gold (Thermo Fisher Scientific)로 염색하였고 최적 노출 설정으로 ChemiDoc imager (BioRad) 상에서 가시화하였다.
포유동물 세포 배양 및 형 질감염
포유동물 세포 배양 실험은 1X 페니실린-스트렙토마이신 (Thermo Fisher), 10 mM HEPES (Thermo Fisher), 및 10% 태아 소 혈청 (VWR Seradigm)이 추가로 보충된, 고 글루코스, 소듐 피루베이트, 및 GlutaMAX (Thermo Fisher)의 둘베코 변형 이클 배지에서 성장된 HEK293FT 세포주 (American Type Culture Collection (ATCC))에서 수행되었다. 모든 세포는 80% 이하의 합류로 유지하였다.
모든 형질감염은 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher)로 수행되었다. 세포는 형질감염 시점에 90% 합류를 보장하기 위해 형질감염 전에 16-20시간에 도말하였다. 96-웰 플레이트 경우에, 세포는 20,000 세포/웰로 도말되었고, 24-웰 플레이트 경우 세포는 100,000 세포/웰로 도말되었다. 플레이트 상의 각 웰 경우에, 형질감염 플라스미드는 총 25 ㎕ 까지 OptiMEM I Reduced Serum Medium (Thermo Fisher)와 배합되었다. 별도로, 23 ㎕의 OptiMEM 은 2 ㎕의 Lipofectamine 2000과 배합되었다. 플라스미드 및 리포펙타민 용액을 이어서 배합하였고 세포 상에 피펫팅하였다.
포유동물 용해물 절단 어세이
인간 코돈-최적화된 IscB 유전자는 2X Gibson Assembly 마스터 믹스 (NEB)를 사용한 깁슨 조립을 통해서 CMV 발현 골격에 클로닝되어서, pCMV-SV40 NLS-IscB 단백질-뉴클레오플라스민 NLS-3xHA 구성체를 생성시켰다. 500 ng의 각각의 단백질 발현 플라스미드는 기술된 대로 24-웰 플레이트의 개별 웰에서 형질감염되었다. 대략 48시간 후에, 세포는 500 ㎕의 둘베코 포스페이트 완충 염수 (Sigma Aldrich)로 세척하였다. 550 ㎕ 빙냉 용해 완충액 (20 mM HEPES 7.5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.1% Triton-X 100, 5% 글리세롤, 1 mM DTT, 1X cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일)을 첨가한 다음에, 세포를 플레이트로부터 스크래핑하고, 깨끗한 튜브로 옮기고 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로 세포는 냉수조에서 진폭 30으로 각각 10초의 4 사이클 동안 초음파처리되었다. 용해물은 최대 속도로 20분 동안 원심분리를 통해서 청징화되었고, 상청액을 수집하였고, 어세이에서 신선하게 사용하거나 또는 후속 사용을 위해 액체 질소에서 급송 냉동시켰다. 표지된 표적 및 시험관내 전사된 ωRNA는 상기 "세포-무함유 전사/번역 절단 어세이"에 기술된 대로 생성되었다.
ωRNA 주형은 기술된 대로 맞춤형 합성 생산물로부터 증폭되었고 HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEB)와 2 ㎕ 중 150 ng DNA 주형, 2 ㎕ T7 RNA 폴리머라제 믹스 (NEB)와 6.67 mM 최종 농도로 각각의 NTP를 30 ㎕의 총 부피 반응물로서, 사용하여 시험관내 전사하였고, RNA Clean & Concentrator-25 kit (Zymo)로 정제하였다. 절단 어세이를 수행하기 위해서, 10 ㎕ 세포 용해물은 1 ㎍의 시험관내 전사된 ωRNA 또는 sgRNA, 또는 음성 대조군용의 무 RNA, 및 1X NEBuffer 3.1 (NEB) 중 100 ng 표적 기질과 인큐베이션되었다. 반응물은 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션된 다음에, 10 ug RNAse A (Qiagen) 및 8 유닛의 프로테이나제 K (NEB)를 첨가하여 켄칭시켰으며, 각각 37℃에서 5분 인큐베이션하였다. DNA 는 PCR 정제를 통해 추출하였고, 제조사 설명서에 따라서 4% 아가로스 E-겔 EX (Thermo Fisher Scientific) 상에서 러닝하였고, ChemiDoc imager (BioRad) 상에서 가시화하였다.
절단 생산물의 시퀀싱
시험관내 절단 어세이는 기술된 대로 수행하였다. 정제된 반응에 대해서 근위 어댑터 어닐링 단계에 투입물로서 2.5 μM 어댑터를 사용하여 기술된 바와 같이 GLOE-seq 라이브러리 제조 프로토콜 (15)을 수행하였다. Illumina 어댑터 및 바코드를 첨가하기 위한 최종 증폭은 63℃의 어닐링 온도에서 15초 및 12 사이클로 EBNext High Fidelity 2x PCR 마스터 믹스 (NEB)를 사용해 수행되었다. 라이브러리는 판독 1의 150 사이클, 판독 2의 150 사이클, 인덱스 1의 8 사이클 및 인덱스 2의 8 사이클로 Illumina MiSeq를 사용해 쌍형성-말단 시퀀싱이 수행되었다. 쌍형성-말단 판독치는 BWA를 사용해 표적 기질에 대해 맵핑되었고, 3' 말단을 추출하였고 맞춤형 Python script를 사용해 그래프화하였다.
효소 풋프린팅 어세이
dsDNA 기질 (191 bp)은 표적 부위 및 TAM 서열을 함유하는 플라스미드로부터 PCR 증폭을 통해 생산되었다. 10 pmol의 dAwaIscB 및 40 pmol의 ωRNA는 반응 완충액 (20 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 및 5% 글리세롤)에서 37℃에 30분 동안 인큐베이션되었다. 다음으로, 0.1 pmol의 DNA 기질을 첨가하였고 반응은 추가 30분 동안 37℃에서 진행되게 하였다. 다음으로, 500 U의 엑소뉴클레아제 III (New England Biolabs)이 첨가되었고, 어세이는 추가 10분 동안 37℃에서 인큐베이션되었고, 20 mM EDTA로 켄칭하였다. 음성 대조군으로서, 다른 반응물을 동시에 실행하였는데, ωRNA를 배제하였고 부피는 물로 대체하였다. 켄칭 후에, 양쪽 반응물을 잠시 50℃로 5분 동안 이동시킨 다음에 즉시 얼음에 위치시켰고, RNAse A (Qiagen), 및 프로테이나제 K (New England Biolabs)로 처리하였고, PCR cleanup kit (Qiagen)를 사용해 정제하였다. 정제된 반응물에 대해서 근위 및 원위 어댑터 어닐링 단계 둘 모두에 대한 투입물로서 2.5 μM 어댑터를 사용하여 기술된 대로 GLOE-seq 라이브러리 제조 프로토콜이 수행되었다 (Sriramachandran, A.et al.(2020), Mol. Cell.78, 975- 985.e7). 라이브러리는 "재료 및 방법"의 "절단 생산물의 시퀀싱"에 기술된 대로 증폭하였고 판독 1의 100 사이클, 판독 2의 100 사이클, 인덱스 1의 8 사이클 및 인덱스 2의 8 사이클로 Illumina MiSeq를 사용해 쌍형성-말단 시퀀싱을 수행하였다. 쌍형성-말단 판독치는 BWA를 사용해 표적 기질에 대해 맵핑되었고, 3' 말단을 추출하였고 맞춤형 Python script를 사용해 그래프화하였다.
포유동물 게놈 편집
ωRNA 스캐폴드 골격은 깁슨 조립을 통해서 pUC19-기반 인간 U6 발현 골격 에 글로닝되었다. 풀링된 12-가이드 라이브러리 경우에, 소정 풀 내 12 가이드의 각각을 첨가하기 위해 프라이머를 등몰 비율로 혼합하였고 ωRNA 스캐폴드 골격에 대해서 U6 프로모터에 어닐링된 가이드 프라이머 및 ωRNA 스캐폴드의 출발부에 어닐링되는 제2 프라이머와 Phusion Flash High-Fidelity 2X Master Mix (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 전체 플라스미드 증폭을 수행하였다. PCR 생산물은 겔 추출하였고, 30 ㎕로 용리한 다음에, 5 유닛 T4 PNK (NEB), 200 유닛 T4 DNA 리가제 (NEB) 및 최종 1X T4 DNA 리가제 완충액 (NEB)의 첨가 및 Stbl3 화학적 적격 이.콜라이 (NEB)에서 형질전환 전 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션을 통해서 블런트-말단을 결찰시켜서 고리화하였다. 개별 가이드 구성체 경우에, 적절한 오버행을 갖는 올리고는 Genewiz에서 합성하였고, 어닐링하였으며, T4 PNK (NEB)를 사용해 인산화하고, 제한-결찰 클로닝을 통해서 ωRNA 골격에 클로닝었다. 단백질 발현 구성체는 상기 "포유동물 용해물 절단 어세이"에 기술된 대로 클로닝하였다.
개별 가이드 서열 경우에, 250 ng 가이드/ωRNA 발현 플라스미드 및 125 ng 단백질 발현 플라스미드는 기술된 대로 각 가이드 조건에 대해 96웰 플레이트의 각각 4개 웰에서 형질감염되었다. 60-72시간 후에, 게놈 DNA는 1xDPBS (Sigma Aldrich)에서 1회 세포를 세척하고, 50 ㎕ QuickExtract DNA Extraction Solution (Lucigen)을 첨가하여서 수확하였다. 세포를 플레이트로부터 스크래핑하여서 QuickExtract에 현탁하였고, 65℃에서 15분, 68℃에서 15분에 이어서, 95℃에서 10분 동안 사이클을 수행하여서 세포를 용해하였다. 2.5 ㎕의 용해된 세포를 각 PCR 반응의 투입물로서 사용하였다.
라이브러리 증폭을 위해서, 표적 게놈 영역은 12-사이클 PCR을 NEBNext High Fidelity 2X PCR 마스터 믹스 (NEB)를 사용하여 63℃의 어닐링 온도에서 15초 동안 수행하여 증폭시킨 다음에, 제2 18-사이클의 PCR 라운드를 후속하여 Illumina 어댑터 및 바코드를 첨가하였다. 라이브러리를 겔 추출하였고 판독 1의 300 사이클, 인덱스 1의 8 사이클, 인덱스 2의 8 사이클로 Illumina MiSeq에서 단일-말단 시퀀싱을 수행하였다. 삽입/결실 (indel) 빈도는 CRISPResso2를 사용해 분석되었다. IscB와 indel 사건의 저빈도를 고려하여, PCR로부터의 노이즈 및 시퀀싱 오차를 제거하기 위해서, 보고된 indel 빈도에 대해서 삽입 또는 결실된 1개 초과 염기 또는 적어도 2 판독치의 indel 만을 계측하였다. 개별 가이드/ωRNA 실험 경우에, 통계적 유의성을 평가하기 위해서, 양측 T-검정은 음성 대조군으로서 비-표적화 가이드/ωRNA 조건을 사용해 수행되었다 (보충 표 ukreP 참조).
TnpB RNP 복합체의 발현 및 정제
이의 천연 유전자좌의 추정 ωRNA와 복합체로 TnpB 단백질을 정제하기 위해서, N-말단 His14-MBP 태그화된 TnpB CDS 및 예측된 가이드 어뎁터의 말단을 넘어 최대 80 bp까지 상응하는 하류 유전자좌는 pET45b(+) 벡터의 T7 프로모터 하류 단일 조작으로서 클로닝되었다. TnpB RNP는 하기 변형에 따라서 발현시키고 유사하게 CRISPR-연관된 IscB RNP로 정제되었다: (1) 용해 완충액, 및 완충액 A 및 B는 40 mM 이미다졸, 및 5 mM β- 머캅토에탄올이 보충되었지만, 모든 완충액 중 MgCl2 및 DTT는 제거하였다; (2) RNP는 Strep-Tactin 수지 대신에 Ni-Sepharose 6 Fast Flow 비드 (GE Healthcare)에서 정제하였다; (3) 용리 완충액은 300 mM 이미다졸 및 5 mM β-머캅토에탄올이 보충되었지만, MgCl2, DTT 및 데스티오바이오틴은 제거하였다; (4) His14-MBP 가용성 태그는 안정성을 제공하기 위해서 RNP에 부착되었다.
시험관내 전사/번역 플라스미드 경쟁 어세이
"세포-무함유 전사/번역 절단 어세이"에 기술된 바와 같이, TAM-특이적 TnpB 활성을 검증하기 위한 시험관내 어세이는 62.5 ng 단백질 주형 및 5 ㎕ 중 7 μM의 최종 농도의 ωRNA를 사용해 설정되었다. SpCas9는 양성 대조군으로서 또한 어세이되었다 (도 S#KnIchC). 반응은 표적 플라스미드 기질의 첨가 전 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션되었다. 각 반응물은 TAM 서열 측접 동족 표적, 동족 표적 단독을 함유하거나, 또는 표적없는, 2개 플라스미드 각각 15 ng을 받았다. 반응물은 추가 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션된 다음에 켄칭하였고, "세포-무함유 전사/번역 TAM 스크린"에 기술된 대로 시퀀싱하였다. 맞춤형 python script를 사용하여 각 플라스미드 기질에 상응하는 절단된 생산물을 정량하였다.
***
본 발명의 기재된 방법, 약학 조성물 및 키트의 다양한 변형 및 이형은 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않고 당업자에게 분명해질 것이다. 본 발명이 특별한 구현예와 함께 기재되어 있지만, 더욱 변형될 수 있고, 청구되는 본 발명이 이러한 특별한 구현예에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해하게 될 것이다. 실제로, 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 다양한 변형은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따른 본 발명의 임의의 변형, 용도, 또는 개조를 포괄하는 것으로 의도되고 본 개시물로부터의 이러한 이탈의 포함은 본 발명이 속하는 분야 내에서 공지의 통상적인 관례 내이며 이전에 기재된 본 명세서의 본질적인 특성에 적용될 수 있다.

Claims (70)

  1. a) Ruv-C 뉴클레아제 도메인을 포함하는 TnpB 폴리펩티드로서, Ruv-C 뉴클레아제 도메인은 임의로 Ruv-CI, Ruv-CII, 및 Ruv-CIII 서브도메인을 포함하는 것인 TnpB 폴리펩티드, 및 b) 스캐폴드 및 재프로그램가능한 스페이서 서열을 포함하는 ωRNA 분자로서, 핵산 성분 분자가 TnpB 폴리펩티드와 복합체를 형성할 수 있고 표적 폴리뉴클레오티드로 TnpB 폴리펩티드를 유도할 수 있는 것인 ωRNA 분자
    를 포함하는, 비-천연 발생의, 조작된 조성물.
  2. 제1항에 있어서, TnpB 폴리펩티드는 약 200 내지 약 500 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 재프로그램가능한 스페이서 서열은 10 뉴클레오티드 내지 30 뉴클레오티드 길이의 스페이서를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, ωRNA 성분 분자는 약 80 내지 200 뉴클레오티드 길이의 스캐폴드를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, TnpB 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드의 5' 표적 인접 모티프 (TAM) 서열에 결합하는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, TAM 서열은 TCA를 포함하는 것인 조성물.
  7. 제5항에 있어서, TAM 서열은 TTCAN을 포함하는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드로 삽입을 위한 도너 서열을 포함하는 상동성 재조합 도너 주형을 더 포함하는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, TnpB 단백질과 연합된 기능성 도메인을 더 포함하는 것인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 기능성 도메인은 트랜스포사제, 인테그라제, 핵염기 데아미나제, 역전사효소, 리콤비나제, 인테그라제, 토포이소머라제, 레트로트랜스포존, 포스파타제, 폴리머라제, 리가제, 헬리트론, 헬리카제, 메틸라제, 데메틸라제, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 전사 활성인자, 전사 억제인자, 전사 방출 인자, 염색질 변형제, 히스톤 변형제, 뉴클레아제인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항의 TnpB 폴리펩티드 및 ωRNA 성분을 코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 조성물을 포함하는 조작된 세포.
  14. 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법으로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 조성물을 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 것인 변형 방법.
  15. 제14항에 있어서, 변형은 DNA 폴리뉴클레오티드 절단을 포함하는 것인 변형 방법.
  16. 제15항에 있어서, 절단은 5' 오버행을 생성시키는 것인 변형 방법.
  17. 제16항에 있어서, 절단은 표적-인접 모티프의 원위에서 발생되는 것인 변형 방법.
  18. 제17항에 있어서, 절단은 스페이서 어닐링 부위 또는 표적 서열의 3'의 부위에서 발생되는 것인 변형 방법.
  19. 제14항에 있어서, 폴리펩티드 및/또는 ωRNA 성분은 폴리펩티드 및/또는 ωRNA 성분(들)을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 통해서 제공되고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 TnpB 폴리펩티드 및/또는 ωRNA 성분 분자를 발현하도록 작동적으로 구성되는 것인 변형 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 치환, 결실, 및 삽입을 포함하는 것인 변형 방법.
  21. 조작된, 비-천연 발생 조성물로서,
    a. TnpB 폴리펩티드로서, 촉매적 불활성인 TnpB 폴리펩티드,
    b. TnpB 단백질과 연합되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 데아미나제, 및
    c. TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 서열에서 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 성분 분자
    를 포함하는 것인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, TnpB는 표 1A, 1B, 1C, 또는 도 1로부터 선택되는 것인 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 뉴클레오티드 데아미나제는 아데노신 데아미나제 또는 시티딘 데아미나제인 조성물.
  24. 제21항 또는 제22항의 조성물의 하나 이상의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드.
  25. 제24항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 벡터.
  26. 제24항 또는 제26항의 조성물의 하나 이상의 성분을 발현하도록 유전자 조작된 세포 또는 이의 자손.
  27. 표적 폴리뉴클레오티드에서 핵산을 편집하는 방법으로서, 제21항 또는 제22항의 조성물, 제24항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 제25항의 하나 이상의 벡터를 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 세포의 개체군에 전달하는 단계를 포함하는 것인 편집 방법.
  28. 제27항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA 내 표적 서열인 편집 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기에서 편집되어서 G→A 또는 C→T 돌연변이가 도입되는 것인 편집 방법.
  30. 제28항 또는 제29항의 방법을 사용하여 만들어진 하나 이상의 염기 편집을 포함하는 단리된 세포 또는 이의 자손.
  31. 조작된, 비-천연 발생 조성물로서,
    a. 촉매적 데드 TnpB 폴리펩티드,
    b. TnpB 폴리펩티드와 연합되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 역전사 효소, 및
    c. TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 대해 복합체의 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 성분 분자로서, 가이드 분자가 표적 폴리뉴클레오티드에 삽입을 위한 도너 서열을 코딩하는 도너 주형을 더 포함하는 것인 ωRNA 성분 분자
    를 포함하는 것인 조성물.
  32. 제31항의 조성물의 하나 이상의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드.
  33. 제32항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 벡터.
  34. 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서,
    제31항의 조성물, 제32항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 제33항의 하나 이상의 벡터를, 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포, 또는 세포 개체군에 전달하는 단계를 포함하고, 복합체는 표적 서열로 역전사효소를 유도하고, 역전사효소는 표적 폴리뉴클레오티드로 ωRNA 성분 분자로부터의 도너 주형에 의해 코딩되는 도너 서열의 삽입을 촉진하는 것인, 변형 방법.
  35. 제34항에 있어서, 도너 서열의 삽입은
    a. 하나 이상의 염기 편집을 도입시키거나;
    b. 조기 중지 코돈을 교정하거나 또는 도입시키거나;
    c. 스플라이스 부위를 파괴하거나;
    d. 스플라이스 부위를 삽입시키거나 또는 복원시키거나;
    e. 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 양쪽 대립유전자에서 유전자 또는 유전자 단편을 삽입시키거나; 또는
    f. 이의 조합인, 변형 방법.
  36. 제34항 또는 제35항의 방법을 사용하여 만들어진 변형을 포함하는 단리된 세포 또는 이의 자손.
  37. 조작된, 비-천연 발생 조성물로서,
    a. TnpB 폴리펩티드,
    b. TnpB 폴리펩티드와 연합되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질, 및
    c. TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 대한 복합체의 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 성분 분자로서, 표적 폴리뉴클레오티드로 삽입을 위한 도너 서열을 코딩하는 도너 주형을 더 포함하고 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 2개 결합 구성요소 사이에 위치되는 것인 ωRNA 분자
    를 포함하는, 조성물.
  38. 제37항에 있어서, TnpB 단백질은 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질의 N-말단에 융합되는 것인 조성물.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, TnpB 단백질은 닉카제 활성을 갖도록 조작되는 것인 조성물.
  40. 제39항에 있어서, ωRNA 성분 분자는 표적화된 삽입 부위의 5' 표적 서열로 융합 단백질을 유도하고, TnpB 단백질은 표적화된 삽입 부위에서 가닥 파손을 생성시키는 것인 조성물.
  41. 제39항에 있어서, ωRNA 성분 분자는 표적화된 삽입 부위의 3' 표적 서열로 융합 단백질을 유도하고, TnpB 단백질은 표적화된 삽입 부위에서 가닥 파손을 생성시키는 것인 조성물.
  42. 제39항에 있어서, 도너 폴리뉴클레오티드는 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단 프로세싱을 촉진하도록 폴리머라제 프로세싱 구성요소를 더 포함하는 것인 조성물.
  43. 제39항에 있어서, 도너 폴리뉴클레오티드는 도너 구성체의 5' 말단, 도너 구성체의 3' 말단, 또는 둘 모두 상에서 표적 서열에 대한 상동성 영역을 더 포함하는 것인 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상동성 영역은 8 내지 25 염기쌍인 조성물.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 하나의 항의 조성물의 하나 이상의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드.
  46. 제45항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터.
  47. 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서,
    제39항 내지 제44항 중 어느 하나의 항의 조성물, 제45항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 제46항의 하나 이상의 벡터를 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 세포의 개체군에 전달하는 단계를 포함하고, 복합체는 표적 서열로 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질을 유도하고, 비-LTR 레트로트랜스포존 단백질은 표적 폴리뉴클레오티드로 도너 구성체로부터의 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 촉진하는 것인, 변형 방법.
  48. 제47항에 있어서, 도너 서열의 삽입은
    a. 하나 이상의 염기 편집을 도입시키거나;
    b. 조기 중지 코돈을 교정하거나 또는 도입시키거나;
    c. 스플라이스 부위를 파괴하거나;
    d. 스플라이스 부위를 삽입시키거나 또는 복원시키거나;
    e. 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 양쪽 대립유전자에서 유전자 또는 유전자 단편을 삽입시키거나; 또는
    f. 이의 조합인, 변형 방법.
  49. 제47항 또는 제48항의 방법을 사용하여 만들어진 변형을 포함하는 단리된 세포 또는 이의 자손.
  50. 조작된, 비-천연 발생 조성물로서,
    a. TnpB 폴리펩티드,
    b. TnpB 폴리펩티드, 및 임의로 역전사효소와 연합되거나 또는 달리 복합체를 형성할 수 있는 인테그라제 단백질, 및
    c. TnpB 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 대해 복합체의 부위-특이적 결합을 유도할 수 있는 ωRNA 성분 분자로서, 가이드 분자가 표적 폴리뉴클레오티드에 삽입을 위한 도너 서열을 코딩하는 도너 주형을 더 포함하고 인테그라제 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 2개 결합 구성요소 사이에 위치되는 것인 ωRNA 성분 분자
    를 포함하는 것인 조성물.
  51. 제50항에 있어서, TnpB 단백질은 인테그라제 단백질 및 임의로 역전사효소에 융합되는 것인 조성물.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, TnpB 단백질은 닉카제 활성을 갖도록 조작되는 것인 조성물.
  53. 제52항에 있어서, ωRNA 성분 분자는 표적 서열로 융합 단백질을 유도하고, TnpB 단백질은 표적화된 삽입 부위에서 닉을 생성하는 것인 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 도너 폴리뉴클레오티드는 도너 구성체의 5' 말단, 도너 구성체의 3' 말단, 또는 둘 모두 상에서 표적 서열에 대한 상동성 영역을 더 포함하는 것인 조성물.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 하나의 항의 조성물의 하나 이상의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드.
  56. 제55항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터.
  57. 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서, 제50항 내지 제54항 중 어느 하나의 항의 조성물, 제55항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 제56항의 하나 이상의 벡터를 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 세포의 개체군에 전달하는 단계를 포함하고, 복합체는 표적 서열로 인테그라제 단백질을 유도하고, 인테그라제 단백질은 표적 폴리뉴클레오티드로 도너 구성체로부터의 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 촉진하는 것인, 변형 방법.
  58. 제57항에 있어서, 도너 서열의 삽입은
    a. 하나 이상의 염기 편집을 도입시키거나;
    b. 조기 중지 코돈을 교정하거나 또는 도입시키거나;
    c. 스플라이스 부위를 파괴하거나;
    d. 스플라이스 부위를 삽입시키거나 또는 복원시키거나;
    e. 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 양쪽 대립유전자에서 유전자 또는 유전자 단편을 삽입시키거나; 또는
    f. 이의 조합인, 변형 방법.
  59. 제57항 또는 제58항의 방법을 사용하여 만들어진 변형을 포함하는 단리된 세포 또는 이의 자손.
  60. 샘플에서 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 조성물로서,
    부차적 활성을 보유하는 하나 이상의 TnpB 단백질;
    표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있는 서열을 포함하고 하나 이상의 TnpB 단백질과 복합체를 형성하도록 디자인된 적어도 하나의 ωRNA 성분;
    폴리뉴클레오티드 성분을 포함하는 검출 구성체로서, TnpB 단백질이 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고 표적 서열에 의해 활성화되면 검출 구성체의 폴리뉴클레오티드 성분을 절단하는 것인 검출 구성체; 및
    임의로, 등온 증폭 시약
    을 포함하는 것인 조성물.
  61. 제60항에 있어서, TnpB는 표 1A, 표 1B, 표 1C, 또는 도 1로부터 선택되거나, 또는 도 1의 서열 정렬의 195D, 277E, 또는 361D에 상응하는 하나 이상의 촉매성 잔기를 포함하는 것인 조성물.
  62. 제60항에 있어서, 하나 이상의 TnpB 단백질은 표 1A, 표 1B, 표 1C, 또는 도 1로부터 선택되고, 45℃ 내지 60℃의 온도 범위에서 활성이고, 즉 뉴클레아제 활성을 보유하는 것인 조성물.
  63. 제60항에 있어서, 등온 증폭 시약은 루프-매개 등온 증폭 (LAMP) 시약인 조성물.
  64. 제63항에 있어서, LAMP 시약은 LAMP 프라이머를 포함하는 것인 조성물.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 하나의 항에 있어서, 반응 특이성 또는 동역학을 증가시키기 위해 하나 이상의 첨가제를 더 포함하는 것인 조성물.
  66. 제60항 내지 제65항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 결합 비드를 더 포함하는 것인 조성물.
  67. 샘플에서 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법으로서, 방법은
    하나 이상의 표적 서열을 TnpB, TnpB와 복합체를 형성할 수 있고 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 서열-특이적 결합을 유도할 수 있는 적어도 하나의 ωRNA 성분 및 검출 구성체와 접촉시키는 단계로서, TnpB는 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고 하나 이상의 표적 서열에 의해 활성화되면 검출 구성체를 절단하는 것인 단계; 및
    검출 구성체의 절단으로부터의 신호를 검출하여서 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계
    를 포함하는 것인 검출 방법.
  68. 제67항에 있어서, 접촉 단계 전에 등온 증폭을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 더 포함하는 것인 검출 방법.
  69. 제68항에 있어서, TnpB 복합체에 대한 표적 폴리뉴클레오티드의 결합에 의한 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드의 검출은 45℃ 내지 60℃의 온도 범위에서 발생되는 것인 검출 방법.
  70. 제67항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드는 1시간 이하에 검출되는 것인 검출 방법.
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